BRPI0710404A2 - métodos de isolamento, microorganismo,enterococcus tolerantes e butanol, métdos de produção de butanol, enterococcus tolerante a 2-butanona e métodos de produção de 2-butanona - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE ISOLAMENTO, MICROORGANISMO, ENTEROCOCCUS TOLERANTES A BUTANOL, MéTODOS DE PRODUçãO DE BUTANOL, ENTEROCOCCUS TOLERANTE A 2-BUTANONA E MéTODOS DE PRODUçãO DE 2-BUTANONA. Foram isoladas bactérias Enterococcus que possui maior tolerância a butanóis. As bactérias são úteis para a produção fermentativa de butanol. Também são fornecidos novos métodos de isolação do Enterococcus tolerante a butanol.

Description

"MÉTODOS DE ISOLAMENTO, MICROORGANISMO, ENTEROCOCCUSTOLERANTES A BUTANOL, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE BUTANOL,ENTEROCOCCUS TOLERANTE A 2-BUTANONA E MÉTODOS DEPRODUÇÃO DE 2-BUTANONA"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioNorte-Americano n° 60/798417, depositado em cinco de maio de 2006.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao campo da indústriamicrobiológica. Especificamente, foram isolados microorganismos quedemonstram alta tolerância a álcoois, particularmente butanóis.

Antecedentes da invenção

Butanol é uma substância industrial importante, útil como aditivode combustíveis, como substância de consumo na indústria de plásticos ecomo extrator em grau alimentício nas indústrias de alimentos e aromas. Todosos anos, 10 a 12 bilhões de libras de butanol são produzidos por meiospetroquímicos e a necessidade dessa commodity química apresenta propensãoa aumentar.

Métodos de síntese química de butanóis são conhecidos. 1-1-butanol pode ser produzido, por exemplo, utilizando o processo Oxo, oprocesso Reppe ou a hidrogenação de crotonaldeído (Ullmann's Encyclopediaof Industrial Chemistry, 6a edição, 2003, WiIey-VCHVerIag GmbH and Co.,Weinheim, Alemanha, Vol. 5, págs. 716-719). 2-Butanol pode ser produzidousando a hidratação de n-buteno (Ullmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry, 6a edição, 2003, WiIey-VCHVerIag GmbH and Co., Weinheim,Alemanha, Vol. 5, págs. 716-719). Além disso, isobutanol pode ser produzidoutilizando a síntese Oxo, hidrogenação catalítica de monóxido de carbono(Ullmann's Encyelopedia of Industrial Chemistry, 6a edição, 2003, Wiley-VCHVerIag GmbH and Co., Weinheim, Alemanha, Vol. 5, págs. 716-719) oucondensação Guerbet de metanol com n-propanol (Carlini et al, J. Molec. Catai.A: Chem. 220: 215-220 (2004)). Esses processos que utilizam materiais departida derivados de produtos petroquímicos geralmente são caros e não sãofavoráveis para o meio ambiente.

Métodos de produção do butanol por meio de fermentaçãotambém são conhecidos, em que o processo mais popular produz uma misturade acetona, 1-butanol e etanol e é denominado processo ABE (Blaschek et al,Patente Norte-Americana n° 6.358.717). A fermentação de acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum é uma das mais antigasfermentações industriais conhecidas e foram relatados processos e genesresponsáveis pela produção desses solventes (Girbal et al, Trends inBiotechnology 16: 11-16 (1998)). Além disso, foram descritos hospedeiros deprodução microbiana recombinante que expressam um processo biossintéticode 1-butanol (Donaldson et al, Pedido de Patente Norte-Americano copendentee atribuído em comum n° 11/527995), um processo biossintético de 2-butanol(Donaldson et al, Pedido de Patente Norte-Americano copendente e atribuídoem comum n° 60/796816) e um processo biossintético de isobutanol (Maggio-Hall et al, Pedido de Patente Norte-Americano copendente e atribuído emcomum n° 11/586315). Entretanto, acredita-se que a produção biológica debutanóis seja limitada pela toxicidade de butanol ao microorganismohospedeiro utilizado na fermentação.

Linhagens de Clostridium que são tolerantes a 1-butanol vêmsendo isoladas por meio de mutagênese química (Jain et al, Patente Norte-Americana n° 5.192.673; e Blaschek et al, Patente Norte-Americana n°6.358.717), sobreexpressão de certas classes de genes tais como as queexpressam proteínas de reação a tensão (Papoutsakis et al, Patente Norte-Americana n° 6.960.465; e Tomas et al, AppL Environ. Microbiol. 69 (8): 4951-4965 (2003)) e por meio de enriquecimento em série (Quratulain et al, FoliaMicrobiologica (Prague) 40 (5): 467-471 (1995); e Soucaille et al, CurrentMicrobiology 14 (5): 295-299 (1987)). Desmond et al, (Appl. Environ. Microbiol.70 (10): 5929-5936 (2204)) relatam que a sobreexpressão de GroESL1 umaproteína de reação à tensão, em Lactococcus Iaetis e Lactobacillus paracaseiproduziu linhagens que foram capazes de crescer na presença de 0,5%volume/volume (v/v) (0,4% peso/volume (p/v)) de 1-butanol. Além disso, foidescrito o isolamento de linhagens tolerantes a 1-butanol a partir desedimentos do estuário (Sardessai et al, Current Science 82 (6): 622-623(2002)) e a partir de lodo ativado (Bieszkiewicz et al, Acta MicrobiologicaPolonica 36 (3): 259-265 (1987)). Para a maior parte dos microorganismosdescritos na técnica, entretanto, o crescimento é completamente inibido emuma concentração de menos de 2,0% p/v de 1-butanol quando cultivado em ummeio líquido a 37°C. Além disso, linhagens de micróbios que apresentam tolerânciaa 2-butanol e isobutanol não são conhecidas na técnica. Conseqüentemente, aidentificação de microorganismos que possuem alta tolerância a 1-butanol, 2-butanol e isobutanol representariam um avanço na técnica.

Além disso, 2-butanona e etanol são compostos valiosos quepodem ser produzidos por meio de fermentação utilizando microorganismos. 2-Butanona, também denominada metil etil cetona (MEK), é um solventeamplamente utilizado e é a cetona produzida comercialmente mais importante,depois da acetona. É utilizada como um solvente para tintas, resinas eadesivos, bem como um extrator seletivo e ativador de reações oxidantes. 2-Butanona pode ser fabricada omitindo-se a última etapa do processobiossintético de 2-butanol (Donaldson et al, Pedido de Patente copendente eatribuído em comum n° 60/796816). Etanol possui alta demanda como umcombustível alternativo. Linhagens geneticamente modificadas de E. coli vêmsendo utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwoodet al (2002), Appi Environ. Microbiol. 68: 6263-6272). Uma linhagemgeneticamente modificada de Zymomonas mobilis que possui maior produçãode etanol é descrita em US 2003/016227 A1. A identificação demicroorganismos com maior tolerância a 2-butanona e etanol aumentaria aprodução desses compostos.

Existe a necessidade, portanto, de linhagens de micróbioshospedeiros que sejam mais tolerantes a butanóis e possam ser utilizadas paraa bioprodução de butanóis em título mais alto. A presente invenção aborda estanecessidade por meio da descoberta de microorganismos tolerantes a butanole do desenvolvimento de métodos de seu isolamento. Além disso, osmicroorganismos descobertos possuem maior tolerância a 2-butanona e etanol.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a microorganismos tolerantes abutanol, particularmente membros do gênero Enterococcus e métodos de seuisolamento. Consórcios microbianos foram enriquecidos e selecionadossegundo a tolerância a butanol. Foram isoladas diversas espécies de Enterococcusque demonstraram tolerância a concentrações de butanol de pelo menos 2,5% p/vde 1-butanol quando cultivados em um meio sólido a 37 0C.

Conseqüentemente, em uma realização, a presente invençãofornece um método de isolamento de um microorganismo tolerante a butanolque compreende:

a) fornecimento uma amostra de micróbios que compreendeum consórcio microbiano;

b) contato do consórcio microbiano em um meio de cultivoque compreende uma fonte de carbono fermentável até o crescimento dosmembros do consórcio microbiano;

c) contato do consórcio microbiano em crescimento da etapa(b) com butanol; e

d) isolamento dos membros viáveis da etapa (c) em que ummicroorganismo tolerante a butanol é isolado. Em uma realização preferida, osmembros viáveis do consórcio microbiano são isolados por meio de umprocesso que compreende as etapas de:

i) cultivo dos membros viáveis do consórcio que foi desafiadocom butanol em um meio líquido na ausência de butanol; por meio do quê, osmembros viáveis se multiplicam;

ii) cultivo das células da etapa (i) na presença de butanol; e

iii) cultivo das células da etapa (ii) que crescem na presençade butanol, em que um microorganismo tolerante a butanol é isolado.

Em uma outra realização, a presente invenção fornecemicroorganismos tolerantes a butanol isolados por meio dos processos deacordo com a presente invenção, em que microorganismos tolerantes a butanolpreferidos pertencem ao gênero Enterococcus.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece ummétodo de isolamento de Enterococcus tolerante a butanol que compreende:

a) fornecimento de uma amostra microbiana que compreendeum consórcio microbiano;

b) enriquecimento do consórcio microbiano com a presençado Enterococcus em um meio de cultivo que compreende:

i) uma fonte de carbono fermentável; e

ii) um inibidor do crescimento de concorrentes;

para gerar um cultivo de Enterococcus enriquecido, no qual osmembros do cultivo enriquecido de Enterococcus estão crescendo;

c) contato do cultivo enriquecido de Enterococcus emcrescimento da etapa (b) com butanol; e

d) isolamento dos membros viáveis da etapa (c) em que umEnterococcus tolerante a butanol é isolado.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece umEnterococcus tolerante a butanol que possui as características a seguir:

i) é um anaeróbio facultativo; e

ii) é Gram-positivo; e

iii) é imóvel; e

iv) possui morfologia celular esférica ou ovóide; e

v) possui a capacidade de iniciar o crescimento em caldo decloreto de sódio a 6,5% e em caldo sob pH 9,6; e

vi) é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanol quandocultivado em um meio sólido.

Em uma outra realização, a presente invenção oferece umEnterococcus tolerante a butanol selecionado a partir do grupo que consiste deATCC PTA-7478 (Enteroeoeeus faeeium PN0110), ATCC_PTA-7479(Enteroeoeeus gallinarium PN0048), ATCC PTA-7477 (Enteroeoeeus faeealisPN0197-10) e ATCC PTA-7480 (Enteroeoeeus faeeium PN0133).

Em uma outra realização, a presente invenção fornece ummétodo de produção de 2-butanona que compreende:

a) fornecimento de um Enteroeoeeus que compreendeconstruções genéticas que codificam um processo biossintético de 2-butanona,que possui as características a seguir:

i) é um anaeróbio facultativo; e

ii) é Gram-positivo; e

iii) é imóvel; e

iv) possui morfologia celular esférica ou ovóide; e

v) possui a capacidade de iniciar o crescimento em caldo de6,5% de cloreto de sódio e em um caldo sob pH 9,6; e

vi) é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanol quandocultivado em um meio sólido; e

b) cultivo do Enteroeoeeus da etapa (a) sob condições pormeio das quais é produzida 2-butanona.

Descrição Resumida de Depósitos Biológicos ε Descrições de Seqüências

As diversas realizações da presente invenção podem ser maisbem compreendidas a partir da descrição detalhada a seguir, depósitosbiológicos e descrições de seqüências em anexo, que fazem parte do presentepedido.

Os depositantes realizaram os depósitos biológicos a seguir combase nos termos do Tratado de Budapeste sobre o ReconhecimentoInterancional de Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimentos dePatentes:

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As seqüências a seguir estão de acordo com C. F. R. 37 1.821-1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequenee Rules) e sãoconsistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial da PropriedadeIntelectual (1998) e as exigências de listagens de seqüências do EPO e PCT(Normas 5.2 e 49.5 (a-bis) e capítulo 208 e Anexo C das InstruçõesAdministrativas). Os símbolos e formato utilizados para dados de seqüênciasde nucleotídeos e aminoácidos encontram-se de acordo com as regrasestabelecidas em 37 C. F. R. § 1.822.

Uma listagem de seqüências é oferecida aqui no presente emDisco Compacto, conforme estabelecido por 37 CFR 1.53 (e) e é incorporadaao presente como referência.Tabela 1

Descrição dos Números de SEQID de Genes ε Proteínas Para o ProcessoBiossintético de 1-Butanol

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Tabela 2

Resumo dos Números de SEQID de Genes ε Proteínas Para o ProcessoBiossintético de 2-Butanol

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Tabela 3

Resumo dos Números de SEQID dos Genes ε Proteínas Para o ProcessoBiossintético de Isobutanol

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SEQ ID N° 39 e 40 são as seqüências de nucleotídeos de primersutilizados para amplificar os genes 16S rRNA das linhagens tolerantes abutanol, conforme descrito no Exemplo 1.

SEQ ID N° 41 a 44 são as seqüências de nucleotídeos dos genes16S rRNA de linhagens de Enterococcus tolerantes a butanol, isoladas comodescrito nos Exemplos 1 a 4.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece microorganismos que demonstramalta tolerância a álcoois, particularmente butanóis, bem como 2-butanona eetanol. Os microorganismos de acordo com a presente invenção são capazesde crescer na presença de 2,5% p/v ou mais de 1-butanol, 2-butanol,isobutanol, 2-butanona ou etanol em um meio sólido. Além disso, a presenteinvenção fornece um método de isolamento de microorganismos tolerantes abutanol. Estes microorganismos tolerantes a butanol podem ser elaboradosgeneticamente para compreender um processo biossintético ou um processobiossintético de 2-butanona e utilizados para a bioprodução de 1-butanol, 2-butanol, isobutanol ou 2-butanona em alto título.

As definições e abreviações a seguir devem ser utilizadas para ainterpretação das reivindicações e do relatório descritivo.

O termo "butanol", da forma utilizada no presente, designa 1-butanol, 2-butanol, isobutanol ou uma de suas misturas.

As expressões "microorganismo tolerante a butanol" e "tolerante",quando utilizadas para descrever um microorganismo de acordo com apresente invenção, designam uma bactéria ou levedura que apresentacrescimento na presença de 2,5% p/v ou mais de 1-butanol, 2-butanol ouisobutanol quando cultivado em um meio líquido a 37 0C.

O termo "consórcio microbiano" designa um grupo heterogêneode micróbios com genótipos diferentes. Um consórcio microbiano pode ser, porexemplo, uma amostra ambiental tal como lodo de esgoto ou amostras de solo,composto ou água contaminada; uma população de micróbios que sofrerammutagênese química de uma linhagem de bactéria pura; uma linhagemmicrobiana que contém uma biblioteca de múltiplas cópias de plasmídeo; umapopulação de mutantes marcados com transposon de uma linhagemespecífica.

A expressão "amostra ambiental" designa uma amostra obtida doambiente. Particularmente, a amostra ambiental pode ser lodo de esgoto ououtra amostra obtida de um ambiente em que houve exposição a butanol e/ououtros solventes. A amostra ambiental compreende um consórcio microbiano.

O termo "enriquecendo", quando aplicado a um cultivo microbianoe, particularmente, ao cultivo de um consórcio microbiano, designa a prática defornecimento às células do consórcio ou cultivo microbiano de um excesso denutrientes de crescimento para aumentar ou encorajar o crescimento das células.

As expressões "fonte de carbono fermentável", "substrato decarbono" ou "substrato de carbono fermentável" são utilizados de formaintercambiável e designam uma fonte de carbono que é prontamente utilizadapor um consórcio microbiano. Fontes de carbono fermentável incluem, mas sem limitar-se a monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos esubstratos de um carbono ou uma de suas misturas. Uma relação nãolimitadora de fontes de carbono fermentáveis preferidas incluem açúcaressimples, tal como glicose, frutose e sacarose; e ácidos carboxílicos tais comoácidos graxos, ácido butírico e ácido valérico.

A expressão "condições aeróbicas" indica condições decrescimento na presença de oxigênio.

A expressão "condiçoes anaeróbicas" indica condições decrescimento na ausência de oxigênio.

A expressão "condições microaerofilicas" indica condições de crescimento com baixos níveis de oxigênio (ou seja, acima dos níveis normaisde oxigênio atmosférico).

A expressão "processo biossintético de butanol" designa umprocesso enzimático de produção de 1-butanol, 2-butanol ou isobutanol.A expressão "processo biossintético de 1-butanol" designa umprocesso enzimático de produção de 1-butanol a partir de acetil-coenzima A(acetil-CoA).

A expressão "processo biossintético de 2-butanol" designa umprocesso enzimático de produção de 2-butanol a partir de piruvato.

A expressão "processo biossintético de 2-butanona" designa umprocesso enzimático de produção de 2-butanona a partir do piruvato.

A expressão "via biosintética do isobutanol" refere-se a umprocesso enzimático para produção de isobutanol a partir de piruvato.

A expressão "acetil-CoA acetiltransferase" designa uma enzimaque catalisa a conversão de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoAe coenzima A (CoA). Acetil-CoA acetiltransferases preferidas são acetil-CoAacetiltransferases com preferências de substrato (reação na direção frontal)para uma acil-CoA e acetil-CoA de cadeia curta e são classificadas como E. C.2.3.1.9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego); entretanto,enzimas com uma faixa de substrato mais ampla (E. C. 2.3.1.16) também serãofuncionais. Acetil-CoA acetiltransferases são disponíveis a partir de uma sériede fontes, tais como Escherichia coli (aminoácidos GenBank N0 NP 416728,NC000913; seqüência de aminoácidos NCBI (National Centerfor BiotechnologyInformation), seqüência de nucleotídeos NCBI), Clostridium acetobutylicum(GenBank N° NP_349476.1 (SEQ ID N° 2), NC_003030; NP_149242 (SEQ IDN° 4), NC_001988), Bacillus subtillis (GenBank N0: NP_390297, NC_000964) eSaceharomyces eerevisiae (GenBank N°: NP_015297, NC_001148).

A expressão "3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase" designa umaenzima que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA. A3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser dependente de dinucleotídeonicotinamida adenina (NADH)1 com preferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA 3 são classificadas como E. C.1.1.1.35 e Ε. C. 1.1.1.30, respectivamente. Além disso, 3-hidroxibutiril-CoAdesidrogenases podem ser dependentes de nicotinamida adeninadinucleotídeo fosfato (NADH), com preferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA e são classificadas como E. C.

1.1.1.157 e E. C. 1.1.1.36, respectivamente. 3-Hidroxibutiril-CoA-desidrogenases são disponíveis a partir de uma série de fontes, tais como C.acetobutylicum (GenBank N0 NP_349314 (SEQ ID NO:6), NC_003030), B.subtilis (GenBank N0 AAB09614, U29084), Ralstonia eutropha (GenBank N0ZP_00117144, NZ_AADY01000001, Alcaligenes eutrophus (GenBank N0YP_294481, NC_007347) e A eutrophus (GenBank N0 P14697, J04987).

O termo "crotonase" designa uma enzima que catalisa aconversão de 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA e H2O. Crotonases podemter preferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA e são classificadas como E. C. 4.2.1.17 e E. C. 4.2.1.55, respectivamente.Crotonases são disponíveis a partir de uma série de fontes, tais como E. coli(GenBank N0 NP_415911 (SEQ ID N0 8), NC_000913), C. acetobutylicum(GenBank N0 NP_349318, NC_003030), B. subtilis (GenBank N0 CAB13705,Z99113) e Aeromonas caviae (GenBank N0 BAA21816, D88825).

A expressão "butiril-CoA desidrogenase", também denominadatrans-enoil-CoA reductase, designa uma enzima que catalisa a conversão decrotonil-CoA em butiril-CoA. ButiriI-CoA desidrogenases podem serdependentes de NADH ou dependentes de NADPH e são classificadas comoE. C. 1.3.1.44 e E. C. 1.3.1.38, respectivamente. Butiril-CoA desidrogenasessão disponíveis a partir de uma série de fontes, tais como C. acetobutylicum(GenBank N0 NP_347102 (SEQ ID N0 10), NC_003030), Euglena gracilis(GenBank N0 Q5EU90, AY741582), Streptomyces collinus (GenBank N0AAA92890, U37135) e Streptomyces coelicolor (GenBank N0 CAA22721,AL939127).A expressão "butiraldeído desidrogenase" designa uma enzimaque catalisa a conversão de butiril-CoA em butiraldeído, utilizando NADH ouNADPH como co-fator. Butiraldeído desidrogenases com uma preferência porNADH são conhecidas como E. C. 1.2.1.57 e são disponíveis a partir de, porexemplo, Clostridium beijerinckii (GenBank N0 AAD31841 (SEQ ID N0 12),AF157306) e C. acetobutylicum (GenBank N0 NP_149325, NC_001988).

A expressão "1-butanol desidrogenase" designa uma enzima quecatalisa a conversão de butiraldeído em 1-butanol. 1-ButanoI desidrogenasessão um subconjunto da família ampla de álcool desidrogenase. 1-ButanoIdesidrogenase pode ser dependente de NADH ou NADPH. 1-ButanoIdesidrogenases são disponíveis, por exemplo, a partir de C. acetobutylicum(GenBank N0 NP_149325, NC_001988; NP_349891 (SEQ ID N0 14),NC_003030; e NP_349892 (SEQ ID N0 16), NC_003030) e E. coli (GenBank N0NP_417484, NC_000913).

A expressão "acetolactato sintase", também conhecido como"sintase de acetoidróxi ácido", designa um polipeptídeo (ou polipeptídeos) quepossui(em) uma atvidade enzimática que catalisa a conversão de duasmoléculas de ácido pirúvico em uma molécula de alfa-acetolactato.Acetolactato sintase, conhecida como E. C. 2.2.1.6 (anteriormente 4.1.3.18)(Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) pode serdependente do co-fator pirofosfato de tiamina. Enzimas de acetolactato sintaseapropriadas são disponíveis a partir de uma série de fontes, tais como Bacillussubtilis (GenBank N0: seqüência de aminoácidos NCBI (National Center forBiotechnology Information) AAA22222, s eqüência de nucleotídeos NCBIL04470), Klebsiella terrigena (GenBank N0 AAA25055, L045507) e Klebsiellapneumoniae (GenBank N0 AAA25079 (SEQ ID N0 20), M73842 (SEQ ID N0 19).

O termo "acetolactato descarboxilase" designa um polipeptídeo(ou polipeptídeos) que possui uma atividade enzimática que catalisa aconversão de alfa-acetolactato em acetoína. Acetolactato descarboxilases sãoconhecidas como EC 4.1.1.5 e são disponíveis, por exemplo, a partir deBacillus subtilis (GenBank N0 AAA22223, L04470), Klebsiella terrigena(GenBank N0 AAA25054, L04507) e Klebsiella pneumoniae (SEQ ID N0 18(aminoácido), SEQ ID N0 17 (nucleotídeo)).

A expressão "butanodiol desidrogenase", também conhecidacomo "acetoína reductase", designa um polipeptídeo (ou polipeptídeos) quepossui(em) uma atividade enzimática que catalisa a conversão de acetoína em2,3-butanodiol. Butanodiol desidrogenases são um subconjunto da amplafamília de álcool desidrogenases. As enzimas de butanodiol desidrogenasepodem ser específicas para a produção de R- ou S-estereoquímica no produtoálcool. Butanodiol desidrogenases S-específicas são conhecidas como EC1.1.1.76 e são disponíveis, por exemplo, a partir de Klebsiella pneumoniae(GenBank N0 BBA13085 (SEQ ID N0 22), D86412. Butanodiol desidrogenasesR-específicas são conhecidas como EC 1.1.1.4 e são disponíveis, por exemplo,a partir de Bacillus cereus (GenBank N0 NP_830481, NC_004722; AAP07682,AE017000) e Lactococcus Iaetis (GenBank N0 AAK04995, AE006323).

A expressão "butanodiol desidratase", também conhecida como"diol desidratase diol" ou "propanodiol desidratase", designa um polipeptídeo(ou polipeptídeos) que possui(em) uma atividade enzimática que catalisa aconversão de 2,3-butanediol em 2-butanona, também conhecida como metil etilcetona (MEK). Butanodiol desidratase pode utilizar o co-fator adenosilcobalamina. As enzimas dependentes de adenosil cobalamina são conhecidascomo EC 4.2.1.28 e são disponíveis, por exemplo, a partir da Klebsiella oxytoea(GenBank N0 BAA08099 (sub-unidade alfa) (SEQ ID N0 24), BAA08100 (sub-unidade beta) (SEQ ID N0 26) e BBA08101 (sub-unidade gama) (SEQ ID N0 28)(obs.: todas as três sub-unidades são necessárias para a atividade), D45071).

O termo "2-butanol desidrogenase" designa um polipeptídeo (oupolipeptídeos) que possui(em) uma atividade enzimática que catalisa aconversão de 2-butanona e m 2 -butanol. 2-Butanol d esidrogenases são umsubconjunto da família ampla de álcool desidrogenases. 2-Butanoldesidrogenase pode ser dependente de NADH ou NADPH. As enzimasdependentes de NADH são conhecidas como EC 1.1.1.2 e são disponíveis, porexemplo, a partir de Rhodococcus ruber (GenBank N0 CAD36475 (SEQ ID N030), AJ491307 (SEQ ID N0 29). As enzimas dependentes de NADPH sãoconhecidas como EC 1.1.1.2 esão disponíveis, por exemplo, a partir dePyrococcus furiosus (GenBank N0 AAC25556, AF013169). A expressão "acetoidróxi ácido isomerorreductase" ou "acetoidróxiácido reductoisomerase" designa uma enzima que catalisa a conversão deacetolactato em 2,3-di-hidroxiisovalerato usando NADPH (nicotinamida adeninadinucleotídeo fosfato reduzida) como um doador de elétrons. Acetoidróxi ácidoisomerorreductases preferidas são conhecidas pelo número EC 1.1.1.86 eseqüências são disponíveis a partir de uma ampla variedade demicroorganismos, que incluem, mas sem limitar-se a Eseheriehia eoli (GenBankN0 NO_418222 (SEQ ID N0 32), NC_000913 (SEQ ID N0 31)), Saccharomyeeseerevisiae (GenBank N0 NP_013459, NC_001144), Methanococcusmaripaludis(GenBank N0 CAF30210, BX957220) e Bacillus subtilis (GenBank N0CAB14789, Z99118).

O termo "acetoidróxi ácido desidratase" designa uma enzima quecatalisa a conversão de 2,3 di-hidroxiisovalerato em a-cetoisovalerato.Acetoidróxi ácido desidratases preferidas são conhecidas pelo número EC4.2.1.9. Essas enzimas são disponíveis a partir de uma ampla variedade demicroorganismos, que incluem, mas sem limitar-se a E. eoli (GenBank N0YP 026248 (SEQ ID N0 34), NC_000913 (SEQ ID N0 33)), S. eerevisiae(GenBank N0 NP_012550, NC_001142), M. maripaludis (GenBank N0CAF29874, BX957219) e B. subtilis (GenBank N0 CAB14105, Z99115).A expressão "α-ceto ácido descarboxilase de cadeia ramificada"designa uma enzima que catalisa a conversão de α-cetoisovalerato emisobutiraldeído e CO2. α-ceeto ácido descarboxilases de cadeia ramificadapreferidas são conhecidas pelo número EC 4.1.1.72 e são disponíveis a partirde uma série de fontes, que incluem, mas sem limitar-se a Lactococcus Iactis(GenBank N0 AAS49166, AY548760; CAG34226 (SEQ ID N0 36), AJ746364,Salmonella typhimurium (GenBank N0 NP_461346, NC_003197) e Clostridiumacetobutylicum (GenBank N0 NP_149189, NC_001988).

O termo "álcool desidrogenase de cadeia ramificada" designa umaenzima que catalisa a conversão de isobutiraldeído em isobutanol. Álcooldesidrogenases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo númeroEC 1.1.1.265, mas podem ser também classificadas sob outras álcooldesidrogenases (especificamente, EC 1.1.1.1 ou 1.1.1.2). Estas enzimasutilizam NADH (adenina dinucleotídeo nicotinamida reduzida) e/ou NADPHcomo doador de elétrons e são disponíveis a partir de uma série de fontes, queincluem, mas sem limitar-se a S. cerevisiae (GenBank N0 NP_010656,NC_001136; NP_014051, NC_001145), E. coli (GenBank N0 NP_417484 (SEQID N0 38), NC 000913 (SEQ ID N0 37)) e C. acetobutylicum (GenBank N0NP_349892, NC_003030).

O termo "gene" designa um fragmento de ácido nucleico que écapaz de ser expresso como uma proteína especifica, que inclui opcionalmenteseqüências reguladoras anteriores (seqüências não-codificadoras 5') eposteriores (seqüências não-codificadoras) à seqüência de código. "Genenativo" indica um gene conforme encontrado na natureza com suas própriasseqüências reguladoras. "Gene quimérico" designa qualquer gene que não éum gene nativo, que compreende seqüências reguladoras e de codificação quenão são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente, um genequimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências decodificação que são derivadas de diferentes fontes ou seqüências reguladorase seqüências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de ummodo diferente que o encontrado na natureza. "Gene endógeno" designa umgene nativo na seu lugar natural no genoma de um organismo. Um gene"exógeno" designa um gene normalmente não encontrado no organismohospedeiro, mas que é introduzido no organismo do hospedeiro por meio detransferência genética. Genes exógenos podem compreender genes nativosinseridos em um organismo não-nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" éum gene que foi introduzido no genoma por meio de um procedimento detransformação.

Conforme utilizado no presente, a expressão "seqüência decodificação" designa uma seqüência de DNA que codifica uma seqüência deaminoácidos específica. "Seqüências reguladoras apropriadas" designam asseqüências de nucleotídeos localizadas acima no fluxo (seqüências nãocodificadoras 5'), no fluxo ou abaixo no fluxo (seqüências não-codificadoras 3')de uma seqüência de codificação e que influenciam a transcrição,processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da seqüência decodificação associada. Seqüências reguladoras podem incluir promotores,seqüências líderes de tradução, introns, seqüências de reconhecimento depoliadenilação, local de processamento de RNA, local de união de efetores eestrutura de circuito de haste.

O termo "promotor" designa uma seqüência de DNA capaz decontrolar a expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional.Geralmente, uma seqüência de codificação está localizada a 3' de umaseqüência promotora. Promotores podem ser inteiramente derivados de umgene nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados depromotores diferentes encontrados na natureza ou até mesmo compreendersegmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem quepromotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em diferentestecidos ou tipos de células ou em estágios diferentes de desenvolvimento ouem resposta a condições ambientais ou fisiológicas diferentes. Promotores quecausam a expressão de um gene na maior parte dos tipos de células na maioria dasvezes são comumente denominados "promotores constitutivos". Reconhece-seainda que, como na maior parte dos casos os limites exatos de seqüênciasreguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA comdiferentes comprimentos podem possuir atividade promotora idêntica.

O termo "conectado operacionalmente" designa a associação deseqüências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico paraque a função de um seja afetada pela do outro. Um promotor é conectadooperacionalmente, por exemplo, a uma seqüência de codificação quando écapaz de efetuar a expressão daquela seqüência de codificação (ou seja, que aseqüência de codificação encontra-se sob o controle de transcrição dopromotor). Seqüências de codificação podem ser ligadas operativamente aseqüências reguladoras em orientação com ou sem sentido.

O termo "expressão", da forma utilizada no presente, designa atranscrição e acúmulo estável de RNA com (mRNA) ou sem sentido derivadodo fragmento de ácido nucleico de acordo com a invenção. Expressão podetambém designar a tradução de mRNA em um polipeptídeo.

Da forma utilizada no presente, o termo "transformação" designa atransferência de um fragmento de ácido nucleico para um organismohospedeiro, o que resulta em herança geneticamente estável. Organismoshospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformado sãodenominados organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".

Os termos "plasmídeo" e "vetor" designam um elementocromossômico adicional que freqüentemente conduz genes que não são partedo metabolismo central da célula e normalmente na forma de fragmentos deDNA de fita dupla. Esses elementos podem ser seqüências de reproduçãoautônoma, seqüências integrantes de genoma, seqüências de fago ounucleotídeo, lineares ou circulares, de um RNA ou DNA de fita dupla ousimples, derivado de qualquer fonte, em que uma série de seqüências denucleotídeos foi unida ou recombinada em uma construção exclusiva que écapaz de introduzir um fragmento promotor e seqüência de DNA para umproduto genético selecionado junto com a seqüência não traduzida 3'apropriada em uma célula. "Vetor de transformação" designa um vetorespecífico que contém um gene exógeno e contém elementos além do geneexógeno que possibilitam a transformação de uma célula hospedeiraespecífica.

Da forma utilizada no presente, a expressão "degeneração decódons" designa a natureza do código genético que permite variação daseqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo codificado. Os técnicos no assunto conhecem bem a "orientaçãode códons" exibida por uma célula hospedeira específica em uso de códons denucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Portanto, ao sintetizar umgene para maior expressão eum uma célula hospedeira, é desejável projetar ogene de tal forma que a sua freqüência de uso do códon aproxime-se dafreqüência da uso do códon preferida da célula hospedeira.

A expressão "otimizado por códons", com referência a genes ouregiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para a transformação devários hospedeiros, designa a alteração de códons no gene ou nas regiões decodificação das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso típico de códondo organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA.

Métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrãoutilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos porSambrook1 J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor1 Nova Iorque (1989) (a seguir, "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan1M. L. e Enquist1 L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring HarborLaboratory Cold Press Spring Harbor1 Nova Iorque (1984); e por Ausubel1 F. M.et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene PubIishingAssoc. e Wiley-Interscience (1987).

O termo "invenção" ou "presente invenção", da forma utilizada nopresente, destina-se a aplicar-se geralmente a todas as realizações dapresente invenção descrita nas reivindicações apresentadas ou alteradas esuplementadas posteriormente ou no relatório descritivo.

Em uma realização, a presente invenção fornece um método deisolamento de microorganismos tolerantes a butanol. O método compreende oenriquecimento de um consórcio microbiano sob condições de crescimento econtato do consórcio enriquecido com butanol, conforme descrito em detalhesabaixo. Também são fornecidos microorganismos que demonstram altatolerância a álcoois, particularmente butanóis, identificados por meio do métodode acordo com a presente invenção. Esses microorganismos tolerantes abutanol podem ser elaborados geneticamente para compreender um processobiossintético de butanol e utilizados para a bioprodução de 1-butanol, 2-butanolou isobutanol em alto título.

Isolamento de Microorganismos Tolerantes a Butanol

Microorganismos tolerantes a butanol podem ser isolados dasamostras ambientais com lodo de esgoto e amostras de outros ambientes ondehá exposição a butanol e/ou outros solventes. Amostras ambientais podem serobtidas, por exemplo, a partir de indústrias de tratamento de esgoto eminstalações químicas. Biorreatores industriais de esgoto são fontesparticularmente boas de amostras ambientais de microorganismos comfenótipos de resistência desejáveis devido ao crescimento a longo prazo napresença de diversos solventes orgânicos (Bramucci et al, Trends Biotechnol.18: 501-505 (2000)). Microorganismos tolerantes a butanol podem também serisolados de outras amostras de micróbios. A amostra de micróbios pode ser,por exemplo, uma população de micróbios que sofreu mutagênese química deuma linhagem bacteriana pura, uma linhagem microbiana que contém umabiblioteca de plasmídeos com múltiplas cópias ou mutantes marcados comtransposons de uma linhagem específica. Não se afirma que nenhuma destasamostras microbianass, incluindo uma população misturada, inclui umconsórcio microbiano.

Em uma realização da presente invenção, a amostra microbiana écultivada em um meio de cultivo para enriquecer o consórcio microbianocontido naquele lugar até que os membros do consórcio estejam crescendo.Em uma realização, os cultivos estão crescendo em fase de registro. O meio decrescimento compreende uma fonte de carbono fermentável e pode incluirníveis apropriados de nitrogênio, fósforo, enxofre e sais. Níveis apropriadosdesses nutrientes necessários para o crescimento do consórcio microbiano sãobem conhecidos dos técnicos no assunto e exemplos não Iim itadores sãofornecidos abaixo. A fonte de carbono fermentável pode ser qualquer fonte decarbono que é rapidamente metabolizada pelos membros do consórcio microbiano, que incluem mas sem limitar-se a sacaroses, frutoses, glicoses esuas misturas. A fonte de carbono fermentável pode também ser um ácidocarboxílico tal como um ácido graxo, ácido butírico ou ácido valérico.Tipicamente, a fonte de carbono está presente em uma concentração de cercade 0,1 % peso/volume a cerca de 1,5% p/v. A fonte de nitrogênio pode serqualquer fonte de nitrogênio apropriada, incluindo mas sem limitar-se a sais deamônio ou extrato de levedura. A fonte de nitrogênio encontra-se tipicamentepresente em um meio de cultivo em concentração de cerca de 10 mM. Fósforopode apresentar-se no meio na forma de sais de fosfato, tal como fosfatos desódio e potássio, os quais estão tipicamente presentes no meio de cultivo emuma concentração de cerca de 50 mM. Enxofre pode estar presente no meiona forma de sais de sulfato, tal como sulfatos de sódio ou amônio, os quaisestão tipicamente presentes no meio de cultivo em uma concentração de cercade 10 mM. Sais adicionais incluem, mas sem limitar-se a cloreto de magnésio,cloreto de cálcio, cloreto de manganês, cloreto férrico, cloreto ferroso, cloretode zinco, cloreto cúprico, cloreto de cobalto e molibdato de sódio. Estes saisestão tipicamente presentes no meio de cultivo em uma concentração de cercade 1μΜ a cerca de 2 mM. O meio de cultivo pode também conter vitaminas taiscomo cloridreto de tiamina.

A cultura de enriquecimento é cultivada sob temperatura de cercade 25 0C a cerca de 60 0C por um tempo suficiente para que os membros doconsórcio microbiano na amostra exibam crescimento, normalmente em cercade 12 horas a cerca de 24 horas. A cultura pode ser cultivada sob condiçõesanaeróbicas, microaerofílicas ou aeróbicas, com ou sem agitação. Como éfacilmente compreendido pelos técnicos no assunto, condições anaeróbicassão aquelas que são isentas de oxigênio e condições microaerofílicas sãoaquelas em que o oxigênio está presente em um nível abaixo do encontrado noar, ou seja, menos de 21%. O crescimento do cultivo pode ser monitorado pormeio de medição da densidade ótica, tipicamente em um comprimento de ondade 600 nm.

O cultivo de enriquecimento crescente é então colocado emcontato com butanol. Este contato pode ser realizado por meio de diluição docultivo de enriquecimento com um meio de cultivo novo que contém butanol. Éparticularmente apropriado se o cultivo de enriquecimento estiver crescendoem fase de registro neste ponto. A concentração de butanol utilizada é de cercade 0,8% p/v a cerca de 3,0% p/v, preferencialmente cerca de 0,8% p/v a cercade 2,0% p/v. Em uma realização, o butanol é predominantemente 1-butanol.Em outra realização, o butanol é predominantemente 2-butanol. Em outrarealização, o butanol é predominantemente isobutanol. Da forma utilizada nopresente, predominantemente significa ter pelo menos cerca de 90% do pesodo butanol total. Além disso, misturas que compreendem várias combinaçõesde dois ou mais dentre 1-butanol, 2-butanol e isobutanol podem ser utilizadas.A cultura é cultivada por um período de tempo até que se observe crescimentosignificativo. Opcionalmente, os cultivos que demonstrarem crescimento significativopodem ser colocados em contato novamente com butanol, uma ou mais vezes paraa seleção em busca de maior tolerância a butanol. Cada contato pode ser feito comconcentrações de butanol progressivamente mais altas.

O consórcio microbiano que foi colocado em contato com butanolé separado em seguida para isolar as linhagens individuais. Diversos meios deisolamento celular são conhecidos dos técnicos no assunto e envolvem tantomeios sólidos quanto líquidos. O consórcio microbiano que foi colocado emcontato com butanol pode ser baseado, por exemplo, em um meio sólido, talcomo um nutriente agar, Agar Luria Bertani (LB), agar LB modificado (ou seja,agar LB suplementado com uma fonte de carbono fermentável e sais) ou meiode enriquecimento mínimo com agar, que pode ou não conter butanol. Sebutanol estiver presente no meio sólido, sua concentração é tipicamente decerca de 1,2% p/v a cerca de 3% p/v. A cultura é cultivada até a formação decolônias. As colônias são isoladas em seguida utilizando métodos conhecidosna técnica para fornecer um microorganismo tolerante a butanol. As colôniasdo meio sólido podem ser recolhidas e identificadas utilizando, por exemplo,métodos conhecidos na técnica, conforme descrito abaixo. Alternativamente, ascolônias do meio sólido podem ser inoculadas em um meio de cultivo (tal comomeio de enriquecimento mínimo), seja líquido ou sólido, que não contémbutanol. Após o crescimento, as células podem ser recolhidas e identificadas.Opcionalmente, as células das colônias podem ser cultivadas na presença debutanol, tanto em meio de cultivo sólido quanto líquido (tal como meio deenriquecimento mínimo). Tipicamente, a concentração de butanol no meio é decerca de 1,2% p/v a cerca de 3% p/v. As células que crescem na presença debutanol são recolhidas. Os microorganismos isolados podem ser identificadosutilizando métodos conhecidos na técnica, tais como seqüenciamento de genesde RNA ribossômico 16S (rRNA), análise de perfil de ácido graxo ouribotipificação.

Os microorganismos tolerantes a butanol isolados por meio dométodo de acordo com a presente invenção são tolerantes a pelo menos 2,5%de butanol (ou seja, 1-butanol, 2-butanol ou isobutanol) quando cultivados emum meio sólido a 37 0C ou pelo menos 2,0% p/v de butanol quando cultivadosem um meio líquido a 37 0C. Dever-se-á notar que a tolerância a butanol dosmicroorganismos é topicamente mais alta quando cultivados em um meiosólido que quando cultivados em um meio líquido. Além disso, a tolerância abutanol dos microorganismos depende da temperatura de crescimento, sendotipicamente mais alta em temperaturas de cultivo mais baixas.Microorganismos isolados por meio de contato do consórcio microbianoenriquecido com um butanol geralmente são também tolerantes a outrosbutanóis. Microorganismos isolados utilizando 1-butanol, por exemplo, sãotambém tolerantes a 2-butanol e isobutanol.

A cultura de enriquecimento pode também ser cultivada ecolocada em contato com butanol em uma cultura continua em um biorreatorquimiostático. As células em um biorreator quimiostático podem ser cultivadasem diversas velocidades de crescimento por meio de ajuste apropriado da taxade diluição. Culturas quimiostáticas podem ter controladas precisamente aaeração e o pH, gerando densidades celulares mais altas. Além disso, butanolpode ser gradualmente adicionado em concentrações crescentes por meio deajuste da composição de alimentação. Após colocar a cultura deenriquecimento em contato com butanol no biorreator, os microorganismostolerantes a butanol são isolados e identificados conforme descrito acima.

Inesperadamente, a maior parte dos microorganismos tolerantes abutanol identificados utilizando o método de açoro com a presente invençãonos exemplos no presente foi de bactérias pertencentes ao gêneroEnterococcus. Enterococcus são células esféricas ou ovóides, imóveis, Gram-positivas e facultativamente anaeróbicas que possuem a capacidade de iniciarcrescimento em caldo de cloreto de sódio a 6,5% e em caldo sob pH 9,6(Bergey's Manual of Systematic Bacteríology, Vol. 2, Sneath et al, Eds.;Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1986, págs. 1063-1065). As linhagens deEnterococcus tolerantes a butanol de acordo com a presente invenção sãoadicionalmente caracterizadas pelas seqüências de genes 16S rRNAfornecidas como SEQ ID N0 41, 42, 43 e 44.

O presente método de isolamento de microorganismos tolerantesa butanol pode ser modificado para isolar seletivamente Enterococcustolerantes a butanol. Nesta realização, o consórcio microbiano da amostraambiental é enriquecido pela presença de Enterococcus em um meio de cultivoque compreende uma fonte de carbono fermentável, níveis apropriados denitrogênio, fósforo, enxofre e sais, conforme descrito acima, e um "inibidor decrescimento competitivo" que funciona para inibir o crescimento demicroorganismos diferentes de Enterococcus. Inibidores de crescimentocompetitivos apropriados apropriados incluem, mas sem limitar-se a bílis, azidae suas misturas. A quantidade ideal do inibidor do crescimento competitivo aser utilizado dependerá do consórcio microbiano e do tipo de inibidor e podeser determinado usando experimentação de rotina. A cultura enriquecida comEnterococcus é cultivada até fase de registro e colocada em contato combutanol, conforme descrito acima. As linhagens de Enterococcus tolerantes abutanol são isoladas e identificadas em seguida, conforme descrito acima.As linhagens de Enterococcus tolerantes a butanol isoladaspodem ser elaboradas geneticamente para compreender construçõesgenéticas que codificam um processo biossintético de butanol e cultivadas sobcondições apropriadas para produzir butanol. O processo biossintético debutanol pode ser um 1-butanol, 2-butanol ou um processo biossintético deisobutanol.

Processo Biossintético de 1-butanol

Um processo biossintético de produção de 1-butanol é descritopor Donaldson et al no Pedido de Patente Norte-Americano copendente eatribuído em comum n° 11/527995, que é incorporado ao presente comoreferência. Este processo biossintético compreende as conversões desubstrato em produto a seguir:

a) acetil-CoA em acetoacetil-CoA, conforme catalisado, porexemplo, pela acetil-CoA acetiltransferase codificada pelos genes fornecidoscomo SEQ ID N0 1 ou 3;

b) acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA, conformecatalisado, por exemplo, pela 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase codificadapelo gene fornecido como SEQ ID N0 5;

c) 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA, conforme catalisado,por exemplo, por crotonase codificada pelo gene fornecido como SEQ ID N0 7;

d) crotonil-CoA em butiril-CoA, conforme catalisado, porexemplo, por butiril-CoA desidrogenase codificada pelo gene fornecido comoSEQ ID NO:9;

e) butiril-CoA em butiraldeído, conforme catalisado, porexemplo, por butiraldeído desidrogenase codificada pelo gene fornecido comoSEQ ID NO:11; e

f) butiraldeído em 1-butanol, conforme catalisado, porexemplo, pela desidrogenase de butanol codificada pelos genes fornecidoscomo SEQ ID N0 13 ou 15.

O processo não requer ATP e gera NAD+ e/ou NADP+ e, destaforma, equilibra-se com as vias metabólicas centrais que geram acetil-CoA.

Processo Biossintético de 2-butanol ε 2-butanona

Processos biossintéticos de produção de 2-butanol e 2-butanonasão descritos por Donaldson et al no Pedido de Patente Norte-Americanocopendente e atribuído em comum n° 60/796816, que é incorporado aopresente como referência. Um processo biossintético de 2-butanol compreendeas conversões de substrato em produto a seguir:

a) piruvato em alfa-acetolactato, conforme catalisado, por exemplo,por acetolactato sintase codificada pelo gene fornecido como SEQ ID N0:19;

b) alfa-acetolactato em acetoína, conforme catalisado, porexemplo, por descarboxilase acetolactato codificado pelo gene fornecido comoSEQ ID N0 17;

c) acetoína em 2,3-butanediol, conforme catalisado, porexemplo, por butanodiol desidrogenase codificada pelo gene fornecido comoSEQ ID N0 21;

d) 2,3-butanodiol em 2-butanona, conforme catalisado, porexemplo, por butanol desidratase codificada pelo gene fornecido como SEQ IDN0 23, 25 e 27; e

e) 2-butanona em 2-butanol, conforme catalisado, porexemplo, por 2-butanol desidrogenase codificada pelo gene fornecido comoSEQ ID N0 29.

A omissão da última etapa (e) do processo acima fornece umprocesso biossintético de produção de 2-butanona, também conhecido comometil etil cetona (MEK).

Processo Biossintético de Isobutanol

Processos biossintéticos de produção de isobutanol são descritospor Maggio-Hall et al no Pedido de Patente Norte-Americano copendente eatribuído em comum n° 11/586315, que é incorporado ao presente comoreferência. Um processo biossintético de isobutanol compreende asconversões de substrato em produto a seguir:

a) piruvato em acetolactato, conforme catalisado, por

exemplo, por acetolactato sintase codificada pelo gene fornecido como SEQ IDN0 19;

b) acetolactato em 2,3-di-hidroxiisovalerato, conformecatalisado, por exemplo, por acetoidróxi ácido isomerorreductase codificadapelo gene fornecido como SEQ ID N0 31;

c) 2,3-di-hidroxiisovalerato em α-cetoisovalerato, conformecatalisado, por exemplo, por acetoidróxi ácido desidratase codificada pelo genefornecido como SEQ ID N0 33;

d) α-cetoisovalerato em isobutiraldeído, conforme catalisado,por exemplo, por ceto ácido descarboxilase de cadeia ramificada codificadopelo gene fornecido como SEQ ID N0 35; e

e) isobutiraldeído em isobutanol, conforme catalisado, porexemplo, por álcool desidrogenase de cadeia ramificada codificada pelo genefornecido como SEQ ID NO:37.

Construção de hospedeiros Enterococcus para a produção de butanol

Linhagens de Enterococcus tolerantes a butanol recombinantesque contêm os genes necessários que codificarão um dos processosenzimáticos de conversão de um substrato de carbono fermentável em butanolpodem ser ser construídas utilizando-se métodos bem conhecidos na técnica.

As seqüências de genoma do Enterococcus faeealis e Enterocoeeus faeeiumsão conhecidas (banco de dados do National Center for BiotechnologyInformation (NCBI)). Estas bactérias possuem teor de G+C de 37%.Enterocoeeus gallinarum é relacionado intimamente ao Enterocoeeus faeealis eEnterococcus faecium.

Na presente invenção, genes que codificam as enzimas de umdos processos biossintéticos de butanol descritos acima podem ser isolados devarias fontes (vide acima). Métodos de obtenção de genes desejados a partirde um genoma bacteriano são comuns e bem conhecidos na técnica debiologia molecular. Se a seqüência do gene for conhecida, por exemplo, podemser designados primers e a seqüência desejada amplificada utilizando métodosde amplificação dirigida por primers tais como reação em cadeia de polimerase(Patente Norte Americana n° 4.683.202) para obter quantidades de DNAapropriadas para clonagem em vetores de transformação. Caso um gene que éheterólogo a uma seqüência conhecida deva ser isolado, bibliotecas genômicasapropriadas podem ser criadas por meio de digestão de endonuclease restritivae podem ser selecionadas com sondas que possuam seqüência complementarà seqüência genética desejada. Após o isolamento da seqüência, o DNA podeser amplificado utilizando métodos de amplificação dirigida por primers padrão,tais como reação em cadeia de polimerase (Patente Norte-Americana n°4.683.202) para obter quantidades de DNA apropriadas para transformaçãoutilizando vetores apropriados. Ferramentas de oti mização de códons paraexpressão em um hospedeiro heterólogo são facilmente disponíveis.

Após a identificação e o isolamento dos genes de processorelevantes, eles podem ser inseridos em um vetor e transformados em umhospedeiro Enterococcus tolerante a butanol por meios bem conhecidos natécnica. Vetores úteis para a transformação de Enteroeoceus são conhecidos(vide abaixo). Tipicamente, o vetor contém seqüências que dirigem atranscrição e a tradução do fragmento de DNA inserido, um marcadorselecionável e seqüências que permitem reprodução autônoma ou integraçãocromossômica. Vetores apropriados compreendem uma região 5' do fragmentode DNA inserido que abriga controles de início de transcrição e uma região 3'do fragmento de DNA que controla o término da transcrição. As duas regiõesde controle podem ser derivadas de genes homólogos à célula hospedeiratransformada, embora deva-se compreender que essas regiões de controlepodem ser também derivadas de genes que não são nativos para a produçãode hospedeiros específicos.

Regiões de controle de início ou promotores, que são úteis paradirigir a expressão de regiões de codificação de um processo relevante nacélula hospedeira de Enterococcus desejada, podem ser obtidos a partir deoutra bactéria de ácido láctico ou outros organismos Gram-positivos. Umexemplo não limitador é o promotor nisA de Lactococcus. Regiões de controlede término podem ser também derivadas de vários genes nativos para oshospedeiros preferidos ou bactérias relacionadas. Opcionalmente, um local detérmino pode ser desnecessário, mas é de maior preferência se incluído.

O gênero Enterococcus pertence à família dos Lactobacillales emuitos plasmídeos e vetores utilizados na transformação de Laetobaeillus,Bacillus subtilis e Streptoeoeeus podem ser utilizados para Enteroeoeeus.Exemplos não limitadores de vetores apropriados incluem pAM/?1 e seusderivativos (Renault et al, Gene 183: 175-182 (1996); e O1SuIIivan et al, Gene137: 227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivativo de pMBB1 (Wyckoff etal, Appl. Environ. Mierobiol. 62: 1481-1486 (1996)); pMG1, um plasmídeoconjugado (Tanimoto et al, J. Baeteriol. 184:580 0-5804 (2002)); pNZ9520(Kleerebezem et al, Appi Environ. Mierobiol. 63: 4581-4584 (1997)); pAM401(Fujimoto et al, Appi Environ. Mierobiol. 67: 1262-1267 (2001)); e pAT392(Arthur et al, Antimierob. Agents Chemother. 38: 1899-1903 (1994)). Vetores deexpressão para E. faeealis utilizando o promotor nisA de Lactococcus podemtambém ser utilizados (Eichenbaum et al, Appl. Environ. Mierobiol. 64: 2763-2769 (1998). Além disso, vetores de reposição de genes no cromossomo E.faecium (Nallaapareddy et al, Appl. Environ. Mierobiol. 72: 334-345 (2006)).Os diversos genes para um processo biossintético de butanolpodem ser reunidos em qualquer vetor apropriado, tal como os descritos acima.Os códons podem ser otimizados para expressão com base no índice decódons deduzido das seqüências de genoma de Enterococcus faecalis ouEnterococcus faeeium. Os plasmídeos podem ser introduzidos na célulahospedeira tolerante a butanol utilizando métodos conhecidos na técnica, taiscomo eletroporação, como descrito por Cruz-Rodz et al (Molecular Genetiesand Genomies 224: 1252-154 (1990)) ou conjugação, conforme descrito porTanimoto et al (J. Baeterioi 184: 5800-5804 (2002)) e Grohamann et al(Mieobiol. Moi Biol. Rev. 67: 277-301 (2003)).

Meio de FermentaçãoOs meios de fermentação para a produção de butanol necessitamconter substratos de carbono apropriados. Substratos apropriados podemincluir, mas sem limitar-se a monossacarídeos tais como glicose e frutose,oligossacarídeos tais como Iactose ou sacarose, polissacarídeos tais comoamido ou celulose ou suas misturas e misturas não purificadas de estoques dealimentação renováveis tais como permeado de soro de queijo, licor de infusãode milho, melado de beterraba de açúcar e malte de cevada.

Embora se contemple que todos os substratos de carbonomencionados acima e suas misturas são apropriados na presente invenção, ossubstratos de carbono preferidos são glicose, frutose e sacarose.

Além de uma fonte de carbono apropriada, o meio de fermentaçãodeve conter minerais apropriados, sais, co-fatores, tampões e outroscomponentes, conhecidos dos técnicos no assunto, apropriados para ocrecimento dos cultivos e promoção do processo enzimático necessário para aprodução de butanol.

Condições de cultivoTipicamente, células são cultivadas a uma temperatura na faixade cerca de 25 0C a cerca de 40 °C em um meio apropriado. Meios decrescimento apropriados na presente invenção são meios comuns preparadoscomercialmente, tais como caldo Luria Bertani (LB)1 caldo de DextroseSabouraud (SD) ou caldo de Meio de Levedura (YM). Outros meios decrescimento sintéticos ou definidos podem também ser utilizados e o meioapropriado de crescimento do microorganismo específico será conhecido dostécnicos no assunto de microbologia ou ciência da fermentação. O uso deagentes conhecidos para modular a repressão de catabólitos direta ouindiretamente, tais como adenosina 2':3'-monofosfato cíclico, pode também serincorporado ao meio de fermentação.

As faixas de pH apropriadas para a fermentação são de pH 5,0 apH 9,0, em que pH 6,0 a pH 8,0 é preferido como condição inicial.

Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ouanaeróbicas, em que condições microaeróbicas ou anaeróbicas são preferidas.

Fermentações contínuas ε em bateladas industriaisButanol pode ser produzido utilizando um método de fermentaçãoem bateladas. Fermentação em bateladas clássica é um sistema fechado emque a composição do meio é definida no começo da fermentação e não estásujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Uma variação no sistemade bateladas padrão é o sistema de alimentação em bateladas. Os processosde fermentação por alimentação em bateladas também são apropriados napresente invenção e compreendem um sistema de bateladas típico comexceção de que o substrato é adicionado em parcelas à medida que afermentação progride. Sistemas de alimentação de batelads são úteis quando arepressão dos catabólitos está apta a inibir o metabolismo das células e édesejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. Fermentações embateladas e fermentações de alimentação de bateladas são comuns e bemconhecidas na técnica e exemplos podem ser encontrados em Thomas D.Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology1 segunda edição(1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA ou Deshpande, Mukund V.,Appi Biochem. Biotechnol., 36: 227 (1992), incorporada ao presente comoreferência.

Butanol pode também ser produzido utilizando métodos defermentação contínua. Fermentação continua é um sistema aberto, em que ummeio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator euma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente paraprocessamento. Fermentação contínua geralmente mantém os cultivos em altadensidade alta constante, em que as células encontram-se principalmente emcrescimento de fase de registro. Fermentação contínua permite a modulaçãode um fator ou qualquer número de fatores que afetem o crescimento celular oua concentração do produto final. Métodos de modulação de nutrientes e fatoresde crescimento para processos de fermentação contínua, bem como métodosde maximização da velocidade de formação de produto, são bem conhecidosna técnica de microbiologia industrial e uma série de métodos é detalhada porBrock, acima.

Contempla-se que a produção de butanol pode ser praticadautilizando processos de bateladas, alimentação de bateladas ou contínuos equalquer modo conhecido de fermentação seria apropriado. Além disso,contempla-se que células podem ser imobilizadas sobre um substrato comocélulas catalisadoras inteiras e submetidas a condições de fermentação para aprodução do butanol.

Métodos de Isolamento de Butanol do Meio de Fermentação

O butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentaçãoutilizando métodos conhecidos na arte para fermentações ABE (vide, porexemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639-648 (1998), Groot et al,Process. Biochem. 27: 61-75 (1992) e referencias ali mencionadas). Sólidos,por exemplo, podem ser removidos do meio de fermentação por meio decentrifugação, filtragem, decantação ou similares. Em seguida, o butanol podeser isolado do meio de fermentação utilizando métodos tais como destilação,destilação azeotrópica, extração líquido-líquido, adsorção, extração de gases,evaporação de membrana ou pervaporação.

Exemplos

A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos aseguir. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizaçõespreferidas da presente invenção, são fornecidos unicamente por meio de ilustração.A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podemdeterminar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar oseu espírito e escopo, podem realizar diversas alterações e modificações dapresente invenção para adaptá-la a vários usos e condições.

O significado das abreviações utilizadas é o seguinte: "min"significa minuto(s), "h" significa hora(s), "seg" significa segundo(s), "μΓ significamicrolitro(s), "ml" significa mililitro(s), "I" significa litro(s), "nm" significananômetro(s), "mm" significa milímetro(s), "cm" significa centímetro(s), 'Vm"significa micrômetro(s), "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol"significa milimole(s), "μηιοΓ significa micromol(es), "g" significa grama(s), 'Vg"significa micrograma(s), "mg" significa miligrama(s), "rpm" significa rotações porminuto, "p/v" significa peso/volume, "OD" significa densidade ótica, "OD6oo"significa densidade ótica medida em um comprimento de onda de 600 nm,"OD595" significa densidade ótica medida em um comprimento de onda de 595nm, "IC50" significa a concentração de butanol que causa uma inibição decrescimento de 50%, "GCMS" significa espectrometria de massa cromatografiade gases e "HPLC" significa cromatografia de líquidos com alto desempenho.

Métodos Gerais

Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrãoutilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e descritos porSambrock1 J., Fritsch1 E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press1 Cold Spring Harbor1 Novalorque, 1989, por T. J. Silhavy, M. L. Bennan e L. W. Enquist, Experiments withGene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Novalorque, 1984 e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology1Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience1 Nova Iorque, 1987.

Materiais e métodos apropriados para a manutenção ecrescimento de culturas bacterianas são também bem conhecidos na técnica.Métodos apropriados para uso nos Exemplos a seguir podem ser encontradosem Manual for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt1 R. G. E. Murray1 RalphN. Costilow1 Eugene W. Nester1 Willis A. Wood1 Noel R. Krieg e G. BriggsPhillips, Eds., American Societyfor Microbiology, Washington, DC, 1994 ou porThomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology,segunda edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA1 1989. Todos osreagentes, enzimas de restrição e materiais utilizados para o cultivo emanutenção das células bacterianas foram obtidos da Aldrich Chemicals(Milwaukee, Wl), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies(Rockville, MD) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), a menos queespecificado em contrário.

Exemplo 1

Isolamento de Microorganismos Tolerantes a Butanol

O propósito deste Exemplo foi de isolar os microorganismostolerantes a butanol. Amostras ambientais foram obtidas de diversos locais detratamento de esgoto e foram cultivadas em culturas de enriquecimento quecontêm 1-butanol em frascos de agitação. Uma linhagem bacteriana tolerante abutanol foi isolada e identificada como Enterococcus faecium.

Amostras ambientais de lodo foram obtidas de indústrias detratamento de esgoto em diversos locais Ε. I. Du Pont de Nemours andCompany. Culturas de enriquecimento foram estabelecidas para cada amostrapor meio de inoculação de um frasco Erlenmeyer com tampa de rosca de 125ml com 1 ml de amostra de lodo em 10 ml de meio de enriquecimento mínimo(ou seja, 10 mM de sulfato de amônio, 50 mM de tampão fosfato de potássio,pH 7,0, 2 mM de MgCI2, 0,7 mM de CaCI2, 50 μΜ de MnCI2, 1 μΜ de FeCI3, 1μΜ de ZnCI2, 1,72 μΜ de CuCI2, 2,53 μΜ de CoCI2, 2,42 μΜ de Na2MoO4, 2 μΜde cloridreto de tiamina, 0,5% de glicose, 0,5% de frutose, 0,5% de sacarose e0,1% de extrato de levedura). As culturas de enriquecimento foram incubadas à37°C com agitação. Após 24h de incubação, as culturas de enriquecimentoforam diluídas 1:10 em um meio fresco que contém 0,8%, 1,2% ou 1,6% p/v de1-butanol (Sigma Chemical Co.; grau de biologia molecular (maior ou igual a99% de pureza)). A incubação prosseguiu sob as mesmas condições. Culturascom o nível mais alto de 1-butanol permitindo crescimento significativo (talcomo cultivo com OD600 inicial de cerca de 0,1 que aumentou em 24 a 48 horasaté ϋΟβοο de cerca de 1,0) foram diluídas 1:10 em seguida em um meio novoque contém níveis mais altos de 1-butanol para seleção de maior tolerância a1-butanol. A maior parte das culturas de enriquecimento cresceu na presençade 1,2% de 1-butanol e culturas de enriquecimento de alguns locais cresceramna presença de 1,6% de 1-butanol. Nenhuma das culturas de enriquecimentocresceu, entretanto, na presença de 2,0% de 1-butanol em um meio líquido.

Linhagens puras de bactérias resistentes a 1-butanol foramisoladas das culturas de enriquecimento conforme segue. As células cultivadasem uma cultura de enriquecimento que contém 1,2% ou 1,6% de 1-butanolforam diluídas em série e as diluições em série foram baseadas em meio agarLuria Bertani (LB), agar LB modificado (ou seja, agar LB suplementado com0,5% de sacarose, 0,5% de glicose, 0,5% de frutose, 0,5% de piruvato desódio, 2 mM de MgCI2, 0,7 mM de CaCI2 50 μΜ de MnCI2, 1 μΜ de FeCI3, 1 μΜde ZnCI2, 1,72 μΜ de CuCI2,2,53 μΜ de CoCI2, 2,42 μΜ de Na2MoO4 e 2 μΜ decloridreto de tiamina) ou meio de enriquecimento mínimo com 2,0% Difco®Agar Noble, (BD Diagnostic Systems, Sparks1 MD), tudo sem 1-butanol.Colônias foram inoculadas em seguida a partir do meio agar em um meio deenriquecimento mínimo (descrito acima) sem 1-butanol nas cavidades de umprato de microtítulo. As células em cada cavidade foram subcultivadas empratos de microtítulo separadas com e sem 1-butanol para identificar isoladostolerantes a 1-butanol. A quantidade de 1-butanol utilizada para desafiar osisolados variou de 1,2% a 3,0% p/v. Diversos isolados dos enriquecimentosexibiram crescimento em 2,0% ou mais de 1-butanol em um meio líquido a 37°C. Os valores IC50 das linhagens isoladas capazes de crescer em um meiolíquido que contém pelo menos 2,0% de 1-butanol foram determinadosconforme segue. O crescimento foi monitorado (por meio de OD6oo) de isoladoscultivados em um meio S30L (ou seja, 10 mM de sulfato de amônio, 5 mM defosfato de potássio, pH 7,0, 50 mM de MOPS, pH 7,0, 2 mM de MgCI2, 0,7 mMde CaCI2, 50 μΜ de MnCI2, 1 μΜ de FeCI3, 1 μΜ de ZnCI2, 1,72 μΜ de CuCI2,2,53 μΜ de CoCI2l 2,42 μΜ de Na2MoO4, 2 μΜ de cloridreto de tiamina, 0,01 Mde glicose e 0,2% de extrato de levedura) a 37 0C na ausência (controle) e napresença de 1,2% a 3,0% p/v de 1-butanol e foi calculado o tempo para o dobrode cada cultura a partir da parte logarítmica da curva de crescimento (tempopara o dobro = 0,693/taxa de crescimento). O percentual de inibição docrescimento causada por 1-butanol nos frascos de amostra foi determinado pormeio de subtração do percentual de crescimento ([tempo para o dobro dofrasco controle/tempo para o dobro do frasco de amostra] χ 100) de 100%. IC50foi a concentração de butanol responsável por 50% da inibição de crescimentoe foi determinada por meio de plotagem da concentração de butanol contra opercentual de inibição. Os resultados para uma Iinhagen representativa que eracapaz de crescer sobre um meio sólido contendo 2,5% p/v de 1-butanol a 37 0Cencontram-se resumidos na Tabela 4. Valores de IC50 mais altos foram obtidosquando as linhagens foram cultivadas a 30 0C (dado não revelado). Os isoladosforam identificados por meio de seqüenciamento do produto que resultou deuma amplificação por reação em cadeia de polimerase (RCP) dos genes16S rRNA em DNA que foi extraído de cada isolado. DNA foi extraído decada uma das linhagens tolerantes a 1-butanol. Cada isolado foiprocessado utilizando-se um kit comercial (Kit de Isolamento de DNAGenômico Microbiano Ultraclean1 obtido de Mo Bio Laboratories, Inc1Carlsbad, CA1 peça n° 12224-50). Os genes 16S rRNA dos isolados foramamplificados por meio de PCR utilizando HotStar Taq (Qiagen, Valencia1CA; Catálogo N0 203446) com primeiros JCR14 (ACGGGCGGTGTGTAC),fornecido como SEQ ID N0 39, e JCR15 (GCCAGCAGCCGCGGTA),fornecido como SEQ ID N0 40. As condições de PCR foram de 15 a 95 0C1seguidos por trinta ciclos a 94 0C por 45 segundos, 55 0C por um minuto e72 0C por um minuto, seguidos por dez minutos a 72 0C. Os produtos dePCR foram purificados e seqüenciados. Cada seqüência foi utlizada comouma seqüência de pesquisa para uma busca BLAST do GenBank para aseqüência genética de 16S rRNA previamente identificada com maiorsimilaridade. A seqüência do gene rRNA da linhagem isolada que foidenominada PN0110 (SEQ ID N0 41) coincidiu com a seqüência de rRNAconhecida para Enterococcus faecium (vide Tabela 4).

Tabela 4

<table>table see original document page 40</column></row><table>Exemplo 2

Isolamento de Fitas Bacterianas Tolerantes a Butanol Utilizando

Culturas Contínuas

O propósito deste Exemplo foi de isolar tiras bacterianastolerantes a butanol. Amostras ambientais foram obtidas a partir de diversoslocais de tratamento de esgoto e foram cultivadas na presença de 1-butanol emcultura contínua em um biorreator quimiostático. Diversas fitas bacterianastolerantes a 1-butanol foram isoladas e identificadas como espécies diferentesde Enterococcus.

Um FermentadorAppiIikon (Appilikon Inc., Clinton, NJ) foi operadocomo um quimiostato anaeróbico. O sistema de biorreator foi composto de umreator com fundo em forma de prato de um litro, Controlador ADI 1032 P100 eunidade de agitação com impulsionadores de turbina e marinhos. Bio ControllerADI 1030 Z510300020 com sensores apropriados foi utilizado para monitorar opH, dissolver oxigênio e temperatura. Uma bomba e cabeça de bomba ColeParmer (Cole Parmer Instrument Co,m Vernon Hills, IL) foram utilizadas para aadição de ácido e base para manter o meio de cultivo em pH 7,0. Atemperatura foi mantida a 37 0C utilizando um banho de água em circulação. Omeio de cultivo (meio S20) consistiu de 5 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, 10mM de sulfato de amônio, 0,1% de extrato de levedura, 0,1% decaseaminoácidos, 100 mM de MOPS, 2 mM de MgCI2, 0,7 mM de CaCI2, 0,05mM de MnCI2, 0,001 mM de ZnCI2, 0,002 mM de cloridreto de tiamina, 1,72 μΜde CuCI2, 2,53 μde M CoCI2, 2,42 μΜ de Na2MoO4, 25 mM de glicose, 12,5 mMde sacarose, 12,5 mM de frutose e um volume de 500 ml desse meio foiutilizado no biorreator. O biorreator foi operado com uma velocidade dealimentação de 0,1 a 1,0 ml/minuto e uma velocidade de agitação de 50 rpm.

O biorreator foi inoculado com uma mistura de diversas amostrasde lodo de esgoto obtidas de diversas instalações de tratamento de esgoto ediversos locais da E.l. Du Pont de Nemours and Company. Após um curtoperíodo de operação em modo de bateladas, o biorreator foi operado em modode alimentação contínua. 1-ButanoI foi adicionado ao biorreator como parte domeio de cultivo ingressante. O nível de 1-butanol no biorreator f oi de 0%quando o biorreator foi trocado de modo de bateladas para modo dealimentação contínua e, em seguida, 1-butanol foi gradualmente aumentadopara 2,5% no biorreator. A velocidade de fluxo do meio encontrava-se na faixade 0,1 a 1,0 ml/min.

A densidade celular no biorreator foi monitorada medindo adensidade ótica a 600 nm. O 1-butanol na alimentação e efluente foideterminado por meio de GCMS utilizando um cromatógrafo de gasesHP6890 com detector de massa 5973 (Agilent Technologies, Inc.,Wilmington DE). A coluna GC foi uma coluna DB-WAX, diâmetro interno de30 m χ 0,32 mm χ 0,25 μίτι (J&W Scientific, Inc., Folsom, CA).

Alternativamente, amostras foram filtradas (filtros Acrodisc CR PTFE de 0,2μΐη) e analisadas por meio de HPLC utilizando uma coluna Shodex®SH1011 (diâmetro interno de 8 mm χ 300 mm de comprimento; ShokoAmerica Inc., Colorado Springs, CO) com uma coluna de guarda Shodex®SH-G. A fase móvel foi de 0,01 N de ácido sulfúrico. A temperatura dacoluna era de 50°C e utilizou-se uma velocidade de fluxo de 0,5 ml/min.Para detecção, foram utilizados um detector fotométrico a 210 nm e umdetector de índice de refração. O volume de injeção da amostra foi de 10μL.

Após um período de ajuste inicial, a quantidade de 1-butanol queentrou no biorreator através da alimentação foi gradualmente aumentada paraatingir uma concentração final de 1-butanol no meio de cultivo de 2,5% p/v.Durante o mesmo período, a quantidade de glicose no efluente do biorreator foimonitorada. O aumento da quantidade de 1-butanol na alimentação resultouem uma redução da densidade celular e uma redução concomitante dautilização de glicose. Incubação contínua resultou novamente no aumento dadensidade celular e utilização de glicose, após adaptação a um nível mais altode 1-butanol. O aumento de 1-butanol para 1,6%, por exemplo, resultou naredução da densidade celular para menos de 1,5 OD600 com reduçãocorrespondente da utilização de glicose. Entretanto, a incubação contínuaresultou no aumento da densidade celular para 2,3 OD600 com um aumentocorrespondente do consumo de glicose.

A caracterização filogenética dos consórcios microbianas nobiorreator anaeróbico e o isolamento de linhagens puras de bactériasresistentes a 1-butanol desse biorreator foram realizados conforme segue.Amostras de células retiradas do biorreator em diversos momentos e dorecipiente de resíduo do biorreator foram diluídas em série e as diluiçõesem série foram colocadas em placas sobre meio agar S20 (meio S20 com1,6% Difco® Agar, agente de solidificação Noble) sem 1-butanol. Colôniasforam inoculadas em seguida a partir do meio agar S20 em 1,2 ml de meioS20 sem 1-butanol nas cavidades de uma placa de microtítulos comcavidades quadradas (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA; Catálogo n°069681). A placa de microtítulos com cavidades quadradas foi vedada comuma cobertura adesiva (Beckman Coulter Inc.; Catálogo n° 538619) eincubada a 37 °C com agitação por mais de 72 horas. A placa demicrotítulos com cavidades quadradas foi utilizada para elaborar uma placamestra por meio de liberação de 200 μL de cultivo de cada cavidadequadrado em uma cavidade correspondente em uma placa de microtítuloscom "fundo em U" (VWR Scientific Products, West Chester, PA; CatálogoN0 62409-052). As células em cada cavidade foram subcultivadas emseguida em 200 μL de meio S20 nas cavidades de placas de microtítuloscom fundo em U (BD Diagnostic Systems; Catálogo N0 353077) com e sem1-butanol para identificar os isolados tolerantes a 1-butanol. Os isoladosforam desafiados separadamente com 2,0% e 3,0% p/v de 1-butanol. Atolerância a butanol foi determinada pelo crescimento na presença de 1-butanol conforme determinado por meio da medição do aumento da densidade ótica a 595 nm (OD5g5) em um leitor de placas de microtítulos(HTS 7000 Plus Bio Assay Reader, PerkinEImer Life and AnalyticalSciences Inc., Wellesley, MA). Isolados que apresentaram leituras deOD595 na faixa de 0,1 a 0,8 após o crescimento por 48 horas a 37 0C comagitação foram selecionados para teste de tolerância adicional. Alternativamente, isolados da placa mestra foram reproduzidos em placassobre agar S20 contendo até 3,4% de 1-butanol utilizando o sistema deseleção de fase sólida transferível Nunc-TSP (Nalgene Nunc International,Napersville, IL; Catálogo N0 445497). Isolados tolerantes foramidentificados por meio de crescimento a 37 0C após 24 h a 72 h. Vários isolados, incluindo os relacionados na Tabela 5, demonstraramcrescimento de 2,5% ou mais de 1-butanol sobre um meio sólido. Osvalores IC50 das linhagens isoladas foram determinados a 37 0C para 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, 2-butanona (também denominada metil etilcetona (MEK)) e etanol, seguindo o método descrito no Exemplo 1. Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 5. Com base nos valoresIC50 determinados para cada composto e uma correlação observada entretolerância a 1-butanol e a cada um dos outros compostos testados, espera-se que as linhagens tolerantes identificadas cresçam sobre um meio sólidoque contém 3,9% p/v de 2-butanol, 2,7% p/v de isobutanol, 5,0% p/v de 2- butanona ou 9,0% p/v de etanol.

Os isolados foram identificados por meio de seqüenciamento dosgenes 16S rRNA, conforme descrito no Exemplo 1. A SEQ ID para o 16S rRNAde cada isolado, o filotipo e as designações de isolados são também fornecidosna Tabela 5.

Tabela 5

Linhagens Bacterianas Tolerantes a Butanol Isoladas de Amostras doAmbiente Utilizando Cultura Contínua

<table>table see original document page 45</column></row><table>Listagem de Sequencias

<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.

<120> Microorganismos tolerantes a solvente e métodos para tratamento

<130> CL3423 PCT

<160> 44

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 1 atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa 120gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt 180ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca 240gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa 300attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt 420gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca 480gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt 540gcatcacaaa aaaaagctga agaagctata aaatcaggtc aatttaaaga tgaaatagtt 600cctgtagtaa ttaaaggcag aaagggagaa actgtagttg atacagatga gcaccctaga 660tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca 720gttacagctg gtaatgcatc aggattaaat gactgtgcag cagtacttgt aatcatgagt 780gcagaaaaag ctaaagagct tggagtaaaa ccacttgcta agatagtttc ttatggttca 840gcaggagttg acccagcaat aatgggatat ggacctttct atgcaacaaa agcagctatt 900gaaaaagcag gttggacagt tgatgaatta gatttaatag aatcaaatga agcttttgca 960gctcaaagtt tagcagtagc aaaagattta aaatttgata tgaataaagt aaatgtaaat 1020ggaggagcta ttgcccttgg tcatccaatt ggagcatcag gtgcaagaat actcgttact 1080cttgtacacg caatgcaaaa aagagatgca aaaaaaggct tagcaacttt atgtataggt 1140

ggcggacaag gaacagcaat attgctagaa aagtgctag 1179

<210> 2<211> 392<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum<400> 2

Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser15 10 15

Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr20 25 30

Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val35 40 45

Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn50 55 60

Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro65 70 75 80

Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser85 90 95

Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala100 105 110

Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala115 120 125

Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile130 135 140

Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr145 150 155 160

Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp165 170 175

Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser

180 185 190

Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys

195 200 205

Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr210 215 220

Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr225 230 235 240Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu245 250 255

Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu260 265 270

Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met275 280 285

Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly290 295 300

Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala305 310 315 320

Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys325 330 335

Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala340 345 350

Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg355 360 365

Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly

Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys385 390

<210> 3<211> 1179<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum<400> 3

atgagagatg tagtaatagt aagtgctgta agaactgcaa taggagcata tggaaaaaca 60

ttaaaggatg tacctgcaac agagttagga gctatagtaa taaaggaagc tgtaagaaga 120

gctaatataa atccaaatga gattaatgaa gttatttttg gaaatgtact tcaagctgga 180

ttaggccaaa acccagcaag acaagcagca gtaaaagcag gattaccttt agaaacacct 240

gcgtttacaa tcaataaggt ttgtggttca ggtttaagat ctataagttt agcagctcaa 300

attataaaag ctggagatgc tgataccatt gtagtaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360

tcaccatatt tgattaacaa tcagagatgg ggtcaaagaa tgggagatag tgaattagtt 420

gatgaaatga taaaggatgg tttgtgggat gcatttaatg gatatcatat gggagtaact 480

gcagaaaata ttgcagaaca atggaatata acaagagaag agcaagatga attttcactt 540

atgtcacaac aaaaagctga aaaagccatt aaaaatggag aatttaagga tgaaatagtt 600

cctgtattaa taaagactaa aaaaggtgaa atagtctttg atcaagatga atttcctaga 660ttcggaaaca ctattgaagc attaagaaaa cttaaaccta ttttcaagga aaatggtact 720

gttacagcag gtaatgcatc cggattaaat gatggagctg cagcactagt aataatgagc 780

gctgataaag ctaacgctct cggaataaaa ccacttgcta agattacttc ttacggatca 840

tatggggtag atccatcaat aatgggatat ggagcttttt atgcaactaa agctgcctta 900

gataaaatta atttaaaacc tgaagactta gatttaattg aagctaacga ggcatatgct 960

tctcaaagta tagcagtaac tagagattta aatttagata tgagtaaagt taatgttaat 1020

ggtggagcta tagcacttgg acatccaata ggtgcatctg gtgcacgtat tttagtaaca 1080

ttactatacg ctatgcaaaa aagagattca aaaaaaggtc ttgctactct atgtattggt 1140

ggaggtcagg gaacagctct cgtagttgaa agagactaa 1179

<210> 4<211> 392<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum<4 00> 4

Met Arg Asp Val Val Ile Val Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ala15 10 15

Tyr Gly Lys Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ala Ile20 25 30

Val Ile Lys Glu Ala Val Arg Arg Ala Asn Ile Asn Pro Asn Glu Ile35 40 45

Asn Glu Val Ile Phe Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn50 55 60

Pro Ala Arg Gln Ala Ala Val Lys Ala Gly Leu Pro Leu Glu Thr Pro65 70 75 80

Ala Phe Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Ser Ile Ser85 90 95

Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ile Val Val100 105 110

Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ser Pro Tyr Leu Ile Asn Asn Gln115 120 125

Arg Trp Gly Gln Arg Met Gly Asp Ser Glu Leu Val Asp Glu Met Ile130 135 140

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Ala Glu Asn Ile Ala Glu Gln Trp Asn Ile Thr Arg Glu Glu Gln Asp165 170 175Glu Phe Ser Leu Met Ser Gln Gln Lys Ala Glu Lys Ala Ile Lys Asn180 185 190

Gly Glu Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Lys Thr Lys Lys195 200 205

Gly Glu Ile Val Phe Asp Gln Asp Glu Phe Pro Arg Phe Gly Asn Thr210 215 220

Ile Glu Ala Leu Arg Lys Leu Lys Pro Ile Phe Lys Glu Asn Gly Thr225 230 235 240

Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu245 250 255

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Ala Lys Ile Thr Ser Tyr Gly Ser Tyr Gly Val Asp Pro Ser Ile Met275 280 285

Gly Tyr Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Leu Asp Lys Ile Asn290 295 300

Leu Lys Pro Glu Asp Leu Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Tyr Ala305 310 315 320

Ser Gln Ser Ile Ala Val Thr Arg Asp Leu Asn Leu Asp Met Ser Lys325 330 335

Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala340 345 350

Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu Tyr Ala Met Gln Lys Arg355 360 365

Asp Ser Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly370 375 380

Thr Ala Leu Val Val Glu Arg Asp385 390

<210> 5

<211> 849

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 5

atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240

tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360

ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt 420

aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480

acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540

gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600

atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660

aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720

ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780

aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840

tcaaaataa 849

<210> 6<211> 282<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum<400> 6

Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile1 5 10 15

Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile20 25 30

Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu35 40 45

Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu50 55 60

Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp65 70 75 80

Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys85 90 95

Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu100 105 110

Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr115 120 125

Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro130 135 140

Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu145 150 155 160

Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro165 170 175Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile180 185 190

Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser195 200 205

Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met210 215 220

Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala225 230 235 240

Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro245 250 255

His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys260 265 270

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<210> 7<211> 786<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum<400> 7

atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60

agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120

ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180

tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240

aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300

atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360

ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420

cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480

cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540

aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600

agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660

gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720

gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780

agatag 786

<210> 8<211> 261<212> PRT<213> Clostridium acetobutylicum<400> 8

Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val1 5 10 15

Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr20 25 30

Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu35 40 45

Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala50 55 60

Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg65 70 75 80

Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu85 90 95

Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly100 105 110

Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala115 120 125

Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly130 135 140

Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln145 150 155 160

Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile165 170 175

Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala180 185 190

Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys195 200 205

Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr210 215 220

Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu225 230 235 240

Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu245 250 255

Gly Phe Lys Asn Arg260

<210> 9<211> 1197<212> DNA<213> Clostridium acetobutylicum<400> 9

atgatagtaa aagcaaagtt tgtaaaagga tttatcagag atgtacatcc ttatggttgc 60

agaagggaag tactaaatca aatagattat tgtaagaagg ctattgggtt taggggacca 120

aagaaggttt taattgttgg agcctcatct gggtttggtc ttgctactag aatttcagtt 180

gcatttggag gtccagaagc tcacacaatt ggagtatcct atgaaacagg agctacagat 240

agaagaatag gaacagcggg atggtataat aacatatttt ttaaagaatt tgctaaaaaa 300

aaaggattag ttgcaaaaaa cttcattgag gatgcctttt ctaatgaaac caaagataaa 360

gttattaagt atataaagga tgaatttggt aaaatagatt tatttgttta tagtttagct 420

gcgcctagga gaaaggacta taaaactgga aatgtttata cttcaagaat aaaaacaatt 480

ttaggagatt ttgagggacc gactattgat gttgaaagag acgagattac tttaaaaaag 540

gttagtagtg ctagcattga agaaattgaa gaaactagaa aggtaatggg tggagaggat 600

tggcaagagt ggtgtgaaga gctgctttat gaagattgtt tttcggataa agcaactacc 660

atagcatact cgtatatagg atccccaaga acctacaaga tatatagaga aggtactata 720

ggaatagcta aaaaggatct tgaagataag gctaagctta taaatgaaaa acttaacaga 780

gttataggtg gtagagcctt tgtgtctgtg aataaagcat tagttacaaa agcaagtgca 840

tatattccaa cttttcctct ttatgcagct attttatata aggtcatgaa agaaaaaaat 900

attcatgaaa attgtattat gcaaattgag agaatgtttt ctgaaaaaat atattcaaat 960

gaaaaaatac aatttgatga caagggaaga ttaaggatgg acgatttaga gcttagaaaa 1020

gacgttcaag acgaagttga tagaatatgg agtaatatta ctcctgaaaa ttttaaggaa 1080

ttatctgatt ataagggata caaaaaagaa ttcatgaact taaacggttt tgatctagat 1140

ggggttgatt atagtaaaga cctggatata gaattattaa gaaaattaga accttaa 1197

<210> 10<211> 398<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum<400> 10

Met Ile Val Lys Ala Lys Phe Val Lys Gly Phe Ile Arg Asp Val His15 10 15

Pro Tyr Gly Cys Arg Arg Glu Val Leu Asn Gln Ile Asp Tyr Cys Lys20 25 30

Lys Ala Ile Gly Phe Arg Gly Pro Lys Lys Val Leu Ile Val Gly Ala35 40 45Ser Ser Gly Phe Gly Leu Ala Thr Arg Ile Ser Val Ala Phe Gly Gly50 55 60

Pro Glu Ala His Thr Ile Gly Val Ser Tyr Glu Thr Gly Ala Thr Asp65 70 75 80

Arg Arg Ile Gly Thr Ala Gly Trp Tyr Asn Asn Ile Phe Phe Lys Glu85 90 95

Phe Ala Lys Lys Lys Gly Leu Val Ala Lys Asn Phe Ile Glu Asp Ala100 105 110

Phe Ser Asn Glu Thr Lys Asp Lys Val Ile Lys Tyr Ile Lys Asp Glu115 120 125

Phe Gly Lys Ile Asp Leu Phe Val Tyr Ser Leu Ala Ala Pro Arg Arg130 135 140

Lys Asp Tyr Lys Thr Gly Asn Val Tyr Thr Ser Arg Ile Lys Thr Ile145 150 155 160

Leu Gly Asp Phe Glu Gly Pro Thr Ile Asp Val Glu Arg Asp Glu Ile165 170 175

Thr Leu Lys Lys Val Ser Ser Ala Ser Ile Glu Glu Ile Glu Glu Thr180 185 190

Arg Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Gln Glu Trp Cys Glu Glu Leu195 200 205

Leu Tyr Glu Asp Cys Phe Ser Asp Lys Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ser210 215 220

Tyr Ile Gly Ser Pro Arg Thr Tyr Lys Ile Tyr Arg Glu Gly Thr Ile225 230 235 240

Gly Ile Ala Lys Lys Asp Leu Glu Asp Lys Ala Lys Leu Ile Asn Glu245 250 255

Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Gly Arg Ala Phe Val Ser Val Asn Lys260 265 270

Ala Leu Val Thr Lys Ala Ser Ala Tyr Ile Pro Thr Phe Pro Leu Tyr275 280 285

Ala Ala Ile Leu Tyr Lys Val Met Lys Glu Lys Asn Ile His Glu Asn290 295 300

Cys Ile Met Gln Ile Glu Arg Met Phe Ser Glu Lys Ile Tyr Ser Asn305 310 315 320

Glu Lys Ile Gln Phe Asp Asp Lys Gly Arg Leu Arg Met Asp Asp Leu325 330 335

Glu Leu Arg Lys Asp Val Gln Asp Glu Val Asp Arg Ile Trp Ser Asn340 345 350

Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Lys Gly Tyr Lys355 360 365Lys Glu Phe Met Asn Leu Asn Gly Phe Asp Leu Asp Gly Val Asp Tyr370 375 380

Ser Lys Asp Leu Asp Ile Glu Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro385 390 395

<210> 11<211> 1407<212> DNA

<213> Clostridium beijerinckii<400> 11

atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60

aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggagtatt cgaaaatgtt 120

gaaaatgcta taagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180

gagcaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattacaaaa taaagaggtc 240

ttggctacaa tgattctaga agaaacacat atgggaagat atgaggataa aatattaaaa 300

catgaattgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcttggtca 360

ggtgataatg gtcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttatagg tgcaataact 420

ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca taggcatgat agctgctgga 480

aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540

atgataaata aggcaattat ttcatgtggc ggtcctgaaa atctagtaac aactataaaa 600

aatccaacta tggagtctct agatgcaatt attaagcatc cttcaataaa acttctttgc 660

ggaactgggg gtccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720

gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780

aggagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840

gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900

gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960

gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattctta 1020

gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca taatctgcga agtaaatgca 1080

aatcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat tgccaattgt aagagttaaa 1140

gatatagatg aagctattaa atatgcaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200

tatatttatt ctaaaaatat agacaaccta aatagatttg aaagagaaat agatactact 1260

atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttaca 1320

actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggaataacct ctgcaaggaa ttttacaaga 1380caaagaagat gtgtacttgc cggctaa 1407

<210> 12<211> 468<212> PRT

<213> Clostridium beijerinckii<400> 12

Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys1 5 10 15

Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser20 25 30

Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val35 40 45

His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu50 55 60

Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val65 70 75 80

Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp85 90 95

Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu100 105 110

Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val115 120 125

Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn130 135 140

Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly145 150 155 160

Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala165 170 175

Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro180 185 190

Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp195 200 205

Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly210 215 220

Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly225 230 235 240

Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile245 250 255

Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn260 265 270Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala275 280 285

Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn290 295 300

Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn305 310 315 320

Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala325 330 335

Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Asn Val Lys340 345 350

Cys Ile Ile Cys Glu Val Asn Ala Asn His Pro Phe Val Met Thr Glu355 360 365

Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu370 375 380

Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala385 390 395 400

Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu405 410 415

Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val420 425 430

Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr435 440 445

Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys450 455 460

Val Leu Ala Gly465

<210> 13<211> 1215<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum<400> 13

atggttgatt tcgaatattc aataccaact agaatttttt tcggtaaaga taagataaat 60

gtacttggaa gagagcttaa aaaatatggt tctaaagtgc ttatagttta tggtggagga 120agtataaaga gaaatggaat atatgataaa gctgtaagta tacttgaaaa aaacagtatt 180aaattttatg aacttgcagg agtagagcca aatccaagag taactacagt tgaaaaagga 240gttaaaatat gtagagaaaa tggagttgaa gtagtactag ctataggtgg aggaagtgca 300atagattgcg caaaggttat agcagcagca tgtgaatatg atggaaatcc atgggatatt 360gtgttagatg gctcaaaaat aaaaagggtg cttcctatag ctagtatatt aaccattgct 420gcaacaggat

ctaattgcgg

tataccgtac

gaggtgtatt

ttaagaactt

agagccaatc

gacactaatt

cacggcgtag

acagtgtaca

cactatgaca

ggtttaccat

aaggaatcag

gaagtcctac

aaaaaatctg tgtaa

<210> 14<211> 390<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum<400> 14

Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro1 5

Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu20 25

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser35 40

Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys50 55

Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg65 70

Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val85

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys100 105

Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val115 120

48054060066072078084090096010201080114012001215

Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys10 15

Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys30

Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr45

Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu60

Val Thr Thr Val Glu Lys Gly75 80

Glu Val Val Leu Ala Ile Gly90 95

Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu110

Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys125

cagaaatgga tacgtgggca gtaataaata atatggatac aaacgaaaaacacatccaga tatggctcct aagttttcta tattagatcc aacgtatacgctaccaatca aacagcagca ggaacagctg atattatgag tcatatatttttagtaatac aaaaacagca tatttgcagg atagaatggc agaagcgttagtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggcataatgtgggc ttcaagtctt gcgataaatg gacttttaac atatggtaaaggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataacaggcttgcaat tttaacacct aattggatgg agtatatttt aaataatgatagtttgttga atatggtgta aatgtttggg gaatagacaa agaaaaaaattagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtactactagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggcataaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaacgcctccaaatattcaa aaaatctgtg taaaacgcct ccgaagtcct acaaatattcArg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser130 135 140

Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys195 200 205

Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu245 250 255

Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys290 295 300

Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn305 310 315 320

His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe325 330 335

Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu340 345 350

Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly355 360 365

Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln370 375 380

Ile Phe Lys Lys Ser Val385 390

<210> 15

<211> 1170

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 15

atgctaagtt ttgattattc aataccaact aaagtttttt ttggaaaagg aaaaatagacgtaattggag aagaaattaa gaaatatggc tcaagagtgc ttatagttta tggcggagga 120agtataaaaa ggaacggtat atatgataga gcaacagcta tattaaaaga aaacaatata 180gctttctatg aactttcagg agtagagcca aatcctagga taacaacagt aaaaaaaggc 240atagaaatat gtagagaaaa taatgtggat ttagtattag caataggggg aggaagtgca 300atagactgtt ctaaggtaat tgcagctgga gtttattatg atggcgatac atgggacatg 360gttaaagatc catctaaaat aactaaagtt cttccaattg caagtatact tactctttca 420gcaacagggt ctgaaatgga tcaaattgca gtaatttcaa atatggagac taatgaaaag 480cttggagtag gacatgatga tatgagacct aaattttcag tgttagatcc tacatatact 540tttacagtac ctaaaaatca aacagcagcg ggaacagctg acattatgag tcacaccttt 600gaatcttact ttagtggtgt tgaaggtgct tatgtgcagg acggtatagc agaagcaatc 660ttaagaacat gtataaagta tggaaaaata gcaatggaga agactgatga ttacgaggct 720agagctaatt tgatgtgggc ttcaagttta gctataaatg gtctattatc acttggtaag 780gatagaaaat ggagttgtca tcctatggaa cacgagttaa gtgcatatta tgatataaca 840catggtgtag gacttgcaat tttaacacct aattggatgg aatatattct aaatgacgat 900acacttcata aatttgtttc ttatggaata aatgtttggg gaatagacaa gaacaaagat 960aactatgaaa tagcacgaga ggctattaaa aatacgagag aatactttaa ttcattgggt 1020attccttcaa agcttagaga agttggaata ggaaaagata aactagaact aatggcaaag 1080caagctgtta gaaattctgg aggaacaata ggaagtttaa gaccaataaa tgcagaggat 1140gttcttgaga tatttaaaaa atcttattaa 1170<210> 16 <211> 389 <212> PRT

<213> Clostrídium acetobutylicum

<400> 16

Met Leu Ser Phe Asp Tyr Ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys15 10 15

Gly Lys Ile Asp Val Ile Gly Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Arg20 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr35 40 45

Asp Arg Ala Thr Ala Ile Leu Lys Glu Asn Asn Ile Ala Phe Tyr Glu50 55 60

Leu Ser Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Lys Gly65 70 75 80Ile Glu Ile Cys Arg Glu Asn Asn Val Asp Leu Val Leu Ala Ile Gly85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ser Lys Val Ile Ala Ala Gly Val Tyr100 105 110

Tyr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Met Val Lys Asp Pro Ser Lys Ile Thr115 120 125

Lys Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gly Ser130 135 140

Glu Met Asp Gln Ile Ala Val Ile Ser Asn Met Glu Thr Asn Glu Lys145 150 155 160

Leu Gly Val Gly His Asp Asp Met Arg Pro Lys Phe Ser Val Leu Asp165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Phe Thr Val Pro Lys Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Ser Gly Val Glu195 200 205

Gly Ala Tyr Val Gln Asp Gly Ile Ala Glu Ala Ile Leu Arg Thr Cys210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Met Glu Lys Thr Asp Asp Tyr Glu Ala225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu245 250 255

Ser Leu Gly Lys Asp Arg Lys Trp Ser Cys His Pro Met Glu His Glu260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu275 280 285

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Phe Val Ser Tyr Gly Ile Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Asn Lys Asp305 310 315 320

Asn Tyr Glu Ile Ala Arg Glu Ala Ile Lys Asn Thr Arg Glu Tyr Phe325 330 335

Asn Ser Leu Gly Ile Pro Ser Lys Leu Arg Glu Val Gly Ile Gly Lys340 345 350

Asp Lys Leu Glu Leu Met Ala Lys Gln Ala Val Arg Asn Ser Gly Gly355 360 365

Thr Ile Gly Ser Leu Arg Pro Ile Asn Ala Glu Asp Val Leu Glu Ile370 375 380

Phe Lys Lys Ser Tyr385<210> 17

<211> 780

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 17

atgaatcatt ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctat gcgaaaccct gcgggcgttt 60tccgcgcagc atcccgagag cgtgctctat cagacatcgc tcatgagcgc cctgctgagc 120ggggtttacg aaggcagcac caccatcgcg gacctgctga aacacggcga tttcggcctc 180ggcaccttta atgagctgga cggggagctg atcgccttca gcagtcaggt ctatcagctg 240cgcgccgacg gcagcgcgcg caaagcccag ccggagcaga aaacgccgtt cgcggtgatg 300acctggttcc agccgcagta ccggaaaacc tttgaccatc cggtgagccg ccagcagctg 360cacgaggtga tcgaccagca aatcccctct gacaacctgt tctgcgccct gcgcatcgac 420ggccatttcc gccatgccca tacccgcacc gtgccgcgcc agacgccgcc gtaccgggcg 480atgaccgacg tcctcgacga tcagccggtg ttccgcttta accagcgcga aggggtgctg 540gtcggcttcc ggaccccgca gcatatgcag gggatcaacg tcgccgggta tcacgagcac 600tttattaccg atgaccgcaa aggcggcggt cacctgctgg attaccagct cgaccatggg 660gtgctgacct tcggcgaaat tcacaagctg atgatcgacc tgcccgccga cagcgcgttc 720ctgcaggcta atctgcatcc cgataatctc gatgccgcca tccgttccgt agaaagttaa 780

<210> 18

<211> 259

<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 18

Met Asn His Ser Ala Glu Cys Thr Cys Glu Glu Ser Leu Cys Glu Thr1 5 10 15

Leu Arg Ala Phe Ser Ala Gln His Pro Glu Ser Val Leu Tyr Gln Thr20 25 30

Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ser Gly Val Tyr Glu Gly Ser Thr Thr35 40 45

Ile Ala Asp Leu Leu Lys His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn50 55 60

Glu Leu Asp Gly Glu Leu Ile Ala Phe Ser Ser Gln Val Tyr Gln Leu65 70 75 80

Arg Ala Asp Gly Ser Ala Arg Lys Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Pro85 90 95

Phe Ala Val Met Thr Trp Phe Gln Pro Gln Tyr Arg Lys Thr Phe Asp100 105 110His Pro Val Ser Arg Gln Gln Leu His Glu Val Ile Asp Gln Gln Ile115 120 125

Pro Ser Asp Asn Leu Phe Cys Ala Leu Arg Ile Asp Gly His Phe Arg130 135 140

His Ala His Thr Arg Thr Val Pro Arg Gln Thr Pro Pro Tyr Arg Ala145 150 " 155 160

Met Thr Asp Val Leu Asp Asp Gln Pro Val Phe Arg Phe Asn Gln Arg165 170 175

Glu Gly Val Leu Val Gly Phe Arg Thr Pro Gln His Met Gln Gly Ile180 185 190

Asn Val Ala Gly Tyr His Glu His Phe Ile Thr Asp Asp Arg Lys Gly195 200 205

Gly Gly His Leu Leu Asp Tyr Gln Leu Asp His Gly Val Leu Thr Phe210 215 220

Gly Glu Ile His Lys Leu Met Ile Asp Leu Pro Ala Asp Ser Ala Phe225 230 235 240

Leu Gln Ala Asn Leu His Pro Asp Asn Leu Asp Ala Ala Ile Arg Ser245 250 255

Val Glu Ser

60120180240300360420480540600660

<210> 19<211> 1680<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 19

atggacaaac agtatccggt acgccagtggctggaagctc agggagtacg ccaggtgttcttcgactcac tgctggattc ctcgattcgcgcgtttatgg ccgccgccgt cggacgcatttccggtccgg gctgttccaa cctgatcaccccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaaagtatggata cggtggcgat gttcagcccgccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaacggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggatctgccggcca gcggggcccc gcagatgggcgcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg

gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcagggcatccccg gcgccaaaat tgacaaggtcattattccgg tacgccacga agccaacgccaccggcaaag cgggcgtggc gctggtcaccggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgaccgcgccgata aagcgaagca ggtccaccaggtcaccaaat acgccgtcga ggtgacggcggccttccgcg ccgccgagca gggccggccggtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtggccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtgatcttcctgc tcggcctgat ggccagccagccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720

acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780

gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840

atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900

gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960

gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020

ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080

cgccgcggcg cgcagctgaa ccagtttgcc ctgcatccgc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140

caggacatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200

attgcccgct acctgtacag cttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260

accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgaaaa 1320

gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380

gtccgcctga aagccaacgt actgcacctg atctgggtcg ataacggcta caacatggtg 1440

gccattcagg aagagaaaaa ataccagcgc ctgtccggcg tcgagttcgg gccgatggat 1500

tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcg aaagggtttg ccgtggaaag cgccgaggcg 1560

ctggagccga ccctgcacgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtggt ggccattccg 1620

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<210> 20<211> 559<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 20

Met Asp Lys Gln Tyr Pro Val Arg Gln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu1 5 10 15

Val Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile20 25 30

Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser35 40 45

Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala50 55 60

Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr65 70 75 80

Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn85 90 95Ser Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala100 105 110

Asp Lys Ala Lys Gln Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe115 120 125

Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Val Glu Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu130 135 140

Ala Glu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala Glu Gln Gly Arg Pro145 150 155 160

Gly Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Val Val Asp Gly Pro Val165 170 175

Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Gly Ala Pro Gln Met Gly Ala Ala180 185 190

Pro Asp Asp Ala Ile Asp Gln Val Ala Lys Leu Ile Ala Gln Ala Lys195 200 205

Asn Pro Ile Phe Leu Leu Gly Leu Met Ala Ser Gln Pro Glu Asn Ser210 215 220

Lys Ala Leu Arg Arg Leu Leu Glu Thr Ser His Ile Pro Val Thr Ser225 230 235 240

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Ala Gly Arg Val Gly Leu Phe Asn Asn Gln Ala Gly Asp Arg Leu Leu260 265 270

Gln Leu Ala Asp Leu Val Ile Cys Ile Gly Tyr Ser Pro Val Glu Tyr275 280 285

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Val Leu Pro Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Tyr Thr Pro Asp Val Glu Leu305 310 315 320

Val Gly Asp Ile Ala Gly Thr Leu Asn Lys Leu Ala Gln Asn Ile Asp325 330 335

His Arg Leu Val Leu Ser Pro Gln Ala Ala Glu Ile Leu Arg Asp Arg340 345 350

Gln His Gln Arg Glu Leu Leu Asp Arg Arg Gly Ala Gln Leu Asn Gln355 360 365

Phe Ala Leu His Pro Leu Arg Ile Val Arg Ala Met Gln Asp Ile Val370 375 380

Asn Ser Asp Val Thr Leu Thr Val Asp Met Gly Ser Phe His Ile Trp385 390 395 400

Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Ser Phe Arg Ala Arg Gln Val Met Ile Ser405 410 415Asn Gly Gln Gln Thr Met Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Gly Ala420 425 430

Trp Leu Val Asn Pro Glu Arg Lys Val Val Ser Val Ser Gly Asp Gly435 440 445

Gly Phe Leu Gln Ser Ser Met Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys450 455 460

Ala Asn Val Leu His Leu Ile Trp Val Asp Asn Gly Tyr Asn Met Val465 470 475 480

Ala Ile Gln Glu Glu Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Phe485 490 495

Gly Pro Met Asp Phe Lys Ala Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly500 505 510

Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu His Ala Ala515 520 525

Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg530 535 540

Asp Asn Pro Leu Leu Met Gly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu545 550 555

<210> 21

<211> 771

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 21

atgaaaaaag tcgcacttgt taccggcgcc ggccagggga ttggtaaagc tatcgccctt 60

cgtctggtga aggatggatt tgccgtggcc attgccgatt ataacgacgc caccgccaaa 120

gcggtcgcct cggaaatcaa ccaggccggc ggacacgccg tggcggtgaa agtggatgtc 180

tccgaccgcg atcaggtatt tgccgccgtt gaacaggcgc gcaaaacgct gggcggcttc 240

gacgtcatcg tcaataacgc cggtgtggca ccgtctacgc cgatcgagtc cattaccccg 300

gagattgtcg acaaagtcta caacatcaac gtcaaagggg tgatctgggg tattcaggcg 360

gcggtcgagg cctttaagaa agaggggcac ggcgggaaaa tcatcaacgc ctgttcccag 420

gccggccacg tcggcaaccc ggagctggcg gtgtatagct ccagtaaatt cgcggtacgc 480

ggcttaaccc agaccgccgc tcgcgacctc gcgccgctgg gcatcacggt caacggctac 540

tgcccgggga ttgtcaaaac gccaatgtgg gccgaaattg accgccaggt gtccgaagcc 600

gccggtaaac cgctgggcta cggtaccgcc gagttcgcca aacgcatcac tctcggtcgt 660

ctgtccgagc cggaagatgt cgccgcctgc gtctcctatc ttgccagccc ggattctgat 720

tacatgaccg gtcagtcgtt gctgatcgac ggcgggatgg tatttaacta a 771<210> 22<211> 256<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae<400> 22

Met Lys Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Gln Gly Ile Gly Lys15 10 15

Ala Ile Ala Leu Arg Leu Val Lys Asp Gly Phe Ala Val Ala Ile Ala20 25 30

Asp Tyr Asn Asp Ala Thr Ala Lys Ala Val Ala Ser Glu Ile Asn Gln35 40 45

Ala Gly Gly His Ala Val Ala Val Lys Val Asp Val Ser Asp Arg Asp50 55 60

Gln Val Phe Ala Ala Val Glu Gln Ala Arg Lys Thr Leu Gly Gly Phe65 70 75 80

Asp Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Val Ala Pro Ser Thr Pro Ile Glu85 90 95

Ser Ile Thr Pro Glu Ile Val Asp Lys Val Tyr Asn Ile Asn Val Lys100 105 110

Gly Val Ile Trp Gly Ile Gln Ala Ala Val Glu Ala Phe Lys Lys Glu115 120 125

Gly His Gly Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Gln Ala Gly His Val130 135 140

Gly Asn Pro Glu Leu Ala Val Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Ala Val Arg145 150 155 160

Gly Leu Thr Gln Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ala Pro Leu Gly Ile Thr165 170 175

Val Asn Gly Tyr Cys Pro Gly Ile Val Lys Thr Pro Met Trp Ala Glu180 185 190

Ile Asp Arg Gln Val Ser Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Gly Tyr Gly195 200 205

Thr Ala Glu Phe Ala Lys Arg Ile Thr Leu Gly Arg Leu Ser Glu Pro210 215 220

Glu Asp Val Ala Ala Cys Val Ser Tyr Leu Ala Ser Pro Asp Ser Asp225 230 235 240

Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Leu Ile Asp Gly Gly Met Val Phe Asn245 250 255

<210> 23<211> 1665<212> DNA<213> Klebsiella oxytoca<400> 23

atgagatcga aaagatttga agcactggcg aaacgccctg tgaatcagga cggcttcgtt 60aaggagtgga tcgaagaagg ctttatcgcg atggaaagcc cgaacgaccc aaaaccgtcg 120attaaaatcg ttaacggcgc ggtgaccgag ctggacggga aaccggtaag cgattttgac 180ctgatcgacc actttatcgc ccgctacggt atcaacctga accgcgccga agaagtgatg 240gcgatggatt cggtcaagct ggccaacatg ctgtgcgatc cgaacgttaa acgcagcgaa 300atcgtcccgc tgaccaccgc gatgacgccg gcgaaaattg tcgaagtggt ttcgcatatg 360aacgtcgtcg agatgatgat ggcgatgcag aaaatgcgcg cccgccgcac cccgtcccag 420caggcgcacg tcaccaacgt caaagataac ccggtacaga ttgccgccga cgccgccgaa 480ggggcatggc gcggatttga cgaacaggaa accaccgttg cggtagcgcg ctatgcgccg 540ttcaacgcca tcgcgctgct ggtgggctcg caggtaggcc gtccgggcgt gctgacgcag 600tgctcgctgg aagaagccac cgagctgaag ctcggcatgc tgggccacac ctgctacgcc 660gaaaccatct ccgtctacgg caccgagccg gtctttaccg acggcgacga cacgccgtgg 720tcgaagggct tcctcgcctc gtcctacgcc tctcgcgggc tgaaaatgcg ctttacctcc 780ggctccggct cggaagtgca gatgggctac gccgaaggca aatccatgct ttatctggaa 840gcgcgctgca tctacatcac caaagccgcg ggcgtacagg gtctgcaaaa cggttccgta 900agctgcatcg gcgtgccgtc tgcggtgcct tccggcattc gcgcggtgct ggcggaaaac 960ctgatctgtt cgtcgctgga tctggagtgc gcctccagca acgaccagac cttcacccac 1020tccgatatgc gtcgtaccgc gcgcctgctg atgcagttcc tgccgggcac cgactttatc 1080tcctccggtt attccgcggt gccgaactac gacaacatgt tcgccggctc caacgaagat 1140gccgaagact ttgacgacta caacgtcatc cagcgcgacc tgaaggtgga cggcggtttg 1200cgtccggttc gcgaagagga cgtcatcgcc atccgtaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260gccgtgtttg ccggaatggg gctgccgccg attaccgatg aagaagttga agccgcgacc 1320tacgcccacg gttcgaaaga tatgccggag cgcaacatcg tcgaagacat caagttcgcc 1380caggaaatca tcaataaaaa ccgcaacggt ctggaagtgg tgaaagcgct ggcgcagggc 1440ggattcaccg acgtggccca ggacatgctc aacatccaga aagctaagct gaccggggac 1500tacctgcata cctccgcgat tatcgtcggc gacgggcagg tgctgtcagc cgtcaacgac 1560gtcaacgact atgccggtcc ggcaacgggc tatcgcctgc agggcgaacg ctgggaagag 1620attaaaaaca tccctggcgc tcttgatccc aacgagattg attaa 1665<210> 24<211> 554<212> PRT

<213> Klebsiella oxytoca<400> 24

Met Arg Ser Lys Arg Phe Glu Ala Leu Ala Lys Arg Pro Val Asn Gln15 10 15

Asp Gly Phe Val Lys Glu Trp Ile Glu Glu Gly Phe Ile Ala Met Glu20 25 30

Ser Pro Asn Asp Pro Lys Pro Ser Ile Lys Ile Val Asn Gly Ala Val35 40 45

Thr Glu Leu Asp Gly Lys Pro Val Ser Asp Phe Asp Leu Ile Asp His50 55 60

Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Ile Asn Leu Asn Arg Ala Glu Glu Val Met65 70 75 80

Ala Met Asp Ser Val Lys Leu Ala Asn Met Leu Cys Asp Pro Asn Val85 90 95

Lys Arg Ser Glu Ile Val Pro Leu Thr Thr Ala Met Thr Pro Ala Lys100 105 110

Ile Val Glu Val Val Ser His Met Asn Val Val Glu Met Met Met Ala115 120 125

Met Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Gln Gln Ala His Val130 135 140

Thr Asn Val Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala Glu145 150 155 160

Gly Ala Trp Arg Gly Phe Asp Glu Gln Glu Thr Thr Val Ala Val Ala165 170 175

Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Ile Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln Val180 185 190

Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Leu Glu Glu Ala Thr Glu195 200 205

Leu Lys Leu Gly Met Leu Gly His Thr Cys Tyr Ala Glu Thr Ile Ser210 215 220

Val Tyr Gly Thr Glu Pro Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp225 230 235 240

Ser Lys Gly Phe Leu Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met245 250 255

Arg Phe Thr Ser Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Met Gly Tyr Ala Glu260 265 270Gly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Ile Thr Lys275 280 285

Ala Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ile Gly290 295 300

Val Pro Ser Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu Asn305 310 315 320

Leu Ile Cys Ser Ser Leu Asp Leu Glu Cys Ala Ser Ser Asn Asp Gln325 330 335

Thr Phe Thr His Ser Asp Met Arg Arg Thr Ala Arg Leu Leu Met Gln340 345 350

Phe Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Ala Val Pro355 360 365

Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Glu Asp Ala Glu Asp Phe370 375 380

Asp Asp Tyr Asn Val Ile Gln Arg Asp Leu Lys Val Asp Gly Gly Leu385 390 395 400

Arg Pro Val Arg Glu Glu Asp Val Ile Ala Ile Arg Asn Lys Ala Ala405 410 415

Arg Ala Leu Gln Ala Val Phe Ala Gly Met Gly Leu Pro Pro Ile Thr420 425 430

Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Lys Asp Met435 440 445

Pro Glu Arg Asn Ile Val Glu Asp Ile Lys Phe Ala Gln Glu Ile Ile450 455 460

Asn Lys Asn Arg Asn Gly Leu Glu Val Val Lys Ala Leu Ala Gln Gly465 470 475 480

Gly Phe Thr Asp Val Ala Gln Asp Met Leu Asn Ile Gln Lys Ala Lys485 490 495

Leu Thr Gly Asp Tyr Leu His Thr Ser Ala Ile Ile Val Gly Asp Gly500 505 510

Gln Val Leu Ser Ala Val Asn Asp Val Asn Asp Tyr Ala Gly Pro Ala515 520 525

Thr Gly Tyr Arg Leu Gln Gly Glu Arg Trp Glu Glu Ile Lys Asn Ile530 535 540

Pro Gly Ala Leu Asp Pro Asn Glu Ile Asp545 550

<210> 25

<211> 675

<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca<400> 25

atggaaatta atgaaaaatt gctgcgccag ataattgaag acgtgctcag cgagatgaag 60

ggcagcgata aaccggtctc gtttaatgcg ccggcggcct ccgcggcgcc ccaggccacg 120

ccgcccgccg gcgacggctt cctgacggaa gtgggcgaag cgcgtcaggg aacccagcag 180

gacgaagtga ttatcgccgt cggcccggct ttcggcctgg cgcagaccgt caatatcgtc 240

ggcatcccgc ataagagcat tttgcgcgaa gtcattgccg gtattgaaga agaaggcatt 300

aaggcgcgcg tgattcgctg ctttaaatcc tccgacgtgg ccttcgtcgc cgttgaaggt 360

aatcgcctga gcggctccgg catctctatc ggcatccagt cgaaaggcac cacggtgatc 420

caccagcagg ggctgccgcc gctctctaac ctggagctgt tcccgcaggc gccgctgctg 480

accctggaaa cctatcgcca gatcggcaaa aacgccgccc gctatgcgaa acgcgaatcg 540

ccgcagccgg tcccgacgct gaatgaccag atggcgcggc cgaagtacca ggcgaaatcg 600

gccattttgc acattaaaga gaccaagtac gtggtgacgg gcaaaaaccc gcaggaactg 660

cgcgtggcgc tttga 675

<210> 26<211> 224<212> PRT

<213> Klebsiella oxytoca<400> 26

Met Glu Ile Asn Glu Lys Leu Leu Arg Gln Ile Ile Glu Asp Val Leu1 5 10 15

Ser Glu Met Lys Gly Ser Asp Lys Pro Val Ser Phe Asn Ala Pro Ala20 25 30

Ala Ser Ala Ala Pro Gln Ala Thr Pro Pro Ala Gly Asp Gly Phe Leu35 40 45

Thr Glu Val Gly Glu Ala Arg Gln Gly Thr Gln Gln Asp Glu Val Ile50 55 60

Ile Ala Val Gly Pro Ala Phe Gly Leu Ala Gln Thr Val Asn Ile Val65 70 75 80

Gly Ile Pro His Lys Ser Ile Leu Arg Glu Val Ile Ala Gly Ile Glu85 90 95

Glu Glu Gly Ile Lys Ala Arg Val Ile Arg Cys Phe Lys Ser Ser Asp100 105 110

Val Ala Phe Val Ala Val Glu Gly Asn Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ile115 120 125

Ser Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Gln Gly130 135 140Leu Pro Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Pro Gln Ala Pro Leu Leu145 150 155 160

Thr Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala165 170 175

Lys Arg Glu Ser Pro Gln Pro Val Pro Thr Leu Asn Asp Gln Met Ala180 185 190

Arg Pro Lys Tyr Gln Ala Lys Ser Ala Ile Leu His Ile Lys Glu Thr195 200 205

Lys Tyr Val Val Thr Gly Lys Asn Pro Gln Glu Leu Arg Val Ala Leu210 215 220

<210> 27

<211> 522

<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca

<400> 27

atgaataccg acgcaattga atcgatggta cgcgacgtat tgagccgcat gaacagcctgcagggcgagg cgcctgcggc ggctccggcg gctggcggcg cgtcccgtag cgccagggtcagcgactacc cgctggcgaa caagcacccg gaatgggtga aaaccgccac caataaaacgctggacgact ttacgctgga aaacgtgctg agcaataaag tcaccgccca ggatatgcgtattaccccgg aaaccctgcg cttacaggct tctattgcca aagacgcggg ccgcgaccggctggcgatga acttcgagcg cgccgccgag ctgaccgcgg taccggacga tcgcattcttgaaatctaca acgccctccg cccctatcgc tcgacgaaag aggagctgct ggcgatcgccgacgatctcg aaagccgcta tcaggcgaag atttgcgccg ctttcgttcg cgaagcggccacgctgtacg tcgagcgtaa aaaactcaaa ggcgacgatt aa

<210> 28<211> 173<212> PRT

<213> Klebsiella oxytoca<400> 28

Met Asn Thr Asp Ala Ile Glu Ser Met Val Arg Asp Val Leu Ser Arg15 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly20 25 30

Gly Ala Ser Arg Ser Ala Arg Val Ser Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Lys35 40 45

His Pro Glu Trp Val Lys Thr Ala Thr Asn Lys Thr Leu Asp Asp Phe50 55 60

60120180240300360420480522Thr Leu Glu Asn Val Leu Ser Asn Lys Val Thr Ala Gln Asp Met Arg65 70 75 80

Ile Thr Pro Glu Thr Leu Arg Leu Gln Ala Ser Ile Ala Lys Asp Ala85 90 95

Gly Arg Asp Arg Leu Ala Met Asn Phe Glu Arg Ala Ala Glu Leu Thr100 105 110

Ala Val Pro Asp Asp Arg Ile Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro115 120 125

Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Asp Leu Glu130 135 140

Ser Arg Tyr Gln Ala Lys Ile Cys Ala Ala Phe Val Arg Glu Ala Ala

Thr Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Leu Lys Gly Asp Asp165 170

<210> 29<211> 1041<212> DNA

<213> Rhodococcus ruber<400> 29

atgaaagccc tccagtacac cgagatcggc tccgagccgg tcgtcgtcga cgtccccacc 60

ccggcgcccg ggccgggtga gatcctgctg aaggtcaccg cggccggctt gtgccactcg 120

gacatcttcg tgatggacat gccggcagag cagtacatct acggtcttcc cctcaccctc 180

ggccacgagg gcgtcggcac cgtcgccgaa ctcggcgccg gcgtcaccgg attcgagacg 240

ggggacgccg tcgccgtgta cgggccgtgg gggtgcggtg cgtgccacgc gtgcgcgcgc 300

ggccgggaga actactgcac ccgcgccgcc gagctgggca tcaccccgcc cggtctcggc 360

tcgcccgggt cgatggccga gtacatgatc gtcgactcgg cgcgccacct cgtcccgatc 420

ggggacctcg accccgtcgc ggcggttccg ctcaccgacg cgggcctgac gccgtaccac 480

gcgatctcgc gggtcctgcc cctgctggga cccggctcga ccgcggtcgt catcggggtc 540

ggcggactcg ggcacgtcgg catccagatc ctgcgcgccg tcagcgcggc ccgcgtgatc 600

gccgtcgatc tcgacgacga ccgactcgcg ctcgcccgcg aggtcggcgc cgacgcggcg 660

gtgaagtcgg gcgccggggc ggcggacgcg atccgggagc tgaccggcgg tgagggcgcg 720

acggcggtgt tcgacttcgt cggcgcccag tcgacgatcg acacggcgca gcaggtggtc 780

gcgatcgacg ggcacatctc ggtggtcggc atccatgccg gcgcccacgc caaggtcggc 840

ttcttcatga tcccgttcgg cgcgtccgtc gtgacgccgt actggggcac gcggtccgag 900

ctgatggacg tcgtggacct ggcccgtgcc ggccggctcg acatccacac cgagacgttc 960accctcgacg agggacccac ggcctaccgg cggctacgcg agggcagcat ccgcggccgc 1020

ggggtggtcg tcccgggctg a 1041

<210> 30<211> 346<212> PRT

<213> Rhodococcus ruber<400> 30

Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Glu Ile Gly Ser Glu Pro Val Val Val15 10 15

Asp Val Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Ile Phe Val Met Asp Met Pro35 40 45

Ala Glu Gln Tyr Ile Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly50 55 60

Val Gly Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Gly Val Thr Gly Phe Glu Thr65 70 75 80

Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ala Cys His85 90 95

Ala Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Thr Arg Ala Ala Glu Leu100 105 110

Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ser Pro Gly Ser Met Ala Glu Tyr115 120 125

Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp130 135 140

Pro Val Ala Ala Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His145 150 155 160

Ala Ile Ser Arg Val Leu Pro Leu Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ala Val165 170 175

Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Leu Arg180 185 190

Ala Val Ser Ala Ala Arg Val Ile Ala Val Asp Leu Asp Asp Asp Arg195 200 205

Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Ala Val Lys Ser Gly210 215 220

Ala Gly Ala Ala Asp Ala Ile Arg Glu Leu Thr Gly Gly Glu Gly Ala225 230 235 240

Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gln Ser Thr Ile Asp Thr Ala245 250 255Gln Gln Val Val Ala Ile260

Ala Gly Ala His Ala Lys275

Ser Val Val Thr Pro Tyr290

Val Asp Leu Ala Arg Ala305 310

Thr Leu Asp Glu Gly Pro325

Ile Arg Gly Arg Gly Val340

<210> 31<211> 1476<212> DNA

<213> Escherichia coli<4 00> 31

atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60

cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020

Asp Gly His Ile Ser Val Val Gly Ile His265 270

Val Gly Phe Phe Met Ile Pro Phe Gly Ala280 285

Trp Gly Thr Arg Ser Glu Leu Met Asp Val295 300

Gly Arg Leu Asp Ile His Thr Glu Thr Phe315 320

Thr Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Gly Ser330 335

Val Val Pro Gly345accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080

atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140

atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200

atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260

aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320

ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380

gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440

atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476

<210> 32<211> 491<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 32

Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln15 10 15

Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala20 25 30

Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln35 40 45

Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser50 55 60

Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg65 70 75 80

Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile85 90 95

Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser100 105 110

Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu115 120 125

Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg130 135 140

Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu145 150 155 160

Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala165 170 175

Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys180 185 190Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser195 200 205

Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile210 215 220

Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu225 230 235 240

Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe245 250 255

Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu260 265 270

Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu275 280 285

Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met290 295 300

Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp305 310 315 320

Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys325 330 335

Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln340 345 350

Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly355 360 365

Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu370 375 380

Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr385 390 395 400

Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr405 410 415

Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu420 425 430

Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile435 440 445

Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala450 455 460

Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr465 470 475 480

Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly485 490

<210> 33<211> 1851<212> DNA

<213> Escherichia coli<400> 33

atgcctaagt accgttccgc caccaccact catggtcgta atatggcggg tgctcgtgcg 60

ctgtggcgcg ccaccggaat gaccgacgcc gatttcggta agccgattat cgcggttgtg 120

aactcgttca cccaatttgt accgggtcac gtccatctgc gcgatctcgg taaactggtc 180

gccgaacaaa ttgaagcggc tggcggcgtt gccaaagagt tcaacaccat tgcggtggat 240

gatgggattg ccatgggcca cggggggatg ctttattcac tgccatctcg cgaactgatc 300

gctgattccg ttgagtatat ggtcaacgcc cactgcgccg acgccatggt ctgcatctct 360

aactgcgaca aaatcacccc ggggatgctg atggcttccc tgcgcctgaa tattccggtg 420

atctttgttt ccggcggccc gatggaggcc gggaaaacca aactttccga tcagatcatc 480

aagctcgatc tggttgatgc gatgatccag ggcgcagacc cgaaagtatc tgactcccag 540

agcgatcagg ttgaacgttc cgcgtgtccg acctgcggtt cctgctccgg gatgtttacc 600

gctaactcaa tgaactgcct gaccgaagcg ctgggcctgt cgcagccggg caacggctcg 660

ctgctggcaa cccacgccga ccgtaagcag ctgttcctta atgctggtaa acgcattgtt 720

gaattgacca aacgttatta cgagcaaaac gacgaaagtg cactgccgcg taatatcgcc 780

agtaaggcgg cgtttgaaaa cgccatgacg ctggatatcg cgatgggtgg atcgactaac 840

accgtacttc acctgctggc ggcggcgcag gaagcggaaa tcgacttcac catgagtgat 900

atcgataagc tttcccgcaa ggttccacag ctgtgtaaag ttgcgccgag cacccagaaa 960

taccatatgg aagatgttca ccgtgctggt ggtgttatcg gtattctcgg cgaactggat 1020

cgcgcggggt tactgaaccg tgatgtgaaa aacgtacttg gcctgacgtt gccgcaaacg 1080

ctggaacaat acgacgttat gctgacccag gatgacgcgg taaaaaatat gttccgcgca 1140

ggtcctgcag gcattcgtac cacacaggca ttctcgcaag attgccgttg ggatacgctg 1200

gacgacgatc gcgccaatgg ctgtatccgc tcgctggaac acgcctacag caaagacggc 1260

ggcctggcgg tgctctacgg taactttgcg gaaaacggct gcatcgtgaa aacggcaggc 1320

gtcgatgaca gcatcctcaa attcaccggc ccggcgaaag tgtacgaaag ccaggacgat 1380

gcggtagaag cgattctcgg cggtaaagtt gtcgccggag atgtggtagt aattcgctat 1440

gaaggcccga aaggcggtcc ggggatgcag gaaatgctct acccaaccag cttcctgaaa 1500

tcaatgggtc tcggcaaagc ctgtgcgctg atcaccgacg gtcgtttctc tggtggcacc 1560

tctggtcttt ccatcggcca cgtctcaccg gaagcggcaa gcggcggcag cattggcctg 1620attgaagatg gtgacctgat cgctatcgac atcccgaacc gtggcattca gttacaggta 1680

agcgatgccg aactggcggc gcgtcgtgaa gcgcaggacg ctcgaggtga caaagcctgg 1740

acgccgaaaa atcgtgaacg tcaggtctcc tttgccctgc gtgcttatgc cagcctggca 1800

accagcgccg acaaaggcgc ggtgcgcgat aaatcgaaac tggggggtta a 1851

<210> 34<211> 616<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 34

Met Pro Lys Tyr Arg Ser Ala Thr Thr Thr His Gly Arg Asn Met Ala1 5 10 15

Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Met Thr Asp Ala Asp Phe20 25 30

Gly Lys Pro Ile Ile Ala Val Val Asn Ser Phe Thr Gln Phe Val Pro35 40 45

Gly His Val His Leu Arg Asp Leu Gly Lys Leu Val Ala Glu Gln Ile50 55 60

Glu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp65 70 75 80

Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser85 90 95

Arg Glu Leu Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Cys100 105 110

Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly115 120 125

Met Leu Met Ala Ser Leu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Phe Val Ser130 135 140

Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Thr Lys Leu Ser Asp Gln Ile Ile145 150 155 160

Lys Leu Asp Leu Val Asp Ala Met Ile Gln Gly Ala Asp Pro Lys Val165 170 175

Ser Asp Ser Gln Ser Asp Gln Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys180 185 190

Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr195 200 205

Glu Ala Leu Gly Leu Ser Gln Pro Gly Asn Gly Ser Leu Leu Ala Thr210 215 220

His Ala Asp Arg Lys Gln Leu Phe Leu Asn Ala Gly Lys Arg Ile Val225 230 235 240Glu Leu Thr Lys Arg Tyr Tyr Glu Gln Asn Asp Glu Ser Ala Leu Pro245 250 255

Arg Asn Ile Ala Ser Lys Ala Ala Phe Glu Asn Ala Met Thr Leu Asp260 265 270

Ile Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Val Leu His Leu Leu Ala Ala275 280 285

Ala Gln Glu Ala Glu Ile Asp Phe Thr Met Ser Asp Ile Asp Lys Leu290 295 300

Ser Arg Lys Val Pro Gln Leu Cys Lys Val Ala Pro Ser Thr Gln Lys305 310 315 320

Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Gly Val Ile Gly Ile Leu325 330 335

Gly Glu Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Asn Arg Asp Val Lys Asn Val340 345 350

Leu Gly Leu Thr Leu Pro Gln Thr Leu Glu Gln Tyr Asp Val Met Leu355 360 365

Thr Gln Asp Asp Ala Val Lys Asn Met Phe Arg Ala Gly Pro Ala Gly370 375 380

Ile Arg Thr Thr Gln Ala Phe Ser Gln Asp Cys Arg Trp Asp Thr Leu385 390 395 400

Asp Asp Asp Arg Ala Asn Gly Cys Ile Arg Ser Leu Glu His Ala Tyr405 410 415

Ser Lys Asp Gly Gly Leu Ala Val Leu Tyr Gly Asn Phe Ala Glu Asn420 425 430

Gly Cys Ile Val Lys Thr Ala Gly Val Asp Asp Ser Ile Leu Lys Phe435 440 445

Thr Gly Pro Ala Lys Val Tyr Glu Ser Gln Asp Asp Ala Val Glu Ala450 455 460

Ile Leu Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Asp Val Val Val Ile Arg Tyr465 470 475 480

Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu Tyr Pro Thr485 490 495

Ser Phe Leu Lys Ser Met Gly Leu Gly Lys Ala Cys Ala Leu Ile Thr500 505 510

Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val515 520 525

Ser Pro Glu Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ile Gly Leu Ile Glu Asp Gly530 535 540

Asp Leu Ile Ala Ile Asp Ile Pro Asn Arg Gly Ile Gln Leu Gln Val545 550 555 560Ser Asp Ala Glu Leu Ala Ala Arg Arg Glu Ala Gln Asp Ala Arg Gly565 570 575

Asp Lys Ala Trp Thr Pro Lys Asn Arg Glu Arg Gln Val Ser Phe Ala580 585 590

Leu Arg Ala Tyr Ala Ser Leu Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val595 600 605

Arg Asp Lys Ser Lys Leu Gly Gly610 615

<210> 35

<211> 1662

<212> DNA

<213> Lactococcus lactis

<400> 35 tctagacata tgtatactgt gggggattac ctgctggatc gcctgcacga actggggatt 60gaagaaattt tcggtgtgcc aggcgattat aacctgcagt tcctggacca gattatctcg 120cacaaagata tgaagtgggt cggtaacgcc aacgaactga acgcgagcta tatggcagat 180ggttatgccc gtaccaaaaa agctgctgcg tttctgacga cctttggcgt tggcgaactg 240agcgccgtca acggactggc aggaagctac gccgagaacc tgccagttgt cgaaattgtt 300gggtcgccta cttctaaggt tcagaatgaa ggcaaatttg tgcaccatac tctggctgat 360ggggatttta aacattttat gaaaatgcat gaaccggtta ctgcggcccg cacgctgctg 420acagcagaga atgctacggt tgagatcgac cgcgtcctgt ctgcgctgct gaaagagcgc 480aagccggtat atatcaatct gcctgtcgat gttgccgcag cgaaagccga aaagccgtcg 540ctgccactga aaaaagaaaa cagcacctcc aatacatcgg accaggaaat tctgaataaa 600atccaggaat cactgaagaa tgcgaagaaa ccgatcgtca tcaccggaca tgagatcatc 660tcttttggcc tggaaaaaac ggtcacgcag ttcatttcta agaccaaact gcctatcacc 720accctgaact tcggcaaatc tagcgtcgat gaagcgctgc cgagttttct gggtatctat 780aatggtaccc tgtccgaacc gaacctgaaa gaattcgtcg aaagcgcgga ctttatcctg 840atgctgggcg tgaaactgac ggatagctcc acaggcgcat ttacccacca tctgaacgag 900aataaaatga tttccctgaa tatcgacgaa ggcaaaatct ttaacgagcg catccagaac 960ttcgattttg aatctctgat tagttcgctg ctggatctgt ccgaaattga gtataaaggt 1020aaatatattg ataaaaaaca ggaggatttt gtgccgtcta atgcgctgct gagtcaggat 1080cgtctgtggc aagccgtaga aaacctgaca cagtctaatg aaacgattgt tgcggaacag 1140ggaacttcat ttttcggcgc ctcatccatt tttctgaaat ccaaaagcca tttcattggc 1200caaccgctgt gggggagtat tggttatacc tttccggcgg cgctgggttc acagattgca 1260

gataaggaat cacgccatct gctgtttatt ggtgacggca gcctgcagct gactgtccag 1320

gaactggggc tggcgatccg tgaaaaaatc aatccgattt gctttatcat caataacgac 1380

ggctacaccg tcgaacgcga aattcatgga ccgaatcaaa gttacaatga catcccgatg 1440

tggaactata gcaaactgcc ggaatccttt ggcgcgacag aggatcgcgt ggtgagtaaa 1500

attgtgcgta cggaaaacga atttgtgtcg gttatgaaag aagcgcaggc tgacccgaat 1560

cgcatgtatt ggattgaact gatcctggca aaagaaggcg caccgaaagt tctgaaaaag 1620

atggggaaac tgtttgcgga gcaaaataaa agctaaggat cc 1662

<210> 36<211> 548<212> PRT

<213> Lactococcus Iactis<400> 36

Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly1 5 10 15

Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu20 25 30

Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn35 40 45

Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His100 105 110

His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu115 120 125

Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Val130 135 140

Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val145 150 155 160

Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro165 170 175

Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln180 185 190Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys Pro195 200 205

Ile Val Ile Thr Gly His Glu Ile Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr210 215 220

Val Thr Gln Phe Ile Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn225 230 235 240

Phe Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile245 250 255

Tyr Asn Gly Thr Leu Ser Glu Pro Asn Leu Lys Glu Phe Val Glu Ser260 265 270

Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr275 280 285

Gly Ala Phe Thr His His Leu Asn Glu Asn Lys Met Ile Ser Leu Asn290 295 300

Ile Asp Glu Gly Lys Ile Phe Asn Glu Arg Ile Gln Asn Phe Asp Phe305 310 315 320

Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Leu Asp Leu Ser Glu Ile Glu Tyr Lys325 330 335

Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Lys Gln Glu Asp Phe Val Pro Ser Asn Ala340 345 350

Leu Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Thr Gln355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala370 375 380

Ser Ser Ile Phe Leu Lys Ser Lys Ser His Phe Ile Gly Gln Pro Leu385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu420 425 430

Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ala Ile Arg Glu Lys Ile Asn435 440 445

Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu450 455 460

Ile His Gly Pro Asn Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr465 470 475 480

Ser Lys Leu Pro Glu Ser Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser485 490 495

Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala500 505 510Gln Ala Asp Pro Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Ile Leu Ala Lys515 520 525

Glu Gly Ala Pro Lys Val Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu530 535 540

Gln Asn Lys Ser545

<210> 37<211> 1164<212> DNA

<213> Escherichia coli

<4 00> 37 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164<210> 38 <211> 387 <212> PRT41<213> Escherichia coli<400> 38

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys15 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val20 25 30

Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp35 40 45

Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser85 90 95

Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys115 120 125

Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser130 135 140

Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys145 150 155 160

Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp165 170 175

Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val180 185 190

Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val195 200 205

Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu210 215 220

Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val225 230 235 240

Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile245 250 255

Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu260 265 270

Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val275 280 285Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp305 310 315 320

Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln325 330 335

Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser340 345 350

Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu355 360 365

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu370 375 380

Ala Ala Arg385

<210> 39 \

<211> 15<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer<400> 39

acgggcggtg tgtac 15

<210> 40

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Primer

<400> 40

gccagcagcc gcggta 16

<210> 41<211> 819<212> DNA

<213> Enterococcus faecium<400> 41

ccgcggcgtg ctgaaccgcg attactagcg attccggctt catgcaggcg agttgcagcc 60

tgcaatccga actgagagaa gctttaagag attagcttag cctcgcgact tcgcaactcg 120ttgtacttcc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg 180tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcttgc tagagtgccc aactgaatga 240tggcaactaa caataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg 300agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tttgcccccg aaggggaagc tctatctcta 360gagtggtcaa aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac 420atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta 480ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcactg aagggcggaa accctccaac 540acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca 600cgctttcgag cctcagcgtc agttacagac cagagagccg ccttcgccac tggtgttcct 660ccatatatct acgcatttca ccgctacaca tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa 720gtctcccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag 780aaaccgcctg cgctcgcttt acgccctaat aaatccgga 819<210> 42 <211> 1458 <212> DNA <213> Enterococcus gallinarum <400> 42 acgctggcgg cgtgcctaac atgcaagtcg aacgcttttt ctttcaccgg agcttgctcc 60accgaaagaa aaagagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccatcagaag 120gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgtataacac tattttccgc atggaagaaa 180gttgaaaggc gcttttgcgt cactgatgga tggacccgcg gtgcattagc tagttggtga 240ggtaacggct caccaaggcc acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt cggcaatgga 360cgaaagtctg accgagcaac gccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg 420ttgttagaga agaacaagga tgagagtaga acgttcatcc cttgacggta tctaaccaga 480aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac accagtggcg aaggcggctc 720tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc 840tgcagcaaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc actctagaga tagagcttcc ccttcggggg 1020caaagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080ccgcaacgag cgcaaccctt attgttagtt gccatcattt agttgggcac tctagcgaga 1140ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200ctgggctaca cacgtgctac aatgggaagt acaacgagtt gcgaagtcgc gaggctaagc 1260taatctctta aagcttctct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagccg 1320gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttggag 1440ccagccgcct aaggtgga 1458<210> 43 <211> 818 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 43 ggcggagtgt cagtcggtgt gtaccggctg cgtgtacggg aggtgtgtac tgccgtcgta 60aatgagagaa gctttaagag atttgcatga cctcgcggtc tagcgactcg ttgtacttcc 120cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 180cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctcgc tagagtgccc aactaaatga tggcaactaa 240caataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 300aaccatgcac cacctgtcac tttgtccccg aagggaaagc tctatctcta gagtggtcaa 360aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 420gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc 480ggagtgctta atgcgtttgc tgcagcactg aagggcggaa accctccaac acttagcact 540catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgag 600cctcagcgtc agttacagac cagagagccg ccttcgccac tggtgttcct ccatatatct 660acgcatttca ccgctacaca tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gtctcccagt 720ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg 780cgctcgcttt acgcccaaaa atccgacaac gctgtacg 818<210> 44 <211> 794 <212> DNA <213> Enterococcus faeeium <400> 44 ggcatgctga tccccgatta ctagcaattc cggcttcatg caggcgagtt ggaacctgca 60atccgaactg agagaagctt taagagatta gcttagcctc gcgacttcgc gactcgttgt 120acttcccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat 180ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tcttgctaga gtgcccaact gaatgatggc 240aactaacaat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 300gacgacaacc atgcaccacc tgtcactttg cccccgaagg ggaagctcta tctctagagt 360ggtcaaagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc 420tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc 480ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt 540agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct 600ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga gagccgcctt cgccactggt gttcctccat 660atatctacgc atttcaccgc tacacatgga attccactct cctcttctgc actcaagtct 720cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac 780cgcctgcgct cgct 794

Claims (57)

1. MÉTODO DE ISOLAMENTO, de um microorganismotolerante a butanol que compreende:a) fornecimento de uma amostra microbiana que compreendeum consórcio microbiano;b) contato do consórcio microbiano com um meio de cultivoque compreende uma fonte de carbono fermentável até o crescimento dosmembros do consórcio microbiano;c) contato do consórcio microbiano em crescimento da etapa(b) com butanol; ed) isolamento dos membros viáveis da etapa (c) em que ummicroorganismo tolerante a butanol é isolado.

2. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1,em que oconsórcio em crescimento da etapa (b) é cultivado em fase de registro.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que, apósa etapa (c), o consórcio é colocado em placas sobre um meio sólido.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, em que o meiosólido contém butanol.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,em que ocontato da etapa (c) é repetido uma ou mais vezes.

6. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1,em que aconcentração de butanol da etapa de contato (c) é de cerca de 0,8% p/v acerca de 3,0% p/v.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,em que oisolamento da etapa (d) compreende as etapas de:i) cultivo dos membros viáveis da etapa (d) em um meiolíquido na ausência de butanol; por meio do quê, os membros viáveis semultiplicam;ii) cultivo das células da etapa (i) na presença de butanol; eiii) coleta das células da etapa (ii) que crescem na presençade butanol, em que um microorganismo tolerante a butanol é isolado.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a fontede carbono fermentável é selecionada a partir do grupo que consiste desacarose, frutose, glicose, ácido butírico, ácido valérico e suas misturas.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,em que obutanol é predominantemente 1-butanol.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,em que obutanol é predominantemente 2-butanol.

11. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1,em que obutanol é predominantemente isobutanol.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,em que oconsórcio é cultivado sob condições anaeróbicas.

13. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1,em que oconsórcio é cultivado sob condições microaerofílicas.

14. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1,em que oconsórcio é cultivado sob condições aeróbicas.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 2,5% p/v de 1-butanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 3,9% p/v de 2-butanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 2,7% p/v deisobutanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 5,0% p/v de 2-butanona quando maturados em um meio sólido a 37 0C.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 9,0% p/v de etanolquando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aamostra microbiana é uma amostra do ambiente.

21. MÉTODO, de acordo coma reivindicação 1, em que omicroorganismo tolerante a butanol é um Enterococcus sp.

22. MICROORGANISMO, tolerante a butanol isolado por meiodo processo de acordo com a reivindicação 1.

23. MICROORGANISMO, tolerante a butanol de acordo com areivindicação 22, em que o microorganismo é uma bactéria do gêneroEnterococcus.

24. MÉTODO DE ISOLAMENTO, de um Enterococcustolerante a butanol que compreende:a) fornecimento de uma amostra microbiana que compreendeum consórcio microbiano;b) enriquecimento do consórcio microbiano para a presençade Enterococcus em um meio de cultivo que compreende:i) uma fonte de carbono fermentável; eii) um inibidor de crescimento de concorrentes;para gerar um cultivo enriquecido de Enterococcus em que osmembros desse cultivo enriquecido estão crescendo;c) contato do cultivo enriquecido de Enterococcus emcrescimento da etapa (b) com butanol; ed) isolamento dos membros viáveis da etapa (c) em que umEnterococcus tolerante a butanol é isolado.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que oEnterococcus da etapa (c) em crescimento é cultivado em uma fase de registro.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que aamostra microbiana é uma amostra do ambiente.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que, apósa etapa (c), os membros do consórcio são colocados em placas sobre um meiosólido.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, em que omeio sólido contém butanol.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que oinibidor de crescimento de concorrente é selecionado a partir do grupo queconsiste de bílis, azida e suas misturas.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que ocontato da etapa (c) é repetido uma ou mais vezes.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que ocontato da etapa (c) é realizado com o butanol em uma concentração de cercade 0,8% p/v a cerca de 3,0% p/v.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que oisolamento da etapa (d) compreende as etapas de:i) cultivo dos membros viáveis da etapa (d) em um meiolíquido na ausência de butanol, por meio do quê os membros viáveis semultiplicam;ii) cultivo das células da etapa (i) na presença de butanol; eiii) coleta das células da etapa (ii) que crescem na presençade butanol, em que um microorganismo tolerante a butanol é isolado.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que afonte de carbono fermentável é selecionada a partir do grupo que consiste desacarose, frutose, glicose, ácido butírico, ácido valérico e uma mistura destes.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que obutanol é predominantemente 1-butanol.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que obutanol é predominantemente 2-butanol.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que obutanol é predominantemente isobutanol.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 2,5% p/v de 1-butanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 3,9% p/v de 2-butanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 2,7% p/v deisobutanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 5,0% p/v de 2-butanona quando maturados sobre um meio sólido a 37 0C.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que osmembros viáveis da etapa (d) são tolerantes a pelo menos 9,0% p/v de 2-etanol quando cultivados sobre um meio sólido a 37 0C.

42. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, isolado pormeio do processo de acordo com a reivindicação 24.

43. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, de acordocom a reivindicação 42, que é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanolquando cultivado sobre um meio sólido.

44. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, de acordocom a reivindicação 42, em que o Enterococcus possui as características aseguir:i) é um anaeróbio facultativo; eii) é Gram-positivo; eiii) é imóvel; eiv) possui morfologia celular ovóide ou esférica; ev) possui capacidade de iniciar crescimento em caldo decloreto de sódio a 6,5% e em um caldo com pH 9,6; evi) compreende uma seqüência de gene 16S rRNAselecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 41, SEQ ID N0 42,SEQ ID N0 43 e SEQ ID N0 44.

45. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, que possuias características a seguir:i) é um anaeróbio facultativo; eii) é Gram-positivo; eiii) é imóvel; eiv) possui morfologia celular ovóide ou esférica; ev) possui capacidade de iniciar o crescimento em caldo decloreto de sódio a 6,5% e em um caldo com pH 9,6; evi) é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanol quandocultivado sobre um meio sólido.

46. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, de acordocom a reivindicação 45, que compreende uma seqüência de gene 16S rRNAselecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 41, SEQ ID N0 42,SEQ ID N0 43 e SEQ ID N0 44.

47. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL,selecionado a partir do grupo que consiste de ATCC_PTA-7478 (Enterococcusfaecium PN0110), ATCC PTA-7479 (Enterococcus gallinarium PN0048), ATCCPTA-7477 (Enteroeoeeus faeealis PN0197-10) e ATCC PTA-7480(,Enterococcus faecium PN0133).

48. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE BUTANOL, quecompreende:a) fornecimento de um Enterococcus que compreendeconstruções genéticas que codificam um processo biossintético de butanol, quepossui as características a seguir:i) é um anaeróbio facultativo; eii) é Gram-positivo; eiii) é imóvel; eiv) possui morfologia celular ovóide ou esférica; ev) possui capacidade de iniciar o crescimento em caldo decloreto de sódio a 6,5% e em um caldo sob pH 9,6; evi) é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanol quandocultivado sobre um meio sólido; eb) cultivo do Enteroeoceus da etapa (a) sob as condições pormeio das quais é produzido butanol.

49. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE BUTANOL, quecompreende:a) fornecimento de um Enteroeoceus isolado por meio doprocesso de acordo com a reivindicação 24, que compreende construçõesgenéticas que codificam um processo biossintético de butanol; eb) cultivo do Enteroeoceus da etapa (a) sob condições pormeio das quais é produzido butanol.

50. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 48ou 49, em que o butanol é predominantemente 1-butanol.

51. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 48ou 49, em que o butanol é predominantemente 2-butanol.

52. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 48ou 49, em que o butanol é predominantemente isobutanol.

53. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 48ou 49, em que o Enterococcus é selecionado a partir de um grupo que consistede ATTCC PTA-7478 (Enterococcus faeeium PN0110), ATCC PTA-7479(Enterocoeeus gallinarium PN0048), ATCCPTA-7477 (Enteroeoceus faeealisPN0197-10) e ATCC PTA-7480 (Enterocoeeus faeeium PN0133).

54. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A BUTANOL, para uso naprodução de butanol.

55. ENTEROCOCCUS TOLERANTE A 2-BUTANONA, parauso na produção de 2-butanona.

56. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA, quecompreende:a) fornecimento de um Enteroeoceus que compreendeconstruções genéticas que codificam um processo biossintético de 2-butanona,que possui as características a seguir:i) é um anaeróbio facultativo; eii) é Gram-positivo; eiii) é imóvel; eiv) possui morfologia celular ovóide ou esférica; ev) possui capacidade de iniciar a maturação em caldo decloreto de sódio a 6,5% e em um caldo sob pH 9,6; evi) é tolerante a pelo menos 2,5% p/v de butanol quandocultivado sobre um meio sólido; eb) cultivo do Enteroeoceus da etapa (a) sob condições pormeio das quais é produzida 2-butanona.

57. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA, quecompreende:a) fornecimento de um Enterocoeeus isolado por meio doprocesso de acordo com a reivindicação 24 que compreende construçõesgenéticas que codificam um processo biossintético de butanol; eb) cultivo do Enterococcus da etapa (a) sob condições pormeio das quais é produzida 2-butanona.