TWI719963B - 含有白蛋白及其類似物之融合蛋白之組合物、其製備及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於人類體抑素(例如，SST-14或SST-28)與人類血清白蛋白之融合蛋白，其包含與人類體抑素至少85%同源之區域及與人類血清白蛋白至少85%同源之區域或具有人類血清白蛋白之部分胺基酸序列之區域，其中連接子肽序列可存在於體抑素與體抑素部分之間或體抑素與白蛋白部分之間。亦揭示構築體，其中該體抑素部分含有體抑素序列之多個串聯重複段。在所選實施例中，體抑素及白蛋白部分之取向可改變，且此等序列可影響該等所揭示融合蛋白之結合及效能。亦揭示上文所提及之構築體之製備及使用方法。
Description
本申請案主張2015年2月26日提出申請之美國臨時專利申請案第US 62/121,487號之優先權之權益，該案之內容係以引用方式併入本文中。
本發明係關於包含體抑素(或其類似物或衍生物)、連接子或間隔子及白蛋白(或其類似物或變體)之融合蛋白。
本發明亦係關於含有藉由間隔子序列及其類似物分隔之人類血清白蛋白部分及體抑素部分之重組融合蛋白。
體抑素(「SST」)係各種內分泌及非內分泌組織之分泌產物且廣泛分佈於整個身體。體抑素抑制垂體、胰臟及胃腸激素分泌釋放，以及細胞介素產生、腸能動力及吸收、血管收縮性及細胞增殖。最近研究已發現，SST具有治療癌症之用途，其抑制腫瘤生長、抑制內分泌腫瘤及許多其他實體腫瘤(例如乳癌、結腸直腸癌、肝癌及肺癌)之增殖。體抑素分子具有兩種生物活性形式：體抑素-14(SST-14，環狀十四肽)及體抑素-28(SST-28，SST-14之N-端延長形式)。SST-14係長度為14個殘基之環狀肽，其在第3位與第14位之半胱胺酸之間含有二硫
鍵。SST-28係相同前體之N端延長形式(28個殘基)，其經蛋白水解裂解以生成SST-14。雖然二者具有類似活性，但是其各別效能及組織學特性不同。舉例而言，SST-14展現更顯著之對升糖素及胃泌激素之抑制，而SST-28展現更顯著之對生長激素及胰島素作用之抑制。體抑素之兩種形式均藉助靶細胞上之受體及細胞內路徑發揮其各別生物學功能。已識別出5種體抑素受體亞型(SSTR 1-5)，SSTR2具有兩種具有不同羧基端之剪接變體：SSTR2A及SSTR2B。
業內已充分認識到體抑素對治療某些過度分泌內分泌病症之有益效應及其對腫瘤之抗增殖效應。然而，由於酶催降解及胞吞作用，體抑素之活體內半衰期僅為2-3min，從而限制了體抑素之臨床實用性。在過去的十年中，已開發出數種穩定的體抑素類似物。舉例而言，奧曲肽(octreotide)及蘭瑞肽(lanreotide)係用於治療生長激素(GH)-分泌型腺瘤及類癌。然而，由於對SSTR之結合親和性改變，仍然存在治療侷限性。因此，此項技術中仍然需要達成高活體內半衰期並同時維持對SSTR之期望結合親和性之體抑素構築體。
血漿中最豐富之蛋白質白蛋白係在肝臟中作為67kDa之單體蛋白質產生且其產生血漿中80%之膠體滲透壓。與HSA融合之人類顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、人類生長激素(GH)、人類胰島素、人類干擾素-a-2b(INF-2b)及介白素-28B(IL-28B)有效地用於構築長效候選治療藥物。然而，在HSA融合蛋白與親本分子之間在生物學及分子機制方面之比較研究之報告較少。
中國專利申請案CN102391376A及CN102675467A(二者皆以引用的方式併入本文中)揭示體抑素-白蛋白融合蛋白。然而，仍然需要進一步開發體抑素-白蛋白融合蛋白。
本發明提供體抑素-白蛋白融合蛋白及其類似物、及其產生及使
用方法。根據本發明所製備之構築體包括白蛋白(或其類似物)部分、體抑素部分(SST-14、SST-28)及分隔該兩部分之間隔子(例如間隔子肽或連接子肽)。
在一個實施例中，本發明提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白或多肽序列之核苷酸序列，其包含：(a)包含編碼人類體抑素肽(SST)之核苷酸序列之區域；(b)包含編碼人類血清白蛋白或其片段(ALB)之核苷酸序列之區域；(c)包含編碼長度為2至100個殘基之多肽之核苷酸序列之間隔子區域(L)；其中，間隔子區域(c)存在於區域(a)與區域(b)之間，或區域(a)與區域(a)之間。
在具體實施例中，視情況選擇核苷酸序列以編碼由如下之式I-X之一者組成之白蛋白-體抑素融合蛋白。
SST-(L)x1-ALB (I)；ALB-(L)x1-SST (II)；[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；及ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；其中，
x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自獨立地係0或選自1至10之整數，前提係至少一個L存在於編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列中。
根據本發明之融合蛋白在本文中亦描述為多肽。根據本發明之多肽在某些實施例中可視情況包括一或多種非天然胺基酸或胺基酸殘基。
體抑素-白蛋白融合蛋白及其類似物大致包括人類SST肽部分、連接子或間隔子及人類白蛋白部分。SST肽部分可包括其主動抑制人類生長激素活性之類似物及衍生物。視情況，SST肽部分係自天然或合成來源獲得。白蛋白部分係(例如)人類白蛋白及/或其活性片段或亞域。選擇連接子或間隔子以增強體抑素-白蛋白融合蛋白之穩定性。更具體而言，體抑素-白蛋白融合蛋白及其類似物具有如以下之結構。
在一實施例中，本發明提供融合蛋白，其包含：(a)包含人類體抑素肽(SST)之區域；(b)包含人類血清白蛋白或其片段(ALB)之區域；(c)包含長度為2至100個殘基之多肽之間隔子區域(L)；其中，間隔子區域(c)係存在於區域(a)與區域(b)之間，或區域(a)與區域(a)之間。
在另一實施例中，本發明包括融合蛋白，其包含選自如下之式I-X之結構：SST-(L)x1-ALB (I)；ALB-(L)x1-SST (II)；[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；及ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；其中，x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自獨立地係0或選自1至10之整數，前提係至少一個L存在於融合蛋白中。
在本發明之另一實施例中，x1、x2、x3、x4各自獨立地係選自1至5之整數，或1至4之整數。在本發明之又一實施例中，y1、y2、y3各自獨立地係選自1至5之整數，或自1至4之整數。
在本發明之更具體實施例中，SST部分包含編碼SST-14或SST-28(分別表示為SEQ ID NO：17或18)之序列或與該等序列之任一者具有至少85%一致性之序列之一或多個串聯重複段。
SST部分視情況為SST-14或SST-28。
在某些實施例中，本發明之體抑素-白蛋白融合蛋白包括白蛋白之變體，包括哺乳動物血清白蛋白，例如人類血清白蛋白，例如具有SEQ ID NO：25，或與之具有至少85%序列一致性之序列。
根據本發明之另一實施例之連接子或間隔子涵蓋在一個端上共價連接至體抑素且在另一個端上共價連接至白蛋白之肽。在本發明之另一實施例中，間隔子包括具有2至100個胺基酸殘基之肽序列。
術語「連接子」或「間隔子」在本文中可互換使用，係指用於分隔單一蛋白質中之多個結構域之短胺基酸序列。在蛋白質中兩個或
更多個離散域之間缺少連接子可導致蛋白質結構域之功能性降低或不當，例如，由於立體阻礙，催化活性或對受體/配體之結合親和性降低。在嵌合蛋白質中使用人造連接子之連接蛋白質結構域可增加結構域間之空間。較佳地，連接子或間隔子之選擇與體抑素及白蛋白無關。
連接子L係撓性或α螺旋結構化多肽連接子或間隔子。在某些實施例中，L含有至少一個GGGGS、A(EAAAK)4A、(AP)n(其中n係選自10至34之整數)、(G)8、(G)5或其任何組合。
本文中所闡述之白蛋白-體抑素融合構築體亦可包括信號肽序列(「SP」)。信號肽係理解為指存在於多肽之N-端處之短胺基酸序列，其引導新合成蛋白質之細胞定位。舉例而言，信號肽可使得蛋白質定位至給定細胞內區域(例如，細胞核)、插入至膜中(例如，細胞膜或內質網)或自細胞分泌。除引導定位之外，信號肽亦可併入至重組蛋白中以改良穩定性、改變表現程度及幫助重組蛋白之適當摺疊。前體蛋白質之信號肽序列通常藉由宿主細胞中之信號肽酶去除以產生成熟蛋白質。
本文中所闡述之白蛋白-體抑素融合構築體亦可包括親和或純化標籤，其作為多肽序列之一部分以促進純化。此等標籤係用作親和層析方法(例如，高效液相層析(HPLC))之一部分，以自粗生物源純化蛋白質樣本。適宜純化標籤包括(但不限於)：聚組胺酸(例如，His-6或H6)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、幾丁質結合蛋白(CBP)、FLAG-標籤(FLAG八肽)。當需要自融合蛋白去除親和標籤時，可在連接子區域中引入特定酶裂解位點。通常用於去除親和標籤之酶包括(但不限於)：Xa因子、腸激酶、凝血酶、TEV蛋白酶及鼻病毒3C蛋白酶。
本發明亦提供藉由投與有效量之包含本發明融合蛋白之醫藥組
合物來治療哺乳動物(例如人類個體)之內分泌釋放之疾病或病症之方法，其中該內分泌釋放之疾病或病症係對體抑素之投藥有反應之病狀。
舉例而言，該疾病或病症係選自由以下組成之群之癌症：乳癌、結腸直腸癌、肝癌、內分泌癌、神經內分泌癌、胰臟癌、前列腺癌及肺癌。在某些實施例中，癌症表現體抑素受體類型1、2、3、4或5。
亦應理解，在本申請案中通篇使用單數形式(例如「一(a)」、「一(an)」及「該」)係出於方便之目的，然而，除非上下文或明確陳述中另有指示，否則該等單數形式意欲包括複數含義。此外，應理解在本文中所提及之每一期刊論文、專利、專利申請案、公開案及諸如此類係以全文引用的方式併入本文中，並用於所有目的。
所有數值範圍應理解為包括此數值範圍內之每一數值點，且應解釋為個別地列舉每一數值點。針對相同組份或性質之所有範圍的終點均包括在內，且意欲可獨立地組合。
如本文所用，術語「約」意指在所報告數值之10%內、較佳地在所報告數值之5%內。
片語「基本上由......組成」意指組合物或方法可包括額外成份及/或步驟，但僅在該等額外成分及/或步驟不實質性改變所主張組合物或方法之基本及新穎特性時如此。
本申請案之SST與白蛋白之融合蛋白提供超過天然SST之優點：(a)更高之活體內穩定性，(b)更高之與SST受體之結合親和性，(c)更高之蛋白質表現產率，及(d)更佳藥物動力學/藥效學特徵。
在下文詳細闡述本發明之前，應理解，由於本文所述之具體方法、方案及試劑可變，故本發明並不限於該等要素。亦應理解，本文所使用之術語僅出於闡述具體實施例之目的而非意欲限制本發明之範
圍，本發明之範圍僅受限於隨附申請專利範圍。除非另外界定，否則本文中所使用之所有技術及科學術語皆具有一般技術者所普遍理解之相同意義。
本發明涵蓋體抑素-白蛋白融合蛋白及其類似物及其產生及使用方法。根據本發明所製備之構築體包括白蛋白(或其類似物)部分、體抑素部分(例如，SST-14、SST-28)及分隔該兩部分之間隔子。
本發明之某些實施例之體抑素-白蛋白融合蛋白包括白蛋白之變體(包括人類血清白蛋白)及/或體抑素之衍生物。本發明之另一實施例之間隔子涵蓋在一個端上共價連接至體抑素且在另一個端上共價連接至白蛋白之肽。本發明之其他實施例中之間隔子包括具有2至100個胺基酸之肽序列。
在一實施例中，本發明提供融合蛋白，其包含：SST；L；及ALB，其中，SST係體抑素或其類似物或衍生物；L係間隔子或連接子；ALB係白蛋白或其類似物或變體。
在某些實施例中，本發明之融合蛋白係選自如下之式I-X。
SST-(L)x1-ALB (I)；ALB-(L)x1-SST (II)；[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；及ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；其中，x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自獨立地係0或選自1至10之整數，前提係至少一個L存在於融合蛋白中。
在又一實施例中，本發明提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白包含：SST；L；及ALB，其中，SST係體抑素或其類似物或衍生物；L係間隔子或連接子；ALB係白蛋白或其類似物或變體。
在某些實施例中，選擇本發明之核苷酸序列以編碼來自以下中之白蛋白-體抑素融合蛋白，SST-(L)x1-ALB (I)；ALB-(L)x1-SST (II)；[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；及ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；其中，x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自獨立地係0或選自1至10之整數，前提係至少一個L存在於編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列中。
本發明之另一實施例提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列，其中間隔子序列係由編碼表示為SEQ ID NO：31或-GGGGS-之胺基酸序列之序列組成。
本發明之另外某一實施例提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列，其中第二區域(b)編碼與SEQ ID NO：19(白蛋白或其片段)具有至少85%序列一致性之多肽。
本發明之一個實施例提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列，其中第一區域(a)編碼與SEQ ID NO：17或18(SST-14、SST-28)或其片段具有至少85%序列一致性之多肽。
本發明亦提供編碼白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列，其包含：(a)包含含有編碼人類體抑素肽之序列之一或多個相鄰重複之核苷酸序列之區域；
(b)包含編碼人類血清白蛋白或其片段之核苷酸序列之區域；(c)包含編碼長度為2至100個殘基之多肽之核苷酸序列之間隔子區域；其中，間隔子區域(c)係存在於區域(a)與區域(b)之間或區域(a)與區域(a)之間；其中，編碼人類體抑素肽之序列之一或多個相鄰重複編碼SST-14或SST-28(如分別表示為SEQ ID NO：17及18)，或與該兩種序列之一者具有至少85%一致性之序列；或其中間隔子序列係由編碼表示為SEQ ID NO：31或GGGGS或表示為SEQ ID NO：30A(EAAAK)4A)之胺基酸序列之序列組成；或其中，區域(a)係由SST-14或SST-28(如分別表示為SEQ ID NO：23及24)之一或多個相鄰重複或與該兩種序列之任一者具有至少85%一致性之序列組成。
此外，本發明提供白蛋白-體抑素融合蛋白之多肽序列，其包含：(a)包含體抑素肽(其可為人類體抑素肽)之多肽序列之區域；(b)包含血清白蛋白(其可為人類血清白蛋白)或其片段之多肽序列之區域；(c)包含長度為2至100個殘基之多肽之間隔子區域。
間隔子區域(c)可存在於區域(a)與區域(b)之間或在區域(a)與區域(a)之間。另外，區域(a)可包含編碼SST-14或SST-28之序列(分別表示為SEQ ID NO：17或18)或與該等序列之一者具有85%一致性之序列之一或多個串聯重複段。
本發明之另一實施例提供質體構築體，其表現具有上文所述之任何融合蛋白或多肽序列之白蛋白-體抑素融合蛋白。
本發明之又一實施例包括利用上文所述之質體構築體所轉化之
細菌細胞。
本發明之另一實施例包括經分離及純化且具有上文所述之多肽序列(例如，白蛋白-體抑素融合蛋白或表現此蛋白質之質體構築體之多肽序列)之白蛋白-體抑素融合蛋白。
對於融合蛋白(例如SEQ ID NO：1-5、7-10及13-16)而言，應注意，該等融合蛋白係作為具有22個殘基之信號肽(SEQ ID NO：20)之前蛋白來編碼。
本發明涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分係藉由與內源性人類SST-14或SST-28之核苷酸序列(分別為SEQ ID No：23及24)具有至少85%序列一致性之核苷酸編碼。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中人類血清白蛋白部分係藉由與內源性人類血清白蛋白之核苷酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少85%序
列一致性之核苷酸編碼。本發明進一步涵蓋多肽構築體，其中人類血清白蛋白部分係內源性人類血清白蛋白蛋白質之片段，例如，其中其係藉由由SEQ ID NO：25之子序列組成之核苷酸編碼。舉例而言，人類血清白蛋白片段視情況包括三個人類血清白蛋白球狀結構域之一或多個，其每一者含有兩個亞結構域，稱為亞結構域IA、IB、IIA、IIB、IIIA及IIIB(Dockal,1999,The Journal Of Biological Chemistry, 274(41)：29303-29310)。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分具有與內源性SST-14或SST-28之多肽序列(分別為SEQ ID NO：17及18)具有至少85%、較佳至少90%之序列一致性之多肽序列。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中人類血清白蛋白部分具有與成熟人類血清白蛋白之多肽序列(SEQ ID NO：19)具有至少85%序列一致性之多肽序列。
本發明亦涵蓋融合蛋白，其包含信號肽、純化標籤(His-6)、第一連接子、人類血清白蛋白部分、第二連接子及體抑素部分。在一個實施例中，融合蛋白係表示為SEQ ID NO：9之多肽或與之具有85%序列一致性之序列。
本發明亦涵蓋融合蛋白，其包含體抑素部分、第一連接子、人類血清白蛋白部分、第二連接子、體抑素部分及純化標籤(His-6)。在一個實施例中，融合蛋白係表示為SEQ ID NO：10之多肽或與之具有85%序列一致性之序列。
本發明亦涵蓋核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，其編碼包含藉由肽間隔子所分隔之N-端人類血清白蛋白部分及C-端體抑素部分之融合蛋白。本發明進一步涵蓋核苷酸序列，其編碼具有與SEQ ID NO：11具有85%序列一致性之白蛋白-體抑素融合構築體。
本發明亦涵蓋核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，其編碼包含藉由肽
間隔子所分隔之N-端體抑素部分及C-端人類血清白蛋白部分之融合蛋白。本發明進一步涵蓋核苷酸序列，其編碼具有與SEQ ID NO：12具有85%序列一致性之白蛋白-體抑素融合構築體。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分包含串聯排列之SST-14或SST-28序列之兩個或更多個拷貝，即分別為「(SST-14)2」或「(SST-14)3」或「(SST-28)2」或「(SST-28)3」。視情況，連接子序列係包括在兩個或更多個串聯體抑素部分之間，及/或信號肽序列係包括在融合蛋白之N-端處。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分包含SST-14序列之兩個或更多個拷貝，其係以至少一個SST14拷貝分別連接在白蛋白之兩側之方式而排列。視情況，連接子序列係包括在兩個或更多個串聯體抑素部分之間及在體抑素與白蛋白之間，及/或信號肽序列係包括在融合蛋白之N-端處。舉例而言，多肽構築體可包括信號肽、藉由間隔子分離之兩個SST-14部分、第二間隔子及HSA部分作為代表。視情況，構築體省略N-端信號肽。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分包含串聯排列之SST-28序列之兩個或三個拷貝，即分別為「(SST-28)2」或「(SST-28)3」。視情況，連接子序列係包括在兩個或更多個串聯體抑素部分之間。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其包含在前面段落中所述之任何白蛋白-體抑素融合蛋白，其中白蛋白-體抑素融合蛋白之活體內半衰期長於內源性SST-14或SST-28肽。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其包含在前面段落中所述之任何白蛋白-體抑素融合蛋白，其中白蛋白-體抑素融合蛋白具有與內源性SST-14或SST-28相比大致相等或更大之對體抑素受體之結合親和性。
本發明亦涵蓋白蛋白-體抑素融合蛋白，其包含表示為SEQ ID
NO：15、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：2之N-端白蛋白部分、內部SST部分及表示為SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之C-端白蛋白部分。視情況，N-端可進一步包括信號肽。視情況，一或多個白蛋白及SST結構域可各自藉由獨立選擇之連接子序列(如表示為SEQ ID NO：1)分隔。
在一些實施例中，SST部分可包含一對或複數個串聯SST序列，例如，(SST-14)2或(SST-28)3，且在兩個或更多個串聯SST重複之間含有或不含中間間隔序列。視情況，一或多個純化標籤序列可包括於兩個部分之間或在N-端或C-端處之序列中以協助融合蛋白之純化。替代實施例包括藉由間隔子分隔之一對SST-14部分，如SEQ ID NO：4所表示。另一實施例可省略純化標籤(例如，His6)，如表示為SEQ ID NO：5之多肽序列所顯示。
本發明所使用之體抑素可係任何體抑素、其類似物或衍生物。其可係人類體抑素或任何其他經分離或天然體抑素。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分包含體抑素類似物。較佳地，此一類似物適於在重組宿主細胞中作為融合蛋白之一部分來表現。應理解，適宜體抑素類似物序列可用於代替包括於本文所揭示之任何實例中之SST-14或SST-28序列。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中體抑素部分包含體抑素多肽序列(例如，分別為SST-14或SST-28；SEQ ID NO：17及18)之兩個或更多個串聯重複段。重複體抑素多肽序列之每一者可係與SST-14或SST-28具有至少85%序列一致性之多肽序列。該等重複變體序列係獨立地經選擇，即，在一些實施例中重複係相同的，而在其他實施例中其係唯一的。
本發明所使用之白蛋白可係任何白蛋白、其類似物或變體。白
蛋白可係人類血清白蛋白，或任何其他經分離或天然白蛋白。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中人類血清白蛋白部分包含多肽序列變體，該變體由於與天然形式(SEQ ID NO：25)相比存在額外或較少半胱胺酸殘基而具有替代性二硫鍵排列或數目。
如前所述，間隔子或連接子可用於本發明中。間隔子或連接子可與體抑素或白蛋白無關。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中替代性地稱為連接子之肽間隔子由長度為約2至約100個胺基酸殘基之多肽序列組成。本發明進一步涵蓋多肽構築體，其中肽間隔子長度為約2至約50個胺基酸殘基、較佳地約2至約30個、或更佳地長度為約3至約20個胺基酸殘基。
本發明亦涵蓋多肽構築體，其中肽間隔子(替代性地稱為連接子)具有多肽序列「GGGGS」(SEQ ID NO：31)。富含Gly及Ser及Thr之多肽提供特別優點：(i)多肽主鏈可自由旋轉，使得相鄰結構域相對於彼此自由移動；(ii)增強之溶解度；(iii)抵抗蛋白分解。另外，許多天然連接子展現α-螺旋結構。α-螺旋結構比富含Gly之連接子剛性更強且更穩定。可使用具有A(EAAAK)4A(SEQ ID NO：30)之序列之經驗性剛性連接子分隔功能結構域。除了將蛋白質結構域連接在一起之作用之外，人造連接子可針對融合蛋白之製造提供其他優點，例如改良生物學活性、增加蛋白質表現及達成期望之藥物動力學性質。
本發明之實施例提供製備體抑素-白蛋白融合蛋白之方法。在實施例中，本發明之體抑素-白蛋白融合蛋白係藉由重組融合蛋白含有編碼基因及將載體引入至宿主中之表現來製備。舉例而言，融合蛋白係藉由在諸如酵母之宿主中之表現獲得。舉例而言，可使用巴斯德畢赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)作為適宜表現宿主，且用於構築重組表現之載體係pPIC9K。另外，可使用諸如CHO或HEK293等哺乳
動物品系作為較佳表現宿主。
本發明亦涵蓋能夠表現白蛋白體抑素融合蛋白之質體構築體，其包含編碼如在任一前面段落中所述之體抑素白蛋白融合蛋白之核苷酸序列。舉例而言，適宜質體構築體包括(但不限於)表示為SEQ ID NO：26之pcDNA3.1載體，其中編碼本文中所揭示之任一白蛋白-體抑素融合蛋白之DNA序列連接至此載體之多個選殖位點。此項技術中已知之其他適宜蛋白質表現載體可基於表現宿主來選擇(例如，具有哺乳動物啟動子系統之表現載體將適宜用於在人類細胞株中表現，而若期望在酵母或細菌中之任一者中表現，則將選擇該等生物體之表現質體)。
本發明亦涵蓋細菌或酵母蛋白質表現系統，其包含利用質體構築體所轉化之細菌或酵母細胞，該質體構築體包含編碼如在任一前面段落中所述之體抑素白蛋白融合蛋白之核苷酸序列。適宜細菌菌株包括(例如)大腸桿菌(Escherichia coli)。適宜酵母菌株包括(例如)巴斯德畢赤酵母。例示性質體構築體包括如表示為SEQ ID NO：27之pPIC9K(Invitrogen)，其中編碼本文中所闡述之任一白蛋白-體抑素融合蛋白之核苷酸序列併入該載體之多個選殖位點中。
本發明亦涵蓋經分離及純化之融合體抑素融合蛋白，其具有如在任一前面段落中所述之多肽序列。
本發明之融合蛋白可用於治療業內已知之採用體抑素治療之病狀。因此，本發明亦涵蓋藉由投與經分離及純化之如在任一前面段落中所述之白蛋白-體抑素融合蛋白治療人類個體之癌症之方法，其中癌症係選自乳癌、結腸直腸癌、肝癌及肺癌。
本發明亦涵蓋藉由投與含有本發明之融合蛋白(例如經分離及純化之如任一前面段落中所述之白蛋白-體抑素融合蛋白)之組合物治療人類個體之癌症之方法。組合物亦可包括適宜載劑。
設計11個具有不同連接子序列之SST14-白蛋白融合蛋白構築體。將8個該等構築體製成質體內之融合基因並藉由100mL規模之HEK293瞬間表現來產生。自培養基收集蛋白質，藉助基於白蛋白之親和純化進行純化，並對儲存緩衝液進行透析。針對該等融合蛋白對SSTR2受體之結合親和性，亦及針對在SSTR2-過表現CHO-K1細胞株中抑制cAMP產生之基於細胞之活性來評估該等融合蛋白。該等研究之結果指示，連接子之長度及類型顯著影響SSTR2受體結合親和性、活體外基於細胞之功能活性及融合蛋白產率。
將參考以下實驗及比較實例更詳細地闡述本發明之所選實施例。該等實例僅用於說明性目的，而非意欲限制本發明之範圍。
製備8個構築體(參見表4)。首先，合成基因並然後將靶序列插入至pcDNA3.1載體中。
使用Maxi-prep或Mega-prep生成約20mg之每一DNA
將FreeStyleTM 293-F細胞以0.55-0.6×106細胞/mL接種於燒瓶中。約24小時後，將細胞以1.1-1.2×106細胞/mL接種於搖瓶中。在FreeStyle培養基中以500ug DNA/80mL製備DNA。在FreeStyle培養基中以1.8mL聚乙烯亞胺(PEI)/80mL製備PEI。將DNA在FreeStyle培養基中混合，且將有效量之PEI添加至DNA溶液中，並在室溫下渦旋培育混合物約15分鐘以形成DNA-PEI複合物。將80mL經培育之DNA-PEI複合物添加至細胞培養物中。約3小時後，添加TC Yeastolate飼料(BD)至終濃度為4克/升培養物。約7至8天後，藉由離心收穫培養基。
轉染前約24小時，將HEK293細胞於燒瓶中接種至50%-90%之匯合率，並添加完全培養基。約24小時之後，清洗細胞，隨後添加基礎培養基。
藉由將DNA添加至無血清培養基來製備DNA及PEI溶液。將PEI溶液添加至DNA溶液並在室溫下培育15分鐘以形成DNA-PEI複合物。
將PEI/DNA混合物添加至細胞中，且將混合物在37℃下培育約4至6小時。去除培養基並添加含有麩醯胺酸及血清之新鮮培養基，隨後在37℃下培育4天。
約4天後收穫培養基，藉由離心收集上清液。對沈澱物重新補充含有L-麩醯胺酸之新鮮培養基以供再培育3天以重複收穫製程。
端視純化方法(連續層析或人工分批純化)，藉由TFF系統(Millipore)將所收集之培養基濃縮至一定體積。
使用層析或分批系統，在約4℃下將經濃縮之蛋白質在結合緩衝
液中與新鮮Ni-NTA樹脂一起培育，並用清洗緩衝液清洗。利用洗脫緩衝液洗脫蛋白質且收集並濃縮各部分以回收經純化之蛋白質。可使用粒徑篩析層析純化進一步純化蛋白質。
最終洗脫物之緩衝液可藉由透析對期望緩衝液交換。
SST-HSA融合蛋白均以高產率呈可溶性形式表現。連接子之長度或性質可影響融合蛋白之蛋白質產率及溶解度。結果指示，隨著融合蛋白構築體變得更長且更複雜，產率略有下降。然而，所有構築體對於擴大規模生產均展現產率。
此分析量測[125I]體抑素與人類體抑素sst2受體之結合。使用標準技術，使用經編碼人類體抑素sst2受體之質體穩定轉染之CHO-K1細胞在經改質之HEPES pH 7.4緩衝液中製備膜。將0.1mg‡小份之膜與0.03nM[125I]體抑素及所測試融合蛋白在25℃下一起培育240分鐘。在1
μM體抑素之存在下估算非特異性結合。將膜過濾並清洗3次且計數過濾器以測定特異性結合之[125I]體抑素。
125I-Tyr-體抑素相對於融合蛋白之競爭性結合研究展示以下結果。抑制效率端視融合蛋白之構築體而不同。具有兩個α-螺旋連接子A(EAAAK)4A之融合蛋白構築體(SEQ ID NO：1)顯示對體抑素與其受體之相互作用之100%抑制。SEQ ID NO：1構築體在人類血清白蛋白之N端側及C端側均具有兩個體抑素部分。在人類血清白蛋白之C端側具有一個藉由相同α-螺旋連接子連接之體抑素之較小構築體(SEQ ID NO：2)顯示96%之抑制。具有撓性更強之GGGGS連接子之相同構築體端視長度顯示82%至85%之較低抑制。GGGGS連接子之長度亦影響抑制。具有5個胺基酸之GGGGS連接子之構築體(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：8)顯示57%至59%之抑制，而具有15個胺基酸(SEQ ID NO：15)或30個胺基酸之GGGGS連接子(SEQ ID NO：16)之構築體顯示大於80%之抑制，表明長於5個胺基酸之GGGGS對於SST功能將更有利。剛性更強之A(EAAAK)4A(a-螺旋)連接子在結合中將比撓性GGGGS連接子更有效。多個SST可增加用於SST受體結合之配體之有效濃度。組胺酸純化標籤之位置可不影響結合。改變融合蛋白中白蛋白之取向或位置可進一步增加蛋白質結合之效率。
使用在CHO-K1細胞中表現之人類重組體抑素sst2a受體。在37℃下，將測試化合物及/或媒劑與細胞(2×105/ml)一起在培育緩衝液中培育20分鐘。相對於10nM奧曲肽反應，測試化合物誘導之50%或更多(50%)之cAMP減少指示可能的sst2a受體促效劑活性。
已在表現SST受體類型2之CHO-K1細胞中觀察到對cAMP之累積之抑制。EC50值為260nM。具有較長連接子之構築體(SEQ ID NO：1、15及2)具有較低EC50值，此與結合分析數據一致。當比較白蛋白-(GGGGS)3-SST14及白蛋白-(GGGGS)3-SST14之EC50值時，α-螺旋連接子對抑制cAMP產生似乎更有效。
<110> 中國大陸商安能泰製藥有限公司(NAL PHARMACEUTICAL GROUP LIMITED)
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (17)
- 一種融合蛋白，其包含下式(V)：[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)，其中，SST係體抑素或其類似物；L係具有A(EAAAK)4A(SEQ ID NO：30)之序列的間隔子或連接子；ALB係白蛋白；及x1、x2、y1或y2各獨立地係0或選自1至6之整數，前提係至少一個L存在於該融合蛋白中。
- 如請求項1之融合蛋白，其中該SST係天然的或合成製造的。
- 如請求項1之融合蛋白，其中該SST包含編碼SST-14或SST-28(分別表示為SEQ ID NO：17或18)之序列或與該等序列之任一者具有至少85%一致性之序列之一或多個串聯重複段。
- 如請求項1之融合蛋白，其中該SST為SST-14或SST-28。
- 如請求項1之融合蛋白，其中L係α螺旋結構化多肽連接子或間隔子。
- 如請求項1之融合蛋白，其中ALB係哺乳動物血清白蛋白。
- 如請求項6之融合蛋白，其中該哺乳動物血清白蛋白係SEQ ID NO：25或與之具有至少85%序列一致性之序列。
- 如請求項1之融合蛋白，其中x1及x2各自獨立地係選自1至5之整數。
- 如請求項1之融合蛋白，其中y1及y2各自獨立地係選自1至5之整數。
- 如請求項1之融合蛋白，其經分離及純化。
- 一種編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含下式(V)：[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)，其中，SST係體抑素或其類似物；L係具有A(EAAAK)4A(SEQ ID NO：30)之序列的間隔子或連接子；該ALB係白蛋白；及x1、x2、y1或y2各獨立地係0或選自1至6之整數，前提係至少一個L存在於該融合蛋白中。
- 如請求項11之多核苷酸，其編碼該多肽序列，其中該SST包含編碼SST-14或SST-28(分別表示為SEQ ID NO：17或18)之序列或與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少85%一致性之序列之一或多個串聯重複段。
- 一種質體構築體，其表現包含如請求項1至10中任一項之融合蛋白之白蛋白-體抑素融合蛋白。
- 一種細菌宿主細胞，其經如請求項13之質體構築體轉化。
- 一種如請求項1至10中任一項之融合蛋白用於製造用於治療人類個體之內分泌釋放之疾病或病症之醫藥品之用途，其中該內分泌釋放之疾病或病症係對體抑素之投藥有反應之病狀。
- 如請求項15之用途，其中該病狀係選自由以下組成之群之癌症：乳癌、結腸直腸癌、肝癌、內分泌癌、神經內分泌癌、胰臟癌、前列腺癌及肺癌。
- 如請求項16之用途，其中該癌症表現體抑素受體類型1、2、3、4或5。
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