BRPI0709619A2 - métodos para extrair ácido nucleico de uma amostra, e para amplificar dna em uma amostra, kit para amplificar dna de uma amostra usando pcr, e, ácido nucleico - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA EXTRAIR áCIDO NUCLEICO DE UMA AMOSTRA, E PARA AMPLIFICAR DNA EM UMA AMOSTRA, KIT PARA AMPLIFICAR DNA DE UMA AMOSTRA USANDO PCR, E, áCIDO NUCLEICO. A invenção refere-se a métodos, kits e ácidos nucleicos envolvidos na detecção de tecidos animais, por exemplo, proteínas animais processadas (PAPs) ou farinha de carne e ossos (MBM), especialmente em rações. Em um método, ácido nucleico como DNA é extraído de uma amostra usando um processo envolvendo incubar a amostra em um tampão de incubação, autoclavar a amostra incubada, e então misturar a amostra com um agente quelante de metal. O DNA extraido deste modo pode então ser submetido a amplificação usando PCR ou PCR-real, por exemplo usando sequências de iniciador e sonda, como especificadas em SEQ ID Nos 1-21.

Description

"MÉTODOS PARA EXTRAIR ÁCIDO NUCLEICO DE UMA AMOSTRA,E PARA AMPLIFICAR DNA EM UMA AMOSTRA, KIT PARAAMPLIFICAR DNA DE UMA AMOSTRA USANDO PCR, E, ÁCIDONUCLEICO"

Esta invenção refere-se a métodos, kits e ácidos nucleicosenvolvidos na detecção e diferenciação de tipos de tecidos de animais, porexemplo proteínas animais processadas (PAPs) ou farinha de carne e ossos(MBM), especialmente em rações.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) sãoum grupo de doenças neurodegenerativas raras, fatais e transmissíveis queincluem doença kuru e Creutzfelt-Jakob (CJD) em humanos, "scrapie" emovelhas, encefalopatia transmissível da marta (TME), e doença debilitantecrônica (CWD) em veados de orelhas longas e alces. A emergência deencefalopatia espongiforme bovina (BSE) em vacas foi primeiro reconhecidano Reino Unido (UK) em 1986 e agora tem sido encontrada em pelo menos26 países no mundo todo. Ela é considerada um problema mundial nãosomente em termos agrícolas, mas também como uma ameaça em potencial àsaúde humana.

O tecido de animal desengordurado, que é processado em altastemperaturas e é também conhecido como farinha de carne e ossos (MBM),tem sido usado como um suplemento dietético para animais de criação,particularmente como um suplemento de proteína para prover os aminoácidosessenciais para animais em lactação e de crescimento rápido. Ele poderia ouser usado diretamente como ração ou como um ingrediente na ração animal.Além disso, a exposição acidental poderia surgir devido a uma contaminaçãocruzada em vários estágios da manipulação. BSE se desenvolveu em umaepidemia como uma conseqüência de uma prática de criação intensiva, isto é,o reciclo de proteína animal na ração de ruminantes, e provavelmente seoriginou de uma nova fonte já em meados dos anos 70, possivelmente umavaca ou outro animal que desenvolveu a doença como uma conseqüência deuma mutação de gene. Os casos de BSE foram as conseqüências do reciclo degado infectado com o próprio BSE. O agente BSE foi espalhado em MBM.

Para evitar que MBM entre na cadeia alimentícia deruminantes, uma interdição foi introduzida no Reino Unido na alimentação domaterial de ruminantes (por exemplo derivado de gado, ovelhas, cabras ouveados) para outros ruminantes (The Bovine Spongiform EncephalopathyOrder 1988 [SI 1988/1039]. Esta interdição foi depois estendida no ReinoUnido para incluir todas as proteínas de mamíferos para todos os animais de criação nas fazendas (excluindo peixes e cavalos). (The Bovine SpongiformEncephalopathy (Amendment) Order 1996 [SI 1996/962]). Uma interdiçãoproibindo o uso de proteína derivada de mamíferos em ração de ruminantesfoi introduzida na União Européia (EU) em 1994 e nos Estados Unidos daAmérica (USA) em 1997. Desde 2000, uma interdição européia foi estendida para incluir proteínas derivadas de mamíferos, pássaros, e peixes, para todosos animais de criação em fazendas a serem usados na produção de alimentos.

A fim de fazer cumprir a legislação corrente, é necessário sercapaz de detectar proteínas proibidas em ração animal, especialmente raçãopara ruminantes. A análise microscópica, que essencialmente envolve a identificação morfológica de fragmentos de osso em material de ração, éatualmente o único método oficialmente reconhecido na EU para a detecçãode constituintes de origem animal em ração animal - Ver EU CommissionDirective 2003/126/EC de 23 de dezembro de 2003, sobre um "métodoanalítico para a determinação de constituintes de origem animal para ocontrole oficial de alimentos" para o protocolo de teste de análisemicroscópica aprovado ("ΜΑΤ"). A análise microscópica permite aidentificação de constituintes animais e diferenciação entre peixes e materialterrestre e material de mamíferos versus não mamíferos. No entanto, a análisemicroscópica requer um analista experimentado, não pode ser usada emamostras líquidas, não pode detectar tecidos moles, e é um métodoconsumidor de tempo e oneroso requerendo o uso de solventes orgânicos parasedimentação de fragmentos de ossos.

Outros métodos sendo desenvolvidos para o teste de tecidos deanimais tem incluído teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA),espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS), espectroscopia deinfravermelho próximo ( (NIRM), reação de cadeia polimerase (PCR) e PCRem tempo real (ver estudo em Gizzi et at, 2003, Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz.22: 311-331). ELISAs visam identificar antígenos específicos da espécie, sema exigência para ossos, via um sistema de detecção à base de anticorpo. Osinconvenientes do método ELISA incluem interferência dos produtos deruminantes como leite, inibição por gelatina, e reatividade cruzada com outrasproteínas como proteínas de plantas. NIRS e NIRM requerem odesenvolvimento de grandes bases de dados comparativas e equipamentooneroso. Particularmente para NIRS, a precisão tem sido problemática. NIRS,NIRM e o método ELISA não são geralmente apropriados para o materialdesengordurados sob condições além da faixa otimizada.

As técnicas PCR em teoria permitem a identificação de taxole/ou de ácido nucleico específico da espécie , particularmente a ácidodeoxiribonucleico (DNA). Um exemplo anterior foi provido em Wang et a(2000, MoL Cell. Probes 14: 1-5), que descreve um método envolvendo aextração de DNA total de MBM bovino ou carne de boi não desengorduradosespalhados em amostras de reação de camundongos de laboratório. Umaquantidade de 0,2 g de amostras foi incubada em uma solução de 20% Chelex100 (uma resina quelante de BioRad, Hercules, CA, USA, usada pararemoção de íons metal contaminantes que podem atuar como inibidores dePCR) em 1% do detergente Triton X-100, aquecida, resfriada e centrifugada eo sobrenadante usado para amplificação PCR de um fragmento de DNA de271 pares de bases de DNA mitocondrial bovino codificando para a parte 3'de tRNALys, a subunidade ATPase 8 e a parte amino-terminal da subunidadeATPase 6. Método é descrito pelos autores como sendo rápido, simples econsistente.

Um exemplo de um teste de PCR em tempo real, envolvendouma sonda e iniciadores de gene citocromo b mitocondrial específico deruminantes com um tamanho de amplicon de 370 pares de bases, foi relatadoem Rensen et ai. (2005, Foodborne Pathogens Dis. 2: 152-159; ver tambémW02005/074522). Uma técnica de processamento de pre-amostra para extrairDNA de ração de gado foi desenvolvida para se dirigir a problemas de níveiselevados de inibidores de PCR em ração de gado. A técnica requeria incubaramostras de ração salpicadas com 10 g em um tampão de Iise de células,aplicando o lisado de células a cartões Whatman FTA™, subseqüentementetratando os cartões com RNAse e então purificando o DNA usando um kit deextração Chelex 100 (o kit "Instagene") de BioRad (Hercules, CA, USA). Oteste foi relatado como sendo capaz de detectar 0,05% (peso/peso) de materialcontaminante de MBM comercialmente desengordurado salpicado em raçãopara gado comercialmente disponível.

O teste de PCR em tempo real, com base na amplificação deum fragmento de gene 16S rRNA DNA mitocondrial de 117 pares de base foidesenvolvido por Chiappini et al (2005, J. AOAC Int. 88: 1399-1403). DNATotal foi extraído de 100 mg de amostras de MBM desengorduradas usandoum sistema chamado Wizard Magnetic DNA Purification System for Foodobtido de Promega (Madison, WI, USA). A especificidade para seu teste foitestada em DNA genômico de material de cavalo, galinha, peru, suíno,ovelha, cabra, anchova, peixe-espada e bovino, mas um sinal de PCR emtempo real foi obtido somente de amostras de cabra, ovelha e bovino. Alémdisso, os autores concluíram que o desempenho de seu teste de PCR emtempo real foi muito afetado pelas condições na graxaria usadas para produzira MBM testada, e a variabilidade de MBM em termos e composição econdições na graxaria evitaram a produção de materiais de referênciaapropriados e impediram a quantificação confiável do teor de MBM na ração.

Apesar de algumas melhoras nas técnicas de PCR, um estudoda União Européia "Estudo de intercomparação para a determinação deproteínas animais processadas incluindo farinha de carne e ossos em estudocom animais" (relatado em Gizzi et al, 2004, J. AOAC Int. 87: 1334-1441)verificou que PCR falhou na determinação de proteínas animais processadastotais (PAPs, que inclui MBM), assim como na diferenciação de PAPs demamíferos, ruminantes e porcos, como indicado pelo número elevado deresultados falsos positivos e falsos negativos dos testes de PCR e PCR emtempo real realizados em 17 laboratórios participantes na EU. Todas astécnicas de PCR comuns foram cobertas pelos participantes, incluindo PCRclássico com eletroforese de gel agarose, PCR-ELISA e PCR em tempo real.

A preparação da amostra variou entre as extrações de kits ou encomendadascom antecedência, opcionalmente incluindo uma etapa de trituraçãorecomendada, com a quantidade de amostra usada variando entre 50 mg a 8 g.

A avaliação global dos métodos de PCR foi "extremamente ruim" em termosde desempenho, e foi concluído que as revisões principais dos protocolosconhecidos poderiam ser requeridas antes de qualquer técnica à base de PCRpoder ser empregada como um teste confiável e robusto para PAPs ou MBM.

A presente invenção dirige-se aos problemas associados comtestes à base de PCR para tecido animal em PAPs ou MBM, e provê, porexemplo, um método alternativo para extrair DNA e uma técnica deidentificação à base de PCR.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção,provê-se um método para extrair ácido nucleico (como DNA) de umaamostra, compreendendo as etapas de:

(i) incubar entre cerca de 30 a 250 g, por exemplo cerca de 35a 45 g, ou cerca de 40 g, da amostra em um tampão de incubação;(ii) autoclavar a amostra incubada na etapa (i); e

(iii) misturar a amostra ou uma porção da amostra autoclavadana etapa (ii) com um agente quelante de metal. O agente quelante de metalpode, por exemplo, ser uma resina de troca iônica quelante de metal.

O método pode ainda compreender a etapa de:(iv) sedimentar o agente quelante de metal, como uma resinade troca iônica quelante de metal, da amostra ou porção na etapa (iii) acimapara produzir um sobrenadante compreendendo ácido nucleico extraído.

O método de extração de acordo com a presente invençãoprovê ácido nucleico de quantidade e qualidade suficientes, por exemplo paraagir como um gabarito para amplificação em reações como PCR e/ou PCR emtempo real. Os inventores verificaram que a reprodutibilidade e precisãodestas reações de amplificação são muito boas (ver abaixo). Comparado comoutras técnicas de extração da técnica anterior, o presente método é tanto fácilcomo efetivo.

Outras quantidades apropriadas de amostra para uso nométodo estão entre cerca de 30 até cerca de 200, 175, 150, 125, 100, 75, ou 50g·

Em uma forma de realização, o tampão de incubação pode serum tampão fosfato, por exemplo um tampão fosfato de sódio a umaconcentração de cerca de 0,05 a 0,2 M ou cerca de 0,1 M.

O tampão de incubação pode ser usado a cerca de 500 a 1,500% (v/p) da massa da amostra, por exemplo cerca de 900 % (v/p) da massa daamostra.

O tampão de incubação , por exemplo um tampão fosfato desódio, pode ter um pH de entre cerca de 6,5 e 7,5, ou cerca de 7,2.

Incubação pode ser conduzida durante cerca de 5 a 60 minutosou durante cerca de 10 a 30 minutos, por exemplo durante cerca de 15minutos.A amostra pode ser autoclavada na etapa (ii) a cerca de 85°C a120°C ou 1210C ou a cerca de 90°C a 100°C, por exemplo a cerca de 95°C. Aetapa na autoclave pode durar por mais do que 1 minuto, por exemplo durantecerca de 5 a 60 minutos ou durante cerca de 10 a 30 minutos, como durantecerca de 15 minutos.

A etapa na autoclave pode prosseguir em ou próximo dapressão atmosférica (em vez de em pressão elevada como usado paraesterilização. A autoclavagem em ou próximo da pressão atmosférica iráreduzir a desregulação do ácido nucleico como o DNA sendo extraído.

Como usado aqui, a frase "pressão quase atmosférica"significa uma pressão de cerca de 50- 150% de pressão atmosférica, porexemplo cerca de 80-120% ou 95-105% de pressão atmosférica.

Em uma forma de realização, a etapa na autoclave prossegueem pressão atmosférica durante 15 minutos a 95°C.

Em particular quando amostras de animal estão sendo usadas,a etapa na autoclave serve para desgranular a amostra e/ou para romper agordura (isto é, para solubilizar gorduras e sebo comumente usados para ligaros grânulos de ração) e liberar ácido nucleico.

O agente quelante de metal como resina de troca iônica, podequelar os íons de metal polivalentes. A resina pode ser um copolímeroestireno divinil benzeno contendo íons iminodiacetato aos pares, por exemploChelex 100.

O agente quelante de metal como uma resina de troca iônicaquelante de metal pode ser sedimentada na etapa (iv) do método por centrifugação, por exemplo a cerca de 10.000 a 12.000 χ g, ou cerca de11.000 χ g.

A amostra pode ser de uma ração animal, por exemplo raçãopara ruminantes.

A amostra pode conter ou ser testada pela presença de materialanimal desengordurado, por exemplo proteínas animais processadas (PAPs)ou farinha de carne e ossos (MBM).

A amostra pode compreender DNA mitocondrial de animal ouruminante, por exemplo DNA mitocondrial codificando um gene de RNA 16S.

Em um aspecto, a amostra compreende DNA de um ou maisdo grupo consistindo de: tecido de animal, ruminante, bovino, ovino, porcino,aves e peixes.

O termo "animal" como usado aqui refere-se a qualquerorganismo vertebrado. Os animais incluem animais domesticados (comogado, ovelha, cabras, porcos, galinha, peru, patos, ganso, codorna, gatos ecachorros), assim como animais não domesticados (como alce, veado, rena egirafas). Os animais também incluem espécies aquáticas como peixe.

De acordo com outro aspecto da invenção, o método comodescrito acima, onde a amostra é ração animal, pode compreender as etapasde:

(i) incubar entre cerca de 35 a 45 g da amostra em um tampãofosfato de sódio 0,1 M a um pH de cerca de 7,1 a 7,3 durante cerca de 10 a 20minutos, por exemplo cerca de 15 minutos, opcionalmente em temperaturaambiente;

(ii) autoclavar a amostra incubada na etapa (i) em ou próximoda pressão atmosférica a cerca de 90 a IOO0C durante cerca de 10 a 30minutos, por exemplo durante cerca de 15 minutos; e

(iii) misturar uma porção da amostra autoclavada na etapa (ii)com a resina de troca iônica quelante de metal, por exemplo Chelex 100.

O método acima pode compreender ainda a etapa de:

(iv) sedimentar a resina da porção da amostra na etapa (iii) porcentrifugação a cerca de 10.000 a 12.000 χ g, ou a cerca de 11.000 χ g.

O sobrenadante ou uma alíquota do mesmo da etapa (iv) dométodo da invenção pode ser usado em uma reação de amplificação como umteste de PCR, PCR em tempo real ou outra reação de amplificação comomencionado abaixo.

O método de acordo com a presente invenção pode aindacompreender a etapa de:

(v) detectar a presença ou ausência de ácido nucleico , porexemplo DNA como DNA mitocondrial.

O ácido nucleico pode ser de um material animaldesengordurado, por exemplo PAPs ou MBM.

O ácido nucleico pode ser detectado na etapa (v) usando umareação de amplificação (por exemplo PCR ou PCR em tempo real).

O termo "reação de amplificação" como usado aqui refere-se auma reação enzimática que resulta em cópias aumentadas de um ácidonucleico gabarito. As reações de amplificação dentro do escopo da invençãoincluem PCR, PCR de transcrição reserva (RT-PCR), PCR em tempo real,RT-PCR em tempo real (RRT-PCR), reação de cadeia ligase (LCR),amplificação com deslocamento de filamento (SDA), amplificação mediadapor transcrição, amplificação à base em seqüência de ácido nucleico(NASBA), amplificação de círculo giratório (RCA) e amplificação de sinal deDNA ramificado (bDNA).

Em um aspecto, um sistema de sinalização é usado paradetectar DNA amplificado na amostra ou porção da amostra permanecendoapós uma reação de amplificação. Este sistema de sinalização pode serbaseado em várias propriedades, mas particularmente irá produzir sinaisvisíveis, que são fluorescentes, quimioluminescentes ou bioluminescentes. Osistema de sinalização pode ser um que pode ser detectado de modohomogêneo, sem abertura do vaso de reação em que a amplificação estáocorrendo ou ocorreu.

Estes sistemas de sinalização podem compreender porexemplo um reagente de sinalização visível como um agente de ligação deDNA que emite um diferente ou distinguível visível quando ligado a um DNAde filamento duplo como comparado a quando ele está livre em solução. Osexemplos de tais corantes são bem conhecidos e incluem brometo de etídeo,assim como reagentes vendidos sob os nomes comerciais SYBR comoSYBRGreen I ou SYBRGoId, ou outros corantes como YOPRO-1. Apresença de quantidades significantes ou elevadas de DNA, como indicadopelo sinal a partir de tal reagente será indicativa de que a reação deamplificação tinha prosseguido.

Alternativamente ou adicionalmente, o sistema de sinalizaçãopode incluir uma sonda rotulada, que liga especificamente ao produtoamplificado. Os rótulos são de modo apropriado rótulos fluorescentes, que sãodetectáveis após irradiação com luz de um comprimento de onda apropriado,seguido por detecção das emissões resultantes do rótulo. Uma ampla faixa de rótulos fluorescentes são comercialmente disponíveis, como corantesrodamina, fluoresceína e cianina. Outros exemplos de fluoróforos incluem,mas não são limitados a fluoresceína, isotiocianato, fluoresceína amina,eosina, rodamina, dansil, umbeliferona, 5-carboxifluoresceína , 6-carboxifluoresceína (FAM), 2',4', 1,4,- tetraclorofluoresceína (ΤΕΤ), 2',4', 5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX), 2',T- dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6 carboxirodamina (R6G), Ν,Ν,Ν'Ν'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-X- rodamina (ROX),ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo) benzóico (DABCYL), ácido 5-(2-aminoetil) aminonaftaleno-1 -sulfônico (EDANS), ácido 4-acetamido-4'- isotiocianatoestilbeno-2,2' dissulfônico, acridina, isotiocianato de acridina, r-amino- N->3-vinilsulfoni l)fenil-naftalimida-3,5, dissulfonato (AmareloLucifer VS), N-(4- anilino-l-naftil)maleimida, antranilamida, AmareloBrilhante, coumarina, 7-amino-4- metilcoumarina, 7-amino-4-trifluoronietilcouluarina (Coumaran 151), cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5', 5"-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Vermelho Bromopirogalol), pentaacetatode dietilenotriamina de 7-dietilamino-3- (4'-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina, ácido 4,4'- diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico,ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno- 2,2'-dissulfônico, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), isotiocianato de eosina,eritrosina B, isotiocianato de eritrosina, etídio, 5-(4,6- diclorotriazin-2-i 1)aminofluoresceína (DTAF), QFITC (XRITC), fluorescamina, IRl 44, IRl446,isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleóna,nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-f coeritrina, o- ftaldialdeído,pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil 1-pireno, vermelho reativo4 (Cibacron. RTM. Vermelho brilhante 3B-A), cloreto de sulfonila delissamina rodamina B, rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodaminaX, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila desulforodamina 101, (vermelho Texas), tetrametil rodamina, isotiocianato detetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólido, derivados dequelato de térbio, Cy5 e Cy5.5.

Em um aspecto, o sistema de sinalização compreende umacombinação de um rótulo repórter e extintor. Os exemplos de pares dedoador/ extintor que podem ser usados na presente invenção são FAM eTAMRA, VIC e TAMRA, FAM e JOE, FAM e ROX, FAM e DABCYL,fluoresceína e tetrametil rodamina, IAEDANS e fluoresceína , EDANS eDABCYL, fluoresceína e fluoresceína , BODIPY FL e BPDIPY FL, FAM eQSY 7 com corantes QSY 9, respectivamente. Outras combinaçõesapropriadas de pares de doador/ extintor serão entendidos pelo versado, oupodem ser determinados usando procedimentos de rotina. Os sinais geradossão lidos usando qualquer dispositivo de detecção conveniente, por exemploum sistema óptico como espectrofluorímetro.

Como será entendido pelo versado na arte, as reações deamplificação incluem reagentes necessários para amplificação do ácidonucleico alvo. Estes reagentes podem incluir iniciadores de oligonucleotídeos,tampões, uma ácido nucleico polimerase, como Taq DNA polimerase, etrifosfatos de deoxi nucleotídeo (dNTPs).

Para técnicas de PCR e PCR em tempo real, ver por exemplo"PCR Primer: A Laboratory Manual" (2003, Dieffenbach & Dveksler, Eds,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA), que seincorpora aqui por referência.

De acordo com outro aspecto da invenção, provê-se ummétodo para amplificar DNA em uma amostra, compreendendo as etapas de:

(i) extrair DNA da amostra de acordo com o método dainvenção definido aqui; e

(ii) amplificar o DNA extraído usando uma reação deamplificação como PCR ou PCR em tempo real.

15 O DNA amplificado na etapa (ii) acima pode ser de material

animal desengordurado, por exemplo PAPs ou MBM.

O PCR ou PCR em tempo real pode empregar um par deiniciadores, e no caso de PCR em tempo real adicionalmente empregar umasonda, em que os iniciadores e sondas são específicos para um ou mais dosseguintes: tecidos de animal, ruminante, bovino, ovino, porcino, aves epeixes.

O par de iniciadores e sonda pode ser específico para DNAmitocondrial, por exemplo DNA mitocondrial codificando um gene de RNA16S , de um ou mais do grupo consistindo de: tecido de animal, ruminante,bovino, ovino, porcino, aves e peixes.

O par de iniciadores e sonda, respectivamente, pode serselecionado dentre o grupo de seqüências consistindo de SEQ ID NOs 1, 2 e 3(específicas de animais), SEQ ID NOs 4, 5 e 6 (específicas de bovinos), SEQID NOs 7, 8 e 9 (específicas de ovinos), SEQ ID NOs 10, 11 e 12 (específicasde porcinos), SEQ ID NOs 13, 14 e 15 (específicas de aves), e SEQ ID NOs16, 17 e 18 (específicas de peixes).

O par de iniciadores e sonda pode ser específico para DNAmitocondrial codificando um gene de RNA 16S de um ou mais do grupoconsistindo de: tecido de porcino, aves e peixes. Por exemplo, o par deiniciadores e sonda, respectivamente, pode ser selecionados dentre o grupo deseqüências consistindo de SEQ ID NOs 10, 11 e 12 (específicas de porcinos),SEQ ID NOs 13, 14 e 15 (específicas de aves), e SEQ ID NOs 16, 17 e 18(específicas de peixes).

O PCR ou PCR em tempo real pode ainda empregar umconjunto de iniciadores, e no caso de PCR em tempo real adicionalmenteempregar uma sonda, em que o conjunto de iniciadores e sonda é específicopara DNA exógeno à amostra, por exemplo as seqüências como especificadasem SEQ ID NOs 19, 20e21.

PCR em tempo real de acordo com a presente invenção podeser realizado usando sondas TaqMan. Os rótulos adicionais para uso em PCRem tempo real e outras reações de amplificação são discutidos abaixo.

O método da presente invenção em um aspecto exclui o uso depurificação de DNA magnético por exemplo o sistema Wizard MagneticDNA Purificação System for Food, obtido de Promega (Madison, WI, USA).

O método da presente invenção em um aspecto exclui o uso deRNAse.

O método da presente invenção em um aspecto exclui o uso decartão Whatman FTA™.

O método da presente invenção em um aspecto exclui o uso deTriton X-IOO no tampão de incubação .

De acordo com outro aspecto da presente invenção, provê-seum kit para amplificar DNA de uma amostra usando PCR, compreendendoum par de iniciadores selecionados dentre o grupo de seqüências consistindode: SEQ ID NOs 1 e 2 (específicas de animais), SEQ ID NOs 4 e 5(específicas de bovinos), SEQ ID NOs 7 e 8 (específicas de ovinos), SEQ IDNOs 10 e 11 (específicas de porcinos), SEQ ID NOs 13 e 14 (específicas deaves), e SEQ ID NOs 16 e 17 (específicas de peixes), e opcionalmente aindacompreendendo um conjunto de iniciadores específico para DNA exógeno àamostra, por exemplo as seqüências como especificadas em SEQ ID NOs 19 e20.

Também é provido um kit para amplificar DNA de umaamostra usando PCR em tempo real, compreendendo um par de iniciadores euma sonda, respectivamente, selecionados dentre o grupo de seqüênciasconsistindo de: SEQ ID NOs 1, 2 e 3 (específicas de animais), SEQ ID NOs 4,5 e 6 (específicas de bovinos), SEQ ID NOs 7, 8 e 9 (específicas de ovinos),SEQ ID NOs 10, 11 e 12 (específicas de porcinos), SEQ ID NOs 13, 14 e 15(específicas de aves), e SEQ ID NOs 16, 17 e 18 (específicas de peixes), eopcionalmente ainda compreendendo um conjunto de iniciadores e uma sondaespecífica para DNA exógeno à amostra, por exemplo as seqüências comoespecificadas em SEQ ID NOs 19, 20 e 21.

Os kits de acordo com a presente invenção podem ser usadospara amplificar um material animal desengordurado, por exemplo PAPs ouMBM, a partir de uma amostra de ração.

Em outro aspecto da invenção provê-se um ácido nucleicoisolado compreendendo uma ou mais das seqüências especificadas em SEQID NOs 1-21, por exemplo as seqüências especificadas em SEQ ID NOs ΙΟ-18. Também é englobado pela invenção um ácido nucleico isolado tendo pelomenos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% deidentidade de seqüência para qualquer uma ou mais das seqüênciasespecificadas em SEQ ID NOs 1-21.

A identidade de seqüências entre seqüências de nucleotídeospode ser determinada por comparação do alinhamento das seqüências.Quando uma posição equivalente nas seqüências comparadas é ocupada pelamesma base, então as moléculas são idênticas nesta posição. A classificaçãode um alinhamento como uma porcentagem de identidade é uma função donúmero de aminoácidos idênticos ou bases em posições compartilhadas pelasseqüências comparadas.

Quando comparando seqüências, os alinhamentos ótimospodem requerer espaços a ser introduzidos em uma ou mais das seqüênciaspara levar em consideração possíveis inserções e deleções nas seqüências. Osmétodos de comparação de seqüências podem empregar penalidades de espaço de modo que, para o mesmo número de moléculas idênticas emseqüências sendo comparadas, um alinhamento de seqüência com algunsespaços como possível, refletindo maior parentesco entre as duas seqüênciascomparadas, irá obter uma maior classificação do que uma com muitosespaços. O cálculo da identidade percentual máxima envolve a produção deum alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades de espaço.

Os programas de computador apropriados para realizar ascomparações de seqüência são amplamente apropriado no setor comercial epúblico. Os exemplos incluem o programa Gap (Needleman & Wunsch, 1970,J. MoI. Biol. 48: 443-453) e o programa FASTA (Altschul et at., 1990, J MoI. Biol. 215: 403-410). Gap e FASTA são disponíveis como parte de AccelrysGCG Package Versão 11.1 (Accelrys, Cambridge, UK), antigamenteconhecido como o GCG Wisconsin Package. O programa FASTA pode seralternativamente acessado pelo público a partir do European BioinformaticsInstitute (http://www.ebi.ac.uk/fasta) e University de Virgínia(http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta_www/cgi). FASTA pode ser usado parapesar uma base de dados de seqüência com uma dada seqüência ou paracomparar duas dadas seqüências (ver

http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_fnn2.cgi). Tipicamente,os parâmetros de defaut dos programas de computador devem ser usadosquando comparando seqüências. Os parâmetros de default podem mudardependendo do tipo e comprimento de seqüências sendo comparadas. Umacomparação de seqüência usando o programa FASTA pode usar osparâmetros de default de Ktup = 2, matriz de classificação = Blosum50,espaço = -10 e ext = -2.

Nos métodos, kits e ácidos nucleicos isolados de acordo com ainvenção, sondas quando presentes podem ser rotuladas com qualquer meiode detecção apropriado. Assim, por exemplo, as sondas compreendendo asseqüências de SEQ ID NOs 3, 6, 9, 12, 15 e 18 não precisam sernecessariamente rotuladas com FAM e TAMRA, e a sonda compreendendo aseqüência de SEQ ID NO: 21 não precisa necessariamente ser rotulada comVIC e TAMRA, mas cada pode ser rotulada com outros meios, comoelaborado acima.

A invenção também engloba ácido nucleico extraído obtenívelde acordo com o método aqui descrito. Este ácido nucleico extraído teránovas propriedades derivadas do método de extração.

A presente invenção será agora descrita em maiores detalhespor meio dos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Neste exemplo, um teste de triagem foi desenvolvido, avaliadoe validado usando iniciadores e sondas específicos de animais para auxiliarcom a identificação de material animal desengordurado contaminante naração animal. O gene usado foi um gene 16s rRNA presente no genomamitocondrial.

Materiais e métodos

PCR em tempo real

O PCR em tempo real incorpora uma sonda fluorogênicaespecífica para a identificação de uma região conservada ou região específicade espécie do gene 16s rRNA em um genoma mitocondrial. Durante PCR, oalvo é amplificado, a sonda rotulada com um corante 5 1 repórter (FAM) e umcorante extintor 3' (TAMRA) com base em tecnologia TaqMan (AppliedBiosystems, Foster City, Califórnia, USA), liga ao alvo entre os iniciadores deflanco. A atividade 5'-3' nucleolítica de Taq polimerase (AmpliTaq Gold™)hidrolisa a sonda liberando o corante repórter da atividade de um coranteextintor. A fluorescência resultante é então medida e é diretamenteproporcional à quantidade de amplicon produzido. Um aumento no sinalfluorescente é somente visto se a seqüência alvo for complementar à sonda e éamplificado durante PCR. Estas exigências limita a detecção de qualquer amplificação não específica.

Iniciadores e sondas

Iniciadores e sondas: os iniciadores e sondas para o alvo foramprojetados usando as seguintes seqüências da base de dados GenBank, ave(X52392), bovino (JO13840), ovino (AF10406), peixes (NC00208) e porcinos (AJ002189).

O projeto dos testes foi auxiliado pelo uso de Primer Express(Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, USA). Para o teste de triagem,iniciadores e sonda foram baseados em uma área de consenso. As áreas dediferenciação foram selecionadas dos testes específicos de animais, onde possível. Tabela 1 mostra as seqüências de iniciador e sonda para o teste detriagem e os testes específicos de animais, com o tamanho do ampliconesperado. Os iniciadores dianteiro e reverso foram fabricados por Sigma-Genosys Ltd, enquanto os iniciadores Probe foram fabricados por AppliedBiosystems. As sondas foram rotuladas com FAM (5' extremidade) e TAMRA (3' extremidade).Tabela 1: Triagem e seqüências de sonda e iniciador específicas de animais.

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Controle positivo interno:

O controle positivo interno (IPC) envolveu a amplificação deuma região do gene de resistência a ampicilina comumente encontrado emvetores de ácido nucleico comerciais (pUC18) mas não encontradonaturalmente em genomas de animais ou plantas. Ele é um controle exógenonão competitivo e foi incluído na validação dos testes para detectar falsospositivos mas pode surgir como um resultado de fatores inibidores presentesno material de amostra ou como um resultado do procedimento de extração deamostra. O gabarito IPC, iniciadores e sonda foram adicionados à misturaTaqMan Máster para permitir a detecção multiplex. Os iniciadores foramusados em uma concentração limitativa (0,03 μΜ) para evitar o produto IPCusando os reagentes PCR em detrimento da eficiência de amplificação de 16srRNA. A fim de detectar a amplificação deste alvo no teste multiplex, a sondafoi rotulada a extremidade 5' com VIC como o corante repórter e naextremidade 3' com TAMRA como o extintor. Os iniciadores e sondas foramprojetados com base na seqüência de pUC18 e são mostradas na tabela 2.

Tabela 2 - Seqüências de sonda e iniciador IPC

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O comprimento do amplicon esperado é de 83 bp.Condições de PCR e ciclagem usadas no desenvolvimento e avaliação :

PCR em tempo real foi realizado e detectado em um detector15 7700 Sequence (Applied Biosystems) em uma volume total de 25 μΐ contendo12,5 μL de mistura Mestre TaqMan (Applied Biosystems), 0,3 μΜ de ambosos iniciadores e 0,1 μΜ de sonda fluorogênica (Applied Biosystems). Ascondições de ciclo foram as seguintes: 50°C durante 2 minutos, seguido por95°C durante 10 minutos, 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos e 53,6°Cdurante 1 minuto. Cada amostra foi testada em duplicata.Condições de PCR e ciclagem usadas na validação:

PCR em tempo real foi realizado e detectado em um detector7900HT Sequence (Applied Biosystems) em volume total de 25 μΐ contendo12,5 μΐ de mistura mestre TaqMan (Applied Biosystems), 0,3 μΜ de ambosos iniciadores e 0,1 μΜ de sonda fluorogênica para o teste 16s rRNA. Para ostestes de validação, ambos os iniciadores, (0,03 μΜ) e sonda fluorogênica(0,15 μΜ) (Applied Biosystems) para o IPC foram também adicionados àmistura mestre com o gabarito de controle positivo interno (0,166 ng pUC18).As condições de ciclo foram iguais que as para o sistema detector 7700Sequence.

Amostras usadas em desenvolvimento e avaliação:Tecido tratado com calor

Tecido tratado com calor foi preparado para gerar os efeitos detratamento de amostra sobre o DNA. Fatias finas de tecido de músculo debovino, ovino, porcino e galinha foram homogeneizadas em 0,1 M PBSpH7,2 (10% p/v). Estas foram então aquecidas nas temperaturas na faixa de90 °C a 133 °C a uma pressão de 3 bars durante 20 minutos. DNA foi extraídode tecido digerido e lisado com proteinase K, usando um método de fenol /clorofórmio, como descrito em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2a' edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 3,Appendix E: Commonly used techniques in molecular cloning, purification ofnucleic acids E3) que é aqui incorporado por referência em sua totalidade).Material desengordurados e padrões quantitativos

Material desengordurados de bovino, ovino e porcino foiproduzido a partir de músculo homogeneizado aquecido a 128 °C durante 20minutos autoclaves simuladas de graxarias e então secado por congelamento.A farinha de peixe (com base em Micromesistius poutassou) foi suprida porUnited Fish Products (UK) e é comercialmente disponível. Material de avecru desengordurados foi preparado a partir de diferentes tecidos, porquematerial desengordurados de aves finamente triturado não foi encontrado. Aração de planta negativa foi formulada com base nas recomendações deUnited Kingdom Agricultural Supply Trade Association (ASTA) usandoingredientes crus adquiridos de BOCM Pauis Ltd. (UK). Tabela 3 mostra acomposição de ração de planta negativa usada para fazer os padrões dematerial desengordurados.

Tabela 3: Composição de ração de planta negativa.

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Material de amostra foi produzido a partir de 20% materialdesengordurados em ração de planta negativo (50% para ave). Exceto pelasmistura de ração de aves, estas foram então trituradas, usando um moinhocentrífugo Retch Ultra para dar um tamanho de partícula fino de < 1 mm.Uma faixa (0,5% a 20% bovino, ovino, peixes e porcino, 1% a 50% ave) depadrões quantitativos foram completados a 2 g com ração negativa usando asmisturas de 20% e 50%.100 amostras codificadas

Amostras codificadas foram preparadas usando materialdesengordurados de ave (galinha), bovino, ovino e porcino, suprido porProsper De Mulder (uma graxaria no Reino Unido) produzido em umainstalação de graxaria. A farinha de carne e ossos foi pre-peneirada usandouma tela de 2 cm de abertura a fim de remover os fragmentos de ossosgrandes e foi dividida em alíquotas na faixa de 0,001% a 10%. Dentre estas,as alíquotas de 0,1%, 1%, 5% e 10% foram usadas para fazer amostras deespécies misturadas de várias combinações usando a ração de planta negativacomo acima.

60 rações negativas de animal

Durante o curso do desenvolvimento do teste, 60 rações deanimais diferentes foram empregadas para determinar os níveis de linha basede controles negativos. Estas são de numerosas plantas graxarias e produtoresde rações animais no Reino Unido, por exemplo. A composição de raçõesanimais de vários fornecedores contém vários ingredientes que são permitidossobre as diretrizes atuais. Assim, foi considerado essencial testar a variedade destas rações compostas em um esforço para determinar uma base de linhaprecisa e sustentável. Uma técnica ELISA (como descrito em Ansfield et al,2000, Food Agric. Immunol. 12: 285-297, que é aqui incorporado porreferência em sua totalidade) foi usado para confirmar se ou não as amostraseram negativas para o material animal.

Amostras usadas em validação:

Várias rações de animais comercialmente disponível, porexemplo grânulos para ovelhas Mendip e grânulos para carneiro Rapid, foramusadas para a validação da triagem e testes específicos de animais. Todas asamostras foram analisadas para confirmar se ou não elas eram negativas de material animal por ELISA e MAT (teste de análise microscópica; ver acima).Além disso, algumas destas rações animais foram salpicadas com quantidadesvariadas de material desengordurados (0,2, 1,0 e 2,0%) de bovino, ovino,porcino, ave (galinha) ou peixe, preparado como previamente descrito. Ambasas amostras de espécies únicas como as espécies misturadas foramproduzidas.

Extração de DNA do material desengordurados, padrões quantitativos, 100amostras codificadas e 60 rações de animal negativas usadas durante odesenvolvimento e avaliação:

Método para extrair DNA de rações animais foi como a seguir:1 ml de solução Chelex (20% Chelex- 100 [Bio-Rad Laboratories, UK, tipoanalítico] + 1% Nonidet P40) foi adicionado a 0,1 g da mistura de ração. Asamostras foram misturadas com vigor e aquecidas a 950C durante 15 minutos.Elas foram então colocadas em gelo durante 1 minuto após o que foramgiradas a 10.000 rpm (cerca de 7,300 χ g) durante 10 minutos. O sobrenadantefoi cuidadosamente removido para tubos limpos e armazenado a -20 °C.

Extração de DNA de amostras usadas na validação:

Este método foi adaptado para uma extração em larga escala.0 peso de partida aumentado para uma maior representação dos constituintesencontrados na ração de amostra. 40 g amostra foram adicionados a 360 ml0,1 M tampão fosfato e embebidos durante 15 minutos, após agitarsuavemente, a amostra foi autoclavada com vapor a 95°C durante 15 minutos.1 ml de sobrenadante retirado de 1 cm abaixo da superfície de líquido daamostra foi adicionado a 0,2 g de Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories). Aamostra foi submetida a vórtice durante 20 segundos e então centrifugadadurante 10 minutos a 13000 rpm (11.000 χ g). 400 μl de sobrenadante foramentão transferidos para um tubo limpo e armazenados a +A0C até serrequerido para teste.

Resultados e discussão

A fim de determinar os efeitos de preparação de ração animal,DNA extraído de tecido tratado a 90°C, 100°C; 110 °C, 120 °C e 133 °C apressão de 3 bar durante 20 minutos, uma simulação do processo de graxaria,foi usada no teste de triagem. Este teste foi projetado para detectar DNAmitocondrial (gene 16s rRNA) de ave (galinha), bovino, ovino, peixe eporcino. No PCR em tempo real fluorescente, o valor Ct é o ciclo em que umaumento estatisticamente significante em delta Rn (ARn) é primeirodetectado. O ARn é um indicado confiável da amplitude do sinal gerado noPCR em tempo real.

Em tecido tratado com calor de ovinos usando o teste detriagem, os valores de Ct aumentaram à medida que a temperatura dotratamento térmico aumentou. Para 90°C , o valor Ct foi 16,80, IOO°C foi17,76, IlO°C foi 18,76, 120°C foi 19,03 e durante 133°C o valor Ct valor foi20,39. Para o DNA ovino de controle, o valor Ct foi 18,70 mostrando queapós IlO0C o DNA se torna degradado afetando a capacidade do PCR deamplificar o alvo. Isto foi consistente com as descobertas de Ebbehoj eThomson (1991, Meat Sei. 30: 221- 234) que mostraram que se tem umapequena degradação de DNA quando a carne de porcino é aquecida durante30 minutos a 80°C mas uma degradação significante ocorre quando atemperatura é elevada a 120°C . Estes resultados mostram que mesmo se oDNA foi degradado pelo processo de graxaria simulada, o teste de triagem éum método detecção apropriado para amostras tratadas em até 133°C a umapressão de 3 bars durante 20 minutos. Isto também foi visto com DNAextraído de material de ave (galinha), bovino, peixe e porcino tratado comcalor.

A fim de avaliar a triagem e testes específicos de animais, 100amostras codificadas foram usadas. As amostras de composição conhecida,padrões quantificados, para cada espécie de animal foram incluídas no teste.Os resultados para o teste de triagem são resumidos na tabela 4. Todas asamostras incluídas a 0,001% não foram detectadas e as no nível de 0,01%deram resultados positivos em alguns casos. As amostras incluídas no nível de0,1% foram detectadas em todos os casos. Com base nestes resultados juntocom os de padrões, a sensibilidade do teste foi determinada como sendo 0,1%.Similarmente, quando as amostras desengorduradas foram misturadas empares ou em grupos, elas foram detectadas em cada e específico caso. Esteestudo codificado mostrou que o teste pode realizar a função de um teste detriagem. A fim de validar completamente este teste, um grande número deamostras foi triado.

Tabela 4 - Resumo de resultados de estudo de amostra codificada

<table>table see original document page 25</column></row><table>10% P com % variando A, B ou O +10% O com % variando A, B ou P +Amostras totalmente misturadas (todas as espécies) +

Chave : (+) Todas amostras positivas; (-) Todas amostrasnegativas; (+/-) Amostras fronteiriças; B=bovino; O=Ovino; A=ave;P=porcino.

Todos os cindo testes específicos de animais individuais foramincapazes de detectar amostras de farinha de carne e ossos incluídas nosníveis de 0,001% e 0,01% mas detectaram as mesmas quando incluídas a0,1%. Este estudo codificado estabeleceu a precisão de cada um dos testesespecíficos de animal. Existe uma correlação muito boa entre as espéciespresentes e as detectadas por cada um dos testes específicos de animal. Noentanto, ambos os testes de bovinos e porcinos produziram um resultado falsopositivo, isto é, os testes identificaram uma amostra contendo somentematerial de ovino e ave como positivo. Os limites de detecção confirmadosneste estudo são consistentes como outras descobertas usando os métodosPCR (Kusama et al, 2004, J. Food Protection 67: 1289-1292; Toyoda et al,2004, J. Food Protection 67: 2819-2832). Níveis de 0,05% foram confirmadosusando PCR em tempo real para detectar material específico de bovino emMBM bovino (Rensen et al, 2005, supra). Os testes dos requerentes mostramlimites de detecção de 0,1% de material específico não somente em misturasúnicas, mas misturas de amostras contendo material desengordurado, umarepresentação de situações de campo reais de contaminados de ração,comparado com os gabaritos de DNA (por exemplo como Lahiff et al, 2002,J. Food Protection 65: 1158-1165; Dalmasso et al, 2004, MoI. Cell Probes 18:81-87). Novamente, este estudo codificado mostrou que os testes específicosde animal podem realizar a função de identificação. A fim de validarcompletamente estes testes, um maior número de amostras foi testado.

Como existem numerosas plantas de graxaria e produtores deração animal no Reino Unido, a composição das rações animais de váriosfornecedores contém vários ingredientes que são permitidos sob as diretrizescorrentes. Assim, foi considerado essencial testar a variedade destas raçõescompostas em um esforço para determinar uma base de linha precisa esustentável. Uma técnica ELISA foi usada para designar as amostras comonegativas (ver acima). Sessenta rações de animal negativas foram testadasusando o teste de triagem. A grande maioria das rações animais (52) foramtambém negativas usando o teste de triagem dos requerentes ( Ct>35 e/ouARn<0,5). No entanto, existem algumas amostras que foram positivas usandoo PCR em tempo real. Sabe-se que o método ELISA trabalha bem emamostras aquecidas até 130 0C. Como a temperatura do processamento éaumentada acima deste valor, a sensibilidade do ELISA declina. Assim, épossível que algumas destas amostras sejam aquecidas a temperaturas emexcesso de 130 0C. A outra explicação possível para a discrepância entre osdois métodos é a diferença em sensibilidade. O ELISA foi determinado paradetectar material desengordurados de animal no nível de inclusão de 0,5%enquanto o teste em tempo real presente detecta amostras no nível de inclusãode 0,1%.

Esta discrepância foi investigada ainda ao se submeter asamostras que eram positivas pelo teste de triagem junto com algumasamostras que eram negativas, usando ELISA, para outra análise usandoanálise microscópica, a única técnica para detectar material animal em raçãoanimal que foi validada para uso na EU. Os resultados da análisemicroscópica são apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Resultados de análise microscópica de amostras de ração mostrandodiferenças quando analisadas por testes ELISA e TaqMan.

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Os resultados da análise microscópica estão em três categorias:negativo, negativo * e fibras musculares. As amostras marcadas negativo sãonegativos verdadeiros. As amostras marcadas negativo* são negativas para omaterial desengordurados mas contém pó de leite, um produto permitido. Aúltima categoria mostra a presença de fibras musculares nas amostras mas aorigem das fibras, isto é, espécies, é desconhecida.

Dentre as 12 amostras enviadas para análise microscópica, oteste de triagem mostrou quatro amostras como negativas enquanto a análisemicroscópica mostrou cinco amostras como negativas. Com amostras 12, 22 e 36, a análise microscópica e os métodos de triagem deram o mesmo resultado.

A amostra 2 foi negativa pelo teste de triagem mas as fibras musculares foramobservadas na análise microscópica . E possível que neste caso as fibrasforam de uma espécie diferente das conhecidas como sendo reconhecidas peloteste de triagem, ave (galinha), bovino ovino, peixe e porcino. Amostras 9 e15 foram positivas pelo teste de triagem mas negativas por análisemicroscópica , apesar da presença de leite em pó ser observada . O leite em póé um aditivo permitido e foi detectado como positivo no teste de triagem dosrequerentes.

As amostras restantes 14, 33, 34, 42, 49 e 57 foram positivaspara o teste de triagem, com a presença de fibras musculares sendoconfirmada por análise microscópica . Em um esforço para resolver a questãocom relação às espécies das quais estas fibras musculares se originam, osrequerentes submeteram as amostras a outra análise por utilização dos testesespecíficos dos animais individuais dos requerentes, isto é, testes que foramprojetados para detectar cada uma das espécies sob investigação. Estesresultados confirmaram que 4 destas amostras eram negativas para ovino,bovino, ave (galinha) e porcino mas positivas para peixes. Assim, é altamenteprovável que estas fibras musculares se originam de peixes. As amostrasrestantes eram negativas para ovino, porcino ave (galinha) e peixe maspositivas para material bovino. O teste de triagem detectou leite em pó efibras musculares e os testes específicos dos animais individuais identificarama origem do material. A identificação específica da espécie é importante,como o consumo de alimentos de farinha de peixe para ruminantes foiinterditado deste 2000 nos Estados Unidos. A técnica de triagem existente(ELISA) falou em detectar algumas destas amostras.

A fim de completamente validar este teste, um número maior de amostras foi testado, usando um procedimento de extração de DNA emlarga escala. A quantidade aumentada de material de partida permitiu umamaior representação dos constituintes encontrados nas amostras. A triagem eos testes específicos de animais foram validados com a inclusão em umcontrole positivo interno mostrou não afetar a detecção do gene alvo (16s rRNA) na triagem e testes específicos de animal (resultados não mostrados).Um total de 872 amostras foi analisado usando o teste de triagem. A raçãonegativa consistia de 286 amostras obtidas de cinco rações de animaiscomerciais diferentes. As amostras foram pré-triadas por ELISA e MAT paraconfirmar que elas não continham qualquer material animal interditado. O salpico de ração negativa comercial com quantidades conhecidas de materialanimal específico gerou as amostras positivas.

Dentre as 286 amostras negativas de ração, 272 foramcorretamente identificadas como negativas e assim 4 resultados falsospositivos foram obtidos . Isto corresponde a uma especificidade de 95.1%. Falsos positivos identificados pelo teste de triagem podem ser potencialmenteidentificados com os testes específicos de animais. Todas as amostraspositivamente salpicadas com 0,2% e 1% de material animal foramcorretamente previstas, dando 100% sensibilidade. Dentre as amostrasnegativas salpicadas com 2% material, uma foi incorretamente prevista comosendo negativa, dando uma especificidade de 99,63%. Os resultados sãoresumidos na Tabela 6.

Tabela 6: Sumário de teste de triagem de validação.

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Dentre as 872 amostras originais testadas para o teste detriagem, 273 foram identificadas como negativas com um total de 599amostras consideradas positivas. Estas 599 amostras positivas foram aindaanalisadas usando os testes específicos de animais. Estes resultados sãoresumidos na Tabela 7.

Tabela 7: Sumário de testes específicos de animais.

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Dentre as 872 amostras analisadas usando o teste de triagem,857 foram previstas corretamente, isto dando uma precisão global de 98,2%.585 dentre as 586 amostras salpicadas foram identificados como sendopositivas. Todas as amostras salpicadas a um nível de 0,2% foramcorretamente identificadas usando os testes específicos de animais. Aespecificidade de 100% neste nível de 0,2% provê uma forte prova de que asamostras contendo este nível de material contaminado serão identificadas. Oteste de triagem oferece uma alternativa confiável, mais sensível, robusta emais barata para o ELISA de triagem existente atualmente usado, eopcionalmente em conjunto com os testes específicos de animal podem proverser um método valioso de identificação de animal.

Exemplo 2

Com base nos resultados do exemplo 1, os requerentespropõem o seguinte procedimento de operação ("OP") para detecção de DNAde material animal desengordurado em distribuições de ração animal.

Introdução

Fim / escopo de OP

Este OP provê um protocolo de laboratório detalhado paratestar rações animais pela presença de DNA de material animaldesengordurado usando um teste de PCR em tempo real sensível. O teste temtrês estágios chaves: a) preparação da amostra for extração de DNA b)preparação da placa c) reação PCR d) processamento dos dados einterpretação de resultados.

Informação dos antecedentes

Os amplos controles de ração da Comunidade Européia(implementados através das Diretrizes TSE (Inglaterra) proibiram o consumopelos animais de proteínas animais processadas que são mantidas,desengorduradas ou criadas para a produção de alimentos. Para erradicar BSEe evitar a foram humana de CJD, uma interdição sobre o uso de proteínasanimais em ração animal está em operação. A fim de fazer cumprir alegislação corrente, é necessário ser capaz de detectar proteínas proibidas naração animal, especialmente ração para ruminantes. Análise microscópica,envolvendo a identificação de material animal através de análise de estruturassólidas estáveis em temperatura com base em morfologia, é atualmente oúnico método oficial reconhecido pela União Européia para a detecção deconstituintes de origem animal em ração animal.

O uso de DNA animal como um alvo em técnicas à base dePCR oferece suporte para os testes atuais como DNA é mais resistente àstemperaturas no processamento do que as proteínas. Esta técnica usa PCR emtempo real para amplificar uma porção da seqüência alvo de 16S rRNA DNAmitocondrial - quaisquer amplicons gerados são analisados.

Princípio envolvido no método

DNA é extraído de 40 g de amostra de ração. A amostra deração é desgranulada em um tampão fosfato usando uma etapa deaquecimento e então uma sub-amostra é tratada com resina chelex. A misturaé submetida a vórtice, centrifugada e uma alíquota de sobrenadante contendoDNA é usada para teste. DNA da amostra é adicionada à mistura Mestrecontendo tampão, iniciadores, sondas, pUC18 e enzima polimerase em umaplaca de teste. A reação de PCR reação é realizada em um detector deseqüência ABI prism 7900. O sistema resulta em uma fluorescência se o alvofor amplificado durante a reação PCR. Fluorescência é medida diretamentedentro da placa PCR e os resultados são calculados com base na intensidadedo sinal fluorescente. O DNA de controle interno (pUCl 8) com iniciadoresespecíficos e sonda fluorescente diferente é usado para avaliar se ocorreuinibição de amplificação. Os valores de Ct (ciclo limiar) são calculados paracada amostra durante sua reação e comparados a um nível de corteestabelecido por placa com base nos valores de Ct de amostras de controle.

Materiais

Documentação e software

- Software ABI SDS, versão 2.0 ou posterior.

- Folha de teste TaqMan™ (ver instruções do fabricante).Produtos químicos e reagentes

- tampão fosfato pH 7,2 + 0,1 (0,1M)

Solução A: 14,2g di- hidrogênio ortofosfato de sódio (anidro),dissolvido em um litro de água destilada

Solução B: 15, 6g di- hidrogênio ortofosfato de sódio(diidratado), dissolvido em um litro de água destilada

Misturar 720ml de solução A com 280 ml de solução B,verificar o pH de 7,2+0,1 (volumes maiores podem ser feitos para uma maiorprodução , mas não devem ser mantidos por mais do que sete dias).

- Cada novo reagente TaqMan deve ser avaliado, como ascaracterísticas como variar de batelada a batelada e entre fabricantes. Novasbateladas de componentes da mistura mestre PCR (reagentes, sondas ouiniciadores) devem ser introduzidos de uma vez e testados a fim de determinara adequação para este fim. A mistura mestre de PCR TaqMan Universal deApplied Biosystems é atualmente usada. Reagentes equivalentes de outrosfornecedores que demonstraram ser apropriados para este fim podem serusados.

- DNA plasmídeo pUC18 (Sigma Catálogo No. D4154)

- água de tipo de biologia molecular certificada isenta deDNA-e RNA (Sigma Catálogo No. W4502)

- iniciadores de controle e específicos purificados por HPLC -ver tabelas 1 e 2 acima.

Amostras de controle

Controle negativo: carga de alimentação Negativacompreendendo colza, soja, girassol e milho em proporções iguais.Osingredientes supridos por GAFTA.

- controles positivos: tecido de bovino, Ovino, Porcino e Avesuprido por Prosper de Mulder. Tecido de peixe suprido por United FishIndustries.Equipamento

- instrumento de detecção de seqüência e PC da ABI PRISM1900HT.

- Balança eletrônica, apropriada para medir entre 40 g ± 5 g.(faixa de 0 a 3 kg)

- Balança eletrônica, apropriada para medir entre 0,2 g ± 0,02g. (faixa de 0 a 100 χ g)

- Centrifuga com rota fixa capaz de girar microtubos a 13000rpm (11.000 χ g)

- Centrifuga para girar placas de 96 cavidades (2000 rpm [700xg])

- Faixa de pipetas de canal único ajustado capazes de distribuirvolumes de 0,1-1000 μΐ com precisão.

- Pipeta de múltiplos canais, faixa de 1-10 μΐ

- cabine de fluxo Laminar ou cabine de segurança classe II

- Autoclave, capaz de operar a 95°C ± 5°C a pressãoatmosférica.

- Congelador, <-18°C

- Misturador de vórtice

Artigos de consumo

- tampões de compressão de cobertura Optical ABI PRISM(Applied Biosystems)

- coberturas adesivas da ABI PRISM (Applied Biosystems)

- Placa de reação de 96 cavidades Optical (Applied Biosystems)

- pontas de barreira de filtro para pipetadores (VWR)

- tubos de microcentrífuga estéreis 0,6- 1,7 ml (Alpha Labs ou outros fornecedores apropriados)

- objetos pequenos de plástico estéreis (VWR)- recipientes autoclaváveis (volume de 1 litro)

- Cilindros de medição de tamanho apropriado .Método

Identificação da amostra e manipulação

Identificar cada apresentação por uma combinação única denúmero de referência e dada de recebimento. A manipulação das amostrasdeve estar de acordo com os procedimentos de segurança relevantes.

Preparação da amostra

A 40 g ± 5 g de amostra adicionar 360 ml de O5IM tampãofosfato pH 7,2 ±0,1. Embeber durante 15 minutos a temperatura ambiente emuma recipiente apropriado para autoclavagem. Autoclavar a 95 ± 5°C durante15 minutos. Pesar 0,2 ± 0,02 g de resina chelex em um tubo demicrocentrífuga de 1,7 ml. Remover as amostras do autoclave e extrair 1 mlde sobrenadante de aproximadamente 1 cm abaixo da superfície de líquido.Transferir para o tubo de microcentrífuga contendo chelex.

Submeter a amostra a vórtice a uma velocidade máximadurante 20 segundos. Centrifugar as amostras durante 10 minutos + 60segundos a 13.000 rpm (11.000 χ g). Remover 10 μl de sobrenadante eadicionar 90 μl de água destilada de tipo molecular. Usar o extratoimediatamente ou manter a <-18°C antes do teste.Preparação de soluções de trabalho

Iniciadores: Iniciadores de oligonucleotídeos (Oligo) sãofornecidos como grânulos liofilizados que precisam ser reconstituídos ediluídos para formar soluções de carga para alíquotas e armazenamento.

Dissolver o grânulo oligo em água de tipo biológico para dar100 uM de solução . Misturar bem por vórtice e deixar durante 2 min emtemperatura ambiente. Misturar novamente.

Distribuir a carga de iniciador de 100 μΜ em 50 μl oualíquotas menores em tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Rotular osiniciadores e armazenar a < - 18 0C.

Sondas: recolocar em suspensão as sondas em Iml tipobiológico. Distribuir em alíquotas de 50 μΐ em microtubos de 0,6 ml, rotular earmazenar a < - 18 0C.

pUC18: Diluir a carga de pUC18 a 1/15.000. Distribuir emalíquotas de 50 μΐ em microtubos de 0,6 ml, rotular e armazenar a < - 18 0C.

Agua - Distribuir em frascos de 25m 1 e armazenar emtemperatura ambiente.

Preparação de controles negativos e positivos

Controle negativo: 40 g ± 5 g de carga de ração negativaprocessada como especificado acima e o extrato chelex é coletado. Estecontrole negativo está pronto para usar ou pode ser armazenado a <-18°Cdurante 1 ano. Novas bateladas de material de controle negativo devem sertestadas junto com a batelada anterior para estabelecer adequação para afinalidade.

Controle positivo (0,2%): 40 g ± 5 g de carga de raçãonegativa salpicada individualmente com 0,08 g de farinha de carne e ossos debovino/porcino/ovino/ Ave/ peixe e processado como especificado acima e oextrato chelex é coletado. Estes controles positivos estão prontos para usar oupodem ser armazenados a <-18°C durante 1 ano. Novas bateladas de materialde controle positivo devem ser testadas junto com a batelada anterior paraestabelecer adequação para a finalidade.

Preparação da mistura mestre PCR

Dependendo do teste, calcular as concentrações de iniciadorese sonda requeridas e ajustar os volumes totais dependendo do número detestes (reservatórios) sendo usados. Remover as cargas divididas em alíquotasde iniciadores, sonda, pUC18 e a mistura universal TaqMan da geladeira/freezer e deixar alcançar a temperatura ambiente. Bater suavemente os tubospara assentar os conteúdos no fundo dos tubos. Trabalhar na cabine desegurança de uma sala limpa, pipetar o volume requerido de cada reagente emuma caixa de 7 ml. Não adicionar o pUC18 neste estágio. Retornar aolaboratório de teste e adicionar o volume requerido de pUC18. Uma vez quetodos os reagentes foram adicionados, submeter a vórtice a mistura durante 5a 10 segundos.

Ajuste das placas TaqMan

Para o teste de triagem geral, fixar uma ou mais placas paraincluir reações para várias sem controles de gabarito (NTC's), pelo menos umcontrole positivo para cada tipo de tecido, exceto para tecido de ave que deveter pelo menos seis reações, controles negativos e as amostras a seremtestadas. Para o teste específico de espécie, o mesmo desenho como acimadeve ser usado, exceto que pelo menos seis reações de controle positivas paraa espécie alvo são incluídas para cálculo dos valores de corte Ct.

Adicionar 23 μΐ da mistura mestre (ver acima) a cada cavidadede uma placa de reação Optical de 96 cavidades. Adicionar 2 μΐ de DNA deamostra apropriado ou DNA de controle para a placa de 96 cavidades. Cobrira placa com cobertura adesiva ABI PRISM e selar. Centrifugar a placadurante 3 s a 2000 rpm (700 χ g) para assentar os conteúdos das cavidades eexpelir quaisquer bolhas de ar. Repetir se as bolhas de ar estiverem presentes.

Realizar o teste TaqMan

Colocar a placa PCR no ABI Prism 7900 e realizar o ciclo. Ascondições de ciclo são como a seguir: 5O0C durante 2 minutos, seguido por95°C durante 10 minutos, 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos e 53,6°Cdurante 1 minuto. Analisar os dados de acordo com instruções dos fabricantese procedimentos locais.

Resultados da análise

Somente operadores treinados devem analisar e interpretar osresultados. Existem várias opções de software disponíveis para ver e analisaros dados.Os valores de pUC18 Ct de controle interno indicam se areação teve sucesso ou foi inibida pela presença de inibidores de polimerase.

Os valores de Ct fora de faixa aceitável (24,5 ciclos a 11,9 ciclos) devemindicar inibição e a amostra em questão deve ser re-testada. Se testessubseqüentes também gerarem valores de controle interno fora da faixaaceitável, então o resultado deve ser registrado como não conclusivo. Asamplificações de NTC devem ter um valor de Ct de entre 39 e 40. Se afluorescência ocorre, isto pode ser devido à degradação térmica de sonda e oteste deve ser repetido.

Para um teste de triagem geral: DNA de aves tinha os maioresciclos de limiar quando comparado a DNA de bovino, ovino e porcino, assimseis valores de Ct de controle positivo foram usados para gerar um corte nesteteste. A média das 6 cavidades + 3 desvio padrão (SD) é usada para calcularum valor de corte. Uma amostra gerando um valor de Ct menor do que ouigual a este valor é registrada como positiva. Uma amostra com um valor Ctmaior do que este corte é registrada como negativa.

Para o teste específico de espécie: Os valores Ct de 6cavidades usadas para controle positivo específico da espécie são usados paradeterminar o valor de corte. A média de 6 cavidades + 3 desvio padrão (SD) éusada para calcular um valor de corte. Uma amostra gerando um valor de Ctmenor do que ou igual a este valor é registrada como positiva. Uma amostracom um valor Ct maior do que este corte é registrada como negativa.

Apesar da presente invenção ter sido descrita com referência aformas de realização preferidas e exemplares, os versados na arte irãoreconhecer que várias modificações e variações à mesma podem ser obtidassem sair do espírito e escopo da presente invenção e que estas modificaçõessão claramente contempladas aqui. Nenhuma limitação com relação às formasde realização específicas descritas aqui e especificadas nas reivindicaçõesanexas é destinada nem deve ser assim deduzida.Todos os documentos citados aqui são incorporados porreferência em sua totalidade, seja isto ou não isto especificamente descritopara cada referência.

Claims (41)

1. Método para extrair ácido nucleico de uma amostra,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(i) incubar entre cerca de 30 a 250 g, por exemplo cerca de 35a 45 g, ou cerca de 40 g, da amostra em um tampão de incubação;(ii) autoclavar a amostra incubada na etapa (i); e(iii) misturar a amostra ou uma porção da amostra autoclavadana etapa (ii) com um agente quelante de metal, por exemplo uma resina detroca iônica quelante de metal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, aindacaracterizado pelo fato de compreendendo a etapa de:(iv) sedimentar o agente quelante de metal da amostra ouporção na etapa (iii) para produzir um sobrenadante compreendendo ácidonucleico extraído.

3. Método de acordo com uma dentre a reivindicação 1 ou areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tampão de incubação é umtampão fosfato, por exemplo um tampão fosfato de sódio a uma concentraçãode cerca de 0,05 a 0,2 M ou cerca de 0,1 M.

4. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que o tampão de incubação é cerca de 500 a 1.500% (v/p) da massa da amostra, por exemplo cerca de 900 % (v/p) da massa daamostra.

5. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que o tampão de incubação, por exemplo umtampão de fosfato de sódio, tem um pH de entre cerca de 6,5 e 7,5, ou cercade 7,2.

6. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa (i) é conduzida durantecerca de 5 a 60 minutos ou durante cerca de 10 a 30 minutos, por exemplodurante cerca de 15 minutos.

7. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a amostra é autoclavada na etapa (ii) a cerca de-85 a 120°C ou a cerca de 90 a 100°C, por exemplo a cerca de 95°C, eopcionalmente durante cerca de 5 a 60 minutos ou durante cerca de 10 a 30minutos, por exemplo durante cerca de 15 minutos.

8. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a amostra é autoclavada na etapa (ii) em oupróximo da pressão atmosférica.

9. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que agente quelante de metal quelata íons de metalpolivalente por exemplo uma resina que é um copolímero estireno divinilbenzeno contendo íons iminodiacetato em pares, como Chelex 100.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 9, caracterizado pelo fato de que o agente quelante de metal, por exemplouma resina de troca iônica quelante de metal, é sedimentado na etapa (iv) porcentrifugação, por exemplo a cerca de 10.000 a 12.000 χ g, ou cerca de-11.000 χ g.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra é de ração animal, porexemplo ração para ruminantes.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra contém ou deve sertestada pela presença de material animal desengordurado, por exemploproteínas animais processadas (PAPs) ou farinha de carne e ossos (MBM).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende DNAmitocondrial de animal ou ruminante, por exemplo DNA mitocondrialcodificando um gene de RNA 16S .

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende DNA deum ou mais do grupo consistindo de: tecido animal, ruminante, bovino, ovino,porcino, aves e peixes.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a amostra é de ração animal, o método caracterizado pelofato compreender as etapas de:(i) incubar entre cerca de 35 a 45 g da amostra em um tampãofosfato de sódio 0,1 M a um pH de cerca de 7,1 a 7,3 durante cerca de 10 a 20minutos, por exemplo cerca de 15 minutos, opcionalmente em temperaturaambiente;(ii) autoclavar a amostra incubada na etapa (i) em ou próximoda pressão atmosférica a cerca de 90 a 100 0C durante cerca de 10 a 30minutos, por exemplo durante cerca de 15 minutos; e(iii) misturar uma porção da amostra autoclavada na etapa (ii)com uma resina de troca iônica quelante de metal, por exemplo Chelex 100.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de compreender a outra etapa de:(iv) sedimentar a resina da porção da amostra na etapa (iii) porcentrifugação a cerca de 10.000 a 12.000 χ g, ou a cerca de 11.000 χ g.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 16, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante ou uma alíquota domesmo da etapa (iv) é usado em uma reação de amplificação como umareação de cadeia polimerase (PCR) ou teste de PCR em tempo real.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de:(v) detectar a presença ou ausência de ácido nucleico, porexemplo DNA como DNA mitocondrial.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o ácido nucleico é de material animal desengordurado, porexemplo PAPs ou MBM.

20. Método de acordo com ou a reivindicação 18 ou areivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é detectadona etapa (v) usando PCR ou PCR em tempo real.

21. Método para amplificar DNA em uma amostra,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(i) extrair DNA da amostra de acordo com o método definidonas reivindicações 1 a 17; e(ii) amplificar o DNA extraído usando uma reação deamplificação como PCR ou PCR em tempo real.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o DNA amplificado na etapa (ii) é de material animaldesengordurado, por exemplo PAPs ou MBM.

23. Método de acordo com ou a reivindicação 21 ou areivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o PCR ou PCR em tempo realemprega um par de iniciadores, e no caso de PCR em tempo realadicionalmente emprega uma sonda, em que os iniciadores e sonda sãoespecíficos para um ou mais dos seguintes: tecido de animal, ruminante,bovino, ovino, porcino, aves e peixes.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o par de iniciadores e sonda são específicos para DNAmitocondrial, por exemplo DNA mitocondrial codificando um gene de RNA-16S, de um ou mais do grupo consistindo de: tecido animal, ruminante,bovino, ovino, porcino, aves e peixes.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o par de iniciadores e sonda, respectivamente, sãoselecionados dentre o grupo de seqüências consistindo de SEQ ID NOs 1, 2 e-3 (específicas de animais), SEQ E) NOs 4, 5 e 6 (específicas de bovinos),SEQ ID NOs 7, 8 e 9 (específicas de ovinos), SEQ ID NOs 10, 11 e 12(específicas de porcinos), SEQ ID NOs 13, 14 e 15 (específicas de aves), eSEQ ID NOs 16, 17 e 18 (específicas de peixes).

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o par de iniciadores e sonda são específicos para DNAmitocondrial codificando um gene de RNA 16S de um ou mais do grupoconsistindo de: tecido porcino, aves e peixes.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o par de iniciadores e sonda, respectivamente, sãoselecionados dentre o grupo de seqüências consistindo de SEQ ID NOs 10, 11e 12 (específicas de porcinos), SEQ ID NOs 13, 14 e 15 (específicas de aves),e SEQ ID NOs 16, 17 e 18 (específicas de peixes).

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-20 a 27, caracterizado pelo fato de que o PCR ou PCR em tempo real aindaemprega um conjunto de iniciadores, e no caso de PCR em tempo realadicionalmente emprega uma sonda, em que o conjunto de iniciadores esondas são específicos para DNA exógeno à amostra, por exemplo asseqüências como especificadas em SEQ ID NOs 19, 20 e 21.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-17 a 28, caracterizado pelo fato de que PCR em tempo real é realizado usandosondas TaqMan.

30. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que ele exclui o uso de purificação do DNAmagnético, por exemplo o Wizard Magnetic DNA Purification System forFood obtido de Promega (Madison, WI, USA).

31. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que ele exclui o uso de RNAse.

32. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que ele exclui o uso de cartão Whatman FTA™.

33. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que o tampão de incubação exclui um detergentecomo Triton X-100.

34. Kit para amplificar DNA de uma amostra usando PCR,caracterizado pelo fato de compreender um par de iniciadores selecionadosdentre o grupo de seqüências consistindo de: SEQ ID NOs 1 e 2 (específicasde animais), SEQ ID NOs 4 e 5 (específicas de bovinos), SEQ ID NOs 7 e 8(específicas de ovinos), SEQ ID NOs 10 e 11 (específicas de porcinos), SEQID NOs 13 e 14 (específicas de aves), e SEQ ID NOs 16 e 17 (específicas depeixes), e opcionalmente ainda compreendendo um conjunto de iniciadoresespecíficos para DNA exógeno à amostra, por exemplo as seqüências comoespecificadas em SEQ ID NOs 19 e 20.

35. Kit para amplificar DNA de uma amostra usando PCR emtempo real, caracterizado pelo fato de compreender um par de iniciadores euma sonda, respectivamente, selecionados dentre o grupo de seqüênciasconsistindo de: SEQ ID NOs 1, 2 e 3 (específicas de animais), SEQ ID NOs 4,-5 e 6 (específicas de bovinos), SEQ ID NOs 7, 8 e 9 (específicas de ovinos),SEQ ID NOs 10, 11 e 12 (específicas de porcinos), SEQ ID NOs 13, 14 e 15(específicas de aves), e SEQ ID NOs 16, 17 e 18 (específicas de peixes), eopcionalmente ainda compreendendo um conjunto de iniciadores e uma sondaespecífica para DNA exógeno à amostra, por exemplo as seqüências comoespecificadas em SEQ ID NOs 19, 20 e 21.

36. ICit de acordo com ou a reivindicação 34 ou areivindicação 35, caracterizado pelo fato de ser para amplificar materialanimal desengordurado, por exemplo PAPs ou MBM, de uma amostra deração.

37. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato decompreender uma ou mais das seqüências especificadas em SEQ ID NOs 1--21, por exemplo as seqüências especificadas em SEQ ID NOs 10-18.

38. Ácido nucleico extraído caracterizado pelo fato de serobtenível de acordo com o método das reivindicações 1 a 33.

39. Método para extrair ácido nucleico de uma amostra,caracterizado pelo fato de ser substancialmente como descrito aqui.

40. Método para amplificar DNA em uma amostra,caracterizado pelo fato de ser substancialmente como descrito aqui.

41. Kit para amplificar DNA de uma amostra, caracterizadopelo fato de ser substancialmente como descrito aqui.