BRPI0710339A2 - método de modulação de uma reação imunólogica, método de redução e extrato - Google Patents

Abstract

<B>MéTODO DE MODULAçãO DE UMA REAçãO IMUNOLOGICA, MéTODO DE REDUçãO E EXTRATO<D> A presente invenção refere-se a um método de modulação de uma reação imune entre linfócitos e um corpo reconhecido pelos linfócitos como exógeno. O método explora a atividade imunomoduladora de uma nova classe de células progenitoras denominadas HUCPVCs derivadas da região perivascular de cordão umbilical humano. O método pode também empregar fatores solúveis exudados por HUCPVCs cultivadas, O método é útil para o tratamento de disfunções imunológicas que incluem doença de enxerto contra hospedeiro, disfunções auto-imunes e similares.

Description

"MÉTODO DE MODULAÇÃO DE UMA REAÇÃO IMUNOLÓGICA, MÉTODO

DE REDUÇÃO E EXTRATO"Campo da Invenção

A prese nte invenção refere-se a células progenitoras que sãoimunoprivilegiadas e/ou imunomoduladoras, sua produção, sua formulação eseu uso terapêutico.

Antecedentes da Invenção

A medula óssea (BM) de adultos é a fonte mais comum de célulasprogenitoras/hastes mesenquimais (MSCs) (também denominadas CélulasEstromais Mesenquimais1) que são definidas funcionalmente pela suacapacidade de diferenciação nos tecidos do esqueleto: osso2"4, cartilagem5"7,gordura8 e músculo9 in vitro. MSCs são classicamente diferenciadas do meioheterogêneo de células por meio de adesão a plástico de cultivo de tecidos eda formação de fibroblastas de unidades de colônia (CFU-Fs), cuja freqüênciaé de 1:100.000 a 1:500.000 células nucleadas em medula de adultos10 eestudos recentes identificaram um conjunto de marcadores com os quais asMSCs são classificadas10,11. Esta baixa proporção de MSCs gera anecessidade de expansão e seleção de cultivo antes do uso para atingir osnúmeros de células apropriados para qualquer tipo de terapia celular. Existemoutras fontes emergentes de MSCs1 tais como: tecido de adipose12, ossotrabecular13 e fígado de feto14, que possuem uma freqüência CFU-F de: 1:3215,1:63613 e 1:88.49514, respectivamente. Embora o tecido de adiposeaparentemente possua a freqüência de progenitores mais alta, o tempo para odobro destas células varia de 3,6 a 4,4 dias15 e o procedimento de extração écomplicado, invasivo e demorado12. A colheita de osso trabecular resulta embaixo rendimento de células (89 χ 106 células/grama de osso de doadoresjovens13), especialmente em combinação com a freqüência de CFU-F; e éextremamente invasiva, resultando em morbidez local do doador.São exclusivas entre essas novas fontes de MSCs as célulasperivasculares do cordão umbilical humano (HUCPVCs)1 que são uma fonte decélulas altamente proliferativa e facilmente acessível de células com um tempopara o dobro da população de vinte horas (dependendo do soro)16. Afreqüência de CFU-Fs em HUCPVCs é de 1:300 na passagem O1 mas aumentapara 1:3 na passagem I171 que é ordens de magnitude mais alta que a medulaóssea16. HUCPVCs representam, portanto, uma população de células comproporção extremamente alta de MSCs que processam a divisão muitorapidamente, de forma a torná-las excelentes candidatas para terapiasmesenquimais clínicas. Estas células vêm sendo utilizadas em vários testespara determinar o seu fenótipo de expressão de marcador e potencial dediferenciação16,18 e concluiu-se que são bioequivalentes a BM-MSCs ouapresentam melhor desempenho que estas.

Além da sua capacidade de diferenciação, MSCs tambémpossuem usos imunológicos potenciais, pois demonstrou-se que BM-MSCs sãoimunoprivilegiadas e imunomoduladoras19"21. Estes termos designam acapacidade de uma célula de evitar o reconhecimento de um sistemaimunológico de hospedeiro não coincidente e a capacidade de reduzir umareação em andamento por aquele sistema, respectivamente. MSCs de váriasfontes diferentes de medula óssea foram testadas para determinar a suaimunogenicidade em cultivos in vitro. Demonstrou-se que MSCs de tecido deadipose derivado de dermolipectomias adultas são capazes de imunoprivilégioe imunomodulação in vitro22, enquanto se concluiu que células de fígado defeto são capazes de evitar uma reação imunológica não coincidente, mas nãoforam capazes de modular a alorreatividade causada por duas populações nãocoincidentes de linfócitos23,24. Desta forma, a fonte de MSCs afeta diretamenteas capacidades imunogênicas dessas células.

Este trabalho in vitro começou a ser validado no ambiente clínico;um menino, por exemplo, foi resgatado de doença de enxerto contrahospedeiro (GvHD) severa aguda por meio de transfusão de MSCs de medulaóssea haploidêntica de sua mãe25. Um ano após o tratamento, em comparaçãocom um conjunto de pacientes que sofria do mesmo nível de severidade dadoença, ele foi o único que sobreviveu. Desde esse paciente inicial, umconjunto de oito pacientes foi tratado com BM-MSCs, dos quais seis exibiramcompleta remissão de sintomas26. BM-MSCs alogenéicas também vêm sendoutilizadas em Mal de Crohn para o tratamento de pacientes que são refratáriosaos tratamentos atuais e esse tratamento atualmente encontra-se em testesclínicos nos Estados Unidos27,28. MSCs de fígado de feto demonstrarameficácia no tratamento inicial de imperfeições da osteogênese (OI). MSCs deum fígado de feto masculino foram transplantadas para um feto feminino com32 semanas não relacionado com Ol severa, que havia sofrido várias fraturasintrauterinas29. Após o transplante, o restante da gravidez prosseguiunormalmente e não houve fraturas adicionais. Esta paciente foi acompanhadapor dois anos após o nascimento e a criança demonstrou curva de crescimentonormal e sofreu apenas três fraturas. Utilizando uma sonda específica de XY,concluiu-se que a paciente possui 0,3% de enxerto em uma biópsia óssea.

Além de células não diferenciadas, concluiu-se que BM-MSCs decoelho induzidas osteogenicamente são imunoprivilegiadas eimunomoduladoras in vitro, mas, quando transplantadas in vivo, a capacidadeimunomoduladora era perdida30. Isso não afetaria, entretanto, o funcionamentodas células, pois necessitaria apenas de proteção de uma reação imunológicapara desempenhar o seu papel. Em uma indução mais envolvida, MSCs demedula óssea murina foram manipuladas para liberar eritropoietina eimplantadas em camundongos, o que resultou em enxerto significativamentemenor em comparação com controles não manipulados31. Desta forma, amanipulação de MSCs pode gerar a sua perda de imunomodulação e/ouimunoprivilégio, podendo ser fundamental para a sobrevivência efuncionamento do enxerto.

Existem provas que sustentam que o imunoprivilégio de MSCstranscende as barreiras das espécies e elas podem ser utilizadas de formaxenogenéica. Isso foi demonstrado em primeiro lugar por Bartholomew etal, que utilizaram BM-MSCs em babuínos e demonstraram aumento dasobrevivência de enxerto da pele21. Embora o resultado final deste estudofosse positivo, o destino específico das células administradas não foideterminado. Wang et al utilizaram células transfectadas com GFP eanálises histológicas para estudar a sobrevivência de BM-MSCsxenogenéicas e demonstraram que as células sobrevivem até a décima-primeira semana sem imunossupressão, mas houve aumento da reaçãoimune ao hospedeiro32. Também se relatou que MSCs sobrevivem emtransplantes xenogenéicos em dois modelos cardíacos33,34. Em trabalhospreliminares com HUCPVCs, as células foram fornecidas por via peritonealem câmaras permeáveis. Após três semanas, não houve inflamaçõesobserváveis mediante visualização macroscópica35. Isso é um trabalhopreliminar encorajador que indica o potencial não apenas para oimunoprivilégio de HUCPVCs, mas também a sua capacidade de teste emmodelos animais sem rejeição.

Os inventores pesquisaram as propriedades imunoprivilegiadas eimunomoduladoras de HUCPVCs in vitro por meio da condução de: cocultivosde HUCPVCs com linfócitos não coincidentes e misturas de cultivos delinfócitos (MLCs) povoadas por dois doadores não coincidentes HLA Tambémse estudou a morte de HUCPVCs, proliferação e ativação de linfócitos comníveis variáveis de HUCPVCs presentes em ambientes de linfócitos ativados enativos. Além disso, foi pesquisada a necessidade de contato celular paraobservação de efeitos imunológicos.Descrição Resumida da Invenção

Os inventores relatam no presente uma série de experimentosque ilustram as capacidades imunoprivilegiadas e imunomoduladoras deHUCPVCs quando testadas em cultivos de linfócitos misturados (MLCs) in vitrode duas vias. Além disso, foram realizadas MLCs que revelam uma reduçãoinduzida por HUCPVC mediante a ativação de linfócitos simuladosanteriormente. Os inventores demonstram ainda que a funçãoimunomoduladora de HUCPVC é mediada por meio de um ou mais fatoressolúveis produzidos a partir do cultivo das HUCPVCs, pois o contato celularnão é necessário para que se observe o efeito imunomodulador. Além disso, osinventores ilustram que HUCPVCs são capazes de modular uma MLC in vitrode duas vias e descrevem o uso dessas células para aplicações em terapiacelular, particularmente para modular a reação imunológica.

Desta forma, em um dos seus aspectos, a presente invençãofornece um método de tratamento de um paciente que apresenta ou possuirisco de desenvolver uma reação imune adversa, que compreende a etapa deadministração ao paciente de uma quantidade imunomoduladora eficaz de (1)uma população celular que compreende e preferencialmente consisteessencialmente de células perivasculares do cordão umbilical humano(HUCPVCs) e/ou (2) um fator solúvel imunomodulador produzido mediante ocultivo das mencionadas células. Em realizações relacionadas, o método éaplicado ao tratamento de pacientes com enxertos alogenéicos ouxenogenéicos, incluindo células, tecidos e órgãos, para reduzir a instalação oua severidade de reações imunológicas adversas, incluindo doença de enxertocontra hospedeiro. Em um aspecto geral, a presente invenção fornece,portanto, um método de modulação de reação imunológica entre linfócitos, taiscomo linfócitos do sangue periférico, e um corpo reconhecido pelos linfócitoscomo exógeno, que compreende a etapa de introdução de uma formulação quecompreende um veículo fisiologicamente tolerável e células HUCPV ou fatoressolúveis imunomoduladores que delas são extraíveis, em uma quantidadeeficaz para modular e, particularmente, para inibir ou reduzir aquela reaçãoimunológica.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece o usode células HUCPVC ou um fator solúvel imunomodulador produzido por meiodelas na fabricação de um medicamento para o tratamento de pacientes quepossuem ou encontram-se em risco de desenvolver uma reação imunológicaadversa, ou para o tratamento de um enxerto antes do transplante, para reduzirou aliviar a reação imunológica entre o enxerto e o paciente.

Em outro dos seus aspectos, a presente invenção fornece umaformulação, em forma de dosagem unitária ou em forma de múltiplasdosagens, que compreende uma quantidade eficaz para a imunomodulação deHUCPVCs e/ou um fator solúvel imunomodulador produzido por meio dela eum veículo fisiologicamente tolerável para tanto.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um extratoimunomodulador ou uma de suas frações imunomoduladoras, que compreendeum ou mais fatores solúveis produzidos por HUCPVCs cultivadas.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método detratamento conforme descrito no presente, em que as células administradassão obtidas e administradas sem armazenagem criogênica.

Em um aspecto adicional da presente invenção, as HUCPVCsadministradas são células imunoprivilegiadas e imunomoduladoras. Emalgumas realizações, as HUCPVCs substancialmente não contêm os fenótiposMHC classe I e MCH classe II. Em uma realização relacionada, as HUCPVCsadministradas são obtidas por meio de descongelamento de uma população deHUCPVCs congeladas.

Em uma realização adicional da presente invenção, as HUCPVCsimunoprivilegiadas administradas são elaboradas geneticamente e incorporamum transgene que codifica uma proteína heteróloga de interesse, particularmas não exclusivamente que inclui uma proteína eficaz para administrar osistema imunológico tal como uma proteína que aumente aimunomodulação, especialmente uma proteína que inibe a reaçãoimunológica adversa, tal como CTLA4.

Estes e outros aspectos da presente invenção são descritos commais detalhes abaixo, com referência às Figuras anexas.

Breve Descrição das Figuras Figura 1: contagens celulares de HUCPVCs após sete dias emtratamento pós-MMC de cultivo (n = 2). As células foram tratadas comconcentrações variáveis de MMC por vinte minutos a 37 0C a 5% de CO2 etestadas para determinar a sua proliferação. Todas aparentemente sãosignificativamente mais baixas que o controle (p < 0,001). Figura 2: proliferação de células colocadas em placas, emcavidades tratadas e não tratadas com MMC. A proliferação foi medidautilizando citometria de fluxo para BrdU e quantificada utilizando intensidade defluorescência média. Não houve diferença significativa entre cavidades tratadase não tratadas (p = 0,62). Figura 3: a morte de HUCPVCs foi medida utilizando intensidadede fluorescência média (MFI) para anexina 5, um marcador da morte celularprecoce, após quatro horas de coincubação com PBLs do Doador 1 (n = 5).Houve um aumento significativo da média de expressão de anexina 5 no cultivocom 10% de HUCPVCs com relação ao controle (p = 0,01, indicado por *); estefoi o único aumento significativo.

Figura 4: a proliferação de linfócitos foi medida utilizandointensidade de fluorescência média (MFI) para BrdU, após seis dias decoincubação com níveis variáveis de HUCPVCs (n = 5). Houve um aumentosignificativo da expressão média de BrdU no cultivo com 10% de HUCPVCscom relação ao controle (p = 0,02, indicado por *).

Figura 5: o número total de células de linfócitos foi medido do dia1 ao 6 ao longo de tratamentos de 10% e 40% HUCPVCs adicionadas no dia 0,3 ou 5 (n = 3). Pode-se observar que, no dia 6, os linfócitos controleaumentaram de quantidade por reação entre si, enquanto os tratamentos comHUCPVCs foram significativamente mais baixos, independentemente dopercentual ou dia de adição (p < 0,05, indicado por *).

Figura 6: a contagem total de linfócitos foi medida do dia 1 ao 6 aolongo de tratamentos de 10 e 40% HUCPVCs adicionadas sobre um insertoTransWelI® (n = 3). Pode-se observar que, em qualquer dia, não houvediferença significativa entre o controle alogenéico e os tratamentos comHUCPVCs.

Figura 7: HUCPVCs não aumentam o número de células delinfócitos ativadas ou em repouso. A adição de HUCPVCs não exibiu aumentosignificativo do número de células de linfócitos em comparação com controlesao longo de seis dias de cultivo (n = 6). Esta figura exibe os números médiosde células + desvios padrões.

Figura 8: expressão de BrdU de PBLs em um cocultivo comHUCPVCs medida com citometria de fluxo. O percentual de divisão celular nãoaumenta com a adição de HUCPVCs, independentemente da dosagem (n = 3).O controle foi a expressão de BrdU dos PBLs sem HUCPVCs.

Figura 9: HUCPVCs agem por meio de um fator solúvel.HUCPVCs podem reduzir significativamente o número de células de linfócitosem MLCs, quando separadas utilizando um inserto TransWelI. O número médiode células de linfócitos controle foi definido em 100% na figura para reduzir avariação de contagens entre os experimentos. Esta figura exibe percentualmédio de contagens de células de linfócitos + desvio padrão (n = 6) (p* < 0,05).Figura 10: HUCPVCs reduzem a expressão de CD25 emcocultivos de linfócitos ativados. Esta figura ilustra o percentual médio deexpressão (barra) e a intensidade média de fluorescência (linha) de expressãode CD25 sobre linfócitos cocultivados com e sem 10% HUCPVCs. Os linfócitosforam manchados com PKH26 para garantir a detecção adequada dapopulação e os resultados são emitidos sobre expressão de PKH26. As médiassão ± desvios padrões (n = 3) (*p < 0,05).

Figura 11: expressão de CD45 em MLC de duas vias (comlinfócitos ativados) com HUCPVCs. Os linfócitos ativados foram manchadoscom PKH26 para delineá-los a partir da população inativa e os resultados sãoemitidos sobre expressão de PKH26. São exibidos o percentual de expressão(barra * ρ < 0,05) e MFI (linha + ρ < 0,05) (η = 3). O controle foi a expressão deCD45 do ATL sem HUCPVCs.

Figura 12: (a) HUCPVCs transfectadas com ProteínaFluorescente Verde (GFP), com nível de expressão de 97,89%. (b) Estascélulas foram transfectadas com um vetor lentiviral, utilizando métodosestabelecidos.

Figura 13: Resultados de Conjunto de Gene Pathfinder de Câncerde Alto Rendimento para MSCs derivadas de medula óssea (A) e HUCPVCs(B). Os genes entre parênteses representam os genes ausentes.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece aplicações inovadoras eclinicamente úteis de HUCPVCs, particularmente no tratamento de condiçõesque se beneficiariam de uma redução da reação adversa oferecida por corposaloantigênicos e xenoantigênicos, resultantes de uma reação imunológicaadversa do hospedeiro ou de uma reação imunológica adversa do corpoantigênico ao hospedeiro. Mais geralmente, a presente invenção fornece ummétodo em que HUCPVCs e/ou fatores solúveis produzidos por eles sãointroduzidos para inibir ou reduzir reações imunológicas entre linfócitos ecorpos reconhecidos como exógenos.

Da forma utilizada no presente, esses corpos podem incluir ummaterial biológico vivo ou morto que seja fornecido ou invasivo ao corpo de ummamífero, incluindo seres humanos. Antigênicos são os corpos em que, nocurso normal, permitem uma reação imunológica, seja pelo recipiente ou pelocorpo, tal como em que o próprio corpo compreende células imunes queincluem linfócitos, como enxerto de órgãos, tecido ou medula óssea. Corposaloantigênicos são corpos que são antigênicos entre indivíduos da mesmaespécie; corpos xenoantigênicos são antigênicos entre indivíduos de espéciesdiferentes. Corpos autólogos são corpos do paciente. Em algumas realizações,os corpos são corpos não coincidentes de HLA. Em outras realizações, oscorpos compreendem linfócitos não coincidentes de HLA.

Embora o mecanismo de ação imunomoduladora de HUCPVCnão seja completamente compreendido, espera-se que as HUCPVCs e fatoressolúveis por elas produzidos possuam um efeito sobre as populações decélulas principais envolvidas no reconhecimento e eliminação de aloantígenos,tais como células que apresentam antígenos, células T incluindo células Tcitotóxicas e células matadoras naturais.

As HUCPVCs úteis no presente método são descritas naliteratura, conforme indicado acima, e são caracterizadas mais particularmentecomo células progenitoras extraíveis da região perivascular de cordãoumbilical, que inclui, mas sem limitar-se a cordão umbilical humano. Utilizandoo protocolo descrito no presente, apreciar-se-á que as células perivascularesdo cordão umbilical podem também ser extraídas da vasculatura do cordãoumbilical de outros mamíferos, incluindo cavalos, vacas, porcos, primatas esimilares. A região perivascular compreende a geléia de Wharton associada àvasculatura do cordão umbilical e externa com relação a ela. As HUCPVCs sãoextraíveis da geléia de Wharton que repousa na região perivascular, utilizandométodos padrão de digestão tais como com colagenase ou enzimasrelacionadas apropriadas para a remoção de tecido conectivo associado,conforme descrito, por exemplo, por Sarugaser et al, 2005, cujo teor integral é incorporado ao presente como referência. Preferencialmente, HUCPVCs sãocolhidas apenas das células perivasculares e não da geléia de Wharton que seestende além da região perivascular, ou de tecidos ou fluidos que são parte daprópria vasculatura ou internos a ela. Isso evita a contaminação por outrascélulas geralmente no interior do cordão. Alternativamente, pode ser realizada extração da geléia de Wharton sem seleção de células perivasculares, desdeque a população celular resultante seja enriquecida para HUCPVCs, utilizando,por exemplo, citometria de fluxo para enriquecer células progenitoras quepossuem o fenótipo e as características indicadas no presente. As HUCPVCssão adicionalmente caracterizadas por proliferação relativamente rápida, exibindo tempo para o dobro, em cada uma das passagens 2 a 7, de cerca devinte horas (dependendo do soro), quando cultivadas sob condições aderentespadrão. Fenotipicamente, as HUCPVCs são caracterizadas, na colheita, comoOct 4-, CD14-, CD19-, CD34-, CD44+, CD45-, CD49e+, CD90+, CD105(SH2)+, CD73 (SH3)+, CD79b-, HLA-G-, CXCR4+, c-kit+. Além disso, HUCPVCs contêm células que são positivas para CK8, CK18, CK19, PD-L2,CD146 e 3G5 (um marcador pericítico), em níveis mais altos que empopulações celulares extraídas de fontes de geléia de Wharton diferentes daregião perivascular.

HUCPVCs podem também expressar níveis variáveis de MHC classe I de 0 a 100%, dependendo da manipulação. Ao submeter as célulascolhidas a um ciclo de congelamento e descongelamento, conforme descrito,por exemplo, por Sarugaser et al, 2005, incorporado ao presente comoreferência, obtém-se uma população de HUCPVC que é substancialmentenegativa para MHC classe I e MHC classe Il (95%). Da forma utilizada nopresente, as HUCPVCs são consideradas "substancialmente" negativas paraMHC classe I e MHC classe Il caso o número de células residentes em umadada população e que expressam um ou os dois fenótipos não seja de mais decerca de 20% da população celular, tal como não mais de 15%, 10%, 5% oumenos da população total de HUCPVCs. Pode-se realizar uma determinaçãoutilizando métodos padrão de citometria de fluxo com anticorpo marcadoapropriado. Esta população de HUCPVCs negativa dupla de MHC éparticularmente útil nos métodos de acordo com a presente invenção. Apreciar-se-á que, no presente método, a população de HUCPVCs administrada podecompreender células negativas classe I de MHC recém extraídas(opcionalmente expandidas) ou as HUCPVCs negativas duplas de MHCdescongeladas. As HUCPVCs negativas duplas de MHC são muito menospropensas a estimular uma reação imunológica em pacientes e o seu usoclínico é, conseqüentemente, preferido no presente. Dever-se-á observar,entretanto, que a manipulação do fenótipo de MHC não é essencial. Aspropriedades de imunoprivilégio e imunomodulação também são observadasem HUCPVCs recém extraídas que foram opcionalmente armazenadas e nãoapenas em HUCPVCs que tenham sido manipuladas por meio decongelamento e descongelamento.

No método do presente, HUCPVCs são exploradas pelas suaspropriedades imunoprivilegiadas e imunomoduladoras, em um ambiente clínicoque se beneficiaria delas. O termo "imunoprivilegiada" é utilizado no presentecom referência a células, tais como HUCPVCs, que, quando incubadas comlinfócitos do sangue periférico, não estimulam a proliferação de PBL até umponto estatisticamente significativo ou retêm a sua viabilidade em um nívelestatisticamente significativo, particularmente quando testadas utilizando ochamado teste MLC de uma via estabelecido nesta técnica e exemplificado nopresente.

O termo "imunomodulador" é utilizado no presente com referênciaà capacidade das HUCPVCs de migrar, reduzir ou inibir a reação entrepopulações não coincidentes de linfócitos, conforme revelado por uma reduçãoda mortalidade de uma população de linfócitos, ou pelo aumento da viabilidadede uma população de linfócitos, conforme determinado utilizando, por exemplo,a chamada reação de linfócitos misturados (MLR) de uma ou duas formas.

Constatou-se ainda que fatores exudados por HUCPVCs emcultivo podem isoladamente exercer um efeito imunomodulador, do tipoobservado ao utilizar-se HUCPVCs intactas. Desta forma, em aspectos erealizações da presente invenção, os fatores solúveis extraídos produzidosmediante cultivo de HUCPVCs são utilizados isoladamente ou em combinaçãocom as células HUCPV, como imunomoduladores.

O um ou mais fatores imunomoduladores exudados mediantecultivo de HUCPVC são denominados no presente fatores solúveis e sãoextraíveis do meio em que HUCPVCs são cultivadas. Em uma realização, osfatores solúveis imunomoduladores são fornecidos na forma de um extratoobtido quando células HUCPVC são removidas do meio condicionado pelo seucrescimento, tal como por meio de centrifugação. Ao empregar-secentrifugação, o extrato é fornecido na forma de sobrenadante. Condições decultivo de HUCPVCs apropriadas são exemplificadas no presente. O extrato éobtido por meio de separação das células do meio de cultivo condicionado, talcomo por meio de centrifugação. Em outras realizações, os fatores solúveissão fornecidos na forma de uma fração imunomoduladora desse extrato. Umafração de extrato que possui atividade imunomoduladora também é útil nopresente e pode ser identificada utilizando as reações de linfócitos misturadosdescritas no presente. Estas frações de extrato naturalmente podem serobtidas por meio de fracionamento do extrato de HUCPVC utilizando qualquermétodo conveniente, incluindo extração de solvente, fracionamento de HPLC,centrifugação, exclusão de tamanhos, sal, fracionamento de gradiente osmóticoe similares. Frações eluídas ou recolhidas podem ser submetidas em seguida aMLR, pod em ser identificadas frações ativas para imunomodulação e umafração com atividade imunomoduladora pode ser utilizada clinicamente daforma descrita no presente.

Desta forma, em algumas realizações, a presente invençãocompreende o uso de extratos imunomoduladores ou suas fraçõesimunomoduladoras que compreendem fatores solúveis exudados durante ocultivo de HUCPVCs.

O uso das HUCPVCs e suas populações que sãoimunoprivilegiadas e/ou imunomoduladoras, de acordo com a presenteinvenção, inclui a sua coleção, opcionalmente sua expansão, opcionalmenteainda a sua armazenagem criogênica e o seu renascimento a partir do estadocongelado e sua formulação subseqüente para administração para o pacientedesejado. O regime específico de manipulação, dosagem e tratamentonaturalmente dependerá de vários fatores, que incluem o tipo e a severidadeda doença ou a condição a ser tratada. Para condições imunológicas (taiscomo GvHD1 condições auto-imunes), o tamanho da população de HUCPVCs,ou seja, a dose administrada ao paciente, repousará geralmente na faixa de0,01 a cerca de cinco milhões de células por quilograma de peso do corpo dopaciente. Para fornecimento, as células são fornecidas adequadamente naforma de formulação que compreende adicionalmente um veículofisiologicamente tolerável, ou seja, um veículo que é tolerável não apenas pelascélulas mas também pelo paciente. Adequadamente, as células são fornecidasem uma formulação estéril que compreende, como veículo, um veículofisiologicamente tolerável tal como solução salina, solução salina tamponada talcomo PBS, meio de cultivo de células ou líquido similar que contém qualquerum dentre: aminoácidos essenciais, fatores do crescimento, citocinas,vitaminas, antibióticos ou meios definidos quimicamente livres de soro etc., ouágua esterilizada. As células formuladas podem ser administradas por meio deinfusão ou de injeção, utilizando, por exemplo, volumes na faixa de 1 a 25 ml.

Os fatores solúveis imunomoduladores produzidos por HUCPVCse extraíveis a partir de meio de cultivo de HUCPVCs gastos são úteis, de formasimilar, conforme descrito acima com referência a HUCPVCs intactas. Em umarealização, o próprio extrato constitui a composição farmacêutica, de forma acompreender o agente ativo na forma de fator solúvel imunomodulador, e omeio que constitui o veículo fisiologicamente tolerável. Alternativamente, oextrato pode ser seco para reter o(s) fator(es) solúvel(is) e reconstituído em umveículo diferente, tal como solução salina tamponada com fosfato. O tamanhoda dosagem e o regime de dosagem apropriados para aplicações clínicaspodem ser determinados com referência à dosagem eficaz para HUCPVCsintactas. O equivalente de dosagem de extrato pode ser determinadocalculando-se as potências relativas do extrato e células intactas no teste deMLR ou qualquer de suas alternativas que reflita o ambiente clínico no qual aterapia será explorada, tal como em modelos animais apropriados da indicaçãodesejada.

Durante o uso, as HUCPVCs formuladas ou fatores solúveisproduzidos desta forma são administrados para tratar pacientes queexperimentam ou encontram-se em risco de desenvolver uma reaçãoimunológica adversa. Esses pacientes incluem particularmente pacientes querecebem ou estão por receber um enxerto ou transplante xenogênico oualogenéico, na forma de células tais como medula e sangue periférico, tecidosque incluem tecido vascular e pele incluindo tecido coronariano e tecidogastrointestinal, ou um órgão tal como fígado, rim, coração, pulmão etc. AsHUCPVCs formuladas são particularmente úteis para reduzir o início ou aseveridade de doença de enxerto contra hospedeiro, uma condição resultantede um ataque imunológico de tecidos hospedeiros mediado por linfócitospresentes no enxerto doador. Em uma realização da presente invenção, asHUCPVCs podem ser utilizadas para tratar o enxerto por meio de incubaçãocom elas por um período de tempo, antes do transplante, suficiente parareduzir ou suspender a atividade de linfócitos residentes no enxerto. Estaincubação necessitaria da inclusão de HUCPVCs (de estoque fresco oucongelado) em uma dosagem de 5 a 60% do total de linfócitos de enxerto(conforme determinado pelo volume de sangue presente no enxerto), preferencialmente 10 a 40% para quatro a dez dias, a fim de suspender aproliferação antes do implante. No caso de um enxerto de órgão, o órgão seriaincubado com HUCPVCs (suspensas em um veículo fisiologicamente tolerável,conforme mencionado acima) de estoque fresco ou congelado, em umadosagem de 0,01 a 5 χ 103 células por grama de massa do órgão, antes do implante, por um período de tempo para fazer com que os linfócitos do órgãotornem-se inativos. Para pacientes que recebem enxerto, as HUCPVCs sãodesejavelmente administradas no tecido diretamente em volta do órgãoalogenéico ao paciente antes (tal como algumas horas antes), durante oudepois do enxerto (tal como algumas horas depois e posteriormente conforme o necessário para controlar a reação imunológica). As HUCPVCs podem seradministradas, mais adequadamente no local do enxerto, tal como por meio deinfusão ou injeção, seja por via subcutânea, intramuscular, intravascular,intravenosa, intraarterial ou intraperitoneal. Em uma realização, o paciente étratado no momento do enxerto por meio de infusão com doses de HUCPVCs na faixa de 5 χ 104 a 5 χ 107 células por quilograma de peso do corpo, tal comocerca de 1 a 5 χ 106 células. As células são formuladas em 10 ml de soluçãosalina normal com albumina de soro humano a 5%. Podem ser utilizadas duasou mais infusões, em que cada qual dura cerca de dez a quinze minutos. Ascélulas podem também ser implantadas em uma formulação de liberação lentaque permite a liberação de células viáveis ao longo do tempo no local deimplante (tal como intraperitoneal, intramuscular etc.). Veículos apropriadospara este propósito incluem gelatina, ácido hialurônico, alginato e similares. Emuma outra realização da presente invenção, HUCPVCs podem ser utilizadaspara o tratamento de condições imunológicas tais como GvHD que seencontram em andamento e possivelmente são refratárias a outrostratamentos. As HUCPVCs ou os fatores solúveis exudados, desta forma,serão úteis para tratar pacientes que sofrem de Ieucemias1 anemias aplásticase deficiências imunológicas ou enzimáticas para as quais é indicado otransplante de tecidos ou células imunes que as contêm.

A administração de HUCPVCs ou os fatores solúveis tambémpossui aplicação no tratamento de doenças auto-imunes, tais como mal deCrohn, lúpus e esclerose múltipla, bem como artrite reumatóide, diabetesmellitus dependente de insulina do tipo 1, síndrome de tensão respiratória emadultos, doença intestinal inflamatória, dermatite, meningite, púrpuratrombocitopênica trombótica, síndrome de Sjogren, encefalite, uveíte,deficiência de adesão de leucócitos, febre reumática, síndrome de Reiter,artrite psoriática, esclerose sistêmica progressiva, cirrose biliar primária,miastenia grave, eritematose do lúpus, vasculite, anemia perniciosa, doençasmediadas por complexo de antígenos e anticorpos, síndrome de Reynard,glomerulonefrite, hepatite ativa crônica, doença celíaca, complicações auto-imunes de AIDS, espondilite anquilosante e mal de Addison. A administraçãode HUCPVCs neste caso é intravenosa em um veículo fisiologicamentetolerável (conforme mencionado anteriormente), com uma dose que varia de0,1 a 10 χ 106 células por quilograma de peso do corpo. Mais de uma dosepode ser necessária e a dosagem pode ser repetida conforme o necessário.

Em segundo lugar, HUCPVCs podem ser utilizadas para otratamento de deficiências de proteínas e enzimas, em que as HUCPVCstenham sido transfectadas com o gene necessário para produzir aenzima/proteína desejada. Este processo pode incluir transdução (incluindo,mas sem limitar-se a: lentiviral, retroviral e adenoviral); e transfecção (incluindo,mas sem limitar-se a: nucleofecção, eletroporação e lipossomal) e sofremtransfusão em um paciente que sofre de uma deficiência. A dose administradaao paciente repousará geralmente na faixa de 0,01 a cerca de cinco milhões decélulas por quilograma de peso do corpo do paciente. HUCPVCs produzirãoem seguida a proteína ou enzima de interesse de forma constitutiva.

Por fim, as HUCPVCs podem ser elaboradas para introduzirtransgenes, por meio dos métodos de transfecção mencionados acima, parauso como vacinas, a fim de gerar grandes quantidades de administração apessoas em risco de exposição a vírus/antígenos específicos.

Materiais ε Métodos

Colheitas celulares:

HUCPVCs:

O consentimento ético para esta pesquisa foi obtido por meio daUniversidade de Toronto, bem como do Centro de Ciências Médicas doSunnybrook & Women's College. Cordões umbilicais foram recolhidos departos de cesariana assépticos de bebês de gestação total, após obter-seconsentimento informado dos dois pais. Os cordões foram transportadosimediatamente para a Universidade de Toronto, onde as células foramextraídas da área perivascular sob condições estéreis conforme relatadoanteriormente16. Resumidamente, seções de 4 cm de cordão foram cortadas eo epitélio foi removido. Os veículos foram extraídos em seguida, incluindo suageléia de Wharton circunvizinha, amarrados em um laço para evitar digestão demúsculos moles e digeridos por uma noite em uma solução de colagenase.Mediante remoção da digestão no dia seguinte, as células foram enxaguadasem cloreto de amônio para Iisar quaisquer glóbulos vermelhos do sangue dosangue do cordão. Em seguida, as células foram enxaguadas e colocadas emplacas em α-MEM a 85% contendo 5% de soro de feto bovino e 10% deantibiótico (penicilina G a 167 unidades/ml; Sigma, gentamicina 50 μg/ml;

Sigma e anfotericina B 0,3 μg/ml) sob densidade de 4000 células/cm2. Ascélulas são passadas quando atingirem 75 a 80% de confluência, o que ocorrea cada cerca de seis a sete dias.

MHC -/- HUCPVCs

Populações de células de teste de >1 χ 105 células foram lavadasem PBS contendo 2% FBS e novamente suspensas em PBS + 2% FBS comconcentrações de saturação (diluição 1:100) do IgGI de camundongoconjugado a seguir HLA-A1B1C-PE (BD Biosciences n° 555553, Lote M076246)(MHC I), HLA-DR, DP, DQ-FITC (BD Biosciences n° 555558, Lote M074842)(MHC II) e CD45-Cy-Cychrome (BD Biosciences n° 555484, Lote 0000035746)por trinta minutos a 4 °C. A suspensão celular foi lavada duas vezes com PBS+ 2% FBS e novamente suspensa em PBS + 2% FBS para análise em umcitômetro de fluxo (XL, Beckman-Coulter, Miami FL) utilizando o softwareExpoADCXL4 (Beckman-Coulter). Manchas positivas foram definidas como aemulsão de um sinal de fluorescência que excedeu os níveis obtidos em >99%de células da população controle manchadas com anticorpos de isotiposcoincidentes (padrões de isotipos monoclonais IgGI1K de camundongoconjugados a cicromo FITC, PE e Cy, BD Biosciences), o que foi confirmadopor meio de fluorescência positiva de amostras de BM humanas. Para cadaamostra, pelo menos dez mil eventos de modo de lista foram recolhidos. Todasas plotagens foram geradas em software de análise EXPO 32 ADC.

As células anexas foram subcultivadas (colocadas em passagem)utilizando solução de tripsina a 0,1% após sete dias, momento em que exibiramconfluência de 80 a 90% conforme observado por meio de microscopia de luz.Mediante passagem, as células foram observadas por meio de citometria defluxo para determinar a expressão de MHC-A, B, C, MHC-DR, DP, DQ e CD45.

Estas foram colocadas em placas em frascos de poliestireno de cultivo detecidos de tecido T-75 em 4 χ 10^3 células/cm2 em SM e tratadas com 10~8 MDex, 5 mM de β-GP e 50 μg/ml de ácido ascórbico para testar a capacidadeosteogênica destas células. Estes frascos foram observados nos dias 2, 3, 4, 5e 6 do cultivo para formação de CFU-01 ou nódulos de ossos. Quaisquercélulas residuais do procedimento de passagem também foramcriopreservadas para uso futuro.

Parcelas de 1 χ 10^6 células PVT foram preparadas em 1 ml devolume total que consiste de 90% FBS1 10% sulfóxido de dimetila (DMSO)(Sigma D-2650, Lote n° 11K2320) e colocadas com pipetas em crioampolas depolipropileno de 1 ml. As ampolas foram colocadas em um congelador a -70°Cpor uma noite e transferidas no dia seguinte para um congelador a -150°C paraarmazenagem a longo prazo. Após uma semana de criopreservação, as célulasPVT foram descongeladas e observadas para determinar citometria de fluxopara expressão de MHC-A, B, C, MHC-DR, DP, DQ e CD45. Foi utilizado umsegundo protocolo, no qual as células PVT foram descongeladas após umasemana de criopreservação, novamente cultivadas por uma semana,subcultivadas e reanalisadas em seguida por meio de citometria de fluxo paraexpressão de MHC-A, B, C, MHC-DR, DP, DQ e CD45.

Observou-se que a freqüência de MHC-/- na população de célulasnovas é mantida ao longo de várias passagens. Quando células novas sãocongeladas após passagem, a -150 °C por uma semana e analisadasimediatamente em seguida para determinar o fenótipo de MHC1 esta populaçãoanalisada exibe uma freqüência notadamente aprimorada de células dofenótipo MHC -/-. Particularmente, a primeira passagem de célulascriopreservadas aumenta a população relativa de células MHC -/- para mais de50% e congelamento subseqüente e passagem dessas células gera umapopulação MHC -/- de mais de 80%, 85%, 90% e 95%.

Linfócitos:

Linfócitos do sangue periféricos (PBLs) foram extraídos desangue heparinizado de doadores saudáveis. Separação celular foi atingida porgradiente de densidade Ficoll-Paque® PLUS (Amersham Biosciences n° 17-1440-03), em que as células foram centrifugadas por 35 minutos a 380 χ g. Orevestimento cor de couro foi removido e contado utilizando um ViCell-XR®(Beckman Coulter) com um protocolo específico para linfócitos conformedeterminado pelo tamanho de célula e de núcleo. As células foram colocadasem placas em seguida de acordo com as exigências do teste em 80% meiosRPMI-1640 (Sigma n° R5886) contendo HEPES (25 mmol/l), L-glutamina (2mmol/l), 10% de soro de feto bovino e 10% antibióticos.

Cultivos de linfócitos misturados:

Mitomicina C:

Para realizar MLCs de uma via, as HUCPVCs e uma daspopulações PBC necessitam permanecer ociosas. Isso é atingido tratando-seas células com mitomicina C (MMC) em um tempo e concentração definidas,permitindo a adesão da MMC ao DNA e evitando a divisão. Esta concentraçãofoi determinada por meio de uma curva de titulação de MMC incubada por vinteminutos a 37 °C (5% CO2) com uma população celular inicial de 5000 célulasem uma cavidade de uma placa de 96 cavidades. Concentrações de 10, 20, 30,40, 50 e 75 μg/ml de MMC foram testadas em meios regulares (85% a-MEM,5% FBS, 10% antibióticos) e lavadas por duas vezes com PBS em seguidapara remover quaisquer traços de MMC. As cavidades foram contadas apósuma semana para determinar a proliferação. É essencial que todos os traçosde MMC sejam removidos, de forma a não afetar a capacidade de proliferaçãode linfócitos quando as populações celulares forem combinadas em uma MLC.Para garantir isso, cavidades vazias de uma placa com 96 cavidade (FaIcon)foram tratadas com MMC e lavadas de acordo com o protocolo. Linfócitosforam adicionados em seguida e testados para determinar a sua proliferaçãoem comparação com cavidades normais controle.

Testes de imunoprivilégios

Três cópias de 1 χ 104 HUCPVCs (foram testadas frescas econgeladas) foram colocadas em placas com 96 cavidades (n = 5). Após afixação das células (após cerca de duas horas), elas foram tratadas com MMCa 20 μg/ml. As HUCPVCs foram enxaguadas em seguida e IO5PBLs doDoador 1 foram adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas a 370C com ar com 5% de CO2 em 80% meios RPMI-1640 contendo HEPES (25mmol/l), L-glutamina (2 mmol/l), 10% soro de feto bovino e 10% antibióticos.Após seis dias, os linfócitos presentes em cultivo com HUCPVCs foramcontados utilizando o contador ViCeII e comparados com controles. Para oteste de morte celular, as placas foram mantidas em incubação por quatrohoras e HUCPVCs foram testadas para determinar os marcadores da mortecelular em estado inicial e final; anexina 5 (R&D Systems TA4638) e 7-amino-actinomicina D (7-AAD), respectivamente. Estes níveis foram medidos ecomparados utilizando Citometria de Fluxo em um Centro de Fluxo BeckmanCoulter. Para o teste de proliferação PBL, as células foram mantidas emincubação por seis dias, após o quê elas foram manchadas com 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), um análogo de base de timidina, e medidas utilizandocitometria de fluxo. Controles de PBLs isoladamente e HUCPVCs isoladosforam utilizados para os dois testes.

Para MLCs de uma via, HUCPVCs foram colocadas em umaplaca de 96 cavidades em três cópias (1, 2, 3 e 4 χ 104 células por cavidade),tratadas com MMC e lavadas com PBS. PBLs foram recuperados de doisdoadores não coincidentes selecionados a partir de um conjunto de doadorespotenciais (Mismatch em cinco de seis HLA testados: Doador 1, HLA-A *01,*02; B *07, *18; DRBI *15, *--; Doador 2 A *01, *--; B *08, DRB1 *03, *-).Realizou-se tipificação no Laboratório Regional de Histocompatibilidade(Hospital Geral de Toronto, Toronto ON) utilizando métodos de determinaçãode DNA em baixa resolução. Após a realização de Ficoll, os linfócitos doDoador 2 foram tratados com MMC para que sejam inativos. As células foramcentrifugadas em seguida, lavadas e adicionadas a uma placa com 96cavidades a 105 células por cavidade. Os linfócitos do Doador 1 foramadicionados a 105 células por cavidade e as três populações celulares forammantidas em coincubação por seis dias, após o quê foram manchadas com 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU)1 análogo base de timidina. Citometria de fluxopara BrdU foi realizada em seguida sobre os linfócitos para testar aproliferação. Em seguida, realizou-se um teste similar, em que o resultado émedido utilizando contagens diárias de linfócitos (do dia 1 ao 6) utilizando ocontador de células ViCell-XR®, com um protocolo específico de linfócitos.Todos os resultados foram comparados com controles alogenéicos e autólogosdos dois doadores.

Testes de imunomodulação

MLCs de duas vias incorporam duas populações de PBL dedoadores não coincidentes (os mesmos doadores acima), cuja proliferação foipermitida. Resumidamente, 1 χ 105 PBLs dos dois doadores foram adicionadosa cada cavidade de uma placa com 96 cavidades e mantidos em incubação porseis dias. No transcurso do experimento, 1 ou 4 χ 104 HUCPVCs foramadicionados a cavidades em três cópias nos dias O, 3 ou 5, a fim de analisar aeficácia de HUCPVCs caso já tenha iniciado uma reação imune. As razões deHUCPVC.PBL de 10 e 40% foram selecionadas, pois ambas haviam exibidoresultados positivos anteriormente e, portanto, foram selecionadas como osníveis baixos e altos de inclusão de HUCPVC. Amostras de cada placa foramcontadas todos os dias utilizando o contador celular ViCell-XR® e comparadascom controles autólogos e alogenéicos.

Fator solúvel

O teste de MLC de duas vias foi realizado novamente, semcontato entre células PBL e HUCPVC para determinar se o efeito observadodeveu-se a um fator solúvel ou se foi necessário o contato entre células. AsHUCPVCs (1 e 4 χ 104 células por cavidade) foram cultivadas sobre um insertoTranswell® (Corning) para uma placa com 24 cavidades e mantidas emconexão por cerca de duas horas. Após a sua conexão, o inserto foi transferidopara a placa com 24 cavidades que continha um co-cultivo de populações PBLdo Doador 1/Doador 2 (os mesmos doadores acima) (n = 3). Os números decélulas de linfócitos foram contados diariamente por seis dias e comparadoscom controles autólogos e alogenéicos utilizando o ViCell-XR®.

Ativação de linfócitos

Os dois testes de imunoprivilégios e MLCs de duas vias foramrealizados conforme mencionado anteriormente. O final deste teste foi a análisecitométrica de fluxo dos linfócitos para determinar a presença de IL-2R (CD25)(Becton Dickinson, n° 555431), um marcador de linfócitos ativados. Este testefoi realizado ao longo de seis dias para determinar se HUCPVCs causaramaumento ou redução da ativação de linfócitos. Os linfócitos também foramcomanchados com CD45 para garantir a obtenção de uma população celularadequada. Controles negativos foram cultivos de linfócitos sem a adição deHUCPVCs não manchados.

Geração de linhagem de células T ativadas

PBLs foram extraídos do Doador 1 e 2 conforme acima eseparados utilizando o gradiente Ficoll. As células foram contadas e células doDoador 2 tornaram-se inativas com MMC. 106 células do Doador 1 foramcolocadas em placas em uma placa com 24 cavidades e estimuladas comrazão 1:1 de PBLs inativas do Doador 2. As células foram alimentadas com 2ml de meios RPM 1-1640 (suplementados com 10% de soro e 10% desuplementos conforme acima) e mantidas em ativação. Meios foram alteradosmediante alteração perceptível da sua coloração para amarelo (cerca de trêsdias). Após cerca de onze dias (ou após alteração da coloração dos meios emtrês dias), as células foram colhidas e contadas. Elas foram novamentecolocadas em placas a 106 por cavidade e novamente estimuladas com umarazão 1:1 de PBLs inativas do Doador 2. Mediante o segundo estímulo,adicionou-se IL-2 em concentração de 100 U/ml (BD Biosciences n° 354043) acada dois dias com alimentação. Quando os meios tornaram-se amarelos antesde três dias, as células foram colhidas, contadas e divididas. Após esteprocedimento, as células estavam prontas para uso como linfócitos T ativados(ATLs)1 com anticorpos específicos para o Doador 2. O cocultivo de PBL eMLCs de duas vias foram conduzidos conforme acima e testados paradeterminar a proliferação celular e expressão de CD25.

Marcação de linfócitos

A fim de visualizar e quantificar a diferença entre duas populaçõesde linfócitos, utilizou-se PKH26 (Sigma n° PKH26-GL). PKH26 é uma tintura demembranas não citotóxica com meia vida longa (cerca de cem dias). As célulasforam manchadas de acordo com o protocolo fornecido com o produto:linfócitos foram tripsinizados, reunidos e peletizados; a tintura diluída foiadicionada em seguida à suspensão celular por dois a cinco minutos (2 ml de 2χ 10"6 de solução molar de PKH26). Após as manchas, adicionou-se um volumeigual de soro para suspender a reação; as células foram suspensas em meios,centrifugadas e lavadas por várias vezes. A mancha foi visualizada em seguidasobre o microscópio de fluorescência para garantir que resultasse absorçãoapropriada da tinta. As células utilizadas para manchas foram os ATLs obtidosdo Doador 1; estas células vermelhas foram incluídas em uma MLC comcélulas não manchadas do Doador 2; e HUCPVCs. O final do teste foicitometria de fluxo para CD45 (BD n° 555482) e CD25, ativada na presença ouausência de PKH26. Controles negativos foram células não manchadas eMLCs sem HUCPVCs.

Transfecção

Em primeiro lugar, células 293 foram transfectadas com o DNAdesejado e plasmídeos (vetor DNA1 10 μg de plasmídeo que expressa gag/pol,10μg de plasmídeo que expressa rev, 10 μg de plasmídeo que expressa TAT15 μg de plasmídeo que expressa VSV-G com 2,5 M de CaCy. Estas forammantidas em incubação por uma noite, após o quê os meios são alterados. Ascélulas são mantidas em seguida com este meio por mais três dias, após o quêo sobrenadante das células é recolhido e filtrado. O sobrenadante viral éconcentrado em seguida com ultracentrifugação (50000 g por noventa minutos)ou utilizando um dispositivo de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 (100.000MWCO; Millipore). Ao término deste processo, o sobrenadante viral pode sercombinado com as HUCPVCs em uma concentração determinada por meio detitulação do vírus concentrado e mantido em incubação por uma noite. No diaseguinte, adiciona-se mais meio e as células são incubadas por mais seishoras antes dos meios serem trocados. Desta forma, podem ser elaboradasHUCPVCs para introduzir e expressar um transgene que codifica qualquerproteína, incluindo proteínas úteis para administrar reações imunológicasadversas (proteínas imunossupressivas). Essas proteínas incluem CTLA4,VCP, PLIF, LSF-1, Nip, CD200 e Uromodulina.

Análise de microconjuntosO Microconjunto de Câncer Humano Oligo GE Array (Superarray

Biosciences, Frederick MD, Cat. n° OHS-802) foi utilizado para encontraralterações na expressão de genes representativos de vários processosdiferentes freqüentemente alterados durante o progresso de câncer. O OligoGEArray para câncer humano possui 440 genes de câncer representativos e éorganizado em agrupamentos de genes funcionais que incluem apoptose, ciclocelular, crescimento e diferenciação celular, transdução de sinal e outros genesrelativos a câncer.

HUCPVCs e MSCs derivadas de medula óssea humana foramcultivadas até a passagem 2 e o RNA foi isolado dessas células. RNApurificado foi processado de acordo com o protocolo do fabricante (SuperarrayBiosciences Corp.) e hibridizado em microconjuntos de Câncer Humano OligoGEArray. O Microconjunto de Câncer Humano Oligo GEArray foi utilizado paradeterminar a expressão diferencial de genes relativos a câncer em HUCPVCsem comparação com MSCs derivadas de medula óssea humana normais.

Resultados

Mitomicina C é um agente antiproliferativo eficaz sobreHUCPVCs:

HUCPVCs foram tratadas com uma série de concentrações deMMC por vinte minutos a 37 0C (5% CO2). A Figura 1 exibe os números decélulas de HUCPVCs após uma semana em tratamento pós-MMC de cultivo (n= 2). Todas as células exibem uma notável redução da proliferação comrelação ao controle (p < 0,001), sem diferença entre os tratamentos. Destaforma, selecionou-se 20 μg/ml de acordo com a literatura. A Figura 2 ilustra afalta de efeito de células colocadas em placas em cavidades tratadas comMMC e lavadas contra cavidades não tratadas (n = 2, ρ = 0,16). MMC1portanto, não apresentará efeito sobre resultados experimentais obtidos emcavidades tratadas anteriormente com MMC. Todas as estatísticas aquiapresentadas foram obtidas utilizando ANOVAs para comparação de meiospelo Projeto R de Computação Estatística.

HUCPVCS não são reconhecidas como exógenas por linfócitos

Mediante coincubação de uma população de HUCPVC comlinfócitos (Doador 1), houve um aumento estatisticamente significativo da mortede HUCPVCs em uma proporção de 10% HUCPVC:PBL (n = 5, p = 0,01),conforme medido por meio de intensidade de fluorescência média de anexina 5(MFI). A Figura 3 demonstra que este aumento da morte celular não foiobservado em doses de HUCPVCs de mais de 10%, logo na proporção correta,HUCPVCs não são atacadas por linfócitos não coincidentes. Isso foiconfirmado utilizando um teste de proliferação de linfócitos no qual pode-seobservar que os linfócitos proliferam-se em resposta a 10% HUCPVC:PBL,conforme medido por BrdU MFI (p = 0,02), mas não em concentrações deHUCPVC mais altas (Figura 4). A proliferação de linfócitos é uma medidapadrão de ativação, pois a divisão de linfócitos TeB ocorre no processo deativação. Portanto, em uma proporção mais baixa, HUCPVCs não fornecempresença suficiente para realizar as suas capacidades anti-imunológicas. Emconcentrações mais altas, entretanto, 20 a 40%, os PBLs não se proliferam eas HUCPVCs não são mortas.

HUCPVCs também foram analisadas para determinar o seu efeitosobre o número de células de linfócitos mediante inclusão em um cocultivo comPBLs ou ATLs restantes. Nos dois casos, HUCPVCs não causaram aumentosignificativo do número de células controle (PBL: 35,2 ± 3,1 x 103, +10%HUCPVCs 45,0 ± 5,7 x 103; ATL: 38,8 ± 18,2 x 103, +10% HUCPVCs 40,8 ± 4,8x 103), o que indica o seu imunoprivilégio em condições de repouso ouestimuladas (Figura 7).

HUCPVCs foram incluídas em uma MLC de uma via emproporções de 10, 20, 30 e 40% da população de PBL e testadas paradeterminar a sua proliferação por meio de expressão de BrdU após seis dias. AFigura 8 não exibe aumento significativo do número de células em proliferação,independentemente da proporção de HUCPVCs incluídas.

HUCPVCs SÃO IMUNOMODULADORASA Figura 5 demonstra que, no dia 6, os linfócitos co-cultivadosalogenéicos aumentaram de quantidade, enquanto todos os cultivos comHUCPVCs presentes, independentemente de quando foram adicionados ou daproporção adicionada, possuem uma contagem de células de linfócitossignificativamente mais baixa que o controle (n = 3).

HUCPVCs PODEM EXERCER A SUA AÇÃO POR MEIO DE UM FATOR SOLÚVEL

Insertos TransWelI® foram utilizados para separar HUCPVCs dePBLs em uma MLC de duas vias. Não foi observada redução significativa donúmero de linfócitos com relação ao controle em nenhum dia com 10% ou 40%HUCPVCs (n = 3) (Figura 6). Mediante aumento do número de amostra,entretanto, a adição de 10% HUCPVCs exibiu uma redução significativa donúmero de células de linfócitos ao longo de um período de cultivo de seis diasem comparação com o controle (MLC: 40,7 ± 32,9 χ 103 células, 10%HUCPVCs: 21,3 ± 14,7 χ 103 células) (Figura 9). Fator(es) solúvel(is) pode(m),portanto, contribuir com a imunomodulação de HUCPVCs, mas ainda não sesabe qual(is) fator(es) e como ele(s) afeta(m) os linfócitos.

HUCPVCs REDUZEM O ESTADO DE ATIVAÇÃO DE LINFÓCITOSATLs manchados com PKH26 foram adicionados em um cocultivocom 10% HUCPVCs e testados para determinar a sua expressão de CD25(receptor IL-2), um marcador da ativação de linfócitos. Mediante inclusão deHUCPVCs, tanto o percentual de células que expressam CD25 (Controle:100% ± 0, 10% HUCPVC: 96,9% ± 0,7) quanto a intensidade média defluorescência (Controle: 28,6 ±0,1, 10% HUCPVC: 3,76 ± 0,01) foramsignificativamente reduzidas (Figura 10). Desta forma, HUCPVCs possuem um efeito físico sobre linfócitos ativados, reduzindo o seu estado de ativação.

Além disso, HUCPVCs reduziram a expressão de CD45 doslinfócitos, tanto o percentual (Controle: 100% ± 0, 10% HUCPVC: 99,6% ±0,1,40% HUCPVC: 98,4% ± 0,36) quanto a intensidade média de fluorescência(Controle: 28,20 ± 4,24, 10% HUCPVC 16,33 ± 1,27, 40% HUCPVC: 14,70 ±1,22) foram significativamente diferentes (p < 0,05) (Figura 11). Estesresultados foram inesperados, pois CD45 é expresso em todos os linfócitos.Observou-se, entretanto, que CD45 é fundamental para o desenvolvimento efunção de linfócitos36 e pode ser uma indicação adicional da função reduzidados linfócitos devido à adição das HUCPVCs.

Transfecção

HUCPVCs foram transfectadas com sucesso com GFP e ascélulas expressaram altos níveis da proteína. Atingiu-se eficiência detransfecção de 97% (Figura 12), com manutenção de boas taxas deproliferação. Esta taxa de sucesso varia de acordo com a passagem em que ascélulas são transfectadas. Com um protocolo de transfecção emfuncionamento, é possível, portanto, transfectar as células com qualquerproteína e tê-las constitutivamente expressas.

Análise de microconjuntos

HUCPVCs não expressam nenhum nível detectável de genesassociados a tumorigênese. A análise de conjunto de genes resultou naausência de genes funcionais associados a câncer humano e genes expressosconhecidamente importantes, tal como na regulagem do ciclo celular, comoCiclina D1 (CCND1), CCND2 e CCND3 (Figura 13).

Discussão

São descritas no presente as propriedades imunoprivilegiadas eimunomoduladoras de uma população de MSCs de uma fonte diferente demedula óssea, o cordão umbilical humano. HUCPVCs são extraídas da áreaperivascular do cordão, pois acreditava-se que esta seria a população decélulas em proliferação mais rápida. Anteriormente, demonstrou-se que célulasendoteliais da parede da veia do cordão umbilical estimularam linfócitos invitro21. Isso ocorre em profundo contraste com os resultados relatados e reforçaa área distinta da qual as HUCPVCs são recuperadas.

HUCPVCs são, portanto, apropriadas para uso clínico, particularmas não exclusivamente para reduzir o início e/ou severidade de doença deenxerto contra hospedeiro e para reduzir ou eliminar rejeição de enxertos pelohospedeiro e para o tratamento de outras disfunções mediadas imunes que sebeneficiariam da supressão de uma reação de linfócitos misturados. Alémdisso, quando manipuladas por transfecção para conterem o gene de umaproteína/enzima de interesse, HUCPVCs são capazes de gerar este produtoconstitutivamente e, portanto, seriam úteis no tratamento de qualquer condiçãoem que uma deficiência de proteína/enzima resulte em um efeito prejudicialpara o paciente, especialmente por poderem ser utilizadas de forma alogenéicaem um paciente não coincidente sem rejeição. Além disso, HUCPVCs podemtambém ser utilizadas para gerar vacinas de interesse após transfecção com ogene necessário.

Como as células progenitoras possuem a propensão de expandir-se e diferenciar-se ao longo do tempo em vários tecidos mesenquimais ditadospelo seu ambiente de crescimento, HUCPVCs como outras células haste ouprogenitoras mesenquimais podem conduzir algum risco de que o seucrescimento e diferenciação in vivo não serão controlados. Notadamente, comoum benefício adicional do uso clínico de HUCPVCs, determinou-se que asHUCPVCs exibem atividade extremamente baixa de telomerase, um indicadorda sua propensão à tumorigênese. Além disso, determinou-se que HUCPVCsnão possuem vários dos marcadores genéticos que são os marcos iniciais datumorigênese. A tumorigênese ocorre por meio de mutações que desregulamprocessos biológicos e fazem com que as células cresçam e dividam-se semverificação, evitem a apoptose (morte celular programada), respondam deforma anormal a fatores de crescimento, recebam fornecimento de sangue(angiogênese) e migrem de um lugar para outro (metástase e invasividade).Muitos genes estão envolvidos em cada um desses mecanismos de controle euma mutação em cada um deles pode causar desregulagem.

As referências a seguir são integralmente incorporadas aopresente como referência.Lista de Referências

1. Horwitz, E, et al, Clarification ofthe Nomenclature for MSC:The International Society for Cellular Therapy Position Statement, Cytotherapy7, 393-395 (2005).

2. Bruder, S. P. et ai, Mesenchymal Stem Cells inOsteobiology and Applied Bone Regeneration, Clin. Orthop. Relat. Res. S247-S256 (1998).

3. Quarto, R. et al, Repair of Large Bone Defects with the Useof Autologous Bone Marrow Stromal Cells, N. Engl. J. Med. 344, 385-386(2001).

4. Krebsbach, P. H., Mankani, M. H., Satomura, K.,Kuznetsov, S. A. e Robey1 P. G., Repair of Craniotomy Defeets Using BoneMarrow Stromal Cells, Transplantation 66, 1272-1278 (1998).

5. Yoo, J. et al, The Chondrogenie Potential of Human BoneMarrow Derived Mesenehymal Progenitor Cells, J. Bone Joint Surg. 80, 1745-1757 (1998).

6. Worster, A. A. et al, Chondroeytie Differentiation ofMesenehymal Stem Cells Sequentially Exposed to Transforming Growth Faetor-Beta 1 in Monolayer and Insulin-Like Growth Faetor-I in a Three-DimensionalMatrix1 J. Orthop. Res. 19, 738-749 (2001).

7. Williams, C. G. et al, In vitro Chondrogenesis of BoneMarrow-Derived Mesenehymal Stem Cells in a Photopolymerizing Hydrogel,Tissue Eng. 9, 679-688 (2003).

8. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. G. eProckop1 D. J., Adipogenie Differentiation of Human Adult Stem Cells from BoneMarrow Stroma (MSCs), J. Bone MinerRes. 19, 256-264 (2004).

9. Shi, D., Reinecke1 H., Murry, C. E. e Torok-Storb1 B.,Myogenie Fusion of Human Bone Marrow Stromal Cells, but not HematopoietieCells, Blood 104, 290-294 (2004).

10. Caplan, Α. I., Mesenchymal Stem Cells, J. OrthopaedicRes. 9, 641-650 (1991).

11. Caplan, Α. I., Review: Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy in Orthopedies, Tissue Eng. 11, 1198-1211(2005).

12. Zuk, P. A. et al, Human Adipose Tissue is a Souree ofMuItipotentStem Cells, MoL Biol Cell 13, 4279-4295 (2002).

13. Sakaguchi, Y. et al, Suspended Cells from Trabeeuiar Boneby Collagenase Digestion Beeome Virtually Identieal to Mesenehymal StemCells Obtainedfrom Marrow Aspirates, Blood 104, 2728-2735 (2004).

14. Campagnoli1 C. et al, Identification of MesenehymalStem/Progenitor Cells in Human First-Trimester Fetai Biood, Liver and BoneMarrow, Blood 98: 2396-2402 (2001).

15. Mitchell1 J. B. et al, Immunophenotype of Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes in Stromal-Associated and Stem Cell-Assoeiated Markers, Stem Cells 24, 376-385 (2006).

16. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, Μ. M. eDavies1 J. E., Human Umbilical Cord Perívascuiar (HUCPV) Cells: A Source ofMesenchymal Progenitors, Stem Cells 23, 220-229 (2005).

17. Sarugaser, R., Hanoun, L., Kwong, F., Stanford1 W. L. eDavies1 J. E., Human Umbilical Cord Perívascuiar Cell (HUCPVC) ClonesDetermine Mesenchymal Stem Cell Identity, 4th Annual 2006 InternationalSociety for Stem Research. Tipo de Ref.: Anais de Conferência.

18. Baksh, D., Yao, R. e Tuan, R., Comparison of Proliferativeand Multilineage Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem CellsDerived from Umbilical Cord and Bone Marrow, Stem Cellsem impressão(2007).

19. Le Blanc, K., Immunomodulatory Effects of Fetal and AdultMesenchymal Stem Cells, Cytotherapy 5, 485-489 (2003).

20. Le Blanc Κ. e Ringden, O., Immunobiology of HumanMesenchymal Stem Cells and Future Use in Hematopoietic Stem CellTransplantation, Biol. Blood Marrow Transplant, 11, 321-334 (2005).

21. Bartholomew, A. et al, Mesenehymal Stem Cells SuppressLymphoeyte Proliferation in Vitro and Prolong Skin Graft Survival in Vivo, Exp.Hematol. 30, 42-48 (2002).

22. Puissant, B. et al, Immunomodulatory Effeet of HumanAdipose Tissue-Derived Adult Stem Cells: Comparison with Bone MarrowMesenehymal Stem Cells, Br. J. Haematol. 129, 118-129 (2005).

23. Gotherstrom1 C. et al, Immunologie Properties of HumanFetal Mesenehymal Stem Cells, Am. J. Obstet. Gyneeoi 190, 239-245 (2004).

24. Gotherstrom, C., Ringden, O., Westgren, M., Tammik, C. eLe Blanc, K., Mesenehymal Stem Cells: Immunomodulatory Effeets of HumanFoetal Liver-Derived Mesenehymal Stem Cells, Bone Marrow Transplantation-32, 265-272 (2003).

25. Le Blanc, K. et al, Treatment of Severe Aeute Graft-versus-Host Disease with Third Party Haploidentieal Mesenehymal Stem Cells, TheLaneet 363, 1439-1441 (2004).

26. Ringden, O. et al, Mesenehymal Stem Cells for Treatmentof Therapy-Resistant Graft-versus-Host Disease, Transplantation, 21 de maiode 2006, 1390-1397 (2006).

27. Taupin, P., OTI-010 Osiris Therapeuties/JCRPharmaeeutieals, Curr. Opin. Investig. Drugs 7, 473-481 (2006).

28. Osiris Therapeutics, Proehymal® Adult HumanMesenehymal Stem Cells for Treatment of Moderate-to-Severe Crohn'sDisease, NCT00294112, 2006, www.clinicaltrials.gov. Tipo de ref.: Relatório.29. Le Blanc, Κ. et al, Fetal Mesenchymal Stem-CellEngraftment in Bone after in Utero Transplantation in a Patient with SevereOsteogenesis Imperfecta, Transplàntation 79, 1607-1614 (2005).

30. Liu1 H. et al, The Immunogenicity and ImmunomodulatoryFunction of Osteogenic Cells Differentiated from Mesenchymal Stem Cells, J.Immunol. 176, 2864-2871 (2006).

31. Eliopoulos, N., Stagg, J., Lejeune, L., Pommey1 S. eGalipeau, J., AIIogeneie Marrow Stromal Cells are Immune Rejeeted by MHCClass I and Il Mismatehed Reeipient Miee, Blood (2005).

32. Wang, Y., Chen, X., Armstrong, M. A. e Li, G., Survival ofBone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in a XenotransplantationModel, J. Orthop. Res. (2007).

33. MacDonaId1 D. J. et al, Persistenee of Marrow Stromal CellsImplanted into Aeutely Infareted Myoeardium: Observations in a XenotransplantModel, J. Thorae. Cardiovase. Surg. 130, 1114-1121 (2005).

34. Saito, T., Kuang, J. Q., Bittira, B., Al-Khaldi, A. e Chiu, R.C., Xenotransplant Cardiae Chimera: Immune Toleranee of Adult Stem Cells,Ann. Thorae. Surg. 74, 19-24 (2002).

35. Zebardast, N., The Role of Human Umbilical CordPerivaseular Cells (HUCPVCs) in Dermal Wound Healing, 1-66, 2007,Universidade de Toronto, Faculdade de Ciências Aplicadas e Engenharia,Divisão de Ciências da Engenharia. Tipo de Ref.: Tese/Dissertação.

36. Dawes, R. et al, Combinations of CD45 Isoforms areCrucial for Immune Function and Disease, J. Immunol., 15 de março de 2006,3417-3425 (2006).

37. Hirschberg, H., Evensen, S. A., Henriksen, T. e Thorsby, E.,The Human Mixed Limphocyte-Endothelium Culture lnteraction, Transplantation19, 495-504 (1975).

Claims (20)

1. MÉTODO DE MODULAÇÃO DE UMA REAÇÃOIMUNOLÓGICA, entre linfócitos e um corpo reconhecido pelos linfócitos comoexógeno, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de introdução,em uma quantidade eficaz para inibir ou reduzir a mencionada reaçãoimunológica, de um agente selecionado a partir de (1) células perivasculares docordão umbilical; e/ou (2) um fator solúvel imunomodulador produzido pelasmencionadas células.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser para o tratamento de pacientes que possuam ou estejam emrisco de desenvolver uma reação imunológica adversa, que compreende aetapa de administração ao paciente de uma quantidade eficaz para aimunomodulação de agentes selecionados a partir de (1) células perivascularesdo cordão umbilical e/ou (2) um fator solúvel imunomodulador produzido pelasmencionadas células.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o paciente possui ou apresenta risco de doença de enxertocontra hospedeiro.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o paciente possui ou apresenta risco de reação de linfócitosmisturados.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o paciente possui ou apresenta risco de rejeição de enxertos.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o enxerto é um enxerto de pele.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o enxerto é um enxerto de órgão.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o enxerto é um enxerto de medula.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o enxerto é um enxerto de sangue periférico.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o paciente possui uma disfunção auto-imune.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o paciente possui leucemia e encontra-se em risco de doençade enxerto contra hospedeiro.

12. MÉTODO DE REDUÇÃO, de uma doença de enxertocontra hospedeiro em um paciente que recebe enxerto, caracterizado pelo fatode que compreende a etapa de exposição do enxerto, antes do seutransplante, a uma quantidade eficaz para imunomodulação de um agenteselecionado a partir de (1) células perivasculares do cordão umbilical e/ou (2)um fator solúvel imunomodulador produzido pelas mencionadas células.

13. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que o agente são células perivasculares do cordãoumbilical.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que o agente são células perivasculares do cordãoumbilical humano (HUCPVCs).

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato de que as células vasculares do cordão umbilicalcompreendem um transgene que codifica uma proteína de interesse.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15,caracterizado pelo fato de que as células perivasculares do cordão umbilicalsão substancialmente HUCPVCs negativas duplas de MHC.

17. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 14 a 16,caracterizado pelo fato de que as HUCPVCs estão presentes em uma doseunitária na faixa de 0,01 a 5 milhões de células HUCPVC por quilograma depaciente.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-13, em que o agente é um fator solúvel imunomodulador produzido porHUCPVCs.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o fator solúvel imunomodulador é fornecido na forma deextrato de meio condicionado pelo crescimento de HUCPVCs.

20. EXTRATO, caracterizado pelo fato de que compreende umfator solúvel imunomodulador produzido mediante cultivo de HUCPVCs.