BRPI0709452A2 - concetrado de imunoglobulinas e fragmentos f(ab)' 2 e/ou fab especìficos de um arbovìrus como um produto medicinal - Google Patents
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Abstract
Concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)'2 elou Fab específicos de um arbovírus como um produto medicinal A invenção refere-se a um produto medicinal novo para o tratamento de arbovírus, isto é, um concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos do referido arbovírus, assim com a seu processo de preparação.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "Concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F(ab)' 2 e/ou Fab específicos de um arbovírus como um produto medicinal"
A presente invenção se refere a um novo produto medicinal para o tratamento de arbovírus, isto é, um concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos do referido arbovírus, assim como seu processo de preparação.
Introdução
Os vírus que usam vetores artrópodes em seu ciclo estão agrupados sob o termo geral arbovírus. Os arbovírus são definidos pela OMS como vírus que subsistem na natureza essencialmente ou principalmente através de transmissão biológica entre hóspedes vertebrados susceptíveis por artrópodes hematófagos; eles se multiplicam e provocam viremia no vertebrado, proliferam nos tecidos do artrópode e são transmitidos para outro vertebrado pelo inseto que pica, após um período de incubação extrínseco.
A transmissão do vírus de um hóspede virêmico para uma fêmea adulta de mosquito ocorre através do sangue que é sugado quando ocorre a picada. O vírus se multiplica dentro do mosquito, atravessa a barreira estomacal do animal e é encontrado nas glândulas salivares. A contaminação de um humano são, é adquirida pela saliva anticoagulante do mosquito, liberada imediatamente antes da picada em um vaso sangüíneo. A janela durante a qual a pessoa é um hóspede virêmico antes de se tornar doente é de apenas alguns dias.
Os arbovírus conhecidos pertencem a cinco famílias de vírus:
Togaviridae, gênero Alphavirus, 28 vírus incluindo os vírus Chikungunya, 0'Nyong Nyong, Ross River, Sindbis e Mayaro.Flaviviridae, gênero Flavivirus, 68 vírus, incluindo o vírus da febre amarela, dengue, encefalite japonesa, o vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite transmitida por carrapato da Eurásia temperada e os vírus que causam a doença da floresta Kyasanur e a febre hemorrágica de Omsk.Bunyaviridae, gênero Bunyavirus (138 vírus, incluindo o vírus Bunyamwera), gênero Phleboviris (43 vírus, incluindo o vírus da febre de Rift Valley), gênero Nairovirus (24 vírus, incluindo o vírus da febre hemorrágica da Crimea-Congo) + 41 vírus não classificados.
- Reoviridae1 gênero Orbivirus (69 vírus) e gênero Coltivirus (2vírus) + 6 vírus não classificados
Rhabdoviridae, gênero Vesiculovirus (18 vírus) e gênero Lyssavirus (16 vírus) + 36 vírus não classificados.
Os principais arbovírus observados nos trópicos são detalhados abaixo.
Dengues se espalham por todas as zonas tropicais e subtropicais domundo e representam o principal problema de saúde pública apresentado pelos arbovírus. Existem quatro sorotipos virais, chamados "dengue 1, 2, 3 e 4", os quais não produzem proteção cruzada. Clinicamente, várias formas de dengue são distinguidas: dengue assintomática, dengue clássica (CD) e as formas graves, particularmente as formas hemorrágicas, dengue hemorrágica (HD) e síndrome do choque de dengue (DSS), que podem causar a morte, especialmente em crianças. Todos os 4 tipos de vírus de dengue podem ser responsáveis por CD assim como por HD. Os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na gênese da HD são desconhecidos. A teoria mais comum refere-se ao fenômeno de "facilitação imunológica": uma vez que um indivíduo que se infectou com um dos quatro sorotipos não está protegido contra os outros três, uma infecção secundária heteróloga pode levar à HD. Os vetores são mosquitos do gênero Aedes: Aedes aegypti é o principal vetor e Aedes albopictus desempenha um papel importante nas áreas rurais e urbanas periféricas, e é bem adaptado a climas temperados.
O vírus do Nilo Ocidental é atualmente considerado o mais disseminado dos flavivírus depois do vírus da dengue; ele afeta humanos esporadicamente ou de forma epidêmica. Ele foi recentemente descrito como emergindo pela primeira vez no continente americano, em uma epidemia que ocorreu em Nova York em 1999 (62 casos incluindo 7 óbitos). Ele então se espalhou consideravelmente nos Estados Unidos, afetando mais de 9.000 pessoas em 44 estados em 2003,incluindo 2.866 casos de encefalite e 264 óbitos. O vírus foi anteriormente encontrado em várias regiões do mundo, na África, no Oriente Médio, índia e Europa. Os mosquitos são os vetores principais do vírus do Niio Ocidental, principalmente os do gênero Culex. Os principais hospedeiros do vírus são aves, selvagens assim como domésticas (patos, pombos, etc.). Eles desempenham um papel chave na disseminação do vírus. O vírus do Nilo Ocidental afeta humanos principalmente pela via de um mosquito vetor. A infecção é caracterizada pelo surgimento súbito de uma febre alta após 3 a 6 dias de incubação. Essa febre é acompanhada por dores de cabeça e dor nas costas, dor muscular, tosse, inchaço dos gânglios linfáticos do pescoço e freqüentemente erupção cutânea, náusea, dor abdominal, diarréia e sintomas respiratórios. Em menos de 15% dos casos, sobrevêm complicações: meningite, encefalite, e raramente hepatite, pancreatite ou miocardite. Geralmente, o paciente se recupera espontaneamente, às vezes com seqüelas. Entretanto, a doença pode ser fatal em idosos e às vezes em crianças novas.
A febre amarela (YF) continua a ser uma epidemia formidável e uma ameaça constante na África Subsaariana e na América tropical. Ela se deve ao vírus amaril. Ela se manifesta na forma de uma hepatonefrite hemorrágica, tifo de amaril, com uma fase inicial ou "vermelha", remissão no terceiro dia e uma fase de estase ou "amarela", com icterícia, vômito, hemorragia (principalmente no trato IG) e síndrome renal. A epidemiologia é complexa devido ao fato de que, em áreas naturais, o vírus amaril circula continuamente entre populações de macacos, devido a mosquitos selvagens simiófilos que agem como vetores. Foi somente por acidente, quando humanos entraram em contato com esse ciclo da selva, que ocorreram os primeiros casos humanos.
Chikungunya (abreviada como CHIK) é, transmitida por mosquitos do gênero Aedes. O nome tem origem na língua Bantu1 e significa: aquele que dobra, que enrola, ou doença do homem encurvado, porque ela causa dor de junta muito severa combinada com rigidez, a qual dá aos pacientes infectados uma aparência de encurvamento muito característica.
Dentre mais de 950 espécies de mosquito, várias delas podem transmitir chikungunya, mas somente Aedes aegypt e Aedes albopictus foram identificadosaté hoje como vetores epidêmicos, devido a sua adaptação a áreas de habitação humana. Essas mesmas espécies também estão envolvidas na transmissão de outros arbovírus: dengue, dengue hemorrágica (HDF)1 febre amarela, etc.
O perfil clínico é dominado por uma febre alta semelhante àquela da dengue (a dengue é freqüentemente confundida com a chikungunya e vice-versa), combinada com dor de junta incapacitante e às vezes com erupção cutânea. Entretanto, há formas severas que têm sido ignoradas até hoje: hepatite fulminante, ataques cardíacos, meningoencefalite, etc. Vários outros arbovírus do gênero alfavírus (cápside de aproximadamente 30 kD e RNA poliadenilado a 3') como Ross River, 0'nyong-nyong e Mayaro têm sido associados com sintomas semelhantes.
A incubação da doença dura de quatro a sete dias em média. Viremia, a presença do vírus no sangue e portanto de possível transmissão estende-se por aproximadamente cinco dias. Desenvolvem-se então anticorpos. Estes permanecem no sangue. Portanto, a imunidade é geralmente adquirida para toda a vida.
Está disponível uma vacina pra prevenir febre amarela. A vacinação é sistemática em populações expostas. Entretanto, 60 a 80% da população precisam estar imunizados (naturalmente ou através de vacinação) para evitar epidemia. Os anticorpos aparecem após cerca de dez dias. A vacinação é contra-indicada em mulheres grávidas e crianças abaixo de 6 meses de idade.
Há também uma vacina em uso na Europa contra a encefalite transmitida por carrapato. Ela é vendida sob o nome TICOVAC® (Baxter SA).
Um estudo de fase I e um de fase Il foram realizados nos Estados Unidos para uma vacina de chikungunya pelo United States Army Medicai Research Institute of Infectious Diseases [Instituto de Pesquisa Médica de Doenças Infecciosas do Exército dos Estados Unidos] (Edelman R et al. "Estudo de fase Il de segurança e imunogenicidade de vacina de vírus vivo de chikungunya" TSI-GSD-218. Junho de 2000; Am J Trop Med Hyg, 62:681-5).
Atualmente não há tratamento com viricida para arbovírus.
O tratamento é puramente sintomático, para baixar a febre e reduzir a dor.Descrição do estado da técnica
Vários estudos demonstraram a eficácia de injeções de imunoglobulina contendo anticorpos anti-hepatite A em indivíduos com risco de serem expostos a este vírus., antes do desenvolvimento da vacina de hepatite A (Ohara et al., Jpn J Exp Med1 Outubro de 1986; 56 (5) :229-33; Conrad ME et al., J Infect Dis, Julho de 1987; 156(1) :56-63).
As imunoglobulinas específicas de hepatite B, ou anti-HBs, são amplamente usadas para proteger qualquer pessoa não vacinada que sofra um corte com objeto contaminado, neonatos de mães que são positivas para antígeno de HBs (nesse caso, uma injeção deve ser dada imediatamente e deve ser acompanhada de iniciação de vacinação), pacientes de transplante de fígado para evitar re-infecção do transplante, e parceiros sexuais de indivíduos positivos para antígeno de HBs, enquanto esperam que a vacinação faça efeito. Essas imunoglobulinas permitem que se estabeleça uma proteção, antes da exposição ao risco ou o durante as 24 horas seguintes ao contato com a infecção (punctura acidental).
Objetivos e breve descrição da invenção
Em face dessa ausência de tratamento com viricida estabelecido, e somente uma vacina tendo recebido autorização para comercialização, o requerente procurou desenvolver um produto medicinal para tratar ou prevenir arbovírus, baseado em imunoglobulinas específicas que possibilitam a imunização rápida de pessoas expostas.
O requerente demonstrou de uma forma surpreendente que esse tratamento requer a combinação de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos do arbovírus a ser tratado, para ser eficaz.
Definições
O termo "concentrado" refere-se a um produto obtido por eliminação de certos componentes. Um concentrado de imunoglobulinas é obtido por eliminação de certos componentes do plasma para obter uma fração de plasma enriquecida 30 de imunoglobulina.O termo "imunoglobulina" (Ig) refere-se a uma globulina natural, presente principalmente no plasma, com funções de anticorpo, que pode ser usada em terapia curativa ou preventiva.
As imunoglobulinas são heterodímeros compostos de 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves, ligadas por pontes de dissulfeto. Cada cadeia é constituída, na posição N-terminal, de um domínio ou região variável (codificada por genes V-J rearranjados para a cadeia leve e V-D-J para a cadeia pesada), a qual é específica para o antígeno contra o qual o anticorpo é dirigido e, em posição C-terminal, de uma região constante, composta de um único domínio CL para a cadeia leve ou 3 domínios (CH1, CH2 e CH3) para a cadeia pesada. A combinação de domínios variáveis e domínios CH1 e CL das cadeias leves e pesadas forma as partes Fab, que são conectadas à região Fc por uma região dobradiça muito flexível que permite que cada Fab se ligue ao antígeno alvo enquanto a região Fc, intermediária das propriedades de efetor do anticorpo, permanece acessível às moléculas do efetor como os receptores FcyR e C1q.
As lgG's são as imunoglobulinas mais comuns (75 a 80 % dos anticorpos na circulação). Elas protegem o corpo contra bactérias, vírus e toxinas que circulam no sangue e na linfa. Além disso, elas se ligam rapidamente ao complemento (um dos componentes do sistema imune). Elas também participam de resposta de memória, que é a base da imunidade sobre a qual se funda o mecanismo de vacinação. Finalmente, as imunoglobulinas G atravessam a barreira placentária e assim produzem imunidade passiva no feto.
As lgA's são encontradas principalmente em secreções como saliva, suco intestinal, suor e leite materno. O principal papel das imunoglobulinas A é prevenir que os agentes patogênicos se liguem a células, particularmente às células de proteção que constituem as membranas mucosas e a epiderme.
As lgM's são imunoglobulinas secretadas ao primeiro contato do corpo com um antígeno. Elas são o primeiro tipo de imunoglobulinas liberadas por plasmócitos. A presença de IgM no sangue indica uma infecção em curso.
A proteólise enzimática de imunoglobulinas por papaína gera 2 fragmentosidênticos, que são conhecidos como fragmento Fab (Fragmento de Ligação aAntígeno) e um fragmento Fc (fração cristalizável). O fragmento Fc suporta as funções de efetor das imunoglobulinas.
Por proteólise por pepsina, um fragmento F (ab)' 2 é gerado, no qual os dois fragmentos Fab permanecem ligados por duas pontes de dissulfeto, e o fragmento Fc é desmembrado em vários peptídeos. O fragmento F (ab)' 2 é formado por dois fragmentos Fab' (um fragmento Fab' consiste em um Fab e uma região dobradiça), ligados por pontes de dissulfeto intercatenárias para formar um F (ab)' 2.
O termo "cromatografia" refere-se a um método de separação dos componentes de uma mistura com base em sua retenção seletiva, com o uso de um meio adequado.
Descrição detalhada da invenção
Primeiramente, a invenção se refere a um concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos de um arbovírus, como um produto medicinal.
O uso de frações de plasma humano enriquecidas de imunoglobulina para o tratamento de várias infecções e deficiências congênitas é conhecido desde o desenvolvimento do processo de precipitação por etanol por Cohn (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soe. 68, 459; Oncley et al. 1949, J. Am. Chem. Soc.71, 541).
Esses fragmentos F (ab)' 2 ou Fab, que contêm o local de ligação doanticorpo, podem ter perdido um certo número das propriedades do anticorpo integral do qual eles derivam, como a capacidade de se ligarem a receptores Fcgama.
O arbovírus em questão, que pode ser tratado com um concentrado como o disposto na invenção, pode ser, por exemplo, um dos vírus de dengue, o vírus de febre amarela, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus de chikungunya, o vírus de Ross River, o vírus de O' nyong-nyong ou o vírus de Mayaro.
No concentrado de acordo com a invenção, são possíveis todas as combinações entre uma mistura de imunoglobulinas A, G e/ou M e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab de Ig A, G e/ou M específicos de um arbovírus.Particularmente, o concentrado de acordo com a invenção é um concentrado de imunoglobulinas A, G e M e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos de um arbovírus.
Preferencialmente, o concentrado de acordo com a invenção é um concentrado de imunoglobulinas exclusivamente M, e de fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos de um arbovírus.
De forma particularmente preferível, o concentrado de acordo com a invenção é constituído de um concentrado exclusivamente de imunoglobulinas G e de fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab de IgG e IgM específicos de um arbovírus.
Preferivelmente, o concentrado de acordo com a invenção contém nomínimo 50% de imunoglobulinas IgG e de 90 a 98% de proteínas que reagem com anticorpos especificamente dirigidos contra imunoglobulinas humanas, particularmente de 5 a 50% de F (ab)' 2 e/ou Fab, particularmente no mínimo 50 a 60 g/l de Ig e fragmentos para uma preparação farmacêutica.
De acordo com a invenção, de 1 a 10 mmol de magnésio e/ou zincopodem ser adicionados ao concentrado.
Outro objeto da invenção é o uso de um concentrado de acordo com a invenção para a fabricação de um produto medicinal para o tratamento do referido arbovírus.
Esse tratamento é profilático e/ou curativo. Ele é usado para conferirimunidade passiva a pessoas ainda não infectadas em uma região de epidemia, ou para tratar pacientes já infectados com o vírus.
O produto medicinal em questão é administrado por via tópica, oral, mucosal, intramuscular ou intravenosa.
Ele é eficaz por várias semanas, aproximadamente 21 dias, período após oqual essa administração deve ser repetida se a epidemia ou os sintomas persistirem.
A invenção também se refere a um processo para preparar um concentrado de acordo com a invenção.Este processo consiste em misturar um concentrado de imunoglobulinas específicas de um arbovírus, e um concentrado de imunoglobulinas específicas do mesmo arbovírus que tenha sofrido proteólise, para obter fragmentos F (ab)' 2 e Fab específicos desse arbovírus. Este processo requer, portanto, a preparação de pelo menos um concentrado de imunoglobulinas.
Este processo começa com a criação de um pool de pelo menos 1000 doações de plasma, cada doação contendo um título suficiente de Ig dirigida contra o referido arbovírus. Um soro que contém um título suficiente corresponde, por exemplo, a um soro que permanece positivo para a detecção de anticorpos anti-chikungunya, após diluição a 1/1000, quando o título é medido por um método como o Elisa.
Essas doações provêm de pessoas que estiveram em contato com a doença, ou pacientes que desenvolveram a doença.
A titulação pode ser efetuada de acordo com o procedimento descrito por C. van de Water et al„ Journal of Immunological Methods, 166 (1993), 157-164.
Para enriquecer esse pool de plasma em imunoglobulinas, os outros componentes do plasma, conhecidos como "contaminantes de lipídeo e proteína" são precipitados em uma única etapa. Essa purificação por precipitação em uma única etapa pode ser efetuada por diluição do plasma em condições de precipitação de acordo com Steinbuch (Steinbuch M., Archiv. Biochem. Biophys., 134, 279-284) e pela adição de ácido caprílico. Ela também pode ser obtida pela adição de agentes de precipitação como Rivanol, cloreto de alumínio, cloreto de cetilpiridínio, ácido octanóico, polifosfatos e na presença de agentes de adsorção como, por exemplo, fosfato tricálcico e bentonita.
O sobrenadante que resulta da precipitação pode constituir o concentrado de imunoglobulinas. Ele contém, portanto, uma mistura de IgG, IgA e IgM. Esse sobrenadante é recuperado, por exemplo, por filtragem, opcionalmente com a adição de pelo menos um aditivo de filtragem.
O sobrenadante que resulta da centrifugação ou filtragem pode sofrer o processamento de desativação viral como, por exemplo, um processamento de desativação viral convencional com um solvente/detergente (Triton X100).Se a precipitação efetuada foi uma precipitação do tipo "caprílica", como a descrita acima, os resíduos de ácido caprílico no sobrenadante são eliminados por cálcio P04.
Para obter um concentrado de IgG1 IgA ou IgM1 o método descrito no pedido de patente EP1385886 pode ser aplicado, particularmente os métodos correspondentes ao ajuste de pH, adsorção em uma coluna pré-carregada, adsorção na coluna do sobrenadante que contém as imunoglobulinas e as proteínas que as acompanham, lavagem da coluna e eluição seqüencial das várias categorias de imunoglobulinas como, por exemplo, IgG, A ou M. Após a etapa de desativação viral, o sobrenadante sofre então uma etapa adicional de purificação por cromatografia em um trocador de ânion executada em pH alcalino. Particularmente, o pH do sobrenadante é ajustado antes para um pH variando de 8,9 a 9,1, e a coluna é carregada com um tampão, a um pH de 8,9 a 9,1. A etapa de cromatografia permite a adsorção de imunoglobulinas na coluna e passagem de proteínas não retidas para o efluente. A cromatografia pode ser executada, por exemplo, sobre um gel reticulado de polissacarídeo ou polímero de vinil, enxertado com grupos DEAE, TMAE ou QAE.
Após lavar a coluna com o mesmo tampão que o tampão de carga para eliminar proteínas não retidas, as imunoglobulinas G são eluídas com um tampão de fosfato, cujo pH varia de 4 a 7, preferivelmente pH 6,2.
Uma eluição opcional subseqüente com o mesmo tampão de fosfato suplementado com NaCI de 100 a 175 mM, preferivelmente 150 mM, a um pH de 6 a 6,3, pode ser usada para coletar a IgA.
Uma eluição subseqüente opcional com o mesmo tampão ajustado para um pH variando de 6 a 7 e suplementado com NaCI de 250 a 350 mM, preferivelmente 300 mM, pode ser usado para coletar a IgM.
Qualquer tipo de mistura de IgA1 IgG e IgM pode ser considerado misturando os concentrados da forma acima descrita.
As imunoglobulinas assim eluídas e coletadas podem ser concentradas por ultrafiltragem e submetidas, por exemplo, a filtragem de esterilizaçãoconvencional e então a filtragem através de filtros nanométricos com porosidade decrescendo de 100 para 15 nanômetros.
À solução de imunoglobulinas concentradas e filtradas adiciona-se um agente estabilizador farmaceuticamente aceitável, como os descritos no pedido de patente W02004/091656, e então essa solução é acondicionada como uma solução estéril e opcionalmente congelada e/ou liofilizada.
A aplicação de nanofiltragem torna possível eliminar vírus resistentes ao tratamento de desativação viral com solvente / detergente.
Uma parte do concentrado de imunoglobulinas assim obtido, ou outro concentrado de imunoglobulinas obtido da forma acima descrita, é submetido a proteólise para obter fragmentos de F (ab)' 2 ou Fab. O concentrado de IG e a mistura de fragmentos resultante da proteólise são então misturados.
Dessa forma, é obtido um concentrado de IgG e F (ab)' 2 e/ou Fab de IgG e IgM.por:
(1) preparação de um concentrado de IgG acima descrito,
(2) preparação de um concentrado de IgM acima descrito,
(3) mistura e digestão de uma parte do concentrado de IgG e de uma parte do concentrado de IgM para obter uma mistura de fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab de IgG e IgM,
(4) mistura de (1)e (3).
Para obter fragmentos F (ab)' 2, faz-se proteólise a pH 4,0, a 35 oC, com pepsina de 1%, esta percentagem correspondendo à razão do peso da pepsina para o peso total de proteína do concentrado (protocolo IGLOO).
Para obter fragmentos Fab, faz-se proteólise com papaína a 1%, esta percentagem correspondendo à razão do peso da papaína para o peso total de proteína do concentrado.
A proteólise de imunoglobulinas G, A e/ou M também pode ser efetuada com o uso de plasmina e/ou tripsina, sendo que a implementação dessas proteases é bem conhecida pelos peritos do setor.O exemplo revelado abaixo descreve uma configuração específica da invenção, mas não deve ser considerado como uma limitação do escopo da mesma.
Exemplo 1: Preparação de um concentrado de imunoglobulina anti-chikungunya
1-1. Criação de um pool de plasma
Coleta-se um litro de plasma rico em anticorpos anti-chikungunya de doadores voluntários recentemente infectados pelo vírus de chikungunya e curados dos sintomas da doença. O título do anticorpo é medido pelo Elisa, e consiste em fixar antígenos do vírus em uma placa de microtitulação, e então revelar os anticorpos específicos através de um reagente marcado com peroxidase de raiz forte dirigido contra imunoglobulinas. Para criação do pool de plasma, são conservadas as amostras testadas positivas, a uma diluição de no mínimo 1/1000 no contexto de um método Elisa "específico",
1-2. Preparação das imunoglobulinas
O pool de plasma resultante da etapa 1-1 é resfriado para -3 oC e, durante o resfriamento, adiciona-se etanol em um volume suficiente para obter uma concentração final de etanol de 8%. O precipitado que nele se forma é descartado.
O pH do sobrenadante é então ajustado para pH 5,9 através da adição detampão de acetato, por exemplo, resfriado a -5 oC e completado com um volume de etanol suficiente para obter uma concentração final de etanol de 19%. O precipitado que nele se forma é coletado por centrifugação, por exemplo, e suspenso novamente em tampão de acetato, por exemplo, para obter um pH final de 4,7 a 4,9.
Adiciona-se então ácido octanóico a 20° C, sob agitação intensa, para obter uma concentração final de ácido octanóico de 20 g/l.
O precipitado aí formado é separado por centrifugação ou filtragem aluvial e descartado. Fosfato tricálcico ou carvão ativado é adicionado ao sobrenadante e então a mistura é clarificada por filtragem de leito profundo.O pH do sobrenadante que contém imunoglobulina, que resulta da etapa de clarificação, é ajustado para 9 através da adição de tampão de NaOH/glicina, por exemplo, e o sobrenadante é aplicado a uma coluna de troca de ânion (TMAE Fractogel, por exemplo), que é carregada a pH 9 com um tampão de glicina/NaCI a pH 9.
É efetuada a lavagem com o tampão de carga até o OD [diâmetro externo] de saída da coluna de 280 nm estar próximo do OD2so medido por ocasião do estabelecimento da linha basal.
É então efetuada a eluição de IgG com um primeiro tampão de fosfato de sódio a pH 6,2. Uma segunda eluição é efetuada com um tampão de fosfato suplementado com NaCl a 300 mM.
O eluído correspondente contém IgA, IgM e parte da lgG4. O processo de operação detalhado dessa purificação é revelado em EP 1385886.
1-3. Preparação de um concentrado ativo contra chikungunya
25% do primeiro eluído, contendo a IgG1 são extraídos e adicionados aeluídos que contêm lgG4, IgA e IgM. Essa mistura de imunoglobulinas é concentrada a 50 g/l através de ultrafiltragem em uma membrana, cujo limiar de corte é igual ou mais baixo do que 30 kD.
O pH da mistura concentrada é ajustado por diafiltragem contra um tampão de citrato a pH de 3,8 a 4,2, para obter um pH ácido compreendido nessa faixa. A solução é então suplementada com pepsina (10000 FlP/mg) de forma que a quantidade de pepsina corresponda a 1 % da quantidade total de proteínas contidas na mistura concentrada.
Essa solução é então filtrada sob condições de esterilidade a 0,2 mm e incubada por 20 h a 37° C.
Após a incubação, o hidrolisado de proteína é neutralizado, por exemplo, pela adição de hidróxido de sódio a pH 6,2 +/- 0,2. O hidrolisado de proteína neutralizado é diafiltrado contra um tampão de glicina a pH 6,2 +/- 0,2, até o OD2So atingir cerca de 0,005, com o OD28O sendo medido na linha de filtrado da membrana de limiar de corte de 30 kD.Os peptídeos resultantes da proteólise de pepsina, cujo tamanho é igual ou menor do que 30 kD, são descartados por ocasião da passagem através da membrana de limiar de corte. O hidrolisado de proteína obtido, portanto, contém fragmentos Fab, fragmentos F (ab)' 2 mas carece de fragmentos Fc.
O hidrolisado de proteína resultante é então misturado com os restantes 75% do primeiro eluído, que contém a IgG. Em seguida a mistura é concentrada por ultrafiltragem para atingir uma concentração final variando de 50 a 160 g/l, dependendo da via de administração selecionada. O título do concentrado é medido de acordo com o método descrito em Edelman, R et al. (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 62 (6), 2000, páginas 681-685). O título assim obtido em anticorpos específicos anti-chikungunya do concentrado é no mínimo 3 a 10 vezes mais alto do que o do plasma inicial.
1-4. Uso da preparação
O concentrado que resulta da etapa 1-3 é estabilizado através da mistura com uma formulação que compreende excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como, por exemplo, glicina sob uma concentração final de 0,22 M, ou como os descritos no pedido de patente WO 2004/091 656. O pH da formulação adicionada ao concentrado é compatível com a obtenção de uma mistura líquida, cujo pH varia de 4,2 a 5,6.
A mistura líquida resultante pode ser administrada, por exemplo, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular, dependendo do estado flebológico do receptor.
A dose administrada corresponde de 0,2 a 0,8 ml/kg e pode, no caso de uma epidemia, ser administrado como medida de precaução a cada 3 semanas a pacientes particularmente expostos, por exemplo, a idosos, mulheres grávidas ou neonatos.
Claims (23)
1. Concentrado de imunoglobulinas e fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab específicos de um arbovírus, como um produto medicinal.
2. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido arbovírus é um dos vírus de dengue, o vírus da febre amarela, ovírus do Nilo Ocidental, o vírus de chikungunya, o vírus de Ross River, o vírus de 0'nyong-nyong ou o vírus de Mayaro.
3. Concentrado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as imunoglobulinas são imunoglobulinas A, G e M.
4. Concentrado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelofato de que as imunoglobulinas são imunoglobulinas G.
5. Concentrado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as imunoglobulinas são imunoglobulinas M.
6. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que contém de 90 a 98% de imunoglobulina e F (ab)' 2e/ou Fab.
7. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que contém de 5 a 50% de F (ab)' 2 e/ou Fab.
8. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab são fragmentos F(ab)' 2 e/ou Fab de IgG e/ou IgM.
9. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que são adicionados de 1 a 10 mmol de magnésio ao mesmo.
10. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que são adicionados de 1 a 10 mmol de zinco ao mesmo.
11. Uso de um concentrado definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 para a fabricação de um produto medicinal para o tratamento do 30 referido arbovírus.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11 para a fabricação de um produto medicinal em uma forma a ser administrada por via tópica, subcutânea, oral, intramuscular ou intravenosa.
13. Processo de preparação de um concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, na qual o referido processo compreende as seguintes etapas:- criação de um pool de no mínimo 1.000 doações de plasma, cada doação contendo um título suficiente de Ig dirigido contra o referido arbovírus,- precipitação de contaminantes lipídicos e protéicos em uma única etapa, - recuperação de um concentrado de Ig no sobrenadante (1),- submissão de parte do primeiro concentrado a proteólise para obter fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab (2),- mistura das frações (1) e (2).
14. Processo para preparação de um concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:- criação de um pool de no mínimo 1.000 doações de plasma, cada doação contendo um título suficiente de Ig anti-chikungunya,- precipitação de contaminantes lipídicos e protéicos em uma única etapa, - cromatografia do sobrenadante em um trocador de ânion em pH alcalino,- eluição de IgG com um tampão de fosfato a um pH entre 4 e 7, para obter um concentrado de IgG (1),- opcionalmente, eluição, em seguida, de IgA com o mesmo tampão de fosfato com NaCI de 100 a 175 mM adicionado ao mesmo, preferivelmente 150 mM, a um pH de 6 a 6,3 (1),- opcionalmente, eluição, em seguida, de IgM com o mesmo tampão de fosfato a um pH entre 6 e 7 e com NaCI de 250 a 350 mM adicionado ao mesmo (1).- opcionalmente, mistura dos concentrados de IgG, IgA e IgM (1),- submissão de parte do primeiro concentrado a proteólise para obter fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab (2),- mistura da fração (1) com a fração (2).
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o pH do sobrenadante é ajustado para o intervalo entre 8,9 e 9,1 e a colunade cromatografia é carregada com um tampão a pH de 8,9 a 9,1 antes da cromatografia.
16. Processo para preparação de um concentrado de acordo com a reivindicação 4 e 8, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintesetapas:(1) preparação de um concentrado de IgG de acordo com a reivindicação 14 ou 15,(2) preparação de um concentrado de IgM de acordo com a reivindicação 14 ou 15,(3) mistura e submissão de uma parte do concentrado de IgG e uma partedo concentrado de IgM a proteólise para obter uma mistura de fragmentos F (ab)' 2 e/ou Fab de IgG e IgM,(4) mistura de (1) e (3).
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a proteólise para obter os fragmentos F (ab)' 2ocorre em pepsina a 1 % em peso de proteínas a pH 4 e 35 oC.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que a proteólise para obtenção dos fragmentos Fab ocorre em papaína.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18,caracterizado pelo fato de que a precipitação é uma precipitação caprílica e no qual os resíduos de ácido caprílico no sobrenadante são eliminados por cálcio P04.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que o precipitado é separado por filtragem após a adição de pelo menos um aditivo de filtragem.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante é tratado com um solvente/detergente.
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado pelo fato de que as imunoglobulinas eluídas são concentradas por ultrafiltragem e passadas por filtragem de esterilização convencional, e então por filtragem através de filtros nanométricos com porosidade decrescendo de 100 para 15 nanômetros.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo fato de que um estabilizador farmaceuticamente aceitável é adicionado à solução de concentrado e imunoglobulinas filtradas que é então acondicionada como uma solução estéril e opcionalmente congelada e liofilizada.
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