BRPI0709793A2 - molÉcula de Ácido nucleico, polipeptÍdeo, vetor, cÉlula, mÉtodos para a fabricaÇço de um polipeptÍdeo, para o tratamente de um animal, para a modificaÇço da atividade antagonista de um polipeptÍdeo, e para a concepÇço racional de mutaÇÕes em um polipeptÍdeo, composiÇço farmacÊutica, uso do polipeptÍdeo, antagonista de polipeptÍdeo variante, e, homodÍmero - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTÍDEO, VETOR, CÉLULA, MÉTODOS PARA A FABRICAÇçO DE UM POLIPEPTIDEO, PARA O TRATAMENTO DE UM ANIMAL, PARA A MODIFICAÇçO DA ATIVIDADE ANTAGONISTA DE UM POLIPEPTIDEO, E PARA A CONCEPÇçO RACIONAL DE MUTAÇÕES EM UM POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, USO DO POLIPEPTÍDEO, ANTAGONISTA DE POLIPEPTÍDEO VARIANTE, E, HOMODÍMERO<D>Os requerentes descrevem um antagonista de polipeptídeo de hormônio de crescimento circularmente permutado; composições compreendendo dito antagonista e métodos para tratar condições que iriam se beneficiar de administração de dito antagonista.

Description

"MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTÍDEO, VETOR,CÉLULA, MÉTODOS PARA A FABRICAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO,PARA O TRATAMENTO DE UM ANIMAL, PARA A MODIFICAÇÃODA ATIVIDADE ANTAGONIS TA DE UM POLIPEPTÍDEO, E PARA ACONCEPÇÃO RACIONAL DE MUTAÇÕES EM UM POLIPEPTÍDEO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO POLIPEPTÍDEO,ANTAGONISTA DE POLIPEPTÍDEO VARIANTE, E, HOMODÍMERO"

A invenção se refere a um antagonista de polipeptídeo dehormônio de crescimento circularmente permutado; composiçõescompreendendo dito antagonista e métodos para tratar condições que iriam sebeneficiar de administração de dito antagonista.

Um grande grupo de fatores de crescimento, referidos comocitocinas, estão envolvidos em um número de diversas funções celulares.Estas incluem modulação do sistema imune, regulação do metabolismoenergético e controle de crescimento e desenvolvimento. Citocinas mediamseus efeitos através de receptores expressos na superfície celular em célulasalvo. Receptores de citocina podem ser divididos em quatro subgruposseparados. Receptores tipo 1 (família de hormônio de crescimento (GH)) sãocaracterizados por quatro resíduos conservados de cisteína na parte amino terminal de seu domínio extracelular e a presença de um motivo conservadoTrp-Ser-Xaa-Trp-Ser na parte C-terminal. O motivo repetido Cys tambémestá presente em Tipo 2 (família de interferon) e Tipo III (família de fator denecrose tumoral).

Sabe-se que muito ligantes de citocina interagem com seureceptor cognato através de sítios específicos. Alguns receptores de citocinatêm tanto sítios de ligação de ligante de alta afinidade como sítios de ligaçãode baixa afinidade.

Por exemplo, sabe-se que uma única molécula de GH seassocia com duas moléculas de receptor (GHR) (Cunningham et al., 1991; deVos et al, 1992; Sundstrom et ai, 1996;Clackson et al., 1998). Isto ocorreatravés de dois sítios de ligação de receptor exclusivos em GH e um sítio deligação comum no domínio extracelular de dois receptores. Sítio 1 namolécula de GH tem uma afinidade maior do que sítio 2, e acredita-se quedimerização de receptor ocorra seqüencialmente com um receptor se ligando asítio 1 em GH seguido por recrutamento de um segundo receptor para sítio 2.O domínio extracelular do GHR existe como dois domínios ligados cada deaproximadamente 100 aminoácidos. E uma mudança conformacional nestesdois domínios que ocorre em ligação de hormônio com a formação docomplexo trimérico GHR-GH-GHR. Internalização do complexo GHR-GH-GHR é seguida por uma etapa de reciclagem através da qual a molécula dereceptor é regenerada para uso posterior dentro da célula.

Uma variedade de diferentes estequiometrias são empregadaspor diferentes citocinas e outros ligantes em ligação de receptor. Assimeritropoetina, como GH, forma um complexo trimérico receptorhormônio-receptor. Interleucina-4 forma um complexo trimérico receptor-hormônio-receptor diferente. Outras citocinas, por exemplo, leptina e GCSF, formamcomplexo tetramérico receptor-hormônio-hormônio-receptor, e outras (eginterleucina 6) provavelmente formam complexos hexaméricos consistindo deduas moléculas solúveis de receptor, duas moléculas de receptortransmembrana e duas moléculas de citocina. Em cada caso existe um sítio deligação de alta afinidade primário que localiza a citocina para o complexoreceptor, e sítios adicionais que desempenham papéis secundários na alteraçãoda conformação ou recrutamento de outras moléculas e com isso iniciamsinalização.

Polipeptídeos variantes de citocina são conhecidos. Porexemplo, variantes de GH são descritas em Patente Norte-Americana5.849.535. A modificação para GH é tanto em sítios de ligação de sítio 1como sítio 2. As modificações para sítio 1 produzem uma molécula de GHque tem uma afinidade maior para GHR comparada com GH tipo selvagem.Estas moléculas modificadas de GH atuam como agonistas. Também existedescrição de modificações em sítio 2 que resultam na criação de antagonistasde GH. Exemplos adicionais de modificações a GH que alteram a afinidadede ligação de GH para sítio 1 são descritos em Patente Norte-Americana5.854.026; Patente Norte-Americana 6.004.931; Patente Norte-Americana6.022.711; Patente Norte-Americana 6.057.292; e Patente Norte-Americana6.136.563. Estas modificações se referem a mutações pontuais em posiçõesespecíficas em GH que produzem uma molécula com propriedades desinalização alteradas.

Permutação circular é uma maneira para gerar variantes depolipeptídeos que retêm a estrutura geral de seqüência primária linear de umpolipeptídeo nativo, mas re-ordena a seqüência formando novos términosamino e carboxil. O processo gera moléculas com propriedades biológicasalteradas. O processo inclui a fusão dos términos amino e carboxil naturais oudiretamente ou usando moléculas ligantes que são tipicamente ligantespeptídicos. A molécula circularizada é então conceitualmente cortada paracriar novos términos amino e carboxil. Polipeptídeos circularmentepermutados podem ser gerados ou recombinantemente ou por síntesepeptídica in vitro.

Permutação circular foi usada para gerar moléculas quiméricascom atividade biológica alterada.

Por exemplo, Patente Internacional 95/27732 descreve acriação de um ligante de IL-4 circularmente permutado fusionado a um agentecitotóxico. O agente IL-4-permutado tem afinidade e citotoxicidade alteradasquando comparado a um agente IL-4-nativo e tem eficácia com respeito amatar células cancerosas que são expostas ao polipeptídeo conjugado.

Patente Internacional WO 99/51632 descreve o uso depermutação circular para gerar novas proteínas de ligação de estreptavidinaque têm afinidade reduzida para biotina. A estreptavidina circularmentepermutada é fusionada a um segundo polipeptídeo para criar uma proteína defusão que se liga diferencialmente a biotina. A afinidade reduzida da proteínade fusão de estreptavidina para biotina facilita liberação da proteína de fusãoquando biotina é usada como um veículo de liberação de droga.

WO 01/51629 descreve β-lactamase bacteriana circularmentepermutada e seu uso como uma proteína marcadora para a detecção deinterações entre proteínas intracelulares e extracelulares que se unem com opolipeptídeo permutado.

Métodos para identificar polipeptídeos circularmentepermutados também são conhecidos. Por exemplo, WO 00/18905, que éincorporada por referência em sua totalidade, descreve um método paraidentificar polipeptídeos permutados, referidos como "permuteínas", usandoum vetor de apresentação em fago no qual uma biblioteca de genespermutados é inserida. A expressão da biblioteca na superfície do vetor deapresentação é detectada por exposição da biblioteca expressa para umaproteína de ligação que potencialmente interage com uma permuteína.

WO 01/30998, que é incorporada por referência em suatotalidade, descreve um método adicional para gerar e identificar proteínascircularmente permutadas. A invenção se refere à formação de proteínas defusão compreendendo a parte amino terminal de uma primeira proteínafusionada à parte carboxil terminal de uma segunda proteína diferente a partirda qual permutações são sintetizadas. Uma biblioteca de proteínas de fusão écriada a qual pode ser tríada por apresentação em fago.

Em pedido co-pendente de requerentes WO 2005/003165A2são descritas, entre outras coisas, moléculas circularmente permutadas dehormônio de crescimento. São descritas a atividade agonista de uma talmolécula e a modificação desta molécula para um antagonista de atividade dereceptor de hormônio de crescimento.De acordo com um aspecto da invenção é fornecido umamolécula isolada de ácido nucleico compreendendo a seqüência de ácidosnucleicos caracterizada pelo fato de que dita seqüência de ácidos nucleicos éselecionada a partir do grupo consistindo de:

(i) uma molécula de ácido nucleico consistindo da seqüênciacomo representado em Figura 1 (SEQ ID NO: 1);

(ii) uma molécula de ácido nucleico compreendendo umaseqüência que hibridiza com a seqüência identificada em (i) caracterizadapelo fato de que dita molécula de ácido nucleico inclui uma modificaçãocompreendendo uma seqüência que codifica resíduo de aminoácido 176 comoindicado em Figura 1, caracterizada pelo fato de que dita modificação resultana adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido edita molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo com atividadeagonista de receptor de hormônio de crescimento;

(iii) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos comorepresentado em Figura 2a (SEQ ID NO: 2).

Em uma forma de realização preferida da invenção é fornecidouma molécula isolada de ácido nucleico que se anela em condições dehibridização estringente com as seqüências descritas em (i) e (ii) acima.

Hibridização de uma molécula de ácido nucleico ocorrequando duas moléculas complementares de ácidos nucleicos passam por umaquantidade de ligação de hidrogênio uma com a outra. A estringência dehibridização pode variar de acordo com as condições ambientais circundandoos ácidos nucleicos, a natureza do método de hibridização, e a composição ecomprimento das moléculas de ácido nucleico usadas. Cálculos considerandocondições de hibridização requeridas para atingir graus particulares deestringência são discutidos em Sambrook et ai., Molecular Cloning: ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 2001); e Tijssen, Laboratory Techniques in Bioehemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nueleie Aeid Probes Part I, Chapter 2(Elsevier, New York, 1993). A Tm é a temperatura na qual 50% de uma dadafita de uma molécula de ácido nucleico é hibridizada com sua fitacomplementar. O seguinte é um conjunto exemplar de condições dehibridização e não é limitante:

Estringência Muito Alta (permite que seqüências quecompartilham pelo menos 90% de identidade hibridizem)

Hibridização: 5x SSC a 65°C por 16 horas

Lavagem duas vezes: 2x SSC em temperatura ambiente(RT) por 15 minutos cada

Lavagem duas vezes: 0,5x SSC a 65°C por 20 minutos cada

Estringência Alta (permite que seqüências que compartilhampelo menos 80% de identidade hibridizem)

Hibridização: 5x-6x SSC a 65°C-70°C por 16-20horas

Lavagem duas vezes: 2x SSC a RT por 5-20 minutos cada

Lavagem duas vezes: Ix SSC a 55°C-70°C por 30 minutoscada

Estringência Baixa (permite que seqüências que compartilhampelo menos 50% de identidade hibridizem)

Hibridização: 6x SSC a RT a 55°C por 16-20 horas

Lavagem pelo menos duas vezes: 2x-3x SSC a RT a 55°Cpor 20-30 minutos cada

Em uma forma de realização preferida da invenção ditamolécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo compreendendo umaseqüência de aminoácidos como representado em Figura 8 (SEQ ID NO: 9).

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos representada emFigura 2 (SEQ ID NO: 2), cuja seqüência foi modificada por adição, deleçãoou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido caracterizado pelofato de que dita modificação inclui resíduo de aminoácido 176 caracterizadopelo fato de que dito polipeptídeo é um antagonista de receptor de hormôniode crescimento.

O polipeptídeo da invenção pode diferir em seqüência deaminoácidos por uma ou mais substituições, adições, deleções, truncamentosque podem estar presentes em qualquer combinação que inclui resíduo deaminoácido 176.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditopolipeptídeo é modificado por substituição de glicina em posição 176 por umaminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: histidina, ácidoaspártico, valina, arginina, alanina, lisina, triptofano, tirosina, fenilalanina eácido glutâmico.

Preferivelmente dita substituição é glicina 176 por arginina oulisina ou alanina; preferivelmente dita modificação é glicina por arginina.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditopolipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos como representadoem Figura 8 (SEQ ID NO: 9)

Em adição, a invenção caracteriza seqüências de polipeptídeostendo pelo menos 75% de identidade com as seqüências de polipeptídeoscomo descrito neste lugar, ou fragmentos e polipeptídeos funcionalmenteequivalentes destes. Em uma forma de realização, os polipeptídeos têm pelomenos 85% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, aindamais preferivelmente pelo menos 97% de identidade, e mais preferivelmentepelo menos 99% de identidade com as seqüências de aminoácidos ilustradasneste lugar.

Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecidoum polipeptídeo de acordo com a invenção ligado a pelo menos um domíniode ligação extracelular de receptor de hormônio de crescimento para formaruma proteína de fusão; preferivelmente dito domínio de ligação consiste dodomínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditosdomínios são ligados através de uma molécula de ligação de peptídeo.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditamolécula de ligação de peptídeo é um ligante peptídico flexível.

Preferivelmente o ligante é um peptídeo que compreende 5 a30 resíduos de aminoácidos. Mais preferivelmente o ligante compreende 10 a20 resíduos de aminoácidos.

Mais preferivelmente o ligante compreende pelo menos umacópia do peptídeo:

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (referidos como "Gly4Ser") (SEQ IDNO: 3).

Em uma forma de realização da invenção o ligante é de 10aminoácidos de comprimento e compreende duas cópias do ligante Gly4Ser.Em uma forma de realização alternativa da invenção, o ligante é 15aminoácidos de comprimento e compreende três cópias do ligante Gly4Ser.Em uma forma de realização ainda alternativa, o ligante é de 20 aminoácidosde comprimento e compreende quatro cópias do ligante Gly4Ser.

Em pedido co-pendente de requerentes, Patente Internacional01/096565, que é incorporado por referência em sua totalidade, são descritasproteínas de fusão que fundem traducionalmente o domínio de ligação deligante de uma citocina ao domínio de ligação de receptor extracelular de ditoligante através de ligantes peptídicos. Estas proteínas de fusão têm depuraçãoatrasada e atividade agonista. Ligantes peptídicos que ligam o polipeptídeo dainvenção com outro para formar polipeptídeos oligoméricos (dímeros,trímeros etc) e para domínios de ligação de receptor extracelulares dehormônio de crescimento são ou flexíveis ou inflexíveis (e.g. helicoidais) oude flexibilidade intermediária (e.g. um ligante combinacional que éparcialmente helicoidal) como descrito em pedido co-pendente de requerentesPatente Internacional 2006/010891, que é incorporado por referência em suatotalidade. Ligantes também podem conter sítios de clivagem, por exemplo,sítios de clivagem de protease para fornecer polipeptídeos de fusão comcaracterísticas de liberação atrasada; estes são descritos em pedido co-pendente de requerentes Patente Internacional 03/062276 que é incorporadopor referência em sua totalidade.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos dois polipeptídeos deacordo com a invenção ligados em tandem.

Em uma forma de realização preferida da invenção é fornecidoum polipeptídeo de fusão compreendendo uma pluralidade de polipeptídeosde acordo com a invenção.

Em uma forma de realização preferida adicional da invenção éfornecido um polipeptídeo de fusão consistindo de dois polipeptídeos deacordo com a invenção ligados em tandem.

Em uma forma de realização preferida alternativa da invençãoé fornecido um polipeptídeo de fusão compreendendo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10polipeptídeos de acordo com a invenção.

Em uma forma de realização preferida ainda adicional dainvenção dito polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou pelo menos doispolipeptídeos de acordo com a invenção que são ligados juntos por umamolécula ligante. Preferivelmente dita molécula ligante é como descritoacima.

De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção éfornecido um polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos doispolipeptídeos de acordo com a invenção compreendendo adicionalmente pelomenos um domínio de ligação de hormônio de crescimento de um receptor dehormônio de crescimento.

Preferivelmente dito polipeptídeo de fusão consiste de doispolipeptídeos de acordo com a invenção e um domínio de ligação de hormônio de crescimento de um receptor de hormônio de crescimento.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditodomínio de ligação compreende um domínio de ligação extracelular dereceptor de hormônio de crescimento; preferivelmente dito domínio consistedo domínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento. De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum polipeptídeo de fusão quimérico compreendendo um polipeptídeo deacordo com a invenção ligado, ou diretamente ou indiretamente, a umpolipeptídeo de prolactina.

Em uma forma de realização preferida da invenção dito polipeptídeo de prolactina compreende uma seqüência de aminoácidoscaracterizada pelo fato de que dita seqüência de aminoácidos é modificada emposição 129 de prolactina humana como representado em Figura 3 (SEQ IDNO: 7).

Em uma forma de realização preferida da invenção dita modificação em posição 129 como representada em Figura 3 (SEQ ID NO: 7)é uma substituição de aminoácido. Preferivelmente dita substituição substituiresíduo de aminoácido de glicina por resíduo de aminoácido de arginina.Preferivelmente dita modificação compreende adicionalmente a deleção depelo menos 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 resíduos de aminoácidos amino terminais de prolactina.

Em uma forma de realização preferida adicional da invençãodito polipeptídeo quimérico compreende adicionalmente um domínio deligação de um receptor de citocina. Preferivelmente dito receptor de citocina éum receptor de hormônio de crescimento.Em uma forma de realização preferida da invenção ditodomínio de ligação compreende um domínio de ligação extracelular dereceptor de hormônio de crescimento; preferivelmente dito domínio consistedo domínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento.

Em uma forma de realização preferida alternativa da invençãodito receptor é um receptor de prolactina.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditodomínio de ligação compreende um domínio de ligação extracelular dereceptor de prolactina; preferivelmente dito domínio consiste do domínioextracelular de receptor de prolactina.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidouma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fusão oufusão quimérica de acordo com a invenção.

De acordo com um aspecto da invenção é fornecido um vetorcompreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

Em uma forma de realização preferida da invenção dito vetor éadaptado para a expressão recombinante de dita molécula de ácido nucleico.

Um vetor incluindo ácido(s) nucleico(s) de acordo com ainvenção não precisa incluir um promotor ou outra seqüência reguladora,particularmente se o vetor é para ser usado para introduzir o ácido nucleicoem células para recombinação no genoma para transfecção estável.

Preferivelmente o ácido nucleico no vetor é operacionalmenteligado a um promotor apropriado ou outros elementos reguladores paratranscrição em uma célula hospedeira. O vetor pode ser um vetor deexpressão bifuncional que funciona em múltiplos hospedeiros.

Por "promotor" é pretendido uma seqüência de nucleotídeosantes do sítio de início de transcrição e que contém todas as regiõesreguladoras requeridas para transcrição. Promotores adequados incluempromotores constitutivos, tecido específicos, induzíveis, de desenvolvimentoou outros para expressão em células eucarióticas ou procarióticas.

"Operacionalmente ligado" significa unido como parte damesma molécula de ácido nucleico, adequadamente posicionada e orientadapara transcrição a ser iniciado a partir do promotor. DNA operacionalmenteligado a um promotor está "sob regulação de início transcricional" dopromotor.

Em uma forma de realização preferida o promotor é umpromotor constitutivo, um induzível ou regulável.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidouma célula transfectada ou transformada com uma molécula de ácido nucleicoou vetor de acordo com a invenção.

Preferivelmente dita célula é uma célula eucariótica.Alternativamente dita célula é uma célula procariótica.

Em uma forma de realização preferida da invenção dita célulaé selecionada a partir do grupo consistindo de; uma célula fungica (e.g. Pichiaspp, Saccharomyces spp, Neurospora spp); célula de inseto (e.g. Spodopteraspp); uma célula de mamífero (e.g. célula COS, célula CHO); uma célulavegetal.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum método para fabricar um polipeptídeo de acordo com a invençãocompreendendo:

i) fornecer uma célula de acordo com a invenção;

ii) incubar dita célula em condições conducentes para aprodução de dito polipeptídeo; e opcionalmente

iii) isolar dito polipeptídeo de dita célula ou do meio decrescimento circundando dita célula.

Em um método preferido da invenção dito polipeptídeo éfornecido com uma etiqueta de afinidade de aminoácido para facilitar oisolamento de dito polipeptídeo.Etiquetas de afinidade são conhecidas na arte e incluemproteína de ligação de maltose, glutationa S transferase, proteína de ligação decalmodulina e a manipulação de trechos de polihistidina em proteínas que sãoentão purificadas por purificação por afinidade em matrizes contendo níquel.

Em muitos casos vetores e/ou kits comercialmente disponíveis podem serusados para fundir uma proteína de interesse a uma etiqueta de afinidadeadequada que é subseqüentemente transfectada em uma célula hospedeirapara expressão e subseqüente extração e purificação em uma matriz deafinidade.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum polipeptídeo de acordo com a invenção para uso como produtofarmacêutico.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum ácido nucleico de acordo com a invenção para uso como produtofarmacêutico.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidauma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de acordocom a invenção.

De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção éfornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula deácido nucleico de acordo com a invenção. Preferivelmente dita molécula deácido nucleico é parte de um vetor; preferivelmente um vetor de expressãoadaptado para expressão eucariótica.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditoproduto farmacêutico ou composição farmacêutica inclui um excipiente oucarreador.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditoproduto farmacêutico ou composição farmacêutica é combinada com umagente terapêutico adicional.Quando administrados os produtos farmacêuticos/composiçõesda presente invenção é administrado em preparações farmaceuticamenteaceitáveis. Tais preparações podem conter rotineiramente concentraçõesfarmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes tamponantes, conservantes,carreadores compatíveis, e opcionalmente outros agentes terapêuticos.

Os produtos farmacêuticos/composições da invenção podemser administrados por qualquer via convencional, incluindo injeção. Aadministração e aplicação podem, por exemplo, ser oral, intravenosa,intraperitoneal, intramuscular, intracavidade, intra-articuar, subcutânea, tópica(olhos), dérmica (e.g um lipídio cremoso solúvel inserido em pele oumembrana mucosa), transdérmica, ou intranasal.

Produtos farmacêuticos/composições da invenção sãoadministrados em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" é aquelaquantidade de produtos farmacêuticos/composições que sozinha, ou juntocom doses adicionais ou drogas sinergísticas, produz a resposta desejada. Istopode envolver apenas tornar mais lenta a progressão da doençatemporariamente, embora mais preferivelmente, isto envolve interromper aprogressão da doença permanentemente. Isto pode ser monitorado pormétodos de rotina ou pode ser monitorado de acordo com métodosdiagnósticos.

As doses dos produtos farmacêuticos/composiçõesadministradas a um sujeito podem ser escolhidas em conformidade comdiferentes parâmetros, em particular em conformidade com o modo deadministração usado e o estado do sujeito (i.e. idade, sexo). Quandoadministrados, os produtos farmacêuticos/composições da invenção sãoaplicados em quantidades farmaceuticamente aceitáveis e em composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis. Tais preparações podem conter rotineiramentesais, agentes tamponantes, conservantes, carreadores compatíveis, eopcionalmente outros agentes terapêuticos. Quando usados em medicina, ossais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamenteaceitáveis podem ser convenientemente usados para preparar saisfarmaceuticamente aceitáveis destes e não são excluídos do escopo dainvenção. Tais sais farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveisincluem, mas não são limitados a, aqueles preparados a partir dos seguintesácidos: clorídrico, bromídrico, sulfurico, nítrico, fosfórico, maleico, acético,salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, e os semelhantes. Também,sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados como sais de metalalcalino ou alcalino terroso, tal como sais de sódio, potássio ou cálcio.

Os produtos farmacêuticos/composições podem sercombinados, se desejado, com um carreador farmaceuticamente aceitável. Otermo "carreador farmaceuticamente aceitável" como usado neste lugarsignifica um ou mais cargas sólidas ou líquidas compatíveis, diluentes ousubstâncias encapsulantes que são adequadas para administração em umhumano. O termo "carreador" significa um ingrediente orgânico ouinorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinadopara facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticastambém são capazes de ser fusionados com as moléculas da presenteinvenção, e um com o outro, de uma maneira tal que não existe interação queprejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desejada.

Os produtos farmacêuticos/composições podem conter agentestamponantes adequados, incluindo: ácido acético em um sal; ácido cítrico emum sal; ácido bórico em um sal; e ácido fosfórico em um sal.

Os produtos farmacêuticos/composições também podemconter, opcionalmente, conservantes adequados, tal como: cloreto debenzalcônio; clorobutanol; parabenos e timerosal.

As composições farmacêuticas podem ser convenientementeapresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas porqualquer dos métodos bem conhecidos na arte de farmácia. Todos os métodosincluem a etapa de colocar o agente ativo em associação com um carreadorque constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composiçõessão preparadas colocando uniformemente e intimamente o composto ativo emassociação com um carreador líquido, um carreador sólido finamentedividido, ou ambos, e então, se necessário, modelando o produto

Composições adequadas para administração oral podem serapresentadas como unidades discretas, tal como cápsulas, comprimidos,pastilhas, cada contendo uma quantidade pré-determinada do composto ativo.Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos nãoaquosos tal como xarope, elixir ou uma emulsão.

Composições adequadas para administração parenteralconvenientemente compreendem uma preparação aquosa ou não aquosaestéril que é preferivelmente isotônica com o sangue do destinatário. Estapreparação pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos usandoagentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes suspensores. Apreparação injetável estéril também pode ser uma solução injetável estéril oususpensão em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico,por exemplo, como uma solução em 1, 3-butanodiol. Entre os solventesaceitáveis que podem ser empregados são água, solução de Ringer, e soluçãoisotônica de cloreto de sódio. Em adição, óleos fixos estéreis sãoconvencionalmente empregados como um solvente ou meio suspensor. Paraeste propósito qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo monoou diglicerídeos sintéticos. Em adição, ácidos graxos tal como ácido oléicopodem ser usados na preparação de injetáveis. Formulação de carreadoradequada para administração oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc.pode ser encontrada em Remington1S Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co., Easton, PA.

Polipeptídeos/moléculas de ácidos nucleicos etc de acordocom a invenção podem ser incorporadas em lipossomos. Lipossomos sãovesículas baseadas em lipídio que encapsulam um agente terapêuticoselecionado que é então introduzido em um paciente. O lipossomo é fabricadoa partir ou de fosfolipídio puro ou uma mistura de fosfolipídio efosfoglicerídeo.

Tipicamente lipossomos podem ser fabricados com diâmetrosde menos do que 200nm; isto possibilita que eles sejam intravenosamenteinjetados e capazes de passar através da camada capilar pulmonar. Alémdisso, a natureza bioquímica de lipossomos confere permeabilidade através demembranas de vasos sangüíneos para ganhar acesso a tecidos selecionados.Lipossomos têm uma meia-vida relativamente curta. Lipossomos assimchamados STEALTHr foram desenvolvidos que compreendem lipossomosrevestidos em polietileno glicol (PEG). Os lipossomos tratados com PEG têmuma meia-vida significantemente aumentada quando administradosintravenosamente a um paciente. Em adição, lipossomos STEALTHRmostram absorção reduzida no sistema reticuloendotelial e tecidosselecionados de acumulação acentuada. Em adição, assim chamadosimunolipossomos foram desenvolvidos que combinam vesículas baseadas emlipídio com um anticorpo ou anticorpos, para aumentar a especificidade daliberação do agente para uma célula/tecido selecionado.

O uso de lipossomos como meio de liberação é descrito emPatente Norte-Americana 5580575 e Patente Norte-Americana 5542935.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoo uso do polipeptídeo de acordo com a invenção na fabricação de ummedicamento para o tratamento de uma condição selecionada a partir dogrupo consistindo de: gigantismo, acromegalia; câncer (e.g. tumor de Wilm,sarcoma osteogênico, mama, colo, próstata, tireóide); retinopatia diabética;nefropatia diabética e outras complicações de diabetes e excesso de GH.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum método de tratamento de um animal, preferivelmente um humano,compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídeo deacordo com a invenção a dito animal com necessidade de tratamento de umadoença ou condição que iria se beneficiar de inibição de hormônio decrescimento ou atividade prolactina.

Exemplos de doenças que iriam se beneficiar da administraçãodo antagonista de polipeptídeo devem ser evidentes para a pessoa versada epodem ser qualquer doença ou condição que envolve a ativação ou ativaçãoaumentada de hormônio de crescimento ou transdução de sinal de receptorprolactina.

Em um método preferido da invenção dita doença ou condiçãoé selecionada a partir do grupo consistindo de: gigantismo, acromegalia;câncer (e.g. tumor de Wilm, sarcoma osteogênico, mama, colo, próstata,tireóide); retinopatia diabética; nefropatia diabética e outras complicações dediabetes e excesso de GH.

Como usado neste lugar, o termo "câncer" se refere a célulastendo a capacidade para crescimento autônomo, i.e., um estado ou condiçãoanormal caracterizada por crescimento celular rapidamente proliferante. Otermo é pretendido para incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ouprocessos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos, ou órgãosmalignamente transformados, independente de tipo histopatológico ou estágiode invasão. O termo "câncer" inclui malignidades dos vários sistemas deórgãos, tal como aquelas afetando, por exemplo, pulmão, mama, tireóide,linfóide, gastrointestinal, e trato geniturinário, assim como adenocarcinomasque incluem malignidades tal como a maioria dos cânceres de colo, carcinomade célula renal, câncer de próstata e/ou tumores testiculares, carcinoma decélula não pequena do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer doesôfago. O termo "carcinoma" é reconhecido na arte e se refere amalignidades de tecidos epiteliais ou endócrinos incluindo carcinomas desistema respiratório, carcinomas de sistema gastrointestinal, carcinomas desistema geniturinário, carcinomas testiculares, carcinomas de mama,carcinomas prostáticos, carcinomas de sistema endócrino, e melanomas.Carcinomas exemplares incluem aqueles que se formam a partir de tecido dacérvice, pulmão, próstata, mama, cabeça e pescoço, colo e ovário. O termo"carcinoma" também inclui carcinosarcomas, e.g., o que inclui tumoresmalignos compostos de tecidos carcinomatosos e sarcomatosos. Um"adenocarcinoma" se refere a um carcinoma derivado de tecido glandular ouno qual as células de tumor formam estruturas glandulares reconhecíveis. Otermo "sarcoma" é reconhecido na arte e se refere a tumores malignos dederivação mesenquimal.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum método para modificar a atividade antagonista de um polipeptídeo deacordo com a invenção compreendendo as etapas de:

i) fornecer um polipeptídeo codificado por uma molécula deácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo de:

a) uma molécula de ácido nucleico consistindo de a seqüênciacomo representado em Figura 1 (SEQ ID NO: 1);

b) uma molécula de ácido nucleico compreendendo seqüênciasque hibridizam com a seqüência identificada em (a) caracterizada pelo fato deque dita molécula de ácido nucleico inclui uma modificação compreendendouma seqüência que codifica resíduo de aminoácido 176 caracterizada pelofato de que dita modificação resulta na adição, substituição ou deleção de pelomenos um resíduo de aminoácido e dita molécula de ácido nucleico codificaum polipeptídeo com atividade agonista de receptor de hormônio decrescimento

ii) mutar um códon que codifica um primeiro resíduo deaminoácido de dito polipeptídeo para produzir um polipeptídeo variante;

iii) determinar a atividade inibidora do polipeptídeo variantecom respeito a ativação de receptor de hormônio de crescimento com issoidentificando uma variante funcional de dito polipeptídeo.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum antagonista de polipeptídeo variante obtido ou viável pelo método deacordo com a invenção.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum método para a concepção racional de mutações em um polipeptídeocompreendendo as etapas de:

i) fornecer um modelo 3D de um primeiro polipeptídeo comorepresentado pela seqüência de aminoácidos em Figura 2 (SEQ ID NO: 2);

ii) fornecer um modelo 3 D de um polipeptídeo variantecaracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo variante é uma variante deseqüência modificada de dito primeiro polipeptídeo que é modificado poradição, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido emFigura 2 (SEQ ID NO: 2);

iii) comparar o efeito da mutação no modelo 3 D de ditosegundo polipeptídeo quando comparado ao modelo 3D de dito primeiropolipeptídeo; e opcionalmente

iv) testar os efeitos de dita modificação na ativação de receptorde hormônio de crescimento de dito segundo polipeptídeo quando comparadoa dito primeiro polipeptídeo.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecidoum homodímero compreendendo polipeptídeos compreendendo primeiro esegundo polipeptídeo caracterizados pelo fato de que ditos polipeptídeoscompreendem uma primeira parte que inclui um polipeptídeo de acordo com ainvenção, ligada ou diretamente ou indiretamente, a uma segunda partecaracterizada pelo fato de que dita segunda parte compreende o domínioextracelular de receptor de hormônio de crescimento.

Em uma forma de realização preferida da invenção ditaprimeira parte compreende a seqüência de aminoácidos como representadoem Figura 2a (SEQ ID NO: 2) caracterizada pelo fato de que dita seqüênciade aminoácidos é modificada por adição, deleção ou substituição de pelomenos um resíduo de aminoácido em posição 176 e dita segunda partecompreendendo o domínio extracelular de receptor de hormônio decrescimento como representado pela seqüência de aminoácidos em Figura 2b(SEQ ID NO: 4), 2c (SEQ ID NO: 5) ou 2d (SEQ ID NO: 6).

Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório, aspalavras "compreendem" e "contêm" e variações das palavras, por exemplo,"compreendendo" e "compreende", significa "incluindo mas não limitado a",e não é pretendido para (e não o faz) excluir outras unidades, aditivos,componentes, números inteiros ou etapas.

Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório, osingular abrange o plural a menos que de outra maneira requerido pelocontexto. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatório deve serentendido como contemplando pluralidade assim como singularidade, amenos que de outra maneira requerido pelo contexto.

Traços, números inteiros, características, compostos, unidadesou grupos químicos descritos em conjunção com um aspecto, forma derealização ou exemplo particular da invenção devem ser entendidos comosendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, forma de realização ou exemplodescrito neste lugar a menos que incompatível com tal.

Uma forma de realização da invenção será agora descrita paraexemplo apenas e com referência às figuras seguintes

Figura 1 (SEQ ID NO: 1) é a seqüência de ácidos nucleicos depermutação circular de hormônio de crescimento GHCP07;

Figura 2a (SEQ ID NO: 2) é a seqüência de aminoácidos depermutação circular de hormônio de crescimento GHCP07; Figura 2b (SEQID NO: 4) é a seqüência de aminoácidos do domínio extracelular de receptorde hormônio de crescimento; Figura 2c (SEQ ID NO: 5) é a seqüência deaminoácidos do domínio A de receptor de hormônio de crescimento; Figura2d (SEQ ID NO: 6) é a seqüência de aminoácidos do domínio B de receptorde hormônio de crescimento.

Figura 3 é a seqüência de aminoácidos de prolactina humana(SEQ ID NO: 7);

Figura 4 é a estratégia usada para permutar circularmentehormônio de crescimento;

Figura 5 (SEQ ID NO: 8) As seqüências de nucleotídeos eaminoácidos (código de aminoácido de 3 letras) de GHCP07BHis. A mutaçãode sítio de ligação 2 é mostrada em negrito. A mudança de aminoácidoatingida pela mutação é mostrada à direita da seqüência (usando código deaminoácido de 1 letra);

Figura 6 SDS-PAGE gel mostrando a purificação deGHCP07BHis; os conteúdos das linhas são mostrados abaixo do gel e aconcentração de proteína, em mg/ml, se medida por ensaio de Bradford émostrada abaixo de cada poço;

Figura 7 A) Bioensaio de GHCP07BHis mostrando suaresposta a dose na ausência e presença de 0,5 nmol de rhGH. GHCP07BHisnão tem nenhuma atividade por si só e ele antagoniza o efeito de rhGH. B)Comparação da atividade antagonística de GHCP07BHis contra GH.G120R.As atividades de GHCP07BHis e GH.G120R são similares;

Figura 8 (SEQ ID NO: 9): As seqüências de nucleotídeos eaminoácidos (código de aminoácido de 3 letras) de GHCP07CHis. Asmutações de sítio de ligação 1 são mostradas sublinhadas e a mutação de sítiode ligação 2 é mostrada em negrito. As mudanças de aminoácidos atingidaspelas mutações são mostradas à direita da seqüência (usando código deaminoácido de 1 letra);

Figura 9 SDS-PAGE gel mostrando a purificação deGHCP07CHis; os conteúdos das linhas são mostrados abaixo do gel e aconcentração de proteína, em mg/ml, se medida por ensaio de Bradford émostrada abaixo de cada poço; e

Figura 10 A) Bioensaio de GHCP07CHis mostrando suaresposta a dose na ausência e presença de 1 nmol de rhGH. GHCP07CHis nãotem nenhuma atividade por si só e ele antagoniza o efeito de rhGH. B)Comparação da atividade antagonística de GHCP07CHis contra B2036. Asatividades de GHCP07CHis e B2036 são similares.

Definições

Molécula de ácido nucleico: Um nucleotídeo é um monômero-de inclui a base ligada a um açúcar, tal como a pirimidina, purina ou análogossintéticos destes, que quando ligados juntos formam uma molécula de ácidonucleico. Uma seqüência de ácidos nucleicos se refere à seqüência de basesem uma molécula de ácido nucleico.

Polipeptídeo: Um polímero no qual os monômeros sãoresíduos de aminoácidos que são unidos através de ligações amida. Os termos"polipeptídeo" ou "proteína" como usados neste lugar são pretendidos paraabranger qualquer seqüência de aminoácidos e incluir seqüências modificadastal como glicoproteínas. O termo "polipeptídeo" é especificamente pretendidopara abranger proteínas naturalmente ocorrentes, assim como aquelas que sãorecombinantemente ou sinteticamente produzidas.

Polipeptídeo variante: Uma variante, i.e. um polipeptídeo epolipeptídeo de referência pode diferir em seqüência de aminoácidos por umaou mais substituições, adições, deleções, truncamentos que podem estarpresentes em qualquer combinação. Entre as variantes preferidas estãoaquelas que variam de um polipeptídeo de referência por substituiçõesconservativas de aminoácidos. Tais substituições são aquelas que substituemum dado aminoácido por outro aminoácido de caracteres similares. A seguintelista não limitante de aminoácidos são consideradas substituiçõesconservativas (similares): a) alanina, serina, e treonina; b) ácido glutâmico eácido aspártico; c) asparagina e glutamina d) arginina e lisina; e) isoleucina,leucina, metionina e valina e f) fenilalanina, tirosina e triptofano. Maisaltamente preferidas são variantes que retêm a mesma função biológica que opolipeptídeo de referência do qual ela varia. Em adição, a invençãocaracteriza seqüências de polipeptídeos tendo pelo menos 75% de identidadecom as seqüências de polipeptídeos ilustradas em Figura 2, ou fragmentos epolipeptídeos funcionalmente equivalentes destes. Em uma forma derealização, os polipeptídeos têm pelo menos 85% de identidade, maispreferivelmente pelo menos 90% de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 95% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 97%de identidade, e mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com asseqüências de aminoácidos ilustradas em Figura 2.

Ácido nucleico recombinante: Um ácido nucleicorecombinante é um que tem uma seqüência que não é naturalmente ocorrenteou tem uma seqüência que é feita por uma combinação artificial de doissegmentos de outra maneira separados de seqüência. Esta combinaçãoartificial freqüentemente é realizada por síntese química ou, mais comumente,pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, e.g.,por técnicas de engenharia genética. Similarmente, uma proteínarecombinante é uma codificada por uma molécula de ácido nucleicorecombinante.

Polipeptídeo de fusão: a fusão traducional de pelo menos doispolipeptídeos para formar único polipeptídeo tipicamente fabricado como umpolipeptídeo recombinante.

Ligante peptídico: um peptídeo tipicamente curto que pode serhelicoidal e, portanto fornece uma conexão rígida entre polipeptídeos ligadosou flexível e, portanto fornece um grau de movimento rotacional entrepolipeptídeos ligados; ou uma combinação de helicoidal e não helicoidal parafornecer algum movimento rotacional entre polipeptídeos ligados. Enquantoque o fornecimento de uma região helicoidal inflexível mantém a separaçãoespecial dos domínios o fornecimento de uma região não helicoidal flexívelpossibilita que os domínios se orientem nos sítios de ligação do(s)receptor(es) de citocina. Um peptídeo é tipicamente um polímero curto deresíduos de aminoácidos.

Agente terapêutico: Este é usado em um sentido genérico einclui agentes de tratamento, agentes profiláticos, e agentes de substituição,por exemplo, agentes que aumentam ou acentuam o efeito terapêutico de umacondição que iria se beneficiar da administração dos polipeptídeos dainvenção, por exemplo, agentes imunomoduladores ou agentesquimioterapêuticos.

Domínio de ligação extracelular: se refere a uma parte de umreceptor de superfície celular que entra em contato com um ligante paraefetuar transdução de sinal mediada por receptor. Por exemplo, o domínioextracelular de receptor de hormônio de crescimento existe como doisdomínios ligados cada de aproximadamente 100 aminoácidos, o SD-100 C-terminal (domínio B) estando mais perto da superfície celular e o domínioSD-100 N-terminal (domínio A) estando mais afastado. E uma mudançaconformacional nestes dois domínios que ocorre em ligação de hormônio decrescimento ou prolactina com a formação do complexo trimérico.Internalização do complexo é seguido por uma etapa de reciclagem através daqual a molécula de receptor é regenerada para uso posterior dentro da célula.

Materiais e Métodos

O antagonista de permutação circular foi sintetizado usandouma estratégia de dois PCRs (Figura 4); o modelo para o PCR foi hormôniode crescimento que havia sido mutado em sítio de ligação 2 (G120R) ouhormônio de crescimento que havia sido mutado tanto em sítio de ligação 1como 2 (H18D, H21N, G120R, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S eI179T). Os iniciadores FOR, LINK e REV usados nas reações de PCR foramGHPermLink- (5'- tggataagggaatggtgctgccaccacagag-3' SEQ ED NO: 10), Nde-GHCP07F (5'- aattaattcatatgagcccccggactg ggcag-3' SEQ ID NO: 11) eGHCP07-XhoR (5'-aattctcgagatcttccagcctccccatc-3' SEQ ID NO: 12),respectivamente. As reações de PCR foram realizadas usando o kit EXPANDPCR (Roche) e as instruções acompanhantes foram seguidas; as temperaturasde anelamento para o primeiro e segundo PCR foram 5 50C e 45°C,respectivamente. O produto final de PCR foi ligado em pET2 1 a+ (Novagen)entre os sítios Ndel e Xhol. O plasmídeo ligado foi então transformado emcélulas XLl Blue de E. coli quimicamente competentes. Plasmídeos feitos apartir de colônias geradas pela transformação foram inicialmente verificadospor análise de restrição usando Ndel e Xhol. Clones que produziramresultados positivos na análise de restrição foram submetidos aseqüenciamento usando iniciadores de seqüenciamento de promotor T7 eterminador T7.

Um único plasmídeo, com a seqüência correta, foi escolhido etransformado em BL21 (DE3) de E. coli) quimicamente competente. Umacolônia de BL21 (DE3) de E. coli transformada com o plasmídeo foiescolhida e usada para inocular 20ml de meio LB suplementado comcarbenicilina (lOOm/ml). Depois de uma incubação com agitação durante anoite a 37°C a cultura foi usada para fornecer um inóculo de 2% para 500mlde LB suplementado com carbenicilina (lOOug/ml); este então foi cultivadoagitando a temperatura ambiente. Quando o ODóOO da cultura atingiu -0,4 acultura foi induzida com IPTG, ImM de concentração final, e então deixadaagitando durante a noite a temperatura ambiente. A cultura foi entãocentrifugada para pelotizar as células e o sobrenadante descartado.

A pelota celular foi ressuspensa em 15ml de tampão deEquilíbrio (20mM de Tampão Fosfato, 0,5M de NaC 1, 20% de glicerol,20mM de imidazol, e pH8) e então as células lisadas usando um tratamento delisozima/deoxicolato de sódio/sonicação. As células lisadas foramcentrifugadas em alta velocidade para peletizar os componentes insolúveis e osobrenadante então decantado para um novo tubo. O sobrenadante foiconstituído para 20ml usando tampão de Equilíbrio e então passado atravésde uma seringa de 0,2pm para purificar adicionalmente a amostra.

A proteína rotulada com His foi purificada usandocromatografia iônica em metal imobilizado, Resina Probond (Invitrogen)carregada com Ni2+ foi usada. Iml de resina foi carregado em uma coluna eequilibrado com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de Equilíbrio. Aamostra de proteína purificada foi então carregada na coluna. A coluna foilavada com tampão de Equilíbrio para 20CV e então com tampão de Lavagem(20mM de Tampão Fosfato, 0,5M de NaC 1, 20% de glicerol, pH6) até que oA280 do eluente fosse abaixo de 0,01. Proteína ligada foi então eluída fora dacoluna usando tampão de Eluição (2OmM de Tampão Fosfato, 0,5M de NaC 1,20% de glicerol, 0,5M de imidazol, pH6), seis frações de Iml foram coletadas.As frações eluídas foram verificadas para conteúdo por análise em gel SDS-PAGE e por ensaio protéico de Bradford.

Proteína purificada foi submetida ao bioensaio GH; atividadeantagonística foi testada considerando estimulação pela proteína de testeapenas e atividade antagonística foi testada considerando a atividade de GHna presença da proteína de teste.

Exemplo

Antagonista de hormônio de crescimento circularmentepermutado, GHCP07B (GHCP07 com a mutação em sítio 2), foi gerados porduas reações de PCR, a primeira produziu um produto de -200bp e este foiusado como um 'megainiciador' em uma segunda reação de PCR paraproduzir o gene de antagonista de hormônio de crescimento circularmentepermutado (GHCP07B) de -600bp. O fragmento de DNA de gene GHCP07Bfoi digerido NdeI e Xhol e então ligado em pET2 1 a+ que havia sido digeridopelas mesmas enzimas de restrição. Transformação deste em células XLlBlue de Ε. coli gerou -500 colônias, sem nenhuma colônia aparecendo naplaca de controle negativo (transformada com água apenas).

Três clones foram escolhidos para processamento adicional;minipreps de plasmídeos foram feitos a partir destes clones e o plasmídeoanalisado por análise de restrição, todos os três clones geraram um padrão dedigestão correto. Estes plasmídeos foram então seqüenciados e a seqüênciaresultante comparada com a seqüência desejada (Figura 5); dois dos trêsplasmídeos geraram a seqüência correta. Um destes plasmídeos foi entãoescolhido para expressar e purificar GHCP07BHis.

O plasmídeo foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli ecultivado. As células resultantes foram lisadas e proteína rotulada com Hispurificada a partir da fração solúvel usando uma coluna de Ni-quelado. Aproteína eluídas foi analisada por SDS-PAGE e Ensaio Protéico de Bradford(Figura 6); um total de -25mg de proteína foi purificado para >90% pura.

Eluição 3 da purificação foi usada no bioensaio e um intervalode dose da atividade de GHCP07BHis foi medido sozinho e também napresença de 0,5nmol de rhGH. Isto mostrou que GHCP07BHis não tevenenhuma atividade agonística e que ele teve atividade antagonística (Figura7A). A atividade de GHCP07BHis foi comparável com aquela de GH.G12OR(Figura 7B).

Antagonista de hormônio de crescimento circularmentepermutado, GHCP07C (GHCP07 com as mutações em sítio 1 e sítio 2), foigerado e analisado da mesma maneira que GHCP07B. A seqüência deGHCP07C é mostrada em Figura 8; a purificação da proteína é mostrada emFigura 9. Eluição 1 da proteína purificada foi usada no bioensaio. Istomostrou que GHCP07C não teve nenhuma atividade agonística e era umpotente antagonista (Figura 10A) com atividade comparável a B2036(hormônio de crescimento tanto com as mutações em sítio 1 como sítio 2)(Figura 10B).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Asterion Limited

<120> Antagonista de polipeptídeo

<130> 0313P/WO

<14 O > PCT/GB2 007/001285

<141> 2007-04-05

<150> 0606946.2<151> 2006-04-06

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 566

<212 > DNA

<213 > artificial

<220>

<223> Hormônio de crescimento permutado circularmente<400> 1

atgagccccg gactgggcag atcttcaagc agacctacag caagttcgac acaaactcac 6 0

acaacgatga cgcactactc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg 12 0

acaaggtcga gacattcctg cgatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gcaccattcc 180

cttatccagg ctttttgaca acgctagtct ccgcgcccat cgtctgcacc agctggcctt 240

tgacacctac caggagtttg aagaagccta tatcccaaag gaacagaagt attcattcct 300

gcagaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt ccgacaccct ccaacaggga 360

ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc tccctgctgc tcatccagtc 420

gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc aacagcctgg tgtacggcgc 480

ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag gaagggcatc caaacgctga 540

tggggaggct ggaagatctc gagtga 566

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Hormônio de crescimento permutado circular<400> 2

Met Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe1 5 10 15Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu20 25 30

Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg35 40 45

Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Thr Ile Pro Leu Ser Arg50 55 60

Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala65 70 75 80

Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln85 90 95

Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu100 105 110

Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn115 120 125

Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu130 135 140

Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly145 150 155 160

Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly165 170 175

Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Leu Glu180 185

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptídeo ligador

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser1 5

<210> 4

<211> 246

<212 > PRT

<213 > Homo sapiens<400> 4

Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp1 5 10 15

Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu20 25 30

Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys35 40 45

His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile50 55 60

Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp65 70 75 80

Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe85 90 95

Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr100 105 110

Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile115 120 125

Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val130 135 140

Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro145 150 155 160

Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu165 170 175

Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile180 185 190

Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr195 200 205

Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu210 215 220

Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr225 230 235 240Cys Glu Glu Asp Phe Tyr245

<210> 5

<211> 126

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp15 10 15

Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu20 25 30

Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys35 40 45

His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile50 55 60

Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp65 70 75 80

Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe85 90 95

Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr100 105 110

Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp115 120 125

<210 > 6

<211> 120

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu15 10 15

Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu20 25 30

Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr35 40 45

Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp50 55 60

Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys65 70 75 80

Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr85 90 95

Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln100 105 110

Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr115 120

<210> 7

<211> 199

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg1 5 10 15

Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu20 25 30

Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg35 40 45

Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala50 55 60

Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe65 70 75 80

Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr85 90 95

His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile100 105 110

Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu115 120 125

Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn130 135 140

Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp

Claims (60)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de quecompreende uma seqüência como representado em SEQ ID NO: 1 quecodifica um polipeptídeo como representado em SEQ ID NO: 2, em que aseqüência de aminoácidos é modificada para incluir uma adição, deleção ousubstituição de aminoácido de resíduo de aminoácido 176.

2. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de quecompreende uma seqüência como representado em SEQ ID NO: 1 quecodifica um polipeptídeo como representado em SEQ ID NO: 2.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptídeo compreendendouma seqüência de aminoácidos como representado em SEQ ID NO: 9.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que dita molécula codificaum polipeptídeo antagonista de hormônio de crescimento.

5. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende aseqüência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 2, cuja seqüência foimodificada por adição, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo deaminoácido, em que dita modificação inclui resíduo de aminoácido 176 e emque dito polipeptídeo é um antagonista de receptor de hormônio decrescimento.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que dito polipeptídeo é modificado por substituição de glicina emposição 176 com um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindode: histidina, ácido aspártico, valina, arginina, alanina, lisina, triptofano,tirosina, fenilalanina e ácido glutâmico.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que arginina ou lisina ou alanina são substituídas por resíduo deglicina 176.

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que dita modificação é glicina por arginina.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5-8, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo érepresentado pela seqüência de aminoácidos em SEQ ID NO: 9.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5-9, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo é ligado aum segundo polipeptídeo compreendendo o domínio de ligação extracelularde receptor de hormônio de crescimento.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que dito segundo polipeptídeo consiste do domínioextracelular de receptor de hormônio de crescimento.

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que dito segundo polipeptídeo consiste daseqüência de aminoácidos como representado em SEQ ID NO: 4.

13. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que dito domínio extracelular é o domínio A dodomínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento consistindo daseqüência de aminoácidos como representado em SEQ ID NO: 5.

14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que dito domínio extracelular é o domínio B dodomínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento consistindo daseqüência de aminoácidos como representado em SEQ ID NO: 6.

15. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de quecompreende pelo menos dois polipeptídeos como definidos em qualquer umadas reivindicações 5-9 ligados em tandem.

16. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo de fusão consiste de doispolipeptídeos ligados em tandem.

17. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de quecompreende uma pluralidade de polipeptídeos como definido em qualqueruma das reivindicações 5-9.

18. Polipeptídeo de fusão de acordo com qualquer uma dasreivindicações 10-17, caracterizado pelo fato de que ditos polipeptídeos sãoligados juntos por uma molécula ligante peptídico.

19. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que dita molécula de ligação de peptídeo é umligante peptídico flexível.

20. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 18 ou-19, caracterizado pelo fato de que o ligante é um peptídeo que consiste de 5 a-30 resíduos de aminoácidos.

21. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico consiste de 10 a 20 resíduosde aminoácidos.

22. Polipeptídeo de fusão de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18-20, caracterizado pelo fato de que o ligante compreendepelo menos uma cópia do peptídeo:Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (referidos como Gly4Ser) (SEQ ID NO:-3).

23. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é de 10 aminoácidos decomprimento e compreende duas cópias do Gly4Ser.

24. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é de 15 aminoácidos decomprimento e compreende três cópias do Gly4Ser.

25. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é de 20 aminoácidos decomprimento e compreende quatro cópias do ligante Gly4Ser.

26. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de quecompreende pelo menos dois polipeptídeos como definidos em qualquer umadas reivindicações 5-9, em que dito polipeptídeo compreende adicionalmentepelo menos um domínio de ligação extracelular de receptor de hormônio decrescimento.

27. Polipeptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo de fusão consiste de doispolipeptídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 5-9 e umdomínio de ligação extracelular de receptor de hormônio de crescimento.

28. Polipeptídeo de fusão quimérico, caracterizado pelo fato deque compreende um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 5-9 ligado, ou diretamente ou indiretamente, a um polipeptídeode prolactina.

29. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 28, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo deprolactina compreende uma seqüência de aminoácidos em que dita seqüênciade aminoácidos é modificada em posição 129 de prolactina humana comorepresentado em SEQ ID NO 7, ou um aminoácido equivalente em umpolipeptídeo de prolactina alternativo.

30. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 29, caracterizado pelo fato de que dita modificação em posição-129 como representado em SEQ ID NO: 7 é uma substituição de aminoácido.

31. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dita substituição substituiresíduo de aminoácido de glicina com resíduo de aminoácido de arginina.

32. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com qualqueruma das reivindicações 28-31, caracterizado pelo fato de que ditopolipeptídeo de prolactina compreende adicionalmente a deleção de pelomenos 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 resíduos de aminoácidos amino terminais.

33. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com qualqueruma das reivindicações 29-32, caracterizado pelo fato de que ditopolipeptídeo compreende adicionalmente um domínio de ligação de ligante deum receptor de citocina.

34. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que dito receptor de citocinacompreende um domínio de ligação extracelular de receptor de hormônio decrescimento.

35. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 34, caracterizado pelo fato de que dito receptor de citocinacompreende um domínio de ligação extracelular de receptor de prolactina.

36. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 34, caracterizado pelo fato de que dito receptor de citocinaconsiste do domínio extracelular de receptor de hormônio de crescimento.

37. Polipeptídeo de fusão quimérico de acordo com areivindicação 35, caracterizado pelo fato de que dito receptor de citocinaconsiste do domínio extracelular de receptor de prolactina.

38. Molécula de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de quecodifica um polipeptídeo de fusão ou quimérico como definido em qualqueruma das reivindicações 10-37.

39. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende umamolécula de ácido nucleico como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-3 ou 38.

40. Vetor de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelofato de que dito vetor é adaptado para a expressão recombinante de ditamolécula de ácido nucleico.

41. Célula, caracterizada pelo fato de ser transfectada com umamolécula de ácido nucleico como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-3 ou 38, ou um vetor como definido na reivindicação 39 ou

42. Célula, caracterizada pelo fato de ser transformada comuma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma dasreivindicações 1-3 ou 38, ou um vetor como definido na reivindicação 39 ou 40.

43. Célula de acordo com a reivindicação 41, caracterizadapelo fato de que dita célula é uma célula eucariótica.

44. Célula de acordo com a reivindicação 42, caracterizadapelo fato de que dita célula é uma célula procariótica.

45. Método para a fabricação de um polipeptídeo,caracterizado pelo fato de que compreende: i) fornecer uma célula como definida em qualquer uma dasreivindicações 41-44; ii) incubar dita célula em condições conducentes para aprodução de dito polipeptídeo; e opcionalmente iii) isolar dito polipeptídeo de dita célula ou do meio decrescimento circundando dita célula.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que dito polipeptídeo é fornecido com uma etiqueta de afinidadede aminoácido para facilitar o isolamento de dito polipeptídeo.

47. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5-37, caracterizado pelo fato de ser para uso como produtofarmacêutico.

48. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3 ou 38, caracterizado pelo fato de ser para uso comoproduto farmacêutico.

49. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 3-36 e incluindo um excipiente ou carreador.

50. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender uma molécula de ácido nucleico como definido em qualqueruma das reivindicações 1-3 ou 38 e incluindo um excipiente ou carreador.

51. Composição de acordo com a reivindicação 50,caracterizada pelo fato de que dita molécula de ácido nucleico é parte de umvetor.

52. Composição de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de que dito vetor é um vetor de expressão adaptadopara expressão eucariótica.

53. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 49-52, caracterizada pelo fato de que dita composição écombinada com um agente terapêutico adicional.

54. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 5-37, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para o tratamento de uma condição selecionada a partir dogrupo consistindo de: gigantismo, acromegalia, câncer; retinopatia diabética;nefropatia diabética e outras complicações de diabetes e excesso de GH.

55. Método para o tratamento de um animal, caracterizadopelo fato de compreender administrar uma quantidade eficaz de umpolipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 5-37 a ditoanimal com necessidade de tratamento de uma doença ou condição que iria sebeneficiar de inibição de hormônio de crescimento ou atividade prolactina.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizadopelo fato de que dita doença ou condição é selecionada a partir do grupoconsistindo de: gigantismo, acromegalia, câncer; retinopatia diabética;nefropatia diabética e outras complicações de diabetes e excesso de GH.

57. Método para a modificação da atividade antagonista de umpolipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:i) fornecer um polipeptídeo codificado por uma molécula deácido nucleico compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos comorepresentado em SEQ ID NO: 1; eii) mutar um códon que codifica um primeiro resíduo deaminoácido de dito polipeptídeo para produzir um polipeptídeo variante.

58. Antagonista de polipeptídeo variante, caracterizado pelofato de ser obtido ou viável pelo método como definido na reivindicação 57.

59. Método para a concepção racional de mutações em umpolipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:i) fornecer um modelo 3D de um primeiro polipeptídeo como10 representado pela seqüência de aminoácidos em SEQ ID NO: 2;ii) fornecer um modelo 3 D de um polipeptídeo variante emque dito polipeptídeo variante é uma variante de seqüência modificada de ditoprimeiro polipeptídeo que é modificado por adição, deleção ou substituição depelo menos um resíduo de aminoácido como representado em SEQ ID NO: 2;iii) comparar o efeito da mutação no modelo 3D de ditosegundo polipeptídeo quando comparado ao modelo 3 D de dito primeiropolipeptídeo; e opcionalmente; eiv) testar os efeitos de dita modificação em ativação dereceptor de hormônio de crescimento pelo segundo polipeptídeo quandocomparado ao primeiro polipeptídeo.

60. Homodímero, caracterizado pelo fato de que compreendedois polipeptídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 10-14