BRPI0709874A2

BRPI0709874A2 - preparaÇÕes antimicrobianas

Info

Publication number: BRPI0709874A2
Application number: BRPI0709874-0A
Authority: BR
Inventors: Roelf Otto; Aldana Mariel Ramirez
Original assignee: Purac Biochem Bv
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2011-07-26
Also published as: JP5133336B2; CN101437414B; WO2007113333A2; WO2007113333A3; JP2009532049A; ES2521265T3; CN101437414A; EP2001313A2; EP1842437A1; EP2001313B1

Abstract

<B>PREPARAÇÕES ANTIMICROBIANAS<D>A presente invenção refere-se a um método para a conservaçãode alimentos contra bactérias Gram-negativas compreendendo a adição de uma preparação antimicrobiana contendo glicina e alanina aos alimentos. A invenção refere-se ainda ao uso de tais preparações antimicrobianas no con- trole da flora intestinal em seres humanos e animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA-ÇÕES ANTIMICROBIANAS".

A presente invenção refere-se a uma preparação antimicrobianae a um processo de conservação de alimentos. Em particular, a presenteinvenção refere-se a um processo de conservação de alimentos com a com-binação de pelo menos dós aminoácidos. A invenção refere-se ainda ao usode tais preparações no controle da flora intestinal em seres humanos e ani-mais.

A morbidade e a mortalidade associadas ao consumo de ali-mentos contaminados por microorganismos infecciosos e que produzem to-xinas não devem ser subestimadas. É por esta razão que a qualidade e asegurança microbiana dos alimentos é causa de constante preocupação pa-ra as indústrias alimentícias, consumidores e agências governamentais. A-lém disso, o apodrecimento e a putrefação de um alimento por microorga-nismos podem comprometer seu valor nutricional, podendo levar a perdaseconômicas substanciais. O apodrecimento causado pelos micróbios resultada proliferação descontrolada ou da atividade destes microorganismos. Paraprevinir a ocorrência de tal fenômeno, tecnologias de conservação foramdesenvolvidas a fim de garantir a qualidade e a segurança microbiológicados alimentos. Tais tecnologias são diversas e incluem (i) procedimentosque previnem o acesso dos microorganismos aos alimentos; (ii) procedimen-tos que desativam os microorganismos; e (iii) procedimentos que previnemou retardam o crescimento dos microorganismos. Alterações na demandados consumidores e na legislação que rege a produção de alimentos fazemcom que os responsáveis pelas tecnologias alimentícias modifiquem e aper-feiçoem constantemente as tecnologias de processamento alimentício exis-tentes, inventando e desenvolvendo novas tecnologias. A tendência agora éproduzir alimentos que, não somente pareçam atraentes, frescos e mais na-turais, mas que também combinem estas qualidade às conveniências cotidi-anas, tais como prazos de validade maiores e preparo mais fácil. Além disso,os consumidores também têm aumentado suas expectativas com relação aosabor, textura, aparência e segurança. Assegurar a realização de tudo isto éum grande desafio para os responsáveis pelas tecnologias alimentícias. Noque diz respeito ao retardamento e à prevenção do crescimento de microor-ganismos nos alimentos, há uma série de novos pedidos para antimicrobia-nos químicos novos e mais naturais sendo registrados. Contudo, estes no-vos conservantes químicos devem satisfazer uma série de requerimentos: (i)devem possuir atividade bactericida ou bacteriostática eficaz contra umaampla variedade de organismos de apodrecimento e patógenos alimentaresdiferentes; (ii) não devem afetar a aparência, o sabor, o aroma ou a texturados alimentos; e (iii) não devem ser tóxicos para os consumidores. Sabe-seque certos aminoácidos apresentam propriedades bactericidas ou bacterios-táticas (por exemplo, Shive, W.; C.G. Skinner (1963) "Aminoacid analogues".Em: Metabolic inhibitors: A comprehensive treatise (Hochster, R.M.;J.H.Quastel eds). Academic Press. Nova Iorque. Volume 1, pp 1 -73).

Além disso, muitos aminoácidos ocorrem naturalmente nos ali-mentos, sendo normalmente considerados seguros e adequados para utili-zação em produtos alimentícios. É exatamente por esta razão que algunsaminoácidos, em especial a glicina, têm sido utilizados comercialmente co-mo conservantes.

Processos para conservação de produtos alimentícios com seri-na foram descritos nas patentes US 2.711.976 e US 6.602.532. Na patenteUS 3.615.703, o sabor dos produtos alimentícios ou bebidas contendo frutasou sucos de fruta, vegetais ou sucos de vegetais, ou cerveja é conservadoatravés da vedação hermética do alimento ou bebida em um receptáculocom lisina, ornitina, histidina ou sais dos mesmos. A patente GB 1.510.942descreve um processo para a conservação de produtos alimentícios, particu-larmente daqueles contendo de 10-60% de açúcar, como por exemplo, gela-tinas, geléias e pudins, que são protegidos contra a putrefação pela adiçãode maltose e glicina aos mesmos. A glicina está presente de forma apropria-da em quantidades variando de 0,3 a 2%. Embora a glicina seja amplamenteutilizada hoje em dia como conservante comercial, sabe-se que este com-posto não é um conservante poderoso, sendo necessárias grandes concen-trações da mesma para que se obtenha a inibição desejada do crescimentobacteriano. Tais concentrações elevadas, entretanto, geram uma nova cate-goria de problemas. Sabe-se que a glicina, a alanina, a serina e a treoninapossuem, em diferentes graus, um sabor adocicado, enquanto a Iisina e aornitina ambas possuem sabores com notas doces e azedas, ao passo quea arginina é intensamente azeda. O impacto dos aminoácidos sobre o pala-dar limita a aplicação destes compostos na condição de conservantes ali-mentícios.

Para que a glicina seja utilizada de forma mais eficaz como con-servante alimentar, criou-se a demanda por outras substâncias que possamser utilizadas em conjunto com a mesma, aumentando seu efeito antimicro-biano. Lee et al. examinaram os efeitos antimicrobianos da utilização da gli-cina em combinação com o hexametafosfato, EDTA, com o ácido cólico ecom o monocaprato de glicerol sobre uma série de espécies de bactériasGram-positivas e negativas (Lee, J. K.; K. Tatsuguchi; M. Tsutsumi; T. Wata-nabe, J. Food Hiq. Soe. Japan 26: 279-284 (1985)). NaWO 01/56408, 1,5-D-anidrofrutose foi usada em combinação com a alanina e com a glicina, a fimde se obter agentes conservantes de alimentos com substâncias antibacteri-anas altamente seguras que podem, desta forma, aumentar as qualidadesde conservação dos alimentos sem produzir quaisquer efeitos indesejáveissobre o paladar ou aroma dos alimentos.

Embora os processos descritos utilizem misturas antimicrobia-nas consistindo em um único aminoácido com um ou mais compostos nãoaminoácidos (veja acima), muito pouco se sabe a respeito das propriedadesantimicrobianas das misturas de aminoácidos.

A presente JP 2000-224976 descreve um processo para a inibi-ção de microorganismos, tal como a bactéria de ácido lático Enterococcufaecalis em regiões com pH > 6,5 da comida, portanto, danificando pouco aqualidade do alimento usando uma mistura de Iactato de cálcio e glicina eum sal de algum outro ácido orgânico. Embora tenha-se descrito na mesmapatente que se pode substituir parte da glicina por alanina, os dados mos-tram que a alanina e as misturas de alanina e glicina são inibidores menoseficazes da proliferação das bactérias Gram-positivas Enterococcus faecalisdo que a glicina isoladamente. Demonstrou-se que a alanina não somente écapaz de contrapor o efeito inibitório da glicina no caso de bactérias Gram-positivas intimamente relacionadas a Enterococcus hirae e a Lactococcuslaetis, mas também nas bactérias Gram-negativas Eseheriehia eoli (Snell,E.E.; B.M.Guirard (1943) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 29:66-73, Hishinuma,F.; K. Izaki; H. Takahashi (1969) "Effeets of glyeine and the-amino acids onthe growth of various mieroorganisms" Agr. Biol. Chem. 33: 1577 - 1586).Bem se sabe que um aminoácido pode cancelar a inibição exercida por umoutro aminoácido e este efeito foi observado em uma série de espécies debactérias Gram-positivas e Gram-negativas, como por exemplo, nas bacté-rias Gram-positivas: BaeiHus anthraeis e Listeria monoeytogenes; e nas es-pécies de bactérias Gram-negativas: Eseheriehia eoli (Gladstone, G.P.(1939) Brit. J. Exp. Pathol. 20: 189-200; Friedman, M.E; W.G. Roessler(1961) J. Bacteriol. 82: 528-533; de Felice et al. (1979) Microbiol1 ver 43:42-58).

Na patente US 2001/033884, uma preparação contendo glicinae serina é utilizada para a conservação de produtos alimentícios contra bac-térias Gram-positivas e Gram-negativas.

O resumo da patente J-53050361 também descreve composi-ções contendo glicina e serina para o ajuste do pH de alimentos.

As patentes US 2001/039264 e US 2002/144946 descrevem ou-tras composições contendo pelo menos cinco ou mais aminoácidos para u-sos diversos, tais como para redução dos níveis sangüíneos de aminoácidosassociados a prática severa de exercícios ou para redução da fadiga, e paraa utilização em hemodiálise respectivamente.

Surpreendentemente, foi descoberto agora que a combinaçãode glicina e alanina produz um efeito sinergístico na inibição das bactériasGram-negativas.

Por isso, a invenção refere-se a uma preparação antimicrobianacontendo pelo menos glicina e alanina dirigida contra bactérias Gram-negativas.

Desta forma, a presente preparação antimicrobiana contendo acombinação de glicina e alanina é particularmente adequada para a inibiçãodo crescimento de espécies de Escherichia coli 0157:H7e de Salmonella.

Bem se sabe que a combinação destes dois aminoácidos podeainda ser combinada a um terceiro aminoácido. Verificou-se que estas com-binações produzem efeitos antibacterianos maiores do que se esperaria como uso isolado dos aminoácidos, isto é, mostrando um efeito sinergístico.

A alanina em questão é preferencialmente uma D-alanina. Maispreferencialmente, a preparação antimicrobiana contém uma DL-alanina. Nocaso de haver outros aminoácidos presentes na composição, estes são pre-ferencialmente DL-aminoácidos.

Sob outro aspecto, a invenção refere-se a um método para aconservação de alimentos contra a ação de bactérias compreendendo a adi-ção das preparações antimicrobianas contendo glicina e alanina acima men-cionadas aos alimentos.

O método de acordo com a presente invenção é particularmenteútil para a proteção de alimentos contra pelo menos um de Salmonella enté-riea e Eseheriehia coli 0157:H7.

Exemplos de tais produtos alimentícios são produtos à base decarnes (curados ou não, frescos e/ou cozidos), saladas e outros produtosvegetais, bebidas e laticínios, alimentos semiprocessados, alimentos conve-nientes como, por exemplo, refeições prontas e produtos desidratados. Ométodo é de particular interesse devido a alguns dos produtos frescos à ba-se de carne serem utilizados para o consumo direto (como por exemplo, filetaméricain, steak tartar, sushi ou carpaccio) sem o prévio aquecimento oucom aquecimento prévio inadequado para garantir efeito bactericida. Outrosprodutos à base de carne são consumidos após a aplicação apenas de a-quecimento parcial, aplicado de forma intencional como, por exemplo, para opreparo de carnes mal passadas, ou de forma não-intencional, aplicado de-vido à preparação inadequada ou por manuseio inadequado dos produtosalimentícios.

As preparações antimicrobianas da presente invenção, incluindoas preparações contendo glicina/alanina, podem ainda ser aplicadas em ou-tras aplicações, tais como no controle da flora intestinal através da inibiçãoda proliferação de bactérias Gram-negativas, tais como a Salmonella e aEscherichia, oferecendo uma vantagem seletiva às bactérias Gram-positivas,tais como os Lactobacilus, através da administração em conjunto com bacté-rias probióticas.

Utilizou-se em um estudo as seguintes culturas: serotipo Esche-richia coli O157:H7 (ATCC 700728), Salmonella enterica (ATCC 13311). To-das as culturas foram transferidas diariamente em tubos com tampas de ros-ca (100 χ 16 mm) contendo 10 ml de caldo de BHI ("brain heart infusion")(Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). As culturas foram incubadas a 30°C semagitar. O caldo BHI foi preparado com quantidades crescentes de dois ami-noácidos. As faixas de concentração dos aminoácidos variaram de 0 a450mM em etapas de 10 a 50mM. Isto resultou em 100 tipos de ensaios di-ferentes. O pH do meio foi ajustado para 6,1 - 6,2. Os meios foram prepara-dos em quantidades de 10ml e subseqüentemente esterilizados por filtração(membranas de nitrato de celulose Sartorius com poros de 0,45 μm de diâ-metro). Foram transferidos 300 μL de cada meio para placas "honeycomb"estéreis de 100 poços da Bioscreen. As placas de poços foram inoculadascom 5 μL de culturas cultivadas no caldo BHI ao longo de uma noite utilizan-do um dispensador de repetição Hamilton estéril de 5 μL (Hamilton, Bona-duz, Suíça). As taxas de crescimento foram determinadas através de testesBioscreen C (Labsystems, Helsinki, Finlândia) que medem de forma cinéticao desenvolvimento da turbidez através de fotometria vertical. As placas fo-ram incubadas por 16-24 horas a 37°C, a densidade óptica das culturas foimedida a cada 30 minutos a 420-580mM usando um filtro de banda larga. OBioscreen mede a densidade óptica das culturas em intervalos de tempoestipulados. A partir destes dados o Bioscreen calcula as taxas de cresci-mento específico máximas.

O propósito do processamento ulterior dos dados é ter certezase os dois aminoácidos atuam de forma independente um do outro, de seestimulam um ao outro na sua ação inibitória (sinergia) ou se cancelam oefeito inibitório um do outro (antagonismo). Quando certo composto não a-presenta efeito sobre um organismo, a taxa de crescimento específico desteorganismo (μ) pode ser expressa em função (f) da atividade inibitória docrescimento com dada concentração de substrato (s) através de, por exem-plo, a equação Monod, a qual se escreve da seguinte maneira: μ = μmáx. S /(Ks + s), em que μmáx representa a taxa de crescimento específico máxima,s representa a concentração do substrato inibidor do crescimento no meio eKs representa a concentração do substrato, em que μ = 0,5 μmax. Contudo,quando a presença de um certo inibidor afeta o crescimento celular, a funçãof para μ deve ser modificada, isto é, μ = f(s,p), em que ρ representa a con- centração do inibidor p. Uma série de estudos sobre a inibição cinética daproliferação bacteriana tem demonstrado que muitos inibidores se compor-tam como inibidores não-competitivos. Isto implica que apenas o valor dataxa de crescimento específico máxima (μmax), e não a afinidade (Ks) é afe-tada. Desta forma, a taxa de crescimento específico na presença do inibidor pode ser escrita da seguinte maneira: μ = μi, s /(Ks + s), em que μi é a taxade crescimento específico máxima na presença de um inibidor ρ. A relaçãoentre μi e μmax e entre a concentração do inibidor ρ pode ser descrita utili-zando a equação de logística Dose-Resposta a qual se escreve: μ/μmax =1/(1 + [p/p0,5]b)(Jungbauer, A. (2001). "The logistic dose response function: a robust fitting function for transition phenomena in life sciences". J. ClinicalLigand Assay 24: 270 - 274). Nesta equação, ρ representa a concentraçãodo inibidor P e p0,5 representa a concentração de Pquando μi = 0,5 μmax; μmáxsendo a taxa de crescimento específico máxima, ou seja, a taxa de cresci-mento específico na ausência do inibidor P, b é uma quantidade não- mensurável que determina a relação entre μi e ρ. A combinação das equa-ções de Monod com a equação de logística Dose-Resposta pode ser escritada seguinte maneira: μ = μmax (s/Ks + s)/(1 + [p/p0,5]b). Na cultura de bateladaonde s comumente é muitas vezes maior que Ks esta equação se reduz a μ= Mmáx/(1 + [Ρ/Ρ0,5]b)·

Ao se comparar diferentes organismos proliferando-se sob con-dições similares, ou organismos similares proliferando-se sob condições dis-tintas, é mais interessante que se utilize a taxa de crescimento relativo aoinvés da taxa de crescimento absoluto como padrão de comparação. A taxade crescimento relativo (O) é a razão entre a taxa de crescimento (μ) e ataxa de crescimento máxima (Umáx), isto é, O = p/Mmáx· Observa-se que en-quanto μ e (Umáx apresentarem as unidades de dimensão (tempo)"1, a suarazão O não possuirá dimensão, ou seja, será um número puro. Pode-sedefinir de forma similar a concentração relativa do inibidor ε como ρ/ρο,5· Aequação reduzida representativa da junção da equação de Monod e da e-quação de logística Dose-Resposta pode então ser escrita da seguinte ma-neira: O = 1/(1 + eb). Para dois inibidores X e Y, por exemplo, é possível de-finir as duas expressões a seguir para O: Ox = 1/(1 + eb1) e Oy = 1/(1 + eb2).

Ox e Oy podem ser avaliados de forma experimental através deum exame dos efeitos inibitórios de X ou de Y sobre a taxa de crescimentodo organismo em questão. Conhecendo as funções avaliadas para Ox e Oy,o efeito independente é definido em teoria da seguinte maneira: Ox. Oy. Oefeito observado de forma experimental para a combinação de X e Y sobre ataxa de crescimento relativa é definido como Oxy. A hipótese de que XeYatuam de forma independente um do outro sobre certo organismo é matema-ticamente representada por OxyZOx. Oy = 1. A rejeição desta hipótese implicaque o efeito combinado de X e Y não é um efeito aditivo, mas sim sinergísti-co ou antagonístico. No caso, os inibidores XeY atuam de forma sinergísti-ca sobre o organismo em questão, OxyIOx. Oy < 1, (porém > 0). Naquelescasos em que os efeitos combinados dos inibidores XeY sejam antagonísti-cos Oxy/Ox. Oy > 1. A sinergia, o efeito independente e o antagonismo podemser visualizados em uma tabela comparando Oxy e Ox. Oy.

Isto é exemplificado na figura 1, em que se oferece um gráficoda relação Ody Aia (taxa de crescimento relativa observada de forma experi-mental) em comparação com OGiy-OAia (taxa de crescimento relativo previs-ta) para a Escherichia coli 0157:H7 (ATCC 700728), mostrando a sinergiaentre o efeito inibitório da glicina e DL-alanina. A linha contínua neste gráficorepresenta a linha onde se observou de forma experimental que a taxa decrescimento relativo (Ogn-Oaia) se iguala a taxa de crescimento relativo pre-vista (OgN.aia) e em que a glicina e a alanina atuam como inibidores indepen-dentes.

A combinação entre a DL-alanina e a glicina é particularmenteeficaz contra Salmonella enterica e Escherichia co//'0157:H7 (sinergismo).

A competição entre Escherichia coli 0157:H7 (ATCC 700728) eLactobacilus plantarum (DFM 20174)(cultura mista A), e entre Salmoriellaenterica (ATCC 13311) e Laetobaeilus plantarum (DFM 20174) (cultura mistaB) foi estudada nas culturas de caldo. Eseheriehia coli, Salmonella enterica eLaetobaeilus plantarum foram transferidos diariamente para tubos com tam-pas de rosca (100 χ 16 mm), contendo 10 ml de caldo de BHI (Oxoid, Ba-singstoke, Reino Unido). As culturas foram incubadas a 30°C sem seremagitadas. 500 μΙ_ de uma cultura de Escherichia coli cultivada por uma noitee 5 μl de uma cultura de Laetobaeilus plantarum foram transferidos paratubos de tampa de rosca contendo 10ml de caldo BHI ou para tubos conten-do 10 ml de caldo BHI com 200 mM de DL-alanina e 200 mM de glicina ou400 mM de DL-alanina e 400 mM de glicina (cultura mista A, primeira trans-ferência). 500 pL de culturas de Salmonella entérica e 5 pL de cultura deLaetobaeilus plantarum cultivadas em uma noite foram transferidas para tü-bos de tampa de rosca contendo 10 ml de caldo de BHI preparado recente-mente ou para um tubo contendo 10 ml de caldo de BHI preparado recente-mente com 200 mM de DL-alanina e 200 mM de glicina ou com 400 mM deDL-alanina e 400 mM de glicina (cultura mista B, primeira transferência).Ambas as culturas mistas foram incubadas a 30°C. Após 24 horas, as cultu-ras foram transferidas para um meio fresco (segunda transferência) e acon-dicionadas sobre ágar vermelho violeta bile Iactose (VRBA) (Oxoid Basings- toke, CM 0485) e sobre ágar MRS (Oxoid, Basingstoke, CM0361). A segun-da transferência também foi incubada por 24 horas a 30°C e acondicionadasubseqüentemente sob ágar vermelho violeta bile Iactose (VRBA) e ágarMRS. Os resultados desta análise, os quais estão resumidos na tabela 1,demonstram a vantagem competitiva do Laetobaeilus plantarum nas culturasmistas tanto com Escherichia coli quanto com Salmonella enterica em meioscontendo DL-alanina e glicina.Tabela 1. Unidades formadoras de colônia (cfu) por ml de caldo na primei-ra e na segunda transferência.

<table>table see original document page 11</column></row><table>

A presente invenção foi utilizada para a conservação de alimen-tos. Os exemplos a seguir são ilustrativos da presente invenção. As culturas-estoque de Salmonella typhimurium ATCC 1331 e de Escherichia coli0157:H7 ATCC 700728, que foram utilizadas para inocular as culturas líqui-das foram rotineiramente mantidas em placas com ágar contendo a BHI (O-xoid CM225, Basingstoke, Reino Unido) reforçado com 1,5% de ágar. Asculturas de Escherichia coli e Salmonella typhimurium foram cultivadas emtubos com tampas de rosca (100 χ 16ml) contendo 10 ml de caldo de BHI eincubadas ao longo de uma noite a 30°C. Pouco antes da inoculação dosalimentos, as culturas foram diluídas com uma solução contendo 0,1% depeptona e 0,85% de NaCI.Leite

Obteve-se leite desnatado estéril de um supermercado local.Quantidades apropriadas de aminoácidos foram adicionadas.

Massa (Lasanha)

Obteve-se uma lasanha bolonhesa pronta para comer de umsupermercado local e o alimento foi completamente homogeneizado utilizan-do um liqüidificador. Quantidades adequadas de aminoácidos foram adicio-nadas a 500g de lasanha homogeneizada. Esta mistura foi selada a vácuo esubseqüentemente irradiada (10 kGray). A lasanha irradiada foi armazenadaa -30°C até a próxima utilização.Carne Fresca

Bifes recém-cortados contendo aproximadamente 20% de gor-dura foram moídos utilizando um moedor de carne Primus MEW 613 (Mas-chinenfabrik Dornhan, Dornhan Alemanha) equipado com uma placa moedo-ra de 2,541/20,32 cm (1/8" polegadas). A temperatura foi mantida a 10°Cdurante todo procedimento. Quantidades apropriadas de aminoácidos foramadicionadas a 500g de carne moída. A mistura de carne moída com aminoá-cidos foi subseqüentemente irradiada (10 kGray). A carne irradiada foi arma-zenada a -30°C até a próxima utilização.Inoculação da Lasagna e da Carne Fresca:

Presunto de peru, lasanha ou carne fresca altamente congela-dos foram descongelados ao longo da noite a -4 (± 1)°C. 500g dos produtosainda congelados foram então rapidamente cortados em peças de 2-4cm etransferidos para recipientes de um processador de alimento de cozinha(processador de alimento Tefal Kaleo tipo 67604). Adicionou-se 1,5 ml deuma cultura bacteriana diluída de forma adequada, misturando-se a compo-sição resultante por aproximadamente de 30 a 60 segundos. Neste estágio,a temperatura da mistura ainda permanecia abaixo de 0°C. Após a mistura,transferiu-se rapidamente duas porções em torno de 25 g da mesma misturapara sacos-filtros (lnterscience, St Nom, França). Os produtos inoculadoscom Escherichia coli ou com Salmonella typhimurium foram incubados poraté duas semanas a 12°C.

Inoculação do Leite

O leite foi resfriado a 10°C e subseqüentemente inoculado comculturas de Salmonella typhimurium diluídas conforme apropriado. Amostrasde leite inoculado foram incubadas a 12°C.

Análise microbiana

A análise microbiana das amostras dos alimentos foi realizadada seguinte maneira: abriu-se uma bolsa selante, adicionando-se a ela duasvezes o peso líquido de um fluido de diluição estéril (8,5% (p/v) NaCl e 0,1%(p/v) peptona bacteriológica). As amostras foram homogeneizadas por umminuto em uma batedeira de laboratório Stomacher 400 (Seward Medicai,Londres, Inglaterra) e 50 pL da matéria homogeneizada foram acondiciona-dos em um meio adequado de ágar utilizando um acondicionador espiralEddyjet tipo 1.23 (IUL Instruments, Barcelona, Espanha). A Escherichia coli0157:H7 e a Salmonella typhimurium foram acondicionadas em ágarVRDBG (Oxoid, CM0485, Basingstoke, Reino Unido). As placas foram incu-badas por 24 horas a 30°C então contadas.

Resultados

O efeito da adição isolada de glicina, DL-alanina e da mistura deglicina (0,67%) e de DL-alanina (0,8%) sobre o crescimento da Salmonellatyphimurium no leite a 12°C é dado na tabela 1:

<table>table see original document page 13</column></row><table>

A tabela mostra que, nas culturas de caldo, a glicina em concen-tração de 100mM e a DL-alanina em concentração de 100mM apresenta umpouco ou nenhum efeito sobre a taxa de crescimento da Salmonella typhi-murium. A combinação por outro lado mostrou ser bastante eficaz na su-pressão do crescimento deste organismo no leite.

Claims

1. Método para a conservação de alimentos contra bactériasGram-negativas compreendendo a adição de preparação antimicrobianacontendo glicina e alanina aos alimentos

2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual a prepara-ção antimicrobiana contém DL-alanina.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o ali-mento é protegido contra pelo menos Salmonella ou Escherichia coli.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual o alimentoé protegido contra pelo menos Salmonella entérica, Escherichia coli0157.H7.

5. Preparação antimicrobiana compreendendo dois ou três ami-noácidos escolhidos dentre pelo menos glicina e alanina para a utilização nocontrole da flora intestinal de seres humanos ou animais.

6. Preparação antimicrobiana de acordo com a reivindicação 5,contendo bactérias probióticas e dois ou mais aminoácidos escolhidos den-tre pelo menos glicina e alanina para a utilização no controle da flora intesti-nal de seres humanos ou animais.

7. Preparação antimicrobiana de acordo com a reivindicação 5ou 6, para a utilização no controle da flora intestinal de seres humanos ouanimais.

8. Método para o controle da flora intestinal de seres humanosou animais através da administração de uma preparação antimicrobiana con-tendo pelo menos glicina e alanina.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, no qual a prepara-ção antimicrobiana é administrada contendo pelo menos glicina, alanina euma bactéria probiótica.