BRPI0709598A2

BRPI0709598A2 - composições de poliptìdeos estabilizados

Info

Publication number: BRPI0709598A2
Application number: BRPI0709598-8A
Authority: BR
Inventors: Scott Glaser; Xiufeng Wu; Brian Robert Miller; William B Snyder; Norman Wang; Lisa J Croner; Alexey Alexandrovich Lugovskoy; Stephen Demarest
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2011-07-19
Also published as: EP2024392A2; AU2007227292A1; GEP20135917B; US20110301331A1; KR101516823B1; CN103073639A; IL194120A; KR20080113241A; EA015992B1; SG170750A1; US20080050370A1; BRPI0709598A8; JP2009531028A; US7960142B2; MX2008011874A; IL194120A0; US20090048122A1; US7951918B2; NZ591252A; WO2007109254A2

Abstract

<B>COMPOSIçõES DE POLIPEPTìDEOS ESTABILIZADOS.<D> A presente invenção refere-se, no mínimo em parte, ao desenvolvimento de moléculas de ligação estabilizadas que consistem em ou compreendem uma scFv estabilizada e métodos para preparar similares moléculas estabilizadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕESDE POLIPEPTÍDEOS ESTABILIZADOS".

Pedido de Patente Relacionados

O pedido de patente reivindica o benefício de prioridade para osseguintes Pedidos de patente provisória dos Estados Unidos, cada um dosquais é por este incorporado por meio de referência em sua totalidade paratodos os fins:

1) Pedido de patente provisória dos Estados Unidos N260/783,622, depositado em 17 de março de 2006, intitulado "STABILIZEDPOLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASINGTHE STABILITY OF SAME"

2) Patente de patente provisória dos Estados Unidos N260/812.688, depositado em 9 de junho de 2006, intitulado "STABILIZEDPOLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASINGTHE STABILITY OF SAME"

3) Pedido de patente provisória dos Estados Unidos N260/873.502, depositado em 8 de dezembro de 2006, intitulado "METHODSFOR EVALUATING AND ENHANCING BIOPHYSICAL PROPERTIES OFPOLYPEPTIDES"

4) Pedido de patente provisória dos Estados Unidos N260/873.996, depositado em 8 de dezembro de 2006, intitulado "STABILIZEDPOLYPEPTIDE COMPOSITIONS".

O conteúdo de quaisquer patentes, Pedidos de patente, e refe-rências citadas do início ao fim deste relatório descritivo são por este incor-poradas por meio de referência em suas totalidades.

Antecedentes da Invenção

A estabilidade protéica é atualmente reconhecida como um pro-blema central para o desenvolvimento e aumento em escala de proteínas,por exemplo, moléculas de anticorpos. As seqüências de domínio variável decadeia pesada e leve de anticorpos estão sob pressão seletiva e podem variarsignificativamente em seqüência de um anticorpo para outro (Wu e Kabat, 1970).

Há um grande número de genes de cadeia pesada variável de linha germinalfuncional (-40; Tomlinson et al., 1992; Tomlinson et al., 1994; Matsuda e Honjo,

1996), variável kappa (-40; Meindl et al., 1989; Cox et al., 1994; Barbie eLefranc, 1998) e variável lâmbda (-30; Williams et al., 1996; Kawasaki, et al.,

1997) embutidos dentro do genoma humano. A capacidade do sistema imu- ne para criar muitas combinações de linhas germinais de domínio variável decadeia pesada e de cadeia leve é um mecanismo para criar diversidade deanticorpos (Edelman, 1959; Franek, 1961). Diversidade adicional é derivadapela inserção de uma região de peptídeo de ligação variável, o peptídeo deligação J (mais peptídeo de ligação D para cadeias pesadas), entre os do-mínios variáveis e os domínios constantes (Leder, 1982). Subseqüente àseleção de anticorpos de linha germinal contra um antígeno específico, célu-las B expressando um único anticorpo com linhas germinais de domínio va-riável selecionado e peptídeos (D-)J-conectivos sofrem o processo de muta-ção hipersomática dentro dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve para aumentar a afinidade de anticorpo para o antígeno (Leder, 1982; To-mlinson et al., 1996). Inserções ou eliminações hipersomáticas dentro dosdomínios variáveis também são comumente observadas, embora em umafreqüência muito menor do que a mutação hipersomática (de Wildt et al.,1999). Portanto, um anticorpo maduro selecionado contra um antígeno em particular terá seqüências de domínio variável altamente únicas as quais nãosão necessariamente otimizadas para estabilidade.

Estabilidade pobre pode afetar a capacidade de um anticorpo oudomínio de anticorpo dobrar adequadamente quando expressada em váriossistemas celulares, por exemplo, em sistemas de expressão bacteriana ou mamífera. Dobramento incorreto ou estabilidade pobre também podem re-sultar em populações fracionadas de material não-funcional (Martsev et al.,

1998) e/ou anticorpos com a tendência para formar grandes agregados solú-veis os quais são potencialmente perigosos ou imunogênicos quando usa-dos terapeuticamente. Outros problemas de estabilidade incluem redobra- mento impedido, degradação, avidez prejudicada, agregação, ou perda deatividade depois de armazenamento.

Problemas de estabilidade não estão limitados a anticorpos queocorrem naturalmente, mas podem ocorrer em moléculas de ligação antigê-nica produzidas por engenharia genética também, tais como bibliotecas deanticorpos recombinantes (Hoogenboom, 2005), fragmentos de anticorpos(Holt et al., 2003; Todorovska et al., 2001; Worn and Plückthun, 2001; Reitere Pastan, 1996) e anticorpos terapêuticos engenheirados genética ou huma-nizados para fins de fabricação e clínicos (Ewert et al., 2004; Carter andMerchant, 1997). Além disso, formas multivalentes de anticorpos, tais comomoléculas biespecífica podem ter problemas de estabilidade. Apesar de an-ticorpos biespecíficos serem desejáveis devido a sua utilidade terapêuticaem seres humanos, sua produção é imprevisível. Por exemplo, anticorposbiespecíficos podem resultar em substancial redução na estabilidade térmi-ca, produção de produto, ou na formação de agregados de baixo peso mole-cular.

Alterações não naturais para os domínios VH e Vl também po-dem surgir ao humanizar anticorpos de roedores. Geralmente a humaniza-ção é realizada enxertando regiões determinantes de complementaridade(CDRs) de roedores sobre o domínio variável de linha germinal humanamais similar (Hurle e Gross, 1994). As linhas germinais escolhidas para hu-manização podem não ser usadas com grande freqüência pelo sistema imu-ne e freqüentemente são necessárias alterações dentro das estruturas hu-manas para obter adequada ligação antigênica.

Proteínas instáveis sofrem de muitos problemas, incluindo umou mais de: inadequabilidade para aumentar em escala a produção em bior-reatores (por exemplo, devido ao baixo rendimento, níveis significativos de subprodutos indesejados tais como produto não reunido, e/ou material agre-gado), dificuldades em purificação de proteína, e inadequabilidade para pre-paração farmacêutica e uso (por exemplo, devido a níveis significativos deprodutos de decomposição, qualidade pobre do produto, e/ou propriedadesfarmacocinéticas desfavoráveis). A instabilidade dentro dos domínios variá-veis de anticorpos, Fabs, Fvs, ou Fvs de cadeia única (scFvs) pode resultarem muitos destes problemas. Construtos de scFv em particular têm demons-trado problemas com estabilidade, solubilidade, expressão, agregação, pro-dutos de decomposição, e manufaturabilidade global tanto em sistemas deexpressão bacterianos quanto em mamíferos (vide Worn e Pluckthun, 2001).Adicionalmente, a incorporação de moléculas scFv em produtos de anticor-pos recombinantes estáveis de modo diverso freqüentemente confere estestraços geralmente indesejáveis ao novo desenho recombinante.

Por conseguinte, existe a necessidade de métodos aprimoradospara prever a estabilidade de proteínas, tais como anticorpos, e para molé-culas de ligação de antígeno estáveis aprimoradas que são adequadas paraprodução escalável. Também existe a necessidade de métodos aprimoradosque possibilitem a produção escalável de uma população de moléculas deligação de antígeno estáveis que são adequadas para aplicações farmacêu-ticas.

Sumário da Invenção

A invenção se baseia, no mínimo em parte, no desenvolvimentode composições de polipeptídeos aprimoradas, por exemplo, moléculas deligação aprimoradas, compreendendo ou consistindo em moléculas scFvcom aprimorada estabilidade e métodos para preparar as mesmas.

Em um aspecto, a invenção pertence a uma população de molé-culas scFv estabilizadas, em que as moléculas scFv estabilizadas compre-endem

i) um Iigante de scFv interposto entre um domínio Vh e um do-mínio VL, em que os domínios VH e Vl são encadeados por uma ligação dis-sulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um aminoácido no domínio VL)e em que os domínios VH e Vl das moléculas scFv têm valores de Tm demais de 55°C; ou

ii) um Iigante de scFv interposto entre um domínio Vh e um do-mínio VL, em que os domínios VH e Vl são encadeados por uma ligação dis-sulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um aminoácido no domínio VL,e em que moléculas scFv têm uma T50 de mais de 49°C.

Em outro aspecto, a invenção pertence a molécula scFv estabili-zada em que a molécula scFv estabilizada compreende

a. um ligante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos (Gly4Ser)n interposta entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domíniosVH e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre o aminoácido 44de Vh e o aminoácido 100 de VL;

ii) um domínio Vh e um domínio Vl em que a molécula tem nomínimo uma substituição selecionada entre um grupo consistindo em:

a) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 13 de VH;

b) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH;

c) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 46 de VL;

d) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 49 de VL;

e) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;

f) substituição de aminoácidos nas posições de Kabat 49 e 50 de

VL;

ou

j)

g) subst

h) subst

i) substsubst

k) subst

I) subst

m) subst

n) subst

o) subst

p) subst

q) subst

r) subst

s) subst

t) subst

u) subst

tuição de aminoácido na posição de Kabat 101 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 20 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 48 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 3 de VL;tuição de aminoácido na posição de Kabat 55 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 67 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 6 de VH ;tuição de aminoácido na posição de Kabat 32 de VHtuição de aminoácido na posição de Kabat 49 de VHtuição de aminoácido na posição de Kabat 43 de VHtuição de aminoácido na posição de Kabat 72 de VH ;tuição de aminoácido na posição de Kabat 79 de VH;tuição de aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;tuição de aminoácido na posição de Kabat 75 de VL;tuição de aminoácido na posição de Kabat 80 de VH;

v) substituição de aminoácido na posição de Kabat 83 de VH;

iii) um domínio Vh e um domínio Vl com uma interface esta-bilizada entre VH e VL da scFv em que a molécula tem no mínimo umasubstituição em uma posição de aminoácido diretamente dentro da interfacee/ou em uma posição de aminoácido que estruturas a interação entre VH eVL1 em que a no mínimo uma posição de aminoácido é selecionada entreum grupo consistindo em: 47H, 37H, 45H, 46H, 51 Η, 59H, 109H, 14H, 26H,27H, 40H, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H, 79H, 82bH, 8H, 32H, 39H, 41H1 62H, 85H, 91 Η, 24H, 60H, 37L, 36L, 44L,59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L,98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L, e 104L, de acordo com a numeração de Kabat,e em que a molécula scFv estabilizada tem uma T50 maior do que a de umamolécula scFv carecendo da substituição.

Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula scFvestabilizada compreendendo um Iigante de scFv (Gly4 Ser)4 interposto entreum domínio Vh e um domínio Vl, em que os domínios VH e Vl são encadea-dos por uma ligação dissulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um a-minoácido no domínio VL.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma molécula scFvestabilizada compreendendo um domínio Vh e um domínio Vl em que a mo-lécula tem no mínimo uma série de substituições selecionadas entre o grupoconsistindo em:

a) uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH, por exemplo, com um glutamato ou glutamina e uma substituição deum aminoácido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina;

b) uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16de VH, por exemplo, com um glutamato ou glutamina; uma substituição deum aminoácido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina;e uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 55 de VH, porexemplo, com uma glicina; e

c) uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16de VH, por exemplo, com um glutamato ou glutamina; uma substituição deum aminoácido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina; uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 55 de VH, por e-xemplo, com uma glicina; e substituição de um aminoácido na posição deKabat 101 de VH, por exemplo, com um ácido aspártico.Em outra modalidade, a molécula scFv estabilizada tem umaestabilidade equivalente a de um fragmento Fab convencional sob condiçõesde estímulo térmico.

Em uma modalidade, a estabilidade é avaliada medindo a capa-cidade para ligar a uma molécula alvo.

Em uma modalidade, a molécula scFv compreende uma se-qüência de aminoácidos codificados por uma seqüência de nucleotídeos se-lecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs:9, 14, 16, e 18.

Em uma modalidade, a molécula scFv compreende uma se-qüência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ IDN0s:10, 15, 17, e 19.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma proteína defusão compreendendo uma molécula scFv estabilizada.

Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende no míni-mo dois sítios de ligação antigênica.

Em outro aspecto, a invenção pertence a uma população de mo-léculas de ligação de antígenos multivalentes estabilizadas, em que as mo-léculas de ligação estabilizadas compreendem no mínimo uma moléculascFv estabilizada compreendendo um Iigante de scFv interposto entre umdomínio Vh e um domínio VL, em que os domínios VH e Vl são encadeadospor uma ligação dissulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um amino-ácido no domínio Vl, e em que a população de moléculas de ligação estabi-lizadas compreendem proteínas solúveis monoméricas das quais não maisde 10% está presente em forma agregada.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação de antígenos mul-tivalentes estabilizadas são expressadas em células CHO ou NSO.

Em outro aspecto, a invenção pertence a uma população de mo-léculas de ligação de antígenos multivalentes estabilizadas, em que cadamolécula de ligação de antígeno multivalente compreende

i) no mínimo uma molécula scFv compreendendo um Iigante descFv interposto entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domíniosVH e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoácido nodomínio Vh e um aminoácido no domínio VL, e em que os domínios VH e Vlda no mínimo uma molécula scFv têm uma Tm de mais de 55°C; ou

ii) no mínimo uma molécula scFv compreendendo um Iigante descFv interposto entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domíniosVH e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoácido nodomínio Vh e um aminoácido no domínio VL, e em que a no mínimo uma mo-lécula scFv da molécula de ligação de antígeno multivalente tem uma T50 demais de 49°C.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma molécula deligação de antígenos multivalentes estabilizada compreendendo

i) no mínimo uma molécula scFv estabilizada, em que a molécu-la scFv estabilizada compreende um Iigante de scFv (Gly4 Ser)n interpostoentre um domínio Vh e um domínio Vl e em que os domínios VH e Vl sãoencadeados por uma ligação dissulfeto;

ii) no mínimo uma molécula scFv estabilizada compreendendoum ligante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos (Gly4 Ser)n interpostoentre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domínios VH e Vl são en-cadeados por uma ligação dissulfeto entre o aminoácido 44 de Vh e o ami-noácido 100 de VL;

iii) no mínimo uma molécula scFv estabilizada, em que a molé-cula scFv estabilizada compreende no mínimo uma substituição selecionadaentre um grupo consistindo em:

a) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 13 de VH;

b) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH;

c) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 46 de VL;

d) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 49 de VL;

e) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;

f) substituições de aminoácidos nas posições de Kabat 49 e 50 de VL;

g) substituição de aminoácido na posição de Kabat 101 de VH;

h) substituição de aminoácido na posição de Kabat 20 de VH;

i) substituição de aminoácido na posição de Kabat 48 de VH;j) substituição de aminoácido na posição de Kabat 3 de VL;k) substituição de aminoácido na posição de Kabat 55 de VH;I) substituição de aminoácido na posição de Kabat 67 de VH;m) substituição de aminoácido na posição de Kabat 6 de VH;n) substituição de aminoácido na posição de Kabat 32 de VH;o) substituição de aminoácido na posição de Kabat 49 de VH;p) substituição de aminoácido na posição de Kabat 43 de VH;q) substituição de aminoácido na posição de Kabat 72 de VH;r) substituição de aminoácido na posição de Kabat 79 de VH;s) substituição de aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;

t) substituição de aminoácido na posição de Kabat 75 de VL;u) substituição de aminoácido na posição de Kabat 80 de VH;v) substituição de aminoácido na posição de Kabat 83 de VH; ouiv) um domínio Vh e um domínio Vl com uma interface estabili-zada entre VH e VL da scFv em que a molécula tem no mínimo uma substi-tuição em uma posição de aminoácido diretamente dentro da interface e/ouem uma posição de aminoácido que estruturas a interação entre VH e VL,em que a no mínimo uma posição de aminoácido é selecionada entre umgrupo consistindo em: 47H, 37H, 45H, 46H, 51 Η, 59H, 109H, 14H, 26H, 27H,40H, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H, 79H,82bH, 8H, 32H, 39H, 41 Η, 62H, 85H, 91H1 24H, 60H, 37L, 36L, 44L, 59L,57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L, 98L,58L, 74L, 77L, 83L, 89L, e 104L, de acordo com a numeração de Kabat,

Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula de Iiga-ção de antígenos multivalentes estabilizada compreendendo no mínimo umamolécula scFv estabilizada compreendendo um Iigante de scFv (Gly4 Ser)4interposto entre um domínio Vh e um domínio Vl, em que os domínios VH eVl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoácido no do-mínio Vh e um aminoácido no domínio VL.

ii) no mínimo uma molécula scFv estabilizada compreendendoum Iigante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos (Gly4 Ser)n interpostoentre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domínios VH e Vl são en-cadeados por uma ligação dissulfeto entre o aminoácido 44 de Vh e o ami-noácido 100 de VL; ou

a) substituição de um aminoácido (por exemplo, glutamina) naposição de Kabat 3 de VL, por exemplo, com uma alanina, uma serina, umavalina, um ácido aspártico, ou uma glicina;

b) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina) na po-sição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com leucina;

c) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina) na po-sição de Kabat 49 de VL, por exemplo, com tirosina ou serina;

d) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina ou vali-na) na posição de Kabat 50 de VL1 por exemplo, com serina, treonina, e ar-ginina, ácido aspártico, glicina, ou lisina;

e) substituições de aminoácidos (por exemplo, serina) na posi-ção de Kabat 49 e (por exemplo, serina) na posição de Kabat 50 de VL, res-pectivamente com tirosina e serina; tirosina e treonina; tirosina e arginina;tirosina e glicina; serina e arginina; ou serina e lisina;

f) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 75 de VL, por exemplo, com isoleucina;

g) substituição de um aminoácido (por exemplo, prolina) na po-sição de Kabat 80 de VL, por exemplo, com serina ou glicina;

h) substituição de um aminoácido (por exemplo, fenilalanina) naposição de Kabat 83 de VL, por exemplo, com serina, alanina, glicina, outreonina;

i) substituição de um aminoácido (por exemplo, ácido glutâmi-co) na posição de Kabat 6 de VH, por exemplo, com glutamina;

j) substituição de um aminoácido (por exemplo, lisina) na posi-ção de Kabat 13 de VH, por exemplo, com glutamato;

k) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina) na po-sição de Kabat 16 de VH, por exemplo, com glutamato ou glutamina;I) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 20 de VH, por exemplo, com uma isoleucina;

m) substituição de um aminoácido (por exemplo, asparagina) naposição de Kabat 32 de VH, por exemplo, com serina;

n) substituição de um aminoácido (por exemplo, glutamina) naposição de Kabat 43 de VH, por exemplo, com Iisina ou arginina;

o) substituição de um aminoácido (por exemplo, metionina) naposição de Kabat 48 de VH, por exemplo, com uma isoleucina ou uma glici-na;

p) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina) na po-sição de Kabat 49 de VH, por exemplo, com glicina ou alanina;

q) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 55 de VH, por exemplo, com uma glicina;

r) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 67 de VH, por exemplo, com uma isoleucina ou uma leucina;

s) substituição de um aminoácido (por exemplo, ácido glutâmi-co) na posição de Kabat 72 de VH, por exemplo, com aspartato ou asparagi-na;

t) substituição de um aminoácido (por exemplo, fenilalanina) na posição de Kabat 79 de VH, por exemplo, com serina, valina, ou tirosina; e

u) substituição de um aminoácido (por exemplo, prolina) na po-sição de Kabat 101 de VH, por exemplo, com um ácido aspártico.

Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula de liga-ção de antígeno multivalente compreendendo no mínimo uma molécula scFv estabilizada, em que a molécula scFv estabilizada compreende no mínimouma série de substituições selecionadas entre o grupo consistindo em:

a) uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16de VH, por exemplo, com um glutamato ou glutamina e uma substituição deum aminoácido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina;

c) uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16de VH, por exemplo, com um glutamato ou glutamina; uma substituição deum aminoácido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina;uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 55 de VH, por e-xemplo, com uma glicina; e substituição de um aminoácido na posição deKabat 101 de VH, por exemplo, com um ácido aspártico.

Em uma modalidade, no mínimo uma molécula scFv estabiliza-da é geneticamente fundida a um anticorpo. Em outra modalidade, duas mo-léculas scFv estabilizadas são geneticamente fundidas a um anticorpo.

Em uma modalidade, no mínimo uma molécula scFv estabiliza-da é geneticamente fundida ao término carbóxi da cadeia leve ou pesada doanticorpo.

Em uma modalidade, no mínimo uma molécula scFv estabiliza-da é geneticamente fundida ao término amino de uma cadeia leve ou cadeiapesada do anticorpo.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo um sítio de ligação que liga a uma molécula prefe-rencialmente expressada sobre células de câncer.

Em uma modalidade, o domínio Vh de uma molécula scFv dainvenção é derivado do anticorpo BHA10.

Em uma modalidade, o domínio Vl de uma molécula scFv dainvenção é derivado do anticorpo BHA10.

Em uma modalidade uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo um sítio de ligação que é específico para uma molé-cula selecionada entre o grupo consistindo em HER1, HER3, CD80, CD86,PD-1, CTLA4, B7-H4, RON, CD200, CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR, ummembro da família de receptores TNF, um receptor Tie, MET, IGF1, IGF2,TNF, um Iigante de TNF, IL-6, TWEAK, Fn14, CD20, CD23, CRIPTO, HGF,α4β1 integrina, α5β1 integrina, α6β4 integrina, e οΛ/β6 integrina.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo um sítio de ligação que liga a uma molécula envolvi-da em modulação de reações imunes. Em uma modalidade, a molécula éum receptor de Fc.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo um sítio de ligação que liga a uma molécula envolvi-da em modulação de angiogênese. Em uma modalidade, uma molécula deligação da invenção liga a VEGF ou angiopoitina.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo um sítio de ligação que liga a um alvo neurológico.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção émultiespecífica. Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãoé biespecífica.

Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção ligaa dois membros da família de receptores de TNF. Em uma modalidade, umamolécula de ligação da invenção liga a LTpR e Trail R2. Em uma modalida-de, uma molécula de ligação da invenção compreende uma molécula scFvBHA10 geneticamente fundida a um anticorpo 14A2.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende uma cadeia pesada tendo uma seqüência selecionada entre ogrupo consistindo em SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, e SEQ ID NO:55.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo damolécula de qualquer uma das reivindicações 4 a 8, 11, 12, e 18 a 22.

Em uma modalidade, a invenção pertence a uma molécula deácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos a qual codi-fica a molécula scFv estabilizada ou molécula de ligação compreendendouma molécula scFv estabilizada da invenção.

Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico é em um ve-tor. Em outra modalidade, a invenção pertence a uma célula hospedeiracompreendendo um vetor similar.Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospe-deira mamífera, por exemplo, uma célula CHO ou uma célula NSO.

Em uma modalidade, a invenção pertence a uma população demoléculas de ligação compreendendo moléculas scFv, a população tendo nomínimo 10% menos agregados relativos a uma célula hospedeira a qual ex-pressa uma população de moléculas de ligação compreendendo moléculasscFv convencionais.

Em um aspecto, a invenção pertence a um método para produziruma molécula de ligação estabilizada, compreendendo cultivar uma célulahospedeira sob condições tais que a molécula de ligação estabilizada sejaproduzida.

Em uma modalidade, no mínimo 10 mg da molécula de ligaçãoestabilizada seja produzida para cada litro do meio de cultura de célulashospedeiras e em que não mais de 10% da molécula de ligação está presen-te em forma de agregado.

Em um aspecto, a invenção pertence a método para tratar umsujeito que se beneficiaria de tratamento com uma molécula de ligação dainvenção compreendendo administrar a molécula de ligação ao sujeito de talmodo que ocorre tratamento.

Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de uma doença ouum distúrbio selecionados entre o grupo consistindo em câncer, uma doençaou distúrbio auto-imune, e uma doença ou distúrbio neurológico-

Em um aspecto, a invenção pertence a um método parra estabi-lizar uma molécula scFv compreendendo fundir geneticamente um domínioVh e um domínio Vl usando um Iigante de scFv (Gly4 Ser)n e produzir o do-mínio Vh para compreender uma cisteína no aminoácido 44 e produzir o do-mínio Vl para compreender uma cisteína no aminoácido 100 para formaruma molécula scFv estabilizada.

Em um aspecto, a invenção pertence a um método para produzirum anticorpo multivalente estabilizado compreendendo uma molécula scFvestabilizada, o método compreendendo fundir geneticamente uma moléculascFv estabilizada ao término amino ou ao término carbóxi de uma cadeialeve ou pesada de uma molécula de anticorpo.

Em uma modalidade, a invenção pertence a um método paraproduzir uma molécula scFv estabilizada compreendendo substituir no míni-mo um aminoácido na interface VH/VL da molécula scFv e/ou no mínimo um aminoácido que estruturas a uma ou mais substituições da interface VH/VLda molécula scFv simultaneamente melhoram a estabilidade térmica de am-bos os domínios VH e Vl da molécula scFv comparada com uma moléculascFv convencional.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um método para produzir uma molécula scFv estabilizada compreendendo substituir nomínimo um aminoácido no domínio VH ou domínio VL que covaria com doisou mais aminoácidos na interface entre os domínios VH e VL.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um métodopara produzir uma proteína de fusão estabilizada compreendendo uma mo- lécula scFv compreendendo substituir no mínimo um aminoácido na interfa-ce VH/VL da molécula scFv e/ou no mínimo um aminoácido no estruturaVH/VL da molécula scFv e fundir geneticamente a molécula scFv a um poli-peptídeo para deste modo produzir uma proteína de fusão estabilizada.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um método para melhorar a estabilidade de uma molécula multivalente compreendendono mínimo uma molécula scFv, o método compreendendo introduzir no mí-nimo uma mutação estabilizante em a no mínimo uma molécula scFv paradeste modo melhorar a estabilidade da molécula multivalente.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um método para melhorar a estabilidade de uma molécula scFv compreendendo intro-duzir no mínimo uma mutação estabilizante em a molécula scFv para destemodo melhorar a estabilidade de uma molécula scFv.

Em ainda outro aspecto, a invenção pertence a um método parafabricação em larga scala de uma proteína de fusão estabilizada, o métodocompreendendo:

(a) conduzir um ensaio de estabilidade térmica de uma moléculascFv para determinar a estabilidade térmica de uma molécula scFv candidata;(b) comparar a estabilidade térmica da molécula scFv candidatacom um controle adequado para identificar moléculas scFv estabilizadastendo aumentada estabilidade térmica em relação ao controle,

(c) selecionar as moléculas scFv estabilizadas identificado naetapa (b);

(d) fundir geneticamente no mínimo uma molécula scFv estabili-zada a proteína para formar uma proteína de fusão estabilizada;

(e) transfectar uma célula hospedeira mamífera com uma molé-cula de ácido nucléico codificando a proteína de fusão estabilizada,

(g) cultivar a célula hospedeira da etapa (f) sob condições taisque a proteína de fusão estabilizada é expressada;

em que a proteína de fusão estabilizada é expressada com nãomais de 10% de agregação de proteína quando cultivada em 10 L ou maisde meio de cultura.

Em ainda outro aspecto, a invenção pertence a um método paradeterminar a estabilidade térmica de uma dobra de proteína a partir de umpolipeptídeo da superfamília de imunoglobulinas (Ig) compreendendo umaseqüência candidata de aminoácidos, o método compreendendo as etapasde:

a) proporcionar um alinhamento de uma série de referência cu-rada de seqüências correspondentes a uma dobra de Ig do polipeptídeo;

b) calcular a covariação entre resíduos aminoácidos das se-qüências do alinhamento para gerar dados de covariação;

c) determinar um escore de covariação de seqüência posição-específico para posições de aminoácido dentro da seqüência candidata apartir de covariações dentro dos dados de covariação; e

d) armazenar ou fornecer resultados do escore de covariação deseqüência posição de aminoácido-específico como uma medida da estabili-dade do polipeptídeo.

Em uma modalidade, o método compreende repetir no mínimoas etapas c) e d) para uma pluralidade de polipeptídeos da superfamília deimunoglobulinas (lg). Em ainda outra modalidade, o método compreendeadicionalmente a etapa de selecionar entre a pluralidade de polipeptídeos dasuperfamília de imunoglobulinas (Ig) um polipeptídeo da superfamília das Igpara produção, com base nos escores de covariação posição de seqüênciaespecífica das seqüências candidatas.

Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente aetapa de produzir o polipeptídeo selecionado entre a superfamília das Ig epreparar este para uso terapêutico.

Em outra modalidade, o polipeptídeo da superfamília das Ig de-rivado de uma proteína selecionada entre o grupo consistindo em uma imu-noglobulina ou fragmento de ligação de antígeno da mesma, um receptor deimunoglobulina, uma proteína de adesão celular, uma integrina, um alerge-no, um receptor de células T, e um complexo de histocompatibilidade maior(MHC).

Em uma modalidade, o polipeptídeo da superfamília das Ig éselecionada entre o grupo consistindo em uma região variável de cadeia pe-sada (Vh)1 uma região variável de cadeia leve (VL), e um anticorpo de cadeiaúnica (scFv).

Em outra modalidade, a dobra de Ig é selecionada entre o grupoconsistindo em uma dobra classe V, uma dobra classe I, uma dobra classeC1, e uma dobra classe C2.

Em uma modalidade, a série de referência curada ou o alinha-mento tem uma diversidade de no mínimo 50%.

Em uma modalidade, cada seqüência do alinhamento tem me-nos de 90% de identidade com cada outra seqüência do alinhamento.

Em outra modalidade, no mínimo uma seqüência é de uma es-pécie mamífera e no mínimo uma seqüência é de uma espécie não-mamífera.

Em uma modalidade, a resíduos da seqüência candidata sãoatribuídos escores de covariação posição específicos positivos para satisfa-zer covariações positivas encontradas em posições correspondentes no ali-nhamento.

Em uma modalidade, aos resíduos da seqüência candidata sãoatribuídos escores de covariação posição específicos negativos para satisfa-zer covariações negativas covariações encontradas em posições correspon-dentes no alinhamento.

Em uma modalidade, a covariação positiva tem um coeficientede associação phi (Φ) de cerca de +0,25 a cerca de +1,0.

Em uma modalidade, a covariação negativa tem um coeficientede associação phi (Φ) de cerca de -0,25 a cerca de -1,0.

Em uma modalidade, o alinhamento é selecionado entre o grupoconsistindo em um alinhamento de seqüência à base de estrutura, um ali- nhamento de seqüência à base de seqüência, e um alinhamento estrutural àbase de estrutura.

Em uma modalidade, o escore de covariação posição específicoé determinado para todos os pares de resíduos possíveis em cada posiçãode resíduo do alinhamento.

Em uma modalidade, o alinhamento é obtido (i) gerando ummodelo HMM (Hidden Markov Model) a partir de um alinhamento inicial; (ii)adquirindo seqüências adicionais com o HMM; e (iii) alinhando as seqüên-cias adicionais com o alinhamento inicial.

Em um aspecto, a invenção pertence a um programa de compu- tador ou produto de programa de computador ou meio legível no computadortendo uma série de instruções executáveis por um processador as quaisquando executadas fazem com que o processador realize um método dainvenção.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um progra-ma de computador ou produto de programa de computador ou meio legívelno computador adequado para uso em um dispositivo eletrônico compreen-dendo dados correspondentes ao alinhamento do método da invenção.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um progra-ma de computador ou produto de programa de computador ou meio legível no computador adequado para uso em um dispositivo eletrônico compreen-dendo os dados de covariação de um método da invenção.

Em uma modalidade, a invenção pertence a um dispositivo ar-ranjado para realizar o método da invenção.

Em um aspecto, a invenção pertence a um sistema em um dis-positivo de computação, compreendendo:

(i) um processo de compilação de seqüência inicial;

(ii) uma localização de armazenamento capaz de conterr dadosde seqüência do alinhamento de qualquer uma das reivindicações 58 a 74;

(iii) uma facilidade de análise, a qual analisa programaticamentecovariação entre pares de resíduos dentro do alinhamento para obter dadosde covariação;

(iv) um dispositivo de saída com interface com o referido disposi-tivo eletrônico, o referido dispositivo de saída dando saída aos dados de co-variação referidos.

Em uma modalidade, a invenção pertence a um meio em umdispositivo de computação contendo etapas executáveis para realizar ummétodo compreendendo quaisquer das etapas do método da invenção.

Em ainda outra modalidade, o display de dados de freqüênciade uso de resíduos compreende uma matriz compreendendo (i) posições deresíduos contíguos correspondentes à seqüência de polipeptídeo; e (ii) fre-qüências de uso de resíduos para um tipo de resíduo em cada posição dèresíduo.

Em ainda outra modalidade, a freqüência de uso de resíduos érepresentada simbolicamente.

Em uma modalidade, todos os 20 aminoácidos naturais, interva-los, e resíduos ambíguos são representados. Em uma modalidade, freqüên-cia de uso de resíduos se correlaciona com tamanho do símbolo.

Em uma modalidade, freqüência de uso de resíduos é correla-cionada positivamente com tamanho do símbolo.

Em uma modalidade, (i) as posições de resíduos são apresen-tadas em colunas; e (ii) as freqüências de uso de resíduos são apresentadas em linhas.

Em outra modalidade, covariação entre os resíduos covariantesé representada por um revestimento de rede.Em um aspecto, a invenção pertence a uma interface gráfica dousuário compreendendo um display gráfico de:

(i) um Iayout de grade compreendendo uma coleção de dadosde freqüência de uso de resíduos para uma série de referência de seqüên-cias de polipeptídeos; e

(ii) um revestimento de co-variação.

Em uma modalidade, a interface compreende adicionalmente:(iii) um display de uma seqüência de interesse.

Em um aspecto, a invenção pertence a um método para produzir um poli- peptídeo da superfamília de imunoglobulinas (Ig) com uma propriedade bio-física aprimorada, o referido método compreendendo as etapas de:

b) calcular a covariação entre resíduos das seqüências do ali-nhamento para identificar resíduos covariáveis;

c) substituir um resíduo do polipeptídeo que falha em satisfazeruma covariação com o resíduo covariável encontrado em uma posição cor-respondente no alinhamento.

Em outra modalidade, a propriedade biofísica é selecionada en-tre o grupo consistindo em estabilidade térmica, perfil de desdobramentocom pH, remoção estável de glicosilação, solubilidade, função bioquímica, ecombinações das mesmas.

Em uma modalidade, a função bioquímica é selecionada entre ogrupo consistindo em reconhecimento de um alvo protéico ou uma porçãoquímica, cuja porção química é selecionada entre o grupo consistindo emfosfato, metil, acetil, lipídeo, detergente, íon metálico, halogênio, RNA, DNA1oligonucleotídeo, e oligonucleosídeo.

Em uma modalidade, o polipeptídeo da superfamília das Ig éderivado de uma proteína selecionada entre o grupo consistindo em um anti- corpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um receptor de imu-noglobulina, uma proteína de adesão celular, uma integrina, um alergeno,um receptor de células T, e uma molécula de complexo de histocompatibili-dade maior (MHC).

Em uma modalidade, o polipeptídeo da superfamília das Ig éselecionada entre o grupo consistindo em uma região variável de cadeia pe-sada (Vh), uma região variável de cadeia leve (Vl), e um anticorpo de cadeiaúnica (sFv).

Em uma modalidade, a dobra de Ig é selecionada entre o grupoconsistindo em uma dobra classe V, uma dobra classe I, uma dobra classeC1, e uma dobra classe C2.

Em outra modalidade, o polipeptídeo da superfamília das Ig éum anticorpo modificado selecionado entre o grupo consistindo em um anti-corpo de domínio, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um an-ticorpo monoclonal não-humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo bies-pecífico, um anticorpo contendo scFv, e um anticorpo com domínio eliminado.

Em uma modalidade, os resíduos covariáveis são parte de umacaracterística estrutural selecionada entre o grupo consistindo em uma liga-ção dissulfeto, uma ponte de sal, uma porção de uma superfície ou bolsa deligação de ligante, e uma rede de van Der Waals, ligação hidrogênio, e/ouinterações carga-carga.

Em outra modalidade, a invenção pertence a um método paraproduzir um anticorpo ou anticorpo modificado com uma aprimorada estabili-dade, o referido método compreendendo as etapas de:

a) proporcionar um modelo estrutural de alta resolução de umanticorpo template que é experimentalmente validado como estável;

b) usando o modelo estrutural para identificar uma interfaceVH/VL e/ou resíduo de estruturação de interface no anticorpo modelo;

c) usando um modelo de homologia para identificar um resíduoda interface VH/VL correspondente do anticorpo ou anticorpo modificado queé importante para estabilizar a interface; e

d) substituir o resíduo da interface VH/VL correspondente noanticorpo ou anticorpo modificado com o resíduo da interface da proteínamodelo.Em uma modalidade, o resíduo da interface da proteína modeloencobre no mínimo 10 Á2 de área superficial na interface.

Em uma modalidade, o anticorpo modificado é selecionado entreo grupo consistindo em um anticorpo de domínio, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal não-humano, um anticorpoquimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo contendo scFv, e um an-ticorpo com domínio eliminado.

Em outra modalidade, a invenção pertence a um polipeptídeoproduzido pelo método da invenção.

Em uma modalidade, o polipeptídeo apresenta um aprimora-mento em uma propriedade biofísica selecionada entre o grupo consistindoem estabilidade térmica, perfil de desdobramento com pH, remoção estávelde glicosilação, solubilidade, função bioquímica, e combinações das mes-mas.

Em uma modalidade, a função bioquímica é afinidade ou especi-ficidade de ligação de ligante.

Em outro aspecto, a invenção pertence a um método para pro-duzir uma biblioteca compreendendo moléculas scFv estabilizadas, o méto-do compreendendo:

(a) proporcionar uma série de referência de seqüências corres-pondentes a uma seqüência de domínio variável de uma molécula scFv;

(b) identificar um aminoácido dentro do domínio variável o qualestá ausente ou é encontrado em baixas freqüências em uma posição cor-respondente na série de referência; e

(c) combinar esta informação com dados de covariação sugerin-do que modificar o aminoácido identificado com baixa freqüência na série dereferência pode satisfazer limites de covariação existentes dentro do domíniovariável; e

(d) substituir o aminoácido da etapa (b) com um aminoácido es- tabilizante candidato para deste modo produzir uma biblioteca compreen-dendo moléculas scFv estabilizadas.

Em uma modalidade, o aminoácido da etapa (b) tem uma classi-ficação de consenso de menos de 0,5. Em outra modalidade, o aminoácidoda etapa (b) está presente dentro de menos de 10% das seqüências na sériede referência. Em outra modalidade, o aminoácido da etapa (b) é um resíduonão-consenso.

Em uma modalidade, o aminoácido estabilizante candidato éencontrado em uma posição correspondente dentro da série de referência.

Em ainda outra modalidade, o aminoácido estabilizante candida-to é um aminoácido de consenso.

Em uma modalidade, o aminoácido estabilizante candidato éidentificado por uma análise de uma estrutura 3-D da seqüência de regiãovariável. Em outra modalidade, o aminoácido estabilizante é identificado porum cálculo de recondensação de cadeia lateral.

Em ainda outro aspecto, a invenção pertence a um método paraproduzir uma molécula scFv estabilizada, o método compreendendo:

(a) proporcionar uma biblioteca de scFv designada de acordocom o método da reivindicação 56,

(b) triar a biblioteca de scFv com uma prova de ensaio térmicopara identificar moléculas scFv candidatas,

(c) comparar a estabilidade térmica de uma molécula scFv can-didata da biblioteca de scFv com um controle adequado,por meio do qual um aumento na estabilidade térmica de umamolécula scFv candidata em relação ao controle identifica a molécula scFvcandidata como uma molécula scFv estabilizada.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma molécula scFvestabilizada identificado usando um método da invenção ou uma proteína defusão compreendendo uma molécula scFv estabilizada da invenção.

Em outro aspecto, a invenção pertence a um método para pre-ver a estabilidade de uma proteína candidata compreendendo uma seqüên-cia de aminoácidos tendo seqüências de domínios candidatos, o métodocompreendendo:

(a) proporcionar uma série de referência de seqüências de ami-noácidos correspondentes a uma seqüência de domínio candidato da proteí-na candidata;

(b) determinar freqüências de resíduos em posições de aminoá-cidos individuais dentro da seqüência de domínio de ensaio para obter umaclassificação de consenso; e

(c) usar a classificação de consenso para prever a estabilidadeda proteína candidata, em que a classificação de consenso se correlacionacom a estabilidade da proteína candidata.

Em outro aspecto, a invenção pertence a um método para pre-ver a estabilidade de uma proteína candidata, o método compreendendo:

(a) proporcionar uma série de referência de seqüências corres-pondentes a uma seqüência de domínio de ensaio da proteína candidata;

Em outra modalidade, a invenção pertence a um método paraprever a estabilidade de uma proteína candidata, o método compreendendo:

(b) determinar freqüências de resíduos em posições de aminoá-cidos dentro da seqüência de domínio de ensaio para obter uma classifica-ção de consenso;

(c) determinar freqüências de resíduos em posições de aminoá-cidos correspondentes dentro das seqüências da série de referência paradeterminar uma classificação de consenso média;

(d) comparar a classificação de consenso com a classificação deconsenso média para determinar um escore de seqüência; e

(e) usar o escore de seqüência para prever a estabilidade daproteína candidata, em que a classificação de consenso está correlacionadadiretamente com a estabilidade da proteína candidata.Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um métodopara prever a estabilidade do anticorpo candidato ou anticorpo modificadocandidato, o método compreendendo:

(a) proporcionar uma série de referência de seqüências de do-mínios VH correspondentes a uma seqüência de domínio VH de ensaio doanticorpo ou anticorpo modificado candidato;

(b) determinar freqüências de resíduos em posições de aminoá-cido dentro da seqüência de domínio VH de ensaio para obter uma classifi-cação de consenso;

(d) comparar a classificação de consenso com a classificaçãode consenso média para determinar um escore de seqüência; e

(e) usar o escore de seqüência para prever a estabilidade doanticorpo ou anticorpo modificado candidato, em que a classificação de con-senso está diretamente correlacionada com a estabilidade do anticorpo ouanticorpo modificado candidato.

Em uma modalidade, a série de referência compreende seqüên-cias de proteína de proteínas com a mesma classe de dobra de proteína quea proteína candidata.

Em outra modalidade, a série de referência compreende se-qüências ortólogas.

Em uma modalidade, a série de referência compreende seqüên-cias humanas, por exemplo, seqüências de VH humanas, por exemplo, damesma classe de Kabat.

Em uma modalidade, a série de referência compreende seqüên-cias de linha germinal de VH humano.

Em uma modalidade, a seqüência de domínio de ensaio é umaporção da seqüência de domínio da proteína candidata.

Em uma modalidade, a classificação de consenso é determina-da para cada posição da seqüência de ensaio para obter uma classificaçãode consenso total, em que a classificação de consenso total se correlacionacom a estabilidade da proteína.

Em outra modalidade, a classificação de consenso total é calcu-lada usando a fórmula:

<formula>formula see original document page 27</formula>

em que:

Ci(r) eqüivale à freqüência do resíduo de consenso em uma po-sição de aminoácido da seqüência de consenso,

hi(r) eqüivale à freqüência do resíduo de ensaio de uma posiçãode aminoácido da seqüência de ensaio, e

i eqüivale ao número de posições de aminoácido dentro da se-qüência de ensaio.

Em uma modalidade, a estabilidade da proteína é determinadacomparando a classificação de consenso da proteína candidata com umaclassificação de consenso de um controle adequado.

Em outra modalidade, a estabilidade da proteína é determinadacomparando a classificação de consenso da proteína candidata com a clas-sificação de consenso da proteína candidata perfeita.

Em ainda outra modalidade, a estabilidade é determinada com-parando o escore da seqüência da proteína candidata com um controle ade-quado.

Em outra modalidade, a estabilidade é determinada comparandoo escore da seqüência do anticorpo ou anticorpo modificado candidato comum controle adequado.

Em uma modalidade, a proteína é uma proteína multidomínio, eem que a seqüência de domínio alvo é derivada do domínio menos estávelda proteína multidomínio.

Em ainda outra modalidade, a proteína é um anticorpo modifica-do selecionado entre o grupo consistindo em um anticorpo camelídeo, anti-corpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal não-humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpocontendo scFv, e um anticorpo com domínio eliminado.

Em outra modalidade, a invenção pertence a um método paraselecionar uma proteína candidata para expressão, compreendendo deter-minar a estabilidade da proteína candidata usando o método da invenção,em que a proteína candidata é selecionada para expressão se sua classifi-cação de consenso ou seu escore de seqüência for preditivo de alta estabilidade.

Em outra modalidade, a invenção pertence a um método paraselecionar uma proteína candidata para expressão, compreendendo deter-minar a estabilidade da proteína candidata usando o método da invenção,em que a proteína candidata é selecionada para expressão se seu escore decovariação específico da posição da seqüência for preditivo de alta estabilidade.

Em outra modalidade, a invenção pertence a um método paraselecionar uma seqüência de ensaio de região variável de imunoglobulinaaceitadora para uso na humanização de um anticorpo doador, o métodocompreendendo determinar a estabilidade da seqüência candidata usando ométodo da invenção, em que a seqüência candidata é selecionada se seuescore de seqüência for preditivo de alta estabilidade.

Em ainda outra modalidade, a invenção pertence a um métodopara selecionar uma seqüência de ensaio de região variável de imunoglobu-lina aceitadora para uso na humanização de um anticorpo do doador, o mé-todo compreendendo determinar a estabilidade da seqüência candidata u-sando o método da invenção, em que a seqüência candidata é selecionadade seu escore de covariação posição específica é preditiva de alta estabilidade.

Em outra modalidade, a seqüência de ensaio é uma seqüênciade linha germinal humana.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1A mostra a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 3) codifi-cando um construto BHA10 scFv convencional compreendendo um Iigante(Gly4Ser)3 (indicado em tipo em negrito). A Figura 1B mostra a seqüênciade aminoácidos (SEQ ID NO: 4) do construto BHA10 scFv convencional.

A Figura 2 representa os resultados de medições de calorimetriade varredura diferencial (DSC) com fragmentos Fab ou scFv convencionaispurificados de BHA10. A Figura 2A representa os resultados de um estudo por DSC comparando o desdobramento de fragmentos Fab e scFv conven-cionais de BHA10. A Figura 2B representa os resultados de varreduras porDSC do scFv de BHA10 purificado em taxas de varredura de 1°C/min e2°C/min.

A Figura 3A representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 9) codificando um construto BHA10 scFv estabilizado com VH44/VL100 dissul-feto estabilizado compreendendo um Iigante (Gly4Ser)3 (indicado em tipoem negrito). A Figura 3B mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:10) do construto BHA10 scFv estabilizado com VH44/VL100 dissulfeto. Osresíduos cisteína formando a ligação dissulfeto VH44/VL100 são indicadoem tipo em negrito e em itálico.

A Figura 4A representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 14)codificando um BHA10 scFv estabilizado compreendendo um Iigante(GIy4Ser)4 (indicado em tipo em negrito). A Figura 4B mostra a seqüência deaminoácidos (SEQ ID NO: 15) do construto (GIy4Ser)4 BHA10 scFv. A anota-ção é a mesma que na Figura 4A.

A Figura 5A representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 16)codificando um BHA10 scFv compreendendo um Iigante (GIy4Ser)5 (indicadoem tipo em negrito). A Figura 5B representa a seqüência de aminoácidos(SEQ ID NO: 17) do construto (GIy4Ser)5 BHA10 scFv. A anotação é a mes- ma que na Figura 5A.

A Figura 6 representa os resultados de uma análise WesternBlot para comparar os níveis de expressão de um BHA10 scFv convencional(alameda 1) e as moléculas BHA10 scFv establilizadas da invenção (alame-das 2-4). Cada amostra foi eIetroforesada sob tanto condições redutoras (painel esquerdo) quanto não-redutoras (painel direito).

A Figura 7A representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 18)codificando um BHA10 scFv estabilizado com VH44/VL100 dissulfeto com-preendendo um Iigante (GIy4Ser)4 (indicado em tipo em negrito). A Figura 7Brepresenta a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) do VH44/VL100dissulfeto + BHA10 scFv estabilizado com (GIy4Ser)4. A anotação é a mesmaque na Figura 7A. Os resíduos cisteína formando a ligação dissulfetoVH44/VL1OO são indicados em tipo em negrito e em itálico.

A Figura 8 representa os resultados de uma prova de ensaiotérmico na qual as estabilidades térmicas das moléculas scFv BHA10 estabi-lizadas da invenção foram comparadas com a de uma molécula scFv BHA10convencional. A temperatura na qual 50% das moléculas scFv conservamsua atividade de ligação (T50) é indicada na legenda da figura.

A Figura 9 representa os resultados de análises por Calorimetriade Varredura Diferencial (DSC) realizadas com um BHA10 scFv convencio-nal e um BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv.

A Figura 10 mostra resultados de ligação do corante fluorescen-te hidrofóbico sulfonato de 1-anilino-8-naftalina (ANS) a BHA10 scFv con-vencional, BHA10 (GIy4Ser)4 scFv, e BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv.

A Figura 11 representa os resultados de análise de freqüênciade resíduos dos domínios VH e VL de BHA10. A Figura 11A lista posiçõesde biblioteca de VH de BHA10 para triagem com base em análise de fre-qüência de resíduos de seqüências de domínio variável de IgG. A Figura11B lista posições de biblioteca de VL de BHA10 para triagem com base emanálise de freqüência de resíduos de seqüências de domínio variável de IgG.

A Figura 12 representa os resultados de uma prova de ensaiotérmico na qual foram avaliados os efeitos de estabilizar mutações deBHA10 scFv sobre estabilidade térmica e a aditividade de mutações estabili-zantes. (GS3 deonota (G4S)3 e GS4 denota (G4S)4; SS denota uma ligaçãodissulfeto).

A Figura 13 representa anticorpos biespecíficos LTpR/TRAIL-R2estabilizados exemplares ("Hercules" anticorpos) da invenção. Os anticorposHercules são formados pela fusão de uma molécula scFv de BHA10 estabili-zada da invenção a um anticorpo de IgG 14A2. A molécula scFv pode serfundida ao C-término ou N-término da cadeia pesada (C-Hercules ou Nh-Hercules) ou ao N-término da cadeia leve (NL-Hercules).

A Figura 14 é um diagrama esquemático representando as rea-ções de PCR seqüenciais usadas para fundir BHA10 scFvs convencionais eproduzidos ao término amino (Figura 14A) ou término carboxila (Figura 14B)de uma cadeia pesada 14A2.

A Figura 15A representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 28)de uma cadeia leve 14A2 quimérica compreendendo peptídeo de sinal (sub-linhado). A Figura 15B mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29)de cadeia leve 14A2 quimérica.

A Figura 16 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 30)da cadeia pesada de um BHA10 scFv NH-Hercules convencional.

A Figura 17 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 31) da cadeia pesada de um BHA10 scFv NH-Hercules convencional.

A Figura 18 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 32)da cadeia pesada de um BHA10 scFv (GIy4Ser)4 Nh- Hercules.

A Figura 19 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 33) da cadeia pesada de um BHA10 scFv (GIy4Ser)4 NH-Hercules.

A Figura 20 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 34)da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100 N-Hercules.

A Figura 21 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 35) da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100 Nh-Hercules.

A Figura 22 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 36)da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 NH-Hercules.

A Figura 23 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 37) da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100/(GIy4Ser)4 NH-Hercules.

A Figura 24 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 44)da cadeia pesada de um BHA10 scFv C-Hercules convencional.

A Figura 25 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 45) da cadeia pesada de um BHA10 scFv C-Hercules convencional.

A Figura 26 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 46)da cadeia pesada de um BHA10 scFv (GIy4Ser)4 C- Hercules.A Figura 27 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 47) da cadeia pesada de um BHA10 scFv (GIy4Ser)4 C-Hercules.

A Figura 28 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 48)da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100 C-Hercules.

A Figura 29 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 49) da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100 C-Hercules.

A Figura 30 representa a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 50)da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-Hercules.

A Figura 31 representa a seqüência de aminoácidos (SEQ IDNO: 51) da cadeia pesada de um BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-Hercules.

A Figura 32 mostra resultados de análises Western Blot de anti-corpos biespecíficos C- e Nh- Hercules expressados transitoriamente emcélulas CHO. O painel esquerdo é analisado sob condições não-redutoras eo painel direito sob condições redutoras.

A Figura 33 representa os resultados de um ELISA para avaliara atividade de ligação dos anticorpos Hercules estabilizados da invenção aR2 receptores TRAIL. A Figura 33A representa os resultados com anticorposC-Hercules estabilizados. A Figura 33B representa os resultados com anti-corpos Nh Hercules estabilizados, "wt" é anticorpo Nh Hercules convencio-nal. "GS4" é um anticorpo Nh Hercules establilizado compreendendo um(Gly4Ser)4 scFv estabilizado, "ds" é um anticorpo Nh Hercules estabilizadocompreendendo um scFv estabilizado compreendendo o Iigante de dissulfe-to VH44/VL100.

A Figura 34 representa os resultados de um ELISA para avaliara atividade de ligação dos anticorpos Hercules estabilizados da invenção aLTpR receptores. A Figura 34A representa os resultados com anticorposHercules de C-terminal estabilizados. A Figura 34B representa os resultadoscom anticorpos Nh Hercules estabilizados, "wt" é anticorpo Nh Hercules con-vencional. "GS4" é um anticorpo Nh Hercules estabilizado compreendendoum (GIy4Ser)4 scFv estabilizado, "ds" é um anticorpo Nh Hercules estabiliza-do compreendendo um scFv estabilizadp compreendendo o Iigante de dis-sulfeto VH44/VL100.

A Figura 35 mostra os resultados de análise SEC de anticorposbiespecíficos C-Hercules estabilizados depois de cromatografia de Proteína A.

A Figura 36 representa os resultados de análise SDS-PAGE deanticorpos biespecíficos Hercules estabilizados purificados. A Figura 36Arepresenta resultados com anticorpos biespecíficos NH-Hercules. A Figura36B representa resultados com anticorpos biespecíficos C-Hercules. 5 ug deamostra foram carregados em cada alameda.

A Figura 37 mostra os resultados de análise SEC analítica de anticorpos biespecíficos N-Hercules estabilizados purificados. O Painel Amostra o perfil de N-Hercules com VH44:VL100 BHA10 scFv depois de cro-matografia de Proteína Aeo Painel B depois de SEC do preparativo. O Pai-nel C mostra o perfil de N-Hercules com Vh44:Vl100/(G4S)4 BHA10 scFvdepois de cromatografia de Proteína Aeo Painel D depois de SEC do pre-parativo.

A Figura 38 mostra os resultados de análise SEC analítica deanticorpos biespecíficos C-Hercules estabilizados purificados. O Painel Amostra o perfil de C-Hercules com VH44:VL100 BHA10 scFv depois de cro-matografia de Proteína Aeo Painel B depois de SEC do preparativo. O Pai- nel C mostra o perfil de C-Hercules com VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFvdepois de cromatografia de Proteína Aeo Painel D depois de SEC do pre-parativo.

A Figura 39 mostra resultados de análises por Calorimetria deVarredura Diferencial (DSC) realizadas com C-Hercules com VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFv e C-Hercules com BHA10 scFv convencional.

A Figura 40 representa os resultados de um ELISA para avaliara atividade de ligação biespecífica dos anticorpos Hercules estabilizados dainvenção para TRAIL-R2 e LTpR Ig receptores. "N-"Hercules" Cys e C-"Hercules" Cys são anticorpos Hercules compreendendo scFvs de Nh- ou C- terminal tendo a ligação dissulfeto VH44/VL100. "N-"Hercules"Cys e N-"Hercules" DM" são anticorpos Hercules compreendendo o scFv de Nh- ouC-terminal compreendendo o dissulfeto VH44/VL100 e o Iigante (Gly4Ser)4.O pentâmero CBE11 é um anticorpo controle com atividade de ligação deLTpR monoespecífica.

A Figura 41 representa os efeitos de anticorpos biespecíficos emonoespecíficos N- e C-Hercules estabilizados sobre o crescimento de célulastumorais. As Figuras 41A a 41D representam efeitos sobre o crescimento decélulas tumorais WiDr1 células tumorais Me180, células tumorais MDA231, ecélulas HUVEC, respectivamente.

A Figura 42 representa um diagrama esquemático de um "mini-body" dimérico de duas cadeias estabilizado compreendendo scFvs estabili-zadas. O "minibody" exemplar contém uma primeira porção de cadeia com-preendendo um scFv estabilizado com especificidade de ligação para antí-geno TRAIL R2 e uma segunda porção de cadeia compreendendo um scFvestabilizado com especificidade de ligação para o antígeno LT$R. A orienta-ção dos domínios VH e VL no scFv pode ser alterada e as especificidadesde ligação respectivas podem ser alteradas.

A Figura 43 representa um diagrama esquemático de um "mini-body" tetravalente dimérico de duas cadeias biespecífico estabilizado exem-plar ("minibody" tetravalente N-scFv estabilizado biespecífico) compreen-dendo fragmentos de scFv estabilizado da invenção anexados aos términosamino. O "minibody" tetravalente bivalente estabilizado exemplar contém umprimeira porção de cadeia compreendendo 2 scFvs estabilizados com espe-cificidade de ligação para antígeno TRAIL R2 e uma segunda porção de ca-deia compreendendo 2 scFvs estabilizados com especificidade de ligaçãopara o antígeno LTpR. Outras configurações também são possíveis, por e-xemplo, o "minibody" tetravalente biespecífico também pode ser construídode tal modo que cada porção de cadeia contém 2 fragmentos de scFv esta-bilizados com diferentes especificidades. Em outra modalidade, a orientaçãodos domínios VH e VL no scFv pode ser alterada. Em outra modalidade,menos do que todos os scFvs são estabilizados.

A Figura 44 representa um diagrama esquemático de um "mini-body" tetravalente dimérico de duas cadeias biespecífico estabilizado exem-plar ("minibody" tetravalente C-scFv biespecífico estabilizado) compreen-dendo fragmentos de scFv estabilizado anexados a ambos os términos car-boxila de um "minibody" bivalente. O "minibody" tetravalente bivalente esta-bilizado exemplar contém uma primeira porção de cadeia compreendendo 2scFvs estabilizados com especificidade de ligação para antígeno TRAIL R2 euma segunda porção de cadeia compreendendo 2 scFvs estabilizados comespecificidade de ligação para o antígeno LT3R. Outras configurações tam-bém são possíveis, por exemplo, os minibodies tetravalentes diméricos deduas cadeias biespecíficos também podem ser construídos de tal modo quecada cadeia contém 2 fragmentos de scFv estabilizada com diferentes espe-cificidades. Em outra modalidade, a orientação dos domínios domínios VH eVL no scFv pode ser alterada. Em outra modalidade, menos do que todos osscFvs são estabilizados.

A Figura 45 mostra um diagrama esquemático de um diabodydimérico de quatro cadeias biespecífico estabilizado compreendendo scFvsestabilizados da invenção. Outras configurações também são possíveis, porexemplo, o "minibody" tetravalente dimérico de duas cadeias biespecíficoestabilizado também pode ser construído de tal modo que cada braço con-tém fragmentos de scFv estabilizados com diferentes especificidades. A ori-entação dos domínios VH e VL pode ser alterada. Em outra modalidade,menos do que todos os scFvs são estabilizados.

A Figura 46 mostra um diagrama esquemático de um anticorposcFv tetravalente dimérico de quatro cadeias biespecífico estabilizado (anti-corpo tetravalente C-scFv estabilizado) compreendendo um scFv estabiliza-do anexado ao término carboxila de CH3 e um peptídeo de ligação de articu-lação. A orientação dos domínios VH e VL no scFv estabilizado pode seralterada. Alternativamente, os fragmentos de scFv estabilizados podem seranexados aos términos amino ou das porções de cadeia pesada ou leve pa-ra formar anticorpos tetravalentes Nh-ScFv ou anticorpos tetravalentes Nl-scFv, respectivamente.

A Figura 47 mostra um diagrama esquemático de um anticorpobiespecífico eliminado o domínio CH2 scFv tetravalente de quatro cadeiasestablizado (anticorpo biespecífico eliminado o domínio CH2 tetravalente C-scFv establizado) compreendendo um scFv estabilizado anexado ao términocarboxila de CH3 e um peptídeo de ligação de articulação. Cada cadeia pe-sada porção do anticorpo biespecífico contém uma região Fv com especifici-dade de ligação para o antígeno TRAIL R2 e uma região estabilizada scFvcom especificidade de ligação para o antígeno LTpR. A orientação dos do-mínios VH e VL no scFv estabilizado pode ser alterada e as especificidadesde ligação antigênica respectivas podem ser alteradas. Em outra modalida-de, menos do que todos os scFvs são estabilizados.

A Figura 48 mostra um diagrama esquemático de um anticorpobiespecífico eliminado o domínio CH2 scFv tetravalente de quatro cadeiasestabilizado (anticorpo biespecífico eliminado o domínio CH2 tetravalenteNh-ScFv estabilizado) compreendendo um scFv estabilizado anexado aotérmino amino de VH e compreendendo um peptídeo de ligação de articula-ção. Cada cadeia pesada porção do anticorpo biespecífico contém uma re-gião Fv com especificidade de ligação para o antígeno TRAIL R2 e uma re-gião scFv estabilizada com especificidade de ligação para o antígeno LTpR.A orientação dos domínios VH e VL no scFv estabilizado pode ser alterada eas especificidades de ligação antigênica respectivas podem ser alteradas.Em outra modalidade, menos do que todos os scFvs são estabilizados.

A Figura 49 mostra um diagrama esquemático de um anticorpobiespecífico eliminado o domínio CH2 scFv tetravalente de quatro cadeiasestabilizado (anticorpo biespecífico eliminado o domínio CH2 tetravalenteNl-scFv estabilizado) compreendendo um scFv estabilizado anexado aotérmino amino de VL e compreendendo um peptídeo de ligação de articula-ção. Cada cadeia pesada porção do anticorpo biespecífico contém uma re-gião Fv com especificidade de ligação para o antígeno TRAIL R2 e uma re-gião scFv estabilizada com especificidade de ligação para o antígeno LTpR.A orientação dos domínios VH e VL na scFv estabilizada pode ser alterada eas especificidades de ligação antigênica respectivas podem ser alteradas.Em outra modalidade, menos do que todos os scFvs são estabilizados.

A Figura 50 representa curvas de T50 de BHA10 scFv selvagem(círculos fechados) versus BHA10 scFVs contendo o VL_S46L (Figura 15A,círculos abertos), VH_V55G (Figura 15B, círculos abertos), e VH P101D (cír-culos abertos) (Figura 15C) mutações estabilizantes.

A Figura 51 representa curvas de DSC do VH-(GS)4-VL-6HisBHA10 scFv selvagem (linha cinza) versus BH10 scFvs contendo as muta-ções estabilizantes VL S46L (linha preta) (Figura 51 A) e VH V55G (linha pre-ta) (Figura 51B).

A Figura 52 representa curvas de DSC do VH-(GS)4-VL-6HisBHA10 scFv selvagem (linha cinza) versus a BH10 scFv contendo contendoa mutação estabilizante VH_P101 D (linha preta).

A Figura 53 representa uma análise SDS-Page dos scFvs sel-vagens ("WT (G4S)X3") e mutantes estabilizados. Todos os scFvs mutantescontêm um peptídeo de ligação gly-ser da fórmula (Gly4 Ser)4 entre o VH deN-terminal e o VL de C-terminal ("(G4S)X4") . A identidade da scFv em cadaalameda é representada. As alamedas 12-14 contêm BHA10 scFv tendouma ligação dissulfeto entre VH44 e VL110. A (G4S)X4/dissulfeto scFv esta-bilizada são denotadas 'DM' para 'duplo mutante'. As duas alamedas finaisincluem mutações designadas que também foram estabilizantes para scFvsencadeado a dissulfeto.

A Figura 54A representa curvas de DSC do ("VH-(GS)4-VL-6His") BHA10 scFv selvagem (linha tracejada), scFv mutante VH S16E (linhacinza delgada), scFv mutante VL S46L (linha preta delgada), scFv mutanteVH V55G (linha cinza espessa), e scFv mutante VH P101D (linha preta es-pessa). A Figura 54B representa a fluorescência dependente da temperatu-ra de 10 mM de ANS em PBS (círculos abertos) ou na presença de BHA10scFv selvagem ("VH-(GS)4-VL-6His") (círculos cinzas fechados), scFv mu-tante VH S16E (losangos), scFv mutante VL S46L (quadrados), scFv mutan-te VH V55G (triângulos invertidos), e scFv mutante VH P101D (triângulos).As linhas através das curvas são os ajustes para um modelo de desdobra-mento de dois estados.

A Figura 55 representa fluorescência ANS em 15 °C na presen-ça de scFvs selavgens e mutantes. A fluorescência ANS induzida por cadascFv é plotada contra a TM do domínio VH do mesmo scFv conforme deter-minado por DSC (Figura 55A) e o aumento dependente de temperatura emfluorescência ANS devida à transição de desdobramento de cada scFv (Fi-gura 55B).

A Figura 56 representa cromatografia de exclusão de tamanho(SEC) de altas concentrações de N-Hercules estabilizado (XWU028; BHA10scFv Vh44:Vl1 00/(Gly4Ser)4 N- Hercules; Figura 56A), C-Hercules estabiliza-do (XWU036; (BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-Hercules; Figura 56B)e o anticorpo BHA10 selvagem (Figura 56C) em seis pontos de tempo (T =0, T = 1 semana, T = 2 semanas, T = 1 mo, T = 2 mo, e T = 3 mo) e baixastemperaturas (2 a 8 °C). O eixo χ é tempo (minutos) e o eixo y é mAU (uni-dades de absorvência) em 280 nm. Não foram observadas alterações signi-ficativas no perfil de eluição com o curso de tempo.

A Figura 57 representa análise SDS-PAGE de XWU028 eXWU036 antes e depois de 3 meses de armazenamento em 2 a 8 QC. PainelA. As amostras foram não reduzidas (designadas como "NR"). O MW espe-rado, -200 kDa, é observado para as amostras biespecíficas. BHA10 rodaem seu MW esperado de -150 kDa. As alamedas 1 a 4 são amostrasXWU028. As alamedas 5 a 8 são amostras XWU036. As alamedas 9 a 10são amostras BHA10 de IgG. Painel B. As amostras foram reduzidas comDTT (designadas como "Red" para reduzidas). Os MWs esperados da ca-deia pesada, -75 kDa, e da cadeia leve, -25 kDa, são observados para asamostras biespecíficas sob condições redutoras. As cadeias pesadas e le-ves de BHA10 rodaram em seus MWs esperados de 50 kDa e 25 kDa, res-pectivamente, sob condições redutoras. As alamedas 1, 2, 6, e 7 são amos-tras XWU028. As alamedas 3, 4, 8, e 9 são amostras XWU036. As alamedas5 e 10 são amostras BHA10 de IgG.

A Figura 58 representa análises de massa intacta de XWU028(Painel A) e XWU036 (Painel B) em T = 0, T = 1 mo, e T = 3 mo. Múltiplospicos são observados para cada proteína devido a vários níveis de sialilaçãodos carboidratos N-encadeados no CH2. A distribuição de carboidratos dosbiespecíficos é típica de proteínas IgGI de rotina.

A Figura 59 representa os resultados de um ensaio ELISA san-duíche medindo ligação biespecífica de amostras de soro contendo Herculesde N- terminal (XWU028; Figura 56A) ou Hercules de C- terminal (XWU036;Figura 56B) a TRAIL-R2 e LTpR receptores.

A Figura 60 representa os resultados de um experimento avali-ando a atividade in vivo relativa de anticorpos biespecíficos estabilizados(XWU028 (losangos) e XWU036 (quadrados abertos)), anticorpos biespecífi-cos não estabilizados (hCBE11 (triângulo fechado)) e anticorpos monoespe-cíficos administrados sozinhos (hBHAIO (triângulo invertido) e ch14A2 (lo-sango)) e em combinação (triângulo aberto) contra um modelo de camun-dongo de xenoenxerto tumoral. A dosagem começou no dia 13. hCBE11 v.VC: P < 0,001; hBHAIO v. VC: P < 0,001; ch14A2 v. VC: P < 0,01; Hercules-Il XWU028 v. VC. : P < 0,001; Hercules-Il XWU028 v.hBHAIO: P < 0,05; Her-cules-ll XWU028 v. ch14A2: P < 0,005 ; Hercules-Il XWU036 v. VC: P <0,001; Hercules-Il XWU036 v. hBHAIO: P < 0,01; Hercules-Il XWU036 v.chi 4A2: P < 0,05; combo v. V.C. : P < 0,001

A Figura 61 representa a seqüência de DNA de cadeia pesada(SEQ ID NO: 52) para anticorpo biespecífico C-Hercules BHA10 scFv VhS16E +Vl S46L.

A Figura 62 representa a seqüência de aminoácidos de cadeiapesada (SEQ ID NO: 53) para anticorpo biespecífico C-Hercules BHA10scFv Vh S16E + Vl S46L.

A Figura 63 representa a seqüência de DNA de cadeia pesada(SEQ ID NO: 54) para anticorpo biespecífico C-Hercules BHA10 scFv VH44-VL100/VH S16E + Vl S46L.

A Figura 64 representa a seqüência de aminoácidos de cadeiapesada (SEQ ID NO: 55) para anticorpo biespecífico C-Hercules BHA10scFv Vh44-Vl100/Vh S16E + Vl S46L.

A Figura 65 representa os resultados de cromatografia de exclu-são de tamanho analítica (SEC) de elutriados de Proteína A de sobrenadan-tes contendo C-Hercules com o Vh S16E estabilizado + Vl S46L BHA10scFv (XWU054) e C- Hercules com ("WT") BHA10 scFv convencional.

A Figura 66 representa géis SDS-PAGE de Hercules de C-terminal purificado com o Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv (Figura 66A) eHercules de C-terminal purificado com o Vh44:Vl100/Vh S16E + Vl S46LBHA1 OscFv (Figura 66B).

A Figura 67 mostra os perfis de eluição SEC analítica de Hercu-les de C-terminal com o Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv (Figura 67A) eHercules de C-terminal com o VH44:VL100/VH S16E + Vl S46L BHA10 scFv(Figura 67B) subseqüente à etapa de purificação de proteína A inicial.

A Figura 68 mostra os resultados de provas de proliferação decélulas tumorais in vitro da atividade de Hercules de C-terminal com o VhS16E + Vl S46L BHA10 scFv (XWU054) e Hercules de C-terminal com oVh44:Vi_1 OO/Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv (XWU055). Tanto a célulasMDA231 (Figura 68A) quanto WiDr (Figura 68B) foram administradas anti-corpo. A atividade para ambos os anticorpos Hercules foi comparada comanticorpo biespecífico XWU036 estabilizado e anticorpos monoespecíficoscorrespondentes (hBHAIO e ch14A2) administrados sozinhos ou em combi-nação.

A Figura 69A representa uma curva de desdobramento de DSCde BIIB7 IgGI tomada sob condições idênticas às usadas para os 18 anti-corpos humanos(humanizados) BIIB remanescentes (linha sólida). O Fabindividual, transições CH2 e CH3 aparentes dentro da curva de DSC sãomarcadas e esboçadas com linhas pontilhadas. A Figura 69B representa asdesdobramento curvas de desdobramento de DSC do anticorpo BIIB7 emambos os formatos IgGI e lgG4.

A Figura 70 representa curvas de desdobramento térmico dequatro anticorpos IgGI humanos(humanizados), BIIB16, BIIB6, BIIB4 e Bl-IB1. As transições de desdobramento dos domínios Ch2 e Ch3 para todos osquatro construtos de IgGI são idênticas, enquanto as transições de desdo-bramento de Fab são altamente variáveis.

A Figura 71 representa resultados de classificação de consensopara 182 seqüências de referência de domínio variável de anticorpo humanoe as seqüências de consenso de subclasses individuais. A. Escores de se-qüência subclasse Vh derivadas por análise de freqüência de resíduos con-tra um banco de dados de Vh mamífero. B. Distribuição de escores de se-qüência de Vh de referência selecionada entre NCBI. Escores de seqüênciade Vh são agrupados de acordo com a subclasse. C. Escores de seqüênciade consenso subclasse Vk derivados por análise de freqüência de resíduoscontra um banco de dados de Vk mamífero. D. Distribuição de escores deseqüência de Vk de referência selecionada entre NCBI. Escores de seqüên-cia de Vk são agrupados de acordo com a subclasse.

A Figura 72 representa gráficos bidimensionais comparando es-cores de seqüência para 18 anticorpos BIIB com os Fab TMs corresponden-tes conforme medido por DSC. A Figura 72A representa escores de BIIB1-18Vh plotados contra as TMs de Fab. A identidade de cada ponto pode ser en-contrada na Tabela 20. Os VHs de BIIB15 e BIIB16 contêm inserções / elimi-nações incomuns em suas CDRs. Os resultados para BIIB15 e BIIB16 sãoapresentados como quadrados. A Tm de Bl IB18 foi etiquetada artificialmentecomo 57,2 0C (para combinar a menor Tm medida de BIIB17) uma vez quesua própria Tm foi imensurável devido à falta de expressão. A Tm de BIIB18 éprovavelmente muito menor com base em seu escore de seqüência extre-mamente baixo e sua incapacidade para expressar. Os resultados de Fabpara BIIB18 são apresentados como um triângulo. Os resultados de Vh deanticorpos BIIB restantes são apresentados como círculos. A Figura 72B re-presenta escores de Vk de BIIB1-18 plotados contra as TMs de Fab. Os sím-bolos são os mesmos que descritos para o gráfico (A), exceto que os esco-res são para Vk.

A Figura 73 representa estruturas representativas para a classeV, classe C, e classe I de dobras de Ig.

A Figura 74 representa um histograma das extensões de se-qüência de Dobras de Ig classe V, I, C1, e C2 obtidas da SCOP.

A Figura 75 representa um histograma de coeficientes de corre-lação de valor f calculado para cada combinação de resíduos dentro da sériede dados classe C.

A Figura 76 mostra o resultado da ferramenta visual NAPMAP(NAPMAP Visual Tool) a qual inclui uma porção da plataforma de alinhamen-to soba a qual a análise de covariação é revestida. A plataforma apresentacolunas contendo todos os aminoácidos incluindo intervalos (tipo de resíduo)para cada posição dentro da região V (n2 da posição do resíduo).

A Figura 77 representa um revestimento de estatística de cova-riação de Dobras de Ig sobre o modelo NAPMAP. A seqüência de interesseé mostrada como uma linha curvada através dos aminoácidos relevantes.Covariações são mostradas como barras retas entre os resíduos aminoáci-dos covariáveis relevantes.

A Figura 78 mostra um detalhe da análise de covariação deBHA10 Vl salientando a covariação entre Tyr na posição de Kabat 36 (posi-ção de resíduo n2 48) e a mutação Ser—>Leu na posição de Kabat 46 (posi-ção de resíduo n- 67) conforme descrito no Exemplo 7.

A Figura 79 mostra um detalhe da análise de covariação deBHA10 Vh salientando a covariação conflitante entre Val na posição de Ka-bat 67 (posição de resíduo n- 100), Thr na posição de Kabat 70 (posição deresíduo n2 104), e a mutação Met->Leu na posição de Kabat 80 (posição deresíduo n2 116).

A Figura 80 (SEQ ID NO: 63) mostra a seqüência de DNA defilamento único de anticorpo p5E8 PRIMATIZED® tetravalente de C-terminalde cadeia pesada compreendendo um scFv convencional.

A Figura 81 (SEQ ID NO: 64) mostra a seqüência de aminoáci-dos de anticorpo p5E8 PRIMATIZED® tetravalente de C-terminal de cadeiapesada compreendendo um scFv convencional.

A Figura 82A (SEQ ID NO: 65) mostra a seqüência de DNA defilamento único de cadeia leve p5E8 PRIMATIZED®. Seqüência de peptídeode sinal é mostrada como sublinhada. A Figura 82B (SEQ ID NO: 66) mostraa seqüência de aminoácidos de cadeia leve p5E8 PRIMATIZED®.

A Figura 83A (SEQ ID NO: 67) mostra seqüência de DNA defilamento único de p5E8 (VL/VH) scFv PRIMATIZED® convencional. Se-qüência de peptídeo de sinal é mostrada como sublinhada. A Figura 83B(SEQ ID NO: 68) mostra seqüência de aminoácidos de p5E8 (VL/VH) scFvPRIMATIZED® convencional.A Figura 84A (SEQ ID NO: 69) mostra seqüência de DNA defilamento único de p5E8 (VH/VL) scFv PRIMATIZED® convencional. A Figu-ra 84B (SEQ ID NO: 70) mostra seqüência de aminoácidos de p5E8 (VH/VL)scFv PRIMATIZED® convencional.

A Figura 85 representa curvas T50 de p5E8 (VH/VL) scFv con-vencional (círculos preenchidos) versus p5E8 (VL/VH) scFv convencional(círculos abertos).

A Figura 86 representa os resultados de um experimento avali-ando a atividade in vivo relativa de anticorpos "Hercules-ll" biespecíficos es-tabilizados (XWU036 (círculo fechado)) e anticorpos monoespecíficos admi-nistrados sozinhos (hBHAIO (triângulo fechado invertido) e ch14A2 (losangofechado)) e em combinação (triângulo aberto invertido) contra um modelo decamundongo de xenoenxerto tumoral de câncer de mama humano (MDA-MB-231).

A Figura 87 representa resíduos VH envolvidos em redes deCovariação que são importantes para manutenção de interface (Figura 87A)e resíduos da interface envolvidos em fazer contatos diretos com a interfaceVH/VL e que são mapeados diretamente para a superfície de domínio VH(Figura 87B). Setas indicam posições de resíduos fora da interface real queanálise de covariação informa como sendo importante para estabilizar a inte-ração VH/VL e para estabilidade de VH/VL. A localização de resíduos CDR3hipervariáveis que fazem contatos diretos na interface entre VH e VL sãoencerrados dentro de uma caixa.

A Figura 88 representa resíduos VL envolvidos em redes de Co-variação que são importantes para manutenção de interface (vide a Figura88A) e resíduos da interface envolvidos em fazer contatos diretos com a in-terface VH/VL e que são mapeados diretamente com a superfície de VL (Fi-gura 88B). Setas indicam posições de resíduos fora da interface real queanálise de covariação informa como sendo importante para estabilizar a inte-ração VH/VL e para estabilidade de VH/VL. A localização de resíduos CDR3hipervariáveis que fazem contatos diretos na interface entre VH e VL sãoencerrados dentro de uma caixa.A Figura 89 representa um ambiente exemplar adequado parapraticar uma modalidade da invenção.

A Figura 90 é um fluxograma de uma seqüência exemplar deetapas que podem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modoa determinar um escore de covariação de seqüência que pode ser usadocomo uma medida da estabilidade de um polipeptídeo.

A Figura 91 é um fluxograma de uma seqüência exemplar deetapas que podem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modoa determinar e usar uma classificação de consenso para prever a estabilida-de de uma proteína candidata.

A Figura 92 é um fluxograma de uma seqüência exemplar deetapas que podem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modoa determinar e usar uma classificação de consenso média como uma medi-da da estabilidade de uma proteína candidata.

A Figura 93 é um fluxograma de uma seqüência exemplar deetapas que podem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modoa usar um resíduo substituto de um polipeptídeo para determinar uma se-qüência do polipeptídeo aprimorado.

As Figuras 94A e 94B mostram as seqüências de aminoácidosdo BHA10 scFVs estabilizados contendo a mutação estabilizante S46L(VL)(SEQ ID NO: 137), e a mutação estabilizante V55G(VH) (SEQ ID NO: 138).A mutação estabilizante é indicada pelo resíduo envolvido por caixa. A se-qüência lider, peptídeo de ligação gly/ser, e domínio CH1 são indicados pe-los resíduos sublinhados, em negrito, e em itálico, respectivamente.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção se baseia, no mínimo em parte, no desenvolvimentode moléculas de ligação alvo estabilizadas que consistem em ou compreen-dem uma molécula scFv estabilizada e métodos para preparar similares mo-léculas de ligação estabilizadas. Além disso, a presente invenção proporcio-na métodos para designar proteínas estáveis, tais como moléculas de anti-corpos.

As moléculas scFv estabilizadas da presente invenção são es-pecialmente úteis para produzir moléculas estáveis multiespecíficas, por e-xemplo, moléculas biespecíficas. As moléculas de ligação estabilizadas dainvenção, por exemplo, moléculas de ligação multiespecíficas podem serexpressada estavelmente em cultura, são adequadas para produção em Iar-ga escala, e são estáveis in vivo.

A invenção também se baseou, no mínimo em parte, no desen-volvimento de moléculas de ligação estabilizadas que consistem em oucompreendem uma molécula scFv estabilizada e métodos para preparar si-milares moléculas de ligação estabilizadas. Além disso, a presente invençãoproporciona métodos para designar proteínas estáveis e para prever a esta-bilidade de proteínas, tais como moléculas de anticorpos.

Antes de descrição adicional da invenção, por conveniência,alguns termos são descritos abaixo:

I. Definições

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "molé-cula scFv" inclui moléculas de ligação as quais consistem em um domíniovariável de cadeia leve (VL) ou porção do mesmo, e um domínio variável decadeia pesada (VH) ou porção do mesmo, em que cada domínio variável (ouporção do mesmo) é derivado dos mesmos ou de diferentes anticorpos. Mo-léculas scFv preferencialmente compreendem um Iigante de scFv interpostoentre o domínio VH e o domínio VL. Moléculas scFv são conhecidas na téc-nica e são descritas, por exemplo, na patente dos Estados Unidos N25.892.019, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423;Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. CâncerResearch 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837.

Um "ligante de scFv" conforme usado aqui, neste Pedido de pa-tente, se refere a uma porção interposta entre os domínios VL e VH do scFv.Ligantes de scFv preferencialmente mantêm a molécula scFv em uma con-formação de ligação antigênica. Em uma modalidade, um ligante de scFvcompreende ou consiste de um peptídeo ligante de scFv. Em algumas mo-dalidades, um peptídeo ligante de scFv compreende ou consiste de um pep-tídeo de ligação gly-ser. Em outras modalidades, um ligante de scFv com-preende uma ligação dissulfeto.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "peptí-deo de ligação gly-ser" se refere a um peptídeo que consiste de resíduosglicina e serina. Um peptídeo de ligação gly-ser exemplar compreende a se-qüência de aminoácidos (Gly4 Ser)n. Em uma modalidade, η = 1. Em umamodalidade, η = 2. Em outra modalidade, η = 3. Em uma modalidade prefe-rencial, η = 4, isto é, (Gly4 Ser)4. Em outra modalidade, η = 5. Em ainda outramodalidade, η = 6.

Outro peptídeo de ligação gly-ser exemplar compreende a se-qüência de aminoácidos Ser(GIy4Ser)n. Em uma modalidade, η = 1. Em umamodalidade, η = 2. Em uma modalidade preferencial, η = 3. Em outra moda-lidade, η = 4. Em outra modalidade, η = 5. Em ainda outra modalidade, η = 6.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "ligaçãodissulfeto" se refere à ligação covalente formada entre dois átomos de enxo-fre. O aminoácido cisteína compreende um grupamento tiol que pode formaruma ligação dissulfeto ou ponte com um segundo grupamento tiol.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "molé-cula scFv convencional" se refere a uma molécula scFv a qual não é umamolécula scFv estabilizada. Por exemplo, uma típica convencional carece demutações estabilizantes e compreende um domínio VH e um domínio VLencadeado por um Iigante (G4S)3.

Uma "molécula scFv estabilizada" da invenção é uma moléculascFv compreendendo no mínimo uma mudança ou alteração comparadacom uma molécula scFv convencional a qual resulta em estabilização damolécula scFv. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "mu-tação estabilizante" inclui uma mutação a qual confere reforço da estabilida-de de proteína (por exemplo, estabilidade térmica) à molécula scFv e/ou auma proteína maior compreendendo a referida molécula scFv. Em uma mo-dalidade, a mutação estabilizante compreende a substituição de um aminoá-cido desestabilizante com uma substituição de aminoácido que confere re-forço da estabilidade de proteína (aqui, neste Pedido de patente, um "ami-noácido estabilizante"). Em uma modalidade, a mutação estabilizante é umana qual a extensão de um Iigante de scFv foi otimizada. Em uma modalida-de, uma molécula scFv estabilizada da invenção compreende uma ou maissubstituições de aminoácidos. Por exemplo, em uma modalidade, uma mu-tação estabilizante compreende uma substituição de no mínimo um resíduoaminoácido cuja substituição resulta em um aumento na estabilidade da in-terface de VH e VL de uma molécula scFv. Em uma modalidade, o aminoá-cido está dentro da interface. Em outra modalidade, o aminoácido é um oqual estruturas a interação entre VH e VL. Em outra modalidade, uma muta-ção estabilizante compreende substituir no mínimo um aminoácido no domí-nio VH ou domínio VL que covaria com dois ou mais aminoácidos na interfa-ce entre os domínios VH e VL. Em outra modalidade, a mutação estabilizan-te é uma na qual no mínimo um resíduo cisteína é introduzido (isto é, é pro-duzida em um ou mais dos domínios VH ou VL) de tal modo que os domí-nios VH e VL são encadeados por no mínimo uma ligação dissulfeto entreum aminoácido no domínio VH e um aminoácido no domínio VL. Em algu-mas modalidades preferenciais, uma molécula scFv estabilizada da invençãoé uma molécula na qual tanto a extensão do Iigante de scFv é otimizadaquanto no mínimo um resíduo aminoácido é substituído e/ou os domínios VHe VL são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoácido nodomínio VH e um aminoácido no domínio VL. Em uma modalidade, mais deuma das mutações estabilizantes descritas aqui, neste Pedido de patente,podem ser feitas em uma molécula scFv.

Em uma modalidade, uma ou mais mutações estabilizantes fei-tas a uma molécula scFv simultaneamente melhora a estabilidade térmica deambos os domínios VH e VL da molécula scFv comparada com uma molécu-la scFv convencional.

Preferencialmente, uma população de uma ou mais das molécu-las scFv estabilizadas da invenção é expressada como uma população deproteínas solúveis monoméricas. Em uma modalidade, não mais de 10%está presente em forma agregada. Em uma modalidade, as moléculas scFvestabilizadas da população podem compreender a mesma mutação estabili-zante ou uma combinação de mutações estabilizantes. Em outras modalida-des, as moléculas scFv estabilizadas individuais da população compreen-dem diferentes mutações estabilizantes.

As moléculas scFv estabilizadas em questão podem ser usadassozinhas para ligar a uma molécula alvo ou podem ser encadeadas a outropolipeptídeo para formar moléculas de ligação estabilizadas as quais com-preendem uma molécula scFv estabilizada. Por exemplo, uma molécula deligação da invenção pode compreender uma molécula scFv encadeada auma segunda molécula scFv ou uma molécula não -scFv, por exemplo, queconfere especificidade de ligação alvo, tal como um anticorpo.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "estabi-lidade de proteína" se refere a uma medida reconhecida na técnica da manu-tenção de uma ou mais propriedades físicas de uma proteína em resposta auma condição ambiental (por exemplo, uma temperatura elevada ou reduzi-da). Em uma modalidade, a propriedade física é a manutenção da estruturacovalente da proteína (por exemplo, a ausência de clivagem proteolítica, o-xidação indesejada ou deamidação). Em outra modalidade, a propriedadefísica é a presença da proteína em um estado adequadamente dobrado (porexemplo, a ausência de agregados ou precipitados solúveis ou insolúveis).

Em uma modalidade, a estabilidade de uma proteína é medida avaliandouma propriedade biofísica da proteína, por exemplo, estabilidade térmica,perfil de desdobramento com pH, remoção estável de glicosilação, solubili-dade, função bioquímica (por exemplo, capacidade para ligar a uma proteína(por exemplo, um ligante, um receptor, um antígeno, e etc.) ou porção quí-mica, e etc.), e/ou combinações das mesmas. Em outra modalidade, a fun-ção bioquímica é demonstrada pela afinidade de ligação de uma interação.

Em uma modalidade, uma medida da estabilidade da proteína é estabilidadetérmica, isto é, resistência a estímulo térmico. A estabilidade pode ser medi-da usando métodos conhecidos na técnica e/ou descritos aqui, neste Pedidode patente.

Os domínios VL e VH de uma molécula scFv são derivados deuma ou mais moléculas de anticorpos. Também será entendido por umapessoa versada na técnica que as regiões variáveis das moléculas scFv dainvenção podem ser modificadas de tal modo que variam em seqüência deaminoácidos da molécula de anticorpo da qual foram derivadas. Por exem-plo, em uma modalidade, podem ser feitas substituições de nucleotídeo ouaminoácido levando a substituições conservativas ou alterações em resíduosaminoácidos (por exemplo, em CDR e/ou resíduos de framework). Alternati-vamente ou além disso, podem ser feitas mutações a resíduos aminoácidosde CDR para otimizar a ligação de antígeno usando técnicas reconhecidasna técnica. As moléculas de ligação da invenção mantêm a capacidade deligar a antígeno.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "deri-vado de" uma proteína designada se refere à origem do polipeptídeo. Emuma modalidade, a seqüência de polipeptídeo ou aminoácidos que a qual éderivada de um polipeptídeo de partida em particular é uma seqüência deregião variável (por exemplo, uma VH ou VL) ou seqüência relacionada coma mesma (por exemplo, uma região de framework ou CDR). Em uma moda-lidade, a seqüência de aminoácidos a qual é derivada de um polipeptídeo departida em particular não é contígua. Por exemplo, em uma modalidade,uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis CDRs são derivadas de um anticorpode partida. Em uma modalidade, a seqüência de polipeptídeo ou aminoáci-dos que é derivada de um polipeptídeo de partida em particular ou seqüên-cia de aminoácidos tem uma seqüência de aminoácidos que é essencial-mente idêntica àquela da seqüência de partida ou uma porção da mesma,em que a porção consiste de no mínimo 3 a 5 aminoácidos, 5 a 10 aminoá-cidos, no mínimo 10 a 20 aminoácidos, no mínimo 20 a 30 aminoácidos, ouno mínimo 30 a 50 aminoácidos, ou a qual é identificável de modo diversopara uma pessoa versada na técnica como tendo sua origem na seqüênciade partida.

Uma molécula de ácido nucléico isolada codificando uma molé-cula scFv estabilizada ou uma porção da mesma pode ser criada introduzin-do uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos naseqüência de nucleotídeos de uma molécula scFv convencional ou uma i-munoglobulina da qual é derivada de tal modo que uma ou mais substitui-ções, adições ou eliminações de aminoácidos são introduzidas na proteínacodificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas de rotina, tais co-mo mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Em uma mo-dalidade, substituições de aminoácido conservativas são feitas em um oumais resíduos aminoácidos não-essenciais. Uma "substituição de aminoáci-do conservativa" é uma na qual o resíduo aminoácido é substituído com umresíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduosaminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, in-cluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), ca- deias laterais acidíferas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), ca-deias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glu-tamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (porexemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,triptofano), cadeias laterais β-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, iso- leucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina,triptofano, histidina). Portanto, um resíduo aminoácido é um polipeptídeoimunoglobulina pode ser substtuído com outro resíduo aminoácido da mes-ma família de cadeia lateral. Em outra modalidade, uma cadeia de aminoáci-dos pode ser substituída com uma cadeia estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição de membros da família de cadeia lateral. Emoutra modalidade, uma mutação é introduzida de modo a introduzir no míni-mo uma molécula cisteína no domínio VH e no domínio VL e, deste modo,introduzir uma ligação dissulfeto na molécula scFv. Em outra modalidade,um aminoácido de uma molécula scFv convencional pode ser substituídocom um aminoácido tendo propriedades físicas (por exemplo, espaciais) oufuncionais similares. Preferencialmente, aminoácidos substituídos em molé-culas scFv convencionais são compatíveis com a integridade da interfaceVL/VH, conformações de CDR, e dobramentos Vh e/ou VL.

Alternativamente, em outra modalidade, mutações podem serintroduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da seqüência codifi-cando imunoglobulina.

As moléculas scFv estabilizadas da invenção ou polipeptídeoscompreendendo as moléculas scFv estabilizadas são moléculas de ligação,isto é, ligam a uma molécula alvo de interesse, por exemplo, um antígeno.Quando uma molécula scFv estabilizada da invenção é fundida a uma se-gunda molécula, a segunda molécula também pode conferir uma especifici-dade de ligação à proteína de fusão.

As moléculas de ligação da invenção consistem em moléculasscFv (por exemplo, um domínio VH e um domínio VL ligados por um Iigantede scFv) ou compreendem uma molécula scFv estabilizada da invenção.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação da invenção sãomonovalentes, isto é, compreendem um sítio de ligação alvo (por exemplo,como no caso de uma molécula scFv). Em uma modalidade, as moléculasde ligação da invenção são multivalentes, isto é, compreendem maisd eumsítio de ligação alvo. Em outra modalidade, as moléculas de ligação compre-endem no mínimo dois sítios de ligação. Em uma modalidade, as moléculasde ligação compreendem dois sítios de ligação. Em uma modalidade, as mo-léculas de ligação compreendem três sítios de ligação. Em outra modalida-de, as moléculas de ligação compreendem quatro sítios de ligação. Em outramodalidade, as moléculas de ligação compreendem mais de quatro sítios deligação.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação da invenção sãomonômeros. Em outra modalidade, as moléculas de ligação da invenção sãomultímeros. Por exemplo, em uma modalidade, as moléculas de ligação dainvenção são dímeros. Em uma modalidade, os dímeros da invenção sãohomodímeros, compreendendo duas subunidades monoméricas idênticas.

Em outra modalidade, os dímeros da invenção são heterodímeros, compre-endendo duas subunidades monoméricas não-idênticas. As subunidades dodímero podem compreender uma ou mais cadeias de polipeptídeo. Por e-xemplo, em uma modalidade, os dímeros compreendem no mínimo duascadeias de polipeptídeo. Em uma modalidade, os dímeros compreendemduas cadeias de polipeptídeo. Em outra modalidade, os dímeros compreen-dem quatro cadeias de polipeptídeo (por exemplo, como no caso de molécu-las de anticorpos).Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "valên-cia" se refere ao número de sítios de ligação alvo potenciais em um polipep-tídeo. Cada sítio de ligação alvo liga especificamente uma molécula alvo ousítio específico sobre uma molécula alvo. Quando um polipeptídeo compre-ende mais de um sítio de ligação alvo, cada sítio de ligação alvo pode ligarespecificamente as mesmas moléculas ou diferentes (por exemplo, podeligar a diferentes moléculas, por exemplo, diferentes antígenos, ou diferentesepítopes sobre a mesma molécula).

O termo "especificidade" se refere à capacidade para ligar espe-cificamente (por exemplo, imunorreagir com) um dado alvo. Um polipeptídeopode ser monoespecífico e conter um ou mais sítios de ligação os quais li-gam especificamente um alvo ou um polipeptídeo pode ser multiespecífico(por exemplo, biespecífico ou triespecífico) e conter dois ou mais sítios deligação os quais ligam especificamente os mesmos alvos ou diferentes. Li-gação específica pode ser conferida por uma molécula scFv estabilizada dainvenção e/ou uma porção não scFv à qual uma molécula scFv estabilizadada invenção é ligada.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção émultiespecífica. Por exemplo, em uma modalidade, uma molécula de ligaçãomultiespecífica da invenção é uma molécula biespecífica (por exemplo, anti-corpo, "minibody", anticorpo com domínio eliminado, ou proteína de fusão,anticorpos de domínio único (por exemplo, camelídeos, de tubarão, sereshumanos) compreendendo no mínimo uma molécula scFv estabilizada) ten-do especificidade de ligação para no mínimo dois alvos, por exemplo, maisde uma molécula alvo ou mais de um epítope sohre a mesma molécula alvo.

Em uma modalidade, uma molécula multiespecífica tem no mínimo um sítiode ligação específico para uma molécula orientada para redução ou elimina-ção e uma molécula alvo sobre uma célula. Em outra modalidade, uma mo-lécula multiespecífica tem no mínimo um sítio de ligação alvo específico parauma molécula orientada para redução ou eliminação e no mínimo um sítio deligação específico para um fármaco. Em ainda outra modalidade, uma molé-cula multiespecífica tem no mínimo um sítio de ligação específico para umamolécula orientada para redução ou eliminação e no mínimo um sítio de li-gação específico para um pró-fármaco.

Em uma modalidade, uma molécula multiespecífica compreendeuma especificidade para uma molécula solúvel e uma especifidade para uma molécula da superfície celular. Em outra modalidade, uma molécula multies-pecífica tem duas especificidades de ligação para dois alvos presentes sobreuma ou mais moléculas solúveis. Em outra modalidade, uma molécula multi-específica tem duas especificidades de ligação para dois alvos presentessobre uma ou mais moléculas da superfície celular (as quais podem estarpresentes sobre uma ou mais células).

Em uma modalidade, as moléculas de ligação têm no mínimoum sítio de ligação alvo específico para uma molécula o qual media um efei-to biológico (por exemplo, o qual modula ativação celular (por exemplo, porligação a um receptor da superfície celular e resultando em transmissão ou inibição de um sinal de ativação ou inibitório), o qual resulta em morte dacélula (por exemplo, por um caminho induzido por sinal celular, por fixaçãodo complemento ou exposição a uma carga útil presente sobre a moléculade ligação), ou o qual modula uma doença ou um distúrbio em um sujeito(por exemplo, mediando ou promovendo morte celular, promovendo Iise deum coágulo de fibrina ou promovendo formação de coágulo, ou modulando aquantidade de uma substância a qual está biodisponível (por exemplo, refor-çando ou reduzindo a quantidade de um Iigante tal como TNFG no sujeito)).

Em outra modalidade, as moléculas de ligação da invenção li-gam no mínimo um alvo que transduz um sinal para uma célula, por exem-pio, ligando a um receptor da superfície celular, tal como um receptor da fa-mília de TNF. Por "transduz um sinal" significa que por ligação à célula, amolécula de ligação converte a influência extracelular sobre o receptor dasuperfície celular em uma resposta celular, por exemplo, modulando um ca-minho de transdução de sinal.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação ligam no mínimoum sítio de ligação alvo específico para uma molécula orientada para redu-ção ou eliminação, por exemplo, uma antígeno da superfície celular ou umantígeno solúvel. Em uma modalidade, a ligação da molécula de ligação aoalvo resulta em redução ou eliminação do alvo, por exemplo, de um tecidoou da circulação. Em outra modalidade, as moléculas de ligação têm no mí-nimo um sítio de ligação específico para uma molécula que pode ser usadopara detectar a presença de uma molécula alvo (por exemplo, para detectarum contaminante ou diagnosticar uma condição ou distúrbio). Em ainda ou-tra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende no míni-mo um sítio de ligação que orienta a molécula de ligação para um sítio espe-cífico em um sujeito (por exemplo, para uma célula tumoral ou coágulo san-güíneo).

Em uma modalidade preferencial, uma molécula multiespecíficaé um anticorpo tetravalente que em quatro sítios de ligação. Uma moléculatetravalente pode ser biespecífica e bivalente para cada especificidade. Des-crição adicional de moléculas biespecíficas exemplares é proporcionada a-baixo.

Moléculas de ligação preferenciais da invenção compreendemseqüências de aminoácidos de região de framework e constante derivadasde uma seqüência de aminoácidos humana. No entanto, polipeptídeos deligação podem compreender seqüências de região de framework e/ou cons-tante derivadas de outra espécie mamífera. Por exemplo, moléculas de liga-ção compreendendo seqüências murinas podem ser apropriadsa para algu-mas aplicações. Em uma modalidade, uma região de framework de primata(por exemplo, primata não-humano), porção de cadeia pesada, e/ou porçãode articulação pode ser incluída nas moléculas de ligação em questão. Emuma modalidade, um ou mais aminoácidos murinos podem estar presentesna região de framework de um polipeptídeo de ligação, por exemplo, umaseqüência de aminoácidos de framework de primata humano ou não -humano pode compreender uma ou mais retro mutações de aminoácidosnas quais o resíduo aminoácido murino correspondente está presente e/oupode compreender uma ou mutações para um resíduo aminoácido diferentenão encontrado no anticorpo murino de partida. Moléculas de ligação prefe-renciais da invenção são menos imunogênicas do que anticorpos murinos.Uma proteína de "fusão" ou quimérica compreende uma primei-ra seqüência de aminoácidos encadeada a uma segunda seqüência de ami-noácidos com a qual não é naturalmente encadeado na natureza. As se-qüências de aminoácidos podem existir normalmente em proteínas separad-sa que são trazidas juntas no polipeptídeo de fusão ou podem existir nor-malmente na mesma proteína mas são colocadas em uma nova disposiçãono polipeptídeo de fusão. Uma proteína de fusão pode ser criada, por exem-plo, por síntese química, ou criando e traduzindo um polinucleotídeo no qualas regiões do peptídeo são codificadas na relação desejada.

O termo "heterólogo" conforme aplicado a um polinucleotídeo ouum polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivadode uma entidade genotipicamente distinta daquela da entidade à qual estásendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo heterólogo ou antígenopode ser derivado de uma espécie diferente, tipo celular diferente de um in-divíduo, ou o mesmo tipo de célula ou diferente de indivíduos distintos.

O termo "domínio de ligação de ligante" ou "porção de ligaçãode ligante" conforme usado aqui, neste Pedido de patente, se refere a qual-quer receptor nativo (por exemplo, receptor da superfície celular) ou qual-quer região ou derivado da mesma retendo no mínimo uma capacidade deligação de ligante qualitativa, e preferencialmente a atividade biológica deum receptor nativo correspondente.

O termo "domínio de ligação de receptor" ou "porção de ligaçãode receptor" conforme usado aqui, neste Pedido de patente, se refere a qual-quer ligante nativo ou qualquer região ou derivado da mesma retendo nomínimo uma capacidade de ligação de receptor qualitativa, e preferencial-mente a atividade biológica de um ligante nativo correspondente.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação da invenção sãomoléculas de "anticorpo" ou "imunoglobulina" estabilizadas, por exemplo,moléculas de anticorpo ou imunoglobulina que ocorrem naturalmente (ou umfragmento de ligação de antígeno das mesmas) ou moléculas de anticorposproduzidas geneticamente que ligam antígeno de uma maneira similar a mo-léculas de anticorpos e que compreendem uma molécula scFv da invenção.Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "imunoglobulina"inclui um polipeptídeo tendo uma combinação de duas cadeias pesadas eduas leves quer ou não possua qualquer imunorreatividade específica rele-vante. "Anticorpos" se refere a similares montagens as quais têm atividade imunorreativa específica conhecida significativa para um antígeno de inte-resse (por exemplo, um antígeno associado a tumor). Anticorpos e imuno-globulinas compreendem cadeias leves e pesadas, com ou sem uma ligaçãocovalente intercadeia entre as mesmas. Estruturas de imunoglobulina bási-cas em sistemas de vertebrados são relativamente bem-entendidas.

Conforme será discutido em mais detalhes abaixo, o termo ge-nérico "imunoglobulina" compreende cinco classes distintas desta que po-dem ser distinguidas bioquimicamente. Todas as cinco classes de anticorposestão dentro do âmbito da presente invenção, a seguinte discussão geral-mente será dirigida à classe de moléculas de imunoglobulina IgG. Com res- peito a IgG, imunoglobulinas compreendem duas cadeias de polipeptídeoleves idênticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Dáltons, eduas cadeias pesadas idênticas de peso molecular de 53.000 a 70.000. Asquatro cadeias são ligadas por ligações dissulfeto em uma configuração em"Y" em que as cadeias leves agrupam por meio de chave as cadeias pesa- das iniciando na boca do "Y" e continuando através da região variável.

Tanto as cadeias leves quanto pesadas são divididas em regi-ões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável"são usados funcionalmente. A este respeito, será reconhecido que os domí-nios variáveis tanto das porções de cadeia leve (VL) quanto pesada (VH)determinam reconhecimento e especificidade antigênicos. Ao invés, os do-mínios constantes de cadeia leve (CL) e de cadeia pesada .(CH1, CH2 ouCH3) conferem importantes propriedades biológicas tais como secreção,mobilidade transplacentária, ligação de receptor de Fc, ligação de comple-mento, e similares. Por convenção a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligaçãode antígeno ou término amino do anticorpo. O N-término é uma região variá-vel e no C-término é uma região constante; os domínios CH3 e CL na verda-de compreendem o carbóxi-término da cadeia pesada e leve, respectiva-mente.

Mutações estabilizantes para moléculas scFv podem ser feitas aaminoácidos na CDR e/ou nas regiões de framework de uma cadeia pesadavariável e/ou cadeia leve variável scFv. Conforme usado aqui, neste Pedidode patente, o termo "resíduos aminoácidos de CDR de região variável" incluiaminoácidos em uma CDR ou região determinante de complementaridadeconforme identificado usando métodos à base de seqüência ou estrutura.Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "CDR" ou "regiãodeterminante de complementaridade" significa os sítios combinando antíge-nos não contíguos encontrados dentro da região variável tanto de polipeptí-deos de cadeia pesada quanto leve. Estas regiões particulares foram descri-tas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) e Kabat et al., Se-quences of protein of immunological interest. (1991), e por Chothia et al., J.Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e por MacCaIIum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) onde as definições incluem sobreposição ou subgrupos de resí-duos aminoácidos quando comparados um com o outro. Os resíduos amino-ácidos os quais englobam as CDRs conforme definido por cada uma dasreferências citadas acima são determinados para comparação. Preferenci-almente, o termo "CDR" é uma CDR conforme definido por Kabat com baseem comparações de seqüências.

Definições de CDR

<table>table see original document page 57</column></row><table>

1A numeração de resíduos segue a nomenclatura de Kabat et al., supra

2A numeração de resíduos segue a nomenclatura de Chothia et al., supra

3A numeração de resíduos segue a nomenclatura de MacCaIIum et al., supraConforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "resí-duos aminoácidos de framework (FR) de região variável" se refere aos ami-noácidos na região de framework de uma cadeia de lg. O termo "região deframework" ou "região FR" conforme usado aqui, neste Pedido de patente,inclui o resíduos aminoácidos que são parte da região variável, mas não sãoparte das CDRs (por exemplo, usando a definição de CDRs de Kabat). Por-tanto, um framework de região variável tem entre cerca de 100 a 120 amino-ácidos de extensão mas inclui somente os aminoácidos fora das CDRs. Parao exemplo específico de uma região variável de cadeia pesada e para asCDRs conforme definido por Kabat et al., região de framework 1 correspon-de ao domínio da região variável englobando os aminoácidos 1 a 30; a regi-ão de framework 2 corresponde ao domínio da região variável englobandoos aminoácidos 36 a 49; a região de framework 3 corresponde ao domínioda região variável englobando os aminoácidos 66 a 94, e a região de frame-work 4 corresponde ao domínio da região variável dos aminoácidos 103 àextremidade da região variável. As regiões de framework para a cadeia levesão separadas de modo similar por cada uma das CDRs da região variávelde cadeia leve. De modo similar, usando a definição de CDRs de Chothia etal. ou McCaIIum et al. os limites da região de framework são separados pe-los términos de CDR respectivos conforme descrito acima. Em modalidadespreferenciais, as CDRs são conforme definido por Kabat.

Em anticorpos que ocorrem naturalmente, as seis CDRs presen-tes sobre cada anticorpo monomérico são seqüências de aminoácidos curtase não-contíguas que são posicionadsa especificamente para formar o sítiode ligação antigênica enquanto o anticorpo assume sua configuração tridi-mensional em um ambiente aquoso. O restante dos domínios variáveis decadeia pesada e leve mostram menos variabilidade intermolecular na se-qüência de aminoácidos e são denominados as regiões de framework. Asregiões de framework largamente adotam uma conformação de β-folha e asCDRs formam alças as quais conectam, e em alguns casos formam parte,da estrutura de β-folha. Portanto, estas regiões de framework agem forman-do um estrutura que proporciona posicionamento das seis CDRs em orienta-ção correta por interações intercadeia, não-covalentes. O sítio de ligaçãoantigênica formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície com-plementar ao epítope sobre o antígeno imunorreativo. Esta superfície com-plementar promove a ligação não-covalente do anticorpo ao epítope de antí- geno imunorreativo. A posição de CDRs pode ser prontamente identificadapor uma pessoa com conhecimento regular da técnia.

Conforme previamente indicado, as estruturas de subunidades econfiguração tridimensional das regiões constantes das várias classes deimunoglobulina são de conhecimento geral. Conforme usado aqui, neste Pe- dido de patente, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável de aminoterminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Conforme usado aqui,neste Pedido de patente, o termo "domínio VL" inclui o domínio variável deamino terminal de uma cadeia leve de imunoglobulina.

O termo "fragmento" se refere a uma parte ou porção de um po- lipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou uma cadeia de anticorpo) compre-endendo menos resíduos aminoácidos do que um polipeptídeo intacto oucompleto. O termo "fragmento de ligação de antígeno" se refere a um frag-mento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que liga antígenoou compete com anticorpo intacto (isto é, com o anticorpo intacto do qualforam derivados) para ligação de antígeno (isto é, ligação específica). Con-forme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "fragmento" de uma mo-lécula de anticorpo inclui fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos,por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo (VL), uma cadeia pesada de an-ticorpo (VH), um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento F(ab')2, umfragmento Fab1 um fragmento Fd, um fragmento Fv, e um fragmento de anti-corpo de domínio único (DAb). Fragmentos podem ser obtidos, por exemplo,através de tratamento químico ou enzimático de um anticorpo ou cadeia deanticorpo intacto ou completo ou por meios recombinantes.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "sítio de ligação" compreende uma região de um polipeptídeo a qual é responsávelpor ligar seletivamente a uma molécula alvo de interesse (por exemplo, umantígeno, ligante, receptor, substrato ou inibidor). Domínios de ligação com-preendem no mínimo um sítio de ligação alvo. Domínios de ligação típicosincluem um anticorpo domínio variável, um domínio de ligação de receptorde um ligante, um domínio de ligação de Iigante de um receptor ou um do-mínio enzimático.

Moléculas de ligação da invenção podem ser preparadas usan-do técnicas que são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, os polipep-tídeos da invenção são "produzidos de modo recombinante," isto é, são pro-duzidos usando tecnologia de DNA recombinante. Técnicas típicas para pre-parar similares moléculas são discutidas em mais detalhes abaixo.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção éum anticorpo que ocorre naturalmente ao qual uma molécula scFv estabili-zada foi fundida. Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãoé um anticorpo modificado ao qual uma molécula scFv estabilizada foi fundi-da. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "anticorpo modi-ficado" inclui formas sintéticas de anticorpos as quais são alteraas de talmodo que não ocorrem naturalmente. Em outra modalidade, uma moléculade ligação da invenção é uma proteína de fusão compreendendo no mínimouma molécula scFv.

Em modalidades preferenciais, um polipeptídeo da invenção nãoprovocará um reação imune nociva em um ser humano.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende uma região constante, por exemplo, uma região constante decadeia pesada. Em uma modalidade, uma região constante similar é modifi-cada comparada com uma região constante selvagem. Isto é, os polipeptí-deos da invenção revelados aqui, neste Pedido de patente, podem compre-ender alterações ou modificações para um ou mais dos três domínios cons-tantes de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou para o domínio de regiãoconstante de cadeia leve (CL). Modificações exemplares incluem adições,eliminações ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou maisdomínios. As alterações referidas podem ser incluídas para otimizar a fun-ção efetora, a meia-vida, e etc.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "malig-nidade" se refere a um tumor não-benigno ou um câncer. Conforme usadoaqui, neste Pedido de patente. o termo "câncer" inclui uma malignidade ca-racterizada por crescimento celular desregulado ou descontrolado. Câncerestípicos incluem: carcinomas, sarcomas, leucemias, e linfomas. O termo "cân-cer" inclui tumores malignos primários (por exemplo, aqueles cujas célulasnão migraram para sítios no corpo do sujeito diferentes do sítio do tumor ori-ginal) e tumores malignos secundários (por exemplo, aqueles que surgem demetástase, a migração de células tumorias para sítios secundários que sãodiferentes do sítio do tumor original).

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "enge-nheirado" inclui manipulação de moléculas de polipeptídeo ou ácido nucléicopor meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese depeptídeo in vitro, por ligação enzimática ou química de peptídeos ou algumacombinação destas téncnicas). Preferencialmente, as moléculas de ligaçãoda invenção são preparadas usando os métodos referidos.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, os termos "en-cadeado," "fundido" ou "fusão" são usados de modo intercambiável. Estestermos se referem a unir juntos os dois ou mais elementos ou componentes,por quaisquer meios inclusive conjugação química ou meios recombinantes.Preferencialmente os polipeptídeos os quais são fundidos são fundidos ge-neticamente, isto é, são fundidos usando tecnologia de DNA recombinante.Uma "fusão em estrutura" se refere à união de dois ou mais frames de leituraaberta (ORFs) para formar um ORF contínuo mais longo, em uma maneiraque mantém o frame de leitura correto dos ORFs originais. Portanto, a prote-ína de fusão resultante é uma única proteína contendo dois ou mais seg-mentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelos ORFs origi-nais (cujos segmentos não são normalmente ligados deste modo na nature-za.) Embora o frame de leitura seja portanto preparado contínuo do início aofim dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espa-cialmente separados, por exemplo, por seqüência encadeadora de scFv emestrutura.

No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma"seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma dire-ção de terminal amino para carboxila na qual resíduos que são adjacentesuns aos outros na seqüência são contíguos na estrutura primária do polipep-tídeo.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, a expressão"sujeito que se beneficiaria de administração de uma molécula de ligação"inclui sujeitos, tais como sujeitos mamíferos, que se beneficiaria de adminis-tração de uma molécula de ligação usada, por exemplo, para detecção deum antígeno reconhecido por uma molécula de ligação (por exemplo, para um procedimento diagnóstico) e/ou de tratamento com uma molécula de li-gação para reduzir ou eliminar o alvo reconhecido pela molécula de ligação.Por exemplo, em uma modalidade, o sujeito pode ser beneficiar de reduçãoou eliminação de uma molécula solúvel ou particulada da circulação ou soro(por exemplo, uma toxina ou patógeno) ou de redução ou eliminação de umapopulação de células expressando o alvo (por exemplo, células tumorais).Conforme descrito em mais detalhes aqui, neste Pedido de patente, a molé-cula de ligação pode ser usada em forma não-conjugada ou pode ser conju-gada, por exemplo, para uma porção detectável, um fármaco, pró-farmaco,ou um isótopo.

O termo "receptor de TNF" ou "membro da família de receptoresde TNF" se refere a qualquer receptor pertencente à superfamília de recep-tores de Fator de Necrose Tumoral ("TNF"). Membros da Superfamília deReceptores de TNF ("TNFRSF") são caracterizados por uma região extrace-lular com dois ou mais domínios ricos em cisteína (-40 aminoácidos cada)arranjados como nós de cisteína (vide Dempsey et al., Cytokine Growth Fac-tor Rev. (2003). 14(3-4): 193-209). Na ligação de seus Iigantes de TNF cog-natos, receptores de TNF transduzem sinais interagindo diretamente ou indi-retamente com proteínas adaptadoras citoplasmáticas conhecidas comoTRAFs (fatores associados com receptores de TNF). TRAFs podem induzir aativação de várias cascatas de quinase que essencialmente levam à ativa-ção de caminhos de transdução de sinal tais como NF-KappaB, JNK1 ERK,p38 e PI3K, que por sua vez regulam processos celulares variando de fun-ção imune e diferenciação de tecido até apoptose.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de vários mem-bros da família de receptores de TNF são conhecidas na técnica e incluemno mínimo 29 genes humanos: TNFRSF1A (TNFR1, também conhecido co-mo DR1, CD 120a, TNF-R-I p55, TNF-R1 TNFRI, TNFAR, TNF-R55,p55TNFR, p55R, ou TNFR60, GenBank Gl N- 4507575; vide também US5,395,760)), TNFRSF1B (CD120b, também conhecido como p75, TNF-R,TNF-R-II, TNFR80, TNFR2,TNF-R75, TNFBR , ou p75TNFR; GenBank Gl N24507577), TNFRSF3 (β Receptor de Linfotoxina (LTpR), também conhecidocomo TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, ou TNF-R-III; Gl Nos. 4505038e 20072212), TNFRSF4 (0X40, também conhecido como antígeno ACT35,TXGP1L, ou CD134; Gl Nos. 4507579 e 8926702), TNFRSF5 (CD40, tam-bém conhecido como p50 ou Bp50; Gl Nos. 4507581 e 23312371), TN-FRSF6 (FAS, também conhecido como FAS-R, DcR-2, DR2, CD95, APO-1,ou APT1; GenBank Gl Nos. 4507583, 23510421, 23510423, 23510425,23510427, 23510429, 23510431, e 23510434)), TNFRSF6B (DcR3, DR3;GenBank Gl Nos. 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027,23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037, e 23200039), TN-FRSF7 (CD27, também conhecido como Tp55 ou S152; GenBank Gl N-4507587), TNFRSF8 (CD30, também conhecido como Ki-1, ou D1S166E;GenBank Gl Nos. 4507589 e 23510437), TNFRSF9 (4-1-BB, também co-nhecido como CD137 ou ILA; Gl Nos. 5730095 e 728738), TNFRSF10A(TRAIL-R1, também conhecido como DR4 ou Apo2; GenBank Gl N-21361086), TNFRSF10B (TRAIL-R2, também conhecido como DR5, KIL-LER, TRICK2A, ou TRICKB; GenBank Gl Nos. 22547116 e 22547119), TN-FRSF10C (TRAIL-R3, também conhecido como DcR1, LIT, ou TRID; Gen-Bank Gl N2 22547121), TNFRSF10D (TRAIL-R4, também conhecido comoDcR2 ou TRUNDD), TNFRSF11A (RANK; GenBank Gl N2 4507565; vide asPatentes dos Estados Unidos Nos. 6.562.948; 6.537.763; 6.528.482;6.479.635; 6.271.349; 6.017.729), TNFRSF11B (Osteoprotegerina (OPG),também conhecido como OCIF ou TR1; Gl Nos. 38530116, 22547122 e33878056), TNFRSF12 (Proteína de Membrana de Associação de cadeia deTranslocação (TRAMP), também conhecido como DR3, WSL-1, LARD,WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3, Fn14, ou TWEAKR; GenBank Gl N2 7706186;Publicação do Pedido de patente dos Estados Unidos N2 2004/0033225A1),TNFRSF12L (DR3L), TNFRSF13B (TACI; Gl N2 6912694), TNFRSF13C(BAFFR; Gl N2 16445027), TNFRSF14 (Mediador de Entrada do Herpes Ví-rus (HVEM), também conhecido como ATAR, TR2, LIGHTR, ou HVEA;GenBank Gl Nos. 23200041, 12803895, e 3878821), TNFRSF16 (Receptordo Fator de Crescimento Nervoso de Baixa Afinidade (LNGFR), também co-nhecido como Receptor de Neurotrofina ou p75(NTR); GenBank Gl Nos. 128156 e 4505393), TNFRSF17 (BCM, também conhecido como BCMA; GlN2 23238192), TNFRSF18 (AITR, também conhecido como GITR; GenBankGl Nos. 4759246, 23238194 e 23238197), TNFRSF19 (Troy/Trade, tambémconhecido como TAJ; GenBank Gl Nos. 23238202 e 23238204), TNFRSF20(RELT, também conhecido como FLJ14993; Gl Nos. 21361873 e 23238200), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (SOBa, também conhecido como Tnfrh2 ou2810028K06Rik), e TNFRSF23 (mSOB, também conhecido como Tnfrhl).Outros membros da família de TNF incluem EDAR1 (Receptor de Ectodis-plasina A, também conhecido como Downless (DL), ED3, ED5, ED1R, E-DA3, EDA1R, EDA-A1R; GenBank Gl N2 11641231; Patente dos Estados Unidos N2 6,355,782), XEDAR (também conhecido como EDA-A2R; Gen-Bank Gl N2 11140823); e CD39 (Gl Nos. 2135580 e 765256).

O termo "ligante de TNF" ou "membro da família de Iigantes deTNF" se refere a um ligante pertencente à superfamília de Fator de NecroseTumoral (TNF). Ligantes de TNF ligam a receptores distintos da superfamíliade receptores de TNF e apresentam 15 a 25% de homologia de seqüênciade aminoácidos um com o outro (Gaur et al., Biochem. Pharmacol. (2003),66(8): 1403-8). As seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos de váriosmembros da superfamília de Receptores de TNF (Ligantes) ("TNFSF") sãoconhecidas na técnica e incluem no mínimo 16 genes humanos: TNFSF1 (também conhecido como Linfotoxina-α (LTA), TNFp ou LT, Gl N2: 34444 e6806893), TNFSF2 (também conhecido como TNF, TNFa, ou DIF; Gl N225952111), TNFSF3 (também conhecido como Linfotoxina-β (LTB), TNFC,ou p33), TNFSF4 (também conhecido como OX-40L, gp34, CD134L, ou gli-coproteína 1 ativada tax-transcripcionalmente, 34kD (TXGP1); Gl N-4507603), TNFSF5 (também conhecido como CD40LG, IMD3, HIGM1,CD40L, hCD40L, TRAP1 CD154, ou gp39; Gl N2 4557433), TNFSF6 (tam-bém conhecido como FasL ou APT1LG1; GenBank Gl N- 4557329),TNFSF7 (também conhecido como CD70, CD27L, ou CD27LG; Gl N-4507605), TNFSF8 (também conhecido como CD30LG, CD30L, ou CD153;Gl N2 4507607), TNFSF9 (também conhecido como 4-1BB-L ou ILA ligand;Gl N2 4507609), TNFSF10 (também conhecido como TRAIL, Apo-2L, ouTL2; Gl N2 4507593), TNFSF11 (também conhecido como TRANCE, RAN-KL, OPGL, ou ODF; Gl Nos. 4507595 e 14790152), TNFSF12 (também co-nhecido como Fn14L, TWEAK, DR3LG, ou AP03L; Gl Nos. 4507597 e23510441), TNFSF13 (também conhecido como APRIL), TNFSF14 (tambémconhecido como LIGHT, LTg, ou HVEM-L; Gl Nos. 25952144 e 25952147),TNFSF15 (também conhecido como TL1 ou VEGI), ou TNFSF16 (tambémconhecido como AITRL, TL6, hGITRL, ou GITRL; Gl N2 4827034). Outrosmembros da família de Iigante de TNF incluem Iigante EDAR1 e XEDAR(ED1; Gl N2 4503449; Monreal et al. (1998) Am J Hum Genet. 63:380), Iigan-te Troy/Trade, BAFF (também conhecido como TALL1; Gl N2 5730097), eIigantes NGF (por exemplo, NGF-β (Gl N2 4505391), NGF-2/NTF3; Gl N24505469), NTF5 (Gl N2 5453808)), BDNF (Gl N2s 25306267, 25306235,25306253, 25306257, 25306261, 25306264; IFRD1 (Gl N2 4504607)).

O termo "Tm", também referido como a "temperatura de transi-ção", é a temperatura na qual 50% de uma macromolécula, por exemplo,molécula de ligação, se torna desnaturada, e é considerada como sendo oparâmetro padrão para descrever a estabilidade térmica de uma proteína.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "resí-duo de formação de estruturação" se refere a resíduos aminoácidos ou posi-ções de resíduos que não estão em uma interface (por exemplo, a interfaceVH/VL) mas que são importantes para manter a interface. Estes resíduosaminoácidos não interagem fisicamente com os resíduos da interface sobreo domínio oposto ou contribuem a área superficial para a interface, mas nãoobstante são importantes para proporcionar contexto estrutural adequadopara resíduos da interface. Os resíduos aminoácidos referidos estrutura ainteração entre VH e VL.

Diz-se de duas ou mais posições de resíduos aminoácidos den-tro de uma seqüência de polipeptídeo candidata que normalmente ocorremjuntos que "covariam" ("posições de resíduos covariáveis" ou "posições deresíduos covariantes"). Covariância entre duas ou mais posições de aminoá-cido é observada quando o tipo de aminoácido encontrado em uma primeiraposição de aminoácido é dependente do tipo de aminoácido encontrado emoutra posição de aminoácido. Isto é, quando um aminoácido particular é en-contrado em uma primeira posição dentro de uma seqüência, um segundoaminoácido particular é geralmente encontrado em uma segunda posiçãodentro da seqüência.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "dobrade Ig" inclui um domínio de proteína encontrado em proteínas pertencentes àsuperfamília de proteínas das imunoglobulinas. Conforme é de conhecimen-to geral na técnica, a dobra de Ig é uma característica peculiar da superfamí-lia das imunoglobulinas (vide, por exemplo, Bork, P., Holm, L. & Sander, C.1994. The Immunoglobulin Fold. J. Moi Biol. 242, 309-320). Estruturas típi-cas para cada classe de dobra de Ig são representadas na Figura 73.

II. Moléculas scFv Estabilizadas

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção éuma molécula scFv estabilizada. As moléculas scFv estabilizadas da inven-ção podem compreender um Iigante de scFv interposto entre um domínio Vhe um domínio VL, em que os domínios VH e Vl são encadeados por umaligação dissulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um aminoácido nodomínio VL. Em outras modalidades, as moléculas scFv estabilizadas da in-venção compreendem um Iigante de scFv tendo uma extensão ou composi-ção otimizada. Em ainda outras modalidades, as moléculas scFv estabiliza-das da invenção compreendem um domínio Vh ou Vl tendo no mínimo umaou mais substituições de aminoácido estabilizantes. Em ainda outra modali-dade, uma molécula scFv estabilizada da invenção compreende no mínimoduas das características estabilizantes listadas acima.

As moléculas scFv estabilizadas da invenção têm aprimoradaestabilidade. Em uma modalidade, populações das moléculas scFv estabili-zadas da invenção ou polipeptídeos compreendendo as mesmas são ex-pressados como uma proteína solúvel monomérica da qual é não mais de10% em forma dimérica, tetramérica, ou agregada de modo diverso. Em ou-tra modalidade, populações das moléculas scFv estabilizadas da invençãotêm domínios VH e VL com valores de Tm de mais de 55°C. Em outra moda-lidade, populações das moléculas scFv estabilizadas da invenção têm umaT50 de mais de 49°C. Em outra modalidade, populações das moléculasscFv estabilizadas da invenção têm uma T50 de mais de 40, 41, 42, 43, 44,45, 46, 47, ou 48°C. Em ainda outra modalidade, populações das moléculasscFv estabilizadas da invenção têm uma T50 de mais de 50, 51,v52, 53, 54,55, 56, 57, 58, OU 49°C.

As moléculas scFv da invenção ligam a uma molécula alvo deinteresse. Os domínios VH e VL usados para fabricar um scFv podem serderivados do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. Em outra moda-lidade, um VH ou VL para uso em um scFv estabilizado da invenção podecompreender um ou mais CDRs as quais ligam a um alvo de interesse, en-quanto o restante do domínio VH ou VL é derivado de um anticorpo diferenteou é sintético. Em uma modalidade preferencial, uma molécula de ligação dainvenção compreende no mínimo uma CDR de um anticorpo, por exemplo,um anticorpo conhecido na técnica para ligar a um alvo de interesse. Emoutra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende nomínimo duas CDRs de um dado anticorpo. Em outra modalidade, uma molé-cula de ligação da invenção compreende no mínimo três CDRs de um dadoanticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção com-preende no mínimo quatro CDRs de um dado anticorpo. Em outra modalida-de, uma molécula de ligação da invenção compreende no mínimo cinco C-DRs de um dado anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula de ligaçãoda invenção compreende no mínimo seis CDRs de um dado anticorpo. Emuma modalidade preferencial, uma molécula de ligação da invenção com-preende no mínimo um domínio VH de um anticorpo, por exemplo, um anti-corpo conhecidas na técnica para ligar a um alvo de interesse. Em uma mo-dalidade preferencial, uma molécula de ligação da invenção compreende nomínimo um domínio VL de um dado anticorpo. Em outra modalidade prefe-rencial, uma molécula de ligação da invenção compreende no mínimo umdomínio VH e um domínio VL de um anticorpo conhecido na técnica paraligar um alvo de interesse. Moléculas scFv podem ser construídas em umaorientação VH-Iigante-VL ou orientação VL-ligante-VH.

A estabilidade de moléculas scFv da invenção ou de proteínas de fusão compreendendo as mesmas pode ser avaliada em referência àspropriedades biofísicas (por exemplo, estabilidade térmica) de uma moléculascFv convencional (não-estabilizada) ou uma molécula de ligação compre-endendo uma molécula scFv convencional. Em uma modalidade, as molécu-las de ligação da invenção têm uma estabilidade térmica que é de mais decerca de 0,1, cerca de 0,25, cerca de 0,5, cerca de 0,75, cerca de 1, cercade 1,25, cerca de 1,5, cerca de 1,75, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cer-ca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, ou cerca de 10 grausCelsius do que uma molécula de ligação controle (por exemplo, uma molécu-la scFv convencional). Moléculas scFv estabilizadas da invenção incluemaquelas identificadas usando métodos da invenção conforme descrito naSeção Vlll abaixo.

Em outras modalidades, as moléculas scFv estabilizadas da in-venção compreendem um Iigante de scFv com uma extensão e/ou composi-ção de aminoácidos otimizadas. Ligantes preferenciais de scFv da invençãomelhoram a estabilidade térmica de uma molécula de ligação da invençãopor no mínimo cerca de 2°C ou 3°C comparada com uma molécula de liga-ção convencional. Em uma modalidade, uma molécula de ligação da inven-ção tem uma estabilidade térmica aprimorada de 1 °C comparada com umamolécula de ligação convencional. Em outra modalidade, uma molécula deligação da invenção tem uma estabilidade térmica aprimorada de 2 °C com-parada com uma molécula de ligação convencional. Em outra modalidade,uma molécula de ligação da invenção tem uma estabilidade térmica aprimo-rada de 4, 5, 6 0C comparada com uma molécula de ligação convencional.Podem ser feitas comparações, por exemplo, entre as moléculas scFv dainvenção e moléculas scFv preparadas usando métodos da técnica anteriorou entre moléculas scFv e fragmentos fab de um anticorpo a partir do qual foram derivados os VH e VL de scFv. A estabilidade térmica pode ser medi-da usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalida-de, pode ser medida a Tm. Métodos para medir Tm e outros métodos paradeterminar a estabilidade protéica são descritos em mais detalhes abaixo.

Em uma modalidade, o Iigante de scFv consiste da seqüência de aminoácidos (GIy4Ser)4 ou compreende uma seqüência (GIy4Ser)4. Ou-tros Iigantes exemplares compreendem ou consistem em seqüências(GIy4Ser)3 e (GIy4Ser)5. Ligantes de scFv da invenção podem ser de exten-sões variáveis. Em uma modalidade, um Iigante de scFv da invenção tem apartir de cerca de 5 a cerca de 50 aminoácidos de extensão. Em outra mo- dalidade, um Iigante de scFv da invenção tem a partir de cerca de 10 a cercade 40 aminoácidos de extensão. Em outra modalidade, um Iigante de scFvda invenção tem a partir de cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos de ex-tensão. Em outra modalidade, um Iigante de scFv da invenção tem a partirde cerca de 17 a cerca de 28 aminoácidos de extensão. Em outra modalida- de, um Iigante de scFv da invenção tem a partir de cerca de 19 a cerca de26 aminoácidos de extensão. Em outra modalidade, um Iigante de scFv dainvenção tem a partir de cerca de 21 a cerca de 24 aminoácidos de exten-são.

Ligantes scFv podem ser introduzidos em seqüências de poli- peptídeos usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, em umamodalidade, pode ser usada mutagênese de PCR. Modificações podem serconfirmadas por análise de seqüência de DNA. DNA de plasmídeo pode serusado para transformar células hospedeiras para produção dos polipeptí-deos estáveis produzidos.

Em algumas modalidades, as moléculas scFv estabilizadas dainvenção compreendem no mínimo uma ligação dissulfeto a qual liga umaminoácido no domínio VL com um aminoácido no domínio VH. Resíduoscisteína são necessários para proporcionar ligações dissulfeto. Ligações dis-sulfeto podem ser incluídsa em uma molécula scFv da invenção, por exem-plo, para conectar FR4 de VL e FR2 de VH ou para conectar FR2 de VL eFR4 de VH. Posições típicas para ligação dissulfeto incluem: 43, 44, 45, 46,47, 103, 104, 105, e 106 de VH e 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100, e 101 deVL, numeração de Kabat. Combinações típicas de posições de aminoácidosos quais são mutados para resíduos cisteína incluem: VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99,VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44, e VH103-VL45.

Em uma modalidade, uma ligação dissulfeto liga o aminoácido44 de Vh e o aminoácido 100 de VL.

Modificações dos genes os quais codificam os domínios VH eVL podem ser realizadas usando técnicas conhecidas na técnica, por exem-plo, mutagênese sítio-dirigida.

Em uma modalidade, uma molécula scFv estabilizada da inven-ção compreende um Iigante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos(Gly4 Ser)4 interposto entre um domínio Vh e um domínio Vl, em que os do-mínios VH e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um amino-ácido no domínio Vh na posição do aminoácido 44 e um aminoácido no do-mínio Vl na posição do aminoácido 100.

Em outras modalidades as moléculas scFv estabilizadas da in-venção compreendem uma ou mais mutações estabilizantes dentro de umdomínio variável (VH ou VL) do scFv. Em uma modalidade, a mutação esta-bilizante é selecionada entre o grupo consistindo em:

d) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina ou vali-na) na posição de Kabat 50 de VL, por exemplo, com serina, treonina, e ar-ginina, ácido aspártico, glicina, ou iisina;

e) substituições de aminoácidos (por exemplo, serina) na posi-ção de Kabat 49 e (por exemplo, serina) na posição de Kabat 50 de VL, res-pectivamente com tirosina e serina; tirosina e treonina; tirosina e arginina;tirosina e glicina; serina e arginina; ou serina e Iisina;

j) substituição de um aminoácido (por exemplo, Iisina) na posi-ção de Kabat 13 de VH, por exemplo, com glutamato;

k) substituição de um aminoácido (por exemplo, serina) na po-sição de Kabat 16 de VH, por exemplo, com glutamato ou glutamina;

l) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 20 de VH, por exemplo, com uma isoleucina;

q) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 55 de VH, por exemplo, com uma glicina;r) substituição de um aminoácido (por exemplo, valina) na po-sição de Kabat 67 de VH, por exemplo, com uma isoleucina ou uma leucina;

s) substituição de um aminoácido (por exemplo, ácido glutâmi-co) na posição de Kabat 72 de VH, por exemplo, com aspartato ou asparagina;

t) substituição de um aminoácido (por exemplo, fenilalanina) naposição de Kabat 79 de VH, por exemplo, com serina, valina, ou tirosina; e

Em uma modalidade exemplar, uma molécula scFv estabilizadada invenção compreende duas ou mais das mutações estabilizantes descri-tas em a) a u) acima. Em uma modalidade exemplar, uma molécula scFvestabilizada da invenção compreende uma substituição de um aminoácidona posição de Kabat 49 de VL1 por exemplo, com tirosina ou serina e umasubstituição de um aminoácido na posição de Kabat 50 de VL, por exemplo,com, treonina, e arginina, ácido aspártico, glicina, ou lisina. Em outra moda-lidade exemplar, uma molécula scFv estabilizada da invenção compreendeuma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH, por e-xemplo, com um glutamato ou glutamina e uma substituição de um aminoá-cido na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina. Em outramodalidade uma molécula de ligação da invenção compreende uma substi-tuição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH, por exemplo, comum glutamato ou glutamina; uma substituição de um aminoácido na posiçãode Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina; e uma substituição de umaminoácido na posição de Kabat 55 de VH, por exemplo, com uma glicina.Em outra modalidade uma molécula de ligação da invenção compreendeuma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH, por e-xemplo, com um glutamato ou glutamina; uma substituição de um aminoáci-do na posição de Kabat 46 de VL, por exemplo, com uma lisina; uma substi-tuição de um aminoácido na posição de Kabat 55 de VH, por exemplo, comuma glicina; e substituição de um aminoácido na posição de Kabat 101 deVH, por exemplo, com um ácido aspártico. Em outra modalidade, uma molé-cuia de ligação da invenção compreende uma substituição de um aminoáci-do na posição de Kabat 6 de VH1 por exemplo, com glutamina. Em outramodalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma substi-tuição de um aminoácido na posição de Kabat 13 de VH, por exemplo, comglutamato. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 deVH, por exemplo, com glutamato ou glutamina. Em outra modalidade, umamolécula de ligação da invenção compreende uma substituição de um ami-noácido na posição de Kabat 20 de VH, por exemplo, com uma isoleucina;Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreendeuma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 32 de VH, por e-xemplo, com serina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da in-venção compreende uma substituição de um aminoácido na posição de Ka-bat 43 de VH, por exemplo, com Iisina ou arginina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma substituição de umaminoácido na posição de Kabat 48 de VH, por exemplo, com uma isoleuci-na ou uma glicina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da inven-ção compreende uma substituição de um aminoácido na posição de Kabatsubstituição 49 de VH, por exemplo, com glicina ou alanina. Em outra moda- lidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma substituiçãode um aminoácido na posição de Kabat 55 de VH, por exemplo, com umaglicina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção com-preende uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 67 de VH,por exemplo, com uma isoleucina ou uma leucina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma substituição de umaminoácido na posição de Kabat 72 de VH, por exemplo, com aspartato ouasparaginas. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende uma substituição de um aminoácido na posição de Kabat 79 deVH, por exemplo, com serina, valina, ou tirosina. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma substituição de um ami-noácido na posição de Kabat 101 de VH, por exemplo, com um ácido aspár-tico.Em outra modalidade exemplar, uma molécula scFv estabilizadada invenção compreende uma ou mais das substituições de aminoácidosestabilizantes descritas aqui, neste Pedido de patente, e um Iigante de scFvcom uma extensão ou composição otimizada (por exemplo, (GIy4Ser)4). Emoutra modalidade exemplar, uma molécula scFv estabilizada da invençãocompreende uma ou mais das substituições de aminoácidos descritas aqui,neste Pedido de patente, e uma ligação dissulfeto a qual liga um aminoácidono domínio VL com um aminoácido no domínio VH (por exemplo, VH44-VL100). Em ainda outra modalidade exemplar, uma molécula scFv estabili-zada da invenção compreende uma ou mais das substituições de aminoáci-dos descritas aqui, neste Pedido de patente, um Iigante de scFv com umaextensão ou composição otimizada (por exemplo, (GIy4Ser)4), e uma ligaçãodissulfeto a qual liga um aminoácido no domínio VL com um aminoácido nodomínio VH (por exemplo, VH44-VL100).

Moléculas estabilizadas scFv podem ser expressadas usandotécnicas reconhecidas na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, molé-culas similares podem ser expressadas usando um vetor de expressão a-propriado para expressão em um sistema de expressão celular, por exem-plo, um sistema de expressão bacteriano ou mamífero.

Em uma modalidade, moléculas scFv podem ser expressadasem E. coli, por exemplo, usando um vetor apropriado para expressão peri-plásmica. Seqüências adicionais podem ser incluídas para otimizar expres-são, por exemplo, uma seqüência de sinal e/ou uma etiqueta para facilitarpurificação e/ou detecção do scFv.

Em uma modalidade, aditivos, tais como 1 a 2% de triton (porexemplo, triton x-100) ou 1 a 2% de glicina ou uma combinação dos mesmos(por exemplo, 1% de glicina e 1% de triton) podem ser adicionados para faci-litar secreção do periplasma para o meio.

III. Métodos para Prever / Determinar Estabilidade de Proteína

Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos para pre-ver, a priori, problemas biofísicos potenciais com proteínas selecionadas pa-ra expressão em grande escala, por exemplo, proteínas terapêuticas ou en-zimas industriais. Em alguns aspectos típicos, os métodos da invenção pos-sibilitam que uma pessoa versada na técnica evite expressar seqüências deproteínas que são previstas para terem estabilidade inerentemente pobrequando expressadas de modo recombinante, por exemplo, em células ma-míferas. Em aspectos alternativos, os métodos da invenção podem ser em-pregados para identificar uma variante de uma seqüência de proteína que éprevista para ter propriedades biofísicas aprimoradas, incluindo, mas nãolimitadas a aprimorada estabilidade, aprimorada estabilidade para alteraçõesno pH, e função bioquímica reforçada.

Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos computa-cionais para prever uma propriedade biofísica de (por exemplo, estabilidadetérmica) algumas proteínas candidatas, ou uma variante de seqüência ouhomólogo da mesma, com base na seqüência de polipeptídeo (por exemplo,seqüência de aminoácidos) da proteína candidata. Em outros aspectos, osmétodos da invenção empregam modelagem estrutural para prever a estabi-lidade da proteína candidata ou para identificar homólogos ou variantes daproteína candidata com estabilidade típica conhecida que podem ser usadospara melhorar a estabilidade de uma proteína candidata, por exemplo, umamolécula scFv.

a. Análise da Covariacão

Em alguns aspectos típicos, a invenção proporciona um métodocomputacional aprimorado denominado "análise de covariação" para preveruma propriedade biofísica (por exemplo, estabilidade protéica). Conformeusado aqui, neste Pedido de patente, "análise de covariação" se refere a ummétodo computacional para identificar duas ou mais posições de resíduosaminoácidos dentro de uma seqüência de polipeptídeo candidata que nor-malmente ocorrem juntos, ou covariam, em homólogos da seqüência candi-data (aqui, neste Pedido de patente, "posições de resíduos covariáveis" ou"posições de resíduos covariantes"). Covariância entre duas ou mais posi-ções de aminoácido é observada quando o tipo de aminoácido encontradoem uma primeira posição de aminoácido é dependente do tipo de aminoáci-do encontrado em outra posição de aminoácido. Isto é, quando um aminoá-cido em particular é encontrado em uma primeira posição dentro de uma se-qüência, um segundo aminoácido em particular é geralmente encontrado emuma segunda posição dentro da seqüência.

Como resíduos covariantes são prováveis de terem coevoluídos,uma observação de covariação indica que a compatibilidade de resíduosaminoácidos presentes em posições normalmente covariáveis é provávelque seja importante por razões funcionais ou estruturais. Por conseguinte, ométodo de covariação da invenção pode ser usado para identificar um oumais resíduos covariáveis ou grupos de resíduos (por exemplo, pares deresíduos covariáveis) dentro de uma seqüência de polipeptídeo (por exem-plo, uma seqüência de polipeptídeo candidata). Conforme usado aqui, nestePedido de patente, um "resíduo covariável" (também denominado um "resí-duo encadeado") é um aminoácido o qual é estatisticamente prevalente emuma posição de resíduo covariável dentro de uma seqüência de polipeptídeo.

Em algumas modalidades, os métodos de covariação da inven-ção podem ser usados para identificar importantes resíduos funcionais emuma seqüência candidata. Além disso, como o número de resíduos covariá-veis dentro de um polipeptídeo candidato é preditivo de sua estabilidade, ométodo de covariação da invenção pode ser usado para prever a estabilida-de da proteína candidata.

Em algumas outras modalidades, os métodos de covariação dainvenção podem ser empregados para orientar designs de proteínas comêxito. Em uma modalidade típica, o método de covariação da invenção podeser usado para identificar covariáveis aminoácidos dentro de uma seqüênciacandidata. Caso presentes, os resíduos covariáveis são preferencialmenteretidos durante engenharia subseqüente da seqüência de proteína. Em outramodalidade exemplar, os métodos de covariação da invenção podem serusado para identificar as posições de aminoácido de resíduos não-covariáveis dentro de uma seqüência de polipeptídeo candidata em que a-minoácidos correspondentes em outras proteínas (por exemplo, proteínascorrespondentes às seqüências de uma série de referência) são normalmen-te aminoácidos covariáveis. Uma vez identificados, resíduos não-covariáveispodem ser substituídos (por exemplo, usando metodologia de DNA recombi-nante) com resíduos covariáveis correspondentes para reforçar a função oumelhorar as propriedades biofísicas (por exemplo, estabilidade) da seqüên-cia de polipeptídeo candidata.

Posições de resíduos covariantes podem ser identificadas poruma análise estatística (por exemplo, uma análise de correlação) de posi-ções de resíduos dentro de um banco de dados de seqüências de polipeptí-deos relacionadas (por exemplo, uma série de referência alinhada ou ali-nhamento de múltiplas seqüências). Em modalidades preferenciais, a análi-se de covariação envolve uma comparação estatística de seqüências de po-lipeptídeos candidatas contra uma banco de dados curados de diversas se-qüências de polipeptídeos tendo a mesma dobra estrutural (por exemplo,uma dobra de Ig).

Na nova análise de covariação descrita aqui, neste Pedido depatente, as seguintes etapas básicas são tomadas para prever a estabilida-de de um polipeptídeo candidato:

1. Proporcionar uma série de seqüências homólogas (aqui,neste Pedido de patente, uma "série de referência") correspondentes a umaseqüência de um polipeptídeo candidato ou um domínio ou porção da mes-ma (aqui, neste Pedido de patente, uma "seqüência de domínio de ensaio").

2. Alinhar a seqüências da série de referência para gerar umasérie alinhada de seqüência homóloga (aqui, neste Pedido de patente, uma"série alinhada).

3. Determinar covariação entre duas ou mais posições de resí-duos (por exemplo, no mínimo um par de aminoácidos) dentro da série dereferência para gerar dados de covariação ou uma série de dados de covari-ação ("série de dados de covariação").

4. Usar os dados de covariação para prever a estabilidade dopolipeptídeo candidato.Etapa 1: Proporcionar uma Série de Referência

Os métodos de covariação da invenção empregam uma série dede seqüências (uma "série de referência") as quais são homólogas a (isto é,relacionadas com) uma seqüência de interesse ou "seqüência de ensaio". A série de referência pode compreender uma série de seqüências homólogastendo grau moderado a elevado de similaridade com a seqüência de ensaio.Em algumas modalidades, as seqüências homólogas da série de referênciatêm um grau moderado a elevado de similaridade das seqüências de amino-ácidos. Em modalidades mais preferenciais, as seqüências homólogas dasérie de referência têm um grau moderado a elevado de similaridade estrutu-ral. Em modalidades ainda mais preferenciais, as seqüências homólogas dasérie de referência têm um grau elevado de similaridade estrutural (por e-xemplo, elas partilham no mínimo um domínio ou dobra de proteína). A sériede seqüências homólogas não precisa ser grande, na medida que seja obti- da uma seleção razoavelmente não tendenciosa.

Em modalidades exemplares, o método de covariação da inven-ção emprega uma série de referência curada. Conforme usado aqui, nestePedido de patente, o termo "série de referência curada" se refere a uma sé-rie de referência na qual seqüências de componentes foram eliminadas ou seqüências adicionais adicionadas de acordo com alguns critérios de sele-ção. Por conseguinte, enquanto uma referência não curada é gerada porseleção não tendenciosa de seqüências de componentes, um banco de da-dos curado é gerado por seleção tendenciosa. Por exemplo, a série de refe-rência de seqüências homólogas pode ser selecionada para eliminar algu- mas seqüências, por exemplo, seqüência redundante. Alternativamente, umbanco de dados curado pode ser expandido, por exemplo, para incluir umnúmero adequado de seqüências não-redundantes ou não-idênticas.

Em algumas modalidades, o banco de dados curado compreen-de no mínimo cem seqüências (por exemplo, 100, 150, 200, 250, 300, 400,500, 750, ou mais seqüências). Em uma modalidade, o banco de dados cu-rado compreende no mínimo mil seqüências (por exemplo, 1000, 2000,3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, ou mais seqüências). Em outramodalidade, o banco de dados curado compreende no mínimo dez mil se-qüências (por exemplo, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 250.000, 500.000,750.000 ou mais seqüência. Em uma modalidade o banco de dados curadocompreende no mínimo 1 milhão de seqüências individuais (por exemplo, 1milhão, 2 milhões, 5 milhões, 10 milhões, ou mais seqüências).

Em modalidades preferenciais, o método de covariação da in-venção emprega uma série de referência curada tendo no mínimo 50% dediversidade (por exemplo, no mínimo 60%, no mínimo 70%, no mínimo 75%,no mínimo 80%, no mínimo 90%, no mínimo 95% de diversidade, no mínimo97%, no mínimo 98%, no mínimo 99% ou mais de diversidade) de modo aminimizar covariações artificiais ou não-informativas. Conforme usado aqui,neste Pedido de patente, o termo "% de diversidade" se refere à percenta-gem de seqüências na série de referência que são não-redundantes ou não-idênticas. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "não re-dundante" se refere a uma seqüência a qual tem menos de 100% de identi-dade de seqüência com cada outra seqüência na série de referência, isto é,uma seqüência a qual difere no mínimo em uma posição de aminoácido decada outra seqüência na série de referência. Em algumas modalidades, umaseqüência da série de referência tem menos de 99%, menos de 95%, menosde 90%, ou menos de 85% de identidade de seqüência com cada outra se-qüência na série de referência. Em modalidades preferenciais, uma seqüên-cia da série de referência tem menos de 80% de identidade de seqüênciacom cada outra seqüência na série de referência (por exemplo, menos de75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, ou menos de 50% deidentidade de seqüência). Em modalidades particularmente preferenciais,cada seqüência da série de referência tem menos de de 80% de identidadede seqüência com cada outra seqüência na série de referência. Em modali-dades exemplares, as seqüências da série de referência são curadas para adiversidade preferencial usando uma ferramenta de filtração a qual selecionaseqüências contendo tipos de seqüências mais comuns (por exemplo, umaferramenta de classificação de Henikoff). Quando duas seqüências têm ex-tensão igual, classificação pr peso de Henikoff assegura que seqüênciascom tipos de resíduos raros são retidos enquanto seqüências com tipos deresíduos mais comuns são descartados (Henikoff et ai, J. Mol. Biol., 243:574-578(1994)).

Em outras modalidades preferenciais, a série de referênciacompreende seqüências codificadas por genes os quais são não evolucio-narmente próximos de genes codificando outras seqüências no banco dedados. Por exemplo, para aumentar a diversidade, a série de referência po-de compreender uma ou mais seqüências ortólogas, que é uma seqüência aqual é de uma espécie diferente (por exemplo, espécie mamífera diferente))mas a qual tem a mesma função bioquímica ou similar. Em uma modalidadetípica, a série de referência pode compreender uma seqüência humana e nomínimo uma seqüência não humana (por exemplo, uma seqüência de mamí-fero não-humano). Em outra modalidade exemplar, a série de referência po-de compreender no mínimo uma seqüência para uma espécie mamífera (porexemplo, um ser humano, chimpanzé, cão, vaca, porco, gato, rato/ou ca-mundongo) e no mínimo uma seqüência não-mamífera (por exemplo, umaseqüência de vertebrado não-mamífero (por exemplo, uma seqüência deteleósteo ou avícola), uma seqüência de invertebrado (por exemplo, umaseqüência de inseto (por exemplo, Drosophila) ou de nematódeo (por exern-pio, C. elegans)), ou uma seqüência fúngica, de planta, bacteriana, ou viral).Em outras modalidades, a série de referência pode compreender uma oumais seqüências parálogas, que é seqüências da mesma espécie que umaprimeira seqüência, mas a qual tem a mesma função bioquímica ou similar.

Em ainda outras modalidades, as seqüências da série de refe-rência têm acima de um determinado limiar de extensão. Preferencialmente,as seqüências da série de referência têm no mínimo 20 resíduos de exten-são (por exemplo, 25, 30, ou 40 resíduos de extensão). Mais preferencial-mente, as seqüências da série de referência têm no mínimo 50 resíduos deextensão (por exemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 resíduos de exten-são). Ainda mais preferenciais são seqüências de no mínimo 100 resíduosde extensão (por exemplo, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, ou maisresíduos de extensão). Em modalidades exemplares, as seqüências da sériede referência são curadas para a extensão preferencial por filtração usandouma ferramena de filtração (por exemplo, uma contagem de resíduo semintervalos). Classificação por contagem de resíduo sem intervalos decres-cente assegura que seqüências mais curtas (por exemplo, seqüências comintervalo) sejam filtradas sobre seqüências mais longas.

As seqüências podem ser obtidas através de estudos de homo-logia baseada em seqüência para quaiquer dos bancos de dados de se-qüências conhecidos na técnica (por exemplo, bancos de dados NCBI, Tl-GR). Em uma modalidade exemplar, um estudo BLAST de rotina com parâ-metros padrão pode ser realizado com a seqüência de ensaio para recuperarseqüências homólogas de interesse. Seqüências com uma percentagemmínima de identidade de seqüência (por exemplo, mais de 25%, 30%, 35%,40%, 45% ou 50% de identidade de seqüência, preferencialmente mais de30% de identidade de seqüência) com a seqüência de ensaio podem serselecionadas para inclusão na série de referência.

Em algumas modalidades preferenciais, a série de referência écurada para compreender seqüências de proteínas tendo a mesma classede dobra de proteína (por exemplo, proteínas tendo SH3, TPR, GPCR, seri-na protease, aspartil protease, globina, imunoglobulina, ou outras dobras).Proteínas similares ou estruturas podem ser identificadas e coletadas pormeio de técnicas de bioinformática conhecidas na técnica (por exemplo, serpesquisadas à base de estrutura usando o banco de dados de domínio con-servado dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (CDD, Con-served Domain Database, National Institutes of Health), ou pesquisando obanco de dados ASTRAL ou o banco de dados de proteína RCSB (PDB)usando uma classificação SCOP desejada). Preferencialmente, as seqüên-cias são derivadas de proteínas cujas estruturas tridimensionais foram solvi-das em alta resolução, por exemplo, por cristalografia de raios X.

Em modalidades preferenciais, seqüências correspondentes aestruturas coletadas são filtradas usando técnicas reconhecidas na técnicapara remover estruturas categorizadas erroneamente, incompletas, redun-dantes, ou de domínio permutado. Em uma modalidade, as estruturas sãoinspecionadas visualmente (por exemplo, usando o visor SwissPDB Viewer)para rupturas na seqüência correspondente devido a densidades não resol-vidas ou permuta de domínio. Os arquivos PDB de estruturas imperfeitassão removidos manualmente da série de estruturas correspondentes. Emoutra modalidade, seqüências (por exemplo, seqüências FASTA) correspon-dentes às estruturas coletadas são filtradas para remover quaisquer seqüên-cias que sejam 100% idênticas, ou subcadeias de combinações perfeitas deseqüências remanescentes. Em ainda outras modalidades, estruturas PDBcom seqüências de aminoácidos aberrantemente longas ou curtas (um mar-co de categorização estrutural errônea) são selecionadas das séries de da-dos de estruturas. Os critérios de corte de extensão podem ser determina-dos, por exemplo, examinando um histograma de todas as extensões deseqüência de seqüências da série de referência. Em ainda outras modalida-des, as estruturas são inspecionadas visualmente (por exemplo, usando ovisor Swiss PDB) para dobramento incorreto. Quaisquer estruturas que nãose conformam com a topologia padrão da dobra de proteína são preferenci-almente descartadas.

Em modalidades exemplares, a série de referência curada com-preende seqüências correspondentes a uma dobra do tipo de imunoglobuli-na ("dobra de Ig") de uma proteína pertencente à superfamília de proteínasdas imunoglobulinas. Conforme é de conhecimento geral na técnica, a dobrade Ig é uma característica diferencial da superfamília das imunoglobulinas(vide, por exemplo, Bork, P., Holm1 L. & Sander, C. 1994. The Immunoglobu-Iin Fold. J. MoL Biol. 242, 309-320). A dobra de Ig aparece freqüentementeem proteínas de mamíferos e serve como uma plataforma para várias fun-ções - particularmente interações proteína-proteína. Por exemplo, todas asimunoglobulinas e a maioria dos receptores de imunoglobulina são compos-tos de múltiplos domínios de dobra de Ig. Dobras de Ig podem ser subdividi-das em várias subfamílias incluindo C1, C2, I, e V. Embora membros de to-das as subfamílias compreendam uma topologia de chave gregade duas-βfolha, estas subfamílias diferem pelo número de filamentos β sobre cada fo-lha e pelas conexões através das β-sheets (vide, por exemplo, AF Williams,Immunology Today, 8, (1987)). Estruturas típicas para cada classe de dobrade Ig são representadas na Figura 73.

Em uma modalidade, a série de referência compreende umaseqüência de dobra de Ig de uma proteína da superfamília das imunoglobu-Iinas selecionada entre o grupo consistindo em uma proteína de adesão ce-lular, uma integrina, um alergeno, um receptor de células T, uma proteína docomplexo de histocompatibilidade principal (por exemplo, uma proteína MHCClasse I ou MHC Classe Il ), um receptor de imunoglobulina (por exemplo,um Fc γ receptor (por exemplo, FcyRI, FcYRIIa)), e uma imunoglobulina (porexemplo, uma imunoglobulina IgG, IgM, IgA, ou IgE).

Em algumas modalidades preferenciais, todas as seqüências dasérie de referência correspondem a uma dobra de Ig ou porção da mesma.Em uma modalidade, a dobra de Ig é uma dobra C1. Em outra modalidade, adobra de Ig é uma dobra C2. Em outra modalidade, a dobra de Ig é uma do-bra V. Em ainda outra modalidade, a dobra de Ig é uma dobra I. Em outramodalidade, todas as seqüências da série de referência correspondem auma dobra C1. Em outra modalidade, todas as seqüências da série de refe-rência correspondem a uma dobra C2. Em outra modalidade, todas as se-qüências da série de referência correspondem a uma dobra I. Em algumasmodalidades preferenciais, as seqüências da série de referência de dobra deIg têm dentro de cerca de 75 a cerca de 150 resíduos de extensão.

Etapa 2: Alinhar a Série de Referência

Na segunda etapa, as seqüências da série de referência sãoalinhadas precisamente para gerar uma série alinhada de seqüências (oualinhamento). Em uma modalidade, as seqüências da série de referênciasão alinhadas usando algoritmos de alinhamento de seqüência (por exem-plo, LALIGN ou BLAST e outros alinhamentos reconhecidos na técnica des-crita acima) para criar uma série alinhada de seqüências (aqui, neste Pedidode patente, um "alinhamento de seqüências à base de seqüência"). Em ou-tra modalidade, estruturas correspondentes as seqüências da série de refe-rência são alinhadas usando um algoritmo de alinhamento estrutural (porexemplo, combinação de estrutura secundária (Secondary Structure Mat-ching, SSM) usando o pacote de alinhamento de estrutura Schrõdinger s-tructaligri) para criar uma série alinhada de estruturas (aqui, neste Pedido depatente, um "alinhamento de estrutura"). Preferencialmente, o algoritmo dealinhamento estrutural assegura que regiões de núcleo (por exemplo, fila-mentos β) de cada estrutura sejam alinhadas, ao invés de alças intervenien-tes. Em ainda outra modalidade, as seqüências da série de referência sãoalinhadas por métodos à base de estrutura (por exemplo, combinando ami-noácidos de uma estrutura sobreposta aos de outra estrutura sobrepostacom base na distância mais curta entre os carbonos α das espinhas dorsaisdo polipeptídeo, por exemplo, usando o pacote Schrõdinger).

Em outra modalidade, as seqüências da série de referência sãoalinhadas usando tanto algoritmos de alinhamento à base de seqüênciaquanto à base de estrutura. Preferencialmente, as estruturas corresponden-tes às seqüências da série de referência são primeiro alinhadas usando umalgoritmo de alinhamento à base de estrutura ou outras ferramentas de dealinhamento orientadas por estrutura, seguidas por alinhamento das se-qüências correspondentes com um algoritmo à base de seqüência. Mais pre-ferencialmente, as estruturas correspondentes às seqüências da série dereferência são primeiro alinhadas, seguido por alinhamento das seqüênciasusando um alinhamento de seqüência à base de estrutura.

Em algumas modalidades opcionais, a série alinhada de se-qüências é adicionalmente curada. Por exemplo, a série alinhada de se-qüências pode ser expandida (por exemplo, por classificação não-intervaloou por classificação de Henikoff) para aumentar sua diversidade (por exem-plo, para obter séries muito grandes de seqüências homólogas tendo amesma dobra). Em outras modalidades, a série alinhada de seqüências po-de ser adicionalmente submetida a várias rodadas de curação e, opcional-mente, alinhamento adicional (por exemplo, alinhamento à base de estrutura).

Em algumas modalidades preferenciais, a invenção proporcionamétodos para curar uma série alinhada contendo um número relativamentepequeno de seqüências de modo a reforçar sua diversidade. Aumentando onúmero de seqüência no alinhamento, a robustez da análise de covariação éaumentada. Em uma modalidade, os métodos podem empregar um modeloou perfil derivado heuristicamente para pesquisar seqüências homólogasadicionais de um banco de dados de seqüências grande disponível publica-mente (por exemplo, o banco de dados NR mantido pela NCBI). Os modelosderivados heuristicamente podem ser produzidos usando um ou mais algo-ritmos à base de regressão selecionados entre, por exemplo, uma regressãode quadrados mínimos parcial, uma regressão linear múltipla, uma regres-são de quadrados mínimos inversa, uma regressão de componente principal,uma importância variável para projeção, ou similares. Em outras modalida-des, o modelo derivado heuristicamente é produzido usando um ou maisalgoritmos à base de padrão selecionados entre, por exemplo, um modelode Markov oculto, um algoritmo de Smith Waterman, rede neural, uma árvo-re de classificação e regressão, um spline de regressão adaptiva multivaria-da, ou similares. Em uma modalidade exemplar, o algoritmo de reconheci-mento de padrão é um Modelo de Markov Oculto. Um HMM é um modeloestatístico onde o sistema sendo modelado contém parâmetros ocultos osquais podem ser extraídos usando parâmetros observáveis e empregadopara análise de reconhecimento de padrão. Por exemplo, HMMs reconheci-dos na técnica podem empregar estruturas secundárias previstas para pes-quisar anticorpos da mesma dobra que um dado anticorpo, ao invés de anti-corpos tendo relação puramente baseada em seqüência (vide por exemplo,Proteins 36(1), 68-76). MetaFam (Silverstein et al. Nucleic Acids Res 29(1),49-51 (2001)), Interpro (Apweiler, et al., Nucleic Aeids Res, 29(1), 37-40,(2001)), e HMMER (Bateman et al, Nueleie Aeids Res 27(1), 260-2 (1999))são ferramentas típicas de reconhecimento de padrão à base de HMM.

Em algumas modalidades adicionais, seqüências extraídas comum algoritmo de HMM podem ser validadas para sua atribuição de classeestrutural adequada usando software de bioinformática reconhecido na téc-nica. Uma ferramenta de validação típica é a ferramenta de classificaçãoPFAM mantida pelo Wellcome Trust Sanger Institute e está disponível publi-camente na Internet. Por exemplo, a ferramenta PFAM 'pfamverify' pode seraplicada a cada seqüência extraída para confirmar que foi classificada corre-tamente pelo HMM classe-específico criado a partir do alinhamento de estru-tura à base de estrutura (Finn et ai, Nucleic Acids Res, 24 (Publicação debanco de dados), D247-51, (2006). Perfis de HMM correspondentes a umgrupo de PFAM (ou família de proteínas relacionadas, por exemplo, um gru-po de dobra de Ig) podem ser baixados do website da PFAM para facilitarclassificação das seqüências extraídas. Seqüências extraídas cujos escoresse situaram abaixo de um corte recomendado são preferencialmente remo-vidas da série de referência.

Em outras modalidades, seqüências extraídas com o algoritmoHMM também podem ser alinhadas usando o algoritmo HMMC. Como estesalgoritmos HMM se baseiam em cuidadosos alinhamentos estruturais, esteprocesso assegura o alinhamento orientado por estrutura das seqüênciasextraídas adicionais. Por exemplo, o pacote HMMER pode ser utilizado paragerar alinhamentos 'mapali' em formato de saíde FASTA.

Em modalidades preferenciais, o método da invenção propor-ciona um novo HMM o qual não somente encontra seqüências similares àsda série alinhada, mas alinha as novas seqüências para assegurar o alinha-mento correto da região de núcleo. Por exemplo, o novo algoritmo de HMMda invenção pode pesquisar domínios separados (por exemplo, domínios dedobra de Ig) dentro de uma única proteína (por exemplo, um membro da su-perfamília das imunoglobulina), extrair cada domínio separadamente, e adi-cionar este à série alinhada de seqüências. Algoritmos ou perfis de HMMpodem ser construídos a partir de alinhamentos de seqüência à base de es-trutura (por exemplo, usando o pacote de software HMMER o qual está dis-ponível publicamente na Internet, por exemplo, em www.psc.edu). Para cadapesquisa de HMM estrutura-específica, seqüências alcançadas acima de umlimiar de escore de critério são preferencialmente retidas como membroscandidatos da classe estrutural cujo HMM foi usado. Para as regiões de al-cence que são subseqüências da seqüência alcançada, o alcence de subse-qüência exato pode ser extraído da seqüência inteira.

Em outras modalidades exemplares, a invenção proporcionamétodos para curar a série alinhada de seqüências de modo a reduzir suaredundância. Por exemplo, enquanto o grande número de seqüências emuma série alinhada estruturalmente (por exemplo, uma série alinhada de do-bras de Ig) representa uma rica fonte de seqüências, algumas subfamílias(por exemplo, algumas subclasses de dobras de Ig) podem ser altamentesuper-representadas, enquanto outras são altamente sub-representadas.Super- ou sub- representação resulta em preferência significativa devido aíntima linhagem comum e limita a utilidade global de análises de covariação.Por conseguinte, em modalidades preferenciais, o alinhamento é submetidoa etapas de filtração adicionais para reduzir a redundância do alinhamento.

Em modalidades preferenciais, no mínimo uma seqüência com mais de 90%de identidade com outra seqüência (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência) é removida doalinhamento. Em modalidades particularmente preferenciais, no mínimo umaseqüência partilhando mais de 80% de identidade de seqüência com outraseqüência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 87%, 88%, 89%, ou 90% deidentidade de seqüência) é removida do alinhamento.

Em modalidades exemplares, a invenção proporciona um novométodo para reduzir a redundância dentro do alinhamento. Os métodos refe-ridos compreendem uso de um algoritmo heurístico para desconbrir e classi-ficar seqüências de corte de identidade de seqüência desejado. Os métodosreferidos compreendem uma ou mais das seguintes etapas seqüenciais: (1)calcular percentagem de identidades para todos os pares de seqüências noalinhamento; (2) agrupar valores de identidade em um ou mais grupos depercentagem de identidade; (3) classificar as seqüências de cada grupo porcontagem decrescente de resíduo sem intervalos e/ou por peso de seqüên-cia de Henikoff; e (4) remover seqüências redundantes de acordo com umcritério de corte (por exemplo, um nível de corte de % de identidade).

A remoção das seqüências redundantes pode ser realizada emuma série de modos. Em uma modalidade, seqüências classificadas são a-grupadas em múltiplos grupos de identidade de seqüência (por exemplo, umgrupo de 99%, um grupo de 98%, um grupo de 97%, e etc.). As seqüênciassão então sistematicamente removidas por classificação (por exemplo, se-qüências com classificação mais alta primeiro) do maior grupo de % de iden-tidade (isto é, o grupo de 99%, seguido pelo grupo de 98%, seguido pelogrupo de 97%, e etc.). As etapas de cálculo de identidade, agrupamentoe/ou classificação (Etapas (1) a (3)) são opcionalmente repetidas depois decada etapa de remoção até o grupo final que satisfaz o critério de corte sereliminado. Em outra modalidade, um único grupo de seqüências classifica-das é criado no critério de corte e seqüências são sistematicamente removi-das por classificação do grupo. As etapas de cálculo de identidade e/ouclassificação (Etapa (1) e (3)) são opcionalmente repetidas depois de cadaetapa de remoção.

Em modalidades preferenciais, o critério de corte é 90% ou mai-or (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência). Em modalidades particularmente preferenciais, ocritério de corte é 80% ou maior (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 87%,88%, 89%, ou 90% de identidade de seqüência).

Em outra etapa opcional, as extensões de seqüências na sériede referência alinhada podem ser truncadas. Em uma modalidade, regiõescom intervalo dentro do alinhamento podem ser removidas para evitar cálcu-Io sobre estas regiões menos informativas. Por exemplo, colunas que nãosão estados de combinação em um perfil de HMM usado para descobrir asseqüências podem ser removidas. Em outra modalidade, seqüências dentrodo alinhamento as quais sobrepõem a extensão de consenso do alinhamen-to são cortadas para remover a porção de projeção da seqüência. Em outramodalidade, seqüências sobrepostas são removidas do alinhamento.

Etapa 3: Análise de Covariação da Série Alinhada

Uma vez que as seqüências da série alinhada são compiladas,análise de covariação é realizada sobre um ou mais pares de resíduos ami-noácidos na série de alinhamento. A análise de covariação resulta na gera-ção de uma nova série de dados (aqui, neste Pedido de patente, uma "sériede dados de covariação") descrevendo a importância estatística de resíduoscorrelacionados dentro dos alinhamentos. Em algumas modalidades, a sériede dados de covariação lista correlações entre cada possível par de resí-duos dentro do alinhamento.

Em modalidades preferenciais, computação de covariação é umprocesso implementado por computador (por exemplo, um processo execu-tável em Java). A computação de covariação pode resultar em vários parâ-metros estatísticos reconhecidos na técnica. Em uma modalidade, a impor-tância estatística (por exemplo, um valor de χ2) da covariação é calculadausando uma análise Qui-quadrada. Em outra modalidade, a força estatística(por exemplo, valor de φ) da covariação é calculada. Por exemplo, um valorde ^negativo pode ser preditivo de uma correlação negativa. Isto é, a pre-sença de um aminoácido em uma primeira posição no alinhamento favorecea ausência de outro aminoácido específico em uma segunda posição. Aoinvés, um valor de ^positivo pode ser preditivo de uma correlação positiva,deste modo indicando que o aminoácido na primeira posição favorece a pre-sença do aminoácido na segunda posição.

Em uma modalidade, um valor de φ é calculado usando a fór-mula I:

<formula>formula see original document page 89</formula>

em que

aibj é o número de vezes que resíduos do tipo "a" ou "b" são en-contrados na mesma seqüência nas posições i e j, respectivamente;

aibj é o número de vezes que ambos os tipos de resíduos estãoausentes da mesma seqüência;

aibj é o número de vezes que a é encontrado presente enquan-to b está ausente; e

aibj é o número de vezes que a está ausente enquanto b estápresente.

Em uma modalidade, um valor de φ é calculado usando a se-guinte fórmula II:

<formula>formula see original document page 89</formula>onde c a j são definidos pela matriz:

<formula>formula see original document page 90</formula>

Em algumas modalidades, um valor de χ2 pode ser calculado

usando uma fórmula à base de "freqüência-de-ocorrência". Em outras moda-lidades, um valor de χ2 é calculado usando uma fórmula "à base de evento"(isto é, número de ocorrências). Uma fórmula à base de evento exemplar édeterminada como Fórmula III:

<formula>formula see original document page 90</formula>

em que

p(i) e p(j) são as freqüências de resíduos de quaisquer dois tiposde resíduos de interesse nas posições i e j, respectivamente, na série deseqüências alinhadas;

c(i,j) é o número de vezes p(i) e p(j) são observadas na mesmaseqüência; e

c(t) é o número total de seqüências no alinhamento;e em que freqüências de resíduos são definidas como o número de vezesum tipo de resíduo é observado em uma posição específico em um alinha-mento dividido pelo número total de seqüências no alinhamento.

Em algumas modalidades, somente um resíduo aminoácido na-tural é considerado um "tipo de resíduo" para os fins de um cálculo de cova-riação. Em modalidades preferenciais, no entanto, um tipo de resíduo tam-bém pode incluir um intervalo como um tipo de resíduo distinto, uma vez queintervalos (especialmente em porção de alça) freqüentemente ajudam a dis-criminar um motivo de outro.

Em algumas modalidades, o cálculo de covariação pode incluiruma função de ponderação de diversidade (por exemplo, um esquema deponderação de Henikoff).

Em outras modalidades, Identidades Médias de Seqüências(SAIs) podem ser usadas para filtrar pares covariantes. Por exemplo, SAIspodem ser usadas para filtrar covariação de pares com mais de identidademédia de seqüência de modo a remover covariações artefatuais potenciaisoriginárias de seqüências intimamente relacionadas. Em modalidades ondeo alinhamento foi submetido a curação por um alto limiar de identidade (porexemplo, 80% de identidade como critério de corte), cálculos de SAI são pre-ferencialmente prescindidos.

Em algumas modalidades, pares covariantes não são reporta-dos pelo cálculo a menos que sejam observados um número mínimo de ve-zes (aqui, neste Pedido de patente, um "corte de evento"). Em uma modali-dade, o corte de evento é 10 ou mais eventos. Em uma modalidade maispreferencial, o corte de evento cerca de 2 ou mais, e menos de 10, eventos(por exemplo, 9, 8, 7, 6, ou 5 eventos).

Etapa 4: Usar Dados de Covariação para Prever Estabilidade Protéica

Em algumas modalidades, as covariações estatisticamente sig-nificantes dentro da série de dados de covariação são usadas para perquisarcovariações correspondentes dentro da seqüência candidata ou de ensaio.Em particular, a conservação de um ou mais aminoácidos covariantes dasérie de referência em posições de aminoácidos correspondentes dentro daseqüência candidata ou de ensaio indica que estes resíduos são funcional-mente importantes e são preditivos de estabilidade de proteína favorável.

Por conseguinte, o número de aminoácidos covariantes que são conserva-dos dentro de uma seqüência candidata ou de ensaio pode ser usado paraprever a estabilidade da seqüência.

Em alguns aspectos típicos, as covariações relevantes podemser visualizadas usando uma interface gráfica do usuário (GUI) da invenção(por exemplo, a ferramenta NAPMAP descrita na Seção V abaixo,) para aná-lise da série de dados de covariação. Como a interpretação de dados na sé-rie de dados de covariação pode ser trabalhosa, a interface gráfica do usuá-rio pode faciliar a análise de dados e facilitar rápidas análises de designs efuncionais de proteína.

Em modalidades exemplares, a presença ou ausência de resí-duos covariantes dentro da série de referência ou alinhamento que estãopresentes ou ausentes dentro da seqüência candidata pode ser usada paraestabelecer um escore o qual é correlativo com a estabilidade da proteína.Por exemplo, onde um par covariante (por exemplo, positivamente covarian-te) de resíduos é considerado como sendo retido dentro da seqüência can-didata, um primeiro escore (por exemplo, um escore positivo) pode ser atri-buído à seqüência candidata. Ao invés, onde um par covariante (por exem-plo, positivamente covariante) de resíduos está faltando na seqüência candi-data, um segundo escore de sinal oposto ao primeiro escore (por exemplo,um escore negativo) pode ser atribuído à seqüência candidata. Em uma mo-dalidade preferencial, à ausência de um par de resíduos negativamente co-variante dentro de uma seqüência de ensaio é atribuído um escore positivo,ao passo que à presença do par de resíduos negativamente covariante éatribuído um escore negativo. Em outra modalidade preferencial, à presençade um par de resíduos positivamente covariante de uma seqüência de en-saio é atribuído um escore positivo, ao passo que à ausência de alguns resí-duos da seqüência de ensaio de par positivamente covariante é atribuído umescore negativo.

Em algumas modalidades, escores de covariação são geradossomente para covariações que satisfazem um nível de limiar de importânciaestatística. Em uma modalidade, escores de covariação são gerados somen-te para covariações acima (ou abaixo) de um determinado valor de x2-valorou valor de φ. Por exemplo, o corte para designação de escore de covaria-r, ção negativo pode ser uma covariação com um coeficiente de associaçãophi (Φ) de menos de +0,2 (cerca de +0,2 a cerca de -1,0), e mais preferenci-%J al de menos de -0,2. Em outra modalidade exemplar, a uma covariação éatribuído um escore de covariação positivo se tiver um coeficiente de asso-ciação phi de mais de -0,2, preferencialmente mais de +0,2. Em modalida-des preferenciais, um escore de covariação negativo é atribuído a uma cova-riação com um coeficiente de associação phi (Φ) de menos de -0,5 (por e-xemplo, -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9, ou -1,0), e um escore de covariação posi-tivo é atribuído a uma covariação com um coeficiente de associação phi (Φ)de mais de +0,5 (por exemplo, +0,5, +0,6, +0,7, +0,8, +0,9, ou +1,0), ao pas-so que todas as outras covariações são mascaradas atribuindo um escoreneutro (por exemplo, zero).

Em algumas modalidades, os escore de covariação negativosou positivos podem ser ponderados para refletir a importância estatística ouforça da covariação correspondente. Em uma modalidade típica, a uma co-variação positiva pode ser atribuído um alto escore de covariação positivo seseu coeficiente de associação phi for também elevado ou um escore de co-variação positivo menor se seu valor de φ for baixo. Por exemplo, a uma se-qüência candidata tendo primeira e segunda covariações com valores de φrespecitivos de +0,5 e +1,0 pode ser atribuída um baixo escore de covaria-ção positivo (por exemplo, +1) para a primeira covariação e um escore decovariação positivo maior para a segunda covariação (por exemplo, +2).

Em outras modalidades, o escore de covariação é atribuído so-mente às covariações as quais são validadas por um meio diferente de signi-ficância estatística calculada. Vários critérios não estatísticos podem ser u-sados para validar que as covariações calculadas são importantes e biologi-camente significativas. Em uma modalidade, a covariação é validada exami-nando se há correlação ou tendência entre resíduos que covariam uns comos outros e sua promixidade uns com os outros dentro de um modelo estru-tural da proteína correspondente. Se os resíduos referidos estiverem em ín-tima proximidade (por exemplo, 30 Á ou menos, preferencialmente 10 Á oumenos) uns com os outros na estrutura, a covariação prevista é validadacomo uma covariação verdadeira. Em outra modalidade, a covariação é vali-dada determinando se os aminoácidos covariáveis formam uma conexão aqual já se sabe que existe dentro de um subgrupo de proteínas correspon- dentes a seqüências da série de referência (por exemplo, uma ligação dis-sulfeto conhecida). Por exemplo, resíduos 6-10 no N-término de sobras decadeia pesada variável de IgG humana ou murina são conhecidos por adotarconformações muito específicas com base na conservação de pares covari-antes de aminoácidos (Ewert et ai, Methods, 34: 184-199 (2004)).

Em ainda outras modalidades, um escore de covariação de umaminoácido em uma seqüência candidata pode ser ponderado para refletir onúmero de covariações dentro da série de referência ou alinhamento quesatisfaz (ou viola). Em uma modalidade, à seqüência candidata é atribuídoum escore de covariação positivo para cada covariação dentro da série dereferência ou alinhamento que satisfaz, e um escore de covariação negativopara cada covariação dentro da série de referência que viola. Em modalida- des preferenciais, o escore de covariação para um aminoácido particular deuma seqüência de ensaio é a soma total do escores de covariação positivodividido pela soma total dos escores de covariação negativos. Por exemplo,onde 2 covariações negativas e 9 covariações positivas são observadasdentro da série de referência em posições de aminoácido correspondentesao aminoácido da seqüência candidata, ao aminoácido da seqüência candi-data pode ser atribuído um escore de covariação total de 7.

Em algumas modalidades, alguns escores de covariação totalsão somados para todos os aminoácidos em uma seqüência candidata (ouporção do mesmo) para obter a "seqüência escore de covariação". Este es- core de covariação de seqüência pode ser empregado para prever a estabi-lidade da seqüência. De modo geral, um escore de covariação de seqüêncianegativo é preditivo de baixa estabilidade protéica, ao passo que um escorede covariação de seqüência positivo é preditivo de alta estabilidade protéica.b. Classificação de Consenso

Em outras modalidades, os métodos computacionais da inven-ção empregam uma nova técnica de classificação denominada "classificaçãoà base de consenso" a qual compara seqüências de polipeptídeos candida-tas contra um banco de dados de seqüências de polipeptídeos relacionadaspara identificar proteínas com estabilidade potencialmente baixa. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, "classificação à base de consenso" serefere a cálculo do número de aminoácidos não-consenso dentro de umaproteína (por exemplo, uma proteína de ensaio) baseado na informação dis-ponível a partir de compilações de seqüências de proteínas relacionadas. Ocálculo resulta em uma "classificação de consenso" para a proteína. Con-forme mostrado nos Exemplos abaixo, a classificação de consenso de umaproteína é altamente correlativa com sua estabilidade protéica determinadaempiricamente. Por conseguinte, um objeto da invenção é empregar classifi-cação à base de consenso para prever estabilidade protéica. Quanto maior odesvio de uma seqüência de proteína de ensaio de uma seqüência de con-senso, maior a classificação de consenso, e mais provavelmente a proteínade ensaio deve conter aminoácidos prejudiciais para sua estabilidade.

Na nova abordagem de classificação de consenso descrita aqui,neste Pedido de patente, as seguintes etapas básicas são empreendidaspara prever a estabilidade de uma proteína candidata ou de ensaio:

1. Proporcionar uma série de seqüências homólogas (aqui,neste Pedido de patente, uma "série de referência") correspondentes a umaseqüência de um domínio (ou porção do mesmo) da proteína candidata (a-qui, neste Pedido de patente, uma "seqüência de domínio de ensaio").

2. Determinar a freqüência de resíduos em cada posição de re-síduo dentro da seqüência de domínio de ensaio (ou porção do mesmo) paraobter uma classificação de consenso.

3. Usar a classificação de consenso para prever a estabilidadeda proteína candidata ou de ensaio.

Em algumas modalidades exemplares, as seguintes etapas op-cionais são empregadas para aumentar o valor preditivo da classificação deconsenso:

4. Determinar a freqüência de resíduos em cada posição de re-síduo correspondente dentro de cada seqüência da série de referência (ouum subgrupo da mesma) para obter um escore médio.

5. Comparar a classificação de consenso com a classificaçãode consenso média para determinar um escore de seqüência.

6. Usar o escore de seqüência para prever a estabilidade daproteína candidata ou de ensaio.Etapa 1: Proporcionar uma Série de Referência

Os métodos à base de classificação de consenso da invençãoempregam uma série de seqüências (uma "série de referência") as quais sãohomólogas a (isto é, relacionadas com) uma seqüência de interesse ou "se- qüência de ensaio". A série de referência pode compreender uma série deseqüências homólogas tendo graus de similaridade moderado a elevadocom a seqüência de ensaio.

A série de seqüências homólogas pode ser determinada poruma pessoa versada na técnica para incluir um número adequado de se-qüências não-redundantes. A série de seqüências homólogas não precisaser grande, contanto que seja obtida uma seleção razoavelmente não ten-denciosa. Não é o número de seqüências, mas a proporção de freqüêciasque é importante.

As seqüências referidas podem ser obtidas através de pesqui-sas à base de homologia de quaisquer dos bancos de dados de seqüênciasconhecidos na técnica (por exemplo, bancos de dados NCBI e TIGR). Emuma modalidade exemplar, uma pesquisa BLAST de rotina com parâmetrospadrão pode ser realizada com a seqüência de ensaio para recuperar se-qüências homólogas de interesse. Seqüências com uma percentagem míni- ma de identidade de seqüência (por exemplo, mais de 25%, 30%, 35%,40%, 45% ou 50% de identidade de seqüência, preferencialmente mais de30% de identidade de seqüência) podem ser selecionadas para inclusão nasérie de referência. Em algumas modalidades, as seqüências com um altograu de identidade de seqüência (por exemplo, mais de 85%, 90%, 95%, ou 98% de identidade de seqüência, preferencialmente mais de 95% de identi-dade de seqüência) são excluídas da série de referência para evitar prefe-rência.

Em algumas modalidades, a série de referência pode ser curadapara incluir somente as seqüências as quais satisfazem um ou mais critériospara inclusão na série. Por exemplo, em algumas modalidades, a série dereferência pode compreender seqüências ortólogas (por exemplo, seqüên-cias as quais são de diferentes espécies (por exemplo, espécies de mamífe-ros diferentes) mas as quais têm a mesma função bioquímica). Em outrasmodalidades, a série de referência compreende seqüências humanas. Emuma modalidade exemplar, a série de seqüências homólogas inclui somenteseqüências de linha germinal mamífera. Em modalidades preferenciais, asérie de referência inclui seqüências de proteínas tendo a mesma classe dedobra de proteína (por exemplo, um domínio de proteína similar) que a pro-teína de ensaio (por exemplo, proteínas tendo uma dobra do tipo de imuno-globulina). As proteínas referidas podem ser identificadas por meio de técni-cas de bioinformática conhecidas na técnica (por exemplo, pesquisando obanco de dados de domínios conservados (CDD) do Instituto Nacional deSaúde dos Estados Unidos.

Etapa 2: Determinar o Escore de Consenso da Seqüência de Ensaio

Uma vez que as seqüências da série de referência são compila-das, a seqüência de consenso da série de referência é determinada de mo-do a facilitar o método de classificação de consenso da invenção. Conformeusado aqui, neste Pedido de patente, o termo "seqüência de consenso" serefere a uma seqüência em que o resíduo (por exemplo, resíduo aminoáci-do) em cada posição dentro da seqüência corresponde ao resíduo mais co-mum nesta posição em uma série alinhada de seqüências relacionadas (istoé, a série de referência).

Para determinar a seqüência de consenso, as seqüências den-tro da série de referência podem primeiro ser alinhadas usando algoritmosde alinhamento de seqüência conhecidos na técnica. Um exemplo preferen-cial e não-limitante de um algoritmo de alinhamento local utilizado para acomparação de seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-68, modificado como em Karlin e Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5858-77. Um algoritmo similar é incor-porado nos programas BLAST (versão 2.0) de Altschul, et ai (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10. Em outra modalidade, o alinhamento é otimizado introdu-zindo intervalos apropriados e a percentagem de identidade é determinadasobre a extensão das seqüências alinhadas (isto é, um alinhamento comintervalos). Para obter alinhamentos com intervalos para fins de compara-ção, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Rés. 25(17):3389-3402. Em outra modalidade, o ali-nhamento é otimizado introduzindo intervalos apropriados e a percentagemde identidade é determinada sobre toda a extensão das seqüências alinha-das (isto é, um alinhamento global). Um exemplo preferencial e não-limitantede um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüênciasglobal é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). Um algoritmo similaré incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) o qual é parte do pacote dosoftware de alinhamento de seqüência GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de" resíduo de pesoPAM120, uma penalidade de extensão de intervalo de 12, e pode ser usadauma penalidade de intervalo de 4.

Para determinar a seqüência de consenso da série alinhada dereferências, é determinado o resíduo que ocorre mais freqüentemente em cada posição dentro da série alinhada de referências. A seqüência de con-senso pode ser determinada visualmente ou pode ser determinada por aná-lise computacional usando um programa de bioinformática disponível publi-camente (por exemplo, a ferramenta EMBOSS CONS disponível no HelixSystems do National Institute of Health).

A seqüência de consenso é empregada nos métodos da inven-ção para determinar uma classificação de consenso. Em algumas modalida-des, uma classificação de consenso é um valor numérico o qual eqüivale àfreqüência ou ocorrência de resíduo dentro da série de referência do resíduode consenso em cada posição de aminoácido na seqüência de consenso(isto é, a "freqüência de resíduo de consenso") com a freqüência ou ocor-rência de resíduo dentro da série de referência do aminoácido na posiçãocorrespondente na seqüência de ensaio (isto é, a "freqüência de resíduo deensaio"). Freqüências de resíduo em uma posição dentro da seqüência deensaio ou de consenso são calculadas somando o número de vezes que o aminoácido nesta posição está presente na posição correspondente na sériede referência alinhada, e dividindo o valor somado pelo número total de se-qüências dentro da série de referência. Em uma modalidade exemplar, aclassificação de consenso em cada posição de aminoácido é calculada divi-dindo a freqüência de resíduo de ensaio pela freqüência de resíduo de con-senso para dar um escore não-zero de entre 1 e 0. Por exemplo, a um resí-duo o qual é idêntico ao aminoácido de consenso naquela posição é atribuí-do um escore perfeito de 1, ao passo que uma classificação de consenso seaproxima de zero, o menos comum o aminoácido é naquela posição.

Em algumas modalidades preferenciais, a classificação de con-senso pode ser somada para cada posição da seqüência de ensaio (ou umaporção da mesma) para obter uma classificação de consenso total. Por e-xemplo, uma classificação de consenso total perfeita é o número de aminoá-cidos na seqüência de ensaio, indicando que a seqüência de ensaio é idênti-ca a sua seqüência de consenso correspondente.

Uma fórmula típica para calcular a classificação de consensototal de uma proteína é determinada abaixo:

<formula>formula see original document page 99</formula>

em que

Ci(r) eqüivale à freqüência de resíduo de consenso em uma po-sição de aminoácido da seqüência de consenso,

hi(r) eqüivale à freqüência de resíduo de ensaio de uma posiçãode aminoácido da seqüência de ensaio, e

Etapa 3: Usar o Escore de Consenso para Prever a Estabilidade Protéica

A classificação de consenso pode ser então empregada paraprever a estabilidade da proteína de ensaio. Em geral, quanto maior o valrorda classificação de consenso, maior a probabilidade de que a proteína deensaio terá estabilidade adequada para seu uso pretendido. Em algumasmodalidades, a classificação de consenso da proteína de ensaio pods sarcomparada com a classificação de consenso de uma seqüência controle. Emuma modalidade típica, a seqüência controle é de uma proteína a qual é co-nhecida por ter propriedades de estabilidade pobres ou indesejadas (aqui,neste Pedido de patente, um "controle negativo"). Por conseguinte, é previs-to que a proteína de ensaio tenha estabilidade aprimorada se sua classifica-ção de consenso for maior do que a do controle negativo. Em outra modali-dade exemplar, a seqüência controle é de uma proteína a qual é conhecida por ter propriedades de estabilidade desejáveis (aqui, neste Pedido de pa-tente, um "controle positivo"). Por conseguinte, é previsto que a proteína deensaio tenha estabilidade aprimorada se sua classificação de consenso forsubstancialmente similar ou maior do que a do controle positivo. Em outrasmodalidades, a classificação de consenso da seqüência de ensaio pode ser comparada com sua classificação de consenso perfeita hipotética, um valoro qual corresponde ao número total de aminoácidos na seqüência de ensaio.Etapa 4: Determinar o Escore de Consenso Médio da Série de Referência

Em algumas modalidades, classificações de consenso médioem parte ou todas as posições de aminoácido das seqüências dentro da sé- rie de referência são determinadas para comparação com as classificaçõesde consenso em posições correspondentes dentro da seqüência de ensaio.Em modalidades preferenciais, a classificação de consenso total médio paraa série de referência é determinada para comparação com a classificação deconsenso total da seqüência de ensaio. A classificação de consenso totalmédia para a série de referência é a soma das freqüências de resíduos paratodas as posições de aminoácidos de uma seqüência dentro da série de re-ferência, dividida pelo número total de seqüências nesta série de referência.Etapa 5: Determinar o Escore da Seqüência

Em algumas modalidades, o escore de seqüência é determinadocomparando a classificação de consenso médio da série de referência com aclassificação de consenso da seqüência de ensaio. O diferencial destes va-lores é o "escore de seqüência" da seqüência de ensaio (também referidoaqui, neste Pedido de patente, como o "escore Δ"). O escore de seqüênciapode ser determinado subtraindo a classificação de consenso da classifica-ção de consenso médio.

Etapa 6: Usar o Escore de Seqüência para Prever a Estabilidade Protéica

O escore de seqüência proporciona uma medida do desvio daclassificação de consenso da seqüência de ensaio da classificação de con-senso médio da série de referência. Os Exemplos abaixo demonstram que oescore de seqüência de uma proteína é altamente correlacionado com a es-tabilidade (por exemplo, estabilidade térmica) da proteína. Por conseguinte, em algumas modalidades, o escore de seqüência também pode ser usadopara prever a estabilidade da proteína. Se o escore Δ da proteína for um va-lor negativo (isto é, a classificação de consenso for menor do que a classifi-cação de consenso médio), a previsão seria que a estabilidade da proteínade interesse terá uma estabilidade menor do que a maioria das proteínas dentro da série de referência.

Em algumas modalidades, as seqüências de ensaio emprega-das nos métodos da invenção são proteínas de domínio único. Conformeusado aqui, neste Pedido de patente, uma "proteína de domínio único" éuma proteína compreendendo um ou mais domínios, em que cada um dos domínios são do mesmo tipo (por exemplo, um domínio pesado variável(VH)).

Em outras modalidades, as seqüências de ensaio empregadasnos métodos da invenção são proteínas multidomínio. Conforme usado aqui,neste Pedido de patente, uma "proteína multidomínio" é uma proteína com- preendendo dois ou mais domínios, onde no mínimo dois dos domínios sãode um tipo diferente. Por exemplo, anticorpos são proteínas compreendendotipicamente seis domínios (isto é, VH, VL, CL, CH1, CH2, e CH3). Em moda-lidades preferenciais, a estabilidade do domínio menos estável de uma pro-teína multidomínio é prevista usando os métodos da invenção. Os Exemplosabaixo demonstram que os métodos da invenção são particularmente efica-zes para prever a estabilidade térmica quando o domínio menos estável (ouporção do mesmo) de uma proteína multidomínio (por exemplo, o domínioVH de um anticorpo) é empregado como uma seqüência de ensaio.

Se o domínio menos estável não for conhecido a priori, pode serdeterminado usando métodos experimentais que são conhecidos na técnica(por exemplo, usando quaisquer dos métodos descritos acima, tais comocalorimetria de varredura diferencial (DSC), dicroismo circular dependenteda temperatura (CD), ou medições da fluorescência). Os métodos referidospermitem a determinação de múltiplas transições de desdobramento térmicoonde o domínio menos estável ou desdobra primeiro (vide a Figura 69A) oulimita o limiar de estabilidade global de uma unidade multidomínio que des-dobra cooperativamente (isto é uma proteína multidomínio a qual apresentauma transição de desdobramento único). O domínio menos estável pode seridentificado em uma série de modos adicionais. Mutagênese pode ser reali-zada para sondar qual domínio limita a estabilidade global. Adicionalmente,resistência a protease de uma proteína multidomínio pode ser realizada sobcondições onde o domínio menos estável é conhecido por ser intrinsicamen-te desdobrado através de DSC ou outros métodos espectroscópicos (Fonta-na, et al., Fold. Des., 2: R17-26, 1997). Uma vez que o domínio menos está-vel seja identificado, a seqüência codificando este domínio (ou uma porçãodo mesmo) pode ser empregada como uma seqüência de ensaio nos méto-dos da invenção.

Em algumas modalidades exemplares, as proteínas multidomí-nio avaliadas usando os métodos da invenção são anticorpos. Os métodosda invenção possibilitam que uma pessoa versada na técnica exclua a sele-ção de domínios de região variável inadequados de entre o vasto conjuntode seqüências de região variável criadas pelos mecanismos de diversidadedo sistema imune. Em modalidades exemplares, por exemplo, moléculasscFv ou moléculas de anticorpos compreendendo domínios de região variá-vel (Fv) com uma estabilidade relativamente elevada (por exemplo, estabili-dade térmica) podem ser identificadas usando os métodos da invenção, eselecionadas. Em outras modalidades exemplares, domínios de região vari-ável (Fv) de imunoglobulina humana tendo estabilidade aceitável podem seridentificados usando os métodos da invenção e selecionados para uso comocadeias de imunoglobulina aceitadoras na humanização de um anticorpo.

Em outras modalidades exemplares, os métodos da invenção podem serempregados para triar seqüências variáveis de anticorpos engenheiradoscandidatas (por exemplo, seqüências VL ou VH humanizadas) para estabili-dade apropriada antes de prosseguir com a síntese de uma molécula de Ii-gação compreendendo a seqüência candidata.

Conforme é de conhecimento na técnica, a estabilidade protéicavaria de um anticorpo para outro com base nas muitgas variações possíveisem anticorpos naturais ou engenheirados. Por exemplo, a pressão seletivado sistema imune para criar diversidade dentro dos domínios variáveis deanticorpo natural pode afetar negativamente sua estabilidade ou dobrabilidadeem sistemas de expressão recombinante (Knappik e Pluckthun, Protein Engng.,8: 81-89, (1995); Wall e Pluckthun, Protein Engng, 12: 605-11 (1999); Knappik etal., J. MoL Biol., 296: 57-86, (2000); Ewert et ai, J. Moi Biol., 3325: 531-33,(2003)). Anticorpos consistindo no mesmo isótipo e subclasse, IgGI huma-na sendo o mais comumente usado para terapêutica de anticorpo, variamem estabilidade de um para o outro essencialmente com base em diferençasem seus domínios variáveis uma vez que o restante de suas seqüências sãoidênticas. O desdobramento térmico de fragmentos de anticorpos Fab pre-dominantemente ocorre em uma única transição aparente. Na maioria doscasos, a região Fv de anticorpo limita a termoestabilidade global do Fab ex-ceto nos raros casos onde a estabilidade de Fv (ou único Vh ou Vl) é extre-mamente baixa ou extremamente elevada e a transição de desdobramentode Fv é desacoplada daquela da região CH1/CL (Shimba, et al., 1995;Rõthlisberger et al., 2005).

Em algumas modalidades, os métodos da invenção empregamuma seqüência de região variável de um anticorpo como uma seqüência deensaio. Em algumas modalidades preferenciais, os métodos da invençãoempregam o domínio variável de cadeia pesada (VH) (ou uma porção domesmo) como uma seqüência de ensaio. Os Exemplos abaixo demonstramque o domínio VH é altamente preditivo da estabilidade de um anticorpocompreendendo o referido domínio.

Em algumas modalidades, a seqüência de ensaio de domíniovariável é comparada com uma série de referência compreendendo, ou con-sistindo somente de, seqüências de domínio variável. As referidas seqüên-cias de domínio variável podem ser compiladas a partir do banco de dadosKabat de seqüências de imunoglobulina (Kabat et al., "Distribution Files ofthe Fifth Edition of Sequences of Proteins of Immunological lnteresf, 1992).Em algumas modalidades preferenciais, a série de referência pode compre-ender ou consistir em seqüências de imunoglobulina humana.

Em outras modalidades preferenciais, a série de referência podecompreender, ou consistir somente em, seqüências de linha germinal huma-na. Em uma modalidade, a referência compreende seqüências de domíniovariável da mesma subclasse Kabat de seqüências de anticorpos.

Em outras modalidades, uma porção de domínio variável (porexemplo, domínio VH) é usada como uma seqüência de ensaio nos métodos da invenção. Uma porção de domínio variável típica é uma seqüência com-preendendo menos do que todas as regiões de framework ou CDRs da se-qüência de região variável (por exemplo, uma seqüência VH que é truncadapara remover CDR3 e FR4). Em uma modalidade, as seqüências de domí-nios VH são da subclasse de linha germinal de Kabat VH1. Em outra modali- dade, as seqüências de domínio variável são da subclasse de linha germinalde Kabat Vh2. Em outra modalidade, as seqüências de domínio variável sãoda subclasse de linha germinal de Kabat VH3. Em outra modalidade, as se-qüências de domínio variável são da subclasse de linha germinal de KabatVh4. Em outra modalidade, as seqüências de domínio variável são da sub- classe de linha germinal de Kabat VH5. Em outra modalidade, as seqüênciasde domínio variável são da subclasse de linha germinal de Kabat VH7.

Os métodos da invenção podem ser empregados com proteínasconhecidas na técnica. Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo ouporção do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpohumanizado. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano.Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo não-humano (por exem-plo, anticorpo monoclonal de camundongo). Em outras modalidades, o anti-corpo é um anticorpo de domínio único (por exemplo, camelídeo, de tubarão,humano). Em ainda outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo quiméri- co. Outros anticorpos modificados típicos para uso nos métodos da invençãoincluem anticorpos com domínio eliminado e moléculas de ligação biespecí-ficas. Outros anticorpos típicos incluem os anticorpos contendo scFv ou anti-corpos modificados descritos acima. Em modalidades preferenciais, é avali-ada a estabilidade das proteínas de ligação mencionadas acima usando umaseqüência de cadeia pesada variável das mesmas (ou porção das mesmas)como a seqüência de ensaio nos métodos da invenção.

Em uma modalidade, da invenção, os dados obtidos para umdado polipeptídeo são armazenados ou fornecidos os resultados como umamedida da estabilidade do polipeptídeo. Em uma modalidade, os métodosdescritos aqui, neste Pedido de patente, podem ser repetidos para uma plu-ralidade de polipeptídeos. Em uma modalidade, uma seleção de um polipep-tídeo pode ser feita com base nos dados obtidos. Em outra modalidade, umpolipeptídeo selecionado pode ser formulado para uso terapêutico.

IV. Métodos para Desenhar / Produzir Proteínas com Propriedades BiofísicasReforçadas (por exemplo. Estabilidade Protéica)

(a) Desiqn de Covariação

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para criarvariantes de proteínas com uma propriedade biofísica reforçada em relaçãoà molécula parental da qual é derivada usando os resultados de uma análisede covariação. Há muitos tipos de esforços de engenharia de proteína ondedados de covariação podem ser usados para facilitar o projeto, inclusive masnão limitado a projetos de estabilidade protéica reforçada, modificação deperfis de desdobramento com pH, remoção estável de glicosilação, e altera-ção da função bioquímica.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos pa-ra criar proteínas com projetos de estabilidade reforçada com base na identi-ficação de escores de covariação (ou as próprias covariações) que são pre-ditivos de estabilidade protéica reforçada ou reduzida de acordo com o mé-todo da Seção III acima. Por exemplo, se uma seqüência pertencente à pro-teína de interesse está faltando ou viola várias covariações chave, podemser feitos projetos de proteína para corrigir isto. Também podem ser incluí-das modificações as quais aumentam o número calculado de fortes covaria-ções observadas dentro de uma única seqüência.

Foi desenvolvida uma série de projetos para estabilizar os do-mínios VH e Vl de BHA10 scFv. Em particular, resultados iniciais de triagemde biblioteca para dois domínios scFv BHA10 validam a capacidade da Fer-ramenta de Análise de Covariação (Covariation Anaiysis Tool) para projetoda estabilidade protéica. O primeiro exemplo envolve a previsão com suces-so de uma mutação estabilizante (S46L) dentro do domínio Vl BHA10 queconfere um significativo aprimoramento na estabilidade térmica (DT50 de +10°C) conforme medido por uma prova de ensaio térmico. Mutação de Ser paraLeu na posição 46 (sistema de numeração de Kabat) leva a uma conexãopositivo com um Tyr existente no resíduo 36 o qual a Ferramenta mostra quecovaria fortemente com Leu 46 (Figura 78). Um segundo exemplo da utilida-de da Ferramenta de Análise de covariação é a correspondênia analítica dosefeitos negativos de uma mutação de BHA10 Vh Q6E. Análise de freqüênciade resíduos únicos sugeriu que mutação para o Glu muito mais comumenteobservado nesta posição levaria a um aumento em estabilidade. No entanto,a Ferramenta de Análise de Covariação indicou que mutação única para Gluviola várias covariações existentes presentes dentro da seqüência de BHA10VH. Para obter um aprimoramento na estabilidade deve-se colocar váriosaminoácidos que preferencialmente estabilizam Glu nesta posição.

Outro exemplo do valor preditivo da Ferramenta de Análise deCovariação é mostrado na Figura 79. Met 80 foi mutado para Leu como par-te de um projeto de biblioteca de resíduo único. Imaginava-se que esta únicamutação seria altamente estabilizante, uma vez que Leu é o aminoácidomais freqüente observado nesta posição dentro do banco de dados de se-qüências. No entanto, análises de covariação indicam que dois outros ami-noácidos devem ser mutados (V67F e T70S) de modo a obter harmonia decovariação.

(b) Desian da Interface

Em ainda outros aspectos, a invenção proporciona métodos pa-ra reforçar uma propriedade biofísica (por exemplo, estabilidade protéica) deuma segunda proteína ou proteína candidata (por exemplo, um anticorpo)usando uma primeira proteína como uma proteína modelo para projeto ra-cional.Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "proteí-na modelo", se refere a uma proteína com uma propriedade biofísica desejá-vel (por exemplo, alta estabilidade protéica térmica) a qual é usada para mo-delar a mesma propriedade em uma segunda proteína para um aprimora-mento da propriedade biofísica também é desejável. Em modalidades prefe-renciais, a proteína modelo é da mesma classe estrutural que a segundaproteína (por exemplo, se a segunda proteína for um anticorpo, um anticorpoé empregado como uma proteína modelo).

Em algumas modalidades, a proteína modelo é identificada co-mo tendo propriedade biofísica desejável (por exemplo, estabilidade protéi-ca) de acordo com um método da invenção. Em uma modalidade típica, aproteína modelo com propriedades de estabilidade desejáveis pode ter sidoidentificada entre um grupo de proteínas (Tqal como BIIB1-4, descrito naTabela 20, acima) usando métodos experimentais tais como os descritos noExemplo 15. Esta proteína modelo serviria então como uma plataforma deseqüência para projeto. Em uma modalidade típica, a proteína modelo é pre-vista para ter uma propriedade biofísica aprimorada (por exemplo, estabili-dade protéica) por um método de análise de covariação da invenção resumi-do acima. Em outras modalidades exemplares, a proteína modelo é previstapara ser uma proteína desejável (por exemplo, uma proteína estabilizada) deacordo com um método de classificação de consenso conforme resumidoacima. Em ainda outra modalidade exemplar, a proteína modelo é identifica-da de acordo com um método de triagem da invenção.

Em outras modalidades, a proteína modelo é uma proteína cria-da de acordo com um método da invenção. Em uma modalidade típica, aproteína modelo é designada para ter uma propriedade biofísica aprimorada(por exemplo, aumentada estabilidade protéica) de acordo com um métodode covariação da invenção. Em outra modalidade exemplar, a proteína mo-delo é designada para ter uma propriedade biofísica aprimorada de acordocom um método de classificação de consenso.

Os métodos deste aspecto da invenção envolvem as seguintesetapas:(1) proporcionar modelos estruturais da proteína modelo e daproteína candidata;

(2) identificar resíduos na proteína modelo que são importan-tes para estabilidade; e

(3) substituir resíduos na proteína candidata que correspon-dem aos resíduos importantes na proteína modelo.

Em uma modalidade, a proteína modelo modelo estrutural éuma estrutura de cristal (por exemplo, uma estrutura de cristal de raios X) ea proteína candidata é modelada por modelagem por homologia usando o modelo estrutural da proteína modelo. Em outra modalidade, um resíduoimportante é um resíduo da interface VH/VL. Conforme usado aqui, nestePedido de patente, um "resíduo da interface" é um resíduo que participa eminterações domínio-domínio dentro de ou entre proteínas. Preferencialmente,um resíduo da interface se situa no limite, isto é, a "interface" entre dois do- mínios da proteína e contribui sua área superficial para no mínimo um dosdomínios (preferencialmente ambos). Os resíduos que encobrem significati-vamente mais área superficial do que outros na interface, isto é, os resíduosos quais não expõem significativamente mais de sua área superficial para asuperfície da proteína dobrada, são consideradas como sendo mais cruciais para a estabilidade da interface. A área superficial que cada resíduo contri-bui para a interface pode ser determinada usando técnicas reconhecidas natécnica (por exemplo, análise usando o software MOLMOL). Em algumasmodalidades, o resíduo da interface encobre no mínimo 10 Á2 de área super-ficial (por exemplo, 10 Á2, 15 Â2, 20 Â2, 25 A2 ou mais de área superficial encoberta).

Resíduos da proteína candidata localizados em posições de a-minoácidos correspondentes às dos resíduos importantes (por exemplo, re-síduos da interface encobertos) da proteína modelo são preferencialmentesubstituídos se são de um tipo não-idêntico. Em algumas modalidades, so- mente são feitas substituições não-conservativas. Em outras modalidades,somente são feitas substituições conservativas.

Em modalidades exemplares, as proteínas modelo e candidatassão moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos ou variantes dos mesmos(por exemplo, moléculas scFv)). Em uma modalidade, a interface que é e-xaminada é aquela entre um domínio Fc (por exemplo, articulação, CH2, eCH3) e outro domínio Fe. Em outra modalidade, a interface é aquela forma-da entre o domínio Vh e o domínio VL.

Em modalidades preferenciais, os projetos são focalizados so-bre a interface entre os domínios VH e VL de um anticorpo. Dados biofísicos(vide dados de DSC - Exemplo 15) sugerem que a afinidade de VH e VL umpara o outro é marginal no formato de scFv (isto é na ausência dos domíniosCH1 e CL do Fab). Em particular, interações de VH e VL não são sempresuficientemente fortes (isto é, não têm suficiente afinidade para levar a umaentidade única cooperativamente dobrada. Portanto, aumentar a estabilidadeda interface VH/VL (isto é, aumentar a afinidade entre os domínios VH e VL)pode ser uma via preferencial para reforçar a estabilidade de anticorpo /scFv. Estabilizando a interface, a transição de dobramento de anticorpo po-de ser convertida em um único evento, aumentar a afinidade dos domíniosum pelo outro, e possibilitar flutuações menos dinâmicas que podem levar aárea superficial hidrofobica exposta (conforme observado por experimentosde ligação de ANS).

Em ainda outras modalidades, os projetos podem ser validadosusando experimentos de calorimetria de varredura difierencial (DSC) osquais possibilitam que uma pessoa versada na técnica observe não quantita-tivamente aumentos de afinidade real entre o VH e VL.(c) Covariacão Combinada e Desiqn de Interface

Em ainda outros aspectos da invenção, duas ou mais das ferra-mentas de criação à base de seqüência descritas aqui, neste Pedido de pa-tente, podem ser empregadas para a criação de variantes de proteínas oti-mizadas. Em uma modalidade típica, design de interface é empregado juntocom análise de covariação para determinar resíduos ou posições de resí-duos os quais são importantes para a estrutura e função da proteína, inclu-indo, por exemplo, estabilidade protéica. Em uma modalidade típica, análisede covariação é usada para determinar resíduos ou posições de resíduosfora de uma interface (aqui, neste Pedido de patente, denominada "resíduosde estruturação") que não interagem fisicamente com os resíduos da interfa-ce sobre o domínio oposto ou contribuem com área superficial para a inter-face, mas não obstante são importantes para proporcionar contexto estrutu-ral apropriado para resíduos da interface. Por exemplo, análise de covaria-ção pode ser conduzida sobre resíduos localizados dentro da interface paraidentificar resíduos de estruturação os quais covariam com os resíduos dainterface. Preferencialmente, resíduos da interface os quais encobrem umalto grau de área superficial (por exemplo, resíduos que encobrem no míni- mo 40 Á2 de área superficial) são selecionados para análise de covariação.Resíduos de estruturação os quais covariam com os resíduos da interfaceselecionados são então identificados usando os métodos de covariação dainvenção. Preferencialmente, são selecionados resíduos dos quais covariamfortemente (por exemplo, valor de phi de no mínimo 0,25). Em outra modali-dade preferencial, são selecionados resíduos de estruturação se eles cova-riam com no mínimo dois resíduos da interface (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10 ou mais resíduos da interface). Quanto maior o número de covaria-ções, maior o escore de covariação que pode ser atribuído ao resíduo deestruturação, uma vez que o número de covariações é preditivo da contribui-ção feita pelo resíduo de estruturação para estabilizaçaõ da interface VH/VL.

Os métodos deste aspecto da invenção envolvem as seguintes

etapas:

(1) proporcionar modelos estruturais de uma proteína modeloe uma proteína candidata;

(2) identificar resíduos da interface (por exemplo, VH/VL) naproteína modelo que são importantes para estabilidade;

(3) identificar resíduos de estruturação os quais covariam comos resíduos da interface da etapa (2), por exemplo, usando a Ferramenta deAnálise de Covariação descrita aqui, neste Pedido de patente;

(4) substituir um ou mais resíduos da interface ou resíduos deestruturação na proteína candidata com os resíduos correspondente ou resí-duos de estruturação identificados nas etapas (2) e (3).Resíduos da proteína candidata localizados em posições de a-minoácido correspondentes as dos resíduos importantes (por exemplo, resí-duos de interface ou de estruturação) da proteína modelo são preferencial-mente substituídos se eles são de um tipo não -idêntico. Em algumas moda-lidades, somente são feitas substituições não-conservativas. Em outras mo-dalidades, somente são feitas substituições conservativas.

Em uma modalidade, da invenção, a seqüência aprimorada deum dado polipeptídeo é armazenada ou fornecida como resultado. Em outramodalidade, um polipeptídeo selecionado pode ser formulado para uso tera-pêutico.

V. Sistemas. Interfaces, e Métodos Implementados por Computador

Um aspecto da invenção pertence a métodos (por exemplo, mé-todos implementados por computador), equipamentos, e software para im-plementar os métodos de seleção ou de criação da invenção. Em modalida-des exemplares, a invenção proporciona um método e equipamento imple-mentado por computador para identificar resíduos aminoácidos (por exem-plo, resíduos aminoácidos covariantes) em uma seqüência candidata. Emoutra modalidade, a invenção proporciona métodos e equipamento imple-mentados por computador para classificar uma ou mais seqüências de en-saio ou candidatas por um escore (por exemplo, uma classificação de con-senso ou escore de covariação) o qual é preditivo de uma propriedade biofí-sica (por exemplo, estabilidade protéica, atividade catalítica, atividade tera-pêutica, resistência a um patógeno ou toxina, toxicidade, e etc).

O aspecto do métodos implementados por computador pode serdescrito pela seguinte seqüência de operações: (a) receber dados (por e-xemplo, dados de seqüência ou estruturais) caracterizando uma série dereferência e uma seqüência de ensaio; (b) a partir dos dados, calcular umescore (por exemplo, um escore de covariação ou classificação de consen-so); (c) classificar os escores para identificar uma ou mais seqüências ouresíduos aminoácidos de interesse.

Em algumas modalidades, os escores são classificados paraidentificar um ou mais resíduos aminoácidos que devem permanecer fixadosna seqüência de ensaio ou candidata. Em outras modalidades, os escoressão classificados para identificar um ou mais resíduos aminoácidos os quaissão candidatos para substituição. Em uma modalidade típica, o método im-plementado por computador classifica posições de resíduos (ou resíduosespecíficos em algumas posições) na ordem do escore de covariação. Emoutra modalidade exemplar, o método implementado por computador classi-fica seqüências candidatas na ordem da classificação de consenso.

Ainda outro aspecto da invenção pertence a equipamento emeios legíveis à máquina nos quais são proporcionados instruções de pro-grama e/ou arranjos de dados para implementar os métodos descritos aci-ma. Freqüentemente, as instruções do programa são proporcionadas comocódigo para realizar algumas operações do método. Dados, caso emprega-dos para implementar características desta invenção, podem ser proporcio-nados como estruturas de dados, tabelas de banco de dados, objetos dedados, ou outros arranjos apropriados de informação especificada. Quais-quer dos métodos ou sistemas desta invenção podem ser representados, notodo ou em parte, como instruções de programa similares e/ou dados pro-porcionados sobre meios legíveis por máquina.

Os métodos implementados por computador da invenção podeincluir um dispositivo de saída que apresenta as informações a um usuário(por exemplo, um display de CRT, um LCD, uma impressora, um dispositivode comunicação tal como um modem, saída de áudio, e similares). Alémdisso, instruções (por exemplo, an algoritmo) para realizar o cálculo, no todoou em parte, podem ser conferidas a um meio adequado para uso em umdispositivo eletrônico para realizar as instruções. Portanto, os métodos dainvenção são suscetíveis a uma abordagem de alta produtividade compre-endendo software (por exemplo, instruções legíveis por computador) ehardware (por exemplo, computadores, robótica, e chips). O processo im-plementado por computador não é limitado a uma plataforma de computadorparticular, processador particular, ou linguagem de programação de alto ní-vel particular.

Em algumas modalidades, os cálculos usados nos métodos dainvenção são realizados por um algoritmo de computador adequado parauso com uma linguagem de programação de computador (por exemplo,PERL). Em modalidades exemplares, o algoritmo de computador é projeta-do para reconhecer (i) um alinhamento de seqüência de uma série de refe-rência e/ou (ii) uma ou mais seqüências de ensaio como input para o algo-ritmo.

(i) Classificação de Consenso Implementada por Computador

Em um aspecto da invenção pertence a método implementadopor computador, equipamento, e software para conduzir o método de classi-ficação de consenso da invenção descrito acima usando um algoritmo im-plementado por computador. Em modalidades exemplares, o algoritmo éprojetado para realizar uma ou mais das seguintes etapas: (1) cortar cadaposição de resíduo do alinhamento como uma coluna e calcular a freqüênciade resíduo de consenso nesta posição; (2) cortar cada posição de resíduo da uma ou mais seqüências de ensaio e calcular a freqüência de resíduo deensaio nesta posição, e (3) dividir a freqüência de resíduo de ensaio pelafreqüência de resíduo de consenso para dar uma classificação de consenso;e/ou (4) somar a classificação de consenso em cada posição para dar umaclassificação de consenso total. Em outras modalidades, o algoritmo podeser projetado para realizar uma ou mais das seguintes etapas adicionais: (5)calcular a classificação de consenso média da série de referência, e/ou (6) oescore de seqüência da seqüência de ensaio.

Estes aspectos da invenção também são incorporados em umsistema para conduzir o método de classificação de consenso da invenção. O sistema inclui (a) um computador que inclui um banco de dados capaz dearmazenar no mínimo uma população de séries de referência, e (b) softwarede sistema. O software de sistema inclui uma ou mais instruções de lógicapara conduzir quaisquer das etapas (1) a (6) do método de classificação deconsenso implementado por computador.

A invenção também proporciona um produto de programa decomputador para conduzir o método de classificação de consenso da inven-ção. O produto de programa de computador inclui um meio legível por com-putador tendo um ou mais instruções de lógica para conduzir quaisquer dasetapas (1) a (6).

(W) Análise de Covariação Implementada por Computador

Outro aspecto da invenção pertence a método implementadopor computador para conduzir a método de análise de covariação da inven-ção conforme descrito acima usando um algoritmo implementado por com-putador. Em modalidades exemplares, os métodos realizam uma ou maisdas seguintes etapas: (1) cortar cada posição de resíduo da série alinhadacomo uma coluna; (2) arranjar colunas em uma matriz; (3) calcular a correla-ção entre várias colunas na matriz para derivar um termo correlativo; (4) adi-cionar termos correlativos a termos lineares, os quais correspondem a resí-duos aminoácidos, paa gerar uma matriz preditora expandida; (5) gerar ummodelo derivado heuristicamente (por exemplo, um modelo de Markov ocul-to) a partir da matriz preditora expandida para identificar correlações importantes.

Estes aspectos da invenção também são incorporados em umsistema para conduzir o método de análise de covariação da invenção. Osistema inclui (a) um computador que inclui um banco de dados capaz dearmazenar no mínimo uma população de bibliotecas de cadeias de qualida-des características, e (b) software de sistema. O software de sistema incluiuma ou mais instruções de lógica para conduzir quaisquer das etapas (1) a(5) do método de classificação de covariação de método implementado porcomputador.

A invenção também proporciona um produto de programa de25 computador para conduzir o método de classificação de covariação da in-venção. O produto de programa de computador inclui um meio legível porcomputador tendo uma ou mais instruções de lógica para conduzir quaisquerdas etapas (1) a (5).

(iii) Interfaces Gráficas do Usuário para Análise de Covariação

Em alguns aspectos típicos, a invenção proporciona uma novainterface gráfica do usuário (GUI) para uso com os métodos de covariaçãoda invenção. Esta ferramenta de análise de covariação, denominada NAP-MAP, auxiliar o usuário a visualizar covariações no contexto de série alinha-da de seqüências. A nova interface gráfica do usuário é implementada porcomputador usando linguagens de programação reconhecidas na técnica(por exemplo, em Java 1.4.2 utilizando a Processing Library em proces-sing.org).

(a) Lavouts de Grade

Em um aspecto, a interface gráfica do usuário da invenção com-preende uma representação gráfica de um alinhamento (por exemplo, umalinhamento de seqüência criado de acordo com os métodos da invenção acima) ou dados correspondentes do mesmo. Uma simples forma deste dis-play é o Iayout de grade. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, otermo "layout de grade" (também conhecido como uma plataforma de ali-nhamento) se refere a uma matriz na qual as propriedades de um alinha-mento são representados. Em uma modalidade, o layout de grade grafica- mente representa posições de resíduos das seqüências de um alinhamento.Em outra modalidade, o layout de grade graficamente representa tipos deresíduo de seqüências dentro do alinhamento. Em outra modalidade, o la-yout de grade graficamente representa a freqüência de tipos de resíduo (ou"freqüência de uso de resíduo") dentro do alinhamento. Em ainda outras modalidades, o layout de grade representa um ou mais propriedades de re-síduos dentro do alinhamento (por exemplo, hidrofobicidade, carga, tama-nho, pKa, e etc.).

Em algumas modalidades exemplares, o layout de grade com-preende um display representativo de (i) posições contíguas de resíduoscorrespondentes a uma seqüência do alinhamento; e (ii) freqüência de usode resíduos para tipos de resíduo em cada posição de resíduo do alinha-mento de seqüência. Em uma modalidade, a freqüência de uso de resíduo érepresentada simbolicamente (por exemplo, por um círculo ou quadrado).Em outras modalidades, todos os 20 aminoácidos naturais, intervalos, e re-síduos ambíguos são representados. Em algumas modalidades, as posiçõesde resíduos são apresentadas em linhas e a freqüência de uso de resíduossão apresentadas em colunas. Em algumas modalidades, as posições deresíduos são apresentadas em colunas e a freqüência de uso de resíduossão apresentados em linhas.

Em uma modalidade, a freqüência de uso de resíduos se corre-laciona (por exemplo, correlacionados positivamente ou negativamente) como tamanho do símbolo (por exemplo, tamanho do círculo), de modo que re-síduos mais conservados podem ser discriminados de resíduos observadosmenos freqüentemente. Por exemplo, a freqüência de resíduos pode ser re-presentada como círculos de vários tamanhos com área de círculo propor-cional à freqüência de seu uso. O raio de cada círculo (R) pode ser usadopara desenhar o nó usando uma função de elipse calculada de acordo com aseguinte fórmula (IV)

<formula>formula see original document page 116</formula>

em que:

A = área média desejada de todos os nósN = número de seqüências usando este resíduoM = o número médio de seqüências usando cada resíduo

Em uma modalidade exemplar, o Iayout de grade compreendeuma matriz de colunas e linhas contíguas em que (i) colunas contíguas re-presentam graficamente posições contíguas correspondentes de resíduos doalinhamento; (ii) cada uma das linhas contíguas representam graficamenteum tipo de aminoácido específico; e (iii) a freqüência de uso de resíduo emcada posição de é representada graficamente em cada célula da matriz. Pre-ferencialmente todos os tipos de resíduo (por exemplo, todos os 20 aminoá-cidos e/ou intervalos possíveis) são representados por uma linha separadano Iayout de grade. Mais preferencialmente, a freqüência de uso de resíduoem cada posição de resíduo do alinhamento é representada graficamenteem cada célula da matriz com um símbolo (por exemplo, um círculo) cujotamanho se correlaciona (por exemplo, correlacionado positivamente) com afreqüência de uso do resíduo. Um Iayout de grade típico é representado naFigura 76.(b) Revestimentos de Covariacão

Em outros aspectos, a interface gráfica do usuário da invençãocompreende uma representação gráfica de uma ou mais covariações (porexemplo, covariações identificadas de acordo com os métodos da invenção acima) ou dados correspondentes às mesmas.

Em algumas modalidades, a interface gráfica do usuário da in-venção compreende representação gráfica tanto de (i) um Iayout de grade;quanto de (ii) uma ou mais covariações. Nestas modalidades, o Iayout degrade pode servir como plataforma de alinhamento para o display de dados de covariação. Dados de covariação podem ser apresentados, por exemplo,revestindo o Iayout de grade com dados de covariação. Dados de covariaçãoarranjados deste modo são denominados um "revestimento de covariação".Por exemplo, covariações podem ser representadas no revestimento de co-variação como linhas ou rede de linhas conectando dois ou mais aminoáci- dos covariáveis que são representados graficamente dentro do Iayout degrade.

As linhas do revestimento de covariação podem ser de váriasespessuras (por exemplo, linhas finas ou barras) ou continuidades (por e-xemplo, tracejadas ou sólidas, retas ou dentadas), na medida que a conexão entre dois ou mais aminoácidos covariáveis seja aparenta para o usuário(vide, por exemplo, a Figura 77, em que covariações são represenadas co-mo barras sem !transparentes que conectam dois aminoácidos covariáveis).Em algumas modalidades exemplares, a representação gráfica da covaria-ção pode representar adicionalmente a importância estatística da covariação (por exemplo, seu valor de φ ou de χ2). Em uma modalidade típica, a espes-sura de uma linha dentro do revestimento da covariação pode ser proporcio-nal à importância estatística da covariação. Por exemplo, a espessura dalinha do revestimento de covariação pode ser desenhada em proporção aovalor de φ de acordo com a fórmula V:

<formula>formula see original document page 117</formula>

em que:

W = espessura de linhaΦ = phi (coeficiente de correlação)

N = multiplicador de amplificação

M = espessura de linha máx

Em outra modalidade exemplar, covariações positivas e negati-vas podem ser discriminadas graficamente umas das outras (por exemplo,por linhas coloridas ou espessuras diferentes). Em ainda outras modalida-des exemplares, somente covariações acima de um certo nível de limiar deimportância estatística são apresentadas ao usuário. Por exemplo, em algu-mas modalidades, podem ser aplicados cortes do valor de φ para visualizarsomente covariações com forças de correlação desejadas,

(c) Traços de Seqüência

Em outros aspectos opcionais, a interface gráfica do usuáriocompreende uma representação gráfica de uma seqüência de interesse paraauxiliar com possíveis esforços de criação de proteína. A seqüência de inte-resse pode ser a seqüência de ensaio ou candidata (isto é, uma seqüênciade entrada ou pode ser uma seqüência na qual covariações desejáveis sãointegradas (isto é, uma seqüência de saída). A seqüência de interesse podeser representada graficamente como uma linha.

Em uma modalidade, a interface gráfica compreende tanto (i)uma representação de uma seqüência de interesse; quanto (ii) um Iayout degrade (por exemplo, a seqüência de interesse é sobreposta sobre o Iayoutde grade). Em outra modalidade, a interface gráfica compreende tanto (i)uma representação de uma seqüência de interesse; quanto (ii) um revesti-mento de covariação (por exemplo, a seqüência de interesse é sobrepostasobre o revestimento de covariação). Em ainda outras modalidades, a inter-face gráfica compreende (i) uma representação de uma seqüência de inte-resse; (ii) um revestimento de covariação; e (iii) um Iayout de grade (por e-xemplo, a seqüência de interesse é sobreposta (por exemplo, acompanha-mento) sobre o revestimento de covariação o qual é por sua vez sobrepostosobre o Iayout de grade).

Uma seqüência de interesse pode ser apresentada sobre umlayout de grade, por exemplo, como uma curva conectando aminoácidosadjacentes que são representados graficamente dentro do Iayout de grade.Uma seqüência de interesse apresentada deste modo é denominada um"traço de seqüência". Em modalidades preferenciais, o traço de seqüênciadeve passar ou atravessar através de somente uma célula (ou respresenta-ção gráfica de um tipo de aminoácido) para uma linha ou coluna em particu-lar do Iayout de grade que representa uma posição de resíduo em particular.Mais preferencialmente, o traço de seqüência passa através da célula a qualrepresenta graficamente o tipo de resíduo ocorrendo em uma posição deresíduo particular dentro da seqüência de interesse. O traço de seqüênciapode passar através de todas as células do Iayout de grade que represen-tam um resíduo dentro da seqüência de interesse, ou pode passar atravésde somente as células que representam uma porção da seqüência de inte-resse. Um traço de seqüência típico de uma seqüência de interesse é repre-sentado na Figura 77. Traços de seqüências representados na mesma (spli-nes de catmull-rom) foram desenhados usando uma função de Bezier. Da-dos dois nós para desenhar uma curva de Bezier de transição de seqüência,os nós dos pares de nós anterior e seguinte são usados como pontos deâncora e os próprios dois nós são usados como o primeiro e segundo pontosde controle. Para os da primeira coluna (representando os primeiros resí-duos de seqüências de aminoácidos), o primeiro ponto de controle dobracomo seu ponto de âncora; para os da última coluna, seu segundo ponto decontrole dobra como seu ponto de âncora.

Em modalidades preferenciais, o gráfico do traço de seqüência étornado interativo para manipulação pelo usuário. Por exemplo, as célulasdentro do Iayout de grade (representando talvez tornadas interativas paraseleção pelo usuário. Em uma modalidade, a célula selecionada pode seratribuído um estado de seleção particular (por exemplo, um estado de sele-ção positivo, neutro, ou negativo). Em uma modalidade típica, uma célularepresentando um resíduo particular pode ser selecionada positivamentepelo usuário de modo que o traço de seqüência pode ser retraçado parapassar através da célula selecionada. Por exemplo, se uma célula for sele-cionada positivamente pelo usuário, múltiplos traços de seqüências podemser gerados para todas as seqüências de interesse (por exemplo, todas asseqüências dentro da série de referência ou alinhamento) que empregam oresíduo representado pela célula selecionada positivamente. Em uma moda-lidade alternativa, uma célula representando um resíduo particular pode serselecionada negativamente pelo usuário de modo que o traço de seqüêncianão passa através da célula selecionada. Por conseguinte, traços de se-qüências podem ser gerados para cada seqüência de interesse (por exem-plo, todas as seqüências dentro da série de referência ou alinhamento) queexclui o resíduo representado pela célula selecionada negativamente.

Múltiplas seqüências de interesse podem ser apresentadas gra-ficamente, na medida que possam ser distinguidas pelo usuário (por exem-plo, usando diferentes espessuras ou continuidades de linhas). Por exem-plo, para comparar diferentes alinhamentos de seqüência, traços de seqüên-cias representando múltiplas seqüências de interesse de dois ou mais ali- nhamentos podem ser revestidos sobre o Iayout de grade (por exemplo, comcores diferentes, preferencialmente cores opostas) para permitir a visualiza-ção de uso de resíduo diferencial em uma escala global,(d) Modos de Displav

A interface gráfica do usuário pode facilitar qualquer funcionali-dade reconhecida na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, a in-terface gráfica do usuário pode ser capaz de girar em movimento panorâmi-co ou dar um zoom sobre diferentes porções do Iayout de grade. Por exem-plo, o tamanho da janela de visualização do Iayout de grade pode ser altera-do dependendo da resolução de tela do computador do usuário e a visuali- zação pode sair de close-up ou ser girada em movimento panorâmico paravisualizar um alinhamento que não se ajusta na janela de visualização inici-almente.

Em modalidades preferenciais, é empregado mascaramento dedados, por exemplo, para enfatizar os pares de covariações mais importan- tes e/ou redes através de vários pares. A interace gráfica do usuário da in-venção pode empregar um ou mais modos de display para a visualização decovariações (por exemplo, covariações estatisticamente signicativas). Prefe-rencialmente, os modos de display referidos estão disponíveis em um gráficointerativo ao visualizar um traço de seqüência de uma seqüência de interes-se. Viewermodes típicos são como se segue:

Modo de visualização n° 1: Somente são apresentadas covaria- ções entre resíduos que também estão presentees na seqüência de interes-se. Estas covariações podem ser consideradas como interações resíduo-resíduo concluídas por hipótese (por exemplo, aquelas encontradas por aná-lise estatística da freqüência de pares de resíduos) que mantêm a moléculade proteína correspondente junto e podem ser importantes para função.

Modo de visualização n° 2: As únicas covariações apresentadassão aquelas entre pares de resíduos tendo somente um resíduo do par deresíduos presente na seqüência de interesse. Estas covariações são intera-ções resíduo-resíduo que tendem a ser conservadas mas não estão presen-tees na seqüência de interesse, e cuja ausência pode ser prejudicial à esta-bilidade protéica. Este modo de visualização é particularmente preferencialquando a Ferramenta de Análise de Covariação é empregada para criaçãode proteína (vide aSeção IV acima).

Modo de visualização n° 3: As únicas covariações apresentadassão aquelas entre pares de resíduos não tendo nehum membro aminoácidodo par covariante presente na seqüência de interesse.

Em algumas modalidades, todos os viewermodes são apresen-tados ao usuário mas cada um em um único formato de display. Em outramodalidade, todos os viewermodes são apresentados separadamente (porexemplo, em janelas de display separadas).

A Figura 89 representa um ambiente típico adequado para prati-car uma modalidade da invenção. Um dispositivo de computação 8900 su-porta um processo de compilação de seqüências inicial 8902 e facilidade deanálise 8904. O dispositivo de computação 8900 pode ser uma estação detrabalho, um servidor, um laptop, um mainframe, um PDA ou outro dispositi-vo de computação equipado com um ou mais processadores e capaz de su-portar o processo de compilação de seqüências inicial 8902 e a facilidade deanálise 8904. O dispositivo de computação 8900 pode ter um único proces-sador ou múltiplos processadores e cada um dos processadores pode ter umnúcleo ou múltiplos núcleos. A facilidade de análise 8904 é implementadaem software e analisa programaticamente covariação entre pares de resí-duos dentro do alinhamento para obter dados de covariação. O dispositivode computação 8900 está em comunicação com, e fornece dados para, umdispositivo de display de saída 8910. O dispositivo de display de Saída 8910apresenta uma interface gráfica do usuário (GUI) 8912 gerada pela facilida-de de análise 8904. A interface gráfica do usuário 8912 pode incluir um Ia-yout de grade 8914 e um revestimento de covariação 8916. O dispositivo decomputação 8900 também pode estar em comunicação sobre uma rede8920 com uma ou mais localizações de armazenamento 8930 e 8940 queencerram respectivamente dados de seqüências 8932 e 8942. O processode compilação de seqüências inicial 8902 recupera programaticamente se-qüências candidatas dos dados de seqüências 8932 e 8942 com base emparâmetros supridos pelo usuário e/ou predeterminados. Os dados de se-qüências recuperados são analisados pela facilidade de análise 8904. Seráreconhecido por aqueles versados na técnica que embora o processo decompilação de seqüências inicial 8902 e facilidade de análise 8904 sejamreporesentados separadamente na Figura 89, podem ser implementadoscomo parte de uma aplicação, processo ou plug-in integrados. Similarmente,deve ser reconhecido que o processo de compilação de seqüências inicial8902 e facilidade de análise podem cada um separadamente ser uma tarefa,linha, processo, aplicação ou plug-in. O dispositivo de computação 8900 po-de comunicar sobre a rede 8920 com as localizações de armazenamento8930 e 8940 usando uma série de meios e configurações diferentes. Porexemplo, a rede 8920 podem ser arranjada como uma rede de área localLAN (Local Area Network), uma rede de área ampla WAN (Wide Area Net-work), uma intranet, a Internet, e/ou pode ser uma rede wireless e/ou umalinha de telefone, ou algum outro tipo de rede possibilitando ao dispositivo decomputação 8900 se comunicar com as localizações de armazenamento8930 e 8940. As localizações de armazenamento 8930 e 8940 podem serbancos de dados ou algum outro tipo de estrutura de dados de armazena-mento hospedado pelos dispositivos de computação que estão acessíveissobre a rede 8920. Deve ser observado que embora componentes da pre-sente invenção sejam representados em uma configuração particular na Fi-gura 89, outars configurações de componentes também são possíveis dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, o processo de compilação deseqüências inicial 8902 e facilidade de análise 8904 podem estar localizadossobre dispositivos de computação separados e/ou os dados de seqüências8932 e 8942 podem estar localizados sobre um ou mais bancos de dadoshospedados pelo dispositivo de computação 8900.

A Figura 90 é um fluxograma de uma seqüência típica de etapasque podem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modo a de-terminar um escore de covariação de seqüência que pode ser usado comouma medida da estabilidade de um polipeptídeo. A seqüência se inicia com oprocesso de compilação de seqüências inicial 8902 proporcionando alinha- mento de uma série de referência curada de seqüências correspondentes auma dobra de Ig de um polipeptídeo (etapa 9000). A facilidade de análise8904 então calcula covariação entre resíduos da seqüência do alinhamentoconforme descrito aqui, neste Pedido de patente, para gerar dados de cova-riação (etapa 9002). A facilidade de análise 8904 usa os dados de covaria- ção para determinar um escore de covariação de seqüência para uma se-qüência candidata entre covariações dentro dos dados de covariação (etapa9004). O escore de covariação de seqüência determinado proporciona umindicador da medida de estabilidade do polipeptídeo e pode ser armazenadoe/ou fornecido a um usuário através da interface gráfica do usuário 8912 ou em alguma outra maneira (etapa 9006).

Conforme observado acima, a facilidade de análise 8904 tam-bém pode ser usada para determinar uma classificação de consenso. A Fi-gura 91 é um fluxograma de uma seqüência típica de etapas que podem serseguidas por uma modalidade da invenção de modo a determinar e usaruma classificação de consenso para prever a estabilidade de uma proteínacandidata. A seqüência se inicia usando o processo de compilação de se-qüências inicial 8902 para proporcionar uma série de referência de seqüên-cias correspondentes a uma seqüência de domínio de ensaio de uma proteí-na candidata (etapa 9100). A facilidade de análise 8904 então determinafreqüências de resíduos em posições de aminoácido dentro da seqüência dedomínio de ensaio para obter uma classificação de consenso (etapa 9102).

A classificação de consenso determinada pode ser então armazenada e/oufornecida a um usuário para proporcionar uma previsão da estabilidade daproteína candidata (etapa 9104).

A facilidade de análise 8904 também pode ser usada para de-terminar uma classificação de consenso média. A Figura 92 é um fluxogramade uma seqüência típica de etapas que podem ser seguidas por uma moda-lidade da invenção de modo a determinar e usar uma classificação de con-senso média como uma medida da estabilidade de uma proteína candidata.A seqüência se inicia usando o processo de compilação de seqüências inici-al 8902 para proporcionar uma série de referência de seqüências correspon-dentes a uma seqüência de domínio de ensaio de uma proteína candidata(etapa 9200). A facilidade de análise 8904 então determina freqüências deresíduos em posições de aminoácido dentro da seqüência de domínio deensaio para obter uma classificação de consenso (etapa 9202). A facilidadede análise 8904 também determina freqüências de resíduos dentro das se-qüências da série de referência para determinar uma classificação de con-senso média (etapa 9204). A classificação de consenso é comparada com aclassificação de consenso média de modo a determinar um escore de se-qüência (etapa 9206) e o escore de seqüência determinado pode ser entãoarmazenado e/ou fornecida a um usuário para proporcionar uma previsão daestabilidade da proteína candidata (etapa 9206).

A Figura 93 é um fluxograma de uma série típica de etapas quepodem ser seguidas por uma modalidade da invenção de modo a identificare substituir um resíduo aminoácido que falha em satisfazer uma covariaçãocom o resíduo covariável encontrado em uma posição correspondente noalinhamento para determinar uma seqüência aprimorada de aminoácidos dopolipeptídeo. A seqüência se inicia pelo processo de compilação de seqüên-cias inicial 8902 proporcionando alinhamento de uma série de referência cu-rada de seqüências correspondentes a uma dobra de Ig de um polipeptídeo(etapa 9300). A facilidade de análise 8904 então calcula covariação entreresíduos da seqüência do alinhamento para identificar resíduos covariáveis(etapa 9302). A facilidade de análise 8904 pode identificar um resíduo parti-cular do polipeptídeo que falha em satisfazer uma covariação e pode substi-tuir um resíduo covariável encontrado em uma posição correspondente noalinhamento (etapa 9304) de modo a melhorar a seqüência do polipeptídeo.A seqüência aprimorada pode ser então armazenada ou fornecida a um u-suário (etapa 9306).

A presente invenção pode ser proporcionada como um ou maisprogramas legíveis por computador incorporados sobre ou em um ou maismeios. Os meios podem ser um disquete, um disco rígido, um CD, um discoversátil digital, um cartão de memória, uma PROM, uma MRAM, uma RAM,uma ROM, ou uma fita magnética. Em geral, os programas legíveis porcomputador podem ser implementados em qualquer linguagem de progra-mação. Alguns exemplos de linguagens que podem ser usados incluemFORTRAN, C, C++, C#, Python ou Java. Os programas de software podemser armazenados sobre ou em um ou mais meios como código de objeto.Aceleração de hardware pode ser usada e todo ou uma porção do códigopode rodar em um FPGA, um ASIP, ou um ASIC. O código pode rodar emum ambiente virtualizado tal como em uma máquina virtual. Múltiplas máqui-nas virtuais rodando o código podem estar presentes sobre um único pro-cessador.

VI. Métodos para Avaliar a Estabilidade Protéica

As propriedades de estabilidade das composições da invençãopodem ser analisadas usando métodos conhecidos na técnica. Podem serempregados parâmetros de estabilidade aceitáveis por aqueles na técnica.Parâmetros tíipicos são descritos em mais detalhes abaixo. Em modalidadesexemplares, é avaliada a estabilidade térmica. Em modalidades preferenci-ais, são avaliados os níveis de expressão (por exemplo, medidos por % deprodução) das composições da invenção. Em outras modalidades preferen-ciais, são avaliados os níveis de agregração das composições da invenção.Em algumas modalidades, as propriedades de estabilidade deuma composição de uma invenção são comparadas com as de um controleadequado. Controles típicos incluem molécula scFv convencional. Um con-trole particularmente preferencial é uma molécula scFv (GIy4Ser)3.

Em uma modalidade, são medidos um ou mais parâmetros des-critos abaixo. Em uma modalidade, um ou mais destes parâmetros é medidodepois de expressão em uma célula mamífera. Em uma modalidade, um oumais parâmetros descritos abaixo são medidos sob condições de fabricaçãoem larga escala (por exemplo, expressão de scFvs ou moléculas compreen-dendo scFvs em um biorreator).

a) Estabilidade Térmica

A estabilidade térmica das composições da invenção pode seranalisada usando uma série de técnicas biofísicas ou bioquímicas não-limitantes conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a estabilidadetérmica é avaliada por espectroscopia analítica.

Um típica método de espectroscopia analítica é Calorimetria deVarredura Diferencial (DSC). DSC emprega um calorímetro o qual é sensívelàs absorvências de calor que acompanham o desdobramento da maioria dsaproteínas ou domínios protéicos (vide, por exemplo, Sanchez-Ruiz, et al.,Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Para determinar a estabilidade térmica deuma proteína, uma amostra da proteína é inserida no calorímetro e a tempe-ratura é aumentada até o Fac ou scFv se desdobrar. A temperatura na quala proteína se desdobra é indicativa da estabilidade protéica global.

Outro método de espectroscopia analítica típico é espectrosco-pia por Dicroismo Circular (CD). A espectroscopia por CD mede a atividadeótica de uma composição como uma função da temperatura crescente. Aespectroscopia por dicroismo circular (CD) mede diferenças na absorção deluz polarizada levógira versus luz polarizada dextrógira a qual surge devido aassimetria estrutural. Uma estrutura desordenada ou desdobrada resulta emum espectro de CD muito diferente daquele de uma estrutura ordenada oudobrada. O espectro de CD reflete a sensibilidade das proteínas aos efeitosdesnaturantes de temperatura crescente e portanto é indicativo da estabili-dade térmica de uma proteína (vide van Mierlo e Steemsma, J. Biotechnol.,79(3):281-98, 2000).

Outro método típico de espectroscopia analítica para medir aestabilidade térmica é Espectroscopia por Emissão de Fluorescência (videvan Mierlo e Steemsma, acima). Aionda outro método típico de de espec-troscopia analítica para medir a estabilidade térmica é espectroscopia porRessonância Magnética Nuclear (NMR) (vide, por exemplo, van Mierlo eSteemsma, acima).

Em outras modalidades, a estabilidade térmica de uma compo-sição da invenção é medida bioquimicamente. Um método bioquímico típicopara avaliar a estabilidade térmica é uma prova de ensaio térmico. Em uma"prova de ensaio térmico", uma composição da invenção é submetida a umafaixa de temperaturas elevadsa por um período de tempo determinado. Porexemplo, em uma modalidade, moléculas scFv de ensaio ou moléculascompreendendo moléculas scFv são submetidas a uma faixa de temperatu-ras crescentes, por exemplo, por 1 a 1,5 horas. A atividade da proteína éentão avaliada por um ensaio bioquímico relevante. Por exemplo, se a prote-ína for uma proteína de ligação (por exemplo, um scFv ou um polipeptídeocontendo scFv da invenção) a atividade de ligação da proteína de ligaçãopode ser determinada por um ELISA funcional ou quantitativo.

Em uma modalidade, um ensaio similar pode ser feito em umformato de alta produtividade. Em outra modalidade, uma biblioteca de scFvvariantes pode ser criada usando métodos conhecidos na técnica. A expres-são de scFv pode ser induzida alguns scFvs podem ser submetidos a estí-mulo térmico. As amostras de ensaio estimuladas podem ser avaliadas paraligação e os scFvs os quais são estáveis podem ser aumentados em escalae adicionalmente caracterizados.

Em algumas modalidades, a estabilidade térmica é avaliadamedindo a temperatura de fusão (Tm) de uma composição da invenção u-sando quaisquer das técnicas acima (por exemplo, técnicas de espectrosco-pia analítica techniques). A temperatura de fusão é a temperatura na qual oponto central de uma curva de transição térmica em que 50% das moléculasde uma composição estão em um estado dobrado.

Em outras modalidades, estabilidade térmica é avaliada medin-do o calor específico ou capacidade térmica (Cp) de uma composição dainvenção usando uma técnica calorimétrica analítica (por exemplo, DSC). Ocalor específico de uma composição é a energia (por exemplo, em kcal/mol)requerida para aumentar por 1 °C, a temperatura de 1 mol de água. Um Cpgrande é um marco de uma composição de proteína desnaturada ou inativa.Em algumas modalidades, a mudança na capacidade térmica (ACp) de umacomposição é medida determinando o calor específico de uma composição antes e depois de sua transição térmica. Em outras modalidades, a estabili-dade térmica pode ser avaliada medindo ou determinando outros parâmetrosda estabilidade termodinâmica incluindo energia de desdobramento livre deGibbs (AG), entalpia de desdobramento (ΔΗ), ou entropia de desdobramento(AS).

Em outras modalidades, uma ou mais das provas bioquímicasacima (por exemplo, uma prova de ensaio térmico) são usadas para deter-minar a temperatura (isto é, o valor da Tc) na qual 50% da composição con-serva sua atividade (por exemplo, atividade de ligação),

b) % de Agregação

Em algumas modalidades, a estabilidade de uma composiçãoda invenção é determinada medindo sua propensão para agregar. A agrega-ção pode ser medida por uma série de técnicas bioquímico ou biofísicasnão-limitantes. Por exemplo, a agregação de uma composição da invençãopode ser avaliada usando cromatografia, por exemplo, Cromatografia de Ex-clusão de Tamanho (SEC). SEC separa moléculas com base no tamanho.Uma coluna é preenchida com contas semi-sólidas de um gel polimérico queadmitirá que íons e moléculas pequenas penetrem no interior mas não molé-culas grandes. Quando uma composição de proteína é aplicada no topo dacoluna, as proteínas dobradas compactas (isto é, proteínas não-agregadas) são distribuídas através de um maior volume de solvente do que é disponívelpara os agregados de proteínas grandes. Conseqüentemente, os agregadosgrandes se movem mais rapidamente através da coluna, e deste modo amistura pode ser separada ou fracionada em seus componentes. Cada fra-ção pode ser quantificada separadamente (por exemplo, por dispersão lumi-nosa) à medida que elutria do gel. Por conseguinte, a % de agregação deuma composição da invenção pode ser determinada comparando a concen-tração de uma fração com a concentração total de proteína aplicada ao gel.Composições estáveis elutriam da coluna como essencialmente uma únicafração e aparecem como essencialmente um único pico no perfil de eluiçãoou cromatograma.

Em modalidades preferenciais, SEC é usado em combinaçãocom dispersão luminosa in-line (por exemplo, dispersão luminosa clássica oudinâmica) para determinar a % de agregação de uma composição. Em al-gumas modalidades preferenciais, dispersão luminosa estática é empregadapara medir a massa de cada fração ou pico, independente do formato mole-cular ou da posição de eluição. Em outras modalidades preferenciais, dis- persão luminosa dinâmica é empregada para medir o tamanho hidrodinâmi-co de uma composição. Outros métodos típicos para avaliar a estabilidadeprotéica incluem SEC de Alta Velocidade (High-Speed SEC, vide, por exem-plo, Corbett et ai, Biochemistrv. 23(8): 1888-94, 1984).

Em uma modalidade preferencial, a % de agregação é determi-nada medindo os agregados de fração de proteína dentro da amostra deproteína. Em uma modalidade preferencial, a % de agregação de uma com-posição é medida determinando a fração de proteína dobrada dentro da a-mostra de proteína,c) % de Rendimento

Em outras modalidades, a estabilidade de uma composição dainvenção é avaliada medindo a quantidade de proteína que é recuperada(aqui, neste Pedido de patente, a "% de produção") depois de expressão(por exemplo, expressão recombinante) da proteína. Por exemplo, a "% deprodução" pode ser medida determinando miligramas de proteína recupera-dos para cada ml de meios de cultura hospedeiro (isto é, mg/ml de proteína).Em uma modalidade preferencial a % de produção é avaliada depois de ex-pressão em uma célula hospedeira mamífera (por exemplo, uma célulaCHO).

d) % de Perda

Em ainda outras modalidades, a estabilidade de uma composi-ção da invenção é avaliada monitorando a perda de proteína em uma faixa de temperaturas (por exemplo, de -80 a 25 °C) depois de armazenamentopor um período de tempo definido. A quantidade ou concentração de proteí-na recuperada pode ser determinada usando qualquer método de quantifica-ção de proteína conhecido na técnica, e comparada com a concentração deproteínainicial. Métodos de quantificação de proteína típicos incluem análise SDS-PAGE ou a prova de Bradford para (Bradford, et ai, Anal. Biochem. 72,248, (1976)). Um preferred método para avaliar a % de perda empregaquaisquer dos métodos de SEC analíticos descritos acima. Será reconhecidoque podem ser determinadas medições da % de Perda sob qualquer condi-ção de armazenamento ou formulação de armazenamento desejada, inclu-indo, por exemplo, preparações de proteínas liofilizadas.

e) % de Proteólise

Em ainda outras modalidades, a estabilidade de uma composi-ção da invenção é avaliada determinando a quantidade de proteína que éproteolisada depois de armazenamento sob condições de rotina. Em uma modalidade exemplar, a proteólise é determinada por SDS-PAGE de umaamostra da proteína em que a quantidade de proteína intacta é comparadacom a quantidade de fragmentos de baixo peso molecular os quais apare-cem sobre o gel do SDS-PAGE. Em outra modalidade exemplar, a proteóliseé determinada por Espectrometria de Massa (MS), em que a quantidade deproteína do peso molecular esperado é comparada com a quantidade defragmentos de proteína de baixo peso molecular dentro da amostra.

f) Afinidade de Ligação

Em ainda outras modalidades, a estabilidade de uma composi-ção da invenção pode ser avaliada determinando sua afinidade de ligação alvo. Uma ampla variedade de métodos para determinar a afinidade de liga-ção são conhecidos na técnica. Um método típico para determinar a afinida-de de ligação emprega ressonância de plasmon superficial. Ressonância deplasmon superficial é um fenômeno ótico que possibilita a análise de intera-ções bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações nas concen-trações de proteínas dentro de uma matriz de biosensor, por exemplo usan-do o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB1 Uppsala, Sweden e Pisca-taway, NJ). Para descrições adicionais, vide Jônsson, U., et ai. (1993) Ann.Biol. Clin. 51:19-26; Jõnsson, U., et ai (1991) Biotechniques 11:620-627;Johnsson, B., et ai (1995) J. Moi Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., et al.(1991) Anal. Biochem. 198:268-277.g) Outros Estudos de Ligação

Em ainda outras modalidades, a estabilidade de uma composi-ção da invenção pode ser avaliada quantificando a ligação de um compostomarcado a porções desnaturadas ou desdobradas de uma molécula de liga-ção. As moléculas referidas são preferencialmente hidrofóbicas, uma vezque preferencialmente ligam ou interagem com grandes fragmentos hidrofó-bicos de aminoácidos que são normalmente enterrados no interior da proteí-na nativa, mas os quais são expostos em uma molécula de ligação desnatu-rada ou desdobrada. Um composto marcado típico é o corante fluorescentehidrofóbico, sulfonato de 1-anilino-8-naftalina (ANS).VII. Métodos para Selecionar Proteínas Estáveis

Os métodos descritos acima para a previsão de estabilidadeprotéica podem ser empregados para selecionar uma proteína candidata(por exemplo, anticorpos) para uso posterior. Em algumas modalidades, osmétodos da invenção são empregados para selecionar uma proteína paraexpressão. Em outras modalidades, os métodos da invenção são usadospara selecionar uma proteína candidata para modificação. Em modalidadesexemplares, os métodos de previsão da invenção podem ser empregados nahumanização de um anticorpo de doador não-humano (por exemplo, paraselecionar uma imunoglobulina aceitadora).

Uma proteína candidata pode ser selecionada com base em suaclassificação de consenso total ou escore de seqüência conforme determi-nado usando os métodos da invenção. Em algumas modalidades, a proteínacandidata é selecionada se sua classificação de consenso for mais de umcontrole negativo adequado (por exemplo, mais de 5%, preferencialmentemais de 10%, mais preferencialmente mais de 20%). Em outras modalida-des, a proteína candidata é selecionada se sua classificação de consensofor substancialmente similar a (por exemplo, dentro de 20%, 10%, ou 5%) oumais de (por exemplo, mais de 5%, preferencialmente mais de 10%, maispreferencialmente mais de 20% ) um controle positivo adequado.

Em outras modalidades, uma proteína candidata é selecionadase sua classificação de consenso for substancialmente similar a sua classifi-cação de consenso ideal ou perfeita (por exemplo, dentro de 30%, preferen-cialmente dentro de 20%, mais preferencialmente dentro de 10%).

Em outras modalidades, uma proteína candidata é selecionadase seu escore de seqüência for mais de zero. Em uma modalidade, a proteí-na candidata é selecionada se seu escore de seqüência for mais de 0,5. Emoutra modalidade, a proteína candidata é selecionada se seu escore de se-qüência for mais de 1. Em outra modalidade, a proteína candidata é selecio-nada se seu escore de seqüência for mais de 2. Em uma modalidade prefe-rencial, a proteína candidata é selecionada se seu escore de seqüência formais de 3.

Em outras modalidades, uma proteína candidata é selecionadase seu Δ escore for mínimo -3, no mínimo -2, ou no mínimo -1, preferencial-mente no mínimo 0, mais preferencialmente no mínimo 1.a. Selecionar uma Imunoglobulina Aceitadora para Humanização de Anticorpos

Anticorpos humanizados podem ser produzidos usando tecnolo-gia de DNA recombinante, vide por exemplo, por exemplo, Queen et al.,Proc. Nati Acad. Sei. USA, (1989), 86:10029-10033; Jones et al., Nature,(1986), 321:522-25; Riechmann et al., Nature, (1988), 332:323-27; Verhoe-yen et al., Science, (1988), 239:1534-36; Orlandi et al., Proc. NatL Acad. Sei.USA, (1989), 86:3833-37; as Patentes dos Estados Unidos Nos. US5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370. Quando um anticorpo de doador não-humano preferencial foi selecionado para hu-manização, pode ser obtido um anticorpo aceitador humano apropriado, porexemplo, de bancos de dados de seqüências de genes de anticorpos huma-nos expressados, de seqüências de Ig de linha germinal ou uma seqüênciade consenso de vários anticorpos humanos. É mais provável que a substitui-ção de CDRs não humanas em uma framework de domínio variável humanoresulte em retenção de sua orientação espacial correta se a framework dedomínio variável humano adoptar a mesma conformação ou similar confor-mação à framework variável não humana da qual se originaram as CDRs.Isto é realizado obtendo os domínios variáveis humanos de anticorpos acei-tadores humanos cujas seqüências de framework aprsentam um alto grau deidentidade de seqüência com os domínios de framework variável não huma-na da qual as CDRs foram derivadas. As regiões de framework variável decadeia pesada e leve podem ser derivadas das mesmas ou de diferentesseqüências de anticorpos humanos. Preferencialmente o anticorpo aceitadorhumano retém os resíduos canônicos e da interface do anticorpo doador.Adicionalmente, o anticorpo aceitador humano preferencialmente tem subs- tancial similaridade na extensão de alças de CDR. Vide Kettleborough et ai,Protein Engineering 4:758 (1991); Kolbinger et a!., Protein Engineering 6:971(1993) e Carter et ai., patente internacional N2 WO 92/22653.

Tendo identificado as CDRs do anticorpo doador e do anticorpoaceitador humano apropriado, a próxima etapa é determinar quais, se hou-ver, resíduos destes componentes devem ser substituídos para otimizar aspropriedades do anticorpo humanizado resultante. Tipicamente, alguns outodos os aminoácidos da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina de doa-dor não-humano que são requeridos para ligação de antígeno (por exemplo,uma ou mais CDRs) são usados para substituto para os aminoácidos cor-respondentes da cadeia leve ou pesada do anticorpo aceitador humano. Oanticorpo aceitador humano retém alguns ou todos os aminoácidos que nãosão necessários para ligação de antígeno. Quando necessário, um ou maisresíduos nas regiões de framework humanas podem ser trocados para resí-duos nas posições correspondentes no anticorpo murino de modo a preser-var a afinidade de ligação do anticorpo humanizado para o antígeno. Estamudança algumas vezes é denominada "retro mutação". Alguns aminoáci-dos dos resíduos de framework de região variável humana são selecionadospara retro mutação com base em sua possível influência sobre a conforma-ção da CDR e/ou ligação a antígeno.

Em alguns casos, no entanto, o processo de humanização resul-ta em mudanças não naturais para o domínio variável o que confere indese- jável instabilidade ao anticorpo humanizado. Por exemplo, a imunoglobulinaaceitadora pode ter raras variações de seqüências que conferem baixa esta-bilidade. Isto é particularmente verdadeiro para algumas seqüências de linhagerminal as quais não podem ser usadas com grande freqüência pelo siste-ma imune.

Os métodos da invenção proporcionam métodos aprimoradospara humanização. Em particular, os métodos da invenção possibilitam queo técnico versado preveja qual seqüência de ensaio (por exemplo, seqüênciade linha germinal de ensaio) com uma série de referência de seqüênciasaceitadoras candidatas (por exemplo, seqüências de linha germinal) sãoconvenientemente estáveis para uso na humanização da seqüência aceita-dora. Seqüências aceitadoras de ensaio (por exemplo, seqüências de linhagerminal) as quais têm um escore que é preditivo de estabilidade aceitável(por exemplo, têm uma alta classificação de consenso comparada com aclassificação de consenso média da série de referência) podem ser selecio-nada\s como uma imunoglobulina aceitadora.

VIII. Métodos à Base de Biblioteca para Identificar Moléculas scFv Estabili-zadas

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodospara identificar moléculas scFv com aprimorada estabilidade protéica, por exemplo, aprimorada estabilidade térmica. Os métodos da invenção com-preendem (i) proporcionar uma biblioteca compreendendo moléculas scFvcandidatas; e (ii) triar a biblioteca para identificar moléculas scFv candidatascom aprimorada estabilidade protéica relativa a um controle adequado (porexemplo, uma molécula scFv controle). Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, uma "molécula scFv candidata" é uma molécula scFv formadaintroduzindo uma ou mais mutações estabilizantes candidatas na moléculascFv, em que o efeito da mutação estabilizante candidata sobre a estabilida-de de a molécula scFv não é conhecido a priori, isto é, uma molécula scFvna qual uma mutação foi introduzida e a qual deve ser avaliada para deter-minar se a mutação resultaa em uma molécula scFv com aumentada estabi-lidade. Em uma modalidade, uma molécula scFv candidata é uma moléculascFv formada introduzindo uma ou mais mutações estabilizantes candidatasem uma molécula scFv convencional (isto é, não-stabilizada). Em outra mo-dalidade, uma molécula scFv candidata é uma molécula scFv formada intro-duzindo uma ou mais mutações estabilizantes candidatas em uma das mo-léculas scFv estabilizadas descritas na Seção II, acima.

Por uma "biblioteca de moléculas scFv candidatas" aqui, nestePedido de patente, se indica no mínimo duas moléculas scFv candidatasnão-redundantes, com no mínimo cerca de 10 sendo preferencial, no mínimocerca de 100 sendo particularmente preferencial, e no mínimo cerca de 1000sendo especialmente preferencial (por exemplo, no mínimo cerca de 104,105, 106, 107, ou 10® moléculas scFv). Em uma modalidade, a biblioteca érandomizada, com mutações não especificadas geradas aleatoriamente emqualquer posição. Em outra modalidade, a biblioteca de scFv é uma parcial-mente randomizada ou criada. Isto é, um resíduo aminoácido específico ouclasse de resíduos aminoácidos é introduzido aleatoriamente em qualquerposição do scFv, ou uma posição de aminoácido específica é selecionadapara mutagênese com um aminoácido não específico, uma classe particularde aminoácidos, ou um amino aminoácido específico. Em uma modalidadepreferencial, uma biblioteca de scFv é criada substituindo um resíduo sele-cionado de uma molécula scFv com um aminoácido de uma classe definida, por exemplo, um aminoácido hidrofóbico, um aminoácido básico, um amino-ácido hidrofílico, um aminoácido carregado, um aminoácido estericamentetendencioso (quer pequeno ou grande), ou uma cisteína capaz de formaçãode ligação dissulfeto.

Em algumas modalidades, a biblioteca de scFv compreende mo- léculas scFv candidatas com uma ou mais mutações estabilizantes candida-tas que são introduzidas dentro de uma região variável (VL e/ou VH) da mo-lécula scFv. Em outras modalidades, a biblioteca de scFv compreende molé-cuias scFv candidatas com uma ou mais mutações estabilizantes candidatasque são introduzidas dentro de um Iigante de scFv da molécula scFv. Emoutras modalidades, a biblioteca de scFv compreende moléculas scFv can-didatas com uma ou mais mutações estabilizantes candidatas que são intro- duzidas dentro de um Iigante de scFv da molécula scFv e uma ou mais mu-tações estabilizantes candidatas que são introduzidas dentro de uma regiãovariável (VL e/ou VH).a. Desiqn de Bibliotecas de scFv

Métodos para desenhar a biblioteca de scFv podem ser auxilia- dos por modelagem molecular ou computacional. Em algumas modalidades,design de biblioteca pode ser realizado in silico. Em algumas modalidades, abiblioteca de scFv pode ser criada pelo seguinte método de duas etapas:

1) identificar resíduos aminoácidos alvo no scFv que quando al-terados por uma mutação (por exemplo, por substituição de aminoácido), são previstos para resultar em aprimorada estabilidade de scFv (aqui, nestePedido de patente, "resíduos desestabilizantes candidatos"); e

2) substituir os resíduos aminoácidos alvo com resíduos candi-datos estabilizantes de aminoácidos.

Etapa n° 1: Identificar Resíduos Desestabilizantes Candidatos

Em algumas modalidades, resíduos aminoácidos desestabilizan-tes candidatos podem ser identificado por análise à base de seqüência. Porexemplo, resíduos aminoácidos desestabilizantes candidatos podem ser i-dentificado comparando uma seqüência de região variável de uma scFv comuma série de referência de seqüências de região variável, por exemplo, se- qüências de região variável de anticorpos humanos que ocorrem natural-mente, e selecionando os resíduos aminoácidos de região variável do scFvos quais são incomuns ou raros em suas posições de aminoácidos corres-pondentes dentro da série de referência. Em modalidades preferenciais, so-mente as regiões de framework de uma seqüência de região variável da scFv são analisadas, ao passo que as regiões determinantes de comple-mentaridade (CDRs) da região variável são conservadas de modo a evitardisrupção da atividade de ligação da molécula scFv.Em algumas modalidades, um resíduo aminoácido desestabili-zante candidato é um resíduo aminoácido o qual está ausente ou encontradoem uma baixa freqüência em uma posição correspondente dentro de umasérie de referência de seqüências homólogas de região variável. Métodospara compilar séries de referência são descritos nas Seções Ill - V, acima.Em modalidades preferenciais, o resíduo aminoácido desestabilizante candi-dato é um resíduo aminoácido o qual está presente dentro de menos de 10%das seqüências em posições correspondentes dentro da série de referência.Em modalidades mais preferenciais, o resíduo aminoácido desestabilizantecandidato é um resíduo aminoácido o qual está presente dentro de menosde 5% das seqüências em posições correspondentes dentro da série de re-ferência. Em modalidades particularmente preferenciais, o resíduo aminoá-cido desestabilizante candidato é um resíduo aminoácido o qual está presen-te dentro de menos de 2% (por exemplo, 0,5%, 0,75%, ou 1%) das seqüên-cias em posições correspondentes dentro da série de referência.

Em outra modalidade, um resíduo aminoácido desestabilizantecandidato é um resíduo aminoácido o qual difere do aminoácido presente naposição correspondente na seqüência de consenso da série de referência deseqüências de região variável (isto é, o resíduo aminoácido de consenso).Métodos para determinar a seqüência de consenso da série de referênciasão descritos na Seção Ill e V, acima.

Em outra modalidade, um resíduo aminoácido desestabilizantecandidato é um resíduo aminoácido o qual tem uma baixa classificação deconsenso. Métodos para determinar uma classificação de consenso de umaminoácido são descritos na Seção Ill e V, acima. Em uma modalidade, oresíduo aminoácido desestabilizante candidato é um resíduo aminoácidocom uma classificação de consenso de menos de 0,5 (por exemplo, menosde 0,4, menos de 0,3, menos de 0,2, ou menos de 0,1). Em uma modalidadepreferencial, o resíduo aminoácido desestabilizante candidato é um resíduo aminoácido com uma classificação de consenso de menos de 0,3.

Etapa n° 2: Seleção de Mutações Estabilizantes Candidatas

Tendo identificado um ou mais aminoácidos desestabilizantescandidatos, a próxima etapa é selecionar uma ou mais mutações estabilizan-tes candidatas para cada aminoácido desestabilizante. A biblioteca de scFvpode ser então criada para incluir uma molécula scFv candidata representa-tiva para cada mutação estabilizante candidata que é selecionada.

Em algumas modalidades, cada variante de aminoácido naturalde um aminoácido desestabilizante em particular é selecionada como umamutação estabilizante candidata (isto é, 19 mutações estabilizantes candida-tas para cada aminoácido desestabilizante).

Em modalidades mais preferenciais, um subgrupo das variantesde aminoácidos naturais de um aminoácido desestabilizante em particularsão selecionados como mutações estabilizantes candidatas (isto é, 1 a 18aminoácidos estabilizantes candidatos para cada aminoácido desestabilizan-te). Em uma modalidade, o subgrupo de mutações estabilizantes candidatascompreende substituições com um aminoácido de uma classe definida, porexemplo, aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos básicos, aminoácidos hi-drofílicos, aminoácidos carregado, ou aminoácidos estericamente tendencio-sos (quer pequenos ou grandes).

Em uma modalidade, um subgrupo de substituições de muta-ções estabilizantes candidatas com aminoácidos as quais estão presentes em altas freqüências em uma posição correspondente à do aminoácido de-sestabilizante dentro de uma série de referência de seqüências homólogasde região variável. Em modalidades preferenciais, uma mutação estabilizan-te candidata compreende substituição com um aminoácido que está presen-te dentro do banco de dados em uma freqüência de mais de 10%. Em moda-lidades mais preferenciais, o aminoácido está presente em uma freqüênciamais de 15%. Em modalidades ainda mais preferenciais, o aminoácido estápresente em uma freqüência de mais de 20%. Em modalidades ainda maispreferenciais, o aminoácido está presente em uma freqüência de mais de25%.

Em outra modalidade, uma mutação estabilizante candidata éuma substituição com o aminoácido de consenso (isto é, o resíduo mais fre-qüente) encontrado na posição do aminoácido desestabilizante dentro dasérie de referência.

Em outra modalidade, um subgrupo de mutações estabilizantescandidatas compreende substituições com todo aminoácido que é encontra-do dentro de uma série de referência de seqüências homólogas de regiãovariável na posição do aminoácido desestabilizante. Por conseguinte, umabiblioteca de scFv pode ser então criada para incluir uma molécula scFvcandidata típica para cada mutação estabilizante candidata que é represen-tada na série de referência.

Em outras modalidades, o subgrupo de mutações estabilizantescandidatas pode ser identificado ou priorizado para triagem por uma análise(por exemplo, inspeção visual ou análise computacional) de uma estruturatridimensional ou modelo de uma região variável da molécula scFv. A estru-tura tridimensional de um polipeptídeo influencia sua estabilidade e atividadebiológica, e a estrutura pode ser determinada ou prevista em uma série de modos. Estrutura terciária pode ser prevista usando construção modelo deestruturas tridimensionais de uma ou mais proteínas homólogas (ou comple-xos de proteínas) que têm uma estrutura tridimensional conhecida. Cristalo-grafia de raios X é talvez o melhor modo conhecido para determinar a estru-tura protéica (por conseguinte, o termo "estrutura de cristal" pode ser usadoao invés do termo "estrutura"), mas também podem ser feitas estimativasusando dicroismo circular, dispersão luminosa, ou medindo a absorção e aemissão de energia radiante. Outras técnicas úteis incluem difração de neu-trons, ressonância magnética nuclear (NMR), e modelagem por homologia.Todos estes métodos são conhecidos por aqueles com conhecimento regu-lar da técnia, e foram bem descritas em livros textos de rotina (vide, por e-xemplo, Physical Chemistry, 4th Ed., W.J. Moore, Prentiss-Hall, N.J., 1972,ou Physical Biochemistry, K.E. Van Holde, Prentiss-Hall, N.J., 1971)) e nu-merosas publicações. Quaisquer destas técnicas podem ser realizadas paradeterminar a estrutura de uma molécula compreendendo uma região variávelde uma molécula scFv (por exemplo, um anticorpo, um Fab, ou a própriamolécula scFv).

A estrutura da região variável pode ser modelada in silico. Porexemplo, a compatabilidade de uma mutação estabilizante candidata com aestrutura tridimensional pode ser analisada modelando computacionalmentea substituição de uma mutação desestabilizante com uma mutação estabili-zante candidata. A mutação estabilizante candidata pode ser selecionadapara inclusão na biblioteca de scFv se for compatível com a estrutura total damolécula scFv. Em uma modalidade, a mutação estabilizante candidata podeser selecionada se não perturbar o dobramento natural ou conformação daregião variável da molécula scFv ou uma ou mais regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) da mesma. Em outra modalidade, a mutaçãoestabilizante candidata pode ser selecionada se não perturbar a capacidadeda região variável para formar uma interface VL/VH nativa.

Em algumas modalidades, uma mutação estabilizante candidatapode ser selecionada aplicando uma técnica de recondensação de cadeialateral a uma estrutura (por exemplo, a estrutura de cristal ou modelo) daregião variável. Em um cálculo de recondensação de cadeia lateral, os resí-duos estabilizantes candidatos podem ser modificados computacionalmente,e a estabilidade dos mutantes resultantes é avaliada computacionalmente. Ocálculo de recondensação de cadeia lateral gera uma lista classificada dosmutantes que têm estabilidade alterada (isto é, energia intramolecular alte-rada). O número de proteínas mutantes que é avaliado computacionalmentepode ser muito grande, uma vez que toda posição de aminoácido variávelpode ser mutada em todos os 20 aminoácidos de rotina. Algoritmos compu-tacionais típicos usados para classificar os resultados da análise computa-cional incluem eliminação de ponta morta e verdadeiros algoritmos de pes-quisa (vide por exemplo, Lasters et ai (Protein Eng. 8:815-822, 1995), Loo-ger e Hellinga {J. Moi Bioi 307:429-445, 2001), e Dahiyat e Mayo (ProteinSei. 5:895-903, 1996)). Por conseguinte, uma biblioteca de scFv pode serentão criada para incluir uma molécula scFv candidata típica para cada umadas mutações estabilizantes candidatas de maior classificação na lista clas-sificada de mutações geradas pelo cálculo de recondensação de cadeia late-ral. Em algumas modalidades, no mínimo a mutação de maior classificaçãoé selecionada (por exemplo, são selecionadas as mutações de maior classi-ficação, as duas de maior classificação, as três de maior classificação, asquatro de maior classificação, ou as cinco de maior classificação),b. Construção de Bibliotecas de scFv

Tendo determinado as mutações estabilizantes candidatas paraincluir na biblioteca de scFv, pode-se usar qualquer um de uma variedade demétodos disponíveis para produzir moléculas scFv candidatas compreen-dendo as mutações. Os polipeptídeos reefridos podem ser produzidos, porexemplo, por meio de métodos recombinantes. Além disso, devido à dege-neração do codigo genético, uma variedade de seqüências de ácido nucléicopodem ser usadas para codificar cada scFv desejado.

Métodos reconhecidos na técnica típicos para preparar uma mo-lécula de ácido nucléico codificando uma molécula scFv candidata incluem,mas não estão limitados a, preparação por mutagênese sítio-dirigida (oumediada por oligonucleotídeo) , mutagênese por PCR, e mutagênese decassete de um DNA preparado anteriormente codificando a scFv candidata.

Mutagênese sítio-dirigida é um método preferencial para prepa-rar variantes de substituição. Esta técnica é de conhecimento geral na técni-ca (vide, por exemplo, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985)e Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488 (1987)). Em resumo, aorealizar mutagênese sítio-dirigida de DNA, o DNA parental é alterado primei-ro hibridizando um oligonucleotídeo codificando a mutação desejada paraum único filamento de similar DNA parental. Depois de hibridização, umaDNApoIwnerase é usada para sintetizar um segundo filamento inteiro, usan-do o oligonucleotídeo hibridizado como um iniciador, e usando o único fila-mento do DNA parental como um modelo. Portanto, o oligonucleotídeo codi-ficando a mutação desejada é incorporado no DNA de filamento duplo resul-tante, o qual pode ser então ligado em um plasmídeo ou outro vetor adequa-do.

Mutagênese por PCR também é adequada para preparar molé-cuias scFv candidatas. Vide Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Acade-mic Press, 1990); e Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-583 (1989). Emresumo, quando pequenas quantidades de DNA modelo são usadas comomaterial de partida em uma reação de PCR, iniciadores que diferem ligeira-mente em seqüência da região correspondente em uma DNA modelo podemser usados para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmentode DNA específico que difere da seqüência modelo somente nas posiçõesonde os iniciadores diferem do modelo. Os iniciadores de PCR também po-dem ser criados para incorporar sítios de restrição, de tal modo que o produ-to de DNA da reação de PCR pode ser então diretamente ligado em umplasmídeo ou outro vetor adequado.

Outro método para preparar variantes, mutagênese de cassete,se baseia na técnica descrita por Wells et al., Gene 34:315-323 (1985). Omaterial de partida é o plasmídeo (ou outro vetor) compreendendo o DNA dopolipeptídeo de partida a ser mutado. O um ou mais códons no DNA parentala ser mutado são identificados. Deve haver um único sítio de endonucleasede restrição sobre cada lado do um ou mais sítios de mutação identificados.Se não existirem similares sítios de restrição, estes podem ser gerados u-sando o método de mutagênese mediada por oligonucleotídeo descrito aci-ma para introduzir os mesmos em localizações apropriadas no DNA de poli-peptídeo de partida. O DNA de plasmídeo é cortado nestes sítios para Iinea-rizá-lo. Um oligonucleotídeo de filamento duplo codificando a seqüência doDNA entre os sítios de restrição mas contendo a uma ou mais mutações de-sejadas é sintetizado usando procedimentos de rotina, em que os dois fila-méníos-do oligonucleotídeo são sintetizados separadamente e em seguidahibridizados Juntos usando técnicas de rotina. Este oligonucleotídeo de fila-mento duplo é referido como o cassete. Este cassete é criado para ter ex-tremidades 5' e 3' que são compatíveis com as extremidades do plasmídeolinearizado, de tal modo que pode ser diretamente ligado ao plasmídeo.

Ácidos nucléicos típicos para cda uma das moléculas scFv can-didatas podem ser geradas pelos métodos acima. Os ácidos nucléicos po-dem ser então clonados em vetores de expressão para formar uma bibliote-ca de vetores de expressão. Células hospedeiras podem ser então transfor-madas com a biblioteca de vetores resultante, e as células hospedeiras culti-vadsa sob as condições apropriadas de modo a expressar cada moléculascFv candidata,c. Métodos de Triagem

Uma biblioteca de scFv a invenção pode ser tríada em uma pro-va (por exemplo, uma prova de alta produtividade total) para identificar mo·léculas scFv candidatas com estabilidade protéica desejada. Uma prova si-milar pode empregar quaisquer dos métodos para avaliar estabilidade pro-téica descritos na Seção VI, acima. Um método particularmente preferencialé uma prova de ensaio térmico. Os métodos de ensaio referidos geralmenteenvolvem comparar a estabilidade térmica de uma molécula scFv candidatacom a de um controle adequado e selecionar a molécula scFv candidata sea estabilidade térmica for mais do que a do controle. Controles adequadostípicos incluem moléculas scFv convencionais, por exemplo, uma moléculascFv (Gly4Ser)3. Moléculas scFv candidatas podem ser selecionadas se ti-verem uma estabilidade térmica que é de mais de cerca de 0,1, cerca de0,25, cerca de 0,5, cerca de 0,75, cerca de 1, cerca de 1,25, cerca de 1,5,cerca de 1,75, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6,cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, ou cerca de 10 graus Celsius do que a docontrole. Em uma modalidade exemplar, uma molécula scFv candidata éselecionada se tiver uma estabilidade térmica que é de mais de cerca de 3graus-G©Ísíus-do que a do controle.

Bibliotecas de scFv podem ser apresentadas em diferentes for-matos de ensaio. Por exemplo, moléculas scFv podem ser apresentadas emsolução (por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), sobrecontas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bactérias (Ladner USP 5,223,409), esporos (Ladner USP '409), ou so-bre fago (Scott e Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science249:404-406); (Cwirla et ai. (1990) Proc. NatL Acad. Sei. 87:6378-6382); (Fe-Iici (1991) J. Mol Biol. 222:301 -310); (Ladner acima.).

Em algumas modalidades exemplares, as moléculas scFv can-didatas são avaliadas em um formato de solução. Em uma modalidade, cadaamostra compreende uma alíquouta de uma solução tendo moléculas scFvcandidatas com a mesma mutação ou ou mutações estabilizantes candida-tas. Uma solução similar pode ser gerada isolando colônias de células hos-pedeiras individuais de uma biblioteca de células hospedeiras transformadascom biblioteca de plasmídeo de expressão e cultivar a colônia de célulashospedeiras em um vaso apropriado sob condições as quais facilitam ex-pressão da molécula scFv. Em uma modalidade, a molécula scFv candidatapodem ser purificada a partir da célula hospedeira e ressolubilizada em umasolução de ensaio apropriada. Em uma modalidade mais preferencial, a mo-lécula scFv candidata é fundida a uma seqüência de peptídeo de sinal clivá-vel de tal modo que a molécula scFv é secretada pela célula hospedeira nomeio de cultura de células hospedeiras. Em ainda outras modalidades prefe-renciais, a célula hospedeira podem ser cultivada sob condições tais quemolécula scFv candidata é liberada no meio, junto com proteínas de célulashospedeiras.

Pode ser desejável automatizar quaisquer dos formatos de en-saio acima. Por exemplo, pode ser empregada robótica para isolar cadamembro da biblioteca de scFv (por exemplo, como colônias de células hos-pedeiras individuais) em rápida sucessão de modo que podem ser avaliadasem vasos separados. Exemplos de vasos de ensaio incluem lâminas de mi-crotítulo (por exemplo, lâminas de microtítulo de 96 cavidades), tubos de en-saio, e tubos de microcentrífuga.

d. Otimização Adicional de Moléculas scFv Estabilizadas

Uma molécula scFv estável identificada pelos métodos de tria-gem acima pode ser remodelada e adicionalmente otimizada para aumentaradicionalmente sua estabilidade protéica. Portanto, as etapas descritas aci-ma podem ser repetidas com uma molécula scFv estável identificada emuma rodada de otimização inicial. Alternativamente, as mutações estabilizan-tes de duas ou mais moléculas scFv estabilizadas podem ser combinadasem uma única molécula scFv para aumentar adicionalmente a estabilidadeprotéica.

Em algumas modalidades, a molécula scFv estável identificadapelos métodos da invenção pode ser adicionalmente otimizada. Por exem-plo, podem ser feitas uma ou mais das alterações adicionais seguintes. Emuma modalidade, uma molécula scFv estabilizada pode ser adicionalmenteestabilizada introduzindo uma ligação dissulfeto a qual liga um aminoácidono domínio VL com um aminoácido no domínio VH. Ligações dissulfeto típi-cas incluem quaisquer das ligações dissulfeto descritas na Seção Il acima.

Uma ligação dissulfeto particularmente preferencial é VH44-VL100.

Em outras modalidades, a molécula scFv estável identificadapelos métodos da invenção é adicionalmente otimizada introduzindo um Ii-gante de scFv com uma extensão ou composição otimizada. Ligantes descFv típicos são descritos na Seção Il acima. Um Iigante de scFv particular-mente preferencial é (GIy4Ser)4.

Em outra modalidade, a molécula scFv estável identificada pelosmétodos da invenção é adicionalmente otimizada introduzindo uma mutaçãoestabilizante em no mínimo um entre o domínio VH ou VL.IX. Métodos para Estabilizar Moléculas de Ligação

Em outros aspectos, a invenção proporciona métodos para me-lhorar as propriedades de estabilidade de moléculas de ligação. Estes méto-dos geralmente envolvem incorporar ou anexar uma molécula scFv estabili-zada da invenção à molécula de ligação. Surpreendentemente, conformemostrado nos exemplos de trabalho aqui, neste Pedido de patente, molécu-Jas scFv da invenção não são somente estáveis por si só, também conferemaprimorada estabilidade a moléculas de ligação nas quais são incorporadas.Por conseguinte, os métodos da invenção proporcionam um meio conveni-ente e confiável -para melhorar a estabilidade de moléculas de ligação co-mercialmente valiosas para as quais a fabricação em larga escala freqüen-temente é limitada por estabilidade protéica pobre (por exemplo, anticorposmultiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e outros anticorposmodificados).

Moléculas scFv estabilizadas podem ser incorporadas em molé-culas de ligação usando metodologia de conjugação de proteína que é co-nhecida na técnica. Em uma modalidade, a scFv estabilizada é fundida dire-tamente a um N- ou C-término de um polipeptídeo, por exemplo, uma molé-cula de anticorpo. Em outra modalidade, um Iigante não-peptídico é empre-gado para ligar a scFv estabilizada a um N- ou C-término de um polipeptí-deo. Em ainda outras modalidades, um peptídeo de ligação é usado paraligar a scFv estabilizada a um polipeptídeo. Em uma modalidade exemplar,o peptídeo de ligação é um peptídeo rico em gly/ser curto. Peptídeos riscos5 em Gly/Ser típicos são listados na Tabela 1 abaixo. Outros peptídeos de li-gação típicos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, os Pedidos depatente Internacional Nos.WO 2005/000898 e WO 2005/000899). Em umamodalidade, um scFv estabilizado da invenção é encadeado à extremidadede C-terminal de uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de10 anticorpo, usando um Iigante S(G4S)3. Em outra modalidade, um scFv esta-bilizado da invenção é encadeado à extremidade de N-terminal de uma mo-lécula de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo, usando um Ii-gante (G4S)5.

Tabela 1: Peptídeos De Ligação

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Em uma modalidade, no mínimo uma molécula scFv estabiliza-da é anexado a uma molécula de anticorpo para produzir uma molécula bi-específica. Em outra modalidade, duas moléculas scFv estabilizadas sãoanexadas a uma molécula de anticorpo para produzir uma molécula biespecífica.

Em algumas modalidades, moléculas de ligação estabilizadasda invenção resultam em produção aumentada comparadas com moléculasscFv convencionais ou moléculas de ligação compreendendo moléculasscFv convencionais. Métodos para avaliar rendimento são descritos na Se-ção Vl1 acima. Em uma modalidade, uma molécula de ligação estabilizadaproduzido pelo métodos da invenção tem um aumento na produção de nomínimo 1% em relação à molécula de ligação não estabilizada. Em outrasmodalidades, a molécula de ligação estabilizada tem um aumento na produ-ção de no mínimo 2%, no mínimo 5%, no mínimo 10%, no mínimo 20%, nomínimo 30%, no mínimo 50%, no mínimo 75%, ou no mínimo 100%, em re-lação à molécula de ligação não estabilizada.

Em algumas modalidades, moléculas de ligação da invençãoresultam em reduzida agregação comparadas com moléculas scFv conven-cionais ou moléculas de ligação compreendendo moléculas scFv convencio-nais. Métodos para avaliar agregação são descritos na Seção VI, acima. Emuma modalidade, uma molécula de ligação estabilizada produzida pelo mé-todos da invenção tem uma redução na agregação de no mínimo 1% emrelação à molécula de ligação não estabilizada. Em outras modalidades, amolécula de ligação estabilizada tem uma redução na agregação de no mí-nimo 2%, no mínimo 5%, no mínimo 10%, no mínimo 20%, no mínimo 30%,no mínimo 50%, no mínimo 75%, ou no mínimo 100%, em relação à molécu-la de ligação não estabilizada.

Em outras modalidades, moléculas de ligação da invenção re-sultam em aumentada estabilidade de longo termo ou vida de armazena-mento comparada com moléculas scFv convencionais ou moléculas de liga-ção compreendendo moléculas scFv convencionais. Métodos para avaliar avida de armazenamento incluem % de perda ou % de proteólise conformedescrito na Seção VI, acima. Em uma modalidade, uma molécula de ligaçãoestabilizada produzida pelo métodos da invenção tem um aumento em vidade armazenamentode no mínimo 1 dia em relação à molécula de ligação nãoestabilizada. Isto significa que a preparação de moléculas de ligação temsubstancialmente a mesma quantidade de moléculas de ligação estáveisque a presente no dia anterior. Em outras modalidades, a molécula de Iiga-ção estabilizada tem um aumento na vida de armazenamento de no mínimo2 dias, no mínimo 5 dias, no mínimo 1 semana, no mínimo 2 semanas, nomínimo 1 mês, no mínimo 2 meses, no mínimo 6 meses, ou no mínimo 1ano, em relação à molécula de ligação não estabilizada.

Em outras modalidades, moléculas de ligação da invenção re-sultam em aprimorada estabilidade por exemplo, quando expressadas emum tipo de célula hospedeira em particular, comparadas com moléculas scFvconvencionais ou moléculas de ligação compreendendo moléculas scFvconvencionais. Em modalidades exemplares, os métodos da invenção resul-tam na produção de moléculas de ligação as quais têm aumentada estabili-dade (por exemplo, aumentado rendimento) quando a molécula de ligação éexpressada em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira bacteriana ou eucariótica (por exemplo, levedura ou mamífera). Células hos-pedeiras mamíferas típicas incluem células de ovário de hamster chinês(CHO), células HELA (carcinoma cervical humano), células CVI (linhagemrenal de macaco) células COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T),células R1610 (fibroblasto de hamster chinês), células BALBC/3T3 (fibro- blasto de camundongo), células HAK (linhagem renal de hamster), célulasSP2/0 (mieloma de camundongo), células BFA-1c1BPT (células endoteliaisbovinas), células RAJI (linfócito humano) e células 293 (rim humano). Em'JTia- mo^üHade preferencial, duas moléculas scFv estabilizadas são ane-xadas a uma molécula de anticorpo para criar uma molécula biespecífica estabilizada para secreção em células CHO.

Em outras modalidades, células hospedeiras capazes de ex-pressar moléculas de ligação estabilizadas podem ser triadas para selecio-nar isolados celulares únicos que são capazes de expressar altos níveis demoléculas de ligação estabilizadas solubilizadas e adequadamente dobradas (por exemplo, moléculas de ligação apresentando menos de 10% de agre-gação). Os métodos referidos podem empregar técnicas de classificaçãocelular ativada por fluorescência (FACS) (vide, por exemplo, Brezinky et ai,J Immunol Meth (2003). 277:141-155). Em uma modalidade, o isolado celu-lar único é adaptado para condições livres de soro para estabelecer uma linhagem de células produtoras estáveis. A linhagem de células produtorasestáveis pode ser então cultivada para facilitar fabricação em larga escala deuma molécula de ligação estabilizada da invenção.Em outras modalidades, os métodos da invenção são emprega-dos para melhorar a estabilidade de uma molécula de ligação que é expres-sada a partir de uma célula hospedeira em um grande volume de meios decultura. Em modalidades exemplares, os métodos da invenção resultam em uma estabilidade aumentada (por exemplo, aumentado rendimento) quandoa molécula de ligação é expressada em no mínimo 1 litro de meio de cultura.Em outras modalidades, os métodos da invenção são usados para produziruma molécula de ligação estabilizada a qual tem uma aumentada estabilida-de (por exemplo, rendimento) quando expressada a partir de uma célula hospedeira em no mínimo 2 litros, no mínimo 10 litros, no mínimo 20 litros,no mínimo 50 litros, no mínimo 75 litros, no mínimo 100 litros, no mínimo 200litros, ou no mínimo 500 litros de meio de cultura. Em uma modalidade e-xemplar, os métodos da invenção são usados para produzir no mínimo 10mg de uma molécula de ligação estabilizada para cada litro de meio de cultura.

X. Moléculas de Ligação Estabilizadas Compreendendo Moléculas scFv Es-tabilizadas

Em uma modalidade, uma molécula de ligação estabilizada dainvenção é uma proteína de fusão. Por exemplo, uma molécula scFv estabi-lizada da invenção pode ser encadeada a uma segunda molécula scFv ouuma molécula não-scFv. Em uma modalidade, uma molécula não-scFv àqual uma-molécula scFv estabilizada da invenção pode ser encadeada pro-porciona no mínimo *um sítio de ligação adicional. Por exemplo, sítios de li-gação típicos que podem ser incluídos em uma molécula de ligação da in- venção incluem: a porção de ligação de receptor de um ligante, a porção deligação de ligante de um receptor, a porção de ligação de substrato de umaenzima, a porção de ligação de enzima de um substrato, ou uma ou maisporções de ligação de antígeno de um anticorpo. Moléculas scFv podem serencadeadas, por exemplo, a moléculas de anticorpos para formar moléculas de anticorpo modificado ou a outros polipeptídeos para formar proteínas defusão. Alguns exemplos são descritos abaixo.A. Moléculas de Anticorpos Modificados

Em uma modalidade, uma molécula scFv estabilizada da inven-ção é encadeada a um anticorpo ou fragmento do mesmo para formar umaproteína de ligação estabilizada a qual é um anticorpo modificado. Em outramodalidade, um scFv estabilizado da invenção é encadeado a um anticorpomodificado, isto é, molécula de anticorpo que não ocorre naturalmente, paraformar uma proteína de ligação estabilizada. Construtos de anticorpos modi-ficados preferenciais são descritos em mais detalhes abaixo. Conforme usa-do aqui, neste Pedido de patente, o termo "anticorpo modificado" inclui for-mas sintéticas de anticorpos os quais são alterados de tal modo que nãoocorem naturalmente, por exemplo, anticorpos que compreendem no mínimoduas porções de cadeia pesada mas não duas cadeias pesadas completas(tais como, anticorpos ou minibodies de domínio eliminado); formas multies-pecíficas de anticorpos (por exemplo, biespecíficos, triespecíficos, e etc.)alteradas para ligar a dois ou mais antígenos diferentes ou a epítopes dife-rentes sobre um único antígeno). Além disso, o termo "anticorpo modifica-do" inclui formas multivalentes de anticorpos (por exemplo, trivalentes, tetra-valentes, e etc., anticorpos que ligam a três ou mais cópias do mesmo antí-geno).

Será entendido que ao discutir as moléculas de ligação da in-venção, as especificidades de ligação típicas descritas aqui, neste Pedido depatente, podem ser conferidas por uma molécula scFv estabilizada da inven-ção, uma molécula de ligação compreendendo uma molécula scFv da inven-ção ou ambas.

Em uma modalidade, as proteínas de ligação estabilizadas dapresente invenção podem ser imunorreativas com um ou mais antígenostumorais ou antígenos associados com distúrbios imunes. Por exemplo, pa-ra distúrbios neoplásicos, o sítio de ligação (isto é, a região variável ou frag-mento imunorreativo ou recombinante do mesmo) das moléculas de ligaçãorelevadas liga a um antígeno associado a tumor selecionado no sítio da ma-lignidade. Similarmente, em uma modalidade, uma molécula de ligação podeligar a no mínimo um marcador selecionado presente sobre células imunes.Dado o número de antígenos reportados associados com neoplasias e dis-túrbios imunes, e o número de antígenos relacionados, aqueles versados natécnica reconhecerão que as moléculas de ligação presentemente descritaspodem portanto ser derivadas de qualquer um de uma série de anticorpos inteiros. Mais geralmente, polipeptídeos úteis na presente invenção podemser obtidos ou derivados de qualquer anticorpo (incluindo aqueles previa-mente reportados na literatura) que reage com uma molécula ou marcadorassociado com a condição selecionada. Além disso, o anticorpo parental ouprecursor, ou fragmento do mesmo, usado para produzir as moléculas de ligação estabilizadas da invenção pode ser murino, humano, quimérico, hu-manizado, de primata não-humano ou primatizado.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, "antígenos as-sociados com tumor" inclui antígenos os quais são geralmente associadoscom células tumorais, por exemplo, expressados sobre células tumorais. Mais geralmente, antígenos associados com tumor compreendem antígenosque proporcionam a localização de anticorpos imunorreativos em uma célu-las neoplásica independente de sua expressão sobre células não-malignas.Os antígenos referidos podem ser relativamente tumor específicos, por e-xemplo, limitados em expressão à superfície de células malignas. Alternati- vãmente, os antígenos referidos.„podem ser encontrados tanto sobre célulasmalignas quanto não-malignas. Por exemplo, CD20 é um antígeno pan Bque é encontrado sobre a superfície tento de células B malignas quanto decélulas não-malignas que se comprovaram como sendo um alvo extrema-mente eficaz para anticorpos imunoterapêuticos para o tratamento de Iinfo- ma não-Hodgkin. A este respeio, antígenos de células pan T tais como CD2,CD3, CD5, CD6 e CD7 também compreendem antígenos associados comtumor dentro do significado da presente invenção. Ainda outros antígenosassociados com tumor típicos compreendem mas não estão limitados aMAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6 & E7, TAG-72, CEA, L6- Antigen, CD19, CD22, CD37, CD52, HLA-DR, EGF Receptor e HER2 Re-ceptor. Em muitos casos anticorpos imunorreativos para cada um destesantígenos foram reportados na literatura. Aqueles versados na técnica reco-nhecerão que cada um destes anticorpos pode servir como um precursorpara anticorpos da invenção de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação estabilizadas dapresente invenção preferencialmente associam com, e ligam a, antígenosassociados com tumor ou imunes conforme descrito acima. Por conseguinte,conforme será discutido em alguns detalhes abaixo as moléculas de ligaçãoestabilizadas da presente invenção podem ser derivadas, geradas ou fabri-cadas a partir de qualquer uma de uma série de anticorpos que reagem comantígenos associados com tumor. Em algumas modalidades as moléculas deligação estabilizadas da invenção são anticorpos com domínio eliminado quesão derivados usando técnicas comuns de engenharia genética por meiodas quais no mínimo uma porção de um ou mais domínios de região cons-tante são eliminados ou alterados de modo a proporcionar as característicasbioquímicas desejadas tais como meia-vida sérica reduzida. Mais particu-larmente, uma pessoa versada na técnica pode prontamente isolar a se-qüência genética correspondente às regiões variáveis e/ou constantes damolécula de ligação estabilizada em questão e eliminar ou alterar os nucleo-tídeos apropriados para proporcionar polipeptídeos da invenção para usocomo subunidades monoméricas de acordo com a presente invenção.

Anticorpos previamente reportados que reagem com antígenosassociados com tumor podem ser estabilizados conforme descrito aqui, nes-te Pedido de patente, para proporcionar as moléculas de ligação estabiliza-das da presente invenção. Anticorpos típicos que podem ser usados paraproporcionar regiões de ligação de antígeno para gerar ou derivar as molé-cuias de ligação estabilizadas reveladas incluem, mas não estão limitados a2B8 e C2B8 (Zevalin® e Rituxan®, IDEC Pharmaceuticals Corp., San Die-go), Lym 1 e Lym 2 (Techniclone), LL2 (Immunomedics Corp., New Jersey),HER2 (Herceptin®, Genentech Inc., South San Francisco), B1 (BexxaKÊ),Coulter Pharm., San Francisco), Campath® (Millennium Pharmaceuticals,Cambridge), abagovomab (Menarini, Italy), CEA-Scan™ (Immunomedics,Morris Plains, NJ), capromab (Prostascint®, Cytogen Corp.), edrecolomab(Panorex®, Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ), igovomab (CIS BioIntl., France), mitumomab (BEC2, Imclone Systems, Somerville, NJ), nofe-tumomab (Verluma®, Boehringer Ingleheim, Ridgefield, CT), OvaRex (Alta-rex Corp., Waltham, MA), satumomab (Onoscint®, Cytogen Corp.), cetuxi-mab (Erbitux®, Imclone Systems, New York, NY), bevacizumab (AVASTIN®.

Genentech Inc., S. San Francisco, CA), apolizumab (REMITOGEN ™, Prote-in Design Labs, Fremont, CA), Iabetuzumab (CEACIDE ™, ImmunomedicsInc., Morris Plains, NJ) , pertuzumab (OMNITARG ™. Genenteeh Inc., S.San Francisco, CA), MB1, BH3, B4, B72.3 (Cytogen Corp.), CC49 (NationalCâncer lnstitute) e 5E10 (University of lowa). Outros sítios de ligação quepodem ser incorporados nas moléculas de ligação em questão incluem osencontrados em: Orthoclone 0KT3 (CD3), ReoPro (Gpllb/glla), Zenapax(C25), Remicade (TNF-a), Simulect (CD25), Synagis (RSV), Mylotarg(CD33), e Campath (CD52). Em modalidades preferenciais, as moléculas deligação estabilizadas da presente invenção ligarão aos mesmos antígenosassociados com tumor que os anticorpos enumerados imediatamente acima.Em modalidades particularmente preferenciais, as moléculas de ligação es-tabilizadas serão derivadas de ou ligar os mesmos antígenos que 2B8,C2B8, CC49 e C5E10 e, ainda mais preferencialmente, carecerão de todoou parte de um domínio CH2.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção po-de ter um ou mais sítios de ligação derivados de um ou mais dos seguintesanticorpos, tositumomab (BEXXAR®), muromonab (ORTHOCLONE®) eibritumomab (ZEVALIN®), cetuximab (ERBITUX™), rituximab (MABTHERA®/ RITUXAN®), infliximab (REMICADE®), abciximab (REOPRO® ) e basiliximab (SIMULECT®), efalizumab (RAPTIVA®, bevacizumab (AVAS-Tl N®), alemtuzumab (CAMPATH®), trastuzumab (HERCEPTIN®),gemtuzumab (MYLOTARG®), palivizumab (SYNAGIS®), omalizumab (XO-LAIR®), daclizumab (ZENAPAX®), natalizumab (TYSABRI®) e ranibizumab(LUVENTIS®), adalimumab (HUMIRA®) e panitumumab (VECTIBIX®).

Em uma modalidade, uma molécula de ligação estabilizada dainvenção liga a CD23 (Patente dos Estados Unidos N2 6,011,138). Em umamodalidade preferencial, uma molécula de ligação estabilizada da invençãoliga ao mesmo epítope que o anticorpo 5E8. Em outra modalidade, uma mo-lécula de ligação da invenção compreende no mínimo um CDR (por exem-plo, no mínimo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 CDRs) de um anticorpo anti-CD23, por e-xemplo, o anticorpo 5E8.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação estabilizada dainvenção liga a um receptor de TNF. Em uma modalidade típica, uma molé-cula de ligação estabilizada da invenção liga a um LTpR. Em outra modali-dade exemplar, uma molécula de ligação estabilizada da invenção liga a umTRAIL receptor. Em outra modalidade, uma molécula de ligação estabilizadada invenção compreende no mínimo um CDR (por exemplo, no mínimo 1, 2,3, 4, 5, ou 6 CDRs) de um anticorpo anti-TRAIL-R2 (por exemplo, 14A2 mu-rino ou quimérico). Em outra modalidade, uma molécula de ligação estabili-zada da invenção compreende no mínimo um CDR de um anticorpo anti-LTpR. Exemplos de anticorpos anti-LTpR incluem BKA11, CDH10, BCG6,AGH1, BDA8, CBE11 e BHA10.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação estabilizada dainvenção liga ao antígeno CRIPTO-I (Pedido de patente internacional N2W002/088170A2 ou Pedido de patente internacional N- W003/083041A2).Em urria modalidade preferencial, uma molécula de ligação estabilizada dainvenção liga ao mesmo epítope que o anticorpo B3F6. Em outra modalida-de, uma molécula de ligação estabilizada da invenção compreende no míni-mo um CDR de um anticorpo anti-CRlPTO-I, por exemplo, o anticorpo B3F6.

Em uma modalidade, a molécula de ligação estabilizada ligaráao mesmo antígeno associado com tumor que Rituxan®. Rituxan® (tambémconhecido como, rituximab, IDEC-C2B8 e C2B8) foi o primeiro anticorpomonoclonal aprovado pela agência americana FDA para tratamento de Iin-foma de células B humano (vide as Patentes dos Estados Unidos Nos.5.843.439; 5.776.456 e 5.736.137 cada uma das quais é incorporada aqui, aeste Pedido de patente, por meio de referência). Y2B8 (2B8 marcado com90Y; Zevalin®; ibritumomab tiuxetan) é a origem murina de C2B8. Rituxan®é um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico o qual é inibidor de cresci-mento e supostamente sensibiliza algumas linhagens celulares de Iinfomapara apoptose por agentes quimioterápicos in vitro. O anticorpo liga de modoeficaz complemento humano, tem forte ligação de FcR, e pode destruir demodo eficaz linfócitos humanos in vitro através tanto de mecanismos depen-dentes de complemento (CDC) quanto dependentes de anticorpo (ADCC)(Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)). Aqueles versados na técnica reco-nhecerão que variantes diméricas (homodímeros ou heterodímeros) deC2B8 ou 2B8, modificadas de acordo com a presente descoberta, podem serusadas em formas conjugadas ou não-conjugadas para tratar de modo efi-caz pacientes se apresentando com malignidades de CD20+. Mais geral- mente, deve ser reiterado que a molécula de ligação estabilizada reveladaaqui, neste Pedido de patente, pode ser usada ou em um estado "nu" ou nãoconjugado ou conjugado a um agente citotóxico para tratar de modo eficazqualquer um de uma série de distúrbios.

Em outras modalidades preferenciais da presente invenção, a molécula de ligação estabilizada da invenção será derivada de, ou ligará a, omesmo antígeno associado com tumor que CC49. CC49 liga antígeno asso-ciado com tumor humano TAG-72 o qual é associado com a superfície dealgumas células tumorais de origem humana, especificamente a linhagem decélulas tumorais LS174T. LS174T [American Type Culture Collection (aqui,neste Pedido de patente, ATCC) N2 CL 188] é uma variante da linhagem deadenocarcinoma de cólon LS180 (ATCC N- CL 187). Será adicionalmentereconhecido que foram desenvolvidos -numerosos anticorpos monoclonaismurinos os quais têm especificidade de ^gação para TAG-72. Um destesanticorpos monoclonais, designados B72.3, é uma IgGI murina produzida porhibridoma B72.3 (ATCC N- HB-8108). B72.3 é um anticorpo monoclonal deprimeira geração desenvolvido usando um extrato de carcinoma de mamahumano como o imunogênio (vide Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U-SA), 78: 3199-3203 (1981); e Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.522.918 e4.612.282 cada uma das quais é incorporada aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência). Outros anticorpos monoclonais dirigidos contraTAG-72 são designados "CC" (para câncer de cólon). Conforme descrito porSchlom et al. (Patente dos Estados Unidos N- 5.512.443 a qual é incorpora-da aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência) anticorpos mono-clonais CC são uma família de anticorpos monoclonais murinos de segundageração que foram preparados usando TAG-72 purificado com B72.3. Devi-do a suas afinidades de ligação relativamente boas para TAG-72, os seguin- tes anticorpos CC foram depositados na ATCC, com acesso restrito tendosido solicitado: CC49 (ATCC N2 HB 9459); CC 83 (ATCC N2 HB 9453);CC46 (ATCC N2 HB 9458); CC92 (ATTCC N2 HB 9454); CC30 (ATCC N2 HB9457); CC11 (ATCC N2 9455); e CC15 (ATCC N2 HB 9460). U.S.P.N.5.512.443 ensina adicionalmente que os anticorpos revelados podem seralterados em sua forma quimérica substituindo, por exemplo, domínios deregiões constantes humanas (Fc) para regiões constantes de camundongopor técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Além de revelaranticorpos anti-TAG-72 murinos e quiméricos, Schlom et al. também produzi-ram variantes de um anticorpo CC49 humanizado conforme revelado na pu- blicação de patente N2 PCT/US99/25552 e construtos de cadeia única con-forme revelado na Patente dos Estados Unidos. N2 5.892.019 cada uma dasquais também é incorporada aqui, a este Pedido de patente, por meio dereferência. Aqueles versados na técnica reconhecerão que cada um dos an-ticorpos, construtos ou recombinantes precedentes, e variações dos mes-mos, podem ser modificados e usados para proporcionar polipeptídeos deacordo com a presente invenção.

Além dos anticorpos anti-TAG-72 discutidos acima, vários gru-pos ία-m-bém reportaram a construção e caracterização parcial de anticorposCC49 e B72.3 com domínio eliminado (por exemplo, Calvo et al. Câncer Bio-therapy, 8(1): 95-109 (1993), Slavin-Chiorini et al. Int. J. Câncer 53:97-103(1993) e Slavin-Chiorini et al. Câncer. Res. 55:5957-5967 (1995).

Ainda outras modalidades preferenciais da presente invençãocompreendem sítios de ligação que são derivados de ou ligam ao mesmoantígeno associado com tumor que C5E10. Conforme determinada no re- querimento co-pendente N2 09/104,717, C5E10 é um anticorpo que reco-nhece um determinante de glicoproteína de aproximadamente 115 kDa queparece ser específico para linhagens de células tumorais de próstata (porexemplo, DU145, PC3, ou ND1). Portanto, em combinação com a presenteinvenção, moléculas de ligação estabilizadas (por exemplo, anticorpos comdomínio CH2 eliminado) que ligam especificamente ao mesmo antígeno as-sociado com tumor reconhecido por anticorpos C5E10 podem ser produzi-dos e usados em uma foram conjugada ou não-conjugada para o tratamentode distúrbios neoplásicos. Em modalidades particularmente preferenciais, amolécula de ligação estabilizada será derivada ou compreenderá toda ouparte da região de ligação de antígeno do anticorpo C5E10 conforme secre-tado a partir da linhagem de células de hibridoma tendo número de acessoda ATCC PTA-865. A molécula de ligação estabilizada resultante pode serentão conjugada a um radionuclídeo conforme descrito abaixo e administra-da a um paciente sofrendo de câncer de próstata de acordo com os métodosaqui, neste Pedido de patente.

Em algumas modalidades, as moléculas de ligação estabilizadasda invenção têm no mínimo uma das especificidades de ligação descritasaqui, neste Pedido de patente, por exemplo, na Seção C abaixo. Em outramodalidade, uma molécula de ligação estabilizada da invenção pode ligar auma molécula alvo de interesse, por exemplo, descrita aqui, neste Pedido depatente, por exemplo, na seção B ou C, abaixo.

Anticorpos previamente reportados que reagem com antígenosassociados com distúrbios de células imunes (por exemplo, distúrbios decélulas B) podem ser estabilizados conforme descrito aqui, neste Pedido depatente, para proporcionar as moléculas de ligação estabilizadas da presen-te invenção. Anticorpos típicos que podem ser usados para proporcionar re- giões de ligação de antígeno para gerar ou derivar as moléculas de ligaçãoestabilizadas reveladas incluem, mas não estão limitadas a um anticorpoanti-TNFa (por exemplo, infliximab (Remicade®, Centocor, Horsham, PA);MAK195-F (Abbott Labs., Abbott Park, IL); adalimumab (Humira®, AbbottLabs, Abbott Park, IL); um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, Orthoclone (OKT3®, OrthoBiotech, Bridgewater, NJ); MEDI-500 (Medimmune, Gaithers-burg, MD); visilizumab (NUVION®, Protein Design Labs (Fremont, CA, LI-SA)), um anticorpo anti-IgE (por exemplo, omalizumab, XOLAIR® , Genente-ch, South San Francisco, CA), um anticorpo anti-VLA-4 (por exemplo,TYSABRI®, Biogenldec, Cambridge, MA), um anticorpo anti-CD147 (por e-xemplo, ABX-CBL (Abgenix, Fremont, CA)), um anticorpo anti-CD25 (porexemplo, basiliximab, Simulect® (East Hanover, NJ); Inolimomab (OPI,France), um anticorpo anti-CD18 (por exemplo, odulimomab, Antilfa®, PateurMeriuex, France), anti-NCA90 (por exemplo, sulesomab, Leukoscan®, Im-munomedics, Morris Plains, NJ), um anticorpo anti-Gpllb/glIa (por exemplo,abciximab, ReoPro®, Centocor, Horsham, PA), um anticorpo anti-C25 (porexemplo, Zenapax), um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, Mylotarg), e umanticorpo anti-CD25 (por exemplo, alemtuzumab, Campath® (MilleneumPharmaceuticals, Cambridge, MA). Em modalidades preferenciais, as molé-culas de ligação estabilizadas da presente invenção ligarão aos mesmo an-tígenos associados a células imunes que os anticorpos enumerados imedia-tamente acima.

Em uma modalidade, o termo, "anticorpo modificado" de acordocom a presente invenção inclui imunoglobulinas, anticorpos, ou fragmentosimunorreativos ou recombinantes dos mesmos, nos quais no mínimo umafração de um ou mais dos domínios de região constante foi eliminado ou al-terado de modo diverso de modo a proporcionar características bioquímicasdesejadas tais como a capacidade para dimerizar de modo não-covalente,aumentada capacidade para localizar no sítio de um tumor, ou reduzidameia-vida sérica quando comparado com um anticorpo inteiro, inalterado deaproximadamente a mesma imunogenicidade. Em uma modalidade prefe-rencial, os polipeptídeos da presente invenção são anticorpos com domínioeliminado os quais compreendem uma cadeia de polipeptídeo similar a umacadeia pesada de imunoglobulina, mas os quais carecem de no mínimo umaporção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Em uma modalidade, umdomínio inteiro da região constante da proteína de ligação estabilizada seráeliminado. Em outra modalidade, todo ou parte do domínio CH2 será elimi-nado.

Em uma modalidade, as proteínas de ligação estabilizadas dainvenção são minibodies. Minibodies são moléculas diméricas compostas deduas cadeias de polipeptídeo cada uma compreendendo uma molécula scFvestabilizada (um único polipeptídeo compreendendo um ou mais sítios deligação antigênica, por exemplo, um domínio VL encadeado por um Iiganteflexível a um domínio VH fundido a um domínio CH3 através de um peptídeo de ligação.

Minibodies podem ser preparados construindo um componentede scFv e componente de peptídeo de ligação-CH3 usando métodos descri-tos na técnica (vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos N25.837.821 ou o Pedido de patente internacional N- WO 94/09817A1). Estescomponentes podem ser isolados dos plasmídeos separados como fragmen-tos de restrição e em seguida ligados e reclonados em um vetor apropriado.Montagem apropriada pode ser verificada por digestão de restrição e análisede seqüência de DNA.

Em outra modalidade, pode ser construído um "minibody" tetra- valente. Minibodies tetravalentes podem ser construídos na mesma maneiraque minibodies, exceto que düas moléculas scFv são encadeadas usandoum Iigante flexível, por exemplo, tendo uma seqüência de aminoácidos(G4S)4G3AS.

Em uma modalidade, anticorpos tetravalentes podem ser produ-zidos combinando uma seqüência de DNA codificando um anticorpo comuma molécula scFv. Por exemplo, em uma modalidade, estas seqüênciassão combinadas de tal modo que a molécula scFv é encadeado em seu N-término ao domínio do anticorpo CH3 através de um Iigante flexível (por e-xemplo, um Iigante gly/ser tal como (GIy4Ser)3.

Em outra modalidade um anticorpo tetravalente pode ser produ-zido fundindo uma molécula scFv estabilizada a um peptídeo de ligação, oqual é fundido a um domínio CH1 para construir uma molécula tetravalentescFv estabilizada - Fab (Coloma e Morrison. 1997. Nature Biotechnology.15:159; WO 95/09917).

Em uma modalidade uma molécula de ligação estabilizada dainvenção compreende um anticorpo tetravalente tetravalente ou biespecíficodentro de um scFv anexado ao N-término da cadeia leve. Em outra modali-dade da invenção, uma molécula de ligação compreende um anticorpo CH2tetravalente ou tetravalente biespecífico com domínio eliminado dentro deum scFv anexado ao N-término da cadeia pesada. Em uma modalidade, afixação da scFv ao N-término resulta em reduzida agregação das moléculas comparadas com moléculas nas quais a scFv é anexada ao término carbóxi.

Anticorpos ou fragmentos dos mesmos para uso em uma molé-cula de ligação estabilizada da invenção podem ser obtidos usando protoco-los reconhecidos na técnica, por exemplo, anticorpos são preferencialmentecultivados em mamíferos por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperito-neais do antígeno relevante (por exemplo, antígenos associados com tumorpurificados ou células ou extratos celulares compreendendo os antígenosreferidos) e um adjuvante. Esta imunização tipicamente provoca uma res-posta imune que compreende produção de anticorpos antígeno-reativos apartir de esplenócitos ou linfócitos ativados. Apesar dos anticorpos resultan- tes poderem ser colhidos do soro animal para proporcionar preparações po-liclonais, freqüentemente é desejável isolar linfócitos individuais do baço, dosKnfonodos ou do sangue periférico para proporcionar preparações homogê-neas de anticorpos monoclonais (MAbs). Preferencialmente, os linfócitos sãoobtidos do baço.

Neste processo bem conhecido (Kohler et al., Nature, 256:495(1975)) os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais, de um mamíferoos quais foram injetados com antígeno são fundidos com uma linhagem decélulas tumorais imortais (por exemplo, linhagem de células de mieloma),deste modo, produzindo células híbridas ou "hibridomas" as quais são tantoimortais quanto capazes de produzir o anticorpo geneticamente codificadoda célula B. Os híbridos resultantes são segregados em cepas genéticasúnicas por seleção, diluição, e recrescimento com cada cepa individual com-preendendo genes específicos para a formação de um único anticorpo. Pro-duzem anticorpos os quais são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referência a sua ascendência genética pura, são denominados "mono-clonais."

Células de hibridoma preparadas deste modo são semeadas ecultivadas em un meio de cultura adequado que preferencialmente contémuma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevida das célulasde mieloma parentais não fundidas. Aqueles versados na técnica reconhece-rão que reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, seleção ecrescimento de hibridomas estão disponíveis comercialmente a partir deuma série de fontes e protocolos padronizados estão bem estabelecidos.

Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão cres-cendo é avaliado para produção de anticorpos monoclonais contra o antíge-no desejado. Preferencialmente, a especificidade de ligação dos anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinado por imuno-precipitação ou por um ensaio in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA)ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Depois de serem iden-tificadas células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidadedesejada, afinidade e/ou atividade, os clones podem ser subclonados porprocedimentos de diluição Iimitante e cultivados por métodos de rotina (Go-ding, Monoclonal Antibodies: Principies e Practice, pp 59-103 (AcademicPress, 1986)). Será adicionalmente reconhecido que os anticorpos monoclo-nais secretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura,fluido de ascite ou soro por procedimentos de purificação convencionais taiscomo, por exemplo, proteína-A, cromatografia por hidroxilapatita, eletrofore-se de gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

Em outra modalidade, DNA codificando anticorpos monoclonaisdesejados podem ser prontamente isolados e seqüenciados usando proce-dimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeosque são capazes de ligar especificamente a genes codificando as cadeiaspesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma isoladas esubclonadas servem como uma fonte preferencial de similar DNA. Uma vezisolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais sãoentão transfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticastais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário deHamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem imunoglo-bulinas de modo diverso. Mais particularmente, o DNA isolado (o qual podeser sintético conforme descrito aqui, neste Pedido de patente) pode ser usa-do para clonar seqüências de região constante e variável para a fabricaçãode anticorpos conforme descrito em Newman et ai, Patente dos Estafos U-nidos N-. 5.658.570, arquivada em 25 de janeiro de 1995, a qual é incorpo- rada por meio de referência aqui, neste Pedido de patente. Essencialmente,isto acarreta extração de RNA das células selecionadas, conversão paracDNA, e amplificação por PCR usando iniciadores Ig específicos. Iniciadoresadequados para estes fins também são descritos na Patente dos EstadosUnidos N2 5.658.570. Conforme será discutido em mais detalhes abaixo, cé- lulas transformadas expressando o anticorpo desejado podem ser cultivadasem quantidades relativamente grandes para proporcionar suprimentos clíni-cos e comerciais da imunoglobulina.

Aqueles versados na técnica também reconhecerão que DNAcodificando anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, sítios deligação antigênica) também podem ser derivados de bibliotecas de fagos deanticorpos, por exemplo, usando tecnologia de fago pd ou fagemídeo Fd.Métodos típicos são determinados, por exemplo, na patente européia N2 EP368 684 B1; na patente dos Estados Unidos N2 5.969.108, Hoogenboom,H.R. e Chames. 2000. Immunol. Today 21:371; Nagy et al. 2002. Nat. Med.8:801; Huie et al. 2001. Proc. Nati Acad. Sei. USA 98:2682; Lui et al. 2002.J. Moi Biol. 315:1063, cada uma das quais é incorporada aqui, a este Pedi-do de patente, por meio de referência. Várias publicações (por exemplo,Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)) descreveram a produção deanticorpos humanos de alta afinidade por troca de cadeia, bem como infec-ção combinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para constru-ir bibliotecas de fagos grandes. Em outra modalidade, pode ser usado dis-play ribossômico para substituir bacteriófago como a plataforma de display(vide, por exemplo, Hanes et al. 2000. Nat. Biotechnoi 18:1287; Wilson et al.2001. Proc. Nati Acad. Sei. USA 98:3750; ou Irving et al. 2001 J. Immunol.Methods 248:31. Em ainda outra modalidade, bibliotecas superficiais celula-res podem ser triadas para anticorpos (Boder et al. 2000. Proc. Natl. Acad.Sei. USA 97:10701; Daugherty et al. 2000 J. Immunol. Methods 243:211. Osprocedimentos referidos proporcionam alternativas para técnicas de hibrido-ma tradicionais para o isolamento e subseqüente clonagem de anticorposmonoclonais.

Em outra modalidade da presente invenção um sítio de ligação de uma molécula de ligação da invenção pode ser proporcionado por umanticorpo humano ou substancialmente humano. Anticorpos humanos ousubstancialmente humanos podem ser fabricados em animais transgênicos(por exemplo, camundongos) que são incapazes de produção de imunoglo-bulina endógena (vide por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos.6.075.181, 5.939.598, 5.591.669 e 5.589.369 cada uma das quais é incorpo-rada aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência). Por exemplo,foi descrito que a eliminação homozigótica da região de ligação de cadeiapesada do anticorpo em camundongos quiméricos e germ-line mutante re-sulta em completa inibição de produção de anticorpos endógenos. A transfe- rência de um array genético de imunoglobulina humana a similares camun-dongos de linhagem germinativa mutante resultará na produção de anticor-pos humano no estímulo antigênico. Outro meio preferencial para produziranticorpos humanos usando camundongos SCID é revelado na Patente dosEstados Unidos N- 5.811.524 a qual é incorporada aqui, a este Pedido de patente, por fneio de referência. Será reconhecido que o material genéticoassociado com estes anticorpos humanos também pode ser isolado e mani-pulado conforme descrito aqui, neste Pedido de patente.

Ainda outro meio altamente eficiente para produzir anticorposrecombinantes é revelado por Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, esta técnica resulta na produção de anticorposprimatizados que contêm domínios variáveis de macaco e seqüências cons-tantes humanas. Esta referência é incorporada por meio de referência emsua totalidade aqui, neste Pedido de patente. Além disso, esta técnica tam-bém é descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096 comumente atribuídas, cada uma das quais é incorporada aqui,a este Pedido de patente, por meio de referência.

Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados pormicromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, células mo-nonucleares do sangue periférico podem ser isoladas de um mamífero imu-nizado e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser tría-das para IgGs específicas que satisfazem os critérios de triagem. Células decavidades positivas podem ser isoladas. Células B produtoras de Ig individu-ais podem ser isoladas por FACS ou identificando as mesmas em uma provade placa hemolítica mediada por complemento. Células B produtoras de Igpodem ser micromanipuladas para dentro de um tubo e os genes VH e VLpodem ser amplificados usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes VH e VLpodem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpos e transfecta-dos para células (por exemplo, células eucarióticas ou procaróticas) paraexpressão.

Além disso, seqüências genéticas úteis para produzir as molécu-las de ligação da presente invenção podem ser obtidas a partir de uma sériede fonte diferentes. Por exemplo, conforme discutido extensivamente acima,uma variedade de genes de anticorpos humanos estão disponíveis sob aforma de depósitos publicamente acessíveis. Muitas seqüências de anticor-pos e genes codificando anticorpos foram publicadas e genes de anticorposadequados podem ser quimicamente sintetizados a partir destas seqüências usando técnicas reconhecidas na técnica. Técnicas de síntese de oligonu-cleotídeos compatíveis com este aspecto da invenção são de conhecimentogeral do técnico versado e podem ser realizadas usando quaisquer dos vá-rios sintetizadores automáticos disponíveis comercialmente. Além disso, se-qüências de DNA codificando vários tipos de cadeias pesadas e leves de- terminadas aqui, neste Pedido de patente, podem ser obtidas através dosserviços de vendedores de síntese de DNA comercial. O material genéticoobtido usando quaisquer dos métodos precedentes pode ser então alteradoou sintético proporcionando a obtenção dos polipeptídeos da presente in-venção.

Alternativamente, linhagens celulares produtoras de anticorpospodem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas de conhecimento ge-ral do técnico versado. As técnicas referidas são descritas em uma varieda-de de manuais de laboratório e publicações primárias. A este respeito, técni-cas adequadas para uso na invenção conforme descrito abaixo são descritasem Current Protocole in Immunology, Coligan et al., Eds., Green PublishingAssociates e Wiley-lnterscience, John Wiley e Sons, New York (1991) o qual é aqui, a este Pedido de patente, incorporado por meio de referência em suatotalidade, incluindo suplementos.

Será adicionalmente reconhecido que o âmbito desta invençãoengloba moléculas de ligação estabilizadas compreendendo alelos, variantese mutações de seqüências de DNA ligando antígeno reconhecidas na técni- ca e uma molécula scFv estabilizada da invenção.

Conforme é de conhecimento geral, RNA pode ser isolado a par-tir das células de hibridoma originais ou a partir de outras células transfor-madas por standard técnicas, tais como extração e precipitação de isotiocia-nato de guanidínio seguida por centrifugação ou cromatografia. Onde dese-jável, mRNA podem ser isolado a partir de RNA total por técnicas de rotinatais como cromatografia sobre oligo dT celulose. Técnicas adequadas sãofamiliares na técnica.

Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leve epesada do anticorpo podem ser preparados, ou simultaneamente ou separa- damente, usando transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo commétodos de conhecimento geral. Reação de PCR pode ser iniciada por inici-adores de região constante de consenso ou por iniciadores mais específicoscom base nas seqüências publicadas de DNA e de aminoácidos de cadeiapesada e leve. Conforme discutido acima, PCR também pode ser usado pa- ra isolar clones de DNA codificando as cadeias leve e pesada de anticorpos.Neste caso as bibliotecas podem ser triadas por iniciadores de consenso ousondas homólogas maiores, tais como sondas de região constante de ca-mundongo.

DNA, tipicamente DNA de plasmídeo, podem ser isolados das células usando técnicas conhecidas na técnica, mapeados por restrição eseqüenciados de acordo com técnicas de rotina de conhecimento geral de-terminadas em detalhes, por exemplo, nas referências precedentes relativasa técnicas de DNA recombinante. Logicamente, o DNA pode ser sintético deacordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo deisolamento ou análise subseqüente. Anticorpos típicos ou fragmentos dosmesmos para uso nas moléculas de ligação da invenção incluem anticorposque reconhecem os alvos determinados aqui, neste Pedido de patente.

Em algumas modalidades, fragmentos de anticorpos de ligaçãode antígeno podem ser produzidos usando técnicas de conhecimento geralna técnica.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção po-de compreender uma molécula de anticorpo completa e uma molécula scFvestabilizada. Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invençãopode compreender uma porção de uma molécula de anticorpo e uma molé-cula scFv estabilizada.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende um fragmento ou porção de um anticorpo e uma molécula scFvestabilizada. Por exemplo, em uma modalidade, uma molécula de ligação dainvenção pode compreender um anticorpo com domínio eliminado e umamolécula scFv estabilizada. Anticorpos com domínio eliminado são molécu-las de anticorpos nas quais um ou mais domínios são parcialmente ou intei-ramente eliminados. Ainda moléculas de ligação estabilizadas compatíveiscom modalidades especialmente preferenciais compreenderão construtoscom domínio eliminado ou variantes em que todo o domínio CH2 foi removi-do (construtos ACH2). Para outras modalidades preferenciais um peptídeode ligação curto pode ser substituído para o domínio eliminado para propor-cionar flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Aquelesversados na técnica reconhecerão que similares construtos são particular-mente preferenciais devido às propriedades regulatórias do domínio CH2sobre a taxa catabólica do anticorpo.

Construtos com domínio eliminado podem ser derivados usandoum vetor (por exemplo, da IDEC Pharmaceuticals, San Diego) codificandoum domínio constante de IgGi humana (vide, por exemplo, o Pedido de pa-tente internacional N- WO 02/060955A2 e o Pedido de patente internacionalN2 WO 02/096948Α2). Será observado que estes construtos típicos foramengenheirados para fundir o domínio CH3 diretamente a uma região de arti-culação dos polipeptídeos respectivos da invenção. Em outros construtospode ser desejável proporcionar um espaçador peptídico entre a região dearticulação e os domínios CH2 e/ou CH3 sintéticos. Por exemplo, podem serexpressados construtos compatíveis em que o domínio CH2 foi eliminado eo domínio CH3 remanescente (sintético ou não sintético) é ligado à região dearticulação com um espaçador de 5 a 20 aminoácidos. Um espaçador similarpode ser adicionado, por exemplo, para assegurar que os elementos regula-tórios do domínio constante permaneçam livres e acessíveis ou que a regiãode articulação permaneça flexível. Por exemplo, pode ser usado um constru-to B3F6 com domínio eliminado tendo um espaçador de aminoácidos curtosubstituído para o domínio CH2 e a região de articulação menor(B3F6.ACH2 [gly/ser]). Outros peptídeos típicos são conhecidos na técnica

(vide, por exemplo, Pedido de patente Internacional PCT Nos. WO2005/000898 e WO 2005/000899). Estes peptídeos de ligação podem serusados em conexão com as moléculas de ligação da invenção. Preferenci-almente, os peptídeos de ligação são usados com um polipeptídeo carecen-do de um domínio de cadeia pesada CH2. Preferencialmente, qualquer pep-tídeo de ligação compatível com a presente invenção será relativamentenão-imunogênico e não inibirá a associação não-covalente dos polipeptídeosda invenção.

Em uma modalidade, uma molécula de Jigação da invençãocompreende uma cadeia pesada de imunoglobulina tendo eliminação ousubstituição de uns poucos ou mesmo um único aminoácido na medida quepermita a associação covalente ou não-covalente desejada entre as subuni-dades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido emáreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir subs-tancialmente a ligação de Fc e deste modo aumentar a localização tumoral.

Similarmente, pode ser desejável simplesmente eliminar a parte de um oumais domínios de região constante que controlam a função efetora (por e-xemplo, ligação de complemento) a ser modulada. As eliminações parciaisreferidas das regiões constantes podem melhorar características seleciona-das do anticorpo (meia-vida sérica) ao mesmo tempo que deixando outrasfunções desejáveis associadas com o domínio de região constante em ques-tão intacto. Além disso, conforme aludido acima, as regiões constantes dos anticorpos revelados podem ser sintéticas através da mutação ou substitui-ção de um ou mais aminoácidos que reforçam o perfil do construto resultan-te. A este respeito pode ser possível romper a atividade proporcionada porum sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação de Fc) enquanto man-tendo substancialmente a configuração e o perfil imunogênico da molécula de ligação estabilizada. Ainda outras modalidades preferenciais podemcompreender a adição de um ou mais aminoácidos à região constante parareforçar características desejáveis tais como função efetora ou proporcionarmais fixação de citotoxina ou carboidrato. Em similares modalidades podeser desejável inserir ou replicar seqüências específicas derivadas de domí-nios de região constante selecionados.

É de conhecimento na técnica que a região constante mediavárias funções efetoras. Por exemplo, ligação do componente C1 do com-plemento a anticorpos ativa o sistema do complemento. A ativação do com-plemento é importante na opsonização e Iise de patógenos celulares. A ati-vação do complemento também estimula a reação inflamatória e tambémpode estar envolvida em hipersensibilidade auto-imune. além disso, anticor-pos ligam a células através da região de Fc, com um sítio receptor de Fc so-bre a região Fc de anticorpo ligando a um receptor de Fc (FcR) sobre umacélula. Há uma série de receptores de Fc os quais são específicos para dife-rentes classes de anticorpo, incluindo IgG (receptores γ), IgE (receptoresépsilon), IgA (receptores a) e IgM (receptores mu). A ligação de anticorpo areceptores de Fc sobre as superfícies celulares dispara uma série de rea-ções biológicas importantes e diversas incluindo engolfamento e destruiçãode partículas revestidas de anticorpo, clearance de complexos imunes, Iisede células alvo revestidas de anticorpos por células assassinas (denominadacitotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo, ou ADCC),liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controleda produção de imunoglobulina.

Em uma modalidade, funções efetoras podem ser eliminadas oureduzidas usando uma região constante de um anticorpo de lgG4, o qual éconsiderado incapaz de eliminar células alvo, ou fabricar variantes de Fc, emque resíduos na região Fc crucial para uma ou mais funções efetoras sãomutadas usando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, na Patentedos Estados Unidos N- 5.585.097. Por exemplo, a eliminação ou inativação(através de mutações ponto ou outros meios) de um domínio de região cons-tante pode reduzir a ligação de receptor de Fc da molécula de ligação estabi-Iizada circulante deste modo aumentando a localização tumoral. Em outroscasos pode ser que modificações de região constante consistentes com apresente invenção moderem a ligação de complemento e deste modo redu-zam a meia-vida sérica e a associação inespecífica de uma citotoxina conju-gada. Ainda outras modificações de região constante podem ser usadas pa-ra modificar ligações dissulfeto ou moléculas de oligossacarídeo que possibi-litam aumentada localização devido a aumento da especificidade de antíge-no ou flexibilidade de anticorpo. Mais geralmente, aqueles versados na téc-nica reconhecerão que anticorpos modificados conforme descrito aqui, nestePedido de patente, podem exercer uma série de efeitos sutis que podem serou não prontamente reconhecidos. No entanto o perfil fisiológico resultante,biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais comolocalização tumoral, biodistribuição e meia-vida sérica, podem ser facilmentemedidos e quantificados usando técnicas imunológicas de conhecimentogeral sem indevida experimentação.

Em uma modalidade, formas modificadas de anticorpos podemser preparadas a partir de um precursor inteiro ou anticorpo parental usandotécnicas conhecidas na técnica. Técnicas típicas são discutidas em mais de-talhes aqui, neste Pedido de patente.B. Proteínas de Fusão Modificadas

Em algumas modalidades, uma molécula de ligação estabilizadada invenção é uma proteína de fusão modificada. Em uma modalidade típi-ca, uma molécula de ligação da invenção é uma proteína de fusão compre-endendo uma molécula scFv estabilizada encadeada à região de ligação deIigante de um receptor, uma molécula de adesão, um ligante, ou uma enzi-ma. Em outra modalidade exemplar, uma molécula de ligação da invenção éproteína de fusão compreendendo uma molécula scFv estabilizada encade-ada a uma porção de ligante de ligação de receptor. Por exemplo uma molé-cula de ligação da invenção é proteína de fusão compreendendo uma molé-cula scFv estabilizada a uma ou mais das seguintes moléculas:

Citocinas e Receptores de Citocinas

Citocinas têm efeitos pleiotrópicos sobre a proliferação, diferen-ciação, e ativação funcional de linfócitos. Várias citocinas, ou porções dasmesmas de ligação de receptores, podem ser utilizadas nas proteínas defusão da invenção. Citocinas típicas incluem as interleucinas (por exemplo,IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, e IL-18),os fatores estimulantes de colônias (CSFs) (por exemplo, CSF de granulóci-tos CSF (G-CSF), CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), e CSF demonócito macrófago CSF (M-CSF)), fator de necrose tumoral (TNF) α e β, einterferons tais como interferon-α, β, ou γ (Patentes dos Estados UnidosNos. 4.925.793 e 4.929.554).

Receptores de citocina tipicamente consistem em um cadeia αligante-específica e uma cadeia β comum. Receptores de citocina típicosincluem aqueles para GM-CSF, IL-3 (Patente dos Estados Unidos N25.639.605), IL-4 (Patente dos Estados Unidos N2 5.599.905), IL-5 (Patentedos Estados Unidos N2 5.453.491), IFNy (patente européia N2 E P0240975),e a família de receptores TNF (por exemplo, TNFa (por exemplo, β receptor<je Iinfotoxina TNFR-1 (patente européia N2 EP 417, 563), TNFR-2 (patenteeuropéia N2 EP 417.014)).

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção podeligar a uma citocina ou a um receptor de citocina.

Proteínas de Adesão

Moléculas de adesão são proteínas ligadas a membrana quepossibilitam que as células interajam umas com as outras. Várias proteínasde adesão, incluindo receptores residentes de leucócitos e moléculas de a-desão celular, de porções de ligação de receptores dos mesmos, podem serincorporadas em uma molécula de ligação da invenção. Receptores residen-tes de leucócitos são expressados sobre supefícies de células de Ieucocitosdurante inflamação e incluem as β-1 integrinas (por exemplo, VLA-1, 2, 3, 4,5, e 6) as quais mediaam ligação a componentes da matriz extracelular, e asp2-integrinas (por exemplo, LFA-1, LPAM-1, CR3, e CR4) as quais ligammoléculas de adesão celular (CAMs) sobre o endotélio vascular. CAMs típi-cas incluem ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, e MAdCAM-1. Outras CAMs incluemas da família das selectinas incluindo E-selectina, L-selectina, e P-selectina.

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção podeligar a uma proteína de adesão ou um receptor de proteína de adesão.Quimocinas

Quimocinas, proteínas quimiotácticas as quais estimulam a mi-gração de leucócitos para um sítio de infecção ou porções de ligação de re-ceptores de quimocina dos mesmos, também podem ser incorporadas emuma molécula de ligação da invenção. Quimocinas típicas incluem proteínasinflamatórias de macrófagos (ΜΙΡ-1-α e ΜΙΡ-1-β), fator quimotáctico de neu-trófilos, e RANTES (regulado na ativação de célula T expressada e secreta-da normalmente).

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção podeligar a uma quimocina ou um receptor.

Fatores de Crescimento e Receptores de Fator de Crescimento

Fatores de crescimento ou seus receptores (ou porções de liga-ção de receptor ou de ligação de Iigante dos mesmos) ou moléculas as quaisligam aos mesmos podem ser incorporados na molécula de ligação da in-venção. Fatores de crescimento típicos incluem angiopoietina, Fator deCrescimento Endotelial Vascular (VEGF) e suas isoformas (Patente dos Es-tados Unidos N2 5.194.596); Fatores de Crescimento Epidérmico (EGFs);Fatores de Crescimento Fibroblástico (FGF), incluindo aFGF e bFGF; fatornatriurético atrial (ANF); fatores de crescimento hepático (HGFs; Patentesdos Estados Unidos Nos. 5.227.158 e 6.099.841), fatores neurotróficos taiscomo fator neurotrófico ósteo-derivado (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6(ΝΤ-3, ΝΤ-4, ΝΤ-5, ou ΝΤ-6), ou um fator de crescimento nervoso tal comofator de crescimento derivado de plaquetas NGF-β (PDGF) (Patentes dosEstados Unidos Nos. 4.889.919, 4.845.075, 5.910.574, e 5.877.016); fatoresde crescimento transformantes (TGF) tais como TGF-α e TGF-β (WO90/14359), fatores osteoindutivos incluindo proteína morfogenética óssea(BMP); fatores de crescimento similares a insulina-l e -II (IGF-I e IGF-II; Pa-tentes dos Estados Unidos Nos. 6.403.764 e 6.506.874); Eritropoietina (E-PO); fator de células-tronco (SCF), trombopoietina (c-MpI ligante), e os poli-peptídeos Wnt (Patente dos Estados Unidos N2 6.159.462).

Receptores de fatores de crescimento típicos os quais podemser usados incluem EGF receptores (EGFRs); VEGF receptores (por exem-plo, Fltl ou Flk1/KDR), PDGF receptores (publicação de patente internacio-nal N2 WO 90/14425); HGF receptores (Patentes dos Estados Unidos Nos.5.648.273, e 5.686.292); IGF receptores (por exemplo, IGFR1 e IGFR2) ereceptores neurotróficos incluindo o receptor de baixa afinidade (LNGFR),também denominado como p75NTR ou p75, o qual liga NGF, BDNF, e NT-3,e receptores de alta afinidade que são membros da família trk das tirosinaquinases receptoras (por exemplo, trkA, trkB (EP 455,460), trkC (EP522,530)). Em outra modalidade, tanto IGFR1 e VEGF são direcionados. Em ainda outra modalidade, VLA4 e VEGF são direcionados. Em outra mo-dalidade, tanto IFA1 quanto VLA4 são direcionados.

Outros receptores da superfície celular e/ou seus Iigantes tam-bém podem ser direcionados (por exemplo, os receptores da família de TNFou seus ligantes (conforme descrito em mais detalhes aqui, neste Pedido de patente).

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção podeligar a um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento.

Hormônios

Hormônios de crescimento típicos ou moléculas as quais ligamaos mesmos para uso como agentes de direcionamento em uma moléculade ligação da invenção incluem renina, hormônio de crescimento humano(HGH; Patente dos Estados Unidos N2 5.834.598), hormônio de crescimentohumano N-metionil; hormônio de crescimento bovino; fator de liberação dehormônio de crescimento; hormônio paratiróide (PTH); hormônio estimulanteda tiróide (TSH); tiroxina; pró-insulina e insulina (Patentes dos Estados Uni-dos Nos. 5.157.021 e 6.576.608); hormônio folículo estimulante (FSH), calci- tonina, hormônio Iuteinizante (LH)1 leptina, glucagons; bombesina; somatro-pina; substância de inibição muleriana; relaxina e prorrelaxina; peptídeo as-sociado a gonadotropina; prolactina; lactogênio placentário; OB proteína; ousubstância de inibição muleriana.

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção pode ligar a um hormônio ou um receptor de hormônio.

Fatores de Coagulação

Fatores de coagulação sangüínea típicos para uso como agen-tes de direcionamento nas moléculas de ligação da invenção incluem os fa-tores de coagulação (por exemplo, fatores V, VII, VIII, Χ, IX, XI, Xll e XIII, fator de von Willebrand); fator tecidual (Patentes dos Estados Unidos Nos.5.346.991, 5.349.991, 5.726.147, e 6.596.84); trombina e protrombina; fibrinae fibrinogênio; plasmina e plasminogênio; ativadores de plasminogênio, taiscomo ativador de plasminogênio tecidual (t-PA) ou uroquinase ou urina hu-mana.

Em outra modalidade, uma molécula scFv da invenção podeligar a um fator de coagulação.

-Em outras modalidades, proteína de ligação estabilizada da in-venção é uma imunoadesina modificada. Conforme é de conhecimento geralna técnica, uma imunoadesina é uma proteína de fusão que combina a regi- ão de ligação alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligante, ouuma enzima, com a região Fc de um anticorpo. Imunoadesinas típicas sãodescritas, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.116.964;5.428.130; 5.714.147; e 6.406.697, cada uma das quais é incorporada pormeio de referência aqui, a este Pedido de patente. Em uma modalidade,uma imunoadesina modificada da invenção é formada encadeando uma mo-lécula scFv estabilizada a uma imunoadesina.

Imunoadesinas previamente reportadas podem ser estabilizadasconforme descrito aqui, neste Pedido de patente, para proporcionar as imu-noadesinas modificadas da presente invenção. Imunoadesinas típicas quepodem ser usadas para gerar ou derivar a imunoadesina modificada revela-da incluem, mas não estão limitadas a, abatecept (Orencia®, Bristol-MeyersSquibb, Princeton, NJ), alefacept (Amevive®, Biogenldec, Cambridge, MA),etanercept (Enbrel®, Amgen, Thousand Oaks, CA), SMART ™ Anti-γ Interfe-ron (Protein Design Labs, Fremont, CA), SMART ™ Anti-L-Selectina (ProteinDesign Labs. Fremont, CA), rilonacept (Regeneron Pharmaceuticals Inc.,Tarrytown, NY), regavirumab (TI-23, Teijin America, New York, NY), R24(National Câncer Institute (Bethesda, MD), Oprelvekin (NEUMEGA® , Gene-tics Institute, Cambridge, MA), ONCOLYSIN B, ONCOLYSIN CD6, ON-COLYSIN M, e ONCOLYSIN S (todas da ImmunoGen Inc., Cambridge, MA,USA), ONCOLYM ™ 131 (Techniclone Corp., Tustin, CA), lmmuRAIT-LL2(Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ), IL-4 RA (BAY 16-9996; BayerCorp.,Berkeley, CA), IC14 (ICOS Corporation, Bothell, WA), CYT-356-Y-90 (ON-CORAD®PR, Cytogen Corp., Princeton, NJ), COTARA ™ (TechnicloneCorp., Tustin, CA), CMB-401 (Wyeth Pharmaceuticals, Madison, NJ), conju-gado AVICIDIN® (NeoRx Corp., Seattle, WA) e antiimunoadesina CD18(Genentech Inc., S. San Francisco, CA).

Outra molécula típica que pode ser incluída em uma moléculade ligação da invenção é membro 9 da superfamília de imunoglobulinas(IGSF9; Genomics. 2002. 79:663-70).

C. Especificidade de Ligação

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção ligaa uma molécula alvo que está presente sobre a superfície de uma célula ouque é solúvel.

Em uma modalidade, no mínimo uma especificidade de ligaçãode uma molécula de ligação da invenção é catalítica. Especificidades de li-gação catalíticas podem ser feitas usando técnicas reconhecidas na técnica(vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N- 6.590.080, e a a Pa-tente dos Estados Unidos N2 5.658.753). Especificidades de ligação catalíti-cas podem trabalhar por uma série de mecanismos básicos similares aque-Ies identificados para enzimas para estabilizar o estado de transição, destemodo reduzindo a energia livre de ativação. Por exemplo, resíduos ácidos ebásicos gerais podem ser otimamente posicionados para participação emcatálise dentro de sítios ativos catalíticos; intermediários de substratos enzi- máticos covalentes podem ser formados; anticorpos catalíticos também po-dem estar em orientação apropriada para reação e aumentar a concentraçãoeficaz de reagentes por no mínimo sete ordens de magnitude (Fersht, A. R.,et al., Am. Chem. Soe. 90 (1968): 5833) e deste modo reduzir grandementea entropia de uma reação química. Finalmente, anticorpos catalíticos podemconverter a energia obtida na ligação de substrato para distorcer a reaçãopara uma estrutura se assemelhando ao estado de transição.

Em uma modalidade, resíduos de ácido ou base podem ser tra-zidos para o sítio de ligação usando uma molécula complementar carregadacomo um imunogênio. Esta técnica se comprovou de êxito para produção de anticorpos com um hapteno contendo um íon amônio carregado positiva-mente (Shokat, et al., Chem. Int. Ed. Engl. 27 (1988): 269-271).

Em outra abordagem, podem ser produzidos anticorpos paracompostos estáveis que se assemelham ao tamanho, à forma, e à carga doestado de transição de uma reação desejada (isto é, análogos do estado de transição). Vide a a Patente dos Estados Unidos N2 4.792.446 e a a Patentedos Estados Unidos N2 4.963.355 as quais descrevem o uso de análogos doestado de transição para imunizar animais e a produção de anticorpos catalí-ticos. Ambas estas patentes são por este incorporadas por meio de referên-cia. Em uma modalidade, similares moléculas podem ser administrada como parte de um imunoconjugado, por exemplo, com uma molécula de veículoimunogênica, tal como KLH.

Especificidades de ligação catalítica típicas podem ter, por e-xemplo, atividade de esterase (envolvendo um estado de transição carrega-do cujas características eletrostáticas e de formato podem ser simuladas por uma estrutura de fosfonato; Jacobs, et al., J. Am. Chem. Soe. 109 (1987):2174-2176; Durfor, et al., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988): 8713-8714; Tra-montano, et al., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988): 2282; Pollack, et al., J. Am.Chem. Soe. 111 (1989): 5961-5962); atividade de peptidase ou amidase(Janda, et al., Science 241 (1988): 1188-1191; Iverson, et al., Science 243(1989): 1184-1188; Paul, et al., Science 244 (1989): 1158-1162); redisposi-ção de Claisen (Jackson, et al., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988): 4841-4842;Hilvert, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988): 4953-4955; Hilvert, et al.,J. Am. Chem. Soe. 110 (1988): 5593-5594); reações redox (Shokat, et al.,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27 (1989): 269-271); clivagem fotoquímica deum dímero de timina (Cochran, et al., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988): 7888-7890); redisposições de transesterificação estereoespecífica (Napper, et al.,Science 237 (1987): 1041-1043); ou uma síntese de amida bimolecular(Benkovic, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988): 5355-5358; Janda, etal., Science 241 (1988): 1188-1191).

Em outra abordagem, especificidades de ligação convencionaispodem ser mutadas para as tornar catalíticas.

Métodos para triagem de atividade de anticorpo catalítico são deconhecimento geral na técnica (por exemplo, Reymond, J.L. 2002. Journal ofImmunological Methods 269:125; Mouratou et al. 2002. J. of ImmunologicalMethods. 269:147. Em ainda outra modalidade, células B catalíticas podemser seleciondas, por exemplo, conforme descrito na patente dos EstadosUnidos N- 6.590.080 usando uma molécula pode ser construída a qual facili-ta seleção de células B catalíticas.

Em outra modalidade, especificidades de ligação catalíticas po-dem ser desenvolidas como parte de um processo de duas etapas. Anticor-pos catalíticos podem ser selecionados somente se apresentando as seguin-tes características de ligação: ligar tanto o substrato quanto um grupamentoreativo de tal modo que os dois grupamentos estão em uma posição reativaum para o outro. Segundo, os anticorpos selecionados podem ser quimica-mente engenheirados ligando de modo covalente um grupamento reativo nacavidade de ligação do anticorpo. J Immunol Methods. 2002. 269:81-98.

Em uma modalidade, uma especificidade de ligação catalítica éespecífica para um pró-farmaco. Uma especificidade de ligação similar podeser usada para catalisar a conversão de um pró-farmaco em um fármaco oqual é eficaz in vivo. Preferencialmente, a reação catalisada é uma reaçãoque não pode ser realizada por enzimas naturais in vivo. Exemplos de ativa-ção de pró-farmaco por anticorpos são conhecidas na técnica (vide, por e-xemplo, Miyashita et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5337).

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invençãocompreende no mínimo uma especificidade de ligação para uma célula alvoe no mínimo uma especificidade de ligação para um pró-farmaco. Por exem-plo, em uma modalidade preferencial, uma molécula de ligação estabilizadada invenção compreende no mínimo uma especificidade de ligação parauma célula tumoral e no mínimo uma especificidade de ligação para um pró-farmaco a qual pode ser convertida para fármaco citotóxico. Em um exem-plo, uma molécula de ligação estabilizada da invenção compreende umaespecificidade de ligação para um pró-farmaco de carbamato: 4-[N,N,-bis(2-cloroetil)]aminofenil-N-[(1S-(1,3-dicarbóxi)propil]carbamato e gera a mostar-da de nitrogênio citotóxica correspondente (Wentworth et al. 1996. Proc Natl.Acad. Sei. USA. 93:799).

Em uma modalidade, molécula de ligação é administrada antesde administração do pró-farmaco para possibilitar a acumulação no sítio dacélula alvo. Pró-farmacos típicos são conhecidos na técnica. Pró-farmacostambém podem ser sintetizados incorporando uma porção projetada para serliberada por ação catalítica, por exemplo, por reações seqüenciais de retro-aldol / retro-Michael catalisadas por um anticorpo com atividade de aldolase.(Shabat et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:7428). As porções demarcaramento de fármaco referidas podem ser preparadas, por exemplo,por modificação de grupamentos oxidrila ou tiol de fármacos.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção émultiespecífica, isto é, tem no mínimo um sítio de ligação que liga a umaprimeira molécula alvo ou epítope da molécula alvo e no mínimo um segun-do sítio de ligação que liga a uma segunda molécula alvo diferente ou a umsegundo epítope diferente da primeira molécula alvo. Em algumas modali-dades, moléculas de ligação multiespecífica da invenção (por exemplo, mo-léculas de ligação biespecífica) compreendem no mínimo um sítio de ligaçãode qualquer um dos anticorpos descritos aqui, neste Pedido de patente, porexemplo, na Seção A, acima.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção ébiespecífica. Moléculas biespecíficas podem ligar a dois sítios alvo diferen- tes, por exemplo, sobre a mesma molécula alvo ou sobre moléculas alvodiferentes. Por exemplo, no caso de anticorpos, moléculas biespecíficas po-dem ligar a dois epítopes diferentes, por exemplo, sobre o mesmo antígenoou sobre dois antígenos diferentes. Moléculas biespecíficas podem ser usa-das, por exemplo, em aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Por exem-pio, podem ser usadas para imobilizar enzimas para uso em imunoensaio.Também podem ser usadas em diagnóstico e tratamento de câncer, por e-xemplo, ligando tanto uma molécula associada a tumor quanto um marcadordetectável (por exemplo, um quelador o qual liga firmemente um radionuclí-deo. Moléculas biespecíficas também podem ser usadas para terapia huma- na, por exemplo, dirigindo a citotoxicidade para um alvo específico (por e-xemplo, ligando a um patógeno ou célula tumoral e a uma molécula de gati-lho citotóxico, tal como o receptor de células T ou o Fcy receptor. Anticorposbiespecíficos também podem ser usados, por exemplo, como agentes fibri-nolíticos ou adjuvantes de vacina.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação muItiespecífica dainvenção incluem aquelas com no mínimo um ramo (isto é, sítio de ligação)dirigido contra uma molécula da superfície celular, e no mínimo um ramodirigido contra uma molécula solúvel. Em outra modalidade, um anticorpomultiespecífico da invenção tem dois sítios de ligação que ligam a moléculassolúveis. Em outra modalidade, um anticorpo multiespecífico da invençãotem dois sítios de ligação que ligam a moléculas da superfície celular.

As moléculas de ligação multiespecífica da invenção podem sermonovalentes para cada especificidade ou multivalentes para cada especifi-cidade. Em uma modalidade, uma molécula de ligação biespecífica da in- venção pode compreender um sítio de ligação que reage com uma primeiramolécula alvo e um sítio de ligação que reage com uma segunda moléculaalvo (por exemplo, um anticorpo biespecífico molécula, proteína de fusão, ou"minibody")· Em outra modalidade, uma molécula de ligação biespecífica dainvenção pode compreender dois sítios de ligação que reagem com umaprimeira molécula alvo e dois sítios de ligação que reagem com uma segun-da molécula alvo (por exemplo, um anticorpo tetravalente scFv2 biespecífica,"minibody" tetravalente, ou diabody).

Em algumas modalidades, no mínimo um sítio de ligação deuma molécula de ligação multiespecífica da invenção é uma região de liga-ção de antígeno de um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno domesmo.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica dainvenção são anticorpos bivalentes ou variantes de anticorpo com um ramocontendo no mínimo uma scFv estabilizada dirigida para uma primeira molé-cula alvo e um segundo ramo contendo no mínimo uma scFv estabilizadadirigida para uma segunda molécula alvo.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica dainvenção compreendem no mínimo uma scFv estabilizada (por exemplo, 2,3, ou 4 scFvs) encadeada ao C-término de uma cadeia pesada, em que asscFvs têm a mesma especificidade de ligação ou diferentes. Uma moléculade ligação típica deste tipo (um anticorpo "C-Hercules") é mostrada na Figu-0 rà 13. Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica da in-venção compreendem no mínimo uma scFv estabilizada (por exemplo, 2, 3,ou 4 scFvs) encadeadas ao N-término de uma cadeia pesada , em que asscFvs têm a mesma especificidade de ligação ou diferentes. Uma moléculade ligação típica deste tipo (um anticorpo "NH-Hercules") é mostradaa naFigura 13. Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica dainvenção compreendem no mínimo uma scFv estabilizada (por exemplo, 2,3, ou 4 scFvs) encadeada ao N-término de uma cadeia leve, em que asscFvs têm a mesma especificidade de ligação ou diferentes. Uma moléculade ligação típica deste tipo (um anticorpo "NL-Hercules") é mostrada na Figu-ra 13. Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica da in-venção compreendem no mínimo uma scFv estabilizada (por exemplo, 2, 3,ou 4 scFvs) encadeada ao N-término da cadeia pesada ou cadeia leve e nomínimo uma scFv estabilizada (por exemplo, 2, 3, ou 4 scFvs) encadeada aoC-término da cadeia pesada, em que as scFvs têm a mesma especificidadede ligação ou diferentes.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação multiespecífica dainvenção são minibodies bivalentes com um ramo contendo no mínimo umfragmento de scFv dirigido para uma primeira molécula alvo e um segundoramo contendo no mínimo um scFv dirigido para uma segunda molécula alvoem que no mínimo uma das moléculas scFv é estabilizada. Um construto de"minibody" bivalente biespecífico típico é mostrado na Figura 42. Na Figura42 um domínio CH3 é fundido em seu N-término a um peptídeo de ligação oqual é fundido em seu N-término a um domínio VH o qual é fundido atravésde seu N-término a um Iigante flexível (Gly4Ser)n o qual é fundido em seu N-término a um domínio VL.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecíficada invenção são minibodies tetravalentes scFv, com cada "minibody" tetra-valente da porção da scFv de cadeia pesada contendo primeiro e segundofragmentos de scFv em que em elsat uma das moléculas scFv é estabiliza-da. O segundo fragmento de scFv referido pode ser encadeado ao N-términodo primeiro fragmento de scFv (por exemplo, minibodies tetravalentes NhscFv biespecíficos ou minibodies tetravalentes Nl scFv biespecíficos). Umexemplo de um "minibody" tetravalente N-scFv biespecífico é mostrado naFigura 43. Alternativamente, o segundo fragmento de scFv pode ser enca-deado ao C-término da referida porção de cadeia pesada contendo o primei-ro fragmento de scFv referido (por exemplo, minibodies tetravalentes C-scFvbiespecíficos). Um exemplo de um "minibody" tetravalente C-scFv biespecí-fico é mostrado na Figura 44. Em uma modalidade, o primeiro e o segundofragmentos de scFv podem ligar a mesma molécula alvo ou diferentes. Ondeo primeiro e o segundo fragmentos de scFv de uma primeira porção de ca-deia pesada de um "minibody" tetravalente biespecífico ligam a mesma mo-lécula alvo, no mínimo um dos primeiro e segundo fragmentos de scFv dasegunda porção de cadeia pesada do "minibody" tetravalente biespecíficoliga uma molécula alvo diferente.Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecíficada invenção são diabodies biespecíficos, com cada ramo do diabody com-preendendo fragmentos tandem de scFv no mínimo um dos quais é estabili-zado. Em uma modalidade, um diabody biespecífico pode compreender umprimeiro ramo com uma primeira especificidade de ligação e um segundoramo com uma segunda especificidade de ligação (vide, por exemplo, a Fi-gura 45). Em outra modalidade, cada ramo do diabody pode compreenderum primeiro fragmento de scFv com uma primeira especificidade de ligaçãoe um segundo fragmento de scFv com uma segunda especificidade de Iiga-ção.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecíficada invenção são anticorpos tetravalentes scFv2 com cada porção de cadeiapesada do anticorpo tetravalente scFv2 contendo uma molécula scFv, emque no mínimo uma das moléculas scFv são estabilizadas. Os fragmentosde scFv podem ser encadeados aos N-términos de uma região variável dasporções de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos tetravalentes Nh scFv2biespecíficos ou anticorpos tetravalentes Nl scFv2 biespecíficos). Alternati-vamente, os fragmentos de scFv podem ser encadeados aos C-términos dasporções de cadeia pesada do anticorpo tetravalente scFv2 (por exemplo,anticorpos tetravalentes C-scFv2 biespecíficos, vide, por exemplo, a Figura46). Cada porção de cadeia pesada do anticorpo tetravalente scFv2 pode terregiões variáveis e fragmentos de scFv que ligam as mesmas ou diferentesmoléculas alvo. Onde o fragmento de scFv e região variável de uma primeiraporção de cadeia pesada de um anticorpo tetravalente scFc2 biespecíficoligam a mesma molécula alvo, no mínimo um dos primeiro e segundo frag-mentos de scFv da segunda porção de cadeia pesada do "minibody" tetrava-lente biespecífico liga uma molécula alvo diferente.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação multiespecíficada invenção são anticorpos com domínio eliminado tetravalentes scFv2 comcada porção de cadeia pesada do anticorpo tetravalente scFv2 contendo umfragmento de scFv no mínimo um dos quais é estabilizado. Os fragmentosde scFv podem ser encadeados aos N-términos de uma região variável dasporções de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos com domínio eliminadotetravalentes Nh scFv2 biespecíficos (vide a Figura 48) ou anticorpos tetra-valentes Nl scFv2 biespecíficos (vide a Figura 49). Alternativamente, osfragmentos de scFv podem ser encadeados aos C-términos das porções decadeia pesada do anticorpo tetravalente com domínio eliminado scFv2 (porexemplo, anticorpos com domínio eliminado tetravalentes C-scFv2 biespecí-ficos, vide por exemplo, a Figura 47).

Moléculas da superfície celular típicas às quais uma molécula deligação da invenção pode ligar incluem receptores ou antígenos de célulastumorais que são superexpressadas sobre a superfície de uma célula tumo-ral ou neoplásica, bem como quaisquer dos receptores de citocina, molécu-las de adesão, ou receptores de fator de crescimento descritos aqui, nestePedido de patente, por exemplo, na seção B acima. Moléculas solúveis típi-cas incluem agentes antitumorais (por exemplo, toxinas, quimioterápicos, epró-farmacos dos mesmos), enzimas solúveis (por exemplo, enzimas con-versoras de pró-farmacos), citocinas, quimocinas, hormônios, fatores decrescimento, ou fatores de coagulação, por exemplo, conforme descrito aqui,neste Pedido de patente, por exemplo, na seção A acima.

Moléculas biespecíficas as quais ligam tanto a antígenos de cé-lulas tumorais quanto a agentes antitumorais ou enzimas solúveis podemportanto localizar o agente anticancerígeno para uma célula tumoral expres-sando o referido antígeno de células tumorais, deste modo maximizando osefeitos tóxicos do agente anticancerígeno sobre uma célula tumoral e mini-mizando um efeito tóxico do anticancerígeno sobre células normais.

Moléculas de ligação biespecífica típicas com no mínimo umsítio de ligação para um antígeno tumoral e no mínimo um sítio de ligaçãopara uma toxina incluem anti-saporin / anti-ld-1, anti-CD22 / anti-saporin,anti-CD7 / anti-saporin, anti-CD38 / anti-saporina, anti-CEA / anti-cadeia Ade ricina, antiinterferon-.a.(IFN-.a.) / antiidiotipo de hibridoma, anti-CEA /antivinca alcalóide). Moléculas de ligação biespecífica típicas com no mínimoum sítio de ligação para uma molécula da superfície celular e no mínimo umsítio de ligação para um pró-farmaco convertendo enzima incluem, por e-xemplo, anti-CD30 / antifosfatase alcalina (a qual catalisa conversão de pró-farmaco de fosfato de mitomicina para o álcool de mitomicina quimioterápi-co).

Em outras modalidades, as moléculas de ligação biespecíficaligam tanto a antígenos de células tumorais quanto a agentes de diagnósti-co, deste modo localizando o referido agente de diagnóstico para uma célulatumoral expressando o referido antígeno de células tumorais e facilitando adetecção de tumor in vitro ou in vivo. Moléculas de ligação biespecíficas típicasincluem anti-CEA / anti-EOTUBE, anti-CEA / anti-DPTA, anti-CEA / anti-.β.- galactosidase, e anti-p185HER2 / anti- -hapteno).

Em outras modalidades, moléculas de ligação biespecífica dainvenção ligam tanto a moléculas solúveis (por exemplo, antígenos solúveis)e moléculas da superfície celular sobre células não tumorais (por exemplo,células imunes). Por exemplo, podem ser usado para dirigir complexos imu- nes solúveis para receptores da superfície celular sobre células imunes, des-te modo facilitando seu clearance do corpo por mecanismos imunes media-dos por células. Moléculas biespecíficas típicas deste tipo incluem antilipo-proteína de baixa densidade (LDL) / anti-Fc receptor (por exemplo, Fc. y.RI,Fc. γ. RlI ou Fe. γ.Rl11)) e moléculas de ligação biespecífica para uso em te-rapia de doenças infecciosas (tais como anti-CD3 / anti-herpes simplex vírus(HSV), anti-receptor de células T:CD3 complexo / antiinfluenza, anti-Fc.gamma.R / anti-HIV.

Em outras modalidades, moléculas de ligação biespecífica dainvenção são capazes de ligar tanto a receptores da superfície celular quan- to a Iigantes solúveis dos mesmos. Em uma modalidade, o Iigante é o Iigantecognato de um receptor da família de TNF.

Receptores da superfície celular típicos aos quais as moléculasde ligação biespecífica podem ligar são antígenos de células tumorais oureceptores de células imunes. Receptores da superfície celular típicos tam- bém incluem receptores de citocina, moléculas de adesão, ou receptores defatores de crescimento, por exemplo, conforme descrito aqui, neste Pedidode patente, por exemplo, na seção B acima. Ligantes solúveis típicos inclu-em citocinas, quimocinas, hormônios, fatores de crescimento, ou fatores decoagulação, por exemplo, conforme descrito na seção B acima.

Moléculas de ligação biespecífica típicas incluem anti-VLA4 /anti-Mac-1, anti-VLA4 / anti-VEGF, anti-VLA4 / antiangiopoietina, anti-VLA4 /anti-TNFa, anti-IGFR1 / anti-VEGF, anti-IGFR1 / antiangiopoietina, anti-IGFR1 / anti-EGFR, anti-HGF-SF / anti-VEGF, anti-HGF-SF / antiangiopoie-tina, e HGF-SF / qualquer segundo antígeno (Vide, por exemplo, Cao et al.Proc. Natl. Acad. Sci 2001. 98:7443; Lu et al. 2004. J. Biol. Chem.279:2856).

Em outras modalidades, as moléculas de ligação biespecífica dainvenção incluem aquelas com no mínimo um ramo (isto é, sítio de ligação)dirigido contra uma primeira molécula solúvel (por exemplo, Iigante solúvel),e no mínimo um ramo dirigido contra uma segunda molécula solúvel (porexemplo, Iigante solúvel). As moléculas de ligação biespecífica referidas podemser empregadas como ferramentas de diagnóstico (por exemplo, anti-lgG decoelho / antiferritina, antiperoxidase de raiz-forte (HRP) / anti-hormônio, anti-somatostatina / anti-substância P, anti-HRP / anti-FITC (vide Nolan et al.,acima)) ou agentes fibrinolíticos (por exemplo, anti-fibrina / antiativador deplasminogênio tecidual (tPA), anti-fibrina / antiativador de plasminogênio dotipo uroquinase (uPA)).

Em uma modalidade preferencial, a molécula solúvel à uma mo-lécula de ligação biespecífica da invenção liga é um Iigante solúvel da famíliade TNF. Exemplos de Iigantes da família de TNF incluem, mas não estãolimitados a, LTA (o qual liga TNFR1 / TNFRSF1A), TNF (o qual liga CD120b/ TNFRSF1B), LTB (o qual liga LTBR / TNFRSF3), OX40L (o qual liga 0X40/ TNFRSF4), CD40L (o qual liga CD40 / TNFRSF5), (o qual liga Fas / TN-FRSF6 e DcR3 / TNFRSF6B), CD27L (o qual liga CD27 / TNFRSF7), CD30L(o qual liga CD30 / TNFRSF8), 4-1-BB-L (o qual liga 4-1-BB / TNFRSF9),TRAIL (o qual liga TRAIL-R1 / TNFRSF10A, TRAIL-R2/TNFRSF1OB, TRAIL-R3 / TNFRSF10C, e TRAIL-R4 / TNFRSF10D), RANKL (o qual liga RANK /TNFRSF11A e Osteoprotegrina / TNFRSF11B), APO-3L (o qual liga APO-3 /TNFRSF12 e DR3L / TNFRSF12L), APRIL (o qual liga TACI / TNFRSF13B),BAFF (o qual liga BAFFR / TNFRSF13A), LIGHT (o qual liga HVEM / TN-FRSF14), NGF Iigands (o qual liga LNGFR1 por exemplo, NGF-β, NGF-2 /NTF3, NTF5, BDNF, IFRD1), GITRL (o qual liga GITR / TNFRSF18), IiganteEDAR1 & XEDAR, Iigante Fn14, e Iigante Troy/Trade.

Em outras modalidades exemplares, as moléculas de ligaçãobiespecífica da invenção têm no mínimo um sítio de ligação para uma pri-meira molécula da superfície celular e no mínimo um sítio de ligação parauma segunda molécula da superfície celular. Em uma modalidade, a primei-ra e segunda moléculas da superfície celular estão Iocalizadsa sobre célulasdiferentes (por exemplo, tipos celulares diferentes). Por exemplo, moléculasbiespecíficas podem ter no mínimo um ramo dirigido contra um antígeno decélula tumoral e no mínimo um ramo diridigo contra receptor da superfíciecelular sobre uma célula não tumoral (por exemplo, uma célula imune). Mo-léculas de ligação biespecífica típicas deste tipo incluem aquelas tendo no mínimo um sítio de ligação para um antígeno de células tumorais e no míni-mo um sítio de ligação dirigido contra uma molécula de gatilho citotóxico deuma célula efetora imune (tal como anti-Fc. y.RI / anti-CD15, anti-p185.sup.HER2 / Fc. γ-RIII (CD16), anti-p185.sup.HER2 / anti-VEGF, anti-CD3 / anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3 / anti-p185.sup.HER2, anti- CD3 / anti-p97, anti-CD3 / anticarcinoma de células renais, anti-CD3 / anti-OVCAR-3, anti-CD3 / L-D1 (anticarcinoma do cólon), anti-CD3 / antianálogode hormônio estimulante de melanócito, anti-EGF receptor / anti-CD3, anti-CD3 / anti-CAMA1, anti-CD3 / anti-CD19, anti-CD3 / MoV18, antimolécula deadesão de células neurais (NCAM) / anti-CD3, antiproteína de ligação de folato (FBP) / anti-CD3, e antiantígeno associado a pan carcinoma (AMOC-31) / anti-CD3)). Moléculas biespecíficas as quais ligam tanto a antígenos decélulas tumorais quanto molécula de gatilho citotóxico são capazes de justa-por de modo eficaz uma célula tumoral com uma célula efetora imune, destemodo ativando a célula efetora para destruir a célula tumoral por meio de mecanismos imunes mediados por células.

Em outra modalidade, a primeira e segunda moléculas da super-fície celular às quais uma molécula de ligação biespecífica é capaz de ligarestão localizadas sobre a mesma célula ou tipo de célula. Por reticulaçãodos primeiro e segundo receptores sobre a mesma célula, as moléculas deligação biespecífica da invenção podem inibir ou reforçar uma atividade (porexemplo, atividade de transdução de sinal) associada com um ou ambos oprimeiro e segundo receptores. Em uma modalidade a primeira e segundamoléculas da superfície celular são do mesmo tipo (por exemplo, são damesma família de moléculas). Em outra modalidade a primeira e segundamoléculas da superfície celular referidas são de tipos distintos (por exemplo,são de diferentes famílias de moléculas). Receptores da superfície celulartípicos aos quais as moléculas de ligação biespecífica ligam incluem antíge-nos de células tumorais ou receptores de células imunes. Receptores dasuperfície celular típicos incluem quaisquer dos receptores de citocina, mo-léculas de adesão, ou receptores de fator de crescimento descritos na seçãoB acima.

Em uma modalidade, moléculas alvo típicas às quais uma molé-cula de ligação da invenção liga incluem um ou mais epítopes de, por exem-plo, sulfato de heparina, fatores de crescimento ou seus receptores (por e-xemplo, receptor de fator de crescimento epidérmico, receptor de fator decrescimento similar a insulina, receptor de fator de crescimento de hepatóci-tos (HGF/SF) (Vide, por exemplo, Cao et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 2001.98:7443; Lu et al. 2004. J. Biol. Chem. 279:2856).

Em uma modalidade exemplar, no mínimo uma das moléculasàs quais uma molécula de ligação biespecífica da invenção liga é um mem-bro da família de receptores de TNF (TNFR). Em outra modalidade exem-plar, a primeira e segunda moléculas alvo às quais uma molécula de ligaçãobiespecífica da invenção liga são ambas membros da família de TNFR. Emoutra modalidade, uma molécula de ligação da invenção liga a um Iigante dafamília de TNFR. Em ainda outra modalidade, uma molécula de ligação dainvenção liga a um membro da família de TNFR e um antígeno expressadosobre a superfície de uma célula tumoral, por exemplo, preferencialmenteexpressada sobre uma célula tumoral. O fator Iimitante no tratamento de tu-mores com moléculas de ligação TNFR monoespecíficas é que freqüente-mente somente um subgrupo de tumores parece ser sensível a similaresterapias. Moléculas de ligação TNFR multiespecíficas podem especificamen-te ativar TNFRs, e reforçar sinalização de receptor, por exemplo, trazendo osTNFRs em íntima proximidade. A invenção proporciona moléculas de ligação de TNFR biespecíficas aprimoradas as quais podem direcionar mais de umTNFR ou tipo de TNFR e reforçar sinalização, deste modo proporcionandoum método aprimorado para tratar câncer. Em uma modalidade, a moléculade ligação de TNFR biespecífica aumenta a força do sinal ligando a dois oumais TNFRs do mesmo tipo aumentando o número de TNFRs sendo trazi- dos juntos. Em outra modalidade mais preferencial, a molécula de ligação deTNFR biespecífica é capaz de ligar a dois receptores da família de TNF dife-rentes.

Em uma modalidade, no mínimo um dos TNFRs aos quais amolécula de ligação de TNFR biespecífica liga contém um domínio de morte. O termo "domínio de morte" se refere a uma região citoplasmática de umreceptor da família de TNF o qual está envolvido em morte celular ou sinali-zação apoptótica mediadas por TNF e indução de citotoxicidade celular me-diada por estes receptores. Esta região acopla o receptor para ativação decaspase através de proteínas adaptoras resultando em ativação do caminho de morte extrínsico.

Exemplos de receptores de TNF os quais contêm domínios demorte incluem, mas não estão limitados a, TNFR1 (TNFRSF1A), Fas (TN-FRSF6), GFI-3 (TNFRSF6B), Í.WGFR (TNFRSF16) TRAIL-R1 (TNFRSF10A),TRAIL-R2 (TNFRSF10B) e DR6 (TNFRSF21). A sinalização apoptótica des- tes receptores é modulada na ligação de um Iigante cognato e formação dequaisquer um dos seguintes pares de receptor-ligante: TNFR1/TNFa,Fas/FasL, DR-3/DR-3LG, TRAIL-R1/TRAIL, ou TRAIL-R2/TRAIL.

Moléculas de ligação de TNFR biespecíficas que direcionamreceptores da família de TNF alvo contendo domínios de morte são úteispara o tratamento de câncer uma vez que os TNFRs deste tipo são freqüen-temente superexpressados sobre células tumorais e estimulação do receptorpode ativar apoptose de células tumorais. Em modalidades preferenciais, oTNFR contendo domínio de morte ao qual a molécula de ligação de TNFRbiespecífica da invenção liga é TRAIL-R2. TRAIL-R2 é preferencial para te-rapia de tumor humano uma vez que sua ativação não dispara apoptose dehepatócitos e portanto pode ter reduzida toxicidade.

Apesar da ativação de alguns receptores contendo domínio demorte, por exemplo, TNFR1 ou Fas, ter sido tóxica em aplicações in vivo, éprovável que amarrando estes receptores a outros receptores de TNF possadiminuir a toxicidade e deste modo tornar um anticorpo tóxico menos tóxico.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação de TNFR bies-pecífica da invenção compreende no mínimo um sítio de ligação dirigido pa-ra um TNFR contendo um domínio de morte e no mínimo um sítio de ligaçãodirigido para um TNFR carecendo de um domínio de morte.

Em algumas modalidades exemplares, TNFRs carecendo de umdomínio de morte incluem TNFRs envolvidas em diferenciação tecidual. E-xemplos de receptores de TNFR envolvidos em diferenciação tecidual inclu-em LTpR1 RANK, EDAR1, XEDAR, Fn14, Troy/Trade, e NGFR. TNFRs en-volvidos em diferenciação tecidual podem influenciar diferenciação tecidualdepois de ligação de um Iigante cognato. Moléculas de ligação de TNFRque direcionam TNFRs envolvidos em diferenciação tecidual podem afetartumores de vários modos. Primeiro, têm o potencial de retardar diretamenteo crescimento tumoral alterando a progressão do ciclo celular. Segundo, di-ferenciação tecidual no contexto de transformação de células tumorais podelevar ao conflito do ciclo celular e falha de apoptose. Terceiro, similar inputconflitante pode tornar uma célula mais sensível a quimioterapia.

Em algumas modalidades preferenciais, TNFR envolvido emdiferenciação tecidual é β receptor de Iinfotoxina (LTpR). LTpR está envolvi-do no controle do estado de maturação de várias céulas estromais especiali-zadsa no sistema imune e desempenha um papel crítico durante o desen-volvimento dos elementos estromais do anlagen de linfonodo. Foi propostoque a ativação de um programa de desenvolvimento em células epiteliais oufibroblastóides no contexto de uma célula transformada é prejudicial parasua sobrevida e esta ação pode ser responsável por parte da atividade anti-tumoral de ativação de LTpR. Estes receptores também podem iniciar pro-gramas inflamatórios que envolvem liberação de quimocina ou promovemreações imunológicas antitumorais. A liberação referida pode afetar o estadoinflamatório do tumor e/ou invocar infiltração de elementos linfóides promo- vendo uma reação imunológica ao tumor. Portanto, moléculas de ligação deTNFR biespecíficas as quais ligam LTpR, sozinho ou em combinação comreceptores de TNF contendo domínios de morte (por exemplo, TRAIL-R2),são englobadas pela invenção.

Em algumas modalidades exemplares, os TNFRs carecendo de um domínio de morte incluem TNFRs envolvidos em regulação imune. Osreceptores referidos incluem TNFR2, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1 BB,0X40, GITR, TACI, BAFF-R, BCMA, e RELT. Receptores da família de TNFadicionais envolvidos em regulação imune incluem TRAIL-R3 e TRAIL-R4.

Outros receptores da família de TNF alvo com um papel na for- mação do tumor podem ser identificados usando bancos de dados de RNAexistentes de expressão de receptores em vários tipos de células os quaispossibilitam que uma pessoa defina receptores da família de TNF que estãopresentes ou são idealmente superexpressados sobre vários tumores. Alémdisso, bancos de dados de RNA existentes proporcionam uma vantagem adicional em que o par de receptores da família de TNF ao qual uma molé-cula de ligação de TNFR biespecífica da invenção liga pode ser otimizadoidentificando os pares de receptores que são mais unicamente expressadossobre um tipo tumoral ou subgrupo de tumores mas não são abundantessobre tecidos normais, especialmente fígado e vasculatura. Em uma maneira similar são identificados pares de receptores (ou mais) que podem liberar umsinal potente para o tumor e evitar tecidos normais.

Métodos para produzir moléculas multiespecíficas são de co-nhecimento geral na técnica. Por exemplo, tecnologia recombinante podeser usada para produzir moléculas multiespecíficas, por exemplo, diabodies, diabodies de cadeia única, scFvs tandem, e etc. Técnicas típicas para pro-duzir moléculas multiespecíficas são conhecidas na técnica (por exemplo,Kontermann et al. Methods in Molecular Biology Vol. 248: Antibody Enginee-ring: Methods e Protocols. Pp 227-242 Publicação do Pedido de patente dosEstados Unidos N2 US 2003/0207346 A1 e as referências citadas na mes-ma). Em uma modalidade, algumas moléculas multiespecíficas multiméricassão preparadas usando métodos tais como os descritos por exemplo, napublicação do Pedido de patente dos Estados Unidos N2 US 2003/0207346A1 ou na publicação de patente dos Estados Unidos N2 5.821.333, ou napublicação de patente dos Estados Unidos N2 US2004/0058400.

Em outra modalidade, uma molécula de ligação multiespecíficada invenção é uma proteína de fusão multiespecífica. Conforme usado aqui,neste Pedido de patente, a expressão "proteína de fusão multiespecífica"designa proteínas de fusão (conforme definido nas partes que se seguem)tendo no mínimo duas especificidades de ligação (isto é, combinar algunsdomínios de ligação de um Iigante ou receptor). Proteínas de fusão multies-pecíficas podem ser montadas, por exemplo, como heterodímeros, hetero-trímeros ou heterotetrâmeros, essencialmente conforme descrito na publica-ção de patente internacional N2 WO 89/02922 (publicada em 6 de abril de1989), na patente européia N2 EP 314, 317 (publicada em 3 de maio de1989), e na Patente dos Estados Unidos N2 5.116.964 emitida em 2 de maiode 1992. Proteínas de fusão multiespecíficas preferenciais são biespecíficas. Exemplos de proteínas de fusão biespecíficas incluem CD4-scFv / TNF re-ceptor-lgG e CD4-scFv/L-selectina-lgG. A última molécula mencionada com-bina a função de ligação de Iinfonodo do receptor residente de linfócitos (L-HR, L-selectina), e a função de ligação de HIV de CD4, e encontra aplicaçãopotencial na prevenção ou no tratamento de infecção por HIV, condiçõesrelacionadas, ou como um diagnóstico.

Em outra modalidade, a invenção pertence a moléculas de liga-ção multiespecífica estabilizadas, por exemplo, moléculas de ligação biespe-cífica, por exemplo, anticorpos, os quais incorporam no mínimo um sítio deligação que liga a um alvo conhecido e no mínimo um sítio de ligação o qualreconhece um alvo desconhecido (por exemplo, em uma modalidade, a mo-lécula biespecífica incorpora sítios de ligação selecionados entre uma biblio-teca de display de fago de anticorpos semi-sintéticos) e um scFv estabilizadoda invenção.

Em uma modalidade da invenção, uma pessoa com conheci-mento regular da técnica pode iniciar com um anticorpo de cadeia única deconhecida especificidade e construir uma biblioteca de Fab usando técnicas conhecidas na técnica ou, alternativamente, o técnico versado pode iniciarcom um fragmento Fab de conhecida especificidade e construir uma biblio-teca de cadeia única estabilizada usando técnicas conhecidas na técnica. Éde conhecimento na técnica que bibliotecas de fontes não imunizadas e pre-paradas por recombinação sintética de seqüências de V-gene (preferencial-mente recombinação de VH com, DH e JH1 e VL com seqüências JL) podemser usadas para isolar anticorpos para qualquer antígeno. Por exemplo, oPedido de patente internacional N2 W092/01047 ensina que fragmentos deanticorpos podem ser apresentados sobre a superfície de bacteriófago e queligarão antígeno. Fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fv, scFv eVH) podem ser selecionados diretamente usando esta característica. Outrosmétodos conhecidos na técnica incluem os ensinados, por exemplo, nas Pa-tentes dos Estados Unidos Nos. 5.698.426; 6.291.159; 5.658.727; 5.667.988;e 5.969.108.

Em outra modalidade, scFv o qual reconhece um alvo conhecido pode ser dimerizado com scFv isolado de uma biblioteca de display de anti-corpo de fago humano semi-sintético. (vide, por exemplo, Kruif e Logtenberg1996. J. Biol. Chem. 271:7630).

Em uma modalidade, a molécula multiespecífica em questão éexpressada em um sistema de expressão usado para expressar moléculas de anticorpos, por exemplo células de mamíferos, levedura tais como Pic-chia, E. coli, Bacculovirus, e etc. Em uma modalidade, a molécula biespecífi-ca em questão é expressada no sistema de vetor NEOSPLA (vide, por e-xemplo, a Patente dos Estados Unidos N- 6.159.730). Este vetor contém opromotor / reforçador de citomegalovírus, o promotor principal de β globina de camundongo, a origem de replicação SV40, a seqüência de poliadenila-ção de hormônio de crescimento bovino, éxon 1 e éxon 2 de fosfotransferasede neomicina, o gene de diidrofolato redutase e seqüência líder.Em uma modalidade, as moléculas multiespecíficas em questãocompreendem um peptídeo de ligação sintético.

Estas moléculas multiespecíficas têm um ou mais sítios de liga-ção para um alvo conhecido e expressam uma biblioteca em um ou mais sítios de ligação. As moléculas multiespecíficas referidas podem ser usadas,por exemplo, para identificar moléculas em íntima proximidade com ou asso-ciadas com o alvo conhecido. Por exemplo, o técnico versado pode usar asmoléculas multiespecíficas em questão em um ensaio para selecionar aque-las que induzem uma resposta particular, por exemplo, apoptose ou ativação celular, usando métodos de triagem de conhecimento geral na técnica. Amolécula biespecífica identificada como produzindo a resposta triaeda podeser então identificada e sua especificidade determinada. Usando os métodosreferidos é possível identificar moléculas em íntima associação com alvos deinteresse em particular, por exemplo, marcadores de células T ou outras mo- léculas de sinalização (tais como CRIPTO-I, moléculas de domínio de morte,ou moléculas envolvida em apoptose). A proximidade do alvo conhecido e amolécula recém identificada como um "vizinho mais próximo" pode ser con-firmada usando imunoprecipitação ou outras técnicas de conhecimento da-queles versados na técnica. Usando estes, .métodos é possíveL icie^tifjçar moléculas como alvos para modular uma reação celular em particular.

Especificidades de ligação compreendendo sítios de reconheci-mento de antígeno ou regiões variáveis inteiras de molécula de ligação mul-tiespecífica, em particular anticorpos multiespecíficos ou variantes de anti-corpos da invenção podem ser derivadas de um ou mais anticorpos paren- tais. Os anticorpos parentais podem incluir anticorpos que ocorrem natural-mente ou fragmentos de anticorpos, anticorpos ou fragmentos de anticorposadaptados de anticorpos que ocorrem naturalmente, anticorpos construídosde novo usando seqüências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos co-nhecidos por serem uma molécula alvo específica. Seqüências que podemser derivadas de anticorpos parentais incluem regiões variáveis de cadeiapesada e/ou leve e/ou CDRs, regiões de framework ou outras porções dasmesmas.Em uma modalidade exemplar da invenção, os anticorpos pa-rentais usados para construir uma molécula de ligação TNFR muItiespecíficasão um anticorpo anti-TRAIL-R2, por exemplo 14A2, e um anticorpo anti-LΤβΡ, por exemplo CBE11 ou BHA10. Anticorpos multivalentes, multiespecí-ficos podem conter uma cadeia pesada compreendendo duas ou mais regi-ões variáveis e/ou uma cadeia leve compreendendo uma ou mais regiõesvariáveis em que no mínimo duas das regiões variáveis reconhecem diferen-tes epítopes de LTpR.

Moléculas de ligação de TNFR multispecíficas, por exemplo,biespecíficas podem sr construídas em uma variedade de diferentes modosusando uma variedade de diferentes seqüências derivadas de anticorposanti-LTpR parentais, incluindo BHA10 murino ou humanizado (Browning etal., J. Immunol. 154: 33 (1995); Browning et al. J. Exp. Med. 183:867 (1996)),CBE11 murino ou humanizado (U.S. Patent 6,312,691 e WO 02/30986, res-pectivamente), e/ou anti-TRAIL-R2 parental murino ou quimérico 14A2. E-xemplos de anticorpos anti-LTpR os quais podem ser usados para as molé-culas de ligação da invenção de TNFR biespecíficas incluem: BKA11, C-DH10, BCG6, AGH1, BDA8, CBE11 e BHA10 ou BHA10. As seguintes li-nhagens de células de hibridoma produzindo anticorpos anti- ί-Τ-β-R mono-clonais podem ser usadas para produzir anticorpos anti-LTpR dos quais de-rivar seqüências de construtos de anticorpos, os quais foram previamentedepositados com a American Type Culture Collection (ATCC) de acordo comas provisões do Tratado de Budapest e foram atribuídas os números de a-cesso ATCC indicados:

Linhaqem Celular Nome mAb N0 de Acesso a) AG.H1.5.1 AGH1 HB 11796 b) BD.A8.AB9 BDA8 HB 11798 c) BC.G6.AF5 BCG6 B11794 d) BH.A10 BHA10 B11795 e) BK.A11.AC10 BKA11 B11799 f) CB.E11.1 CBE11 B11793 g) CD.H10.1 CDH10 B11797Outros exemplos de anticorpos receptores anti-TNF os quaispodem ser usados nas moléculas de ligação de TNFR multiespecíficas dainvenção incluem anticorpos dirigidos para receptores de TNF contendo umdomínio de morte. Uma série de anticorpos foram gerados para domínio de morte contendo receptores de TNF e são de conhecimento geral na técnica.Os anticorpos referidos incluem anticorpos monoclonais anti-TNF-R1 (siste-mas R&D anti-TNF-R1; Tularik mAb ns 985, Patentes dos Estados UnidosNos. 6.110.690; 6.437.113), anti-Fas receptor mAb CH-11 (Patente dos Es-tados Unidos n2 6.312.691; publicação de patente internacional ne WO95/10540), anticorpos anti-DR3 (Patente dos Estados Unidos n- 5.985.547;Johnson, et al. (1984) ImmunoBioIogy of HLA, ed. Dupont, B.O., Springer,New York; Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.462.176; 6.469.166), e anti-corpos anti-TRAIL-R (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.763.223;6.072.047; 6.284.236; 6.521.228; 6.569.642; 6.642.358; e Patente dos Esta- dos Unidos n2 6.417.328).

Uma série de anticorpos também foram cultivados para recepto-res de TNF envolvidos em diferenciação tecidual e são conhecidos na técni-ca. Exemplos de anticorpos anti-receptores de TNF específicos para recep-tores de TNF envolvidos em diferenciação tecidual incluem: anticorpos mo- noclonais anti-RANK (Immunex - Patentes dos Estados Unidos Nos.6.562.948; 6.537.763; 6.528.482; 6.479.635; 6.271.349; 6.017.729; Komed -WO 03/080671), anticorpos anti-EDAR policlonais (anti-humanos) e mono-clonais (anticamundongo) (R&D Systems - MAB745, BAF157; Elomaa et al.(2001) Human Molecular Genetics. 10:953), anticorpos anti-XEDAR mono- clonais e policlonais (R&D Systems - MAB1093 e AF1093), anticorpos anti-Fn14 monoclonais (Nakayama et al. (2003) J. Immunology 170:341; clonesITEM-1, ITEM-2, e ITEM-4 disponíveis na eBioscience), anticorpo anti-TROY(T3323 da Sigma-AIdrich), e anticorpos anti-NGFR (anti-roedor) (ChemiconUSA).

Uma série de anticorpos também foram cultivados para recepto-res de TNF envolvidos em regulação imune e são conhecidos na técnica.Exemplos de anticorpos anti-receptores de TNF específicos para receptoresde TNF envolvidos em regulação imune incluem: anticorpos anti-HVEM(HGSI - publicação de patente internacional N- WO 03/086301), anticorposanti-CD40 (Biogen - publicação de patente internacional N- WO 97/20063;Chiron - Patentes dos Estados Unidos N-s 5.677.165; 5.874.082; 6.004.552;

6.056.959; 6.315.998; Publicação do Pedido de patente dos Estados UnidosN- 2002/0106371; Publicação do Pedido de patente dos Estados Unidos Nos.2003/0059427; US20030118588A1; 2003/0211100A1; US2002020142358A1;Patentes dos Estados Unidos Nos. US 6312693; US 6051228; Fanslow et al.- Patente dos Estados Unidos N- US 5801227), anti-4-1BB (publicação de patente internacional N2 PCT WO 03/084999; Patente Européia N- EP0948353; Patente dos Estados Unidos N- 6210669; Genecraft - publicaçãode patente internacional N- WO 03/083069), e anticorpos anti-BAFF-R (poli-clonal de coelho - catálogo ProSci ns 3097), entre muitos outros anticorposcultivados para receptores de regulação imune.

Uma variedade de outros construtos de anticorpos multivalentespodem ser desenvolvidos por uma pessoa versada na técnica usando técni-cas de DNA recombinante de rotina, por exemplo conforme descrito no Pe-dido de patente Internacional N2 PCT/US86/02269; no Pedido de patenteEuropéia N2 184,187; no Pedido de patente Européia N2 171,496; no Pedido de patente Européia N2 173,494; na Publicação de Patente InternacionalPCT N2 WO 86/01533; na Patente dos Estados Unidos N2 4.816.567; no Pe-dido de patente Européia N2 125,023; Better et al. (1988) Science240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. NatL Acad. Sei. USA 84:3439-3443;Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. NatL Acad. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Câncer Res.47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J.Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207;Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; na Patente dos Estados Unidos N25,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988)Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060; e Wintere Milstein, Nature, 349, pp. 293-99 (1991)). Preferencialmente anticorposnão -humanos são "humanizados" ligando o domínio de ligação de antígenonão-humano com um domínio constante humano (por exemplo, Cabilly et al.,Patente dos Estados Unidos N2 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984)).

Outros métodos os quais podem ser usados para preparar cons-trutos de anticorpos multivalentes são descritos nas seguintes publicações:Ghetie, Maria-Ana et al. (2001) Blood 97:1392-1398; Wolff, Edith A. et al.(1993) Câncer Research 53:2560-2565; Ghetie, Maria-Ana et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sei. 94:7509-7514; Kim, J.C. et al. (2002) Int. J. Câncer97(4): 542-547; Todorovska, Aneta et al. (2001) Journal of ImmunologicalMethods 248:47-66; Coloma M.J. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:159-163; Zuo, Zhuang et al. (2000) Protein Engineering (SuppL) 13(5): 361-367;Santos A.D., et al. (1999) Clinicai Câncer Research 5:3118s-3123s; Presta,Leonard G. (2002) Current Pharmaceutical Biotechnology 3:237-256; vanSpriel, Annemiek et al., (2000) Review Immunology Today 21 (8) 391-397.XI. Expressão de Moléculas de Ligação

Depois de manipulação do material genético isolado proporcio-nar polipeptídeos da invenção conforme determinado acima, os genes sãotipicamente inseridos em um vetor de expressão para introdução em célulashospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada depolipeptídeo que, por sua vez, proporciona as moléculas de ligação reivindi-cadas.

O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado aqui, neste Pe-dido de patente, para os fins da relatório descritivo e reivindicações, paraindicar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículopara introduzir em e expressar um gene desejado em uma célula. Conformede conhecimento daqueles versados na técnica, similares vetores podem serfacimente selecionados entre o grupo consistindo em plasmídeos, fagos,vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a presente invençãocompreenderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados pa-ra facilitar clonagem do gene desejado e a capacidade para penetrar e/oureplicar em células eucarióticas ou procarióticas.

Para os fins desta invenção, podem ser empregados numerosossistemas de vetor de expressão. Por exemplo, uma classe de vetor utilizaelementos de DNA os quais são derivados de vírus animais tais como papi-Ioma vírus bovino, polioma vírus, adenovírus, vírus da varíola bovina, bacu-lovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação de ribossoma inter-nos. Adicionalmente, células as quais têm integrado o DNA em seus cro-mossomos podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores osquais possibilitam seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcadorpode proporcionar prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência abiocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais co-mo cobre. O gene marcador selecionável pode ser ou diretamente encadea-do às seqüências de DNA para ser expressado, ou introduzido na mesmacélula por cotransformação. Elementos adicionais também podem ser ne-cessários para síntese otimizada de mRNA. Estes elementos podem incluir seqüências de sinal, sinais de junção, bem como promotores transcricionais,reforçadores, e sinais de terminação. Em modalidades particularmente prefe-renciais os genes de região variável clonados são inseridos em um vetor deexpressão junto com os genes de região constante de cadeia pesada e leve(preferencialmente humanos) sintéticos conforme discutido acima. Preferen-cialmente, isto é efetuado usando um vetor de expressão proprietário da I-DEC, Inc., referido como NEOSPLA (Patente dos Estados Unidos N-6.159.730). Este vetor contém o promotor / reforçador de citomegalovírus, opromotor principal de β globina de camundongo, a origem de replicaçãoSV40, a seqüência de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino,neomicina fosfotransferase éxon 1 e éxon 2, o gene diidrofolato redutase eseqüência líder. Conforme visto nos exemplos abaixo, foi visto que este ve-tor resulta em nivel de expressão de anticorpos muito elevado na incorpora-ção de genes de regiões variável e constante, transfecção em células CHO,seguida por seleção em meio contendo G418 e amplificação por metotrexa- to. Sistemas vetoriais também são ensinadas nas Patentes dos Estados U-nidos Nos. 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais é incorporada pormeio de referência em sua totalidade aqui, neste Pedido de patente. Estesistema proporciona altos níveis de expressão, por exemplo, > 30pg/célula/dia. Outros sistemas vetoriais típicos são revelados, por exemplo,na Patente dos Estados Unidos Ns 6.413.777.

Em outras modalidades preferenciais os polipeptídeos da inven- ção da presente invenção podem ser expressados usando construtos policis-trônicos tais como aqueles revelados no Pedido de patente provisória dosEstados Unidos copendente N- 60/331.481 depositado em 16 de novembrode 2001 e incorporado aqui, a este Pedido de patente, em sua totalidade.Nestes novos sistemas de expressão, múltiplos produtos genéticos de inte-resse tais como cadeias pesadas e leves de anticorpos podem ser produzi-dos a partir de um único construto policistrônico. Estes sistemas usam vanta-josamente um sítio de ingresso de ribossoma interno (IRES) proporcionandoníveis relativamente elevados de polipeptídeos da invenção em células hos-pedeiras eucarióticas. Seqüências IRES compatíveis são reveladas na Pa- tente dos Estados Unidos N2 6.193.980 a qual também é incorporada aqui, aeste Pedido de patente. Aqueles versados na técnica reconhecerão que ossistemas de expressão referidos podem ser usados para produzir de modoeficaz toda a γ de polipeptídeos revelados no presente requerimento.

Mais geralmente, uma vez que o vetor ou seqüência de DNA codificando uma subunidade monomérica da molécula de ligação (por e-xemplo, um anticorpo modificado) tenha sido preparado, o vetor de expres-são pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Isto é, ascélulas hospedeiras podem ser transformadas. A ilntrodução do plasmídeona célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadasa, transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fusão de protoplasto,precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envelopado, micro-injeção, e infecção com vírus intacto. Vide, Ridgway, A. A. G. "MammalianExpression Vectorst' Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez e De- nhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). O mais preferencialmente,a introdução de plasmídeo no hospedeiro é através de eletroporação. Ascélulas transformadas são cultivadas sob condições apropriadas para a pro-dução das cadeias leves e cadeias pesadas, e avaliadas para síntese deproteína de cadeia pesada e/ou leve. Técnicas de ensaio típicas incluemensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ouanálise por classificador celular ativada por flourescência (FACS), imunohis- toquímica e similares.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo "trans-formação" será usado em um sentido amplo para se referir à introdução deDNA em uma célula hospedeira receptora que muda o genótipo e conse-qüentemente resulta em uma mudança na célula receptora.

Ao longo destas mesmas linhagens, "células hospedeiras" serefere a células que tenham sido transformadas com vetores construídosusando recombinant DNA técnicas e codificando no mínimo um gene heteró-logo. Em descrições de processos para isolamento de polipeptídeos a partirde hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura celular" são u- sados de modo intercambiável para denotar a fonte de anticorpo a menosque seja claramente especificado de modo diverso. Em outras palavras, arecuperação de polipeptídeo a partir das "células" pode significar ou a partirde células inteiras centrifugadas, ou a partir da cultura celular contendo tantoo meio quanto as células suspendidas.

Em uma modalidade, a linhagem de células hospedeiras usadaspara expressão de proteína (por exemplo, de moléculas multivalentes deligação) é de origem de mamífero; os versados na técnica têm a capacidadede determinar preferencialmente-linhagens de células hospedeiras particula-res as quais são melhor adequadas para o produto genético desejado a ser expressado nas mesmas. Linhagens de células hospedeiras incluem, masnão estão limitados a, DG44 e DUXB11 (linhagens de ovário de hamsterchinês CHO, menos DHFR), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linha-gem de rim de maçado), COS (um derivado de CVI com SV40 T antígeno),R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camun-dongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/0 (mieloma de camundon-go), P3.times.63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (célulasendoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Em umamodalidade podem ser usadas células NSO. Células CHO são particularmen-te preferenciais. Linhagens de células hospedeiras estão tipicamente dispo-níveis em serviços comerciais, a American Tissue Culture Collection ou apartir da literatura publicada.

A produção in vitro possibilita aumento em escala para dargrandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para cultura decélulas mamíferas sob condições de cultura tecidual são conhecidas na téc-nica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um rea-tor de erguimento de ar ou em um reator de agitador contínuo, ou cultura decélulas imobilizadas ou atraídas, por exemplo, em fibras ocas, microcápsu-las, sobre microcontas de agarose ou cápsulas de cerâmica. Caso necessá-rio e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelosmétodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtração por gel, cromato-grafia de permuta iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatogra-fia de (imuno-)afinidade, por exemplo, depois de biosíntese preferencial deum polipeptídeo da região de articulação sintético ou antes de ou subse-qüente à etapa de cromatografia HIC descrita aqui, neste Pedido de patente.

Genes codificando o polipeptídeo da invenção também podemser expressados em células não-mamíferas tais como células de bactériasou leveduras ou plantas. A este respeito será reconhecido que vários micro-organismos não-mamíferos unicelulares tais como bactérias também podemser transformados; isto é aqueles capazes de serem cultivados em culturasou fermentação. Bactérias, as quais são suscetíveis a transformação, inclu-em membros das enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; S-treptococcus, e Haemophilus influenzae. Será adicionalmente reconhecidoque, quando expressados em bactérias, os polipeptídeos tipicamente se tor-nam parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos devem ser isolados, puri-ficados e em seguida montados em moléculas funcionais. Onde formas te-travalentes de anticorpos são desejadas, as subunidads serão então auto-montadas em anticorpos tetravalentes (publicação do Pedido de patente in-ternacional N2WO 02/096948A2).Além de procariotas, micróbios eucarióticos também podem serusados. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de baker comum, é o maiscomumente usado entre microorganismos eucarióticos embora uma série deoutras cepas estejam disponíveis comumente. Para expressão em Saccha- romyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature,282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene,10:157 (1980)) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1o qual proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de le-vedura carecendo da capacidade para cultivar em triptofano, por exemplo ATCC N2 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). A presença dalesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de leve-dura então proporciona um ambiente eficaz poara detectar transformaçãopor crescimento na ausência de triptofano.XII. Marcação ou Conjugação de Moléculas de Ligação

As moléculas de ligação da presente invenção podem ser usa-das em forma não-conjugada ou podem ser conjugadas a no mínimo um deuma variedade de moléculas efetoras, isto é, funcionais, por exemplo, parafacilitar a detecção alvo ou para estudo por imagens ou terapia do paciente.Os polipeptídeos da invenção podem ser marcados ou conjugados quer an- tes ou depois da purificação, quando é realizada purificação. Em particular,os polipeptídeos da presente invenção podem ser conjugados a citotoxinas(tais como radioisótopos, fármacos citotóxicas, ou toxinas) agentes terapêu-ticos, agentes citostáticos, toxinas biológicas, pró-farmacos, peptídeos, pro-teínas, enzimas, vírus, lipídeos, modificadores da resposta biológica, agen-tes farmacêuticos, Iigantes imunologicamente ativos (por exemplo, Iinfocinasou outros anticorpos em que a molécula resultante liga tanto à célula neo-plásica quanto a uma célula efetora tal como uma célula T), PEG, ou molé-culas detectáveis úteis em estudo por imagens. Em outra modalidade, umpolipeptídeo da invenção pode ser conjugado a uma molécula que reduz a vascularização de tumores. Em outras modalidades, as composições revela-das podem compreender polipeptídeos da invenção acoplados a fármacosou pró-farmacos. Ainda outras modalidades da presente invenção compre-endem o uso de polipeptídeos da invenção conjugados a biotoxinas especí-ficas ou seus fragmentos citotóxicos tais como ricina, gelonina, exotoxina depseudomonas ou toxina diftérica. A seleção de qual polipeptídeo conjugadoou não conjugado usar dependerá do tipo e do estágio do câncer, do uso detratamento auxiliar (por exemplo, quimioterapia ou radiação externa) e dacondição do paciente. Será reconhecido que uma pessoa versada na técnicapode prontamente fazer uma seleção similar em vista dos ensinamentos a-qui, neste Pedido de patente.

Será reconhecido que, em estudos prévios, anticorpos antitumo-rais marcados com isótopos têm sido usados com sucesso para destruir cé-lulas em tumores sólidos bem como Iinfomas / Ieucemias em modelos ani-mais, e em alguns casos em seres humanos. Radioisótopos típicos incluem:

90Y) 125|f 131,f 123^ 111,n 105Rh> 153^ 67^ 67^ 166^ 177^ 186Re Q 188Re

Os radionuclídeoos agem produzindo radiação ionizante a qual causa múlti-pias rupturas de filamentos no DNA nuclear, levando à morte celular. Os isó-topos usados para produzir conjugados terapêuticos tipicamente produzema- ou β-partículas de alta energia as quais têm uma extensão de trajetóriacurta. Os radionuclídeos referidos destróem células à quais estão em íntimaproximidade, por exemplo, células neoplásicas às quais o conjugado se ane-xou ou nas quais penetrou. Têm pouco ou nenhum efeito sobre células não-localizadas. Radionuclídeos são essencialmente não -imunogênicos.

Com respeito ao uso de conjugados radiomarcados em combi-nação com a presente invenção, polipeptídeos da invenção podem ser dire-tamente marcados (tais como através de iodação) ou podem ser marcados indiretamente através do uso de um agente quelante. Conforme usado aqui,neste Pedido de patente, as expressões "marcação indireta" e "abordagemde marcação indireta" ambas significam que um agente quelante é fixado demodo covalente a uma molécula de ligação e no mínimo um radionuclídeo éassociado com o agente quelante. Os agentes quelantes referidos são tipi-camente referidos como agentes quelantes bifuncionais uma vez que ligamtanto o polipeptídeo quanto o radioisótopo. Agentes quelantes particularmen-te preferenciais compreendem derivados de ácido 1 -isotiocicmatobenzil-3-metildioteleno triaminapentaacético ("MX-DTPA") e ácido ciclohexil dietileno-triamina pentaacético ("CHX-DTPA"). Outros agentes quelantes compreen-dem derivados de P-DOTA e EDTA. Radionuclídeos particularmente prefe-renciais para marcação indireta incluem 111In e 90Y.

Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, as expressões"marcação direta" e "abordagem de marcação direta" ambas significam queum radionuclídeo é fixado de modo covalente diretamente a um polipeptídeo(tipicamente através de um resíduo aminoácido). Mais especificamente, es-tas tecnologias de ligação incluem marcação aleatória e marcação sítio-dirigida. No último caso, a marcação é dirigida em sítios específicos sobre opolipeptídeo, tais como os resíduos de açúcar N-encadeados presentes so-mente sobre a porção Fc dos conjugados. Além disso, várias técnicas e pro-tocolos de marcação direta são compatíveis com a presente invenção. Porexemplo, polipeptídeos marcados com Tecnécio-99m podem ser preparados por processos de permuta de ligante, reduzindo pertecnato (TcO/T) com so-lução de íons estanoso, quelando o tecnécio reduzido sohre uma coluna Se-phadex e aplicando os polipeptídeos a esta coluna, ou por técnicas de mar-cação em lote, por exemplo, incubando pertecnato, um agente redutor talcomo SnCfe, uma solução tampão tal como uma solução de ftalato de sódio-potássio, e os anticorpos. Em qualquer evento, radionuclídeos preferenciaispara marcar anticorpos diretamente são de conhecimento geral na técnica eum radionuclídeo particularmente preferencial para marcação direta é 131Ianexado de modo covalente através de resíduos tirosina. Polipeptídeos deacordo com a invenção podem ser derivados, por exemplo, com iodeto de potássio ou sódio radioativo e um agente oxidante químico, tais como hipo-clorito de sódio, cloramina T ou similares, ou um agente oxidante enzimático,tal como lactoperoxidase, glicose oxidase e glicose. No entanto, para os finsda presente invenção, a abordagem de marcação indireta é particularmentepreferencial.

Patentes relativas a queladores e conjugados de queladores sãoconhecidas na técnica. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N24.831.175 de Gansow é dirigida para quelatos de ácido dietilenotriaminapen-taacético polissubstituídos e conjugados protéicos contendo os mesmos, emétodos para sua preparação. As Patentes dos Estados Unidos Nos.5.099.069, 5.246.692, 5.286.850, 5.434.287 e 5.124.471 de Gansow tambémse referem a quelatos de DTPA polissubstituídos. Estas patentes são incorpo-radas aqui, a este Pedido de patente, em sua totalidade. Outros exemplosde queladores de metais compatíveis são ácido etilenodiaminatetraacético(EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DPTA), 1,4,8,11-tetraazatetrade-cano, ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-1,4,8,11-tetraacético, ácido 1-oxa-4,7,12,15-tetraazaheptadecano-4,7,12,15-tetraacético, ou similares. Ciclohe-xil-DTPA ou CHX-DTPA é particularmente preferencial e é exemplificadoextensivamente abaixo. Ainda outros queladores compatíveis, incluindo a-queles ainda a serem descobertos, podem ser facilmente discernidos por umtécnico versado e estão claramente dentro do âmbito da presente invenção.

Queladores compatíveis, incluindo o quelador bifuncional espe-cífico usado para facilitar quelação no Pedido de patente co-pendente SerialNos. 08/475,813, 08/475,815 e 08/478,967, são preferencialmente selecio-nados proporcionando alta afinidade para metais trivalentes, apresentamaumentadas proporções de tumor-para-não-tumor e reduzida captação ós-sea bem como maior retenção in vivo de radionuclídeo em sítios alvo, isto é,sítios tumorais de Iinfoma de células B. No entanto, outros queladores bifun-cionais que podem possuir ou não todas estas características são conheci-dos na técnica e também podem ser benéficos em terapia tumoral.

Também será reconhecido que, de acordo com os ensinamen-tos aqui, neste Pedido de patente, polipeptídeos podem ser conjugados adiferentes radioetiquetas para fins de diagnóstico e terapêutico. Até estemomento os Pedidos de patente co-pendentes supracitados, aqui, neste Pe-dido de patente, incorporados por meio de referência em sua totalidade, re-velam conjugados terapêuticos radiomarcados para "estudo por imagens"para diagnóstico de tumores antes da administração de anticorpo terapêuti-co. Conjugado "ln2B8" compreende um anticorpo monoclonal murino, 2B8,específico para antígeno CD20 humano, que é anexado a 111^In através deum quelador bifuncional, isto é, MX-DTPA (ácido dietilenotriaminapentaacé-tico), o qual compreende uma mistura a 1:1 de 1 -isotiocianatobenzil-3-metil-DTPA e 1-metil-3-isotiocianatobenzil-DTPA. 111In é particularmente preferen-cial como um radionuclídeo diagnóstico porque entre cerca de 1 a cerca de10 mCi pode ser administrado com segurança sem toxicidade detectável; eos dados de estudo por imagens são geralmente preditivos de distribuiçãode anticorpos marcados com 90Y subseqüentes. A maioria dos estudos porimagens utilizam 5 mCi de anticorpo marcado com 111Inl porque esta dose étanto segura quanto tem aumentada eficiência de estudo por imagens com-parada com menores doses, com estudo otimizado por imagens ocorrendoem três a seis dias depois da administração de anticorpos. Vide, por exem-plo, Murray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985) e Carraguillo et ai, J. Nuc. Med.26:67(1985).

Conforme indicado acima, uma variedade de radionuclídeos sãoaplicáveis à presente invenção e aqueles versados na técnica podem pron-tamente determinar qual radionuclídeo é o mais apropriado sob várias cir-cunstâncias. Por exemplo, 131I é um radionuclídeo de conhecimento geralusado para imunoterapia orientada. No entanto, a utilidade clínica de 131Ipode ser limitada por vários fatores incluindo: meia-vida física de oito dias;dealogenação de anticorpo iodado tanto no sangue quanto em sítios tumo- rais; e características de emissão (por exemplo, grande componente γ) asquais podem ser subótimas para deposição de dose localizada no tumor.Com o advento de agentes quelantes superiores, a oportunidade de fixargrupamentos quelantes metálicos a proteínas aumentou as oportunidadespara utilizar outros radionuclídeos tais como 111In e 90Y. 90Y proporciona vá- rios benefícios para utilização em aplicações radioimunoterapêuticas: ameia-vida de 64 horas de 90Y é suficientemente longa para possibilitar a a-cumulação de anticorpos pelo tumor e, diferentemente de, por exemplo, 131I190Y é um puro β emissor de alta energia sem irradiação γ associada em suadecomposição, com um alcance no tecido de 100 a 1.000 diâmetros celula-res. Além disso, a quantidade mínima de radiação penetrante possibilita ad-ministração ambulatorial de anticorpos marcados com 90Y. Adicionalmente, ainternalização de anticorpo marcado não é necessária para destruição celu-Iar1 e a emissão local de radiação ionizante pode ser letal para células tumo-rais adjacentes carecendo da molécula alvo.

Aqueles versados na técnica reconhecerão que estes conjuga-dos não-radioativos também podem ser montados usando uma variedade detécnicas dependendo do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo,conjugados com biotina são preparados, por exemplo, reagindo os polipeptí-deos com um éster ativado de biotina tal como o éster de N-hidroxissuccini-mida de biotina. Similarmente, conjugados com um marcador fluorescentepodem ser preparados na presença de um agente de ligação, por exemplo, os listados acima, ou por reação com um isotiocianato, preferencialmentefluoresceína-isotiocianato. Conjugados dos polipeptídeos da invenção comsubstâncias citostáticas / citotóxicas e quelatos de metal são preparados emuma maneira análoga.

Muitas moléculas efetoras carecem de grupamentos funcionais adequados aos quais anticorpos podem ser encadeados. Em uma modali-dade, uma molécula efetora, por exemplo, um fármaco ou pró-farmaco é fi-xado ao anticorpo através de uma molécula de ligação. Em uma modalidade,a molécula de ligação contém uma ligação química que possibilita a ativaçãode citotoxicidade em um sítio particular. Ligações químcas adequadas são de conhecimento geral na técnica e incluem ligações dissulfeto, ligações lá-beis em ácido, ligações fotolábeis, ligações lábeis em peptidase, ligaçõestioéter formadas entre grupamentos sulfidrila e maleimida, e ligações lábeisem esterase. O mais preferencialmente, a molécula de ligação compreendeuma ligação dissulfeto ou uma ligação tioéter. De acordo com a invenção, a molécula de ligação preferencialmente compreende um grupamento químicoreativo. Grupamentos químicos reativos particularmente preferenciais sãoésteres de N-succinimidila e ésteres de N-sulfossuccinimidila. Em uma mo-dalidade preferencial, o grupamento químico reativo pode ser ligado de mo-do covalente ao efetor através de ligação dissulfeto entre grupamentos tiol. Em uma modalidade uma molécula efetora é modificada para compreenderum grupamento tiol. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que umgrupamento tiol contém um átomo de enxofre ligado a um átomo de hidrogê-nio e também é tipicamente referido na técnica como um grupamento sulfi-drila, o qual pode ser denotado como "--SH" ou "RSH."Em uma modalidade, uma molécula de ligação pode ser usada para unir amolécula efetora com a molécula de ligação. A molécula de ligação da in-venção pode ser clivável ou não-clivável. Em uma modalidade, a moléculade ligação clivável é uma molécula de ligação redox-clivável, de tal modoque a molécula de ligação é clivável em ambientes com um menor potencialredox, tal como o citoplasma e outras regiões com maiores concentraçõesde moléculas com grupamentos sulfidrila livres. Exemplos de moléculas de ligação que podem ser clivadas devido a uma alteração no potencial redoxincluem aquelas contendo dissulfetos. O estímulo clivante pode ser propor-cionado na captação intracelular da proteína de ligação da invenção onde omenor potencial redox do citoplasma facilita clivagem da molécula de liga-ção. Em outra modalidade, uma redução no pH dispara a liberação da carga de maitansinóide para dentro da célula alvo. A redução no pH está implicadaem muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como tráfego de endos-soma, crescimento tumoral, inflamação, e isquemia do miocárdio. O pH caide um pH fisiológico 7.4 para 5 a 6 em endossomas ou 4 a 5 em lisossomas.Exemplos de moléculas de ligação sensíveis a ácido as quais podem ser usadas para 4er por alvo lisossomas ou endossomas de células de câncer,incluem moléculas com ligações cliváveis por ácido tais como as encontra-das em acetais, cetais, ortoésteres, hidrazonas, tritilas, cis-aconitilas, ou tio-carbamoílas (vide por exemplo, Willner etal., (1993), Bioconj. Chem., 4: 521-7; Patente dos Estados Unidos Nos. 4.569.789, 4.631.190, 5.306.809, e 5.665.358). Outras moléculas de ligação sensíveis a ácido típicas compre-endem seqüências dipeptídicas Phe-Lys e Val-Lys (King et al., (2002), J.Med. Chem., 45: 4336-43). O estímulo clivante pode ser proporcionado notráfego de captação intracelular para compartimentos endossômicos de bai-xo pH (por exemplo, lisossomas). Outras moléculas de ligação cliváveis por ácido típicas são as moléculas que contêm duas ou mais ligações cliváveispor ácido para fixação de dois ou mais maitansinóides (King et al., (1999),Bioconj. Chem., 10: 279-88; WO 98/19705).Moléculas de ligação clivagens podem ser sensíveis a agentesde clivagem supridos biologicamente que estão associados com uma célulaalvo particular, por exemplo, enzimas lisossômicas ou associadas com tu-mor. Exemplos de moléculas de ligação que podem ser clivadas enzimati-camente incluem, mas não estão limitadas a, peptídeos e ésteres. Moléculasde ligação clivagens por enzima típicas incluem aquelas que são sensíveis aproteases associadas com tumor tais como Catepsina B ou plasmina (Du-bowchik et ai, (1999), Pharm. Ther., 83: 67-123; Dubowchik et ai, (1998),Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 3341-52; de Groot et ai, (2000), J. Med. Chem.,43: 3093-102; de Groot et ai, (1999)m 42: 5277-83). Sítios cliváveis por ca-tepsina B incluem as seqüências dipeptídicas valina-citrulina e fenilalanina-Iisina (Doronina et ai, (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84); Dubowchik et ai,(2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69). Outros sítios cliváveis por enzimatípicos incluem aqueles formados por seqüências de oligopeptídeos de 4 a16 aminoácidos (por exemplo, Suc-p-Ala-Leu-Ala-Leu) as quais são reco-nhecidas por proteases trouse tais como Thimet Oliogopeptidase (TOP),uma enzima que é preferencialmente liberada por neutrófilos, macrófagos, eoutros granulócitos.

Em uma modalidade adicional, a molécula de ligação é formadareagindo uma molécula de ligação da invenção com uma molécula de liga-ção da fórmula:

<formula>formula see original document page 208</formula>

em que:

X é uma molécula de fixação;Y é uma molécula espaçadora; eZ é uma porção de fixação efetora.

O termo "molécula de fixação de molécula de ligação" inclui mo-léculas as quais possibilitam a fixação covalente do peptídeo de ligação auma molécula de ligação da invenção.

A molécula de fixação pode compreender, por exemplo, umacadeia covalente de 1 a 60 átomos de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre,opcionalmente substituídos com átomos de hidrogênio e outros substituintesos quais possibilitam que a molécula de ligação realize sua função pretendi-da. A molécula de fixação pode compreender grupamentos funcionais peptí-dico, éster, alquila, alquenila, alquinila, arila, éter, tioéter, e etc. Preferenci-almente, a molécula de fixação é selecionada de tal modo que é capaz de reagir com um grupamento funcional reativo sobre um polipeptídeo compre-endendo no mínimo uma sítio de ligação antigênica, para formar uma molé-cula de ligação da invenção. Exemplos de moléculas de fixação incluem, porexemplo, moléculas de fixação de amino, carboxilato, e tiol.

Moléculas de fixação de amino incluem moléculas as quais rea-gem com grupamentos amino sobre um polipeptídeo, de tal modo que umamolécula de ligação da invenção é formada. Moléculas de fixação de aminosão conhecidas na técnica. Exemplos de moléculas de fixação de amino in-cluem carbamidas ativadas (por exemplo, as quais podem reagir com umgrupamento amino sobre uma molécula de ligação para formar uma molécu- Ia de ligação a qual compreende grupamento uréia), aldeídos (por exemplo,os quais podem reagir com grupamentos amino sobre uma molécula de liga-ção), e isocianatos ativados (os quais podem reagir com um grupamentoamino sobre uma molécula de ligação para formar uma molécula de ligaçãoa qual compreende um grupamento uréia). Exemplos de moléculas de fixa- ção de amino incluem, mas não estão limitados a, molécula de N-succini-midila, N-sulfossuccinimidila, N-ftalimidila, N-sulfoftalimidila, 2-nitrofenila, 4-ni-trofenila, 2,4-dinitrofenila, 3-sulfonila-4-nitrofenila, ou 3-carbóxi-4-nitrofenila.

Moléculas de fixação de carboxilato incluem moléculas as quaisreagem com grupamentos carboxilato sobre um polipeptídeo, de tal modo que se forma uma molécula de ligação da invenção. Moléculas de fixação decarboxilato são conhecidas na técnica. Exemplos de moléculas de fixação decarboxilato incluem, mas não estão limitadas a intermediários éster ativadose intermediários carbonila ativados, os quais podem reagir com um grupa-mento COOH sobre uma molécula de ligação para formar uma molécula deligação a qual compreende um grupamento éster, tioéster, ou amida.

Moléculas de fixação de tiol incluem moléculas as quais reagemcom grupamentos tiol presentes sobre um polipeptídeo, de tal modo que seforma uma molécula de ligação da invenção. Moléculas de fixação de tiolsão conhecidas na técnica. Exemplos de moléculas de fixação de tiol inclu-em grupamentos acila ativados (os quais podem reagir com uma sulfidrilasobre uma molécula de ligação para formar uma molécula de ligação a qualcompreende um tioéster), grupamentos alquila ativados (os quais podemreagir com uma sulfidrila sobre uma molécula de ligação para formar umamolécula de ligação a qual compreende uma molécula tioéster), aceitadoresde Michael tais como grupamentos maleimida ou acrílicos (os quais podemreagir com uma sulfidrila sobre uma molécula de ligação para formar umproduto de adição do tipo de Michael), grupamentos os quais reagem comgrupamentos sulfidrila através de reações redox, grupamentos dissulfetoativados (os quais podem reagir com um grupamento sulfidrila sobre umamolécula de ligação para formar, por exemplo, uma molécula de ligação aqual compreende uma molécula de dissulfeto). Outras moléculas de fixaçãode tiol incluem compostos de acrilamidas, α-iodoacetamidas, e ciclopropan-1,1-dicarbonila. Além disso, a molécula de fixação de tiol pode compreenderuma molécula a qual modifica um tiol sobre a molécula de ligação para for-mar outra espécie reativa à qual a molécula de ligação pode ser fixada paraformar uma molécula de ligação da invenção.

A molécula espaçador, Y1 é uma ligação covalente ou uma ca-deia covalente de átomos a qual pode conter um ou mais resíduos aminoá-cidos. Também pode compreender 0 a 60 átomos de carbono, oxigênio, en-xofre ou nitrogênio opcionalmente substituído com hidrogênio ou outrossubstituintes os quais possibilitam que a molécula de ligação resultante rea-Iize sua função pretendida. Em uma modalidade, Y compreende uma molé-cula de alquila, alquenila, alquinila, éster, éter, carbonila, ou amida.

Em outra modalidade, um grupamento tiol sobre a molécula deligação é convertido em um grupamento reativo, tal como um grupamentocarbonila reativo, tal como uma cetona ou aldeído. A molécula de fixação éem seguida reagida com a cetona ou aldeído para formar o composto dese-jado da invenção. Exemplos de moléculas de fixação de carbonila reativoincluem, mas não estão limitadas a, hidrazinas, hidrazidas, hidroxilaminas O-substituídas, cetonas α-β-insaturadas, e H2C=CH-CO-NH-NH2. Outros e-xemplos de moléculas de fixação e métodos para modificar moléculas tiol asquais podem ser usadas para formar moléculas de ligação da invenção sãodescritos em Pratt, M. L. et al. J Am Chem Soe. 2003 May 21; 125 (20): 6149-59; e Saxon, E. Science. 2000 Mar 17; 287 (5460): 2007-10.

A molécula de ligação pode ser uma molécula a qual é capaz dereagir com uma molécula efetora ou um derivado da mesma para formaruma molécula de ligação da invenção. Por exemplo, a molécula efetora podeser encadeada às porções remanescentes da molécula através de uma Iiga- ção dissulfeto. Em similares casos, a molécula de ligação é selecionada detal modo que seja capaz de reagir com um derivado da porção efetora apro-priada de tal modo que a molécula efetora seja fixada à molécula de ligaçãoda invenção. Conforme descrito acima, a molécula de ligação e/ou o peptí-deo de ligação como um todo podem ser selecionados de modo que o peptí-deo de ligação seja clivado em um ambiente apropriado.

Moléculas de peptídeos de ligação particularmente preferencialincluem, por exemplo, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (vide,por exemplo, Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), N-succini-midil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) (vide, por exemplo, a Patente dosEstados Unidos N2 4.563.304), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato(SPP) (vide, por exemplo, CAS Número de registro 341498-08-6), N-succi-nimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (vide, por e-xemplo, Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)), e N-succi-nimidil 4-metil-4-[2-(5-nitro-piridil)~ ditiojpentanoato (SMNP) (vide, por exem-pio, a Patente dos Estados Unidos N- 4.563.304) As moléculas de peptídeosde ligação mais preferenciais para uso na composição da invenção são SPP,SMCC, e SPDB. Em uma modalidade preferencial, SPDB é usado para en-cadear uma molécula efetora a uma molécula de ligação da invenção.

Moléculas efetoras citotóxicas preferenciais para uso na presen-te invenção são fármacos citotóxicos, particularmente aqueles que são usa-dos para terapia do câncer. Conforme usado aqui, neste Pedido de patente,"uma citotoxina ou agente citotóxico" significa qualquer agente que é préju-dicial para o crescimento e a proliferação de células e pode agir para reduzir,inibir ou destruir uma célula ou malignidade. Citotoxinas típicas incluem, masnão estão limitadas a, radionuclídeos, biotoxinas, toxinas enzimaticamenteativas, citostáticos ou citotóxicos agentes terapêuticos, pró-farmacos, Iigan- tes imunologicamente ativos e modificadores da resposta biológica tais comocitocinas. Qualquer citotoxina que age para retardar ou tornar mais lento ocrescimento de células imunorreativas ou células malignas está dentro doâmbito da presente invenção.

Citotoxinas típicas incluem, em geral, agentes citostáticos, agen- tes alquilantes, antimetabólitos, agentes antiproliferativos, agentes de liga-ção de tubulina, hormônios e antagonistas hormonais, e similares, típicasCitotoxinas típicas que são compatíveis com a presente invenção incluemsubstâncias alquilantes, tais como mecloretamina, trietilenofosforamida, ci-clofosfamida, ifosfamida, clorambucil, bussulfan, melfalan ou triaziquona, também compostos de nitrosouréia, tais como carmustina, lomustina, ousemustina.

Moléculas particularmente preferenciais para conjugação sãomaitansinóides. Maitansinóides foram isolados originalmente do arbusto daÁfrica Oriental pertencente ao gênero Maytenus, mas subseqüentementetambém foram descobertos como sendo metabólitos de bactérias do solo,tais como Actinosynnema pretiosum (vide, por exemplo, a Patente dos Esta-dos Unidos N- 3.896.111). Maitansinóides são conhecidos na técnica porincluírem maitansina, maitansinol, C-3 ésteres de maitansinol, e outros aná-logos e derivados de maitansinol (vide, por exemplo, as Patentes dos Esta-dos Unidos Nos. 5.208.020 e 6.441.163). C-3 Ésteres de maitansinol podemser naturais ou derivados sinteticamente. Além disso, tanto C-3 ésteres demaitansinol que ocorrem naturalmente quanto sintéticos podem ser classifi-cados como um C-3 éster com ácidos carboxílicos simples, ou um C-3 éstercom derivados de N-metil-L-alanina, o último sendo mais citotóxico do que o precedente. Análogos de maitansinóides sintéticos também são conhecidosna técnica e são descritos, por exemplo, em Kupchan et al., J. Med. Chem.,21, 31-37 (1978). Métodos para produzir maitansinol e análogos e derivadosdos mesmos são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N24.151.042.

Maitansinóides adequados para uso como conjugados de anti-corpos podem ser isolados a partir de fontes naturais, produzidos sintetica-mente, ou produzidos semi-sinteticamente usando métodos conhecidos natécnica. Além disso, os maitansinóides podem ser modificados em qualquermaneira adequada, contanto que seja preservada citotoxicidade suficientena molécula do conjugado final.

Maitansinóides particularmente preferenciais compreendendouma molécula de ligação que contém um grupamento químico reativo são C-3 ésteres de maitansinol e seus análogos onde a molécula de ligação con-tém uma ligação dissulfeto e a molécula de fixação compreende um éter N-succinimidílico ou N-sulfossuccinimidílico. Muitas posições sobre maitansi-nóides podem sen/ir como a posição para ligar quimicamente a molécula deligação, por exemplo, através de uma molécula de fixação efetora. Por e-xemplo, também são úteis a posição C-3 tendo um grupamento oxidrila, aposição C-14 modificada com hidroximetil, a posição C-15 modificada comhidróxi e a posição C-20 tendo um grupamento hidróxi. A molécula de liga-ção mais preferencialmente é encadeada à posição C-3 de maitansinol. Omais preferencialmente, o maitansinóide usado em conexão com a composi-ção da invenção é N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(- 3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) ou N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(4-- mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina (DM4).

Moléculas de ligação com outras ligações químicas também po-dem ser usadas no contexto da invenção, assim como outros maitansinói-des. Exemplos específicos de outras ligações químicas as quais podem serincorporadas nas moléculas de ligação incluem aquelas descritas acima, taiscomo, por exemplo ligação lábil em ácido, ligações tioéter, ligações fotolá-beis, ligações lábeis em peptidase e ligações lábeis em esterase. Métodospara produzir maitansinóides com moléculas de ligação e/ou moléculas efe-toras de fixação são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Uni-dos Nos. 5.208.020, 5.416.064, e 6.333.410.A molécula de ligação (e/ou a molécula de fixação efetora) deum maitansinóide tipicamente e preferencialmente é parte de uma moléculade peptídeo de ligação maior que é usada para unir o anticorpo ao maitansi-nóide. Qualquer molécula de peptídeo de ligação adequada pode ser usada em conexão com a invenção, na medida que a molécula de ligação propor-cione retenção das características de citotoxicidade e direcionamento domaitansinóide e do anticorpo, respectivamente. A molécula de ligação une omaitansinóide ao anticorpo através de ligações químicas (conforme descritoacima), de tal modo que o maitansinóide e o anticorpo são acoplados quimi-camente (por exemplo, ligado de modo covalente) um ao outro. Desejavel-mente, a molécula de ligação liga quimicamente o maitansinóide ao anticor-po através de ligações dissulfeto ou ligações tioéter. O mais preferencial-mente, o anticorpo é acoplado quimicamente ao maitansinóide através deligações dissulfeto.

Outras classes preferenciais de agentes citotóxicos incluem, porexemplo, a família de fármacos de antraciclina, os fármacos vinca, as mito-micinas, as bleomicinas, os nucleosídeos citotóxicos, a família de fármacosde pteridina, diinenos, e as podofilotoxinas. Membros particularmente úteisdestas classes incluem, por exemplo, adriamicina, carminomicina, daunoru-bicina (daunomicina), doxorubicina, aminopterina, metotrexato, metopterina,mitramicina, estreptonigrina, diclorometotrexato, mitomicina C, actinomicina-D, porfiromicina, 5-fluorouracil, floxuridina, ftorafur, 6-mercaptopurina, citara-bina, arabinosídeo de citosina, podofilotoxina, ou podofilotoxina derivadostais como etoposídeo ou fosfato de etoposídeo, melfalan, vinblastina, vincris-tina, leurosidina, vindesina, Ieurosina e similares. Ainda outras citotoxias quesão compatíveis com os ensinamentos aqui, neste Pedido de patente, inclu-em taxol, taxano, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina,tenoposídeo, colchicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, procaína,tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Hormônios e antagonistas hormonais, tais como corticosterói-des, por exemplo, prednisona, progestinas, por exemplo, hidroxiprogestero-na ou medroprogesterona, estrogênios, por exemplo, dietilestilbestrol, anties-trogênios, por exemplo, tamoxifeno, androgênios, por exemplo, testosterona,e inibidores de aromatase, por exemplo, aminoglutetimida também são com-patíveis com os ensinamentos aqui, neste Pedido de patente. Conforme ob-servado previamente, uma pessoa versada na técnica pode fazer modifica-ções químicas para o composto desejado de modo a produzir reações destecomposto mais convenientes para fins de preparar conjugados da invenção.

Um exemplo de citotoxinas particularmente preferenciais com-preende membros ou derivados da família enediina de antibióticos antitumo-rais, incluindo caliqueamicina, esperamicinas ou dinemicinas. Estas toxinassão extremamente potentes e agem clivando DNA nuclear, levando a mortecelular. Diferentemente de toxinas de proteína as quais podem ser clivadasin vivo para dar muitos fragmentos de polipeptídeos inativos porém imuno-gênicos, toxinas tais como caliqueamicina, esperamicinas e outras enediinassão moléculas pequenas as quais são essencialmente não-imunogênicas.Estas toxinas não-peptídicas são encadeadas quimicamente aos dímeros outetrâmeros por técnicas as quais foram previamente usadas para marcar an-ticorpos monoclonais e outras moléculas. Estas tecnologias de ligação inclu-em ligação sítio-específica através dos resíduos de açúcar N-encadeadosrecentes comonte sobr a porção Fc dos construtos. Os métodos de ligaçãosítio-dirigida têm a vantagem de reduzir os possíveis efeitos de ligação sobreas propriedades de ligação dos construtos.

Entre outras citotoxinas, Será reconhecido que polipeptídeostambém podem ser associados com uma biotoxina tal como ricina subunida-de A, abrina, toxina diftérica, botulinum, cianginosinas, saxitoxina, shigatoxi-na, tétano, tetrodotoxina, tricoteceno, verrucologen ou uma enzima tóxica.Preferencialmente, os referidos construtos serão preparados usando técni-cas de engenharia genética que possiblitam expressão direta do construtode molécula de ligação-toxina. Outros modificadores da resposta biológicaque podem ser associados com os polipeptídeos da invenção da presenteinvenção compreendem citocinas tais como Iinfocinas e interferons. Em vistada presente descoberta sugere-se que uma pessoa versada na técnica podeprontamente formar os construtos referidos usando técnicas convencionais.Outra classe de citotoxinas compatíveis que podem ser usadasem associação com os polipeptídeos revelados são fármacos radiossensibi-Iizantes que podem ser dirigidos de modo eficaz a células imunorreativas outumorais. Os fármacos referidos reforçam a sensibilidade a radiação ionizan-te, deste modo aumentando a eficácia da radioterapia. Um conjugado inter-nalizado pela célula tumoral liberaria o radiossensibilizador mais próximo donúcleo onde a radiossensibilização seria máxima. Os polipeptídeos encade-ados a radiossensibilizador não ligado da invenção seria mais rapidamenteclareado do sngue, localizando o agente de radiossensibilização remanes-cente no tumor alvo e proporcionando mínima captação em tecidos normais.

Depois de rápido clearance do sangue, radioterapia auxiliar seria adminis-trada em um de três modos: 1.) radiação de feixe externo dirigida especifi-camente para o tumor, 2.) radioatividade implantada diretamente no tumorou 3.) radioimunoterapia sistêmica com a mesma molécula de ligação. Umavariação potencialmente atrativa desta abordagem seria a fixação de umradioisótopo terapêutico ao imunoconjugado radiossensibilizado, deste modoproporcionando a conveniência de administrar ao paciente um único fármaco.

Em uma modalidade, uma molécula que reforça a estabilidadeou a eficácia do polipeptídeo pode ser conjugada. Por exemplo, em umamodalidade, PEG pode ser conjugado aos polipeptídeos da invenção paraaumentar sua meia-vida in vivo. Leong, S.R., et al. 2001. Cytokine 16:106;2002; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531; ou Weir et al. 2002. Biochem. Soe.Transactions 30:512.

Conforme previamente aludido, citotoxinas compatíveis podemcompreender um pró-farmaco. Conforme usado aqui, neste Pedido de paten-te, o termo "pró-farmaco" se refere a um precursor ou forma derivada deuma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para célu-las tumorais comparado com o fármaco de origem e é capaz de seer ativadoenzimaticamente ou convertido na forma de origem mais ativa. Pró-farmacoscompatíveis com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, pró-farmacos contendo fosfato, pró-farmacos contendo tiofosfato, pró-farmacoscontendo sulfato, pró-farmacos contendo peptídeo, pró-farmacos contendoβ-lactama, pró-farmacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituí-da ou pró-farmacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-farmacos de 5-fluorouridina que podem ser con-vertidas para o fármaco livre de citotóxicos mais ativos. Em uma modalidade,um agente citotóxico, tal como um maitansinóide, é administrado como umpró-farmaco o qual é liberado pela hidrólise de ligações dissulfeto. Exemplosadicionais de fármacos citotóxicos que podem ser derivados em uma formade pró-farmaco para uso na presente invenção compreendem os agentesquimioterápicos descritos acima.

XIII. Administração de Moléculas de Ligação

Métodos para preparar e administrar moléculas de ligação dainvenção a um sujeito são de conhecimento geral ou são prontamente de-terminados por aqueles versados na técnica. A via de administração das mo-léculas de ligação da invenção pode ser oral, parenteral, por inalação ou tó-pica. O termo parenteral conforme usado aqui, neste Pedido de patente, in-clui administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular,subcutânea, rectal ou vaginal. As formas intravenosa, intra-arterial, subcutâ-nea e intramuscular de administração parenteral são geralmente preferenci-ais. Apesar de todas estas formas de administração serem claramente con-templatadas como estando dentro do âmbito da invenção, uma forma paraadministração seria uma solução para injeção, em particular para injeção ougotejamento intravenoso ou intra-arterial. Geralmente, uma composição far-macêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por e-xemplo, tampão de acetato, fosfato ou citrato), um tensoativo (por exemplo,polissorbato), opcionalmente um agente estabilizante (por exemplo, albumi-na humana), e etc. No entanto, em outros métodos compatíveis com os en-sinamentos aqui, neste Pedido de patente, os polipeptídeos podem ser libe-rados diretamente no sítio da população celular adversa deste modo aumen-tando a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.

Preparações para administração parenteral incluem soluções,suspensões, e emulsões estéreis aquosas ou não-aquosas. Exemplos desolventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetaistais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato deetila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas / aquosas, emul-sões ou suspensões, incluindo salina e meios tamponados. Na invenção em questão, veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limi-tados a, 0,01 a 0,1 Me preferencialmente 0,05 M de tampão de fosfato ou0,8% de salina. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções defosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução deRinger lactada, ou óleos não voláteis. Veículos intravenosos incluem reposi- tores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aquelesbaseados em dextrose de Ringer, e similares. Preservantes e outros aditivostambém podem estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos,antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e similares.

Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em á-gua) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de solu-ções ou dispersões injetáveis estéreis. Em similares casos, a composiçãodeve ser estéril e deve ser fluida na medida que exista fácil seringabilidade.Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e prefe- rencialmente será preservada contra a ação contaminante de microorganis-mos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meiode dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glice-rol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas ade-quadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanhode partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.

Prevenção da ação de microorganismos pode ser otida por vá-rios agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, cloro-butanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois,tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorçãoprolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo nacomposição um agente o qual retarda a absorção, por exemplo, monoestea-rato de alumínio e gelatina.

Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser pre-paradas incorporando um composto ativo (por exemplo, um polipeptídeo porsi só ou em combinação com outros agentes ativos) na quantidade requeridaem um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientesenumerados aqui, neste Pedido de patente, conforme requerido, seguida poresterilização filtrada. Geralmente, são preparadas dispersões incorporando ocomposto ativo em um veículo estéril, o qual contém um meio de dispersãobásico e os outros ingredientes requeridos entre aqueles enumerados acima.

No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis,os métodos de preparação preferenciais são secagem a vácuo e secagempor congelamento, a qual produz um pó de um ingrediente ativo mais qual-quer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada es-téril da mesma. As preparações para injeções são processadas, preenchidasem recipientes tais como ampolas, bolsas, garrafas, seringas ou frascos, eseladas sob condições assépticas de acordo com métodos conhecidos natécnica. Adicionalmente, as preparações podem ser embaladas e vendidassob a forma de um kit tal como aqueles descritos nas publicações de patenteco-pendentes U.S.S.N. 09/259.337 e U.S.S.N. 09/259.338 cada uma dasquais é incorporada aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência.

Os artigos de fabricação referidos preferencialmente terão rótulos ou bulasindicando que as composições associadas são úteis para tratar um sujeitosofrendo de, ou predisposto a distúrbios autoimunes ou neoplásicos.

Doses eficazes das moléculas de ligação estabilizadas da pre-sente invenção, para o tratamento das condições descritas acima variamdependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração,sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ouum animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profiláticoou terapêutico. Geralmente, o paciente é um ser humano, porém mamíferosnão-humanos incluindo mamíferos transgênicos também podem ser trata-dos. As dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos derotina de conhecimento daqueles versados na técnica para otimizar a segu-rança e a eficácia.

Para imunização passiva com uma molécula de ligação da in-venção, a dosagem pode variar, por exemplo, a partir de cerca de 0,0001 a100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg,0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, e etc.), do peso corpo-ral do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg de pesocorporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg,preferencialmente no mínimo 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas aci-ma também são pretendidas para estarem dentro do âmbito da invenção.

Aos sujeitos podem ser administradas as doses referidas diari-amente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer ou-tro esquema determinado por análise empírica. Um tratamento típico acarre-ta administração em múltiplas dosagens durante um período prolongado, porexemplo, de no mínimo seis meses. Regimes de tratamento típicos adicio-nais acarretam administração uma vez por cada duas semanas ou uma vezao mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Esquemas de dosagem típicos in-cluem 1 a 10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em diasalternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou maisanticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são admi-nistrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo ad-ministrado pode Ostar dentro das faixas indicadas.

As moléculas de ligação da invenção podem ser administradaem múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, porexemplo, diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Os in-tervalos também podem ser irregulares conforme indicado medindo os níveissangüíneos de polipeptídeo ou molécula alvo no paciente. Em alguns méto-dos, a dosagem é ajustada para obter uma determinada concentração plas-mática de molécula de ligação ou toxina, por exemplo, 1 a 1000 μg/ml ou 25a 300 pg/ml. Alternativamente, moléculas de ligação podem ser administra-das como uma formulação de liberação gradual, em cujo caso é nexessáriaadministração menos freqüente. A dosagem e a freqüência variam depen-dendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humani-zados mostram a meia-vida mais longa, seguidos por anticorpos quiméricose anticorpos não-humanos. Em uma modalidade, as moléculas de ligaçãoda invenção podem ser administradas em forma não-conjugada, Em outra modalidade, os polipeptídeos da invenção podem ser administrados múlti-plas vezes em forma conjugada. Em ainda outra modalidade, as moléculasde ligação da invenção podem ser administrada em forma não-conjugada,em seguida em forma conjugada, ou vice versa.

A dosagem e a freqüência de administração podem variar de-pendendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações pro-filáticas, composições contendo os presentes anticorpos ou um coquetel dosmesmos são administradas a um paciente ainda não no estado de doençapara reforçar a resistência do paciente. Uma quantidade similar é definidacomo sendo uma "dose eficaz profilática." Neste uso, as quantidades preci-sas novamente dependem do estado de saúde e da imunidade geral do pa-ciente, mas geralmente variam de 0,1 a 25 mg por dose, especialmente de0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dosagem relativamente baixa é administrada emintervalos relativamente infreqüentes durante um período de tempo longo.Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas.

Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente eleva-da (por exemplo, a partir de cerca de 1 a 400 mg/kg de molécula de ligação,por exemplo, anticorpo por dose, com dosagens de a partir de 5 a 25 mgsendo mais comumente usadas para radioimunoconjugados e doses maio-res para moléculas conjugadas a fármaco de citotoxina) em intervalos relati- vãmente curtos é algumas vezes necessária até a progressão da doença serreduzida ou terminada, e preferencialmente até o paciente mostrar melhoraparcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, pode ser admi-nistrado ao paciente um regime profilático.

Em uma modalidade, um sujeito pode ser tratado com uma mo-lécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção (por e-xemplo, em um vetor). Doses para ácidos nucléicos codificando polipeptí-deos variam a partir de cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 μg a10 mg, ou 30 a 300 μς de DNA por paciente. Doses para vetores virais in-fecciosos variam de 10 a 100, ou mais, vírions por dose.

Agentes terapêuticos podem ser administrados por meios paren-terais, tópicos, intravenosos, orais, subcutâneos, intra-arteriais, intracraniais,intraperitoneais, intranasais ou intramusculares para tratamento profiláticoe/ou terapêutico. Injeção intramuscular ou infusão intravenosa são preferen-ciais para administração de uma molécula de ligação da invenção. Em al-guns métodos, moléculas de ligação terapêuticas particulares são injetadasdiretamente dentro do crânio. Em alguns métodos, moléculas de ligação são administrada como uma composição ou dispositivo de liberação gradual, talcomo um dispositivo Medipad™.

Agentes da invenção podem ser administrados opcionalmenteem combinação com outros agentes que são eficazes no tratamento dosdistúrbio ou condições que necessitem de tratamento (por exemplo, profiláti-co ou terapêutico). Agentes adicionais preferenciais são aqueles os quaissão reconhecidos na técnica e são administrados padronizadamente paraum distúrbio particular.

As dosagens de tratamento único eficaz (isto é, quantidadesterapeuticamente eficazes) de polipeptídeos marcados com 90Y da invenção variam a partir de entre cerca de 5 e cerca de 75 mCi, mais preferencialmen-te entre cerca de 10 e cerca de 40 mCi. Dosagens não-ablativas da medulade tratamento único eficaz de anticorpos marcados com 131I variam a partirde entre cerca de 5 e cerca de 70 mCi, mais preferencialmente entre cercade 5 e cerca de 40 mCi. Dosagens ablativas de tratamento único eficaz (istoé, podem requerer transplantação de medula óssea autóloga) de anticorposmarcados com 131I variam a partir de entre cerca de 30 e cerca de 600 mCi,mais preferencialmente entre cerca de 50 e menos de cerca de 500 mCi. Emassociação com um anticorpo quimérico modificado, devido à meia-vida cir-culante mais longa vis-à-vis anticorpos murinos, um tratamento único eficaz de dosagens não-ablativas da marrow de anticorpos quiméricos marcadoscom lodo 131 variam a partir de entre cerca de 5 e cerca de 40 mCi, mais pre-ferencialmente menos de cerca de 30 mCi. Critérios de estudo por imagenspara, por exemplo, a etiqueta de 111In, são tipicamente menos de cerca de 5mCi.

Apesar de uma grande experiência clínica ter sido obtida com1311 e 90γ outros radiomarcadores são conhecidas na técnica e têm sido u-sados para fins similares. Ainda outros radioisótopos são usados para estu-do por imagens. Por exemplo, radioisótopos adicionais os quais são compa-tíveis com o âmbito da presente invenção incluem, mas não estão limitadosa, 123I, 125I, 32P1 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I,197Hg, 203Pb, 206Bi1 177Lul 186Rel 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re,199Au, 225Ac, 211At, e 213Bi. A este respeito α, γ e β emissores são todos com-patíveis com a presente invenção. Além disso, em vista da presente desco-berta sugere-se que uma pessoa versada na técnica pode determinar pron-tamente quais radionuclídeos são compatíveis com um curso de tratamentoselecionado sem indevida experimentação. Até o momento, radionuclídeosadicionais os quais já foram usados em diagnóstico clínico incluem 125I, 123I,99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, bem como 111In. Anticorpos também têm sidomarcados com uma variedade de radionuclídeos para uso potencial em imu-noterapia dirigida (Peirersz et al. Immunol. Cell Bioi 65: 111-125 (1987)).Estes radionuclídeos incluem 188Re e 186Re bem como 199Au e 67Cu em umamenos extensão. A Patente dos Estados Unidos N- 5.460.785 proporcionadados adicionais referentes a similares radioisótopos e é incorporada aqui, aeste Pedido de patente, por meio de referência.

Quer ou não as moléculas de ligação da invenção são usadasem uma forma conjugada ou não-conjugada. Será reconhecido que a princi-pai vantagem da presente invenção é a capacidade para usar estes polipep-tídeos em pacientes mielossuprimidos, especialmente aqueles que estãosendo submetidos, ou sofreram, terapias auxiliares tais como radioterapia ouquimioterapia. Em outras modalidades preferenciais, os polipeptídeos (no-vamente em uma forma conjugada ou não-conjugada) podem ser usados emum regime terapêutico combinado com agentes quimioterápicos. Aquelesversados na técnica reconhecerão que similares regimes terapêuticos po-dem compreender a administração seqüencial, simultânea, concorrente oucoextensiva dos anticorpos revelados e um ou mais agentes quimioterápi-cos. Modalidades particularmente preferenciais deste aspecto da invençãocompreenderão a administração de uma molécula de ligação conjugada atoxina, por exemplo, conjugada a um maitansinóide tal como um D4 maitan-sinóide.

Apesar das moléculas de ligação poderem ser administradasconforme descrito imediatamente acima, deve ser enfatizado que em outrasmodalidades polipeptídeos conjugados e não conjugados podem ser admi-nistrados a pacientes saudáveis de modo diverso como um agente terapêu-tico de primeira linha. Em similares modalidades os polipeptídeos podem seradministrados a pacientes tendo reservas de medula vermelha normal oumédia e/ou a pacientes que não têm, e não estão, sofrendo terapias auxilia-res tais como radiação de feixe externo ou quimioterapia.

No entanto, conforme discutido acima, modalidades seleciona-das da invenção compreendem a administração de moléculas de ligação apacientes mielossuprimidos ou em combinação ou associação com uma oumais terapias auxiliares tais como radioterapia ou quimioterapia (isto é umregime terapêutico combinado). Conforme usado aqui, neste Pedido de pa-tente, a administração de polipeptídeos em associação ou combinação comuma terapia auxiliar significa a administração ou aplicação seqüencial, simul-tânea, coextensiva, concorrente, concomitante ou contemporânea da terapiae das moléculas de ligação reveladas. Aqueles versados na técnica reco-nhecerão que a administração ou aplicação dos vários componentes do re-gime terapêutico combinado pode ser regulada para reforçar a eficácia glo-bal do tratamento. Por exemplo, agentes quimioterápicos podem ser admi-nistrados em cursos de tratamento padrão de conhecimento geral seguidosdentro de umas poucas semanas por radioimunoconjugados da presenteinvenção. Inversamente, polipeptídeos associados a citotoxina podem seradministrados por via intravenosa seguidos por radiação de feixe externolocalizada no tumor. Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo pode seradministrado concorrentemente com um ou mais agentes quimioterápicosselecionados em uma única visita ao consultório. Um técnico versado (porexemplo, um oncologista experiente) seria prontamente capaz de discernirregimes terapêuticos combinados eficazes sem indevida experimentaçãocom base na terapia auxiliar selecionada e nos ensinamentos da presenterelatório descritivo.

A este respeito será reconhecido que a combinação das molécu-las de ligação (quer conjugadas ou não-conjugadas) e o agente quimioterá-pico pode ser administrada em qualquer ordem e dentro de qualquer tramede tempo que proporcione um benefício terapêutico para o paciente. Isto é, oagente quimioterápico e o polipeptídeo podem ser administrados em qual-quer ordem ou concorrentemente. Moléculas de ligação e agentes quimiote-rápicos podem ser administrados separadamente ou podem ser administra-dos sob a forma de uma composição. Em modalidades selecionadas os poli-peptídeos da presente invenção serão administrados a pacientes que foramsubmetidos previamente a quimioterapia. Em ainda outras modalidades, os polipeptídeos e o tratamento quimioterápico serão administrados substanci-almente simultaneamente ou concorrentemente. Por exemplo, ao pacientepode ser administrada a molécula de ligação enquanto estiver sendo subme-tido a um tratamento de quimioterapia. Em modalidades preferenciais a mo-lécula de ligação será administrada dentro de 1 ano de qualquer agente outratamento quimioterápico. Em outras modalidades preferenciais o polipeptí-deo será administrado dentro de 10, 8, 6, 4, ou 2 meses de qualquer agenteou tratamento quimioterápico. Em ainda outras modalidades preferenciais opolipeptídeo será administrado dentro de 4, 3, 2 ou 1 semana de qualqueragente ou tratamento quimioterápico. Em ainda outras modalidades o poli- peptídeo será administrado dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 dias do qualquer agenteou tratamento quimioterápico selecionado. Será adicionalmente reconhecidoque os dois agentes ou tratamentos podem ser administrados ao pacientedentro de uma questão de horas ou minutos (isto é substancialmente simul-taneamente).

Além disso, de acordo com a presente invenção um pacientemielossuprimido deverá significar qualquer paciente apresentando conta-gens sangüíneas reduzidas. Aqueles versados na técnica reconhecerão quehá vários parâmetros de contagem sangüínea usados convencionalmentecomo indicadores clínicos de mielossupressão e pode-ser facilmente medir aextensão na qual está ocorrendo mielossupressão em um paciente. Exem-plos de medições de mielossupressão aceitas na técnica são a Contagem deNeutrófilos Absoluta (ANC) ou contagem de plaquetas. A mielossupressãoreferida ou mieloablação parcial podem ser a conseqüência de vários distúr-bios bioquímicos ou doenças ou, mais provavelmente, como a conseqüênciade quimioterapia ou radioterapia anterior. A este respeito, os versados natécnica reconhecerão que pacientes que sofreram quimioterapia tradicionaltipicamente apresentam reduzidas reservas de medula vermelha. Conformediscutido acima, os sujeitos referidos freqüentemente não podem ser trata-dos usando níveis ótimos de citotoxina (isto é radionuclídeos) devido a efei-tos colaterais inaceitáveis tais como anemia ou imunossupressão que resul-tam em aumentada mortalidade ou morbidez.

Mais especificamente polipeptídeos conjugados ou não conju-gados da presente invenção podem ser usados para tratar de modo eficazpacientes tendo ANCs menores do que cerca de 2000/mm3 ou contagem deplaquetas menor do que cerca de 150,000/ mm3. Mais preferencialmente ospolipeptídeos da presente invenção podem ser usados para tratar pacientestendo ANCs de menos de cerca de 1500/ mm3, menos de cerca de1000/mm3 ou ainda mais preferencialmente menos de cerca de 500/ mm3.Similarmente, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados pa-ra tratar pacientes tendo uma contagem de plaquetas de menos de cerca de75.000/mm3, menos de cerca de 50.000/mm3 ou ainda menos de cerca de10.000/mm3. Em um sentido mais geral, os versados na técnica serão facil-mente capazes de determinar quando um paciente é mielossuprimido usan-do diretrizes e procedimentos implementados pelo governo.

Conforme indicado acima, muitos pacientes mielossuprimidossofreram cursos de tratamento incluindo quimioterapia, radioterapia por im-plante ou radioterapia de feixe externo. No caso do último, uma fonte de ra-diação externa é para irradiação local de uma malignidade. Para métodos deimplantação de radioterapia, reagentes radioativos estão localizados cirurgi-camente dentro da malignidade, deste modo irradiando seletivamente o sítioda doença. Em qualquer evento, os polipeptídeos revelados podem ser usa-dos para tratar distúrbios em pacientes apresentando mielossupressão inde-pendente da causa.

A este respeito será adicionalmente reconhecido que os polipep-tídeos da presente invenção podem ser usados em associação ou em com-binação com qualquer agente ou agentes quimioterápicos (por exemplo,proporcionando um regime terapêutico combinado) que elimina, reduz, inibeou controla o crescimento de células neoplásicas in vivo. Conforme discuti-do, os agentes referidos freqüentemente resultam na redução de reservasde medula vermelha. Esta redução pode ser compensada, no todo ou emparte, pela reduzida mielotoxicidade dos compostos da presente invençãoque vantajosamente possibilitam o tratamento agressivo de neoplasias emsimilares pacientes. Em outras modalidades preferenciais os imunoconjuga-dos radiomarcados revelados aqui, neste Pedido de patente, podem ser u-sados de modo eficaz com radiossensibilizadores que aumentam a susceti-bilidade das células neoplásicas a radionuclídeos. Por exemplo, compostosradiossensibilizantes podem ser administrados depois da molécula de liga-ção radiomarcada terem sido largamente clareados da corrente sangüíneamas ainda permanecem em níveis terapeuticamente eficazes no sítio do tu-mor ou -tumores.

Com respeito a estes aspectos da invenção, agentes quimiote-rápicos típicos que são compatíveis com a presente invenção incluem agen-tes alquilantes, vinca alcalóides (por exemplo, vincristina e vinblastina), pro-carbazina, metotrexato e prednisona. A combinação de quatro fármacosMOPP (mecletamina (mostarda de nitrogênio), vincristina (Oncovin), procar-bazina e prednisona) é muito eficaz para tratar vários tipos de Iinfoma ecompreende uma modalidade preferencial da presente invenção. Em pacien-tes resistentes a MOPP, podem ser usadas as combinações ABVD (por e-xemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina), ChIVPP (clo-rambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona), CABS (lomustina, doxoru-bicina, bleomicina e estreptozotocina), MOPP mais ABVD, MOPP mais ABV(doxorubicina, bleomicina e vinblastina) ou BCVPP (carmustina, ciclofosfa-mida, vinblastina, procarbazina e prednisona). Arnold S. Freedman e Lee M.Nadler, Malignant Lymphomas, em Harrison's Principles of Internal Me-dicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et ai, eds., 13th ed. 1994) e V. T. DeVi-ta et ai, (1997) e as referências citadas no mesmo para dosagem de rotina eplanejamento. Estas terapias podem ser usadas não modificadas, ou altera-das conforme necessário para um paciente em particular, em combinaçãocom um ou mais polipeptídeos da invenção conforme descrito aqui, nestePedido de patente.

Regimes adicionais que são úteis no contexto da presente in-venção incluem uso de agentes alquilantes únicos tais como ciclofosfamidaou clorambucil, ou combinações tais como CVP (ciclofosfamida, vincristina eprednisona), CHOP (CVP e doxorubicina), C-MOPP (ciclofosfamida, vincris-tina, prednisona e procarbazina), CAP-BOP (CHOP mais procarbazina ebleomicina), m-BACOD (CHOP mais metotrexato, bleomicina e leucovorin),ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida,etoposídeo e leucovorin mais MOPP padrão), ProMACE-CytaBOM (predni-sona, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, citarabina, bleomicina, vin-cristina, metotrexato e leucovorin) e MACOP-B (metotrexato, doxorubicina,ciclofosfamida, vincristina, dose fixa de prednisona, bleomicina e leucovorin).Aqueles versados na técnica serão prontamente capazes de determinar do-sagens de rotina e planejamento para cada um destes regimes. CHOP tam-bém foi combinado com bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostarda denitrogênio, arabinosídeo de citosina e etoposídeo. Outros agentes quimiote-rápicos compatíveis incluem, mas não estão limitadas a, 2-clorodeoxiade-nosina (2-CDA), 2'-deoxicoformicina e fludarabina.

Para pacientes com grau intermediário e elevado de NHL, quenão tenham êxito em obter remissão ou recidiva, é usada terapia de recupe-ração. Terapias de recuperação empregam fármacos tais como arabinosídeode citosina, cisplatina, etoposídeo e ifosfamida administrados sozinhos ouem combinação. Em formas recidivantes ou agressivas de alguns distúrbiosneoplásicos são freqüentemente usados os seguintes protocolos: IMVP-16(ifosfamida, metotrexato e etoposídeo), MIME (enxerto de metila (metil-gag),ifosfamida, metotrexato e etoposídeo), DHAP (dexametasona, alta dose decitarabina e cisplatina), ESHAP (etoposídeo, metilpredisolona, HD citarabina,cisplatina), CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona e bleomicina) e CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona) cadaum com taxas de dosagem e esquemas de conhecimento geral.

A quantidade de agente quimioterápico a ser usado em combi-nação com os polipeptídeos da presente invenção pode variar por sujeito oupode ser administrada de acordo com a que é conhecida na técnica. Vide, por exemplo, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman &Gilman1S The Pharmacological Basis of Terapêuticos 1233-1287 ((Joel G.Hardman et ai, eds., 9th ed. 1996).

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção po-de ser administrada a um sujeito que foi submetido, está sofrendo, ou sofre- rá um procedimento cirúrgico, por exemplo, para remover um tumor primário,uma metástase ou tecido ou crescimento pré-canceroso como uma terapiapreventiva.

Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção éadministrada em associação com um biológico. Biológicos úteis no tratamen- to de cânceres são conhecidos na técnica e uma molécula de ligação da in-venção pode ser administrada, por exemplo, em associação com os referi-dos biológicos conhecidos.

Por exemplo, a agência americada FDA aprovou os seguintesbbiológicos para o tratamento de câncer de mama: Herceptin® (trastuzumab, Genentech Inc., South San Francisco, CA; um anticorpo monoclonal huma-nizado que tem atividade antitumoral em câncer de mama HER2-positivo);Faslodex® (fulvestrant, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, Wilmington, DE;um antagonista receptor de estrogênio usado para tratar câncer de mama);Arimidex® (anastrozole, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP; um inibidor dearomatase não-esteroidal o qual bloqueia aromatase, uma enzima necessá-ria para produzir estrogênio); Aromasin® (exemestane, Pfizer Inc., New York,NY; um inativador de aromatase esteróide irreversível usado no tratamentode câncer de mama); Femará® (letrozole, Novartis Pharmaceuticals, EastHanover, NJ; um inibidor de aromatase não-esteróide aprovado pela agênciaamericana FDA para tratar câncer de mama); e Nolvadex® (tamoxifeno , As-traZeneca Pharmaceuticals, LP; um antiestrogênio não-esteróide aprovadopela agência americana FDA para tratar câncer de mama). Outros biológicoscom os quais as moléculas de ligação da invenção podem ser combinadasincluemj: Avastin™ (bevacizumab, Genentech Inc.; a primeira terapia apro-vada pela FDA projetada para inibir a angiogênese); e Zevalin® (ibritumomabtiuxetan, Biogen ldec, Cambridge1 MA; um anticorpo monoclonal radiomar-cado aprovado atualmente para o tratamento de Iinfomas de células B).

Além disso, a FDA aprovou os seguintes biológicos para o tra-tamento de câncer colorretal: Avastin™ ;Erbitux™ (cetuximab, ImCIone Sys-tems Inc., New York, NY, e Bristol-Myers Squibb, New York1 NY; é um anti-corpo monoclonal dirigido contra o receptor de fator de crescimento epidér-mico (EGFR)); Gleevec® (mesilato de imatinib; uma inibidor da quinase pro-téica); e Ergamisol® (cloridrato de Ievamisol1 Janssen Pharmaceutica Pro-ducts, LP1 Titusville, NJ; um imunomodulador aprovado pela FDA em 1990como um tratamento adjuvante em combinação com 5-fluorouracil depois deresseção cirúrgica em pacientes com câncer de cólon Estágio C de Dukes).

Para uso no tratamento de Linfomas Não-Hodgkin terapias atu-almente aprovadas incluem: Bexxar® (tositumomab e iodo 1-131 tositumo-mab, GIaxoSmithKIine, Research Triangle Park1 NC; um tratamento multi-etapas envolvendo um anticorpo monoclonal de camundongo (tositumomab)encadeado a uma molécula radioativa (iodo 1-131)); Intron® A (interferon a-2b, Schering Corporation, Kenilworth, NJ; um tipo de interferon aprovadopara o tratamento de Iingoma não Hodgkin folicular em associação com qui-mioterapia de combinação contendo antraciclina (por exemplo, ciclofosfami-da, doxorubicina, vincristina, e prednisona [CHOP])); Rituxan® (rituximab,Genentech Inc., South San Francisco, CA, e Biogen Idec1 Cambridge, MA; um anticorpo monoclonal aprovado para o tratamento de Iinfoma não Hodg-kin; Ontak® (denileukin diftitox, Ligand Pharmaceuticals Inc., San Diego1 CA;uma proteína de fusão consistindo em um fragmento de toxina diftérica fun-dida geneticamente a interleucina-2); e Zevalin® (ibritumomab tiuxetan, Bio-gen Idec; um anticorpo monoclonal radiomarcado aprovado pela FDA para otratamento de Iinfomas Não-Hodgkin de células B).

Para tratamento de Leucemia, biológicos típicos os quais podemser usados em combinação com as moléculas de ligação da invenção inclu-em Gleevec®; Campath®-1H (alemtuzumab, Berlex Laboratories, Richmond,CA; um tipo de anticorpo monoclonal usado no tratamento de leucemia Iinfo-cítica crônica). Além disso, Genasense (oblimersen, Genta Corporation, Ber-kley Heights, NJ; pode ser usada uma terapia anti-sentido de BCL-2 em de-senvolvimento para tratar leucemia (por exemplo, sozinho ou em combina-ção com um ou mais fármacos de quimioterapia, tais como fludarabina e ci-clofosfamida) podem ser administrados com as moléculas de ligação reivin-dicadas.

Para o tratamento de câncer pumonar, biológicos típicos incluem Tarceva™ (erlotinib HCL, OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY; uma molé-cula pequena projetada para orientar o caminho do receptor de fator decrescimento epidérmico humano 1 (HER1)).

Para o tratamento de mieloma múltiplo, biológicos típicos inclu-em Velcade® Velcade (bortezomib, Millennium Pharmaceuticals, CambridgeMA; um inibidor de proteassoma). Biológicos adicionais incluem Thalidomid®(thalidomide, Clegene Corporation, Warren, NJ; um agente imunomoduladore parece ter múltiplas ações, incluindo a capacidade para inibir o crescimen-to e a sobrevida de células de mieloma e antiangiogênese).

Outros biológicos típicos incluem o MOAB IMC-C225, desenvol-vido pela ImCIone Systems, Inc., New York, NY.

Além disso, as moléculas de ligação reivindicadas podem seradministradas em associação com vacinas ou outros agentes (por exemplo,citocinas) para modular reações imunes anticancerígenas. Por exemplo, Me-lacine® (Corixa Corporation, Seattle, WA) é uma vacina tumoral alogênicaque foi reportada por ter resultados promissores no tratamento de melanomaressecado T3N0M0. GMK® (Progenics Pharmaceutical, Inc., Tarrytown, NY)é um antígeno de gangliosídeo administradp como um agente adjuvante faseIll em pacientes que estão em alto risco para recurrência de melanoma. Avacina terapêutica antigastrina (Anti-gastrin therapeutic vaccine®,AphtonCorporation, Miami, FL) neutraliza hormônios G17 e glyextened e está emestudos clínicos fase Ill para pacientes com cânceres colorretais, pancreáti-cos, e estomacais. CeaVac® (Titan Pharmaceuticals, Inc., South San Fran-cisco, CA) é um vacina de anticorpo antiidiotipo sendo estudado em câncercolorretal. Finalmente, Theratope® (Biomira Inc., Edmonton, Alberta, Cana-da) e uma vacina terapêutica de carboidrato sintética sendo investigada co-mo um agente fase Ill em pacientes com câncer de mama metastático(Pharmaceutical Research e Manufacturers of America, 2000).

Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invençãopode ser administrada em associação com um agente antiangiogênico, porexemplo, Endostatin (um inibidor endotelial-específico, endógeno, derivadode tumor, que detém a produção de células endoteliais microvasculares);anticorpo anti-VEGF; talidomida; ou inibidores de metaloproteinase da matrizinibem a síntese e degradação da membrana de base de vasos sangüí-neos).

Conforme previamente discutido, as moléculas de ligação dapresente invenção, fragmentos imunorreativos ou recombinantes dos mes-mos podem ser administrados em uma quantidade farmaceuticamente eficazpara o tratamento in vivo de distúrbios de mamíferos. A este respeito, seráreconhecido que as moléculas de ligação reveladas serão formuladas demodo a facilitar administração e promover estabilidade do agente ativo. Pre-ferencialmente, farmacêuticas composições de acordo com a presente in-venção compreendem um veículo estéril não-tóxico e farmaceuticamenteaceitável, tal como salina fisiológica, tampãos não-tóxicos, preservantes esimilares. Para os fins do presente requerimento, uma quantidade farmaceu-ticamente eficaz de uma molécula de ligação da invenção, conjugada ounão-conjugada a um agente terapêutico, deve significar uma quantidade su-ficiente para obter ligação eficaz a um alvo e para obtr um benefício, por e-xemplo, para melhorar sintomas de uma doença ou um distúrbio ou paradetectar uma substância ou uma célula. No caso de células tumorais, o poli-peptídeo preferencialmente será capaz de interagir com antígenos imunorre-ativos selecionados sobre células neoplásicas ou imunorreativas e propor-cionam um aumento na morte destas células. Logicamente, as composiçõesfarmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em doses ú- nicas ou múltiplas proporcionando uma quantidade farmaceuticamente efi-caz do polipeptídeo.

Dentro do âmbito da presente descoberta, os polipeptídeos dainvenção podem ser administrados a um ser humano ou outro animal de a-cordo com os métodos de tratamento supracitados em uma quantidade sufi- ciente para produzir um efeito terapêutico ou profilático. Os polipeptídeos dainvenção podem ser administrados a similar ser humano ou outro animal emuma forma de dosagem convencional preparada combinando a molécula deligação da invenção com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitá-vel convencional de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido poruma pessoa versada na técnica que a forma e a qualidade característica doveículo ou diluente farmaceuticamente aceitável são ditadas pela quantidadede ingrediente ativo com o qual deve ser combinado, a via de administraçãoe outroas variáveis de conhecimento geral. Aqueles versados na técnica re-conhecerão adicionalmente que um coquetel compreendendo uma ou mais espécies de polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode secomprovar particularmente eficaz.XIV. Métodos de Uso

As moléculas da invenção podem ser usadas em circunstânciasonde é desejável usar moléculas scFv estabilizadas ou composições com- preendendo similares moléculas scFv, por exemplo, para fins de diagnósticoou terapêuticos. Modalidades preferenciais da presente invenção proporcio-nam compostos, composições, kits e métodos para o diagnóstico e/ou trata-mento de distúrbios que se beneficiariam de administração de uma moléculade ligação da invenção, por exemplo, distúrbios neoplásicos em um sujeitomamífero que necessite de similar tratamento. Preferencialmente, o sujeito éum ser humano.

Em uma modalidade, as moléculas de ligação em questão po-dem ser usadas em um ensaio para detectar um antígeno tumoral in vitro,por exemplo, usando um ensaio ELISA. Ensaios típicos são conhecidos natécnica, vide, por exemplo, o Requerimnto de Patente dos Estados UnidosNúmero 20040077025.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação em questão sãoúteis para detectar a presença de células portando antígeno tumoral usandotecnologia de setudos por imagens. Para similares aplicações, pode ser de-sejável conjugar a molécula de ligação a uma molécula detectável, por e-xemplo, uma radioetiqueta, conforme descrito adicionalmente abaixo.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação em questão sãoúteis para reduzir ou eliminar células (por exemplo, por apoptose) portandoum epítope (por exemplo, um epítope de Cripto ou um epítope de um mem-bro da família de receptores de TNF, por exemplo, TRAIL-R2 ou LTpR) re-conhecido por uma molécula de ligação da invenção. Em outra modalidade,as moléculas de ligação em questão são eficazes para reduzir a concentra-ção de ou eliminar moléculas alvo solúveis na circulação.

Em outra modalidade, uma molécula de ligação da invençãoreduz o tamanho do tumor, inibe o crescimento do tumor e/ou prolonga otempo de sobrevida de um sujeito portando tumor. Por conseguinte, estainvenção também se refere a um método para tratar tumores em um ser hu-mano ou outro animal administrando a um humano ou animal similar umaquantidade eficaz e não-tóxica de polipeptídeo. Uma pessoa versada na téc-nica seria capaz, por experimentação de rotina, de determinar qual quanti-dade eficaz e não-tóxica de polipeptídeo seria para os fins de tratar maligni-dades. Por exemplo, uma quantidade terapeuticoamente ativa de um poli-peptídeo pode variar de acordo com fatores tais como o estágio da doença(por exemplo, estágio I versus estágio IV), a idade, sexo, complicações mé-dicas (por exemplo, condições ou doenças de imunossupressão) e peso dosujeito, e a capacidade da molécula de ligação para provocar uma reaçãodesejada no sujeito. O regime de dosagem pode ser ajustado proporcionan-do a resposta terapêutica ótima. Por exemplo, várias doses divididas podemser administradas diariamente, ou a dose pode ser reduzida proporcional-mente conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. De modogeral, no entanto, espera-se que uma dosagem eficaz esteja dentro da faixade cerca de 0,05 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal por dia emais preferencialmente a partir de cerca de 0,5 a 10, miligramas por quilo-grama de peso corporal por dia.

Para fins de esclarecimento "mamífero" se refere a qualquer a-nimal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésti-cos e de criação, e animais de zoológico, de competição, ou de estimação,tais como cães, cavalor, gatos, vacas, e etc. Preferencialmente, o mamíferoé humano. "Tratamento" se refere tanto a tratamento terapêutico quanto pro-filático ou medidas preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento in-cluem aqueles já com uma doença ou distúrbio bem como aqueles nos quaisa doença ou distúrbio deve ser evitado. Portanto, o mamífero pode ter sidodiagnosticado como tendo a doença ou distúrbio ou pode ser predisposto oususcetível à doença.

Em geral, as composições descritas podem ser usadas profilati-camente ou terapeuticamente. Por exemplo, um neoplasma compreendendoum marcador que possibilite o direcionamento das células cancerosas pelamolécula de ligação pode ser detectado ou inibido (por exemplo, destruído)usando uma molécula de ligação da invenção. Em uma modalidade prefe-rencial, as moléculas de ligação da invenção são usadas para tratar tumoressólidos. Cânceres típicos que podem ser tratados incluem, mas não estãolimitados a, carcinomas de próstata, gástricos tais como câncer de cólon, depele, de mana, ovariano, pulmonar e pancreático. Em outra modalidade, osanticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar sarcoma deKaposi, neoplasias do sistema nervoso central (hemangioblastomas capila-res, meningiomas e metástases cerebrais), melanoma, sarcomas gastroin-testinal e renal, rabdomiossarcoma, glioblastoma (preferencialmente glio-blastoma multiforme), leiomiossarcoma, retinoblastoma, cistadenocarcinomapapilar do ovário, tumor de Wilms ou carcinoma pulmonar de células peque-nas. Será reconhecido que polipeptídeos apropriados podem ser derivadospara moléculas associadas a tumor relacionadas com cada uma das neopla-sias precedentes sem indevida experimentação em vista da presente descri-ção.

Malignidades hematológicas típicas que são suscetíveis a trata-mento com a invenção revelada incluem Iinfoma de Hodgkins e não-Hodgkins bem como leucemias, incluindo ALL-L3 (leucemia do tipo de Bur-kitt), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemias celulares monocíticas.Será reconhecido que os compostos e métodos da presente invenção sãoparticularmente eficazes para tratar uma variedade de Iinfomas de células B,incluindo Iinfoma não-Hodgkin de baixo grau / folicular (NHL), Iinfoma celular(FCC), Iinfoma de células do manto (MCL), Iinfoma de células grandes difu-sas (DLCL), (SL) NHL linfocítico pequeno, NHL de grau intermediário / folicu-lar, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de alto grau, NHLlinfoblástico de alto grau, NHL de células pequenas não clivadas de altograu, doença maciça de NHL e Macroglobulinemia de Waldenstrom. Deveser evidente para os versados na técnica que estes Iinfomas freqüentementeterão diferentes nomes devido a sistemas de classificação em mudança, eque pacientes tendo Iinfomas classificados sob diferentes nomes tambémpodem se beneficiar dos regimes terapêuticos combinados da presente in-venção. Além dos distúrbios neoplásicos mencionados acima, será reconhe-cido que a invenção revelada pode ser usada vantajosamente para tratarmalignidades adicionais portando moléculas associadas com tumores com-patíveis.

Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção écapaz de ligar especificamente a um antígeno de células tumorais e inibir ocrescimento de células tumorais em um paciente. Em algumas modalidades,as células tumorais são células tumorais do cérebro, cabeça, pescoço, prós-tata, mama, testicular, cólon, pulmão, ovário, bexiga, uterinas, cervicais,pancreáticas e estômago. Em outras modalidades, uma molécula de ligaçãoda invenção liga especificamente ao antígeno de células tumorais e inibe ocrescimento de células tumorais as quais superexpressam o antígeno. Emuma modalidade, as células tumorais são linhagens celulares as quais su-perexpressam o antígeno, tais como linhagens celulares derivadas de cân-ceres do cérebro, mama, testicular, cólon, pulmão, ovário, bexiga, uterino,cervical, pancreático e do estômago.

Em ainda outras modalidades as moléculas de ligação da pre-sente invenção podem ser usadas para tratar distúrbios imunes que incluem,mas não estão limitados a, aspergilose broncopulmonar alérgica; rinite alér-gica; anemia hemolítica auto-imune; Acanthosis nigricans; dermatite de con-tato alérgica; doença de Addison; dermatite atópica; Alopecia areata; Alope-cia universalis; Amiloidose; púrpura anafilactóide; reação anafilactóide; ane-mia aplásica; Angioedema1 hereditário; Angioedema, idiopático; espondiliteanquilosante; Arterite, cranial; Arterite, células gigantes; Arterite, de Takaya-su; Arterite, temporal; Asma; Ataxia-telangiectasia; ooforite auto-imune; or-quite auto-imune; falência poliendócrina auto-imune; doença de Behcet; do-ença de Berger; doença de Buerger; bronquite; pênfigo bolhoso; Candidíase,mucocutânea crônica; síndrome de Caplan; síndrome de enfarte pós-miocardial; síndrome pós-pericardiotomia; Cardite; sprue celíaco; doença deChagas; síndrome de Chediak-Higashi; doença de Churg-Strauss; síndromede Cogan; doença de aglutinina do frio; síndrome de CREST; doença deCrohn; Crioglobulinemia; alveolite fibrosante criptogênica; Dermatite herpeti-fome; Dermatomiosite; Diabetes mellitus; síndrome de Diamond-Blackfan;síndrome de DiGeorge; lúpus eritematoso discóide; fasciite eosinofílica; E-pisclerite; Drythema elevatum diutinum; Eritema marginatum; Eritema multi-forme; Eritema nodoso; febre familial do mediterrâneo; síndrome de Felty;Fibrose pulmonar; Glomerulonefrite, anafilactóide; Glomerulonefrite, auto-imune; Glomerulonefrite, pós-estreptocóccica; Glomerulonefrite, pós-transplantação; Glomerulopatia, membranosa; síndrome de Goodpasture;Granulocitopenia, imunomediada; Granuloma anular; Granulomatose, alérgi-ca; miosite granulomatosa; doença de Grave; tiroidite de Hashimoto; doençahemolítica do recém-nascido; Hemocromatose, idiopática; púrpura de Heno-ch-Schoenlein; Hepatite, crônica ativa e crônica progressiva; Histiocitose X;síndrome hipereosinofílica; purpura trombocitopênica idiopática; síndrome deJob; dermatomiosite juvenil; artrite reumatóide juvenil (artrite crônica juvenil);doença de Kawasaki; Ceratite; Ceratoconjuntivite seca; síndrome de Landry--Guillain-Barre-Strohl; Lepra, lepromatosa; síndrome de Loeffler; lúpus; sín-drome de Lyell; doença de Lyme; granulomatose linfomatóide; Mastocitose,sistêmica; doença do tecido conjuntivo misto; Mononeurite múltipla; síndro-me de Muckle-Wells; síndrome de Iinfonodos mucocutâneos; síndrome delinfonodos mucocutâneos; reticulohistiocitose multicêntrica; esclerose múlti-pla; miastenia gravis; micose fungóide; vasculite necrotizante, sistêmica;síndrome nefrótica; síndrome de sobreposição; Paniculite; hemoglobinúriado resfriado paroxísmico; hemoglobinúria noturna paroxísmica; Penfigóide;Pênfigo; Pênfigo eritematoso; Pênfigo foliaceus; Pênfigo vulgaris; doença do criador de pombos; Pneumonite, hipersensibilidade; Poliarterite nodosa; Po-limialgia reumática; Polimiosite; Polineurite1 idiopática; polineuropatias famili-ares portuguesas; Pré-eclâmpsia / eclâmpsia; cirrose biliar primária; esclero-se sistêmica progressiva (escleroderma); Psoríase; artrite psoriática; protei-nose alveolar pulmonar; fibrose pulmonar, fenômeno / síndrome de Ray- naud; tiroidite de Reidel; síndrome de Reiter, policrondrite relapsante; febrereumática; artrite reumatóide; sarcoidose; esclerite; colangite esclerosante;doença do soro; síndrome de Sezary; síndrome de Sjogren; síndrome deStevens-Johnson; doença de Still; panencefalite esclerosante subaguda;oftalmia simpática; lúpus eritematoso sistêmico; rejeição de transplante; coli- te ulcerativa; doença de tecido conjuntivo indiferenciada; Urticária, crônica;Urticária, resfriado; Uveite; Vitiligo; doença de Weber-Christian; granuloma-tose de Wegener e síndrome de Wiskott-Aldrich.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação da invenção po-dem ser usadas para aplicações de pré-direcionamento. Por exemplo, as mesmas vantagens serão evidentes em aplicações de para iberação de fár-macos quimioterápicos.

Por exemplo, em pré-direcionamento um tumor é pré-direcio-nado com um construto de ligação que tem afinidade para o antígeno asso-ciado ao tumor por um lado e, por exemplo, para um hapteno radiomarcado pelo outro. O hapteno radiomarcado é administrado posteriormente, prefe-rencialmente depois do construto de ligação que tem afinidade para o antí-geno associado ao tumor ter clareado (vide, por exemplo, Boerman et al.2003. J. Nuclear Med. 44:400). Em outro exemplo, um anticorpo o qual énão-tóxico, mas foi derivado para reagir com um fármaco ou pró-farmacoque é tóxico somente quando ligado pela molécula de ligação. Dados os da-dos de biodistribuição nos presentes exemplos, as moléculas de ligação dainvenção são bem adequadas para uso em aplicações de pré-direciona-mento. Em uma modalidade, um agente de clareamento pode ser eliminadoda metodologia de pré-direcionamento usando as presentes moléculas deligação.

Esta invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exem-plos os quais não devem ser considerados como limitantes. Os conteúdosde todas as referências, patentes e Pedidos de patente publicados citadosdo início ao fim deste requerimento são incorporados aqui, a este Pedido depatente, por meio de referência.

EXEMPLOS

Do início ao fim dos exemplos, foram usados os seguintes mate-riais e métodos a menos que determinado de modo diverso.

Materiais e Métodos Gerais

Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos queindicado de modo diverso, técnicas convencionais de química, biofísica, bio-Iogia molecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmen-te, por exemplo, tecnologia de anticorpo), e técnicas de rotina em eletrofore-se. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); AntibodyEngineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCaf-ferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et ai,C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds.Ausubel et ai, John Wiley & Sons (1992).

Construtos de Expressão

Em geral, a menos que indicado de modo diverso, os construtosde expressão para scFvs nos seguintes Exemplos incluíram um peptídeo desinal de Gene Ill de N-terminal bem como um peptídeo de purificação de C-terminal compreendendo as etiquetas Myc e His e um sítio de clivagem deEnteroquinase. Seqüência de DNA para cada peptídeo são determinadasabaixo:

Seqüência de DNA de peptídeo de sinal de Gene Ill de N-terminalATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGT_(SEQ ID NO: 25)

Seqüência de DNA de peptídeo de sinal de Gene Ill de N-terminalMKKLLFAIPLVVPFYSHS (SEQ ID NO: 26)Seqüência de DNA de peptídeo de purificação de C-terminalGACGACGACGACAAAAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO: 27)Seqüência de DNA de peptídeo de purificação de C-terminalDDDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO: 58)

Anticorpos

Anticorpos BIIB usados em alguns Exemplos (BIIB1-BIIB18) sãouma coleção de anticorpos terapêuticos de várias especificidades. Dezesse-te dos 18 anticorpos foram expressados a partir de linhagens de célulasCHO volumosas ou clonais estáveis e 1 dos anticorpos (BIIB13) foi expres-sado usando transfecção transitória em células HEK293E. Todos os 18 anti- corpos contêm cadeias leves kappa. A maioria dos anticorpos foram IgGIhumana; no entanto, BIIB2, BIIB5 e BIIB11 foram lgG4 humana. Dezessetedos 18 anticorpos foram humanos ou humanizados. BIIB15 foi PRIMATI-ZED® (Nakamura et al., 2000). A identidade da linha germinal humana paracada anticorpo foi avaliada por alinhamento CIustaIW (ClustalW WWW Ser-vice at the European Bioinformatics Institute, Thompson et al., 1994) dasseqüências BIIB Vh ou Vk contra as linhas germinais humanas disponíveispublicamente (Lefranc et al., 1999).

Quinze dos 18 anticorpos totais foram da subclasse IgGI e os 3restantes foram lgG4 (BIIB2, BIIB5 e BIIB11). As seqüências CH1 de IgGI elgG4 têm diferenças de 10 aminoácidos (6 são conservativas) e um padrãode ligação dissulfeto alternado com a cadeia leve.

Um construto IgGI e e lgG4 com uma região Fv em duplicataestava disponível para investigar o efeito da subclasse de IgG sobre a esta-bilidade de Fab. Foram criados dois construtos os quais continham a regiãoVh de BIIB7 enxertaa ou a uma região constante de cadeia pesada IgGI oua uma lgG4.

Exemplo 1. Preparação de Proteínas Convencionais BHA10 scFv e Fab

BHA10 scFv foi subclonada a partir do plasmídeo pXWU034,usando a reação de cadeia polimerase (PCR) com iniciadores de oligonucle-otídeos mostrados na Tabela 2 abaixo. O iniciador forward BHA10-01F con-tém um único sítio de endonuclease de restrição Sph I (seqüência sublinha-da) seguido por 18 bases de seqüência complementar ao gene de domíniovariável de cadeia pesada de N-terminal BHA10. O iniciador reverso,BHA10-01R, contém 24 bases de seqüência complementar ao gene de do-mínio variável de cadeia leve de C-terminal BHA10, 15 bases de seqüênciacomplementar a um sítio de enteroquinase, e sítios de endonuclease de res-trição adjacentes Hind Ill e Xba I (sítios de endonuclease são sublinhados).Depois de amplificação por PCR, um produto de PCR correspondente aotamanho esperado foi resolvido por eletroforese por gel agarose, excisado, epurificado usando o kit de extração UItrafree-DA da Millipore de acordo comas instruções do fabricante (Millipore; Bedford, MA). O produto de PCR puri-ficado foi digerido com Sph I, tornado de ponta cega digerindo com DNAPolymerase I na presença de dNTPs1 e em seguida digerido com Hind III. Oproduto de PCR blunt-ended/ digerido com Hind Ill foi ligado a pKJS216 di-gerido por Sca M Hind III. pKJS216 é um vetor de E. colique dirige a expres-são de proteína recombinante sob o controle de um promotor ara C indutível.Uma porção da mistura de ligação foi usada para cepa de E. coli transfor-mada XL1 -Blue. Colônias resistente a fármaco de ampicilina foram tríadas eanálise da seqüência de DNA confirmou a seqüência correta do construtoplEH003 final. Seqüências de DNA e de aminoácidos de BHA10 scFv sãomostradas nas Figuras 1A e 1B, respectivamente.

Tabela 2. Oligonucleotídeos para amplificação por PCR de um BHA10 scFvconvencional.<table>table see original document page 242</column></row><table>

Para expressão de BHA10 scFv, colônias recém isoladas de E.coli cepa W3110 (ATCC, Manassas, Va. Cat. n- 27325) transformadas complasmídeo plEH003 foram cultivadas em 4 χ 250 ml de meio SB (Teknova,Half Moon Bay, Ca. Cat. ns S0140) contendo 50 μς/ιηΙ de carbenicilina emfrascos baffled de 1 L para OD6oo = 0,8, induzidas adicionando a 0,02% dearabinose, e cultivadas de um dia para o outro. Bactérias foram coletadaspor centrifugação. Os péletes foram solubilizados e Iisados usando 40 mL dereagente de extração de proteína B-PER (Cat n2 78243, Pierce). scFv solubi-Iizado foi aplicado a uma coluna de 5 mL de Ni-NTA-SuperfIow (Cat n-30410, Qiagen). scFv ligado foi lavado com 60 mM de imidazol, pH 8,0 e elu-triado com 300 mM de imidazol, pH 8,0. scFv elutriado foi carregado sobreuma coluna de 6 mL de agarose Protein L (Cat ns 20510, Pierce). Proteínaligada foi lavada com salina tamponada com fosfato (PBS) e elutriada com0,1 M de glicina, pH 3,0. scFvs purificadas foram dialisadas contra PBS earmazenadas a -20 2C. As concentrações de proteína foram determinadasusando um E2SOnm = 2,1 ml mg"1 cm"1.

Para preparação enzimática de BHA10 Fab, BHA10 IgG foi mis-turada com 4 μΙ de um estoque de papaína concentrado (0,3 mg/mL, 30 Uni-dades/mg - Cat n- 108014, Roche) em 8,3 ml de solução contendo 2,4mg/mL de BHA10 IgGI, 100 mM de Tris-HCI, 20 mM de EDTA a pH 7.0. Areação foi deixada para prosseguir por 90 minutos a 25 QC. A solução do di-gesto foi diluída a 1:5 com 20 mM de acetato, pH 5.0 e carregada sobre umacoluna de 6 ml SP-Sepharose FF equilibrada com tampão de diluição. A co-luna foi lavada com 2 volumes de coluna de tampão de diluição. FragmentosFab brutos foram elutriados com 30 volumes de coluna de um gradiente li-near de 0 a200 mM de NaCI. Um amplo pico centrando a 140 mM de NaCI(total de -24 mL) foi coletado e continha a maior parte do material de IgGdigerida. O volume elutriado foi reduzido para 2 mL por concentração e car-regado sobre uma coluna de preparativo G300 SW Tosohaas SEC (109 mL)equilibrada com PBS. Fab foi elutriado a 0,8 volumes de coluna sobre 15mL. Fab purificado foi concentrado para entre 2 a 11 mg/mL. As concentra-ções de foram determinadas usando um ε2βο nm = 1,5 mL mg"1 cm"1.

Exemplo 2. Estabilidade Térmica de Moléculas Convencionais BHA10 scFvCalorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi usada para tes-tar se uma BHA10 scFv isolada é intrinsicamente menos estável do que seucomplemento Fab. Foram realizadas varreduras usando um calorímetro de varredura diferencial capilar automatizado (capDSC, MicroCaI1 LLC). Solu-ções de proteína e de referência foram amostradas automaticamente de lâ-minas de 96 cavidades usando a fixação robótica. Antes de cada varreduraprotéica, foram realizadas 2 varreduras com tampão na célula da amostra eusadas para subtração de fundo. Uma única varredura de limpeza foi reali- zada usando 5% de Liquinox depois de cada varredura de proteína. Depoisde cada varredura, o instrumento enxaguou automaticamente tanto as célu-las de referência quanto da amostra três vezes com 2 ml de H2O deionizadadestilada contendo 0,01% de azida de sódio. Foram realizadas varreduras a1 9C/min usando o modo de feedback de meio para reforçada resolução de pico. A faixa de varredura foi de 20 a 95 eC. Todas as lâminas de 96 cavida-des contendo proteína foram armazenadas dentro do instrumento a 6 eC.

A Figura 2 mostra medições por DSC com fragmentos de anti-corpos purificados BHAtO Fab e scFv. Dentro do calorímetro, a temperaturaé aumentada até o Fab ou scFv desdobrar. A temperatura na qual cada pro-teína desdobra (isto é, o valor da TM) pode ser indicativa da estabilidade glo-bal. Todos os quatro domínios do BHA10 Fab (VH, VL, CH1 e CL) desdobramcooperativamente a 78 9C (Figura 2A). O domínio scFv carece dos domíniosCr1 e Cl. Sem este estruturação, os domínios da scFv desdobram em tem-peraturas muito menores do que o Fab e há uma redução significativa na entalpia calorimétrica dos domínios indicando a perda de interações estabili-zante. O domínio Vl desdobra com uma Tm de 68 eC, ao passo que o domí-nio Vh desdobra a 58 9C, 20 9C menos do que o que foi observado para atransição de desdobramento do BHA10 Fab (Figura 2B). Adicionalmente, háuma dependência da taxa de varredura da Tm, sugerindo que está ocorrendoagregação de proteína durante a fase de aquecimento a qual reduz artifici-almente a Tm da scFv à medida que a taxa de varredura é retardada (Sán-chez-Ruiz et al., Biochemistry, 27: 1648-1652, 1988). A baixa estabilidadeaparente e a propensão para agregar podem ser fatores determinantes paraa incapacidade de células CHO para produzir quantidades significativas dematerial estável, não -agregado o qual contém scFvs tais como as molécu-las de anticorpos biespecíficos Hercules convencionais.

Exemplo 3. Construção de Moléculas BHA10 scFv com Aprimorada Estabili-dade Térmica

Sabendo que o domínio BHA10 scFv, conforme evidenciado noExemplo 2, é intrinsicamente instável, foi sugerida a hipótese de que produ-zindo o scFv através do uso de tecnologia de DNA recombinante para pro-duzir um scFv modificado que é termodinamicamente ou funcionalmente e-quivalente a um Fab sob condições de estímulo térmico deve resultar em umdomínio scFv que é útil para construir um anticorpo biespecífico. Além disso,também foi sugerida a hipótese de que produzindo o domínio scFv isoladosozinho deve conferir quaisquer propriedades biofísicas benéficas que são obtidas quando reintroduzido como um componente de uma molécula bies-pecífica inteira. Até o momento, foi iniciado um esforço para melhorar a es-tabilidade biofísica do domínio BHA10 scFv usando um sistema de expres-são de E. coli e melhoras monitoradas na estabilidade medindo ligação dedomínios scFv termicamente resistentes a Iigante em uma prova de ensaiotérmico.

Para estabilizar os domínios scFv foram aplicados dois métodos:

1) introduzir uma ligação dissulfeto entre o domínio Vh e Vl do BHA10 scFv;e 2) otimizando a extensão do (GIy4Ser)n Iigante que conecta os domíniosVHe Vl do BHAIOscFv.

A. Construção de BHA10 scFvs estabilizados por dissulfetoO vetor de expressão bacteriana produtor BHA10 scFv, pl-EH003, foi utilizado como o vetor parental. O kit QuickChange Site-DirectedMutagenesis Kit (Stratagene; La Jolla1 CA) foi usado, de acordo com as ins-truções do fabricante, para introduzir dois resíduos cisteína, um em Vh e umsegundo em Vl que pode participar na formação de uma ligação dissulfetoestabilizante. Pares de iniciadores VH44-F e VH44-R (Tabela 3) foram usa-dos para mutagenizar o resíduo Gly (GGA) na posição 44 (sistema de nume-ração de Kabat) de cadeia pesada variável BHA10 para um resíduo Cys(TGC). O produto de mutagênese foi digerido com enzima sensível a metila-ção Dpn I de acordo com o protocolo do kit e transformado na cepa de E.coli XLIO-GOLD® (Stratagene; La Jolla, CA). Colônias de E coli transforma-das para resistência a fármaco de ampicilina foram tríadas para a mutaçãode seqüência correta por análise de seqüência de DNA. O plasmídeo resul-tante, plEH004, foi utilizado para uma reação subseqüente para mutar o re-síduo Gln (CAG) na posição 100 (sistema de numeração de Kabat) de ca-deia leve variável BHA10 para um resíduo Cys (TGC) usando pares de inici-adores VL100-F e VL100-R (Tabela 3). Iniciadores forward (VH44-F) e re-verso tVH44-R) mutam Gly (GGA) para um Cys (TGC) na posição 44 de Vh(TGC indicado por seqüência sublinhada). Iniciadores forward (VL100-F) ereverso (VL100-R) mutam Gln (CAG) para um Cys (TGC) na posição 100 deVl (TGC indicado por seqüência sublinhaad).

Colônias de E coli XL10-GOLD® transformadas para resistênciaa fármaco de ampicilina foram triadas para a mutação de seqüência corretapor análise de seqüência de DNA e plasmídeo plEH006 foi identificada comocontendo as duplas mutações de cisteína nas posições VH44 e VL100. Se-qüências de DNA e de aminoácidos de VH44/VL100 dissulfeto-estabilizadaBHA10 scFv são mostradas nas Figuras 3A e 3B, respectivamente.

Tabela 3. Oligonucleotídeos para construção de VH44/VL100 dissulfeto-estabilizado BHA10 scFv.<table>table see original document page 246</column></row><table>

Β. Construção de BHA10 scFv com Iiqantes (GIy4Ser)n alternativos

Plasmídeo plEH003 codificando huBHAIO scFv com o (GIy4Ser)3

Iigante convencional foi modificado para conter um (GIy4Ser)4 ou (GIy4Ser)5 Ii-gante por amplificação por PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeosdescritos na Tabela 4.

BHA10 scFv (GIy4Ser)4 foi montado usando um iniciador de PCR5' forward designado pXWU002-F1 e um iniciador de PCR 3' reverso desig-nado XWU002-R. O iniciador de PCR 5' VH XW002-F1 incluiu um sítio deendonuclease de restrição Btg I (seqüência sublinhada) localizado no térmi-no carboxila de BHA10 VH seguido por seqüência codificando um (GIy4Ser)4ligante. O iniciador de PCR 3' VL XW002-R incluiu um sítio Xba I e um sítiode Enteroquinase parcial. As regiões parciais BHA10 VH + (GIy4Ser)4 ligante+ as BHA10 VL foram amplificadas em uma reação de PCR usando a sériede iniciadores de PCR XW002-F1/ XW002-R do DNA de plasmídeo plEH003(descritas no Exemplo 1). O fragmento genético BHA10 scFv- (GIy4Ser)4 li-gante parcial correspondente ao tamanho esperado foi resolvido por eletrofo-rese de gel agarose, excisado, e purificado usando o kit de extração Ultra-free-DA da Millipore de acordo com as instruções do fabricante (Millipore;Bedford, MA). O produto de PCR purificado foi digerido e clonado no vetorplEH003 digerido por Btg MXba I resultando no plasmídeo pXWU002 codifi-cando BHA10 scFv contendo um (GIy4Ser)4 ligante. BHA10 scFv contendo o(GIy4Ser)5 ligante foi construído em modo similar usando iniciadores de PCRXW003-F e XW002-R para produzir o plasmídeo pXWU003. O iniciador dePCR 5' forward (XWU003-F) continha um sítio Btg I (seqüência sublinhada)seguido por seqüência codificando uns poucos aminoácidos do término car-boxila de BHA10 VH e seqüência codificando um (GIy4Ser)5 Iigante parcial.Seqüências corretas foram confirmadas por análise de seqüência de DNA.Seqüências de DNA e de aminoácidos de BHA10 scFv contendo o(GIy4Ser)4 Iigante são mostradas na Figuras 4A e 4B, respectivamente. Se-qüências de DNA e de aminoácidos de BHA10 scFv contendo o (GIy4Ser)5Iigante são mostradas nas Figuras 5A e 5B, respectivamente.

Tabela 4. Oligonucleotídeos para construção de BHA10 scFv com Iigantes(GIy4Ser)4 ou (GIy4Ser)5.

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Exemplo 4. Caracterização de Moléculas BHA10 scFv com Aprimorada Es-tabilidade Térmica

A. Expressão e Análise Western blot de BHA10 scFvs Engenheirados

Para expressão de BHA10 scFvs engenheirados, a cepa de E.coli W3110 (ATCC, Manassas, Va. Cat. n- 27325) foi transformada complasmídeos plEH003, pXWU002, pXWU003 e plEH006 e colônias resisten-tes a ampicilina selecionadas e cultivadas em 10 ml de meio SB (Teknova,Half Moon Bay, Ca. Cat. n- S0140) contendo 50 μg/ml de carbenicilina emum tubo de centrífuga cônico de 50 ml para OD6oo ξ 0,8, foram induzidasadicionando a 0,02% arabinose, e cultivadas de um dia para o outro. Bacté-rias foram coletadas por centrifugação e os péletes foram ressuspensos emvolume a 1/20 de uma solução gelada iso-osmótica de 50 mM de Tris-HCI,pH 8.0, 1 mM de EDTA1 e 20% de sucrose (peso/ vol) e esfriado sobre gelo.Volume igual de 50 mM de Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM de EDTA, e 20% de su-crose (peso/ vol) contendo 2 mg/ml de Lysozyme (Sigma) foi adicionado àsuspensão bacteriana e incubada sobre gelo com mistura ocasional por 10minutos. A suspensão bacteriana foi centrifugada por 10 minutos a 8000 χ g,4 °C e a fração periplásmica foi retida.

As amostras foram misturadas com tampão de amostra nativa ou tampão de amostra contendo o agente redutor ditiotreitol e aquecido a90°C por 3 minutos. Amostras reduzidas e não reduzidas foram eletrofore-sadas sobre um gel de Tris-glicina poliacrilamida SDS-PAGE e transferidoeletroforeticamente sobre uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen, LifeTechnologies, Carlsbad, CA). A membrana foi bloqueada com PBS contendo5% (peso/ vol) de leite sem gordura e 0,1% de Triton X-100 e incubada comum anticorpo kappa anti-humano (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).A membrana foi lavada e em seguida incubada com um anticorpo HRP anti-coelho (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Complexos imunes foramdetectados usando o sistema de análise Western Blotting ECL de acordocom o fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Foi visto que um dos três pares de dissulfeto testados, isto é,Vh44:Vl100, produziram quantidades adequadas de proteína quando ex-pressadas em E. coli (Figura 6, alameda 2). (Os dissulfetos Vh 44:Vl 105 eVh 106:Vl43 testadas não produziram tanto scFv intacto). Similarmente, pro- Iongando a extensão do (GIy4Ser)n Iigante para η = 4 (alameda 3) ou η = 5(não mostrado) também produziu quantidades adequadas de proteína em E.coli. Combinando tanto as modificações VH44:VL100 e (GIy4Ser)4 Iigante emBHA10 scFv usando os métodos decritos no Exemplo 3 também levou aquantidades adequadas de proteína expressada (Figura 6, alameda 4). Se-qüências de DNA e de aminoácidos de BHA10 scFv contendo a combinaçãode modificações VH44:VL100 e (GIy4Ser)4 Iigante são mostradas nas Figuras7A e 7B, respectivamente. Em ambos os casos onde o BHA10 scFv contémas mutações VH44:VL100, foi visto que os scFvs migram com aumentadamobilidade no gel de poliacrilamida desnaturante, não-redutor, ainda migra-ram similarmente a BHA10 scFv convencional sob condições desnaturantes,redutoras (Figura 6, alamedas 2 e 4). Esta análise sugere que as variantesde BHA10 scFv contendo as mutações VH44:VL100 provavelmente formamligações dissulfeto intactas e talvez obtendo uma estrutura mais compacta.

B. Prova de desnaturação térmica.

As atividades dos BHA10 scFvs convencionais e engenheiradosforam então comparadas em uma prova de ensaio térmico a qual pode ser usada para determinar a temperatura na qual 50% das moléculas scFv re-tém sua atividade de ligação antigênia depois de um evento de estímulotérmico. O valor numérico correspondente a esta temperatura é referido co-mo o valor "T50" e as unidades são em 0C. Neste ensaio, os scFvs foramsubmetidos a uma faixa de temperaturas que engloba a temperatura detransição térmica de BHA10 scFv convencional.

A cepa de E. co//'W3110 (ATCC, Manassas, Va. Cat. n- 27325)foi transformada com plasmídeos codificando os BHA10 scFvs convencio-nais e engenheirados sob o controle de um promotor ara C indutível. Trans-formantes foram cultivados de um dia para o outro em meio de expressãoconsistindo em SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. n- S0140) suplemen-tado com 1% de glicina, 1% de Triton X100, 0,02% de arabinose, e 50 μg/mlde carbenicilina ou em 37°C ou em 32°C. Bactérias foram peletizadas porcentrifugação e os sobrenadantes foram colhidos para tratamento adicional.Incluindo glicina e Triton X-100 no meio resulta na liberação de conteúdosperiplásmicos (proteína de E. coli nativa e scFv) no meio (Yang et al. Appliede Enviromental Microbiology. (1998) 64:2869-2874). A presença de proteínasde E. coli no sobrenadante é essencial para a performance deste ensaioporque as proteínas termicamente desnaturadas agem como um "sorvedou-ro", capturando moléculas scFv desdobradas transitoriamente em agregados inativos irreversíveis.

Cada biblioteca foi triada em duplicata usando uma prova deensaio térmico com sobrenadante de uma replicata submetido a condiçõesde tratamento e o segundo sobrenadante servindo como referência não-tratada. Provas de desnaturação térmica podem ser realizadas em uma úni-ca temperatura ou faixa de temperaturas para medir a estabilidade. Máqui-nas Thermocycler capazes de gerar gradientes térmicos estáveis foram usa- dos para tratar sobrenadantes da amostra (iCycler, Bio-Rad1 Gaithersburg,Md).

A temperatura de estímulo variou dependendo das propriedadesdo variante de BHA10 scFv parental e foi geralmente dois a três graus Celsi-us maior do que o valor T50 determinado experimentalmente. Lâminas Fro-zen Master foram degeladas e usadas para inocular lâminas de microtítulode cavidades profundas contendo 250 μΙ de meio de expressão por cavida-de, e culturas cultivadas de um dia para o outro a 32°C. Como um controle,culturas contendo o plasmídeo parental foram cultivadas sob as mesmascondições e processadas simultaneamente à biblioteca. Bactérias foram pe- Ietizadas e alíquotas de 50 a 100 μΙ de sobrenadante de ensaio foram colo-cadas ou tubos de faixa de PCR (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat.η2 N801-535) ou lâminas de 96 cavidades (Applied Biosystems, Foster City,Ca, Cat. ns N801-560) e as amostras foram aquecidas por 60 a 90 minutos.As amostras foram transferidas para lâminas de 96 cavidades de fundo em ν (Corning, Corning, NY, Cat. n2 3357) e centrifugadas em uma centrífuga clí-nica refrigerada (1EC modelo 8R, Thermo Electron, Waltham, Ma) por 30 mi-nutos, e 100 μΙ do sobrenadante foi transferido para lâminas de microtítulode rotina (Corning, Corning, NY, Cat. n2 3357). Uma alíquota do sobrena-dante foi reservada para o DELFIA de referência. Para a maioria das biblio- tecas, as lâminas contendo o restante dos sobrenadantes foram vedados(Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat n2 235205) e colocados em um incubadorajustado para a temperatura de estímulo apropriada (Echo Therm, TorreyPines Scientific, San Marcos, Ca) por 90 minutos. Para traiagens requerendomúltiplas temperaturas de estímulo (ou para temperaturas acima de de 75°C) os sobrenadantes foram transferidos para lâminas de PCR de 96 ca-vidades (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat. η2 N801 -560) e incuba-das por 90 minutos na temperatura desejada.Depois de estímulo térmico, as amostras foram centrifugadas a2.000 RPM para remover o material agregado. Amostras de BHA10 scFvsolúveis remanescentes no sobrenadante clareado e tratado foram avaliadaspara ligação a antígeno LTpR Ig cognato por prova DELFIA. Lâminas de 96cavidades (MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY1 Cat. n- 437111) foramrevestidas com proteína de fusão consistindo no ectodomínio do LTp recep-tor (LTpR) fundido a uma região Fc humana a 1 μg/ml em 0,1 M de tampãode carbonato de sódio, pH 9.5. As lâminas foram revestidas de um dia parao outro a 4°C, e bloqueadas com tampão de prova DELFIA (DAB, 10 mM deTris HCI, 150 mM de NaCI, 20 μΜ de EDTA, 0,5 % de BSA1 0,02% de Tween20, 0,01% de NaN3, pH 7.4) por uma hora com agitação em temperaturaambiente. As lâminas foram lavadas 3 vezes com DAB sem BSA (tampão delavagem), e amostras de ensaio diluídas em DAB foram adicionadas às lâ-minas em um volume final de 100 μΙ. As lâminas foram incubadas por umahora com agitação em temperatura ambiente, e em seguida lavadas 3 vezescom tampão de lavagem para remover moléculas scFv não ligadas e funcio-nalmente inativadas. BHA10 scFv ligado foi detectado por adição de 100 μΙpor cavidade de DAB contendo 40 ng/ml de anticorpo anti-His6 marcadocom-Eu (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. n2 AD0109) e incubado em tempe-fatura ambiente com agitação por uma hora. As lâminas foram lavadas 3vezes com tampão de lavagem, e 100 μΙ de solução de reforço DELFIA(Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. n2 4001-0010) foi adicionado por cavidade.Depois de incubação por 15 minutos, as lâminas foram lidas usando o méto-do do Európio sobre um Victor 2 (Perkin Elmer, Boston, MA).

Dados de ensaio foram processados usando o software Spotfire

DecisionSite (Spotfire, Somerville, Ma.) e expressados como a proporçãodas contagens DELFIA observadas em temperatura de estímulo para a tem-peratura de referência para cada clone. Clones que deram reprodutivelmenteproporções maiores do que ou iguais a duas vezes a que foi observada parao plasmídeo parental foram considerados alcences. DNAs de plasmídeosdestes clones positivos foram isolados por mini-prep (Wizard Plus, Promega,Madison, Wl) e retransformados de volta em E. coli W3110 para provas deensaio térmico secundário de confirmação.

Para gradientes térmicos, os dados foram analisados usando osoftware Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, Ca) usando uma reaçãode dose sigmóide com inclinação variável como o modelo. Os valores obti-dos para o ponto central das curvas de desnaturação térmica são referidoscomo valores de T50, e não são considerados como sendo equivalentes avalores de Tm biofisicamente derivados.

Os resultados da prova de ensaio térmico são representados naFigura 8. Conforme representado na Figura 8, todas as moléculas scFv es-tabilizadas da invenção resultaram em aprimoramentos na atividade de liga-ção (T5o > 49°C) comparadas com a scFv convencional. Em particular, osvalores de T50 de BHA10 posição de biblioteca VL46 scFv (S46L), posição debiblioteca VH16 scFv (S16E e S16Q), e posições de biblioteca VL49: VL50scFv apresentaram aumentos na estabilidade térmica variando de + 3°C a +12°C em relação ao BHA10 scFv convencional. Além disso, os valores deT50 de BHA10 posição de biblioteca VL3 scFv (Q3A, Q3G, Q3S, Q3V, eQ3D), posição de biblioteca VH67 scFv (V67I e V67L), posição de bibliotecaVh48 scFv (M48I e M48G), posição de biblioteca VH20 scFv (V20I) e posiçãode biblioteca Vh101 scFv (P101D) apresentaram aumentos na estabilidadetérmica variando de + 4° C a + 18°C em relação ao BHA10 scFv convencio-nal. Uma das mutações estabilizantes (VL K13E) acidentalmente resultou deum erro de PCR. Foi visto que a incorporação de uma destas mutações es-tabilizantes em plEH009 aumenta adicionalmente a estabilidade térmica emesmo excede a de BHA10 Fab sob estas condições. De modo importante,a Vl46 não-covalente, mutação VH101, e mutações VH55 derivadas de umou mais dos quatro métodos de criação (modelagem por homologia da inter-face VL/VH, classificação de consenso, modelagem computacional, e análisede covariação) resultaram em um aprimoramento na estabilidade térmica descFv quase se aproximando daquela observada com as mutações dissulfetoe validando a utilidade e inovação destas ferramentas de criação. Em parti-cular, a T50 do construto ρΙΕΗΟΟβ, BHA10 VH44:VL100 scFv (59°C), diferiude BHA10 Fab (62°C) por somente 3 0C, ao passo que foi visto que o cons-truto ρΙΕΗ009, ΒΗΑ10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 ligante, e funcionalmenteequivalente a BHA10 Fab sob estas condições. Estes resultados demons-tram que as scFvs estabilizadas da invenção têm atividade aprimorada de-pois de um evento de estímulo térmico.

c. Medições de Afinidade

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi usada para medir aafinidade de sLTpR para o BHA10 Fab derivado usando clivagem enzimáticada molécula BHA10 IgGI. sLTpR foi preparado conforme descrito previa-mente (Eldredge et ai, Biochemistry, (2006)). O Fab e sLTpR foram concen-trados para 6,0 e 2,0 mg/mL, respectivamente, usando dispositivos de filtrode ultracentrífuga Amicon (MWCO 10.000). As soluções de estoque concen-tradas foram simultaneamente dialisadas contra PBS antes das mediçõespor ITC. Foi realizada ITC em uma unidade VP-ITC (MicroCaI LLC, Nor-thampton, MA) ajustada para 30 9C. Aproximadamente 500 μ!_ de uma solu-ção a 7 μΜ de sLTpR foi colocada na célula da amostra e dialisado de PBSfoi colocado na célula de referência. Um total de 234 μΙ_ de BHA10 Fab a 70μΜ foi titulado para a célula da amostra em 7 χ 10 μΙ_, 12 χ 7 μΙ_, seguido por8 χ injeções de 10 μΙ_. A estequiometria da reação foi 1:1. Curvas de ITCforam analisadas usando o programa Origin Software fornecido pelo fabri-cante.

Medições K0 de preparações de BHA10 scFv convencional,BHA10 (GIy4Ser)4 scFv, e BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv conformedescrito nos Exemplos 3 e expressadas e purificadas usando os métodosdescritos no Exemplo 1 foram realizadas usando ressonância de plasmonsuperficial (SPR) em um instrumento Biacore 3000 (Biacore Inc., Piscata-way, NJ). Todos os experimentos foram realizados em tampão de HBS-EP,pH 7.4. Anticorpo PENTA-His biotinilado (20 μg/mL, Cat n2 34440, Qiagen)foi imobilizado sobre um chip CM5 revestido com estreptavidina em uma ta-xa de fluxo de 10 μΙ/min por aproximadamente 1 minuto. Soluções de ensaioa 0,1 μΜ de scFvs foram injetadas sobre o chip em uma taxa de fluxo de 5μΙ/min por 10 minutos e capturadas sobre a superfície através do anticorpoPENTA-His imobilizado. Para investigar ligação entre sLTpR e scFv captura-do, uma série de concentração de sLTpR (1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, e 200 nM)foi duplamente injetada em uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min sobre a superfícierevestida com scFv. O fundo foi subtraído dos sensorgramas da amostra deensaio usando dados de sensorgrama de uma célula de fluxo contendo tam-pão somente e dados de sensorgrama da superfície PENTA-His onde scFvfoi injetado seguido por uma injeção de tampão ao invés de sLTpR. As cur-vas foram analisadas usando o software de instruções do BiaEvaI 3.0. Valo-res de Kd foram calculados ajustando as curvas de associação e dissociaçãocinética poara um modelo de ligação de Langmuir a 1:1. As superfícies doschips foram regeneradas por duas injeções de 10 μί consecutivas de 0,1 Mde glicina, pH 3.0.

A Tabela 5 mostra os resultados da prova de afinidade Biacore.A afinidade de ligação de BHA10 scFv produzido de modo recombinante éessencialmente a mesmo que o BHA10 Fab preparado conforme descrito no Exemplo 1. Adicionalmente, introdução do (G4S)4 Iigante somente ou na pre-sença do dissulfeto (VH44:VL100) estabilizante, ou a combinação dos doisnão resultou em qualquer perda de afinidade significativa para o antígeno.

Tabela 5. Prova de afinidade Biacore -ligação a LTpR.

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*Medido por calorimetria de titulação isotérmica

D. Estudos de Calorimetria de Varredura Diferencial

Análises por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foramrealizadas com preparações de BHA10 scFv, BHA10 (GIy4Ser)4 scFv, eΒΗΑ10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv. Os experimentos foram realizados con-forme descrito acima para as comparações iniciais do scFv convencionalcontra o Fab produzido enzimaticamente exceto que fora realizados em umataxa de varredura de 4 9C/min. BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv demons- trou propriedades superiores de termoestabilidade comparado com o scFvselvagem. Em particular, o menos estável dos dois domínios, o domínio Vhde BHA10 VH44:VL1 OOZ(GIy4Ser)4 scFv, desnaturou em aproximadamente 5gC acima da de BHA10 scFv convencional (Figura 9). Aumentos na "tempe-ratura de fusão" ou Tm podem ser devido a dois fatores separados, (i) umaumento na termoestabilidade do estado de equilíbrio dobrado ou (ii) umatendência reduzida para agregar. A diferença de temperatura - 5 2C entre oBHA10 scFv convencional e BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv foi relati-vamente independente da taxa de varredura (entre 0,2 e 4,0 9C/min) suge-rindo a mudança de Tm observada foi devida a estabilização do estado de equilíbrio dobrado.

E. Estudos de Ligação de ANS

A capacidade para ligar o corante fluorescente hidrofóbico sulfo-nato de 1-anilino-8-naftalina (ANS) é freqüentemente um marco de intera-ções com regiões hidrofóbicas significativamente maiores ou em um estadonativo da proteína ou em um estado parcialmente desdobrado que pode o-correr em tratamento com temperatura aumentada. A fluorescência intrínsicado corante é enxtinta em solvente e significativamente aumenta quando ex-posta a grandes áreas superficiais hidrofóbicas. O BHA10 scFv convencionalintrinsicamente liga ANS em um nível muito mais forte do que o BHA10(GIy4Ser)4 scFv, ou BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv indicando a presen-ça de exposição hidrofóbica forçada no scFv por um Iigante de tamanho ina-dequado. A adição do Iigante mais longo, especificamente (GIy4Ser)4, pare-ceu mediar este efeito. A exposição aparente de uma superfície hidrofóbicapelo BHA10 scFv convencional pode levar a um nível aumentado de agrega- ção na presença de outras proteínas ou moléculas, ou mesmo na presençado próprio em isolamento. Aquecendo BHA10 scFv acima de sua Tm pare-ceu induzir ligação de ANS para os BHA10 scFvs convencionais e engenhei-rados. De modo interessante, o BHA10 scFv convencional mostrou um au-mento gradual na ligação de ANS1 como uma função de temperatura cres-cente, sugerindo possíveis aumentos na exposição hidrofóbica em tempera-turas abaixo da Tm - tais como temperaturas usadas em cultura de célulasbacterianas e de mamíferos (isto é, 37 9C) (Figura 10). Em contraste, tantoBHA10 (GIy4Ser)4 e BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFvs não apresentamesta propriedade sugerindo que as mutações estabilizantes descritas nestainvenção reduzem a tendênciar para auto-associar ou associar com outroscomponentes protéicos da cultura celular com base em reduzida exposiçãode áreas superficiais hidrofóbicas.

Exemplo 5. Identificação de Mutações Estabilizantes as quais conferem A-primorada Estabilidade Protéica Intrínseca

(i) Identificação de Mutações Estabilizantes

Uma variedade de métodos à base de seqüência (por exemplo,classificação de consenso, análise de covariação, modelagem por homologiade interface VH/VL) foram usadas para identificar mutações estabilizantes asquais conferiram aprimorada estabilidade protéica a moléculas de ligação deinteresse. Estas mutações estabilizantes foram usadas na criação e constru-ção de bibliotecas de expressão de região variável de anticorpo.

A. Análise de covariação

Uma série de projetos foram desenvolvidos para estabilizar osdomínios VH e Vl de BHA10 scFv com base na forte covariação exibida pordois ou mais resíduos dentro de uma única seqüência. Foi realizada análisede covariação sobre os domínios VH e Vl de BHA10 scFv usando métodossimilares aos descritos no Exemplo 17 abaixo de modo a identificar covaria-ções ausentes ou violativas de tal modo que mutações estabilizantes pos-sam ser previstas e incluídas em uma biblioteca de expressão de região va-riável de anticorpo para triagem experimental.

Em um primeiro exemplo, mutação de Ser para Leu na posição46 (S46L; sistema de numeração de Kabat) dentro da Vl de BHA10 exibiuuma conexão positiva com um Tyr existente no resíduo 36 o qual a Ferra-menta de Análise de Covariação mostrou que covaria fortemente com Leu46 (vide a Figura 78). Esta mutação também foi prevista como sendo estabi-Iizante por análise de freqüência de resíduos.

Além de S46L, uma segunda mutação prevista por covariaçãocomo sendo estabilizante foi uma mutação V55G dentro do domínio Vh de BHA10. Apesar da freqüência de resíduo ter indicado que Val é observadoinfreqüentemente nesta posição, esta posição é embutida dentro de CDR2 eé variável. Portanto, sem informação adicional, não foram tentadas previa-mente alterações nesta posição. Na inspeção por análise de covariação, noentanto, os dados de covariação sugeriram que esta posição foi fortementecorrelacionada com no mínimo 10 aminoácidos diferentes que já existemdentro do domínio Vh de BHA10. Mutação para Gly na posição 55 satisfeztodas as 10 covariações.

Outro exemplo da utilidade da Ferramenta de Análise de Cova-riação foi o efeito negativo previsto de uma mutação Q6E de Vh de BHA10.Análise de freqüência de resíduo único sugeriu que mutação para o Glu mui-to mais comumente observado nesta posição levaria a um aumento em es-tabilidade. No entanto, a Ferramenta de Análise de Covariação indicou quemutação única para Glu viola várias covariações existentes presentes dentroda seqüência Vh de BHA10. Para obter um aprimoramento na estabilidade,deve-se substituir vários aminoácidos que preferencialmente estabilizam Glunesta posição.

Ainda, outro exemplo do valor preditivo da Ferramenta de Análi-se de Covariação é mostrado na Figura 79. Met 80 foi mutada para Leu co-mo parte de um projeto de biblioteca de resíduo único. Imaginava-se queesta única mutação seria altamente estabilizante, uma vez que Leu é o ami-noácido mais freqüente observado nesta posição dentro do banco de dadosde seqüências. No entanto, análises de covariação indicam que dois outrosaminoácidos devem ser mutados (V67F e T70S) de modo a obter harmoniade covariação.

B. Classificação de Consenso

Classificação de Consenso foi utilizada como um método paraidentificar resíduos aminoácidos dentro das regiões Vh e Vl de scFv paramutagênese para aumentar a estabilidade intrínseca da scFv. A classifica-ção avalia a tendência relativa de seqüências Vh e Vk de consenso devido amutações hipersomáticas e variações de linhas germinais evolucionárias.Informação derivada desta análise foi então usada para projetar uma biblio-teca para triagem para variantes de scFv com aprimorada estabilidade.

A série de referência de seqüências Vh e Vk kappa de mamíferousadas para derivar a seqüência de consenso para classificação e as fre-qüências de aminoácidos individuais em cada posição de resíduo foramcompiladas, classificadas, e selecionadas conforme descrito previamente (Demarest, et al., J. Moi Biol. 335, 41-48 (2004); Demarest, et al., ProteinEng. Des. Sei In Press, (2006). As séries de referência de mamífero foramconstruídas de forma simples (naively) para incluir V-genes de vários mamí-feros de modo a obter diversidade através da tendência evolucionária entreespécies. A série de referência de Vh de mamífero contém 61 seqüências Vhessencialmente de NCBI e TIGR representando um total de 17 espécies demamíferos diferentes. A série de referência de Vk de mamífero contém 53seqüências Vk de 13 espécies de mamíferos diferentes.

Análises estatísticas das Vh e Vl de BHA10 foram realizadasusando bancos de dados de IgG designados usuais e um script PERL modi- ficado (Demarest et ai, 2004; Demarest et ai, 2006). A freqüência de ami-noácidos de cada resíduo dentro das Vh e Vl de BHA10 foi calculada a partirdo banco de dados usual. A freqüência de resíduos de cada aminoácidodentro da VH e VL de BHA10, Sj(r), para cada posição, /', em uma seqüênciaindividual foi calculada pelo número de vezes que um tipo de resíduo em particular (r = A,C,D...V,W,Y) é observado dentro da série de dados divididapelo número total de seqüências. A Figura 11 mostra as freqüências de resí-duos de Vh e Vl de BHA10 dividida pela freqüência de resíduos dos resíduosde consenso do banco de dados. Dividindo pela freqüência de resíduos deconsenso, um corte estringente para a criação de bibliotecas em posições de resíduos onde o aminoácido BHA10 é raramente observado entre seqüên-cias de Vh ou Vl comuns é obtido. Posições de bibliotecas foram determina-das por aquelas cuja freqüência de resíduo dividida pela freqüência de resí-duo mais freqüente (Si(r)/MFRi(r)) foi < 0,3. Os resíduos listados à direita doscálculos de freqüência de resíduo são aqueles encontrados comumente emseqüências humanas conforme publicado (Chothia, et ai, J. MoL Biol. 278,457-479, (1998)) e podem ser especificamente direcionados em um formato de biblioteca para triagem para o aminoácido mais estabilizante. As CDRsdas Vh e Vl de BHA10 não foram consideradas para otimização de estabili-dade devido à potencial interrupção da interação com LTpR, mas pode serconsiderada para projetos de segunda geração.C. Modelagem por Homoloqia de Interface VH/VL

Conforme descritas no Exemplo 15 abaixo, análises de calori-metria de varredura diferencial foram realizadas sobre 17 anticorpos huma-nos. Os candidatos superiores, BIIB1-4 tinham todos excelentes proprieda-des de estabilidade (isto é, muito elevada e desejada) . Estes anticorpos al-tamente estáveis podem ser usados como uma plataforma para aumentar a estabilidade de scFvs ou domínios de anticorpos com baixa estabilidade in-trínseca. Em particular, foi posta ênfase sobre a interface entre Vh e Vl pro-porcionando um nível potencialmente maior de propriedades de estabilidade.

Convertendo o Fab de BHA10 para um formato de scFv resultouem uma alteração no termograma por DSC indicativa de um evento de des-dobramento totalmente cooperativo, conforme observado por uma únicatransição de desdobramento de temperatura maior (Fab), para um evento dedesdobramento largamente não cooperativo, conforme observado por fuástransições de desdobramento de temperatura menores individuais (scFv).Em outras palavras, no formato Fab, os contatos do interdomínio foram sufi- cientemente fortes para prender todos os domínios juntos em uma únicatransição de desdobramento de temperatura maior. Assim que os domíniosCh1 e Cl foram removidos, os domínios VH e Vl da scFv não tiveram mais acapacidade de orientar a transição de desdobramento em um evento coope-rativo. É postulado que ao estabilizar a interface, pode-se não somente es- tabilizar ambos os domínios VH e Vl simultaneamente, mas também promo-ver a aderência da interface VH/VL e impedir agregação.

Os 4 anticorpos superiores BIIB mais estáveis (BIIB1-4) foramusados para projetar mutações estabilizantes na scFv de BHA10 através deum procedimento de duas etapas. Primeiro, uma estrutura de cristal do Fabde ΒΗΑ1Ό humanizado foi utilizada para análise estrutural. Especificamente,a estrutura de cristal foi empregada para identificar todos os resíduos na in-terface entre Vh e Vl bem como a quantidade de área superficial que cadaresíduo contribu para a interface (usando o software MOLMOL). Os resíduosque encobrem significativamente mais área superficial do que outros na in-terface são considerados como sendo mais cruciais para a interface. Comouma priorização de limite arbitrário, aqueles que encobrem entre 30 e 40 À2são considerados importantes. Aqueles que encobrem >40 Â2 são conside-rados cruciais. A estas duas categorias foi dada a maior prioridade em ter-mos de modelagem por homologia e mutagênese. A quantidade de área su-perficial que cada resíduo encobre na interface é listada na Tabela 6. Emsegundo lugar, os tipos de aminoácidos na interface entre Vh e Vl foramcomparados com os aminoácidos que existem nas mesmas posições emBIIB1-4 (isto é os anticorpos extremamente estáveis). Este método possibili-tou identificação de uma série de mutações importantes para estabilizar ascFvde BHA10.

Duas mutações, S46L na Vl e P101D na Vh foram validadasexperimentalmente conforme descrito no Exemplo 8. De fato, estas duasmutações foram as mutações estabilizantes únicas máximas testadas naprova de ensaio térmico (por exemplo, vide a Figura 50A). Ambas as muta-ções estabilizam ambos os domínios VH e Vl simultaneamente, sugerindoque ajudam a construir cooperatividade entre os domínios.

Tabela 6. Análise da Área Superficial VhVl de BHA10.

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(Posições de resíduos marcadas com '*' indicam boas oportunidades paradesign de estabilidade - através de mutação para resíduos encontrados emBIIB1,2,3, ou 4).

D. Análise Computacional

Métodos computacionais foram usados para analisar BHA10para fazer recomendações sobre posições por meio do qual substituições deaminoácidos podem aumentar a estabilidade. Estes métodos foram compos-tos de duas etapas: análise à base de seqüência (etapa 1); e análise à basede estrutura (etapa 2). Durante a primeira etapa, foi usado um banco de da-dos de seqüências de domínios variáveis de anticorpos. Aminoácidos pre-sentes em baixas freqüências em suas posições respectivas (menos do queem 10% das seqüências do banco de dados) ou aqueles que não combinamo aminoácido de consenso correspondente foram selecionados para substi-tuições para aminoácidos de alta freqüência ou de consenso (mutaçõescandidatas). Durante a segunda etapa uma estrutura tridimensional ou mo-delo de um fragmento Fab do anticorpo foi usado. As mutações candidatasforam avaliadas em seu contexto estrutural e foram priorizadas para provaexperimental com base em propriedades estruturais, compatibilidade comregiões determinantes de complementaridade (CDRs) conformações, papelno tamponamento (packing) da interface VL/VH, e dobramento de cadeiaspesadas e leves.

BHA10 é incomum em tendo uma serina na posição 46 sobre acadeia leve. No banco de dados, aproximadamente 1% das seqüências VL(subtipo kappa) possuem S46, ao passo que aproximadamente 79% dasseqüências VL (subtipo kappa) têm L46. Além disso, KV1 de consenso hu-mano tem L46. Uma vez identificado como uma mutação candidata, a substi-tuição S46L foi avaliada no contexto de um modelo tridimensional de Fab deBHA10. Foi visto que a posição 46 está presente na interface Vl/Vh fazendocontatos com Y101 e W103 de VH e Y36 e Y55 de VL. Análise à base de es- trutura revelou que substituição S46L foi compatível com a integridade dainterface Vl/Vh, conformações de CDR, e dobramento de VL.

Serina é um aminoácido infreqüente na posição 16 da cadeiapesada. No banco de dados, aproximadamente 5% das seqüências VH pos-suem S16, 25% têm A16, 21% têm G16, 11% têm E16, e aproximadamente10% são Q16. Também HV1 de consenso humana tem A16. Uma vez identi-ficadas como mutações candidatas, as substituições S16A, G, E, e Q foramavaliadas no contexto de modelo tridimensional de Fab de BHA10. Foi vistoque a posição 16 está presente na alça proximal à interface VH/CH1 fazendocontatos com K13 e S16 de VH. Análise à base de estrutura revelou que as substituições S16A, G, E, e Q foram compatíveis com a integridade da inter-face Vl/Vh, conformações de CDR, e dobramento de VH. Também foi conclu-ído que seriam preferenciais cadeias laterais hidrofílicas longas de E16 eQ16. Por conseguinte, as posições Vl 46 e Vh 16 foram representadas nacriação da biblioteca.

Uma abordagem complementar a análise computacional fez usode técnicas de engenharia de proteína à base de estrutura, tais como Roset-ta (Kuhlman B. et al., PNAS 200198(19): 10687-91) e DEEK (Hanf K.J.,Ph.D. Thesis, MIT, 2002). Dada uma estrutura tridimensional de uma interfa-ce protéica, estes métodos podem produzir mutações em seqüência de ami- noácidos que levam a aprimoradas AAG para ligação de VH a VL (diferençaentre estados ligado e não ligado) e/ou AAG para dobramento de VH e VL(diferença entre estados dobrado e desdobrado de referência). O uso destesmétodos revelaram que S46L é uma mutação que aumenta a ligação de VHa VL, ao passo que S16E é uma mutação que aumenta o dobramento daVH.

E. Abordagens de Desiqn de Interface e Covariacão Combinadas

Análise de covariação foi usada para determinar redes de resí-duos importantes para proporcionar e suportar a interface entre VH e VL emantendo uma forte afinidade entre Vh/Vi , deste modo resultando em au-mentada estabilidade de scFv. Resíduos diretamente envolvidos na interfaceentre VH e VL da scFv de BHA10 foram identificados conforme descrito noExemplo 5C e são listados na Tabela 6 acima. Resíduos que covariam for-temente com os resíduos mais altamente enterrados listados na Tabela 6acima foram calculados usando a metodologia de covariação descrita naSeção Ill (a) acima. O HMM usado para análise de covariação elimina a ca-pacidade para investigar resíduos em CDR2 e CDR3 de ambos os domíniosVH e VL que são enterrados na interface. Não obstante, acredita-se que nãosurgiriam fortes covariações a partir destas posições de resíduos uma vezque são altamente variáveis devido a intensas pressões seletivas que exis-tem para anticorpos para ser capaz de reconhecer antígenos com alta afini-dade. Portanto, os resíduos que foram usados para determinar se existeuma rede de covariação para suportar a interface entre tanto VH e VL foram:

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Resíduos cujo aparecimento no alinhamento de seqüências classe

V se correlacionou com os resíduos da interface listados acima foram deter-minados usando um corte de valor fi > 0,25. Nenhum resíduo foi consideradotão importante para manter uma forte interface entre VH e VL se não tiversido correlacionado com no mínimo 2 dos resíduos da interface listados dire-tamente acima. As Tabelas 7 e 8 listam os resíduos dentro dos domínios VHe VL, respectivamente, que demonstram 2 ou mais correlações com resí-duos da interface. Quanto maior o número de links, maior o impacto que seconcebe que cada uma destas posições de aminoácido tenha para estabili-zar a interface entre VH e VL.

Tabela 7 - Resíduos com VH com múltiplas correlações fortes para resíduosestruturais observados na interface da estrutura de cristal de raios X BHA10.

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Resíduos em negrito encobrem área superficial na interface.

Resíduos em itálico são aqueles diretamente adjacentes na seqüência pri-mária a resíduos que encobrem superfície na interface.*Característica de subclasse distintiva

**Covariações com muitos dos mesmos resíduos que o resíduo primário,mas em um menor nível de correlação devido a freqüência de resíduo maisfraca.

Tabela 8. Resíduos com VL com múltiplas fortes correlações para resíduosestruturais observados na interface da estrutura de cristal de raios X BHA10.

<table>table see original document page 267</column></row><table><table>table see original document page 268</column></row><table>

Resíduos em negrito encobrem área superficial na interface.Resíduos em itálico são aqueles diretamente adjacentes na seqüência pri-mária a resíduos que encobrem superfície na interface.

*Q50, A89, Y135 são conservados tanto em cadeias pesadasquanto leves e covariações não parecem se correlacionar com posições decadeia leve.

Os resíduos das Tabelas 7 e 8 foram mapeados para as super-fícies das VH e VL de BHA10, respectivamente, e comparados com os resí-duos reais que fazem contato direto na interface entre os dois domínios (videas Figuras 87 e 88). Dois corroborados a partir desta análise. Primeiro, cova-riações não proporcionam informação (neste estágio) sobre redes envolven-do resíduos CDR2 e CDR3 na interface. Segundo, covariações sugerem quenão somente são resíduos que fazem contatos diretos dentro da interfaceimportantes para sua manutenção, ma que muitos outros resíduos fora dosresíduos diretos da interface são importantes para estruturação e suportandoas posições dos resíduos da interface. Este ponto é ilustrado pelos resíduosque são ilustrados sobre a superfície da rede de covariação mas estão au-sentes sobre a superfície obtida simplesmente usando as estruturas paracalcular os resíduos que encobrem diretamente superfície na interface.

Foi visto que existem violações de algumas poucas destas redesde covariação de interface dentro das scFvs de BHA10 ou p5E8 (descritasabaixo no Exemplo 21): seqüências VH ou VL. Foi mostrado que mutaçãodos aminoácidos nativos / não-ideais nestas posições para os resíduos ami-noácidos da interface idealmente suportiva descritas nas Tabelas 7 e 8 be éaltamente estabilizante ou para as BHA10 ou as p5E8 scFvs: (a) BHA10 VLS46L, e (b) Ided 52 VH S49G (n2 kabat e de raios X) E72D (73 para raiosX). Um destes resíduos (S46LVl) estava diretamente na interface, um(S49GVh) estava diretamente adjacente à interface, e um estava distai à in-terface (E72DVh)· No entanto, todos os três foram previstos com base naAnálise de covariação para serem estabilizantes para a interface. A estabili-zação da interface pode ser observada usando medições por DSC como umaumento na estabilidade térmica tanto da Vh e quanto da VL.

ii) Construção e Triagem de Bibliotecas de BHA10 scFv com AprimoradaEstabilidade TérmicaA) Construção de Bibliotecas de scFv

Bibliotecas projetadas para conter as substituições de aminoáci-dos desejadas na BHA10 scFv convencional (pXWU002) usando os méto-dos descritos nos Exemplos 4, 5, e 6 foram criadas usando o kit de mutagê-nese sítio-dirigida QuikChange Il (QuikChange Il Site-Directed MutagenesisKit) seguindo as instruções proporcionadas pelo fabricante (Stratagene, LaJolla, Ca.) usando oligonucleotídeos listados na Tabela 9. A seqüência deDNA da scFv convencional é representada na Figura 1.

Colônias transformadas individuais foram selecionadas para lâ-minas de cavidade profunda de 96 cavidades (Corning, Corning, NY, Cat. n-3960) contendo 400 μΙ/cavidade de LB mais 50 mg/ml de carbenicilina e cul-tivadas de um dia para o outro a 37°C. Lâminas master foram criadas adi-cionando um volume igual de LB contendo 20% de glicerol para cada cavi-dade das lâminas de cavidade profunda de 96 cavidades e transferindo alí-quotas de 50 μΙ da suspensão bacteriana para lâminas de microtítulo esté-

reis (Corning, Corning, NY, Cat. n2 3359) e congelando para armazenamentoa -80°C.

Tabela 9. Oligonucleotídeos para engenharia de estabilidade de scFv deBHA10.

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fPosições alvo para mutagênese são indicadas por sublinhado. Bases am-bíguas são abreviadas como se segue: W = A ou T, V = A ou C ou G1Y = Cou T, S = C ou G, M = A ou C, N = A ou C ou G ou T, R = A ou G, K = G ouT1 B = Cou GouT (J Biol Chem. 261(1): 13-7(1986)).

B. Ensaio de Estímulo Térmico

As atividades das scFvs BHA10 convencionais e produzidas porengenharia foram então comparadas em uma prova de ensaio térmico a qualpode ser usada para determinar a temperatura na qual 50% das moléculasscFv conservam sua atividade de ligação antigênica depois de um evento deestímulo térmico. O valor numérico correspondente a esta temperatura é re-ferido como o valor de T50 e as unidades são em 0C. Nesta prova, as scFvsforam submetidas a uma faixa de temperaturas que englobam a temperaturade transição térmica e BHA10 scFv convencional.

E. coli cepa W3110 (ATCC, Manassas, Va. Cat. n2 27325) foitransformada com plasmídeos codificando BHA10 scFvs convencionais eproduzidas por engenharia sob o controle de um promotor ara C indutível.Transformantes foram cultivados de um dia para o outro em meio de expres-são consistindo em SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. n- S0140) suple-mentado com 1% de glicina, 1% de Triton X100, 0,02% de arabinose, e 50μg/ml de carbenicilina ou em 37°C ou em 32°C. Bactérias foram peletizadaspor centrifugação e sobrenadantes foram colhidos para tratamento posterior.Incluindo glicina e Triton X-100 no meio resultou na liberação de conteúdosperiplásmicos (proteína de E. coli nativa e scFv) no meio. A presença de pro-teínas de E. coli no sobrenadante é essencial para a performance deste en-saio porque as proteínas termicamente desnaturadas agem como um "sor-vedouro", capturando moléculas scFv desdobradas transitoriamente em a-gregados irreversíveis inativos.

Cada biblioteca foi triada em duplicata usando uma prova deensaio térmico com sobrenadante de uma replicata submetida a condiçõesde tratamento e o segundo sobrenadante servindo como referência não tra-tada. Provas de estímulo térmico podem ser realizadas em uma única tem-peratura ou faixa de temperaturas para medir a estabilidade. Máquinas deThermocycler capazes de gerar gradientes térmicos estáveis são usadaspara tratar sobrenadantes da amostra (iCycler, Bio-Rad, Gaithersburg, Md).

A temperatura de estímulo variou dependendo das propriedadesda variante de BHA10 scFv parental e foi geralmente dois a três graus Celsi-us maior do que o valor da T50 determinado experimentalmente. LâminasMaster congeladas foram degeladas e usadas para inocular lâminas de mi-crotítulo de cavidades profundas contendo 250 μΙ de meio de expressão porcavidade, e culturas cultivadas de um dia para o outro a 32°C. Como umcontrole, culturas contendo o plasmídeo parental foram cultivadas sob asmesmas condições e processadas simultaneamente à biblioteca. Bactérias foram peletizadas nas lâminas de cavidades profundas por centrifugação a2000 rpm (IEC modelo 8R, Thermo Electron, Waltham, Ma) por 30 minutos,e 100 μΙ do sobrenadante foi transferido para lâminas de microtítulo de rotina(Corning, Corning, NY, Cat. ns 3357). Uma alíquota do sobrenadante foi re-servada para o DELFIA de referência. Para a maioria das bibliotecas, as lâ-minas contendo o restante dos sobrenadantes foram seladas (Nalge Nunc,Rochester, NY, Cat n2 235205) e colocadas em uma incubadora ajustadapara a temperatura de estímulo apropriada (Echo Therm, Torrey Pines Sci-entific, San Marcos, Ca) por 90 minutos. Para triagens requerendo múltiplastemperaturas de estímulo (ou por temperaturas de mais de 75°C) os sobre-nadantes foram transferidos para lâminas de PCR de 96 cavidades (AppliedBiosystems, Foster City, Ca, Cat. ns N801-560) e incubadas por 90 minutosna temperatura desejada.

Depois de estímulo térmico, o material agregado foi removidopor centrifugação e amostras de BHA10 scFv solúveis remanescentes nosobrenadante clareado tratado foram avaliadas para ligação a antígenoLTpR Ig cognato por tete DELFIA. Lâminas de 96 cavidades (MaxiSorp, Nal-ge Nunc, Rochester, NY, Cat. n- 437111) foram revestidas com proteína defusão consistindo no ectodomínio do ίΤβ receptor (LTpR) fundido a uma re-gião Fc humana a 1 μg/ml em 0,1 M de tampão de carbonato de sódio, pH9.5. As lâminas foram revestidas de um dia para o outro a 4°C, e bloqueadascom tampão de ensaio DELFIA (DAB, 10 mM de Tris HCI, 150 mM de NaCI,20 μΜ de EDTA, 0,5 % de BSA, 0,02% de Tween 20, 0,01% de NaN3, pH7.4) por uma hora com agitação em temperatura ambiente. As lâminas foramlavadas 3 vezes com DAB sem BSA (tampão de lavagem), e amostras deensaio diluídas em DAB foram adicionadas às lâminas em um volume finalde 100 μl. As lâminas foram incubadas por uma hora com agitação em tem-peratura ambiente, e em seguida lavadas 3 vezes com tampão de lavagempara remover moléculas scFv não ligadas e funcionalmente inativadas.BHA10 scFv ligado foi detectado por adição de 100 μl por cavidade de DABcontendo 40 ng/ml de anticorpo anti-His6 marcado com Eu(Perkin Elmer,Boston, MA, Cat. ne AD0109) e incubado em temperatura ambiente com agi-10 tação por uma hora. As lâminas foram lavadas 3 vezes com tampão de lava-gem, e 100 μΙ de solução de reforço DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat.n2 4001-0010) foi adicionado por cavidade. Depois de incubação por 15 mi-nutos, as lâminas foram lidas usando o método de Európio em um Victor 2(Perkin Elmer, Boston, MA).

Dados de ensaio foram processados usando o software SpotfireDecisionSite (Spotfire, Somerville, Ma.) e expressados como a proporçãodas contagens DELFIA observdas em temperatura de estímulo para a tem-peratura de referência para cada clone. Clones que deram reprodutivelmenteproporções maiores do que ou iguais a duas vezes a que foi observada parao plasmídeo parental foram considerados alcences. DNAs de plasmídeosdestes clones positivos foram isolados por mini-prep (Wizard Plus, Promega,Madison, Wl) e retransformados de volta em E. co//'W3110 para provas deensaio térmico secundário de confirmação.

Para gradientes térmicos, os dados foram analisados usando osoftware Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, Ca) usando uma reaçãode dose sigmoidal com inclinação variável como o modelo. Os valores obti-dos para o ponto central das curvas de desnaturação térmica são referidoscomo valores T50, e não são considerados como sendo equivalentes a valo-res de Tm biofisicamente derivados.

Resultados primários e confirmatórios destes ensaios são mos-trados na Tabela 10. Várias das moléculas scFv estabilizadas da invençãoresultaram em aprimoramentos na atividade de ligação (T50 > 49°C) compa-radas com o scFv convencional. Em particular, os valores de T50 de BHA10posição da biblioteca VL46 scFv (S46L), posição da biblioteca VH16 scFv(S16E e S16Q), e posições da biblioteca VL49: VL50 scFv apresentaram au-mentos na estabilidade térmica variando de + 3°C a + 12°C em relação aoBHA10 scFv convencional. Além disso, os valores de T50 de BHA10 posiçãoda biblioteca VL3 scFv (Q3A, Q3G, Q3S, Q3V, e Q3D), posição da bibliotecaVh67 scFv (V67I e V67L), posição da biblioteca VH48 scFv (M48I e M48G),posição da biblioteca VH20 scFv (V20I) e posição da biblioteca VH101 scFv(P101D) apresentaram aumentos na estabilidade térmica variando de + 4°Ca + 18°C em relação ao BHA10 scFv convencional. Uma das mutações es-tabilizantes (VL K13E) acidentalmente resultou de um erro de PCR. Foi vistoque a incorporação de uma destas mutações estabilizantes em plEH009aumenta adicionalmente a estabilidade térmica e mesmo excede a deBHA10 Fab sob estas condições (Figura 12). De modo importante, a muta-ção V|_46 não-covalente e mutações VH55 derivadas de um ou mais dos qua-tro métodos de design (modelagem por homologia da interface VL/VH, classi-ficação de consenso, modelagem computacional, e análise de covariação)resultaram em um aprimoramento na estabilidade térmica de scFv quase seaproximando da observada com as mutações de dissulfeto e validando autilidade e inovação destas ferramentas de criação.

A Figura 1B mostra as seqüências de aminoácidos de BHA10scFv convencional (SEQ ID NO: 4) e as Figuras 94A e B mostram a seqüên-cia de aminoácidos de BHA10 scFVs estabilizados contendo a mutação es-tabilizante S46L(VL) (SEQ ID NO: 137), e a mutação estabilizante V55G(VH) (SEQ ID NO: 138), respectivamente. A seqüência de DNA de BHA10scFv selvagem (SEQ ID NO: 3) é representada na Figura 1A. A mutação es-tabilizante é indicada pelo resíduo envolvido por caixa. A seqüência lider,peptídeo de ligação gly/ser, e domínio CH1 são indicadas pelos resíduossublinhados, em negrito, e em itálico, respectivamente.

Tabela 10. Posições da biblioteca de BHA10 VH e VL, composição da biblio-teca, e resultados de triagem.<table>table see original document page 275</column></row><table>

na = não aplicável

A Tabela 11 mostra os resultados de uma análise de estabilida-de térmica completa das várias mutações estabilizantes individuais e combi-nadas introduzidas em um scFv convencional. Estes resultados demonstramque os aprimoramentos na atividade são aditivos e que os métodos descritosnesta invenção são capazes de melhorar as propriedades de estabilidadetérmica de scFvs mesmo além das de Fabs nativos. Mesmo na ausência deuma ligação dissulfeto covalente nas posições Vh44-Vi_100, foram identifica-das mutações estabilizantes que na combinação apresentaram aumentos naestabilidade térmica variando de + 19°C a + 33°C em relação ao BHA10scFv convencional.

Tabela 11. Características de construtos BHA10 usados para produzir prote-ínas variantes e resultados de T50 de prova de ensaio térmico.<table>table see original document page 276</column></row><table><table>table see original document page 277</column></row><table>

na = não aplicávelaa = aminoácidos

Sumário

Três mutações estabilizantes (Vl_S46L, Vh_V55G, e VH_P101 D)foram experimentalmente validadas por prova de estímulo térmico (T50).

Tanto as mutações V|_S46L como VH_V55G foram previstaspara serem estabilizantes para os domínios individuais VH e VL com basenas análises de covariação descritas no Exemplo 3 acima. Conforme repre-sentado na Figura 50A e B, ambas estas mutações levam a aumentos signi-ficativos na T50 do BHA10 scFv. Em particular, a mutação VL_S46L estabili-za o scFv por -7-8 0C ao passo que a mutação VH_V55G estabiliza o scFvpor -12 °C. Ambas estas mutações também encolhem significativamente ointervalo da Tm entre Vh e Vl conforme determinado por DSC (vide a Figura51). Os dados de DSC mostram que ambas as mutações levam a aumentossignificativos tanto na Tm (ponto central das transições de desdobramentotérmico) de ambos os domínios VH e VL e na entalpia calorimétrica (isto é,área sob a curva) para o scFv. Aumentos nestes valores proporcionam vali-dação experimental de que estas mutações estabilizantes previstas são defato estabilizantes para o scFv. Além disso, como estas duas mutações es-tabilizam ambos os domínios VH e Vl simultaneamente, provavelmente sãoimportante para construir cooperatividade entre os domínios VH e Vl . Porconseguinte, espera-se que a intensificação da interface entre Vh e Vl possanão somente ajudar a aumentar a estabilidade, mas reduzir a tendência deformar agregados também.

A mutação estabilizante Vl_S46L e uma terceira mutação esta-bilizante (VH_P101D) também foram previstas para serem estabilizantescom base em modelagem por homologia de interface VH/VL descrita no E-xernplo 4 acima. A mutação estabilizante VH_P101D estabilizou o scFv por-15 'C conforme medido por prova de ensaio térmico (Figura 50C). Alémdisso, DSC (vide a Figura 52) mostra que esta mutação estabilizante leva aaumentos significativos na Tm tanto dos domínios VH e VL e na entalpia ca-lorimétrica, indicando que é provável que esta mutação também estabilizecooperativamente o scFv como um todo através da interface VH/VL.

Exemplo 6. Caracterização Biofísica de BHA10 scFvs Estabilizados Com-preendendo Mutações Estabilizantes

Seqüências genéticas de região V de vários plasmídeos listadosna Tabela 11 foram subclonadas em um vetor de expressão de E. coli modi-ficado para dirigir expressão de proteína recombinante sob o controle de umpromotor ara C indutível. BHA10 scFvs variantes foram expressados e purifi-cados usando métodos descritos acima. Um sítio de clivagem aparente noN-término do domínio Vl levou a um baixo nível de VL na maioria das prepa-rações de scFv conforme avaliado por análise SDS-Page (Figura 53).

As propriedades hidrodinâmicas de cada scFv foram investiga-das por HPLC de exclusão de tamanho (Agilent Technologies) com detecto-res de dispersão luminosa estática e do índice refrativo (MiniDAWN/ReX,Wyatt Technology). Foi visto que cada scFv era predominantemente mono-mérico; no entanto, uns poucos dos scFvs, incluindo o scFv (não estabiliza-do) selvagem, apresentou um baixo nível de material dimérico (Tabela 12).Nenhum dos scFvs purificados teve níveis detectáveis de oligômeros maio-res do que dímero.

Tabela 12. Resultados de SEC / Dispersão Luminosa de scFvs

<table>table see original document page 278</column></row><table><table>table see original document page 279</column></row><table>

aProteinas sem erro padrão foram expressadas uma vez.bn.d., não determinado.

cEstes valores foram determinados DEPOIS de SEC do preparativo a serrealizada para reduzir agregados

A meta final do experimento foi investigar se as mutações de-signadas reforçam a estabilidade e levam a uma menor propensão para a-gregação. A termoestabilidade de cada scFv foi avaliada usando dois méto-dos separados. Primeiro, foi analisado o desdobramento térmico dos scFvsusando DSC (Figura 54A). Em segundo lugar, a termoestabilidade de cadascFv foi investigada aquecendo as proteínas na presença de um corantehidrofóbico fluorescente, 1-anilino-8-sulfonato (ANS, Figura 54B). ANS ge-ralmente liga a proteínas parcialmente desdobradas ou proteínas desnatura-das por calor em estados desdobrados compactos. Na associação com á-reas superficiais hidrofóbicas expostas, a fluorescência de ANS aumentasignificativamente presumivelmente devido a seqüestração dos efeitos deextinção do solvente.

As curvas de ANS dependente da temperatura foram ajustadaspara uma transição de desdobramento protéico de dois estados conformedescrito abaixo. O tampão foi PBS e a concentração de scFv usado em cadaexperimento foi 750 nM. Foram realizadas medições da fluorecência sobreum espectropolarímetro de Dicroismo Circular JASCO modelo 812 equipadocom um dispositivo de aquecimento de Peltier e banho de água externo. Afluorecência foi compilada usando um acessório contendo um tubo fotomulti- plier perpendicular à trajetória da luz. O acessório é equipado com um mo-nocrômetro ajustável ajustado para 480 nm. A sensibilidade foi ajustada para600 V. Foi realizado aquecimento em uma taxa contínua de 120 °C/min. Omonocrômetro da excitação foi ajustado para 370 nm.

Desdobramento térmico de cada scFv neste estudo levou a um aumento na fluorescência de ANS. O ponto central do desdobramento térmi-co (isto é, a Tm) de cada domínio protéico scFv foi determinado usando DSCajustando cada pico de desdobramento à equação de Gibbs-Helmholtz u-sando o software Origin 7.0 fornecido pelo fabricante (MicroCal, lnc). TmStambém foram derivadas usando fluorescência de ANS por incorporação da equação de Gibbs-Helmholtz na rotina de ajuste da curva não-linear em Ka-

leighdaGraph™:

AG1J0(T) = AH1J0(T) -TAS1J0(T), (1)

onde AG1J0(T) é a alteração dependente da temperatura na energia livre deGibbs no desdobramento, AHy0(T) é a alteração da entalpia associada comdesdobramento, e ASy0(T) é a entropia associada com desdobrado. A e-quação pode ser expandida para:

<formula>formula see original document page 280</formula>

onde Tm é o ponto central da curva de desdobramento e ACp ° é a alteraçãona capacidade térmica entre os estados dobrado e desdobrado. Esta eqüa-ção pode ser usada para derivar a dependência da temperatura da intensi-dade de fluorescência de ANS presumindo que a intensidade de fluorescên-cia é a soma da fluorescência de ANS intrínseca na presença de scFv do-brado e desdobrado,

<formula>formula see original document page 280</formula>

onde iT(T) é o sinal de fluorescência total dependente da temperatura, iF eiy são as intensidades de fluorescência dos estados dobrado e desdobrado,respectivamente, e fF e fu são as frações de scFv dobrado e desdobrado,respectivamente na temperatura dada. As frações dobradas estão relaciona-das com a constante de desdobramento de equilíbrio e energia de desdo-bramento livre:

<formula>formula see original document page 281</formula>

Fatorando Ku(T) e AGu0CT) na equação (3) e presumindo queas intensidades de fluorescência de ANS na presença de scFv dobrado edesdobrado são linearmente dependente da temperatura (isto é iF = i, +i2T<formula>formula see original document page 281</formula> foi obtida a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 281</formula>

Para obter a equação final utilizada para ajustar os dados, a re-lação para AG1J0(T) na equação (2) é substituída na equação (5) assumindo

que ACp0 é independente da temperatura e proporcional à diferença na áreasuperficial exposta a solvente entre os estados dobrado e desdobrado (Hay-nie & Friere, Proteins: Struct. Funct. Genet. 16: 115-140, (1993); Myers et ai,Protein Sei. 4: 2138-2148 (1995)).

As medições da termoestabilidade para todos os scFvs deriva-dos de experimentos de DSC e de ligação de ANS foram comparáveis. Odesdobramento de cda scFv foi irreversível; portanto, a agregação teve umefeito sobre a Tm absoluta medida por DSC ou ligação de ANS. Como asduas técnicas aqueceram as amostras diferentemente e em taxas diferentes,não se espera que as TMs sejam idênticas nos formatos experimentais (Sán-chez-Ruiz et ai, Biochemistry, 27:1648-1652 (1988)). No entanto, a tendên-cia observada para cada técnica experimental foi idêntica (vide Tabela 13).

Os experimentos de DSC prontamente discriminaram entre as transiçõesdos desdobramentos de Vh e VL. Os experimentos de ligação de ANS nãoforam capazes de discriminar precisamente 2 transições (isto é desdobra-mento Vh vs. Vl); portanto, somente a Tm aparente foi proporcionada para osexperimentos de ligação de ANS. A Tm aparente observada por ligação deANS pareceu se correlacionar bem com a Tm do último domínio para desdo-brar, quer Vh ou Vl dependendo da mutação, conforme determinado porDSC. Devido a agregação de material desdobrado em ambos os formatos deensaio, as TmS foram usadas como um guia para classificar em ordem osreforços de estabilidade proporcionados por cada mutação sem interpreta-ção adicional de energias livres de desdobramento de scFv, e etc.

Tabela 13. Medições da termoestabilidade de cada scFv.

<table>table see original document page 282</column></row><table>

aEstas mutações particulares levam a eventos de desdobramento Vh/Vl úni-co, cooperativo.

bTodos os scFvs subseqüentes foram construídos com o (G4S)*4 Iigante deaminoácidos.

cAnálise complicada de múltiplas transições.dIncapaz de discriminar Vh vs. Vl.

Sumário

Todas as mutações únicas projetadas selecionadas das triagensde biblioteca: Vh S16E, S16Q, V55G, P101D, e Vl S46L estabilizaram signi-ficativamente o domínio Vh e em alguns casos, o domínio Vl também (Figura53). O fundamento lógico por trás da experimentação destas posições parareforços da estabilidade freqüentemente vem de múltiplas formas de análise.Métodos de consenso previram que todas as mutações Vh S16E, S16Q,V55G, P101D e Vl S46L estabilizariam o BHA10 scFv (Exemplo 3). No en-tanto, Vh V55G e P101D (incidentalmente, as duas mutações estabilizantesprincipais) estão posicionadas dentro de CDR2 e CDR3 de VH, respectiva-mente, e não foram consideradas para mutagênese até ser compilada evi-dência preditiva adicional que sugeriu que mutação nestas duas posiçõespode levar a eventos estabilizantes. Tanto Vh V55G quanto Vl S46L tambémforam previstos para serem estabilizantes com base em Análises de Covari-ação. Finalmente, Vh P101D e Vl S46L foram previstos para serem potenci-almente estabilizantes para a interface VhAZl com base na composição da interface de anticorpos humanos altamente estáveis (Exemplo 3).

Mutações únicas na interface VH/VL aumentaram a estabilidadede ambos os domínios, ao passo que mutações Vh fora da interface somen-te estabilizaram o próprio domínio VH. Vh S16E, S16Q, e V55G estavam forada interface e aumentaram a Tm aparente do BHA10 Vh por 3, 2, e 11 2C, respectivamente. A estabilidade de Vl foi relativamente não afetada por esasmutações. A mutação Vh V55G pareceu aumentar a estabilidade da Vh paracombinar com a do domínio Vl, sem levar a aumentos detectáveis na estabi-lidade de Vl. Ambas as mutações na interface, Vh P101D e Vl S46L aumen-taram significativamente a estabilidade de ambos os domínios. A mutação P101D em particular leva a desdobramento totalmente cooperativo dos do-mínios VH e Vl sugerindo que a interface e a cooperatividade de dobramen-to entre Vh e Vl foi significativamente reforçada. Portanto, mutações na inter-face Vh/Vl podem proporcionar os meios mais eficazes para formar uma re-gião Fv estabilizada e proporcionar um fundamento lógico para priorizar de-signs de estabilidade para a interface Vh/Vl de scFvs sobre designs dirigidospara resíduos fora da interface Fv.

Combinando mutações de Vh eventualmente leva a uma desas-sociação entre a cooperatividade do desdobramento VHA/l (Tabela 13). Àmedida que a Tm de Vh subiu acima de 75 -C (o resultado de combinaçõesde mutações de VH), a Tm da Vl começa a se mover para temperaturas me-nores. Iso sugere hiperestabilização do domínio Vh sem formar mutações decompensação dentro do domínio Vl podem levar a reduzida cooperatividadede dobramento e uma interação enfraquecida entre os dois domínios. Ape-sar das TMs dos domínios VH e Vl (incluindo a Tm do BHA10 scFv selvagem)serem freqüentemente muito diferentes, evidência de que mutações na inter-face entre os dois domínios podem estabilizar ambos os domínios simulta-neamente sugere que os dois domínios estão interagindo em algum nível umcom o outro - embora não se espere que a aparente afinidade entre os do-mínios isolados seja extremamente elevada, exceto talvez na variante esta-bilizada Vh P101D (Brandts & Lin, Biochemistry, 29: 6927-6940, (1990)).

Aumentando a estabilidade da scFv levou a reduzida ligaçãointrínseca do corante fluorescente hidrofóbico ANS em temperatura ambien-te (15 9C, Figura 55). O scFv selvagem liga fracamente a ANS sugerindo quea proteína pode expor permanentemente ou transitoriamente área superficialhidrofóbica a solvente. scFvs estabilizados pareceram perder completamen-te a capacidade de ligar ANS sob condições ambiente - a fluorescência deANS na presença das scFvs mais estabilizadas não foi de mais do que a deANS somente no solvente. Gráficos de VH_TM (medida por DSC ou experi-mentos de ligação de ANS dependente da temperatura) vs. ANS-fluorescência na presença de proteína dobrada a 15 qC demonstram quefluorescência de ANS scFv-dependente diminui à medida que a estabilidadede scFv aumenta (Figura 55). A redução de ligação de ANS por estabiliza-ção de scFv pode indicar que menos área superficial hidrofóbica fica expostaa solvente e que scFvs estabilizadas podem ter uma menor propensão in-trínseca para agregação.

Medições de K0 de várias mutações BHA10 scFv individuais ecombinadas estabilizantes foram realizadas usando ressonância de plasmonsuperficial (SPR) em um instrumento Biacore 3000. A Tabela 13 mostra osresultados da prova de afinidade Biacore. A afinidade de ligação dos BHA10scFvs variantes variou de 1X a 2,5X do BHA10 scFv original.Exemplo 7. Produção de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos Estabilizados

Tanto BHA10 scFv convencional quanto os BHA10 scFvs estabi-lizados da invenção foram usados para construir um painel de anticorposbiespecíficos referidos como "Hercules". Anticorpos biespecíficos Herculescompreendem uma fusão de anticorpo quimérico 14A2 IgG que liga a TRAILR2 receptor com um BHA10 scFv que liga a LTpR. Os anticorpos Herculesforam construídos tanto como fusões de BHA10 scFv de N- terminal e C-terminal (vide a Figura 13). Fusões de N- terminal scFv podem ser produzi-das por engenharia como fusões de cadeia leve e/ou cadeia pesada ("Nl-Hercules" ou "NH-Hercules", respectivamente). A decisão quanto a qual regi-ão amino terminal V (pesada ou leve) é selecionada para unir o scFv é es-sencialmente orientada por qual cadeia se considera que tolera um scFvfundido o qual é capaz de reconhecer o primeiro antígeno alvo ao mesmotempo que não interferindo de modo apreciável com a ligação do domínioFab ao segundo antígeno alvo.

É também possível usar os métodos descritos nesta invençãopara produzir anticorpos tetravalentes ou biespecíficos consistindo somentede scFvs estabilizados fundidos diretamente a regiões de articulação de an-ticorpo ou a domínios CH2 ou CH3 conforme representado, por exemplo, naFiguras 42 a 49. Os anticorpos referidos podem compreender regiões Fc deextensão total (vide, por exemplo, a Figura 46) ou regiões Fc com domínioCH2 eliminado (vide, por exemplo, a Figura 42). Em outras modalidades exem-plares, dois ou mais domínios scFv estabilizados podem ser fundidos ao mes-mo término de uma cadeia pesada ou leve (vide, por exemplo, a Figura 43).A. Construção de "Nh- Hercules" com BHA10 convencional, (G4S)4, Vh44:V. 100, e Vh44:Vi 10OZ(GlVjSer)4 scFvs

Quatro projetos de anticorpos biespecíficos anti-L^R (BHA10) χanti-TRAlL R2 (chi14A2) foram baseados em anexar os BHA10 scFvs con-vencional e variante ao término amino da cadeia pesada de anticorpo anti-TRAlL R2. Os DNAs de BHA10 scFvs descritos no Exemplo 3 foram usadospara construir um painel de anticorpos biespecíficos Nh- Hercules por ampli-ficação por PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeos descritos naTabela 14. Um (GIy4Ser)5 Iigante foi usado para conectar os BHA10 scFvs ao término amino maduro de cadeia pesada chi14A2. O iniciador por PCR 5'VH forward (scFvBHA10-F1) inclui um sítio de restrição de endonucleaseMlu I (seqüência sublinhada) para clonagem seguida por seqüência codifi-cando os últimos três aminoácidos do peptídeo de sinal de cadeia pesada eo término amino de BHA10 VH. Dois iniciadores por PCR 3' reversos foram usados para gerar os produtos de PCR com iniciador reverso internoXWU005-R codificando o término carboxila de BHA10 VL seguido pelo(GIy4Ser)5 ligante, e iniciador reverso scFvBHA10-R1 codificando uma regiãoanti-TRAlL R2 VH parcial e um sítio Bgl Il (seqüência sublinhada) para clo-nagem.

Tabela 14. Oligonucleotídeos para amplificação por PCR de N- Herculescom BHA10 scFvs convencionais, (GIy4Ser)4, VH44:VL100 e VH44:VL100/(GIy4Ser)4

<table>table see original document page 286</column></row><table>As seqüências genéticas BHA10 scFv + (GIy4Ser)5 Iigante + anti-TRAIL R2 VH parcial foram amplificadas em duas reações por PCR seqüen-ciais através das seqüências de sobreposição comuns codificando o(GIy4Ser)5 Iigante conforme representado na Figura 14A para prepararBHA10 scFv convencional a partir do DNA de plasmídeo pXWU034, BHA10scFv (GIy4Ser)4 do plasmídeo pXWU002, BHA10 scFv VH44:VL100 do plas-mídeo plEH006, e BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 do plasmídeo pl-EH009. Os produtos de PCR do painel de BHA10 scFvs amplificados forampurificador por eletroforese por gel agarose usando o kit de extração Millipo-re UItrafree-DA de acordo com instruções do fabricante (Millipore; Bedford1MA). Os produtos de PCR purificados foram digeridos com endonucleasesde restrição Mlu \IBgl Ij e ligados em um vetor pN5KG1 digerido por Mlu UBgIIl contendo a chi14A2 IgGI previamente modificada para remover um sítioBgl Il interno presente na seqüência codificante chi14A2 IgGI. O vetor de expressão mamífero pN5KG1 contém um gene de neomicina fosfotransfera-se modificado (contendo íntron), de translação prejudicada, para selecionareventos de integração transcricionalmente ativos, e um gene de diidrofolatoredutase murino para permitir amplificação com metotrexato (Barnett, et ai,Antibody Expression e Engineering. (Imanaka, Η. Y. W. a. T., ed), pp. 27-40,Oxford University Press, New York, NY, (1995)).

O painel resultante de construtos formam proteínas de fusão dosBHA10 scFvs variantes ao término amino do domínio VH de anticorpo R2anti-TRAlL através do (GIy4Ser)5 Iigante de 25 aminoácidos. Fusão da se-qüência genética de BHA10 scFv convencional ao término amino da seqüênciagenética de cadeia pesada do anticorpo anti-TRAlL R2 produziu o plasmídeopXWU005. Fusão da seqüência genética de BHA10 scFv (GIy4Ser)4 ao términoamino da seqüência genética de cadeia pesada do anticorpo anti-TRAlL R2produziu o plasmídeo pXWU026. Fusão da seqüência genética de BHA10scFv VH44:V|_100 ao término amino da seqüência genética de cadeia pesada do anticorpo anti-TRAlL R2 produziu o plasmídeo pXWU027. Fusão da se-qüência genética de BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 ao término aminoda seqüência genética de cadeia pesada do anticorpo anti-TRAlL R2 produ-ziu o plasmídeo pXWU028. As misturas de ligação foram usadas para trans-formar células competentes de E. coli cepa TOP 10 (Invitrogen Corporation,Carlsbad, CA). Colônias de E. coli transformadas para resistência a fármacode ampicillna foram tríadas para presença de insertos. Análise de seqüênciade DNA confirmou a seqüência correta dos construtos finais.

A cadeia leve quimérica 14A2 usada é comum entre todos osanticorpos biespecíficos N- e C-Hercules e as seqüências de DNA (SEQ IDNO: 28) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) são mostradas nas Figuras 15Ae 15B. A cadeia leve quimérica 14A2 é expressada com um peptídeo de si-nal no N-término tendo as seguintes seqüências de DNA e de aminoácidos:ATGGCCTGGACTCCTCTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCTCAGGGTCTTTCTCC (SEQ ID NO: 59)MAWTPLFFFFVLHCSGSFS (SEQ ID NO: 60)

As seqüências de DNA (SEQ ID NO: 30)_e de aminoácidos(SEQ ID NO: 31) de cadeia pesada para BHA10 scFv Nh- Hercules conven-cionais são mostradas nas Figuras 16 e 17, respectivamente. A seqüênciade DNA (SEQ ID NO: 32) e de aminoácido (SEQ ID NO: 33) de cadeia pe-sada para BHA10 scFv (GIy4Ser)4 Nh- Hercules são mostradas nas Figuras18 e 19, respectivamente. Seqüências de DNA (SEQ ID NO: 34) e de ami-noácido (SEQ ID NO: 35) de cadeia pesada para BHA10 scFv VH44:VL100N- Hercules são mostradas nas Figuras 20 e 21, respectivamente. Seqüên-cias de DNA (SEQ ID NO: 36) e de aminoácido (SEQ ID NO: 37) de cadeiapesada para ΒΗΑ1Ό scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N- Hercules são mostradasnas Figuras 22 e 23, respectivamente. Cada uma das cadeias pesadas foiexpressada com um peptídeo de sinal no N-término tendo as seguintes se-qüências de DNA e de aminoácidos:

ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCT ACGCGTGTCCTGTCC (SEQ ID NO: 61)MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ ID NO: 62)

B. Construção de C-scFv "Hercules" com BHA10 convencional. (G4S)^.Vh44:Vl100, e Vh44:Vi 10OZ(GIv4Ser)4 scFvs

Quatro projetos de anticorpo biespecífico anti-LTpR (BHA10) χanti-TRAlL R2 (chi14A2) foram baseados em anexar os BHA10 scFvs con-vencional e variantes ao término carboxila da cadeia pesada do anticorpoanti-TRAlL R2. Os DNAs de BHA10 scFvs descritos no Exemplo 3 foramusados para construir um painel de anticorpos biespecíficos C- Hercules poramplificação por PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeos descritosna Tabela 15. Um Ser(GIy4Ser)3 Iigante foi usado para conectar os BHA10scFvs ao término carboxila de cadeia pesada chi14A2. O iniciador de PCRforward 5' VH (XWU006-F1) inclui um sítio de endonuclease de restriçãoBamH I (seqüência sublinhada) para clonagem seguido por seqüência codi- ficando uma porção do peptídeo Iigante Ser(GIy4Ser)3 e o término amino deBHA10 VH. O iniciador de PCR reverso 3' VL (XWU006-R1) primes cadeialeve de BHA10 scFv e inclui um códon de parada seguido por um sítio BamHI (seqüência sublinhada) para clonagem. Iniciador de PCR de sobreposiçãoforward 5' interno (XWU006-F2) inclui seqüência codificando o (GIy4Ser)3ligante e contém uma mutação silenciosa indicada em tipo em negrito. Inici-ador de PCR de sobreposição reverso 3' interno (XWU006-R2) inclui se-qüência codificando o (GIy4Ser)3 Iigante e contém uma mutação silenciosaindicada em tipo em negrito para remover um sítio SamHI localizado na regi-ão de BHA10 scFv (GIy4Ser)3 ligante.

Tabela 15. Oligonucleotídeos para amplificação por PCR de C- Herculescom BHA10 convencional, (G4S)4, VH44:VL100, e VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFvs.

<table>table see original document page 289</column></row><table>

Conforme representado na Figura 14B, seqüências genéticasBHA10 scFv foram amplificadas em uma reação de PCR de duas etapasusando a série de iniciadores de PCR 5' VH XWU006-F1 + 3' VL XWU006-R1 e uma série de iniciadores de PCR de sobreposição interna (XWU006-F2e XWU006-R2) designada para eliminar um sítio BamH I dentro da região doBHA10 scFv (GIy4Ser)3 ligante. Estas condições de PCR foram usadas parapreparar BHA10 scFv convencional do plasmídeo pXWU034, BHA10 scFv(GIy4Ser)4 do plasmídeo pXWU002, BHA10 scFv VH44:VL100 do plasmídeoplEH006, e BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 do plasmídeo plEH009. Osprodutos de PCR do painel de BHA10 scFvs amplificados foram purificadospor eletroforese por gel agarose usando o kit de extração UItrafree-DA daMillipore de acordo com instruções do fabricante (Millipore; Bedford1 MA). Osprodutos de PCR purificados foram digeridos com endonuclease de restriçãoBamH I e ligados em um único sítio BamH I do vetor pN5KG1 previamenteengenheirado para conter várias modificações. Em resumo, o vetor pN5KG1contendo chi14A2 IgGI foi modificado para remover o códon de parada naextremidade 3' do gene de cadeia pesada e introduzir nucleotídeos codifi- cando para a seqüência de aminoácidos Ser-Gly-Gly-Gly imediatamente se-guidos por um sítio de endonuclease de restrição BamH I (codificando paraGly-Ser) para clonagem. Por último, um sítio de endonuclease de restriçãoBamH I indesejado interno na região chi14A2 VL também foi eliminado.

O painel de construtos resultantes forma proteínas de fusão dos BHA10 scFvs variantes para o término carboxila da cadeia pesada de anti-corpo anti-TRAlL R2 através do Ser(GIy4Ser)3 ligante de 16 aminoácido. Fu-são da seqüência genética BHA10 scFv convencional ao término carboxila daseqüência genética de cadeia pesada de anticorpo anti-TRAlL R2 produziu oplasmídeo pXWU006. Fusão da seqüência genética BHA10 scFv (GIy4Ser)4 aotérmino carboxila da seqüência genética de cadeia pesada de anticorpo anti-TRAlL R2 produziu o plasmídeo pXWU034. Fusão da seqüência genéticaBHA10 scFv Vh44:Vl100 ao término carboxila da seqüência genética de ca-deia pesada de anticorpo anti-TRAlL R2 produziu o plasmídeo pXWU035.Fusão da seqüência genética BHA10 scFv VH44:Vi_100/(Gly4Ser)4ao términocarboxila da seqüência genética de cadeia pesada de anticorpo anti-TRAlLR2 produziu o plasmídeo pXWU036.

As misturas da ligação foram usadas para transformar E. colicepa TOP 10 células competentes (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).Colônias de E. coli transformadas para resistência a fármaco de ampicilinaforam tríadas para presença de insertos. Análise de seqüência de DNA con-firmou a seqüência correta dos construtos finais. A cadeia leve quimérica14A2 usada é comum entre todos os anticorpos biespecíficos N- e C-Hercules e seqüências de DNA e de aminoácidos são mostradas nas Figu-ras 15A e 15B. Seqüências de DNA e de aminoácidos de cadeia pesada pa-ra BHA10 scFv C- Hercules convencional são mostradas nas Figuras 24 e25, respectivamente. Seqüências de DNA e de aminoácidos de cadeia pe-sada para BHA10 scFv (GIy4Ser)4 C- Hercules são mostradas nas Figuras26 e 27, respectivamente. Seqüências de DNA e de aminoácidos de cadeiapesada para BHA10 scFv VH44:VL100 C- Hercules são mostradas nas Figu-ras 28 e 29, respectivamente. Seqüências de DNA e de aminoácidos de ca-deia pesada para BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C- Hercules são mos-tradas nas Figuras 30 e 31, respectivamente. Um sumário dos construtosHercules biespecíficos de C- terminal é encontrado na Tabela 16.

Tabela 16. Plasmídeos intermediários e de expressão codificando 'Hercules'

<table>table see original document page 291</column></row><table>

C. Expressão Transitória de Anticorpos Biespecíficos em Células CHO

DNAs de plasmídeo pXWU005, pXWU026, pXWU027, pXWU028;e pXWU006, pXWU034, pXWU035, e pXWU036 (Tabela 16) foram usadospara transformar células CHO DG44 para produção transitória de proteínade anticorpo. Cada 20 ug de plasmídeo de DNA foi combinado com 4 χ 106células em um volume de 0,4 ml de 1XPBS. A mistura foi adicionada a umacuvette de 0,4 cm (BioRad) e colocada sobre gelo por 15 min. As célulasforam eletroporadsa a 600 uF e 350 volts com um eletroporador Gene Pulser(BioRad). As células foram colocadas no meio CHO-SSFM Il contendo 100uM de Hipoxantina e 16 uM de Timidina dentro de um frasco T-25 e incuba-das a 37° por 4 dias.

Sobrenadantes contendo proteínas Hercules produzidas por es-te sistema de expressão CHO transitório foram coletados e avaliados porWestern Blot. A Figura 32 mostra que os anticorpos Hercules contendo ou oligante VH44:VL100 (ds = dissulfeto) ou VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFvsestabilizados aprimoraram dramaticamente as produções de expressão in-dependente de se a scFv foi fundida ao Nh- ou C- término (alamedas 3, 4, 7, 8). Surpreendentemente, não foi detectada proteína secretada com BHA10scFv selvagem nem fusões (GIy4Ser)4 Iigante BHA10 scFv N-terminal indi-cando o benefício de estabilização de scFv sobre expressão (alamedas 6 e7). Além disso, fusões convencionais BHA10 scFv e (GIy4Ser)4 IiganteBHA10 scFv C-terminal apresentaram uma quantidade significativa de umsubproduto de -55-60 de peso molecular a qual é substancialmente reduzi-da nos construtos estabilizados sugerindo que a estabilização de scFv podemelhorar a qualidade do produto.

D. Ensaio ELISA de Ligação Biespecífica

Os sobrenadantes foram testados para atividade de ligação indi-vidual a TRAIL R2 e LTpR receptores produzidos de modo recombinante emensaios ELISA. Em ambos os ensaios, o receptor foi imobilizado sobre lâmi-nas e as amostras de ensaio foram incubadas para permitir ligação a recep-tor. Amostras ligadas foram detectadas com anticorpo marcado.

Lâminas de microtítulo de 96 cavidades Immulon Il (Fisher, Catn- 14245-61) foram revestidas com 100 μΙ/ cavidade de 2 μg/ml de LTpR-Igem tampão Na2CO3 / NaHCO3 pH 9.5, de um dia para o outro a 4 -C e blo-queadas com 200 μΙ de tampão de diluição (0,5% de leite em pó sem gordu-ra Nonfat Dry Milk em PBS mais 0,01% de Thimerosal) por 1 h a 37 9C. Naetapa seguinte, 100 μΙ de sobrenadante 'Hercules' individual ou proteína pu-rificada em tampão de diluição foi adicionado a cavidades em duplicata eincubado por 1 h a 37 -C. Depois de lavar com água corrente, 100 μΙ de 100ng/ml de proteína de fusão TRAIL-R2 Fc 6X-His marcada (R&D Systems,Minneapolis1 MN) foi adicionado às cavidades e incubado por 1 h a 37 QC.Depois de lavar, 100 μΙ de uma diluição a 1/2000 de Conjugado Penta-HisHRP (QIAGEN, Cat n2 34460) foi adicionado a cada cavidade e incubado por1 h a 37 eC. Depois de lavar, 100 μΙ/ cavidade de um Substrato HRPO com-binado a TMB Peroxidase Substrato /Peroxidase Solução B (Kirdgaard ePerry Labs, Cat. 50-76-00) foi adicionado. A reação foi interrompida com 100μΙ de 2 M de H2SO4 depois de 5 a 10 min. O OD foi medido a 450 nm e 540nm usando uma leitora de lâminas Molecular Devices e foram geradas cur-vas de ligação.

As Figuras 33 e 34 mostram que tanto os anticorpos Herculesde N- terminal (Figura 33A, 34A) e quanto de C- terminal (Figura 33B, 34B)contendo ou a BHA10 scFv estabilizada por VH44:VL100 (ds = dissulfeto) oupor ligante VH44:VLlOO/(Gly4Ser)4 mostram aprimorada ligação a LTpR (Fi-gura 33) e TRAIL R2 (Figura 34), respectivamente, comparados com Hercu-Ies contendo um BHA10 scFv convencional (wt).

E. Expressão Estável de Anticorpos Biespecíficos em Células CHO, Purifi-cação de Anticorpos, e Caracterização.

DNAs de plasmídeo pXWU027, pXWU028, e pXWU006, pX-WU035, e pXWU036 (Tabela 16) foram usados para transformar célulasCHO DG44 deficientes de DHFR para produção estável de proteína de anti-corpo. Células transfectadas foram cultivadas em meio α menos MEM con-tendo 2 mM de glutamina suplementada com 10% de soro fetal bovino diali-sado (Invitrogen Corporation) e enriquecido como um conjunto de cultura decarga estável usando anticorpos marcados com fluorescente e classificaçãocelular ativada por fluorescente reiterativa (FACS) (Brezinsky, et al. J Immu-nol Methods. 277(1-2): 141-55 (2003)). FACS também foi usada para gerarlinhagens celulares individuais. Conjuntos de células ou linhagens celularesforam adaptados para condições livres de soro e aumentados em escalapara produção de anticorpos.

Os sobrenadantes de conjuntos de células CHO transfectadasou linhagens celulares expressando 1) Hercules de C -terminal com aBHA10 scFv estabilizada por VH44:VL100 e 2) Hercules de C- terminal com aBHA10 scFv estabilizada por Iigante VH44:VL1 OCV(GIy4Ser)4, bem como li-nhagens de células CHO clonais expressando 3) Hercules de N- terminalcom a BHA10 scFv estabilizada por VH44:VL100 e 4) Hercules de N- terminalcom a BHA10 scFv estabilizada por Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4 foram co- Ietadas e purificadas usando coluna de Proteína A Sepharose FF (6 mL) u-sando um PBS1 10 mM de tampão de fluxo EDTA. Proteínas Hercules foramelutriadas usando 0,1 M de glicina, pH 3.0 e neutralizadas imediatamentepara pH 7.5-8.5 usando base Tris. Além disso, C-Hercules contendo aBHA10 scFv convencional foi expressado e purificao por cromatografia deProteína A para comparação. Proteína A elutria de C-Hercules contendo aBHA10 scFv convencional, Hercules de C-terminal com a VH44:VL100BHA10 scFv, e Hercules de C-terminal com a VH44:VL100/(GIy4Ser)4 BHA10scFv foram examinados para a presença de agregados por cromatografia deexclusão de tamanho analítica (Figura 35). O perfil do cromatograma de C- Hercules contendo a BHA10 scFv convencional apresentou ~ 40% de agre-gados. Em contraste, Hercules de C-terminal com a VH44:VL100 BHA10scFv reduziu o nível de agregados para 20% e estabilização adicional atingi-da através de Hercules C-terminal com a VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10scFv reduziu o nível de agregados para 10%. O nível de agregação pareceu depender das propriedades da scFv e não se foi anexado ao Nh- ou C-término da IgG 14A2 (dados não mostrados). Os eluentes de proteína AHercules foram adicionalmente purificados por diálise em 0,1 M de acetato,pH 5.0, e purificação por cromatografia de permuta catiônica MonoS (GEHealthcare) usando um tampão de fluxo idêntico ao dialisado. ProteínasHercules foram elutriadas usando uma etapa de gradiente para 0,1 M deacetato, pH 5.0, 0,5 M de NaCI. Os eluentes MonoS foram coletados e pas-sados através de uma coluna SEC de preparativo TosoHaas para removeragregados.

As Figuras 36A e 36B mostram géis SDS-PAGE de Hercules deN- terminal purificado com o BHA10 scFv estabilizado por VH44:VL100 eHercules de Nh- terminal com o BHA10 scFv estabilizado por IiganteVH44:VL100/(Gly4Ser)4 e Hercules de C- terminal com o BHA10 scFv estabi-lizado por VH44:VL100 e Hercules de C- terminal com o BHA10 scFv estabili-zado por Iigante VH44:VLl00/(Gly4Ser)4, respectivamente. As alamedas re-duzidas mostram os tamanhos esperados das proteínas de cadeia pesada eleve. De modo importante, não há nível significativo de subprodutos de pesomenor molecular degradados ou indesejados que tenha sido freqüentementeobservado com Hercules contendo domínios scFv selvagens.

A Figura 37 (Painéis A e C) mostra os perfis de eluição SEC a-nalítica de Hercules de Nh- terminal com a BHA10 scFv estabilizada porVH44:VL100 e Hercules de Nh- terminal com a BHA10 scFv estabilizada porligante VH44:VL1 OOZ(GIy4Ser)4, respectivamente, subseqüente à etapa depurificação de proteína A inicial. A Figura 37 (Paneis BeD) também mostraos perfis de eluição SEC analítica de Hercules de NH-terminal com a BHA10scFv estabilizada por VH44:VL100 e Hercules de Nh- terminal com a BHA10scFv estabilizada por Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4, respectivamente, de- pois de remoção por SEC do preparativo de contaminantes de proteína não-monomérica residual. Similarmente, Figura 38 (Painéis A e C) mostra os per-fis de eluição SEC analítica de Hercules de C- terminal com a BHA10 scFvestabilizada por VH44:VL100 e Hercules de C- terminal com a BHA10 scFvestabilizada por Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4, respectivamente, subseqüen- te à etapa de purificação de proteína A inicial. A Figura 38 (Painéis BeD)mostra os perfis de eluição SEC analítica de Hercules de C-terminal com aBHA10 scFv estabilizada por VH44:VL100 e Hercules C- terminal com aBHA10 scFv estabilizada por Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4, respectivamen-te, depois de remoção por SEC do preparativo de contaminantes de proteína não-monomérica residual. Estes estudos demonstram que a estabilização daBHA10 scFv por adição ou do VH44:VL100 dissulfeto ou do VH44:VL100 dis-sulfeto e (GIy4Ser)4 Iigante resulta em quantidades de preparativo de >98%pure, anticorpo biespecífico Hercules monomérico que é essencialmentelivre de espécies de peso molecular de superior.

Estudos de DSC realizados sob condições idênticas demons-tram que C-Hercules VH44:VL100/(GIy4Ser)4 BHA10 scFv é mais termoestá-vel do que C-Hercules contendo convencional BHA10 scFv (Figura 39). Operfil de desnaturação para C-Hercules contendo BHA10 scFv convencionalinicia ~5 -C temperatura menor do que o perfil observado para o C-HerculesVH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv. Estes resultados sugerem que a scFvpode limitar a termoestabilidade global das moléculas Hercules. Isto se cor-relaciona com um aumento de 5 qC da Tm observada para a VH44:VL100/(GIy4Ser)4 BHA10 scFv em relação à BHA10 scFv convencional.

Versões purificadas dos construtos Hercules estabilizados foramentão testados para atividade de ligação biespecífica a receptores TRAIL-R2e LTpR produzidos de modo recombinante em uma prova ELISA. Nesta pro-va LTpR Ig receptor foi imobilizado sobre lâminas e amostras de ensaio fo-ram em seguida incubadas para permitir ligação a receptor. Amostras nãoligadas foram removidas por lavagem seguida por uma segunda etapa deincubação com TRAIL R2- (His)6. Depois de uma etapa de lavagem, com-plexos duplamente ligados foram detectados com um anticorpo anti- (His)6marcado. Os resultados deste estudo e a concentração eficaz (EC50, emμg/ml) na qual cada construto são representados na Figura 40. A Figura 40mostra que tanto os anticorpos Hercules de N- terminal quanto de C- termi-nal com ou a BHA10 scFv estabilizada por VH44:VL100 (ds=dissulfeto) oupor Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4 demonstram clara ligação biespecífica tan-to a LTpR quanto a TRAIL R2. Uma versão multivalente (pentamérica) deum de anticorpo ligação de LTpR (CBE11) foi usado como um controle parademonstrar que reconhecimento único de LTpR somente não induz sinal naprova de ligação.

Exemplo 8. Aumento em Escala da Produção de Anticorpos "Hercules" Bi-específicos Estabilizados em Células CHO

Linhagens de células CHO DHFR-deficièntes transfectadas es-tavelmente com DNAs de plasmídeos pXWU028 e pXWU036 (Tabela 16)foram tríadas para selecionar isolados celulares únicos que são capazes deexpressar altos níveis de moléculas Hercules solubilizadas e adequadamen-te dobradas que foram estabilizadas usando os métodos da invenção. Osmétodos de triagem celular empregaram a análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de Brezinky et al. (Brezinky et ai, J Immu-nol Meth (2003). 277:141-155). Em resumo, anticorpos anti-Hercules cometiqueta fluorescente foram usados para marcar células CHO apresentandoexpressão transitória de anticorpos Hercules sobre sua superfície. Céulasapresentando uma assinatura de intensidade de fluorescência foram entãoselecionadas adequando a comutação do equipamento de classificação ce-lular à assinatura. Células únicas apresentando altos níveis de produtividadeforam selecionadas deste modo e adaptadas para condições livres de soropara estabelecer linhagens celulares produtoras estáveis. As linhagens celu-lares produtoras foram subseqüentemente aumentadas em escala para pro- dução e purificação da proteína de anticorpo biespecífico.

80 L de sobrenadante de Hercules de N- terminal contendoVH44:VLl00/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv (XWU028) de uma rodada de biorreatorde 11 dias foi colhido e pré-clareado por ultrafiltração. O anticorpo biespecí-fico foi capturado por cromatografia de Proteína A e elutriado em volume de 1218 ml. A fração de Proteína A foi adicionalmente purificada em dois lotesseparados por cromatografia de permuta aniônica seguida por cromatografiade exclusão de tamanho do preparativo. O primeiro lote produziu 825,5 mgem uma concentração de 4,85 mg/ml em PBS com 98,9% de pureza e umacarga de endotoxina de 0,13 EU/mg. O segundo lote produziu 318 mg emuma concentração de 10,3 mg/ml com uma pureza de 99,1% e uma cargade endotoxina de 2,37 EU/mg. Um total de 1143,5 mg de Hercules de N-terminal monomérico altamente purificado contendo VH44:VL100/(Gly4Ser)4BHA10 scFv foi recuperado.

24 L de sobrenadante de Hercules de C- terminal contendo Vh44:Vl1 00/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv (XWU036) de uma rodada de biorreatorde 11 dias foi colhido e pré-clareado por ultrafiltração. O anticorpo biespecí-fico foi purificado em dois lotes separados conforme descrito acima usandocromatografia de Proteína A para capturar produto bruto seguida por croma-tografia de permuta aniônica e cromatografia de exclusão de tamanho dopreparativo. O primeiro lote produziu 985,5 mg em uma concentração de 13mg/ml com 98,5% de pureza e uma carga de endotoxina de 0,01 EU/mg. Osegundo lote produziu 570 mg em uma concentração de 11,42 mg/ml comuma pureza de 99 % e uma carga de endotoxina de 1,91 EU/mg. Um total de1555,5 mg de Hercules de C- terminal monomérico altamente purificado con-tendo Vh44:Vl1 OOZ(GIy4Ser)4 BHA10 scFv foi recuperado.

Uma linhagem de células CHO produtoras do anticorpo biespe-cífico XWU054 foi isolada e foi visto que produzem 21,5 mg/L. Isto está den-tro da faixa esperada para linhagens de células CHO não amplificadas emgrau de pesquisa e nós preveríamos produtividade muito maior se fôssemosgerar uma Linhagem de Células de Produção.

Estes estudos de aumento em escala da produção foram con-duzidos com linhagens de células CHO não amplificadas e ainda resultaramem produções excedentes de 1 gm de anticorpos biespecíficos biofisicamen-te estáveis e de alta qualidade. Presumivelmente uma estratégia de amplifi-cação de linhagem celular aumentaria muito a produtividade celular das li-nhagens de células CHO transfectadas possibilitando o desenvolvimento deprocessos adequados para aplicações comerciais. Estes estudos exemplifi-cam a utilidade dos métodos descritos nesta invenção para possibilitar oaumento em escala da produção de anticorpos biespecíficos estáveis emuma linhagem celular (por exemplo, CHO) adequada para fabricação.

Exemplo 9. Atividade Biológica de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos

Linhagens de células tumorais WiDr, (ATCC CCL-218) uma li-nhagem celular de carcinoma de cólon humano, Me180, (ATCC HTB 33)uma linhagem celular de carcinoma epitelial cervical humano, e MDA231,(Dr. Dajun Yang, University of Michigan) uma linhagem celular de carcinomade mama humano foram cultivadas em MEM-EarIes com 10% de FCS, 2 mMde L-Glutamina,1X aminoácidos não-essenciais, 0,5 mM de piruvato de só-dio, e Penicilina / Estreptomicina. Linhagens de células tumorais foram en-xaguadas uma vez com PBS e as células foram Iiberadsa por digestão comtripsina. As células foram coletadas por centrifugação, ressuspendida emmeio completo, contadas e semeadas em lâminas de cultura de tecido de 96cavidades a 5000 células/ cavidade para WiDr e Me180 e 1500 células/ ca-vidade para MDA231. IFND humano (Biogen Idec, Corp) é adicionado àssuspensões de células para resultar em uma concentração final de citocinade 80 U/ml para WiDr e MDA231 e 50 U/ml para Me180. 50 μΙ da suspensãode células tumorais / IFNy foram misturadas com 50 μΙ de 2X diluições seri-ais de 3 dobras concentradas de anticorpos de ensaio preparados em meiocompleto. As concentrações finais de anticorpos de ensaio tipicamente varia-ram de 5000 pM a 0,07 pM. As células foram cultivadas por 4 dias (WiDr &Me180) ou 3 dias (MDA231) a 37 0C em uma câmara umidificada com 5%de CO2 e destruição celular avaliada pela adição de 20 μί7 cavidade de rea-gente Promega CeIITiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega Corporation, Madison1 Wl). As lâminas foram lidas em uma leitora de lâminas de microtítulo a 490 nM (Spectromax Plus1 Molecular Devices,Sunnyvale CA). Foi feito gráfico dos dados usando Microsoft Excel (Microsoftlnc, WA).

Os resultados destes estudos são mostrados nas Figuras 41A-41 D. A Figura 41A mostra que o anticorpo 14A2 IgG teve atividade modestapara inibir o crescimento de células tumorais WiDr e em combinação comBHA10 IgG apresentou um ligeiro aumento em atividade anticélulas tumoraiscomparado com BHA10 IgG somente. Em contraste, ambos os anticorposHercules biespecíficos apresentaram aumento da destruição de células tu-morais das células WiDr. A Figura 41B mostra que tanto os anticorpos 14A2IgG quanto BHA10 IgG tiveram atividade modesta, se não desprezível, nainibição do crescimento de células tumorais Me180 como agentes únicos ouem combinação. Em contraste, ambos os anticorpos Hercules biespecíficosapresentaram destruição de células tumorais das células Me180 cells. A Fi-gura 41C mostra que tanto os anticorpos 14A2 IgG quanto BHA10 IgG tive-ram atividade desprezível na inibição do crescimento de células tumoraisMDA231 como agentes únicos e talvez alguma atividade quando usados emcombinação. Em contraste, o anticorpo Hercules biespecífico XWU036 (Her-cules C- terminal com o BHA10 scFv estabilizado pelo Iigante VH44:VL100/(GIy4Ser)4) apresentou destruição de células tumorais das células MDA231.A Figura 41D mostra que nenhum dos anticorpos demonstra qualquer ativi-dade para células endoteliais da veia umbilical humana cultivadas de contro- Ie (HUVEC) demonstrando que a atividade de destruição celular dos anticor-pos biespecíficos não é indiscriminada. HUVEC mostra coloração positivapara LTpR e TRAIL-R2 por análise FACS (dados não mostrados) indicandopresença de receptores e que a atividade do anticorpo biespecífico pode serdependente de gatilho específico ou componentes de caminho único em cé- lulas tumorais.

Exemplo 10. Estudos da Estabilidade de Anticorpos "Hercules" BiespecíficosForam conduzidos estudos da estabilidade em tempo real dasamostras de anticorpos biespecíficos de N- e C-terminal XWU028 (BHA10scFv Vh44:Vi_1 00/(Gly4Ser)4 N- Hercules) e XWU036 (BHA10 scFv VH44: VL100/(Gly4Ser)4 C-Hercules) armazenados em 2 a 8 9C por três meses. Aqualidade da proteína foi avaliada para (1) agregação, (2) precipitação, (3)clivagem de polipeptídeo ou proteólise, e (4) modificações pós-translacionaistais como deamidação ou oxidação.

As amostras de anticorpos biespecíficos de N- e C-terminal dealta e baixa concentração usadas para os estudos foram XWU028 a 1,8mg/mL (Baixa) e 10,3 mg/mL (Alta) e XWU036 a 5,0 mg/mL (Baixa) e 11,4mg/mL (Alta). Os anticorpos foram formulados em PBS. Para o estudo daestabilidade, amostras dos pontos de tempo inicial (T = 0), intermediário (T =1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses) e final (T = 3 meses) foram analisa-das imediatamente depois da coleta da amostra. Além disso, amostras inici-ais (T = 0) foram congeladas e armazenadas a -70 eC até serem degeladaspara análises secundárias ao final do estudo de 3 meses. IgG BHA10 (8,7mg/mL) foi usada como controle e foi manuseada de modo similar.A. Análise de agregação e precipitação de proteína

A agregação ou precipitação de proteína foi monitorada usandocromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC) encadeada a disper-são luminosa inline e detectores de do índice refrativo (Wyatt Technologies,MiniDawn e rEX, respectivamente). A análise SEC / de dispersão luminosanão mostrou evidência de agregação ou perda de material que possa ocorreratravés de precipitação. Os perfis de eluição SEC dos pontos de tempo inici-al, T = 0, e final, T = 3 meses, para XWU028, XWU036, e o anticorpo BHA10foram quase idênticos (Figuras 56A, 56B, e 56C, respectivamente). As a-mostras XWU028 e XWU036 acumularam ambas -1% de material agregadopor volta do completamento do estudo; no entanto a detecção destes agre-gados foi próxima do menor limite de detecção determinado para este méto-do (Tabela 17). A formação de agregados foi independente da concentraçãode proteína. Com base nas massas moleculares determinadas usando de-tecção de dispersão luminosa, é possível que os baixos níveis de agregadosnas amostras de ensaio sejam provavelmente um produto de espécies mo-nomérica\s convertendo para dímeros. Nenhuma das amostras de anticor-pos biespecíficos, XWU028 ou XWU036, acumulou níveis detectáveis deagregados de alta ordem, muito embora este tipo de agregado pudesse tersido facilmente observado usando estes métodos. O anticorpo BHA10 nãodemonstrou aumento em agregados durante o curso de 3 meses do estudo(Tabela 17).

Tabela 17. Percentagem de monômero detectado usando cromatografia deexclusão de tamanho analítica.

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B. Análises de proteólise e de modificação Pós-translacional

A proteólise foi monitorada usando SDS-PAGE e análise demassa intacta por cromatografia líquida / espectroscopia de massa (LC/MS)(Agilent LC/MSD TOF acoplado a um sistema Agilent 1100 LC através deuma interface de electrospray). Para análise SDS-PAGE, 5 ug de proteína foicarregado por alameda. Amostras reduzidas foram preparadas em 1X tam-pão de amostra de Tris-glicina contendo 5% de β-mercaptoetanol. XWU028e XWU036 não apresentaram evidência de proteólise durante o período dearmazenamento de 3 meses em 2 a 8 °C conforme determinado por análiseSDS-PAGE não-redutora e redutora (Figuras 57A e B). Similarmente, XWU028 eXWU036 não apresentaram evidência de produtos proteolíticos de peso mo-lecular inferior durante o período de armazenamento de 3 meses em 2 a 8°C conforme determinado por análise LC/MS (Figura 58).

Modificações pós-translacionais foram monitoradas usandoLC/MS. Amostras de T = 0, T = 1 mês, e T = 3 meses foram analisadas tantona forma não-reduzida quanto reduzida. Amostras reduzidas foram prepara-das tratando em 50 mM de DTT / 4 M de cloridrato de guanidina por 1 hora a37°C. Tampão A de HPLC consiste de 0,03% de TFA em água e tampão Bde HPLC contém 0,025% de TFA em acetonitrila. A taxa de fluxo foi mantidaconstante a 100 μl por minuto. 7,5 μg de cada amostra (reduzida e não-reduzida) foi injetado sobre uma coluna C4 de 2,1 χ 50 mm e analisado porAgilent ESI-TOF. Um método de ligar-e-eluir foi usado para amostras não-reduzidas ao passo que um método de gradiente foi usado para amostrasreduzidas. Foram obtidos espectros usando o pacote de software Analyst edesconvolutos usando o pacote de software MaxEntI incluídos com a ins-trumentação. Espectros de massa desconvolutos de XWU028 e XWU036(altas concentrações) em T = 0, T = 1 mês, e T = 3 meses são mostrados naFigura 58. Nem XWU028, nem XWU036, demonstraram quaisquer altera-ções detectáveis em seus espectros de massa, indicando ausência de modi- ficação pós-translacional que potencialmente pode afetar de modo adverso afunção ou estabilidade de anticorpos biespecíficos.

Tomados juntos, os dados indicam que ambos os anticorposbiespecíficos de N- e C-terminal contendo domínios scFv estabilizados sãoestáveis sob condições de armazenamento prolongado tais como as reque-ridas para produtos de fármacos biológicos. Estes resultados são particular-mente estimulantes porque estes estudos de estabilidade foram conduzidoscom os anticorpos biespecíficos de N- e C-terminal preparados em um tam-pão simples (PBS) e não com soluções preparadas com formulações ótimas.Exemplo 11. Atividade Farmacocinética In Vivo e Estabilidade Sérica de An-ticorpos "Hercules" Biespecíficos

Uma injeção de bólus único de 10 mg/kg (1 mg/ml) de Herculesde N- terminal (XWU028) ou Hercules de C- terminal (XWU036) diluído emsalina tamponada com fosfato (PBS) foi administrada por via intraperitonealem camundongos machos CB17- scid. Os camundongos foram sacrificadosem 0, 0.5, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 240, e 336 horas pós-injeção usando trêscamundongos por ponto de tempo para cada anticorpo biespecífico. Amos-tras de soro foram preparadas para análise por ensaio ELISA para quantifi-car os níveis dos anticorpos biespecíficas. Lâminas de ELISA foram revesti-das com IgG de cabra-anti-humana, bloqueada com PBS / 1% de BSA, ediluições de soro contendo os anticorpos biespecíficos foram diluídas serial-mente em PBS / 1 % de BSA, adicionadas às lâminas e incubadas. Anticor-pos capturados foram detectados com um anticorpo ligado a HRP de dadeiakappa de cabra-anti-humana. Os resultados do estudo farmacocinético sãomostrados na Tabela 18. Hercules de N- terminal (XWU028) tem uma meia-vida de eliminação (ty2) de 10,3 dias com uma concentração sérica máximade 85,67 μο/ιηΙ. Hercules de C- terminal (XWU036) tem uma meia-vida deeliminação mais longa (ty2) de 15,1 dias com uma concentração sérica máxi-ma de 105,67 μg/ml. Ambas as moléculas têm volumes similares de distribu-ição (Vd) embora ^stes valores não tenham sido ajustados para biodisponibilidade.

Tabela 18. Parâmetros Farmacocinéticos

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* não ajustado para biodisponibilidadeAmostras de soro também foram analisadas no ELISA de liga-ção biespecífica descrito no Exemplo 7. Neste ensaio, as amostras de sorocontendo Hercules N- terminal (XWU028) ou Hercules C- terminal (XWU036)descritas acima foram testadsa para atividade de ligação biespecífica a re-ceptores TRAIL-R2 e LTpR produzidos de modo recombinante em um en-saio ELISA. As Figuras 59A e B mostram que amostras de soro de camun-dongos tratados com Hercules de N- e C- terminal contêm anticorpos queligam de modo biespecífico tanto a TRAIL-R2 quanto a LTpR e são intima-mente paralelos aos perfis de eliminação observados a partir do estudo far-macocinético indicando que os anticorpos biespecíficos estão permanecen-do intactos sob condições fisiológicas por períodos de tempo prolongado.

Exemplo 12. Atividade Biológica In Vivo de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos

(A) Atividade Biológica In Vivo de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos emum Modelo de Tumor de Câncer do Cólon

Células de carcinoma de cólon humano WiDr (2x10E6 célulaspor camundongo) foram implantadas por via subcutânea em 125 camundon-gos nus atímicos. Os tumores foram cultivados até atingirem aproximada-mente 100 mg, ponto no qual um total de 70 camundongos foram seleciona-dos para o estudo, divididos em 7 grupos de 10 camundongos. Foram admi-nistrados tratamentos IP, iniciando no dia 13 pós-implantação, como se se-gue: Grupo 1 = PBS sem pirogênio; Grupo 2 = CBE11, 2 mg/kg, 1x/ semana;Grupo 3 = hBHA10, 2 mg/kg, 2x/ semana; Grupo 4 = ch14A2, 2 mg/kg, 2x/semana; Grupo 5 = Hercules-Il XWU028, 2 mg/kg, 1x/ semana; Grupo 6 =Hercules-Il XWU036, 2 mg/kg, 1x/ semana; Grupo 7 = hBHA10 + ch14A2, 1mg/kg each, 2x/ semana. Os tamanhos dos tumores e os pesos corporaisforam registrados bissemanalmente. O estudo foi terminado quando o tama-nho médio do tumor do grupo de veículo atingiu aproximadamente 2000 mg.O volume do tumor foi calculado usando a fórmula: (L χ W2/2). Análises inte-rinas de camundongos tratados com o XWU028 e XWU036 apresentaramatividade antitumoral significativa (p < 0,001) para ambos os anticorpos bi-específicos comparados com veículo controle de PBS (Figura 60).Para XWU028, foram observadas reações antitumorais significa-tivas (p < 0,05) comparadas com reações com tratamento único com mAbhBHAIO ou ch14A2. Para XWU036, foi observada uma reação antitumoralsignificativa (p < 0,05) comparada com a reação com tratamento com mAbch14A2 e, notavelmente, uma maior reação significativa (p < 0,01) compara-da com mAb hBHAIO. De modo importante, os anticorpos biespecíficos de-monstraram superior atividade antitumoral in vivo embora administrados so-mente uma vez por semana sugerindo que os reforços da estabilidade des-critos nesta invenção resultam em aprimoradas propriedades de anticorpo eestabilidade física sob condições fisiológicas.

(B) Atividade Biológica In Vivo de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos emum Modelo de Tumor de Câncer do Mama

Células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 foramimplantadas por via subcutânea em 135 camundongos nu atímicos (2x10E6células por camundongo). Os tumores foram cultivados até o dia 13 ponto noqual 75 camundongos portando tumor com um tamanho médio de aproxima-damente 168 mg foram atribuídos a grupos de tratamento (N = 10) e de con-trole de veículo (N = 15). Os camundongos receberam anticorpos e veículoIP iniciando no dia 13. Grupos exemplares são mostrados como se segue:Grupo 1 = PBS sem pirogênio; 1x/ semana; Grupo 2 = hBHAIO, 2 mg/kg, 2x/semana; Grupo 3 = ch14A2, 2 mg/kg, 2x/ semana; Grupo 4 = Hercules-IlXWU036, 2 mg/kg, 1x/ semana; Grupo 5 = hBHAIO + ch14A2, 1 mg/kg cada,2x/ semana. Os tamanhos dos tumores e os pesos corporais foram registra-dos bi-semanalmente. O estudo foi terminado quando o tamanho médio dotumor do grupo de veículo atingiu aproximadamente 2800 mg. O volume dotumor foi calculado usando a fórmula: (L χ W2/2). XWU036 demonstrou ativi-dade antitumoral estatisticamente significativa (p < 0,001) comparado comqualquer tratamento único com hBHAIO ou ch14A2 mAbs ou com tratamen-to com uma mistura dos dois anticorpos. De modo importante, o anticorpobiespecífico XWU036 demonstrou boa atividade antitumoral in vivo adminis-trado em um esquema de dosagem de uma vez por semana sugerindo queos reforços da estabilidade descritos nesta invenção resultam em aprimora-das propriedades de anticorpo e estabilidade física sob condições fisiológi-cas (vide a Figura 86).

Exemplo 13. Produção de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos EstabilizadosContendo Mutações scFv Estabilizantes Não-covalentes

BHA10 scFvs da invenção contendo mutações estabilizantesnão-covalentes somente e em combinação com uma ligação dissulfetoVh44-Vl100 foram usados para construir anticorpos C-Hercules biespecíficosestabilizados compreendendo uma fusão de anticorpo de IgG 14A2 quiméri-co que liga a TRAIL R2 receptor com um BHA10 scFv que liga a LTfiR. Osanticorpos biespecíficos foram construídos como fusões de BHA10 scFv deC-terminal usando métodos essencialmente conforme descrito no Exemplo 7.A. Construção de Anticorpo Biespecífico C-Hercules com BHA10 Vh S16E +Vl S46L e Vh44-V, 100/Vh S16E + V, S46L scFvs

PCR foi usado para amplificar fragmentos genéticos de BHA10scFv variantes de DNAs de plasmídeo plEH-050 (plasmídeo parental doplasmídeo de elevada expressão plEH076) e plEI-K)52 (plasmídeo parentaldo plasmídeo de elevada expressão plEH080) contendo os BHA10 Vh S16E+ Vl S46L e VH44-VL100/VH S16E + Vl S46L scFvs, respectivamente usandoos iniciadores de oligonucleotídeo descritos na Tabela 19. Os fragmentosgenéticos de BHA10 scFv variantes foram isolados em gel. Devido a um sítioBamHI na região de Iigante de plasmídeos plEH-050 e plEH-052, os frag-mentos genéticos foram digeridos com endonucleases de restrição pPuM I eKpn I e ligados ao plasmídeo modificado pN5KG1 digerido com as mesmasendonucleases de restrição resultando em um produto de fusão dos scFvsanti-LTBR estabilizados (BHA10) ao término carboxila do domínio CH3 doanticorpo anti-TRAILR2 (14A2) através de um Iigante de 16 aminoácidosSer(Gly4Ser)3. Seqüências corretas foram confirmadas por análise de se-qüência de DNA.

Tabela 19. Oligonucleotídeos para amplificação por PCR de BHA10 Vh S16E+ Vl S46L e VH44-VL100/Vh S16E + Vl S46L scFvs.<table>table see original document page 307</column></row><table>

Fusão da seqüência genética de BHA10 scFv Vh S16E + VlS46L ao término carboxila da seqüência genética de cadeia pesada do anti-corpo anti-TRAlL R2 produziu o plasmídeo pXWU054. Fusão da seqüênciagenética de BHA10 scFv VH44-VL100/VH S16E + Vl S46L ao término carbo-xila da seqüência genética de cadeia pesada do anticorpo anti-TRAlL R2produziu o plasmídeo pXWU055.

As misturas de ligação foram usadas para transformar 10 célu-las competentes de E. coli cepa TOP (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).Colônias de E. coli transformadas para resistência ao fármaco ampicilina foram tríadas para presença de inserções. Análise de seqüência de DNAconfirmou a seqüência correta dos construtos finais. O DNA de cadeia leve14A2 quimérico (SEQ ID NO: 28) e seqüências de aminoácidos (SEQ ID NO:29) são mostrados nas Figuras 15A e 15B. O DNA de cadeia pesada (SEQID NO: 52) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) para anticorpo bi-específico C-Hercules BHA10 scFv Vh S16E + Vl S46L são mostrados nasFiguras 61 e 62, respectivamente. O DNA de cadeia pesada (SEQ ID NO:54) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) para anticorpo biespecífi-co C-Hercules BHA10 scFv VH44-VL100/VH S16E + Vl S46L são mostradosnas Figuras 63 e 64, respectivamente.

As cadeias pesadas empregaram o mesmo peptídeo de sinalusado previamente.

B. Expressão Estável de Anticorpos Biespecíficos em Células CHO. Purifica-ção de Anticorpos, e Caracterização.

Linhagens de células CHO deficientes de DHFR transfectadasde modo estável com DNAs de plasmídeo pXWU054 e pXWU055 e adapta-das para condições livre de soro foram escaladas para produção de proteínade anticorpo biespecífico e proteínas purificadas conforme descrito no E-xemplo 8. A proteína A elutria de sobrenadantes contendo C-Hercules com oanticorpo biespecífico estabilizado Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv e C-com o Vh44-Vl100/Vh S16E + Vl S46L ΒΗΑ10 scFv estabilizado foram exa-minados para a presença de agregados por cromatografia de exclusão detamanho analítica (Figura 65). O perfil do cromatograma de C-Hercules con- tendo o BHA10 scFv convencional mostrou ~ 40% de agregados. Em con-traste, Hercules de C-terminal com o Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv esta-bilizado reduziu significativamente agregados para níveis comparáveis aosobservados com IgGs de rotina.

As Figuras 66A e 66B mostram géis SDS-PAGE de Hercules de C-terminal purificado com os Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv e Hercules deC-terminal com os VH44:VL100/VH S16E + Vl S46L BHA10 scFv, respecti-vamente. As alamedas reduzidas mostram os tamanhos esperados das pro-teínas de cadeia pesada e leve. De modo importante, não há nível significa-tivo de subprodutos de peso molecular inferior degradados ou indesejadosque tenham freqüentemente sido observados com Hercules contendo domí-nios scFv selvagens .

As Figuras 67A e 67B mostram os perfis de eluição SEC analíti-cos de Hercules de C-terminal com os Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv eHercules de C-terminal com os VH44:VL100/VH S16E + Vl S46L BHA10 scFv, respectivamente, subseqüente à etapa de purificação de proteína Ainicial. Estes estudos demonstram que a estabilização do BHA10 scFv poradição de mutações VH S16E + Vl S46L somente e em combinação com odissulfeto Vh44:Vl100 resulta em quantidades de preparativo >98% puro,anticorpo biespecífico Hercules monomérico que é essencialmente livre de espécies de peso molecular de ordem superior.

Exemplo 14. Atividade Biológica de Anticorpos "Hercules" Biespecíficos Con-tendo Mutações scFv Estabilizantes Não-covalentes

A atividade biológica in vitro de Hercules de C-terminal com osVh S16E + Vl S46L BHA10 scFv (XWU054) e Hercules de C-terminal com os Vh44:Vl1 00/Vh S16E + Vl S46L BHA10 scFv (XWU055) foram testadasna prova de proliferação de células tumorais conforme descrito no Exemplo7.Resultados destes estudos são mostrados na Figura 68. A Figu-ra 68B mostra que o anticorpo IgG 14A2 teve moderada atividade na inibiçãodo crescimento de células tumorais WiDr e em combinação com IgG BHA10apresentaram um ligeiro aumento na atividade anticélulas tumorais compa-rados com IgG BHA10 somente. Em contraste, ambos os anticorpos Hercu-les biespecíficos (XWU054 e XWU055) apresentaram aumentada destruiçãode células tumorais das células WiDr comparável à observada com a molé-cula XWU036 (Hercules de C- terminal com o BHA10 scFv estabilizado peloIigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4) descrita no Exemplo 10. A Figura 68A mostraque ambos os anticorpos 14A2 IgG e BHA10 IgG tiveram atividade despre-zível na inibição do crescimento de células tumorais MDA231 como agentesúnicos bem como quando usados em combinação. Em contraste, os anticor-pos Hercules biespecíficos (XWU054 e XWU055) apresentaram aumentadadestruição de células tumoraios das células MDA231 comparável à observa-da com a molécula XWU036 (Hercules de C- terminal com o BHA10 scFvestabilizado pelo Iigante VH44:VL100/(Gly4Ser)4) descrita no Exemplo 10.Exemplo 15: Utilização de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) paraMedir a Estabilidade Térmica de Seqüências de Anticorpos Humanos ouHumanizados

Para avaliar a faixa de estabilidades aparentes de anticorpos, foirealizada calorimetria de varredura diferencial (DSC) sobre uma série de 17anticorpos BIIB humanos ou humanizados.

Os anticorpos BIIB foram dialisados exaustivamente contra umtampão de 20 mM de citrato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio a pH 6.0.Dialisados foram usados dentro da célula de referência de um calorímetropara definir a linha basal de cada varredura de anticorpos. Subseqüente àdiálise, as concentrações de BIIB1-17 foram medidas por 280 nm de absor-vência (Pace et al., Protein Sei. 4, 2411-2423, 1995). Soluções de anticorposusadas para DSC foram preparadas universalmente a 1 mg/mL diluindo osestoques concentrados com seus dialisados.

Foram realizadas varreduras usando um calorímetro de varredu-ra diferencial capilar automático (capDSC, MicroCaI1 LLC). Soluções de pro-teína e de referência foram amostradas automaticamente de lâminas de 96cavidades usando a fixação robótica. Antes de cada varredura de proteína,foram realizadas 2 varreduras com tampão na célula da amostra e usadaspara subtração de fundo. Uma única varredura de limpeza foi realizada u-sando 5% de Liquinox depois de cada varredura de proteína. Depois de ca-da varredura, o instrumento enxaguou automaticamente tanto as células dereferência quanto de amostra com 3X 2 mL de H2O deionizada destiladacontendo 0,01% de azida de sódio. Foram realizadas varreduras em 19C/min usando o modo de feedback de meio para aumento da resoluçãomáxima. A faixa de varredura foi de 20 a 95 eC. Todas as lâminas de 96 ca-vidades contendo proteína foram armazenadas dentro do instrumento a 6'C.

As varreduras foram analisadas usando o software Origin supri-do pelo fabricante. Subseqüente à subtração do fundo, linhas basais nãozero foram corrigidas usando uma terceira ordem polinomial. As transiçõesde desdobramento de cada domínio de IgGI foram desconvolutas ajustandoas curvas multi-pico para 3 transições separadas. Domínios de IgGI e lgG4Fcy recombinantes foram utilizados para identificar os picos de Ch2 e Ch3dentro de cada transição. Presumiu-se que a uma ou mais transições restan-tes correspondem ao desdobramento da porção do anticorpo Fab.

A maioria das porções Fab dos 17 anticorpos desdobraram emtransições únicas aparentes com pontos centrais de desdobramento térmico(TMs) variando de 57 a 82 'C dependendo das propriedades únicas de cadaFv individual. Somente três anticorpos, BIIB15, BIIB16, e BIIB17 apresenta-ram 4 transições. Um traço de DSC de IgGI típico é mostrado na Figura69A. A Cpmax (isto é a altura de um pico de DSC) para porções Fab é geral-mente significativamente mais do que a do domínios Ch2 ou Ch3. Isto é ra-zoável considerando que a massa de proteína Fab dentro de um anticorpo é4 dobras maior do que a de ou os domínios Ch2 ou os Ch3, e a porção Fabdo anticorpo também contém área superficial enterrada entre 4 domínios aocontrário dos domínios Ch2 e Ch3 cujas transições envolvem cada a disrup-ção de somente uma única interface homodimérica. Em geral, as transiçõesobservadas para os domínios Ch2 e Ch3 de cada anticorpo IgGI se sobre-puseram bem uma sobre a outra. O mesmo é verdadeiro para os domíniosCh2 e Ch3 das 3 lgG4s. Por estas razões, as transições de Fab de cada mo-lécula de IgGI ou lgG4 foram prontamente identificadas. Um anticorpo (Bl-IB18) não foi estudado por DSC. BIIB18 expressou pobremente e nunca re-sultou em material solúvel / não-agregado. Este anticorpo foi incluída nasanálises de seqüências descritas no Exemplo 16.

Um dos anticorpos, BIIB7, foi analisado tanto no formato deIgGI quanto de lgG4 humanas. As aparentes termoestabilidades de Fab deBIIB7 no formato de IgGI e lgG4 conforme medido pelso pontos centrais desuas transições de desdobramento térmico (Tm) foram muito similares (videa Figura 69B). Variação na subclasse de domínio constante não afetou a Tmde Fab ou a entalpia do desdobramento calorimétrico de Fab.

As transições de sobreposição correspondentes aos domínios Ch2 e Ch3 do lgG4 Fc ocorrem em temperaturas significativamente menoresdo que as de IgGI e fazem artificialmente as transições de Fab parecerem-1-2 °C menores para lgG4. Uma vez que as transições de IgG sejam com-pletamente desconvolutas, as TMs de Fab estão muito próximas do que pa-recem nos traços de DSC (ΔΤΜ < 1 °C). O fato de que as curvas por DSC de Fab de BHB7 nos formatos de IgGI e lgG4 serem altamente similares suge-re que a termoestabilidade dos Fabs de IgGI e dos Fabs de lgG4 podem serdiretamente comparadas.

Medições por DSC com 17 dos anticorpos BIIB humanizadosindicam que as regiões Fv influenciaram extremamente a aparente estabili- dade de seus Fabs respectivos. Por exemplo, a Figura 70 demonstra as cur-vas de DSC muito diferentes obtidas para BIIB1, BIIB4, BIIB6 e BIIB16. To-dos os quatro anticorpos são IgGI, e a únicas diferenças de seqüências en-tre estes se situam na região de Fv. A posição e a magnitude das transiçõespor DSC de Ch2 e Ch3 de todos os 17 anticorpos são independentes do Fabao qual estão fixados (vide a Figura 70). A faixa de TMs de Fab para os 17anticorpos da parte de cima na Tabela 20 foi entre 57,2 e 81,6 eC (±24,4 9C),com BIIB1 apresentando a maior estabilidade de Fab aparente e BIIB17 amenor.

Os três anticorpos com os menores valores de Tm de Fab men-suráveis, BIIB15, BIIB16, e BIIB17, demonstram uma disconexão entre tran-sições de desdobramento de domínio dentro do Fab (Vide a Figura 70 paracurva de DSC de BIIB16). O pico de Fab esperado foi dividido em duas tran-sições separadas. As menores transições de Tm foram listadas na Tabela 20,mas uma segunda transição, a qual pode representar o desdobramento daunidade estrutural Ch1/Cl, ocorreu com TMs de 74, 72 e 70 0C para BIIB15,BIIB16 e BIIB17, respectivamente. BIIB18 foi incluído no estudo como umexemplo de um anticorpo o qual não expressariam e cuja seqüência de Vhdivergiu significativamente da de consenso (vide o Exemplo 16).

As análises por DSC mostraram claramente que as únicas pro-priedades de regiões Fv individuais podem atenuar altamente a TMs aparen-te de uma porção Fab inteira de um anticorpo. Nos casos extremos de Bl-IB15, BIIB16 e BIIB17, as estabilidades de Fv aparentes foram tão baixasque as transições de desdobramento dos domínios dentro da porção Fab setornaram desacopladas uma da outra. De modo a manter uma única transi-ção aparente para o desdobramento de todos os quatro domínios do Fab,pode haver um limite de Tm total mínimo (>70 0C para IgGIs sob as condi-ções de varredura descritas aqui), caso contário aparecem múltiplas transi-ções. Seria conveniente atribuir as transições de desdobramento de baixatemperatura de BIIB15, BIIB16, e BIIB17 ao Fv e as segundas transições demaior temperatura, ao domínio CH1/CL. No entanto, Ewert e colaboradoresmostraram que o desdobramento do domínio VH/VL não é sempre acopladoe pode depender da subclasse, da estabilidade Vh/Vl, e da complementari-dade Vh/Vl (Ewert et al., .J. Mol. Biol. 325: 531-553, 2003). De fato, muitopoucos de seus construtos de scFv Vh/Vl com estrutura derivados por con-senso apresentaram desdobramento cooperativo. Portanto, é provável que,à medida que as transições desacoplam, o cenário de desdobramento possaser mais complicado do que uma única divisão em duas transições represen-tando a região Fv e as regiões Ch1/Cl.

As estabilidades aparentes conforme medido por DSC para osFabs de IgGI e lgG4 de BIIB7 foram altamente similares muito embora hajadiferenças inerentes substanciais em seqüência Ch1 e ligação dissulfeto asduas subclasses. Há muitas explicações possíveis para isto tais como (1) aspropriedades biofísicas do Fv determinam o teto de termoestabilidade doFab de BIIB7 independente de se a CH1 é IgGI ou lgG4, (2) a aparente es-tabilidade da região Ch1/Cl é idêntica entre IgGI e lgG4, ou (3) a unidadeestrutural CH1/CL não desdobra dentro do frame de tempo do experimentode DSC. O fato de que o Fab BIIB7 desdobrou em uma única Tm e com umaentalpia calorimétrica similar tanto nos formatos de IgGI quanto de lgG4 su-gere uma potencial dependência de estabilidade sobre o Fv e não as regiõesconstantes.<table>table see original document page 314</column></row><table>Exemplo 16: Utilização de Classificação de Consenso para identificar Regiãovariável de anticorpo com estabilidade sub-ótima

Classificação de consenso foi utilizada como um método paraidentificar quais dos anticorpos BIIB continham números significativamentemaiores de aminoácidos não-ótimos dentro de suas regiões Fv. A classifica-ção avalia a tendência relativa de seqüências Vh e Vk de consenso devido amutações hipersomáticas e variações de linhas germinais evolucionárias. Asmedições de DSC para os 17 anticorpos foram usadas para qualificar a ca-pacidade da abordagem de classificação de consenso para prever pobreestabilidade de anticorpos.

A série de referência de seqüências Vh e Vk kappa mamíferasusadas para derivar a seqüência de consenso para classificação e as fre-qüências de aminoácidos individuais em cada posição de resíduo foram co-letadas, armazenadas, e selecionadas conforme descrito previamente (De-marest et al., J. MoL Biol. 335: 41-48, 2004). As séries de referência de ma-míferos foram construídas de forma simples (naively) para incluir V-genes devários mamíferos de modo a obter diversidade através da tendência evolu-cionária entre espécies. A série de referência de Vh de mamífero contém 61seqüências Vh essencialmente de NCBI e TIGR representando um total de17 espécies de mamíferos diferentes. A série de referência Vk de mamíferocontém 53 seqüências Vk de 13 espécies de mamíferos diferentes.

Seqüências Vh e Vk humanas para construir uma série de refe-rência (ou para uso como seqüências de ensaio) foram reunidas do bancode dados NCBI usando os critérios de pesquisa de "cadeia pesada variávelde anticorpo de homo sapiens" e "cadeia leve variável kappa de anticorpo dehomo sapiens", respectivamente. Um total de 182 seqüências de V-genehumanas, 114 Vh e 68 VK, foram selecionadas semi-aleatoriamente do bancode dados NCBI para comparação contra bancos de dados de Vh e Vk demamíferos. A distribuição de subclasse de seqüências Vh e Vk humanas ob-tidas por seleção do tipo "coleta" semi-aleatória do banco de dados NCBIproduziu a representação de subclasse esperada baseada em uso de Vh ouVk de linha germinal natural (Guigou et al., 1990) sugerindo pouca preferên-cia no modo que as seqüências foram escolhidas do NCBI.

As seqüências foram então categorizadas em suas subclassesde domínios variáveis individuais (Vh1-Vh7 e Vk 1- Vk 4) por alinhamento deCIustaIW contra as subclasse de seqüências de consenso obtidas do websi-te Aho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy. As subclasses foram adicio-nalmente confirmadas por alinhamento contra as seqüências de linha germi-nal humana disponíveis publicamente (Lefranc et al., Nucleic Acids Res. 27,209-212, 1999). Não mais de 5 seqüências humanas de qualquer uma sub-missão de NCBI multisseqüência foram incluídas dentro das séries de refe-rência para reduzir preferência potencial introduzida por séries de iniciadoresou uso de V-gene à base de antígeno. A reunião das seqüências foi realiza-da singelamento (na/Ve/y); portanto, houve uma abundância natural de se-qüências VH3 e VK1 depois do agrupamento das subclasses. O escore mé-dio e desvio padrão (descrito abaixo e na Tabela 20) foram calculados paracada subclasse usando 25 seqüências humanas VH1, 3 VH2, 44 VH3, 34 VH4,5 Vh5, 3 Vh7, 29 Vk 1, 4 Vk 2, 19 Vk 3 e 16 VK4. Somente 2 dos 18 anticorpos(BIIB5 e BIIB14) continham domínios VH com populações de seqüências desubgrupo mínimo (isto é VH2, VH5 ou VH7). Quatro dos 18 anticorpos (BIIB3,BIIB4, BIIB17 e BIIB18) continham domínios variáveis da subclasse VK2 cujasubclasse foi subrepresentada no espaço de seqüência e cuja precisão declassificação foi mal definida. Não foram encontradas seqüências VH6 natu-rais dentro da série de referência de seqüência Vh humana. Isto não foi umapreocupação uma vez que nenhum dos construtos de anticorpos BIIB conti-nha um domínio Vh6.

As seqüências de domínio variável dos 18 anticorpos BIIB e as182 seqüências humanas Vh e Vk obtidas do NCBI foram classificadas con-tra a série de referência de seqüências de anticorpos de mamíferos. Todasas seqüências Vh e Vk foram truncadas antes de CDR3 (dois resíduos de-pois dos resíduos YYC de consenso) para reduzir a imprevisibilidade intro-duzida pela natureza hipervariável da região de união V-(D-)J-C. Freqüên-cias de resíduos (p,|r)), em cada posição dentro do banco de dados de ma-míferos foram calculadas somando o número de vezes que cada aminoácido(A,C,D...VjW1Y,-) ocorre em cada posição de resíduo dentro do banco dedados dividido pelo número total de seqüências. Os escores foram avaliados

para cada seqüência de ensaio Vh e Vk humana usando a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 317</formula>

em que c,(r) eqüivale à freqüência de resíduo de consenso em cada posiçãodo bancos de dados de domínio variável de mamífero e h,(r) eqüivale à fre-qüência de resíduo de ensaio de cada aminoácido da seqüência de ensaiode domínio variável humano. Escores de consenso perfeito para as seqüên-cias de consenso dos bancos de dados de mamíferos foram 104 para Vh e100 para VK.

A. Classificação Aleatória de Seqüências Vh e Vk Usando um Bnaco de Da-dos de V-Gene de Mamífero

Seqüências de consenso das subclasses Vh e VK foram classifi-cadas contra o consenso do bancos de dados de mamíferos e plotadas nasFiguras 71A e 71C, respectivamente. O consenso da subclasse Vh3 classifi-cou somente 1 ponto abaixo do escore "perfeito" hipotético do consenso dobancos de dados de mamíferos e diferiu do consenso do bancos de dadosde mamíferos por um total de três resíduos. Portanto, é evidente que o ban-co de dados de mamíferos é tendencioso para seqüências similares a VH3.Todas as outras seqüências de consenso da subclasse Vh humanas tiveramescore significativamente menor. Uma preferência para seqüências VK4 foiobservada para o banco de dados de Vk de mamíferos (Figura 71C). Os es-cores das seqüências BIIB humanas ou humanizadas foram analisados combase na performance de seqüências do NCBI humanas de subclasse com-parável. Distribuições dos escores de seqüências Vh individuais são mostra-das na Figura 71B, e distribuições dos escores de seqüências Vk individuaissão mostradas na Figura 71 D.

B. Resultados de Classificação para BIIB1 a BIIB18

Escores de Vh e Vk para todos os 18 anticorpos BIIB foram cal-culados e comparados com os números relativos derivados da série de refe-rência de seqüências de V-gene humano da NCBI (Tabela 20). Também in-cluída na Tabela 20 é a diferença entre o escore do V-gene de BIIB e o es-core de subclasse médio. É a diferença entre estes escores que foi usadapara examinar tendências de estabilidade potenciais. BIIB1 a 18 foram mar-cados em ordem descendente de suas estabilidades de Fab medidas. Asubclasse de V-gene e a linha germinal humana individual mais próxima pa-ra os genes BIIB Vh e Vk foram determinadas por análise ClustaIW.

Escores à base de consenso foram derivados para os 18 anti-corpos BIIB e comparados com os perfis de desdobramento térmico de Fabdeterminados experimentalmente. Anticorpos BIIB com maior diferença entreo escore de BIIB V-gene e seu escore de subclasse médio (isto é, menoresescores de seqüência) foi correlacionado com a baixa TmS de Fab medida noExemplo 15 (Tabela 20, Figura 72A). Não houve tendência aparente correla-cionando os escores Vk com a TMs medida por DSC (Figura 72B). De fato, aseqüência Vk de menor classificação pertenceu a BIIB2 o qual tevew a se-gunda maior estabilidade de Fab aparente.

Inserções e eliminações de aminoácidos de CDR incomuns fo-ram encontradas em BIIB15 e BIIB16, bem como em BIIB18, que teve o piorescore de Vh de todos os anticorpos BIIB e nunca foi expressado em níveisapreciáveis. A classificação de Vh não sugeriu problemas de estabilidadepotenciais para BIIB15 e BIIB16; no entanto, suas TMs de Fab foram duasdas menores testadas (Figura 72A). BIIB15 continha uma CDR1 incomu-mente longa (13 aminoácidos de extensão e 2 mais longo que qualquer do-mínio similar a VH3 em nosso banco de dados de mamíferos ou domínio Vh3em série de seqüências humanas) e BIIB16 continha uma CDR2 incomu-mente curta (15 aminoácidos de extensão e 1 aminoácido mais curto do quea maioria significativa das outras CDR2s de Vh3 tanto em nosso banco dedados de Vh de mamíferos quanto em nossa série de referência de VrS hu-manos).

C. Utilidade de Bancos de Dados de Seqüências de Mamíferos Pequenaspara Análise da Freqüência de Resíduos e Previsão da Estabilidade dosFabs BIIB

Classificação dos domínios VH BIIB contra o banco de dados deseqüências VH de mamíferos se comprovou uma ferramenta útil para deter-minar a abundância de aminoácidos não-ótimos dentro de cada domínio Vh,os quais podem por sua vez limitar a estabilidade total de um Fab. Os esco-res foram úteis para selecionar Fabs com baixa estabilidade e o potencialpara reduzida longevidade in vitro e aumentadas taxas de agregação. Combase nas preferências de subclasses observadas para os bancos de dadosde V-gene de mamíferos, pode-se questionar se seria melhor usar bancosde dados de V-gene estritamente humanos para realizar a classificação deconsenso em oposição ao banco de dados de mamífero usado aqui. No en-tanto, com base no número significativo de variáveis de determinação deestabilidade que a classificação não reflete, tais como as posições de resí-duos exatos de aminoácidos não consenso, a força da interação Vh/Vl, anatureza da união V-(D-)J-C e a incidência de inserções ou eliminações hi-persomáticas, é difícil acreditar que um banco de dados de Vh apenas deRum proporcionaria uma melhora significativa. Um banco de dados estrita-mente humano usado para classificação também pode requerer um númerosignificativamente maior de seqüências para combinar com a diversidadeevolucionária de forma simples (naively) incluída dentro do banco de dadosde mamíferos. Uma parte dos dados que indica que a abordagem do bancode dados de mamíferos funciona em é a das seqüências Vh de consenso desubclasse humana classificadas em ordem ascendente de sua abundânciade subclasse genômica e uso de subclasse aparente (Guigou et al., 1990;Teale e Medina, 1992; Tomlinson et a!., 1992). O banco de dados de Vh demamíferos parece pesar as contribuções totais das subclasses Vh humanasadequadamente. O fato de que cada consenso de seqüência das subclassesVh e Vk geralmente classificadas acima da grande maioria das seqüênciasindividuais e humanas únicas selecionadas entre o NCBI sugere que o ban-co de dados de mamíferos está capturando informação de consenso paratodas as subclasses, muito embora exista uma preferência para VH3. Portan-to, devido à exisência de outros fatores influencindo a estabilidade que aclassificação não incorpora, é impropável que a tendência observada na Fi-gura 72A aumente por ajuste fino do banco de dados de seqüências Vh usa-das para classificação.

Inserções ou eliminações incomuns em domínios VH posrecemter efeitos significativos sobre a estabilidade não refletidos por classificaçãode consenso. A CDR1 incomumente longa (13 aminoácidos) de BIIB15 e aCDR2 incomumente curta (15 aminoácidos) de BIIB16 provavelmente sãosobras de humanização da seqüência de camundongo original. De fato, aseqüência BIIB16 Vh alinha intimamente com duas seqüências Vh de ca-mundongo no banco de dados de mamífero que também continha uma C-DR2 de 15 aminoácidos. Forçar a CDR incomumente pequena sobre a fra-mework humana pode ter afetado de modo adverso a estabilidade deste an-ticorpo. BIIB18 não somente apresentou o escore de menor Vh de todas asseqüências BIIB mas também continha uma CDR2 extraordinariamente lon-ga (22 resíduos comparada com o máximo de 19 aminoácidos usual). Por-tanto, não é surpreendente considerar os múltiplos problemas possíveis ine- rentes dentro da seqüência de BIIB18 que nunca atingiram níveis de expres-são possibilitando nada menos do que ensaios biológicos extremamente bru-tos com sobrenadantes não purificados. Os resultados para BIIB15, BIIB16 eBIIB18 sugere que inserções ou eliminações de Vh incomuns podem ter ummaior efeito sobre a termoestabilidade do anticorpo do que a maioria das mutações de ponto único. O comportamento excepcionalmente pobre deBIIB18 não foi previsto com base em uma visão superficial sobre sua se-qüência uma vez que seu Fv continha todos os aminoácidos "essenciais"estritamente conservados dentro das dobras do gene V. Ter a capacidadede selecionar anticorpos inoportunos usando um pente um tanto mais fino é a real utilidade da abordagem de classificação.

Não foram evidentes tendências ao comparar as estabilidadesde Fab medidas contra os escores de Vk. Combinar os escores de Vk com osescores de Vh simplesmente reduziu a propensão observada para os esco-res de Vh somente. Diferentemente dos resultados de classificação de VH, as classificações de consenso de Vk humano não estavam em linha com a a-bundância natural de linhas germinais Vk e uso de gene (Guigou et al., 1990;Meindl et al., 1990; Cox et al., 1994); muito embora as próprias classifica-ções de consenso todas tenham classificado melhor do que suas seqüênciasde subclasses kappa humanas individuais (Figura 72B). É somente especu-lação que estes desvios da ordem esperada de classificações de consensoVk podem deter a capacidade dos bancos de dados de mamíferos para pre-ver com precisão a domínios Vk de baixa estabilidade. Além disso, não hou-ve seqüências Vk2 suficientes para definir o escore médio da subclasse Vk2.

Depois das distribuições de subclasses serem determinadas para as 68 se-qüências Vk humanas, somente 4 foram Vk2 (o que reflete muito bem o usode Vk2). Mesmo com estas desvantagens, os resultados de Vk ainda suge-rem que a maior diversidade de seqüência de genes VH pode, mais freqüen-temente do que não, tornar domínios VH o componente determinante de es-tabilidade de Fabs (Demarest et al., 2006); embora estejam disponíveis e-xemplos do oposto na literatura (Róthlisberger et al., 2006).

D. Dependência da Estabilidade na Linha germinal Vh ou Vl e pareamentoVh/VL

Muitos dos 18 anticorpos continham V-genes de linhas germi-nais de sobreposição cujas CDRs e mutações hipersomáticas variaram ecujo pareamento Vh ou Vk foi o mesmo ou diferente. Isto possibilitou umacomparação de estabilidades de Fab de anticorpos contra as linhas germi-nais individuais das quais foram derivados. Os dois Fabs mais estáveis, Bl-IB1 e BIIB2, têm as mesmas combinações de linha germinal VH1 e Vk1. Ospareamentos Vh e Vk não parecem ter claras preferências intrínsecas combase em um estudo de Winter e colaboradores, mas se acredita que sejam"orientados por receptor" (de Wildt et al., 1999b). BIIB1 e BIIB2 ligam antíge-nos relativamente dissimilares, CCL2 e VLA4; portanto, a combinação ouocorreu aleatoriamente ou foi a conseqüência de humanização. Houve umanítida abundância de aminoácidos não-ótimos dentro dos domínios VH dos

Fabs menos estáveis, BIIB17 e BII18 (isto é baixos escores de seqüência eBIIB18 continha uma inserção incomum). Ambos estes anticorpos tambémcontinham a mesma linha germinal Vk2, sugerindo potencialmente proble-mas de estabilidade protéica de cadeia leve no topo dos problemas à basede Vh identificados pela classificação. Um estudo futuro interessante seriadeterminar se este Vk2 particular foi um contribuinte para o comportamentobiofísico pobre destes dois anticorpos. A subclasse Vk2 em general não foiassociada com estabilidades de Fab pobres uma vez que BIIB3 e BIIB4também contêm um gene da subclasse Vk2. A linha germinal AB019438VH1(Lefranc et al., 1999) cortado quatro vezes. Os valores da Tm para estesFabs (BIIB12, BIIB11, BIIB7 e BIIB3) variou de 71,2 a 78,2. Interessante-mente, seus escores de seqüência Vh se correlacionaram com suas estabili-dades de Fab aparentes (BIIB12 < BIIB11 < BIIB7 ~ BIIB3). Uma correlaçãode classificação de Vh positiva também foi vista nos anticorpos BIIB1 e BIIB2descritos acima com a mesma linha germinal VH1. A aparente imprecisão daclassificação de Vh1 no entanto, foi enfatizada por uma correlação de estabi-lidade negativa observada para BIIB4 e BIIB6 as quais ambas continham alinha germinal M99649VH3.

Apesar do uso de famílias da linha germinal VH em adultos hu-manos parecer ser razoavelmente aleatório, a família VH3 contém a maioriados membros em seres humanos. Genes Vh3 ou similares a VH3 estocasti-camente apareceram mais freqüentemente na série de referência humana eno banco de dados de mamíferos. Os resultados de Ewert e Plückthun de-monstraram que uma seqüência Vh3 humana derivada por consenso foi omais estável dos domínios VH derivados por consenso (Ewert e Pluckthun,2003). Este resultado pode não ser inteiramente inesperado considerandoque a subclasse VH3 tem mais seqüências de linha germinal para contribuirpara a criação de um consenso ótimo comparada com as outras subclasses.

Os dados de estabilidade mostram que IgGs contendo linhas germinais Vh3não apresentam em geral valores de Tm de Fab maiores. Há genes das sub-classes Vh3 e VH1 tanto na parte de cima quanto na parte de baixo da listade estabilidade. Apesar de muitos outros fatores contribuírem para a estabi-lidade global do Fab, especialmente as propriedades do complemento Vkdentro do Fv, pode-se esperar uma tendência para maiores estabilidades deFab para aqueles contendo linhas germinais da subclasse VH3 se os domí-nios Vh3 em geral forem mais estáveis do que as outras subclasses. Estenão parece ser o caso dos estudos de estabilidade limitada descritos aqui.Exemplo 17. Análise de Covariacão de Polipeptídeos de dobra de Ig

A. Coletar e Filtrar Estrueturas de dobra de Ig

Estruturas de proteínas de Dobra de Ig ou domínios de Dobra delg de proteínas multidomínio foram reunidas do banco de dados ASTRAL, oqual contém estruturas de domínio combinando a hierarquia SCOP. Domí-nios de Ig específicos de imunoglobulina foram vistos sob as seguintes clas-sificações dentro da hierarquia SCOP: "Ali β proteínas" --> "β-sanduíche si-milar a Imunoglobulina" --> "Imunoglobulina". Sob imunoglobulina, estavamdisponíveis quatro séries de estruturas: "série V," "série C1," "série C2," e"série I." Quatro scripts de download personalizado foram rodados separa-damente para obter arquivos pdb de "classe V", "classe C1", "classe I", e"classe C2".

Uma vez que os arquivos da estrutura para cada subfamília fo-ram descarregados, foi realizada alguma filtração para remover estruturascategorizadas erroneamente, incompletas, redundantes, ou com domíniopermutado (Liu Y, et ai, Protein Sei. (2002), 1285-1299). Houve 4 etapas defiltração principas, descritas abaixo:Etapa n° 1. Remoção de seqüências que têm rupturas

Estruturas de cada subclasse foram inspecionadas visualmente,usando o visor SwissPDB Viewer, para rupturas em seqüência (quer densi-dades não resolvidas ou seções faltando devido a permuta de domínio). Osarquivos PDB de estruturas imperfeitas foram removidos manualmente dasséries de dados de estruturas classe V, C1, C2, e I.Etapa n° 2. Remoção de seqüências 100% idênticas

Estruturas de formato PDB foram convertidas para seqüênciasde aminoácidos de formato FASTA, e filtradas para remover quaisquer se-qüências que foram ou 100% idênticas a, ou subcadeias de combinação per-feita de, seqüências restantes.

Etapa n° 3. Remoção de seqüências de extensão aberrante

Estruturas de PDB com seqüências de aminoácidos aberrante-mente longas ou curtas foram removidas das séries de dados de estruturas.Os critérios de corte de extensão foram determinados examinando o histo-grama de todas as extensões de seqüências (Figura 74). Os histogramaspareceram um tanto distribuídos normalmente. Seqüências fora de dois des-vios padrão da média foram removidas de cada série de dados de subfamí-lia. O número médio global de resíduos para a superfamília de imunoglobuli-nas foi 106,10 e o desvio padrão foi 12,19. Conseqüentemente, os cortesglobais usados foram <= 81 e >=131 resíduos. Uma decomposição das ex-tensões médias e desvios padrão é mostrada na Tabela 21.

Tabela 21. Critérios de Extensão de Seqüência de Séries de Dados de Es-truturas

<table>table see original document page 324</column></row><table>

Etapa n° 4. Remoção de seqüências mal dobradas

As estruturas foram inspecionadas visualmente, usando o visorSwissPDB Viewer, para dobramento incorreto. Foram descartadas quaisquerestruturas que não não se conformam à topologia de sanduíche de duas β-folha. Como somente cinco domínios classe C2 foram obtidos da SCOP,Dobras de Ig subclasse C2 não foram perseguidas adicionalmente. Nas par-tes que se seguem, classe C1 é referida como classe C.

B. Obtenção de Alinhamentos de Seqüências de Alinhamentos de Estrutura

Para cada classe separada, as estruturas de Dobra de Ig foramsobrepostas uma à outra usando Combinação de Estrutura Secundária SSM(Secondary Structure Matching) dentro do pacote Schrõdinger structalign(Vide a documentação do programa Schrõdinger Prime para instruções so-bre como criar sobreposições). Sobreposições foram realizadas em uma ba-se 'all-to-all' ou uma base 'all-to-one'. Cada algoritmo levou a alinhamentosde qualidade similares, de modo que 'all-to-one' foi escolhido para as sobre-posições. Algumas sobreposições foram corrigidas para assegurar que asregiões de núcleo de cada estrutura foram sobrepostas ao invés das alças.As sobreposições foram então usadas para gerar alinhamentos de seqüên-cia à base de estrutura de todas as seqüências classe V, classe I, e classe Cdentro de cada alinhamento estrutural. O alinhamento de cada seqüênciasobre outra foi realizado usando o pacote Schrõdinger combinando aminoá-cidos de uma seqüência aos da segunda seqüência com base na distânciamais curta entre carbonos α das espinhas dorsais do polipeptídeo.

C. Construção de um Banco de Dados de Seqüências de Dobra de Ig Curadas

Uma série de etapas definidas foram criadas para gerar umasérie de dados de Dobras de Ig curadas para calcular estatísticas de covari-ação robusta:

Etapa n° 1. Construção de perfis de HMM

Três perfis de Modelo de Markov Oculto HMM (Hidden MarkovModel) foram construídos, cada um baseado nos alinhamentos de seqüên-cias à base de estrutura para uma das três classes de Dobras de lg. Os per-fis foram criados com o pacote de software HMMER (versão 1.8), usando oscomandos "hmmbuild" e "hmmcalibrate" com opções padrão. Estes HMMsforam usados para detectar e alinhar seqüências de Dobras de Ig adicionaisno banco de dados NR mantido na NCBI.

Etapa n° 2. Pesquisar NR usando os novos perfis de HMM classe V, I, e C.

Os três HMMs classe-específicos foram usados para pesquisarseqüências similares em um banco de dados NR local. O banco de dadosNR é um arquivo grande contendo ~3 milhões de seqüências de proteínasnão-redundantes. Para cada um dos HMMs classe V, I, e C1 o comando deHMMER "hmmsearch" foi usado para pesquisar NR. Cada resultado classifi-cou seqüências de NR por seus escores relativos ao HMM usado, e propor-cionou informação sobre o número de regiões de alcence pelo HMM e asposições das regiões de alcence dentro de cada seqüência de NR. Para ca-da pesquisa HMM classe-específica de Dobra de Ig, seqüências alcançadasde NR acima de um limiar de escore do critério recomendado foram retidascomo membros candidatos da classe de Dobra de Ig cujo HMM foi usado.Para estas regiões de alcence que foram subseqüências de uma seqüênciade NR, o alcence de subseqüência de NR exato foi extraído da seqüência deNR inteira usando um programa personalizado.

Etapa n° 3. Validação de atribuição de classe de Dobra de Ig usando PFAM.

PFAM é uma ferramenta de classificação de domínio e família de proteína, criada e mantida no Wellcome Trust Sanger Institute (Fin, et ai,Nuc. Acids. Res., (2006), 34: D247-D251), que pode ser aplicada a seqüên-cias de proteínas individuais. Uma ferramenta Pfam fcfamverify' foi aplicadaa cada seqüência candidata de Dobra de Ig obtida na etapa 2 acima, paraconfirmar que foi classificada corretamente pelos HMMs de Dobra de Ig classe-específicos criados a partir dos alinhamentos de seqüências à basede estrutura. Perfis de HMM Ig-clan da PFAM (incluindo HMMs de Ig V-, I-,C1-, C2-, e menos específicas) foram baixados do website PFAM. Cada se-qüência de NR foi classificada pelos HMMs Ig-clan, revelando quão bem ca-da seqüência se conforma a cada PFAM HMM. Seqüências cujos escores sesituam abaixo de cortes recomendados (TC1 - definido no website PFAM)para as classes V, I, ou C foram removidas das séries de seqüências res-pectivas. Portanto, as seqüências sw Dobra de Ig candidatas classe-específicas encontradas na etapa 2 foram retidas somente se seus escoresPFAM validaram suas atribuições de classe de Dobra de Ig.

Etapa n° 4. Alinhar as novas seqüências de Dobra de Ig.

As seqüências de Dobras de Ig que foram extraídas de NR comestudos de HMM e que sobreviveram à etapa 3 acima, foram em seguidaalinhadas a nossos HMMs personalizados de sua classe atribuída. Uma vezque estes HMMs tinham se baseado em cuidadosos alinhamentos estrutu- rais, este processo assegurou um alinhamento das novas seqüências orien-tado por estrutura. O pacote HMMER foi utilizado para gerar alinhamentos'mapali' em formato de fasta output, a ser usado na Ferramenta de Covaria-ção de Seqüência descrita abaixo. Os alinhamentos também foram forneci-dos em formato de output de 'Estocolmo', e inspecionados para seqüências aberrantes ou mal alinhadas, as quais foram omitidas manualmente. Os ali-nhamentos resultantes, consistindo das seqüências estruturalmente-alinhadas originais e as seqüências HMM-alinhadas adicionadas de NR,continham os seguintes números de seqüências: -50.000 classe V; -10.000classe C; -10.000 classe I.

Etapa n° 5. Remover seqüências redundantes ou similares.

Espera-se que estes alinhamentos sejam tendenciosos paraseqüências freqüentemente observadas, com subrepresentação de seqüên-cias raras e um conseqüente mascaramento da diversidade de seqüência.Por exemplo, espera-se uma grande preferência no alinhamento de seqüên-cia de Dobra de Ig classe V para domínios variáveis de imunoglobulina muri-na e humana. Uma vez que a super-representação de tipos de seqüênciaparticulares limita a utilidade de análises de covariação, uma ferramenta defiltração foi criada e aplicada para reduzir a redundância do alinhamento. Aferramento usou um novo algoritmo heurístico para encontrar seqüênciascom >80% de identidade uma com a outra, e removeu as mesmas do ali-nhamentos. Em resumo, percentagem de identidades foram calculadas paratodos os pares de seqüências. Os valores de identidade foram então agru-pados em grupos de percentagem de identidade (isto é grupo de 99%, grupode 98%, grupo de 97%, e etc.). Durante a redução de cada grupo, as se-qüências de cada grupo foram classificadas por contagem decrescente deresíduo não-intervalo, e em seguida por seu peso de seqüência de Henikoff(Henikoff S and Henikoff JG, J. MoL Biol., (1994), 243: 184-199). Depois des-ta etapa, o número de seqüências restantes em cada alinhamento foram:2.786 classe V; 1.587 classe I; e 518 classe C.Etapa n° 6. Remoção de intervalos para criar os alinhamentos finais

Nos alinhamentos finais, foram removidas colunas que não fo-ram estados de combinação no perfil de HMM usado para encontrar estasseqüências (vide o manual HMMER). Portanto, enquanto muitas nas se-qüências contêm mais aminoácidos do que a extensão do alinhamento final,as extensões foram truncadas paa evitar cálculos sobre as regiões de inter-valo menos informativas do alinhamento. Os números finais de resíduos (in-cluindo intervalos) dentro do alinhamentos foram 144 para a classe V, 60para a classe I, e 111 para a classe C.D. Descrição geral dos alinhamentos finais

a) Classe V

Depois do filtro de 80% final ser aplicado, as 2.786 seqüênciasclasse V podem ser divididas em três categorias: (1) Gene variável de imu-noglobulina classe, 49%, as quais incluem ambos os domínios VH e Vl dediversas imunoglobulinas; (2) Genes classe V de Receptor de Células T,16%, os quais continham os domínios hipervariáveis; e (3) Outros genesclasse V, 35%. Os genes classe V de Imunoglobulina vêm de uma imensavariedade de espécies variando de peixe cartilaginoso a primatas. Houveuma preferência para seqüências classe V humanas (537 das 1272 seqüên-cias). No entanto, outras espécies de vertebrados foram somente minima-mente representadas: camundongo (33), vaca (5), camelo (23), Ihama (31),símio do gênero Macacus (17), galinha (6), e etc. A série de seqüências dereceptores de células T foi quase tão diversa variando de peixe a primata enão continha uma preferência para seqüências humanas. A "Outra" catego-ria compreendeu um grande número de diversas seqüências sem subcate-gorias reais compreendendo mais de 1 a 2% das seqüências restantes. A"Outra" categoria continha uma série ainda mais ampla de espécies incluin-do cordatos (essencialmente), peixe cartilaginoso, cefalópodes, e insetos.

b) Classe C

Depois do filtro de 80% final ser aplicado, as 518 seqüênciasclasse C podem ser divididas em três categorias: (1) domínios constantes deImunoglobulina, 44%; (2) Dobras de Ig tipo MHC, 21%; e (3) Outra Dobrasde Ig classe C, 35%. A categoria de domínio constante de Imunoglobulinacontinha diversas seqüências variando de peixe cartilaginoso a primatas. Asubcategoria de imunoglobulina classe C não foi tendenciosa para primataou ainda seqüências de mamífero (somente 3 seqüências humanas perma-neceram não filtradas: IgE-CH4, um Cl kappa, e um Cl lâmbda). A subcate-goria MHC também variou de peixe cartilaginoso a primatas e também apre-sentou pouca preferência para um grupo evolucionário. A "Outra" categoriaclasse C continha muitas proteínas desconhecidas, uma subcategoria muitopequena de várias β-2-microglobulinas, e muitas outras proteínas que nãoforam observadas com uma freqüência digna de uma subcategoria.c) Classe I

A classe I não teve quaisquer subcategorias claras. Moléculasde titânio ou similares a titânio cortadas comumente como moléculas de a-desão celular ou similares a adesão celular.E. Cálculo da Estatística de Covariação

A força de correlação (em termos de um valor de φ) e significân-cia (em termos de um valor de χ2) de covariações entre todos os pares pos-síveis de aminoácidos nos alinhamentos foi calculada com base em métodos reconhecidos na técnica, mas incluíram as seguintes variações: 1) Intervalosforam incluídos como um tipo de resíduo distinto; (2) o esquema de ponde-ração de Henikoff não foi realizado; (3) Identidades Médias de Seqüência(SAI) não foram usadas para filtrar pares covariáveis; (4) valores de χ2 foramcalculados usando contagens à base de evento (número de ocorrências), aoinvés de freqüências; e (5) pares covariantes não foram reportados pelo pro-grama a menos que foram observados um número mínimo de vezes. Foramcriadas dois conjuntos de estatística, o primeiro (e menor série) com um cor-te de evento de 10 e um segundo (série muito maior) com um corte de even-to de 6 eventos. A capacidade para calcular estes parâmetros sobre qual- quer alinhamento de seqüência dado foi codificada em um Java executável etestado com Java Runtime Engine (JRE) versão 1.4.2.

Com base no número de posições dentro do alinhamento e umtotal de 23 resíduos possíveis em cada posição (incluindo intervalos, resí-duos ambíguos B, e Z), houve 2,4 milhões de correlações calculadas para aclasse C, 700 mil calculadas paa a classe I, e 4,1 milhões calculados para aclasse V. A Figura 75 mostra os valores φ calculados para a classe V comalta significância de χ2. Os valores de φ variam de -1 a +1. Os valores de φpositivos se afastam de 0 (isto é para +1), a força de correlação (isto é a co-variação) entre dois aminoácidos em posições definidas dentro dos alinha- mentos aumenta. Correlações negativas (isto é, a presença de um aminoá-cido em um sítio no alinhamento forçando a ausência de outro aminoácidoespecífico em um segundo sítio) aumentam enquanto os valores de φ semovem para -1. Cortes para o que é uma covariação real são um tanto arbi-trários, mas aqueles com um valor de φ > 0,5 são fortemente correlaciona-dos uns com os outros. Portanto, de acordo com a Figura 75, somente 370das 2,4 milhões de correlações possíveis dentro da classe C são fortes. Noentanto, correlações acima 0,3 foram reportadas como importantes e au-mentariam o número de correlações positivas observadas para todas as trêsclasses por -10 dobras. Estas correlações representam a parte muito pe-quena, porém importante da série de dados que é usada para análises pos-teriores, gerando designs de proteína, ou previsão de posições de resíduos funcionais.

F. Validação da Estatística de Covariação

Houve vários critérios usados para validar as fortes covariaçõesque foram derivadas do banco de dados de Dobras de Ig foram significativose expressivos à parte das forças estatísticas com base nos cálculos. O pri- meiro foi para analisar se houve uma tendência entre resíduos que covaria-ram um com o outro e sua proximidade dentro de Dobras de Ig de estruturaconhecida. Estudos prévios na literatura demonstraram que existe uma cor-relação entre posições covariáveis e sua proximidade um com o outro - em-bora sejam muito fracas - de acordo com esses resultados. Um segundo critério viu se os cálculos de covariação de Dobra de Ig geraram conexõesconhecidas entre posições de aminoácido que já tenha sido reportado, ondeexista dentro de subgrupos conhecidos de Dobras de lg. Um caso de ensaioclaro foi em N-término de dobras de cadeia pesada variável de IgG humana /murina (parte da classe V). Os resíduos 6 a 10 são conhecidos por adotar conformações muito específicas com base na conservação de pares covari-antes de aminoácidos (Ewert S, et ai, Methods, (2004), 24: 184-199). Foivisto que dois dos três pares reportados de aminoácidos covariáveis têmvalores de φ acima de 0,3 - bem acima do fundo aparente da série de da-dos.

Exemplo 18. Preparação de um Antcorpo Tetravalente p5E8 PRIMATIZED®

Compreendendo um p5E8 scFv Convencional

p5E8G1 PRIMATIZED® é um anticorpo monoclonal de símio dogênero Macacus / humano quimérico (PRIMATIZED®) contendo regiões va-riáveis pesadas e leves de símio do gênero Macacus fundidas a regiõesconstantes humanas γ 1 e kappa , respectivamente. p5E8G1 PRIMATIZED®liga a CD23 humano, o receptor de baixa afinidade para IgE (FceRII) (Ma-vromatis and Cheson. 2003. J. Clin. Oncol. 21:1874; Pedido de patente dosEstados Unidos N2 20030059424). Um anticorpo p5E8 PRIMATIZED® tetra-valente foi construído usando uma estratégia similar àquela descrita nos E-xemplos 1 a 8. O p5E8 scFv PRIMATIZED® usado para construir o anticorpotetravalente consiste de seqüências de regiões VL e VH de p5E8 amarradaspor um Iigante curto na orientação VL -> (GIy4Ser)3 Iigante VH e é descri-to em maiores detalhes no Exemplo 19. Seqüências corretas foram confir-madas por análise de seqüência de DNA. DNA de plasmídeo foi usado paratransformar células CHO DG44 para produção estável de proteína de anti-corpo. A Figura 80 mostra a seqüência de DNA de anticorpo PRIMATIZED®p5E8 tetravalente de C-terminal de cadeia pesada compreendendo um scFvconvencional. A Figura 81 mostra a seqüência de aminoácidos de anticorpoPRIMATIZED® p5E8 tetravalente de C-terminal de cadeia pesada compre-endendo um scFv convencional. A Figura 82A mostra a seqüência de DNAde cadeia leve de p5E8 PRIMATIZED®. A Figura 82B mostra a seqüênciade aminoácidos de cadeia leve de p5E8 PRIMATIZED®.

Exemplo 19. Preparação de p5E8 scFv PRIMATIZED® e Proteínas FabscFvs de p5E8 PRIMATIZED® em ambas as orientações (VL(GIy4Ser)3 Iigante VH (VL/VH) e VH (GIy4Ser)3 Iigante VL (VH/VL))foram subclonados por amplificação por PCR de plasmídeos descritos noPedido de Patente dos Estados Unidos N- 20050163782. Oligonucleotídeosusados na construção são mostrados na Tabela 22.

scFvs de p5E8 PRIMATIZED (VLTVH) foi construído por PCRusando o iniciador forward P5E8-VL01F o qual contém 29 bases codificandoparte da seqüência líder gplll seguida por 15 bases de seqüência comple-mentar ao gene de domínio variável leve de N-terminal p5E8 e o iniciadorreverso, P5E8-VH01R, o qual contém 15 bases de seqüência complementarao domínio variável pesado de C-terminal p5E8 seguido por um único sítiode endonuclease Sal I adjacente (o sítio de endonuclease é sublinhado).Similarmente, scFvs de p5E8 PRIMATIZED (VH/VL) foi construído por PCRusando o iniciador forward P5E8-VH01F o qual contém 29 bases codificandoparte da seqüência líder gplll seguida por 18 bases de seqüência comple-mentar ao gene de domínio pesado variável de N-terminal p5E8 e o iniciadorreverso, P5E8-VL01R, o qual contém 12 bases de seqüência complementarao gene de domínio leve variável de C-terminal p5E8 seguido por um únicosítio de endonuclease Sal I adjacente (o sítio de endonuclease é sublinhado).

Tabela 22. Oligonucleotídeos para amplificação de PCR de alguns PRIMA-

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TIZED® p5E8 scFvs convencionais.

Depois de amplificação por PCR, iniciador P5E8-Leader01 foiadicionado a ambas as reações para uma segunda reação de PCR. O inici-ador P5E8-Leader01 contém um único sítio de endonuclease Nde I seguidopor 25 bases codificando a porção N-terminal da seqüência Iider gplll, se-guida por 22 bases complementares às extremidades 5' de P5E8-VL01F eP5E8-VH01F e amplificados por PCR de novo. Produtos de PCR correspon-dentes aos tamanhos esperados foram resolvidos por eletroforese por gelagarose, excisados, e purificados usando o kit de extração Millipore Ultra-free-DA de acordo com instruções do fabricante (Millipore; Bedford, MA). Osprodutos de PCR purificados foram em seguida digeridos com Nde I e Sal I eclonados nos sítios Nde I/ Sal I de um vetor de expressão de E. coli modifi-cado designado para orientar expressão de proteína recombinante sob ocontrole de um promotor ara C indutível. O vetor de expressão continha umamodificação codificando um único sítio Nde I sobrepondo o códon de partidado BHA10 scFv. Reações de ligação individuais foram realizadas com cadaum dos produtos de PCR purificados por gel e o vetor de expressão digeridoe uma porção de cada uma das misturas de ligação foram usados paratransformar cepa XL1 -BIue de E. coli. Colônias resistentes a fármaco de am- picilina foram triadas e análise de seqüência de DNA confirmou a seqüênciacorreta do p5E8 (VH/VL) final codificando plEH-162 e p5E8 (VL/VH) codifi-cando construtos plEH-163. Seqüências de DNA e de aminoácidos de p5E8(VLTVH) scFv são mostradas nas Figuras 83A e 83B, respectivamente. Se-qüências de DNA e de aminoácidos de p5E8 (VH/VL) scFv são mostradas nas Figuras 84A e 84B, respectivamente.

Para expressão de scFvs de p5E8 convencionais, colônias re-cém isoladas de E. coli cepa W3110 (ATCC, Manassas, Va. Cat. n- 27325)transformadas com plasmídeos plEH-162 e plEH-163 foram cultivadas e fo-ram preparadas ou sobrenadantes da cultura ou extratos de periplasma con-forme descrito no Exemplo 4.

Fab p5E8 PRIMATIZED® foi preparado por digestão enzimáticade IgG de p5E8 PRIMATIZED® seguindo métodos descritos no Exemplo 1.Fab purificado foi concentrado para entre 2 a 11 mg/ml_. As concentraçõesde Fab foram determinadas usando um e280nm = 1,5 mL mg"1 cm"1. Exemplo 20. Estabilidade Térmica de Anticorpos p5E8 scFv ConvencionaisComo foi observada uma excelente correlação entre valores deT50 obtidos usando a prova de ensaio térmico descrita nos Exemplos 4 e 5 evalores de Tm calculados por análise DSC (r2 = 0,93), uma prova de ensaiotérmico foi empregada para avaliar as estabilidades térmicas relativas dosscFvs p5E8 (VL/VH) e p5E8 (VH/VL). A prova de ensaio térmico foi utilizadaconforme descrito nos Exemplos 4 e 5 exceto que antígeno solúvel CD23 em1 ug/ml foi usado para revestir as lâminas e a concentração do anticorpoanti-6 His marcado com Eu (Perkin Elmer1 Boston, MA, Cat. n2 AD0109) foiaumentada para 250 ng/ml. Resultados deste ensaio determinaram que ovalor de T50 de p5E8 (VL/VH) é 38 9C e p5E8 (VH/VL) é ligeiramente menora 34 9C (Figura 85). Dados os valores de T50 notavelmente baixos de am-bos os scFvs e a observação de que dos dois p5E8 (VL/VH) foi ligeiramentemais termicamente estável, p5E8 (VL/VH) foi selecionado para engenhariade estabilidade posterior.

Exemplo 21. Construção de Moléculas p5E8 scFv com Aprimorada Estabili-dade Térmica

Variantes individuais e bibliotecas projetadas para conter assubstituições de aminoácidos desejadas no p5E8 (VL/VH) scFv convencionalusando os métodos descritos nos Exemplos 3 e 5 foram criadas conformepreviamente descrito usando oligonucleotídeos listados na Tabela 23.

Na Tabela 23, cada nome de oligonucleotídeo dá referência asubstituições de aminoácidos em uma ou mais posições em VH ou VL deacordo com o sistema de numeração de Kabat. "Fundamento lógico" se refe-re ao método de criação empregado. Os métodos referidos são descritos emdetalhes no Exemplo 5 acima. Resíduos mutagênicos são mostrados comoletras maiúsculas. Pares de oligonucleotídeos para introduzir dissulfetosVH/VL estão dentro de caixas. Abreviações são: "COMP"- Análise Compu-tacional, "COVAR"- Análise de Covariação, "CONS" - Classificação de Con-senso, Design de Interface "INTER-VH/VL", "SS"- ligação dissulfeto VH/VL,e "TBD"- a ser determinado.

Tabela 23. Oligonucleotídeos e fundamento lógico para construção de p5E8(VL/VH) scFvs variantes.

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tPosições alvo para mutagênese são indicadas por sublinhado. Bases am-bíguas são abreviadas como se segue: W = A ou T, V = A ou C ou G1Y = COU T1 S = C OU G1 M = A OU C, N = A ou C OU G OU T1 R = A ou G1 K = G OUT1 B = C ou G ou T (J Biol Chem. 261 (1 ):13-7 (1986)).

Colônias transformadas individuais foram selecionadas em pla-cas de cavidades profundas de 96 cavidades, processadas, e triadas de a-cordo com os métodos detalhados no Exemplo 5. Transformantes foram cul-tivados de um dia para o outro em meio de expressão consistindo em SB(Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. ns S0140) suplementado com 0,6 % deglicina, 0,6 % de Triton X100, 0,02% de arabinose, e 50 μg/ml de carbenicili-na em ou 37°C ou 32°C.

Depois de estímulo térmico, o material agregado foi removidopor centrifugação e testado no CD23 DELFIA solúvel conforme descrito noExemplo 3. Dados de ensaio foram processados usando o software SpotfireDecisionSite (Spotfire, Somerville, Ma.) e expressados como a taxa das con-tagens DELFIA observadas na temperatura de estímulo para a temperaturade referência para cada clone. Clones que dão de modo reprodutível taxasmaiores ou iguais a duas vezes a observada para o plasmídeo parental fo-ram considerados alcences. DNAs de plasmídeos destes clones positivosforam isolador por mini-prep (Wizard Plus, Promega, Madison, Wl) e retrans-formado de volta em E. co//'W3110 para provas de ensaio térmico secundá-rio de confirmação bem como para determinação da seqüência de DNA.

Resultados primáros e confirmatórios destes ensaios são mos-trados na Tabela 24. Várias das moléculas scFv estabilizadas da invençãoresultaram em aprimoramentos na atividade de ligação (T50 >38°C) compa-radas com o p5E8 scFv convencional. Em particular, os valores de T5o daposição da biblioteca de p5E8 VH6 (E6Q), posição da biblioteca VH49 (S49Ge S49A), posição da biblioteca VH43 (Q43K), posições da biblioteca VH72(E72D e E72N), e posição da biblioteca VH79 (F79S), apresentaram aumen-tos na estabilidade térmica variando de + 4°C a + 5°C em relação ao p5E8scFv convencional. Os valores da T50 de posição da biblioteca de p5E8 VL50(V50D e V50S), posição da biblioteca VL75 (V75I), posição da bibliotecaVl.80 (P80S), e posições da biblioteca VL83 (F83A, F83G, F83S e F83T),apresentaram aumentos na estabilidade térmica variando de + 3°C a + 7°Cem relação ao p5E8 scFv convencional.

Além disso, os valores de T50 da posição da biblioteca de p5E8Vh32 (N32S) e posição da biblioteca Vh79 (F79Y) apresentaram aumentosna estabilidade térmica de + 2°C em relação ao p5E8 scFv convencional.

Mutações estabilizantes foram identificadas usando um sorti-mento dos métodos de criação descritos no Exemplo 5- as mutações VH6(E6Q), V|_75 (V75I), VL80 (P80S) e VL83 (F83A, F83G, F83S e F83T) foramderivadas usando Análise Computacional, a mutação VH32 (N32S) foi deri-vada usando Classificação de Consenso, e as quatro mutações VH49 (S49Ge S49A), Vh43 (Q43K), VH72 (E72D e E72N), as mutações VH79 (F79S eF79Y) foram derivadas usando Análise de Covariação, e as mutações VL50(V50D e V50S) foram derivadas usando análise da interface VH/VL, validan-do a utilidade e a novidade destas ferramentas de criação. Combinando asmutações VH43Q e VH32S com mutações estabilizantes VH49G, VH72D, ouVh49A reforçou a estabilidade térmica (T50) de p5E8 até 53°C, um aumentode 15°C em relação ao p5E8 scFv convencional.

Tabela 24. Posições da biblioteca de p5E8 VH e VL1 composição da bibliote-ca, e resultados da triagem.

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A Tabela 25 mostra os resultados de uma análise extensiva da

estabilidade térmica as várias mutações estabilizantes individuais e combi-nadas introduzidas em um scFv convencional. Foram identificadas mutaçõesestabilizantes que na combinação apresentaram aumentos na estabilidadetérmica variando de + 10°C a + 15°C com relação ao p5E8 scFv convencio-nal. Estes resultados demonstram, como mostrado de modo similar no E-xemplo 5, que melhoras na atividade são aditivas e que os métodos descri-tos nesta invenção são capazes de melhorar as propriedades de estabilida-de térmica de um segundo scFv de ensaio demonstrando a utilidade geraldos métodos.Tabela 25. Características de construtos p5E8 usadas para produzir proteí-nas variantes e resultados de T50 de prova de ensaio térmico.

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na = não aplicável

aa = aminoácidos

TBD = a ser determinado

Exemplo 22. Produção de Anticorpos Tetravalentes p5E8 Estabilizadosp5E8 scFvs estabilizados da invenção são usados para construiranticorpos tetravalentes tanto como fusões de scFv de N- terminal quanto deC- terminal similares em configuração conforme mostrado na Figura 13.

A. Construção de Antcorpo Tetravalente Nh- p5E8

Os DNAs de p5E8 scFvs descritos no Exemplo 21 são usadospara construir um anticorpo tetravalente Nh- p5E8 similar ao descrito no E-xemplo 7 acima. Um Iigante (GIy4Ser)5 é usado para conectar o p5E8 scFvao término amino maduro de cadeia pesada de IgG p5E8 PRIMATIZED®. Aorganização da molécula é um p5E8 scFv- (Gly4Ser)5 Iigante- cadeia pesa-da de IgG p5E8 PRIMATIZED®. Esta molécula se assemelha à cadeia levepara formar o anticorpo tetravalente. A seqüência correta seria confirmadapor análise de seqüência de DNA. O construto pode ser usado para transfec-tar células CHO conforme descrito no Exemplo 8 para aumento em escalada produção de um Antcorpo Tetravalente Nh- p5E8. Células CHO transfec-tadas podem ser tríadas para ligação a antígeno CD23 imobilizado por en-saio DELFIA. Lâminas de 96 cavidades, por exemplo, (MaxiSorp, NalgeNunc1 Rochester, NY, Cat. n2 437111) podem ser revestidas com antígenoCD23 solúvel a 1 ug/ml em 0,1 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9.5.As lâminas são revestidas de um dia para o outro a 4oC, e bloqueadas comtampão de ensaio DELFIA (DAB, 10 mM de Tris HCI, 150 mM de NaCI, 20mM de EDTA, 0,5 % de BSA, 0,02% de Tween 20, 0,01% de NaN3, pH 7.4)por uma hora com agitação em temperatura ambiente. As lâminas são lava-das 3 vezes com DAB sem BSA (tampão de lavagem), e amostras de ensaiodiluídas em DAB são adicionadas às lâminas em um volume final de 100 ul.As lâminas são incubadas por uma hora com agitação em temperatura am- biente, e em seguida lavadas 3 vezes com tampão de lavagem para removermaterial não ligado. Anticorpo ligado é detectado por adição de 100 ul porcavidade de DAB contendo 250 ng/ml de anticorpo anti-humano marcadocom Eu (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. n2 1244-330) e incubado em tempe-ratura ambiente com agitação por uma hora. As lâminas são lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, e 100 ul de solução de reforço DELFIA (Perkin El-mer, Boston, MA, Cat. ns 4001-0010) é adicionado por cavidade. Depois deincubação por 15 minutos, as lâminas são lidas usando o método de Európioem uma leitora de lâminas Victor 2 (Perkin Elmer, Boston, MA).B. Construção de C- P5E8 Antcorpo Tetravalente

Os DNAs de p5E8 scFvs descritos no Exemplo 21 acima sãousados para construir um anticorpo tetravalente C- p5E8 conforme descritono Exemplo 7 acima. Um peptídeo Iigante Ser(Gly4Ser)3 é usado para conec-tar o p5E8 scFv ao término carbóxi de cadeia pesada de IgG p5E8 PRIMA-TIZED®. A organização da molécula é uma cadeia pesada de IgG p5E8 PRI- MATIZED® - Ser(GIy4Ser)3 Iigante- p5E8 scFv. Esta molécula se assemelhacom a cadeia leve para formar o anticorpo tetravalente. A seqüência corretaseria confirmada por análise da seqüência de DNA. O construto pode serusada para transfectar células CHO conforme descrito no Exemplo 8 paraaumento em escala da produção de um Antcorpo Tetravalente C- p5E8. Cé-lulas CHO transfectadas podem ser tríadas conforme descrito acima.

Equivalentes

Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de de-terminar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equiva-lentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui, neste Pedi-do de patente. Pretende-se que os equivalentes referidos sejam englobadospelas seguintes reivindicações.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> BIOGEN IDEC MA INC.

<120> COMPOSIÇÕES DE POLIPEPTÍDEOS ESTABILIZADOS

<130> BGN-A242PC

<140> PCT/US2007/006883

<141> 2007-03-19

<150> 11/725.970

<151> 2007-03-19

<150> 60/783.622

<151> 2006-03-17

<150> 60/812.688

<151> 2006-06-09

<150> 60/873.502

<151> 2006-12-08

<150> 60/873.996

<151> 2006-12-08

<160> 161

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<400> 1

cagtagcatg caggtccaac tggtgcag 28

<210> 2<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 2

gttctagaaa gcttttgtcg tcgtcgtctt tgatctccac cttggtaccc tg 52

<210> 3<211> 714<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

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caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120

cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180

aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300

gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 3 60

tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420

tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480

ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540

tcggcctcct accggtacag tggagtccct tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600

gatttcactc tcaccatcag cagcctccag cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660caatatgaca cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat caaa 714

<210> 4<211> 238<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp. Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys165 170 175Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg TYr Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr210 215 220

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235

<210> 5<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 5

gcaggcccct ggacagtgcc ttgagtggat gggatg 36

<210> 6<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 6

catcccatcc actcaaggca ctgtccaggg gcctgc 36

<210> 7

<211> 41<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 7

cctatccatt cacgttcggc tgcggtacca aggtggagat c 41

<210> 8<211> 41<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Xniciador sintético<400> 8

gatctccacc ttggtaccgc agccgaacgt gaatggatag g 41

<210> 9<211> 714<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 9

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagt gccttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 360tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540tcggcctcct accggtacag tggagtccct tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600gatttcactc t-caccatcag cagcctccag cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660caatatgaca cctatccatt cacgttcggc tgcggtacca aggtggagat caaa 714

<210> 10<211> 238<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Sèr Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys165 170 175

Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr210 215 220

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235

<210> 11<211> 85<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 11

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggggcggcggatc cggtggtggt ggtag 85

<210> 12<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 12

ttttgttcta gaaaactttt gtcgtcg 27

<210> 13<211> 85<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 13

aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggag ggggcggttc aggcggtgga gggtccggtg 60ggggcggatc tgggggcggc ggatc 85

<210> 14<211> 729<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 14

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300

gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggtggaggg 360

tccggtgggg gcggatctgg gggcggcgga tccggtggtg gtggtagtga cattcagatg 420

acccagtctc ctagctccct gtccgcctca gtaggagaca gggtcaccat cacctgcaag 480

gccagtcaga atgtgggtat taatgtagcc tggtatcaac agaaaccagg gaaggctcct 540

aaatcactga tttcctcggc ctcctaccgg tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600

agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660

acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggccaggg taccaaggtg 720gagatcaaa 729

<210> 15<211> 243<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly -Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys145 150 155 160

Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser <3ly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val225 230 235 240

Glu Ile Lys<210> 16<211> 744<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 16

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 3 00gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg agggggcggt 360tcaggcggtg gagggtccgg tgggggcgga tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt 420agtgacattc agatgaccca gtctcctagc tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc 480accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa 540ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc tcggcctcct accggtacag tggagtccct 600tccagattca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctccag 660cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag caatatgaca cctatccatt cacgttcggc 720cagggtacca aggtggagat caaa 744

<21Ό> 17<211> 248<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr ValIOO 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly <31y Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala180 185 190Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser -Gly Ser Gly Ser195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe210 215 220

Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys245

<210> 18<211> 729<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 18

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagt gccttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggtggaggg 360tccggtgggg gcggatctgg gggcggcgga tccggtggtg gtggtagtga cattcagatg 420acccagtctc ctagctccct gtccgcctca gtaggagaca gggtcaccat cacctgcaag 480gccagtcaga atgtgggtat taatgtagcc tggtatcaac agaaaccagg gaaggctcct 540aaatcactga tttcctcggc ctcctaccgg tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggctgcgg taccaaggtg 720gagatcaaa 729

<210> 19<211> 243<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser115

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys145 150 155 160

Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 20Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser20

<210> 21<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15

<210> 22<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Etiqueta 6xHis sintética<400> 22

His His His His His His1 5

<210> 23<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 23

Gly Gly Gly Gly Ser -Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser20 25

<210> 24<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ser1 5

<210> 25<211> 54<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 25

atgaaaaaac tgctgttcgc gattccgctg gtggtgccgt tctatagcca tagt 54

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 26

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser1 5 10 15

His Ser

<210> 27<211> 90<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 27

gacgacgacg acaaaagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 60gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga 90

<210> 28<211> 669<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<4-00> 28

caacttgtgc- tcactcagtc atcttcagtc tctttctccc tgggagcctc agcaaaactc 60acgtgcacct tgagtagtca gcacagtacg tacaccattg aatggtatca gcaacagccc 120ctcaagcctc ctaagtatgt gatggagctt aagaaagatg gaagccacag cacaggtgat 180gggattcctg atcgcttctc tggatccagc tctggtgctg atcgctacct tagcatttcc 240aacatccagc ctgaagatga agcaatatac atctgtggtg tgggtgatac aattaaggaa 300caatttgtgt atgttttcgg cggtggaacc aaggtcgaaa tcaaacgtac ggtggctgca 360ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 420gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 480gccctccaat cgggtaactc ccaggagagttacagcctca gcagcaccct gacgctgagcgcctgcgaag tcacccatca gggcctgagcgagtgttga

gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 540

aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 600

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 660669

<210> 29<211> 222<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 29

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser Leu Gly Ala15 10 15

Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met35 40 45

Glu Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser65 70 75 80

Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp85 90 95

Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val100 105 110Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215 220

<210> 30<211> 2139<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 30

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatcatggagctca gcagcctgag gtctgaagatgaaggttttc cttactgggg ccaagggacctctgggggcg gcggatccgg tggtggtggttccctgtccg cctcagtagg agacagggtcggtattaatg tagcctggta tcaacagaaatcggcctcct accggtacag tggagtccctgatttcactc tcaccatcag cagcctccagcaatatgaca cctatccatt cacgttcggcggagggtccg gtggaggggg ctctggagggggtggctccc agatccagtt ggtgcagtctgtcaagatct cctgcaaggc ttctggttttaaacaggctc caggaaaggg tttaaagtggccaacatata cagatgactt caagggacgaactgcctatt tgcagatcaa caacctcaacagattcatct atgatcctta ttgggggtttgtctccgcag ctagcaccaa gggcccatcgacctctgggg gcacagcggc cctgggctgcacggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacccagtcctcag gactctactc cctcagcagcacccagacct acatctgcaa cgtgaatcacgttgagccca aatcttgtga caaaactcacctggggggac cgtcagtctt cctcttcccccggacccctg aggtcacatg cgtggtggtgttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtgcagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagcaatggcaagg agtacaagtg caaggtctccaccatctcca aagccaaagg gcagccccgacgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagcagcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaatcctcccgtgc tggactccga cggctccttcagcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca

actgcagaca aatccaocag cacagcctac 240

actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300

acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 360

agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420

accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480

ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540

tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600

cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660

cagggtacca aggtggagat caaaggcggt 720

ggcggttcag ggggcggtgg atcgggggga 780

ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca 840

accttcacag actattcaat acactgggtg 900

atgggctgga taaacactga gactggtgag 960

tttgccttct ctttggtgac ctctgccacc 1020

aatgaggaca cggctacatt tttctgtgct 1080

gcttactggg gccaggggac tctggtcact 1140

gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 1200

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 1260

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 1320

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aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 1440

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1500

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1560

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1620

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1680

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1740

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1800

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1860

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1920

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1980

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2040

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2100cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggttga 2139

<210> 31<211> 712<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val105 110

Ala Arg Ser Trp100

Thr Val Ser Ser

115

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly120 125Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val

145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

165 170 175

Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr210 215 220

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly225 230 235 240

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro260 265 270

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser275 280 285

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro290 295 300

Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu305 310 315 320

Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val325 330 335

Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu340 345 350

Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp355 360 365

Gly Phe Ala Tyr Trp Cly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala370 375 380

Ser Thr Lys -Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser385 390 395 400

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe405 410 415

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly420 425 430

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu435 440 445

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr450 455 460Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

465 470 475 480

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

485 490 495

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys500 505 510

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val515 520 525

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr530 535 540

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu545 550 555 560

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His565 570 575

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys580 585 590

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln595 600 605

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu610 615 620

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro625 630 635 640Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn645 650 655

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu660 665 670

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val675 680 685

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln690 695 700

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly705 710

<210> 32<211> 2154<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 32

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggtggaggg 360tccggtgggg gcggatctgg gggcggcgga tccggtggtg gtggtagtga cattcagatg 420acccagtctc ctagctccct gtccgcctca gtaggagaca gggtcaccat cacctgcaag 480gccagtcaga atgtgggtat taatgtagcc tggtatcaac agaaaccagg gaaggctcct 540aaatcactga tttcctcggc ctcctaccgg tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600

agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660

acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggccaggg taccaaggtg 720

gagatcaaag gcggtggagg gtccggtgga gggggctctg gagggggcgg ttcagggggc 780

ggtggatcgg ggggaggtgg ctcccagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag 840

aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg gttttacctt cacagactat 900

tcaatacact gggtgaaaca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac 960

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gtgacctctg ccaccactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaacaatga ggacacggct 1080

acatttttct gtgctagatt catctatgat ccttattggg ggtttgctta ctggggccag 1140

gggactctgg tcactgtctc cgcagctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1200

ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 1260

ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 1320

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 1380

tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 1440

aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1500

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtc-ttcctct tccccccaaa acccaaggac 1560

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1620

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1680

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1740

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1800

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1860

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1920

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1980

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2040

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2100gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg ttga 2154

<210> 33<211> 717<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys145 150 155 160Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val225 230 235 240

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu260 265 270

Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile275 280 285

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp290 295 300

Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn305 310 315 320

Thr Glu

Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe325 330 335

Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn340 345 350

Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Airg Phe IIe355 360 365

Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val370 375 380

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala400

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu415

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly420 425 430

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser435 440 445

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Sèr Leu450 455 460

Gly Thr Gln Thr Tyr Xle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr465 470 475 480

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr485 490 495

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr385 390 395

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser405 410Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe500 505 510

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro515 520 525

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val530 535 540

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr545 550 555 560

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val565 570 575

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys580 585 590

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser595 600 605

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro610 615 620

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val625 630 635 640

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

645 650 655

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp660 665 670Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp675 680 685

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His690 695 700

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly705 710 715

<210> 34<211> 1773<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 34

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120

cctggacagt gccttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180

aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300

gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 360

tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420

tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480

ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540

tcggcctcct accggtacag tggagtccct tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600

gatttcactc tcaccatcag cagcctccag cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660

caatatgaca cctatccatt cacgttcggc tgcggtacca aggtggagat caaaggcggt 720

ggagggtccg gtggaggggg ctctggaggg ggcggttcag ggggcggtgg atcgggggga 780

ggtggctccc agatccagtt ggtgcagtct ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca 840

gtcaagatct cctgcaaggc ttctggtttt accttcacag actattcaat acactgggtg 900aaacaggctc caggaaaggg tttaaagtgg atgggctgga taaacactga gactggtgag 960

ccaacatata cagatgactt caagggacga tttgccttct ctttggtgac ctctgccacc 1020

actgcctatt tgcagatcaa caacctcaac aatgaggaca cggctacatt tttctgtgct 1080

agattcatct atgatcctta ttgggggttt gcttactggg gccaggggac tctggtcact 1140

gtctccgcag ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 1200

acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 1260

acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 1320

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 1380

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 1440

gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1500

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1560

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1620

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1680

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1740

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aac 1773

<210> 35<211> 712<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 35

Gln Val Gln Leu Val -Gln Ser -Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys165 170 175

Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr210 215 220Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly225 230 235 240

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro260 265 270

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser275 280 285

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro290 295 300

Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu305 310 315 320

Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val325 330 335

Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu340 345 350

Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp355 360 365

Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala370 375 380

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser385 390 395 400

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe405 410 415

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly420 425 430

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu435 440 445

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr450 455 460

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys465 470 475 480

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro485 490 495

Ala Pro Olu Leu X»eu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Piro Pro Lys500 505 510

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val515 520 525

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr530 535 540

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu545 550 555 560Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His565 570 575

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys580 585 590

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln595 600 605

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu610 615 620

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro625 630 635 640

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn645 650 655

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu660 665 670

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val675 680 685

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln690 695 700

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly705 710

<210> 36<211> 2154<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 36

caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60

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cctggacagt gccttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180

aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240

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aaatcactga tttcctcggc ctcctaccgg tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600

agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660

acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggctgcgg taccaaggtg 720

gagatcaaag gcggtggagg gtccggtgga gggggctctg gagggggcgg ttcagggggc 780

ggtggatcgg ggggaggtgg ctcccagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag 840

aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg gttttacctt cacagactat 900

tcaatacact gggtgaaaca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac 960

actgagactg gtgagccaac atatacagat gacttcaagg gacgatttgc cttctctttg 1020

gtgacctctg ccaccactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaacaatga ggacacggct 1080

acatttttct gtgctagatt catctatgat ccttattggg ggtttgctta ctggggccag 1140

gggactctgg tcactgtctc cgcagctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1200

ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 1260

ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 1320

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 1380

tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 1440

aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1500

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1560

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1620gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1680

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1740

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1800

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1860

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1920

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1980

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2040

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2100

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg ttga 2154

<210> 37<211> 717<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ale. Gln Tyr Asn Glu. Lys Plie50 55 60

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys

145 150 155 160

Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val225 230 235 240

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly245 250 255Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly <5ly Gly Ser Gln Ile Gln Leu260 265 270

Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile275 280 285

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp290 295 300

Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn305 310 315 320

Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe325 330 335

Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn340 345 350

Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Arg Phe Ile355 360 365

Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Cly Thr Leu Val370 375 380

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala385 390 395 400

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu405 410 415

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly420 425 430

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser435 440 445

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu450 455 460

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

465 470 475 480

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr485 490 495

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe500 505 510

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro515 520 525

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val530 535 540

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr545 550 555 560

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val565 570 575

Leu Thr Val580

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys585 590Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser595 600 605

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro610 615 620

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val625 630 635 640

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

645 650 655

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp660 665 670

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp675 680 685

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His690 695 700

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly705 710 715

<210> 38<211> 64<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 38

gggggtggat ccggtggagg gggctccggc ggtggcgggt cccaggtcca actggtgcagtctg 64

<210> 39<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 39

tgggggcggc gggtccggtg gtggtggtag 30

<210> 40<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22.0>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 40

taccaccacc accggacccg ccgcccccag 30

<210> 41<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 41

gttaacggat cctcatttga tctccacctt gg 32

<210> 42<211> 48<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 42

tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc tccggcggtg gcgggtcc 48

<210> 43<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 43

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15

<210> 44<211> 2115<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 44

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540ggactctact ccctcagcag cgtggtgacctacatctgca acgtgaatca caagcccagcaaatcttgtg acaaaactca cacatgcccaccgtcagtct tcctcttccc cccaaaacccgaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagctacgtggacg gcgtggaggt gcataatgccagcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcaccgagtacaagt gcaaggtctc caacaaagccaaagccaaag ggcagccccg agaaccacagctgaccaaga accaggtcag cctgacctgcgccgtggagt gggagagcaa tgggcagccgctggactccg acggctcctt cttcctctaccagcagggga acgtcttctc atgctccgtgcagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaatccggcggtg gcgggtccca ggtccaactggggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggctcactgggtga ggcaggcccc tggacagggaaatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttctccaccagca cagcctacat ggagctcagctactgtgcaa gatcctggga aggttttccttcctcaggtg ggggcggatc tgggggcggcatgacccagt ctcctagctc cctgtccgccaaggccagtc agaatgtggg tattaatgtacctaaatcac tgatttcctc ggcctcctacggcagtggat ctgggacaga tttcactctcgcaacctatt tctgtcagca atatgacaccgtggagatca aatga

gtgcoctcca gcagcttggg cacccagacc 600

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gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380

gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440

tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500

cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560

aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620

agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680

tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740

gggtccggtg gtggtggtag tgacattcag 1800

tcagtaggag acagggtcac catcacctgc 1860

gcctggtatc aacagaaacc agggaaggct 1920

cggtacagtg gagtcccttc cagattcagc 1980

accatcagca gcctccagcc tgaagacttc 2040

tatccattca cgttcggcca gggtaccaag 21002115

<210> 45<211> 704<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 45

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro -Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys20 25

Ser Ile His Trp Val Lys35 40

Gly Trp Ile Asn Thr Glu

Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr30

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met45

Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu305 310 315

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro465 470 475 480

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu500 505 510

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu515 520 525

Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr530 535 540

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr545 550 555 560

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr565 570 575

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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu595 600 605

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln610 615 620

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala625 630 635 640

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro645 650 655

Ser Arg Phe

660

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile665 670Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr675 680 685

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys690 695 700

<210> 46<211> 2130<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 46

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180

acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300

tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaocggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380

tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440

gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500

cactgggtga ggcaggcccc tggacaggga cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560

aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620

tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680

tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740

tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg gcggcgggtc cggtggtggt 1800

ggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 1860

gtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaat gtgggtatta atgtagcctg gtatcaacag 1920

aaaccaggga aggctcctaa atcactgatt tcctcggcct cctaccggta cagtggagtc 1980

ccttccagat tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040

cagcctgaag acttcgcaac ctatttctgt cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 2100ggccagggta ccaaggtgga gatcaaatga 2130

<210> 47<211> 709<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 47

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160

Trp Asn Ser <31y Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro465 470 475 480

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Cln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu500 505 510

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu515 520 525

Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr530 535 540Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr545 550 555 560

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr565 570 575

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser580 585 590

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln595 600 605

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr610 615 620

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln625 630 635 640

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg645 650 655

Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp660 665 670

Phe Thr Leu Tlir Xle Ser Ser Leu Gln Pro Olu Asp Phe Ala. Thr Tyr675 680 685

Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr690 695 700

Lys Val Glu Ile Lys705<210> 48<211> 2115<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 48

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180

acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300

tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380

tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500

cactgggtga ggcaggcccc tggacagtgc cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560

aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620

tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680

tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740

tcctcaggtg ggggcggatc tgggggcggc gggtccggtg gtggtggtag tgacattcag 1800

atgacccagt ctcctagctc cctgtccgcc tcagtaggag acagggtcac catcacctgc 1860

aaggccagtc agaatgtggg tattaatgta gcctggtatc aacagaaacc agggaaggct 1920

cctaaatcac tgatttcctc ggcctcctac cggtacagtg gagtcccttc cagattcagc 1980

ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctccagcc tgaagacttc 2040

gcaacctatt tctgtcagca atatgacacc tatccattca cgttcggctg cggtaccaag 2100gtggagatca aatga 2115

<210> 49<211> 704<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 49

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175

Leu -Gln Ser Ser -Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350

Thr Leu Pro -Pro Ser Arg Asp Glu355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn385 390 395

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 " 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro465 470 475 480

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu500 505 510

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu515 520 525

Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr530 535 540

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr545 550 555 560

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr565 570 575Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser580 585 590

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu595 600 605

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln610 615 620

Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

625 630 635 640

Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

645 650 655

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile660 665 670

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr675 680 685

Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys690 695 700

<210> 50<211> 2130<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 50

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatctcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180

acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300

tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360

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ggçacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

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tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

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ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380

tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440

gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500

cactgggtga ggcaggcccc tggacagtgc cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560

aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620

tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680

tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740

tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg gcggcgggtc cggtggtggt 1800

ggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 1860

gtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaat gtgggtatta atgtagcctg gtatcaacag 1920

aaaccaggga aggctcctaa atcactgatt tcctcggcct cctaccggta cagtggagtc 1980ccttccagat tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040cagcctgaag acttcgcaac ctatttctgt cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 2100ggctgcggta ccaaggtgga gatcaaatga 2130

<210> 51<211> 709<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 51

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr <31u Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser -Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro465 470 475 480

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495

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<210> 52<211> 2130<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 52

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaagtggaactcag gcgccctgac cagcggcgtgggactctact ccctcagcag cgtggtgacctacatctgca acgtgaatca caagcccagcaaatcttgtg acaaaactca cacatgcccaccgtcagtct tcctcttccc cccaaaacccgaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagctacgtggacg gcgtggaggt gcataatgccagcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcaccgagtacaagt gcaaggtctc caacaaagccaaagccaaag ggcagccccg agaaccacagctgaccaaga accaggtcag cctgacctgcgccgtggagt gggagagcaa tgggcagccgctggactccg acggctcctt cttcctctaccagcagggga acgtcttctc atgctccgtgcagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaatccggcggtg gcgggtccca ggtccaactgggggagtcag tgaaggtgtc ctgcaaggctcactgggtga ggcaggcccc tggacagggaaatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttctccaccagca cagcctacat ggagctcagctactgtgcaa gatcctggga aggttttccttcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggcggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcctgtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaataaaccaggga aggctcctaa attactgattccttccagat tcagcggcag tggatctgggcagcctgaag acttcgcaac ctatttctgtggccagggta ccaaggtgga gatcaaatga

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tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500

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acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040

cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 21002130

<210> 53<211> 709<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 53

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

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180 185 190

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260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro465 470 475 480

Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu500 505 510

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Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

565 570 575

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln595 600 605

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<210> 54<211> 2130<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 54

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tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

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cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gcçgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380

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cactgggtga ggcaggcccc tggacagtgc cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560

aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620

tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680

tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740

tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg gcggcgggtc cggtggtggt 1800

ggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 1860

gtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaat gtgggtatta atgtagcctg gtatcaacag 1920

aaaccaggga aggctcctaa attactgatt tcctcggcct cctaccggta cagtggagtc 1980

ccttccagat tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040

cagcctgaag acttcgcaac ctatttctgt cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 2100ggctgcggta ccaaggtgga gatcaaatga 2130

<210> 55<211> 709<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 55

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335

Lys Thr Ile

340

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415

Lys Ser Arg Trp -Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly450 455 460

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

465 470 475 480

Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr485 490 495

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Alci Piro Gly Gln Cys Lbu Glu500 505 510

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu515 520 525

Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr530 535 540

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

545 550 555 560

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

565 570 575

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser580 585 590

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln595 600 605

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr610 615 620

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln625 630 635 640

Lys Pro Gly Lys Ala Piro Lys L6U Leu Xle Ser* Seir Ala Seir Tyir Airg645 650 655

Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp660 665 670

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr675 680 685Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr690 695 700

Lys Val Glu Ile Lys705

<210> 56<211> 64<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 56

gggggtggat ccggtggagg gggctccggc ggtggcgggt cccaggtcca actggtgcag 60tctg 64

<210> 57<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 57

gttaacggat cctcatttga tctccacctt gg 32

<210> 58

<211> 29

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 58Asp Asp Asp Asp Lys Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu1 5 10 15

Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His20 25

<210> 59<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 59

atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcagggtc tttctcc 57

<210> 60<211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 60

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Gly1 5 10 15

Ser Phe Ser

<210> 61

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 61

atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt cctgtcc 57

<210> 62<211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 62

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg1 5 10 15

Val Leu Ser

<210> 63<211> 2115<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 63

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc ttggcaaagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgcgcag cctccgggtt caggttcacc ttcaataact actacatgga ctgggtccgc 120caggctccag ggcaggggct ggagtgggtc tcacgtatta gtagtagtgg tgatcccaca 180tggtacgcag actccgtgaa gggcagattc accatctcca gagagaacgc caagaacaca 240ctgtttcttc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtctatta ctgtgcgagc 300ttgactacag ggtctgactc ctggggccag ggagtcctgg tcaccgtctc ctcagctagc 360accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420gcggccctgg gctgcctggt caaggactactcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacctactccctca gcagcgtggt gaccgtgccctgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacctgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgcgtcttcctct tccccccaaa acccaaggacacatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaagacggcgtgg aggtgcataa tgccaagacataccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctgaagtgcaagg tctccaacaa agccctcccaaaagggcagc cccgagaacc acaggtgtacaagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtcgagtgggaga gcaatgggca gccggagaactccgaoggct ccttcttcct ctacagcaaggggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcatagcctctccc tgtctccggg taaatccggcggtggcgggt ccgacatcca gatgacccaggacagagtca ccatcacttg cagggcaagtcagcagaaac caggaaaagc tcctaagctcggggtcccat caaggttcag cggcagtggaagcctgcagc ctgaagattt tgcgacttatacgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatctccggtggtg gtggtagtga ggtgcagctgggggggtccc tgagactctc ctgcgcagcctacatggact gggtccgcca ggctccagggagtagtggtg atcccacatg gtacgcagacgagaacgcca agaacacact gtttcttcaagtctattact gtgcgagctt gactacagggaccgtctcct catga

<210> 64<211> 704

ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

gggggtggat ccggtggagg gggctccggc 1380

tctccatctt ccctgtctgc atctgtaggg 1440

caggacatta ggtattattt aaattggtat 1500

ctgatctatg ttgcatccag tttgcaaagt 1560

tctgggacag agttcactct caccgtcagc 1620

tactgtctac aggtttatag tacccctcgg 1680

aaaggtgggg gcggatctgg gggcggcggg 1740

gtggagtctg ggggcggctt ggcaaagcct 1800

tccgggttca ggttcacctt caataactac 1860

caggggctgg agtgggtctc acgtattagt 1920

tccgtgaagg gcagattcac catctccaga 1980

atgaacagcc tgagagctga ggacacggct 2040

tctgactcct ggggccaggg agtcctggtc 21002115<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys20 25

Asn Tyr Tyr Met Asp Trp35 40

Trp Val Ser Arg Ile Ser50 55

Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Phe Asn30

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu45

Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr65 70 75 80

Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala -Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95

Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Thr Gly Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro <3lu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu <3ln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr305 310 315 320Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg <3lu Pro Gln Val Tyr Thr Leu340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445

Ser Gly Gly -Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser450 455 460

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly465 470 475 480

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr Tyr485 490 495

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile500 505 510

Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly515 520 525

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro530 535 540

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val Tyr Ser Thr Pro Arg

545 550 555 560

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

565 570 575

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu580 585 590

Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys595 600 605

Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Asp Trp610 615 620

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser625 630 635 640

Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe645 650 655Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn660 665 670

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr675 680 685

Thr Gly Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser690 695 700

<210> 65<211> 645<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 65

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgca gggcaagtca ggacattagg tattatttaa attggtatca gcagaaacca 120

ggaaaagctc ctaagctcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccgtcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg cgacttatta ctgtctacag gtttatagta cccctcggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttoccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 645

<210> 66<211> 214<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr Tyr20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val Tyr Ser Thr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg -Gly Glu Cys210

<210> 67<211> 723<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 67

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60atcacttgca gggcaagtca ggacattagg tattatttaa attggtatca gcagaaacca 120ggaaaagctc ctaagctcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg g-cagtggatc tgggacagag ttcactctca ccgtcagcag cctgcagcct 240gaagattttg -cgacttatta ctgtctacag gtttatagta cccctcggac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa aggcggtggc gggtccggtg ggggtggctc cgggggcggt 360ggctccgagg tgcagctggt ggagtctggg ggcggcttgg caaagcctgg ggggtccctg 420agactctcct gcgcagcctc cgggttcagg ttcaccttca ataactacta catggactgg 480gtccgccagg ctccagggca ggggctggag tgggtctcac gtattagtag tagtggtgat 540cccacatggt acgcagactc cgtgaagggc agattcacca tctccagaga gaacgccaag 600aacacactgt ttcttcaaat gaacagcctg agagctgagg acacggctgt ctattactgt 660gcgagcttga ctacagggtc tgactcctgg ggccagggag tcctggtcac cgtctcctca 720tga 723

<210> 68<211> 240<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr Tyr20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val Tyr Ser Thr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu115 120 125Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys130 135 . 140

Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Asp Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser165 170 175

Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vctl Lys Gly Airg Phe180 185 190

Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn195 200 205

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr210 215 220

Thr Gly Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser225 230 235 240

<210> 69<211> 723<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 69

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc ttggcaaagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgcgcag cctccgggtt caggttcacc ttcaataact actacatgga ctgggtccgc 120caggctccag ggcaggggct ggagtgggtc tcacgtatta gtagtagtgg tgatcccaca 180tggtacgcag actccgtgaa gggcagattcctgtttcttc aaatgaacag cctgagagctttgactacag ggtctgactc ctggggccagggcgggtccg gtgggggtgg ctccgggggcccatcttccc tgtctgcatc tgtaggggacgacattaggt attatttaaa ttggtatcagatçtatgttg catccagttt gcaaagtggggggacagagt tcactctcac cgtcagcagctgtctacagg tttatagtac ccctcggacg tga

433

accatctoca gagagaacgc caagaacaca 240

gaggacacgg ctgtctatta ctgtgcgagc 300

ggagtcctgg tcaccgtctc ctcaggcggt 3 60

ggtggctccg acatccagat gacccagtct 420

agagtcacca tcacttgcag ggcaagtcag 480

cagaaaccag gaaaagctcc taagctcctg 540

gtcccatcaa ggttcagcgg cagtggatct 600

ctgcagcctg aagattttgc gacttattac 660

ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa 720723

<210> 70<211> 240<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Phe Asn20 25 30

Asn Tyr Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45

Trp Val Ser Arg Ile Ser Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr65 70 75 80Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95

Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Thr Gly Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160

Asp Ile Arg Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val210 215 220

Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235 240

<210> 71<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 71

cgctggtggt gccgttctat agccatagtg acatccagat gacc 44

<210> 72<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 72

gtggtcgact ttgatttcca c 21

<210> 73<211> 47<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 73

cgctggtggt gccgttctat agccatagtg aggtgcagct ggtggag 47

<210> 74<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 74

gtggtcgact gaggagacgg tgac 24

<210> 75<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador sintético<400> 75

ggcatatgaa aaaactgctg ttcgcgattc cgctggtggt gccgttctat ag 52

<210> 76<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 76

gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggcggc ttg 33

<210> 77<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 77

gagtctgggg gcggcrrcgc aaagcctggg ggg 33

<210> 78<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 78

gtctgggggc ggcttgrhgm agcctggggg gtccctg 37

<210> 79<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 79

gttcaggttc accttcagca actactacat ggac 34

<210> 80<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 80

caataactac tacatgmrct gggtccgcca ggctc 35

<210> 81<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 81cgccaggctc cagggarggg gctggagtgg gtc 33

<210> 82<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 82

gggctggagt gggtcgsccg tattagtagt agtg 34

<210> 83<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 83

gagtgggtct cacgtatgag tagtagtggt gatc 34

<210> 84<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 84

ggtattattt aaattggtat gcccagaaac caggaaaag 39

<210> 85<211> 36<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 85

gtattagtag tagtggtrgc cccacatggt acgcag 36

<210> 86<211> 32

<212> DNA ,

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 86

gtagtagtgg tgatrvcaca tggtacgcag ac 32

<210> 87<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 87

gtggtgatcc cacawactac gcagactccg tg 32

<210> 88<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 88

gattcaccat ctccagarac aacgccaaga acacac 36<210> 89<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 89

catctccaga gagaacagca agaacacact gtttc 35

<210> 90<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 90

gccaagaaca cactgkhcct tcaaatgaac age 33

<210> 91<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 91

gaacacactg tttcttgaaa tgaacagcct gagag 35

<210> 92<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 92

caaatgaaca gcctgagagg cgaggacacg gctgtc 36

<210> 93<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 93

gagctgagga cacggctrsc tattactgtg cg 32

<210> 94<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 94

gtctattact gtgcgargtt gactacaggg tctg 34

<210> 95<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 95

cagtctccat cttccggctc tgcatctgta ggg 33<210> 96<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 96

ccctgtctgc atctrscggg gacagagtca cc 32

<210> 97<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 97

ctgtagggga cagactgacc atcacttgca gg 32

<210> 98<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 98

ggggacagag tcaccctgac ttgcagggca ag 32

<210> 99<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 99

gacagagtca ccatcagctg cagggcaagt cag 33

<210> 100<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 100

gcagggcaag tcagrgcatt aggtattatt taaattg 37

<210> 101<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 101

gcaagtcagg acattmkcta ttatttaaat tgg 33

<210> 102<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 102

aattggtatc agcaggcccc aggaaaagct cc 32

<210> 103<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 103

ccaggaaaag ctcctsrcct cctgatctat gttg 34

<210> 104<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<220>

<221> modified_base<222> (18). . (19)<223> a, c, g or t<400> 104

ctaagctcct gatctatnnk gcatccagtt tgcaaag 37

<210> 105<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 105

ctatgttgca tccagtcgcc aaagtggggt ccc 33

<210> 106<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 106

cagtttgcaa agtgggtccc catcaaggtt cagc 34

<210> 107<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 107

cagtggatct gggacagact tcactctcac cgtc 34

<210> 108<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 108

gagttcactc tcaccatcag cagcctgcag cc 32

<210> 109<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 109cagcagcctg cagrgcgaag attttgcgac 30

<210> 110<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 110

ctgcagcctg aagatrscgc gacttattac tg 32

<210> 111<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 111

cctgaagatt ttgcggacta ttactgtcta cag 33

<210> 112<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 112

gcgacttatt actgtsmrca ggtttatagt acc 33

<210> 113<211> 33<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 113

gtttatagta cccctmwaac gttcggccaa ggg 33

<210> 114<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 114

gtacccctcg gacgtggggc caagggacca ag 32

<210> 115<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 115

gctccagggc aggggtgcga gtgggtctca cg 32

<210> 116<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 116

gtacccctcg gacgtgcggc caagggacca ag 32<210> 117<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 117

cttgactaca gggtcttgct cctggggcca gggag 35

<210> 118<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 118

ggaaaagctc ctaagtgcct gatctatgtt gc 32

<210> 119<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 119

gactacaggg tctgactgct ggggccaggg agtc 34

<210> 120

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 120

ggaaaagctc ctaagtgcct gatctatgtt gc 32

<210> 121<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 121

caggctccag ggcagtgcct ggagtgggtc tcac 34

<210> 122<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 122

cctcggacgt tcggctgcgg gaccaaggtg gaaatc 36

<210> 123<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<220>

<221> modified_base<222> (17)..(18)<223> a, c, g or t<400> 123

gtaccggtag gaggcmnnrk aaatcagtga tttagg 36

<210> 124<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 124

gggaaggctc ctaaattact gatttcctcg gcc 33

<210> 125<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<220>

<221> modified_base<222> (18)<223> a, c, g or t<400> 125

ggacaccttc actgacbncc caggcttctt cac 33

<210> 126<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 126

gatcctggga aggttttgac tactggggcc aagggac 37

<210> 127<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 127

gggtcctcag tgaãgwtrtc ctgcaaggct tctg 34

<210> 128<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 128

cagggacttg agtggvkkgg atggatttat cctg 34

<210> 129<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<220>

<221> modified_base<222> (17)<223> a, c, g or t<400> 129gaagttcaag ggcaggnyca caatcactgc agac 34

<210> 130<211> 42<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 130

ggatggattt atcctggaaa tggtcatgct cagtacaatg ag 42

<210> 131<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<220>

<221> modified_base<222> (17)<223> a, c, g or t<400> 131

ggtggtagtg acattvnsat gacccagtct cctagc 36

<210> 132

<211> 75

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 132

ggcggtggag ggtccggtgg agggggctct ggagggggcg gttcaggggg cggtggatcggggggaggtg gctcc 75

<210> 133<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 133

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 25

<210> 134<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotideo sintético<400> 134

agagagacgc gtgtcctgtc ccaggtccaa ctggtgcag 39

<210> 135<211> 89<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 135

agccacctcc ccccgatcca ccgccccctg aaccgccccc tccagagccc cctccaccggaccctccacc gcctttgatc tccaccttg 89<210> 136<211> 90<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 136

agagagagat cttgactgtc tctccaggct tcttcagctc aggtccagac tgcaccaactggatctggga gccacctccc cccgatccac 90

<210> 137<211> 290<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 137

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser15 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro20 25 30

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr35 40 45

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu65 70 75 80Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr85 90 95

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr165 170 175

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg195 200 205

Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr225 230 235 240

Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Phe Leu Glu Gln Lys260 265 270

Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His275 280 285

His His290

<210> 138<211> 290<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Construto sintético<400> 138

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro20 25 30

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr35 40 45

Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu50 55 60

Trp Met Gly Trp Ile65 70

Tyr Pro Gly Asn Gly His Ala Gln Tyr Asn Glu75 80Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr85 90 95

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr165 170 175

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg195 200 205

Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr225 230 235 240

Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Phe Leu Glu Gln Lys260 265 270

Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His275 280 285

His His290

<210> 139<211> 33<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 139

Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys Ser15 10 15

Val Glu Gly Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly Ala Val20 25 30

Val

<210> 140<211> 44<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 140

Gln Val Leu Gln Ser Val Ala Gly Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln15 10 15

Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu Tyr Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu20 25 30

Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile Arg Leu Val Thr Ser35 40

<210> 141<211> 42<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 141

Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln15 10 15

Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln20 25 30

Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val35 40

<210> 142

<211> 51

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 142

Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val Arg Val Val Gly Thr Glu1 5 10 15

Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr Asp Gly Pro Ser Glu Gln20 25 30

Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly Ser Ser Phe Val Glu Leu35 40 45

Ala Ser Thr50

<210> 143<211> 44<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 143

Ala Leu Thr Gln Gln Asp Gly Gly Met Ser Val Ala Glu Gly Gln Ala15 10 15

Leu Leu Leu Pro Cys Gly Ala Thr Leu Gly Gly Pro Asn Leu Ser Val20 25 30

Val Trp Val Ser Pro Arg Gln Glu Asp Leu Val Ala35 40

<210> 144<211> 45<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 144

Ser Leu Arg Val Ser Pro Lys Asn Pro Arg Val Pro Lys Ser His Thr1 5 10 15

Leu Glu Leu His Cys Glu Ser Gln Cys Asp Ser His Leu Lys Tyr Ser20 25 30

Leu Lys Leu Ser Trp Ser Lys Asp Gly Glu Ala Phe Glu35 . 40 45

<210> 145<211> 44<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 145

Val Val Pro Thr Val His Arg Asn Val Thr Val Ser Arg Gly Glu Pro15 10 15

Val Thr Leu Asn Cys Ser Ile Asn Met Thr Asn Ile Thr Gln Ile Ser20 25 30

Trp Arg Lys Asp Thr Leu Ile Phe Val Tyr Leu Ala35 40

<210> 146<211> 39<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 146

His Gln Gln Gln Ile Gly Val Glu Gly Lys Glu Val Ile Leu Asn Cys15 10 15

Lys Thr His Asp Lys Asp Val Thr Trp Lys Tyr Lys Tyr Asp Thr Gly20 25 30

Ser Ala Ile Ile Ile Ile Gln35

<210> 147<211> 51<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 147

Val Ala Ser Gln Gly Gly His Val Glu Ser Val Tyr Leu Tyr Gly Thr15 10 15

Val Glu Leu Pro Cys Glu Phe Pro Phe Val Thr Gly Pro Gln Asp Leu20 25 30

Val Met Thr Trp Leu Lys Val Val Gln Asp Ser Glu Asn Val Val Val35 40 45

His Ser Tyr50<210> 148<211> 51<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 148

Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn1 5 10 15

Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Asp Leu Leu Ala20 25 30

Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln Phe Val35 40 45

Ala Gly Glu50

<210> 149<211> 50<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 149

Lys Ile Glu Ala Pro Val Asn Val Ile Val Gln Arg Gly Leu Cys Val15 10 15

Leu Ile Pro Cys Asn Phe Thr Val Gly Pro Lys Tyr Asn Leu Thr Lys20 25 30Asp Ala Ile Gly Ile Trp Tyr Lys Gly His Pro Asn Asp Pro Val Ala35 40 45

Ala Ser50

<210> 150<211> 49<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 150

Gln Gly Ala Val Pro Glu Glu Leu His Lys His Pro Gly Gln Thr Leu15 10 15

Leu Leu Gln Cys Gln Tyr Ser Pro Lys Arg Gly Pro Tyr Gln Pro Lys20 25 30

Ser Trp Cys Gln Gln Thr Ser Pro Ser Arg Cys Thr Leu Leu Val Thr35 40 45

Ser

<210> 151<211> 46<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 151

Ser Leu Ser Asp Ser Val Ser Ser Ala Val Leu Gly Ser Ser Ala Lys1 5 10 15

Leu Xle Cys Gln Phe Thr Pro Val Val Asp Ala Lys Asn Val Glu Ile20 25 30

Arg Trp Phe Thr Arg Ser Phe Arg Pro Tyr Val His Gln Tyr35 40 45

<210> 152<211> 49<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 152

Val Gly Thr Gln Arg Pro Ile Glu Leu His Leu Gly Glu Leu Arg Gly15 10 15

Ser Ile Thr Ile Pro Cys Pro Pro Gly Asp Ser Trp Gly Gly Thr Arg20 25 30

Arg Leu Trp Cys Arg Val Gly Arg Ser Arg Cys Ile Leu Ile Ala Asp35 40 45

Thr

<210> 153<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 153

Gln Leu Val Pro Val Pro Asn Val Thr Val Ser Pro Gly Glu Thr Ala15 10 15

Ile Leu Ser Cys Leu Val Leu Ser Glu Ala Pro Tyr Asn Leu Thr Trp20 25 30

Val Arg Asp Trp Arg Val Leu35

<210> 154<211> 47<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<400> 154

Met Val Glu Gln Met Asp Asn Lys Thr Val Val Ser Gly Lys Pro Val15 10 15

Thr Phe Leu Cys Asn Tyr Ile Leu Ser Met Arg Val Arg Gln Val Leu20 25 30

Trp Lys Lys Thr Ala Glu Gln Gly Asp Thr Ala Ile Val Ala Ser35 40 45

<210> 155<211> 42<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<400> 155

Ser Gln Met Val Ser Glu Pro Gly Lys Asn Ile Thr Leu Thr Cys Glu15 10 15

Pro Arg Glu Asn His Leu Leu Glu Glu Val Ser Trp Glu Lys Ile Gln20 25 30

Pro Gln Gln Ile Asp Leu Leu Ile Ser Cys35 40

<210> 156<211> 30<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético<220>

<221> M0D_RES<222> (6) . . (10)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> M0D_RES<222> (11)..(15)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> M0D_RES<222> (16)..(20)

<223> Região pode estar ou não presente<220><221> MOD_RES<222> (21)..(25)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> MOD_RES<222> (26)..(30)

<223> Região pode estar ou não presente<400> 156

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 157<211> 31<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<220>

<221> MOD_RES<222> (7)..(11)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> MOD_RES<222> (12).. (16)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> MOD_RES<222> (17) . . (21)

<223> Região pode estar ou não presente<220><221> MOD_RES<222> (22)..(26)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> MOD_RES<222> (27)..(31)

<223> Região pode estar ou não presente<400> 157

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 158<211> 4<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Sintética<220>

<221> MOD_RES<222> (1)<223> Suc-p-Ala<400> 158Ala Leu Ala Leu1

<210> 159<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Etiqueta 5xHis sintética<400> 159

His His His His His1 5

<210> 160<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptideo sintético<220>

<221> M0D_RES<222> (16)..(20)

<223> Região pode estar ou não presente<220>

<221> M0D_RES<222> (21)..(25)

<223> Região pode estar ou não presente<400> 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 25

<210> 161<211> 4<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 161

Ser Gly Gly Gly

Claims

1. População de moléculas scFv estabilizadas, em que as molé-culas scFv estabilizadas compreendemi) um Iigante de scFv interposto entre um domínio Vh e umdomínio VL, em que os domínios Vh e Vl são encadeados por uma ligaçãodissulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um aminoácido no domínioVl, e em que os domínios Vh e Vl das moléculas scFv têm valores de Tm demais de 55°C; ouii) um Iigante de scFv interposto entre um domínio Vh e umdomínio VL, em que os domínios Vh e Vl são encadeados por uma ligaçãodissulfeto entre um aminoácido no domínio Vh e um aminoácido no domínioVL, e em que moléculas scFv têm uma T50 de mais de 49°C.

2. Molécula scFv estabilizada em que a molécula scFv estabili-zada compreendei) um Iigante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos(Gly4 Ser)n interposto entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os do-mínios Vh e Vl são ligados por uma ligação dissulfeto entre o aminoácido 44de Vh e o aminoácido 100 de VL;ii) um domínio Vh e um domínio Vl em que a molécula temno mínimo uma substituição selecionada entre um grupo consistindo em:a) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 13 de VH;b) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH;c) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 46 de VL;d) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 49 de VL;e) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;f) substituição de aminoácidos nas posições de Kabat 49 e 50 deVL;g) substituição de aminoácido na posição de Kabat 101 de VH;h) substituição de aminoácido na posição de Kabat 20 de VH;i) substituição de aminoácido na posição de Kabat 48 de VH;j) substituição de aminoácido na posição de Kabat 3 de VL;k) substituição de aminoácido na posição de Kabat 55;l) substituição de aminoácido na posição de Kabat 67 de VH;m) substituição de aminoácido na posição de Kabat 6 de VH;n) substituição de aminoácido na posição de Kabat 32 de VH ;o) substituição de aminoácido na posição de Kabat 49 de VH;p) substituição de aminoácido na posição de Kabat 43 de VH;q) substituição de aminoácido na posição de Kabat 72 de VH;r) substituição de aminoácido na posição de Kabat 79 de VH;s) substituição de aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;t) substituição de aminoácido na posição de Kabat 75 de VL;u) substituição de aminoácido na posição de Kabat 80 de VH ;v) substituição de aminoácido na posição de Kabat 83 de VH ; ouiii) um domínio Vh e um domínio Vl com uma interface esta-bilizada entre VH e VL da scFv em que a molécula tem no mínimo umasubstituição em uma posição de aminoácido diretamente dentro da interfacee/ou em uma posição de aminoácido que estruturas a interação entre VH eVL, em que a no mínimo uma posição de aminoácido é selecionada entreum grupo consistindo em: 47H, 37H, 45H, 46H, 51H1 59H, 109H, 14H, 26H,-27H, 40H, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H,-79H, 82bH, 8H, 32H, 39H, 41 Η, 62H, 85H, 91 Η, 24H, 60H, 37L, 36L, 44L,-59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L,-98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L, e 104L, de acordo com a numeração de Kabat,e em que a molécula scFv estabilizada tem uma T50 mais do que a de umamolécula scFv carecendo da substituição.

3. Molécula scFv estabilizada de acordo com a reivindicação 2,em que a molécula scFv estabilizada tem uma estabilidade equivalente à deum fragmento Fab convencional sob condições de ensaio térmico.

4. Proteína de fusão compreendendo uma molécula scFv estabi-lizada como definida na reivindicação 2.

5. População de moléculas de ligação de antígenos multivalen-tes estabilizadas, em que as moléculas de ligação estabilizadas compreen-dem no mínimo uma molécula scFv estabilizada compreendendo um Iigantede scFv interposto entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domí-nios Vh e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoáci-do no domínio Vh e um aminoácido no domínio VL, e em que a população demoléculas de ligação estabilizadas compreendem proteínas solúveis mono-méricas das quais não mais de 10% está presente em forma aggregada.

6. População a reivindicação 5, em que as moléculas de ligaçãode antígenos multivalentes estabilizadas são expressadas em células CHOou NSO.

7. População de moléculas de ligação de antígenos multivalen-tes estabilizadas, em que cada molécula de ligação de antígeno multivalente compreendei) no mínimo uma molécula scFv compreendendo um Iigantede scFv interposto entre um domínio Vh e um domínio Vl, em que os domí-nios Vh e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoáci-do no domínio Vh e um aminoácido no domínio Vl, e em que os domínios Vhe Vl da no mínimo uma molécula scFv têm uma Tm de mais de 55°C; ouii) no mínimo uma molécula scFv compreendendo um Iigantede scFv interposto entre um domínio Vh e um domínio Vl, em que os domí-nios Vh e Vl são encadeados por uma ligação dissulfeto entre um aminoáci-do no domínio Vh e um aminoácido no domínio VL, e em que a no mínimo uma molécula scFv da molécula de ligação de antígeno multivalente temuma T50 de mais de 49°C.

8. Molécula de ligação de antígenos multivalentes estabilizadacompreendendoi) no mínimo uma molécula scFv estabilizada, em que a mo- lécula scFv estabilizada compreende um Iigante de scFv (Gly4 Ser)n interpos-to entre um domínio Vh e um domínio Vl e em que os domínios Vh e Vl sãoencadeados por uma ligação dissulfeto;ii) no mínimo uma molécula scFv estabilizada compreenden-do um Iigante de scFv tendo a seqüência de aminoácidos (Gly4 Ser)n inter-posto entre um domínio Vh e um domínio VL, em que os domínios Vh e Vlsão encadeados por uma ligação dissulfeto entre o aminoácido 44 de Vh e oaminoácido 100 de VL;iii) no mínimo uma molécula scFv estabilizada, em que a mo-lécula scFv estabilizada compreende no mínimo uma substituição seleciona-da entre um grupo consistindo em:a) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 13 de VH;b) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 16 de VH;c) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 46 de VL;d) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 49 de VL;e) substituição de um aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;f) substituição de aminoácidos nas posições de Kabat 49 e 50 de VL;g) substituição de aminoácido na posição de Kabat 101 de VH;h) substituição de aminoácido na posição de Kabat 20 de VH;i) substituição de aminoácido na posição de Kabat 48 de VH;j) substituição de aminoácido na posição de Kabat 3 de VL;k) substituição de aminoácido na posição de Kabat 55 de VH;I) substituição de aminoácido na posição de Kabat 67 de VH;m) substituição de aminoácido na posição de Kabat 6 de VH;n) substituição de aminoácido na posição de Kabat 32 de VH;o) substituição de aminoácido na posição de Kabat 49 de VH;p) substituição de aminoácido na posição de Kabat 43 de VH;q) substituição de aminoácido na posição de Kabat 72 de VH;r) substituição de aminoácido na posição de Kabat 79 de VH;s) substituição de aminoácido na posição de Kabat 50 de VL;t) substituição de aminoácido na posição de Kabat 75 de VL;u) substituição de aminoácido na posição de Kabat 80 de VH;v) substituição de aminoácido na posição de Kabat 83 de VH;ouiv) um domínio Vh e um domínio Vl com uma interface esta-bilizada entre VH e VL da scFv em que a molécula tem no mínimo umasubstituição em uma posição de aminoácido diretamente dentro da interfacee/ou em uma posição de aminoácido que estruturas a interação entre VH eVL, em que a no mínimo uma posição de aminoácido é selecionada entreum grupo consistindo em: 47H, 37H, 45H, 46H, 51 Η, 59H, 109H, 14H, 26H,-27H, 40H, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H,-79H, 82bH, 8H, 32H, 39H, 41 Η, 62H, 85H, 91 Η, 24H, 60H, 37L, 36L, 44L,-59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L,-98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L, e 104L, de acordo com a numeração de Kabat,

9. Molécula de ligação de antígeno multivalente a reivindicação-8, em que a no mínimo uma molécula scFv estabilizada é geneticamentefundida a um anticorpo.

10. Molécula de ligação de antígeno multivalente a reivindicação-8, em que duas moléculas scFv estabilizadas são geneticamente fundidas aum anticorpo.

11. Molécula de ligação de antígeno multivalente a reivindicação-9, em que a no mínimo uma molécula scFv estabilizada é geneticamentefundida ao término carbóxi da cadeia leve ou pesada do anticorpo.

12. Molécula de ligação de antígeno multivalente a reivindicação-9, em que a no mínimo uma molécula scFv estabilizada é geneticamentefundida ao término amino de uma cadeia leve ou cadeia pesada do anticor-po.

13. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 8 a 12, a qual compreende no mínimo umsítio de ligação que liga a uma molécula preferencialmente expressada so-bre células de câncer.

14. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 8 a 12, em que a molécula é selecionadaentre o grupo consistindo em HER1, HER3, CD80, CD86, PD-1, CTLA4, B7-H4, RON, CD200, CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR, um membro da famí-lia de receptores TNF, um Tie receptor, MET, IGF1, IGF2, TNF, um Iigantede TNF, IL-6, TWEAK, Fn14, CD20, CD23, CRIPTO, HGF, α4β1 integrina,α5β1 integrina, α6β4 integrina,, e α\/β6 integrina.

15. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 8 a 12, a qual compreende no mínimo umsítio de ligação que liga a uma molécula envolvida em modulação de rea-çoes imunes.

16. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 8 a 12, a qual compreende no mínimo umsítio de ligação que liga a uma molécula envolvida em modulação de angio-gênese.

17. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 18 a 12, a qual compreende no mínimo umsítio de ligação que liga a um alvo neurológico.

18. Molécula de ligação de antígeno multivalente de acordo comqualquer uma das reivindicações 8 a 12, a qual é multiespecífica.

19. Molécula de ligação de antígeno multivalente de qualqueruma das reivindicações 18 a 12, a qual é biespecífica.

20. Molécula de ligação de antígeno multiespecífica da reivindi-cação 19, a qual liga a dois membros da família de receptores de TNF.

21. Molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüênciade nucleotídeos a qual codifica a molécula scFv estabilizada como definidaem qualquer uma das reivindicações 2 a 3 ou o complemento da mesma.

22. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação-21, a qual está em um vetor.

23. Célula hospedeira compreendendo o vetor da reivindicação 22.

24. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 23, emque a célula é uma célula CHO ou uma célula NSO.

25. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 23, a qualexpressa uma população de moléculas de ligação compreendendo molécu-las scFv, a população tendo no mínimo 10% menos agregados relativos auma célula hospedeira a qual expressa uma população de moléculas de li-gação compreendendo moléculas scFv convencionais.

26. Método para produzir uma molécula de ligação estabilizada,compreendendo cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação-23 sob condições tais que a molécula de ligação estabilizada seja produzida.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que no mini-mo 10 mg da molécula de ligação estabilizada seja produzida para cada litrodo meio de cultura de células hospedeiras e em que não mais de 10% damolécula de ligação está presente em forma de agregado.

28. Método para tratar um sujeito que se beneficiaria de trata- mento com uma molécula de ligação como definida em qualquer uma dasreivindicações 8 a 20 compreendendo administrar a molécula de ligação aosujeito de tal modo que ocorre tratamento.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o sujeitoestá sofrendo de uma doença ou um distúrbio selecionados entre o grupo consistindo em câncer, uma doença ou distúrbio auto-imune, e uma doençaou distúrbio neurológico.

30. Método para estabilizar uma molécula scFv compreendendofundir geneticamente um domínio Vh e um domínio Vl usando um (Gly4 Ser)nIigante de scFv e produzir o domínio Vh para compreender uma cisteína no aminoácido 44 e produzir o domínio Vl para compreender uma cisteína noaminoácido 100 para formar uma molécula scFv estabilizada.

31. Método para produzir um anticorpo multivalente estabilizadocompreendendo uma molécula scFv estabilizada, o método compreendendofundir geneticamente uma molécula scFv estabilizada ao término amino ou ao término carbóxi de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo molécula.

32. Método para produzir uma molécula scFv estabilizada com-preendendo substituir no mínimo um aminoácido na interface VH/VL da mo-lécula scFv e/ou no mínimo um aminoácido que estruturas uma ou maissubstituições na interface VH/VL da molécula scFv simultaneamente melho- ram a estabilidade térmica de ambos os domínios Vh e Vl da molécula scFvcomparada com uma molécula scFv convencional.

33. Método para produzir uma molécula scFv estabilizada com-preendendo substituir no mínimo um aminoácido no domínio VH ou no do-mínio VL que co-varia com dois ou mais aminoácidos na interface entre osdomínios VHe VL.

34. Método para produzir uma proteína de fusão estabilizadacompreendendo uma molécula scFv compreendendo substituir no mínimoum aminoácido na interface VH/VL da molécula scFv e/ou no mínimo umaminoácido no estrutura VH/VL da molécula scFv e fundir geneticamente amolécula scFv a um polipeptídeo para deste modo produzir uma proteína defusão estabilizada.

35. Método para melhorar a estabilidade de uma molécula multi-valente compreendendo no mínimo uma molécula scFv, o método compre-endendo introduzir no mínimo uma mutação estabilizante em no mínimo umamolécula scFv para deste modo melhorar a estabilidade da molécula multi-valente.

36. Método para fabricação em larga escala de uma proteína defusão estabilizada, o método compreendendo:(a) conduzir um ensaio de estabilidade térmica de uma moléculascFv para determinar a estabilidade térmica de uma molécula scFv candida-ta;(b) comparar a estabilidade térmica da molécula scFv candidatacom um controle adequado para identificar moléculas scFv estabilizadastendo aumentada estabilidade térmica em relação ao controle,(c) selecionar as moléculas scFv estabilizadas identificado naetapa (b);(d) fundir geneticamente no mínimo uma molécula scFv estabili-zada a proteína para formar uma proteína de fusão estabilizada;(e) transfectar uma célula hospedeira mamífera com uma molé-cula de ácido nucléico codificando a proteína de fusão estabilizada,(f) cultivar a célula hospedeira da etapa (e) sob condições taisque a proteína de fusão estabilizada é expressada;em que a proteína de fusão estabilizada é expressada com nãomais de 10% de agregação de proteína quando cultivada em 10 L ou maisde meio de cultura.

37. Interface gráfica do usuário compreendendo um display grá-fico de:(i) um Iayout de grade compreendendo uma coleção dedados de freqüência de uso de resíduos para uma série de referência deseqüências de polipeptídeos; e(ii) um revestimento de co-variação.

38. Método para produzir um polipeptídeo da superfamília deimunoglobulinas (Ig) com uma propriedade biofísica aprimorada, o referidométodo compreendendo as etapas de:a) proporcionar um alinhamento de uma série de referência cu-rada de seqüências correspondentes a uma Ig fold do polipeptídeo;b) calcular a covariação entre resíduos das seqüências do ali-nhamento para identificar resíduos covariáveis;c) substituir um resíduo do polipeptídeo que falha em satisfazeruma covariação com o resíduo covariável encontrado em uma posição cor-respondente no alinhamento.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a propri-edade biofísica é selecionada entre o grupo consistindo em estabilidade tér-mica, perfil de desdobramento com pH (N.T.: pH unfolding), remoção estávelde glicosilação, solubilidade, função bioquímica, e combinações das mesmas.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a funçãobioquímica é selecionada entre o grupo consistindo em reconhecimento deum alvo protéico ou uma porção química, cuja porção química é selecionadaentre o grupo consistindo em fosfato, metila, acetila, lipídeo, detergente, íonmetálico, halogênio, RNA1 DNA, oligonucleotídeo, e oligonucleosídeo.

41. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o polipep-tídeo da superfamília das Ig é derivado de uma proteína selecionada entre ogrupo consistindo em um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, um receptor de imunoglobulina, uma proteína de adesão celular,uma integrina, um alergeno, um receptor de células T, e uma molécula decomplexo de histocompatibilidade maior (MHC).

42. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a Ig foldéselecionada entre o grupo consistindo em uma fold classe V, uma fold classeI, uma fold classe C1, e uma fold classe C2.

43. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o polipep-tídeo da superfamília das Ig é um anticorpo modificado selecionado entre ogrupo consistindo em um anticorpo de domínio, um anticorpo humanizado,um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal não-humano, um anticorpoquimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo contendo scFv, e um an-ticorpo com domínio eliminado.

44. Método da reivindicação 38, em que os resíduos covariáveissão parte de uma característica estrutural selecionada entre o grupo consis-tindo em uma ligação dissulfeto, uma ponte de sal, uma porção de uma su-perfície ou bolsa de ligação de ligante, e uma rede de van Der Waals, Iiga-ção hidrogênio, e/ou interações carga-carga.

45. Método para produzir um anticorpo ou anticorpo modificadocom uma aprimorada estabilidade, o referido método compreendendo asetapas de:a) proporcionar um modelo estrutural de alta resolução de umanticorpo padrão que é experimentalmente validado como estável;b) usar o modelo estrutural para identificar uma interface VH/VLe/ou resíduo de estruturação de interface no anticorpo template;c) usar um modelo de homologia para identificar um resíduo dainterface VH/VL correspondente do anticorpo ou anticorpo modificado que éimportante para estabilizar a interface; ed) substituir o resíduo da interface VH/VL correspondente noanticorpo ou anticorpo modificado com o resíduo da interface da proteínatemplate.

46. Método da reivindicação 45, em que o resíduo da interfaceda proteína padrão encobre no mínimo 10 Á2 de área superficial na interface.

47. Método da reivindicação 45, em que o anticorpo modificadoé selecionado entre o grupo consistindo em um anticorpo de domínio único,um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo monoclonalnão-humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticor-po contendo scFv, e um anticorpo com domínio eliminado.

48. Polipeptídeo produzido pelo método como definido em qual-quer uma das reivindicações 38 a 47.

49. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, em que opolipeptídeo apresenta um aprimoramento em uma propriedade biofísicaselecionada entre o grupo consistindo em estabilidade térmica, perfil de des-dobramento com pH, remoção estável de glicosilação, solubilidade, funçãobioquímica, e combinações das mesmas.

50. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 49, em que fun-ção bioquímica é afinidade ou especificidade de ligação de ligante.

51. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, o qual deri-vado de uma proteína selecionada entre o grupo consistindo em um anticor-po ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um receptor de imuno-globulina, uma proteína de adesão celular, uma integrina, um alérgeno, umreceptor de células T, e um complexo de histocompatibilidade maior (MHC)molécula.

52. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, o qual é se-lecionado entre o grupo consistindo em uma região variável de cadeia pesa-da (VH), uma região variável de cadeia leve (VL), e um anticorpo de cadeiaúnica (sFv).

53. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, em que a Igfold é selecionada entre o grupo consistindo em uma fold classe V, uma foldclasse I, uma fold classe C1, e uma fold classe C2.

54. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, o qual é umanticorpo modificado selecionado entre o grupo consistindo em um anticorpo dedomínio único, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpomonoclonal não-humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico,um anticorpo contendo scFv, e um anticorpo com domínio eliminado.

55. Método para produzir uma biblioteca compreendendo molé-culas scFv estabilizadas, o método compreendendo:(a) proporcionar uma série de referência de seqüências corres-pondentes a uma seqüência de domínio variável de uma molécula scFv;(b) identificar um aminoácido dentro do domínio variável o qualestá ausente ou é encontrado em baixas freqüências em uma posição cor-respondente na série de referência;(c) combinar esta informação com dados de covariação sugerin-do que modificar o aminoácido identificado com baixa freqüência na série dereferência pode satisfazer e de covariação existentes dentro do domínio va-riável; e(d) substituir o aminoácido da etapa (b) com um aminoácido es-tabilizante candidato para deste modo produzir uma biblioteca compreen-dendo moléculas scFv estabilizadas.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o amino-ácido da etapa (b) tem uma classificação de consenso de menos de 0,5.

57. Método para produzir uma molécula scFv estabilizada, o mé-todo compreendendo:(a) proporcionar uma biblioteca de scFv designada de acordocom o método de acordo com a reivindicação 56,(b) triar a biblioteca de scFv com uma prova de ensaio térmicopara identificar moléculas scFv candidatas,(c) comparar a estabilidade térmica de uma molécula scFv can-didata da biblioteca de scFv com um controle adequado, por meio do qualum aumento na estabilidade térmica de uma molécula scFv candidata emrelação ao controle identifica a molécula scFv candidata como uma moléculascFv estabilizada.

58. Molécula scFv estabilizada identificado usando o método deacordo com a reivindicação 57.

59. Proteína de fusão compreendendo a molécula scFv estabili-zada de acordo com a reivindicação 58.

60. Método para prever a estabilidade de uma proteína candida-ta compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo seqüências dedomínios candidatos, o método compreendendo:(a) proporcionar uma série de referência de seqüências de ami-noácidos correspondentes a uma seqüência de domínio candidato da proteí-na candidata;(b) determinar freqüências de resíduos em posições de aminoá-cidos individuais dentro da seqüência de domínio de ensaio para obter umaclassificação de consenso; e(c) usando a classificação de consenso para prever a estabilida-de da proteína candidata, em que a classificação de consenso se correlacio-na com a estabilidade da proteína candidata.