BRPI0709922A2 - composiÇço farmacÊutica contendo a proteÍna nmb0606 - Google Patents
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Abstract
<B>COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA CONTENDO A PROTEÍNA NMBO6O6<D>A presente invenção refere-se ao campo da medicina, particularmente ao desenvolvimento de formulação farmacêutica contendo proteína NMBO6O6. A formulação descrita na presente invenção é capaz de conferir proteção contra doenças diferentes causadas ou não por agentes patogêni- cos. A proteína NM80606 foi identificada como componente de vesícula da membrana externa (OMV) de Neisseria meningitidis, e ela foi obtida através de tecnologia de DNA recombinante sendo sua imunogenicidade e atividadeprotetora avaliadas em modelos animais. Devido ao alto nível de conservação que o gene codificando NMBO6O6 mostrou, composição farmacêutica -contendo esta proteína tem um alto valor como indutores de uma resposta imune reativa-cruzada. Formulação apresentada na presente invenção é aplicável ao campo da medicina humana
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO A PROTEÍNA NMB0606".
Campo Técnico
A presente invenção refere-se ao campo da medicina, particu-larmente ao desenvolvimento de nova formulação de vacina de aplicaçãopreventiva ou terapêutica, que permite um aumento na qualidade de respos-ta imune contra antígenos de vacina de doenças de fontes diferentes.
Estado Anterior da Técnica
Neisseria meningitidis, um diplococo Gram-negativo cujo únicohospedeiro conhecido é o homem, é o agente causai de meningite meningo-cócica. Geralmente, esta bactéria é encontrada em veículos assintomáticosdentre a população normal, sendo este nicho a fonte mais comum para seuisolamento microbiano.
Em uma base mundial, crianças pequenas menores de dois a-nos de idade são a população mais suscetível a contrair meningite meningo-cócica, no entanto, adultos jovens e população adulta normal podem sertambém afetados.
Doença meningocócica não-tratada tem um curso fatal para amaioria dos indivíduos afetados, e vacinação poderia prevenir esta situação,ao parar os eventos no início da fase de colonização bacteriana.
Várias estratégias foram desenvolvidas com o objetivo de obten-ção de uma vacina capaz de satisfazer às necessidades a fim de induzir pro-teção contra esta doença em população geral. Para este propósito, antíge-nos capsulares foram levados em consideração, uma vez que sua especifi-cidade imunológica permitiu a classificação em sorogrupos deste microorga-nismo. Cinco desses sorogrupos foram definidos como responsáveis pelamaioria dos casos clínicos de doença meningocócica em todo o mundo. Osorogrupo A é a principal causa de epidemias na África subsaariana. Os so-rogrupos BeC estão associados, na maioria dos casos, com as ocorrênciasem nações desenvolvidas. Os sorogrupos Y e W135 são comuns na maioriados casos recorrentes da doença, e eles são prevalentes em algumas áreasdos Estados Unidos, com um aumento acentuado nos últimos anos. A partirdestes dados é óbvia a razão do uso, estudo e avaliação de polissacarídeoscapsulares como candidatos à vacina. Uma vacina tetravalente, com baseem polissacarídeos capsulares, confere proteção contra sorogrupos A, C, Ye W-135 foi licenciada nos Estados Unidos. Anticorpos elicitados após vaci-nação são específicos de sorogrupo (Rosenstein, N. e outros, 2001, Men-ningococcal disease, N. Engl. J. Med., 3444, 1378-1388).
O sorogrupo B, que é diferente do resto, continua a ser umacausa significante de doença meningocócica endêmica e epidêmica, e isto éprincipalmente devido à completa falta de vacinas eficientes contra ele. Foinotado que polissacarídeo capsular B é pobremente imunogênico, mais aexistência do risco teórico para uma vacina baseada neste composto de in-duzir imunotolerância e auto-imunidade por causa de sua similaridade deestrutura com cadeias de oligossacarídeo que estão presentes em estruturasfetais neurais humanas. (Finne, J. e outros, 1987, An IgG monoclonal anti-body to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulatedpolysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisues. J. Im-munol. 138:4402-4407). Deste modo, o desenvolvimento de vacinas contrasorogrupos B é concentrado no uso de antígenos subcapsulares.
Proteínas de membrana externa e vacinas de vesícula
Tentativas iniciais, nos anos 70, em produzir vacinas baseadasem proteínas de membrana externa foram baseadas em depleção de LPSde preparações de proteína de membrana externa por detergente (Frasch,C.E. e Robins, J.D., 1978, Protection against group B meningococcal disea-se. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection ina guinea pig model. J. Exp. Med., 147(3):629-44). As proteínas de membra-na externa, OMPs, foram então precipitadas para produzir agregados sus-pensos em cloreto de sódio. Apesar de resultados promissores em estudosanimais, essas vacinas falharam em induzir anticorpo bactericida em adultosou crianças (Zollinger, W.D. e outros, 1978, Safety and immunogenicity of aNeisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animais and humans, J. In-fect. Dis. 137(6):728-39). O desempenho pobre dessas vacinas pode seramplamente atribuído à perda de estrutura terciária que acompanhou preci-pitação. A próxima etapa lógica foi, então, produzir uma vacina com proteí-nas mostradas em sua conformação nativa na forma de vesículas de mem-brana externa (Zollinger, W.D. e outros, 1979, Complex of meningococcalgroup B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang, L.Y. e Frasch1 C.E. 1984. Deve-Iopment of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine andevaluation in a mouse model. Infect. Immun. 46(2):408-14136).
Essas vacinas de vesícula de membrana externa eram signifi-cantemente mais imunogênicas do que os agregados de OMP e imunogeni- cidade foi mostrada ser aumentada mais através de adsorção ao hidróxidode alumínio adjuvante (Wang, L.Y. e Frasch1 C.E., 1984. Neisseria meningi-tidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect. Immun. 46(2):408-14136).
Vários testes de eficácia foram realizados usando vacinas de vesícula de membrana externa solúveis de formulações diferentes. As duasvacinas mais extensivamente estudadas foram desenvolvidas nos anos 80em respostas a surtos de doença em Cuba (Sierra, G.V. e outros, 1991.Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and massavaccination results in Cuba. NIPH Ann. Dis. 14(2): 195-210) e Norway (Bju- ne, G. e outros, Effect of outer membrane vesicle against group B meningo-coccal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6), respectivamente. Avacina de OMV produzida pelo Finlay Institute em Cuba (comercialmentecomercializada como VA-MENGOC-BC) é produzida da cepa B:4:P1.19,15com polissacarídeo de sorogrupo C e uma preparação de OMPs de alto pe- so molecular e é adsorvida em hidróxido de alumínio (Sierra, G.V. e outros,1991, Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection Trial andmass vaccination results in Cuba. NIPH Ann. Dis. 14(2): 195-210). Esta vaci-na contribuiu para o declínio rápido da epidemia em Cuba (Rodriguez, A.P. eoutros, The epidemiological impacto f antimeningococcal B vaccination in Cuba. 1999. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94(4):433-40).
A vacina produzida pelo Norwegian National Institute for PublicHealth (NIPH) era similarmente pretendida inicialmente para uso durante umperíodo de doença hiperendêmica causada por outro organismo do cloneET-5 (B:15:P1.7,16). Ela era também uma vacina monovalente produzida devesículas de membrana externa purificadas adsorvidas em hidróxido de a-lumínio (Bjune, G. e outros, 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccineagainst group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6). Vacinas de vesícula de membrana externa parecem apresentar eficaz-mente proteínas de membrana externa em uma conformação suficientemen-te natural para permitir a geração de anticorpos bactericidas funcionais, pelomenos em adolescentes e adultos. As respostas de anticorpo geradas foramtambém mostradas aumentar a opsonofagocitose de meningococci. A formu-lação precisa das vacinas (isto é, teor de OMP1 teor de LPS e a presença ouausência de adjuvante) tem um impacto significante sobre a imunogenicida-Je (Lehmann, A.K. e outros, 1991. Immunization against serogroup B me-ningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemilumines-cence. APMIS. 99(8):769-72, Gomez, J.A. e outros, 1998. Effectofadjuvantsin the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferring-binding proteins of Neisseria menigitidis. Vaccine. 16(17):1633-9, Steeghs,L. e outros, 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipo-polysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitides: Influence of Adju-vants on the Immune Response. Infect Immun. 67(10):4988-93).
O perfil antigênico de doenças isoladas também muda rapida-mente e uma vacina com cobertura de apenas um número limitado de cepasselecionadas é provável de se tornar ineficaz dentro de alguns anos a me-nos que a composição da vacina seja mudada para espelhar epidemiologialocal.
No momento, vacinas de OMV têm sido usadas mais amplamen-te do que qualquer outra vacina do sorogrupo B e são potencialmente úteisno contexto de surtos de doença causados por um único tipo de PorA.
Os imunógenos que geram reatividade cruzada entre cepas ain-da têm que ser completamente definidos. Estudos de soros pós-vacinaçãode testes de vacina de ambos Finlay Institute e NIPH sugeriram que anticor-pos contra ambos PorA (P1, a proteína de subtipo de soro classe 1) e OpcA(outra OMP principal, antes conhecida como Opc) (Wedege, E. e outros,1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neis-seria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted MeningococcalDisease During the Nomegian Serogroup B Proteetion Trial. Infec. Immun.66(7):3223-31) foram ambos importantes na mediação de atividade bacteri-cida de soro (com PorA mais imunogênica) ambos antígenos mostram varia-bilidade de cepa para cepa acentuada.
A proeminência de proteína PorA e o nível significante de varia-bilidade nesta proteína, que parece sofrer variação contínua ambos entre edurante surtos (Jelfs, J. e outros, 2000. Sequenee Variation in the porA Geneof a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemie Spread. Clin. Diagn.Lab. Immunl. 7(3):390-5) em epítopos aos quais a maioria da atividade bac-"tericida em pós-vacinação (e pós-doença) é direcionada, aumentaram aspreocupações de que a proteção oferecida por vacinas baseadas em OMVde cepa única (monovalente) pudesse ser de subtipo de soro restrito (isto é,dependente do tipo PorA).
Em uma tentativa de superar este problema potencial, uma vaci-na de OMV foi desenvolvida nos Países Baixos na RIVM que continha prote-ínas PorA de seis isolatos patogênicos prevalentes diferentes (Van Der Ley,P. e Poolman, J.T., 1992. Construction of a multivalent meningoeoceal vacei-ne strain based on the elass 1 outer membrane protein. Infect. Immun.60(8):3156-61, Claassen, I. e outros, 1996. Produetion, Charaeterization andControl of a Neisseria meningitides hexavalent elass 1 outer membrane pro-tein eontaining vesiele vaeeine. Vaccine. 14(10): 1001-8). Neste caso, as ve-sículas de vacina foram extraídas de duas variantes da cepa H44/76 bemcaracterizada que tinha sido geneticamente engenheirada para expressartrês proteínas PorA separadas.
A pesquisa por um antíqeno universal
Está claro que as proteínas de membrana externa (OMP) podeminduzir uma resposta imune funcional contra doença do sorogrupo B, masque nenhuma das vacinas até agora desenvolvidas é universalmente prote-tora devido à grande heterogeneidade das regiões expostas de superfíciedas proteínas de membrana externa. A imunidade reativa-cruzada modestainduzida pelas vacinas de vesículas de membrana externa (OMV) tem ali-mentado a pesquisa por um antígeno de membrana externa (ou grupo deantígenos) que induzisse anticorpos funcionais e que estivesse presente emtodas as cepas meningocócicas. Tais antígenos, se eles estivessem presen-tes em todas as cepas sem importar o sorogrupo, poderiam formar a basede uma vacina meningocócica verdadeiramente universal, o que eliminaria oproblema potencial de troca capsular em cepas patogênicas seguindo vaci-nação com polissacarídeo.
Uma vez que se tornou aparente que a variabilidade da proteínaPorA imunodominante limitaria seu uso como uma vacina universal, váriasoutras proteínas de membrana externa principal foram consideradas peloseu potencial de vacina e várias dessas estão sob desenvolvimento adicio-nal. Aquelas que foram consideradas como incluindo as proteínas classe 5 (OpcA), NspA e proteínas reguladas por ferro (TbpA e B, FbpA, FetA). TbpBfaz parte do complexo de ligação de transferrina com TbpA. Trabalho recen-te sugere que TbpA tem ambos um papel funcional maior em ligação de fer-ro (Pintor, M. e outros, 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in de-fective mutants of Neisseria meningitidis, J. Med. Microbiol. 47(9): 757-60) eé um imunógeno mais eficaz do que TbpB.
Uma proteína de membrana externa menor altamente conserva-da foi encontrada através de uma nova técnica usando combinações de pre-parações de proteína de membrana externa de cepas meningocócicas dife-rentes para imunizar camundongos (Martin, D. e outros, 1997. Highly Con-served Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection AgainstExperimental Infection. J. Exp. Med. 185 (7): 1173-83). As células B doscamundongos foram usadas para produzir hibridomas que foram então ava-liados quanto à reatividade cruzada contra cepas múltiplas de meningococci.Verioficou-se que o anticorpo monoclonal altamente reativo-cruzado se liga auma proteína de membrana externa de 22 kDa que foi chamada NspA. Imu-nização com proteína NspA recombinante foi mostrada induzir uma respostabactericida reativa-cruzada em camundongos contra cepas dos sorogruposΑ-C. Vacinação também protege camundongos contra infecção meningocó-cica letal (Martin, D. e outros, 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J. Exp.Med. 185(7): 1173-83). Comparação de seqüências de NspA entre cepas meningocócicas geneticamente divergentes demonstra que a proteína é al-tamente conservada (97% de homologia) (Cadieux, N. e outros, 1999. Bacte-ricidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Direeted aga-inst Neisseria meningitides NspA Outer Membrane Protein. Infect. Immun.67(9):4955-9).
A presença de NspA foi detectada através de ELISA em 99,2%de cepas testadas dos sorogrupos A-C usando anticorpos monoclonais anti-NspA (Martin, D. e outros, 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidisSurfaee Protein Confers Proteetion against Experimental Infection. J. Exp.Med. 185(7):1173-83). Esses anticorpos monoclonais foram mostrados ser bactericidas contra várias cepas de meningococei e são capazes de reduzirbacteremia meningocócica em um modelo de camundongo (Cadieux, N. eoutros, 1999. Baeterieidal and Cross-Protective Aetivities of a MonoclonalAntibody Direeted against Neisseria meningitides NspA Outer MembraneProtein. Infect. Immun. 67(9):4955-9). Embora esses dados pareçam suge- rir que NspA é uma candidata promissora à vacina que é capaz de protegeralém dos limites do sorogrupo, soro de NspA anti-recombinante policlonalnão se liga à superfície de cerca de 35% das cepas meningocócicas do so-rogrupo B patogênicas apesar da presença do gene NspA nesses organis-mos (Moe, G.R. e outros, 1999. Differenees in Surfaee Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infect. Immun. 67(11):5664-75).
Apresentação de antíqeno e formulação de vacina
Trabalho anterior sugeriu que a forma na qual os antígenos sãoapresentados é provável de ser crítica. Os epítopos em proteínas ligadas à membrana são freqüentemente dependentes da manutenção da estruturaterciária correta e isto por sua vez é freqüentemente dependente dos domí-nios ligados à membrana hidrofóbica. Foi mostrado que as preparações deproteínas de membrana externa elicitam imunidade em seres humanos ape-nas quando apresentadas em forma de vesícula (Zollinger, W.D. e outros,1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outermembrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48. Zol-linger, W.D. e outros, 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria me-ningitides type 2 protein vaccine in animais and humans. J. Infect. Dis.137(6):728-39).
Vacinas de proteína única têm sido usadas no campo por déca-das e geralmente exibem boa estabilidade. Se apresentação na forma devesículas for requerida, para permitir que os antígenos permaneçam ligadosà membrana, estabilidade e reproducibilidade podem ser difíceis de garantir.A imunogenicidade e a reatogenicidade de vesículas de membrana externa"podem variar com alterações na quantidade de proteína e LPS removidasnos processos de purificação. Um corpo substancial de experiência em pro-dução de vesícula acumulou em fabricação de vacina de OMV, no entanto, eas vacinas atualmente produzidas são sujeitas a controle de qualidade com-pleto. Construção de vesículas de Iipossoma totalmente sintéticas podepermitir otimização e padronização adicionais de tais vacinas (Christodouli-des, M. e outros, 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of Iiposomes andadjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the inductionof a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology144(Pt 11):3027-37). Em outras palavras, proteínas de membrana externatêm sido apresentadas tanto em vesículas e como proteínas expressas pu-ras, e o desenvolvimento de respostas de anticorpo tem sido modesto. Osprincipais esforços até agora se concentraram em injeção intramuscular devacina meningocócica, levando à produção de IgG sistêmico. No entanto,em doença meningocócica onde invasão do hospedeiro é através do epitélionasal, a produção de IgA secretor pode ser também importante.
A seqüência de genoma de N. meningitidis
As seqüências de genoma de MC58 (um meningococcus do so-rogrupo B) (Tettelin, H. e outros, 2000. Complete Genome Sequence ofNeisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459):1809-15172) e de Z2491 (uma cepa do sorogrupo A) (Parkhill, J. e outros, 2000.Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidisZ2491. Nature 404 (6777):502-6173) foram elucidadas e publicadas durante2000. A disponibilidade das seqüências de gene detalhadas deve ter umainfluência drástica sobre a pesquisa de vacina meningocócica. Embora osequenciamento do genoma MC58 estivesse em progresso, Pizza e outroscomeçaram a identificar as estruturas de leitura aberta que eram previstascodificar proteínas ligadas à membrana, expostas na superfície ou exporta-das. Eles identificaram 570 tal como ORFs, amplificaram-nas através de re-ação de cadeia de polimerase e as clonaram em Escherichia coli para permi-tir expressão das proteínas codificadas como proteínas marcadas com Hisou de fusão de glutationa S-transferase (Pizza, M. e outros, 2000. Identifica-tion of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequeneing. Science 287 (5459): 1816-20). Os 61% (350) dasORFs selecionadas foram expressos com sucesso, aquelas que falharamem expressar foram freqüentemente aquelas contendo mais de um domíniode transmembrana hidrofóbico (possivelmente excluindo várias proteínasligadas à membrana externa). As proteínas recombinantes foram purificadase usadas para vacinar camundongos. Os soros imunes foram então avalia-dos quanto à ligação de superfície a cepas meningocócicas múltiplas atravésde ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e citometria de fluxo equanto à atividade bactericida contra duas cepas usando o ensaio bacterici-da de soro. Finalmente, sete proteínas foram selecionadas para estudo adi-cional com base em uma resposta positiva em todos os três ensaios. Formu-lações de vacina de teste usando várias dessas proteínas em combinaçãocom adjuvantes foram mostradas induzir títulos bactericidas significantescontra a cepa meningocócica homóloga (MC58) em camundongos, mas ne-nhuma das proteínas induziu títulos SBA tão altos quanto uma vacina devesícula de membrana externa de MC58 (Giuliani, M. e outros, 2000. Proee-edings 129 IPNC. P. 22). Por outro lado, há alguma evidência de que combi-nações dessas proteínas podem exibir imunogenicidade maior em camun-dongos do que proteínas únicas (Santini, L. e outros, 2000. Proceedings 12eIPNC, p. 25). As várias estruturas de leitura aberta que foram excluídas du-rante este trabalho, talvez através de falha de expressão de proteína ou mo-dificação de suas propriedades imunológicas, podem também ter potencialde vacina e requererem investigação adicional.
Componentes de vacina podem ser selecionados mais eficaz-mente uma vez que uma compreensão da contribuição dos antígenos indivi-duais para a patogênese de N. meningitidis tendo sido obtida. Os própriosantígenos podem ser candidatos à vacina eficazes ou, alternativamente, osmutantes atenuados poderiam ser considerados como constituintes de vaci-na. Um problema importante de prevenção e/ou terapia de doença meningo-eócica é que nenhuma vacina disponível até agora confere uma proteção"universal devido à heterogeneidade de antígenos usados como vacinas atéagora.
Descrição da invenção
A presente invenção contribui para resolver o problema mencio-nado antes ao fornecer formulações farmacêuticas contendo uma proteínacuja seqüência é altamente conservada, mesmo em gêneros bacterianospatogênicos diferentes. O objetivo técnico que a presente invenção busca éo desenvolvimento de formulações com a habilidade em aumentar a respos-ta imune hospedeira sistêmica e mucosal contra diferentes patógenos novosou um espectro mais amplo dos existentes. No objeto de trabalho da presen-te invenção é descrito, pela primeira vez, o uso da proteína NMB0606 comoum componente de uma formulação de vacina com caráter terapêutico oupreventivo.
Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composi-ções farmacêuticas, compreendendo esta proteína, que têm o objetivo deprevenir ou tratar qualquer infecção causada por uma bactéria pertencenteao gênero Neisseria. Em outra realização preferida, essas composições far-macêuticas mencionadas compreendendo o antígeno previamente dito sãoúteis para a prevenção e tratamento de doenças causadas por N. meningiti-dis e N. gonorrhoeae. É especificamente um objeto da presente invençãouma formulação farmacêutica onde a proteína NMB0606 está presente emuma faixa de 0,5-100 pg/dose, em uma formulação farmacêutica aceitável. Adita formulação compreende, opcionalmente, um adjuvante de vacina capazde potencializar a resposta imune contra o ingrediente farmaceuticamenteativo, a proteína NMB0606.
Em outra realização da presente invenção, composições farma-cêuticas poderiam conter um ou vários antígenos sendo de origem sintética,recombinante ou natural. Em outra realização da presente invenção, compo-sições farmacêuticas combinadas poderiam conter antígenos de polissacarí- deo, incluindo polissacarídeos bacterianos, e, mais especificamente, polis-sacarídeos de N. meningitidis. As formulações da presente invenção podemconter proteína-polissacarídeos conjugados, sendo o polissacarídeo de ori-gem bacteriana.
Em uma realização preferida da presente invenção, formulações farmacêuticas contendo NMB0606 também contêm antígenos de naturezade peptídeo, com o propósito de expansão do espectro de proteção induzidopor vacinas derivadas das ditas composições.
A presente invenção revela formulações farmacêuticas, caracte-rizadas por serem uma vacina com a habilidade em elicitar uma respostaimune protetora no organismo hospedeiro contra infecções causadas porbactérias do gênero Neisseria. Mais especificamente, a formulação farma-cêutica da presente invenção é uma vacina capaz de elicitar uma respostaprotetora contra infecções causadas por Neisseria meningitidis ou Neisseriagonorrhoeae. Formulações farmacêuticas descritas aqui são administradas através de via parenteral ou mucosal, incluindo via oral.
Em outra realização preferida da presente invenção, a proteínaNMB0606 pode ser empregada como adjuvante, ou veículo de peptídeos,polissacarídeos ou qualquer outro antígeno com menos imunogenicidade,objetivando reforçar a imunogenicidade dos ditos elementos. O Exemplo 11 mostra que a proteína NMB0606 é capaz de aumentar os níveis de anticorpocontra um peptídeo derivado viral quando o dito peptídeo é conjugado aNMB0606. Está também compreendido no escopo da presente invençãocobrir o uso de determinantes protetores para um antígeno de proteína dadoque eles são inseridos na seqüência de aminoácido de NMB0606, objetivan-do induzir uma resposta imune aumentada contra tais determinantes, entãosendo parte de novas proteínas híbridas presentes em uma composiçãofarmacêutica.
Em outra realização preferida da presente invenção, composi-ções farmacêuticas compreendidas na presente invenção poderiam conterfragmentos de proteína NMB0606, capazes de induzir uma resposta proteto-ra contra a meningococcus ou qualquer outra bactéria do gênero Neisseria.
Em uma realização particular da presente invenção, composições farmacêu-ticas contêm mimótopos de NMB0606 ou peptídeos miméticos de NMB0606gerados através de síntese de tecnologia de DNA recombinante. O termo"mimótopo" descreve aqui qualquer peptídeo sendo capaz de induzir anti-corpos, e que eles são combinados com proteína NMB0606 enquanto sendocapazes de induzir uma resposta imune protetora contra Neisseria.
É também uma parte da presente invenção a detecção de doen-ça meningocócica através do uso de componentes farmacêuticos contendoNMB0606, ou o gene codificando NMB0606, identificado como Seq. ID No.3, de uma maneira independente ou entre outros componentes dentro deuma amostra biológica obtida de um indivíduo.Breve descrição dos desenhos
Figura 1. Vetor de clonagem pM238 empregado na clonagem eexpressão de proteína NMB0606.
Figura 2. Construção final de seqüência de nucleotídeo do genede NMB0606 em vetor pM238.
Figura 3. Análise SDS-PAGE de frações obtidas de rompimentocelular: faixa 1, sobrenadante após ruptura; faixa 2, pélete após ruptura.MWM: Marcador de peso molecular.
Figura 4: Análise SDS-PAGE das frações diferentes de proces-so de purificação de proteína NMB0606 recombinante: Faixa 1, sobrenadan-te após solubilização de uréia a 4M em tampão de carbonato-bicarbonato;faixa 2: fração não-ligada (passagem) para a matriz; faixa 3: fração eluídacom carbonato-bicarbonato, Imidazol a 20 mM e tampão contendo NaCI a0,3M; Faixa 4: fração eluída com carbonato-bicarbonato, Imidazol a 100 mMe tampão contendo NaCI a 0,3M (proteína purificada). MWM: Marcador depeso molecular.
Figura 5. Níveis de anticorpo (IgG) contra proteína recombinanteNMB0606, obtidos após imunização de camundongo com o mesmo antígenoligado com o adjuvante de Freund (Freund), hidróxido de alumínio (AIum) oupolissacarídeo C de N. meningitidis através de via subcutânea. Resultadosde ELISA são representados, como o inverso da diluição mais alta que du-plica o valor de soro pré-imune.
Figura 6. Reconhecimento de determinantes antigênicos pre-sentes em N. meningitidis, cepa CU385, OMVs usando soros de murino ob-tidos após imunização de camundongos com o mesmo antígeno ligado comadjuvante de Freund (Freund), hidróxido de alumínio (AIum) ou polissacarí-deo C de N. meningitidis através de via subcutânea. Resultados são repre-sentados, como o inverso da diluição mais alta que duplica o valor de sorospré-imunes.
Figura 7. Resultados de pesquisas de homologia entre proteínaNMB06060 ("busca") e seqüências detalhadas em genomas de sorogruposdiferentes de N. meningitidis ("sujeito") usando o programa BLAST.
Figura 8. Reconhecimento de proteína NMB0606 em cinco ce-pas diferentes de N. meningitidis, por soros elicitados contra o antígeno re-combinante ligado com polissacarídeo C de N. meningitidis por via subcutâ-nea. Soros elicitados com outros adjuvantes tinham um perfil similar. Resul-tados são expressos como o inverso da diluição mais alta que duplica o valorde soros pré-imunes.
Figura 9. Experimentos de proteção passiva de infecção menin-gocócica no modelo de rato bebê usando soros elicitados contra o antígenorecombinante ligado com adjuvante de Freund (Freund), hidróxido de alumí-nio (AIum) ou polissacarídeo C de N. meningitidis (PsC). Infecção foi feitacom a cepa Z4181. C-: grupo de animais não-tratados, C+: soros de camun-dongos hiperimunes contra vesículas de membrana externa de Z4181. Osímbolo * representa uma diferença estatística significante com relação aocontrole negativo (C-). Com relação aos níveis de bacteremia, esses sãoexpressos como unidades de formação de colônia por mL (cfu/ml).
Figura 10. Reconhecimento de proteína NMB0606 e um painelde antígenos não-relacionados pelos mAbs gerados (mAbs D6/34, 3F7/14 e8C9/26). P1, proteína Classe 1 cepa Neisseria meningitidis B:4:P1.15; P64k,subunidade E3 de piruvato desidrogenase de Neisseria meningitidis; T.T.,toxóide do tétano; HBsAg1 Antígeno de superfície da Hepatite B. Esses re-sultados são mostrados como valores de absorbância (492 nm) em um en-saio tipo ELISA.
Figura 11. Reconhecimento de proteína NMB0606 por sorosconvalescentes humanos de sobreviventes de doença meningocócica. Comoum controle negativo, soros de doador saudável foram empregados. Os re-sultados são mostrados como a absorbância (492 nm) em um ensaio tipoELISA.
Figura 12. Títulos de antipeptídeo JY1 dos soros de animais i-munizados ou com peptídeo livre (JY1), proteína recombinante (NMB0606)ou o conjugado JY1-NMB0606.
Figura 13. Níveis de anticorpo (IgA) contra proteína NMB0606recombinante em amostras de lavagem pulmonar de camundongos imuniza-dos de forma intranasal com uma NMB0606 recombinante com polissacarí-deo C de N. meningitidis (NMB0606+PsC) ou com a proteína incorporadaaos Iipossomas (NMB0606_Lip).
Apresentação detalhada de exemplos de realização/ExemplosExemplo 1. Detecção de proteína NMB0606 em preparações de vesículasde membrana externa de N. meningitidis soroqrupo B
Com o objetivo de estudar proteínas que estão presentes nasvesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis sorogrupo B (cepaB:4:P 1.19, 15), uma eletroforese bidimensional foi realizada de acordo como método descrito em outro lugar (Górg, A. e outros 1985, Electrophoresis6:599-604). Subseqüentemente, uma digestão enzimática foi feita nas prote-ínas extraídas em gel usando tripsina (Promega, Madison, Wl, U.S.). Peptí-deos gerados após digestão foram extraídos em solução usando microcolu-nas (ZipTips, Millipore, MA, U.S.)· Para análise de espectrometria de massa,os peptídeos foram eluídos de microcolunas com acetonitrila a 60%, ácidofórmico a 1% seguido por uma aplicação imediata em nanopontas (Protana,Dinamarca).
Medições foram realizadas em um espectrômetro de massa hí-brido com quatro pólos e tempo de vôo (QTof-2®, Manchester, Reino Unido),equipado com uma fonte de ionização (nanoESI). Dados de espectrometriade massa foram adquiridos em uma faixa w/z de 400-2000 em 0,98 segundoe usando 0,02 segundo entre varreduras. Aquisição de dados e processa-mento de dados foram realizados usando o programa MassLynx (versão 3.5,Micromass).
Identificação de proteína com base em dados de espectro demassa foi realizada usando o programa ProFound (Zhang, W. e Chait, B.T.2000. ProFound: an expert system for protein Identification using mass spec-trometric peptide mapping information. Anal. Chem. 72:2482-2489.http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). A pesquisa foi subscrita paraos genes e seqüências de proteína derivadas contidos no banco de dadosSwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) e NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando a oxidação de metioninas, de-saminação e carboxiamidometilação de cisteínas como possíveis modifica-ções a serem encontradas.
Identificação de proteínas com base nos espectros de massa foirealizada com o programa MASCOT (Perkins, D.N. e outros, 1999. Probabi-iity-based protein Identification by searching sequence databases using massspectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567.http://www.matrixscience.com/). Parâmetros de pesquisa incluem modifica-ções de cisteína bem como oxidações e desaminações.
Partindo da análise de resultados obtidos da identificação deproteínas presentes em preparações de vesículas de membrana externa, aproteína NMB0606 foi selecionada para ser avaliada como possível candida-to à vacina, da qual um peptídeo foi identificado através de espectrometriade massa.
Exemplo 2. Análise baseada em homoloaia de proteína NMB0606 com pro-dutos de gene relatados em bancos de dados.
Para a identificação da proteína NMB0606, uma pesquisa dehomologia de seqüência foi feita no banco de dados NCBI empregando oprograma BLAST (Altschul, S.F. e outros, 1990. Basic local alignment searchtool. J. Mol. Biol. 215:403-410, http://ncbi.nlm.nia.gov/BLAST/)· Os resulta-dos deste procedimento indicaram homologia, em adição à proteína corres-pondente em outros sorogrupos de Neisseria, com a proteína em vários mi-croorganismos, incluindo proteína yajC de E. coli, que foi bem caracterizadacomo uma parte do mecanismo SEC nesta bactéria. (Taura, T. e outros(1994) Genetic analysis of SecY: Additional export-defective mutations andfactors affecting their phenotypes. Mol. Gen. Genet., 243:261-269; Duong,F. e Wickner, W. (1997) The SecDFyajC domain of preprotein translocasecontrois preproteina movement by regulating SecA membrane cycling. EM-BO J., 16:2756-2768). Foi mostrado que a proteína homóloga em Brucellaabortus é capaz de induzir uma resposta celular significante contra este pa-tógeno em camundongos (Vemulapalli, R. e outros (1998) Cloning and se-quencing of yajC and SecD homologs Of Brucella abortus and demonstranti-on of immune responses to YajC in mice vaccinated with B. abortus RB51.Infec. Immun. 66:5684-5691). No entanto, este é o primeiro trabalho onde ovalor desta proteína conservada hipotética é apontado como um antígeno devacina valioso, capaz de induzir uma resposta humoral protetora após imuni-zação com esta proteína em uma formulação de vacina.
A conservação desta proteína entre vários genes microbianosgerou a denominação de um grupo de proteína ortóloga com um domínioconservado em NCBI [gnlCDDH 1572 COG1862. YajC, Preprotein transloca-se subunit YajC [Intracelular trafficking and secretion]], presumivelmente in-dicando uma origem filogenética comum de um ancestral comum a todaselas.
A análise da vizinhança desses genes empregando o banco dedados MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome database forcomparative analysis. Nuclei Acids Res. 31, 58-62) revelou uma similarida-de significante na organização de gene presente nos microorganismos pre-viamente mencionados, então confirmando que eles são homólogos prová-veis em seus respectivos genomas.Exemplo 3. Clonagem e expressão do gene de NMB0606, codificando a pro-teína NMB0606 de N. meningitidis em Escherichia coli.
A fim de clonar e expressar o gene de NMB0606, o vetor de clo-nagem pM-238 foi empregado. Este vetor permite que a clonagem seja reali-zada usando enzimas de restrição diferentes e a geração de níveis de ex-pressão altos de proteínas heterólogas na forma de corpos de inclusão emE. coli.
O vetor pM-238 (Figura 1) tem os elementos que seguem: pro-^motor de triptofano, segmento de gene codificando a seqüência de estabili-zação de 47 aminoácidos de fragmento Nt de P64 kDa da cepa de N. me-ningitidis B:4:P1.19,15, seqüência de terminador transcripcional T4 de bacte-riófago e a seqüência do gene que confere resistência à Ampicilina comomarcador de seleção. Este vetor de clonagem também permite seleção re-combinante por meio de um tingimento de cor azul/branca de colônias trans-formadas, devido à presença de subunidade alfa IacZ de beta-galactosidase.
Da seqüência de nucleotídeo de gene codificando NMB0606 (E-xemplo 1) um par de iniciador de oligonucleotídeo (0606U e 06060L) foi pro-jetado para amplificação do dito segmento de gene, evitando a região decodificação de peptídeo de sinal, do DNA genômico da cepa CU385(B:4:P1.19, 15)
Xbal
0606U: 5' CGGAGCTCTAGATCTTCAAGCTGTTGCAC 3'(No. de identificação de seqüência: 1)0606L: 5' TTACCCGGGATCCACAATCGACTTTTGC 3'
BamHl
(No. de identificação de seqüência: 2)
Para a previsão de peptídeo de sinal o servidor SignaIP WorldWide Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0) foi empregado. Apósamplificação por PCR do gene codificando NMB0606 (Saiki, R.K. e outros(1988). S lniciador-d/'recíec/ enzymatic amplification of DNA with a thermo-stable DNA polymerase. Science 239:487-491) empregando iniciadores0606U e 0606L, o produto de PCR foi digerido usando enzimas de restriçãoXba-I e Bam-HI, e clonado em vetor de clonagem pM238 previamente dige-rido. A construção final é mostrada na Figura 2, e a proteína NMB0606 éexpressa como uma proteína de fusão para o segmento Nt de proteína P64kDa. Seqüenciamento do gene clonado de NMB0606 foi realizado usando osequenciador automático ALFexpress Il (Termo Sequenase® Cy® 5 DyeTerminator Kit, Amersham Biosciences) e oligonucleotídeos 1573 (Seq. ID.No. 8) e 6795 (Seq. ID. No. 9) que ligam a seqüência do estabilizador P64 eterminador transcripcional T4, respectivamente. O plasmídeo gerado aqui foichamado pM-NMB0606 para uso posterior.
Para a expressão do gene de NMB0606, a cepa de E. coliGC366 foi transformada através de método químico com o plasmídeo pM-NMB0606 (Figura 2). O experimento de expressão foi realizado em meiomínimo (M9) (Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Nova York, USA) suplementado com glico-se a 1%, triptona a 1%, CaCI2 a 0,1 mM, MgSO4 a 1mM e ampicilina a 50pg/ml. Culturas bacterianas foram incubadas 12 horas a 37- C e 250 rpm.Culturas cultivadas foram centrifugadas e rompimento ultra-sônico do péletecelular foi realizado (IKA LABORTECHNIK). Frações de pélete e sobrena-dante foram analisadas através de SDS-PAGE (Laemmli, UK, 1970. Cleava-ge of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophageT4. Nature 277:680) mais fingimento com Coomassie Brilliant Blue R-250. Aporcentagem de expressão foi realizada através de densitometria de gel(LKB Bromma 2202 Ultrascan Laser densitometer; Amersham PharmaciaBiotech., Reino Unido). A proteína NMB0606 foi obtida da fração de pélete,sendo cerca de 15% do teor de proteína total desta fração (Figura 3). Amos-tras de pélete celular foram solubilizadas em tampão de carbonato-bicarbonato (carbonato de sódio a 0,1M, hidrogenocarbonato de sódio a0,1 M) contendo uréia em concentrações molares diferentes (2M, 4M, 6M e8Μ). Quando o tampão anterior com 4M foi empregado, a proteína NMB0606foi solubilizada. O sobrenadante, após solubilização, passou por uma croma-tografia de afinidade de metal a fim de atingir a purificação da proteína deinteresse e uma simples foi obtida onde a molécula que migra no tamanhoesperado é cerca de 60% das proteínas totais, embora outro peso molecularmaior possa ser compreendido eles correspondem a agregados da mesmaproteína conforme foi demonstrado através de imunoidentificação. Na Figuranúmero 4, o padrão eletroforético pode ser compreendido em algumas a-mostras tomadas ao longo do processo de purificação. Uma última etapa dediálise foi realizada antes de sua avaliação em animais de laboratório.
Exemplo 4. Avaliação da resposta imune induzida após imunização com pro-teína NMB0606 através de via subcutánea.
Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMB0606, um expe-rimento de imunização foi planejado e conduzido em camundongos, onde aproteína NMB0606 foi administrada adjuvada com Hidróxido de Alumínio,Adjuvante de Freund ou polissacarídeo C de N. meningitidis. Com essaspreparações, camundongos fêmeas Balb/C (8-10 semanas de vida) foramimunizados, uma vez divididos em 3 grupos de 8 camundongos cada. Trêsimunizações foram aplicadas através de via intraperitoneal, com 7 dias deintervalo entre elas. Uma dose de reforço com a proteína adjuvada em Hi-dróxido de alumínio foi dada no dia 45. Na Tabela 1 é descrita a composiçãodos grupos:
Tabela 1: Grupos de camundongos Balb/C empregados no experimento deimunização
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Títulos de anticorpo (IgG) contra a proteína recombinante e aproteína homóloga presentes na bactéria foram determinados através de umELISA, em amostras de soro obtidas após a dose de reforço. Na Figura 5, ostítulos de anticorpo contra a proteína recombinante de animais individuaissão mostrados. Níveis de anticorpo específicos foram detectados logo apósa segunda inoculação (dados não mostrados), sendo ainda mais altos apósa última inoculação. Além disso, a imunoidentificação por Western blotting foifeita, onde a respectiva faixa de proteína foi reconhecida (dados não mos-trados). Os soros obtidos após a imunização com a proteína recombinantereconheceram a proteína natural presente em uma preparação de proteínade membrana externa (OMP) de cepa CU385. Esses resultados são apre-sentados na Figura 6.
Exemplo 5. Caracterização da seqüência do gene codificando a proteína
NMB0606 em cepas diferentes de N. meningitidis e Neisseria gonorrhoeae.
Para analisar a conservação da seqüência do gene codificandoa proteína NMB0606 na espécie patogênica do gênero Neisseria, uma pes-quisa de similaridade com os genomas de Neisseria meningitidis (sorogru-pos A, B e C) e Neisseria gonorrhoeae, detalhados no banco de dados NC-BI, foi feita (NC 003116.1, NC 003112.1, NC 003221, NC002946) empre-gando o programa BLAST (Altschul, S.F. e outros, 1990. Basic local alingn-ment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A Figura 7 mostra os resultados dacomparação de seqüência para aquelas seqüências que produzem um ali-nhamento significante em cada um dos genomas analisados. Essas seqüên-cias têm 100% de identidade no sorogrupo B, 99% de identidade no soro-grupo A e uma identidade de 98% com Neisseria gonorrhoeae, com a se-qüência obtida para o gene que codifica a proteína NMB0606 (Seq. ID. No.3). Ainda, a seqüência do referido gene foi determinada para 3 isolatos Cu-banos (Seq. ID Nos. 5-7), que pertencem ao sorogrupo B (B:4:P1.19, 15) eum alinhamento de seqüência foi feito usando o programa CIustaIX(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os resultados do alinhamento mostram quehá uma grande conservação na seqüência de nucleotídeo do gene deNMB0606 entre as cepas analisadas e em geral o gênero Neisseria.
O uso da proteína NMB0606 como um candidato à vacina, le-vando em consideração o alto grau de similaridade existente entre as se-qüências previamente mencionadas, permitiria a geração de uma respostaimune eficaz, com uma proteção de amplo espectro (devido à reatividadecruzada) contra a doença meningocócica.
Exemplo 6. Caracterização da resposta imune com ação de amplo espectroinduzida pela imunização de camundonqos Balb/C com a proteínaNMB0606.
Para avaliar se a imunização com a proteína NMB0606 induziuuma resposta amplamente reativa-cruzada com outras cepas de Neisseria,um ELISA foi feito. As placas de poliestireno foram revestidas com célulasintegrais de 5 cepas de Neisseria, que pertencem a sorotipos e subtipos desoro diferentes. As placas foram incubadas com soros agrupados obtidoscontra a proteína NMB0606, através de duas vias de imunização, conformedescrito no Exemplo 4.
A Figura 8 mostra o reconhecimento de antígenos presentes emcepas de sorogrupos A, B e C de N. meningitidis pelos soros elicitados apósa imunização com a proteína NMB0606 recombinante adjuvada com Adju-vante de Freund. O resto dos soros tinha um comportamento comparávelneste ensaio.
Exemplo 7. Proteção induzida pelos soros de murino específicos para prote-ína NMB0606, contra cepas homólogas e heterólogas, no modelo de ratobebê.
Para determinar a atividade funcional dos anti-soros obtidos, umensaio de proteção foi conduzido no modelo de rato bebê para infecção me-ningocócica. Vinte e quatro ratos (5-6 dias de vida) foram divididos em gru-pos de 6 ratos cada.
Foi determinado se os soros administrados através de via intra-peritoneal protegiam os ratos de infecção causada por bactérias (cepaZ4181), inoculadas pela mesma via uma hora depois. Os soros de cada gru-po foram agrupados e diluídos 1/10 (em PBS estéril) antes deles serem ino-culados em ratos bebês. Quatro horas mais tarde, os animais foram amos-trados e bactérias viáveis em seu sangue foram contadas.
Para interpretar os resultados, uma Análise de Variância (Anova)foi feita, seguido por um Teste de Comparação Múltipla de Dunnet, onde osgrupos de teste foram comparados com o controle negativo. Como pode serobservado na Figura 9, o grupo recebendo soro de camundongos imuniza-dos com NMB0606 ligado com polissacarídeo C não mostrou diferenças es-tatisticamente significantes em comparação com grupo de controle negativo,então os títulos de anticorpo eram protetores no modelo de rato bebê.
Um ensaio similar foi feito infectando ratos bebês com a cepaCU385 (B:4:P.1.19,15) e tal como no experimento anterior, anticorpos decamundongos imunizados com a proteína misturada com polissacarídeo Cprotegeram rato bebê contra infecção meningocócica no modelo empregado(dados não mostrados). Um ensaio similar foi feito infectando ratos bebêscom as cepas H44/48 e 120/90, isoladas de pacientes Cubanos, cuja classi-ficação sorológica é homóloga à cepa B385. Além disso, experimentos deprovocação foram conduzidos com a cepa H44/76 (B:15:P1.7,16) do soro-grupo B. Em todos os casos, o anti-soro contendo anticorpos elicitados coma proteína NMB0606 alvo adjuvada com polissacarídeo C era capaz de pro-teger ratos contra infecção meningocócica.
Exemplo 8: Imunoqenicidade de proteína NMB0606 em um modelo de ani-mal de imunização neonatal.
Com o objetivo de avaliar se a proteína NMB0606 era capaz deinduzir uma resposta de anticorpo após vacinação em fase neonatal, um ex-perimento de imunização em camundongos neonatais OF1. Imunização decamundongos de 7 dias de vida é considerada um modelo que reproduz ascaracterísticas de resposta imune humoral humana durante a fase neonatalpara muitos antígenos. Devido a este fato, 3 grupos de camundongo (6 ca-mundongos/grupo) foram imunizados nos dias 7, 10 e 14 após nascimento.Camundongos do primeiro grupo receberam 10 pg de proteína NMB0606adjuvada com Alum (400 μg/dose). O segundo grupo de camundongos re-cebeu 10 pg de proteína NMB0606 adjuvada com fosfato de alumínio (400pg/dose), enquanto camundongos do terceiro grupo receberam 400 Mg/dosede Hidróxido de alumínio sozinho com antígeno. Em 21 dias de idade amos-tras de sangue foram obtidas e analisadas através de ELISA, a fim de mediros níveis de anticorpo contra NMB0606. Os títulos anti-NMB0606 detectadosem todos os três grupos de camundongos são mostrados abaixo.Tabela 2. Títulos de anticorpo anti-NMB0606 detectados em três grupos decamundongos OF1 imunizados em fase neonatal
<table>formula see original document page 24</column></row><table>
*MGT, títulos geométricos médios de títulos de anticorpo anti-NMB0606 IgGdetectados em camundongos de 21 dias de vida.
Como pode ser avaliado na Tabela 2, ambas as formulaçõescontendo proteína NMB0606 e adjuvantes aceitos para uso humano elicita-ram níveis de anticorpo significantes para um modelo animal com uma ima-turidade notável em seu sistema imune, isto sugerindo o fato que este antí-geno de vacina pode ser imunogênico após sua administração a neonataishumanos, e por sua vez capaz de conferir imunidade contra o Meningococ-cus neste momento inicial de vida.Exemplo 9
Geração de anticorpos monoclonais contra proteína NMB0606 capaz demediar a atividade bactericida contra Neisseria meningitidis
Para gerar anticorpos monoclonais (mAbs) específicos contraproteína NMB0606, e estudar a habilidade funcional de mediação de ativida-de bactericida contra cepa homóloga e heteróloga de N. meningitidis, umprograma de imunização foi conduzido com uma preparação de proteínaNMB0606 com 80% de pureza (Exemplo 3). A imunização foi feita emBalb/C (H-2d, fêmeas, 5-6 semanas de vida) e 4 doses foram aplicadas co-mo segue: Nos dias 0, 15 e 30 da rotina de administração, 10 pg de antíge-no NMB0606 por camundongo (volume total 100 μΙ) foram administradosatravés de via subcutânea, emulsificados com Adjuvante de Freund; no dia50, 10 pg de antígeno por camundongo em Solução Salina Tamponada comFosfato (NaCI a 140 mM, KCI a 270 mM, KH2PO4 a 1,5 mM, Na2HPO4 a 6,5mM χ 2H20, pH 7,2) foram administrados através de via intraperitoneal. Ex-trações de sangue foram feitas nos dias 0 e 45.Esplenócitos do animal com o título mais alto, medido através deum ELISA indireto usando proteína NMB0606 com o antígeno de revesti-mento (Exemplo 3), foram fundidos com células de mieloma de camundongoX63 Ag8 653. Os hibridomas resultantes foram isolados e avaliados de acor-do com procedimentos padrão (Gavilondo, J.V. 1995, Anticuerpos Mono-clonales: Teoria y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).
A reatividade dos anticorpos secretados pelos hibridomas dire-cionados à proteína NMB0606, bem como seus antígenos não-relacionadosde reatividade cruzada, foi testada por um ELISA indireto empregando 5μg/ml de cada antígeno, e a mesma concentração de cada mAbs a ser en-saiado. A Figura 10 mostra os resultados obtidos neste experimento, ao todo2 clones positivos foram obtidos (mAbs D6/34, 3F7/14 e 8C9/26) que especi-ficamente reconheceram proteína NMB0606, e não reagem nem com a se-qüência de aminoácido correspondendo ao terminal N de P64k, nem com oresto dos antígenos não-relacionados ensaiados.
Para determinar a habilidade dos mAbs gerados contra a proteí-na NMB0606 em mediar uma resposta bactericida contra cepas homólogase heterólogas de Neisseria meningitidis, um teste bactericida foi realizado. Otítulo de anticorpo bactericida foi expresso como a recíproca da diluição maisalta dos anticorpos testados que era capaz de matar 50% ou mais bactérias;dois dos mAbs (3F7/14 e 8C9/26) atingiram títulos bactericidas maiores doque 1:128 contra a cepa homóloga B:4:P.1.19,15 e um título (D6/34) maiordo que 1:80. Eles também mostraram títulos mais altos do que 1:64 contraas cepas heterólogas B:15:P.1,7,16 e C:2a:P1.5 respectivamente.
Exemplo 10
Caracterização das reqiões-alvo da resposta imune de murino contra a pro-teína NMB0606
A fim de identificar as regiões na proteína que são mais freqüen-temente reconhecidas pelos anti-soros de murino gerados contra o antígenorecombinante, um ensaio SPOTScan foi feito. Um conjunto de peptídeos desobreposição que atravessa a seqüência da proteína foi sintetizado em umamembrana de celulose, que foi incubada com soros agrupados diluídos1:100. A reação de antígeno-anticorpo foi detectada pela incubação com umconjugado de imunoglobulina G anti-murino - fosfatase alcalina, seguido pelaadição de uma solução que continha o substrato Bromo-cloro-indolil-fosfato.
Várias regiões antigênicas comuns dentro da proteína foram observadas,sem importar a preparação que era empregada para a imunização (dadosnão mostrados).
Exemplo 11. Reconhecimento da proteína NMB0606 por soros humanos.
Uma coleção de soros humanos, vindo de indivíduos convales-centes, foi empregada neste estudo, que foi realizado através de ELISA. Asplacas foram revestidas com proteína NMB0606, obtida através de eletrofo-rese preparativa (5 Mg/ml). Após bloqueio das placas com leite em pó desna-tado a 3% em PBS contendo Tween-20, os soros foram diluídos (1:50) namesma solução e foram incubados nas placas. O imunoensaio continuoucomo foi amplamente relatado. Soros de doador saudável foram emprega-dos como controles negativos. Ainda, soros agrupados de indivíduos vacina-dos com uma vacina recombinante contra Hepatite B foram usados comocontrole não-relacionado (dados não mostrados).
A Figura 11 mostra os resultados obtidos com 5 soros de conva-lescentes neste ensaio. Pode ser visto que os soros humanos reconhecerama proteína, que indica que ela é expressa durante a infecção meningocócicae ela é imunogênica.
Exemplo 12. Proteína NMB0606 como um veículo para um peptídeo.
Para demonstrar a capacidade carreadora da proteína recombi-nante NMB0606, ela foi conjugada a um peptídeo sintético de 15 mer, deri-vado da região V3 de proteína gp120 de HIV-1, isolato JY1. A conjugação foifeita através do método de glutaraldeído. Peptídeo JY1 livre, a proteína re-combinante NMB0606 e o conjugado JY1-NMB0606 foram administrados acamundongos adultos em um programa de 3 doses, onde os imunógenosforam emulsificados com Adjuvante de Freund. Duas semanas após a tercei-ra dose, amostras de soro foram obtidas dos animais imunizados, e as a-mostras foram analisadas através de ELISA para determinar os títulos deanticorpo antipeptídeo. Para fazer isso, as placas foram revestidas com pep-tídeo livre (20 ug/ml) e o imunoensaio continuou como foi previamente des-crito. Os resultados do experimento (Figura 12) mostram a capacidade car-readora de proteína NMB0606, capaz de significantemente potencializar aresposta de anticorpo contra peptídeo JY1, após sua conjugação.
Exemplo 13. Avaliação da resposta imune induzida após imunização comproteína NMB0606 através de via mucosal.
Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMB0606, um expe-rimento de imunização foi planejado e conduzido em camundongos, onde aproteína NMB0606 foi administrada encapsulada em Iipossomas ou adjuva-da com polissacarídeo C de N. meningitidis. Lipossomas foram obtidos atra-vés de desidratação-reidratação conforme previamente descrito (Carmenate,T. e outros (2001). Proteína Opc recombinante de Neisseria meningitidis re-constituída em Iipossomas elicita anticorpos opsônicos seguindo imunização.Biotechnol. Appl. Biochem. 34:63-69). Com essas duas preparações, ca- mundongos fêmeas Balb/C (8-10 semanas de vida) foram imunizadas. Trêsdoses de 50 pg através de via intranasal foram aplicadas, com intervalos de15 dias entre elas. A fim de analisar a resposta imune em nível mucosal, ní-veis de anticorpo IgA foram medidos em lavagens pulmonares de animaisimunizados. Na Figura 13, os níveis de anticorpo IgA detectado são mostra-dos para os dois grupos avaliados.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnologia
<120> "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO A PROTEÍNA NMB0606".
<130> PROTEÍNA NMB0606
<140>
<141>
<150> CU 2006-0075
<151> 2006-03-31
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador 0606U
<400> 1
cggagctcta gatcttcaag ctgttgcac 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador 0606L
<400> 2
ttacccggga tccacaatcg acttttgc 28
<210> 3
<211> 267
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (gupo B)
<400> 3
atgaatcaag ctgttgcaca atttgctcct ttagtgttga ttatggtggt gttctacttcctgatcatgc gtccgcagca aaagaaattc aaagcgcatc aggcaatgct tgccgccttg 120aaagtcggcg acaaagtggt cttggcggca ggtttcaagg gtaaggtaac cagagtcggc 180gaacagtttt ttaccgtgga tatcggacag ggtacaaaaa tcgaggtcga agtggaacgc 240aatgcgattg ccgcaaaagt cgattga 267
<210> 4
<211> 88
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β)
<400> 4
Met Asn Gln Ala Val Ala Gln Phe Ala Pro Leu Val Leu Ile Met Val
1 5 10 15
Val Phe Tyr Phe Leu Ile Met Arg Pro Gln Gln Lys Lys Phe Lys Ala
20 25 30
His Gln Ala Met Leu Ala Ala Leu Lys Val Gly Asp Lys Val Val Leu
35 40 45
Ala Ala Gly Phe Lys Gly Lys Val Thr Arg Val Gly Glu Gln Phe Phe
50 55 60
Thr Val Asp Ile Gly Gln Gly Thr Lys Ile Glu Val Glu Val Glu Arg65 70 75 80
Asn Ala Ile Ala Ala Lys Val Asp85
<210> 5
<211> 267
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β)
<400> 5
atgaatcaag ctgttgcaca atttgctcct ttagtgttga ttatggtggt gttctacttc 60ctgatcatgc gtccgcagca aaagaaattc aaagcgcatc aggcaatgct tgccgccttg 120aaagtcggcg acaaagtggt cttggcggca ggtttcaagg gtaaggtaac cagagtcggc 180gaacagtttt ttaccgtgga tatcggacag ggtacaaaaa tcgaggtcga agtggaacgc 240aatgcgattg ccgcaaaagt cgattga 267
<210> 6<211> 267
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β)
<400> 6
atgaatcaag ctgttgcaca atttgctcct ttagtgttga ttatggtggt gttctacttc 60
ctgatcatgc gtccgcagca aaagaaattc aaagcgcatc aggcaatgct tgccgccttg 120
aaagtcggcg acaaagtggt cttggcggca ggtttcaagg gtaaggtaac cagagtcggc 180
gaacagtttt ttaccgtgga tatcggacag ggtacaaaaa tcgaggtcga agtggaacgc 240aatgcgattg ccgcaaaagt cgattga 267
<210> 7
<211> 267
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo B)
<400> 7
atgaatcaag ctgttgcaca atttgctcct ttagtgttga ttatggtggt gttctacttc 60ctgatcatgc gtccgcagca aaagaaattc aaagcgcatc aggcaatgct tgccgccttg 120aaagtcggcg acaaagtggt cttggcggca ggtttcaagg gtaaggtaac cagagtcggc 180gaacagtttt ttaccgtgga tatcggacag ggtacaaaaa tcgaggtcga agtggaacgc 240aatgcgattg ccgcaaaagt cgattga 267
<210> 8<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador 1573
<400> 8
ttccatggta gataaaagaa tggctttag 29
<210> 9
<211> 27
<212> ADN
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador 6795
<400> 9
aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 27
Claims (17)
1. Formulação farmacêutica caracterizada por conter a proteínaNMB0606 identificada como SEQ ID NO:4.
2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1para a prevenção ou tratamento de infecções causadas por bactérias do gê-nero Neisse ria.
3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1para a prevenção ou tratamento de infecções causadas por Neisseria me-ningitidis ou Neisseria gonorrhoeae.
4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,onde a proteína NMB0606 está presente na faixa de 0,5-100 pg/dose, emuma formulação farmaceuticamente aceita.
5. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada por conter um adjuvante de vacina opcional.
6. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por conter em adição um ou vários antígenos de natureza dife-rente obtidos através de meios recombinantes, sintéticos ou naturais.
7. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter antígenos de polissacarídeo, incluindo polissacarí-deos bacterianos.
8. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 7,caracterizada por conter polissacarídeos capsulares de Neisseria meningiti-dis.
9. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter conjugados de proteína-polissacarídeo onde ocomponente polissacarídeo é um polissacarídeo bacteriano.
10. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter antígenos de peptídeo.
11. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recipienteuma resposta protetora contra infecções causadas por bactérias do gêneroNeisseria.
12. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11,caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recipienteuma resposta protetora contra infecções causadas por Neisseria meningitidisou Neisseria gonorrhoeae.
13. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 aser administrada por via parenteral ou mucosal.
14. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo uso de proteína NMB0606 sozinha, combinada ou fundi-da, como um adjuvante ou veículo para antígenos de natureza diferente.
15. Formulação farmacêutica caracterizada por conter fragmen-tos de peptídeo, ou peptídeos miméticos de antígeno de proteína NMB0606,em formulações farmaceuticamente aceitas.
16. Método para diagnóstico de uma infecção causada por bac-térias do gênero Neisseria e compreendendo a detecção de proteínaNMB0606 ou seus fragmentos, ou de uma maneira independente ou emcombinação com outros componentes, em uma amostra biológica de umindivíduo.
17. Método para diagnóstico de uma infecção causada por bac-téria do gênero Neisseria, e compreendendo a detecção do gene codificandoNMB0606, identificado como SEQ ID NO:3, ou de uma maneira independen-te ou em combinação com outros componentes, em uma amostra biológicade um indivíduo.
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