BRPI0710076A2

BRPI0710076A2 - compostos com base em imidazol, composições compreendendo-os e métodos de seu uso

Info

Publication number: BRPI0710076A2
Application number: BRPI0710076-0A
Authority: BR
Inventors: David J Augeri; Jeffrey Bagdanoff; Lakmal W Boteju; Kenneth G Carson; Theodore C Jessop; S David Kimball
Original assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2011-08-02
Also published as: US7649098B2; EA200870292A1; PT2010501E; WO2007100617A2; US20100076030A1; US8093267B2; IL193297A; EP2010501A2; US20070208063A1; NO20084024L; US8404732B2; JP2009527564A; EP2090334A2; NZ570308A; ECSP088692A; EP2090334A3; SG170024A1; PL2010501T3; AU2007221265A1; US20130005775A1

Abstract

<B>COMPOSTOS COM BASE EM IMIDAZOL, COMPOSIçõES COMPREENDENDO-OS E MéTODOS DE SEU USO<D>São descritas compostos com base em imidazol, composições compreendendo-os, e os métodos de seu uso para o tratamento, prevenção ou controle de distúrbios e doenças inflamatórias ou autoimunes. Os compostos particulares são de Fórmula I.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS-TOS COM BASE EM IMIDAZOL, COMPOSIÇÕES CÕMPREENDENDO-OSE MÉTODOS DE SEU USO".

Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Patente dosEstaidos Unidos 11/698.253, depositado em 25 de Janeiro de 2007, e Pedi-dos de Patente dos Estados Unidos N-: 60/776.473, depositado em 24 defevereiro de 2006, e 60/815.221, depositado em 20 de Junho de 2006, todosos quais são incorporados aqui por referência.

1. CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a compostos com base em imidazol, emétodos de seus uso para o tratamento, prevenção e controle de várias do-enças e distúrbios.

2. ANTECEDENTES

Esfingosina-1-fosfato (S1P) é uma molécula bioativa com efeitospotentes sobre os sistemas de órgão múltiplos. Saba, J.D. e Hla, T. Circ.Res. 94:724-734 (2004). Embora alguns acreditem que o composto é ummensageiro secundário intracelular, seu modo de ação é ainda um objeto dedebate. Id. Realmente, seu metabolismo é ainda pouco conhecido. Hla, T.,Science 309:1682-3 (2005). Pesquisadores atualmente acreditam que S1P éformado pela fosfarilação de Esfingosina, e degradado por desfosforilaçãoou clivagem. Sua clivagem no fosfato de etanolamina e um aldeído de ca-deia longa é reportadamente catalizados por S1P liase. Id.] Pyne & Pyne,Biochem J. 349:385-402 (2000).

Esfingosina-1-fosfato liase é uma enzima dependente de vitami-na B6 localizada na membrana do retículo endoplásmico. Van Veldhoven eMannaerts, J. Biol. Chem. 266:12502-12507 (1991); Van Veldhoven eMannaerts, Adv. Lipid. Res. 26:69 (1993). O polinucleotídeo e seqüências deaminoácido de SP1 liase humano e seus produtos de gene são descritos noPedido de Patente PCT Ne. WO 99/16888.

Recentemente, Schwab e colaboradores concluíram que umcomponente de 2-acetil-4-tetraidroxibutilimidazol, cor caramelo Ill (TI), inibea atividade de S1P liase quando administrado a camundongos. Schwab, S. eoutro, Science 309:1735-1739 (2005). Enquanto outros têm postulado que Tlexerce seus efeitos por um mecanismo diferente (veja, por exemplo, Pyne,S.G.. ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112 (2000)), é claro que a adminis-tração do composto a ratos e camundongos induz Iinfopenia e causa o acú-mulo de células T maduras no timo. veja, por exemplo, Schwab, supra-, Py-ne, S.G.. ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112 (2000); Gugsyan, R., e ou-tro, Immunoloav 93(3):398-404 (1998); Halweg, K.M. e Büchi, G.,J.Org.Chem. 50:1134-1136 (1985); Patente dos Estados Unidos 4.567.194de Kroeplien e Rosdorfer. Ainda, não existem relatos conhecidos de Tl tendoum efeito imunológico em animais diferentes de camundongos e ratos. Em-bora a Patente dos Estados Unidos 4.567.194 afirme que Tl e alguns com-postos relacionados podem ser úteis como agentes medicinais imunossu-pressores, estudos do composto em humanos não encontraram nenhumefeito imunológico. Veja, Thuvander, A. e Oskarsson, A., Fd. Chem. Toxic.

32(1):7-13 (1994); Houben, G.F., e outro, Fd. Chem. Toxic. 30(9):749-757(1992).

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

e sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos (por exemplo, hidratos) des-tes, em que: X é O ou NR3; R1 é ORiA, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila,alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou hetero-cicloalquila opcionalmente substituída; R2 é OR2A, C(O)OR2a, hidrogênio,halogênio, nitrilo, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, hete-rociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; R3é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio; R4 é OR4A,OC(O)R4a, hidrogênio, halogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, he-

Esta invenção está direcionada, em parte a compostos de Fór-mula I:

<formula>formula see original document page 3</formula>teroalquila, heterociclo, alquilheterociclo ou heterocicloalquila opcionalmentesubstituída; R5 é N(R5A)2, hidrogênio, hidróxi, ou alquila, arila, alquilarila, ari-lalquila, heteroaiquila, heterociclo, alquilheterocilo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída; e cada qual de Ria, R2A, R3A, R4A, e R5A é indepen-dentemente hidrogênio ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroaiquila,heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída.

Esta invenção também abrange composições farmacêuticascompreendendo compostos de Fórmula I, e métodos de tratamento de dis-túrbios e doenças inflamatórias utilizando compostos de Fórmula I.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Certos aspectos desta invenção podem ser entendidos com refe-rência às seguintes figuras:

A figura 1 fornece um plote de ponto de citometria de fluxo re-presentativo mostrando o efeito de controle de veículo (VC), um compostoda invenção (Composto 1), e Tl sobre a composição de célula T (CD4+ eCD8+) de timo, e a média/desvio padrão para todos os camundongos (n = 3).

A figura 2 fornece um plote de ponto de FACS representativomostrando o efeito de controle de veículo (VC), um composto da invenção(Composto 1), e Tl sobre um subgrupo de células CD4+ (emigrantes tímicosrecentes) em camundogos.

A figura 3 fornece um plote de ponto de FACS representativomostrando o efeito de controle de veículo (VC), um composto da invenção(Composto 1), e Tl sobre um subgrupo de células CD8+ (emigrantes tímicosrecentes) em camundogos.

A figura 4 mostra os efeitos de controle de veículo, TI, Composto1, e 1-(4-metil-5-((1S,2R,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)tiazol-2-il)etanona (Com-posto 2) sobre contagens de sangue total de camundongos.

A figura 5 mostra o efeito de dosagem oral única de um compos-to da invenção sobre artrite induzida por colágeno em camundogos.

A figura 6 mostra o efeito de dosagem oral única de um compos-to da invenção sobre a célula sangüínea branca e contagens de linfócito demacacos cinomolgos.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA

Esta invenção resulta, em parte, de estudos de camundongos degene rompido por S1P liase, e refere-se grandemente a compostos acredita-dos serem úteis no tratamento, prevenção e/ou controle de distúrbios e do-enças autoimunes e inflamatórias.

5.1. Definições

A menos que de outro modo indicado, o termo "alquenila" signifi-ca um hidrocarboneto de cadeia linear, ramificada e/ou cíclica tendo de 2 a20 (por exemplo, 2 a 10 ou 2 a 6) átomos de carbono, e incluindo pelo me-nos uma ligação dupla de carbono-carbono. Porções alquenila representati-vas incluem vinila, alila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-l-butenila* 2-metil-2-buteni!a, 2,3-dimetil-2-buteniia, 1-hexenila, 2-hexenila, 3-hexenila, 1-heptenila, 2-heptenila, 3-heptenila, 1-octenila, 2-octenila, 3octeniia, 1-nonenila, 2-nonenila, 3-nonenila, 1-decenila, 2-decenila e 3-decenila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "alquila" significaum hidrocarboneto de cadeia linear, ramificado e ou cíclica ("cicloalquila")tendo de 1 a 20 (por exemplo, 1 a 10 ou 1 a 4) átomos de carbono. Porçõesalquila tendo de 1 a 4 carbonos são referidas como "alquila inferior." Exem-plos de grupos alquila incluem, porém não estão limitados à, metila, etila,propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, pentila, hexila, isoexila, heptila,4,4-dimetilpentila, octila, 2,2,4-trimetilpentila, nonila, decila, undecila e dode-cila. Porções cicloalquila podem ser monocíclicas ou multicíclicas, e exem-plos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, e adamantila.Exemplos adicionais de porções alquila têm porções lineares, ramificadas e/ou cíclicas (por exemplo, 1 -etil-4-metil-cicloexila). O termo "alquila" incluihidrocarbonetos saturados bem como porções alquenila è alquinila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "alquilarila" ou"alquil-arila" significa uma porção alquila ligada a uma porção arila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "alquilheteroarila"ou "alquil-heteroarila" significa uma porção alquila ligada a uma porção hete-roarila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "alquilheterociclo"ou "alquil-heterociclo" significa uma porção alquila ligada a uma porção hete-rociclo.

A menos que dè outro modo indicado, o termo "alquinila" signifi-ca um hidrocarboneto de cadeia linear, ramificada ou cíclica tendo de 2 a 20(por exemplo, 2 a 20 ou 2 a 6) átomos de carbono, e incluindo pelo menosuma ligação tripla de carbono-carbono. Porções alquinila representativasincluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1 -butinila, 4-pentinila, 1-hexinila, 2-hexinila, 5-hexinila, 1-heptinila, 2-heptinila, 6-heptinila, 1-octinila, 2-octinila, 7-octinila, 1-noninila, 2-noninila, 8-noninila, 1-decinila, 2-decinila e 9-decinila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "alcóxi" significaum grupo -O-alquila. Exemplos de grupos alcóxi incluem, porém não estãolimitados a, -OCH3, -OCH2CH3, -O(CH2)2CH3, -O(CH2)3CH3, -O(CH2)4CH3, e-O(CH2)5CH3.

A menos que de outro modo indicado, o termo "arila" significaum anel aromático ou um sistema de anel aromático ou parcialmente aromá-tico composto de átomos de carbono e hidrogênio. Uma porção arila podecompreender múltiplos anéis ligados ou fundidos entre si. Exemplos de por-ções arila incluem, porém não estão limitados à, antracenila, azulenila, bife-nila, fluorenila, indan, indenila, naftila, fenantrenila, fenila, 1,2,3,4-tetraidro-naftaleno, e tolila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "arilalquila" ou"aril-alquila" significa uma porção arila ligada a uma porção alquila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "agente de redu-ção de linfócito circulante" significa um composto que tem um CLRF mais doque cerca de 20 por cento.

A menos que de outro modo indicado, o termo "fator de reduçãode linfócito circulante" ou "CLRF" significa a diminuição no número de linfóci-tos circulantes em camundogos causada por administração oral de uma do-se única de um composto em 100 mg/kg, como determinado pelo métododescrito nos Exemplos, abaixo.

A menos que de outro modo indicado, os termos "halogênio" e"halo" abrangem flúor, cloro, bromo e iodo.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heteroalquila"refere-se a uma porção alquila (por exemplo, linear, ramificada ou cíclica)em que pelo menos um de seus átomos de carbono foi substituído com umheteroátomo (por exemplo, Ν, O ou S).

A menos que de outro modo indicado, o termo "heteroarila" sig-nifica uma porção arila em que pelo menos um de seus átomos de carbonofoi substituído com um heteroátomo (por exemplo, Ν, O ou S). Exemplosincluem, porém não estão limitados à, acridinila, benzimidazolila, benzofura-nila, benzoisotiazolila, benzoisoxazolila, benzoquinazolinila, benzotiazolila,benzoxazolila, furila, imidazolila, indolila, isotiazolila, isoxazoiiia, oxadiazolila,oxazolila, ftalazinila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pi-rimidila, pirrolila, quinazolinila, quinolinila, tetrazolila, tiazolila, e triazinila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heteroarilalquila"ou "heteroaril-alquila" significa uma porção heteroarila ligada a uma porçãoalquila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heterociclo" refe-re-se a um sistema de anel ou anel aromático, parcialmente aromático ounão aromático monocíclico ou policíclico compreendido de carbono, hidrogê-nio e pelo menos um heteroátomo (por exemplo, Ν, O ou S). Um heterociclopode compreender múltiplos anéis (isto é, dois ou mais) fundidos ou ligadosentre si. Heterociclos incluem heteroarilas. Exemplos incluem, porém nãoestão limitados à, benzo[1,3]dioxolila, 2,3-diidro-benzo[1,4]dioxinila, cinolini-la, furanila, hidantoinila, morfolinila, oxetanila, oxiranila, piperazinila, piperidi-nila, pirrolidinonila, pirrolidinila, tetraidrofuranila, tetraidropiranila, tetraidropi-ridinila, tetraidropirimidinila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiopiranila e valerolac-tamila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heterocicloalqui-la" ou "heterociclo-alquila" refere-se a uma porção heterociclo ligada a umaporção alquila.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heterocicloalqui-la" refere-se a um heterociclo não aromático.

A menos que de outro modo indicado, o termo "heterocicloalqui-lalquila" ou "heterocicloalquil-alquila" refere-se a uma porção heterocicloal-quila ligada a uma porção alquila.

A menos que de outro modo indicado, os termos "controlar,""controlando" e "controle" abrangem a prevenção da recorrência da doençaou distúrbio específico em um paciente que sofreu anteriormente da doençaou distúrbio, e/oü alongamento do tempo que um paciente sofreu da doençaou distúrbio permanece em remissão. Os termos abrangem a modulação doprincípio, desenvolvimento e/ou duração da doença ou distúrbio, ou mudan-ça da maneira que um paciente responde à doença ou distúrbio.

A menos que de outro modo indicado, o termo "sais farmaceuti- camente aceitáveis" refere-se a sais preparados a partir bases ou ácidosnão tóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluindo bases e ácidos inorgâni-cos e bases e ácidos orgânicos. Sais de adição de base farmaceuticamenteaceitáveis adequados incluem, porém não estão limitados a, sais metálicosfeitos de alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio e zinco ou sais or-gânicos feitos de lisina, Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina,dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metilglucamina) e procaína.Ácidos não tóxicos adequados incluem, porém não estão limitados a, ácidosinorgânicos e orgânicos tais como ácidos acéticos, algínicos, antranílicos,benzenossulfônicos, benzóicos, canforsulfônicos, cítricos, etenossulfônicos, fórmicos, fumáricos, furóicos, galacturônicos, glucônicos, glucurônicos, glu-tâmicos, glicólicos, hidrobrômicos, hidroclóricos, isetiônicos, lácticos, maléi-cos, málicos, mandélicos, metanossulfônicos, múcicos, nítricos, pamóicos,pantotênicos, fenilacáticos, fosfóricos, propiônicos, salicílicos, esteáricos,sucínicos, sulfanílicos, sulfúricos, tartáricos, e ácido p-toluenossulfônico. Á-cidos não tóxicos específicos incluem ácidos hidroclóricos, hidrobrômicos,fosfóricos, sulfúricos, e metanossulfônicos. Exemplos de sais específicos,desse modo, incluem sais de cloridrato e mesilato. Outros são bem conheci-dos na técnica. Veja, por exemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences(18ê edição, Mack Publishing, Easton PA: 1990) e Remington: The Science ePractice of Pharmacy (19§ edição, Mack Publishing, Easton PA: 1995).

A menos que de outro modo indicado, os termos "prevenir,""prevenindo" e "prevenção" contemplam uma ação que ocorre antes do pa-ciente começar a sofrer da doença ou distúrbio específico, que inibe ou re-duz a gravidade da doença ou distúrbio. Em outras palavras, os termos a-brangem a profilaxia.

A menos que de outro modo indicado, uma "quantidade profilati-camente eficaz" de um composto é uma quantidade suficiente para preveniruma doença ou condição, ou um ou mais sintomas associados com a doen-ça ou condição, ou prevenir sua recorrência. Uma quantidade profilaticamen-te eficaz de um composto significa uma quantidade de agente terapêutico,sozinha ou em combinação com outros agentes, que fornecem um benefícioprofilático na prevenção da doença. O termo "quantidade profilaticamenteeficaz" pode abranger uma quantidade que melhora a profilaxia total ou real-ça a eficácia profilática de outro agente profilático.

A menos que de outro modo indicado, o termo "agente de realcede nível de S1P" significa um composto que tem um SLEF de pelo menoscerca de 10-vezes.

A menos que de outro modo indicado, o termo "fator de realcede nível de S1P" ou "SLEF" significa um aumento em S1P nos baços de ca-mundongos causado por administração oral de uma dose única de um com-posto em 100 mg/kg, como determinado pelo método descrito nos Exem-pios, abaixo.

A menos que de outro modo indicado, o termo "mistura estereoi-somérica" abrange misturas racêmicas bem como misturas estereomerica-mente enriquecidas (por exemplo, R/S = 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45,60/40, 65/35 e 70/30).

A menos que de outro modo indicado, o termo "estereomerica-mente puro" significa uma composição que compreende um estereoisômerode um composto e é substancialmente livre de outros estereoisômeros da-quele composto. Por exemplo, uma composição estereomericamente purade um composto tendo um estereocentro será substancialmente livre do es-tereoisômero oposto do composto. Uma composição estereomericamentepura de um composto tendo dois estereocentros será substancialmente livrede outros diastereômeros do composto. Um composto estereomericamentepuro compreende mais do que cerca de 80% por peso de um estereoisôme-ro do composto e menos do que cerca de 20% por peso de outros estereoi-sômeros do composto, mais do que cerca de 90% por peso de um estereoi-sômero do composto e menos do que cerca de 10% por peso dos outrosestereoisômeros do composto, mais do que cerca de 95% por peso de umestereoisômero do composto e menos do que cerca de 5% por peso dosoutros estereoisômeros do composto, mais do que cerca de 97% por pesode um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 3% por pesodos outros estereoisômeros do composto, ou mais ao que cerca de 99% porpeso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 1% porpeso dos outros estereoisômeros do composto.

A menos que de outro modo indicado, o termo "substituído,"quando usado para descrever uma porção ou estrutura química, refere-se aum derivado daquela porção ou estrutura em que um ou mais de seus áto-mos de hidrogênio são substituídos com uma porção química ou grupo fun-cional tal como, porém não limitado a, álcool, aldeído, alcóxi, alcanoilóxi, al-coxicarbonila, alquenila, alquila (por exemplo, metila, etila, propila, t-butila),alquinila, alquilcarbonilóxi (-OC(O)alquil), amida (-C(O)NH-alquil- ou -alquilNHC(O)alquil), amidinil (-C(NH)NH-alquila ou -C(NR)NH2), amina (pri-mária, secundária e terciária tal como alquilamino, arilamino, arilalquilamino),aroíla, arila, arilóxi, azo, carbamoíla (-NHC(O)O-alquil- ou -OC(O)NH-alquil),carbamila (por exemplo, CONH2, bem como CONH-alquila, CONH-arila, eCONH-arilalquil), carbonila, carboxiía, ácido carboxílico, anidrido de ácidocarboxílico, cloreto de ácido carboxílico, ciano, éster, èpóxido, éter (por e-xemplo, metóxi, etóxi), guanidino, halo, haloalquila (por exemplo, -CCI3,-CF3, -C(CF3)3), heteroalquila, hemiacetal, imina (primária e secundária), iso-cianato, isotiocianato, cetona, nitrilo, nitro, oxo, fosfodiéster, sulfeto, sulfo-namido (por exemplo, SO2NH2), sulfona, sulfonila (incluindo alquilsulfonila,arilsulfonila e arilalquilsulfonila), sulfóxido, tiol (por exemplo, sulfidrila, tioéter)e uréia (-NHCONH-alquil-).

A menos que de outro modo indicado, uma "quantidade terapeu-ticamente eficaz" de um composto é uma quantidade suficiente para forne-cer um benefício terapêutico no tratamento ou controle de uma doença oucondição, ou para retardar ou minimizar um ou mais sintomas associadoscom a doença ou condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto significa uma quantidade de agente terapêutico, sozinho ou emcombinação com outras terapias, que fornecem um benefício terapêutico notratamento ou controle da doença ou condição. O termo "quantidade tera-peuticamente eficaz" pode abranger uma quantidade que melhora a terapiatotal, reduz ou evita os sintomas ou causas de uma doença ou condição, ourealça a eficácia terapêutica de outro agente terapêutico.

A menos que de outro modo indicado, os termos "tratar," "tratan-do" e "tratamento" contemplam uma ação que ocorre enquanto um pacienteestá sofrendo da doença ou distúrbio específico, que reduz a gravidade dadoença ou distúrbio, ou retarda ou atrasa a progressão da doença ou distúrbio.

A menos que de outro modo indicado, o termo "incluem" tem omesmo significa como "incluem, porém não estão limitados a," e o termo "in-clui" tem o mesmo significa como "inclui, porém não está limitado a." Simi-larmente, o termo "tal como" tem o mesmo significa como o termo "tal como,porém não está limitado a."

A menos que de outro modo indicado, um ou mais adjetivos i-mediatamente precedendo uma série de substantivos devem ser construídoscomo aplicando-se a cada qual dos substantivos. Por Exemplo, a frase "al-quila, arila, ou heteroarila opcionalmente substituída" tem o mesmo significacomo "alquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ouheteroarila opcionalmente substituída."

Deve ser observado que uma porção química que faz parte deum composto maior pode ser descrita aqui utilizando um nome comumentede acordo com ela, quando ela existe como uma molécula simples ou umnome comumente de acordo com seu radical. Por exemplo, os termos "piri-dina" e "piridila" são de acordo com o mesmo significado quando usadospara descrever uma porção ligada a outras porções químicas. Desse modo,as duas frases "ΧΟΗ, em que X é piridila" e "ΧΟΗ, em que X é piridina" sãode acordo com o mesmo significado, e abrangem os compostos piridin-2-ol,piridin-3-ol e piridin-4-ol.

Deve ser também observado que se a estereoquímica de umaestrutura ou uma porção da estrutura não estiver indicada com, por exemplo,linhas negritas óu tracejadas, a estrutura ou a porção da estrutura deve serinterpretada como abrangendo todos os estereoisômeros dela. Entretanto,qualquer átomo mostrando em um desenho com valências não satisfeitas éassumido estar ligado a átomos suficientes de hidrogênio para satisfazer asvalências. Além disso, ligações químicas descritas com uma linha sólida pa-ralela a uma linha tracejada abrangem tanto as ligações simples quanto asduplas (por exemplo, aromáticas), se as valências permitirem.

5.2. Compostos

Esta invenção encompasses compostos de Fórmula I:

<formula>formula see original document page 12</formula>

e sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos (por exemplo, hidratos) des-te, em que: X é O ou NR3; Ri é ORm, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila,alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou hetero-cicloalquila opcionalmente substituída; R2 é OR2A, C(0)0R2a> hidrogênio,halogênio, nitrilo, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, hete-rociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; R325 é OR3A, N(R3A)2, NHC(O)R3A, NHSO2R3A, ou hidrogênio; R4 é OR4A,OC(O)R4A, hidrogênio, halogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, he-teroalquila, heterociclo, alquilheterociclo ou heterocicloalquila opcionalmentesubstituída; R5 é N(R5A)2, hidrogênio, hidróxi, ou alquila, arila, alquilarila, ari-lalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterocilo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída; e cada qual de R1A, R2A1 R3A1 R4a> β R5A é indepen-dentemente hidrogênio ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila,heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituí-da.

Compostos!particulares de Fórmula I são tais que se X for O, Rrserá alquila dentre 1 a 4 átomos, fenila, benzila ou feniletiía; R2 será hidro-gênio; e um dentre R4 e R5 será hidroxila; o outro dentre R4 e R5 não seráalquila de 1 a 6 carbonos, hidroxialquila de 1 a 6 carbonos, poliidroxialquilade 1 a 6 carbonos tendo até uma hidroxila por carbono, poliacetilalquila de 1a 6 carbonos tendo até uma acetila por carbono, fenila, benzila ou feniletiía.

Em modalidades particulares, o composto não é 2-acetil-4-tetraidroxibutiümidazoi, 1-(4-(1,1,2,2,4-pentaidroxibutÍI)-1H-imidazol-2-il)etanona, tetraacetato de 1-(2-acetil-1H-imidazol-4-il)butano-1,1,2,2-tetrail,ou pentaacetato de 1-(2-acetil-1H-imidazol-4-il)butano-1,1,2,2,4-pentail.

Uma modalidade particular abrange compostos de Fórmula II:

<formula>formula see original document page 13</formula>

e sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos destes, em que: X é O ouNR3; Ri é ORm, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila,heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcional-mente substituída; R2 é OR2A, C(O)OR2A1 hidrogênio, halogênio, nitrilo, oualquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheteroci-clo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; R3 é 0R3A, N(R3a)2,NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio; R6 é 0R6A, OC(O)R6a, N(R6b)2,NHC(O)R6b, hidrogênio, ou halogênio; R7 é 0R7A, OC(O)R7a, N(R7b)2,NHC(O)R7b, hidrogênio, ou halogênio; R8 é OR8a, OC(O)R8a, N(R8b)2,NHC(O)R8B, hidrogênio, ou halogênio; R9 é CH2OR9a, CH2OC(O)R9a,N(R98)2, NHC(O)R9b, hidrogênio, ou halogênio; cada qual de RiA, R2A, R3A,R6a, R7A, ReA e R9a é independentemente hidrogênio ou alquila, arila, alquila-rila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloal-quila opcionalmente substituída; e cada qual de R6b, R7B, Rsb e R9B é inde-pendentemente hidrogênio ou alquila opcionalmente substituída com oumais grupos hidróxi ou halogênio;

Compostos particulares de Fórmula Il são tais que: 1) se X for O,R1 será alquila de 1 a 4 átomos, fenila, benzila ou feniletila, e R2 será hidro-gênio, pelo menòs dois dentre R6, R7, Re e R9 não serão hidroxila ou acetato;2) se X for O, Ri será metila, R2 será hidrogênio, R6 e R7 serão ambos hidro-xila, e um dentre R8 e R9 será hidrogênio, o outro não será NHC(0)R9b; 3) seX for O, Ri será ORia, Ria será hidrogênio Ou alquila inferior, e R2 será hi-drogênio, pelo menos um, porém não todos, dentre R6, R7, Re e R9 será hi-droxila ou acetato.

Compostos particulares da invenção são de Fórmula ll(a):

<formula>formula see original document page 14</formula>

Outros são de Fórmula III:

<formula>formula see original document page 14</formula>

em que: Z é alquila opcionalmente substituída; R1 é ORiA, NHOH, hidrogê-nio, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilhe-terociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; R2 é 0R2A,C(0)0R2a, hidrogênio, halogênio, nitrilo, ou alquila, arila, alquilarila, arilalqui-Ia1 heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcio-nalmente substituída; R3 é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidro-gênio; e cada qual de RiA) R2A, e R3a é independentemente hidrogênio oualquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheteroci-clo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída.

Outra modalidade da invenção abrange compostos de Fórmula

<formula>formula see original document page 15</formula>

e sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos destes, em que: Ri é ORiA,ΝΗΟΗ, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, hete-rociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; R3é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio; R6 é 0R6A,OC(O)R6a, N(R6b)2, NHC(O)R6b, hidrogênio, ou halogênio; R7 é 0R7A,OC(O)R7a, N(R7b)2, NHC(O)R7b, hidrogênio, ou halogênio; R8 é 0R8A,lê OC(O)R8a, N(R8b)2, NHC(O)R8b, hidrogênio, ou halogênio; R9 é CH2OR9a,CH2OC(O)R9a, N(R9b)2, NHC(O)R9b, hidrogênio, ou halogênio; e cada qualde RiA, R3a, R6a, R7a,'R8a e R9a é independentemente hidrogênio ou alquila,arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ouheterocicloalquila opcionalmente substituída.

Os compostos particulares são de Fórmula IV(a):

<formula>formula see original document page 15</formula>Com respeito a cada uma das Fórmulas mostradas acima quecontêm as porções descritas abaixo, certas modalidades da invenção sãotais que:

Em algumas, X é O. Em outras, X é NR3.

Em algumas, Ri é hidrogênio. Em outras, Ri é alquila inferioropcionalmente substituída. Em outras, Ri é NHOH. Em outras, Ri é ORm eR-ia é, por exemplo, hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

Em algumas, R2 é hidrogênio. Em outras, R2 não é hidrogênio.Em outras, R2 é nitrilo. Em outras, R2 é alquila inferior opcionalmente substi-tuída. Em outras, R2 é OR2A. Em outras, R2 é C(O)OR2A- Em algumas, R2A éhidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

Em algumas, R3 é 0R3A. Em outras, R3 é N(R3a)2 ou NHC(O)R3a.Em outras, R3 é NHSO2R3a. Em algumas, R3a é hidrogênio ou alquila inferioropcionalmente substituída. Em outras, R3a é heterociclo ou arila opcional-mente substituída.

Em algumas, R4 é 0R4A. Em outras, R4 é halogênio.

Em algumas, R5 é N(R5a)2. Em outras, R5 é hidrogênio. Em ou-tras, R5 é hidroxila. Em outras, R5 é heteroalquila (por exemplo, alcóxi). Emoutras, R5 é alquila opcionalmente substituída. Em outras, R5 é arila opcio-nalmente subsituída.

Em algumas, um ou mais de R6, R7, Re. e Rg é hidróxi ou halogênio. Em al-gumas, todos de R6, R7, Re, e Rg são hidroxila ou acetato.

Em algumas, Z é alquila opcionalmente substituída com uma oumais porções hidroxila, acetato ou halogênio.

Os compostos da invenção podem conter um ou mais estereo-centros, e podem existir como misturas racêmicas de enantiômeros ou mis-turas de diastereômeros. Esta invenção abrange formas estereomericamen-te puras de tais compostos, bem como misturas daquelas formas. Os este-reoisômeros podem ser assimetricamente sintetizados ou resolvidos utili-zando técnicas padrão tais como colunas quirais ou agentes de resoluçãoquiral. Veja, por exemplo, Jacques, J., e outro, Enantiomers, Racemates andResolutions (Wiley Interscience, Nova Iorque, 1981); Wilen, S. H., e outro,Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel1 Ε. L., Stereochemistry of Carbon Com-postos (McGraw Hill, NY1 1962); e Wilen1 S. H., Tables of Resolving Agentsan Optical Resolutions, p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press,Notre Dame, IN, 1972).

Esta invenção também abrange as mistura estereoisoméricas decompostos descritas aqui. Ela também abrange isômeros configuracionaisde compostos descritos aqui, ou em mistura ou em forma substancialmentepura ou pura, tal como isômeros eis (Z) e trans (E) de alceno e isômeros esyn e anti-oxima.

Os compostos preferidos da invenção são agentes de reduçãode linfócito circulantes. Certos compostos inibem a quantidade de linfócitoscirculantes, como determinado utilizando o método descrito nos Exemplos,por mais do que cerca de 20, 50, 75, 100, 150 ou 200 por cento. A este res-peito, descobriu-se que enquanto Tl é capaz de reduzir linfócitos circulantesem camundogos, muitos análogos e derivados de TI, tais como 1-(4-metil-5-((1S,2R,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)tiazol-2-il)etanona, têm pouco ou nenhumefeito sobre os linfócitos circulantes, a despeito de relatos ao contrário. Veja,WO 97/46543.

Sem serem limitados pela teoria, compostos da invenção sãosupostos realizarem a série de reação metabólica de S1P, e podem inibirS1P Iiase diretamente ou indiretamente in vivo. Compostos particulares sãoos agentes de realce de nível de S1P. Certos compostos aumentam a quan-tidade de S1P, como.determinado utilizando o método descrito abaixo nosExemplos, por mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, ou 30 vezes.

Os compostos da invenção podem ser preparados por métodosconhecidos na técnica (por exemplo, variando e adicionando-se aos méto-dos descritos em Pyne, S.G., ACGC Chem. Res. Comm. 11:108-112 (2000);Halweg, K.M. e Büchi, G., J.Orq.Chem. 50:1134-1136 (1985)). Os compos-tos podem também ser feitos pelos métodos descritos abaixo e variantesdestes, que será evidente para aqueles versados na técnica.5.3. Métodos de Uso

Esta invenção abrange um método de modulação (por exemplo,aumento) da quantidade de S1P em um paciente (por exemplo, um camun-dongo, rato, cão, gato ou humano) em necessidade disto, que compreendeadministrar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto da invenção(isto é, um composto descrito aqui).

Outra modalidade abrange um método de redução do número decélulas T no sangue de um paciente, que compreende administrar ao paci-ente uma quantidade eficaz de um composto da invenção.

Outra modalidade abrange um método de tratamento, controleou prevenção de uma doença afetada por (ou tendo sintomas afetados por)níveis de S1P, que compreende administrar a um paciente em necessidadedisto uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de umcomposto da invenção.

Outra modalidade abrange a método de supressão da respostaimune em um paciente, que compreende administrar ao paciente uma quan-tidade eficaz de um composto da invenção.

Outra modalidade abrange um método de tratamento, controleou prevenção de um distúrbio ou doença autoimune ou inflamatória, quecompreende administrar a um paciente em necessidade disto uma quantida-de terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto da inven-ção. Exemplos de doenças e distúrbios incluem espondilite ancilosante, as-ma (por exemplo, asma bronquial), dermatite atópica, doença de Behcet,doença do enxerto versus hospedeiro, síndrome Kawasaki, lúpus eritemato-so, esclerose múltipla, miastenia grave, polinose, psoríase, artrite psoriática,escleroderma, rejeição de transplante (por exemplo, de órgão, célula ou me-dula óssea), diabetes tipol, e uveíte.

Doenças e distúrbios adicionais incluem doença de Addison,síndrome anti-fosfolipídeo, gastrite atrófica autoimune, acloridria autoimune,doença celiálica, Doença de Crohn, Síndrome de Cushing, dermatomiosite,Síndrome de Goodpasture, Doença Grave, tiróide de Hashimoto, atrofia a-drenal idiopática, trombocitopenia idiopática, Síndrome Lambert-Eaton, pen-figóide, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, cirrose biliáriaprimária, colangite esclerosante primária, síndrome de Reiter, Raynauds,policondrite reincidente, Síndrome de Schmidt, Síndrome de Sjogren, oftal-mia simpática, Arterite de Takayasu, arterite temporal, tirotoxicose, coliteulcerativa, e granulomatose de Wegener.

A quantidade, rotina de administração e escala de dosagem deum composto dependerá de fatores tais como da indicação específica a sertratada, prevenida, ou controlada, e da idade, sexo e condição do paciente.Os papéis desempenhados por tais fatores são bem conhecidos na técnica,e podem ser acomodados por experimentos de rotina. Em uma modalidadeparticular, um composto da invenção é administrado a um paciente humanoem uma quantidade de cerca de 0,5,1, 2,5 ou 5 mpk.5.4. Formulações Farmacêuticas

Esta invenção abrange composições farmacêuticas compreen-dendo um ou mais compostos da invenção. Certas comjDOsições fármacêutl·cas são em forma de dosagem unitária para administração orai, mucosai(por exemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal, ou retal), parenteral (por e-xemplo, subcutânea, intravenosa, injeção de bolo, intramuscular, ou intra-arterial), ou transdérmica a um paciente. Exemplos de formas de dosagemincluem, porém não estão limitados a: comprimidos, capselas; cápsulas, taiscomo cápsulas de gelatina elásticas moles; selos; pastilhas; lozangos; dis-persões; supositórios; ungüentos; cataplasmas (cataplasmas); pastas; pós;curativos; cremes; emplastros; soluções; emplastros; aerossóis (por exem-plo, inaladores ou sprays nasais); géis; formas de dosagem líquidas ade-quadas para administração oral ou mucosai a um paciente, incluindo sus-pensões (por exemplo, suspensões líquidas aquosas e não aquosas, emul-sões óleo-em-água, ou emulsões água-em-óleo), soluções, e elixires; formasde dosagem líquidas adequadas para administração parenteral a um pacien-te; e sólidos estéreis (por exemplo, sólidos cristalinos ou amorfos) que po-dem ser reconstituídos para fornecer formas de dosagem líquidas adequa-das para administração parenteral a um paciente.

A formulação deve ajustar-se ao modo de administração. Porexemplo, administração oral requer revestimentos para proteger os compos-tos desta invenção da degradação dentro do trato gastrointestinal. Similar-mente, uma formulação pode conter ingredientes que facilitam a liberaçãodo(s) ingrediente(s) ativo(s) para o sítio de ação. Por exemplo, os compostospodem ser administrados em formulações lipossômicas, a fim de protegê-losdas enzimas degradativas, facilitar o transporte no sistema circulatório, erealizar a liberação através de membranas celulares para sítios intracelula-res.

Similarmente, compostos poucos solúveis podem ser incorpora-dos em formas de dosagem líquidas (e formas de dosagem adequadas parareconstituição) com o auxílio de agentes de solubilização, emulsificantes etensoativos tais como, porém não limitado à, ciclodextrinas (por exemplo, a-ciclodextrina, β-ciclodextrina, Captisol®, e Encapsin™ (veja, por exemplo,Davis e Brewster, 2004, Nat. Rev. Drua Pise. 3:1023-1034), Labrasol®, La-brafil®, Labrafac®, cremafor, e solventes não aquosos, tal como, porém nãolimitados a, álcool stílico, álcool isopropílico, carbonato de etiia, acetato deetila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno gli-col, formamida de dimetila, sulfóxido de dimetila (DMSO), óleos biocompatí-veis (por exemplo, óleos de caroço de algodão, amendoim, ,milho, germe,oliva, rícino, e gergelim), glicerol, álcool de tetraidrofurfurila, polietileno gli-cóis, ésteres de ácido graxo de, e misturas destes (por exemplo, DMSO: ó-leo de milho).

Compostos pouco solúveis podem também ser incorporados emsuspensões utilizando outras técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo,nanopartículas de um composto podem ser suspensas em um líquido parafornecer uma nanossuspensão (veja, por exemplo, Rabinow, 2004, NatureRev. Druq Pise. 3:785-796). Formas de nanopartículas de compostos descri-tas aqui podem ser preparadas pelos métodos descritos nas Publicações dePatente dos Estados Unidos NQs. 2004-0164194, 2004-0195413, 2004-0251332, 2005-0042177 A1, 2005-0031691 A1, e Patentes dos Estados U-nidos N2S. 5.145.684, 5.510.118, 5.518.187, 5.534.270, 5.543.133,5.662.883, 5.665.331, 5.718.388, 5.718.919, 5.834.025, 5.862.999,6.431.478, 6.742.734, 6.745.962, as totalidades de cada quais são incorpo-radas aqui por referência. Em uma modalidade, a forma de nanopartículacompreende partículas tendo um tamanho de partícula médio de menos doque cerca de 2000 nm, menos do que cerca de 1000 nm, ou menos do quecerca de 500 nm.

A composição, forma, e tipo de uma forma de dosagem variarãodependendo de seu uso. Por exemplo, uma forma de dosagem usada notratamento agudo de uma doença pode conter quantidades maiores de umou mais dos ingredientes ativos que ele compreende, do que uma forma dedosagem usada no tratamento crônico da mesma doença. Similarmente,uma forma de dosagem parenteral pode conter quantidades menores de umou mais dos ingredientes ativos que ele compreende, do que uma forma dedosagem usada para tratar a mesma doença. Estes e outros modos em queformas de dosagem específicas abrangidas por esta invenção variarão umada outra, serão facilmente evidentes para aqueles versados na técnica. Veja,por exemplo, RemingtG,n's Pharmaceutical Sciences, 18ã edição, Mack Pu-blishing, Easton PA (1990).

5.4.1. Formas de Dosagem Oral

As composições farmacêuticas da invenção adequadas paraadministração oral podem ser apresentadas como formas de dosagem dis-cretas, tais como, porém não limitadas a, comprimidos (por exemplo, com-primidos mastigáveis), capselas, cápsulas, e líquidos (por exemplo, xaropesaromatizados). Tais formas de dosagem contêm quantidades pre-determinadas de ingredientes ativos, e podem ser preparadas por métodosde farmácia bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por e-xemplo, Remington's Pharmaceuticai Sciences, 18ã edição, Mack Publishing,Easton PA (1990).

Formas de dosagem oral típicas são preparadas combinando-seo(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura íntima com pelo menos um exci-piente de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais.Excipientes podem tomar uma ampla variedade de formas dependendo daforma de preparação desejada para administração.

Por causa de sua facilidade de administração, comprimidos ecápsulas representam as formas de unidade de dosagem oral mais vantajo-sas. Se desejado, comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosasou não aquosas padrão. Tais formas de dosagem podem ser preparadas pormétodos convencionais de farmácia. Em geral, formas de dosagem e com-posições farmacêuticas são preparadas misturando-se uniformemente e in-timamente os ingredientes ativos com veículos líquidos, veículos sólidos fi-namente divididos, ou ambos, e em seguida modelando o produto na apre-sentação desejada se necessário. Desintegrantes podem ser incorporadosnas formas de dosagem líquidas para facilitarem a rápida dissolução. Lubrifi-cantes podem também ser incorporados para facilitarem a fabricação deformas de dosagem (por exemplo, comprimidos).

5.4.2. Formas de Dosagem Parenteral

Formas de dosagem Parenteral podem ser administradas a pa-cientes por várias rotinas incluindo, porém não limitado às subcutâneas. in-travenosas (incluindo injeção de bolo), intramuscuiares, e intra-arteriais. Porque sua administração tipicamente desvia as defesas naturais do pacientecontra contaminantes, formas de dosagem parenteral são especificamenteestéreis ou capazes de serem esterilizadas antes da administração a umpaciente. Exemplos de formas de dosagem parenteral incluem, porém nãoestão limitados às soluções prontas para injeção, produtos secos prontos aserem dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitávelpara injeção, e emulsões.

Veículos adequados que podem ser usados para fornecer for-mas de dosagem parenteral da invenção são bem conhecidas por aquelesversados na técnica. Exemplos incluem, porém não estão limitados à: Águapara Injeção USP; veículos aquosos tais como, porém não limitados à, Inje-ção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção deDextrose e Cloreto de Sódio, e Injeção de Ringer Lactada; veículos miscíveisem água tais como, porém não limitados a, álcool etílico, polietileno glicol, epolipropileno glicol; e veículos não aquosos tais como, porém não limitadosa, óleo de milho, óleo de caroço de algodão, óleo de amendoim, óleo degergelim, oleato de etila, miristato de isopropila, e benzoato de benzila.5.4.3. Formas de dosagem Transdérmica. Tópica e MucosalFormas de dosagem Transdérmica, tópica e mucosal incluem,porém não estão limitadas às, soluções oftálmicas, sprays, aerossóis, cre-mes, loções, ungüentos, géis, soluções, emulsões, suspensões, ou outrasformas conhecidas por alguém versado na técnica. Veja, por exemplo, Re-mington's Pharmaceutical Sciences, 16- e 18â edições, Mack Publishing,Easton PA (1980 & 1990); e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,4a edição, Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Formas de dosagem trans-dérmica incluem emplastros "tipo reservatório" ou "tipo matriz", que podemser aplicados à pele e usado durante um período específico de tempo parapermitir a penetração de uma quantidade desejada de ingredientes ativos.

Excipientes adequados (por exemplo, veículos e diluentes) eoutros materiais que podem ser usados para fornecer formas de dosagemtransdérmica, tópica e mucosal são bem conhecidos por aqueles versadosnas técnicas farmacêuticas, e dependem do tecido particular ao qual umadeterminada dosagem ou composição farmacêutica será aplicada.

Dependendo do tecido específico a ser tratado, componentesadicionais podem ser usados antes de, em combinação com , ou subse-qüente ao tratamento com ingredientes ativos da invenção. Por exemplo,realçadores de penetração podem ser usados para ajudar na liberação deingredientes ativos ao tecido.

O pH de uma forma de dosagem ou composição farmacêutica,ou do tecido ao qual a forma de dosagem ou composição farmacêutica éaplicado, pode também ser ajustado para melhorar a liberação de um oumais ingredientes ativos. Similarmente, a polaridade de um veículo de sol-vente, sua intensidade iônica, ou tonicidade podem ser ajustadas para me-lhorar a liberação. Compostos tais como estearatos podem também ser adi-cionados às formas de dosagem ou composições farmacêuticas para vanta-josamente alterar a hidrofiIicidade ou Iipofilicidade de um ou mais ingredien-tes ativos a fim de melhorar a liberação. A este respeito, estearatos podemservir como veículo de lipídeo para a formulação, como um agente emulsifi-cante ou tensoativo, e como um agente de realce de penetração ou realcede liberação. Diferentes sais, hidratos ou solvatos dos ingredientes ativospodem ser usados também para ajustar as propriedades da composição re-sultante.

6. EXEMPLOS

Aspectos desta invenção podem ser entendidos a partir dos se-guintes Exemplos, que não limitam seu escopo.

6.1. Camundonqos de Gene Rompido por S1P Lisase

Captura de gene é um método de mutagênese insercional alea-tório que usa um fragmento de codificação de DNA pa:ra um gene marcadorselecionável ou repórter como um mutagênico. Os vetores de captura degene foram designados para interagirem nos íntrons ou exons de uma ma-neira que permite a maquinaria de ligação celular ligar os exons codificadospor vetor aos mRNAs celulares. Vetores de captura de gene tipicamentecontêm seqüências marcadoras selecionáveis que são precedidas por fortesseqüências receptoras de ligação e não são precedidas por um promotor.Desse modo, quando tais vetores integram-se em um gene, a maquinaria deligação celular liga os exons do gene capturado na extremidade 5' da se-qüência marcadora selecionável. Tipicamente, tais genes marcadores sele-cionáveis podem apenas ser expressos se o vetor codificando o gene estiverintegrado em um íntron. Os eventos de captura de gene resultantes sãosubseqüentemente identificados selecionando quanto às células que podemsobreviver à cultura seletiva.

Células-tronco embriônicas (derivadas de Linhagem de murinoA129) foram mutadas por um processo envolvendo a inserção de pelo me-nos uma porção de uma seqüência de vetor geneticamente construída nogene de SP1 liase. As células-tronco embriônicas mutadas foram em segui-da microinjetadas em blastocistos, que foram seqüencialmente introduzidosem hospedeiras fêmeas pseudo-grávidas e levadas a termo utilizando méto-dos estabelecidos. Neste caso, o vírus foi inserido entre os 1 e 2, e rompeu ogene SP1 liase. Os animais quiméricos resultantes foram subseqüentementecriados para produzir filhotes capazes de transmissão de linha germinativade um alelo contendo a mutação construída no gene SP1 liase.

Técnicas úteis para romper um gene em uma célula, e especi-almente uma célula ES, que pode anteriormente ter um gene rompido sãodescritas nas Patentes dos Estados Unidos N9s. 6.136.566; 6.139.833 e6.207.371 e Pedido de Patente dos Estados Unidos Ns. 08/728,963, cadados quais são incorporados aqui por referência em suas totalidades.6.2. Efeitos Hematolóqicos de Rompimento de S1P Liase

O sangue total foi coletado por sangramento retro-orbital e colo-cado em um tubo de coleta de sangue capilar que continha EDTA. O sanguefoi analisado utilizando o analisador Cell-Dyn 3500R (Abbott Diagnostics). Oanalisador emprega tecnologia dual para fornecer a base para uma identifi-cação diferencial de célula sangüínea branca (WBC) de cinco partes. Sepa-ração por Dispersão Polarizada de Múltiplos Ângulos (M.A.P.S.S.) fornece acontagem de célula sangüínea branca e informação diferencial, enquanto aimpedância fornece informação adicional na presença de linfócitos frágeis ecélulas sangüíneas vermelhas hipotonicamente resistentes.

Aproximadamente 135 microlitros de sangue total foram aspira-dos no analisador utilizando uma bomba peristáltica. Quatro técnicas deAvaliação independente foram utilizadas pelo Sistema Cell-Dyn 3500R (Ab-bott, IL) para obter os parâmetros hematológicos. A contagem ótica de WBC(WOC) e os dados diferenciais de WBC foram avaliados no canal de fluxoótico, resultante na identificação das subpopulações de WBC (neutrófilos,linfócitos, monócitos, eosinófilos, e basófilos) para o WBC de cinco partesdiferencial. A contagem de Impedância de WBC (WIC) foi avaliada em umcanal de impedância elétrica. Os dados de plaqueta e RBC foram avaliadosem um segundo canal de impedância elétrica. A hemoglobina foi avaliada nocanal espectrofotométrica. A amostra foi aspirada, diluída, misturada, e asavaliações para cada parâmetro foram obtidos durante cada ciclo de instru-mento. Os parâmetros de análise hematológicos obtidos foram contagem decélula sangüínea branca, neutrófilo, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófi-los, células sangüíneas vermelhas, hemoglobina, hematócrito', plaquetas, amplitude de distribuição de célula vermelha, volume corpuscular médio evolume plaquetário médio.

As amostras de sangue foram obtidas a partir de um total de 16camundongos. A análise e comparação das amostras de sangue foram obti-das a partir de sete camundongos tipo selvagem, seis camundongos hetero-zigotos e três camundongos homozigotos. Não existem diferenças associa-das com genótipo significantes entre camundongos de diferentes gruposcom respeito às contagem de célula sangüínea (RBC) vermelha, níveis dehemoglobina, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular médio,concentração de hemoglobina corpuscular médio, contagem de plaqueta ouvolume de plaqueta médio. Existem diferenças em amplitude de hematócritodistribuição de célula vermelha. O hematócrito médio em camundongos ho-mozigotos (-/-) foi 37 ± 2,56 por cento, em camundongos heterozigotos (+/-),40,9 ± 4 por cento e em camundongos tipo selvagem (+/+) foi de 44,7 ± 2,7por cento. A amplitude de distribuição de células sangüíneas vermelhas emcamundongos homozigotos (-/-) foi de 25,2 ± 4,2 por cento, em camundon-gos heterozigotos (+/-), 17,6 ± 1,3 por cento e camundongos tipo selvagem(+/+) foi de 17,2 ±2 porcento.

Similarmente, camundongos deficientes de SP1 Iiase não tinhamnenhuma diferença significante nas contagens totais de célula sangüíneabranca como comparado aos camundongos heterozigotos ou tipo selvagem.Camundongos homozigotos (-/-) tinham uma contagem total de célula san-güínea branca de 7200 ± 700 células/μΙ. Camundongos heterozigotos (+/-)tinham uma contagem total de célula sangüínea branca de 6200 ± 1800 cé-lulas/μΙ e camundongos tipo selvagem (+/+) tinham uma contagem total decélula sangüínea branca de 7200 ± 2600 células/μΙ.

Nos camundongos que foram homozigotos quanto ao rompimen-to de S1P liase, a contagem de linfócito foi diminuída, ao mesmo tempo emque o número de neutrófilos, monócitos, eosinófilos, e basófilos foi aumenta-do. As contagens de linfócito de sangue de camundongos homozigotos (-/-)durante o rompimento no gene de SP1 liase foram grandemente reduzidas.A contagem média de linfócito em camundongos homozigotos (-/-) foi de 847±139 células/μΙ, em camundongos heterozigotos (+/-) a contagem de linfóci-to médio foi de 4582 ± 2364 células/μΙ, em oposição à contagem média delinfócito em camundongos tipo selvagem (+/+) que foi de 6126 ± 2151 célu-las/μl.

Ao contrário, contagem média de neutrófilo em camundongoshomozigotos (-/-) foi de 5020 ±612 células/μΙ, enquanto em camundongosheterozigotos (+/-) a contagem média de neutrófilo foi 1380 ± 1140 células/μΙe camundongos tipo selvagem (+/+) tinham a contagem média de neutrófilode apenas 886 ± 479 células/μΙ. Similarmente, a contagem média de monó-cito em camundongos homozigotos (-/-) foi de 950 ±218 células/μΙ, enquan-to em camundongos heterozigotos (+/-) a contagem média de monócito foide 250 ± 108 células/μΙ e em camundongos tipo selvagem (+/+) a contagemmédia de monócito foi de apenas 146 ± 92 células/μΙ. Igualmente com eosi-nófilos, a contagem média de eosinófilo em camundongos homozigotos (-/-)foi de 247 ± 297 células/μΙ, enquanto em camundongos heterozigotos (+/-) acontagem média de eosinófilo foi de 8 ± 8 células/ylj^ern camundongos tiposelvagem (+/+)'a contagem média de eosinófilo foi de apenas 14 ± 21 céiu-las/μl.

O mesmo foi real de basófilo. A contagem média de basófilo emcamundongos homozigotos (-/-) foi de 130 ± 90 células/μΙ, em camundongosheterozigotos (+/-) a contagem média de basófilo foi de 7 ± 5 células/μΙ e emcamundongos tipo selvagem (+/+) a contagem média de basófilo foi de ape-nas 16 ± 11 células/μΙ.

• Similarmente, a contagem média de monócito em camundongoshomozigotos (-/-) foi de 950 ± 218 células/μΙ, enquanto em camundongosheterozigotos (+/-) a contagem média de monócito foi de 250 ± 108 célu-las/μl e em camundongos tipo selvagem (+/+) a contagem média de monóci-to foi de apenas 146 ± 92 células/μΙ. Igualmente com, a contagem média deeosinófilo em camundongos homozigotos (-/-) foi de 247 ± 297 células/μΙ,enquanto em camundongos heterozigotos (+/-) a contagem média de eosi-nófilo foi de 8 ± 8 células/μΙ e em camundongos tipo selvagem (+/+) a conta-gem média de eosinófilo foi de apenas 14 ± 21 células/μΙ.6.3. Síntese de oxima de (Z)-1-(4-((1R.2S.3R)-1.2.3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)-etanona<formula>formula see original document page 28</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (TI, preparado de acordo com Halweg, K.M. e Büchi, G.,J.Org.Chem. 50:1134-1136 (1985)) (350 mg, 1,52 mmol) foi suspenso emágua (10 ml). Hidrocloreto de hidroxilamina (126,8 mg, 1,82 mmol, 1,2 eq.) eacetato de sódio (247,3 mg, 3,04 mmol. 2 eq.) foram adicionados, e a sus-pensão foi agitada a 50°C. A mistura reacional tornou-se clara após aproxi-madamente 4 horas. A agitação foi continuada a 50°C durante 16 horas. Aanálise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência de material de—partida. A mistura reacional foi deixada atingir temperatura ambiente e pas-sada através de um filtro de porosidade fino. Esta solução foi usada direta-mente para purificar o produto usando HPLC preparativa: Coluna de sílicaAtlantis HILIC 30 χ 100mm; 2% - 21% de água em acetonitrilo durante 6 mi-nutos; 45 ml/minuto; com detecção em 254 nm. As frações do produto foramcolocadas e o acetonitrilo foi evaporado sob pressão reduzida. A soluçãoaquosa foi Iiofilizada para produzir o produto, uma mistura de aproximada-mente 3:1 anti:isômeros Syn1 como um sólido branco: 284 mg (77%).LCMS: Coluna Sunfire C-18, 4,6 χ 50mm; 0 - 17% de MeOH (0,1% TFA) emágua (0,1% TFA) durante 5 minutos; taxa de fluxo = 3 ml/minuto; Detecção220nm; Tempos de retenção: 0,56 min (isômero syn, 246,0 (M+1)) e 0,69minutos (anti isômero, 246,0 (M+1)). 1H NMR (D2O e DCI) δ 2,15 e 2,22 (sin-gletos, 3H), 3,5 - 3,72 (m, 4H), 4,76 (br, prótons de OH e H2O), 4,95 e 4,97(singletos, 1H), 7,17 e 7,25 (singletos, 1H), 13C NMR (D2O e DCI) δ 10,80,16,76, 63,06, 64,59, 64,75, 70,86, 72,75, 72,85, 117,22, 117,64, 135,32,138,39,141,35,144,12.6.4. Síntese de oxima de (E)-1-(4-((1R.2S.3R)-1.2,3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)-etanona

Este composto foi preparado em duas etapas, como mostradoabaixo<formula>formula see original document page 29</formula>

Primeiro, a um frasco carregado com Tl (21,20 mmol, 4,88g) éadicionada água (25 ml) e 1N de HCI aquoso (21,2 ml, 21,2 mmol). Apósmmol, 7.00 g) em dioxano (55 ml) foi adicionada e a reação foi mantida a50°C durante 4 horas. Na conclusão, a reação foi resfriada temperatura am-biente e a solução foi ajustada ao pH=7 pela adição de 1N de NaOH aquoso.A solução neutralizada foi em seguida concentrada a uma massa plástica,que foi purificada por cromatografia flash em sílica gel [10% de MeOH/1%NH4OH (5% em peso de solução em água) em DCM] para fornecer o tritil-éter como plástico claro. Tratamento da massa plástica com hexano e con-centração forneceram uma espuma branca, que pode ser secada a vácuoem um sólido flocoso (10,00 g, 97% de produção).

Segundo, a uma solução em temperatura ambiente, vigorosa-mente agitada do oxima-éter de tritila (4,8 g, 10 mmol) em dioxano (90 ml) éadicionada uma solução de HCI em dioxano (4M, 60 ml). Após alguns minu-tos, um precipitado branco foi observado, e a agitação foi continuada duranteum total de 30 minutos, antes da filtragem sobre um filtro de vidro fritado eenxágüe da massa com dioxano e éter. A massa foi redissolvida em água(200 ml), tratada com ondas sonoras durante 5 minutos, em seguida resfria-20 da para 0°C, tratada com celita (5 g), e filtrada sobre um filtro de vidro filtra-do. A solução aquosa foi concentrada até secura, em seguida isolada demetanol (30 ml) / éter de dietila (60 ml) para fornecer a E-oxima como póbranco analiticamente puro (3,8 g, 80% de produção).

6.5. Síntese de oxíma de O-metila de (Z)-1-(4-((1R.2S.3R)-1.2,3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona

O composto capitulado foi preparado como descrito acima no

Exemplo 6,3, usando hidrocloreto de metoxilamina no lugar de hidrocloretode hidroxilamina, em 74% de produção. O produto foi um sólido fofo branco.LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 0-17% de MeOH (0,1% TFA) emágua (Õ.í% TFA) durante 5 minutos; taxa de fluxo = 3 ml/minuto; Detecção220 nm; Tempos de retenção: 1,59 minutos (isômero syn, 260,1 (M+1)) e1,73 minutos (anti isômero, 260,1 (M+1)). 1H NMR (D2O) δ 2,18 e 2,22 (sin-gletos, 3H), 3,54 - 3,60 (m, 1H), 3,66 - 3,79 (m, 3H), 3,94 e 3,95 (singletos,3H), 4,76 (br, prótons de OH e H2O), 4,93 e 4,97 (singletos, 1H), 7,17 e 7,25(singletos, 1H), 13C NMR (D2O) δ 11,55, 17,56, 62,32, 62,38, 62,99, 63,07,67,09, 71,54, 73,86, 119,09, 138,64, 139,79, 142,95, 144,98, 148,97.

6.6. Síntese de 1 -(5-metil-4-((1 R.2S.3RH ,2.3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etanona

O composto capitulado foi preparado em sete etapas, usando oprocesso delineado abaixo.<formula>formula see original document page 31</formula>

4-Metilimidazol-1-dimetilaminossulfonamida (2): A uma solução em tem-peratura ambiente de 4-metil imidazol 1 (3,00 g, 36,54 mmol) em tolueno(200 ml) foi consecutivamente adicionado trietilamina (5,6 ml, 40,20 mmol) ecloreto de N,N-dimetilaminossulfamoíla (3,9 ml, 36,54 mmol). O vaso foi ar-mazenado em um refrigerador a 5°C durante 48 horas, em seguida os sóli-dos foram filtrados da reação e o líquido foi concentrado para obter uma mis-tura de 2,5:1 de regioisômeros 2 e 2a. O produto cru foi purificado por cro-matografia flash sobre sílica gel (80-100% de eluente de acetato de ti-la:hexano) para obter um 2:2a em uma mistura de regioisômeros de 5,5:1(4,31 g, 62% de produção): M+1=190,1

4-Metil-2-acetilimidazol-1-dimetilaminossulfonamida (3): A uma soluçãoa -78°C do imidazol 2 (1,99 g, 10,54 mmol) em tetraidrofurano (70 ml) foiadicionada lentamente uma solução de n-BuLi em dioxano (2,5M, 11,60 ml).Após 40 minutos, N-metoxi-N-metilacetamida (1,30 g, 12,65 mmol) foi adi-cionado gota a gota à solução resfriada. A reação foi deixada aquecer paratemperatura ambiente e mantida durante 2 horas. Na conclusão, a reação foisaciada pela adição de NH4CI aquoso saturado (20 ml), em seguida diluídacom água (20 ml). As camadas foram separadas, e a camada orgânica foilavada com acetato de etila (2 χ 30 ml). Os orgânicos combinados foram la-vados com salmoura (20 ml), em seguida concentrados sobre MgSO4 e con-centrados. O produto cru foi purificado por cromatografia flash sobre sílica(60-80% de eluente de acetato de etila:hexano) para fornecer 3 como umóleo (1,85 g, 76% de produção): M+1 = 232,1.

4-Metil-2-(1-(triisopropilsililóxi)vinil)-1-dimetilaminossulfonamida(4): Auma solução de imidazol 3 (1,65 g, 7,14 mmol) em diclorometano (45 ml) foiconsecutivamente adicionado trietilamina (1,00 ml. 14.28 mmol) e trifluoro-metanossulfonato de triisopropiísilila (2,12 ml, 7,86 mmol). A reação foi man-tida em temperatura ambiente durante 20 horas, em seguida saciada pelaadição de NaHCO3 aquoso saturado (20 ml). A mistura foi diluída com água(20 ml) e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi lavada comdiclorometano (2 χ 20 ml) e os orgânicos combinados foram lavados comsolução de salmoura (20 ml), em seguida concentrados sobre MgSO4 econ-centrados. O óleo resultante foi purificado por cromatografia flash sobre síli-ca gel (1-2% de eluente de metanohdiclorometano) para fornecer éter deSililenol 4 como um óleo laranja (2,26 g, 83% de produção): M+1= 388,2.Lactol (5): A uma solução a -78°C de imidazol 4 (2,26 g, 5.84 mmol) em te-traidrofurano (40 ml) foi lentamente adicionada uma solução de hexano de n-BuLi (2,5M, 3.27 ml). Após 30 minutos, uma solução de (-)-2,3-0-isopropilidina-D-eritronolactona (1,66 g, 10,51 mmol) em tetraidrofurano (10ml) foi adicionada lentamente à solução a -78°C. A reação foi mantida a -78°C durante 2 horas, em seguida deixada aquecer para 0°C antes da saci-edade da reação pela adição de NH4CI aquoso saturado (20 ml). A misturafoi diluída com água (10 ml) e as camadas foram separadas. Os orgânicosforam lavados com acetato de etila (2 χ 20 ml) e os orgânicos combinadosforam lavados com salmoura (20 ml), em seguida concentrados sobre Mg-SO4 e concentrados. O produto cru foi purificado em sílica gel (30-50% deeluente de acetato de etila:hexano) para fornecer o lactol 5 (2,69 g, 85% deprodução) como uma espuma branca: M+1=546,4.

Diol (6): A umá solução a 0°C do lactol 5 (2,09 g, 3,83 mmol) em etanol (70ml) foi adicionado NaBH4 granular (1,4 g, 38,32 mmol) em algumas porções.Após 2 horas, a reação foi aquecida para temperatura ambiente durante 30minutos, em seguida concentrada. O resíduo foi redissolvido em água (40ml) e acetato de etila (40 ml). A mistura bifásica foi agitada vigorosamentedurante 10 minutos, em seguida as camadas foram separadas. A camadaaquosa foi lavada com acetato de etila (2 x 40 ml) e os orgânicos combina-dos foram lavados com salmoura (30 ml), em seguida concentrados sobreMgSO4 e concentrados. A espuma branca foi purificado por cromatografiaflash sobre sílica (5% de eluente de metanohdiclorometano) para fornecerdiol 6 (1,88g, 90% de produção) como uma mistura de 3:1 de diastereôme-ros inseparáveis na posição benzílica: M+1= 547,4.

Imidazol (7): Fluoreto de césio (315 mg, 2,08 mmol) foi adicionada a umasolução do imidazol 6 (567 mg, 1,04 mmol) em etanol (10 ml) e aquecidopara 65°C. Após 1 hora, a reação foi resfriada para temperatura ambiente etratada com NH4CI aquoso saturado (1 ml), em seguida concentrada. O pro-duto cru foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel (5% de Meta-nol:diclorometano eluente) para fornecer imidazol 7(380 mg, 94% de produ-ção) como uma espuma branca: M+1=392,1.Produto Final (8): O imidazol protegido 7(380 mg, 0,97 mmol) foi dissolvidaem acetona (6 ml) e consecutivamente tratada com água (6 ml) e HCI aquo-sa concentrada (3 ml). O vaso foi aquecido para 40°C durante 45 minutos,em seguida resfriado para temperatura ambiente e concentrado. O materialcru foi purificado por cromatografia preparativa de fase reversa usando umacoluna 150mm x 30 mm Zorbax C-6 usando solventes não tamponados pelométodo seguinte: ciclo de 1% de acetonitrilo:água isocrático durante 5 minu-tos (TR=1,52 minutos). Seguindo liofilização, Composto 8 foi obtido como osal de ácido dimetilaminossulfâmico um amorfo sólido: M+1= 245,1; 1H NMR(400 MHz1 CDCI3) maior δ 5,04 (d, 1H), 3,62 (comp, m, 2H), 3,42 (comp, m,2Η), 2,62 (s, 6Η), 2,43 (s, 3Η), 2,21 (s, 3H); menor δ 5,01 (d, 1H), 3,79(comp, m, 2H), 3,55 (comp, m, 2H), 2,62 (s, 6H), 2,43 (s, 3H), 2,21 (s, 3H).

6.7. Síntese de (1 R,2S,3R)-1 -(2-(1-hidrazonoetil)-1 H-imidazol-4-il)butano-1,2.3,4-tetraol

<formula>formula see original document page 34</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (TI, preparado de acordo com Halweg, K.M. e Büchi, G., J. Orq.Chem. 50:1134-1136 (1985)) (148 mg, 0,64 mmol) foi suspenso em metanol(3 ml) e água (1 ml). Hidrato de hidrazina (35 mg, 0,7 mmol, 1,2 eq.) e ácidoacético (uma gota) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°C du-rante 6 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a ausên-cia de material de partida. A mistura reacional foi resfriada para temperaturaambiente e diluída com tetraidrofurano. O precipitado branco resultante foicoletado e lavado com tetraidrof urano para produzir o produto, uma misturade aproximadamente 3:1 E:Z de isômeros, como um sólido branco: 90mg(58%).

LCMS: Coluna Zorbax C-8, 4,6 x 150mm; 10 - 90% em água (10mM acetato de amônio) durante 6 minutos; taxa de fluxo = 2 ml/minuto; De-tecção 220nm; Tempos de retenção: 0,576 min (isômero syn, 245,0 (M+1)) e1.08 minutos (anti isômero, 245,0 (M+1)). 1H NMR (DMSO-d6) δ 2,5 (single-to, 3H sob DMSO), 3,4 - 3,7 (m, 4H), 4,3 (m, 2H), 4,6 (m, 2H), 4,8 (m, 1H),4,9 e 5,0 (dupletos, 1H), 7,04 e 7,21 (singletos, 1H).

6.8. Síntese de N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1.2.3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)acetoidrazida

<formula>formula see original document page 34</formula>1-[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (160 mg, 0,70 mmol) foi suspenso em metanol (3 ml) e água (1 ml).Hidrazida acética (56 mg, 0,75 mmol, 1,2 eq.) e ácido hidroclórico (uma gota,12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°C durante 48 ho-ras. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência de ma-terial de partida. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambientee diluída com tetraidrofurano. O precipitado branco resultante foi coletado elavado com tetraidrofurano para produzir o produto, uma mistura de aproxi-madamente 3:1 E:Z de isômeros, como um sólido branco: 129 mg (65%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 2 - 20% em água (10 mM de ace-tato de amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220 nm; Tempo de retenção: 0,53 minutos (287,1 (M+1)). 1H NMR (DMSO-d6) δ 2,2 (singletos, 3H), 2,5 (singletos, 3H sob DMSO), 3,4 - 3,7 (m, 4H),4,3 (br, 2H), 4,6-5,0 (br, 4H), 7,0 (br, 1H), 10,30 e 10,37 (singletos, 1H).

6.9. Síntese de (E)-4-metil-N'-(1 -(4-((1 R.2S,3R)-1.2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)benzenossulfonoidrazida

<formula>formula see original document page 35</formula>

1-[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (153 mg, 0,67 mmol) foi suspenso em metanol (3 ml) e água (1 ml).Hidrazida de p-toluenossulfonila (140 mg, 0,75 mmol, 1,2 eq.) e ácido hidro-clórico (uma gota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a50°C durante 24 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto ea ausência de material de partida. A mistura reacional foi resfriada para tem-peratura ambiente e carregada seca em sílica gel. Cromatografia flash emsílica gel (10g SiO2, 4:1 acetato de etila:metanol) para produzir o produto,uma mistura de aproximadamente 85:15 E:Z de isômeros, como um sólidobranco: 142 mg (53%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10-90% em água (10 mM de ace-tato de amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220nm; Tempos de retenção: 0,50 minutos (399,2 (M+1)) e 0,66 minutos(399,3 (M+1)). 1H NMR (Metanol-d4) δ 2,2 (singletos, 3H), 2,41 e 2,45 (sin-gletos, 3H), 3,6 - 3,85 (m, 4H), 4,99 e 5,05 (singletos, 1H), 7,09 (br s, 1H),7,39 (d, 2H, j =8 Hz), 7,77 e 7,87 (d, 2H, j =8 Hz).6.10. Síntese de N'-(1 -(4-((1 R.2S.3RM .2.3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)benzoÍdrazida

<formula>formula see original document page 36</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (150 mg, 0,65 mmol) foi suspenso em metanol (3 ml) e água (1 ml).Hidrazida de ácido benzóico (102 mg, 0,75 mmol, 1,2 eq.) e ácido hidroclóri-co (uma gota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°Cdurante 18 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a au-sência de material de partida. A mistura reacional homogênea foi resfriadapara temperatura ambiente e concentrada a vácuo. SPE de Fase Reversa Ο-18 (1 Og de Alltech Hi-Ioad C18, gradiente de água a 20% de Metanol/água)para produzir o produto, uma mistura de aproximadamente 1:1 E:isômeros Z,como um sólido incolor: 193 mg (85%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10-90% em água (10 mM de ace-tato de amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220 nm; Tempo de retenção: 0,49 minutos (349.2 (M+1)). 1H NMR (Metanol-d4) δ 2,2 (singletos, 3H), 2,42 e 2,45 (singletos, 3H), 3,6 - 3,85 (m, 4H), 5,11e 5,14 (singletos, 1H), 7,30 (br s, 1H), 7,40-7,7 (m, 4H), 7,80 e 7,95 (m, 2H),8,1 (br s, 1H).

6.11. Síntese de (E)-etil 2-(1-(4-((1R.2S,3R)-1,2.3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)hidrazinacarboxilato<formula>formula see original document page 37</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-ÍI]-etanona (150 mg, 0,65 mmol) foi suspenso em metanol (3 ml) e água (1 ml).

Carbazato de etila,

(78 mg, 0,75 mmol, 1,2 eq.) e ácido hidroclórico (uma gota, 12N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°C durante 18 horas. Aanálise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência de material departida. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambiente, concen-trada a vácuo, e diluída com acetona. O precipitado branco resultante foicoletado e lavado com acetona para produzir o produto, um isômero aparen-te, como um sólido branco: 96mg (47%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 2 - 20% em água (10mM acetato de amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto;Detecção 220 nm; Tempo de retenção: 0,25 min (317,35 (M+1)). 1H NMR(Metanol-d4) δ 1,36 (t, 3H, j =8 Hz), 2,28 (s, 3H), 2,42 e 2,45 (singletos, 3H),3,60 - 3,85 (m, 4H), 4,34 (dd, 2H, j =8 Hz), 5,08 (s, 1H), 7,27 (s, 1H).

6.12. Síntese de (E)-N'-(1 -(4-((1 R.2S.3R)-1,2,3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida

<formula>formula see original document page 37</formula>

1-[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (215 mg, 0,93 mmol) foi suspenso em metanol (3 ml) e água (1 ml).Hidrazida de ácido nicotínico (137 mg, 1,0 mmol, 1,1 eq.) e ácido hidroclórico(uma gota, 12 Ν) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°C du-rante 48 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a au-sência de material de partida. A mistura reacional foi resfriada para tempera-tura ambiente, e parcialmente concentrada a vácuo. O precipitado brancoresultante foi coletado e lavado com água para produzir o produto, um isô-mero aparente, como um sólido branco: 311 mg (95%).LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10 - 90% em água (10 mM aceta-to de amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220nm; Tempo de retenção: 0,22 min (350,27 (M+1)), 1H NMR (DMSOd6) δ2,37 (s, 3H), 3,60 - 3,85 (m, 4H), 4,40 (m, 2H), 4,71 (m, 1H), 5,01 (m, 2H),5,16 (m, 1H), 7,25 (br, 1H), 7,64 (br, 1H), 8,35 (br, 1H), 8,80 (br, 1H), 9,14(br, 1H).

6.13. Síntese de 3-cloro-N'-(1 -(4-((1 R,2S.3R)-1,2,3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)benzoidrazida

cloroidrazida de ácido benzóico (170 mg, 1,0 mmol, 1,2 eq.) e ácido hidrocló-rico (uma gota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 50°Cdurante 48 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a au-sência de material de partida. A mistura reacional foi resfriada para tempera-tura ambiente, e parcialmente concentrada a vácuo. O precipitado brancoresultante foi coletado e lavado com etanol para produzir o produto, comouma mistura de -3:1 E:Z, como um sólido branco: 108 mg (33%).LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10-90% em água (10 mM acetatode amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220nm; Tempo de retenção: 0,63 minutos (383,23 (M+1)), 1H NMR (Metanol-d4) δ 2,44 (s, 3H), 3,60- 3,90 (m, 4H), 5,12 (s, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,65 (m,2H), 8,04 (m, 2H).6.14. Síntese de (EM-flúor-Ν'-η -(4-«1 R,2S.3R)-1,2,3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)benzoidrazida

<formula>formula see original document page 39</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (172 mg, 0,74 mmol) foi suspenso em etanol (4 ml) e água (1 ml). 4-Fluoroidrazida de ácido benzóico (131 mg, 0,85 mmol, 1,1 eq.) e ácido hi-droclórico (uma gota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a55°C durante 48 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto ea ausência de material de partida. A mistura reacional foi resfriada para tem-peratura ambiente, e parcialmente concentrada a vácuo. O precipitado bran-co resultante foi coletado e lavado com etanol para produzir o produto, comoum isômero aparente, como um sólido branco: 97 mg (35%).LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10- 90% em água (10 mM acetatode amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção 220nm; Tempo de retenção: 0,55 min (367.24 (M+1)). 1H NMR (Metanol-d4, umagota DCI) δ 2,55 (s, 3H), 3,60 - 3,90 (m, 4H), 5,22 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,54(s, 1H), 8,08 (m, 2H).

6.15. Síntese de (E)-6-amino-N'-(1-(4-((1 R.2S.3RV1.2.3.4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida

<formula>formula see original document page 39</formula>1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (115 mg, 0,50 mmol) foi suspenso em etanol (4 ml) e água (1 ml).Hidrazida substituída (91 mg, 0,6 mmol, 1,2eq.) e ácido hidroclórico (umagota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 55°C durante 48horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência dematerial de partida. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambi-ente, e parcialmente concentrada a vácuo. O precipitado branco resultantefoi coletado e lavado com etanol para produzir o produto, como um isômeroaparente, como um sólido branco: 136 mg (75%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10- 90% em água (10 mM acetatode amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220nm; Tempo de retenção: 0,15 min (365.32 (M+1)). 1H NMR (Metanol-d4,uma gota DCI) δ 2,58 (s, 3H), 3,60-3,90 (m, 4H), 5,22 (s, 1H), 7,17 (m, 1H),7,54 (m, 1H), 8,44 (m, 1H), 8,68 (m, 1H).

6.16. Síntese de (E)-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1.2.3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)isonicotinoidrazida

<formula>formula see original document page 40</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (168 mg, 0,73 mmol) foi suspenso em etanol (4 ml) e água (1 ml).Hidrazida isonicotínica (110 mg, 0,80 mmol, 1,1eq.) e ácido hidroclórico (u-ma gota, 12 N) foram adicionados, e a suspensão foi agitada a 55°C durante24 horas. A análise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência dematerial de partida. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambi-ente, e parcialmente concentrada a vácuo. O precipitado branco resultantefoi coletado e lavado com etanol para produzir o produto, como um isômeroaparente, como um sólido branco: 136 mg (75%).

LCMS: Coluna C-18 Sunfire, 4,6 χ 50mm; 10-90% em água (10 mM acetatode amônio) durante 2,5 minutos; taxa de fluxo = 3,5 ml/minuto; Detecção220nm; Tempo de retenção: 0,15 min (365,32 (M+1)), 1H NMR (Metanol-d4,uma gota DCI) δ 2,63 (s, 3H), 3,60 - 3,90 (m, 4H), 5,12 (s, 1H), 7,58 (s, 1H),8,63 (d, 2H, j = 8 Hz), 9,14 (d, 2H, j = 8 Hz).

6.17. Síntese de (E)-N1-M -(4-((1 R.2S.3F0-1.2.3.4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)bifenil-3-carboidrazida

<formula>formula see original document page 41</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (315 mg, 1,36 mmol) e bifenil-3-carboidrazida (360 mg, 1,81 mmol)foram suspensos em DMSO (2 ml), ácido hidroclórico concentrado (duasgotas) foi adicionado, e a suspensão foi agitada a 40°C durante 5 horas. Aanálise de LCMS indicou a formação do produto e a ausência de material departida. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambiente, diluídacom metanol e purificada por HPLC de fase reversa (10 mM NH4OAc / ace-tonitrilo). Duas frações (isômeros E e Z) da massa desejada foram colocadasseparadamente e liofilizadas. A fração um forneceu um sólido branco, 95 mg(16%). A fração dois foi um sólido branco, 82 mg (14%).Fração um: Coluna HpLC Zorbax C-8 analítica, 4,6 χ 150mm; Solvente A =10 mM acetato de amônio; Solvente B = MeCN; 5% de B em 0 minuto, 5%de B em 1 minuto, 90% de B em 3 minutos, parada de 4 minutos; taxa defluxo = 3 ml/minuto; Detecção 220 nm; Tempo de retenção : 2,9 minutos (no-ta: contém -5% do outro isômero). M+H = 425,28,1H NMR (DMSO-d6 com 2gotas de D2O) δ 2,3 (singleto, 3H) , 3,3 - 3,7 (m, 4H), 4,9 (m, 1H), 7,19 (s,1H), 7,37 (m, 1H) 7,47 (m, 2H), 7,67 (m, 3H), 7,85-7,92 (m, 2H) e 8,15 (s,1H). HSQC da mesma amostra correlacionada ao sinal do próton em 2,3(CH3) com um sinal de carbono em 20 ppm.

Fração dois: Coluna HPLC Zorbax C-8 analítica, 4,6 χ 150mm; Solvente A =10 mM de acetato de amônio; Solvente B = MeCN; 5% de B em 0 minuto,5% de B em 1 minuto, 90% de B em 3 minutos, parada de 4 minutos; taxa defluxo = 3 ml/minuto; Detecção 220 nm; Tempo de retenção : 2,963 minutos(nota: contém -6% do outro isômero). M+H = 425,28, 1H NMR (DMSO-d6com 2 gotas de D2O) δ 2,4 (singleto, 3H), 3,4 - 3,6 (m, 4H), 4,77 e 4,86 (sin-gletos amplos, combinado = 1H), 6,9 e 7,1 (singletos amplos, combinado =1H), 7,40 (m, 1H) 7,50 (m, 2H), 7,61 (m, 1H), 7,73 (m, 2H), 7,87 (m, 2H) e8,10 (s, 1H). HSQC da mesma amostra correlacionada ao sinal do próton em2,4 (CH3) com um sinal de carbono em 13 ppm.

6.18. Síntese de N-hidróxi-4-((1 R,2S,3R)-1,2.3.4-tetraidroxibuti0-1 H-imidazol-2-carboxamida

<formula>formula see original document page 42</formula>

1 -[4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidróxi-butil)-1 H-imidazol-2-il]-etanona (18 g, 78,3 mmol) foi suspenso em dicloroetano (160 ml) e 2,2-dimetóxi propano (160 ml). Ácido 4-toluenossulfônico (3 g) foi adicionado e amistura agitada a 70°C durante 18 horas. A reação foi diluída com diclorome-tano e lavada com água, 5% de bicarbonato, salmoura e em seguida carre-gado seco sobre SiO2. Purificação por cromatografia flash (hexano / acetatode etila) forneceu 1-(4-((4S,4'R,5R)-2,2,2,,2,-tetrametil-4,4,-bi(1,3-dioxolan)-5-il)-1 H-imidazol-2-il)etanona como um óleo incolor (18,8 g, 60,6 mmol, 77%;M+H cálculo: 311,4, obs: 311,3).

O produto obtido acima (20 g, 64,5 mmol) foi dissolvido em DMF.K2CO3 foi adicionado (12,5 g, 90,3 mmol) seguido por brometo de benzila(10,7 ml, 90,3 mmol). A reação foi aquecida a 50°C durante 18 horas. Análi-se de LC/MS indicou resto de material de partida. Uma porção adicional debrometo de benzila (5 ml, 42 mmol) foi adicionada e a temperatura aumenta-da para 60°C. Após 3 horas a reação foi saciada com água fria e extraídacom acetato de etila. Os extratos orgânicos foram lavados com água, emseguida salmoura, secados sobre sulfato de sódio, e carregados sobre sílicagel. Cromatografia flash (20 a 40% de acetato de etila em hexano) forneceu1 -(1 -benzil-4-((4S,4,R, 5R)-2,2,2',2,-tetrametil-4,4,-bi(1,3-dioxolan)-5-il)-1 H-imidâzol-2-il)etanona (16,1 g, 62%).

O intermediário obtido (13g, 32,5 mmol) foi dissolvido em dioxa-no (120 ml) e tratado com NaOH (13.2 g) dissolvido em dissolvido em bran-queamento comercial (200 ml, 6% de NaOCI). Após 2 horas de agitação vi-gorosa, a reação foi extraída com acetato de etila. Os extratos orgânicosforam lavados com salmoura em seguida concentrados sobre celite. Filtra-ção e evaporação forneceu um sólido que foi também secado a vácuo parafornecer ácido 1-benzil-4-((4S,4,R,5R)-2,2,2',2,-tetrametil-4,4,-bi(1,3-dioxolan)-5-il)-1H-imidazol-2-carboxílico (13 g, produção quantitativa, cálculoM+H: 403,2, obs: 403,2).

O produto obtido acima (600 mg, 1,49 mmol), O-tritilidroxilamina(820 mg, 2,98 mmol), EDAC (430 mg, 2,24 mmol) e HOBt (305 mg, 2,24mmol) foram combinados com DMF (8 ml) e trietilamina (622 μΙ, 4,47 mmol).A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 22 horas, concentra-da e em seguida carregada sobre sílica usando DCM / MeOH. Cromatografiaflash (MeOH / DCM) forneceu 1 -benzil-4-((4S,4,R,5R)-2,2,2,,2,-tetrametil-4,4,-bi(1,3-dioxolan)-5-il)-N-(tritilóxi)-1H-imidazol-2-carboxamida (480 mg, 0,73mmol, 49%, cálculo M+H: 660,3, obs: 660,4).

O produto, obtido acima (480 mg, 0,73 mmol) foi dissolvido emetanol (50 ml). Pd(OH)2 (500 mg, 20% sobre carbono, úmido) foi adicionadoe a reação agitada sob H2 (65 psi) durante 18 horas e filtrada. Etanol foi re-movido a vácuo. O resíduo foi dissolvido em DCM e purificado por cromato-grafia flash (MeOH / DCM) para fornecer N-hidróxi-4-((4S,4,R,5R)-2,2,2,,2'-tetrametil-4,4'-bi(1,3-dioxolan)-5-il)-1 H-imidazol-2-carboxamida (150 mg,0,46 mmol, 63%, cálculo M+H: 328,1, obs: 328,3).

O produto obtido acima (150 mg, 0,46 mmol) foi dissolvido emacetona (8 ml) e água (8 ml). A reação foi resfriada para uma temperaturainterna de -15°C usando um gelo seco / banho de acetona. HCI concentrado(3 ml) foi adicionada em uma taxa tal que a temperatura interna restante foiabaixo de -10°C. O banho gelado foi removido e a reação agitada em tempe-ratura ambiente durante 3 horas, a 4°C durante 18 horas e novamente emtemperatura ambiente durante 7 horas. Após remoção da acetona e algumaágua a vácuo, um precipitado formou-se. Dioxano (20 ml) foi adicionado se-guido por THF (10 ml). O sólido foi isolado por filtração, lavado com THF /dioxano e secado a vácuo para fornecer N-hidróxi-4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tètraidroxibutil)-1H-imidazol-2-carboxamida como o sal de hidrocloreto (98mg, 0,40 mmol, 87%).

Espectroscopia de massa: cálculo M+H: 248,1, obs: 248,2. HPLC analítico:Luna Fenil-Hexila, 5 um, 4,6x50 mm, 10 mM de acetato de amônio isocráticocom 1% de acetonitrilo, taxa de fluxo = 3 ml/minuto, 220 nm de detecção,tempo de retenção = 0,245 minutos. 1H NMR (DMSO-d6) δ 3,37-3,64 (m,4H), 4,96 (singleto amplo, 1H), 7,47 (s, 1H), 11,9 (singleto amplo, 1H).6.19. Avaliação dos Efeitos sobre os Linfócitos em Camundogos

Os compostos foram administrados por gavagem oral ou em á-gua potável. Para experimentos de dosagem oral, os compostos foram res-suspensos a partir de cristais em 10 mg/ml em veículo (por exemplo, água).Aos camundongos (Híbridos de F1 de linhagem 129/B6) foi fornecida gava-gem com uma dose única de 100 mg/kg dose de composto (equivalente a100 mpk da base livre para cada composto) ou um controle de apenas umveículo, e retornaram as suas gaiolas. Os camundongos foram anestesiadosutilizando isofluorano dezoito horas após a dosagem e os tecidos foram cole-tados para análise como descrito abaixo. Para estudos de água potável, oscompostos foram dissolvidos em 50 mg/L em água acidifiçada (pH = 2,8)contendo 10 g/L de glicose. Os camundongos foram permitidos livre acessoà água contendo composto (ou solução de glicose com um controle) durante72 horas. Ao término das 72 horas, os tecidos foram coletados para análise.

As avaliações de CBC foram obtidas comó segue. Os camun-dongos foram anestesiados com isofluorano e o sangue foi coletado do ple-xo retro-orbital em tubos de coleta de EDTA (Capiject-MQK, Terumo MedicaiCorp., Elkton, MD). Análise de CBC automatizada foi realizada utilizando uminstrumento Cell-Dyn 3500 (Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL) ou um He-maVet 850 (Drew Scientific1 Inc., Oxford, CT).

As avaliações de citometria de fluxo (FACS) foram obtidas comosegue. Vinte e cinco μΙ de sangue total foram Iisados por choque hipotônico,lavados uma vez em 2 ml de tampão de lavagem de FACS (FWB: PBS/0,1%BSA/0.1% de NaN3^mM de EDTA) e manchados durante 30 minutos a 4°Cno escuro com uma combinação de anticorpos conjugados com fluorocromodiluídos em 50 μΙ de FWB. Após o manchamento, as células foram lavadasuma vez com 2 ml de FWB e ressuspensas em 300 μΙ de FWB para aquisi-ção.

Procedimentos padrão para remoção nao estéril de baço e timoforam seguidos. Os órgãos foram dispersos em suspensões de célula únicaforçando o tecido através de um coador celular de 70 μιη (Falcon, BectonDickinson Labware, Bedford, MA). Para análise de FACS1 RBCs foram Iisa-dos por Iise hipotônica, lavados, e células 1x106 foram incubadas com 10 μΙde anti-CD16/CD32 (Fc Block™, BD-PharMingen, San Diego, CA) (1/10 dilu-ição em FWB) durante 15 minutos a 4°C. As células foram manchadas comuma combinação de anticorpos conjugados com fluorocromo diluídos em 50-100 μl de FWB, adicionados diretamente às células em Bloco Fc, durante 30minutos a 4°C no escuro. Após manchamento as células foram lavadas umavez com 1 ml de FWB, e ressuspensas em 300 μΙ de FWB para aquisição.Todos os anticorpos foram adquiridos de BD-PharMingen, San Diego, CA amenos que de outro modo especificado. As amostras forma analisadas utili-zando um citômetro de fluxo FACSCaIibur e software CeIIQuest Pro (BectonDickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA).

Misturas de anticorpos usadas para o timo foram: TCRb APCCy7; CD4 APC; CD8 PerCP; CD69 FITC; e CD62L PEI. Misturas de anticor-pos usadas para baço e sangue foram: B220 PerCP; TCRb APC; CD4 APCCy7; CD8 PE Cy7; CD69 FITC; e CD62L PE.

6.20. Avaliação de Efeitos sobre os Níveis de S1P em Camundoqos

Os níveis de S1P em baços de camundongos (Híbridos de F1 delinhagem 129/B6) foram avaliados utilizando uma adaptação do ensaio deligação de rádio-receptor descrito em Murata, N., e outro, Anal. Biochem.282:115-120 (2000). Este método utilizou células HEK293F superexpres-sando Edg-1, um dos subtipos de receptor de S1P, e foi baseado na compe-tição de S1P rotulado e S1P não rotulado em uma determinada amostra.

As células HEK293F foram transfectadas com um vetor de ex-pressão de (Edg-1) receptor S1P pEFneo e um clone de célula resistente aG418 foi selecionado. As células HEK293F expressando Edg-1 foram cultu-radas em 12 multiplacas em DMEM contendo 5 % (volume/volume) de FBSem uma atmosfera de ar umidificado:C02 (19:1). Vinte quatro horas antes doexperimento, o meio foi alterado para DMEM fresco (sem soro) contendo0,1% (peso/volume) de BSA.

Dezoito horas após o composto teste ser administrado, os ca-mundongos foram sacrificados e seus baços foram removidos e congelados.S1P foi obtido a partir dos tecidos congelado utilizando métodos conhecidos.Veja, por exemplo, Yatomi, Y., e outro, FEBS Lett. 404:173-174 (1997). Emparticular, 10 baços de camundongo em 1 ml de tampão de fosfato geladode 50 mM (pH 7,5) contendo 1 mM de EGTA, 1mM de DTT e inibidores deprotease completa Roche foram homogeneizados três vezes em intervalosde um minuto em gelo. O resultado é centrifugado em 2500 rpm e 4ÔC du-rante 10 minutos para remover resíduos celulares. O sobrenadante foi emseguida ultracentrifugado a 45000 rpm e 4°C em um rotor 70Ti durante 1hora para diminuir as proteínas associadas com membrana. O sobrenadantefoi descartado, e a pélete foi de ressuspensa em volume mínimo (~1 ml) detampão de fosfato gelado de 50 mM (pH 7,5) contendo 1 mM de EGTA, 1mM de DTT e 33% de glicerol com inibidores de protease completa Rochepresentes. A concentração total de proteína foi avaliada utilizando o ensaioBradford.

S1P foi extraído de clorofórmio/KCI/NH4OH (pH ~ 12), e a faseaquosa superior é mantida. Ela foi em seguida extraída em clorofór-mio/metanol/HCI (pH < 1), e a fase orgânica inferior foi mantida e evaporadapara fornecer S1P, que foi estocada em um freezer até o uso. Exatamenteantes do ensaio, a amostra secada foi dissolvida por sonicação em um tam-pão aglutinante consistindo em 20 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM de Na-Cl, 15 mM de NaF1 e 0,4 % (peso/volume) BSA.

O teor de S1P de uma amostra foi avaliado por um ensaio deligação de radiòreceptor com base em uma ligação competitiva de [33P]S1Pcom S1P na amostra em células expressando Edg-1. Células HEK293F ex-pressando Edg-1 em 12 multiplacas confluentes foram lavadas duas vezescom tampão de ligação gelado e em seguida incubadas com o mesmo tam-pão contendo 1 nM de [33P]S1P (cerca de 18,00 dpm por cavidade) e dosesaumentadas de S1P autêntico ou amostra teste em um volume final de 0,4ml. As placas foram mantidas em gelo durante 30 minutos, e as células fo-ram lavadas duas vezes com o mesmo tampão de ligação gelado para re-mover o ligando não ligado. As células foram solubilizadas com uma soluçãocomposta de 0,1 % de SDS, 0,4 % de NaOH, e 2 % de Na2CO3, e a radioati-vidade foi contada por um contador de cintilação líquida. O teor de S1P noensaio foi bem estimado por extrapolação da curva de deslocamento padrão.O teor de S1P na(s) amostra(s) teste inicial(is) foi calculado multiplicando-seo valor obtido da curva padrão pela eficiência recuperada extração de S1P edo fator de diluição.

6.21. Efeitos de Compostos sobre os Linfócitos em Camundoqos

Utilizando os métodos acima descritos, os efeitos in vivo de vá-rios compostos foram determinados. Como mostrado nas Figuras 1-3, quan-do administrados aos camundongos (Híbridos F1 de linhagem 129/B6) emágua potável, tanto Tl quanto um composto representativo da invenção(Composto 1) reduziram a saída de linfócito do timo.

A figura 4 mostra os efeitos de controle de veículo (água potá-vel), TI, composto 1, e 1-(4-metil-5-((1S,2R,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)tiazol-2-il)etanona (Composto 2) sobre as contagens de sangue total. Interessan-temente, os efeitos in vivo reportados por Pyne (WO 97/46543) para Com-posto 2 não foram observados.

6.22. Modelo de Artrite Induzida por Coláqeno

Artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo amplamenteusado de artrite reumatóide (RA), uma doença da articulação causada porprocessos autoimunes e inflamatórios. Veja, geralmente, Wooley P.H. eoutro, J. Immunol. 135(4):2443-2451; A. Persidis, Nature Biotechnoloqy17:726-728; Current Protocols in Immunoloav (John Wiley & Son, Inc. 1996).Estudos anteriores estabeleceram uma hierarquia de sensibilidade à CIAligada a certos haplótipos de H-2. Mais recentemente, Campbell e colabora-dores re-avaliaram CIA em camundongos C57BL/129sv (H-2b) e descobri-ram que camundongos derivados da base C57B6 podem desenvolver CIA.Campbell I. K, e outros. Eur. J. Immunol. 30: 1568-1575 (2000).

Aqui, colágeno para injeção, 2mg/ml de colágeno tipo Il de fran-go (CII) (Sigma), foi dissolvido em 10 mM de ácido acético agitando-se du-rante a noite a 4°C. Adjuvante de Freund completo (CFA) foi adquirido pron-to (Sigma). Utilizando uma seringa de vidro, Cll foi emulsificado em um vo-lume igual de CFA exatamente antes da imunização. Para imunizar os ca-mundongos, uma seringa de vidro e agulha 26G foram usadas, e os camun-dongos foram injetados com emulsão de CII/CFA intradermicamente na baseda cauda. CFA e 100 pg de Cll de frango em um volume total 50 μΙ de CFAforam usados para cada injeção. Uma imunização formentadora de 100 pgde Cll emulsificado em CFA foi fornecida através da mesma rotina 3 sema-nas após a imunização primária.

Injeção do colágeno induziu à intumescência da almofada dapata e articulação de camundongos. Os camundongos foram inspecionadosa cada dois a três dias durante o início da artrite, que foi avaliada por combi-nação de avaliações de compasso da espessura da almofada da pata trasei-ra e avaliação visual das articulações das patas traseiras afetadas. A pro-gressão de CIA foi seguida durante 10 semanas após o início da doença,tempo após o qual a doença foi avaliada por histologia das articulações. Oscamundongos foram negativamente considerados para artrite se eles nãodesenvolveram CIA dentro de 150 dias de imunização de colágeno tipo II.

A presença ou ausência de artrite em camundogos foi determi-nada por um sistema de classificação visual estabelecido. Em CIA de ca-mungondos, qualquer ou as quatro podem ser afetadas. A inflamação emseu pico estende-se do tornozelo em todo o caminho através das digitais, eé caracterizada por eritema e intumescência extrema. Assim que a artriteapareceu, cada pata foi examinada 2 a 3 vezes por semana. Para avaliar agravidade da inflamação, a classificação visual amplamente usada de 0 a 4foi de usada, ém que: 0 = normal, nenhuma evidência de eritema e; 1 = eri-tema e intumescência branda confinada ao meio do pé ou articulação dotornozelo ou digitais individuais; 2 = eritema e intumescência branda esten-dendo-se ao tornozelo e o meio do pé ou intumescência em mais do que umdigital; 3 = eritema e intumescência moderada estendendo-se do tornozeloàs articulações metatarsais; e 4 = eritema e intumescência grave abrangen-do o tornozelo, pé e digitais.

6.23. Efeito sobre o Modelo de Artrite Induzida por Coláqeno

O efeito de um composto da invenção no modelo de CIA comodeterminado utilizando 30 camundongos (Híbridos F1 de linhagem 129/B6)no modelo acima descrito. Os camundongos foram aleatoriamente divididosem dois grupos cegados, que receberam 0 mpk (controle de veículo) ou 100mpk do composto. O veículo foi água destilada, estéril. O controle de veículofoi dosado em 10 μΙ/g de peso corporal.

A dosagem foi realizada uma vez ao dia por gavagem oral. Elacomeçou três dias antes da iniciação do experimento de CIA, e continuoudurante toda a duração do experimento. A figura 5 mostra o efeito do com-posto sobre CIA durante o tempo, em que a marca acumulativa é a somadas marcas do membro dianteiro e tornozelo.

6.24. O Efeito de um Composto em MacacosO efeito de um composto da invenção em vinte macacos cino-molgos, machos, que receberam tratamento, foi investigado por CovanceResearch Products Inç. (Alice, TX). Cada animal foi identificado com umatatuagem individualmente numerada. Os animais foram aclimados duranteaproximadamente 11 dias antes da administração de dose. No momento daadministração de dose, os animais foram considerados ser adulto jovem/adulto idoso.

Durante a aclimação e o período teste, os animais foram aloja-dos em gaiolas individuais. Os animais não foram misturados durante pelomenos 48 horas após a administração da dose para permitir o monitoramen-to de quaisquer efeitos relacionados com veículos ou artigos teste. Os ani-mais tinham acesso à dieta de primata não certificada ad libitum, exceto co-mo especificado para a administração de dose. Frutas e outros prazeres fo-ram também fornecidos, como apropriados, durante períodos de não jejum.Água foi fornecida ad libitum.

O composto testado foi armazenado protegido da luz em um re-cipiente selado em dessecante sob condições ambientes (temperatura am-biente aproximada). Água destilada foi fornecida por Covance para adminis-tração oral a animais no grupo de controle de veículo. As formulações dedose de artigo teste para o teste foram preparadas no dia da administração.Para cada grupo, uma quantidade apropriada do artigo teste foi pesada e umvolume apropriado de água destilada.

Todos os animais foram jejuados durante a noite antes da dosa-gem durante aproximadamente 4 horas após a dose. As doses individuaisforam calculadas com base nos pesos corporais tirados no dia da adminis-tração de dose.

A dose oral foi administrada por meio de intubação nasogástrica.Antes da abstinência o tubo de gavagem foi inundado com aproximadamen-te 5 ml de água. Para análise de hematologia, sangue (aproximadamente0,5 ml) foi coletado de cada animal antes da dose (Dia -7), antes da dose(Dia -3), e em 8, 16, 24, 32, e 48 horas após a dose. Os testes de hematolo-gia de sangue total foram realizados utilizando as amostras frescas obtidasno dia da coleta.

Como mostrando na figura 6, uma dose oral única dose do com-posto teve um significante efeitos sobre as contagens de linfócitos e célulasangüínea branca dos macacos, quando avaliados 32 horas após a dosa-gem.

Algumas Publicações, Patentes e Pedidos de Patentes são aquiincorporados por referência em suas totalidades.

Claims

1. Agente de redução de linfócito circulante de Fórmula I:<formula>formula see original document page 51</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato (por exemplo, hidrato)deste, em que:X é O ou NR3;R1 é OR1a, NHOH1 hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilal-quila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída;R2 é OR2A, C(O)OR2A, hidrogênio, halogênio, nitrilo, ou alquila,arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ouheterocicloalquila opcionalmente substituída;R3 é OR3A, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R 3a> ou hidrogênio;R4 é OR4a, OC(O)R4A, hidrogênio, halogênio, ou alquila, arila,alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo ou heteroci-cloalquila opcionalmente substituída;R5 é N(R5a)2, hidrogênio, hidróxi, ou alquila, arila, alquilarila, ari-lalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterocilo, ou heterocicloalquila op-cada qual de R-1a, R2A, R3A, R4A, e Rsa é independentemente hidrogênio oualquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheteroci-clo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída;com a condição de que: se X for O, R1 será alquila dentre 1 a 4 átomos, fe-nila, benzila ou feniletila; R2 será hidrogênio; e um dentre R4 e R5 será hi-droxila; o outro dentre R4 e R5 não será alquila de 1 a 6 carbonos, hidroxi-lalquila de 1 a 6 carbonos, poliidroxialquila de 1 a 6 carbonos tendo até umahidroxila por carbono, poliacetilalquila de 1 a 6 carbonos tendo até uma ace-tila por carbono, fenila, benzila ou feniletila.

2. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, que tem um CLRF de mais do que cerca de 50 por cento.

3. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em que X é O.

4. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em que X é NR3.

5. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em que Ri é hidrogênio.

6. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em qüe Ri é alquila inferior opcionalmente substituída.

7. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em que Ri é NHOH.

8. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1, em que Ri é ORia.

9. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 7, em que Ria é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substi-tuída.

10. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 é hidrogênio.

11. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 não é hidrogênio.

12. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 é nitrilo.

13. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 é alquila inferior opcionalmente substituída.

14. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 é OR2A-

15. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R2 é C(O)OR2a.

16. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 14 ou 15, em que R2a é hidrogênio ou alquila inferior opcional-mente substituida.

17. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R3 é OR3a-

18. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R3 é N(R3A)2 ou NHC(O)R3A-

19. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R3 é NHSO2R3a-

20. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 17, 18 ou 19, em que R3A é hidrogênio ou alquila inferior opcio-nalmente substituída.

21. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 17, 18 ou 19, em que R3a é heteróciclo ou arila opcionalmentesubstituída.

22. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R4 é OR4A-

23. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R4 é halogênio.

24. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é N(R5a)2.

25. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é hidrogênio.

26. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é hidroxila.

27. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é heteroalquila (por exemplo, alcóxi).

28. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é alquila opcionalmente substituída.

29. Agente redução de linfócito circulante de acordo com a rei-vindicação 1, em que R5 é arila opcionalmente subsituída.

30. Agente de realce de nível de S1P de Fórmula I:<formula>formula see original document page 54</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, em que:Xé Oou NR3;R1 é ORia, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilal-quila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída;R2 é OR2A, C(O)OR2A, hidrogênio, halogênio, nitrilo, ou alquila,arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ouheterocicloalquila opcionalmente substituída;R3 é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio;R4 é OR4A, OC(O)R4a, hidrogênio, halogênio, ou alquila, arila,alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo ou heteroci-cloalquila opcionalmente substituída;R5 é N(R5a)2, hidrogênio, hidróxi, ou alquila, arila, alquilarila, ari-lalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterocilo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída; ecada qual de RiA, R2A, R3A, R4A, e R5A é independentemente hidrogênio oualquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheteroci-clo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída;com a condição de que o agente não seja 2-acetil-4-tetraidroxibutilimidazol,-1-(4-(1,1,2,2,4-pentaidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona, tetraacetato de 1-(2-acetil-1H-imidazol-4-il)butano-1,1,2,2-tetrail, ou pentaacetato de 1-(2-acetil-1 H-imidazol-4-il)butano-1,1,2,2,4-pentail.

31. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, que tem um SLEF de mais do que cerca de 20 vezes.

32. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que X é O.

33. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que X é NR3.

34. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que Ri é hidrogênio.

35. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reiyindi-cação 30, em que Ri é alquila inferior opcionalmente substituída.

36. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que Ri é NHOH.

37. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que Ri é ORia-

38. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que Ria é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substi-tuída.

39. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R2 é hidrogênio.

40. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R2 não é hidrogênio.

41. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R2 é nitrilo.

42. Agente de realce de nível de S1.P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R2 é alquila inferior opcionalmente substituída.

43. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, êm que R2 é OR2A.

44. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R2 é C(O)OR2a.

45. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 43 ou 44, em que R2A é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmentesubstituída.

46. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R3 é OR3a.

47. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R3 é N(R3a)2 ou NHC(O)R3a.

48. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R3 é NHSO2R3A-

49. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 46, 47 ou 48, em que R3A é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmen-te substituída.

50. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 46, 47 ou 48, em que R3a é heterociclo ou arila opcionalmente substi-tuída.

51. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R4 é OR4A-

52. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R4 é halogênio.

53. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é N(R5A)2·

54. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é hidrogênio.

55. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é hidroxila.

56. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é heteroalquila (por exemplo, alcóxi).

57. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é alquila opcionalmente substituída.

58. Agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindi-cação 30, em que R5 é arila opcionalmente subsituída.

59. Composto de Fórmula II:<formula>formula see original document page 56</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, em que :X é O ou NR3;R1 é ORia, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilal-quila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída;R2 e OR2a, C(O)OR2a, hidrogênio, halogênio, nitrilo, ou alquila,arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ouheterocicloalquila opcionalmente substituída;R3 é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio;R6 é OR6a, OC(O)R6a, N(R6b)2, NHC(O)R6b, hidrogênio, ou halo-gênio;R7 é OR7a, OC(O)R7a, N(R78)2, NHC(O)R78, hidrogênio, ou halo-gênio;R8 é OR8a, OC(O)R8a, N(R88)2, NHC(O)R88, hidrogênio, ou halo-gênio;R9 é CH2OR9a, CH2OC(O)R9a, N(R98)2, NHC(O)R98l hidrogênio,ou halogênio;cada qual de Rm, R2a, R3A, R6a, R7A, Rsa e R9a é independente-mente hidrogênio ou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, hete-rociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída; ecada qual de R68, R78, R88 e R98 é independentemente hidrogê-nio ou alquila opcionalmente substituída com ou mais grupos hidróxi ou ha-logênio;com a condição de que: 1) se X for O, Ri é alquila de 1 a 4 áto-mos, fenila, benzila ou feniletila, e R2 é hidrogênio, pelo menos dois de R6,R7, R8 e R9 não são hidroxila ou acetato; 2) se X for O, Ri é metila, R2 é hi-drogênio, R6 e R7 são ambos hidroxila, e um de R8 e R9 é hidrogênio, o outronão é NHC(O)R98; 3) se X for O, Ri é ORia, Ria é hidrogênio ou alquila infe-rior, e R2 é hidrogênio, pelo menos um, porém não todos, de R6, R7, R8 e R9é hidroxila ou acetato.

60. Composto de acordo com a reivindicação 59, que é um a-gente de redução de linfócito circulante.

61. Composto de acordo com a reivindicação 59, que é um a-gente de realce de nível de S1P.

62. Composto de acordo com a reivindicação 59, que é de Fór-mula II(a):<formula>formula see original document page 58</formula>

63. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que X é O.

64. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que X éNR3.

65 Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R1 éhidrogênio.

66. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R1 éalquila inferior opcionalmente substituída.

67. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R1 éNHOH.

68. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R1 éOR1A.

69. Composto de acordo com a reivindicação 67, em que R1A éhidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

70. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 éhidrogênio.

71. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 nãoé hidrogênio.

72. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 énitrilo.

73. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 éalquila inferior opcionalmente substituída.

74. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 éOR2A.

75. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R2 éC(O)OR2A-

76. Composto de acordo com a reivindicação 74 ou 75, em queR2A é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

77. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R3 éOR3A.

78. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R3 éN(R3A)2OUNHC(O)R3A.

79. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que R3 éNHSO2R3A.

80. Composto de acordo com a reivindicação 77, 78 ou 79, emque R3A é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

81. Composto de acordo com a reivindicação 77, 78 ou 79, emque R3A é heterociclo ou arila opcionalmente substituída.

82. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que X é Oe R2 não é hidrogênio.

83. Composto de acordo com a reivindicação 82, em que R2 éalquila inferior opcionalmente substituída.

84. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que um oumais de R6, R7, Re1 e Rg é hidróxi ou halogênio.

85. Composto de acordo com a reivindicação 62, em que todosde Re, R71 Re, β Rg são hidroxila ou acetato.

86. Composto de Fórmula III:<formula>formula see original document page 59</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável ou sòlvato deste, em que:Z é alquila opcionalmente substituída;R1 é OR1A, ΝΗΟΗ, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilal-quila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída;R2 é OR2a, C(O)OR2a, hidrogênio, halogênio, nitrilo, ou alquila,arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ouheterocicloalquila opcionalmente substituída;R3 é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio;cada qual de RiA, R2A, e R3a é independentemente hidrogênio ou alquila op-cionalmente substituída, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heteroci-clo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila.

87. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que Z éalquila opcionalmente substituída com uma ou mais porções hidroxila, aceta-to ou halogênio.

88. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que Ri éalquila inferior opcionalmente substituída.

89. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que Ri éNHOH.

90. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que R2 éhidrogênio ou halogênio.

91. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que R3 éOR3A.

92. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que R3 éN(R3a)2 ou NHC(O)R3a.

93. Composto de acordo com a reivindicação 86, em que R3 éNHSO2R3a.

94. Composto de acordo com a reivindicação 91, 92 ou 93, emque R3a é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

95. Composto de acordo com a reivindicação 91, 92 ou 93, em <>que R3a é heterociclo ou arila opcionalmente substituída.

96. Composto de Fórmula IV:ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, em que:Ri é ORia, NHOH, hidrogênio, ou alquila, arila, alquilarila, arilal-quila, heteroalquila, heterociclo, alquilheterociclo, ou heterocicloalquila op-cionalmente substituída;R3 é OR3a, N(R3a)2, NHC(O)R3a, NHSO2R3a, ou hidrogênio;R6 é OR6a, OC(O)R6a, N(R6b)2, NHC(O)R6b, hidrogênio, ou halo-gênio;R7 é OR7A, OC(O)R7a, N(R7b)2, NHC(O)R7b, hidrogênio, ou halo-gênio;R8 é OR8A, OC(O)R8a, N(R8b)2, NHC(O)R8b, hidrogênio, ou halo-gênio;R9 é CH2OR9a, CH2OC(O)R9a, N(R9b)2, NHC(O)R9b, hidrogênio,ou halogênio; ecada qual de Ria, R3a, ReA, R7A, R8a e R9a é independentemente hidrogênioou alquila, arila, alquilarila, arilalquila, heteroalquila, heterociclo, alquilhetero-ciclo, ou heterocicloalquila opcionalmente substituída.

97. Composto de acordo com a reivindicação 96, que é de Fór-mula IV(a):<formula>formula see original document page 61</formula>

98. Composto de acordo com a reivindicação 96, em que um oumais de R6, R7, R8, e R9 é hidróxi ou halogênio.

99. Composto de acordo com a reivindicação 96, em que todosde R6, R7, R8, e R9 são hidroxila ou acetato.

100. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que todosde R6, R7, R8, e R9 são hidroxila ou acetato.

101. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que Ri éalquila inferior opcionalmente substituída.

102. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que Ri éNHOH.

103. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que R3 éOR3A.

104. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que R3 éN(R3a)2 ou NHC(O)R3a.

105. Composto de acordo com a reivindicação 97, em que R3 éNHSO2R3A.

106. Composto de acordo com a reivindicação 103, 104 ou 105,em que R3A é hidrogênio ou alquila inferior opcionalmente substituída.

107. Composto de acordo com a reivindicação 103, 104 ou 105,em que R3A é heterociclo ou arila opcionalmente substituída.

108. Composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou sol-vato deste, em que o composto é :Oxima de 1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)-etanona;Oxima de (E)-1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)-etanona;Oxima de (Z)-1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)-etanona;Oxima de 1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanonaO-metila;Oxima de (E)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona O-metil;Oxima de (Z)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona O-metila;-1-(5-metil-4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etanona;(1R,2S,3R)-1-(2-(1-hidrazonoetil)-1H-imidazol-4-il)butano-1,2,3,4-tetraol;N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)acetoidrazida;-4-metil-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)benzenosulfonoidrazida;(E)-4-metil-N'-(1-(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)benzenosulfonoidrazida;(Z)-4-metil-N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)benzenosulfonoidrazida;N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2- il)etilideno)benzoidrazida;2-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)hidrazinacarboxilato de etila;2-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)hidrazinacarboxilato de (E)-etila; 2-(1 (4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)hidrazinacarboxilato de (Z)-etila;N'-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida;(E)-N'-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2- il)etilideno)nicotinoidrazida;(Z)-N1-O -(4-((1R,2S,3R)t1 ,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida;3-cloro-N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)benzoidrazida; 4-flúor-N'-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2- il)etilideno)benzoidrazida;(E)-4-flúor-N'-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)benzoidrazida;(Z)-4-flúor-N'-(1 -(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2- il)etilideno)benzoidrazida;6-amino-N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida;(E)-6-amino-N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutiO-lH-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida; (Z)-6-amino-N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)nicotinoidrazida;N'-(1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1H-imidazol-2-il)etilideno)isonicotinoidrazida;(E)-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)isonicotinoidrazida;(Z)-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)isonicotinoidrazida;N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)bifenil-3-carboidrazida;(E)-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)bifenil-3-carboidrazida;(Z)-N'-(1 -(4-((1 R,2S,3R)-1,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-il)etilideno)bifenil-3-carboidrazida; ouN-hidróxi-4-((1R,2S,3R)-1 ,2,3,4-tetraidroxibutil)-1 H-imidazol-2-carboxamida.

109. Composição farmacêutica compreendendo um agente deredução de linfócito circulante de acordo com a reivindicação 1, e um diluen-te ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

110. Composição farmacêutica compreendendo um agente derealce de nível de S1P de acordo com a reivindicação 30, é um diluente ouexcipiente farmaceuticamente aceitável.

111. Composição farmacêutica compreendendo um compostode acordo com a reivindicação 59, 84, 96 ou 108, e um diluente ou excipien-te farmaceuticamente aceitável.

112. Método de redução do número de linfócitos circulantes emum paciente, que compreende administrar ao paciente uma quantidade efi-caz de um agente de redução de linfócito circulante de acordo com a reivin-dicação 1.

113. Método de modulação da quantidade de S1P em um paci-ente, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de umagente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindicação 30.

114. Método de supressão da resposta imune em um paciente,que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um a-gente de redução de linfócito circulante de acordo com a reivindicação 1.

115. Método de supressão da resposta imune em um paciente,que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um a-gente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindicação 30.

116. Método de supressão da resposta imune em um paciente,que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de umcomposto de acordo com a reivindicação 59, 84, 96 ou 108.

117. Método de tratamento, controle ou prevenção de uma do-ença ou distúrbio, que compreende administrar a um paciente em necessi-dade disto uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz umagente de redução de linfócito circulante de acordo com a reivindicação 1,em que a doença ou distúrbio é artrite reumatóide, asma, dermatite atópica,doença de Behcet, doença do enxerto versus hospedeiro, lúpus eritematoso,esclerose múltipla, polinose, psoríase, rejeição de transplante ou uveíte.

118. Método de tratamento, controle ou prevenção de uma do-ença ou distúrbio, que compreende administrar a um paciente em necessi-dade disto uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum agente de realce de nível de S1P de acordo com a reivindicação 30, emque a doença ou distúrbio é artrite reumatóide, asma, dermatite atópica, do-ença de Behcet, doença do enxerto versus hospedeiro, lúpus eritematoso,esclerose múltipla, polinose, psoríase, rejeição de transplante ou uveíte.

119. Método de tratamento, controle ou prevenção de uma do-ença ou distúrbio, que compreende administrar a um paciente em necessi-dade disto uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum composto de acordo com a reivindicação 59, 84, 96 ou 108, em que adoença ou distúrbio é artrite reumatóide, asma, dermatite atópica, doença deBehcet, doença do enxerto versus hospedeiro, lúpus eritematoso, esclerosemúltipla, polinose, psoríase, rejeição de transplante ou uveíte.