ES2633939T3 - Células progenitoras inmuno-privilegiadas y moduladoras - Google Patents

Abstract

Un agente seleccionado entre (1) células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVC) y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado como un extracto de medio acondicionado por el crecimiento de HUCPVC, para ser usado en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción inmune adversa.

Description

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DESCRIPCION

Celulas progenitoras inmuno-privilegiadas y moduladoras Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a celulas progenitoras que son inmunoprivilegiadas y/o inmunomoduladoras, su produccion, su formulacion y su uso terapeutico.

Antecedentes de la invencion

La medula osea adulta (BM) es la fuente mas comun de celulas mesenquimales madres/progenitoras (MSC) (tambien denominadas celulas estromales mesenquimales1) que se definen funcionalmente por su capacidad de diferenciarse en forma de tejidos esqueleticos: hueso2-4, cartilago5-7, grasa8 y musculo9 in vitro. Las MSD se distinguen clasicamente del medio teterogeneo de las celulas a traves de la adhesion al plastico de cultivo de tejidos y la formacion de fibroblastos unitarios de colonias (CFU-F), cuya frecuencia son 1:100.000 - 1:500.000 celulas nucleadas en medula adulta10, y algunos estudios han identificado ahora un conjunto de marcadores con los que se clasifican las MSC. Esta baja proporcion de MSC conduce a la necesidad de expansion de cultivos y la seleccion antes de su uso para alcanzar los numeros apropiados de celulas para cualquier tipo de terapia celular. Hay otras fuentes emergentes de MSC como: tejido adiposo12, hueso trabecular13 e higado fetal14 que tienen una frecuencia de CFU-F de: 1:3215, 1:63613 y 1:88.49514, respectivamente. Aunque el tejido adiposo parece que tiene la frecuencia mas elevada de progenitores, el tiempo de duplicacion de esas celulas varia en el intervalo entre 3,6 y 4,4 dias15, y el procedimiento de extraccion es complicado, invasivo y prolongado12. La extraccion de hueso trabecular da lugar a un rendimiento celular bajo (89 x 106 celulas/gramo de hueso a partir de donantes jovenes13), especialmente cuando se combina con la frecuencia de DFU-F; y es extremadamente invasiva, dando lugar a la morbilidad del sitio donante.

Son unicas entre estas nuevas fuentes de MSC las celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC), que son una fuente facilmente accesible y altamente proliferativa de celulas con un tiempo de duplicacion de la poblacion de 20 horas (dependiente del suero)16. La frecuencia de CFU-F en HUCPVC es 1:300 en el paso 0 pero aumenta hasta 1:3 en el paso 117, que es ordenes de magnitud mayor que la medula osea16. Por lo tanto, las HUCPVC representan una poblacion de celulas con una proporcion extremadamente elevada de MSC que proceden a dividirse muy rapidamente, haciendolas asi un candidato excelente para terapias mesenquimales clinicas. Estas celulas han sido usadas en diversos ensayos para determinar su fenotipo de expresion marcador y potencial de diferenciacion16, 18, y se ha encontrado que son bioequivalentes, o rinden mejor, que las BM-MSC.

Ademas de su capacidad para diferenciarse, las MSC tienen tambien usos inmunologicos potenciales ya que las BM-MSC han mostrado tanto inmunopriviligiadas como inmunomoduladoras19-21. Estos terminos se refieren a la capacidad de una celula para evadir el reconocimiento a partir de un sistema inmune del hospedante no coincidente, y la capacidad de atenuar una respuesta en marcha por ese sistema, respectivamente. Las MSC de varias fuentes distintas de la medula osea han sido ensayadas en cuanto a su inmunogenicidad en cultivos in vitro. Las MSC del tejido adiposo derivado de dermolipectomias de adultos se mostro que eran capaces de inmunoprivilegio e inmunomodulacion in vitro22, mientras que las celulas de higado fetal se encontro que eran capaces de evitar una respuesta inmune no coincidente, sin embargo, no fueron capaces de modular la alo-reactividad provocada por dos poblaciones no coincidentes de linfocitos23, 4. Por tanto, la fuente de MSC afecta directamente a las capacidades inmunogenas de esas celulas.

Este trabajo in vitro ha comenzado a ser validado en ajuste clinico; por ejemplo, un muchacho se recupero de una enfermedad aguda grave de injerto contra hospedante (GvHD) mediante la transfusion de medula osea haploidentica de su madre25. Un ano despues del tratamiento, en comparacion con un grupo de pacientes que padecia del mismo nivel de gravedad de la enfermedad, fue el unico que vivia. Como este paciente inicial, un conjunto de 8 pacientes fue tratado con BM-MSC, de los que 6 mostraron una remision completa de los sintomas26. Las BM-MSC alogenas se usaron tambien en la enfermedad de Crohn para tratar pacientes que eran refractarios a los tratamientos actuales, y este tratamiento esta actualmente en ensayos clinicos en los Estados Unidos27, 28. Las MSC de higado fetal han mostrado eficacia en el tratamiento temprano de osteogenesis imperfecta (OI). Las MSC de un higado fetal de macho fueron trasplantadas a un feto de hembra de 32 semanas con OI grave, que padecia de diversas fracturas intrauterinas29. A continuacion del trasplante, el resto del embarazo evoluciono normalmente, y no hubo mas fracturas. Este paciente fue sometido a seguimiento hasta 2 anos despues del nacimiento, y el nino mostro una curva de crecimiento normal y sufrio solamente 3 fracturas. Usando una sonda especifica XY, el paciente se encontro que tenia un injerto de 0,3% en una biopsia osea.

Ademas de celulas no diferenciadas, las BM-MSC de conejo osteogenicamente inducidas se encontro que eran inmunoprivilegiadas e inmunomoduladoras in vitro, pero cuando fueron trasplantadas in vivo, la capacidad inmunomoduladora se perdio30. Esto no afectaria a la funcion de las celulas, sin embargo, sin embargo, ya que solo requieren proteccion de una respuesta inmune con el fin de cumplir su funcion. En una induccion mas implicada, se manipularon MSC de medula osea de muridos para liberar eritropoyetina y se implanto en ratones, lo que dio lugar a

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un injerto significativamente menor en comparacion con testigos no manipulados31. Por tanto, la manipulacion de MSC puede conducir a su perdida de inmunomodulacion y/o inmunoprivilegio y puede ser crucial para la supervivencia y funcion del injerto.

Hay una evidencia que apoya que el inmunoprivilegio de las MSC trasciende las barreras entre especies y pueden ser usadas xenogenamente. Esto se demostro en primer lugar por Bartholomew et al. que usaron BM-MSC humanas en babuinos, y mostraron una supervivencia mejorada del injerto de piel21. Aunque el resultado final de este estudio fue positivo, el destino final especifico de las celulas administradas no fue determinado. Wang et al. utilizaron celulas transfectadas GFP y analisis histologicos para estudiar la supervivencia de MB-MSC xenogenas, y mostraron que las celulas sobrevivieron hasta la finalizacion de la semana 11 sin inmunosupresion, sin embargo, hubo una reaccion inmune aumentada del hospedante. Las MSC se ha informado tambien que sobreviven en trasplantes xenogenos en dos modelos cardiacos33, 34. En un trabajo preliminar con HUCPVC, las celulas fueron suministradas por via peritoneal en camaras permeables. Despues de 3 semanas, no hubo inflamacion apreciable observada tras visualizacion macroscopica. Este es un trabajo preliminar alentador que indica la capacidad potencial no solamente para el inmunoprivilegio de las HUCPVC, sino tambien para su capacidad para ensayarlas en modelos de animales sin rechazo.

Los inventores investigaron las propiedades inmunoprivilegiadas e inmunomoduladoras de HUCPVC in vitro realizando: co-cultivos de HUCPVC con linfocitos no coincidentes y cultivos de linfocitos mixtos (MLC) poblados por dos donantes no coincidentes de HLA. Tambien se estudiaron la muerte de HUCPVC, proliferacion de linfocitos y activacion con niveles variables de HUCPVC presentes en entornos de linfocitos desprovistos de sistema inmune y activados. Ademas, se investigo la necesidad del contacto celular para la observacion de efectos inmunologicos.

Lu et al (Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1996;22(2):61-78) hacen referencia al estado actual y posibles aplicaciones futuras de celulas madre derivadas de medula osea, cordon umbilical, sangre y sangre periferica. Ennis et al. (Cytotherapy. 2008;10(2):174-81) hacen referencia a las propiedades inmunologicas in vitro de celulas perivasculares de cordon umbilical humano. El documento WO 2006/019357 A1 se refiere al aislamiento de celulas madre/progenitoras de membrana amniotica de cordon umbilical. Weiss et al. (2006) hacen referencia a la caracterizacion preliminar de celulas madre de matriz de cordon umbilical humano y un examen del efecto del trasplante en un modelo de roedores de la enfermedad de Parkinson. El documento Us 2005/148074 se refiere a celulas progenitoras de gelatina de Wharton de cordon umbilical humano. Ryan et al (J Infmlamm. 2005 Jul 26;2;8) hacen referencia a celulas madre mesenquimales y su capacidad para evitar un rechazo alogeno.

Sumario de la invencion

Los inventores describen ahora en la presente memoria descriptiva una serie de experimentos que ilustran las capacidades inmunopriviligiadas e inmunomoduladoras de HUCPVC al ser ensayadas en cultivos de linfocitos mixtos in vitro (HUCPVC) de una y dos vias. Ademas, cuando se realizaron MLC que ponen de manifiesto una disminucion inducida de HUCPVC en la activacion de linfocitos previamente estimulados. Los inventores muestran adicionalmente que la funcion inmunomoduladora de HUCPVC esta mediada a traves de un(os) factor(es) soluble(s) producidos tras el cultivo de las HUCPVC, ya que no es necesario el contacto celular para que se observe el efecto inmunomodulador. Ademas, los inventores ilustran que las HUCPVC son capaces de modular un MLC in vitro de dos vias y describen el uso de estas celulas para aplicaciones en terapias celulares, particularmente para modular la respuesta inmune.

Por tanto, la presente invencion proporciona un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado en forma de un extracto de medio acondicionado mediante el crecimiento de HUCPVC, para ser usado en el tratamiento de un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una reaccion inmune adversa.

La invencion proporciona tambien un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado en forma de un extracto de medio acondicionado por factor de HUCPVC, para ser usado en la reduccion de la enfermedad de injerto contra hospedante en un receptor de injerto mediante un metodo que comprende la etapa de exponer el injerto, antes de su trasplante, a una cantidad eficaz inmunomoduladora del agente.

La invencion proporciona tambien un metodo in vitro para modular una reaccion inmune entre linfocitos y un cuerpo reconocido por los linfocitos como extrano, que comprende la etapa de introducir, en una cantidad eficaz para inhibir o reducir dicha reaccion inmune, un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado en forma de un extracto de medio acondicionado por el crecimiento de HUCPVC.

Una cantidad eficaz inmunomoduladora de (1) una poblacion celular que comprende, y preferentemente consiste esencialmente, en celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC) y/o (2) un factor soluble inmunomodulador producido tras cultivar dichas celulas puede ser administrado a un sujeto. El agente puede ser aplicado para tratar receptores de injertos alogenos o xenogenos, que incluyen celulas, tejidos y organos, para

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reducir la aparicion o gravedad de una reaccion inmune a los mismos, incluida la enfermedad de injerto contra hospedante. En un aspecto general, la presente invencion proporciona por tanto un metodo in vitro para modular una reaccion inmune entre linfocitos, como linfocitos de sangre periferica, y un cuerpo reconocido por los linfocitos como extrano, que comprende la etapa de introducir una formulacion que comprende un vehiculo fisiologicamente tolerable y celulas HUCPV o factores solubles inmunomoduladores que son extraibles de las mismas, en una cantidad eficaz para modular y, particularmente, para inhibir o reducir esa reaccion inmune.

Tambien se expone el uso de celulas HUCPVC o un factor soluble inmunomodulador producir mediante las mismas en la elaboracion de un medicamente para el tratamiento de un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una reaccion inmune adversa, o para el tratamiento de un injerto antes del trasplante, para atenuar o reducir una reaccion inmune entre el injerto y el receptor.

Tambien se expone una formulacion, en forma de dosificacion unitaria o en forma de dosis multiples, que comprende una cantidad eficaz inmunomoduladora de HUCPVC y/o un factor soluble inmunomodulador producido por las mismas, y un vehiculo fisiologicamente tolerable para la misma.

Un extracto inmunomodulador, o una fraccion inmunomoduladora del mismo, puede comprender uno o mas factores solubles producidos mediante HUCPVC cultivadas.

Las celulas administradas pueden ser obtenidas y administradas sin almacenamiento criogenico.

Las HUCPVC administradas pueden ser celulas inmunopriviligiadas e inmunomoduladoras. Las HUCPVC pueden carecer sustancialmente de los fenotipos de clase I y clase II de MHC. Las HUCPVC administradas pueden ser obtenidas descongelando una poblacion de HUCPVC congeladas.

Las HUCPVC inmunoprivilegiadas administradas por ser tratadas por ingenieria genetica e incorporar un transgen que codifique una proteina heterologa de interes, particularmente, pero no exclusivamente, que incluya una proteina eficaz para manipular el sistema inmune como una proteina que aumente la inmunomodulacion, y especialmente una proteina que inhiba una reaccion inmune adversa, como CTLA4.

Estos y otros aspectos de la presente invencion se describen mas en detalle a continuacion, haciendo referencia a las Figuras que se acompanan, en las cuales:

Breve referencia a las figuras

Figura 1: Recuentos de celulas HUCPVC despues de 7 dias en cultivo de tratamiento post-MMC (n = 2). Las celulas fueron tratadas con concentraciones variables de MMC durante 20 minutos a 37°C a 5% de CO2 y fueron ensayadas en cuanto a su proliferacion. Se observo que todos fueron significativamente inferiores al testigo (p < 0,001).

Figura 2: Proliferacion de celulas dispuestas en placas en pocillos tratados y sin tratar con MMC. La proliferacion se midio usando citometria de flujo para BrdU y y se cuantifico usando intensidad de fluorescencia media. No hubo diferencia significativa entre los producidos tratados y sin tratar (p = 0,62).

Figura 3: Se midio la muerte de HUCPVC usando la intensidad de fluorescencia media (MFI) para anexina 5, un marcador de muerte celular temprana, despues de 4 horas de co-incubacion con PBL del donante 1 (n = 5). Hubo un aumento significativo en la expresion de anexina 5 en el cultivo con 10% de HUCPVC con relacion al testigo (p = 0,01, indicado por *); este fue el unico aumento significativo.

Figura 4: La proliferacion de linfocitos se midio usando intensidad de fluorescencia media (MFI) para BrdU, despues de 6 dias de co-incubacion con niveles variables de HUCPVC (n = 5). Hubo un aumento significativo de la expresion media de BrdU en el cultivo con un 10% de HUCPVC con relacion al testigo (p = 0,02, indicada mediante *).

Figura 5: El numero total de linfocitos se midio desde el dia 1 al 6 a lo largo de tratamientos de 10 y 40% de HUCPVC anadidos los dias 0, 3 o 5 (n = 3). Se puede observar que en el dia 6, los linfocitos testigos aumentan en numero en respuesta unos a otros, mientras que los tratamientos con HUCPVC fueron significativamente inferiores independientemente del porcentaje de dia anadido (p < 0,05, indicado mediante *).

Figura 6: El recuento de linfocitos totales se medio desde el dia 1 al 6 a lo largo de tratamientos de 10 y 40% de HUCPVC anadidos en un inserto TransWell® (n 0 3). Se puede observar que en cualquier dia, no hay diferencia significativa entre el testigo alogeno y los tratamientos con HUCPVC.

Figura 7: Las HUCPVC no aumentan el numero de linfocitos en reposo o activados. La adicion de HUCPVC no mostro un aumento significativo del numero de celulas de linfocitos en comparacion con los testigos sobre 6 dias en cultivo (n = 6). Esta figura muestra los numeros medios de celulas + desviaciones tipicas.

Figura 8: Expresion de BrdU de PBL en un co-cultivo con HUCPVC medido con citometria de flujo. El porcentaje de

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celulas en division no aumenta con la adicion de HUCPVC, independientemente de la dosis (n = 3). El testigo fue la expresion de BrdU de los PBL sin HUCPVC.

Figura 9. Las HUCPVC actuan a traves de un factor soluble. Las HUCPVC son capaces de reducir significativamente el numero de linfocitos en MLC, cuando se separan usando un inserto TransWell. El numero de linfocitos testigos medio se ajusta a 100% en la figura para reducir la variacion en recuentos entre experimentos. Esta figura muestra recuentos de linfocitos en porcentaje medio + desviacion tipica (n = 6). (p* < 0,05).

Figura 10: Las HUCPVC reducen la expresion de CD25 en co-cultivos de linfocitos activados. Esta figura ilustra la expresion de porcentaje medio (barra) y la intensidad de fluorescencia media (linea) de expresion de CD25 sobre linfocitos co-cultivados con y sin 10% de HUCPVC. Los linfocitos fueron tenidos con PKH26 para asegurar una deteccion apropiada de la poblacion, y los resultados estan encerrados en la expresion de PKH26. Las medias son ± desviaciones tipicas (n = 3). (*p<0,05).

Figura 11: Expresion de CD45 en MLC de dos vias (con linfocitos activados) con HUCPVC. Los linfocitos activados fueron tenidos con PKH26 para delinearlos de la poblacion inactiva, y los resultados estan incluidos en la expresion de PKH26. Se muestra los porcentajes de expresion (bar* < 0,05) y MFI (linea + p < 0,05) (n = 3). El testigo fue la expresion de CD45 de ATL sin HUCPVC.

Figura 12: (A) HUCPVC transfectados con proteina fluorescente verde (GFP), con un nivel de expresion de 97,89% (B). Estas celulas fueron transfectadas con un vector lentiviral, usando tecnicas establecidas; y

Figura 13: Resultados de la ordenacion de genes Pathfinder cancerigenos de alta produccion derivados de medula osea (A) y HUCPVC (B). Los genes entre parentesis representan los genes que estan ausentes

Descripcion detallada y realizaciones preferidas

La presente invencion se refiere a aplicaciones nuevas y clinicamente utiles de HUCPVC, particularmente para ser usadas en el tratamiento de estados que se beneficiarian de una reduccion en la respuesta adversa provocada por cuerpos aloantigenos y xenoantigenos, que resultan de una respuesta inmune adversa por el hospedante, o de una reaccion inmune adversa por el cuerpo antigeno para el hospedante. Mas generalmente, la presente invencion se refiere a un metodo en el que HUCPVC y/o factores solubles producidos por los mismos son introducidos para inhibir o reducir reacciones inmunes entre linfocitos y cuerpos reconocidos como extranos.

Como se usan en la presente memoria descriptiva, estos cuerpos pueden incluir cualquier material vivo o muerto que es suministrado o es invasivo para el cuerpo de un mamifero, incluido un ser humano. Estos cuerpos antigenos son los que en el transcurso normal provocan una respuesta inmune por el receptor o por el cuerpo, por ejemplo, cuando el propio cuerpo comprende celulas inmunes que incluyen linfocitos, como medula osea, tejido o injerto de organo. Los cuerpos antigenos son cuerpos que son antigenos entre individuos en la misma especie; los cuerpos xenoantigenos son antigenos entre individuos de especies diferentes. Los cuerpos autologos son cuerpos del receptor. Los cuerpos pueden ser cuerpos no coincidentes de HLA. Los cuerpos pueden comprender linfocitos no coincidentes de HLA.

Aunque el mecanismo de la accion inmunomoduladora HUCPVC no esta completamente comprendida, se espera que las HUCPVC y los factores solubles producidos por ellas tengan un efecto sobre las poblaciones celulares principales implicadas en el reconocimiento y eliminacion de aloantigenos, como celulas que presentan antigenos, celulas T incluidas celulas T citotoxicas y celulas asesinas naturales.

Las HUCPVC utiles en la presente descripcion estan descritas en la bibliografia, como se indico con anterioridad, y se caracterizan mas particularmente como celulas progenitoras extraibles de la zona perivascular del cordon umbilical incluido, pero sin limitacion, el cordon umbilical humano. Usando el protocolo descrito en la presente memoria descriptiva, se apreciara que las celulas perivasculares de cordon umbilical pueden ser extraidas tambien de la vasculatura del cordon umbilical de otros mamiferos que incluyen caballos, vacas, cerdos, primates y similares. La zona perivascular comprende la gelatina de Wharton asociada con la vasculatura del cordon umbilical y externa al mismo. Las HUCPVC son extraibles de la gelatina de Wharton que se situa en la region perivascular, usando metodos estandar de digestion como con colagenasa o enzimas relacionadas adecuadas para suprimir tejido conectivo asociado, como se describe, por ejemplo, por Sarugaser et al., 2005. Preferentemente, las HUCPVC son extraidas solamente a partir de las celulas perivasculares y no a partir de la gelatina de Wharton que se extiende mas alla de la region perivascular, o a partir de tejidos o fluidos que son parte o internas de la propia vasculatura. Esto evita la contaminacion por otras celulas en el cordon, generalmente. De forma alternativa, se puede realizar la extraccion de la gelatina de Wharton sin seleccion de celulas perivasculares, con la condicion de que la poblacion celular resultante este enriquecida en HUCPVC usando, por ejemplo, citometria de flujo para enriquecer en celulas progenitoras que tengan el fenotipo y las caracteristicas indicadas en la presente memoria descriptiva. Las HUCPVC ademas se caracterizan por una proliferacion relativamente rapida, exhibiendo un tiempo de duplicacion, en cada uno de los pasos 2-7, de aproximadamente 20 horas (dependiente del suero) cuando se cultivan bajo condiciones adherentes estandar. Fenotipicamente, las HUCPVC se caracterizan, en la extraccion, como Oct 4-, CD14-, CD19-,

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CD34-, CD44+, CD45-, CD49e+, CD90+, CD105(SH2)+, CD73(SH3)+, CD79b-, HLA-G-, CXCR4+, c-kit+. Ademas, HUCPVCs contiene celulas que son positivas para CK8, CK18, CK19, PD-L2, CD146 y 3G5 (un marcador de pericitos), a niveles mayores que en poblaciones celulares extraidas de fuentes de gelatina de Wharton distintas de la region perivascular.

Las HUCPVC pueden expresar tambien niveles variables de clase I de MHC, de 0-100% dependiendo de la manipulacion. Al someter las celulas extraidas a un ciclo de congelacion-descongelacion como se describe, por ejemplo, por Sarugaser et al., 2005, se obtiene una poblacion de HUCPVC que es sustancialmente negativa para clase I de MHC y clase II de MHC (95%). Como se usan en la presente memoria descriptiva, las HUCPVC se considera que son "sustancialmente" negativas para clase I de MHC y clase II de MHC si el numero de celulas residentes en una poblacion dada y que expresan uno o los dos fenotipos no es de mas de aproximadamente 20% de la poblacion celular, por ejemplo, no mas de 15%, 10%, 5% o menos de la poblacion total de HUCPVC. Se puede hacer una determinacion usando tecnicas estandar de citometria de flujo con un anticuerpo etiquetado apropiado. Esta poblacion de HUCPVC negativa de doble MHC es particularmente util en los metodos descritos en la presente memoria descriptiva. Se apreciara que la poblacion de HUCPVC administrada puede comprender celulas negativas de clase I MCH (opcionalmente expandidas) recientemente extraidas, o las HUCPVC negativas de doble MCH descongeladas. Las HUCPVC negativas de doble MHC es mucho menos probable que estimulen una respuesta inmune en un receptor y consecuentemente su uso clinico es preferido en la presente invencion. Sin embargo, debe apreciarse que la manipulacion del fenotipo de MHC no es esencial. Las propiedades inmunoprivilegiadas e inmunomoduladoras se observan tambien en HUCPVC recientemente extraidas que han sido opcionalmente almacenadas y no solamente en HUCPVC que han sido manipuladas mediante congelacion/descongelacion.

Las HUCPVC pueden ser explotadas por sus propiedades inmunoprivilegiadas e inmunomoduladoras, en un ajuste clinico que se beneficie de ellas. El termino "inmunoprivilegiada" es usado en la presente memoria descriptiva con referencia a celula, como HUCPVC, que cuando son incubadas con linfocitos de sangre periferica, no estimulan la proliferacion de PBL hasta un alcance estadisticamente significativo, o retienen su viabilidad a un nivel estadisticamente significativo, particularmente cuando son ensayadas usando el denominado ensayo MLC de una via establecido en esta tecnica e ilustrado en la presente memoria descriptiva.

El termino "inmunomodulador" es usado en la presente memoria descriptiva en referencia a las HUCPVC para atenuar, reducir o inhibir la reaccion entre poblaciones no coincidentes de linfocitos, segun se pone de manifiesto por una reduccion en la mortalidad de una poblacion de linfocitos, o por un aumento de la viabilidad de una poblacion de linfocitos, segun se determina usando, por ejemplo, la denominada reaccion de linfocitos mixtos de una o dos vias (MLR).

Ademas, se ha encontrado que los factores exudados por HUCPVC cultivadas pueden solos ejercer un efecto inmunomodulador, del tipo observado cuando se usan HUCPVC intactas. Por tanto, los factores solubles extraidos producidos tras el cultivo de HUCPVC son usados solos o en combinacion con las celulas HUCPV, como inmunomoduladores.

Los uno o mas factores inmunomoduladores exudados tras cultivar HUCPVC se denominan en la presente memoria descriptiva factores solubles y son extraibles del medio en el que se cultivan las HUCPVC. Los factores solubles inmunomoduladores pueden ser proporcionados en forma de un extracto obtenido cuando las celulas HUCPVC son retiradas del medio acondicionado por su crecimiento, como mediante centrifugacion. Cuando se emplea la centrifugacion, el extracto es proporcionado en forma de la materia sobrenadante. Las condiciones de cultivo de HUCPVC adecuadas se ilustran en la presente memoria descriptiva. El extracto es obtenido separando las celulas del medio de cultivo acondicionado, como mediante centrifugacion. Los factores solubles pueden ser proporcionados en forma de una fraccion inmunomoduladora de este extracto. Una fraccion de extracto que tiene actividad inmunomoduladora es util tambien en la presente memoria descriptiva, y puede ser identificado usando las reacciones de linfocitos mixtos descritas en la presente memoria descriptiva. Estas fracciones de extractos pueden ser obtenidas naturalmente fraccionando el extracto de HUCPVC usando cualquier tecnica conveniente que incluye extraccion con disolventes, fraccionamiento por HPLC, centrifugacion, exclusion de tamanos, fraccionamiento gradiente salino u osmotico y similares. Las fracciones eluidas o recogidas pueden ser sometidas cada una al MLR y las fracciones activas para inmunomodulacion pueden ser identificadas y puede ser clinicamente usada una fraccion con actividad inmunomoduladora de la manera descrita en la presente memoria descriptiva.

Por tanto, la presente descripcion comprende el uso de extracto inmunomoduladores o fracciones inmunomoduladoras de los mismos que comprende factores solubles exudados durante el cultivo de HUCPVC.

El uso de las HUCPVC y sus poblaciones que son inmunoprivilegiadas y/o inmunomoduladoras implica su recogida, opcionalmente su expansion, ademas opcionalmente su almacenamiento criogenico y reavivamiento a partir del estado congelado y su posterior formulacion para una administracion al receptor previsto. El regimen particular de manipulacion, dosificacion y tratamiento dependera naturalmente de numerosos factores, que incluyen el tipo y gravedad de la enfermedad o estado que va a ser tratado. Para estados inmunologicos (por ejemplo, GvHD, estados autoinmunes), el tamano de la poblacion de HUCPVC, es decir, la dosificacion administrada al receptor, se situara generalmente en el intervalo de 0,01 a aproximadamente 5 millones de celulas por kilogramo de peso corporal del

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receptor. Para el suministro, las celulas son proporcionadas adecuadamente en forma de una formulacion que comprende adicionalmente un vehiculo fisiologicamente tolerable, es decir, un vehiculo que sea tolerable no solamente por las celulas sino tambien por el receptor. Adecuadamente, las celulas se proporcionan en una formulacion esterilizada que comprende, como vehiculo, un vehiculo fisiologicamente tolerable como solucion salina, solucion salina tamponada como PBS, medio de cultivo celular o liquido similar que contiene cualquiera de: aminoacidos esenciales, factores de crecimiento, citoquinas, vitaminas, antibioticos o medios quimicamente definidos exentos de suero, etc., o agua esterilizada. Las celulas formuladas pueden ser administradas mediante infusion o mediante inyeccion usando, por ejemplo, volumenes en el intervalo de 1-25 ml.

Los factores solubles inmunomoduladores producidos por HUCPVC y extraibles a partir de un medio de cultivo de HUCPVC agotado son analogamente solubles de la manera anteriormente descrita con referencia a HUCPVC intactas. El propio extracto puede constituir la composicion farmaceutica, que comprende asi el agente activo en la forma de factor soluble inmunomodulador, y el medio que constituye el vehiculo fisiologicamente tolerable. De forma alternativa, el extracto puede ser secado, para retener el (o los) factor(es) soluble(s) y ser reconstituido en un vehiculo diferente, como solucion salina tamponada con fosfato. El tamano de la dosis y regimen de dosificacion adecuados para aplicaciones clinicas pueden ser determinados con referencia al efecto de dosificacion para HUCPVC intactas. El equivalente de dosis de extracto puede ser determinado calculando las potencias relativas del extracto y celulas intactas en el ensayo MLR, o cualquier alternativa para el mismo que sea un reflejo del entorno clinico en el que sera utilizada la terapia, como en modelos de animales apropiados de la indicacion dirigida a diana.

En uso, las HUCPVC formuladas o factores solubles producidos mediante las mismas son administrados para tratar sujetos que experimentan o estan en riesgo de desarrollar una reaccion inmune adversa. Estos objetos incluyen particularmente sujetos que reciben o van a recibir un trasplante o injerto alogeno o xenogeno, en la forma de celulas como medula y sangre periferica, tejidos que incluyen tejidos de piel y vasculares que incluyen tejido coronario y tejido gastrointestinal o un organo como higado, rinon, corazon, pulmon, etc. Las HUCPVC formuladas son utiles particularmente para reducir la aparicion o gravedad de la enfermedad de injerto contra hospedante, un estado que resulta de un ataque inmune de los tejidos del hospedante mediado por linfocitos presentes en el injerto del donante. Las HUCPVC pueden ser usadas para tratar el injerto mediante incubacion con el mismo durante un periodo de tiempo, antes del trasplante, suficiente para reducir o detener la actividad de los linfocitos residentes en el injerto. Esta incubacion requeriria la inclusion de HUCPVC (a partir de una reserva de nueva aportacion o congelada) a una dosis de 5-60% de los linfocitos totales del injerto (segun se determina mediante el volumen de sangre presente en el injerto), preferentemente 10-40% entre 4 y 10 dias, con el fin de parar la proliferacion antes de la implantacion. En el caso de injerto de organos, el organo seria incubado con HUCPVC (en suspension en un vehiculo fisiologicamente tolerable como se menciono anteriormente), a partir de una reserva de nueva aportacion o congelada, a una dosis de 0,01 a 5 x 103 celulas por gramo de masa del organo, antes de la implantacion, durante un periodo de tiempo que provoque que los linfocitos del organo se hagan inactivos. Para sujetos que sean receptores de injertos, las HUCPVC son administradas deseablemente a traves del tejido que rodea directamente el organo alogeno para el receptor antes (por ejemplo, en horas), de forma simultanea o posterior al injerto (por ejemplo, en horas despues, o posteriormente en la medida necesaria para regular la reaccion inmune). Las HUCPVC pueden ser administradas, lo mas adecuadamente, en el sitio del injerto, como mediante infusion o inyeccion, ya sea subcutanea, intramuscular o intraperitoneal. El receptor puede ser tratado en el momento del injerto por infusion con dosis de HUCPVC en el intervalo de 5 x 104 a 5 x 107 celulas por kg de peso corporal, como aproximadamente 1 a 5 x 106 celulas. Las celulas son formuladas en 10 ml de solucion salina normal con albumina de suero humano al 5%. Pueden ser usadas dos o mas infusiones, que dura cada una aproximadamente 10-15 minutos. Las celulas pueden ser implantadas tambien en una formulacion de liberacion lenta que permita la liberacion de celulas viables a lo largo del tiempo en el sitio de implantacion (como intraperitoneal, intramuscular, etc.). Los vehiculos adecuados para esta finalidad incluyen gelatina, acido hialuronico, alginato y similares. Las HUCPVC pueden ser utilizadas para tratar estados inmunologicos como GvHD que estan en curso, y posiblemente son refractarios a otros tratamientos. Las HUCPVC o los factores solubles exudados son utiles por tanto para tratar sujetos afectados con leucemias, anemias aplasticas y deficiencias enzimaticas o inmunes para las que estan indicados los trasplantes de celulas inmunes o tejidos que las contienen.

La administracion de HUCPVC o los factores solubles tiene aplicacion tambien en el tratamiento de enfermedades autoinmunes como enfermedad de Crohn, lupus y esclerosis multiple asi como artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina de tipo 1, sindrome de dificultad respiratoria en adultos, enfermedad de inflamacion intestinal, dermatitis, meningitis, purpura trombocitopernica trombotica, sindrome de Sjorgren, encefalitis, uveitis, deficiencia de adhesion de leucocitos, fiebre reumatica, sindrome de Reiter, artritis soriatica, esclerosis sistemica progresiva, cirrosis biliar primaria, miastenia grave, lupus eritematoso, vasculitis, anemia perniciosa, enfermedades mediadas por complejos de antigeno-anticuerpo, sindrome de Reynard, glomerulonefritis, hepatitis activa cronica, enfermedad celiaca, complicaciones autoinmunes del SIDA, espondilitis anquilosante y enfermedad de Addison. La administracion de HUCPVC en este caso es por via intravenosa en un vehiculo fisiologicamente tolerable (como se menciono anteriormente, con una dosis que varia en el intervalo de 0,1 - 10 x 106 celulas/kg de peso corporal. Puede ser necesario mas de una dosis, y la dosificacion puede ser repetida en la medida necesaria.

En segundo lugar, las HUCPVC pueden ser usadas para tratar deficiencias de proteinas/enzimas, en las que las HUCPVC han sido transfectadas con el gen necesario para producir la proteina/enzima deseada. Este

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procedimiento puede incluir transduccion (incluidas, pero sin limitacion: lentiviral, retroviral y adenomviral) y transfeccion (incluidas, pero sin limitacion: nucleofeccion, electroporacion, liposomal) y son transfusionadas a un paciente que padece una deficiencia. La dosis administrada al receptor se situara generalmente en el intervalo de 0,01 a aproximadamente 5 millones de celulas por kilogramo de peso corporal del receptor. Las HUCPVC produciran seguidamente la proteina o enzima de interes constitutivamente.

Finalmente, las HUCPVC pueden ser tratadas por ingenieria genetica para introducir transgenes, a traves de los metodos de transfeccion anteriormente mencionados, para ser usadas como vacunas con el fin de generar grandes cantidades para una administracion a personas en riesgo de exponerse a virus/antigenos especificos.

MATERIALES Y METODOS

Extracciones celulares

HUCPVC

Se obtuvo en consentimiento etico para esta investigacion de la Universidad de Toronto, asi como del Centro de Ciencias de la Salud del Sunnybrook & Women's College. Los cordones umbilicales se recogieron de partos por cesarea asepticos de bebes a termino, tras obtener el consentimiento informado de ambos padres. Los cordones fueron inmediatamente transportados a la Universidad de Toronto donde fueron extraidas celulas de la zona perivascular bajo condiciones esterilizadas como se informo previamente16. De forma breve, se cortaron secciones de 4 cm de cordon y se separo el epitelio. Seguidamente fueron extraidos los vasos, incluyendo su gelatina de Wharton circundante, se ataron en un bucle para evitar la digestion de musculos lisos y fueron digeridos durante una noche en una solucion de colagenasa. Tras la separacion del digesto el dia siguiente, las celulas fueron aclaradas en cloruro de amonio para lisar cualesquiera globulos de la sangre del cordon. A continuacion de esto, las celulas fueron aclaradas y dispuestas en placas en a-MEM al 85% que contenia 5% de suero bovino fetal y 10% de antibioticos (penicilina G a 167 unidades/ml; Sigma, gentamicina 50 pg/ml; Sigma y anfotericina B 0,3 £g/ml) a una densidad de 4.000 celulas/cm2. Las celulas son pasadas cuando alcanzan una confluencia de 75-80%, lo que es aproximadamente cada 6-7 dias.

MHC -/- HUCPVC

Se lavaron poblaciones de celulas de ensayo de > 1 x 105 celulas en PBS que contenia 2% de FBS y se volvieron a poner en suspension en PBS + 2% FBS con concentraciones de saturacion (dilucion de 1:100) de la IgG1 HLA- A,B,C-PE del siguiente raton conjugado (BD Biosciences n° 555558, Lote M074842) (MHC II) y CD45-Cy-Cy-cromo (BD Biosciences n° 555484, Lote 0000035746) durante 30 minutos a 4°C. La suspension celular se lavo dos veces con BPS + 2% de FBS y se volvio a poner en suspension en PB S + 2% de FBS para un ana-lisis en un citometro de flujo (XL, Bechman-Coulter, Miami, FL) usando el software ExpoADCXL4 (Beckman-Coulter). La tincion positiva se definio como la emision de una senal de fluorescencia que sobrepasaba los niveles obtenidos por >99% de celulas de la poblacion testigo tenida con anticuerpos de isotipos coincidentes (IgG1 de raton conjugado a FITC-, PE- y Cy- cy-cromo, patrones de isotipos monoclonales k, BD Biosciences), que se confirmo mediante fluorescencia positiva de muestra BM humana. Para cada muestra, se recogieron al menos 10.000 acontecimientos en modo de lista. Todos los graficos fueron generados en software de analisis EXPO 32 ADC.

Las celulas unidas fueron sub-cultivadas (pasadas) usando solucion de tripsina al 0,1% despues de 7 dias, en cuyo momento exhibieron una confluencia de 80-90% segun se observo mediante microscopia optica. Tras el paso, las celulas fueron observadas mediante citometria de flujo en cuanto a la expresion de MHC-A, B, C, MHC-DR, DP, DQ y CD45. Seguidamente se dispusieron en placas en matraces de poliestireno de cultivo de tejidos T-75 a 4 x 103 celulas/cm2 en SM y se trataron con Dex 10-8 M, p-BP 5 mM y 50 pg/ml de acido ascorbico para ensayar la capacidad osteogenica de estas celulas. Estos matraces fueron observados los dias 2, 3, 4, 5 y 6 de cultivo en cuanto a la formacion de DFU-O, o nodulo oseo. Cualesquiera celulas residuales del procedimiento de pasado fueron tambien crioconservadas para un uso futuro.

Se prepararon partes alicuotas de 1 x 106 celulas PVT en un volumen total de 1 ml que consistia en 90% de FBS, 10% de dimetil-sulfoxido (DMSO) (Sigma D-2650, Lote n° 11K2320) y se pipetearon en crio-viales de polipropileno de 1 ml. Los viales se colocaron en un congelador a -70°C durante una noche y se transfirieron el dia siguiente a un congelador a -150°C para un almacenamiento a largo plazo. Despues de una semana de crio-conservacion, las celulas PVT fueron descongeladas y observadas mediante citometria de flujo en cuanto a la expresion de MHC- A,B,C, MHC-DR,DP,DQ y CD45. Se uso un segundo protocolo en el que las celulas PVT fueron descongeladas despues de una semana de crioconservacion, vueltas a cultivar durante una semana, sub-cultivadas y a continuacion nuevamente analizadas mediante citometria de flujo en cuanto a la expresion de MHC-A, B, C, MHC- DR, DP, DQ y CD45.

No se aprecio que la frecuencia de MHC-/- en la poblacion de nueva aportacion se mantenga a traves de varios pasos. Cuando las celulas de nueva aportacion son congeladas despues de pasar, a -150°c durante una semana y a continuacion inmediatamente analizadas en cuanto a fenotipo de MHC, esta poblacion analizada exhibe una

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frecuencia considerablemente aumentada de celulas del fenotipo MHC -/-. En particular, el primer paso de celulas crioconservadas aumenta la poblacion relativa de celulas MCH -/- hasta mas de 50% y la congelacion y pasos posteriores de esas celulas produce una poblacion de MHC-/ mayor que 80%, 85% y 95%.

Linfocitos

Se extrajeron linfocitos de sangre periferica (PBL) de sangre heparinizada de donantes sanos. La separacion celular se consiguio mediante un gradiente de densidad de Ficoll-Paque® PLUS (Amersham Biosciences n° 17-1440-03) en el que las celulas fueron centrifugadas durante 35 minutos a 380 x g. La capa leucocitaria se separo y se sometio a recuento usando un dispositivo ViCell-XR® (Beckman Coulter) con un protocolo especifico para linfocitos segun se determina mediante el tamano de celulas y nucleos. Las celulas se dispusieron seguidamente en placas en la medida adecuada para las necesidades del ensayo en medios RPMI-1640 al 80% (Sigma n° R5886) que contenian HEPES (25 mmol/l), L-glutamina (2 mmol/l), suero bovino fetal al 10% y antibioticos al 10%.

Cultivos de linfocitos mixtos

Mitomicina C

Con el fin de realizar MLCs de una via, las HUCPVC y una de las poblaciones PBL tienen que permanecer inactivas. Esto se consigue tratando las celulas con mitomicina C (MMC) a una concentracion y tiempo ajustados, permitiendo que la MMC se adhiera al DNA y evite la division. Esta concentracion se determino mediante una curva de titulacion de MMC incubada durante 20 minutos a 37°C (5% de CO2) con una poblacion celular de partida de 5000 celulas en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se ensayaron concentraciones de 10, 20, 30, 40, 50 y 75 pg/ml de MMC en medios regulares (85% de a-MEM, 5% de FBS, 10% de antibioticos) y posteriormente se lavaron dos veces con PBS para separar cualesquiera restos de la MMC. Los pocillos se sometieron a recuento despues de una semana para valorar la proliferacion. Es esencial que todos los restos de MMC sean separados con el fin de no afectar la capacidad proliferadora de los linfocitos cuando las poblaciones celulares se combinan en un MLC. Para asegurar esto, pocillos vacios de una placa de 96 pocillos (Falcon) fueron tratados con MMC y lavados como para el protocolo. Seguidamente fueron anadidos linfocitos y fueron ensayados en cuanto a su proliferacion en comparacion con pocillos normales testigos.

Ensayos de inmunoprivilegio

Se dispusieron en placas triplicados de 1 x 104 HUCPVC (se ensayaron tanto de nueva aportacion como congelados) en placas de 96 pocillos (n = 5). Una vez que todas las celulas se unieron (despues de aproximadamente 2 horas), fueron tratadas con MMC a 20 pg/ml. Seguidamente las HUCPVC fueron aclaradas y se anadieron a cada pocillo 105 PBL del donante 1. Las placas fueron incubadas a 37°C con aire con 5% de CO2 en medios RPMI-1640 al 80% que contenian HEPES (25 mmol/l), L-glutamina (2 mmol/l), 10% de suero bovino fetal y 10% de antibioticos. Despues de 6 dias los linfocitos presentes en el cultivo con HUCPVC fueron sometidos a recuento usando el contador ViCell y se compararon con los testigos. Para el ensayo de muerte celular, las placas se dejaron incubar durante cuatro horas y las HUCPVC fueron valoradas en cuanto a marcadores de muerte celular de fase temprana y tardia, anexina 5 (R&D Systems TA4638) y 7-amino-actinomicina D (7-AAD), respectivamente. Estos niveles fueron medidos y comparados usando citometria de flujo en una entidad Beckman Coulter Flow- Center. Para el ensayo de proliferacion de PBL, las celulas se dejaron incubar durante 6 dias, despues de lo cual fueron tenidas con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), un analogo de base de timidina, y fueron medidas usando citometria de flujo. Se usaron testigos de PBL solos y HUCPVC solas para ambos ensayos.

Para MLC de una via, las HUCPVC se dispusieron en primer lugar en placa en una placa de 96 pocillos por triplicado (1, 2, 3 y 4 x 104 celulas por pocillo), se trataron con MMC y se lavaron con PBS. Se recuperaron PBL de dos donantes no coincidentes seleccionados entre una agrupacion de donantes potenciales (no coincidentes en 5 de 6 HLA ensayados: Donante 1 HLA-A *01, *02, B *07, *18; DRB1 *15, *--; Donante 2 A *01, *--; B *08, *--; DRB1 *03, *..). La tipificacion se realizo en el Regional Histocompatibility Laboratory (Toronto General Hospital, Toronto, ON) usando tecnicas de asignacion de DNA a baja resolucion. Despues del tratamiento con Ficol, los linfocitos del donante 2 fueron tratados con MMC para que fueran inactivos. Seguidamente las celulas se centrifugaron y se lavaron y se anadieron a una placa de 96 pocillos a 105 celulas por pocillo. Los linfocitos del donante 1 fueron anadidos a 105 celulas por pocillo y las tres poblaciones celulares se dejaron co-incubar durante 6 dias, despues de lo cual fueron tenidas con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), un analogo de base de timidina. Seguidamente se realizo una citometria de flujo para BrdU sobre los linfocitos para ensayar la proliferacion. A continuacion de esto, se realizo un ensayo similar, siendo medido el resultado mediante el uso de recuentos diarios de linfocitos (desde el dia 1 al 6) usando el contador celular ViCell-XR®, con un protocolo especifico para linfocitos. Todos los resultados fueron comparados con testigos alogenos y autologos de ambos donantes.

Ensayos de inmomodulacion

Los MLC de dos vias incorporan dos poblaciones de PBL de donantes no coincidentes (los mismos donantes que anteriormente), siendo permitido a ambos que proliferaran. De forma breve, se anadieron 1 x 105 PBL de ambos

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donantes a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se dejaron incubar durante seis dias. En el transcurso del experimento, se anadieron 1 6 4 x 104 HUCPVC a pocillos por triplicado en los dias 0, tres o cinco con el fin de analizar la eficacia de las HUCPVC si ya ha comenzado una reacci6n inmune. Las relaciones de 10 y 40% de HUCPVC:PBL se escogieron ya que ambas mostraron resultados positivos previamente y, por tanto, fueron escogidas como los niveles bajo y elevado de inclusi6n de HUCPVC. Las muestras de cada placa se sometieron a recuento cada dia usando el contador celular ViCell-XR® y se compararon con testigos aut6logos y al6genos.

Factor soluble

Se realiz6 nuevamente el ensayo MLC de dos vias, sin contacto celular directo de HUCPVC a PBL para determinar si el efecto apreciado era debido a un factor soluble, o si era necesario el contacto directo. Las HUCPVC (1 y 4 x 104 celulas por pocillo) se cultivaron en un inserto Trasnswell® (Corning) para una placa de 24 pocillos y se dej6 que se uniera durante aproximadamente 2 horas. Una vez que se unieron, el inserto fue transferido a la placa de 24 pocillos que contenia un co-cultivo de poblaciones de PBL del donante 1/donante 2 (mismos donantes que anteriormente) (n = 3). Los numeros de linfocitos se contaron diariamente durante seis dias y se compararon con los testigos aut6logos y al6genos usando el dispositivo ViCell-XR®.

Activacion de linfocitos

Se realizaron ensayos de inmunoprivilegio y MLC de dos vias como se mencion6 anteriormente. El punto final de este ensayo fue un analisis citometrico de flujo de los linfocitos en cuanto a la presencia de IL-2R (CD25) (Becton Dickinson, n° 555431), un marcador de linfocitos activados. Este ensayo se realiz6 durante 6 dias para determinar si las HUCPVC provocaron un aumento o disminuci6n en la activaci6n de linfocitos. Los linfocitos fueron tambien co- tenidos con CD45 para asegurar que se obtuvo una poblaci6n celular apropiada. Los testigos negativos fueron cultivos de linfocitos sin HUCPVC anadidas y sin tenir.

Generacion de linea de celulas T activada

Se extrajeron PBL de los donantes 1 y 2 como anteriormente y se separaron usando el gradiente de Ficol. Las celulas se contaron y las celulas del donante 2 se hicieron inactivas con MMC. Se dispusieron en placas 106 celulas de donante 1 en una placa de 24 pocillos y se estimularon con una relaci6n 1:1 de pBl inactivos del donante 2. Las celulas fueron alimentadas con 2 ml de medios RPMI-1640 (complementados con 10% de suero y 10% de complementos como anteriormente) y se dejaron activar. Los medios se cambiaron tras un cambio perceptible de su color a amarillo (~3 dias). Despues de ~11 dias (o cuando los medios cambiaron de color en 3 dias), las celulas fueron extraidas y contadas. Se volvieron a disponer en placas a 106 por pocillo, y se volvieron a estimular con una relaci6n 1:1 de PBL inactivos del donante 2. Tras la segunda inactivaci6n, se anadi6 IL-2 a una concentraci6n de 100 U/ml (BD Biosciences n° 354043) cada 2 dias con alimentaci6n. Cuando los medios de volvieron amarillos antes de 3 dias, las celulas se extrajeron, se contaron y se escindieron. A continuaci6n de este procedimiento, las celulas estaban listas para ser usadas como linfocitos T activados (ATL), son antibi6ticos especificos para el donante 2. El co-cultivo de PBL y las MLC de dos vias se llevaron a cabo como anteriormente y se ensayaron en cuanto a la proliferaci6n celular y expresi6n de CD25.

Marcado de linfocitos

Con el fin de visualizar y cuantificar la diferencia entre dos poblaciones de linfocitos, se us6 PKH26 (Sigma, n° PKH26-GL). El PHK26 es un colorante de membrana no citot6xica con una semivida prolongada (~100 dias). Las celulas se tineron como para el protocolo suministrado con el producto: los linfocitos fueron tripsinizados, reunidos y sedimentados; el colorante diluido fue seguidamente anadido a la suspensi6n celular durante 2 a 5 minutos (2 ml de soluci6n de PHK26 2 x 10-6 molar). Despues de la tinci6n, se anadi6 un volumen igual de suero para detener la reacci6n; las celulas se pusieron en suspensi6n en medios, tras centrifugar y lavar varias veces. La mancha fue seguidamente visualizada en el microscopio de fluorescencia para asegurar una para asegurar que tuvo lugar una absorci6n apropiada del colorante. Las celulas usadas para la tinci6n fueron aTl obtenidas del donante 1, Esta gl6bulos rojos fueron incluidos en un MLC con celulas sin tenir del donante 2 y HUCPVC. El punto final de este ensayo fue una citometria de flujo para CD45 (BD n° 555482) y CE25, albergadas en presencia o ausencia de PKH26. Los testigos negativos fueron celulas sin tenir y MLC sin HUCPVC.

Transfeccion

En primer lugar, 293 celulas son transfectadas con el DNA deseado y plasmidos (DNA vector, 10 pg de plasmido de expresi6n gag/pol, 10 pg de ese plasmido de expresi6n, 5 pg de plasmido de expresi6n de VSV-G con CaCl2 2,5 M). Estas se dejan incubar durante una noche, despues de lo cual se cambia el medio. Las celulas se dejan seguidamente con este medio durante tres dias mas, despues de lo cual la materia sobrenadante de las celulas se recoge y se filtra. La materia sobrenadante viral se concentra seguidamente mediante ultracentrifugaci6n (50000 g durante 90 minutos) o usando un dispositivo Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter (100.000 MVCO, Millipore). Cuando se completa este procedimiento, la materia sobrenadante viral puede ser combinada con las HUCPVC a una concentraci6n determinada titulando el virus concentrado y se deja incubar durante una noche. Al dia siguiente, se

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anade mas medio y las celulas se incuban durante 6 horas mas antes de cambiar el medio. De esta manera, las HUCPVC pueden ser tratadas por ingeniena genetica para introducir y expresar un transgen que codifique cualquier protema, incluidas protefnas utiles para tratar reacciones inmunes adversas (protefnas inmunosupresoras). Estas protemas incluyen CTLA4, VCP, PLIF, ISF-1, Nip, CD200 y Uromodulin.

Analisis de micromatrices

Se uso el dispositivo Oligo GEArray Human Cancer Microarray (Superaaray Biosciences, Frederick MD, Cat#: OHS- 802) para encontrar cambios en la expresion de genes representativos de diversas trayectoras diferentes frecuentemente alteradas durante el progreso de The Oligo GE-Array de cancer ya que el cancer humano tiene 440 genes cancengenos representativos y esta organizado en agrupaciones genicas funcionales que incluyen apoptosis, ciclo celular, crecimiento y diferenciacion celular, transduccion de senales y otros genes relacionados con el cancer.

Se hicieron crecer HUCPVC y MSC derivadas de medula osea humana hasta el paso 2 y se aislo RNA de estas celulas. El RNA purificado fue tratado segun el protocolo del fabricante (Superarray Biosciences Corp.) y fue hibridado a micromatrices Olego GEArray Human Cancer. Se uso el dispositivo Oligo GEArray Human Cancer MIcroarray para determinar la expresion diferencial de genes relacionados con cancer en HUCPVC en comparacion con MSC derivadas de medula osea humana normales.

RESULTADOS

La mitomicina C es un agente antiproliferativo eficaz sobre HUCPVC

Se trataron HUCPVC con una gama de concentraciones de MMC durante 20 minutos a 37°C (5% de CO2). La figura

1 muestra los numeros de celulas de las HUCPVC despues de una semana en cultivo posterior al tratamiento de MMC (n = 2). Todas las celulas muestran una apreciable disminucion de proliferacion con relacion al testigo (p < 0,001), sin diferencias entre tratamientos. Por tanto, se escogieron 20 pg/ml de acuerdo con la bibliograffa. La figura

2 ilustra la falta de efecto de las celulas dispuestas en placas en pocillos tratados con MMC y lavados, frente a pocillos sin tratar (n = 2, p = 0,16). Por lo tanto, la MMC no tendra un efecto sobre los resultados experimentales obtenidos en pocillos previamente tratados con MMC. Todas las estadfsticas presentadas en la presente memoria descriptiva fueron obtenidas usando analisis ANOVA para comparar medias a traves del proyecto R Project for Statistical Computing.

Las HUCPVC no son reconocidas como extranas por linfocitos

Tras la co-incubacion de una poblacion de HUCPVC con linfocitos (donante 1), hubo un aumento estadfsticamente significativo en la muerte de HUCPVC en una proporcion de 10% HUCPVC:PBL (n = 5, p = 0,01), al ser medida mediante intensidad de fluorescencia media de anexina 5 (MFI). La figura 3 muestra que esta muerte celular aumentada no fue apreciada a dosis de HUCPVC mayores de 10%, por tanto, a la proporcion corrrecta, las HUCPVC no son atacadas por linfocitos no coincidentes. Esto se confirmo usando un ensayo de proliferacion de linfocitos en el que se puede observar que los linfocitos proliferan en respuesta a 10% de HUCPVC:PBL, al ser medida mediante MFI de BrdU (p = 0,02), pero no a concentraciones superiores de HUCPVC (figura 4). La proliferacion de linfocitos es una medida estandar de activacion, ya que la division de linfocitos T y B se produce en la cascada de activacion. Por lo tanto, a una proporcion inferior, las HUCPVC no proporcionan una presencia suficiente de forma que se lleven a cabo sus capacidades de evitacion inmunologica. Sin embargo, a concentraciones superiores, 20-40%, los PBL no proliferan y las HUCPVC no son destruidas.

Las HUCPVC se analizaron tambien en cuanto a su efecto sobre el numero de linfocitos tras la inclusion en un co- cultivo con PBL en reposo o ATL. En ambos casos, las HUCPVC no provocaron un aumento significativo sobre el numero de celulas testjgos (PBL: 35,2 ± 3,1x103, +10% HUCPVC 45,0 ± 5,7x103; ATL: 38,8 ± 18,2x103, + 10% HUCPVC 40,8 ± 4,8x103), indicando que su inmunoprivilegio esta en reposo o en condiciones estimuladas (figura 7).

Las HUCPVC fueron incluidas en un MLC de una vfa en proporciones de 10, 20, 30 y 40% de la poblacion de PBL y se valoraron en cuanto a su proliferacion por expresion de BrdU despues de 6 dfas. La figura 8 no muestra un aumento significativo en el numero de celulas que proliferan independientemente de la proporcion de HUCPVC incluidas.

Las HUCPVC son inmunomoduladoras

La figura 5 muestra que en el dfa 6 los linfocitos co-cultivados alogenos han aumentado de numero, mientras que todos los cultivos con HUCPVC presentes, independientemente de cuando fueron anadidas o de la proporcion anadida, tienen un recuento de linfocitos significativamente inferior que el testigo (n = 3).

Las HUCPVC pueden ejercer su accion a traves de un factor soluble

Se usaron insertos TransWell® para separar HUCPVC de PBL en un MLC de dos vfas. No se observo una

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reduccion significativa en el numero de linfocitos con relacion al testigo en cualquier dia con 10% o 40% de HUCPVC (n = 3) (figura 6). Sin embargo, tras aumentar el numero de muestras, la adicion de 10% de HUCPVC mostro una reduccion significativa del numero de linfocitos sobre un periodo de cultivo de 6 dias en comparacion con el testigo (MLC: 40,7 ± 32,9 x 103 celulas, 10% HUCPVC: 21,3 ± 14,7 x 103 celulas) (Figura 9). Por lo tanto, el (o los) factor(es) soluble(s) contribuye(n) a la inmunomodulacion de HUCPVC, sin embargo, no se conoce aun que factor(es) es/son y el modo en que afectan a los linfocitos.

Las HUCPVC reducen el estado de activacion de los linfocitos

Se anadieron ATL tenidos con PKH26 en un co-cultivo con 10% de HUCPVC y se ensayaron en cuanto a su expresion de CD25 (receptor de IL-2), un marcador de activacion de linfocitos. Tras la inclusion de HUCPVC, se redujeron significativamente tanto el porcentaje de celulas que expresan CD25 (testigo: 100% ± 0, 10% HUCPVC: 96,9% ± 0,7) como la intensidad de fluorescencia media (testigo: 28,6 ± 0,1, 10% HUCPVC: 3,76 ± 0,1) (figura 10). Por tanto, las HUCPVC tienen un efecto fisico sobre los linfocitos activadas, reduciendo su estado de activacion.

Ademas, las HUCPVC redujeron la expresion de CD45 de los linfocitos, tanto el porcentaje (testigo: 100% ± 0,10% HUCPVC: 99,6% ± 0,1; 40% HUCPVC: 98,4% ± 0,36) como la intensidad de fluorescencia media (testigo: 28,20 ± 4,24, 10% HUCPVC: 16,33 ± 1,27, 40% HuCPvC: 14,70 ± 1,22) fueron significativamente diferentes (p < 0,05) (Figura 11). Estos resultados fueron inesperados ya que CD45 es expresado en todos los linfocitos. Sin embargo, se observo que CD45 es crucial para el desarrollo y funcionamiento de los linfocitos36, y puede ser un indicio adicional de la funcion reducida de los linfocitos debido a la adicion de las HUCPVC.

Transfeccion

Las HUPCVC fueron satisfactoriamente transfectadas con GFP, y las celulas expresaron niveles elevados de la proteina. Se consiguio una eficacia de transfeccion de 97% (figura 12), con un mantenimiento de buenas proporciones proliferativas. Esta proporcion satisfactoria varia segun el paso al que son transfectadas las celulas. Con un protocolo de transfeccion que funciona, es por tanto posible transfectar las celulas con cualquier proteina y tenerla constitutivamente expresada.

Analisis de micromatrices

Las HUCPVC no expresan niveles detectables de genes asociados con tumorigenesis. Los analisis de micromatrices genicas dieron como resultado la ausencia de genes funcionales asociados a cancer humano y genes expresados que se conoce que son importantes, por ejemplo, en la regulacion del ciclo celular, como ciclina D1 (CCND1), CCND2 y CCND3 (figura 13).

SINTESIS EXPOSITIVA

Se describen en la presente memoria descriptiva las propiedades inmunoprivilegiadas e inmunomoduladoras de una poblacion de MSC a partir de una fuente distinta de la medula osea o el cordon umbilical. Las HUCPVC son extraidas de la zona perivascular del cordon, y esta se cree que es la poblacion mas rapidamente proliferante de celulas. Anteriormente, se mostro que las celulas endoteliales de la pared de la vena del cordon umbilical estimulaban los linfocitos in vitro27. Esto supone un contraste marcado respecto a los resultados informados y refuerza la zona distinta de la que son extraidas las HUCPVC.

Por tanto, las HUCPVC son bien adecuadas para un uso clinico particularmente, pero no solamente, para reducir la aparicion y/o gravedad de la enfermedad de injerto contra hospedante y para reducir o eliminar el rechazo de injertos por el hospedante y para el tratamiento de otros trastornos de mediacion inmune que se beneficiarian de la supresion de una reaccion de linfocitos mixtos. Ademas, cuando se manipulan mediante transfeccion para que contengan el gen de una proteina/enzima de interes, las HUCPVC son capaces de proporcionar este producto constitutivamente y, por tanto, serian utiles en el tratamiento de cualquier estado en el que una deficiencia de proteinas/enzimas diera lugar en un efecto perjudicial para el paciente, especialmente cuando pueden ser usadas alogenamente en un paciente no coincidente sin rechazo. Ademas, las HUCPVC pueden ser usadas tambien para generar vacunas de interes despues de una transfeccion con el gen necesario.

Como celulas progenitoras que tienen propension a expandirse y diferenciarse a lo largo del tiempo en diversos tejidos mesenquimales dictados por su entorno de crecimiento, las HUCPVC, como otras celulas progenitoras o madre mesenquimales, pueden implicar algun riesgo de que su crecimiento y diferenciacion in vivo no sean controlados. De forma apreciable, como una ventaja adicional del uso de las HUCPVC clinicamente, se ha determinado que las HUCPVC exhiben una actividad de telomerasa extremadamente baja, un indicador de su propension a la tumorigenesis. Ademas, se ha determinado que las HUCPVC carecen de muchos marcadores geneticos que son distintivos de tumorigenesis. La tumorigenesis se produce mediante mutaciones que desregulan las trayectorias biologicas y provocan que las celulas crezcan y se dividan sin control, para evitar la apoptosis (muerte celular programada), para responder anormalmente a factores de crecimiento, para recibir suministro de sangre (angiogenesis) y para desplazarse de un lugar a otro (metastasis e invasivas). Muchos genes estan

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implicados en cada uno de estos mecanismos de control, u una mutacion de uno cualquiera de ellos puede provocar la desregulacion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC) y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado como un extracto de medio acondicionado por el crecimiento de HUCPVC, para ser usado en el tratamiento de un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una reaccion inmune adversa.
2. 2. Un agente para ser usado segun la reivindicacion 1, en que el agente modula una reaccion inmune entre linfocitos y un cuerpo reconocido por los linfocitos como extrano.
3. 3. Un agente para ser usado segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el sujeto tiene o esta en riesgo de una enfermedad de injerto contra hospedante, una reaccion de linfocitos mixtos o una reaccion a un injerto.
4. 4. Un agente para ser usado segun la reivindicacion 3, en que el injerto es un injerto de piel, un injerto de organos, un injerto de medula o un injerto de sangre periferica.
5. 5. Un agente para ser usado segun la reivindicacion 1, en que el sujeto tiene un trastorno autoinmune.
6. 6. Un agente para ser usado segun la reivindicacion 1, en que el sujeto esta afectado por una leucemia y esta en riesgo de enfermedad de injerto contra hospedante.
7. 7. Un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC) y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado como un extracto de medio acondicionado por crecimiento de HUCPVC, para ser usado en la reduccion de la enfermedad de injerto contra hospedante en un receptor de injerto mediante un metodo que comprende la etapa de exponer el injerto, antes de su trasplante, a una cantidad eficaz inmunomoduladora del agente.
8. 8. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que el agente es celulas perivasculares de cordon umbilical.
9. 9. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC).
10. 10. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que las celulas perivasculares de cordon umbilical comprenden un transgen que codifica una proteina de interes.
11. 11. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que las celulas perivasculares de cordon umbilical son HUCPVC sustancialmente negativas para doble MHC.
12. 12. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en que las HUCPVC estan presentes en una dosis unitaria en el intervalo de 0,01 a 5 millones de HUCPVC por kilogramo de sujeto.
13. 13. Un agente para ser usado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en que el agente es un factor soluble inmunomodulador, proporcionado como un extracto de medio acondicionado mediante crecimiento de HUCPVC.
14. 14. Un metodo in vitro para modular una reaccion inmune entre linfocitos y un cuerpo reconocido por los linfocitos como extrano, que comprende la etapa de introducir, en una cantidad eficaz para inhibir o reducir dicha reaccion inmune, un agente seleccionado entre (1) celulas perivasculares de cordon umbilical humano (HUCPVC) y/o (2) un factor soluble inmunomodulador proporcionado como un extracto de medio acondicionado por crecimiento de HUCPVC.
15. 15. Un metodo in vitro segun la reivindicacion 14, en que el agente es un agente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.