BRPI0710035A2 - beta-galactosidade com atividade transgalactosilante - Google Patents

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Abstract

BETA-GALACTOSIDASE COM ATIVIDADE TRANSGALACTOSILANTE A presente invenção está relacionada com um nova <225>-galactosidase com atividade transgalactosilante, isolada do microorganismo Bifidobacterium bifidum. A<225>-galactosidase é capaz de converter a lactose em uma mistura de galactooligossacarídeos que são <225>ligados e indesejavelmente produz a dissacarídeo galactobiose <244>-ligada. A mistura pode ser incorporada em numerosos produtos alimentícios e rações animais para a melhora da saúde intestinal, promovendo o crescimento de bifidobactéria no intestino, e reprimindo o crescimento da microflora patogênica.

Description

"BETA-GALACTOSIDASE COM ATIVIDADE TRANSGALACTOSILANTE"
A presente invenção está relacionada com um nova /?-galactosidase com atividadetransgalactosilante, capaz de converter a Iactose em uma mistura de galactooligossacarí-deos. Em particualar, está relacionada com uma /?-galactosidase isolada de uma cepa deBifidobacterium bifidum recentemente descoberta.
A invenção está relacionada particularmente com seqüências de DNA que codifi-cam a nova enzima isolada /?-galactosidase, para a enzima codificada por uma tal seqüênciade DNA e para uma célula de hospedeiro, compreendendo a seqüência de DNA ou conten-do um vetor recombinante incorporando a seqüência de DNA. A invenção também está rela-cionada com o uso da enzima codificada por uma seqüência de DNA1 ou da célula do hos-pedeiro contendo uma seqüência de DNA ou vetor recombinante, para produzir galactooli-gossacarídeos.
As bifidobactérias colonizam naturalmente o baixo trato intestinal, um meio ambien-te que é pobre em mono e dissacarídeos, já que tais açúcares são preferivelmente consu-midos pelos hospedeiros e microorganismos presentes no alto trato intestinal. A fim de so-breviver no baixo trato intestinal, as bifidobactérias produzem vários tipos de exo- e endogli-cosidases ligadas à superfície e/ou nas formas extracelulares, através das quais elas podemutilizar diversos carboidratos.
Além da atividade de hidrolase, algumas enzimas produzidas pelas bifidobactériasmostram atividade de transferase. Essa atividade de transglicosilação de glicosidases é ex-tensivamente utilizada para a síntese enzimática de vários oligossacarídeos, para os quaisjá foi provado que atuam como fatores de promoção de crescimento das bifidobactérias.
É de conhecimento que os membros das bifidobactérias produzem enzimas β-galactosidase, que estão envolvidas no metabolismo bacteriano da lactose. Moller, P.L. et alem Appl & Environ. Microbial.. (2001), 62, (5), 2276-2283 descrevem o isolamento e a carac-terização dos genes dessas três /?-galactosidases de uma cepa da bactéria Bifidobacteriumbifidum. Eles consideraram que todas essas três /?-galactosidases foram capazes tambémde catalisar a formação de galactooligossacarídeos beta-ligados através de transgalactosila-ção.
Dumortier et al em Carbohvdrate Research. 201. (1990), 115-123 descreveu a for-mação de oligossacarídeos através de uma reação de transgalactosilação durante a hidróli-se da lactose com o microorganismo Bifidobacterium bifidum DSM 20456. A sua análise daestrutura da mistura de oligossacarídeos produzida mostrou que as uniões foram uniões β-(1 —► 3), β-(1 —► 6) e /?-(1 —»4)-D-galactosil. Dumortier sugeriu que os compostos produzidospelos microorganismos Bifidobacterium bifidum estão envolvidos na aderência da bactériano intestino grosso.
WO 01/90317 descreve uma nova β-galactosidase do microorganismo β-
PI0710035-3galactosidase, em particular uma versão truncada da enzima que possui uma alta atividadetransgalactosilante.
Foi considerado que uma cepa do microorganismo Bifidobacterium bifidum é capazde produzir uma atividade da enzima galactosidase que converte a Iactose em uma novamistura de galactooligossacarídeos que contém indesejavelmente até 35% de dissacarí-deos, incluindo galabiose (Gal (α 1-6) - Gal). Esse dissacarídeo é conhecido (consultar Pa-ton, JCe Paton1 A W (1998), Clin. Microbiol. Revs.. 11, 450-479; Carlsson, K A (1989), Ann.Reviews Bichem.. 58, 309-350) por ser um anti-adesivo capaz de prevenir a adesão de toxi-nas, por exemplo, toxina de Shiga e patógenos, tais como E. coli, para a parede do intestino.
Essa cepa do microorganismo Bifidobacterium bifidum foi depositada sob o númerode acesso NCIMB 41171 na Coleção Nacional de Bactérias Industriais e Marinhas, Aberde-en, UK em 31 de março de 2003. Ela está descrita também na Patente UK N0 2 412 380.
Agora foi descoberto que essa cepa do microorganismo Bifidobacterium bifidumproduz várias /?-galactosidases, incluindo a nova ^-galactosidase. Essa enzima produz umnúmero de oligossacarídeos diferentes que são /Migados.
De acordo com essa invenção, é fornecida uma seqüência de DNA que codificauma proteína com uma seqüência de aminoácidos conforme fornecido na SEQ. ID NO: 2 ouhibridiza sob rigorosas condições para a seqüência de DNA que codifica essa proteína. Aseqüência de proteína é fornecida na SEQ. ID NO: 1 ou pode compreender um fragmentoou seu degenerativo.
A frase "degenerativo" é construída para significar uma seqüência de DNA que é nomínimo 50% homóloga para SEQ. ID NO: 1, preferivelmente 50 até 98% homóloga, maispreferivelmente de 75 até 95% homóloga.
Tal seqüência de DNA pode compreender substituições, adições ou deleções denucleotídeo, que resultam em menos do que 60%, preferivelmente menos do que 45%, maispreferivelmente menos do que 25% de mudança na seqüência de aminoácidos mostrada naSEQ. ID NO: 2. As substituições de nucleotídeo podem resultar em substituições conserva-doras de aminoácidos.
De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido uma enzima codifi-cada por uma seqüência de DNA conforme definido acima. Tal enzima pode compreender aseqüência de aminoácidos fornecida em SEQ. ID NO: 2 ou um seu fragmento.
De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um vetor recombinan-te, preferivelmente um vetor de expressão, compreendendo uma seqüência de DNA con-forme definido acima. Tal vetor pode ser incorporado em uma célula de hospedeiro, tal comouma célula bacteriana, célula de levedura ou célula de fungo. Alternativamente, a seqüênciade DNA pode ser incorporada em tal célula de hospedeiro. Uma célula de hospedeiro ade-quada pode ser selecionada do grupo que compreende Bifidobacterium, Lactococcus, Lac-tobacillus, Bacillus, por exemplo, Bacillus subtilus ou Bacillus cireulans, Eseheriehia e As-pergillus, por exemplo, Aspergillus niger.
Utilizando Iaetose como um substrato, a enzima codificada pela seqüência de DNA1conforme definido acima, produz uma mistura de oligossacarídeos, compreendendo dissa-carídeos, tais como Gal (βλ - 3) Glc, Gal (βλ - 3) Gal, Gal (βλ - 6) Gal e Gal (αλ - 6) Gal1trissacarídeos e tetrassacarídeos, tais como Gal (βλ - 6) Gal (βλ -4) Glc, Gal (βλ - 3) Gal (βλ- 4) Glc e Gal (βλ - 6) Gal (βλ - 6) Gal (βλ - 4) Glc.
A enzima ou a célula de hospedeiro, conforme descrito acima, pode ser utilizadapara produzir uma mistura de galactooligossacarídeos, que podem formar parte de um pro-duto para melhorar a saúde intestinal. Tal produto pode ser selecionado do grupo que con-siste de produtos laticínios (por exemplo, leite líquido, leite em pó, tal como leite em pó inte-gral, leite em pó desnatado, leite em pó semi-desnatado, pós a base de soro, leites parabebês, fórmulas para bebês, sorvetes, iogurte, queijo, produtos laticínios fermentados), be-bidas, tais como suco de fruta, alimentos infantis, cereais, pães, biscoitos, doces, bolos, su-plementos alimentares, produtos dietéticos, ração animal, ração para aves domésticas ou,de fato, qualquer outro alimento ou bebida. A presença de galactooligossacarídeos em taisprodutos possui a vantagem de intensificar o crescimento da Bifidobacterium que promove asaúde, no produto ou na flora intestinal do consumidor após a ingestão do produto ou am-bos.
Alternativamente, os oligossacarídeos assim produzidos podem ser utilizados paraa preparação de um medicamento, por exemplo, na forma de comprimido ou cápsula, para aprevenção da adesão de patógenos ou toxinas produzidas pelos patógenos à parede dointestino. O medicamento pode ser administrado a um paciente, por exemplo, após o cursode tratamento com antibiótico, que freqüentemente altera ou mesmo destrói a flora intestinalsadia normal.
De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo paraa produção de uma enzima conforme definido acima que compreende a cultura de uma cé-lula de hospedeiro conforme definido acima em um meio de cultura adequado sob condiçõesque permitem a expressão da enzima e a recuperação da enzima resultante ou produtos abase de enzima da cultura.
A invenção está direcionada também para um processo para a produção da misturade galactooligossacarídeos que compreende o contato da enzima conforme definido acimacom um material contendo Iactose sob condições que conduzem à formação da mistura degalactooligossacarídeo.
O material adequado contendo Iactose pode ser selecionado da lactose, leite inte-gral, leite semi-desnatado, leite desnatado, soro, leite semi-integral e soro impregnado dis-ponível comercialmente. Tais produtos laticínios podem ser obtidos de vacas, búfalos, ove-lhas e cabras. Leite semi-integral é definido como leite integral do qual foi retirada a nata,que é subseqüentemente substituída através da adição de gordura ou óleo vegetal.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ. ID NO: 1) do microorganismoBifidobacterium bifidum β-galactosidase da invenção; e
A Figura 2 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 2) correspondendo àseqüência de nucleotídeos da Figura 1.
A Figura 3 é um gráfico que mostra a reação de curso do tempo durante a síntesede galactooligossacarídeo com β-galactosidase e Iactose 40% (p/p) em tampão de fosfato0.1M em pH 6.0 como substrato; e
A Figura 4 mostra um cromatograma de troca aniônica de alto desempenho da mis-tura de galactooligossacarídeo sintetizado pela β-galactosidase do microorganismo B. bifi-dum NCIMB 41171 utilizando Iactose 40% (p/p) em tampão de fostato 0.1 M em pH 6.0 comosubstrato (Glc = glicose, Gal = galactose, Lac = lactose, α (1 - 6) = galactobiose, DP = graude polimerização).
O DNA genômico foi isolado da cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) uti-lizando o método de Lawson et ai. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. O DNAfoi digerido com enzimas de restrição e fragmentos possuindo uma dimensão máxima de 15kbp foram ligadas com o vetor pSP72, que foi digerido com as mesmas enzimas de restri-ção. As células de E. coli foram transformadas com um vetor contendo inserções consistindode Pstl, Eco RI, Bam Hl, Kpnl, Smal digerido de DNA cromossomal do microorganismo B.bifidum. Os clones com atividade β-galactosidase foram selecionados nas placas de AgarLuria Bertani contendo p-nitrofenil, X-β-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo) eisopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG). As misturas de ligação com Pst I DNA cromossomalforneceram aumento para 13 clones β-galactosidase positivos, um dos quais é identificadocomo pP2.
O seqüenciamento de DNA no fragmento P2 de DNA inserido foi realizado utilizan-do o método de Sanger de terminação de cadeia dideoxi (Russel P., 2002 iGenetics, Pear-son Education, Inc., San Francisco, 187-189), utilizando o kit de seqüenciamento de cicloV.3.0 BigDye Terminator (Applied Biosystems, USA). A seqüência de DNA de P2 é mostra-da na Figura 1 (SEQ. ID NO: 1).
A estrutura de leitura aberta (ORF) foi localizada através da utilização do IocalizadorORF da NCBI (National Center of Biotechnology Information). A seqüência de nucleotídeoda Figura 1 foi traduzida em todas as seis estruturas de leitura possíveis e uma estrutura deleitura aberta de 738 aminoácidos que codificam uma suposta β-galactosidase foi identifica-da. A tradução é mostrada na Figura 2 (SEQ. ID NO: 2).
A presente invenção será também descrita através de forma de referência para oseguinte exemplo.
Exemplo 1
Materiais e Métodos
Todos os produtos químicos e preparações de meios de cultura utilizados ao longodesse estudo foram obtidos das empresas Sigma (Dorset, UK), Invitrogen (Paisley, UK),Oxoid (Basingstoke, UK), Qiagen (West Sussex1 UK) e Promega (Southampton, UK).
Cepas de Bactérias
A cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) foi mantida em glóbulos criogênicosem tubos Microbank à temperatura de -70°C. Para experimentos posteriores, a cepa foi revi-vificada em meio Agar Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) e meio TPY (meio de extratode levedura tripticase fitona) e cresceu anerobicamente (composição de CO2 e N2, 80% e20%, respectivamente) à temperatura de 37°C durante 48 horas. A morfologia da colônia e aausência de contaminação foram testadas através de coloração de gram.
Cepas de E. coli
A cepa de Escherichia coli DH5a utilizada nesse estudo foi comumente incubadasob condições aeróbicas à temperatura de 37°C em meio agar ou caldo Luria Bertani (LB)(Sambrook J. e Russel W. D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York) e quando necessário, foi suplementada com antibióti-cos (100 //g/ml de ampicilina e/ou 15 pg/ml de cloranfenicol) e 40 μ\ de X-yff-Gal 2%, 7 μ\ deIPTG (isopropil-/?-D-tiogalactosídeo), que foram aplicados na superfície de uma placa deagar 90 mm semi-pronta.
A cepa de E. coli DH5a (Invitrogen, Paisley, UK) (genótipo: F 08O/acZAMA(/acZYA-argF)U 169 recA1 endA1 hsdR17(rk", mk")p/?oAsupE44 f/j/'-1 gyrA96re/A1A) é umacepa σ-galactosidase positiva e foi utilizada nos experimentos de expressão e para outras manipulações genéticas.
Extração de DNA Genômico do microorganismo Bifidobacterium bifidum
O DNA genômico foi isolado da cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) uti-lizando o seguinte método no qual o DNA cromossomal foi preparado da pelota de célulacoletada de 100 ml de caldo WC anaeróbio. As células foram submetidas à re-suspensão em 10 ml de tampão TES (Tris-HC110 mM, EDTA 10 mM, NaCI, pH8) e tratadas com 200 μΙde proteinase K (em 20 mg/ml) e 200 μΙ de RNase (ambos 10 mg/ml) e incubadas por umahora à temperatura de 65°C. O volume de 12 ml de fenol/clorofórmio foi adicionado e a ex-tração foi repetida até que a fase aquosa pudesse ser facilmente separada da interfase. ODNA genômico foi precipitado com isopropanol e submetido à resuspensão em Tris-HCI 10mM - EDTA 1 mM (pH8). O DNA genômico foi, então, digerido com fosfatase alcalina. Adigestão do DNA genômico do microorganismo B. bifidum foi realizada utilizando EcoRI,Pstl, BamHI, Smal e Kpnl. As misturas de ligação foram utilizadas para transformar DH5a deΕ. coli e os clones β-galactosidase positivos foram identificados como colônias azuis nasplacas contendo X-Gal.
Preparação do Vetor DNA
O vetor utilizado para clonagem e expressão ao longo de todo esse estudo foi o pSP72 (Promega, UK) (Krieg, P.A. e Melton, D. A. (1987). In vitro RNA synthesis with SP6RNA polymerase. Methods in Enzymology. 155: 397-415).
Esse vetor foi selecionado devido à falta de atividade de complementação do frag-mento a da β-galactosidase, que é codificada em pSP72. Esse vetor não carrega o segmen-to curto do DNA de E. coli contendo a seqüência regulatória e a informação codificadora para os primeiros 146 aminoácidos da β-galactosidase, que em combinação com as cepasde E. coli (isto é, DH5a), que expressam a porção carboxi-terminal dessa β-galactosidase,está fornecendo uma β-galactosidase ativa (complementação a).
O vetor foi digerido com as seguintes enzimas de restrição: Pstl, BamHI, HindIII,Smal, Kpnl e EcoRI, de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um excesso de 10 vezes a enzima sobre o DNA (unidades de enzima: μgr de DNA equivalente às dez uni-dades de enzima por uma µgr de DNA de plasmídeo ou dez unidades de enzima por 0.5pmol de DNA de plasmídeo). Após a inativação térmica da enzima (20 minutos à temperatu-ra de 65°C), os padrões de restrição foram analisados através de análise de eletroforesehorizontal com gel. A presença de um fragmento único no gel indica a completa digestão do vetor e a digestão de restrição do mesmo.
A digestão suficiente do vetor foi testada também através da transformação de mo-léculas não ligadas em células de E. coli DH5a viáveis. O número de colônias formadas emplacas de agar LB suplementadas com ampicilina (100 µg/ml) foi um indicador das molécu-las não digeridas e a base esperada durante os experimentos subseqüentes.
Os vetores também foram desfosforilados com uma fosfatase alcalina de intestinode bezerro, CIAP (Promega, Southampton, UK), de acordo com as instruções do fabricante.A eficiência do tratamento foi testada através da ligação (com T4 DNA Iigase de Bacteriófa-go, de acordo com as instruções do fabricante), após transformação nas células DH5a. Onúmero de colônias formadas mostrou o número de moléculas arredondadas (vetor não clo- nado) e uma subtração das colônias acima das colônias formadas sem o tratamento do ve-tor CIAP mostrou o número de vetores não desfosforilados.
Construção da Biblioteca de DNA Genômico
O DNA genômico foi parcialmente com seis enzimas de restrição que reconhecemfreqüentemente as seqüências de hexa-nucleotídeos, que ocorrem dentro do DNA procarió- tico. EcoRI, BamHI, Pstl, Kpnl, Smal e Hindlll são endonucleases de restrição tipo II, quereconhecem especificamente as seqüências 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3, 5'CTGCA/G'3,5'GGTAC/C3',5'CCC/GGG3' e 5'A/AGCTT3' respectivamente, e fazem o duplo filamentose quebrar dentro dessas seqüências, gerando projeções de 5 dos 4 nucleotídeos, AATT1GATC, AGCT para EcoRI, BamHI e Hindllll respectivamente, e projeções de 3, ACGT,GTAC para Pstl e Kpnl respectivamente e pontas obtusas para Smal.
Todas essas enzimas foram ativas e habilitadas para clivagem de DNA somente napresença de íons de magnésio divalente. Esses íons foram os únicos cofatores necessários.
Digestão de Restrição do DNA
Todas as digestões de restrição das amostras de DNA genômico foram incubadasdurante 2 horas à temperatura de 37°C e finalmente submetidas à inativação térmica à tem-peratura de 65°C durante 20 minutos. As reações foram, então, resfriadas até a temperaturaambiente e a quantidade adequada de tampão de carga foi adicionada, após a leve misturacom um capilar de vidro selado. As soluções, então, foram carregadas nos poços de umaplaca com gel de agarose 0.8% (fornecimento de energia de 4 - 5 volts/cm para 14-16 ho-ras) e a dimensão do DNA digerido foi estimado com aquela dos padrões de DNA de 1 kbp(Promega, UK) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).
Purificação dos fragmentos gerados após a digestão de restrição
A purificação de fragmento das misturas de reação e os géis de agarose foi realiza-da através do uso do kit de extração de gel QIAEX da empresa Qiagen (West Sussex, UK).Os protocolos estão descritos com detalhes no manual do fabricante.
Ligação e Transformação do DNA
Após a purificação dos fragmentos de DNA com o kit de extração de gel Qiaxex, e-Ies foram ligados com o vetor pSP72 tratado com CIAP. Para a ligação, as quantidades a-propriadas de DNA foram transferidas para tubos de microcentrífuga de 0.5 ml, conformemostrado na Tabela 1.
<table>table see original document page 8</column></row><table>
Tabela 1: Misturas de ligação. O tubo A mostra os números de vetor de DNA auto-ligado, que deve ser subtraído na ordem do número total de trasnformantes após a trans-formação. O tubo B mostra a ligação do vetor com os fragmentos de DNA e o tubo C mostrao controle a fim de que a transformação seja eficientemente calculada.Antes de cada ligação, os fragmentos de DNA foram aquecidos à temperatura de45°C durante 5 minutos para fundir qualquer terminal coesivo que foi submetido ao reane-Iamento durante a preparação do fragmento. Uma proporção molar do vetor: insert de DNAde 1:1 foi selecionada para todas as reações de ligação e a montagem da reação foi reali-zada de acordo com as instruções da empresa Promega.
Aos tubos AeB foram adicionados 1.0 μΙ de tampão de ligação 10x e 0.5 unidadesWeiss de T4 DNA Iigase (Promega, UK) e o volume de ligação foi ajustado para 10 μΙ comágua com grau biológico molecular. Ao tubo C foi adicionado 1.0 μΙ de tampão de ligação10x e o volume de ligação foi ajustado para 10 μΙ com água com grau biológico molecular.
Os fragmentos dê DNA foram adicionados aos tubos junto com água e, então, a-quecidos até a temperatura de 45°C durante 5 minutos para fundir qualquer terminal coesivoque tenha sido submetido ao reanelamento durante a preparação. A temperatura do DNA foiresfriada até o ponto de O0C antes que o restante dos reagentes de ligação seja adicionadoe as misturas de ligação sejam incubadas por toda a noite à temperatura de 16°C (Sambro-ok e Russell, 2001).
Após a precipitação e purificação do etanol dos fragmentos ligados (a fim de remo-ver a mistura de ligação que causa uma redução da eficiência de transformação), as trans-formações foram realizadas, de acordo com as instruções de Hanahan. Foi adicionado ~ 50ng de DNA ligado em 5 μl de solução ao volume de 100 μl de células DH5a viáveis. Após otratamento térmico e expressão do gene de resistência a ampicilina, as células foram espa-lhadas sobre a superfície das placas de LB contendo ampicilina (100 ug/ml), X-β-Gal (40 μlde X-0-Gal 2%) e IPTG (7 μl de IPTG 20%).
O número de transformantes de cada reação de ligação foi medido. O número detransformantes comumente obtido do tubo C foi de 2 χ 105 - 1 χ 106 cfu/ug enquanto do tuboA foi de 500 - 600 cfu/ug. O número de transformantes no tubo A foi uma indicação do tra-tamento eficiente do DNA do vetor. O número de transformantes no tubo B estava em umafaixa de 2 - 4 χ 104 cfu/ug.
Número de Transformantes
As misturas de ligação com DNA cromossomal Pstt forneceu aumento aos 13 clo-nes β-galactosidase positivos fora dos ~ 2500 transformantes exibidos enquanto que comSamHI forneceu aumento aos 7 clones positivos (~ 1500 transformantes exibidos), EcoRIforneceu aumento aos 3 clones positivos (~ 1300 transformantes exibidos), Kpnl forneceuaumento aos 7 clones positivos (~ 2000 transformantes exibidos), Smal forneceu aumentoaos 3 clones positivos 1600 transformantes exibidos) e HindIII forneceu aumento aos 2clones positivos (~ 1200 transformantes exibidos).
Digestão Positiva de Clone
A fim de identificar os diferentes genes da β-galactosidase, os plasmídeos isoladosdos clones positivos foram digeridos de acordo com a seguinte tabela:
<table>table see original document page 10</column></row><table>
A análise de eletroforese com gel dos fragmentos gerados após a digestão mostrouque os plasmídeos pB1, pP1, pP2 e pP11 possuem cada um insert que codifica uma dife-rente β-galactosidase. Os clones contendo P2 foram utilizados para mais análises.
Seqüenciamento de DNA
O seqüenciamento de DNA foi realizado com o método de Sanger de terminação decadeia de dideoxi através da utilização do kit de seqüenciamento de ciclo v.3.0 BigDye Ter-minator (Applied Biosystems, USA) e analisado com o ABI Prism 3100, um sistema de análi-se de DNA com base na fluorescência, incorporando eletroforese capilar.
As terminações 5' e 3' dos fragmentos de DNA do insert foram seqüenciados comos iniciadores específicos do vetor. Os inserts foram também seqüenciados através da utili-zação do Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs1 UK). O GPS-1 é um sis-tema "in vitro" com base no transposon TN7, que utiliza TnsABC Transposase para inserirTransposon randomicamente no DNA alvo. O doador: a proporção de massa do DNA alvode 1:4 foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. O número de plasmídeos alvofoi de 25. Esse número foi calculado de acordo com as instruções do fabricante e ele assu-me 5 vezes uma profundidade de cobertura.
Devido à longa seqüência de nucleotídeo do plasmídeo pP2 na qual a proteína P2foi codificada, somente a parte que continha o gene da /?-galactosidase foi selecionada paraser seqüenciada. A enzima inativada após a inserção do insert da transposase em uma po-sição relativa de 172bp do fragmento seqüenciado, indicou que o códon inicial estava nosentido contrário dessa posição. De forma similar, a inserção do insert na posição 2882bpeliminou completamente a atividade da enzima, indicando que o códon de interrupção exis-tia a partir dessa posição. Além disso, a atividade da enzima foi eliminada completamentecom a inserção dos inserts nas posições 262bp, 331 bp, 375bp, 621 bp, 866bp, 1348bp,1358bp, 1394bp, 1513bp, 1704bp, 2128bp, 2519bp com relação ao primeiro nucleotídeo quefoi seqüenciado.
A análise do domínio N-terminal com software SignaIIP e PSORT não mostrouqualquer sinal de peptídeo, indicando que P2 não é secretado no meio extracelular.
A mistura de reação de seqüenciamento continha aproximadamente 400 - 600 ngde DNA de plasmídeo, 3.2 pmol da solução de iniciador e 4 μ\ da solução BigDye Termina-tor.
Identificação da Estrutura de Leitura Aberta
A estrutura de leitura aberta (ORF) do P2 foi localizada através da utilização do Io-calizador ORF da NCBI, cujo endereço na rede éHTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). O código genético bacteriano foi utilizado e ocomprimento da estrutura foi determinado como sendo de 100 bp. A seqüência de nucleotí-deo foi traduzida em seis estruturas possíveis e uma estrutura de leitura aberta de 738 ami-noácidos que codificam uma suposta /?-galactosidase foi identificada (a tradução é mostradana Figura 2).
Exemplo 2
Síntese com enzima clonada de /?-qalactosidase isolada do microorganismo Bifido-bacterium bifidum NCIMB 41171 na célula de hospedeiro do microorganismo E.coli (cepaDH5a)
A seguinte síntese descrita, a menos que estabelecido de outra forma, foi realizadacom as células inteiras de hospedeiro DH5a de E coli após o tratamento da biomassa de E.coli (coletada através de centrigufação a 10,000 g) com tolueno a uma concentração de2000 ppm a fim de aumentar a permeabilidade celular e também fazer com que as célulasnão viáveis sejam submetidas à destruição da sua membrana citoplasmática. A biomassa deE. coli foi preparada conforme descrito no Exemplo 1 sob o título de "Cepas de E coli".
Síntese com enzima clonada
A síntese com y8-galactosidase foi realizada a uma concentração de substrato de40% (p/p) da concentração inicial de lactose. A solução de síntese foi preparada em tampãofosfato 0.1 M a um pH de 6.0 contendo adicionalmente Tween 80 1 g/l (monooleato sorbitande polioxietileno (20). A síntese foi realizada à temperatura de 40°C em banho-maria comagitação de 150 rpm. O pH ótimo para a enzima específica foi selecionado com base nasmedições de atividade (utilizando o-nitrofenil-/?-D-galactopiranosídeo como substrato) deuma preparação enzimática específica com valores variáveis de pH.
Para a síntese de galactooligossacarídeo, foi utilizado o volume de 2 ml do sobre-nadante de Iisado de célula (após a ruptura das células de E. coli através de prensa France-sa) com 8 g de Iactose 50% (p/p) a fim de fornecer uma concentração final de substrato de40% (p/p). Essa preparação enzimática possui uma atividade de 735 U/ml.
As concentrações dos diferentes açúcares presentes na mistura durante a síntesesão mostradas na Figura 3. Os cromatogramas da cromatografia de troca iônica de alto de-sempenho acoplada com detecção amperométrica com pulso (HPAEC-PAD) das misturasde galactooligossacarídeos sintetizados através da /?-galactosidase clonada do microorga-nismo B. bifidum NCIMB 41171 são mostrados na Figura 4. As concentrações de açúcar namistura de galactooligossacarídeos no ponto de tempo ótimo de síntese são mostradas naTabela 1.
Tabela 1: Composição de carboidrato da síntese de galactooligossacarídeo na con-centração de Iactose inicial de 40% (p/p) no ponto de tempo onde a concentração máximade oligossacarídeo foi observada.
<table>table see original document page 12</column></row><table>
Lac: Lactose, Glc: glicose, Gal: galactose, DP: grau de polimerizaçãoListagem de Seqüência
<110> mcdonald, sarah c<120> "PRODUTO E PROCESSO'<130> 14011:KG<150> <151> GB 0606112.1 28-03-2006<160> 2<170> Patentin versão 3.4<210> <211> <212> <213> 1 4395 dna Bifidobacterium bifidum
<220>
<221> Beta-galactosidase
<222> (1)..(4395)
<400> 1
tcctttagat tggattgaaa acttcctttt tttatgtaaa aggatattcg gggaaattcc 60ctttttgaaa atttcatgac caaaaatccc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 120cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 180gctgcttgca aacaaaaaaa cccccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 240taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 300ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 360tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 420ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 480cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 540agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 600gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 660atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 720gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 780gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 840ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 900cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 960cgattcatta atgcaggtta acctggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 1020ccggcagatc tgatatcatc gatgaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagagtcg 1080acctgcagaa gtactggcag tccggcctcg ccgccggcgc cgtcaaggag tgatctcgcg 1140ggagggccag tgtccgcttg cagcatgcgt cacgttcgtc tgacggtctt gacgtgcgcc 1200tagcggctgg ccctccctac ggaacatgta tatgatatgg agggacgctc accgtgtgcg 1260atgcgggctg gcgcgatatg gcaccagccc gcatcgcatg tcacagttga tttttcgtcg 1320atgcgacggt tcggccgggg cgtcagacaa tgaacaagta atggagcgga atatgagtaa 1380acgcagaaag cacagttggc cgcagccgct gaagggcgcc gaatcccgtc tctggtatgg 1440cggtgattac aatcccgacc aatggccgga ggaggtctgg gacgatgata tccgtctgat 1500gaagaaggcc ggcgtcaacc ttgtatcagt cggcatcttc tcatgggcga agatcgagcc 1560ggaggaaggc aagtacgatt tcgactggct ggaccgtgcc atcgataagc tcggcaaggc 1620gggcatcgct gtagacctcg cctccgccac cgcctccccg ccgatgtggc tgacccaggc 1680ccatccggag gtgctgtgga aggacgagcg cggcgacacc gtgtggccgg 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2580gatgggcacc aagacggtca agtccaaggt cgccgtcgtg ttcgactacg agtcccagtg 2640ggccaccgag tacaccgcga acccgaccca gcaggtcgat cattggaccg agccgttgga 2700ttggttccgc gcgcttgccg acaacggcat caccgccgac gtggttccgg tgcggtccga 2760ttgggattcc tacgagattg ccgtgctgcc gtgcgtgtat ttgctgtccg aagagacgag 2820ccgcagggtt cgggagttcg tggcgaacgg cggcaagttg ttcgtgacgt actacaccgg 2880attgagcgac gagaacgacc acatctggct tggcggctac ccgggctcga ttcgtgacgt 2940cgtcggcgtg cgcgtcgaag agttcgcccc gatgggcaac gacatgccgg gcgcattgga 3000tcacctcgac ctggacaatg gcacggtggc gcatgacttt gccgacgtga tcacgtccac 3060ggccgacacg tccacggtac tggcctccta taaggcggaa cgctggaccg gcatgaacga 3120ggtgccggcc atcgtggcca acgggtatgg cgacgggcgg accgtatatg tcggatgccg 3180tctgggccgt caggggcttg cgaagagcct gccggcgatg ctgggttcca tggggctgtc 3240ggacctcgcc ggtgatggcc gcgtgctgcg tgtcgaacgc gccgacgccg cggcggcgag 3300ccgcttcgag ttcgtgttca accgcaccca tgaaccggtg accgtcgacg ttgaagggga 3360ggccatcgcg gcttcgctcg cgcatgtcga cgacgggcgg gccaccatcg atccgacggg 3420tgttgtcgtg ctcaggcgat aatcgttgga aacactgggc tgtaagggct taggaaaggc 3480gtatgtttgc ggtgacacgc gacatacgcc ttatgggaaa gaaggcgctg gcgcttaccg 3540ggctgcggcg atgctggtca gcgtcgctgc gtgcggcaac tcaagcagca gctccgctcc 3600gaagcaggaa ggcgacgtca aggaaatcac cgtgtgggct tggggcctac gctgactcag 3660gtggccaagg acttcaaaaa aggagaccgg catcaatgtc aacctggtga acaccggcca 3720gggcgacaag acctgggacg agttctatca ggacgccaag aagattcaca cccttggcga 3780caactactac atcacgtccg acaccggtgt cgccggcttc tacgactcga tgacctggct 3840ggccagtgcg acgctgttct ccaccgaagg cgagacggtc accattaacc tgactggcgc 3900cccgaaggtc aaggcccgcg gtatcttcgg cgactacctt ggcaagtcct acaccggcaa 3960ccagaagctg agcgatggcg tcgccgcttt gggaacaggc tctgaaggac tacgcgaagg 4020atcagggcta caccgtcaag taaccttcgc agtcaagcaa tctggcgtgg taatgaccgg 4080aatacggtga ccttcggtca tcccttcctc gtgtgaaggc ccctcccctc aacagggagg 4140ggccttcaca tatctgcccc tgttgcaacg cgcgtgtaaa ctctacgatg agcgaattct 4200tcccgacaca tcgagcacgc taaggagatg acatgacgat atcggcacgg ttgtggcggc 4260tgcacctgca tatctttgtg ttgctcaaga tctgtgagat gacactggca gcacgcctcc 4320agcgcgccgc cggacacgcg caccctcatc accgaatgga cgggggacca tatcatgacg 4380actctgatcg ccaat 4395
<210> 2
<211> 738
<212> PRT
<213> Bifidobacterium bifidum<220>
<221> Beta-galactosidase
<222> (1)..(738)
<400> 2
Met Tyr Met Ile Trp Arg Asp Ala His Arg Val Arg Cys Gly Leu Ala1 5 10 15
Arg Tyr Gly Thr Ser Pro His Arg Met Ser Gln Leu Ile Phe Arg Arg20 25 30
Cys Asp Gly Ser Ala Gly Ala Ser Asp Asn Glu Gln Val Met Glu Arg35 40 45
Asn Met Ser Lys Arg Arg Lys His Ser Trp Pro Gln Pro Leu Lys Gly50 55 60
Ala Glu Ser Arg Leu Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp65
70
75
80
Pro Glu Glu Val Trp Asp Asp Asp Ile Arg Leu Met Lys Lys Ala Gly85 90 95
Val Asn Leu Val Ser Val Gly Ile Phe Ser Trp Ala Lys Ile Glu Pro100 105 110
Glu Glu Gly Lys Tyr Asp Phe Asp Trp Leu Asp Arg Ala Ile Asp Lys115 120 125
Leu Gly Lys Ala Gly Ile Ala vai Asp Leu Ala Ser Ala Thr Ala Ser130 135 140
Pro Pro Met Trp Leu Thr Gln Ala His Pro Glu vai Leu Trp Lys Asp145 150 155 160
Glu Arg Gly Asp Thr Val Trp Pro Gly Ala Arg Glu His Trp Arg Pro165 170 175
Thr Ser Pro vai Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Asn Leu Cys Arg Arg Met180 185 190
Ala Glu His Tyr Lys Gly Asn Pro Tyr vai Val Ala Trp His vai ser195 200 205
Asn Glu Tyr Gly Cys His Asn Arg Phe Asp Tyr Ser Asp Asp Ala Met210 215 220
Arg Ala Phe Gln Lys Trp Cys Lys Lys Arg Tyr Lys Thr Ile Asp Ala225 230 235 240
Val Asn Glu Ala Trp Gly Thr Ala Phe Trp Ala Gln His Met Asn Asp245 250 255
Phe Ser Glu Ile Ile Pro Pro Arg Tyr Ile Gly Asp Gly Asn Phe Met260 265 270
Asn Pro Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Lys Arg Phe Ser Ser Asp Ala Leu275 280 285
Lys Glu Leu Tyr Ile Ala Glu Arg Asp Val Leu Glu Ser Ile Thr Pro290 295 300
Gly Leu Pro Leu Thr Thr Asn Phe Met Val ser Ala Gly Gly Ser Met305 310 315 320
Leu Asp Tyr Asp Asp Trp Gly Ala Glu vai Asp Phe Val ser Asn Asp325 330 335
His Tyr Phe Thr Pro Gly Glu Asp His Phe Asp Glu Val Ala Tyr Ala340 345 350Ala ser Leu Met Asp Gly Ile Ser Arg Lys Glu Pro Trp Phe Gln Met355 360 365
Glu His Ser Thr Ser Ala vai Asn Trp Arg Pro Ile Asn Tyr Arg Ala370 375 380
Glu Pro Gly Ser vai Val Arg Asp Ser Leu Ala Gln Val Ala Met Gly385 390 395 400
Ala Asp Ala Ile Cys Tyr Phe Gln Trp Arg Gln Ser Lys Ala Gly Ala405 410 415
Glu Lys Trp His Ser ser Met Val Pro His Ala Gly Glu Asp Ser Gln420 425 430
Ile Phe Arg Asp Val Cys Glu Leu Gly Ala Asp Leu Gly Arg Leu Ser435 440 445
Asp Glu Gly Leu Met Gly Thr Lys Thr Val Lys Ser Lys vai Ala Val450 455 460
Val Phe Asp Tyr Glu ser Gln Trp Ala Thr Glu Tyr Thr Ala Asn Pro465 470 475 480
Thr Gln Gln Val Asp His Trp Thr Glu Pro Leu Asp Trp Phe Arg Ala485 490 495
Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Ala Asp Val Val Pro Val Arg ser Asp500 505 510
Trp Asp Ser Tyr Glu Ile Ala vai Leu Pro Cys Val Tyr Leu Leu Ser515 520 525
Glu Glu Thr Ser Arg Arg Val Arg Glu Phe vai Ala Asn Gly Gly Lys530 535 540
Leu Phe vai Thr Tyr Tyr Thr Gly Leu ser Asp Glu Asn Asp His Ile545 550 555 560
Trp Leu Gly Gly Tyr Pro Gly ser Il e Arg Asp Val Val Gly Val Arg565 570 575
Val Glu Glu Phe Ala Pro Met Gly Asn Asp Met Pro Gly Ala Leu Asp580 585 590
His Leu Asp Leu Asp Asn Gly Thr Val Ala His Asp Phe Ala Asp Val595 600 605
Ile Thr Ser Thr Ala Asp Thr Ser Thr Val Leu Ala Ser Tyr Lys Ala610
615
620
Glu Arg Trp Thr Gly Met Asn Glu Val Pro Ala Ile Val Ala Asn Gly
Tyr Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr Val Gly Cys Arg Leu Gly Arg Gln645 650 655
Gly Leu Ala Lys Ser Leu Pro Ala Met Leu Gly ser Met Gly Leu Ser660 665 670
Asp Leu Ala Gly Asp Gly Arg Val Leu Arg Val Glu Arg Ala Asp Ala675 680 685
Ala Ala Ala Ser Arg Phe Glu Phe Val Phe Asn Arg Thr His Glu Pro690 695 700
vai Thr vai Asp Val Glu Gly Glu Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala His705 710 715 720
vai Asp Asp Gly Arg Ala Thr Ile Asp Pro Thr Gly vai Val Val Leu
625
630
635
640
725
730
735
Arg Arg

Claims (18)

1. Seqüência de DNA1 CARACTERIZADA pelo fato dea) codificar uma proteína com uma seqüência de aminoácidos conforme fornecidona SEQ. ID. NO: 2, oub) hibridizar sob condições rigorosas de hibridização para a seqüência de a), ouc) é um degenerativo da seqüência de a) ou b).
2. Seqüência de DNA1 de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelofato da seqüência ser fornecida na SEQ. ID. NO: 1 ou um seu fragmento.
3. Seqüência de DNA1 de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,CARACTERIZADA pelo fato da citada seqüência compreender substituições, adições oudeleções de nucleotídeo que resultam em menos do que 60% de mudança, preferivelmentemenos do que 45% de mudança, mais preferivelmente menos do que 25% de mudança naseqüência de aminoácidos, de acordo com a SEQ. ID NO: 2 ou um seu fragmento.
4. Seqüência de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,CARACTERIZADA pelo fato da citada seqüência compreender substituições de nucleotí-deo, que resultam nas substituições conservadoras de aminoácido.
5. Uma enzima, CARACTERIZADA pelo fato de ser codificada por uma seqüênciade DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.
6. Uma enzima, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma seqüência deaminoácidos, de acordo com a SEQ. ID NO: 2 ou um seu fragmento.
7. Uma /?-galactosidase, CARACTERIZADA pelo fato de possuir uma seqüênciaconforme definido na SEQ. ID NO: 2.
8. Um vetor recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma se-qüência de DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.
9. O vetor, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato do citadovetor ser um vetor de expressão.
10. Uma célula de hospedeiro, CARACTERIZADA pelo fato de compreender umaseqüência de DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.
11. Uma célula de hospedeiro, CARACTERIZADA pelo fato de compreender o ve-tor, de acordo com qualquer a reivindicação 8 ou reivindicação 9.
12. Uma célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação-11, CARACTERIZADA pelo fato da citada célula ser uma célula bacteriana, uma célula delevedura ou uma célula de fungo.
13. Uma célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADA pelo fato da citada célula ser selecionada do grupo que consiste de Bifi-dobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus e Aspergillus.
14. Uma célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADA pelo fato da célula ser selecionada do grupo que consiste de Bifidobac-terium bifidum, Bacillus subtilus, Bacillus circulans e Aspergillus niger.
15. Uso de uma enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7,ou uma célula de qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, CARACTERIZADA pelo fatode produzir uma mistura de oligossacarídeos.
16. Uso de uma enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7,ou uma célula de qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, CARACTERIZADA pelo fatode produzir uma mistura de oligossacarídeos para ser parte de um produto selecionado dogrupo que consiste de produtos laticínios, tais como leite líquido, leite em pó, tal como leiteem pó integral, leite em pó desnatado, leite em pó semi-desnatado, pós a base de soro, lei-tes para bebês, fórmulas para bebês, sorvetes, iogurte, queijo, produtos laticínios fermenta-dos, bebidas, tais como suco de fruta, alimentos infantis, cereais, pães, biscoitos, doces,bolos, suplementos alimentares, produtos dietéticos, produtos comestíveis probióticos, pro-dutos comestíveis prebióticos, ração animal, ração para aves domésticas e medicamentos.
17. Uso de uma célula de hospedeiro, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 10 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de produzir um produto selecionado do grupoque consiste de produtos laticínios, tais como leite líquido, leite em pó, tal como leite em póintegral, leite em pó desnatado, leite em pó semi-desnatado, pós a base de soro, leites parabebês, fórmulas para bebês, sorvetes, iogurte, queijo, produtos laticínios fermentados, bebi-das, tais como suco de fruta, alimentos infantis, cereais, pães, biscoitos, doces, bolos, su-plementos alimentares, produtos dietéticos, produtos comestíveis probióticos, produtos co-mestíveis prebióticos, ração animal, ração para aves domésticas e medicamentos.
18. Processo para produção de uma enzima, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 5 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a cultura de uma célulade hospedeiro, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, em um meio decultura adequado sob condições que permitem a expressão da citada enzima e recuperaçãoda enzima resultante da cultura.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0525857D0 (en) * 2005-12-20 2006-02-01 Product and process
US9637746B2 (en) 2008-12-15 2017-05-02 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways
AU2009347008B2 (en) 2009-05-27 2013-08-15 Clasado Limited Method of preventing diarrhoea
AU2010255150B2 (en) * 2009-06-05 2014-02-27 Amano Enzyme Inc. Beta-galactosidase derived from Bacillus circulans
EP2566953B1 (en) * 2010-05-07 2019-01-02 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation
EP2611922A1 (en) 2010-08-31 2013-07-10 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation
RU2523581C2 (ru) * 2012-10-12 2014-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ AsBgl 1390 ИЗ АРХЕИ SACCHAROVORANS В КАЧЕСТВЕ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, БЕТА-КСИЛОЗИДАЗЫ И БЕТА-МАННОЗИДАЗЫ
HK1216547A1 (zh) 2012-12-21 2016-11-18 Greenlight Biosciences Inc. 用於將甲烷轉化成燃料、丙酮酸或異丁醇的無細胞系統
AU2014306074B2 (en) 2013-08-05 2018-08-30 Greenlight Biosciences, Inc. Engineered proteins with a protease cleavage site
BR112017020690A2 (pt) 2015-03-30 2018-06-26 Greenlight Biosciences Inc produção livre de células de ácido ribonucleico
RU2609646C2 (ru) * 2015-04-30 2017-02-02 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КГУ") Модифицированный вариант гена LacZ из E. coli, кодирующий стабилизированный вариант белка, для использования в качестве транскрипционного репортера в Yarrowia lipolytica
KR102563261B1 (ko) * 2015-12-31 2023-08-07 엘지디스플레이 주식회사 전도성 코팅액 조성물, 이를 이용한 정전기 방지막 및 표시장치
CA3020312A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Greenlight Biosciences, Inc. Cell-free production of ribonucleic acid
EP3565892A4 (en) 2017-01-06 2020-10-07 Greenlight Biosciences, Inc. Cell-free production of sugars
ES3057273T3 (en) 2017-04-11 2026-02-27 Kerry Group Services Int Ltd Lactase enzymes with improved properties
US12435326B2 (en) 2017-04-11 2025-10-07 Kerry Group Services International Ltd Lactase enzymes with improved properties
CN110678479A (zh) 2017-04-11 2020-01-10 科·汉森有限公司 性能改善的乳糖酶
FI3609909T3 (fi) 2017-04-11 2025-09-03 Kerry Group Services Int Ltd Laktaasientsyymit, joilla on parannettu aktiivisuus matalissa lämpötiloissa
KR102894284B1 (ko) 2017-10-11 2025-12-03 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물
BR112021007244A2 (pt) * 2018-10-17 2021-08-10 Chr. Hansen A/S enzimas lactase com propriedades melhoradas em ph ácido
RU2698460C1 (ru) * 2019-03-28 2019-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Способ получения рекомбинантной в-1,4-галактозидазы bgaa из streptococcus pneumoniae
WO2021037986A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Chr. Hansen A/S Production of lactase enzymes using altered regulation strains

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2723618A1 (de) * 1977-05-25 1978-11-30 Wolfgang Dockhorn Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der dichte einer beschwerten spuelfluessigkeit einer tief-, insbesondere einer oelbohrung
US4435389A (en) 1980-07-07 1984-03-06 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Composition for promoting growth of bifidobacteria
EP0089940A1 (en) 1982-03-23 1983-09-28 BioCarp AB Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides
JPS6259290A (ja) 1985-09-09 1987-03-14 Riyoushiyoku Kenkyukai イソラフイノ−ス及びその製造方法
JP2711095B2 (ja) 1986-09-27 1998-02-10 ユニチカ株式会社 ビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤の製造法
DK199887D0 (da) 1987-04-15 1987-04-15 Danisco Bioteknologi As Gaerstamme
JP2518663B2 (ja) 1987-12-24 1996-07-24 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法
FR2640997A1 (en) 1988-12-22 1990-06-29 Ajinomoto Kk Process for the manufacture of a galactose transfer product.
JP2819312B2 (ja) 1989-07-18 1998-10-30 焼津水産化学工業株式会社 Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法
JP2819313B2 (ja) 1989-07-18 1998-10-30 焼津水産化学工業株式会社 Ｎ―アセチルラクトサミンの製造方法
CA2027835A1 (en) 1990-01-19 1991-07-20 William D. Prevatt Strains of phaffia rhodozyma containing high levels of astaxanthin
JP2750767B2 (ja) 1990-02-21 1998-05-13 雪印乳業株式会社 新規糖アルコール
JP2952439B2 (ja) 1991-11-26 1999-09-27 株式会社ホーネンコーポレーション 新規飲食品素材
JPH05146296A (ja) * 1991-11-27 1993-06-15 Yakult Honsha Co Ltd β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
FI95319C (fi) * 1993-05-12 1996-01-10 Borealis Polymers Oy Menetelmä ja laitteisto näytteen ottamiseksi
JP2904687B2 (ja) 1993-09-17 1999-06-14 雪印乳業株式会社 新規オリゴ糖
FR2723963B1 (fr) 1994-08-31 1997-01-17 Gervais Danone Co Preparation de produits fermentes par streptococcus thermophilus, enrichis en galacto-oligosaccharides et en beta-galactosidase
JP3037576B2 (ja) * 1995-01-26 2000-04-24 コーエイ工業株式会社 濾液測定方法およびその装置
JP3246296B2 (ja) 1995-11-09 2002-01-15 宇部興産株式会社 半溶融金属の成形方法
JPH1023898A (ja) 1996-07-10 1998-01-27 Meiji Milk Prod Co Ltd Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の新規な製造法
KR100245383B1 (ko) 1996-09-13 2000-03-02 정훈보 교차홈 형성 전열관 및 그 제조 방법
JP2894293B2 (ja) 1996-09-17 1999-05-24 不二製油株式会社 ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９
EP1084228A1 (en) * 1998-06-09 2001-03-21 U.S. Department of Agriculture GENES CODING FOR TOMATO beta-GALACTOSIDASE POLYPEPTIDES
NL1010770C2 (nl) 1998-12-09 2000-06-13 Nutricia Nv Preparaat dat oligosacchariden en probiotica bevat.
JP3049693B1 (ja) 1998-12-10 2000-06-05 ソフィアインターナショナル株式会社 端末ターミナル
FR2789086B1 (fr) 1999-02-03 2003-01-31 Alain Rambach Procede de detection de bacteries cultivees en condition anaerobie
KR20080045766A (ko) * 2000-05-26 2008-05-23 아를라 푸즈 에이엠비에이 비피도박테륨에서 단리한 베타-갈락토시다제
EP1227152A1 (en) 2001-01-30 2002-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Bacterial strain and genome of bifidobacterium
US6905594B2 (en) * 2002-10-11 2005-06-14 G6 Science Corp. Filter apparatus and methods to capture a desired amount of material from a sample suspension for monolayer deposition, analysis or other uses
GB0229015D0 (en) 2002-12-12 2003-01-15 Novartis Nutrition Ag New Compound
GB0303716D0 (en) 2003-02-18 2003-03-19 Mars Uk Ltd Food product and process
KR100857500B1 (ko) * 2003-06-30 2008-09-08 클라사도 인크. 신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물 및 그 제조방법
US7111503B2 (en) * 2004-01-22 2006-09-26 Datalog Technology Inc. Sheet-form membrane sample probe, method and apparatus for fluid concentration analysis
GB0522740D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Clasado Inc Process for the production of oligosaccharides
CN101095698B (zh) 2006-06-26 2010-12-01 青岛东海药业有限公司 酪酸梭菌防治便臭毒素引起的相关症状和疾病的用途
GB0809921D0 (en) 2008-05-30 2008-07-09 Clasado Inc Product and process therefor

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