BRPI0709917A2

BRPI0709917A2 - composições e métodos de uso para anticorpos de c-met

Info

Publication number: BRPI0709917A2
Application number: BRPI0709917-7A
Authority: BR
Inventors: David Raymond Stover; Josef Prassler; Catrin Berger; Bodo Brocks
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2011-07-05
Also published as: AU2007245181A1; CN101415730B; US8101727B2; US20090175860A1; MX2008012485A; ES2386738T3; KR20080113218A; CA2646048A1; WO2007126799A2; CN103183738B; AR060241A1; CN103183738A; PE20080352A1; JP2009532026A; JP5536445B2; WO2007126799A3; EP2004693B1; CL2007000851A1; TW200815470A; RU2008142833A

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS DE USO PARA ANTICORPOS DE C-MET. Anticorpos e fragmentos que ligam à proteína alvo c-Met, particularmente a epítopos localizados no domínio extracelular de c-Met, são fornecidos, como adicionalmente métodos de uso dos anticorpos e kits, para tratar uma célula indesejada, em particular, uma célula associada a uma condição relacionada a c-Met tal como um câncer, uma metástase, ou uma condição inflamatória.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES E MÉTODOS DE USO PARA ANTICORPOS DE C-MET".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se às composições contendo anti-corpos que especificamente ligam à proteína de c-Met alvo, métodos de fa-zer estes anticorpos, e métodos de uso para tratar condições proliferativas,tais como cânceres e metástase, e condições inflamatórias.

ANTECEDENTES

O Receptor de Fator de Crescimento Hepatócitos, aqui referidocomo c-Met, é um receptor de tirosina cinase que foi mostrado ser supra-expressado e/ou mutado em uma variedade de malignidades, especifica-mente,' várias mutações de c-Met são encontradas em vários tumores defase sólida. O Iigante de c-Met, fator de crescimento de hepatócitos (HGF),também conhecido como fator de difração (SF), liga a c-Met em uma via queestá implicada em invasão de células tumorais e metástase (Ma et al., 2003Câncer and Metastasis Reviews. 22:309-325).

Interação de HGF com c-Met inicia uma cascata de eventos in-tracelulares (Derman et al., 1996 J Biol Chem 23;271(8):4251-4255). Ligaçãode HGF resulta em ativação da atividade de tirosina cinase intrínseca de c-Met e autofosforilação de vários resíduos de tirosina no domínio intracelular(Ma et al., 2003 Câncer and Metastasis Reviews. 22:309-325). Ativação davia de HGF/c-Met resulta em um arranjo vasto de respostas celulares inclu-indo difração celular, angiogênese, proliferação, motilidade intensificada dascélulas, invasão e metástase. Antagonismo pode atuar para inibir autofosfori-lação e/ou induzir internalização do cMet de superfície, e/ou infra-regular aatividade de cMet.

Células tumorais podem invadir uma fronteira de tecido, degra-dando e remodelando a matriz extracelular circunvizinha, de modo que ascélulas tumorais podem migrar-se através da fronteira do tecido de matrizextracelular permitindo disseminação e formação de metástase. Sinalizaçãode HGF/c-Met é uma via que medeia crescimento invasivo normal e maligno.Mutações de sentido contrário de c-Met foram identificadas em uma variedade de cânceres, com a maioria das mutações localizada no domínio de cina-se. Mutantes são caracterizados por atividade de tirosina cinase aumentadaassim promovendo as ações biológicas de c-Met.

Há uma necessidade por composições e métodos para tratarcânceres, metástase de cânceres e condições inflamatórias, tais como agen-tes que interferem com a sinalização de HGF/c-Met na qual a atividade de c-Met contribui para invasão e/ou metástase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A tirosina cinase de receptor c-Met está envolvida nos processosde migração, invasão e morfogenia que acompanham embriogênese e rege-neração de tecido. Várias linhas de evidência indicaram que c-Met tambémrepresenta um papel em patogênese de tumor. Mutações de linhagem ger-minal ativadoras dentro do domínio de cinase de c-Met são associadas aodesenvolvimento de carcinoma de célula renal papilar hereditária (PRCC).Mutações dentro do domínio de cinase foram também relatadas, emborararamente, em formas esporádicas de PRCC, em carcinoma de cabeça epescoço de célula escamosa e em carcinoma gástrico. Níveis elevados de c-Met, junto com seu único Iigante HGF/SF, são observados clinicamente emfreqüência alta em múltiplos tumores relevantes. Uma correlação entre ex-pressão aumentada e progressão da doença, metástase e mortalidade dopaciente foi relatada em vários cânceres, incluindo carcinoma de bexiga,mama e gástrico como também Iiomiossarcoma e glioblastoma.

Anticorpos da invenção especificamente ligam c-Met com afini-dade alta e modulam o efeito de c-Met da doença. Anticorpos que antagoni-zam níveis ou atividade de c-Met são contemplados para tratar doenças pro-Iiferativas ou doenças inflamatórias. Doenças proliferativas acreditadas tra-táveis pelos anticorpos da invenção incluem especialmente cânceres. Anti-corpos que agonizam níveis ou atividade de c-Met são contemplados pararegeneração de órgãos, cura de ferida, regeneração de tecido, e outros.

Uma modalidade da invenção aqui fornece um anticorpo queseletivamente liga a uma proteína de c-Met, ou uma porção imunologica-mente ativa deste anticorpo, ou um fragmento de anticorpo funcional. Emuma modalidade o anticorpo ou porção imunologicamente ativa deste anti-corpo é de um mamífero, tendo uma origem tal como roedor, humano oucamelídeo, ou é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade particular, oanticorpo de anti-c-Met é caracterizado como tendo uma região de ligaçãode antígeno que é específica para proteína de c-Met alvo, e o anticorpo oufragmento funcional liga c-Met ou um fragmento de c-Met. O anticorpo podeser policlonal ou monoclonal. Em certas modalidades, o anticorpo ou porçãoimunologicamente ativa deste anticorpo é um anticorpo monoclonal. Outramodalidade da invenção inclui, por exemplo, um fragmento funcional, tal co-mo uma porção de ligação de antígeno, ou um tal fragmento fornecido emum andaime ou estrutura não-tradicional ou com base em não-imunoglobulina.

Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento funcional desteanticorpo liga à proteína alvo, c-Met, com uma K0 de 2,0 χ 10"5 M ou menos,2,0 χ 10"6 M ou menos, 2,0 χ 10'7 M ou menos, 2,0 χ 10"8 M ou menos, ou 2,0x 10"9 M ou menos. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo ou frag-mento funcional deste anticorpo tem uma taxa fora (Kfora) para proteína de c-Met alvo de 1,0 χ 10"2 por seg ou menor, 1,0 χ 10"3 por seg ou menor ou 1 χ10'4 por seg ou menor, ou 1,0 χ 10 5 por seg ou menor. Em uma modalidaderelacionada, o anticorpo ou fragmento funcional deste anticorpo liga à prote-ína de c-Met alvo com uma Kd de 2,0 χ IO 5M ou menos, 2,0 χ 10'6 M oumenos, 2,0 χ 10~7 M ou menos, 2,0 χ 10~8 M ou menos, ou 2,0 χ 10'9 M oumenos, e inibe ligação de HGF a c-Met. Em uma modalidade relacionada, oanticorpo ou fragmento funcional do mesmo antagoniza atividade de cMet.

Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento funcional des-te anticorpo liga à proteína de c-Met alvo e modula, isto é, ou ativa (agoniza)ou inibe (antagoniza), atividade de c-Met, incluindo mas não limitado a fosfo-rilação, especialmente autofosforilação. Em certas modalidades, agonismoou ativação de fosforilação de c-Met estimula pelo menos um de uma ativi-dade selecionada do grupo de regeneração de órgão, cura de ferida, e rege-neração de tecido. Em uma modalidade relacionada, o órgão é rim, fígado,pâncreas, coração, pulmão, estômago, intestino, pele, timo, ou tiróide.Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção antago-nizou cMet, em que o antagonismo resulta em pelo menos uma atividadeselecionada de: inibição de proliferação celular, inibição de migração de cé-lula, inibição de sobrevivência de célula, inibição de metástase e/ou inibiçãode ligação de HGS ou de indução de internalização de cMet. Na maioria dasmodalidades, o antagonista de anticorpo de cMet da invenção pode ser usa-do no tratamento de uma doença proliferativa, especialmente um câncer oudoença inflamatória.

Em uma modalidade relacionada, a ligação é determinada porum ou mais ensaios que podem ser usados para medir uma atividade que éantagonismo ou agonismo pelo anticorpo. Os ensaios medem pelo menosum dos efeitos do anticorpo em uma ligação de c-Met que incluem pelo me-nos: indução de uma atividade da enzima da via de transdução de sinal de c-Met; indução da expressão de um gene da via de transdução de sinal de c-Met; ligação direta com base em eletroquimiluminescência a c-Met; ensaioimunoabsorvente ligado à enzima de ligar a c-Met; e proliferação, sobrevi-vência, migração ou metástase de uma célula. Se o anticorpo tiver um efeitoantagonístico ou um agonístico é determinado comparando os resultadosaos controles que carecem do Iigante natural de HGF. Desse modo um anti-corpo antagonístico bloqueia indução de cMet até mesmo na presença deHGF, enquanto um anticorpo agonístico causa indução na ausência de HGF.

Em outra modalidade, a invenção fornece seqüências de amino-ácido e de nucleotídeo isoladas fornecendo anticorpos e a seqüência de nu-cleotídeo de codificação isolada selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 1-30, 73-76, e 85-88. Em uma modalidade relacionada, a invenção forneceseqüências de aminoácido isoladas codificadas por estas seqüências de nu-cleotídeo, respectivamente, e variantes conservadoras destas seqüências deaminoácido. Em outra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeoisolada de cada uma das SEQ ID NOs: 1-20 codifica uma seqüência de ami-noácido de cadeia leve de ligação de antígeno. Em ainda outra modalidaderelacionada, a seqüência de nucleotídeo isolada de cada uma das SEQ IDNOs: 21-30 codifica uma seqüência de aminoácido de uma cadeia pesadade ligação de antígeno.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma seqüência deaminoácido isolada selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 31-72, 77-84, e89-96, e variantes conservadoras destas seqüências. Em uma modalidaderelacionada, a seqüência de aminoácido isolada de cada uma das SEQ IDNOs: 31-54 inclui uma cadeia leve de ligação de antígeno. Em outra modali-dade relacionada, a seqüência de aminoácido isolada de cada uma das SEQID NOs: 55-72 inclui uma cadeia pesada de ligação de antígeno.

Em uma certa modalidade, a invenção fornece uma seqüênciade aminoácido isolada tendo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 porcento de identidade com as SEQ ID NOs: 31-72, 77-84, e 89-96. Em umamodalidade relacionada, a invenção fornece uma seqüência de nucleotídeoisolada tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identidadecom uma seqüência descrita nas SEQ ID NOs: 1-30, 73-76, e 89-96.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada de quaisquer destes anticorpos, ou um fragmen-to funcional de quaisquer destes anticorpos. Desse modo em certas modali-dades, a invenção fornece uma região de ligação de antígeno isolada tendouma cadeia leve codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionadado grupo das SEQ ID NOs: 1-20. Em modalidade relacionada, a invençãofornece uma região de ligação de antígeno isolada tendo uma cadeia pesadacodificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo das SEQID NOs: 21-30. Em outra modalidade relacionada, a invenção fornece umaregião de ligação de antígeno isolada tendo uma cadeia leve codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 1-20,e uma cadeia pesada codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecio-nada do grupo das SEQ ID NOs: 21-34.

Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece uma regiãode ligação de antígeno isolada tendo uma cadeia leve com uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 31-54. Em outra mo-dalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligação de antígenoisolada tendo uma cadeia pesada com uma seqüência de aminoácido sele-Gionada do grupo das SEQ ID NOs: 55-72. Em ainda outra modalidade rela-cionada, a invenção fornece uma região de ligação de antígeno isolada ten-do uma cadeia leve com uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po das SEQ ID NOs: 31-54 e variantes conservadoras destas seqüências, euma cadeia pesada com uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po das SEQ ID NOs: 55-72 e variantes conservadoras destas seqüências.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma região de ligaçãode antígeno isolada tendo uma cadeia leve de Ig Iambda codificada por umaseqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 73. Em uma modalidade relacio-nada, a invenção fornece uma região de ligação de antígeno isolada tendouma cadeia leve de Ig capa codificada por uma seqüência de nucleotídeoselecionada do grupo das SEQ ID NOs: 74-76.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada tendo uma cadeia leve de Ig Iambda com umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo da SEQ ID NO: 77-80. Emoutra modalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligação deantígeno isolada tendo uma cadeia leve de Ig capa com uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 81-84.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanoou humanizado isolado ou fragmento funcional do anticorpo, o anticorpo ten-do uma região de ligação de antígeno que é específica para um epítopo en-contrado na proteína ^e c-Met, de modo que o anticorpo ou fragmento fun-cional liga aos receptores de superfície de c-Met em uma célula, e impedeou melhora o desenvolvimento ou metástase de um câncer. Em uma moda-Iidade relacionada, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmentofuncional tendo uma região de ligação de antígeno que é específica para umepítopo da proteína de c-Met alvo, o epítopo contendo um ou mais resíduosde aminoácido de um domínio extracelular (ECD) de c-Met. Em uma modali-dade relacionada, o epítopo é um epítopo conformacional.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo isolado ou fragmentofuncional como descrito acima é um fragmento de anticorpo de Fab ou scFv,ou é um nanocorpo de camelídeo. O Fab ou scFv em certas modalidadessão monovalentes. A natureza monovalente do anticorpo é particularmenteadequada para um agente projetado para antagonizar a proteína de c-Met.Em uma certa modalidade, quaisquer dos anticorpos de IgG é uma IgG. Emuma modalidade relacionada, quaisquer dos anticorpos acima são umaIgGI, uma lgG2, uma lgG3 ou uma lgG4. Em uma modalidade particular, aIgG é uma lgG4. Em uma modalidade mais específica, a lgG4 é codificadapor uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo das SEQ ID NOs:85-88. Em ainda outra modalidade relacionada, a lgG4 é codificada por umaseqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 porcento de identidade com uma seqüência selecionada do grupo que consistenas SEQ ID NOs: 85-88. Em uma outra modalidade relacionada, a lgG4 temuma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQID NOs: 89-96 e variantes conservadoras destas seqüências. Alternativa-mente, o anticorpo de anti-c-Met aqui é uma IgA, uma IgD, uma IgE ou umaIgM.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far-macêutica compreendendo pelo menos um dos anticorpos acima ou frag-mentos funcionais ou variantes conservadoras destes anticorpos, e um veí-culo farmaceuticamente aceitável ou excipiente deste.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um animaltransgênico ou uma célula transgênica portando um gene que codifica qual-quer um dos antiGorpos-acima ou fragmentos funcionais deles.

Em certas modalidades, a invenção fornece um método paratratar um distúrbio ou condição relacionada a c-Met que envolve administrara um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de qualqueruma das composições farmacêuticas acima. O distúrbio ou condição é umcâncer ou uma condição inflamatória.

Em uma modalidade, o câncer é esofagiano, mama, rim incluin-do mas não limitado a carcinoma de célula renal papilar, glioma, cabeça epescoço, epitelial, pulmão, pele, leucemia, linfoma, mieloma, cérebro, pan-creático, gástrico, gastrintestinal, estômago, cólon, intestino, fígado, genital,urinário, melanoma, ou próstata, como também outros tumores conhecidos aalguém versado na técnica. Em uma modalidade particular, o câncer é defígado, renal ou esofagiano ou é um sarcoma. Mais particularmente, o cân-cer é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro, câncer deestômago, câncer genital, câncer urinário, câncer de próstata, câncer de be-xiga (superficial e músculo-invasivo), câncer de mama, câncer cervical, cân-cer de cólon, câncer colorretal, glioma (incluindo glioblastoma, astrocitomaanaplástico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), câncer esofagiano, câncergástrico, câncer gastrintestinal, câncer de fígado, carcinoma hepatocelular(HCC) incluindo HCC de infância, câncer de cabeça e pescoço (incluindocarcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma nasofarin-geano), carcinoma de célula de Hurthle1 câncer epitelial, câncer de pele, me-Ianoma incluindo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma incluin-do mieloma múltiplo, leucemias, câncer de pulmão incluindo câncer de pul-mão de célula não-pequena (incluindo todos os subtipos histológicos: ade-nocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma broncoalveolar,carcinoma de célula grande, e tipo adenoescamoso misturado), câncer depulmão de célula pequena, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer depróstata, câncer de rim, câncer de célula renal incluindo câncer de célularenal papilar hereditário e esporádico, Tipo I e Tipo II, e câncer de célula re-nal de célula clara; sarcomas, em particular osteossarcoma, sarcomas decélula clara, e sarcomas de tecido macio (incluindo rabdomiossarcomas al-veolar e embrionário, sarcomas alveolares de parte macia); carcinoma detiróide (papilares e outros subtipos).

Em uma modalidade dada, uma condição inflamatória exemplaré devido a uma infecção. Em uma modalidade, o método de tratamento seriabloquear a infecção patogênica. Em uma modalidade particular, a infecção éumas infecções bacterianas, incluindo, por exemplo, uma infecção de Liste-ria. Vide, por exemplo, Shen et al. Cell 103: 501-10, (2000). Não significandoser limitado a um mecanismo de ação, é acreditado que as bactérias usemuma proteína de ligação de c-Met para se interiorizar. Anticorpos da inven-ção bloqueariam esta interação, assim impedindo internalização. Em outramodalidade, o tratamento estimula uma resposta celular, por exemplo, umaresposta curativa de ferida.

Em certas modalidades, qualquer um dos métodos acima envol-ve administrar também um agente quimioterapêutico. Em uma modalidaderelacionada, o agente quimioterapêutico é um agente anticâncer. Combina-ções específicas são fornecidas ao longo do pedido de patente.

Em uma modalidade relacionada, qualquer um dos métodos a-cima envolve administrar também um inibidor via-específico. O inibidor via-específico pode ser um agente quimioterapêutico ou um agente biológico,por exemplo, tal como anticorpos. Inibidores via-específicos incluem, masnão são limitados a, inibidores de EGFR, VEGFR, etc.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método paratratar uma célula indesejada envolvendo contatar a célula com qualquer umdos anticorpos acima ou fragmentos funcionais destes anticorpos. Em umamodalidade relacionada, a célula porta c-Met na superfície da célula. Emoutra modalidade relacionada, o método acima também envolve tratar a cé-lula com um agente quimioterapêutico ou radiação.

Em uma modalidade relacionada a vários dos métodos acima,seguindo administrando ao sujeito ou contatando a célula, estes métodospodem também envolver observar melhora ou retardamento de desenvolvi-mento ou metástase do câncer.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método paraidentificar uma célula portando o receptor de superfície de c-Met, o métodoenvolvendo contatar a célula com qualquer um dos anticorpos acima oufragmentos funcionais de modo que os anticorpos ou fragmentos funcionaistenham uma marcação detectável. Por exemplo, a marcação é radioativa,fluorescente, magnética, paramagnética, ou quimioluminescente. Em umamodalidade relacionada, o método acima também envolve uma etapa deimagear ou separar a célula. Por exemplo, separar a célula é isolar a célulaportando c-Met de uma população maior de células.

Em outra modalidade, o anticorpo humano ou humanizado aci-ma ou fragmento de anticorpo é um anticorpo sintético, por exemplo, um po-lipeptídeo produzido por um sintetizador de aminoácido de fase sólida.Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far-macêutica que inclui qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentos fun-cionais destes anticorpos e um agente terapêutico adicional. O agente tera-pêutico adicional é selecionado do grupo que consiste em um agente anti-câncer; um antibiótico; um agente antiinflamatório; um fator de crescimento;e uma citocina.

A invenção também refere-se a um método de impedir ou tratardoenças proliferativas ou doenças, tais como um câncer, em um mamífero,particularmente um humano, com uma combinação de agentes farmacêuti-cos compreendendo:

(a) um antagonista de c-Met da invenção; e

(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos;

em que pelo menos um agente farmaceuticamente ativo é umanticâncer terapêutico.

A invenção também refere-se às composições farmacêuticascompreendendo:

(a) um antagonista de c-Met de anticorpo;

(b) um agente farmaceuticamente ativo; e

(c) um veículo farmaceuticamente aceitável;

A presente invenção também refere-se a um pacote comercialou produto compreendendo:

(a) uma formulação farmacêutica de um antagonista de c-Met deanticorpo; e

(b) uma formulação farmacêutica de um agente farmaceutica-mente ativo para uso simultâneo, concorrente, separado ou seqüencial;

Em uma certa modalidade, a invenção fornece um anticorpo iso-lado tendo uma primeira seqüência de aminoácido que é uma cadeia pesadatal como SEQ ID NOs: 55-72, ou uma seqüência tendo pelo menos 60, 70,80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade de seqüência com uma seqüênciaselecionada do grupo das SEQ ID NOs: 55-72; e uma segunda seqüência deaminoácido que é uma cadeia leve tal como SEQ ID NOs: 31-54, ou-umaseqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 % de identidade deseqüência com uma seqüência selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 31-54.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um imunoconju-gado que tem um primeiro componente que é um anticorpo ou fragmentocomo descrito acima e um segundo componente que é uma segunda se-qüência de aminoácido. Por exemplo, o segundo composto do imunoconju-gado é uma citotoxina, ou é uma proteína Iigadora ou anticorpo tendo umaespecificidade de ligação para um alvo que é diferente c-Met. Por exemplo, oalvo da especificidade de ligação diferente de c-Met é um antígeno de tumorou proteína associado ao tumor em uma superfície de uma célula de câncer.Em certas modalidades, a invenção fornece qualquer um dos anticorpos a-cima como um anticorpo biespecífico.

Em outra modalidade, a invenção fornece um kit que tem qual-quer um dos anticorpos acima ou fragmentos de anticorpo. Em algumas mo-dalidades, o kit também contém um veículo farmaceuticamente aceitável ouexcipiente deste. Em outras modalidades relacionadas, qualquer um dosanticorpos acima no kit estão presentes em uma dose de unidade. Em aindaoutra modalidade-relacionada, o kit-inclui instruções para uso em administrarqualquer um dos anticorpos acima, ou fragmentos funcionais destes anticor-pos, a um sujeito, ou para uso de pesquisa ou triagem.

Agentes terapêuticos que antagonizam a atividade de cMet seri-am prognosticados ter um impacto benéfico em tratamento de uma gamaextensiva de tumores clinicamente relevantes. Inclusos na invenção estãoanticorpos completamente humanos que diretamente ligam ao domínio ex-tracelular de c-Met e bloqueia a interação com HGF/SF.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1A e 1B são alinhamentos de seqüência das cadeias de Vhda invenção, delimitando também as regiões de FR1, CDR1, FR2, CDR2,FR3, CDR3 e FR4 de cada cadeia.

FIG. 2A e 2B são alinhamentos de seqüência das cadeias de VlIambda da invenção, delimitando também as regiões de FR1, CDR1, FR2,CDR2, FR3, CDR3 e FR4 de cada cadeia.

FIG. 3 é um alinhamento de seqüência das cadeias de Vl capada invenção, delimitando também as regiões de FR1, CDR1, FR2, CDR2,FR3, CDR3 e FR4 de cada cadeia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos isolados, particular- mente anticorpos tendo uma seqüência de aminoácido humana ou humani-zada que especificamente liga a c-Met, especificamente a uma porção extra-celular da proteína de c-Met e que inibe as propriedades funcionais de c-Met. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são derivados deseqüências de cadeia pesada e leve particulares e/ou compreendem carac-terísticas estruturais particulares tais como regiões de CDR compreendendoas seqüências de aminoácido particulares. A invenção fornece anticorposisolados, métodos de fazer tais anticorpos, ensaios para detectar tais anti-corpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo taisanticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunocon-jugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção também refere-se aos métodos de usar os anticorpos para inibir, isto é, antagonizar, a fun-ção de c-Met para -inibir o desenvolvimento-de um distúrbio-ou condição as-sociada à presença de c-Met alvo de receptor celular resultando no trata-mento de uma doença proliferativa, por exemplo, um câncer ou uma condi-ção inflamatória. A invenção em uma modalidade diferente também refere-sea anticorpos que ativam, isto é, agonizam, fosforilação de c-Met, e métodosde uso de anticorpos agonísticos que estimulam por exemplo, regeneraçãode órgão, cura de ferida, ou regeneração de tecido.

Em uma modalidade dada, a condição inflamatória é uma infec-ção. Em uma modalidade, o método de tratamento seria bloquear a infecçãopatogênica. Em uma modalidade particular, a infecção são umas infecçõesbacterianas, incluindo, por exemplo, uma infecção de Listeria.Para que a presente invenção possa ser entendida mais facil-mente, certos termos são definidos ter os significados aqui, exceto quandodo contrário requerido pelo contexto. Definições adicionais são expostas aolongo da descrição detalhada.

Um "polipeptídeo de c-Met" ou "receptor de c-Met" ou "c-Met"refere-se à tirosina cinase do receptor que liga Fator de Crescimento de He-patócitos. Exemplos específicos incluem, por exemplo, um polipeptídeo hu-mano codificado pela seqüência de nucleotídeo fornecida em GenBank no.de acesso. NM_000245, ou a proteína humana codificada pela seqüência depolipeptídeo fornecida em GenBank no. de acesso. NP_000236, ou o domí-nio extracelular dos mesmos. A proteína de precursor de cadeia simplesprimária é pós-translacionalmente clivada para produzir as subunidades al-fas e betas que são dissulfeto ligados para formar o receptor maduro. A tiro-sina cinase do receptor c-Met está envolvida em processos celulares, inclu-indo, por exemplo, os processos de migração, invasão e morfogenia queacompanham a embriogênese e regeneração de tecido.

A frase "distúrbio ou condição relacionada a c-Met" refere-se aqualquer doença, distúrbio ou condição que é o resultado de expressão in-desejada ou carência de expressão, regulação indesejada ou carência deregulação, ou atividade indesejada ou carência de atividade, de c-Met, ouque possa ser modulada, tratada, ou curada modulando a expressão ou ati-vidadede-c-Met. Por-exemplo, ativação da-via de HGF/c-Met pode ser espe-rada em uma proporção grande de pacientes de câncer, ou em pacientescuja doença realmente é dirigida por alterações relacionadas à via de c-Met.Por exemplo, supra-regulação pode ser devido a diferentes mecanismoscomo supra-expressão de HGF e/ou c-Met, ou ativação constitutiva por mu-tação de c-Met. Um distúrbio ou condição relacionada a c-Met inclui, masnão é limitada a, por exemplo, doenças e distúrbios proliferativos e doençase distúrbios inflamatórios. Doenças proliferativas incluem mas não são Iimi-tadas a, por exemplo, cânceres incluindo, por exemplo, gástrico, esofagiano,mama, rim incluindo carcinoma de célula renal papilar, glioma, cabeça epescoço, epitelial, pulmão, pele, leucemia, linfoma, mieloma, cérebro, pan-creático, gastrintestinal, estômago, intestino, cólon, fígado, genital, urinário,melanoma, e próstata, como também outros tumores conhecidos a alguémversado na técnica. Doenças inflamatórias incluem, mas não são limitadas a,por exemplo, infecção bacteriana incluindo, por exemplo, por Listeria. Outrosdistúrbios são descritos aqui e, por exemplo, em Online Mendelian Inheritan-ce in Man ("OMIM") entradas para, por exemplo, Proto-oncogene de Met emOMIN no. de acesso 164860 e para Fator de Crescimento de Hepatócitos /Fator de Difração em OMIM no. de acesso 142409. Outros exemplos serãoconhecidos àqueles versados na técnica, por exemplo, como revisado porCorso et al., TRENDS in Mol. Med. 11(6): 2841 (2005) e Christensen et al.,Câncer Letts. 225: 1-26 (2005), ambos destes são incorporados por referência.

O termo "resposta imune" refere-se a qualquer atividade de Iin-fócitos, células de apresentação de antígeno, células fagocitárias, granulóci-tos, e macromoléculas solúveis produzidas por estas células ou pelo fígado(incluindo produção e/ou secreção de anticorpos, citocinas, e complemento)que resulta em ligação seletiva para, danificação, destruição, ou eliminaçãodo corpo humano da invasão por patógenos, células ou tecidos infetadoscom patógenos, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou in-flamação patológica, células humanas ou tecidos normais.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se a uma relação causaibioquímiea-em geral iniciada por uma-interação de-proteína-proteína tal co-mo ligação de um fator de crescimento a um receptor, resultando em trans-missão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de umacélula. Em geral, a transmissão envolve fosforilação específica de um oumais resíduos de tirosina, serina, ou treonina em uma ou mais proteínas nasérie de reações que causam transdução de sinal. Os penúltimos processostipicamente incluem eventos nucleares, resultando em uma alteração na ex-pressão de gene.

Um "receptor de superfície" inclui, por exemplo, moléculas ecomplexos moleculares capazes de receber um sinal e capazes da trans-missão de um tal sinal ao longo da membrana plasmática de uma célula. Umexemplo de um receptor de superfície de célula da presente invenção é c-Met ao qual uma molécula de proteína de fator de crescimento se liga porexemplo, um fator de crescimento de hepatócitos (HGF).

O termo "anticorpo" abrange qualquer metade que tem funçãode ligação semelhante à imunoglobulina. O termo inclui moléculas de anti-corpo inteiras e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, "porçãode ligação de antígeno") ou cadeias simples dos mesmos, anticorpos de ca-melídeo incluindo, por exemplo, nanocorpos, construções de ligação de exi-bição de fago, e outros. Um anticorpo de ocorrência natural é uma glicopro-teína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadei-as leves (L4 interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesadaé compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aquicomo VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante decadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Há ape-nas dois tipos de cadeia leve: Iambda e capa. Cada cadeia leve é compre-endida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como Vl) euma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve écompreendida de um domínio, Cl. As regiões de Vh e Vl podem ser tambémsubdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de de-terminação de complementaridade (CDR), entremeadas com as regiões quesão conservadas mais, denominadas regiões de estrutura (FR). Como seencontra na natureza,-cada VH-e Vl é composta de-três CDRs e quatro FRsdispostas do término amino para o término carbóxi na ordem a seguir: FR1,CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4,. As regiões variáveis das cadeias pe-sadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglo-bulina para hospedar tecidos ou fatores, incluindo várias células do sistemaimune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (CIq) do sis-tema de complemento clássico. Um anticorpo pode ser monoclonal ou poli-clonal.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente "porção de antígeno") refere-se a comprimento total ou um oumais fragmentos de um anticorpo tendo a habilidade para especificamenteligar a um antígeno (por exemplo, uma porção de c-Met). Foi mostrado que afunção de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser executada porfragmentos de uma molécula de anticorpo de comprimento total. Exemplosde fragmentos de ligação contendo uma porção de ligação de antígeno deum anticorpo incluem um fragmento de Fab, que é um fragmento monova-lente que consiste nos domínios de VL, VH, Cl e CH1; um fragmento deF(ab)2, que é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos deFab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; um frag-mento de Fd tendo os domínios de Vh e CH1; um fragmento de Fv tendo osdomínios de Vl e Vh de uma seqüência de aminoácido simples de uma ca-deia de anticorpo; um fragmento de dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546) tendo um domínio de VH; e uma região de determinação de comple-mentaridade isolada (CDR).

Referência a uns fragmentos de anticorpo que contêm as por-ções de ligação de antígeno pode contemplar o fragmento isolado ou conju-gado às metades químicas ou biológicas, ou aos fragmentos ligados às es-truturas ou andaimes derivados de imunoglobulina não-tradicionais, incluindomas não limitados a, por exemplo, ancirinas, fibronectinas, anticorpos dedomínio, lipocalina, imunofarmacêuticos modulares pequenos, maxicorpos,nanocorpos, proteína A, afilina, gama-cristalina e ubiquitina, e outros andai-mes contemplados conhecidos a alguém versado na técnica.

Além disso, embora em uma molécula de anticorpo de ocorrên-cia natural haja duas cadeias tendo domínios de Fv, Vl e Vh que são codifi-cados através de genes separados, eles podem ser unidos usando métodosrecombinantes, por um Iigador sintético que os permite ser recombinante-mente expressos como uma cadeia de proteína simples em que as regiõesde Vl e Vh formam uma molécula monovalente (conhecida como Fv de ca-deia simples (scFv); vide por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85:5879-5883). Tais anticor-pos de cadeia simples são também abrangidos dentro do termo porção deligação de antígeno de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são ob-tidos usando técnicas convencionais conhecidas àqueles de habilidade natécnica, e os fragmentos são triados para utilidade da mesma maneira quesão os anticorpos intactos ou outros fragmentos dos mesmos.

Um "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que é substan-cialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas dife-rentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente liga a umdeterminante que é um conjunto de aminoácidos em c-Met é substancial-mente livre de anticorpos que específica e substancialmente ligam a antíge-nos diferentes de c-Met). Um anticorpo isolado que especificamente liga auma proteína de c-Met tal como c-Met humano, pode, porém, ter reatividadecruzada para outros antígenos, tais como para moléculas de c-Met de outrasespécies, ou para proteínas tendo uma quantidade alta de homologia a umaseqüência de aminoácido de c-Met humana. Além disso, um anticorpo isola-do pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou químicas.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal" referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo, todasestas compartilham uma composição molecular simples. Uma composiçãode anticorpo monoclonal desse modo exibe uma especificidade de ligaçãosimples e afinidade para um epítopo particular.

Como aqui usado, o termo "anticorpo policlonal" refere-se a umacomposição de anticorpo tendo uma população de anticorpo heterogênea.-Anticorpos policlonais são freqüentemente derivados do soro agrupado deanimais imunizados ou de humanos selecionados.

O termo "anticorpo humano", como aqui usado, é intencionadoincluir anticorpos tendo regiões variáveis em que pelo menos uma e em ge-ral a estrutura e regiões de CDR são derivadas de seqüências de origemhumana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a regiãoconstante também é derivada de tais seqüências humanas, por exemplo,seqüências de linhagem germinal humana, ou versões mutadas de seqüên-cias de linhagem germinal humana. Os anticorpos humanos da invençãopodem incluir resíduos de aminoácido não codificados por seqüências hu-manas (por exemplo, mutações tais como substituições introduzidas por mu-tagênese aleatória ou loco-específica in vitro ou através de mutação somáti-ca in vivo).

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorposque exibem uma especificidade de ligação simples tendo regiões variáveisem que a estrutura e regiões de CDR são derivadas de seqüências huma-nas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzi-dos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo umgenoma compreendendo um transgene de cadeia pesada, em geral de ori-gem humana, e um transgene de cadeia leve, em geral de origem humana,fundido em uma célula imortalizada, em geral de origem humana.

O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado,inclui anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isola-dos através de meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de umanimal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromos-sômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparadodeles, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para ex-pressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorposisolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinató-rio, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualqueroutro meio que envolva corte de toda ou uma porção de uma ou mais se-qüências-de gene de imunoglobulina humana para outras seqüências deDNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis em quea estrutura e regiões de CDR são derivadas de seqüências de imunoglobuli-na de linhagem germinal humana. Em certas modalidades, porém, tais anti-corpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese invitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências de Ig humana forusado em mutagênese somática in vivo), de forma que as seqüências deaminoácido das regiões de Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são se-qüências que, embora derivadas e relacionadas às seqüências de Vh e Vlde linhagem germinal humana, podem não existir naturalmente dentro dorepertório de linhagem germinal de anticorpo humano in vivo.Como aqui usado, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (porexemplo, IgA, IgD, IgM, IgE, ou IgG tal como IgGI, uma lgG2, uma lgG3 oulgG4) que é fornecido pelos genes de região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anti-corpo específico para um antígeno" é usado alternadamente aqui com o ter-mo "um anticorpo que especificamente liga a um antígeno".

Como aqui usado, um anticorpo que "especificamente liga a c-Met humano" é intencionado referir-se a um anticorpo que liga a c-Met hu-mano com uma K0 de 2,0 χ 10"5 M ou menos, 2,0 χ 10"6 M ou menos, 2,0 χ10"7 M ou menos, 2,0 χ 10"8 M ou menos, ou 2,0 χ 10'9 M ou menos. Comoaqui usado, o termo "reatividade cruzada" refere-se a um anticorpo ou popu-lação de anticorpos que ligam a epítopos em outros antígenos. Isto pode sercausado por avidez ou especificidade baixas do anticorpo ou por antígenosdistintos múltiplos tendo identidade ou epítopos bem parecidos. Reatividadecruzada às vezes é desejável quando se quer ligação geral a um grupo rela-cionado de antígenos ou ao tentar marcação de espécies cruzadas se a se-qüência de epítopo de antígeno não for altamente conservada em evolução.

Um anticorpo que "reage cruzado com um antígeno diferente dec-Met humano" refere-se a um anticorpo que liga àquele antígeno com umaKd de 0,5 χ 10'7 M ou menos, 5 χ 10"8 M ou menos, ou 2 χ 10'9 M ou menos.Um anticorpo que "não reage cruzado com um antígeno particular" é inten-cionado a referi-se-a um anticorpo que liga àqueJe antígeno, se-é que, comuma Kd de 1,5 χ 10'8 M ou mais, ou uma K0 de 5-10 χ 10"7 M ou 5 χ 10'6 Mou mais. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reagem cruzadocom o antígeno exibindo essencialmente ligação indetectável contra estasproteínas em ensaios de ligação padrões.

Como aqui usado, um anticorpo que "inibe ligação a c-Met" refe-re-se a um anticorpo que inibe ligação de Iigante de HGF/SF ao receptor desuperfície de c-Met com uma Ki de 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 1 nMou menos, 0,75 nM ou menos, 0,5 nM ou menos, ou 0,25 nM ou menos.

Como aqui usado, um anticorpo que "inibe atividade de c-Met detransdução de sinal" é intencionado referir-se a um anticorpo que inibe ativi-dade proliferativa induzida por c-Met ou outra atividade induzida com um IC50menos que 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1,0 nM, 0,5 nM, ou menos.

O termo "Kassoc" ou "Ka", como aqui usado, é intencionado re-ferir-se à taxa de associação de uma interação de anticorpo-antígeno parti-cular, e o termo "Kdís" ou "Kd". como aqui usado, é intencionado referir-se àtaxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. Otermo "KD", como aqui usado, é intencionado a referir-se à constante de dis-sociação que é obtida da razão de K0 a Ka (isto é Kp/Ka) e é expressado co-mo uma concentração molar (M). Valores de K0 para anticorpos podem serdeterminados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um métodopara determinar a K0 de um anticorpo é usar ressonância de plasmon desuperfície, ou usar um sistema de biossensor tal como um sistema de Biacore®.

Como aqui usado, o termo "anticorpo de agonista" ou "anticorpode ativação" é intencionado a referir-se a um anticorpo que aumenta uma oumais atividades induzidas por c-Met em pelo menos 20 %-40 % quando adi-cionado a uma célula, tecido ou organismo que expressa c-Met. Em algumasmodalidades, o anticorpo ativa a atividade de c-Met em pelo menos 50 %, 60%, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % ou mais que 100 %. Em algumasmodalidades, um anticorpo de agonista da invenção aumenta pelo menosuma atividade de c-Met em 10 vezes. Em geral, este aumento é observado-na-ausêneia do indutor biológico,-HGF. Porém, em algumas modalidades,tais como em um controle para um ensaio, o anticorpo ativador é adicionadona presença de HGF.

Como aqui usado, o termo "afinidade" refere-se à resistência deinteração entre o anticorpo e uma porção do antígeno conhecida como o"epítopo", em um sítio antigênico simples. Dentro de cada sítio antigênico, aregião variável do "braço" do anticorpo interage através de forças não-covalentes fracas com o antígeno em numerosas localizações atômicas ouátomos de resíduo de aminoácido do anticorpo; em geral, o quanto maior onúmero de tais interações, mais forte a afinidade do anticorpo para o antígeno.Como aqui usado, o termo "avidez" refere-se a uma medida in-formativa da estabilidade ou resistência geral do complexo de anticorpo-antígeno. É controlada através de três fatores principais: afinidade de anti-corpo-epítopo; a valência de cada um do antígeno e anticorpo; e o arranjoestrutural ou configuração tridimensional destas partes interagentes. Por fimestes fatores definem a especificidade do anticorpo que é a probabilidadeque o anticorpo particular liga a um epítopo de antígeno preciso e a estabili-dade e duração da ligação.

Para obter uma sonda tendo uma avidez mais alta, um conjuga-do dimérico (duas moléculas de uma proteína de anticorpo ou polipeptídeoacopladas a um marcador de FACS) pode ser construído, desse modo fa-zendo interações de afinidade baixa (tais como com um anticorpo de linha-gem germinal) mais facilmente detectadas por FACS. Outro meio para au-mentar a avidez de ligação de antígeno envolve gerar dímeros ou multíme-ros de quaisquer das construções descritas aqui dos anticorpos de c-Met.Tais multímeros podem ser gerados através de ligação covalente entre mó-dulos individuais, por exemplo, imitando a ligação natural do término C-ao-Nou imitando os dímeros de anticorpo que são unidos através de suas regiõesconstantes. As ligações engenheiradas na interface de Fc/Fc podem ser co-valentes ou não-covalentes. Além disso, pares de dimerização ou multimeri-zação diferentes de Fc podem ser usados na construção de híbridos de anti-corpo de anti-c-Met tas como anticorpos bi-funcionais,-para aumentar taisestruturas de ordem mais alta.

Como aqui usado, o termo "afinidade alta" para um anticorpo deIgG refere-se a um anticorpo tendo uma K0 de 10"8 M ou menos, 10'9 M oumenos, ou 10"10 M ou menos para um antígeno alvo. Porém, ligação de "afi-nidade alta" pode variar para outros isótipos de anticorpo. Por exemplo, liga-ção de "afinidade alta" para um isótipo de IgM refere-se a um anticorpo ten-do uma Kd de 10"7 M ou menos, ou 10"8 M ou menos.

Como aqui usado, o termo "sujeito" inclui qualquer mamífero,incluindo um humano, ou um mamífero não-humano, ou outro animal.

O termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, porexemplo, mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelhas, cães, ga-tos, cavalos, vacas, e não-mamíferos tais como pássaros, anfíbios, répteis, etc.

O termo, "otimizado" significa que uma seqüência de nucleotídeofoi alterada para codificar uma seqüência de aminoácido usando códons quesão preferidos na célula ou organismo de produção, em geral uma célulaeucariótica, por exemplo, uma célula de uma levedura tal como Pichia, umacélula mamífera tal como célula de Hamster Ovário Chinês (CHO) ou umacélula humana. A seqüência de nucleotídeo otimizada é engenheirada parareter completamente ou tanto quanto possível a seqüência de aminoácidocodificada pela seqüência de nucleotídeo de partida original que é tambémconhecida como a seqüência "parental". As seqüências otimizadas aqui fo-ram engenheiradas para ter códons com as seqüências de nucleotídeo quesão preferidas em células humanas, expressão porém otimizada destas se-qüências em outras células eucarióticas são também visadas aqui. As se-qüências de aminoácido dos anticorpos aqui codificados através das se-qüências de nucleotídeo otimizadas são também referidas como otimizadas.

Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhesnas subseções a seguir.

Ensaios padrões para avaliar a habilidade de ligação dos anti-corpos para c-Met de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindopor-exemplo, ELlSAst-westem blot-e RlAs. Ensaios adequados são-conheci-dos aos versados na técnica. Vide, por exemplo, F. Ausubel, et ai., ed. 2006,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Inters-cience, Nova Iorque. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de liga-ção) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padrões conhe-cidos na técnica, tais como por análise de Biacore. Ensaios para avaliar osefeitos dos anticorpos sobre as propriedades funcionais de c-Met (por exem-plo, induzindo internalização do receptor, inibindo ligação do fator de cresci-mento a c-Met, inibindo autofosforilação de cMet, inibindo ativação da via decMet, assim impedindo ou melhorando a proliferação, ou ensaios de cinase)são descritos em aqui.Conseqüentemente, um anticorpo que "inibe" uma ou mais des-tas propriedades funcionais de c-Met (por exemplo, bioquímicas, imunoquí-micas, atividades biológicas celulares, fisiológicas ou outras, ou outras) co-mo determinado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica edescritas aqui, refere-se a um antagonismo estatisticamente significativo oudiminuição na atividade particular com relação àquela vista na ausência doanticorpo (por exemplo, ou na presença de um anticorpo de controle de es-pecificidade irrelevante). Um anticorpo que inibe os efeitos da atividade de c-Met tal como diminuição estatisticamente significativa em pelo menos 10 %do parâmetro medido, por pelo menos 50 %, 80 % ou 90 %, e em certasmodalidades um anticorpo da invenção pode inibir mais que 95 %, 98 % ou99 % da atividade funcional de c-Met. Em geral, a diminuição da atividade émedida seguindo um evento de indução, tal como adição de HGF.

Alternativamente, um anticorpo que "agoniza" uma ou mais des-tas propriedades funcionais de c-Met (por exemplo, bioquímicas, imunoquí-micas, atividades biológicas celulares, fisiológicas ou outras, ou outras) co-mo determinado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica edescritas aqui, refere-se a um aumento estatisticamente significativo na ati-vidade particular com relação àquele visto na ausência do anticorpo (por e-xemplo, ou na presença de um anticorpo de controle de especificidade irre-levante). Um anticorpo que estimula ou agoniza os efeitos da atividade de c-Met tal como aumento estatisticamente significativo em pelo menos 10 % doparâmetro medido, por pelo menos 50 %, 80 % ou 90 %, e em certas moda-lidades um anticorpo da invenção pode agonizar mais que 95 %, 98 % ou 99% ou mais, da atividade de c-Met funcional.

ANTICORPOS RECOMBINANTES

Anticorpos da invenção são os anticorpos recombinantes, isola-dos e estruturalmente caracterizados como descritos nos Exemplos. As se-qüências de nucleotídeos de Vh dos anticorpos são mostradas nas SEQ IDNOs: 21-30 respectivamente. Tabelas C-E fornecem exemplos de seqüên-cias de nucleotídeo de Vh de anticorpos diferentes da invenção. As seqüên-cias de nucleotídeo de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 1-20 respectivamente. (Tabelas C-E fornecem exemplos de seqüências denucleotídeo de Vl de anticorpos diferentes da invenção). As seqüências denucleotídeo de cadeia leve de Ig Iambda e capa dos anticorpos são mostra-das nas SEQ ID NOs: 73-76 e nas Tabelas C-E. As seqüências de nucleotí-deo de lgG4 dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 85-88 e nasTabelas C-E. Outros anticorpos da invenção incluem nucleotídeos que forammutados, ainda têm pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identi-dade com as seqüências descritas acima.

As seqüências de aminoácido de Vh dos anticorpos são mostra- das nas SEQ ID NOs: 55-72 respectivamente e nas Tabelas A-B e E. As se-qüências de aminoácido de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ IDNOs: 31-54 respectivamente e nas Tabelas A-B e E. As seqüências de ami-noácido de cadeia leve de Ig Iambda são mostradas nas SEQ ID NOs: 77-80respectivamente e nas Tabelas A-B e E. As seqüências de aminoácido de cadeia leve de Ig capa dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 81-84 respectivamente e nas Tabelas A-B e E. As seqüências de aminoácido delgG4 dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 89-96 respectivamen-te e nas Tabelas A-B e E. Anticorpos adicionais da invenção incluem amino-ácidos que foram mutados, e retém pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade com as seqüências descritas acima.

Uma vez que cada um destes anticorpos pode ligar a um sítioem uma-porção extracelular de c-Met, a Vh /-Vt-(seqüências de-nucleotídeoe seqüências de aminoácido), Vh / cadeia leve de Ig Iambda (seqüências denucleotídeo e seqüências de aminoácido), e Vh / cadeia leve de Ig capa (se- qüências de nucleotídeo e seqüências de aminoácido) podem ser "mistura-das e emparelhadas" para dar combinações adicionais de moléculas de liga-ção de anti-c-Met da invenção. Ligação de c-Met de tais anticorpos pode sertestada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (porexemplo, ELISAs). As seqüências de VH, VL, cadeia leve de Ig lambda, e cadeia leve de Ig capa dos anticorpos da presente invenção são particular-mente tratáveis para combinações novas, uma vez que estes anticorpos u-sam seqüências de VH, VL, cadeia leve de Ig lambda, e cadeia leve de Igcapa derivadas das mesmas seqüências de linhagem germinal ou similarese desse modo exibem similaridade estrutural.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece um an-ticorpo recombinante isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmotendo pelo menos: uma região variável de cadeia pesada (Vh) compreen-dendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nasSEQ ID NOs: 55-72; e uma região variável de cadeia leve (Vl) compreen-dendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nasSEQ ID NOs: 31-54; em que o anticorpo especificamente liga c-Met.

Exemplos de combinações de cadeia pesada e leve incluem pe-lo menos: uma Vh da SEQ ID NO: 65 e uma Vl da SEQ ID NO: 32; ou umaVh da SEQ ID NO: 66 e uma Vl da SEQ ID NO: 34; ou uma Vh da SEQ IDNO: 67 e uma Vl da SEQ ID NO: 37; ou uma Vh da SEQ ID NO: 68 e uma Vlda SEQ ID NO: 38; ou uma Vh da SEQ ID NO: 69 e uma Vl da SEQ ID NO:51; ou uma Vh da SEQ ID NO: 70 e uma Vl da SEQ ID NO: 52; ou uma Vhda SEQ ID NO: 71 e uma Vl da SEQ ID NO: 53; ou uma Vh da SEQ ID NO:72 e uma Vl da SEQ ID NO: 54; ou uma Vh da SEQ ID NO: 55 e uma Vl daSEQ ID NO: 31; ou uma Vh da SEQ ID NO: 58 e uma Vl da SEQ ID NO: 36;ou uma Vh da SEQ ID NO: 61 e uma Vl da SEQ ID NO: 41; ou uma Vh daSEQ ID NO: 62 e uma Vl da SEQ ID NO: 45. Tabelas A-B ilustram exemplosde emparelhamentos "misturados e emparelhados" de seqüências de ami-noácido de Vm e-VL-de-antiGorpQS diferentes da invenção. Figs.-1-3 são tabe-las que ilustram exemplos de uma seqüência de aminoácido de Vh e Vl queilustra regiões de FR e de CDR que podem ser fornecidas em andaimes al-ternativos para fornecer construções tendo a mesma atividade antagonísticade cMet ou similar que os anticorpos aqui.

Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção fornece umanticorpo recombinante isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmotendo pelo menos: uma região de Vh que compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 55-72 euma cadeia leve de Ig Iambda que compreendem uma seqüência de amino-ácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 77-80, em que oanticorpo especificamente liga c-Met.

Exemplos de combinações de Vh / cadeia leve de Ig Iambda in-cluem pelo menos: uma Vh da SEQ ID NO: 66 e uma cadeia leve de Iglambda da SEQ ID NO: 77; ou uma Vh da SEQ ID NO: 65 e uma cadeia levede Ig Iambda da SEQ ID NO: 78; ou uma região de Vh que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 69, uma cadeia leve de Ig Iambdada SEQ ID NO: 79; ou uma região de Vh da SEQ ID NO: 70 e uma cadeialeve de Ig Iambda da SEQ ID NO: 80.

Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção fornece umanticorpo recombinante isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmotendo pelo menos: uma região de Vh que compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 55-72 euma cadeia leve de Ig capa que compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81-84 em que o anti-corpo especificamente liga c-Met.

Exemplos de combinações de Vh / cadeia leve de Ig capa inclu-em pelo menos: uma região de Vh da SEQ ID NO: 71 e uma cadeia leve deIg capa da SEQ ID NO: 81; ou uma região de Vh da SEQ ID NO: 68 e umacadeia leve de Ig capa da SEQ ID NO: 82; ou uma região de Vh da SEQ IDNO: 67 e uma cadeia leve de Ig capa da SEQ ID NO: 83; ou uma região deVh da SEQ ID NO: 72 e uma cadeia leve de Ig capa da SEQ ID NO: 84._ — Em outro aspecto, a invenção fornece-um anticorpo recombinan-te isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo tendo pelo menos:uma cadeia de Vh que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecio-nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21-30 e uma cadeia de Vl quecompreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que con-siste nas SEQ ID NOs: 1-20.

Desse modo exemplos de combinações de cadeia pesada e leveincluem pelo menos: uma região de Vh que compreende a seqüência de nu-cleotídeo da SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve que com-preende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; ou uma região de Vhque compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 e uma regi-ão variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleotídeo daSEQ ID NO: 6; ou uma região de Vh que compreende a seqüência de nucle-otídeo da SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve que compre-ende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11; ou uma região de Vhque compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 28 e uma regi-ão variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleotídeo daSEQ ID NO: 15; ou uma região de Vh que compreende a seqüência de nu-cleotídeo da SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve que com-preende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18; ou uma região deVh que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30 e umaregião variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleotídeoda SEQ ID NO: 20; ou uma região de Vh que compreende a seqüência denucleotídeo da SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia leve quecompreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; ou uma regiãode Vh que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23 euma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleo-tídeo da SEQ ID NO: 1; ou uma região de Vh que compreende a seqüênciade nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 e uma cadeia leve, região variável quecompreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7; ou uma regiãode Vh que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 euma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleo-tídeo da SEQ ID NO: 8; ou uma região de-VH que-compreende a seqüênciade nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia leve quecompreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 9; ou uma regiãode Vh que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 euma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de nucleo-tídeo da SEQ ID NO: 10. Vide A-B que ilustram exemplos de emparelhamen-tos "misturados e emparelhados" de seqüências de nucleotídeo de Vh e Vlde anticorpos diferentes da invenção para exemplos adicionais de empare-Ihamentos de seqüências de nucleotídeo Vh e VL.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo recombinan-te isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo tendo pelo menos:uma cadeia de Vh que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecio-nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21-30 e uma cadeia leve de IgIambda que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do gru-po que consiste nas SEQ ID NOs: 73.

Desse modo um exemplo de uma combinação de Vh / cadeialeve de Ig Iambda inclui: uma região de Vh que compreende a seqüência denucleotídeo da SEQ ID NO: 23 e uma cadeia leve de Ig Iambda que compre-ende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 73.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo recombinan-te isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo tendo pelo menos:uma cadeia de Vh que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecio-nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21-30 e uma cadeia leve de Igcapa que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 74-76.

Desse modo exemplos de combinações de Vh e cadeia leve deIg capa incluem pelo menos: uma região de Vh que compreende a seqüên-cia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia levede Ig capa que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 74;ou uma região de Vh que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve de Ig capa que compreendea seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 75; ou uma região de Vh quecompreende a seqüência-de nucleotídeo-da-SEQ ID-NO: 27 e-uma regiãovariável de cadeia leve de Ig capa que compreende a seqüência de nucleo-tídeo da SEQ ID NO: 76.

Como aqui usado, um anticorpo humano compreende regiõesvariáveis de cadeia pesada ou leve que são "o produto de" ou "derivadas de"uma seqüência de linhagem germinal particular se as regiões variáveis doanticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina delinhagem germinal humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portando genes de imunoglobulina humana com o antígeno deinteresse, ou triar uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana exibi-da em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano do qual é oproduto ou derivado de uma seqüência de imunoglobulina de linhagem ger-minal humana pode ser identificado como tal comparando a seqüência deaminoácido do anticorpo humano às seqüências de aminoácido de imuno-globulinas de linhagem germinal humana e selecionando a seqüência deimunoglobulina de linhagem germinal humana que está na seqüência maisíntima (isto é, maior % de identidade) à seqüência do anticorpo humano. Umanticorpo humano do qual é o produto ou derivado de uma seqüência deimunoglobulina de linhagem germinal humana particular pode conter diferen-ças de aminoácido quando comparado à seqüência de linhagem germinal.Tais diferenças são devido a, por exemplo, pelo menos umas mutações so-máticas de ocorrência natural ou uma introdução intencionalmente de muta-ção loco-dirigida. Porém, um anticorpo humano selecionado é tipicamentepelo menos 90 % idêntica em seqüência de aminoácidos a uma seqüênciade aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem ger-minai humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpohumano como sendo de origem humana quando comparado às seqüênciasde aminoácido de linhagem germinal de imunoglobulina de outras espécies(por exemplo, seqüências de linhagem germinal murina). Em certos casos,um anticorpo humano pode ser pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou pelomenos 95 %, ou até mesmo pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de iden-tidade em seqüência de aminoácido à seqüência de aminoácido codificada-por um gene de imunoglobulina de linhagem germinal. Tipicamente, um anti-corpo humano derivado de uma seqüência de linhagem germinal humanaparticular exibirá não mais que 10 diferenças de aminoácido da seqüênciade aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinalhumana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais que 5,ou até mesmo não mais que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácido da se-qüência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagemgerminal.

ANTICORPOS DE IDENTIDADE

Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção tem pelomenos seqüências de nucleotídeo de cadeia pesada e leve de região variá-vel, ou seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve de região variá-vel, ou seqüências de nucleotídeo de Ig lambda, ou seqüências de aminoá-cido de Ig lambda, ou seqüências de nucleotídeo de Ig capa, ou seqüênciasde aminoácido de Ig capa ou seqüências de nucleotídeo de lgG4, ou se-qüências de aminoácido de lgG4 que têm homologia ou identidade às se-qüências de aminoácido e nucleotídeo dos anticorpos descritos aqui, e emque os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticor-pos de anti-c-Met da invenção, isto é, demonstram a atividade ou atividadesfuncionais parentais. As atividades funcionais parentais podem ser antago-nísticas ou agonísticas. Na maioria das modalidades, a atividade é antago-nística.

Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo recombinanteisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo uma região deVh e uma região variável de cadeia leve, de modo que a região de Vh com-preende uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %,95 % ou 99 % de identidade a uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste nas SEQ ID NOs: 55-72, a região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80 %, 85 %,90 %, 95 % ou 99 % de identidade a uma seqüência de aminoácido selecio-nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31-54, em que o anticorpoespecificamente liga a c-Met e o anticorpo apresenta pelo menos uma dasseguintes propriedades antagonísticas funeionais: o anticorpo induz interna-lização do receptor de cMet ou o anticorpo inibe ligação de um fator de cres-cimento de proteína para c-Met, ou o anticorpo inibe autofosforilação de c-Met assim impedindo ativação da via de c-Met, ou o anticorpo inibe supra-regulação da via de cMet que é o resultado da transdução de sinal, ou o an-ticorpo inibe ligação de c-Met, assim impedindo ou melhorando proliferaçãocelular, sobrevivência, migração, invasão ou alterações na morfologia, e es-pecialmente impedindo ou melhorando câncer tal como crescimento de tu-mor e ou metástase.

Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é responsivo e ativafosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular. Em uma modalida-de, a resposta celular é uma resposta curativa de ferida.

Em um exemplo adicional, a invenção fornece um anticorpo re-combinante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo umacadeia leve de Ig Iambda de modo que a cadeia leve de Ig Iambda compre-ende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80 % de identidade auma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQID NOs: 77-80. Em outras modalidades, o anticorpo liga especificamente a c-Met, e o anticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais aseguir: o anticorpo ativa induz internalização do receptor de cMet, o anticor-po inibe ligação de um fator de crescimento de proteína a c-Met, com tal ini-bição assim impedindo ativação do receptor, por exemplo, impedindo supra-regulação de via resultante de ativação de cMet e/ou transdução de sinal, ouo anticorpo impedindo ou melhorando proliferação celular, sobrevivência ce-lular, migração, invasão ou alterações em morfologia, ou o anticorpo antago-nizando atividade de c-Met, assim impedindo ou melhorando câncer tal co-mo crescimento de tumor e ou metástase.

Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ativa fosforilação dec-Met que estimula uma resposta celular.

Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo recombi-nante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo uma ca-deia leve de Ig capa em que: a cadeia leve de Ig capa tem uma seqüênciade aminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade a uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81-84; oanticorpo especificamente liga a c-Met, e o anticorpo apresenta pelo menosum das propriedades funcionais fornecidas acima e ao longo do relatóriodescritivo. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ativa fosforilação dec-Met que estimula uma resposta celular.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo recom-binante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo em que o anti-corpo é uma lgG4 de modo que a lgG4 tem uma seqüência de aminoácidoque é pelo menos 80 % de identidade a uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 89-96; o anticorpo especifi-camente liga a c-Met, e o anticorpo apresenta pelo menos uma das proprie-dades funcionais a seguir fornecidas acima e ao longo do relatório descritivo.Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é agonístico, e ativa fosforilaçãode c-Met que estimula uma resposta celular.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais, ou três ou mais das propriedades funcionais antagonísticasdebatidas aqui. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano,um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo recom-binante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo umaregião de Vh e uma região variável de cadeia leve, de modo que a região deVh é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80 %de identidade a uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo queconsiste nas SEQ ID NOs: 21-30; a região variável de cadeia leve é codifi-cada por uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80 % de identi-dade a uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consistenas SEQ ID NOs: 1-20; o anticorpo codificado especificamente liga a c-Met,e o anticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais forne-cidas acima e ao longo do relatório descritivo. Em uma modalidade alternati-va, o anticorpo ativa fosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em um outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo recom-binante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo umacadeia leve de Ig Iambda de modo que a cadeia leve de Ig Iambda codificadapor uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80 % de identidade auma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste da SEQID NO: 73; o anticorpo codificado especificamente liga a c-Met, e o anticorpoapresenta pelo menos uma das propriedades funcionais fornecidas acima eao longo do relatório descritivo. Em uma modalidade alternativa, o anticorpoé agonístico e ativa fosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo recombi-nante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo uma ca-deia leve de Ig capa em que: a cadeia leve de Ig capa codificada por umaseqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80 % de identidade a uma se-qüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:74-76; o anticorpo especificamente liga a c-Met, e o anticorpo apresenta pelomenos uma das propriedades funcionais fornecidas acima e ao longo do re-latório descritivo. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ativa fosforila-ção de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo recom-binante isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo em que o anti-corpo é uma lgG4 em que a lgG4 é codificada por uma seqüência de nucleo-tídeo que é pelo menos 80 % de identidade a uma seqüência de nucleotídeoselecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 85-88; o anticorpo co-dificado especificamente liga a c-Met, e o anticorpo apresenta pelo menosuma das propriedades funcionais fornecidas acima e ao longo do relatóriodescritivo. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é agonístico, e ativafosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais, ou três das propriedades funcionais antagonísticas debatidasaqui. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticor-po humanizado ou um anticorpo quimérico.

Em outras modalidades, as seqüências de aminoácido de Vhe/ou Vl-podem ser 50 %, 60·%, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %ou 99 % de identidade às seqüências expostas acima. Um anticorpo tendoregiões de Vh e Vl tendo identidade alta (isto é, 80 % ou mais) às regiões deVh e Vl das SEQ ID NOs: 31-72 respectivamente, pode ser obtido através demutagênese (por exemplo, mutagênese loco-dirigida ou mediada por PCR)das moléculas de ácido nucléico que codificam as SEQ ID NOs: 31-72, se-guido testando o anticorpo alterado codificado para a função retida (isto é, asfunções expostas acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

Em outras modalidades, as regiões variáveis de seqüências denucleotídeo de cadeia pesada e/ou de cadeia leve podem ser 60 %, 70 %,80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade às seqüênciasexpostas acima. Um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada ecadeia leve tendo identidade alta (isto é, 80 % ou mais) às cadeias pesadasde região variável da SEQ ID NO: 21-30 e cadeias leve de região variável daSEQ ID NO: 1-20 respectivamente, pode ser obtido através de mutagênese(por exemplo, mutagênese loco-dirigida ou mediada por PCR) das moléculasde ácido nucléico compreendendo as SEQ ID NOs: 1-30 seguido testando oanticorpo alterado codificado para função retida (isto é, as funções expostasacima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

Em outras modalidades, as seqüências de aminoácido de cadeialeve de Ig Iambda podem ser 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idênticas às seqüências expostas acima. Um anticorpotendo uma cadeia leve de Ig Iambda com identidade alta (isto é, 80 % oumais) às cadeias leves de Ig Iambda das SEQ ID NOs: 77-80 respectivamen-te, pode ser obtido através de mutagênese (por exemplo, mutagênese Ioco-dirigida ou mediada por PCR) das moléculas de ácido nucléico que codifi-cam as SEQ ID NOs: 77-80, seguido testando o anticorpo alterado codifica-do para função retida (isto é, as funções expostas acima) usando os ensaiosfuncionais descritos aqui.

Em outras modalidades, a seqüência de nucleotídeo de cadeialeve de Ig Iambda pode ser 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99 % idêntica à seqüência exposta acima. Um anticorpo tendo umacadeia leve de Ig Iambda com identidade-alta (isto é, 80 % ou-mais) à cadeialeve de Ig Iambda da SEQ ID NO: 73 respectivamente, pode ser obtido atra-vés de mutagênese (por exemplo, mutagênese loco-dirigida ou mediada porPCR) das moléculas de ácido nucléico que compreendem SEQ ID NO: 73seguido testando o anticorpo alterado codificado para função retida (isto é,as funções expostas acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

Em outras modalidades, as seqüências de aminoácido de cadeialeve de Ig capa podem ser 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idênticas às seqüências expostas acima. Um anticorpotendo uma cadeia leve de Ig capa com identidade alta (isto é, 80 % ou mais)a cadeias leves de Ig capa das SEQ ID NOs: 81-84 respectivamente, podeser obtido através de mutagênese (por exemplo, mutagênese loco-dirigidaou mediada por PCR) das moléculas de ácido nucléico que codificam asSEQ ID NOs: 81-84, seguido por teste do anticorpo alterado codificado parafunção retida (isto é, as funções expostas acima) usando os ensaios funcio-nais descritos aqui.

Em outras modalidades, a seqüência de nucleotídeo de cadeialeve de Ig capa pode ser 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %ou 99 % idêntica ou homóloga à seqüência exposta acima. Um anticorpotendo uma cadeia leve de Ig capa com identidade alta (isto é, 80 % ou mais)às cadeias leves de Ig capa das SEQ ID NOs: 74-76 respectivamente, podeser obtido através de mutagênese (por exemplo, mutagênese loco-dirigidaou mediada por PCR) das moléculas de ácido nucléico compreendendo asSEQ ID NOs: 74-76 seguido testando o anticorpo alterado codificado parafunção retida (isto é, as funções expostas acima) usando os ensaios funcio-nais descritos aqui.

Em outras modalidades, o anticorpo que é uma lgG4 pode ser50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica àsseqüências de aminoácido expostas acima. Uma lgG4 com identidade alta(isto é, 80 % ou mais) às composições de lgG4 das SEQ ID NOs: 89-96 res-pectivamente, pode ser obtida através de mutagênese (por exemplo, muta-gênese loco-dirigida ou mediada por PCR) das moléculas de ácido nucléicoque codificam SEQ ID NOs: 89-96, seguido por teste do anticorpo alteradocodificado derivado através de mutagênese para função retida (isto é, asfunções expostas acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

Em outras modalidades, o anticorpo é uma lgG4 que é 60 %, 70%, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à seqüência denucleotídeo exposta acima. Uma lgG4 com identidade alta (isto é, 80 % oumais) à lgG4 das SEQ ID NOs: 85-88 respectivamente, pode ser obtido atra-vés de mutagênese (por exemplo, mutagênese loco-dirigida ou mediada porPCR) das moléculas de ácido nucléico compreendendo SEQ ID NOs: 85-88seguido testando o anticorpo alterado codificado para função retida (isto é,as funções expostas acima) usando os ensaios funcionais descritos aqui.Como aqui usado, a porcentagem de identidade entre duas se-qüências de aminoácido ou duas seqüências de nucleotídeo é equivalente àporcentagem de identidade entre as duas seqüências, e estes termos sãousados alternadamente aqui. A porcentagem de identidade entre as duasseqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadaspelas seqüências (isto é, % homologia = # de posições idênticas/total # deposições χ 100), levando em conta o número de intervalos, e o comprimentode cada intervalo que necessita ser introduzido para alinhamento ótimo dasduas seqüências. A comparação das seqüências e determinação da porcen-tagem de identidade entre duas seqüências podem ser realizadas usandoum algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não-limitativos abaixo.

A porcentagem de identidade entre duas seqüências de aminoá-cido ou duas seqüências de nucleotídeo pode ser determinada usando oalgoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) emque foi incorporado no programa ALIGN (versão 2,0), usando uma tabela deresíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a porcentagem de iden-tidade entre duas seqüências de aminoácido ou duas seqüências de nucleo-tídeo pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que foi incorporado no programa GAP no paco-te de software GGG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou umamatriz de Blossom 62 ou uma matriz de PAM250, e um peso de intervalo de16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

Adicionalmente ou como alternativa, as seqüências de proteínada presente invenção podem também ser usadas como uma "seqüência deconsulta" para executar uma pesquisa junto às bases de dados públicas pa-ra, por exemplo, identificar as seqüências relacionadas. Tais pesquisas po-dem ser executadas usando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, etal., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de proteína de BLAST po-dem ser executadas com o programa XBLAST, contagem = 50, comprimentode palavra = 3 para obter as seqüências de aminoácido homólogas às molé-cuias de anticorpo da invenção. Para obter alinhamentos intervalados parapropósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizada como descritoem Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ao utilizarprogramas BLAST e Gapped BLAST1 os parâmetros predefinidos dos res-pectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.Vide http:lwww.ncbi.nhn.nih.gov.

Condições que permitirão as seqüências de nucleotídeo hibridarcom as seqüências de nucleotídeo mostradas aqui, podem ser determinadasde acordo com as técnicas conhecidas. Hibridação das seqüências de nu-cleotídeo é realizada sob condições de severidade reduzida, severidade mé-dia ou até mesmo condições rigorosas. Condições de severidade baixa e-xemplares são um tampão contendo 35-40 % formamida com a solução de5x Denhardt, 0,5 % SDS e IxSSPE a 37° C. Condições de severidade mé-dia exemplares são um tampão contendo 40-45 % formamida com soluçãode 5xDenhardt, 0,5 % SDS, e 1x SSPE a 42e C. Condições de severidadealta exemplares são um tampão contendo 50 % formamida com a soluçãode 5x Denhardt, 0,5 % SDS e IxSSPE a 429 C ou temperatura mais alta,dependendo da porcentagem G + C e do comprimento dos polinucleotídeos.Vide J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual {2-ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory).

Hibridação das seqüências de nucleotídeo sob qualquer umadas condições de severidade exemplares acima é executada em solução ecolhida em um filtro. Alternativamente, hibridação das seqüências de nucleo-tídeo sob qualquer uma das condições de severidade exemplares acima éexecutada em géis, por exemplo Southern Blotting.

ANTICORPOS COM MODIFICAÇÕES CONSERVADORAS

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem uma re-gião de Vh incluindo seqüências selecionadas do grupo das SEQ ID NOs:55-72 e uma região variável de cadeia leve incluindo seqüências seleciona-das do grupo das SEQ ID NOs: 31-54, de modo que uma ou mais destasseqüências têm seqüências de aminoácido especificadas com base nos an-ticorpos descritos aqui ou modificações conservadoras dos mesmos, e osanticorpos têm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de anti-c-Met da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece um anticorpoisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo uma cadeia deVh e uma cadeia de Vl de modo que a cadeia de Vh tem seqüências de ami-noácido selecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 55-72 e modificações con-servadoras das mesmas; e a cadeia de Vl tem seqüências de aminoácidoselecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 31-54 e modificações conservado-ras das mesmas; o anticorpo especificamente liga a c-Met; e o anticorpo a-presenta pelo menos uma das propriedades funcionais a seguir: o anticorpoativa induz internalização do receptor de cMet, o anticorpo inibe ligação deum fator de crescimento de proteína a c-Met, com tal inibição assim impe-dindo ativação do receptor, por exemplo, impedindo supra-regulação da viaresultante da ativação de cMet e/ou transdução de sinal, ou o anticorpo im-pedindo ou melhorando a proliferação celular, sobrevivência da célula, mi-gração, invasão ou alterações na morfologia, ou o anticorpo antagonizando aatividade de c-Met, assim impedindo ou melhorando câncer tais como cres-cimento de tumor e ou metástase.

Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é agonístico e ativafosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é uma cadeialeve de Ig Iambda tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po das SEQ ID NOs: 77-80, de modo que uma ou mais destas seqüênciastêm seqüências de aminoácido derivadas das seqüências de aminoácidodos anticorpos descritos aqui, tendo modificações conservadoras das mes-mas, de modo que os anticorpos derivados retêm as propriedades funcionaisdesejadas dos anticorpos de anti-c-Met da invenção. Conseqüentemente, ainvenção fornece um anticorpo parental isolado, ou porção de ligação deantígeno do mesmo, tendo uma cadeia leve de Ig Iambda de modo que acadeia leve de Ig Iambda tem seqüências de aminoácido selecionadas dogrupo das SEQ ID NOs: 77-80 e modificações conservadoras das mesmas;o anticorpo especificamente liga a c-Met; e o anticorpo apresenta pelo me-nos uma das propriedades antagonísticas funcionais descritas aqui.Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é agonístico e ativafosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular.

Em outras modalidades, a invenção provê um anticorpo comuma cadeia leve de Ig capa tendo uma seqüência de aminoácido seleciona-da do grupo das SEQ ID NOs: 81-84, de modo que um ou mais destes anti-corpos têm uma seqüência de aminoácido derivada dos anticorpos descritosaqui, tendo modificações conservadoras da mesma, e em que os anticorposdemonstram as propriedades funcionais dos anticorpos de anti-c-Met de ori-gem da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece um anticorpo mo-noclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, tendo umacadeia leve de Ig capa de modo que a cadeia leve de Ig capa tem seqüên-cias de aminoácido selecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 81-84 e modifi-cações conservadoras das mesmas; o anticorpo especificamente liga a c-Met; e o anticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionaisfornecidas aqui.

Em outras modalidades, um anticorpo da invenção é uma lgG4tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo das SEQ IDNOs: 89-96, em que uma ou mais destas seqüências têm uma seqüência deaminoácido derivada de uma seqüência de aminoácido parental dos anticor-pos descritos aqui ou modificações conservadoras da mesma, e os anticor-pos demonstram as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos deanti-c-Met da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece um anticor-po isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, em que o anticorpoé uma lgG4, em que: a lgG4 tem uma seqüência de aminoácido selecionadado grupo das SEQ ID NOs: 89-96 e modificações conservadoras das mes-mas; o anticorpo especificamente liga a c-Met; e o anticorpo apresenta pelomenos uma das propriedades antagonísticas funcionais descritas aqui.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais, ou três ou mais das propriedades funcionais antagonísticaslistadas debatidas acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticor-pos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.

Como aqui usado, o termo "modificações de seqüência conser-vadoras" é intencionado referir-se às modificações de aminoácido que nãosignificativamente afetam ou alteram as características de ligação do anti-corpo que contém a seqüência de aminoácido. Tais modificações conserva-doras incluem substituições, adições e deleções de aminoácido como descri-tas aqui. As modificações são introduzidas em um anticorpo da invenção portécnicas padrões conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida emutagênese mediada por PCR.

Substituições de aminoácido conservadoras substituem um resí-duo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente que tem umacadeia lateral química e fisicamente similar. Famílias de resíduos de amino- ácido que têm cadeias laterais similares são conhecidas na técnica. Estasfamílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo,lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido as-pártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exem-plo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, tripto-fano), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina,isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas(por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (porexemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um oumais resíduos de aminoácido podem ser substituídos dentro das regiões deCDR de um anticorpo da invenção com outros resíduos de aminoácido damesma família de cadeia lateral, e ò anticorpo alterado pode ser testado pa-ra função retida usando os ensaios funcionais descritos aqui.ESTRUTURAS DE ANTICORPO

Uma ampla variedade de estruturas ou andaimes de anticorpo /imunoglobulina pode ser empregada desde que o polipeptídeo resultanteincluem uma ou mais região de ligação que seja específica para a proteínade cMet das seqüências exemplares aqui. Tais estruturas ou andaimes in-cluem os 5 idiotipos principais das imunoglobulinas humanas, ou fragmentosdos mesmos (tais como aqueles revelados em outro lugar aqui), e incluemimunoglobulinas de outras espécies animais, preferivelmente tendo aspectoshumanizados. Anticorpos de cadeia pesada simples tais como aqueles iden-tificados em camelídeos são de interesse particular nesta consideração. Es-truturas novas, andaimes e fragmentos continuam sendo descobertos e de-senvolvidos por aqueles versados na técnica.

Alternativamente, futuras estruturas ou andaimes de não-imunoglobulina conhecidas podem ser empregadas, contanto que elas com-preendam uma região de ligação específica para a proteína de c-Met. Taiscompostos são conhecidos aqui como "polipeptídeos que compreendemuma região de ligação c-Met-específica". Estruturas ou andaimes de não-imunoglobulina conhecidas incluem Adnectinas (fibronectina) (CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zuri-que, Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e A-blynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIina) (Pieris Proteolab AG,Freising, Alemanha), imuno-farmacêuticos modulares pequenos (TrubionPharmaceutics Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc. (Mountain View,CA)), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquiti-na) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

ANTICORPOS QUE LIGAM AO MESMO EPÍTOPO COMO ANTICORPO DEANTI-C-Mets DA INVENÇÃO

Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos que ligamao mesmo epítopo como os vários anticorpos de anti-c-Met da invenção for-necidos aqui o faz. Tais anticorpos adicionais podem ser identificados combase em sua habilidade para competir cruzado (por exemplo, para competiti-vamente inibir a ligação, em uma maneira estatisticamente significativa) comoutros anticorpos da invenção em ensaios de ligação de c-Met padrões. Ahabilidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de anticorpos tendohabilidade conhecida para ligar a c-Met humano demonstra que o anticorpode teste pode competir com aquele anticorpo. Um tal anticorpo pode, de a-cordo com a teoria não-limitativa, ligar o mesmo epítopo ou um relacionado(por exemplo, um estruturalmente similar ou espacialmente próximo) em c-Met humano como o anticorpo com que compete. Tais anticorpos podem serpreparados e isolados como descritos nos Exemplos.

ANTICORPOS DE CAMELÍDEO

Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família de cameloe dromedário (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius) incluindo mem-bros mundiais novos tais como espécies de Ihama (Lama paccos, Lamaglama e Lamavicugna) foram caracterizadas com respeito a tamanho, com-plexidade estrutural e antigenicidade em sujeitos humanos. Certos anticor-pos de IgG desta família de mamíferos como se encontram na natureza ca-recem de cadeias leves, e desse modo têm estruturas que são distintas daestrutura quaternária de quatro cadeias típica tendo duas cadeias pesadas eduas leve, características dos anticorpos de outros animais. VidePCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicada em 3 de março de 1994).

Uma região do anticorpo de camelídeo que é o domínio de vari-ável simples pequeno identificado como VHh pode ser obtida através de en-genharia genética para render uma proteína pequena tendo afinidade altapor um alvo, resultando em uma proteína derivada anticorpo de peso mole-cular baixo conhecida como um "nanocorpo de camelídeo". Vide patente U.S. número 5.759.808 emitido em 2 de junho de 1998; vide também Stijle-mans, B., et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M., et al.,2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M., et al. 2003 BioconjugadoChem 14: 440 448; Cortez-Retamozo, V., et al. 2002 Int J Câncer 89: 456-62; e Lauwereys, M., et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Bibliotecas enge-nheiradas de anticorpos de camelídeo e fragmentos de anticorpo estão co-mercialmente disponíveis, por exemplo, de Ablynx, Ghent, Bélgica. Como éconhecido na técnica por outros anticorpos de origem não-humana, uma se-qüência de aminoácido de um anticorpo de camelídeo pode ser alterada re-combinantemente para obter uma seqüência que mais estritamente se as-semelha a uma seqüência humana, isto é, o nanocorpo pode ser humaniza-do. Desse modo a antigenicidade natural baixa de anticorpos de camelídeopara humanos pode ser também reduzida.O nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular aproxima-damente de um décimo do de uma molécula de IgG humana, e a proteínatem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma conseqüênciado tamanho pequeno é a habilidade dos nanocorpos de camelídeo para ligara sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis a proteínas de anticor-pos maiores, isto é, nanocorpos de camelídeo são úteis como reagentes pa-ra detectar antígenos que são do contrário secretos usando técnicas imuno-lógicas clássicas, e são também úteis como possíveis agentes terapêuticos.

Por exemplo, ainda outra conseqüência de tamanho pequeno é que um na-nocorpo de camelídeo pode inibir como resultado da ligação a um sítio es-pecífico em um sulco ou fenda estreita de uma proteína alvo, e conseqüen-temente pode servir em uma capacidade que mais estritamente se asseme-lha à função de um fármaco de peso molecular baixo clássico que a de umanticorpo de peso molecular alto clássico.

O baixo peso molecular e tamanho compacto também resultamem nanocorpos de camelídeo que são extremamente termoestáveis, está-veis a pH extremo e para digestão proteolítica estável, e têm antigenicidadebaixa. Outra conseqüência é que nanocorpos de camelídeo passam facil-mente do sistema circulatório para tecidos, isto é, para extravasar, e atémesmo cruza a barreira hematoencefálica e assim pode ser engenheiradopara tratar distúrbios que afetam o tecido nervoso. Nanocorpos podem tam-bém facilitar o transporte de fármaco ao longo da barreira de hematoencefá-lica. Vide pedido de patente U. S. 20040161738 publicada em 19 de agostode 2004. Estas características combinadas com a antigenicidade baixo paraseres humanos indicam grande potencial terapêutico. Também, estas molé-culas podem ser expressas completamente em células procarióticas taiscomo E. colisão expressas como proteínas de fusão com bacteriófago, e asproteínas assim expressas são funcionais.

Conseqüentemente, uma característica da presente invenção éum anticorpo ou nanocorpo de camelídeo que tem afinidade alta por proteínade c-Met alvo. Em certas modalidades aqui, o anticorpo ou nanocorpo decamelídeo é produzido naturalmente no animal camelídeo, isto é, é produzi-do pelo camelídeo seguindo imunização com proteína de c-Met alvo ou umfragmento de peptídeo da mesma, usando técnicas descritas aqui para ou-tros anticorpos, ou é recombinantemente produzido em um animal camelí-deo transgênico. Alternativamente, o nanocorpo de camelídeo de anti-c-Meté engenheirado, isto é, produzido pela seleção de por exemplo uma bibliote-ca de fago que exibe proteínas de nanocorpo de camelídeo apropriadamentemutagenizadas usando procedimentos de panning, com c-Met como um alvocomo descrito nos exemplos aqui. Nanocorpos engenheirados podem tam-bém ser personalizados através de engenharia genética para terem umameia-vida em um sujeito recipiente de 45 minutos a duas semanas.

ANTICORPOS ENGENHEIRADOS E MODIFICADOS

Um anticorpo da invenção pode ser preparado usando um anti-corpo tendo uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl, seqüências de ca-deia leve de Ig lambda, ou seqüências de cadeia leve de Ig capa mostradasaqui como material de partida, isto é, como uma seqüência parental, paracriar um anticorpo modificado derivado que é um anticorpo modificado quepode ter as propriedades alteradas e melhoradas comparado ao anticorpode partida. Um anticorpo pode ser engenheirado modificando um ou maisresíduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (i. e., Vh e/ou Vl) oudentro da cadeia leve de Ig lambda apenas, ou dentro da cadeia leve de Igcapa apenas, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma oumais regiões da estrutura. Adicionalmente ou como alternativa, um anticorpopode ser engenheirado modificando os resíduos dentro da(s) região(ões)constante(s), por exemplo para alterar uma função efetora do anticorpo.

Um tipo de engenharia de região variável que pode ser executa-da é enxerto de CDR. Anticorpos interagem predominantemente com antí-genos alvos através de resíduos de aminoácido que estão localizados nasregiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve(CDRs). Por este motivo, as seqüências de aminoácido dentro das CDRssão mais diversas entre anticorpos individuais que as seqüências fora dasCDRs. Porque seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das inte-rações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinan-tes que imitam as propriedades dos anticorpos de ocorrência natural especí-ficos construindo vetores de expressão que incluem as seqüências de CDRde um anticorpo de ocorrência natural, enxertadas sobre as seqüências deestrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, porexemplo, Riechmann, L., et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P., et al.,1986 Nature 321:522-525; Queen, C., et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Vide.U.S.A 86:10029-10033; patente U. S. No. 5.225.539 para Winter e patentesU. S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.)

Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas de bases dedados públicas de DNA ou referências publicadas que incluem seqüênciasde gene de anticorpo de linhagem germinal. Por exemplo, seqüências deDNA de linhagem germinal para genes humanos de região variável de ca-deia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados de seqüênciade linhagem germinal humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), como também em Kabat, Ε. A., et al., 1991 Sequen-ces of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U. S. Departmentof Health and Human Services, Publicação de NIH No. 91-3242; Tomlinson,I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. JImunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um destes são expressamenteincorporados aqui por referência. Foi encontrado que sob certas circunstân-cias é benéfico mutar resíduos dentro das regiões de estrutura para manterou intensificar a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo (vide por e-xemplo, Patentes U. S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 deQueen et al).

Outro tipo de modificação da região variável é mutação dos resí-duos de aminoácido dentro das regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de Vhe/ou Vl para assim melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por e-xemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como "maturação deafinidade". Mutagênese loco-dirigida ou mutagênese mediada por PCR po-dem ser executadas para introduzir a(s) mutação(ões), e o efeito conseqüen-te na ligação do anticorpo ou em outra propriedade funcional de interesse éavaliado por ensaios in vitro ou in vivo como descritos aqui e fornecidos nosExemplos. Modificações conservadoras (como debatidas acima) podem serintroduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções deaminoácido. Tipicamente, não mais que um, dois, três, quatro ou cinco resí-duos são alterados dentro de uma região de CDR, embora alterações adi-cionais sejam também intencionadas.

Anticorpos engenheirados da invenção incluem aqueles em quemodificações foram feitas nos resíduos da estrutura dentro das cadeias Vhe/ou VL, e/ou leve de Ig lambda, e/ou cadeias leves de Ig capa, por exemplopara melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificaçõesde estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Porexemplo, um método é para "re-mutar" um ou mais resíduos da estruturapara aquele da seqüência de linhagem germinal correspondente. Mais espe-cificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resí-duos de estrutura que diferem da seqüência de linhagem germinal da qual oanticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando asseqüências de estrutura de anticorpo às seqüências de linhagem germinaldas quais o anticorpo é derivado. Para retornar as seqüências da região deestrutura para sua configuração de linhagem germinal, as mutações somáti-cas são re-mutadas para os resíduos de linhagem germinal, por exemplo,por mutagênese dirigida ou mutagênese mediada por PCR. Tais anticorposre-mutados são também abrangidos dentro da invenção.

Outro tipo de modificação da estrutura envolve mutar um oumais resíduos dentro da região de estrutura, ou até mesmo dentro de umaou mais regiões de CDR, para remover os epítopos de célula T para assimreduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Este método é tambémreferido como "desimunização" e é descrito em mais detalhe na Publicaçãode patente U. S. No. 20030153043 por Carr et al.

Além disso ou alternativamente às modificações feitas dentrodas regiões de estrutura ou de CDR, anticorpos da invenção podem ser en-genheirados para incluir modificações dentro da região de Fc, tipicamentepara alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais comomeia-vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/oucitotoxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um anticorpo dainvenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais me-tades químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alte-rar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades fun-cionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em mais de-talhe abaixo. A numeração dos resíduos na região de Fc é a do índice EU deKabat.

Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modifica-da de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça éalterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este método é descritotambém na patente U. S. No. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resí-duos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo,para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou aumentar ou di-minuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de dobradiça de Fc de um anti-corpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais espe-cificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na regi-ão de interface do domínio de CH2-CH3 do fragmento de dobradiça de Fc demodo que o anticorpo tem ligação prejudicada da proteína de StaphylococcylA (SpA) com relação à ligação de SPA do domínio de dobradiça de Fc nati-vo. Este método é descrito em mais detalhe na patente U. S. No. 6.165.745por Ward et al.

Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentarsua meia-vida biológica. Vários métodos são possíveis. Por exemplo, umaou mais das mutações a seguir podem ser introduzidas: T252L, T254S,T256F, como descritas na patente U. S. No. 6.277.375 para Ward. Alternati-vamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alteradodentro da região de CH1 ou CL para conter um receptor de aproveitamentoque liga o epítopo tirado das duas alças de um domínio de CH2 de uma re-gião de Fc de uma IgG, como descrito nas patentes U. S. Nos. 5.869.046 e6.121.022 por Presta et al.

Em ainda outras modalidades, a região de Fc é alterada substi-tuindo pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoáci-do diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, umou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácidodiferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um Ii-gante efetor mas retenha a habilidade de ligação de antígeno do anticorpode origem. O Iigante efetor ao qual afinidade é alterada pode ser, por exem-plo, um receptor de Fc ou o componente de C1 de complemento. Este méto-do é descrito em mais detalhe nas patentes U. S. Nos. 5.624.821 e5.648.260, ambos por Winter et al.

Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionadosdos resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de a -minoácido diferente de modo que o anticorpo tem ligação alterada de C1qe/ou citotoxicidade dependente de complemento reduzida ou abolida (CDC).Este método é descrito em mais detalhe nas patentes U. S. Nos. 6.194.551por Idusogie et al.

Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido sãoalterados assim para alterar a habilidade do anticorpo para fixar o comple-mento. Este método é descrito também na Publicação de PCT WO 94/29351por Bodmer et al.

Em ainda outra modalidade, a região de Fc é modificada paraaumentar a habilidade do anticorpo para mediar citotoxicidade celular de-pendente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo porum receptor de Fcy modificando um ou mais aminoácidos. Este método édescrito também na Publicação de PCT WO 00/42072 por Presta. Além dis-so, os sítios de ligação em IgGI humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRnforam mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (videShields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Anticorpos que têmtais regiões de Fc modificadas estão dentro do escopo das composiçõesaqui.

Em ainda outra modalidade, a glicosilação dè um anticorpo émodificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, oanticorpo carece de glicosilação). Glicosilação pode ser alterada, por exem-pio, para aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno de c-Met alvo.Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alte-rando um ou mais sítios de glicosilação dentro da seqüência do anticorpo.

Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitasque resulta em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estruturade região variável para assim eliminar a glicosilação naquele sítio. Tal agli-cosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo por antígeno. Um tal mé-todo é descrito em mais detalhe nas patentes U. S. Nos. 5.714.350 e6.350.861 por Co et al.

Adicionalmente ou como alternativa, um anticorpo pode ser feitotendo um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosiladotendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendoestruturas de GIcNac de bifurcação aumentadas. Tais padrões de glicosila-ção alterados foram demonstrados aumentar a atividade de ADCC dos anti-corpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exem-plo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinariaenzimática de glicosilação alterada. Células com maquinaria de glicosilaçãoalterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hos-pedeiras em que para expressar anticorpos recombinantes da invenção paraassim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP1.176.195 por Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene deFUT8 funcionalmente rompido que codifica uma fucosil transferase de modoque os anticorpos expressos em um tal linhagem celular exibem hipofucosi-lação. Publicação de PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma Iinha-gem celular de CHO variante, células Lecl3, com habilidade reduzida paraligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipo-fucosilação dos anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide tam-bém Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Publicaçãode PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celulares enge-nheiradas para expressar glicosil transferases de modificação da glicoproteí-na (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIII)) demodo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares engenheiradaexibem estruturas de GIcNac de bifurcação aumentadas que resultam naatividade de ADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana et al.,1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pelainvenção é pegilação. Um anticorpo pode ser pegilado para, por exemplo,aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegi-Iar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, é tipicamente reagidocom polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeí-do de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG se tornamcovalentemente ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A pegilaçãopode ser realizada por uma reação de acilação ou por uma reação de alqui-lação com uma molécula de PEG reativo (ou um polímero solúvel em águareativo análogo). Como aqui usado, o termo "polietileno glicol" é intenciona-do que abranger quaisquer das formas de PEG que foram usadas para deri-vatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, oanticorpo a ser pegilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para pegilarproteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorposda invenção. Vide por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0401 384 por Ishikawa et al.

MÉTODOS DE CRIAR ANTICORPOS

Como debatido acima, os anticorpos de anti-c-Met tendo se-qüências de cadeia VH, VL, leve de Ig Iambda ou cadeia leve de Ig capa mos-tradas aqui podem ser usados para criar anticorpos de anti-c-Met adicionaismodificando os resíduos nas cadeias Vh e/ou, VL, e/ou leve de Ig Iambdae/ou seqüências de cadeia leve de Ig capa, ou modificando a(s) região(ões)constante(s) ligada(s) a estas. Desse modo, em outro aspecto da invenção,as características estruturais de um anticorpo de anti-c-Met da invenção sãousadas para criar anticorpos de anti-c-Met estruturalmente relacionados re-tendo pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos antagonísticosou agonísticos parentais da invenção, tais como ligação a c-Met humano etambém inibindo uma ou mais propriedades funcionais de c-Met (por exem-pio, induzindo internalização, impedindo ativação, por exemplo, uma supra-regulação resultando da transdução de sinal, impedindo ou melhorando asobrevivência da proliferação, migração, invasão celulares ou alterações emmorfologia ou o anticorpo inibe ligação de receptor de c-Met impedindo oumelhorando câncer tal como crescimento de tumor e ou metástase) ou nocaso agonístico, ativando fosforilação de c-Met e estimulando uma respostacelular, como também outras propriedades funcionais fornecidas aqui.

Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR dos anticorpos dapresente invenção, ou mutações dos mesmos, podem ser combinadas re-combinantemente com as regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRspara criar anticorpos de anti-c-Met, recombinantemente engenheirados, adi-cionais da invenção, como debatidos acima. Outros tipos de modificaçõesincluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para ométodo de engenharia é uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl forneci-das aqui, ou uma ou mais regiões de CDR das mesmas a serem usadascomo uma seqüência parental. Para criar o anticorpo engenheirado, não énecessário de fato preparar (isto é, expressar como uma proteína) um anti-corpo tendo uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl fornecidas aqui, ouuma ou mais regiões de CDR das mesmas. De preferência, a informaçãocontida na(s) seqüência(s) de nucleotídeo ou aminoácido é usada como omaterial de partida para técnicas mutacionais conhecidas na técnica paracriar uma(s) seqüência(s) de "segunda geração" derivada(s) da(s) seqüên-cia(s) original(is) e depois a(s) seqüência(s) de "segunda geração" de nucle-otídeo é/são preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.

Conseqüentemente, em certas modalidades, a invenção forneceum método para preparar um anticorpo de anti-c-Met tendo como material departida parental uma seqüência de anticorpo de Vh tendo uma seqüênciaselecionada do grupo das SEQ ID NOs: 55-72 e uma seqüência de anticorpode Vl tendo uma seqüência selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 31-54.O método envolve alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro daseqüência parental de anticorpo de Vh e/ou Vl para criar pelo menos umaseqüência de anticorpo alterada; e expressar a seqüência de anticorpo alte-rada como uma proteína.

Em outras modalidades, a invenção fornece um método parapreparar um anticorpo de anti-c-Met que compreende: uma seqüência deanticorpo de cadeia leve de Ig Iambda tendo uma seqüência selecionada dogrupo das SEQ ID NOs: 77-80, e alterar pelo menos um resíduo de aminoá-cido dentro da seqüência de anticorpo de cadeia leve de Ig Iambda para criarpelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; e expressar a seqüênciade anticorpo alterada como uma proteína.

Em modalidades relacionadas, a invenção fornece um métodopara preparar um anticorpo de anti-c-Met que compreende: uma seqüênciade anticorpo de cadeia leve de Ig capa tendo uma seqüência selecionada dogrupo das SEQ ID NOs: 81-84; alterar pelo menos um resíduo de aminoáci-do dentro da seqüência de anticorpo de cadeia leve de Ig capa para criarpelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; e expressar a seqüênciade anticorpo alterada como uma proteína.

O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais, outrês ou mais das propriedades funcionais debatidas aqui.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem seravaliadas usando ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou descritos a-qui, tais como aqueles expostos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Em certas modalidades dos métodos de criar anticorpos da in-venção, mutações podem ser fortuita ou seletivamente introduzidas ao longode toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo de anti-c-Met e os anticorpos de anti-c-Met modificados resultantes podem ser ex-pressos e triados para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcio-nais como descritas aqui. Métodos mutacionais foram descritos na técnica.

Por exemplo, Publicação de PCT WO 02/092780 por Short descreve méto-dos para criar e triar mutações de anticorpo usando mutagênese de satura-ção, montagem de ligação sintética, ou uma combinação destes. Alternati-vãmente, Publicação de PCT WO 03/074679 por Lazar et al. descreve mé-todos de usar métodos de triagem computacional para otimizar as proprie-dades físico-químicas dos anticorpos.ANTICORPOS DA INVENÇÃO

As seqüências de nucleotídeo e polipeptídeo são fornecidas dosanticorpos da invenção abaixo. As seqüências de aminoácido e de nucleotí-deo dos anticorpos parentais, ou primeira triagem, são fornecidas na TabelaA e Tabela C, respeitosamente. As seqüências de aminoácido e nucleotídeodos anticorpos de afinidade melhorada quando comparados aos anticorposparentais são fornecidas na Tabela B e Tabela D, respeitosamente.TABELA A: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE REGIÕES VARIÁVEIS DECADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS PARENTAIS DE Fab DE AN-TI-cMet

<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>TABELA Β: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE REGIÕES VARIÁVEIS DECADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS DE FAB DE ANTI-cMet ME-LHORADOS NA AFINIDADE

<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table>

TABELA C: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE REGIÕES VARIÁVEIS DECADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS PARENTAIS DE Fab DE AN-TI-cMet<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table>

TABELA D: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE REGIÕES VARIÁVEIS DECADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS DE FAB DE ANTI-cMet ME-LHORADOS NA AFINIDADE<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>

Seqüências de nucleotídeo relacionadas adicional que são con-templadas dentro do escopo da invenção têm, por exemplo, alterações debase oscilantes, uso de códon otimizado, seqüências otimizadas para ex-pressão de hospedeiro, por exemplo, modificações para remover as seqüên-cias de encaixe secretas, e mutações conservadoras. Seqüências de poli-peptídeo relacionadas adicionais são contempladas dentro do escopo dainvenção que têm, por exemplo, alterações conservadoras de aminoácido,ou contêm seqüências de aminoácido adicionais tais como marcadores6xHis ou outros marcadores são fundidas a uma segunda seqüência de poli-peptídeo, ou contêm alterações de resíduo que reduzem a resposta imuneao anticorpo terapêutico, ou que têm resíduos de FR1, FR2, FR3 ou FR4modificados, regiões de FR e CDR são fornecidas nas FIGs. 1-3. Seqüên-cias de CDR preferidas são como fornecidas nas Figuras.

Doenças dependentes de proteína cinase são doenças especi-almente proliferativas, preferivelmente um tumor benigno ou especialmentemaligno, mais preferivelmente carcinoma de cérebro, rim, fígado, glândulaad-renal, bexiga, mama, estômago (tumores especialmente gástricos), ová-rios, cólon, reto, próstata, pâncreas, pulmão, vagina, tiróide, sarcoma, glio-blastomas, mieloma múltiplo ou câncer gastrintestinal, especialmente carci-noma de cólon ou adenoma colorretal, ou um tumor de pescoço e cabeça,uma hiperproliferação epidérmica, especialmente psoríase, hiperplasia dapróstata, uma neoplasia, especialmente de caráter epitelial, preferivelmentecarcinoma mamário, ou uma leucemia, especialmente até onde c-Met estáenvolvido. Eles podem provocar a regressão dos tumores e impedir a forma-ção de metástase tumoral e o crescimento de (também micro)metastases.Além disso, eles podem ser usados em hiperproliferação epidérmica (porexemplo psoríase), em hiperplasia da próstata, no tratamento de neoplasias,especialmente de caráter epitelial, por exemplo carcinoma mamário, e emleucemias. É também possível usar os anticorpos da invenção no tratamentode doenças do sistema imune até então como várias ou, especialmente, pro-teína tirosina cinases individuais e / ou (também) proteína serina/treoninacinases estejam envolvidas; além, disso, os anticorpos da invenção podemser usados também no tratamento de doenças do sistema nervoso centralou periférico onde a transmissão de sinal por pelo menos uma proteína tiro-sina cinase e/ou (também) proteína serina/treonina cinase esteja envolvida.

Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento funcional des-te anticorpo liga à proteína de c-Met alvo e modula, isto é, ativa ou inibe, fos-forilação de c-Met. Em certas modalidades, ativação de fosforilação de c-Metestimula pelo menos uma dentre uma atividade selecionada do grupo deregeneração de órgão, cura de ferida, e regeneração de tecido. Em umamodalidade relacionada, o órgão é pele, rim, fígado, pâncreas, coração,pulmão, intestino, timo, ou tiróide. Em modalidades alternativas, anticorpospara c-Met bloquearia infecção de patógeno, particularmente infecção deListeria, ou melhoraria as doenças patogênicas tais como malária (Carrolo,et al., Nature Med. 9: 1363-1369, 2003).

Anticorpos que mostram inibição c-Met são úteis no tratamentode câncer de cólon, incluindo metástase, por exemplo no fígado, e carcino-ma pulmonar de não-célula pequena. Anticorpos de Anti-cMet podem tam-bém ser usados no tratamento de carcinoma renal papilar hereditário (Sch-midt, L1 et al. Nat. Genet. 16, 68-73, 1997) e outras doenças proliferativasem que c-MET é supra-expressado ou constitutivamente ativado por muta-ções (Jeffers e Vande Woude. Oncogene 18, 5120-5125, 1999; e referênciacitada nele) ou rearranjos cromossômicos (por exemplo TPR-MET; Cooperet al. Nature 311, 29-33, 1984; Park. et al. Cell 45, 895-904, 1986). Antago-nistas de anticorpo da invenção são especialmente úteis para tratar uma cé-lula indesejada, em particular, uma célula associada a uma condição rela-cionada a c-Met tal como um câncer, uma metástase, ou uma condição in-flamatória. Cânceres exemplares incluem, mas não são limitados a, por e-xemplo, esofagiano, mama, rim incluindo mas não limitados a carcinoma decélula renal papilar, glioma, cabeça e pescoço, epitelial, pulmão, pele, Ieu-cernia, linfoma, mieloma, cérebro, pancreático, gástrico, gastrintestinal, es-tômago, intestino, cólon, fígado, genital, urinário, melanoma, e próstata.Cânceres e condições adicionais são fornecidos aqui ou conhecidos na técnica.

Também, anticorpos que mostram antagonismo de c-Met sãoúteis no tratamento de câncer de bexiga (superficial e invasivo muscular),câncer de mama, câncer cervical, câncer colorretal, glioma (incluindo glio-blastoma, astrocitoma anaplástica, oligoastrocitoma, oligodendroglioma),câncer esofagiano, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular (HCC) incluin-do HCC infantil, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de cabe-ça e pescoço de célula escamosa, carcinoma nasofaringeano), carcinoma decélula de Hurthle, melanoma maligno, mesotelioma, mieloma múltiplo, Ieu-cemias, câncer de pulmão de célula não-pequena (incluindo todos os subti-pos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcino-ma broncoalveolar, carcinoma de célula grande, e tipo adenoescamoso mis-turado), câncer de pulmão de célula pequena, câncer ovariano, câncer pan-creático, câncer de próstata, câncer de célula renal incluindo câncer de célu-la renal papilar hereditário e esporádico, Tipo I e Tipo II, e câncer de célularenal de célula clara; sarcomas, em particular osteossarcoma, sarcomas decélula clara, e sarcomas de tecido macio (incluindo rabdomiossarcomas al-veolares e embrionários, sarcomas alveolares de parte macia); carcinoma detiróide (papilares e outros subtipos).

Em certas modalidades, a invenção fornece um método paratratar um distúrbio ou condição relacionada a c-Met que envolve administrara um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de qualqueruma das composições farmacêuticas acima. O distúrbio ou condição é umcâncer ou uma condição inflamatória. Em outra modalidade relacionada, ocâncer é esofagiano, mama, rim, cabeça e pescoço, epitelial, pulmão, leu-cemia, linfoma, mieloma, cérebro, pancreático, estômago, cólon, fígado, ge-nital, urinário, melanoma, ou próstata. Em uma modalidade particular, o cân-cer é hepático ou esofagiano.

Em certas modalidades, qualquer um dos métodos acima envol-ve também administrar um agente quimioterapêutico. Em uma modalidaderelacionada, o agente quimioterapêutico é um agente anticâncer.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método paratratar uma célula indesejada que envolve contatar a célula com qualquer umdos anticorpos acima ou fragmentos funcionais destes anticorpos. Em umamodalidade relacionada, a célula carrega um receptor de c-Met. Em outramodalidade relacionada, o método acima também envolve tratar a célulacom um agente quimioterapêutico ou radiação.

Em uma modalidade alternativa, o anticorpo é responsivo e ativafosforilação de c-Met que estimula uma resposta celular, tal como em curade ferimento.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far-macêutica que inclui os anticorpos acima ou fragmentos funcionais destesanticorpos e um agente terapêutico adicional. O agente terapêutico adicionalé selecionado do grupo que consiste em um agente anticâncer; um antibióti-co; um agente antiinflamatório; um fator de crescimento; e uma citocina.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICAM ANTICORPOS DAINVENÇÃOOutro aspecto da invenção refere-se às moléculas de ácido nu-cléico que codificam os anticorpos da invenção. Exemplos de seqüências deVh estão mostrados nas SEQ ID NOs: 21-30. Exemplos de seqüências de Vlestão mostrados nas SEQ ID NOs: 1-20. Um exemplo de uma seqüência denucleotídeo de Ig Iambda é mostrado nas SEQ ID NOs: 73. Exemplos deSeqüência de nucleotídeo de Ig capa estão mostrados nas SEQ ID NOs: 74-76. Exemplos de seqüências de nucleotídeo de lgG4 estão mostrados nasSEQ ID NOs: 85-88.

Os ácidos nucléicos fornecidos aqui que codificam os anticorpospodem estar presentes em células inteiras, em um Iisado de célula, ou po-dem ser ácidos nucléicos em uma forma parcialmente purificada ou substan-cialmente pura. Um ácido nucléico é isolado ou tornado substancialmentepuro quando purificado longe de outros componentes celulares ou outroscontaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas celulares,através de técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagemde CsCI, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e simila-res bem conhecidos na técnica. Vide, F. Ausubel, et al., ed. 2006, CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, No-va Iorque. Um ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ouRNA e pode ou não conter seqüências intrônicas. Em uma modalidade, oácido nucléico é uma molécula de cDNA. O ácido nucléico pode estar pre-sente em um vetor tal como um vetor de exibição de fago, ou em um vetorde plasmídeo recombinante.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos usando téc-nicas de biologia molecular padrões. Para anticorpos expressos por hibrido-mas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongos transgênicosportando genes de imunoglobulina humana como descritos mais abaixo), oscDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feitos pelohibridoma podem ser obtidos por técnicas padrões de amplificação de PCRou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de genesde imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), ácidonucléico que codifica o anticorpo pode ser restabelecido de vários clones defago que são membros da biblioteca.

Uma vez fragmentos de DNA que codificam segmentos de Vh eVl são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser também manipuladospor técnicas de DNA recombinantes padrões, por exemplo para converter osgenes de região variável para genes de cadeia de anticorpo de comprimentototal, para genes de fragmento de FAB ou para um gene de scFv ligado aosnucleotídeos de codificação nos vetores conhecidos. Nestas manipulações,um fragmento de DNA de codificação de Vl ou Vh é operativamente ligado aoutra molécula de DNA, ou a um fragmento que codifica outra proteína, talcomo uma região constante do anticorpo ou um Iigador flexível. O termo "o-perativamente ligado", como usado neste contexto, é intencionado significarque os dois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira funcional, porexemplo, de modo que as seqüências de aminoácido codificadas pelos doisfragmentos de DNA permaneçam dentro da estrutura, ou de modo que aproteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.

O DNA isolado que codifica a região de Vh pode ser convertidoem um gene de cadeia pesada de comprimento total operativamente ligandoao DNA de codificação de Vh a outra molécula de DNA que codifica regiõesconstantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências dos genesde região constante de cadeia pesada humana são conhecidos na técnica(vide por exemplo, Kabat1 Ε. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immu-nological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and HumanServices, Publicação NIH No. 91-3242) e os fragmentos de DNA que abran-gem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. Aregião constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI,lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Para um fragmento de gene de ca-deia pesada de Fab, o DNA de codificação de Vh pode ser operativamenteligou a outra molécula de DNA que codifica apenas a cadeia pesada CH1região constante.

O DNA isolado que codifica a região de Vl pode ser convertidopara um gene de cadeia leve de comprimento total (como também para umgene de cadeia leve de Fab) operativamente ligando o DNA de codificaçãode Vl a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeialeve, Cl. As seqüências dos genes de região constante de cadeia leve hu-mana são conhecidas na técnica (vide por exemplo, Kabat, Ε. A., et al., 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest1 Quinta Edição, U. S. De-partment of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242) e osfragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidas por am-plificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser umaregião constante capa ou uma lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA de codifica-ção de Vh e Vl são operativamente ligados a outro fragmento que codificaum Iigador flexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácido(Gly4-Ser)3, de modo que as seqüências de Vh e Vl podem ser expressascomo uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões de Vl e Vhunidas pelo Iigador flexível (vide por exemplo, BIRD et al., 1988 Science242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883;McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DA INVENÇÃO

Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por umavariedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal con-vencional por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão deKohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Muitas técnicas podem ser empre-gadas para produzir anticorpo monoclonal por exemplo, transformação viralou oncogênica de linfócitos B.

Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema muri-no. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabe-lecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitosimunizados para fusão são conhecidos na técnica. Pares de fusão (por e-xemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão são tambémconhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invençãopodem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonalmurino preparada como descrito acima. DNA que codifica as imunoglobuli-nas de cadeia leve e pesada pode ser obtido do hibridoma murino de inte-resse e pode ser engenheirado para conter seqüências de imunoglobulinanão-murina (por exemplo, humana) usando técnicas padrões de biologia mo-lecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveismurinas podem ser ligadas às regiões constantes humanas usando métodosconhecidos na técnica (vide por exemplo, Patente U. S. No. 4.816.567 paraCabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR muri-nas podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhe-cidos na técnica (vide por exemplo, Patente U. S. No. 5.225.539 para Winter, e patentes U. S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 paraQueen et al.)

Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anti-corpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dire-cionados contra c-Met podem ser gerados usando camundongos transgêni-cos ou transcromossômicos portando partes do sistema imune humano aoinvés do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos etranscromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundon-gos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente refe-ridos aqui como "camundongos de Ig humana".

O HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém miniloci de gene deimunoglobulina humana que codifica as seqüências de imunoglobulina hu-mana de cadeia pesada e leve κ não-rearranjadas (μ e γ), junto com muta-ções alvejadas que inativam os Ioci endógenos das cadeias μ e γ (vide porexemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Conseqüente-mente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM de camundongoou κ, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesadahumanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerarIgGK humana de afinidade alta monoclonal (Lonberg, N., 1994 Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995lntern. Rev. Immunol.13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. Ν. Y.Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMAb, e asmodificações genômicas carregadas por tais camundongos, é também des-crita em Taylor1 L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen1J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993Proe. Natl. Aead. Sei. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J.Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology579-591; e Fishwild1 D. et al., 1996 Nature Bioteehnology 14: 845-851, osconteúdos de tudo são especificamente incorporados por este meio por refe-rência em sua totalidade. Vide também, patentes U. S. Nos. 5.545.806;5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016;5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; patente U. S.No. 5.545.807 para Surani et al.; Publicações de PCT Nos. WO 92103918,WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962,todas para Lonberg e Kay; e Publicação de PCT No. WO 01/14424 para Kor-man et al.

Em outra modalidade, produção dos anticorpos humanos da in-venção pode ser suscitada ("levantada") usando um camundongo portandoseqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomostais como um camundongo portando um transgene de cadeia pesada huma-na e um transcromossoma de cadeia leve humano. Tais camundongos, refe-ridos aqui como "camundongos KM", são descritos em detalhes na Publica-ção de PCT WO 02/43478 para Ishida et al.

Ainda também, sistemas de animais transgênicos alternativosque expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na téc-nica e podem ser usados para levantar anticorpos de anti-c-Met da invenção.Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomou-se (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, por e-xemplo, nas patentes U. S. Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas de animais transcromossômicos alternati-vos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis natécnica e podem ser usados para levantar anticorpos de anti-c-Met da inven-ção. Por exemplo, camundongos portando um transcromossoma de cadeiapesada humano e um trancromossoma de cadeia leve humano, referido co-mo "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritosem Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. Além dis-so, vacas portando os transcromossomos de cadeia pesada e leve humanosforam descritos na técnica (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology20:889-894) e pode ser usados para levantar anticorpos de anti-c-Met dainvenção.

Anticorpos humanos ou anticorpos monoclonais humanos po-dem também ser preparados usando métodos de exibição de fago para triarbibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibiçãode fago para identificar e clonar anticorpos humanos são estabelecidos natécnica. Vide por exemplo: patentes U. S. Nos. 5.223.409; 5.403.484; e5.571.698 para Ladner et al.; Patentes U. S. Nos. 5.427.908 e 5.580.717 Do-tar et al.; Patentes U. S. Nos. 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; epatentes U. S. Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e6.593.081 para Griffiths et al.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tambémser preparados usando camundongos SCID nos quais foram reconstituídascélulas imunes humanas de modo que uma resposta de anticorpo humanopode ser gerada sob imunização. Tais camundongos são descritos, por e-xemplo, nas patentes U. S. Nos. 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson et al.GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA c-Metc-Met purificado, recombinante, extracelular, humano expressoem E. coli (R & D Systems, Mineápolis, MN), ou c-Met purificado, recombi-nante, humano conjugado com hemocianina de lapa (KLH), é usado como oantígeno. Outras fontes de c-Met expressados são também contempladascomo estando dentro do escopo da invenção, incluindo, por exemplo, cMetisolado de sistemas de expressão tais como baculovírus, células de CHO, eoutro conhecido a alguém versado nas técnicas.

Anticorpos monoclonais completamente humanos para c-Metsão preparados usando cepas de HCo7, HCo12 e HCo17 de camundongostransgênicos HuMab e cepa de KM de camundongos transcromossômicostransgênicos, cada um destes expressam genes de anticorpo humano. Emcada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve capa decamundongo endógeno pode ser homoziguamente rompido como descritoem Chen et al., 1993 EMBO J.12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno pode ser homoziguamente rompido como descritono Exemplo 1 da Publicação de PCT WO 01109187. Cada uma destas ce-pas de camundongo carregam um transgene humano de cadeia leve capa,KCo5, como descrito em Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa de HCo7 carrega o transgene humano de cadeia pesada HCo7 como descrito nas patentes U. S. Nos. 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. Acepa de HCo12 carrega o transgene humano de cadeia pesada HCo12 co-mo descrito no Exemplo 2 da Publicação de PCT WO 01/09187. A cepa deHCo17 carrega o transgene humano de cadeia pesada HCo17. A cepa deKNM contém o transcromossoma de SC20 como descrito em Publicação dePCT WO 02/43478.

Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanospara c-Met, camundongos HuMab e camundongos KM são imunizados comdomínio extracelular de c-Met purificado recombinante expresso em E. coliou com c-Met-KLH conjugado como antígeno. Esquemas de imunização ge- ral para camundongos HuMab são descritos em Lonberg, N., et al:, 1994Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D., et al., 1996 Nature Biotechnology14:845-851 e Publicação de PCT WO 98/24884. Os camundongos têm 6-16semanas de idade na primeira infusão do antígeno. Uma preparação recom-binante purificada (5-50 pg) de antígeno de c-Met (por exemplo, purificadode células de E. coli transfeccionadas que expressam domínio extracelularde c-Met) é usada para imunizar os camundongos HuMab e camundongosKM de maneira intraperitoneal, subcutaneamente (Sc) ou através de injeçãonas patas.

Camundongos transgênicos são imunizados duas vezes comantígeno no adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Ribi de maneiraintraperitoneal (IP), subcutaneamente (Sc) ou através das patas (FP), segui-do por 3-21 dias imunização IP, Sc ou FP (até um total de 11 imunizações)com o antígeno em adjuvante de Freund incompleto ou de Ribi. A respostaimune é monitorada através de sangria retro-orbital. O plasma é triado porELISA, e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina huma-na de anti-c-Met são usados para fusões. Os camundongos são reforçadosintravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção dobaço. Tipicamente, 10-35 fusões para cada antígeno são executadas. Váriasdúzias de camundongos são imunizadas para cada antígeno. Um total de 82camundongos das cepas de HCo7, HCo12, HCo17 e KM de camundongos éimunizado com c-Met.

Para selecionar camundongos HuMab ou KM produzindo anti-corpos que ligam c-Met, soros de camundongos imunizados podem ser tes-tados por ELISA como descrito por Fishwild, D., et al., 1996. Brevemente,em um protocolo exemplar, placas de microtitulação são revestidas com c-Met purificado recombinante de E. coli a 1-2 pg / ml em PBS, 50 μΙ/poços,incubadas 4e C durante a noite depois bloqueadas com 200 μΙ/poço de 5 %soro de galinha em PBS/Tween (0,05 %). Outras concentrações e fontesalternativas podem também ser usadas. Diluições de plasma dos camun-dongos c-Met-imunizados são adicionadas a cada poço e incubados durante1 -2 horas em temperatura ambiente. As placas são lavadas com PBS/Tweene depois incubadas com um anticorpo policlonal de Fc de IgG anti-humanade cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) durante 1 hora emtemperatura ambiente. Após lavar, as placas são desenvolvidas com subs-trato de ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas através de espec-trofotômetro a um comprimento de onda λ de 415-495 nm. Alternativamente,outros tipos de detecção são possíveis, e podem ser fornecidos por alguémversado na técnica. Camundongos que desenvolvem as titulações mais altasde anticorpos de anti-c-Met são usados para obter células para fusões. Fu-sões são executadas e sobrenadantes de hibridoma são testados para ativi-dade de anti-c-Met por ELISA.

Esplenócitos de camundongo isolados dos camundongos Hu-Mab e camundongos KM são fundidos em uma linhagem celular de mielomade camundongo com base nos protocolos padrões usando PEG. Os hibri-dornas resultantes são depois triados para produção de anticorpos antígeno-específicos. As suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos decamundongos imunizados são fundidas com um quarto do número de célu-las de mieloma de camundongo não-segregadas SP2/0 (ATCC, CRL 1581)com 50 % de PEG (Sigma). Células são colocadas em placas em aproxima-damente 1x105/poço em placa de microtitulação de fundo chato, seguido poraproximadamente incubação de duas semanas em meio seletivo contendo10 % soro bovino fetal, 10 % P388D 1 (ATCC, CRL TIB-63) meio condicio-nado, 3-5 % fator de clonagem Origen® (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL10013, com glicose alta, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM HE-PES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/l gentamicina e 1x HAT (Sigma,CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio emque HAT é substituído com HT. Poços individuais são depois triados por E-LISA para anticorpos monoclonais de anti-c-Met de IgG humana. Uma vezcrescimento de hibridoma extensivo ocorreu, o meio é usualmente monitora-do após 10-14 dias. Os hibridomas de segregação de anticorpo são re-colocados na placa, triados novamente e, se ainda positivo para IgG huma-na, os anticorpos monoclonais de anti-c-Met são subclonados pelo menosduas vezes limitando a diluição. Os subclones estáveis são depois cultivadosin vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura detecido para caracterização adicional.

IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS DE IG HUMANA

Camundongos de Ig humana usados para levantar anticorposhumanos da invenção, são imunizados com uma preparação purificada ouenriquecida de antígeno de c-Met e/ou c-Met recombinante, ou uma proteínade c-Met de fusão, como descrita por Lonberg, N., et al., 1994 Nature368(6474): 856-859; Fishwild, D., et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação de PCTWO 98124884 e WO 01/14424. Os camundongostêm 6-16 semanas de idade na primeira infusão. Por exemplo, uma prepara-ção purificada ou recombinante (5-50 pg) de antígeno de c-Met é usada paraimunizar os camundongos de Ig humana intraperitonealmente.

Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonaiscompletamente humanos para c-Met são descritos acima. Experiência cumu-lativa com vários antígenos mostrou que os camundongos transgênicos res-pondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antí-geno no adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações IP (até um total de 6) com antígeno no adjuvante de Freund incompleto a cada duassemanas. Porém, adjuvantes diferentes de Freund são também observadosser eficazes. Além disso, células inteiras são observadas na ausência deadjuvante ser altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monito-rada no curso do protocolo de imunização com amostras de plasma que são obtidas através de sangria retro-orbital. O plasma pode ser triado por ELISA,-e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana deanti-c-Met podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser re-forçados intravenosamente com antígeno 3 dias antes do sacrifício e remo-ção do baço. É esperado que 2-3 fusões para cada imunização possam ne-cessitar ser executadas. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imuni-» ' zados para cada antígeno. Usualmente cepas de HCo7 e HCo12 são usa-das. Além disso, 12 transgenes de HCo7 e HCo podem ser criados junta-mente em um camundongo só tendo dois transgenes de cadeia pesada hu-manos diferentes (HCo7/HCo12).

GERAÇÃO DE HIBRIDOMAS QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONO-CLONAIS HUMANOS

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonaishumanos da invenção, esplenócitos e/ou células de Iinfonodo de camundon-gos imunizados são isolados e fundidos em uma linhagem celular imortaliza-da apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo.Os hibridomas resultantes são triados para a produção de anticorpos antíge-no-específicos. Por exemplo, suspensões de célula simples de. linfócitos es-plênicos de camundongos imunizados são fundidas com um sexto de váriascélulas não-segregantes de mieloma de camundongo P3X63-Ag8.653(ATCC, CRL 1580) com 50 % PEG. Em uma modalidade exemplar, as célu-las são colocadas em placa de microtitulação de fundo chato, seguido poruma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20 % Soro deClone fetal, 18 % "653" meios condicionados, 5 % Origen® (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 5 mM HEPES, 0:055 mM 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml penicilina, 50 pg/ml estreptomicina, 50Mg/ml gentamicina e 1X HAT (Sigma; HAT é adicionado 24 horas após a fu-são). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultiva-das em meio em que HAT é substituído com HT. Poços individuais podemser depois triados por ELISA para anticorpos de IgM e IgG monoclonais hu-manas. Uma vez crescimento de hibridoma extensivo ocorre, o meio podeser analisado, usualmente após 10-14 dias. Os hibridomas segregantes deanticorpo podem ser re-colocados na placa, triados novamente, e se aindapositivo para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclona-dos pelo menos duas vezes limitando a diluição. Os subclones estáveis po-dem ser depois cultivados in vitro para gerar quantidades pequenas de anti-corpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, os hibridomasselecionados são crescidos em frascos spinner de dois litros para purificaçãodo anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes são filtrados e concentrados porcromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscata-way, N.J.). IgG eluída é verificado por eletroforese em gel e cromatografialíquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução de tampão étrocada para PBS, e a concentração é determinada por OD2eo usando extin-ção de um coeficiente 1,43. Os anticorpos monoclonais são aliquotados earmazenados a -80° C.

GERAÇÃO DE TRANSFECTOMAS PRODUCING ANTICORPOS MONO-CLONAIS

Anticorpos da invenção são também produzidos em um transfec-toma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técni-cas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como são bemconhecidos na técnica (por exemplo, Morrison, S., (1985) Science229:1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos deanticorpo dos mesmos, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas decomprimento parcial ou total, podem ser obtidos através de técnicas de bio-logia molecular padrões (por exemplo, Amplificação de PCR ou clonagem decDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e osDNAs podem ser inseridos nos vetores de expressão de modo que os genessejam operativamente ligados às seqüências de controle transcricionais etranslacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligados" é intencio-nado significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo cu-jas seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetorservem para função intencionada de regular a transcrição e translação dogene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle deexpressão são selecionados para ser compatíveis com a célula hospedeirade expressão usada. O gene de anticorpo cadeia leve e o gene de anticorpode cadeia pesada podem ser inseridos em vetor separado ou, mais tipica-mente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Osgenes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos"padrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares nofragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega senenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeialeve e pesada dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criargenes de anticorpo de comprimento total de qualquer isótipo de anticorpoinserindo-os em vetores de expressão que já codificam regiões constantesde cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isótipo desejado de modoque o segmento de Vh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CHdentro do vetor e o segmento de Vl seja operativamente ligado ao segmentode Cl dentro do vetor. Adicionalmente ou como alternativa, o vetor de ex-pressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secre-ção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia deanticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinal é ligadodentro da estrutura ao término amino do gene de cadeia de anticorpo. Opeptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeosinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína de não-imunoglobulina).Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expres-são recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras que con-trolam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospe-deira. O termo "seqüência reguladora" é intencionado incluir os promotores,intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo,sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos ge-nes de cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, porexemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymo-logy. 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Será apreciado por aque-Ies versados na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a se-leção das seqüências reguladoras, pode depender de tais fatores como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão deproteína desejado, etc. Seqüências reguladoras para expressão de célulahospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam níveis altosde expressão de proteína para células mamíferas, tais como promotoresce/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Símio Vírus 40(SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus(AdMLP)), e polioma. Alternativamente, seqüências reguladoras não-viraispodem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda também, elementos reguladores compostos de seqüências defontes diferentes, tais como o sistema de promotor de SRa contendo se-qüências do promotor prematuro de SV40 e a repetição terminal longa dovírus de leucemia de célula T humano tipo 1 (Takebe, Y., et al., 1988 Mol.CeIL Biol. 8:466-472).

Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulado-ras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregarseqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação dovetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genesde marcador selecionável. O gene de marcador selecionável facilita a sele-ção das células hospedeiras às quais o vetor foi introduzido (vide, por exem-plo, Pats. U. S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel etal.). Por exemplo, o gene de marcador selecionável tipicamente confere re-sistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em umacélula hospedeira à qual o vetor foi introduzido. Genes de marcador selecio-nável incluem o gene de diidrofolato reductase (DHFR) (para uso em célulashospedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo(para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) deexpressão codificando as cadeias pesadas e leves são transfeccionados emuma célula hospedeira através de técnicas padrões. As várias formas dotermo "transfecção" são intencionadas abranger uma ampla variedade detécnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em umacélula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação,precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrana e outras. Éteoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hos-pedeiras procarióticas ou eucarióticas. Expressão de anticorpos em célulaseucarióticas, em particular células hospedeiras mamíferas, é debatida por-"que tais células eucarióticas, e em particular células mamíferas, são maisprováveis que células procarióticas para montar e segregar um anticorpocorretamente dobrado e imunologicamente ativo. Expressão procariótica dosgenes de anticorpo foi relatada ser ineficaz para produção de rendimentosaltos de anticorpo ativo (Chefe, M. A. e Wood, C. R., 1985 Immunology To-day 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas para expressar os anticorposrecombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês(CHO), incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, 1980Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 usadas com um marcador selecio-nável de DH FR, por exemplo, como descrito em R.J. Kaufman e P. A. Sharp1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma de NSO, células COS ecélulas SP2. Em particular, para o uso com células de mieloma de NSO1 ou-tro sistema de expressão é o sistema de expressão de gene de GS mostra-do em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de ex-pressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidosnas células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos cultivandoas células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitirexpressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpono meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Anticorpospodem ser restabelecidos do meio de cultura usando métodos de purificaçãode proteína padrões.

IMUNOCONJUGADOS

Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza um anticorpode anti-c-Met, ou um fragmento do mesmo, conjugado com uma metade te-rapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossu-pressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são referidos aqui como "imu-noconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas sãoreferidos como "imunotoxina". Uma citotoxina ou agente citotóxico incluiqualquer agente que é prejudicial (por exemplo, mata) às células. Exemplosincluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mi-tomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorru-"bicina, daunorrubicina, de diidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina,actinomicina D, 1-deidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (porexemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, arabinosida de cito-sina, decarbazina de 5-fluorouracila), agentes de ablação (por exemplo, me-cloretamina, tiotepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina(CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mi-tomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas(por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina),antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomi-cina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (por exem-plo, vincristina e vinblastina).

Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser con-jugadas com um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueami-cinas, maytansinas e auristatinas, e derivados das mesmas. Um exemplo deum conjugado de anticorpo de caliqueamicina está comercialmente disponí-vel (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

Citoxinas podem ser conjugadas com anticorpos da invençãousando tecnologia de Iigador disponível na técnica. Exemplos de tipos deligador que foram usados para conjugar uma citotoxina com um anticorpoincluem, mas não são limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetose ligadores contendo peptídeo. Um ligador pode ser selecionado que é, porexemplo, suscetível à clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisos-somal ou suscetível à clivagem através de proteases, tais como proteasespreferencialmente expressas em tecido de tumor tais como catepsinas (porexemplo, catepsinas B, C, D).

Para mais debate dos tipos de citotoxinas, Iigadores e métodospara conjugar agentes terapêuticos para anticorpos, vide também Saito, G.,et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P. A. et al., 2003 CâncerImunol. Imunother. 52:328-337; Payne, G., 2003 Câncer Cell 3:207-212; Al-len, T. M., 2002 Nat. Rev. Câncer 2:750"763; Pastan, I. e Kreitman, R. J.,"2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P. D. e Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Anticorpos da presente invenção podem também ser conjugadoscom um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, tam-bém referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioati-vos que podem ser conjugados com os anticorpos para uso de modo diag-nóstico ou terapeuticamente podem incluir, mas não são limitados a, iodo131,índio111, ítrio90, e lutétio177. Método para preparar radioimunoconjugados éestabelecido na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comerci-almente disponíveis, incluindo Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) e Bexxar™(Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para pre-parar radioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados paramodificar uma resposta biológica dada, e a metade de fármaco não será in-terpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por e-xemplo, a metade de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo quepossua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, porexemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma,tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, ou toxina de Diphthe-ria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferona γ; ou, mo-dificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleu-cina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulante decolônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de colô-nias de granulócitos (G-CSF), ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjugar tal metade terapêutica para anticorpossão bem conhecidas, vide, por exemplo, Amon et al., "Monoclona! AntibodiesFor Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodi-es And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss,Inc. 1985); Hellstrom et at., "Antibodies For Drug Delivery", em ControlledDrug Delivery (2ã Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker,Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer The-rapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Ap-plications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCâncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And The-rapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe etal., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjuga-tes", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).

MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS

Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculasbiespecíficas compreendendo um anticorpo de anti-c-Met, ou um fragmentodo mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligaçãode antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra moléculafuncional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anti-corpo ou ligando a um receptor) para gerar uma molécula biespecífica queliga pelo menos a dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. O anti-corpo da invenção pode ser de fato derivatizado ou ligado a mais de umaoutra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que ligam amais de dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculasmultiespecíficas são também intencionadas ser abrangidas pelo termo "mo-lécula biespecífica" como aqui usado. Para criar uma molécula biespecíficada invenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (porexemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou do contrário) a uma ou mais outras moléculas de ligação, taiscomo outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou ligação mimético,de modo que uma molécula biespecífica resulte.

Em certas modalidades, moléculas biespecíficas são direciona-das contra outras tirosina cinases de receptor, incluindo mas não limitado a,por exemplo, cRon ou EGFR, ou outros alvos na via de cMet. Alvos de mo-lécula biespecífica adicionais incluem receptores e Iigantes alvejados paraterapêuticas anticâncer, tais como aquelas fornecidas aqui.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas bies-pecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de Iiga-ção para c-Met e uma segunda especificidade de ligação para um segundo"epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo alvo é um receptor de Fc, porexemplo, FcyRI humano (CD64) ou um receptor de Fca humano (CD89).Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligar célulasefetoras expressando FcyR, FcaR ou FceR (por exemplo, monócitos, macró-fagos ou células polimorfonucleares (PMNs), e alvejar células que expres-sam c-Met. Estas moléculas biespecíficas alvejam células expressando c-Met para célula efetora e desencadeiam atividades de célula efetora media-das por receptor Fc, tais como fagocitose de umas células expressando c-Met, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC),liberação de citocina, ou geração de ânion de superóxido.

Adicionalmente, para a invenção em que a molécula biespecíficaé multiespecífica, a molécula pode também incluir uma terceira especificida-de de ligação, além de uma especificidade de ligação de anti-Fc e uma es-pecificidade de ligação de anti-c-Met. Por exemplo, a terceira especificidadede ligação poderia ser uma porção de fator de anti-intensificação (EF), porexemplo, uma molécula que liga a uma proteína de superfície envolvida naatividade citotóxica e assim aumenta a resposta imune contra a célula alvo.A "porção de fator de anti-intensificação" poderia ser um anticorpo, fragmen-to de anticorpo funcional ou um Iigante que liga a uma molécula dada, porexemplo, um antígeno ou um receptor, e assim resulta em uma intensifica-ção do efeito dos determinantes de ligação ao receptor de Fc ou antígeno decélula alvo.

A "porção de fator de anti-intensificação" pode ligar um receptorde Fc ou um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator deanti-intensificação poderia ligar a uma entidade que é diferente da entidade àqual as primeira e segunda especificidades de ligação ligam. Por exemplo, aporção de fator de anti-intensificação pode ligar uma célula T citotóxica (porexemplo por CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 ou outra célulaimune que resulte em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invençãocompreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticor-po, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, umFab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia simples de Fv. O anticorpo pode tam-bém ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer frag-mento mínimo do mesmo tal como um Fv ou uma construção de cadeia sim-ples como descrita em Ladner et al. Patente U. S. No. 4.946.778, os conteú-dos desta são expressamente incorporados por referência.

Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um recep-tor de Fcy é fornecida por um anticorpo monoclonal, a ligação desta não ébloqueada pela imunoglobulina humana G (IgG). Como aqui usado, o termo"receptor de IgG" refere-se a quaisquer dos oito genes de cadeia γ Iocaliza-dos no cromossomo 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas detransmembrana ou de receptor solúveis que são agrupadas em três classesde receptor Fy : FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), e FcyRIII (CD 16). Em outramodalidade, o receptor Fcy é um FcyRI humano de afinidade alta. FcyRIhumano é uma molécula de 72 KDa, e tem afinidade alta por IgG monoméri-ca (108-109 M-1).

A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonaisde anti-FcY são descritas por Fanger et al. na Publicação de PCT WO88/00052 e na patente U. S. No. 4.954.617, os ensinamentos destas sãocompletamente aqui incorporados por referência. Estes anticorpos ligam aum epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em um sítio que é distinto do sítio deligação do receptor Fcy e, desse modo, sua ligação não é bloqueada subs-tancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos de anti-FcYRI especí-ficos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb197. O hibridoma produzindo mAb 32 está disponível da American Type Cul-ture Collection, acesso de ATCC No. HB9469. Em outras modalidades, oanticorpo de receptor anti-Fcy é uma forma humanizada do anticorpo mono-clonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritasem Graziano, R. F. et al., 1995 J. Imunol 155 (10): 4996-5002 e Publicaçãode PCT WO 94/10332. O anticorpo 1122 produzindo a linhagem celular foi* depositado na American Type Culture Collection sob a designaçãoHA022CL1 e tem o acesso no. CRL 11177.

Em ainda outras modalidades, a especificidade de ligação para"um receptor de Fc é fornecida por um anticorpo que liga a um receptor deIgA humano, por exemplo, um receptor de Fc-alfa FcyRI (CD89), a ligaçãodeste não tem que ser bloqueada pela imunoglobulina humana A (IgA). Otermo "receptor de IgA" é intencionado incluir o produto de gene de um gene(FcyRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido codificar vá-rias isoformas de transmembrana alternativamente juntadas de 55 a 110KDa. FcyRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos,granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de célulanão-efetoras. FcyRI tem uma afinidade intermediária ou média (5 χ 107 M'1)para IgAI e lgA2, que é aumentada sob exposição a citocinas G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al., 1996 Criticai Reviews in Immunology 116:423-440). Quatro anticorpos monoclonais FcyRI-específicos, identificados comoA3, A59, A62 e A77 que ligam FcyRI fora do domínio de ligação de Iigantede IgA foi descrito (Monteiro, R. C. et al., 1992 J. Imunol. 148:1764).

FcyRI e FcyRI são receptores acionadores para o uso nas molé-culas biespecíficas da invenção porque eles são expressos primariamenteem células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos ecélulas dendríticas; expressos em níveis altos (por exemplo, 5,000-100.000por célula); mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fago-citose); medeiam apresentação de antígeno intensificada dos antígenos, in-cluindo auto-antígenos, alvejados para eles.

Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculasbiespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos ehumanizados.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem serpreparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes, por e-xemplo, as especificidades de ligação de anti-FcR e anti-c-Met, usando mé-todos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligaçãoda molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjuga-das uma com a outra. Quando as especificidades de ligação forem proteínasou peptídeos, uma variedade de agentes acopladores ou reticulantes podeser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes reticulantes in-cluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA),ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM),N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide por exemplo,Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Na-tl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos emPaulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan etal., 1985 Science229:81-83), e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes deconjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce ChemicalCo. (Rockford, IL).

Anticorpos são conjugados por ligação de sulfidrila das regiõesde dobradiça de término C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidadeparticular, a região de dobradiça é modificada para conter um número estra-nho de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, por conjugação.

Alternativamente, genes que codificam ambas as especificida-des de ligação podem ser engenheirados no mesmo vetor e podem ser ex-pressos e montados, por exemplo, como uma proteína de fusão, na mesmacélula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula bies-pecífica for um mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligante χ proteínade fusão de Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma mo-lécula de cadeia simples que compreende um anticorpo de cadeia simples eum determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia sim-ples que compreende dois determinantes de ligação. Moléculas biespecífi-cas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples.Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo,na patente U. S. Número 5.260.203; patente U. S. Número 5.455.030; paten-te U. S. Número 4.881.175; patente U. S. Número 5.132.405; patente U. S.Número 5.091.513; patente U. S. Número 5.476.786; patente U. S. Número5.013.653; patente U. S. Número 5.258.498; e patente U. S. Número- 5.482.858.

Ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicospode ser confirmada, por exemplo, através de ensaio de imunoabsorventeHigado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (ERA), análise de FACS, bioen-saio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio de Western blot. Ca-da um destes ensaios em geral detecta a presença de complexos de proteí-na-anticorpo de interesse particular empregando um reagente marcado (porexemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exem-plo, os complexos de anticorpo de FcR podem ser detectados usando porexemplo, um anticorpo ligado à enzima ou fragmento de anticorpo que reco-nhecem e especificamente liga aos complexos de anticorpo-FcR. Alternati-vamente, os complexos podem ser detectados usando qualquer um de umavariedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radio-ativamente marcado e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por e-xemplo, Weintraub; B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCouser on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, março,1986 que é incorporada aqui por referência). O isótopo radioativo pode serdetectado por tais meios como o uso de um contador γ ou um contador decintilação ou através de auto-radiografia.

ENSAIOS PARA MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DE c-Met (AGONISMO OUANTAGONISMO)

Os anticorpos de anti-c-Met são ensaiados por ter uma habilida-de agonística ou antagonística de c-Met. Agonismo é a habilidade para subs-tituir o efetor positivo HGF ligando e ativando c-Met, por exemplo, um recep-5 tor de c-Met humano carregado em uma célula de uma linhagem celular es-tabelecida em cultura, ou carregado em uma linhagem celular primária esta-belecida de uma amostra de tecido humano, ou proteína de c-Met purificadaque está comercialmente disponível (R&D Systems #358 MT) que é imobili-zada em uma placa de ensaio ou em uma conta. Uma medida da atividade10 agonística é a concentração do efetor, neste caso um anticorpo ou fragmen-to de anticorpo aqui, que produz 50 % de atividade de HGF de controle, istoé, EC5O- A EC50 pode ser determinada usando um ensaio de ligação de Ii-- gante como determinado por uma técnica imunológica padrão tal como ELI-SA, RIA ou por um ensaio baseado em célula tal como difração de célula,15 crescimento em ágar macio e/ou ensaio de invasão de matriz (ensaio de tu-■ bulomorfogênese). Preferivelmente a atividade inibidora EC50 é menor que 5pg/ml, menor que 1 pg/ml, menor que 0,5 pg/ml, menor que 0,1 pg/ml, e atémesmo preferivelmente menor que 50 ng/ml, como medida, por exemplo, porELISA. Antagonismo é a habilidade para impedir interação e inibir a ação do20 efetor positivo de HGF ligando o receptor de c-Met, por exemplo, um c-Methumano carregado em uma célula de uma linhagem celular estabelecida emcultura, ou carregado em uma linhagem celular primária estabelecida deuma amostra de tecido humano, ou proteína de c-Met purificada que estácomercialmente disponível (R&D Systems #358 MT) que é imobilizada em25 uma placa de ensaio ou em uma conta. Uma medida da atividade antagonís-tica é a concentração do efetor, neste caso um anticorpo ou fragmento deanticorpo aqui que inibe 50 % da atividade de HGF de controle, isto é, IC50·A IC50 pode ser determinada usando um ensaio de ligação de Iigante comodeterminado por uma técnica imunológica padrão tal como ELISA, RIA ou30 por um ensaio baseado em célula, tal como difração de célula, crescimentoem ágar macio e/ou ensaio de invasão de matriz (ensaio de tubulomorfogê-nese). Preferivelmente a atividade inibidora de IC50 é menor que 5 Mg/ml,menor que 1 pg/ml, menor que 0,5 pg/ml, menor que 0,1 pg/ml, e até mesmopreferivelmente menor que 50 ng/ml, como medida, por exemplo, por ELISA.ENSAIO DE MODULAÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE c-Met POR ANTI-CORPOS DE ANTI-c-Met AGONÍSTICOS OU ANTAGONÍSTICOS

Agonismo ou antagonismo por anticorpos de anti-c-Met da in-venção é medido por ativação ou inibição de fosforilação de c-Met em célu-las com e sem estimulação com HGF. Células de uma linhagem celular taiscomo células de A549 são colocadas em placa a uma densidade de 3 X 104células por poço em um volume total de 100 μΙ/poço suplementado comDMEM com 10 % FBS em placas de 96 poços de fundo chato tratadas comcultura de tecido (Costar, #3595). As placas são incubadas a 379 C em umaatmosfera de 5 % CO2 durante 24 h após as quais o meio é aspirado sua-vemente de cada poço das placas e um volume de 100 μΙ/poço DMEM adi-cionado. As placas são incubadas a 37- C em uma atmosfera de 5 % CO2durante 24 h após as quais uma amostra de um anticorpo purificado a ser' testado, 100 μΙ por poço do anticorpo ou uma diluição, é adicionado às célu-las no poço diluído em DMEM. Como um controle negativo por falta de ati-vação, uma amostra de um anticorpo não relacionado (tendo uma especifici-dade conhecida não relacionado com os determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, é adicionada aos poços designados.

As células são incubadas a 37e C durante um período de tempocurto (por exemplo, 2 horas) ou um período de tempo mais longo (por exem-plo, 24 horas). Onde apropriado, as células são estimuladas pela adição deHGF em meios de DMEM livres de soro a uma concentração final de 200ng/poço. Em geral, quando ensaiar a atividade agonística dos anticorpos,com exceção do controle positivo (não tratado com anticorpo), HGF é omiti-do dos poços de anticorpo de amostra de teste. Em geral, quando ensaiar aatividade antagonística dos anticorpos, HGF é incluído nos poços de anti-corpo de amostra de teste. Placas são também incubadas por 10 min a 37eC, depois o meio é aspirado suavemente dos poços das placas. As célulassão lavadas com PBS frio e a solução é aspirada suavemente das placas.As células são Iisadas com 50 μΙ de tampão de Iise (NP-40 tampão de lise:120 mM NaCI1 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 % ΝΡ-40, 1 mM EDTA1 6 mM EG-TA1 20 mM NaF1 1 mM Benzamidina com 0,5 mM Na3VO4 recentemente adi-cionado, e 0,1 mM PMSF. As placas são agitadas em temperatura ambientedurante 15 minutos, e são depois armazenadas a -80Q C até precisadas paraELISA.

Um ELISA é usado para determinar os níveis de fosforilação dec-Met. Para preparação da placa de ELISA, placa Nunc-lmuno™, Maxi-Sorb™ Surface (VWR AG Internacional, N°391-8786) é lavada duas vezescom tampão de lavagem (PBS-0,05 % Tween Biorad #670-6531), e 100 μΙde c-Met anticorpo de captura monoclonal (DO-24) em PBS são adiciona-dos. As placas são incubadas durante a noite a 45 C três vezes lavadas comPBS-0,05 % Tween. Os sítios de ligação não-específicos são bloqueados1 com 200 μΙ/poço 3 % BSA em PBS-T durante 2 horas em temperatura ambi-ente, com agitação. Imediatamente antes do uso, a solução de bloqueio éremovida.

Usados de célula congelados são fundidos agitando em tempe-ratura ambiente e 40 μΙ de Iisado são adicionados às placas de Nunc-lmunoe as placas são incubadas a 4e C durante 4 horas. As placas são lavadastrês vezes com PBS-T, e 50 μΙ/poço de 0,2 μg/ml anticorpo anti-fosfotirosinaPY20-HRP (ZYMED, #03-7722) em 3 % albumina de soro bovino-PBS-T. Asplacas são incubadas durante a noite a A- C e lavadas três vezes com PBS-T. O PBS-T é aspirado e 90 μΙ / poço substrato de fosfatase alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS100RY) adicionados e desenvolvidos enquanto agitandosuavemente por 45 min em temperatura ambiente. As placas são lidas u-25 sando uma leitora de placa de 96 poços.

Estes resultados demonstram que os membros da classe anta-gonística de anticorpos de anti-c-Met inibem a habilidade de HGF para esti-mular fosforilação de c-Met.

MODULAÇÃO DE PROLIFERAÇÃO INDUZIDA POR HGF COM CLONES30 AGONÍSTICOS E ANTAGONÍSTICOS DE ANTICORPOS DE ANTI-c-Met

Um ensaio é executado para medir o efeito antagonístico ou a-gonístico de anticorpos de anti-c-Met, na ausência ou sob estimulação comHGF. Células de uma linhagem celular, tal como 4MBr-5, são colocadas emplaca a uma densidade de 3 X 103 células por poço em um volume total de100 μl/poço suplementado com Ham's F12K com 10 % FBS em placas tra-tadas com cultura de tecido de fundo chato de 96 poços (Costar, #3610). Asplacas são incubadas a 37g C em uma atmosfera de 5 % CO2 por 2 h apósas quais são adicionados 50 μΙ de meio contendo o anticorpo purificado a sertestado. Como um controle negativo por falta de modulação, uma amostrade um anticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhecida nãorelacionada com os determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, é adi-cionada aos poços designados. As placas são incubadas a 37e C em umaatmosfera de 5 % CO2 por 1 h após as quais, 50 μΙ do meio sozinho ou 50 μΙcontendo HGF (por exemplo, cerca de 0,5 pg/μΙ a cerca de 50 ng/ml) sãoadicionados. As placas são incubadas a 37e C em uma atmosfera de 5 %. CO2 durante 72 h após as quais incorporação de BrDU é ensaiada usando aELISA de proliferação celular, ensaio de BrdU (Roche) No de Cat. 1 669* 915. Brevemente, 20 μΙ/poço de solução de BrdU (#1) são adicionados e asplacas incubadas durante 22 h a 37- C em uma atmosfera de 5 % CO2. Meioé suavemente removido e a placa secada durante 1 h a 60Q C. 200 μΙ deFixDenat (solução #2) são adicionados e as placas incubadas em temperatu- ra ambiente com agitação suave durante 30 minutos. A solução é suave-mente removida e 100 μΙ/poço solução de trabalho de anti-BrDU adiciona-dos. As placas são incubadas em temperatura ambiente com agitação suavedurante 90 minutos. A solução é suavemente removida e os poços lavadostrês vezes com 250 μΙ de solução de lavagem. A solução é suavemente re-movida e 100 μΙ/poço solução de substrato adicionados, as placas são me-didas a A405nm.

Estes resultados demonstram que proliferação estimulada porHGF das células expressando níveis de c-Met é inibida em células que fo-ram tratadas com clones de anticorpo anti-c-Met antagonístico.MODULAÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR c-Met-DEPENDENTE COM UMACLASSE ANTAGONÍSTICA DE ANTICORPOS DE ANTI-c-Met

Células de certas linhagens celulares, tais como células de NCl-Η441 que expressam c-Met, são conhecidas migrar em resposta a um gradi-ente de concentração de HGF. Ensaios são executados usando células deNCI-H441 onde a habilidade dos anticorpos de anti-cMet para modular mi-gração através de uma membrana perfurada (Ensaio de Câmara Boyden) deuma área de concentração de HGF baixa para uma área de concentração deHGF alta é medida.

Migração celular é ensaiada usando ensaio de migração celularde 96 poços de quimiotaxia de QCM™ 8 μΜ. Conseqüentemente, 24 h antesdo ensaio, as células foram lavadas duas vezes com PBS estéril e privadasno DMEM contendo 1 % FBS a 37g C em uma atmosfera de 5 % CO2. Sub-seqüentemente, as células são tripsinadas e re-suspensas em 1,0 χ 106 cé-lulas por ml na presença de concentração apropriada do anticorpo purificadopor 30min a 37e C. Como um controle negativo por falta de modulação, umaamostra de um anticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhe-cida não relacionada aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, éadicionada aos poços designados.

Sob condições estéreis a tampa da placa de câmara de migra-ção é removida e 150 μΙ de soro meios livres contendo 50 ng/ml HGF (R&DNo de Cat. 294-HGN) são adicionados aos poços da bandeja alimentadora(câmara inferior). 100 μΙ de 5-10 χ 104 células em DMEM com 1 % FBS pré-incubado com anticorpo são adicionados suavemente à câmara superior. Aplaca é coberta e incubada durante 16 horas a 37e C entre 4-6 % CO2. Se-guindo as instruções dos fabricantes, as células/meios na câmara superiorsão descartados e a câmara colocada em uma Bandeja Alimentadora de 96poços à qual 150 pL/poço solução de separação de célula pré-aquecida fo-ram adicionados. Células são desalojadas incubando durante 30 minutos a379 C com agitação suave periódica. Subseqüentemente, 50 μΙ de tintura deCyQuant GR pré-diluída são adicionados a cada poço da bandeja alimenta-dora. A placa é incubada durante 15 minutos em temperatura ambiente e150 μΙ da mistura transferidos para uma placa de 96 poços nova adequadapara medição de fluorescência usando um conjunto de filtro de 480/520 nm.

Dados obtidos mostram que uma classe do clones de anticorpoantagonístico de anti-c-Met são capazes de inibir uma conseqüência biológi-ca de ativação de c-Met, a saber, migração de células NCI-H441 estimuladapor HGF através de uma membrana microporosa.

DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES DE AFINIDADE K0 DE ANTICOR-POS DE ANTI-c-Met POR BIACORE™

A afinidade de ligação de anticorpo purificado é determinada u-sando ressonância de plasmon de superfície usando o instrumento BIACO-RE™ 3000 (Pharmacia Biosensor AB1 Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.),seguindo os protocolos do fabricante, como descritos acima para anticorposantagonísticos.

DETERMINAÇÃO DE CONSTANTES DE AFINIDADE (K0) DE ANTICOR-POS DE ANTI-c-Met COM CITOMETRIA DE FLUXO

A afinidade de ligação de anticorpos purificados para c-Met ex-pressos na superfície de células de carcinoma pulmonar humano A549 ecélulas pulmonares cinomólogas é determinada através de citometria de flu-xo usando o citômetro de fluxo de BD™ Biosciences LSR de acordo com osprotocolos do fabricante, como descritos acima para anticorpos antagonísti-cos.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composi-ção, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou umacombinação de anticorpos monoclonais, ou porção(ões) de ligação de antí-geno dos mesmos, da presente invenção, formulada juntamente com umveículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ouuma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ouimunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo,uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combi-nação de anticorpos (ou imunoconjugados ou bispecíficos) que ligam a epí-topos diferentes no antígeno alvo ou que têm atividades complementares.

Composições farmacêuticas da invenção podem também seradministradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outrosagentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo deanti-c-Met da presente invenção combinado com pelo menos um outro agen-te anticâncer ou antiinflamatório. Exemplos de agentes terapêuticos que po-dem ser usados em terapia de combinação são descritos em maior detalheabaixo na seção em usos dos anticorpos da invenção.

Como aqui usado, "o veículo farmaceuticamente aceitável" incluiqualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentesantibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absor-ção, e outros que sejam fisiologicamente compatíveis. O veículo deveria seradequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, pa-renteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). De-pendendo da rota de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imu-noconjugado, ou molécula biespecífica, podem ser revestidos em um mate-rial para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturaisque possam inativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou* mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitá-vel" refere-se a um sal que não afeta a atividade biológica desejada do com-posto de origem e não dá efeito toxicológico indesejado (vide por exemplo,Berge, S. M., et al., 1977 J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de tais sais in-cluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição deácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tóxicos, tais co-mo clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforosoe outros, como também de ácidos orgânicos não-tóxicos tais como ácidosmono e di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos25 hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáti-cos e outros. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metaisalcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, co-mo também de aminas orgânicas não-tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolami-30 na, etilenodiamina, procaína e outros.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluirum antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantesfarmaceuticamente aceitáveis incluem pelo menos: antioxidantes solúveisem água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de só-dio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e outros; antioxidantes solúveisem óleo, tais como palmitato de ascorbila hidroxianisol butilado (BHA), hi-droxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e ou-tros; e agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido tetraacéticode etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e outros.

Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos adequados quepodem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção inclu- em água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol,e outros), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como a-zeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Flui-dez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de re-vestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

Estas composições podem também conter adjuvantes tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dis-persantes. Prevenção de presença de microorganismos pode ser assegura-da por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de vários a-gentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol,ácido sórbico de fenol, e outros. Pode também ser desejável incluir agentesisotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros nas composições.Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode serprovocada pela inclusão de agentes tais como os que tardam a absorção, monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dis-persões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporâneade soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentespara substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto desde que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com ocomposto ativo, uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invençãoé contemplado. Compostos ativos adicionais podem também ser incorpora-dos nas composições.

Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e es-táveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição po-de ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra es-trutura ordenada adequada para concentração alta de fármaco. O veículopode ser um solvente ou dispersão contendo meio, por exemplo, água, eta-nol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, eoutros), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode sermantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelouso de tensoativos. Em muitos casos, pode-se incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de só-dio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis podeser provocada incluindo na composição um agente que tarda a absorção porexemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporandoo composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado comum ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requeri-do, seguido por microfiltração de esterilização. Em geral, as dispersões sãopreparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril contendoum meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daquelesenumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluçõesinjetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e seca-gem por refrigeração (liofilização) que rende um pó do ingrediente ativo maisqualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtradaestéril do mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado comum material de veículo para produzir uma forma de dosagem simples varia-rá, dependendo do sujeito sendo tratado, e do modo particular de adminis-tração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com ummaterial de veículo para produzir uma forma de dosagem simples em geralserá aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.Em geral, fora de cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de cercade 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou de cerca de 1 por cento a cercade 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farma-ceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a respostadesejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, umbolo simples pode ser administrado, várias doses divididas podem ser admi-nistradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente re-duzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêuti-ca. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na formade unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade dedosagem. Forma de unidade de dosagem como aqui usada refere-se às uni-dades fisicamente distintas adaptadas como dosagens unitárias para os su-jeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predetermi-nada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico deseja-do em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificaçãopara as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada e diretamentedependente das características únicas do composto ativo e do efeito tera-pêutico particular a ser alcançado, e as limitações inerentes na técnica decomposição de um tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade emindivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso do corpodo hospedeiro. Por exemplo dosagens podem ser 0,3 mg/kg peso do corpo,1 mg/kg peso do corpo, 3 mg/kg peso do corpo, 5 mg/kg peso do corpo ou10 mg/kg peso do corpo ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime detratamento exemplar requer administração uma vez por semana, uma vez acada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatrosemanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cadatrês a 6 meses. Regimes de dosagem para um anticorpo de anti-c-Met dainvenção incluem 1 mg/kg peso do corpo ou 3 mg/kg peso do corpo por ad-ministração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando um dos pro-gramas de doseamento a seguir: cada quatro semanas para seis dosagens,depois a cada três meses; cada três semanas; 3 mg/kg peso do corpo umavez seguido por 1 mg/kg peso do corpo a cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos com as mesmasespecificidades de ligação ou diferentes são administrados simultaneamenteem cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nasfaixas indicadas. Anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múlti-plas. Intervalos entre as dosagens simples podem ser, por exemplo, sema-nalmente, mensal, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem tam-bém ser irregulares como indicado medindo níveis de sangue de anticorpopara o antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, dosagem é ajustadapara alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 -1000ug/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 Mg/ml.

Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como umaformulação de liberação contínua em cujo caso administração menos fre-qüente é requerida. Dosagem e freqüência variam, dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram ameia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorposquiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e freqüência de adminis-tração podem variar, dependendo se o tratamento é profiláctico ou terapêuti-co. Em aplicações profilácticas, uma dosagem relativamente baixa é admi-nistrada em intervalos relativamente infreqüentes em um período longo detempo. Alguns pacientes continuam recebendo tratamento para o resto desua vida. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta emintervalos relativamente curtos é às vezes requerida até progressão da do-ença ser reduzida ou terminada ou até que o paciente mostre melhora parci-al ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode seradministrado com um regime profiláctico.

Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composi-ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obteruma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a respostaterapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo deadministração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionadodependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a ativi-dade das composições particulares da presente invenção empregadas, oudo éster, sal ou amida destes, da rota de administração, do tempo de admi-nistração, da taxa de excreção do ser composto particular empregado, daduração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usadosem combinação com as composições particulares empregadas, da idade,sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do pacientesendo tratado, e como também de fatores conhecidos nas técnicas médicas.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo deanti-c-Met da invenção resulta em uma diminuição na severidade dos sinto-mas da doença, um aumento na freqüência e duração de períodos sem sin-tomas da doença, ou uma prevenção de diminuição da capacidade ou inap-tidão devido à aflição da doença. Sintomas da doença incluem critérios diag-nósticos padrões de câncer, tais como estágio, tamanho de tumor primário,membro e tamanho de metástase, ou extensão da inflamação.

Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma ou mais rotas de administração usando um ou mais de uma varie-dade de métodos conhecido na técnica. Como será apreciado pelo artesãoversado, a rota e/ou modo de administração variará, dependendo dos resul-tados desejados. Rotas de administração para anticorpos da invenção inclu-em rotas de administração intravenosas, intramusculares, intradérmicas, in-traperitoneais, parenterais, subcutâneas, espinhais ou outras, por exemplopor injeção ou infusão. A frase "administração parenteral" como aqui usadasignifica modos de administração diferentes de administração enteral e tópi-ca, usualmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusãointravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital,intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueana, subcutânea, sub-cuticular, intra-articular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidurale intraesternal.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser adminis-117trado por uma rota não-parenteral, tal como uma rota de administração tópi-ca, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sub-Iingual ou topicamente.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos queprotegerão o composto contra liberação rápida, tais como uma formulaçãode liberação controlada, incluindo implantes, emplastos transdérmicos, esistemas de liberação microencapsulados. Podem ser usados polímeros bi-odegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de vinila de etileno, poliani-dridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou em ge-ral conhecidos àqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., MareeiDekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dis- positivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade,uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com umdispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivosmostrados nas patentes U. S. Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335;5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes bemconhecidos e módulos úteis na presente invenção incluem pelo menos: pa-tente U. S. No. 4.487.603 que mostra uma bomba de micro-infusão implan-tável para dispensar medicação em uma taxa controlada; patente U. S. No.4.486.194 que mostram um dispositivo terapêutico para administrar medica-mentos através da pele; patente U. S. No. 4.447.233 que mostram umabomba de infusão de medicação para liberar medicação em uma taxa deinfusão precisa; patente U. S. No. 4.447.224 que mostram um aparelho deinfusão implantável de fluxo variável para liberação contínua de fármaco;patente U. S. No. 4.439.196 que mostram um sistema de liberação de fár-maco osmótico tendo compartimentos de multicâmaras; e patente U. S. No. 4.475.196 que mostra um sistema de liberação de fármaco osmótico. Estaspatentes são incorporadas aqui por referência. Muitos outros tais implantes,sistemas de liberação, e módulos são conhecidos àqueles versados na téc-nica.

Em certas modalidades, os anticorpos da invenção podem serformulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, abarreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrófi-los. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem aBBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em Iiposso-mas. Para métodos de fabricação de lipossomas, vide, por exemplo, Paten-tes U. S.s 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem com-preender uma ou mais metades que são seletivamente transportadas emcélulas ou órgãos específicos, desse modo para intensificar a liberação defármaco alvejada (vide, por exemplo, V. V. Ranade, 1989 J. Cline Pharma-col. 29:685). Metades alvo exemplares incluem folato ou biotina (vide, porexemplo, Patente U. S. 5.416.016 para Low et al.); manosídeos (Umezawaet al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G.Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob." Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A de tensoativo (Briscoe etal., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem.269:9090); vide também K. Keinanen; M. L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett.346:123; J. J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imunomethods 4:273.

AS COMBINAÇÕES

A invenção também refere-se a um método de impedir ou tratardoenças proliferativas ou doenças, tais como um câncer, em um mamífero,particularmente um humano, com uma combinação de agentes farmacêuti-cos que compreendem.

(a) uma composição de antagonista de anticorpo de c-Met; e

(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos.

A invenção também refere-se às composições farmacêuticascompreendendo:

(a) uma composição de antagonista de anticorpo de c-Met;

(b) um agente farmaceuticamente ativo; e

(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também refere-se a um pacote ou produtocomercial compreendendo:

(a) uma formulação farmacêutica de uma composição de anta-gonista de anticorpo de c-Met; e

(b) uma formulação farmacêutica de um agente farmaceutica- mente ativo para uso simultâneo, concorrente, separado ou seqüencial.

OS AGENTES FARMACEUTICAMENTE ATIVOS

O termo "agentes farmaceuticamente ativos" é vasto abrangendomuitos agentes farmaceuticamente ativos que têm mecanismos diferentesde ação. Combinações de alguns destes com anticorpos/composições deantagonista de c-Met podem resultar em melhorias na terapia de câncer. Emgeral, agentes farmaceuticamente ativos são classificados de acordo com omecanismo de ação. Muitos dos agentes disponíveis são anti-metabólitosdas vias de desenvolvimento de vários tumores, ou reagem com o DNA das„ células tumorais. Há também agentes que inibem enzimas, tais como topoi- somerase I e topoisomerase II, ou que são agentes anti-mitóticos.

Pelo termo "agente farmaceuticamente ativo" é especialmentesignificado qualquer agente farmaceuticamente ativo diferente de uma com-posição de antagonista de anticorpo c-Met ou um derivado do mesmo. Inclui,mas não é limitado a:

i. um inibidor de aromatase;

ii. um anti-estrogênio, um anti-andrógeno ou um agonistade gonadorrelina;

iii. um inibidor de topoisomerase I ou um inibidor de topoi-somerase II;

iv. um agente ativo de microtúbulo, um agente de alquila-ção, um anti-metabólito antineoplástico ou um composto de platina;

v. um composto de alvejar/diminuir uma atividade de pro-teína ou de lipídio cinase ou uma atividade de proteína ou de lipídio fosfata-se, um composto anti-angiogênico também ou um composto que induze pro-cessos de diferenciação de célula;

vi. anticorpos monoclonais;

vii. um inibidor de ciclooxigenase, um bisfosfonato, um ini-bidor de heparanase, um modificador de resposta biológica;

viii. um inibidor de isoformas oncogênicas de Ras;

ix. um inibidor de telomerase;

x. um inibidor de protease, um inibidor de metaloproteina-se de matriz, um inibidor de aminopeptidase de metionina, ou um inibidor deproteassoma;

xi. agentes usados no tratamento de malignidades hema-tológicas ou compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de Flt-3;

xii. um inibidor de HSP90;

xiii. anticorpos antiproliferativos;

xiv. um inibidor histona desacetilase (HDAC);

xv. um composto que alveja, diminui ou inibe a ativida-de/função de serina/treonina mTOR cinase;

xvi. antagonista de receptor de somatostatina;

xvii. um composto anti-leucêmico;

xviii. métodos danificadores de célula tumoral;

xix. um aglutinante de EDG;

XX. um inibidor de ribonucleotídeo reductase;

xxi. um inibidor S-adenosilmetionina descarboxilase;

xxii. um anticorpo monoclonal de VEGF ou VEGFR;

xxiii. terapia fotodinâmica;

xxiv. um esteróide angiostático;

XXV. um implante contendo corticosteróides;

xxvi. antagonista de receptor de AT1; e

xxvii. um inibidor de ACE.

O termo "inibidor de aromatase", como aqui usado, refere-se aum composto que inibe a produção de estrogênio, isto é, a conversão dossubstratos androstenediona e testosterona para estrona e estradiol, respec-tivamente. O termo inclui, mas não é limitado a, esteróides, especialmenteatamestano, exemestano e formestano; e, em particular, não-esteróides,especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano,testolactona, cetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol e letrozol. Exemesta-no é comercializado como AROMASIN; formestano como LENTARON; fa-drozol como AFEMA; anastrozol como ARIMIDEX; letrozol como FEMARAou FEMAR; e aminoglutetimida como ORIMETEN. Uma combinação da in- venção compreendendo um agente farmaceuticamente ativo que é um inibi-dor de aromatase é particularmente útil para o tratamento de tumores positi-vos de receptor de hormônio, por exemplo, tumores de mama.

O termo "anti-estrogênio", como aqui usado, refere-se a umcomposto que antagoniza o efeito dos estrogênios no nível de receptor deestrogênio. O termo inclui, mas não é limitado a, tamoxifeno, fulvestrant, ra-Ioxifeno e cloridrato de raloxifeno. Tamoxifeno pode ser administrado naforma como é comercializado, por exemplo, NOLVADEX; e cloridrato de ra-loxifeno é comercializado como EVISTA. Fulvestrant pode ser formuladocomo revelado na patente U. S. No. 4.659.516 e é comercializado como FASLODEX. Uma combinação da invenção compreendendo um agente far-" maceuticamente ativo que é um anti-estrogênio é particularmente útil para otratamento de tumores positivos de receptor de estrogênio, por exemplo,tumores de mama.

O termo "anti-andrógeno", como aqui usado, refere-se a qual- quer substância que é capaz de inibir os efeitos biológicos de hormônios an-drogênicos e inclui, mas não é limitado a, bicalutamida (CASODEX) que po-de ser formulada por exemplo, como revelado na patente U. S. No.4.636.505.

O termo "agonista de gonadorrelina", como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, abarelix, goserrelina e acetato de goserrelina. Goser-relina é revelada na patente U. S. No. 4.100.274 e é comercializado comoZOLADEX. Abarelix pode ser formulado, por exemplo, como revelado napatente U. S. No. 5.843.901.

O termo "inibidor de topoisomerase I", como aqui usado, inclui, mas não é limitado a, topotecan, gimatecan, irinotecan, camptotecina e seusanálogos, 9-nitrocamptotecina e o conjugado de camptotecina macromolecu-lar PNU-166148 (composto A1 em WO 99/17804). Irinotecan pode ser admi-nistrado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, sob amarca registrada CAMPTOSAR. Topotecan pode ser administrado, por e-xemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, sob a marca regis-trada HYCAMTIN.

O termo "inibidor de topoisomerase II", como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, as antraciclinas, tais como doxorrubicina, incluindoformulação lipossomal, por exemplo, CAELYX, daunorrubicina, incluindoformulação lipossomal, por exemplo, DAUNOSOME, epirrubicina, idarrubici-na e nemorrubicina; as antraquinonas mitoxantrona e losoxantrona; e as po-dofilotoxinas etoposida e teniposida. Etoposida é comercializado como E-TOPOPHOS; teniposida como VM 26-BRISTOL; doxorrubicina como ADRI-BLASTIN ou ADRIAMYCIN; epirrubicina como FARMORUBICIN; idarrubici-na como ZAVEDOS; e mitoxantrona como NOVANTRON.

O termo "agente ativo de microtúbulo" como aqui usado, refere-se a agentes de estabilização de microtúbulo, desestabilização de microtú--bulo e inibidores de polimerização de microtublina incluindo, mas não limita-dos a, taxanos, por exemplo, paciltaxel e docetaxel; alcalóides de vinca, porexemplo, vinblastina, especialmente sulfato de vinblastina; vincristina, espe-cialmente sulfato de vincristina e vinorelbina; discodermolidas; coquicina eepotilonas e derivados dos mesmos, por exemplo, epotilona B ou um deriva-do do mesmo. Paclitaxel é comercializado como TAXOL; docetaxel comoTAXOTERE; sulfato de vinblastina como VINBLASTIN R.P; e sulfato de vin-cristina como FARMISTIN. Também incluso são as formas genéricas de pa-clitaxel como também várias formas de dosagem de paclitaxel. Formas ge-néricas de paclitaxel incluem, mas não são limitadas a, cloridrato de betaxo-Iol. Várias formas de dosagem de paclitaxel incluem, mas não são limitadasa, paclitaxel de nanopartícula de albumina comercializado como ABRAXA-NE; ONXOL, CYTOTAX Discodermolida pode ser obtida, por exemplo, comorevelado na patente U. S. No. 5.010.099. Também incluso são derivados deEpotolina que são revelados na patente U. S. No. 6.194.181, WO 98/10121,WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 e WO 00/31247.

Especialmente preferido é Epotolina A e/ou B.O termo "agente de alquilação", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan ou nitrosouréia (BCNUou Gliadel), ou temozolamida (TEMODAR). Ciclofosfamida pode ser admi-nistrada, por exemplo, na forma como é comercializada, por exemplo, sob amarca registrada CYCLOSTIN; e ifosfamida como HOLOXAN.

O termo "anti-metabólito anti-neoplástico" inclui, mas não é limi-tado a, 5-fluorouracil (5-FU); capecitabina; gencitabina; agentes de desmeti-lação de DNA, tais como 5-azacitidina e decitabina; metotrexato; edatrexato;e antagonistas de ácido fólico tais como, mas não limitado a, pemetrexed.Capecitabina pode ser administrada, por exemplo, na forma como é comer-cializado, por exemplo, sob a marca registrada XELODA; e gencitabina co-mo GEMZAR.

O termo "composto de platina", como aqui usado, inclui, mas nãoé limitado a, carboplatina, cis-platina, cisplatina, oxaliplatina, Satraplatina e agentes de platina tais como ZD0473. Carboplatina pode ser administrada,por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, CARBOPLAT;e oxaliplatina como ELOXATIN.

O termo "compostos de alvejar/diminuir uma proteína ou ativida-de de lipídio cinase; ou uma proteína ou atividade de lipídio fosfatase; ououtros compostos anti-angiogênicos", como aqui usado, inclui, mas não élimitado a, inibidores de proteína tirosina e/ou serina cinase e/ou treoninacinase ou inibidores de lipídio cinase, por exemplo:

i)compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dosreceptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tais como compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de VEGF, especi-almente compostos que inibem o receptor de VEGF, tais como, mas não li-mitados a, derivados de 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (AEE788); BAY 43-9006;compostos de isolcolina revelados em WO 00/09495 tais como (4-terc-butil-fenil)-94-piridin-4-ilmetil-isoquinolin-1-il)-amina (AAL881); e

ii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedos receptores de fator de crescimento derivados de plaquetas (PDGFR),tais como compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de PDG-FR1 especialmente compostos que inibem o receptor de PDGF, por exemplo,um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo, imatinib, SU101,SU6668 e GFB-111;

iii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedos receptores de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR);

iv) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedo receptor de fator de crescimento insulino-símile 1 (IGF-1R), tais comocompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de IGF-IR, especi-almente compostos que inibem o receptor de IGF-1R. Compostos incluemmas não são limitados aos compostos revelados em WO 02/092599 e deri-vados dos mesmos de derivados de 4-amino-5-fenil-7-ciclobutil-pirrolo[2,3-djpirimidina (AEW541);

v) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadeda família de tirosina cinase de receptor Trk;

vi) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade" da família de tirosina cinase de receptor Axl;

vii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedo receptor de c-Met;

viii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadeda tirosina cinase de receptor Ret;

ix) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadeda tirosina cinase de receptor Kit/SCFR;

x) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedas tirosina cinases de receptor C-kit (parte da família de PDGFR), tais co-mo compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade da família detirosina cinase de receptor c-kit, especialmente compostos que inibem o re-ceptor de c-kit, por exemplo, imatinib;

xi) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadedos membros da família c de Abl e seus produtos de fusão gênica, por e-xemplo, BCR-AbI Cinase, tal como compostos que alvejam, diminuem ouinibem a atividade dos membros da família c-Abl e seus produtos de fusãogênica, por exemplo, um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exem-pio, imatinib, PD180970, AG957, NSC 680410 ou PD173955 de ParkeDavis;BMS354825

xii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadede membros da família de proteína cinase C (PKC) e de Raf das seri-na/treonina cinases, membros da família de MEK, SRC, JAK, FAK, PDK eRas/MAPK, ou família de Pl(3) cinase, ou da família de cinase relacionada àPl(3) cinase, e/ou os membros da família de cinase ciclina-dependente(CDK) e são especialmente aqueles derivados de estaurosporina reveladosna patente U. S. No. 5.093.330, por exemplo, midostaurina; exemplos de outros compostos incluem, por exemplo, UCN-01; safingol; BAY 43-9006;. Briostatina 1; Perifosina; llmofosina; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; Isis3521; LY333531/LY379196; compostos de isoquinolina, tais como aqueles" revelados em WO 00/09495; FTIs; PD184352 ou QAN697, um inibidor deP13K;

xiii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade

de proteína-tirosina cinase, tais como mesilato de imatinib (GLEEVEC); tir-fostina ou pirimidilaminobenzamida e derivados dos mesmos (AMN107).Uma tirfostina é preferivelmente um composto de peso molecular baixo (Mr <1500), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, especialmente umcomposto selecionado da classe de benzilidenomalonitrila ou S arilbenze-nomalonirila ou a classe de compostos de quinolina de bi-substrato, maisespecialmente qualquer composto selecionado do grupo que consiste emTyrphostin A23/RG-50810, AG 99, Tyrphostin AG 213, Tyrphostin AG 1748,Tyrphostin AG 490, Tyrphostin B44, enantiômero de Tyrphostin B44 (+), Tyr-phostin AG 555, AG 494, Tyrphostin AG 556; AG957 e adaphostin (éster deadamantila de ácido 4-{[(2,5-diidroxifenil)metil]amino}-benzóico, NSC680410, adaphostin);

xiv) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividadeda família de fator de crescimento epidérmico de tirosina cinases de receptor(EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo ou heterodímeros), tais comocompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade da família de fatorde crescimento de receptor epidérmico são especialmente compostos, prote-ínas ou anticorpos que inibem os membros da família de tirosina cinase dereceptor EGF, por exemplo, receptor de EGF1 ErbB2, ErbB3 e ErbB4 ou ligaa EGF ou Iigantes relacionados a EGF1 e são em particular aqueles compos-tos, proteínas ou anticorpos monoclonais genérica e especificamente revela-dos em WO 97/02266, por exemplo, o composto do Exemplo 39, ou na EP O564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0837 063, patente U. S. No. 5.747.498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO97/49688, WO 97/38983 e, especialmente, WO 96/30347, por exemplo,composto conhecido como CP 358774, WO 96/33980, por exemplo, com-posto ZD 1839; e WO 95/03283, por exemplo, composto ZM105180, por e-xemplo, trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab, Iressa, OSI-774, Cl 1033,EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 ou E7.6.3, e- derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina que são revelados em WO03/013541, erlotinib e gefitinib. Erlotinib pode ser administrado na forma co-mo é comercializado, por exemplo TARCEVA, e gefitinib como IRESSA, an-ticorpos monoclonais humanos contra o receptor de fator de crescimentoepidérmico incluindo ABX-EGFR; e

xv) Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a ativida-de/função de mTOR serina/treonina cinase são especialmente compostos,proteínas ou anticorpos que alvejam/inibem os membros da família demTOR cinase, por exemplo, RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, ra-pamicina e derivados/análogos dos mesmos, AP23573 e AP23841 de Ariad,everolimus (CERTICAN) e sirolimus. CERTICAN (everolimus, RAD) um ini-bidor de sinal de proliferação investigatório novo que impede a proliferaçãode células T e células vasculares de músculo liso.

Quando referir a anticorpo, é para incluir anticorpos monoclonaisintactos, nanocorpos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos for-mados de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fragmentos de anticorposdesde que eles exibam a atividade biológica desejada.

A frase "composto que alveja, diminui ou inibe a atividade deuma proteína ou lipídio fosfatase" como aqui usada inclui mas não é limitadaa inibidores de fosfatase 1, fosfatase 2A, PTEN ou CDC25, por exemplo,ácido ocadáico ou um derivado do mesmo.

O termo "anticorpos monoclonais", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, Ibritumomab tiuxe-tan, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF, e tositumomab e iodo I131. Beva-cizumab pode ser administrado na forma como é comercializado, por exem-plo AVASTIN; cetuximab como ERBITUX; trastuzumab como HERCEPTIN;Rituximab como MABTHERA; Ibritumomab tiuxetan como ZEVULIN; anti-RANKL como denosumab (AMG 162), anti-CD40 como HCD122 (pedido depatente U. S. 2002-0106371), e tositumomab e iodo I131 como BEXXAR.

A frase "outros compostos anti-angiogênicos" inclui mas não élimitada a compostos tendo outro mecanismo para sua atividade, por exem-plo, não relacionados à inibição de proteína ou lipídio cinase, por exemplo,, talidomida (THALOMID) e TNP-470.

A frase "compostos que induzem processos de diferenciação decélula" como aqui usada, inclui mas não é limitada a ácido retinóico, α, γ ouδ-tocofherol ou a, γ ou δ-tocotrienol.

O termo "inibidor de ciclooxigenase" como aqui usado inclui, masnão é limitado a, por exemplo, Inibidores de Cox-2, ácido 5-alquil 2-arilaminofenilacético substituído e derivados, tais como celecoxib (CELE-BREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib ou um ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacético, por exemplo, ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoroanilino)fenil acético, lumiracoxib.

O termo "bisfosfonatos", como aqui usado, inclui, mas não é limi-tado a, ácido etridônico, clodrônico, tiludrônico, pamidrônico, alendrônico, ibandrônico, risedrônico e zoledrônico. "Ácido etridônico" pode ser adminis-trado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, DIDRO-NEL; "ácido clodrônico" como BONEFOS; "ácido tiludrônico" como SKELID;"ácido pamidrônico" como AREDIA; "ácido alendrônico" como FOSAMAX;"ácido ibandrônico" como BONDRANAT; "ácido risedrônico" como ACTO-NEL; e "ácido zoledrônico" como ZOMETA.

O termo "inibidor de heparanase", como aqui usado, refere-seaos compostos que alvejam, diminuem ou inibem degradação de sulfato deheparina. O termo inclui, mas não é limitado a, Pl 88.

O termo "modificador de resposta biológica", como aqui usado,inclui, mas não é limitado a Iinfocina ou interferonas, por exemplo, interfero-na γ.

O termo "inibidor de isoformas oncogênicas de Ras", como aquiusado, inclui, mas não é limitado a H-Ras, K-Ras ou N-Ras, como aqui usa-do, refere-se aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividadeoncogênica de Ras, por exemplo, um inibidor de farnesil transferase (FTI),por exemplo, L-744832, DK8G557 ou R115777 (ZARNESTRA).

O termo "inibidor de telomerase", como aqui usado, inclui, masnão é limitado aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividadede telomerase. Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade detelomerase são especialmente compostos que inibem o receptor de telome-rase, por exemplo, telomestatina.

O termo "inibidor de metaloproteinase de matriz" ou (inibidor deMMP), como aqui usado, inclui, mas não é limitado, inibidores peptidomimé-tico e não-peptidomiméticos de colágeno; derivados de tetraciclina, por e-xemplo, inibidor peptidomimético de hidroxamato batimastat; e seu análogooralmente biodisponível marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), me-tastat (NSC 683551) BMS 279251, LADRE 12-9566, TAA211, MMI270B ouAAJ996.

O termo "inibidor de aminopeptidase de metionina", como aquiusado, inclui, mas não é limitado a, compostos que alvejam, diminuem ouinibem a atividade de aminopeptidase de metionina. Compostos que alve-jam, diminuem ou inibem a atividade de aminopeptidase de metionina são,por exemplo, bengamida ou um derivado do mesmo.

O termo "inibidores de proteassoma", como aqui usado, incluicompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade do proteossoma.Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade do proteossomaincluem, mas não são limitados a, PS-341; MLN 341. bortezomib ou Velcade.

A frase "agente usado no tratamento de malignidades hematoló-gicas", como aqui usada, inclui, mas não é limitada a, inibidores de tirosinacinase FMS-símile, por exemplo, compostos alvejando, diminuindo ou inibin-do a atividade de receptores de tirosina cinase FMS-símile (Flt-3R); interfe-rona, 1-b-D-arabinofuransilcitosina (ara-c) e bissulfano; e inibidores de ALK,por exemplo, compostos que alvejam, diminuem ou inibem cinase de Iinfomaanaplástico.

A frase "compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividadede Flt-3" como aqui usada, inclui, mas não é limitada a compostos, proteínasou anticorpos que inibem Flt-3, por exemplo, N-benzoil-estaurosporina, mi-dostaurina, um derivado de estaurosporina, SU11248 e MLN518.

O termo "inibidores de HSP90", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade deATPase intrínseca de HSP90; degradando, alvejando, diminuindo ou inibindoas proteínas clientes de HSP90 por meio da via de proteossoma de ubiquiti-na. Compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade de ATPase in-trínseca de HSP90 são especialmente compostos, proteínas ou anticorposque inibem a atividade de ATPase de HSP90, por exemplo, 17-alilamino,17-demetoxigeldanamicina (17AAG), um derivado de geldanamicina; outroscompostos geldanamicina-relacionados; radicicol e inibidores de HDAC.

O termo "um anticorpo antiproliferativo" como aqui usado, inclui,mas não é limitado a trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM1, erloti-nib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTIN), rituximab (RITUXAN), PR064553(anti-CD40) e Anticorpo 2C4. Por anticorpos é significado por exemplo anti-corpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecífi-cos formados de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fragmentos de anticor-pos desde que exibam a atividade biológica desejada.

O termo "inibidor de HDAC", como aqui usado refere-se a com-postos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade anti-proliferativa. Estes incluem mas não são limitados a compostos reveladosem WO 02/22577, especialmente N-hidróxi-3-[4-[[(2-hidroxietil)[2-(1 H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, e N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida e sais farmacêutica-mente aceitáveis dos mesmos (LBH589). Isto também especialmente incluiácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA); éster de piridino-3-ilmetila de áci-do [4-(2-amino-fenilcarbamoyl)-benzil]-carbâmico e derivados dos mesmos;ácido butírico, piroxamida, tricostatina A, Oxamflatina, apicidina, Depsipeptí-deo; depudecina e trapoxina.

A frase "composto que alveja, diminui ou inibe a atividade/funçãode mTOR serina/treonina cinase" como aqui usada, inclui mas não é limitadaa compostos, proteínas ou anticorpos que alvejam/inibem os membros dafamília de mTOR cinase, por exemplo, RAD, RAD001, CCI-779, ABT578,SAR543, rapamicina e derivados/análogos dos mesmos, AP23573 eAP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN) e sirolimus (RAPAMUNE), CCI-779 e ABT578. CERTICAN (everolimus, RAD) um inibidor de sinal de prolife-ração investigatório novo que impede proliferação de células T e célulasvasculares de músculo liso.

O termo "antagonista de receptor de somatostatina", como aqui" usado, inclui, mas não é limitado a, agentes que alvejam, tratam ou inibem oreceptor de somatostatina, tal como octreorida e SOM230.

O termo "composto anti-leucêmico" como aqui usado, inclui, masnão é limitado a Ara-C, um análogo de pirimidina que é o derivado de 2'-a-hidróxi ribose (arabinosida) de deoxicitidina. Também incluso é o análogo depurina de hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) e fosfato de fludarabina.

A frase "métodos danificadores de célula tumoral" refere-se amétodos, tais como radiação de ionização. O termo "radiação de ionização",referido acima e doravante, significa que radiação de ionização que ocorreou raios eletromagnéticos, tais como Raios X e raios gama; ou partículas,tais como partículas alfa, beta e gama. Radiação ionizante é fornecida, masnão limitada a, em terapia de radiação e é conhecida na técnica. Vide Hell-man, Câncer, 49 Edição, Vol. 1, Devita et al., Eds., págs. 248-275 (1993).

O termo "aglutinante de EDG" como aqui usado, inclui, mas nãoé limitado s, uma classe de imunossupressores que modula recirculação delinfócitos, tais como FTY720.

O termo "inibidor de ribonucleotídeo reductase" como aqui usa-do, inclui, mas não é limitado a, pirimidina ou análogos de nucleosídeo depurina incluindo, mas não limitado a, fludarabina e/ou ara-C; 6-tioguanina; 5-FU; cladribina; 6-mercaptopurina, especialmente em combinação com ara-Ccontra ALL; e/ou pentostatina. Inibidores de ribonucleotídeo reductase sãoespecialmente hidroxiuréia ou derivados de 2-hidróxi-1H-isoindol-1,3-diona,tais como PL-1, PL-2, PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7 ou PL 8. Vide Nandy etal., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, págs. 953-961 (1994).

O termo "inibidores de S-adenosilmetionina descarboxilase",como aqui usado, inclui, mas não é limitado a, os compostos revelados napatente U. S. No. 5.461.076.

A frase "anticorpos monoclonais de VEGF ou VEGFR", comoaqui usado, inclui mas não é limitado a, compostos revelados em WO98/35958, por exemplo, 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina ou um sal. farmaceuticamente aceitável do mesmo, por exemplo, o succinato, ou emWO 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 eEP 0 769 947; aqueles como descrito por Prewett et al., Câncer Res, Vol. 59,págs. 5209-5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, págs.14765-14770 (1996); Zhu et al., Câncer Res, Vol. 58, págs. 3209-3214(1998); e Mordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, págs. 14-21 (1999)em WO 00/37502 e WO 94/10202; ANGIOSTATIN, descrito por 0'Reilly etal., Cell, Vol. 79, págs. 315-328 (1994); ENDOSTATIN, descrito por 0'Reillyet al., Cell, Vol. 88, págs. 277-285 (1997); amidas de ácido antranílicos;ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; ou anticorpos de anti-VEGF ou anticorpos de receptor de anti-VEGF, por exemplo, rhuMAb e RHUFab; aptâmero de VEGF, por exemplo, Macugon; inibidores de FLT-4;inibidores de FLT-3; anticorpo de IgGI de VEGFR-2; Angiozyme (RPI 4610);e Avastan.

O termo "terapia fotodinâmica", como aqui usado, refere-se àterapia que usa certas químicas conhecidas como agentes de fotossensibili- zação para tratar ou impedir cânceres. Exemplos de terapia fotodinâmicasincluem, mas não são limitadas a, tratamento com agentes, tais como, porexemplo, VISUDYNE e porfímero de sódio.O termo "esteróide angiostático", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, agentes que bloqueiam ou inibem angiogênese, tais como,por exemplo, anecortave, triancinolona, hidrocortisona, 11-a-epiidrocotisol,cortexolona, 17a-hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona,testosterona, estrona e dexametasona.

A frase "Implante contendo corticosteróides" como aqui usado,inclui, mas não é limitada a, agentes, tais como, por exemplo, fluocinolona edexametasona.

O termo "antagonista de receptor AT1" como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, agentes, tais como DIOVAN.

O termo "inibidor de ACE" como aqui usado, inclui, mas não élimitado a CIBACEN, benazepril, enazepril (LOTENSIN), captopril, enalapril,fosinopril, lisinopril, moexipril, quinapril, ramipril, perindopril e trandolapril.

Outros agentes farmaceuticamente ativos incluem, mas não sãolimitados a, alcalóides de planta, agentes hormonais e antagonistas, modifi-cadores de resposta biológica, preferivelmente Iinfocinas ou interferonas,oligonucleotídeos sem sentido ou derivados de oligonucleotídeo; ou agentesdiversos ou agentes com outro mecanismo de ação ou desconhecido.

Em cada caso onde citações de pedidos de patente ou publica-ções científicas são dadas, em particular com respeito às respectivas reivin-dicações compostas e os produtos finais dos exemplos de funcionamento, oassunto dos produtos finais, as preparações farmacêuticas e as reivindica-ções é por este meio incorporado no presente pedido por referência paraestas publicações. Compreendidos são igualmente os estereoisômeros cor-respondentes, como também as modificações de cristal correspondentes,por exemplo, solvatos e polimorfos que são revelados. Os compostos usa-dos como ingredientes ativos nas combinações reveladas aqui podem serpreparados e administrados como descritos nos documentos citados, res-pectivamente.

A estrutura dos agentes ativos identificados por números de có-digo, genérico pode ser tirada dos nomes comerciais da edição atual docompêndio padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo,Patentes Internacionais, por exemplo, Publicações Mundiais IMS1 ou as pu-blicações mencionadas acima e abaixo. O conteúdo correspondente dosmesmos é por este meio incorporado por referência.

Será entendido que referências aos componentes (a) e (b) é sig-nificada também incluir os sais farmaceuticamente aceitáveis de quaisquerdas substâncias ativas. Se as substâncias ativas compreendidas pelos com-ponentes (a) e/ou (b) tiverem, por exemplo, pelo menos um centro básico,elas podem formar sais de adição de ácido. Sais de adição de ácido corres-pondentes podem também ser formados tendo, se desejado, um centro bá- sico adicionalmente presente. Substâncias ativas tendo um grupo ácido, porexemplo, COOH, podem formar sais com bases. As substâncias ativas com-preendidas nos componentes (a) e/ou (b) ou uns sais farmaceuticamenteaceitáveis dos mesmos podem também ser usadas na forma de um hidrato, ou inclui outros solventes usados para cristalização.

Desse modo, em um primeiro aspecto, a presente invenção refe-re-se a um método para a prevenção de tratamento de doenças proliferati-vas ou doenças que são desencadeadas através de angiogênese persisten-te em um mamífero, preferivelmente um paciente humano que compreendetratar o paciente simultânea ou seqüencialmente com quantidades farmaceu-ticamente eficazes de uma combinação de:

(a) uma composição de antagonista de anticorpo de c-Met; e

(b) um agente farmaceuticamente ativo.

Em modalidade preferida, a presente invenção fornece uma pre-paração farmacêutica compreendendo:

(a) uma composição de antagonista de anticorpo de c-Met; e

(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos selecionadosdo grupo que consiste em um inibidor de aromatase; um antiestrogênio; umanti-andrógeno; um agonista de gonadorrelina; um inibidor de topoisomeraseI; um inibidor de topoisomerase II; um agente ativo de microtúbulo; um agen-te de alquilação; um anti-metabólito anti-neoplástico; um composto de plati-na; um composto alvejando/diminuindo uma proteína ou atividade de cinasede lipídio ou uma atividade proteína ou de lipídio fosfatase, um compostoanti-angiogênico; um composto que induz diferenciação de processos celula-res; anticorpos monoclonais; um inibidor de ciclooxigenase; um bisfosfonato;um inibidor de heparanase; um modificador de resposta biológica; um inibi-dor de isoformas oncogênicas de Ras; um inibidor de telomerase; um inibi-dor de protease, um inibidor de metaloproteinase de matriz, um inibidor demetionina aminopeptidase; um inibidor de proteassoma; agentes alvejando,diminuem ou inibem a atividade de Flt-3; um inibidor de HSP90; anticorposantiproliferativos; um inibidor de HDAC; um composto que alveja, diminui ouinibe a atividade/função de mTOR serina/treonina cinase; antagonista dereceptor de somatostatina; um composto anti-leucêmico; métodos danifica-dores de célula tumoral; um aglutinante de EDG; um inibidor de ribonucleotí-deo reductase; um inibidor de S-adenosilmetionina descarboxilase; um anti-corpo monoclonal de VEGF ou VEGFR; terapia fotodinâmica; um esteróide- angiostático; um implante contendo corticosteróides; antagonista de receptorAT1; e um inibidor de ACE.

Qualquer da combinação de componentes (a) e (b), o método detratar um animal de sangue quente compreendendo administrar estes doiscomponentes, uma composição farmacêutica compreendendo estes doiscomponentes para uso simultâneo, separado ou seqüencial, o uso da com-binação para a demora de progressão ou o tratamento de uma doença proli-ferativa ou para a fabricação de uma preparação farmacêutica para estespropósitos ou um produto comercial compreendendo uma tal combinação decomponentes (a) e (b), todos como mencionados ou definidos acima, seráreferido subseqüentemente também como combinação da invenção (de for-ma que este termo refere-se a cada uma destas modalidades que dessemodo pode substituir este termo onde apropriado).

Administração simultânea pode, por exemplo, ocorrer na formade uma combinação fixa com dois ou mais ingredientes ativos, ou adminis-trando dois ou mais ingredientes ativos que são formulados simultaneamen-te de modo independente. Uso seqüencial (administração) preferivelmentesignifica administração de um (ou mais) componente de uma combinação deuma só vez, outros componentes em um ponto de tempo diferente que é emuma maneira crônica escalonada, preferivelmente de modo que a combina-ção mostra mais eficiência que os compostos simples administradas inde-pendentemente (especialmente mostrando sinergismo). Uso separado (ad-ministração) preferivelmente significa administração dos componentes dacombinação independentemente um do outro em pontos de tempo diferen-tes, preferivelmente significando que os componentes (a) e (b) são adminis-trados de modo que nenhuma sobreposição dos níveis de sangue mensurá-veis de ambos os compostos está presente de uma maneira sobreposta (aomesmo tempo).

Também combinações de dois ou mais de administração se-qüencial, separada e simultânea são possível, preferivelmente de modo quea combinação de componente-fármacos mostra um efeito terapêutico con-junto que excede o efeito encontrado quando a combinação de componente-fármacos for usada independentemente em intervalos de tempo tão grandesque nenhum efeito mútuo em sua eficiência terapêutica possa ser encontra-dos, um efeito sinergístico sendo especialmente preferido.

O termo "demora de progressão" como aqui usado significa ad-ministração da combinação em pacientes que estão em um pré-estágio ouem uma fase prematura, da primeira manifestação ou uma recaída da doen-ça a ser tratada, em que os pacientes, por exemplo, uma pré-forma da do-ença correspondente é diagnosticada ou que os pacientes estão em umacondição, por exemplo, durante um tratamento médico ou uma condição queé o resultado de um acidente sob a qual é provável que uma doença corres-pondente se desenvolverá.

"Junto terapeuticamente ativo" ou "efeito terapêutico em conjun-to" significa que os compostos podem ser dados separadamente (em umamaneira crônica escalonada, especialmente uma maneira seqüência-específica) em tais intervalos de tempo que eles preferivelmente, no animalde sangue quente, especialmente ser humano, a ser tratado, ainda mostramuma interação (preferivelmente sinergística) (efeito terapêutico em conjunto).

Se este for o caso, pode inter alia ser determinado seguindo os níveis desangue, mostrando que ambos os compostos estão presentes no sangue doser humano a ser tratado pelo menos durante certos intervalos de tempo.

"Farmaceuticamente eficaz" preferivelmente refere-se a umaquantidade que é terapeuticamente ou em um sentido mais vasto tambémprofilaticamente eficaz contra a progressão de uma doença proliferativa.

O termo "um pacote comercial" ou "um produto", como aqui usa-do especialmente define um "kit de partes" no sentido que os componentes(a) e (b) como definidos acima podem ser dosados independentemente oupelo uso de combinações fixas diferentes com quantidades distinguidas doscomponentes (a) e (b), isto é, simultaneamente ou em pontos de tempo dife-rentes. Além disso, estes termos compreendem um pacote comercial quecompreende (especialmente combinando) como componentes de ingredien-tes ativos (a) e (b), juntos com as instruções para uso simultâneo, seqüencial(cronologicamente escalonada, em seqüência tempo-específica, preferenci-, almente) ou (menos preferivelmente) separados dos mesmos na demora deprogressão ou tratamento de uma doença proliferativa. As partes do kit de" partes podem ser depois, por exemplo, administradas simultânea ou crono-logicamente escalonadas, que é em pontos de tempo diferentes e com inter-valos de tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes.Muito preferivelmente, os intervalos de tempo são escolhidos de modo que oefeito na doença tratada no uso combinado das partes é maior que o efeitoque seria obtido através do uso de qualquer um dos pares de combinação(a) e (b) (como pode ser determinado de acordo com os métodos padrões. Arazão das quantidades total do par de combinação (a) para o par de combi-nação (b) a serem administrados na preparação combinada pode ser varia- da, por exemplo, para contender com as necessidades de uma sub-população de paciente a ser tratado ou as necessidades do paciente simplescujas necessidades diferentes podem ser devido à doença particular, idade,sexo, peso do corpo, etc. dos pacientes. Preferivelmente, há pelo menos umefeito benéfico, por exemplo, uma intensificação mútua do efeito dos paresde combinação (a) e (b), em particular um efeito mais aditivo que conse-qüentemente poderia ser alcançado com doses inferiores de cada um dosfármacos combinados, respectivamente, que tolerável no caso de tratamentocom os fármacos individuais apenas sem combinação, produzindo efeitosvantajosos adicionais, por exemplo, menos efeitos colaterais ou um efeitoterapêutico combinado em uma dosagem não-eficaz de um ou ambos dospares de combinação (componentes) (a) e (b), e muito preferivelmente umsinergismo forte dos pares de combinação (a) e (b).

Tanto no caso do uso da combinação de componentes (a) e (b)e do pacote comercial, é qualquer combinação de uso simultâneo, seqüenci-al e separado também possível, significando que os componentes (a) e (b)podem ser administrados em um ponto de tempo simultaneamente, seguido por administração de apenas um componente com toxicidade de hospedeiromais baixa qualquer cronicamente, por exemplo, mais de 3-4 semanas dedoseamento diário, em um ponto de tempo mais tarde e subseqüentementeo outro componente ou a combinação de ambos os componentes em umponto de tempo ainda posterior (em cursos de tratamento de combinação defármaco subseqüentes para um efeito ótimo anti-tumoral) ou outros.

A COMBINAÇÃO DA INVENÇÃO pode também ser aplicada emcombinação com outros tratamentos, por exemplo, intervenção cirúrgica,hipertermia e/ou terapia de irradiação.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven-ção podem ser preparadas através de meios convencionais e podem seradequadas para administração enteral, tal como oral ou retal, e parenteralpara mamíferos incluindo o homem, compreendendo uma quantidade tera-peuticamente eficaz de um inibidor de VEGF e pelo menos um agente far-maceuticamente ativo sozinho ou em combinação com um ou mais veículos25 farmaceuticamente aceitáveis, especialmente aqueles adequados para apli-cação enteral ou parenteral.

As composições farmacêuticas compreendem de cerca de0,00002 a cerca de 100 %, especialmente, por exemplo, no caso de dilui-ções de infusão que estão prontas para o uso, de 0,0001 a 0,02 %, ou, por30 exemplo, no caso de concentrados de injeção ou infusão ou formulaçõesespecialmente parenterais, de cerca de 0,1 % a cerca de 95 %, preferivel-mente de cerca de 1 % a cerca de 90 %, mais preferivelmente de cerca de20 % a cerca de 60 % de ingrediente ativo (em peso de peso, em cada ca-so). Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser, porexemplo, em forma de dose de unidade, tais como na forma de ampolas,frascos, drágeas, tabletes, sacos de infusão ou cápsulas.

A dosagem eficaz de cada um dos pares de combinação empre-gados em uma formulação da presente invenção podem variar, dependendodo composto particular ou composições farmacêuticas empregadas, do mo-do de administração, da condição sendo tratada e da severidade da condi-ção sendo tratada. Médico, clínico ou veterinário de habilidade usual podemfacilmente determinar a quantidade eficaz de cada um dos ingredientes ati-vos necessários para impedir, tratar ou inibir o progresso da condição.

Tirfostinas, especialmente Adafostina, são preferivelmente ad-, ministradas a um animal de sangue quente, especialmente um ser humanoem uma dosagem na faixa de cerca de 1 -6000 mg/dia, mais preferivelmente25-5000 mg/dia, o mais preferivelmente 50-4000 mg/dia. A menos que docontrário declarado aqui, o composto é preferivelmente administrado de uma 5, especialmente de 1-4 vezes por dia.

Preparações farmacêuticas para a terapia de combinação paraadministração enteral ou parenteral são, por exemplo, aquelas em formas dedosagem de unidade, tais como tabletes revestidos com açúcar, cápsulas ousupositórios, e além disso ampolas. Se não indicado do contrário, estas for-mulações são preparadas através de meios convencionais, por exemplo, pormeio de processos convencionais de mistura, granulação, revestimento comaçúcar, dissolução ou liofilização. Será apreciado que o conteúdo de unida-de de um par de combinação não contido em uma dose individual de cadaforma de dosagem em si mesmo não necessita constituir uma quantidadeeficaz uma vez que a quantidade eficaz necessária pode ser alcançada poradministração de uma pluralidade de unidades de dosagem. Alguém de ha-bilidade na técnica tem a habilidade para determinar quantidades farmaceu-ticamente eficazes apropriadas dos componentes de combinação.

Preferivelmente, os compostos ou os sais farmaceuticamenteaceitáveis dos mesmos, são administrados como uma formulação farmacêu-tica oral na forma de um tablete, cápsula ou xarope; ou como injeções pa-renterais se apropriado.

Na preparação das composições para administração oral, quais-quer meios farmaceuticamente aceitáveis podem ser empregados tais comoágua, glicóis, óleos, alcoóis, agentes aromatizantes, conservantes, agentesde coloração. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem amidos, açú-cares, celuloses microcristalinas, diluentes, agentes granulantes, lubrifican-tes, aglutinantes, agentes desintegrantes.

Soluções do ingrediente ativo, e também suspensões, e solu-ções ou suspensões aquosas especialmente isotônicas, são úteis para ad-ministração parenteral do ingrediente ativo, isto sendo possível, por exem-plo, no caso de composições Iiofilizadas que compreendem o ingredienteativo sozinho ou junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, por e-xemplo, manitol, para tais soluções ou suspensões serem produzidas antesdo uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou com-preender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentesintumescentes e/ou agentes emulsificantes, solubilizantes, sais para regulara pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de uma maneira co-nhecida per se, por exemplo, por meio de processos de dissolução ou Iiofili-zação convencionais. As soluções ou suspensões podem compreendersubstâncias de aumento de viscosidade, tais como carboximetilcelulose desódio, carboximetilcelulose, dextrana, polivinilpirrolidona ou gelatina. Sus-pensões em óleo compreendem como o componente de óleo os óleos vege-tais, sintéticos ou semi-sintéticos habituais para propósitos de injeção.

O agente isotônico pode ser selecionado de qualquer um daque-les conhecidos na técnica, por exemplo manitol, dextrose, glicose e cloretode sódio. A formulação de infusão pode ser diluída com o meio aquoso. Aquantidade de meio aquoso empregado como um diluente é escolhida deacordo com a concentração desejada de ingrediente ativo na solução de in-fusão. Soluções de infusão podem conter outros excipientes comumenteempregados em formulações a ser administradas intravenosamente tais co-mo antioxidantes.A presente invenção também refere-se a "uma preparação com-binada" que, como aqui usada, especialmente define um "kit de partes" nosentido que os pares de combinação (a) e (b) como definidos acima podemser dosados independentemente ou por uso de combinações fixas diferentescom quantidades distinguidas dos pares de combinação (a) e (b), isto é, si-multaneamente ou em pontos de tempo diferentes. As partes do kit de partespodem depois, por exemplo, ser administradas simultânea ou cronologica-mente escalonadas, que é em pontos de tempo diferentes e com intervalosde tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes. A razãodas quantidades totais do par de combinação (a) para o par de combinação(b) a serem administradas na preparação combinada pode ser variada, porexemplo, para contender com as necessidades de uma sub-população de- pacientes a ser tratada ou as necessidades do paciente apenas com basena severidade de qualquer efeito colateral que o paciente sofre.15 USOS E MÉTODOS DA INVENÇÃO

Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) dapresente invenção têm diagnóstico in vitro e in vivo e utilidades terapêuticas.Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas às células em cultu-ra, por exemplo in vitro ou in vivo, ou em um sujeito, por exemplo, in vivo,20 para tratar, impedir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. O termo"sujeito" como aqui usado é intencionado a incluir os animais humanos enão-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados, por e-xemplo, mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelhas, cachorros,gatos, vacas, cavalos, galinhas, e não-mamíferos, tais como pássaros, anfí-25 bios e répteis. Os métodos são particularmente adequados para tratar paci-entes humanos tendo um distúrbio associado à expressão aberrante de c-Met. Quando os anticorpos para c-Met forem administrados junto com outroagente, os dois ou podem ser administrados em ordem ou simultaneamente.

Em uma modalidade, os anticorpos (e imunoconjugados e molé-30 cuias biespecíficas) da invenção podem ser usados para detectar níveis dec-Met, ou níveis de células contendo c-Met. Isto pode ser alcançado, por e-xemplo, contatando uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma a-mostra de controle com o anticorpo de anti-c-Met sob condições que permi-tem a formação de um complexo entre o anticorpo e c-Met. Qualquer com-plexo formado entre o anticorpo e c-Met é detectado e comparado na amos-tra e no controle. Por exemplo, métodos de detecção padrões, bem conheci- dos na técnica, tais como ELISA e ensaios citométricos de fluxo, podem serexecutados usando as composições da invenção.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção também forne-ce métodos para detectar a presença de c-Met (por exemplo, antígeno de c-Met humano) em uma amostra, ou medir a quantidade de c-Met, compreen- dendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo dainvenção, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo para que espe-cificamente ligue c-Met, sob condições que permitem a formação de umcomplexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e c-Met. A formação de umcomplexo é depois detectada, em que uma diferença no complexo de forma- ção entre a amostra comparada à amostra de controle é indicativa da pre->ença de c-Met na amostra.

Também dentro do escopo da invenção estão kits que consistemnas composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunocon-jugados e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para o uso. Okit pode também conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou maisanticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo umaatividade complementar que liga a um epítopo no antígeno alvo distinto doprimeiro anticorpo). Kits tipicamente incluem uma marcação que indica o usointencionado dos conteúdos do kit. O termo marcação inclui qualquer escritu- ra, ou material registrado provido dentro ou com o kit, ou que do contrárioacompanha o kit.

A invenção tendo sido descrita por completo, é também ilustradapelos exemplos a seguir e reivindicações que são ilustrativos e não são sig-nificadas ser Iimitativos também. Aqueles versados na técnica reconhecerãoou poderão apurar usando experimentação mais rotineira, numerosos equi-valentes para os procedimentos específicos descritos aqui. Tais equivalentesestão dentro do escopo da presente invenção e reivindicações. Os conteú-dos de todas as referências, incluindo patentes emitidas e pedidos de paten-te publicados, citados ao longo deste pedido são por este meio incorporadospor referência.EXEMPLOS

EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPOS c-Met-ESPECÍFICOS HUMA-NOS DA BIBLIOTECA HUCAL GOLD®

Anticorpos terapêuticos contra proteína humana de c-Met sãogerados por seleção de clones tendo afinidades de ligação altas, usandocomo a fonte de anticorpo proteínas variantes de uma biblioteca de exibiçãode fago comercialmente disponível, a biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®.HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab (Knappik et al., 2000 J. Mol. Biol.296:57-86; Krebs et al., 2001 J lmunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger* et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205) em que todas as CDRs sãodiversificadas através de mutação apropriada, e empregando a tecnologia deCysDisplay™ para ligar fragmentos de Fab à superfície de fago (WO• 01/05950 Lõhning 2001).

PROCEDIMENTOS GERAIS: SALVAMENTO DE FAGEMÍDEO, AMPLIFI-CAÇÃO DE FAGO, E PURIFICAÇÃO

A biblioteca HuCAL GOLD® é amplificada em meio bacteriano20 rico padrão (2xYT) contendo 34 pg/ml cloranfenicol e 1 % glicose (2xYT-CG). Após infecção das células em uma ODeoonm de 0,5 com fagos ajudantesde VCSM13 (incubando a mistura de células e fago durante 30 min a 37e Csem agitação seguido por 30 min a 37Q C agitando a 250 rpm), as célulassão centrifugadas (4120 g; 5 min; 49 C), são re-suspensas em 2xYT /25 34 μ g/m I cloranfenicol / 50 pg/ml canamicina / 0,25 mM IPTG, e crescidasdurante a noite a 229 C. Ao término deste período as células são removidasatravés de centrifugação, e os fagos são precipitados com PEG duas vezesdo sobrenadante, são re-suspensos em PBS / 20 % glicerol e são armaze-nados a-80Q C.

30 Amplificação de fago entre dois ciclos de panning é conduzida

como segue: células de TG1 de cepa de E. colide fase de meio-log são infe-tadas com fagos que são eluídos seguindo a seleção com proteína de c-Met,e são colocados em placa sobre LB-ágar suplementado com 1 % de glicosee 34 μ g/m I de cloranfenicol (placas de LB-CG). Após incubação durante anoite das placas a 30Q C1 colônias bacterianas são raspadas da superfície deágar, e usadas para inocular caldo de 2xYT-CG para obter uma ODeoonm de0,5, depois os fagos ajudantes de VCSM13 são adicionados para obter umainfecção produtiva como descrita acima.

PRÉ-EXPERIMENTOS PARA PANNING DE SOLUÇÃO USANDO CONTASMAGNÉTICAS STREP-TACTIN

O marcador Strep Il foi relatado ter baixa afinidade para a matrizde Strep-Tactin (KD ~1 μΜ de acordo com (Voss e Skerra, 1997 Protein Eng.10:975-982), portanto, um pré-experimento é executado para avaliar a con-veniência de usar contas de MagStrep revestidas com Strep-Tactin pela cap-turar do antígeno durante as seleções de anticorpo, e evitar perda de antí-geno durante os pannings.

Para aquele propósito, 8 mg de contas de MagStrep são incuba-dos com 46 pg de c-Met marcado com His-Strep por 1 h em temperaturaambiente e a amostra é dividida em quatro tubos de Eppendorf pré-bloqueados. Um tubo serve como o controle positivo (nenhuma lavagem) eas outras três amostras são lavadas com severidades diferentes de acordocom a seção de panning manual de HuCAL GOLD®. Detecção de ligação doc-Met marcado com His-Strep às contas de MagStrep (contas magnéticasrevestidas com Strep-Tactin obtidas de IBA, Gõttingen, Alemanha) é execu-tada em BioVeris usando um anticorpo de anti-c-Met de cabra e um anticor-po de detecção de anti-cabra marcado com Rubídio.

Como mostrado nas figuras aqui, nenhuma perda significativa dec-Met marcado com His-Strep das contas revestidas com Strep-Tactin é de-tectável quando as contas não-lavadas forem comparadas com aquelas con-tas lavadas com severidades de HuCAL® diferentes. Desse modo, o c-Metmarcado com His-Strep parece ser adequado para o uso nos pannings desolução com contas magnéticas revestidas com Strep-Tactin (contas deMagStrep).

SELEÇÃO POR PANNING DE ANTICORPOS c-Met-ESPECÍFICOS DA Bl-BLIOTECA

Para a seleção de anticorpos que reconhecem o c-Met humano,duas estratégias de panning são aplicadas.

Em geral, fago-anticorpos HuCAL GOLD® são divididos em qua-tro fundos gerais compreendendo combinações diferentes de genes de Vhprincipais (fundo geral 1 continha VH1/5 λκ; fundo geral 2 cotinha VH3/Ak;fundo geral 3 continha de VH2/4/6 λκ; e fundo geral 4 continha VHI-6/λκ).Estes fundos gerais são submetidos individualmente a dois ciclos de panningde solução em c-Met marcado com capturado com His-Strep sobre contasmagnéticas de StrepTactin (contas de Mega Strep; IBA), e para o terceirociclo de seleção apenas, ou em c-Met marcado com His-Strep capturadosobre contas magnéticas de StrepTactin ou em proteína de c-Met humanamarcada com APP capturada por contas de Estreptavidina (Dynabeads® M-280 Streptavidin; Dynal) com um anticorpo de anti-APP biotinilado.

Especificamente, para o panning de solução usando c-Met mar-- " cado com His-Strep acoplado as contas magnéticas de StrepTactin, o proto-colo a seguir é aplicado: tubos pré-bloqueados são preparados (1,5 ml tubosde Eppendorf) por tratamento com 1,5 ml 2x ChemiBLOCKER diluído 1:1com PBS durante noite a 4Q C. Contas pré-bloqueadas são preparadas atra-vés de tratamento como segue: 580 μΙ (28 mg contas) de contas magnéticasde StrepTactin são lavados uma vez com 580 μΙ de PBS e re-suspensas em580 μΙ de 1x ChemiBLOCKER (diluído em um volume 1x PBS). Bloqueio dascontas é executado nos tubos pré-bloqueados durante a noite a 4- C.

Partículas de fago diluídas em PBS a um volume final de 500 μΙpara cada condição de panning são misturadas com 500 μΙ 2x ChemiBLOC-KER / 0,1 % Tween e persistidas durante uma hora em temperatura ambien-te em uma roda giratória. Pré-adsorção das partículas de fago para remoçãode StrepTactin ou fagos de ligação de conta é executada duas vezes: 160 μΙde contas magnéticas bloqueadas com StrepTactin (4 mg) são adicionadosàs partículas de fago bloqueadas, e são incubados durante 30 min em tem-peratura ambiente em uma roda giratória. Após separação das contas porum dispositivo magnético (Dynal MPC-E), o sobrenadante de fago (-1,1 ml)é transferido para um tubo de reação fresco, bloqueado e pré-adsorção érepetida usando 160 μΙ de contas bloqueadas durante 30 min. Depois, c-Metmarcado com His-Strep, ou 400 nM ou 100 nM, é adicionado às partículasde fago bloqueadas em um tubo de reação fresco, bloqueado de 1,5 ml e amistura é incubada por 60 min em temperatura ambiente em uma roda gira-tória.

Os complexos de fago-antígeno são capturados usando 320 μΙou 160 μΙ de contas magnéticas bloqueadas com StrepTactin adicionadosaos fundos gerais de 400 nM ou 100 nM de panning de fago, respectivamen-te sendo depois incubados por 20 min em temperatura ambiente em umaroda giratória. Partículas de fago ligadas às contas magnéticas de StrepTac-tin são colhidas novamente com o separador de partícula magnético.

Contas são depois lavadas sete vezes com PBS/ 0,05 % Tween(PBST), seguido lavando mais três vezes com PBS apenas. Elução das par-tículas de fago das contas magnéticas de StrepTactin são executadas poradição de 200 μΙ de 20 mM DTT em 10 mM Tris-HCI, pH 8,0 para cada tubopor 10 min. O eluato é colhido, e as contas são lavadas uma vez com 200 μΙPBS e o eluato de PBS é adicionado ao eluato de DTT. Esta amostra de e-Iuato é usada para infetar 14 ml de uma cultura de TG-1 de E. coli que épreviamente crescida a uma OD6Oonm de 0,6-0,8.

Após infecção e centrifugação subseqüente por 10 min a 5000rpm cada pelota bacteriana foi re-suspensa em 500 μΙ de meio 2xYT, colo-cada em placa sobre placas de ágar 2xYT-CG e incubadas durante a noite a309 C. Na manhã seguinte, as colônias resultantes são raspadas das placase o fago é preparado por salvamento e amplificação como descrito acima.

O segundo ciclo de pannings de solução em c-Met marcado comHis-Strep é executado de acordo com o protocolo do primeiro ciclo, excetoque quantidades decrescentes de antígeno são usadas (50 nM, e 10 nM) e aseveridade do procedimento de lavagem é alterada apropriadamente.

Duas estratégias de panning diferentes são aplicadas para o ter-ceiro ciclo de seleção: a produção de fago amplificada do segundo ciclo depanning é dividida e submetida a duas condições de panning diferentes. Aprimeira metade da produção de fago é usada para a estratégia de panningpadrão em c-Met humano marcado com His-Strep capturado sobre contasde StrepTactin como descrito acima (quantidades de antígeno são 10 nM ou1 nM, respectivamente).

A segunda variação de panning para o terceiro ciclo de seleçãoé executada em c-Met humano marcado com APP. Proteína de c-Met mar-cada com APP a uma concentração final de 50 nM ou 10 nM é misturadacom 1 ml de partículas de fago pré-clareadas da segunda rodada, e a mistu-ra é incubada em temperatura ambiente durante 1 hora em uma roda girató-ria. Em paralelo, 8 mg de Dynabeads M-280 Streptavidin pré-bloqueadas(DynaI) são incubados com 40 pg de anticorpo de anti-APP de camundongobiotinilado durante 30 min em temperatura ambiente em uma roda giratóriaseguida por duas etapas de lavagem com PBST. Os complexos pré-formados que consistem em fago-anticorpos ligados a c-Met marcado comAPP são capturados pelas contas magnéticas de M-280 Streptavidin revesti-- ~ das com anti-APP durante 30 min em temperatura ambiente. Elução e ampli-ficação de fago são executadas como descrito acima.SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DE FRAGMENTOS DE Fab SOLÚVEIS

As inserções de codificação de FAB dos fagemídeos HuCALGOLD® selecionados são subclonadas em vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH (vide figuras) para facilitar a expressão rápida e eficientedos Fabs solúveis. Para este propósito, o DNA de plasmídeo dos clones se-lecionados é digerido com enzima de restrição endonucleases Xba\ e EcoRI,assim excisando a inserção de codificação de Fab (ompA-VLCL e phoA-Fd).Esta inserção é depois clonada em vetor de expressão digerido comXba\/EcoR\ pMORPH®X9_Fab_FH.

Proteínas de Fab são expressadas deste vetor, e como resulta-do carregam dois marcadores C-terminais (FLAG™ e 6xHis, respectivamen-te) para detecção e purificação.

MICROEXPRESSÃO DE ANTICORPOS DE Fab HUCAL GOLD® EM E coliPara obter quantidades suficientes de proteína codificadas porcada um dos clones obtidos acima, colônias bacterianas simples resistentesa cioranfenicol são selecionadas após subclonagem dos Fabs selecionadosno vetor de expressão de pMORPH®X9_Fab_FH. Cada uma destas colô-nias é depois usada para inocular os poços de uma placa de microtitulaçãode 96 poços estéreis, com cada poço contendo 100 μΙ de meio de 2xYT-CGpor poço, e bactérias são crescidas durante a noite a 37e C. Uma amostra(5 μΙ) de cada cultura de TG-1 de E colié transferida para uma placa de mi-crotitulação de 96 poços fresca, estéril pré-enchida com 100 μΙ de meio 2xYTsuplementado com 34 pg/ml de cioranfenicol e 0,1 % de glicose por poço. Asplacas de microtitulação são incubadas a 309 C com agitação a 400 rpm emum agitador de microplaca até que as culturas fiquem ligeiramente turvas(-2-4 h) com uma OD6oonm de cerca de 0,5.

Para expressão no formato destas placas, 20 μΙ de meio 2xYTsuplementado com 34 μg/ml de cioranfenicol e 3 mM de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo) são adicionados por poço (concentração final 0,5 mMIPTG), as placas de microtitulação vedadas com fita permeável a gás, e in-cubadas durante a noite a 30Q C agitando a 400 rpm.

GERAÇÃO DE USADOS DE CÉLULAS INTEIRAS (EXTRATOS DE BEL)

Para cada poço das placas de expressão, 40 μΙ tampão de BEL(2xBBS / EDTA: 24,7 g/l de ácido bórico, 18,7 g de NaCI/l, 1,49 g de EDTA/I,pH 8,0) contendo 2,5 mg/ml de Iisozima são adicionados, e as placas sãoincubadas por 1 ha 22e C em um agitador de placa de microtitulação(400 rpm). Os extratos de BEL são usados para analise de ligação por FMAT(vide Exemplo 2).

EXPRESSÃO DE QUANTIDADES EM MICROGRAMA DE ANTICORPOSDE Fab DE HUCAL GOLD® EM E coli E PURIFICAÇÃO

Expressão de fragmentos de Fab codificados por pMOR-PH®X9_Fab_FH em células de TG1 F de E coli é realizada em tubos deplástico de 50 ml. Para este propósito, pré-culturas inoculadas com clonessimples são crescidas em meio 2xYT-CG durante a noite a 30e C. Na manhãseguinte, 50 μΙ de cada pré-cultura são usados para inocular 25 ml de meio2xYT suplementado com 34 pg/ml de Cioranfenicol, 1 mM de IPTG, e 0,1 %de glicose em tubos de plástico estéreis de 50 ml, e incubados durante anoite a 309 C. As células de E. coli são colhidas, as pelotas de célula gela-das e por fim rompidas com Bicho Buster (Novagen). Os fragmentos de Fabsão isolados usando Ni-NTA Agarose (Qiagen, Hilden1 Alemanha).

EXPRESSÃO DE QUANTIDADES EM MILIGRAMA DE ANTICORPOS DEFab DE HUCAL GOLD® EM E. coli E PURIFICAÇÃO

Expressão de fragmentos de Fab codificados por pMOR-PH®X9_Fab_FH em células TG1 F é realizada em culturas de frasco de agi-tador usando 750 ml de meio de 2xYT suplementado com 34 pg/ml de clo-ranfenicol. Culturas são agitadas a 30e C até que a OD6Oonm alcançasse 0,5.

Expressão é induzida por adição de 0,75 mM de IPTG seguido por incuba-ção por 20 h a 30e C. As células são rompidas usando lisozima, e fragmen-tos de Fab são isolados através de cromatografia de Ni-NTA (Qiagen, Hil-den, Alemanha). Concentrações de proteína são determinadas através deUV-espectrofotometria (Krebs et al., 2001).

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS DE HUCAL® c-Met-- L ESPECÍFICOS

Extratos de BEL de clones de E. coli individuais selecionadospelas estratégias de panning supracitadas são analisados por Tecnologia deEnsaio de Microvolume Fluorométrico (FMAT™, analisador de Sistema deDetecção Celular 8200, Applied Biosystems), para identificar dos clones decodificação de Fabs c-Met-específico.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO COM BASE EM TECNOLOGIA DE ENSAIO DEMICROVOLUME FLUOROMÉTRICO (FMAT) PARA DETECÇÃO DE FabsDE LIGAÇÃO DE c-Met DE LISADOS BACTERIANOS

Para a detecção de anticorpos de Fab de ligação a c-Met de Ii-sados de E. coli (Extratos de BEL), ligação é analisada com o sistema dedetecção celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Para acoplar c-Met mar-cado com His-Strep sobre contas de M-450 Expoxy (DynaI)1 uma amostra de300 μΙ de contas de M-450 Epoxy (1,2x108 contas) é transferida para umtubo de reação e capturadas com um separador de partícula magnético. Osobrenadante é removido e as contas são lavadas quatro vezes em 1 ml de100 mM tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. Para revestimento de antígeno,60 pg de c-Met marcado com His-Strep são adicionados à suspensão deconta em 150 μΙ de 100 mM tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. A suspen-são de antígeno-conta é incubada por 16 h em temperatura ambiente emuma roda giratória. As contas revestidas são depois lavadas três vezes comPBS e re-suspensas em um volume final de 250 μΙ PBS.

Para cada placa de 384 poços, uma mistura de 20 ml de PBScontendo 3 % BSA, 0,005 % Tween-20, 4 μΙ de contas revestidas com c-Met(1,9x106 contas) e 4 μ! de anticorpo de detecção Cy5™ são preparados.Uma amostra de 45 μΙ desta solução é dispensada por poço em uma placade FMAT de fundo preto/clara de 384 poços (Applied Biosystems). O extratode BEL contendo Fab (5 μΙ) é adicionado a cada poço. As placas de FMATsão incubadas em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguin-te as placas são analisadas no Sistema de Detecção Celular 8200 (Applied- , Biosystems).

São obtidos clones positivos, e as seqüências de cadeia pesadae leve dos clones rendendo sinais positivos, específicos em FMAT são anali-sadas. Clones de anti-c-Met únicos (não-redundantes) são identificadosmostrando ligação suficientemente forte a c-Met humano. Estes clones sãoexpressos, purificados e testados para afinidade e em ensaios funcionais.

DETERMINAÇÃO DAS AFINIDADES NANOMOLARES USANDO RESSO-NÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE

Usando estes clones, análise de SPR cinética é executada emuma fatia de CM5 (Biacore, Suécia) que tinha sido revestida com uma den-sidade de -400 RU de qualquer c-Met humano recombinante, em 10 mM deacetato de Na pH 4,5 usando química de acoplamento de amina de EDC-NHS padrão. Uma quantidade comparável de albumina de soro humana(HSA) é imobilizada na célula de fluxo de referência. PBS (136 mM NaCI, 2,7mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4 pH 7,4) é usado como o tam-pão corrente. As preparações de Fab são aplicadas em série de concentra- ção de 16 - 500 nM a uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Fase de associação éajustada para 60 s e fase de dissociação para 120 s. Um sumário das afini-dades em nM para c-Met humano é mostrado na Tabela 1 aqui.Tabela 1. Afinidades de Fabs selecionado para humano, c-Met

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EXEMPLO 3: ANÁLISE QUANTITATIVA DE AFINIDADES DE LIGAÇÃO:DETERMINAÇÃO DE CANDIDATOS DE Fab de c-Met ANTI-HUMANO QUELIGAM c-Met DE COMPRIMENTO TOTAL" DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE

A fim de também caracterizar os anticorpos de anti-c-Met, a afi-nidade para o humano de comprimento total e c-Met cinomólogo é determi-nada. GTL16, células CHO que supra-expressam c-Met cinomólogo ou célu-las 4MBr-5 de reso são lavadas, tripsinadas, e suspensas em PBS contendo3 % FCS (3 % FCS/PBS) a 49 C. 2-5x105 células/amostra são re-suspensasem 140 μΙ de 3 % FCS//PBS contendo 5 pg/ml de Fabs de anti-cMet purifi-cados ou diluições seriais dos mesmos. Como um controle positivo 5 pg/mlde D024 (lgG2a de camundongo), c-Met ANTI-HUMANO é usado. As célu-las são incubadas durante 30-60 minutos a A- C antes de serem empelota-das através de centrifugação para 2 min a 2000 rpm (716 g) a 4- C e lavadasem 200 μΙ em 3 % FCS/PBS esfriado. As células são novamente empelota-das por centrifugação e o PBS suavemente removido. Células são re-suspensas em 100 μΙ de IgG anti-humana de cabra (H+L) conjugada com PE(Jackson No de Cat. 109-116-088) diluída 1:200 em 3 % FCS/0,02 %NaN3ZPBS. Para controle positivo, IgG de anti-camundongo de cabra de(H+L) conjugada com PE (Jackson No de Cat. 115-116-146) diluída 1:200em 3 % FCS/PBS é usada. As amostras são incubadas na escuridão por 30-60 min a 49 C. Seguindo centrifugação e lavando em 200 μΙ de 3 %FCS/0,02 % NaN3ZPBS as células são re-suspensas em 100 μΙ de 3 %FCS/PBS e ensaiadas usando arranjo de FACS ou FACS-Calibur.

Os dados de afinidade resumidos no c-Met humano e cinomólo-go estão mostrados na Tabela 2 aqui. Todos os seis Fabs testados mostra-dos na Tabela 2 são observados ter afinidade a c-Met humano abaixo de100 nM. Nove clones também produzem anticorpos com afinidades menoresque 10 nM. Em todos os casos testados, as afinidades para c-Met cinomólo-go e de camundongo são quase idênticas às para c-Met humano.

TABELA 2. DADOS DE AFINIDADE DE Fabs SELECIONADOS NO C-MET

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EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS DE HUCAL®CONVERSÃO PARA O FORMATO DE IgG

Dimerização mediada por anticorpo pode resultar em ativaçãoagonística da atividade de c-Met de tirosina cinase. Portanto Fabs, selecio-nados em base de c-Met purificado de ligação, são convertidos no formatode IgG. Para expressar imunoglobulina de comprimento total (Ig), fragmen-tos de domínio variável de cadeias pesadas (Vh) e leves (Vl) ou são subclo-nados dos vetores de expressão de Fab pMORPH®X9_FH no pMOR-PH®_h_lg ou na série de vetor pMORPH®2_h_lg para IgGI humana e lgG4humana. Enzimas de restrição EcoRI, Mfe\, e Blp\ são usadas para subclo-nagem do fragmento de domínio de Vh em pMORPH®_h_lgG1 e pMOR-PH®_h_lgG4. Enzimas de restrição Mfe\ e Blp\ são usadas para subclona-gem do fragmento de domínio Vh em pMORPH®2_h_lgG1f e pMOR-PH®2_h_lgG4. Subclonagem do fragmento de domínio Vl em pMOR-PH®_h_lgK e pMORPH®2_h_!gK é executada usando os sítios de EcoRV eSsMMl enquanto subclonaGEM em pMORPH®_h_lgY e pMORPH®2_h_lgY2 é feitA usando EcoRV e Hpa\.

EXPRESSÃO TRANSIENTE E PURIFICAÇÃO DE IgG HUMANA

Células de HEK293 são transfeccionadas com uma quantidadeequimolar de vetores de expressão de IgG de cadeia pesada e leve. Nosdias 4 ou 5 após transfecção, o sobrenadante de cultura de célula é colhido.Após ajustar o pH do sobrenadante para 8,0 e filtração estéril, a solução ésubmetida à cromatografia de coluna de proteína padrão A (Poros 20A, PEBiosystems).

- CONVERSÃO DE Fabs PARENTAIS NOS FORMATOS DE IgGI E lgG4

Em paralelo ao começo da maturação de afinidade, inserçõessão clonadas nos vetores de expressão pM0RPH®_h_lgG1 e pMOR-- - PH®_h_lgG4. Expressão de escala pequena é executada por transfecçãotransiente das células HEK293 e as imunoglobulinas de comprimento totalsão purificadas do sobrenadante de cultura de célula.

IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE c-Met ANTI-HUMANO DE IgG QUEMODULAM PROLIFERAÇÃO DEPENDENTE DE c-Met

Os anticorpos específicos para c-Met diferentes resultantes se-lecionados da biblioteca HuCAL GOLD® são depois convertidos no formatode IgG e testados para potência para inibir proliferação dirigida por HGF.

A atividade funcional de cada um dos clones selecionados é avaliada usando um ensaio de incorporação de BrdU sob estimulação deHGF de células 4MBr-5. Células 4MBr-5 são colocadas em placa a umadensidade de 3 X 103 células por poço em um volume total de 100 μΙ/poçoHam's F12K suplementado com 10 % FBS em placas tratadas com culturade tecido de fundo chato de 96 poços (Costar, #3610). As placas são incu-badas a 379 C em uma atmosfera de 5 % CO2 durante 2 h após as quais sãoadicionados 50 μΙ de meio contendo o anticorpo purificado a ser testado.Como um controle negativo por falta de modulação, uma amostra de um an-ticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhecida não relaciona-da aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, é adicionada aospoços designados. As placas são incubadas a 379 C em uma atmosfera de 5% CO2 durante 1 h após as quais, 50 μΙ do meio sozinho ou 50 μΙ de HGFcontendo (por exemplo, cerca de 0,5 Mg/μΙ a cerca de 50 ng/ml) são adicio-nados. As placas são incubadas a 379 C em uma atmosfera de 5 % CO2 du-rante 72 h após as quais incorporação de BrDU é ensaiada usando o ELISAde proliferação de célula, ensaio de BrdU (Roche) No de Cat. 1 669 915.Brevemente, 20 μΙ/poço de solução de BrdU (#1) são adicionados e as pla-cas incubadas por 22 h a 37e C em uma atmosfera de 5 % CO2. Meio é sua-vemente removido e a placa secada durante 1 h a 60e C. 200 μΙ de FixDenat(solução #2) são adicionados e as placas incubadas em temperatura ambi-ente com agitação suave durante 30 minutos. A solução é suavemente re-movida e 100 μΙ/poço solução de trabalho de anti-BrDU adicionada. As pla-cas são incubadas em temperatura ambiente com agitação suave durante 90minutos. A solução é suavemente removida e os poços lavados três vezescom 250 μΙ de solução de lavagem. A solução é suavemente removida e 100μΙ/poço de solução de substrato adicionados, as placas são medidas aA405nm.

DETERMINAÇÃO DE EC50

Os dados que mostram a concentração eficaz para 50 % de ini-bição de proliferação estimulada por HGF para os clones de anticorpos ten-do a maior afinidade para c-Met estão mostrados na Tabela 3 aqui. Os da-dos mostram que concentrações eficazes de EC5O variam de 4 nM, com umvalor mediano entre 6 e 150 nM.

IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE c-Met ANTI-HUMANO DE IgG QUEMODULAM MIGRAÇÃO DEPENDENTE DE c-Met

Migração celular em resposta à estimulação com HGF é ensaia-da usando células NCI-H441 no ensaio de migração celular de quimiotaxiade 8 μΜ de 96 poços de QCM™. Como descrito acima, 24 h antes do ensaioas células foram lavadas duas vezes com PBS estéril e privadas no DMEMcontendo 1 % FBS a 37e C em uma atmosfera de 5 % CO2. Subseqüente-mente, as células são tripsinadas e re-suspensas a 1,0 χ 106 células por mlna presença de concentração apropriada do anticorpo purificado por 30min a37Q C. Como um controle negativo por falta de modulação, uma amostra deum anticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhecida não re-Iacionada aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, é adicionadaaos poços designados.

Sob condições estéreis a tampa da placa de câmara de migra-ção é removida e 150 μΙ de meios livres de soro contendo 50 ng/ml de HGF(R&D No de Cat. 294-HGN) são adicionados aos poços da bandeja alimen-tadora (câmara inferior). 100 μΙ de 5-10 χ 104 células em DMEM com 1 %FBS pré-incubado com anticorpo são adicionados suavemente à câmarasuperior. A placa é coberta e incubada durante 16 horas a 372 C entre 4-6 %CO2. Seguindo as instruções dos fabricantes, as células/meios na câmarasuperior são descartados e a câmara colocada em uma Bandeja Alimentado-ra de 96 poços à qual 150 μLypoço de solução de separação de célula pré-aquecida foram adicionados. Células são desalojadas incubando durante 30minutos a 37Q C com agitação suave periódica. Subseqüentemente, 50 μΙ detintura de CyQuant GR pré-diluída são adicionados a cada poço da bandejaalimentadora. A placa é incubada durante 15 minutos em temperatura ambi-ente e 150 μΙ da mistura transferidos para uma placa de 96 poços nova ade-quada para medição de fluorescência usando um conjunto de filtro de480/520 nm.

Os dados que mostram a concentração eficaz para 50 % inibiçãode migração estimulada por HGF para os clones de anticorpos tendo a maiorafinidade para c-Met estão mostrados na Tabela 3 aqui. Os dados mostramque concentrações eficazes de EC5O variam de 0,14 nM, com um valor me-diano entre 0,27 e 0,61 nM.TABELA 3. CONCENTRAÇÃO. EFICAZ PARA 50 % DE INIBIÇÃO DE FabsSELECIONADOS _

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EXEMPLO 5: MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE Fabs DE ANTI-c-Met SE-LECIONADOS PARA PERMUTA PARALELA DE CASSETES DE LCDR3 EHCDR2

Para otimizar as afinidades dos anticorpos descritos aqui para c-Met para um fundo geral de fragmentos de Fab parentais, o LCDR3, estrutu-ra 4 e a região constante das cadeias leve (405 bp) de cada Fab parental éremovida usando Bph e Sph\, e é substituída por um repertório de LCDR3sdiversificados junto com estrutura 4 e o domínio constante. Uma amostra de0,5 pg do vetor de fundo geral de aglutinante é ligada com um excesso molarde 3 vezes do fragmento inserido portando os LCDR3s diversificados.

Em um método similar, o HCDR2 é diversificado usando os sí-tios de Xho\ e físsHII, e as regiões de estrutura de conexão são mantidasconstantes. Para aumentar a eficiência da clonagem, o HCDR2 parental ésubstituído por uma seqüência de enchimento de 590 bp antes da inserçãodo cassete de HCDR2 diversificado.

Misturas de ligação de bibliotecas diferentes são eletroporadasem 4 ml de células de TOPIO F de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),rendendo de 2x107 a 2x108 colônias independentes. Amplificação das biblio-tecas é previamente executada como descrito (Rauchenberger et al., 2003 JBiol Chem. 278(40):38194-38205). Para controle de qualidade, vários clonespor biblioteca são escolhidos fortuitamente e seqüenciados (SequiServe,Vaterstetten, Alemanha) usando preparadores CFR84 (Vl) e OCAL_Seq_Hp(VH).

SELEÇÃO DE CANDIDATOS PARA MATURAÇÃO DE AFINIDADE

Seis candidatos de maturação selecionados ("Fabs parentais")são selecionados usando as propriedades a seguir: afinidades para c-Methumano menos que 10 nM, com reatividade cruzada significativa para c-Metcinomólogo, EC50 menos que 250 nM, e níveis de expressão de Fa bons amoderados em E. colie atividade no formato de IgG em proliferação dirigidapor c-Met e ensaios de migração. As propriedades de fragmentos de Fabselecionados são fornecidas na Tabela 4.

TABELA 4. PROPRIEDADES DOS Fabs SELECIONADOS

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GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE FAB SELECIONADAS PARA MATURA-ÇÃO DE AFINIDADE

A fim de obter clones tendo atividade aumentada de afinidade einibidor dos anticorpos de anti-c-Met, os clones de Fab selecionados mos-trados no exemplo anterior são submetidos a outros ciclos de diversificaçãoe seleção, um processo conhecido como maturação de afinidade. Para estepropósito, as regiões de CDR são diversificadas usando cassetes de matu-ração de LCDR3 e HCDR2 correspondentes pré-construídos por mutagêne-se de trinucleotídeo (Virnekás et al., 1994 Nucleic Acids Res. 22:5600-5607;Nagy et al., 2002 Nature Medicine 8:801-807).

Fragmentos de Fab do vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH são subclonados no vetor de fagemídeo pMORPH®25 (vi-de número patente U. S. 6.753.136). Este vetor fornece a proteína de fagoplll de N-terminalmente fundida em um resíduo de cisteína como tambémuma cisteína C-terminal para a cadeia de anticorpo Fd e desse modo permi-te exibição ligada a dissulfeto dos respectivos fragmentos de Fab na superfí-cie de fago. Duas estratégias diferentes são aplicadas em paralelo para oti-mizar a afinidade e a eficácia dos Fabs parentais.

Cinco bibliotecas de Fab de anticorpo de fago são geradas emque o LCDR3 de cinco dos seis clones parentais é substituído por um reper-tório de seqüências de CDR3 de cadeia leve individuais. (A maturação deLCDR3 de um clone não é executada, como este clone tem um sítio de res-trição de Bph adicional em uma das regiões de CDR e a enzima de restriçãode Bph é usada para o procedimento de clonagem de biblioteca).

Em paralelo, a região de HCDR2 de cada clone parental é subs-tituída por um repertório de seqüências de CDR2 de cadeia pesada individu-- ais. Cada Fab parental é excisado e substituído por um enchedor de 590 bp.Este enchedor de DNA facilita a separação de bandas de vetor digerido sim-ples de digerido duplo e reduz a base dos Fabs de alta afinidade parentaisdurante os pannings de maturação. Em uma etapa subseqüente, o enchedoré excisado dos plasmídeos de codificação de Fab de cada clone parental esubstituído para o cassete de maturação de HCDR2 altamente diversificado.

Bibliotecas de maturação de afinidade grande de mais de 2x107membros são geradas através de procedimentos de clonagem padrões, e osclones diversificados são transformados em células de TOPIOF' de E. colieletrocompetentes (Invitrogen). Fagos de apresentação de FAB são prepa-rados como descritos acima.

Fundo gerais de maturação são construídos para facilitar o pro-cesso de seleção subseqüente:

Fundo geral 1a consistiu nas bibliotecas de LCDR3-1; fundo ge-ral 1b consistiu nas bibliotecas de HCDR2-1; fundo geral 2a consistiu nasbibliotecas de LCDR3-2; e fundo geral 2b consistiu nas bibliotecas de HC-DR2-2.Para cada fundo geral o panning é executado em solução usan-do quantidades decrescentes de c-Met marcado com His-Strep e captura deantígeno de fago através de contas de Strep-Tactin. Em paralelo, cada fundogeral é aplicado em pannings usando quantidades decrescentes de c-Metbiotinilado que é capturado sobre placas revestidas com Neutravidin. A fimde aumentar a severidade de panning e selecionar as taxas melhoradas,competição com Fabs parentais purificados como também antígeno não-marcado é executada durante períodos de incubação prolongados.

Imediatamente após panning os fundos gerais de fagemídeo en-riquecidos são subclonados no vetor de expressão de pMORPH®X9_FH.Clones simples são escolhidos, e expressão de genes nos Fabs é induzidacom IPTG.

ESTRATÉGIAS DE MATURAÇÃO DE PANNING

Procedimentos de panning usando os quatro fundos gerais deanticorpo são executados com c-Met marcado com His-Strep e com c-Met" marcado com His-Strep biotinilado em solução para dois ou três ciclos, res-pectivamente. Para cada uma das estratégias de panning, competição comas proteínas purificadas de Fab parental ou com c-Met marcado com APPnão-marcado, como também baixas concentrações de antígeno e lavagemextensiva, são usadas para aumentar a severidade.

O panning da solução em c-Met marcado com His-Strep não-marcado é executado mais de dois ciclos de seleção principalmente de a-cordo com o protocolo padrão descrito no Exemplo 1. Exceções para estesprocedimentos são a aplicação de quantidades reduzidas de antígeno (dimi-nuindo de 5 nM até 1 nM), a severidade alta do procedimento de lavagem oucom ou sem competidor, e períodos de incubação prolongados de fagos deanticorpo junto com o antígeno.

Para o primeiro ciclo de seleção usando c-Met biotinilado, ospoços de uma placa de Neutravidin são lavados duas vezes com 300 μΙ dePBS. Os poços são bloqueados com 2x ChemiBLOCKER (Chemicon, Te-mecula, CA) diluídos 1:1 em PBS (Tampão de Bloqueio). Antes das sele-ções, os fagos de HuCAL GOLD® são também bloqueados com um volumede Tampão de Bloqueio contendo 0,1 % Tween-20 durante 30 min em tem-peratura ambiente. As preparações de fago bloqueadas são transferidas emalíquotas de 100 μΙ para os poços de uma placa revestida com Neutravidindurante 30 min em temperatura ambiente. Este etapa de pré-adsorção é re-petida uma vez. Preparações de fago bloqueadas e pré-clareadas são incu-badas com 5 nM c-Met biotinilado por 2 h a 22Q C em uma roda giratória.

Uma amostra contendo Fab parental e APP-c-Met, ou um controle positivonão contendo nenhum competidor, é adicionada e as amostras são incuba-das durante a noite a 4Q C em uma roda giratória.

Complexos de antígeno-fago são capturados nos poços de umaplaca de Neutravidin por 20 min em temperatura ambiente. Após etapas delavagem extensivas, partículas de fago ligadas são eluídas por adição de200 μΙ de 20 mM DTT em 10 mM Tris pH 8,0 por poço durante 10 min emtemperatura ambiente. O eluato é removido e adicionado a 14 ml de célulasde TG1 de E. coli crescidas a uma ODeoonm de 0,6-0,8. Os poços são enxa-guados uma vez com 200 μΙ de PBS e esta solução é também adicionada àscélulas de TG1 de E. coli. Infecção de fago de E. coli é permitida por 45 mina 37Q C sem agitação. Após centrifugação por 10 min a 5000 rpm, as pelotasbacterianas foram re-suspensas em 500 μΙ de meio 2xYT, colocadas sobreplacas de ágar 2xYT-CG e incubadas durante a noite a 30- C. As colôniassão colhidas raspando da superfície das placas e as partículas de fago sãosalvadas e amplificadas como descrito acima.

O segundo e terceiro ciclo da seleção são executados comodescrito acima para o primeiro ciclo de seleção, exceto que as condições delavagem são mais rigorosas e concentrações de antígeno são 1 e 0,1 nM,respectivamente.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO COM BASE EM ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA(BIOVERIS) DE Fabs DE LIGAÇÃO DE c-Met

Para a detecção de afinidade melhorada, fragmentos de anticor-pos específicos para c-Met em Iisados de E. coli (Extratos de BEL), uma Es-tação de Trabalho BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europe, Witney, Ox-fordshire, UK), é usada. O ensaio é realizado em placas de microtitulação depolipropileno de 96 poços e PBS suplementado com 0,5 % BSA e 0,02 %Tween-20 como o tampão de ensaio. c-Met humano biotinilado é imobilizadoem contas paramagnéticas de M-280 Streptavidin (DynaI) de acordo com asinstruções do provedor. Uma diluição 1:25 da solução de matéria-prima deconta é adicionada por poço. Amostras de 100 μΙ de extrato de BEL diluído econtas são incubadas durante a noite em temperatura ambiente em um agi-tador. Para detecção, (Fab)'2 anti-humano (Dianova) marcado com BV-tag™de acordo com instruções do provedor (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshi-re, UK) é usado.

Um conjunto de clones fortuitamente escolhidos é analisado pelométodo descrito acima. Um subconjunto daqueles clones que dão os valoresmais altos é escolhido para análise adicional na titulação de equilíbrio desolução.

DETERMINAÇÃO DAS AFINIDADES EM PICOMOLAR USANDO TITULA-ÇÃO DE EQUILÍBRIO DE SOLUÇÃO (SET)

Para determinação de KD, frações de monômero (pelo menos 90% de conteúdo de monômero, analisado por SEG analítica; Superdex75,Amersham Pharmacia) de Fab são usadas. Determinação da afinidade combase em eletroquimioluminescência (ECL) na solução e avaliação dos dadosé executada basicamente como descrito por Haenel et al., 2005. Uma quan-tidade constante de Fab é equilibrada com concentrações diferentes (3n dilu-ições seriais) de c-Met humano (4 nM de concentração de partida) na solu-ção. c-Met humano biotinilado acoplado às contas paramagnéticas (M-280Streptavidin, Dynal), e (Fab)2 anti-humano marcado com BV-tag™ (BioVerisEurope, Witney, Oxfordshire, UK) (Dianova) é adicionado e a mistura incu-bada durante 30 min. Subseqüentemente, a concentração de Fab não-ligadoé quantificada por detecção de ECL usando o analisador M-SERIES® 384(BioVeris Europe).

Para este propósito, clones simples são selecionados e purifica-dos por Ni-NTA Agarose na escala de pg. Afinidades preliminares são de-terminadas através de titulação de equilíbrio de solução de 4 pontos (SET)em BioVeris. Destes dados, afinidades de exibição de clones são seleciona-das. Estes Fabs são purificados na escala de mg. Afinidades finais são de-terminadas de duas bateladas independentes de cada Fab clone usandouma medição de SET de 8 pontos e c-Met humano, camundongo, e cinomó-logo.

Determinação da afinidade para c-Met de camundongo e cino-mólogo é feita essencialmente como descrito acima usando c-Met de ca-mundongo (R&D Systems) e c-Met cinomólogo como analito em solução emvez de c-Met humano. Para detecção de Fab livre, c-Met humano biotiniladoacoplado às contas paramagnéticas é usado. As afinidades são calculadasde acordo com métodos conhecidos àqueles versados na técnica, por e-xemplo, Haenel et ai., 2005 Anal Biochem 339.1:182-184.

Usando as condições de ensaio descritas acima, as afinidadespara os Fabs anti-c-Met otimizados na afinidade são determinadas na solu-ção. Afinidades são determinadas para anticorpos com KDs abaixo de 4,6 pM para c-Met humano. Análise com base em FACs de ligação a c-Met cino" expresso em células CHO, como descrito acima, é realizada. As afinidadesestão resumidas na Tabela 5 aqui.

TABELA 5. AFINIDADES DE Fabs

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EXEMPLO 6: CARACTERIZAÇÃO DE Fabs DE c-Met ANTI-HUMANO OTI-MIZADOS NA AFINIDADETÉCNICAS DE SATURAÇÃO DE FACS

Especificidade de ligação dos Fabs maduros na presença de 50% de soro humano (HS) é determinada. Diluições seriais de Fabs de anti-cMet otimizados são incubadas na presença de 50 % de soro humano ou napresença de 2,8 % de BSA. Ligação de saturação de FACS às células deGTL-16 é avaliada, células de GTL16 são lavadas, tripsinadas, e suspensasem PBS contendo 3 % FCS (3 % FCS/PBS) a 49 C. 2-5x105 células/amostrasão re-suspensas em 140 μΙ de 3 % FCS//PBS contendo 5 pg/ml de Fabs deanti-cMet otimizados purificados ou diluições seriais dos mesmos. Como umcontrole positivo 5 pg/ml de D024 (lgG2a de camundongo), c-Met anti-humano é usado. As células são incubadas durante 30-60 minutos a 4S Cantes de ser empelotadas através de centrifugação por 2 min a 2000 rpm(716 g) a 4e C e lavadas em 200 μΙ de 3 % FCS/PBS frio. As células são no-vamente empelotadas por centrifugação e o PBS suavemente removido. Cé-lulas são re-suspensas em 100 μΙ de IgG anti-humana de cabra (H+L) conju-gado com PE (Jackson No de Cat. 109-116-088) diluídas 1:200 em 3 %FCS/PBS; Para controle positivo, IgG de anti-camundongo de cabra (H+L)conjugado com PE (Jackson No de Cat. 115-116-146) diluído a 1:200 em 3% FCS/PBS é usado. Amostras são incubadas na escuridão por 30-60 min a45 C. Seguindo centrifugação e lavagem em 200 μΙ de 3 % FCS/PBS as cé-lulas são re-suspensas em 100 μΙ de 3 % FCS/PBS e ensaiadas usando ar-ranjo de FACS ou FACS-Calibur.

Curvas de ligação exemplares estão mostradas na Tabela 6 queresume a atividade de ligação dos Fabs de anti-c-Met otimizados na presen-ça de 50 % de soro humano comparada à atividade de ligação em 2,8 %BSA variando de 83,3 % a 100 %. O valor mediano é observado ser 90,2 %,desse modo os Fabs de anti-c-Met são observados completamente ligar aoalvo na presença de soro humano.

Anticorpo Atividade de ligação c / 50 % soro humano vs 2,8 % BSA ( %)5091 83,85097 90,25098 1005185 *

* LIGAÇÃO DE 5185 NÃO ANALISADA AINDA EM TERMOS DE EC50 UMAVEZ QUE SATURAÇÃO NÃO É ALCANÇADACONVERSÃO DE ANTI-CMET OTIMIZADO CANDIDATO FABS NO FOR-MATO DE IgG

Dimerização mediada por anticorpo pode resultar em ativaçãoagonística da atividade de c-Met de tirosina cinase. Portanto, Fabs otimiza-dos selecionados na base de c-Met purificado de ligação, são convertidos noformato de IgG. Para expressar imunoglobulina de comprimento total (Ig),fragmentos de domínios variáveis de cadeias pesadas (Vh) e leves (Vl) sãosubclonados na série dos vetores de expressão de Fab pM0RPH®X9_FHou pMORPH®_h_lg do vetor de pM0RPH®2_h_lg para IgGI humana elgG4 humana. Enzimas de restrição EcoRI1 MfeI, e Blpl são usadas parasubclonagem do fragmento de domínio de Vh em pM0RPH®_h_lgG1 epMORPH®_h_lgG4. Enzimas de restrição /Wfel e S/pl são usadas para sub-clonagem do fragmento de domínio de Vh em pMORPH®2_h_lgG1f epMORPH®2_h_lgG4. Subclonagem do fragmento de domínio de Vl emu pMORPH®_h_lgK e pMORPH®2_h_lgK é executada usando os sítios deEcoRV e BsiWl1 enquanto que subclonagem em pMORPH®_h_lgy e pMOR-PH®2_h_lgY2 é feita usando EcoRV e Hpa.

EXPRESSÃO TRANSIENTE E PURIFICAÇÃO DE IgG HUMANA

Células de HEK293 são transfeccionadas com uma quantidadeequimolar de vetores expressão de IgG de cadeia pesada e leve. Nos dias 4ou 5 após transfecção, o sobrenadante de cultura de célula é colhido. Apósajustar o pH do sobrenadante para 8,0 e filtração estéril, a solução é subme-tida à cromatografia de coluna de proteína A padrão (Poros 20A, Biosystems PE).

IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE c-Met ANTI-HUMANO OTIMIZA-DOS DE IgG MODULANDO PROLIFERAÇÃO DEPENDENTE DE c-Met

Os anticorpos c-Met-específicos otimizados resultantes selecio-nados da biblioteca HuCAL GOLD® são depois convertidos no formato deIgG e testados para potência para inibir proliferação dirigida por HGF.

A atividade funcional de cada um dos clones selecionados éavaliada usando um ensaio de incorporação de BrdU sob estimulação deHGF de células 4MBr"5. Células 4MBr"5 são colocadas em placa a uma den-sidade de 3 X 103 células por poço em um volume total de 100 μΙ/poço deHam's F12K suplementado com 10 % de FBS em placas tratadas com cultu-ra de tecido de fundo chato de 96 poços (Costar, #3610). As placas são in-cubadas a 37g C em uma atmosfera de 5 % CO2 durante 2 h após as quaissão adicionados 50 μΙ de meio contendo o anticorpo purificado a ser testado.Como um controle negativo por falta de modulação, uma amostra de um an-ticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhecida não relaciona-da aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, é adicionada aospoços designados. As placas são incubadas a 37Q C em uma atmosfera de 5% CO2 durante 1 h após as quais, 50 μΙ do meio sozinho ou 50 μΙ contendoHGF (por exemplo, cerca de 0,5 Mg/μΙ a cerca de 50 ng/ml) são adicionados.As placas são incubadas a 37e C em uma atmosfera de 5 % CO2 durante 72h após as quais incorporação de BrDU é ensaiada usando o ELISA de proli-feração celular, ensaio de BrdU (Roche) No de Cat. 1 669 915. Brevemente,- 20 μΙ/poço de solução de BrdU (#1) são adicionados e as placas incubadasdurante 22 h a 37Q C em uma atmosfera de 5 % CO2. Meio é suavementeremovido e a placa secada durante 1 h a 60s C. 200 μΙ de FixDenat (solução#2) são adicionados e as placas incubadas em temperatura ambiente com20 agitação suave durante 30 minutos. A solução é suavemente removida e 100^ μΙ/poço de soíução de trabalho de anti-BrDU adicionados. As placas são in-

cubadas em temperatura ambiente com agitação suave durante 90 minutos.A solução é suavemente removida e os poços lavados três vezes com 250 μΙde solução de lavagem. A solução é suavemente removida e 100 μΙ/poço de25 solução de substrato adicionados, as placas são medidas a A405nm.DETERMINAÇÃO DE EC50

Os dados que mostram a concentração eficaz para 50 % de ini-bição de proliferação estimulada de HGF para os clones de anticorpos tendoa maior afinidade para c-Met estão mostrados na Tabela 7 aqui. Os dados30 mostram que concentrações eficazes EC5O variam de 0,13 nM, com um valormediano entre 0,5 nM e 1,3 nM.TABELA 7. ATIVIDADE INIBIDORA DE CANDIDATOS DE ANTI-c-Met OTI-MIZADOS NA FORMAÇÃO DE IgG EM PROLIFERAÇÃO ESTIMULADAPOR HGF _

<table>table see original document page 166</column></row><table>

TÉCNICAS DE ENSAIO IMUNOABSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA)

Especificidade de ligação dos Fabs maduros na presença de 50- % de soro humano (HS) é determinada. Diluições seriais de anticorpo biotini-lado humano recombinante, em TBS são revestidas sobre placas de microti-tulação de Neutravidin por 2 h em temperatura ambiente, de 8 ng de anticor-po por poço para uma concentração de 125 ng de anticorpo por poço. Apósrevestimento do antígeno, os poços são bloqueados com TBS / 0,05 % Twe-en (TBS-T) suplementados com 1 % BSA por 1 h em temperatura ambiente.Fabs purificados descritos acima são diluídos em TBS / 4 % BSA ou TBS /50 % HS a uma concentração final de 1 pg/ml, adicionados aos poços reves-tidos e bloqueados e as placas são incubadas por 1 h em temperatura ambi-ente. Para detecção, um anticorpo anti-flag de fosfatase alcalina conjugadocom (AP) (diluição de 1:5000 em TBST) e o substrato de AttoPhos fluorogê-nico (Roche) é usado. Após cada incubação, os poços das placas de microti-tulação são lavados cinco vezes com TBST, exceto após a etapa de incuba-ção final com o anticorpo secundário marcado quando os poços são lavadostrês vezes. A fluorescência é medida em uma leitora de placa TECAN aSpectrafluor.IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE IgG DE c-Met ANTI-HUMANO QUEMODULAM MIGRAÇÃO DEPENDENTE DE c-Met

Migração celular em resposta à estimulação com HGF é ensaia-da usando células de NCI-H441 no ensaio de migração celular de quimiota- xia de 8 μΜ de 96 poços de QCM™. Como descrito acima, 24 h antes doensaio, as células foram lavadas duas vezes com PBS estéril e privadas noDMEM contendo 1 % FBS a 37g C em uma atmosfera de 5 % CO2. Subse-qüentemente, as células são tripsinadas e re-suspensas a 1,0 χ 106 célulaspor ml na presença de concentração apropriada do anticorpo purificado por30 min a 379 C. Como um controle negativo por falta de modulação, umaamostra de um anticorpo não relacionado (tendo uma especificidade conhe-cida não relacionada aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tampão, éadicionada aos poços designados.

Sob condições estéreis a tampa da placa de câmara de migra- ção é removida e 150 μΙ de meios livres de soro contendo 50 ng/ml HGF- (R&D No de Cat. 294-HGN) são adicionados aos poços da bandeja alimen-tadora (câmara inferior). 100 μΙ de 5-10 χ 104 células em DMEM com 1 %FBS pré-incubado com anticorpo são adicionados suavemente à câmarasuperior. A placa é coberta e incubada durante 16 horas a 37e C entre 4-6 %de CO2. Seguindo as instruções dos fabricantes, as células/meios na câmarasuperior são descartados e a câmara colocada em uma Bandeja Alimentado-ra de 96 poços à qual 150 pL/poço de solução de separação de célula pré-aquecida foram adicionados. Células são desalojadas incubando durante 30minutos a 37e C com agitação suave periódica. Subseqüentemente, 50 μΙ de tintura de CyQuant GR pré-diluída são adicionados a cada poço da bandejaalimentadora. A placa é incubada durante 15 minutos em temperatura ambi-ente e 150 μΙ da mistura transferidos para uma placa de 96 poços nova ade-quada para medição de fluorescência usando um conjunto de filtro de480/520 nm.

Os dados que mostram a concentração eficaz para 50 % de ini-bição de migração estimulada por HGF para os clones de anticorpos tendo amaior afinidade para c-Met estão mostrados na Tabela 8 aqui. Os dadosmostram que concentrações eficazes de EC5O variam de 0,61 nM, com umvalor mediano entre 0,73 nM e 0,76 nM.

Tabela 8. ATIVIDADE INIBIDORA DE CANDIDATOS anti-c-Met OTIMIZA-

<table>table see original document page 168</column></row><table>

EXEMPLO 7: MODULAÇÃO DE HGF STIMULATED c-Met AUTOFOSFORI-LAÇÃO POR SELECIONADO ANTAGONÍSTICO ANTICORPOS DE ANTI-c-- Met

Agonismo ou antagonismo por anticorpos de anti-c-Met da in-venção é medido por ativação ou inibição de fosforilação de c-Met em célu-las com e sem estimulação com HGF. Células de uma linhagem celular taiscomo células de A549 são colocadas em placa a uma densidade de 3 X 104células por poço em um volume total de 100 μΙ/poço de DMEM suplementa-do com 10 % FBS em placas tratadas com cultura de tecido de fundo chatode 96 poços (Costar, #3595). As placas são incubadas a 37s C em uma at-mosfera de 5 % CO? durante 24 h após as quais o meio é aspirado suave-mente de cada poço das placas e um volume de 100 μΙ/poço de DMEM adi-cionado. As placas são incubadas a 375 C em uma atmosfera de 5 % CO2durante 24 h após as quais uma amostra de um anticorpo purificada é testa-da, 100 μΙ por poço do anticorpo ou uma diluição, são adicionados às célulasno poço diluído em DMEM. Como um controle negativo por falta de ativação,uma amostra de um anticorpo não relacionado (tendo uma especificidadeconhecida não relacionada aos determinantes de epítopo de c-Met), ou tam-pão, é adicionada aos poços designados.As células são incubadas a 37- C durante um período de tempocurto (por exemplo, 2 horas) ou um período de tempo mais longo (por exem-plo, 24 horas). Onde apropriado, as células são estimuladas pela adição deHGF em meios de DMEM livres de soro a uma concentração final de 200ng/poço. Em geral, quando ensaiar a atividade agonística dos anticorpos,com exceção do controle positivo (não tratado com anticorpo), HGF é omiti-do dos poços de anticorpo de amostra de teste. Em geral, quando ensaiar aatividade antagonística dos anticorpos, HGF é incluído nos poços de anti-corpo de amostra de teste. As placas são também incubadas por 10 min a37s C, depois o meio é aspirado suavemente dos poços das placas. As célu-las são lavadas com PBS frio contendo e a solução é aspirada suavementedas placas. As células são lisadas com 50 μl de tampão de lise (tampão delise NP-40: 120 mM de NaCI, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 % de NP-40, 1mM de EDTA, 6 mM de EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM de Benzamidina com0,5 mM de Na3VO4 recentemente adicionado, e 0,1 mM de PMSF). As pla-- cas são agitadas em temperatura ambiente durante 15 minutos, e são de-pois armazenados em -80g C até necessário para ELISA.

Um ELISA é usado para determinar os níveis de fosforilação dec-Met. Para preparação de placa ELISA, Placa de Nunc-lmuno™, Superfíciede MaxiSorb™ (VWR AG Internacional, N°391-8786) são lavadas duas ve-zes com tampão de lavagem (PBS-0,05 % Tween Biorad #670-6531), e 100μl de anticorpo monoclonal de captura de c-Met (DO-24) em PBS são adi-cionados. As placas são incubadas durante a noite a A- C três vezes lavadascom PBS-0,05 % Tween. Sítios de ligação não-específicos são bloqueadoscom 200 μl/poço de 3 % BSA em PBS-T durante 2 horas em temperaturaambiente, com agitação. Imediatamente antes do uso a solução de bloqueioé removida.

Lisados de célula congelados são fundidos agitando em tempe-ratura ambiente e 40 μl de lisado são adicionados às placas de Nunc-lmunoe as placas são incubadas a 4e C durante 4 horas. As placas são lavadastrês vezes com PBS-T, e 50 μl/poço de 0,2 μg/ml de anticorpo de anti-fosfotirosina PY20-HRP (ZYMED, #03-7722) em 3 % de albumina de sorobovino-PBS-T. As placas são incubadas durante a noite a 49 C. e três vezeslavadas com PBS-T. O PBS-T é aspirado e 90 μΙ / poço de substrato de fos-fatase alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS100RY) adicionados e desenvolvi-dos enquanto agitando suavemente por 45 min em temperatura ambiente.As placas são lidas usando uma leitora de placa de 96 poços.

Os dados que mostram a concentração eficaz para 50 % de ini-bição de migração estimulada por HGF para os clones de anticorpos tendo amaior afinidade para c-Met são mostrados na Tabela 9 aqui. Os dados mos-tram que concentrações eficazes de EC5O variam de 0,166 nM, com um valormediano entre 0,193 e 0,219 nM.

TABELA 9. ATIVIDADE INIBIDORA DE CANDIDATOS DE anti-c-Met OTI-MIZADOS NA FORMAÇÃO DE IgG EM AUTOFOSFORILAÇÃO DE RE-CEPTOR ESTIMULADO COM HGF

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EXEMPLO 8: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO E SEQÜÊNCIAS DE NU-CLEOTÍDEO DE GENES OTIMIZARAM PARA EXPRESSÃO

Para aumentar expressão mamífera, alterações são introduzidasnas cadeias pesadas e leves de Fabs aqui para otimização de uso de códonpara expressão em uma célula mamífera. É conhecido que vários motivos deação negativa eis diminuem a expressão em mamíferos. O processo de oti-mização aqui remove os sítios de ação negativa eis (tais como sítios de spli-ce ou sinais poly(A)) que negativamente influenciam a expressão. O proces-so de otimização aqui também enriquece o conteúdo de GC, para prolongara meia-vida do mRNA.

Regiões variáveis de cadeia leve e pesada são otimizadas u-sando um clone de um Fab e isolado através de seleção com exibição defago. Depois as seqüências de nucleotídeo que codificam cada uma das ca-deias leves e pesadas inteiras deste e outros clones são cada uma otimiza-das usando estes procedimentos.

PROCESSO DE OTIMIZAÇÃO PARA CADEIAS DE VH E VL

Para otimizar a seqüência de nucleotídeo e seqüência de ami-noácido de cada uma das cadeias de Vl e Vh1 o uso de códon é adaptado àimpulsão de códon de genes mamíferos, especialmente H. sapiens. Alémdisso, regiões de conteúdo de GC muito alto (> 80 %) ou muito baixo (< 30%) são reduzidas ou eliminadas onde possível.

Durante o processo de otimização, os motivos de seqüência deação eis a seguir são evitados: caixa TATA interna, chi-sítios e sítios de en-trada ribossômica, extensões de seqüência rica em AT ou rica em GC, ele-mentos de seqüência de motivo de instabilidade do RNA (ARE), elementosinibidores de seqüência de RNA (INS), elementos de seqüência responsivo acAMP (CRS), seqüências repetidas e estruturas secundárias de RNA, sítios- doadores e aceitantes de splice incluindo sítios secretos, e pontos de ramifi-cação. Exceto como indicado, a introdução de sítios de Mlul e Hindlll é evi-tada no processo de otimizar a seqüência de nucleotídeo da cadeia de Vl.Exceto como indicado, a introdução de sítios de Mlyl e BstEII é evitada noprocesso de otimizar a seqüência de nucleotídeo da cadeia de VH.

SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE CADEIAS Vh E Vl OTIMIZADAS PA-RA EXPRESSÃO

Uso de códon é adaptado aos dos Mamíferos descritos parapermitir taxas de expressão mais altas e mais estáveis em uma célula mamí-fera para as seqüências de aminoácido otimizadas resultando nas cadeiasde Vh e Vl do clone acima.

Histogramas podem ser usados para mostrar as porcentagensde códons de seqüência para cada uma das seqüências parentais e genesotimizados respectivamente, e analisa a classe de qualidade das seqüênciasde nucleotídeo respeitáveis que codificam as cadeias de Vh e VL. Valor dequalidade como aqui usado significa que o códon mais freqüente usado paraum aminoácido dado no sistema de expressão desejado é fixo como 100, eos códons restantes são escalados de acordo com a freqüência de uso.(Sharp, P. M., Li, W. H., NucIeicAcids Res. 15 (3), 1987).

Também, o índice de adaptação de códon (CAI) é um númeroque descreve quão bem os códons da seqüência de nucleotídeo equiparamcom a preferência de uso de códon do organismo alvo. O valor máximo deCAI é ajustado para 1,0, desse modo um CAI de > 0,9 é considerado comopermitindo expressão alta. O CAI para a cadeia de Vl antes da otimização éobservado ser 0,73, e após otimização, o CAI é determinado ser 0,95. Simi-larmente, o CAI para a cadeia de Vh antes da otimização é observado ser0,74, e após otimização, é determinado ser 0,98.

O conteúdo de GC na cadeia de Vl da seqüência de origem éaumentado para a seqüência otimizada.

OTIMIZAÇÃO PARA EXPRESSÃO DE CADEIAS LEVES E CADEIAS PE-SADAS DE COMPRIMENTO TOTAL

O processo de otimização é aplicado a cada uma das seqüên-cias de nucleotídeo de comprimento total de origem das cadeias leve e asseqüências de nucleotídeo de comprimento total de origem das cadeias pe-sadas.

O processo de otimização é usado para a construção das se-qüências de nucleotídeo de cadeia leve associadas aos números de clonede origem. Também, o processo de otimização é usado para a construçãodas seqüências de nucleotídeo de cadeia pesada associadas aos númerosde clone de origem.TABELA Ε. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS DA INVENÇÃO

<table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table><table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 184</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table><table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table><table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table><table>table see original document page 194</column></row><table><table>table see original document page 195</column></row><table><table>table see original document page 196</column></row><table><table>table see original document page 197</column></row><table><table>table see original document page 198</column></row><table><table>table see original document page 199</column></row><table><table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table><table>table see original document page 202</column></row><table><table>table see original document page 203</column></row><table><table>table see original document page 204</column></row><table><table>table see original document page 205</column></row><table><table>table see original document page 206</column></row><table><table>table see original document page 207</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Novartis AG

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO PARA ANTICORPOS DE C-Met<130> ON/4-34782A<150> US 60/787556<151> 2006-03-30<160> 96

<170> PatentIn version 3.3<210> 1

<211> 327<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 1

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccaggcttat gattcttcta tgcttcgtgtgtttggcggc 300ggcacgaagt taaccgttct tggccag 327

<210> 2<211> 330<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 2

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gctaattatc atgattcttgggtgtttggc 3 00

ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330

<210> 3

<211> 330<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 3

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gcttctgatt atacttcttgggtgtttggc 3 00ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330

<210> 4<211> 330<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 4

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gctcattatc atgatatttgggtgtttggc 3 00

ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330

10 <210> 5

<211> 327<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5

15 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-20 acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccaggctcat gattctcttt attctcgtgtgtttggcggc 3 0025 ggcacgaagt taaccgttct tggccag 327

<210> 6<211> 342<212> DNA<213> Homo sapiens30 <400> 6

gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattttctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatta taat-catcct 300

catacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342

<210> 7<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 7

gatatcgtgà tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60

attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattttctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatgcttttggttgg 300

acctttggcc agggtacgaa agttgaaatt aaacgtacg 339

<210> 8<211> 342<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 8

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc ttcagtattc tgat-gagcct 300

tggacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342

<210> 9

<211> 342<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 9

gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60

attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattttctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatgc ttat-gagcct 300

aatacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342

<210> 10<211> 342<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 10

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc ttcagtatgctttttctcct 300

tggacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cg 342

<210> 11<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 11

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgataatat tggttcttat tatgtttatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gattttcctt ctattgtgtttggcggcggc 300acgaagttaa ccgttcttgg ccag 324

<210> 12<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 12

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60tcgtgtagcg gcgataatat tggttcttat tatgtttatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gattcttata tttttgtgtttggcggcggc 300

acgaagttaa ccgttcttgg ccag 324

<210> 13<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 13

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtçagac_cgcgcg-—tatc 60

tcgtgtagcg gcgataatat tggttcttat tatgtttatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ctctacttat gatgctttta cttttgtgtttggcggcggc 300

acgaagttaa ccgttcttgg ccag 324

<210> 14<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 14

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gataagtatg tttttgtgtttggcggcggc 300

acgaagttaa ccgttcttgg ccag 324

<210> 15<211> 330<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 15

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctct tcgttcttat tttgtttctt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat gatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg cgcttcttgg gatactcttt ctgatgttgaggtgtttggc 3 00ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330

<210> 16<211> 330<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 16

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60tcgtgtagcg gcgattctct tcgttcttat tttgtttctt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat gatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg cgcttcttgg gatcctcctt ctgcttttgaggtgtttggc 300

ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330

<210> 17<211> 327<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 17

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctct tcgttcttat tttgtttctt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat gatgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg cgcttcttgg gataatgatc attttgaggtgtttggcggc 300ggcacgaagt taaccgttct tggccag 327

<210> 18<211> 327<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 18

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60tcgtgtagcg gcgataagct tggttcttat tttgtttatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat gataatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtctttt ggtatttcta atttttatgtgtttggcggc 300

ggcacgaagt taaccgttct tggccag 327

<210> 19<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 19

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgataagct tggttcttat tttgtttatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat gataatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg cggttcttgg gcttatcttg gtgatgtgtttggcggcggc 3 00 acgaagttaa ccgttcttgg ccag 324

<210> 20<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens <400> 20

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaa-aatt 60agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattatggta ttgcttgggt gcgcca-gatg 120

cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atctatccgt ctgatagcta tacca-attat 180

tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattagcaccgcgtat 240

cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcg-tatgtct 300

tatgattatc agcatcaggc tccttctatg gattcttggg gccaaggcac cctggt-gacg 3 60

gttagctca 369

<210> 21<211> 363<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 21

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata tgaattgggt ccgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt atcaatccgt ggactggcaa tacga-attac 180

gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattagcaccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgt-gatcct 300

ggtttttttt attatactcc ttctgatctt tggggccaag gcaccctggt gacggt-tagc 3 60

tca 363

<210> 22<211> 363<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 22

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata tgaattgggt ccgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt attgatcctt ggaatggtca gacta-attat 180

gctcagaagt ttcagggtcg ggtcaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgt-gatcct 300

ggtttttttt attatactcc ttctgatctt tggggccaag gcaccctggt gacggt-tagc 3 60

tca 363

<210> 23<211> 363<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 23

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata tgaattgggt ccgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcgtt attgatcctt ggaatggtat tacta-attat 180

gctcagaagt ttcagggtcg ggtcaccatg acccgtgata ccagcattagcaccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgt- gatcct 300

ggtttttttt attatactcc ttctgatctt tggggccaag gcaccctggt gacggt-tagc 360tca 363

<210> 24<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 24

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgccaagcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcgatccgt ttggcactgc gaattacgcg 180

cagaagtttc agggccgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgtatatg 240

gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtttatcag 300

gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctca 339

<210> 25<211> 339<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 25

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt attgatccta ttatgggtac tgag-tatgct 180

cagaagtttc agggtcgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgta-tatg 240

gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtt-tatcag 3 00gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctca 339

<210> 26<211> 342<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 26

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcgag attgatcctg ttattggtga gact-gattat 180

gctcagaagt ttcagggtcg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccagcaccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgcgcgtgtttat 300

caggatgttt ggggccaagg caccctggtg acggttagct ca 342

<210> 27<211> 363<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 27

caggtgcaat tgcaagaaag tggtccgggc ctggtgaaac cgggcgaaac cct-gagcctg 60

acctgcaccg tttccggagg tagcatttct tcttcttctt attattggaa ttg-gattcgc 120

caggcccctg ggaagggtct cgagtggatt ggcgagatct attttggctg gacc-tattat 180

aatccgagcc tgaaaggccg ggtgaccatt agcgttgata cttcgaaaaa ccagtt-tagc 240

ctgaaactga gcagcgtgac ggcggaagat acggccgtgt attattgcgcgcgtggttat 300gagtttcatg gttatactac ttttgattat tggggccaag gcaccctggt gacggt-tagc 360

tca 363

<210> 28<211> 348<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 28

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaa-aatt 60

agctgcaaag gttccggata ttccttttct aattattgga ttggttgggt gcgcca-gatg 120

cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcttt atctttccgg atactagctatacccgttat 180

tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattagcaccgcgtat 240

cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtgt-taag 300

cttattactg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca348

<210> 29<211> 375<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 29

caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cct-gagcctg 60

acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttg-gattcgc 120

cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag ca-agtgggtt 180

aacgattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaa-aaac 240

cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgtattattgcgcg 3 00

cgtcagggtg ctgtttatcc tggtccttat ggttttgatg tttggggcca agg-caccctg 360

gtgacggtta gctca 375

<210> 30<211> 336<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 30

gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgac-catc 60

tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgatttggta ccag-cagttg 120

cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat gatgatacta atcgtccctcaggcgtgccg 180

gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattacgggcctgcaa 240

agcgaagacg aagcggatta ttattgctct acttatgata attatcaggctggttgggtg 3 00

tttggcggcg gcacgaagtt aaccgttctt ggccag 336

<210> 31<211> 109<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 31

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Asp Ser Ser Met LeuArg

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 32<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) . . (110)<223> Idêntica à SEQ ID NO:51<400> 32

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His AspSer

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 33<211> 110<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 33

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Ser Asp Tyr ThrSer

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110

<210> 34<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(110)<223> Idêntica à SEQ ID NO:52<400> 34

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His AspIle

85 90 95Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 35<211> 109<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 35

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala His Asp Ser Leu Tyr SerArg

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 36<211> 114<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 36Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Tyr Asn His Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

<210> 37<211> 113<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 37

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Ala Phe Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysArg

100 105 110

Thr

<210> 38<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 38

25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu GlnTyr

85 90 95

Ser Asp Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

<210> 39<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) .. (114)<223> Idêntica à SEQ ID NO:53<400> 39

25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

Q35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Ala Tyr Glu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

15

<210> 40<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens20 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(114)<223> Idêntica à SEQ ID NO:54<400> 40

25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

15 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

30 20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

ΪΛ35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu GlnTyr

85 90 95

Ala Phe Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

<210> 41<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 41

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val

25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60232

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Ser Ile Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 42<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 42

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr TyrVal

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Tyr Ile Phe30 Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 43<211> 108<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 43

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr TyrVal

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Ala Phe Thr PheVal

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 44<211> 108<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 44

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr TyrVal

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Tyr Val PheVal

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 45<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 45

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr PheVal

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr35 40 45

Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ser AspVal

85 90 95

Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 46<211> 110<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 46

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr PheVal

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Pro Pro Ser AlaPhe

85 90 95

Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105 110

<210> 47<211> 109<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 47

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr PheVal

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asn Asp His PheGlu

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 48<211> 109<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 48

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Tyr PheVal

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Gly Ile Ser Asn Phe Tyr

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Tyr PheVal

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Ala Tyr Leu Gly AspVal

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105

<210> 50<211> 112<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 50

Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly SerAsn

20 25 30

Tyr Val Ile Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys LeuLeu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg PheSer50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly LeuGln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Asn TyrGln

85 90 95

Ala Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyGln

100 105 110

<210> 51<211> 110<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(110)<223> Idêntica à SEQ ID NO:32<400> 51

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His AspSer

5 85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 52<211> 110<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(110)<223> Idêntica à SEQ ID NO:34<400> 52

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

20 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His AspHe

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln100 105 110

<210> 53<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(114)<223> Idêntica à SEQ ID NO:39<400> 53

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Ala Tyr Glu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

<210> 54<211> 114<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(114)<223> Idêntica à SEQ ID NO:40<400> 54

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu GlnTyr

85 90 95

Ala Phe Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr

<210> 55<211> 121<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(121)

<223> Idêntica à SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 56<211> 121<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(121)

<223> Idêntica à SEQ ID NO:69 e SEQ ID NO:70<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 57<211> 121<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Trp Asn Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210> 58

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) . . (113)

<223> Idêntica à SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:68<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser<210> 59<211> 113<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(113)

<223> Idêntica à SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:72<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser<210> 60<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Val Ile Gly Glu Thr Asp Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val ThrVal

100 105 110

Ser Ser

<210> 61<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro GlyGlu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser SerSer

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly LeuGlu

35 40 45

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Phe Gly Trp Thr Tyr Tyr Asn Pro SerLeu

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln PheSer

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Glu Phe His Gly Tyr Thr Thr Phe Asp Tyr TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 62<211> 116<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyGlu

1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser AsnTyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Phe Ile Phe Pro Asp Thr Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro SerPhe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Val Lys Leu Ile Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr LeuVal

100 105 110

Thr Val Ser Ser115

<210> 63<211> 125<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro SerGln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser SerAsn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly LeuGlu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Val Asn Asp TyrAla

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser LysAsn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr AlaVal

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Ala Val Tyr Pro Gly Pro Tyr GlyPhe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125

<210> 64<211> 123<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyGlu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr AsnTyr

20 25 30

Gly Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro SerPhe50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Met Ser Tyr Asp Tyr Gln His Gln Ala Pro Ser Met AspSer

100 105 HO

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65<211> 121 <212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(121) <223> Idêntica à SEQ ID NO:55 e SEQ ID NO:66<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

10 15

25 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66<211> 121<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) . . (121)<223> Idêntica à SEQ ID NO:55 e SEQ ID NO: 65<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67<211> 113<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(113)<223> Idêntica à SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO: 68<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGln50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 HO

Ser

<210> 68<211> 113<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) . . (113) <223> Idêntica à SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:67<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

30 35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGln50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser

<210> 69<211> 121<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) .. (121)<223> Idêntica à SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:70<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70<211> 121<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1)..(121)<223> Idêntica à SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO: 69<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 71<211> 113<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) .. (113)<223> Idêntica à SEQ ID NO:59 e SEQ ID NO:72<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys PheGln50 55 60

Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

5 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser

<210> 72<211> 113<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA<222> (1) . . (113) <223> Idêntica à SEQ ID NO:59 e SEQ ID NO: 71<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

30 35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys PheGln50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser

<210> 73<211> 642<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 73

gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcg-tatc 60

tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaa-acccggg 120

caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccgga-acgc 180

tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcactcaggcggaa 240

gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gctcattatc atgatatttgggtgtttggc 3 00

ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggtcactctgttc 360

ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cata-agtgac 420

ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt ca-aggcggga 480

gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagc-tatctg 540

agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacg- catgaa 600

gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642

<210> 74<211> 660<212> DNA <213> Homo sapiens<400> 74

gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60

attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattt tctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatgc ttat-gagcct 300

aatacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cggtggctgc ac-catctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataacgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac cta-cagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtctacgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg a-gagtgttag 660<210> 75<211> 660<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 75

gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60

attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattttctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc ttcagtattc tgat-gagcct 300

tggacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cggtggctgc ac-catctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgttgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataacgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac cta-cagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtctacgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg a-gagtgttag 660<210> 76<211> 657<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 76

gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgc-gacc 60

attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattttctgggttgg 120

taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttctactcgtgaa 180

agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgac-catt 240

tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatgcttttggttgg 300

acctttggcc agggtacgaa agttgaaatt aaacgtacgg tggctgcaccatctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgtgtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctcca-atcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcct-cagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcga-agtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagãgcttca acaggggaga gtgttag657

<210> 77<211> 214<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 77

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVaI

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His AspIle

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln ProLys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu LeuGln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr ProGly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys AlaGly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr AlaAla

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His ArgSer

180 185 190Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys ThrVal

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210<210> 78<211> 214<212> PRT<213> Homo sapiens <400> 78

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His AspSer

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu LeuGln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr ProGly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys AlaGly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr AlaAla

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His ArgSer

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys ThrVal

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser210

<210> 79<211> 214<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 79

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His AspSer

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln ProLys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu LeuGln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr ProGly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys AlaGly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His ArgSer

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys ThrVal

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser210<210> 80<211> 214<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 80

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro GlyGln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys TyrVal

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IleTyr

35 40 45

Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser GlySer

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln AlaGlu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His AspIle

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly. Gln ProLys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu LeuGln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr ProGly130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys AlaGly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr AlaAla

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His ArgSer

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys ThrVal

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210<210> 81<211> 219<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 81

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Ala Tyr Glu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser AspGlu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn AsnPhe

130 135 140 .

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala LeuGln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp TyrGlu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu SerSer

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215

<210> 82

<211> 219<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 82

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu GlnTyr

85 90 95

Ser Asp Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser AspGlu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn AsnPhe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala LeuGln

145 150 155 160Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys AspSer

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp TyrGlu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu SerSer

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215

<210> 83<211> 218<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 83

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr

85 90 95

Ala Phe Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysArg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp GluGln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn PheTyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu GlnSer

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp SerThr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GluLys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser SerPro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 84<211> 219<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 84

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser LeuGly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu TyrGly

20 25 30

Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnPro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr- Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu GlnTyr

85 90 95

Ala Phe Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IleLys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser AspGlu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn AsnPhe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala LeuGln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys AspSer

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp TyrGlu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu SerSer

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 85<211> 1347<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 85

caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggata tacctttact ggttattata tgaattgggt ccgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt atcaatccgt ggactggcaa tacga-attac 180

gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattagcaccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgt-gatcct 300

ggtttttttt attatactcc ttctgatctt tggggccaag gcaccctggt gacggt-tagc 3 60

tcagcttcca ccaagggacc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gag-cacctcc 420

gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggt-gacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt ccta-cagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcac-gaag 600acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa ga-gagttgag 660

tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc ccagcacctg agttcctggg gggac-catca 720

gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccct-gaggtc 780

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctgg-tacgtg 840

gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacag-cacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caag-gagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaa-agcc 1020

aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagat-gacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcgacatcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtgg-caggag 1260

gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacaca-gaag 1320

agcctctccc tgtctctggg taaatga 1347

<210> 86<211> 1323<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 86

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaa-agtg 60agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt attgatccta ttatgggtac tgag-tatgct 180

cagaagtttc agggtcgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgta-tatg 240

gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtt-tatcag 300

gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggac-catcc 360

gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgc- cctgggctgc 420

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccct-gacc 480

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcag-cagc 540

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgta-gatcac 600

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cc-catgccca 660

tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaa-accc 720

aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgt-gagc 780

caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcata-atgcc 840

aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcct-cacc 900

gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaa-aggc 960

ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagc-cacag 1020gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cct-gacctgc 1080

ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tggg-cagccg 1140

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctccttcttcctctac 1200

agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctcatgctccgtg 1260

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctggg- taaa 1320

tga 1323

- <210> 87<211> 1323<212> DNA <213> Homo sapiens<400> 87

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcgatccgt ttggcactgc gaat-tacgcg 180

cagaagtttc agggccgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgta-tatg 240

gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtt-tatcag 300

gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggac-catcc 360

gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc 420

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccct-gacc 480agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcag-cagc 540

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgta-gatcac 600

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cc-catgccca 660

tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaa-accc 720

aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgt-gagc 780

caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcata-- atgcc 840

aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcct-cacc 900

gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaa-aggc 9 60

ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagc-cacag 1020

gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cct-gacctgc 1080

ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tggg-cagccg 1140

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctccttcttcctctac 1200

agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctcatgctccgtg 1260

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctggg-taaa 1320

tga 1323

<210> 88

<211> 1323<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 88

caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaa-agtg 60

agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgcca-agcc 120

cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcgatccgt ttggcactgc gaat-tacgcg 180

cagaagtttc agggccgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgta-tatg 240

gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtt-tatcag 300

gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggac-catcc 360

gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgccctgggctgc 420

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccct-gacc 480

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcag-cagc 540

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgta-gatcac 600

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cc-catgccca 660

tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaa-accc 720

aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgt-gagc 780

caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcata-atgcc 840

aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcct-cacc 900gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaa-aggc 960

ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagc-cacag 1020

gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cct-gacctgc 1080

ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tggg-cagccg 1140

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1200

agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctcatgctccgtg 1260

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctggg-taaa 1320

tga 1323

<210> 89<211> 448<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 89

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly ProSer

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser ThrAla

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val ThrVal

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe ProAla

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val ThrVal

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val AspHis

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys TyrGly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly ProSer225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu15 Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu LysThr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrLeu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrCys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluSer

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuAsp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

Val Phe LeuArg

245

Thr Pro GluPro

260

Glu Val GlnAla275

Lys Thr LysVal

290

Ser Val LeuSer

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluAla

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu GlyLys

435 440 445

<210> 90 <211> 440<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro CysSer

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

145 150 155 160

- Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly ThrLys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProAla

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysPro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValVal

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp TyrVal

260 265 270Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluGln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnPro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu MetThr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProSer

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn AsnTyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn ValPhe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnLys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440<210> 91<211> 440<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

. Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro CysSer

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp

130 135 140Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly ThrLys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProAla

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysPro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValVal

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp TyrVal

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluGln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGly305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnPro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu MetThr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProSer

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn. Tyr

370 375 380

" Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn ValPhe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnLys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440

<210> 92<211> 440<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro CysSer

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly ThrLys180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProAla

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysPro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValVal

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp TyrVal

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluGln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnPro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu MetThr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProSer

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn AsnTyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn ValPhe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnLys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440

<210> 93<211> 448<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly ProSer

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser ThrAla

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val ThrVal

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe ProAla

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val ThrVal

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val AspHis

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys TyrGly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly ProSer

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerArg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu AspPro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg ValVal

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluTyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu LysThr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrLeu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluSer

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuAsp

385 390 395 400Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp LysSer

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluAla

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu GlyLys

435 440 445

<210> 94<211> 448<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

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85 90 95Ala Arg Asp Pro Giy Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

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115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser ThrAla

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val ThrVal

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe ProAla

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val ThrVal

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys TyrGly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly ProSer

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerArg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu AspPro260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnAla

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg ValVal

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluTyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu LysThr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrLeu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrCys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluSer

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuAsp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp LysSer

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluAla

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu GlyLys

435 440 445

<210> 95<211> 448<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlyAla

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlyTyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln LysPhe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu TrpGly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly ProSer

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser ThrAla

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val ThrVal

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe ProAla

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val AspHis

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys TyrGly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly ProSer

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerArg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnAla

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg ValVal

290 295 300Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluTyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu LysThr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrLeu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrCys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluSer

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuAsp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp LysSer

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluAla

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu GlyLys

435 440 445

<210> 96<211> 440<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 96Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro GlySer

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser SerTyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu TrpMet

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys PheGln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrMet

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysAla

85 90 95

Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro CysSer

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly ThrLys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProAla

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysPro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp TyrVal

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluGln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnPro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu MetThr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProSer

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn AsnTyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn ValPhe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnLys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440

Claims

1. Anticorpo humano ou humanizado isolado ou fragmento fun-cional do mesmo compreendendo uma região de ligação de antígeno que éespecífica para proteína alvo c-Met, em que o anticorpo ou fragmento fun-cional do mesmo liga a c-Met.

2. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo ligaà proteína alvo c-Met com uma K0 de 2,0 χ 10"5 M ou menos, 2,0 χ 10"6 M oumenos, 2,0 χ 10"7 M ou menos, 2,0 χ 10"8 M ou menos, e 2,0 χ 10"9 M ou menos.

3. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmotem uma taxa fora (Kfora) para proteína alvo c-Met de 1,0 χ 10"2 por seg me-nor ou 1,0 χ 10"3 por seg ou menor 1 χ 10"4 por seg ou menor ou 1,0 χ 10"5por seg ou menor.

4. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo ligaà proteína alvo c-Met com uma K0 de 2,0 χ 10"5 M ou menos, 2,0 χ 10'6 M oumenos, 2,0 χ 10"7 M ou menos, 2,0 χ 10"8 M ou menos, e 2,0 χ 10'9 M ou me-nos, e inibe HGF que liga c-Met.

5. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo ligaà proteína alvo c-Met e modula fosforilação de c-Met.

6. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 5, em que a ativação da fosforilação de c-Met estimula pelomenos uma de uma atividade selecionada do grupo de regeneração de ór-gão, cura de ferida, e regeneração de tecido.

7. Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo coma reivindicação 6, em que o órgão é selecionado do grupo de rim, fígado,pâncreas, coração, pulmão, intestino, pele, timo, e tiróide.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que ligaçãodo anticorpo a c-Met é determinada por pelo menos um ensaio selecionadode uma quantidade de antagonismo ou agonismo de: indução de ligando deuma enzima de atividade da via de transdução de sinal de c-Met; indução deligando de uma expressão do gene da via de transdução de sinal de c-Met;ligação com base em eletroquimiluminescência de um ligando a c-Met; en-saio imunoabsorvente ligado à enzima de ligação de um ligando a c-Met; eproliferação, sobrevivência, migração ou metástase de uma célula.

9. Região de ligação de antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 1.

10. Seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo dasSEQ ID NOs: 1-30, 73-76, e 85-88.

11. Seqüência de aminoácido isolada codificada por uma se-qüência de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, e variantes con-servadoras da seqüência de aminoácido.

12. Seqüência de nucleotídeo isolada de acordo com a reivindi-cação 10, em que cada uma das SEQ ID NOs: 1-20 codifica uma cadeia levede ligação de antígeno.

13. Seqüência de nucleotídeo isolada de acordo com a reivindi-cação 10, em que cada uma das SEQ ID NOs: 21-30 codifica uma cadeiapesada de ligação de antígeno.

14. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada dogrupo das SEQ ID NOs: 1-20.

15. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia pesada codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada dogrupo das SEQ ID NOs: 21 -30.

16. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada dogrupo das SEQ ID NOs: 1-20, e uma cadeia pesada codificada por uma se-qüência de nucleotídeo selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 21-30.

17. Seqüência de aminoácido isolada selecionada do grupo dasSEQ ID NOs: 31-72, 77-84, e 89-96 e variantes conservadoras das mesmas.

18. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 17, em que cada uma das SEQ ID NOs: 31-54 compreende uma ca-deia leve de ligação de antígeno.

19. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 17, em que cada uma das SEQ ID NOs: 55-72 compreende uma ca-deia pesada de ligação de antígeno.

20. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo dasSEQ ID NOs: 31-54.

21. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupodas SEQ ID NOs: 55-72.

22. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo dasSEQ ID NOs: 31-54 e variantes conservadoras das mesmas, e uma cadeia pesada codificada por uma seqüência de aminoácido selecionada do grupodas SEQ ID NOs: 55-72 e variantes conservadoras das mesmas.

23. Seqüência de aminoácido isolada tendo pelo menos 50, 60,-70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade com as SEQ ID NOs: 31-72, 77--84, e 89-96.

24. Seqüência de nucleotídeo isolada tendo pelo menos 60, 70,-80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade com uma seqüência descrita nasSEQ ID NOs: 1-30, 73-76, e 85-88.

25. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve de Ig Iambda codificada por uma seqüência de nucleotídeo sele-cionada do grupo da SEQ ID NO: 73.

26. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve de Ig capa codificada por uma seqüência de nucleotídeo sele-cionada do grupo das SEQ ID NOs: 74-76.

27. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve de Ig Iambda como mostrada em uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo da SEQ ID NO: 77-80,

28. Região de ligação de antígeno isolada compreendendo umacadeia leve de Ig capa como mostrada em uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo das SEQ ID NOs: 81-84.

29. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 que éuma IgG.

30. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 29 que éuma lgG1, um lgG2, um lgG3 ou um lgG4.

31. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 30, em quea lgG4 é codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupodas SEQ ID NOs: 85-88.

32. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 31, em quea lgG4 é codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 60,- 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade com uma seqüência seleciona-da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 85-88.

33. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 30, em quea lgG4 como mostrada em uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste nas SEQ ID NOs: 89-96 e variantes conservadoras dasmesmas.

34. Anticorpo humano ou humanizado isolado ou fragmento fun-cional do mesmo, compreendendo uma região de ligação de antígeno que éespecífica para um epítopo de c-Met, em que o anticorpo ou fragmento fun-cional liga a receptores de superfície de c-Met em uma célula, e impede oumelhora desenvolvimento ou metástase de um câncer ou impede ou melhorauma condição inflamatória.

35. Anticorpo isolado ou fragmento funcional de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-34 que é um fragmento de anticorpo deFab ou scFv.

36. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 35 que éuma IgG.

37. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 36 que éuma IgGI, uma lgG2, uma lgG3 ou uma lgG4.

38. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 37, em quea lgG4 é codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 85-88.

39. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 38, em quea lgG4 é codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 60,-70, 80, 90, 95 ou 99 por cento de identidade com uma seqüência seleciona-da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 85-88.

40. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 37, em quea lgG4 compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 89-96 e variantes conservadoras das mesmas.

41. Anticorpo isolado ou fragmento funcional de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-34, que é um fragmento de Fab ou frag-mento de anticorpo de scFv ou um nanocorpo de camelídeo.

42. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1-41, em que o epítopo é um epí-topo conformacional.

43. Epítopo de acordo com a reivindicação 42, em que o epítopocompreende resíduos de uma seqüência de aminoácido de um domínio ex-tracelular de c-Met.

44. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos umanticorpo ou fragmento funcional de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1-42 e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente deste.

45. Animal transgênico portando um gene que codifica um anti-corpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-42.

46. Método para tratar um distúrbio ou condição relacionada a c-Met, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmouma quantidade eficaz da composição farmacêutica de acordo com a reivin-dicação 44.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o distúr-bio ou condição é um câncer ou condição inflamatória.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o cânceré selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro, câncer de estô-mago, câncer genital, câncer urinário, câncer de próstata, câncer de bexiga(superficial e invasivo muscular), câncer de mama, câncer cervical, câncerde cólon, câncer colorretal, glioma (incluindo glioblastoma, astrocitoma ana-plástico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), câncer esofagiano, câncergástrico, câncer gastrintestinal, câncer de fígado, carcinoma hepatocelular(HCC) incluindo HCC de infância, câncer de cabeça e pescoço (incluindocarcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma nasofarin-geano), carcinoma de célula de Hurthle, câncer epitelial, câncer de pele, me-lanoma incluindo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma incluin-do mieloma múltiplo, leucemias, câncer de pulmão incluindo câncer de pul-mão de célula não-pequena (incluindo todos os subtipos histológicos: ade-nocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma broncoalveolar,carcinoma de célula grande, e tipo adenoescamoso misturado), câncer depulmão de célula pequena, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer depróstata, câncer de rim, câncer de célula renal incluindo câncer de célularenal papilar hereditário e esporádico, Tipo I e Tipo II, e câncer de célula re-nal de célula clara; sarcomas, em particular osteossarcoma, sarcomas decélula clara, e sarcomas de tecido macio (incluindo rabdomiossarcomas al-veolares e embrionários, sarcomas alveolares de parte macia); carcinoma detiróide (papilares e outros subtipos).

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o cânceré selecionado do grupo de cânceres que consistem em fígado e esofagiano.

50. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o métodoadicionalmente compreende administrar um agente quimioterapêutico.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o agentequimioterapêutico é um agente anticâncer.

52. Método para tratar uma célula indesejada compreendendocontatar a célula com um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo deacordo com qualquer uma das reivindicações 1-42.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que a célulaporta c-Met.

54. Método de acordo com a reivindicação 52 ou 53, adicional-mente compreendendo tratar a célula com um agente quimioterapêutico ouradiação.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-54, em que seguindo a administração ou contato, o método adicionalmentecompreende observar a melhora ou retardamento do desenvolvimento oumetástase do câncer.

56. Método para identificar uma célula compreendendo c-Met, ométodo compreendendo contatar a célula com um anticorpo ou fragmento deanticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-42, em que oanticorpo ou fragmento adicionalmente compreende uma marcação detectável.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que a marca-ção é radioativa, fluorescente, magnética, paramagnética, ou quimiolumines-cente.

58. Método de acordo com a reivindicação 56, adicionalmentecompreendendo uma etapa de imagear ou separar a célula.

59. Anticorpo humano ou humanizado ou fragmento de anticorpode acordo com qualquer uma das reivindicações 1-42, em que o anticorpo éum anticorpo sintético.

60. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 44,adicionalmente compreendendo um agente terapêutico adicional.

61. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 60,em que o agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consisteem um agente anticâncer; um antibiótico; um agente antiinflamatório; umfator de crescimento; e uma citocina.

62. Anticorpo isolado compreendendo uma primeira seqüênciade aminoácido que é uma cadeia pesada selecionada do grupo que consistenas SEQ ID NOs: 55-72, e seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95ou 99 por cento de identidade de seqüência com uma seqüência seleciona-da do grupo das SEQ ID NOs: 55-72; e uma segunda seqüência de aminoá-cido que é uma cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ IDNOs: 31-54, e seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cen-to de identidade de seqüência com uma seqüência selecionada do grupodas SEQ ID NOs: 31-54.

63. Imunoconjugado compreendendo um primeiro componenteque é um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-42.

64. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 63, compre-endendo um segundo componente tendo uma segunda seqüência de ami-noácido.

65. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 64, adicio-nalmente compreendendo uma citotoxina.

66. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 64, em quea segunda seqüência é uma proteína Iigadora ou anticorpo tendo uma espe-cificidade de ligação para um alvo que é diferente de c-Met.

67. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 64.

68. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 67, emque o alvo da especificidade de ligação diferente de c-Met é um antígeno detumor ou proteína associada ao tumor em uma superfície de uma célula decâncer.

69. Kit compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo deacordo com qualquer uma das reivindicações 1-42.

70. Kit de acordo com a reivindicação 69, adicionalmente com-preendendo um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente deste.

71. Kit de acordo com a reivindicação 69, em que o anticorpoestá presente em uma dose de unidade e adicionalmente compreendendoinstruções para o uso na administração a um sujeito.