BRPI0618037A2 - célula hospedeira microbiana recombinante e método de produção de 1-butanol - Google Patents

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Abstract

<B> CéLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE E MéTODO DE PRODUçãO DE 1-BUTANOL<D> A presente invenção refere-se a métodos de produção fermentativa de álcoois de quatro carbonos. Especificamente, butanol, preferencialmente 1-butanol, é produzido por meio do crescimento fermentativo de bactéria recombinante que expressa via biossintética de 1-butanol.

Description

"CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE E MÉTODO DE
PRODUÇÃO DE 1-BUTANOL"Referência Cruzada a Pedido Relacionado
O presente pedido reivindica prioridade com base em 35 U. S. C. §119 do Pedido Provisório Norte-Americano com número de série 60/721677,depositado em 29 de setembro de 2005, e do Pedido Provisório Norte-Americanocom número de série 60/814470, depositado em dezesseis de junho de 2006.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo de microbiologiaindustrial e à produção de álcoois. Mais especificamente, 1-butanol é produzidopor meio da fermentação industrial de microorganismo recombinante.
Antecedentes da Invenção
Butanol é importante substância industrial, útil como aditivo paracombustíveis, substância de estoque de alimentação na indústria de plásticos ecomo extrator de grau alimentício na indústria de alimentos e aromas. A cada ano,4,5 a 5,5 milhões de toneladas de butanol são produzidos por meios petroquímicose a necessidade dessa substância commodity irá aumentar de forma similar.
São conhecidos métodos de síntese química de 1-butanol, taiscomo o Processo Oxo, o Processo Reppe e a hidrogenação decrotonaldeído (Ullmann's Encyclopedia of Indvstrial Chemistry1 sextaedição, 2003, WiIey-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Alemanha, Vol.5, págs. 716-719). Estes processos utilizam materiais de partida derivadosde petroquímicos e são geralmente caros e desfavoráveis para o meioambiente. A produção de 1-butanol a partir de materiais de partidaderivados de plantas minimizaria emissões de gases do efeito estufa erepresentaria avanço na técnica.
São também conhecidos métodos de produção de 1-butanol pormeio de biotransformação de outras substâncias orgânicas. Muramoto et al (JP63017695), por exemplo, descrevem método de produção de álcoois, incluindobutanol, a partir de aldeídos utilizando linhagens de Pseudomonas. Além disso,Kuehnle et al (EP 1149918) descrevem processo de preparação de 1-butanol e2-butanol por meio da oxidação de hidrocarbonetos por várias linhagens deRhodococcus ruber.
Também são conhecidos métodos de produção de butanol pormeio de fermentação, em que o processo mais popular produz mistura deacetona, 1-butanol e etanol e é conhecido como os processos ABE(Blaschek et al, Patente US 6.358.717). A fermentação de acetona, butanole etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum é uma das fermentaçõesindustriais mais antigas conhecidas e os processos e genes responsáveispela produção desses solventes foram relatados (Girbal et al, Trends inBiotechnology 16: 11-16 (1998)). A fermentação real, entretanto, tem sidomuito complicada e de difícil controle. A fermentação de ABE caiucontinuamente desde os anos 1950 e quase todo o butanol agora éproduzido por meio de processos petroquímicos, conforme descrito acima.Em fermentação de ABE típica, ácidos butírico, propiônico, láctico e acéticosão produzidos em primeiro lugar por C. acetobutylicum, o pH do cultivocai, sofre alteração "borboleta" metabólica e são formados em seguida 1-butanol, acetona, isopropanol e etanol. Em fermentações de ABEconvencionais, o rendimento de 1-butanol a partir de glicose é baixo,tipicamente cerca de 15% e raramente excedendo 25%.Conseqüentemente, a concentração de 1-butanol em fermentações de ABEconvencionais normalmente é de menos de 1,3%.
Tentativas de maximizar a produção de 1-butanol a partir doprocesso de ABE por meio da eliminação de todos os demais subprodutos desolvente não foram totalmente bem sucedidas e, por isso, o processo produzquantidades significativas de acetona, que não é útil como aditivo de gasolina.Processo de produção fermentativa de butanol em que 1-butanol é o únicoproduto representaria avanço na técnica.
Existe necessidade, portanto, de processo eficaz para seucusto e ambientalmente responsável de produção de 1-butanol como únicoproduto. A presente invenção aborda esta necessidade e revela hospedeirode produção microbiana recombinante que expressa via biossintética de 1-butanol.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção fornece microorganismo recombinante quepossui via biossintética de 1-butanol elaborado. O microorganismo elaboradopode ser utilizado para a produção comercial de 1-butanol. Conseqüentemente,a presente invenção fornece célula hospedeira microbiana recombinante quecompreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica polipeptídeo quecatalisa substrato para produzir conversão selecionada a partir do grupo queconsiste de:
a. acetil-CoA em acetoacetil-CoA;
b. acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA;
c. 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA;
d. crotonil-CoA em butiril-CoA;
e. butiril-CoA em butiraldeído; e
f. butiraldeído em 1-butanol;
em que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para amencionada célula hospedeira microbiana e em que a mencionada célulahospedeira microbiana produz 1-butanol.
Em outra realização, a presente invenção fornece método deprodução de 1-butanol que compreende:
i. fornecimento de célula hospedeira microbianarecombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codificapolipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversão selecionada apartir do grupo que consiste de:
a. acetil-CoA em acetoacetil-CoA;
b. acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA;
5 c. 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA;
d. crotonil-CoA em butiril-CoA;
e. butiril-CoA em butiraldeído; e
f. butiraldeído em 1-butanol;
em que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para amencionada célula hospedeira microbiana; e
ii. contato da célula hospedeira de (i) com substrato de carbonofermentável sob condições por meio das quais é produzido 1-butanol.
Breve Descrição das Figuras ε Descrições de Seqüências
A presente invenção pode ser mais completamente compreendidaa partir da descrição detalhada a seguir, figura e das descrições de seqüênciasanexas, que fazem parte do presente pedido.
A Figura 1 exibe a via biossintética de 1-butanol. As etapasdenominadas "a", "b", "c", "d", "e" e "f representam o substrato para produzirconversões descrito abaixo.
As seqüências a seguir estão de acordo com 37 C. F. R.1.821-1.825 (Requirements for Patent Applications Containing NucleotideSequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the SequeneeRules) e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial daPropriedade Intelectual (OMPI) (1998) e as exigências de listagens deseqüências do EPO e PCT (Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capítulo 208 eAnexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e formato utilizadospara dados de seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem àsregras estabelecidas em 37 C. F. R. § 1.822.Tabela 1
Resumo de Números de SEQID de Genes E Proteínas
<table>table see original document page 6</column></row><table>SEQ ID N0 17 a 44 são as seqüências de nucleotídeos de primers deoligonucleotídeos utilizados para amplificar os genes da via biossintética de 1-butanol.
SEQ ID N0 45 a 72 são as seqüências de nucleotídeos de primersde oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento.
SEQ ID N0 73 a 75 são as seqüências de nucleotídeos de primersde oligonucleotídeos utilizados para construir os vetores de transformaçãodescritos no Exemplo 9.
SEQ ID N0 76 é a seqüência de nucleotídeos do gene CAC0462otimizado por códon denominado no presente CaTER.
SEQ ID N0 77 é a seqüência de nucleotídeos do gene EgTERotimizado por códon, denominado no presente EgTER (opt).
SEQ ID N0 78 é a seqüência de nucleotídeos do gene aldotimizado por códon, denominado no presente ald (opt).
SEQ ID N0 79 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pFP988.
SEQ ID N0 80 a 127, 160 a 185 e 190 a 207 são as seqüências deácido nucléico de primers de clonagem, seqüenciamento ou seleção de PCRutilizados para a clonagem, seqüenciamento ou seleção dos genes da viabiossintética de 1-butanol descrito no presente e são mais completamentedescritos nas Tabelas 4 e 5.
SEQ ID N0 156 é a seqüência de nucleotídeos do conjunto degenes cscBKA.
SEQ ID N0 157 é a seqüência de aminoácidos de sacarosehidrolase (CscA).
SEQ ID N0 158 é a seqüência de aminoácidos de D-frutoquinase(CscK).
SEQ ID N0 159 é a seqüência de aminoácidos de sacarosepermease (CscB).
SEQ ID N0 186 é a seqüência de nucleotídeos do gene teryotimizado por códons descrito no Exemplo 17.
SEQ ID N0 187 é a seqüência e aminoácidos da butil-CoAdesidrogenase (ter) codificada pelo gene tery otimizado por códons (SEQID N0 186).
SEQ ID N0 188 é a seqüência de nucleotídeos do gene aldyotimizado por códons descrito no Exemplo 17.
SEQ ID N0 189 é a seqüência de aminoácidos da butiraldeídodesidrogenase (ald) codificada pelo gene aldy otimizado por códons (SEQID N0 188).
SEQ ID N0 208 é a seqüência de aminoácidos do DNA modeloutilizado no Exemplo 14.
Descrição Detalhada da InvençãoA presente invenção refere-se a métodos de produção de 1-butanol utilizando microorganismos recombinantes. A presente invençãoatende a uma série de necessidades comerciais e industriais. Butanol ésubstância commodity industrial importante com uma série de aplicações, emque o seu potencial como combustível ou aditivo de combustível éparticularmente significativo. Embora apenas álcool de quatro carbonos,butanol possui teor de energia similar ao da gasolina e pode ser misturado comqualquer combustível fóssil. Butanol é preferido como combustível ou aditivo decombustível por gerar apenas CO2 e pouco ou nenhum SOx ou NOx quandoqueimado no motor a combustão interna padrão. Além disso, butanol é menoscorrosivo que etanol, o aditivo de combustível de maior preferência até aqui.
Além da sua utilidade como biocombustível ou aditivo decombustível, butanol possui o potencial de impacto a problemas na distribuiçãode hidrogênio na emergente indústria de células de combustível. As células decombustível atualmente são invadidas por preocupações com segurançaassociadas ao transporte e distribuição de hidrogênio. Butanol pode serfacilmente reformado pelo seu teor de hidrogênio e pode ser distribuído pormeio dos postos de gasolina existentes na pureza necessária para células decombustível ou veículos.
Por fim, a presente invenção produz butanol a partir de fontes decarbono derivadas de plantas, evitando o impacto ambiental negativoassociado a processos petroquímicos padrão para a produção de butanol.
As definições e abreviações a seguir devem ser utilizadas para ainterpretação das reivindicações e do relatório descritivo.
A expressão "invenção" ou "presente invenção", da forma utilizadano presente, é expressão não limitadora e não se destina a designar nenhumarealização isolada da invenção específica, mas engloba todas as realizaçõespossíveis conforme descrito no relatório descritivo e nas reivindicações.
"ABE" é a abreviação do processo de fermentação de Acetona,Butanol e Etanol.
A expressão "via biossintética de 1-butanol" indica o processoenzimático para produzir 1-butanol a partir de acetil-coenzima A (acetil-CoA).
A expressão "acetil-CoA acetiltransferase" designa enzima quecatalisa a conversão de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA ecoenzima A (CoA). Acetil-CoA acetiltransferases preferidas são acetil-CoAacetiltransferases com preferências de substrato (reação na direção frontal)para acetil-CoA e acil-CoA de cadeia curta e são classificadas como E. C.2.3.1.9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego); emboraenzimas com faixa de substrato mais ampla (E. C. 2.3.1.16) também sejamfuncionais. Acetil-CoA acetiltransferases são disponíveis a partir de uma sériede fontes, tais como Escherichia coli (GenBank n° NP_416728 (SEQ ID N0129), NC 000913 (SEQ ID N0 128); seqüência de aminoácidos NCBI (CentroNacional de Informações Biotecnológicas), seqüência de nucleotídeos NCBI),Clostridium acetobutylicum (GenBank n° NP_349476.1 (SEQ ID N0 2),NC 003030 (SEQ ID N0 1), NP_149242 (SEQ ID N0 4), NC_001988 (SEQ IDN0 3), Bacillus subtilis (GenBank n° NP_390297 (SEQ ID N0 131), NC_000964(SEQ ID N0 130)) e Saccharomyces cerevisiae (GenBank n° NP_015297 (SEQID N0 133) e NC_001148 (SEQ ID N0 132)).
A expressão "3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase" designa enzimaque catalisa a conversão de acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA. 3-HidroxibutiriI-CoA desidrogenases podem ser dependentes de dinucleotídeonicotinamida adenina (NADH) reduzido, com preferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA e são classificados como E. C.1.1.1.35 e E. C. 1.1.1.30, respectivamente. Além disso, 3-hidroxibutiril-CoAdesidrogenases podem ser dependentes de fosfato dinucleotídeo nicotinamidaadenina (NADPH) reduzido, com preferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA e são classificados como E. C.1.1.1.157 e EC 1.1.1.36, respectivamente. 3-Hidroxibutiril-CoA desidrogenasessão disponíveis por meio de uma série de fontes, tais como C. acetobutylicum(GenBank n° NP_349314 (SEQ ID N0 6), NC_003030 (SEQ ID N0 5)), B. subtilis(GenBank n° AAB09614 (SEQ ID N0 135), U29084 (SEQ ID N0 134)), Ralstoniaeutropha (GenBank n° YP_294481 (SEQ ID N0 137), NC_007347 (SEQ ID N0136)) e Alcaligenes eutrophus (GenBank n° AAA21973 (SEQ ID N0 139),J04987 (SEQ ID N0 138)). -
O termo "crotonase" designa enzima que catalisa a conversão de3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA e H2O. Crotonases podem possuirpreferência de substrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoAe são classificados como E. C. 4.2.1.17 e E. C. 4.2.1.55, respectivamente.Crotonases são disponíveis por meio de uma série de fontes, tais como E. coli(GenBank n° NP_415911 (SEQ ID N0 141), NC_000913 (SEQ ID N0 140)), C.acetobutylicum (GenBank n° NP_349318 (SEQ ID N0 8), NC_003030 (SEQ IDN0 6)), B. subtilis (GenBank n° CAB13705 (SEQ ID N0 143), Z99113 (SEQ IDNº 142)) e Aeromonas caviae (GenBank n° BAA21816 (SEQ ID Nº 145),D88825 (SEQ ID Nº 144)).
A expressão "butiril-CoA desidrogenase" designa enzima quecatalisa a conversão de crotonil-CoA em butiril-CoA. Butiril-CoA desidrogenases podem ser dependentes de NADH ou dependentes de NADPHe são classificadas como E. C. 1.3.1.44 e E. C. 1.3.1.38, respectivamente.Butiril-CoA desidrogenases são disponíveis por meio de uma série de fontes,tais como C. acetobutylicum (GenBank n° NP_347102 (SEQ ID Nº 10),NC_003030 (SEQ ID Nº 9))), Euglena gracilis (GenBank n° Q5EU90, SEQ ID Nº 147), AY741582, SEQ ID Nº 146)), Streptomyces collinus (GenBank n° AAA92890(SEQ ID Nº149), U37135 (SEQ ID Nº 148)) e Streptomyces coelicolor (GenBank n°CAA22721 (SEQ ID Nº 151), AL939127 (SEQ ID Nº 150)).
A expressão "butiraldeído desidrogenase" designa enzima quecatalisa a conversão de butiril-CoA em butiraldeído, utilizando NADH ouNADPH como cofator. Butiraldeído desidrogenases com preferência paraNADH são conhecidas como E. C. 1.2.1.57 e são disponíveis, por exemplo, pormeio de Clostridium beijerinckii (GenBank n° AAD31841 (SEQ ID N0 12),AF157306 (SEQ ID Nº 11)) e C. acetobutylicum (GenBank n° NP_149325 (SEQID Nº 153), NC_001988 (SEQ ID Nº 152)). A expressão "butanol desidrogenase" indica enzima que catalisa aconversão de butiraldeído em 1-butanol, utilizando NADH ou NADPH comocofator. Butanol desidrogenases são disponíveis, por exemplo, por meio de C.acetobutylicum (GenBank n° NP_149325 (SEQ ID Nº 153), NC_001988 (SEQID Nº 152; obs.: esta enzima possui atividade de aldeído e álcool desidrogenase); NP_349891 (SEQ ID N0 14), NC_003030 (SEQ ID Nº 13) eNP_349892 (SEQ ID Nº 16), NC_003030 (SEQ ID N0 15)) e E. coli (GenBankn° NP_417484 (SEQ ID Nº 155), NC_000913 (SEQ ID Nº 154)).
A expressão "anaeróbio facultativo" designa microorganismo quepode crescer em ambientes aeróbicos e anaeróbicos.
A expressão "substrato de carbono" ou "substrato de carbonofermentável" designa fonte de carbono capaz de ser metabolizado pororganismos hospedeiros de acordo com a presente invenção e,particularmente, fontes de carbono selecionadas a partir do grupo que consistede monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e substratos de umcarbono ou suas misturas.
O termo "gene" indica fragmento de ácido nucléico que é capazde ser expresso na forma de proteína específica, que inclui opcionalmenteseqüências reguladoras anteriores (seqüências não codificadoras 5') eposteriores (seqüências não codificadoras 3') à seqüência de codificação."Gene nativo" indica gene encontrado na natureza com suas própriasseqüências reguladoras. "Gene quimérico" indica qualquer gene que não sejagene nativo, que compreende seqüências de codificação e reguladoras quenão são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente, gene quiméricopode compreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação quesão derivadas de diferentes fontes, ou seqüências reguladoras e seqüências decodificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de maneira diferente daencontrada na natureza. "Gene endógeno" indica gene nativo no seu localnatural no genoma de organismo. "Gene heterólogo" ou "exógeno" indica genenormalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzidono organismo hospedeiro por meio de transferência genética. Os genesexógenos podem compreender genes nativos inseridos em organismo nãonativo ou genes quiméricos. "Transgene" é gene que foi introduzido no genomapor meio de procedimento de transformação.
Da forma utilizada no presente, a expressão "seqüência decodificação" indica seqüência de DNA que codifica seqüência de aminoácidosespecífica. "Seqüências reguladoras apropriadas" indicam seqüências denucleotídeos localizadas acima no fluxo (seqüências não codificadoras 5'), naseqüência ou abaixo no fluxo (seqüências não codificadoras 3') de seqüênciade codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamentode RNA ou tradução da seqüência de codificação associada. Seqüênciasreguladoras podem incluir promotores, seqüências líderes de tradução, introns,seqüências de reconhecimento de poliadenilação, local de processamento deRNA1 local de união efetora e estrutura de circuito de haste.
O termo "promotor" designa seqüência de DNA capaz decontrolar a expressão de seqüência de codificação ou RNA funcional.Geralmente, seqüência de codificação está localizada a 3' de seqüênciapromotora. Os promotores podem ser totalmente derivados de genenativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentespromotores encontrados na natureza ou mesmo compreender segmentosde DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem que diferentespromotores podem dirigir a expressão de gene em diferentes tecidos outipos de células, ou em diferentes etapas de desenvolvimento, ou emresposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotoresque fazem com que gene seja expresso na maior parte dos tipos decélulas na maior parte das vezes são comumente denominados"promotores constitutivos-. Reconhece-se ainda que, como na maior partedos casos as fronteiras exatas de seqüências reguladoras não foramcompletamente definidas, fragmentos de DNA com comprimentosdiferentes podem possuir atividade promotora idêntica.
A expressão "ligado operativamente" designa a associação deseqüências de ácidos nucléicos sobre um único fragmento de ácidonucléico, de forma que a função de um seja afetada pelo outro. Promotor éligado operativamente com seqüência de codificação, por exemplo, quandofor capaz de afetar a expressão daquela seqüência de codificação (ou seja,a seqüência de codificação encontra-se sob o controle transcricional dopromotor). As seqüências de codificação podem ser ligadasoperativamente a seqüências reguladoras em orientação com ou semsentido.
O termo "expressão", da forma utilizada no presente, designaa transcrição e acúmulo estável de RNA com (mRNA) ou sem sentidoderivado do fragmento de ácido nucleico de acordo com a presenteinvenção. Expressão pode também designar tradução de mRNA empolipeptídeo.
Da forma utilizada no presente, o termo "transformação"designa a transferência de fragmento de ácido nucléico para organismohospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismoshospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucléico transformadossão designados organismos "transgênicos", "recombinantes" ou"transformados".
Os termos "plasmídeo", "vetor" e "conjunto" designamelemento cromossômico adicional que freqüentemente conduz genes quenão são parte do metabolismo central da célula e, normalmente,encontram-se na forma de fragmentos de DNA com fita dupla circulares.Esses elementos podem ser seqüências de reprodução autônoma,seqüências de integração de genomas, seqüências de nucleotídeos oufagos, lineares ou circulares, de DNA ou RNA de fita simples ou dupla,derivados de qualquer fonte, em que uma série de seqüências denucleotídeos se uniu ou recombinou em uma só construção que é capazde introduzir fragmento promotor e seqüência de DNA para produtogenético selecionado junto com seqüência não traduzida 3' apropriadapara célula. "Conjunto de transformação" indica vetor específico quecontém gene exógeno e que possui elementos além do gene exógeno quefacilitam a transformação de célula hospedeira específica. "Conjunto deexpressão" designa vetor específico que contém gene exógeno e quepossui elementos além do gene exógeno que permitem maior expressãodaquele gene em hospedeiro exógeno.
Da forma utilizada no presente, a expressão "degeneração decódon" indica a natureza no código genético que permite variação daseqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos depolipeptídeo codificado. Os técnicos no assunto conhecem bem a "orientaçãode códons" exibida por célula hospedeira específica no uso de códons denucleotídeos para especificar dado aminoácido. Portanto, ao sintetizar genepara maior expressão em célula hospedeira, é desejável projetar o gene deforma que a sua freqüência de uso de códons aproxime-se da freqüência deuso de códons preferido da célula hospedeira.
A expressão "otimizado por códons", quando referir-se agenes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucléico paratransformação de diversos hospedeiros, designa a alteração de códons nogene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucléico pararefletir o uso de códons típico do organismo hospedeiro sem alterar opolipeptídeo codificado pelo DNA.
Os métodos padrão de clonagem molecular e DNA recombinanteutilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e descritos porSambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor NY (1989) (a seguir, Maniatis); por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. eEnquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1984); e por Ausubel, F. M. et al,Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc.e Wiley-Interscience (1987).Via Biossintética de 1-butanol
Microorganismos que utilizam carboidratos empregam o processode Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)1 o processo de Entner-Doudoroff e o ciclode fosfato de pentose como processos metabólicos centrais para fornecerenergia e precursores celulares para crescimento e manutenção. Estesprocessos contêm em comum o intermediário 3-fosfato de gliceraldeído e, porfim, piruvato é formado diretamente ou em combinação com o processo deEMP. Em seguida, piruvato é transformado em acetil-coenzima A (acetil-CoA)por uma série de meios, que incluem reação com o complexo de piruvatodesidrogenase, piruvato-formato Iiase e piruvato-ferredoxin oxidorreductase.Acetil-CoA serve de intermediário fundamental, tal como na geração de ácidosgraxos, aminoácidos e metabólitos secundários. As reações combinadas deconversão de açúcar em acetil-CoA produzem energia (tal como 5'-trifosfato deadenosina, ATP) e equivalentes redutores (tais como dinucleotídeonicotinamida adenina NADH reduzido e fosfato de dinucleotídeo nicotinamidaadenina NADPH reduzido). NADH e NADPH devem ser reciclados nas suasformas oxidadas (NAD+ e NADP+, respectivamente). Na presença deaceitadores de elétrons inorgânicos (tais como O2, NO3" e SO42"), osequivalentes redutores podem ser utilizados para aumentar o circuito deenergia; alternativamente, pode-se formar subproduto de carbono reduzido. Aprodução de etanol e 1-butanol resultante da fermentação de carboidrato sãoexemplos deste último.
A presente invenção permite a produção de 1-butanol a partir defontes de carboidrato com microorganismos recombinantes por meio dofornecimento de via biossintética de 1-butanol completo a partir de acetil-CoAem 1-butanol, conforme exibido na Figura 1. Esta via biossintética, quegeralmente falta na comunidade microbiana devido à ausência de genes ou àfalta de regulagem de gene apropriada, compreende as conversões desubstrato em produto a seguir:
a. acetil-Coa em acetoacetil-CoA, conforme catalisado, porexemplo, por acetil-CoA acetiltransferase;
b. acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA, conformecatalisado, por exemplo, por 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase;
c. 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA, conforme catalisado,por exemplo, por crotonase;
d. crotonil-CoA em butiril-CoA, conforme catalisado, porexemplo, por butiril-CoA desidrogenase;
e. butil-CoA em butiraldeído, conforme catalisado, porexemplo, por butiraldeído desidrogenase; e
f. butiraldeído em 1-butanol, conforme catalisado, porexemplo, por butanol desidrogenase.
O processo não necessita de ATP, gera NAD+ e/ou NADP+ e, destaforma, equilibra-se com os processos metabólicos centrais que geram acetil-CoA. A capacidade de organismos naturais de produzir 1-butanol por meio defermentação é rara e exemplificada mais proeminentemente por Clostridiumbeijerínckii e Clostridium acetobutylicum. A organização genética e a regulagemgenética para Clostridium acetobutylicum foram descritas (L. Girbal e P.Soucaille, Trends in Biotechnòlogy 216: 11-16 (1998)). Muitas destas atividadesenzimáticas, entretanto, são também associadas a processos alternativos, taiscomo utilização de hidrocarbonetos, oxidação de ácidos graxos e metabolismode poli-hidroxialcanoato. Desta forma, ao fornecer processo recombinante deacetil-CoA em 1-butanol, existe uma série de escolhas para realizar as etapas dereação individuais e os técnicos no assunto serão capazes de utilizar seqüênciasdisponíveis ao público para construir os processos relevantes. Relação dequantidade representativa de genes conhecidos na técnica e úteis na construçãoda via biossintética de 1-butanol encontra-se abaixo na Tabela 2.Tabela 2Fontes de Genes de Processo de 1-Butanol
<table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>Hospedeiros microbianos para a produção de 1-butanol
Hospedeiros microbianos para a produção de 1-butanol podemser selecionados a partir de bactérias, cianobactérias, fungos filamentosos eleveduras. O hospedeiro microbiano utilizado para a produção de 1-butanol épreferencialmente tolerante a 1-butanol, de forma que o rendimento não sejalimitado pela toxicidade de butanol. Micróbios que sejam metabolicamenteativos em altos níveis de título de 1-butanol não são bem conhecidos natécnica. Embora mutantes tolerantes a butanol tenham sido isolados a partir deClostridia solventogênica, pouca informação é disponível com relação àtolerância a butanol de outras linhagens bacterianas potencialmente úteis. Amaior parte dos estudos sobre a comparação de tolerância a álcool embactérias sugere que butanol é mais tóxico que etanol (de Carvalho et al,Microsc. Res. Tech. 64: 215-22 (2004) e Kabelitz et ai, FEMS Microbiol. Lett.220: 223-227 (2003)). Tomas et al (J. Bacteriol. 186: 2006-2018 (2004)) relatamque o rendimento de butanol durante a fermentação em Clostricliumacetobutylicum pode ser limitado pela toxicidade a butanol. O efeito principal debutanol sobre Clostridium acetobutylicum é o rompimento das funções demembrana (Hermann et al, AppI. Environ. Microbiol. 50: 1238-1243 (1985)).
Os hospedeiros microbianos selecionados para a produção de 1-butanol são preferencialmente tolerantes a 1-butanol e são capazes deconverter carboidratos em 1-butanol. Os critérios de seleção de hospedeirosmicrobianos apropriados incluem os seguintes: tolerância intrínseca a 1-butanol, alta taxa de utilização de glicose, disponibilidade de ferramentasgenéticas para manipulação de genes e capacidade de gerar alteraçõescromossômicas estáveis.
Linhagens de hospedeiros apropriadas com tolerância para 1-butanol podem ser identificadas por meio de seleção com base na tolerânciaintrínseca da linhagem. A tolerância intrínseca de micróbios a 1-butanol podeser medida determinando-se a concentração de 1-butanol que é responsávelpor inibição de 50% da taxa de crescimento (IC50) quando cultivados em meiomínimo. Os valores IC50 podem ser determinados utilizando métodosconhecidos na técnica. Os micróbios de interesse podem ser cultivados, por exemplo, na presença de várias quantidades de butanol e a taxa decrescimento monitorada medindo-se a densidade ótica a 600 nanômetros. Otempo de dobra pode ser calculado a partir da parte logarítmica da curva decrescimento e utilizado como medida da taxa de crescimento. A concentraçãode 1-butanol que produz inibição de 50% do crescimento pode ser determinada a partir de gráfico do percentual de inibição de crescimento contra aconcentração de 1-butanol. Preferencialmente, a linhagem hospedeira deverápossuir IC50 para 1-butanol de mais de cerca de 0,5% peso/volume.
O hospedeiro microbiano para a produção de 1-butanol deverátambém utilizar glicose em alta taxa. A maior parte dos micróbios é capaz de utilizar carboidratos. Entretanto, certos micróbios ambientais não podem utilizarcarboidratos em alta eficiência e, portanto, não seriam hospedeiros apropriados.
A capacidade de modificação genética do hospedeiro é essencialpara a produção de qualquer microorganismo recombinante. O modo detecnologia de transferência genética pode ser por meio de eletroporação, conjugação, transdução ou transformação natural. Ampla série cie plasmídeosconjugativos de hospedeiros e marcadores de resistência a drogas édisponível. Os vetores de clonagem são adequados aos organismoshospedeiros com base na natureza de marcadores de resistência a antibióticosque podem funcionar naquele hospedeiro.
O hospedeiro microbiano também necessita ser manipulado a fimde desativar processos concorrentes de fluxo de carbono por meio da exclusãode vários genes. Isso necessita da disponibilidade de transposons paradesativação direta ou vetores de integração cromossômica. Além disso, ohospedeiro de produção deverá ser propenso a mutagênese química, de formaque possam ser obtidas mutações para aumentar a tolerância intrínseca a 1-butanol.
Com base nos critérios descritos acima, hospedeiros microbianosapropriados para a produção de 1-butanol incluem, mas sem limitar-se amembros dos gêneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella,Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus,Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter1 Corynebacterium,Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula e Saccharomyces. Os hospedeirospreferidos incluem: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacilluslicheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis,Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium,Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis eSaccharomyces cerevisiae.
Construção de hospedeiros de produção
Organismos recombinantes que contêm os genes necessários quecodificarão o processo enzimático de conversão de substrato de carbono fermentávelem 1-butanol podem ser construídos utilizando métodos bem conhecidos na técnica.Na presente invenção, genes que codificam as enzimas da via biossintética de 1-butanol, ou seja, acetil-CoA acetiltransferase, 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase,crotonase, butiril-CoA desidrogenase, butiraldeído desidrogenase e butanoldesidrogenase, podem ser isolados a partir de várias fontes, conforme descrito acima.
Métodos de obtenção de genes desejados a partir de genomabacteriano são comuns e bem conhecidos na técnica de biologia molecular. Caso aseqüência do gene seja conhecida, por exemplo, bibliotecas genômicas apropriadaspodem ser criadas por meio de digestão de endonucleases de restrição e podem serselecionadas com sondas complementares à seqüência genética desejada. Após oisolamento da seqüência, o DNA pode ser amplificado utilizando métodos deamplificação dirigida por primers padrão tais como reação em cadeia de polimerase(Mullis, Patente Norte-Americana n° 4.683.202) para obter quantidades de DNAapropriadas para transformação utilizando vetores adequados. Ferramentas paraotimização de códons para expressão em hospedeiro heterólogo são facilmentedisponíveis. Algumas ferramentas de otimização de códons são disponíveis combase no teor de GC do organismo hospedeiro. O teor de GC de alguns exemplos dehospedeiros microbianos é fornecido na Tabela 3.
Tabela 3
Teor de GC de Hospedeiros Microbianos
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Após a identificação e isolamento dos genes de processo relevantes,eles podem ser transformados em hospedeiros de expressão apropriados por meiosbem conhecidos na técnica. Vetores ou conjuntos úteis para a transformação de umasérie de células hospedeiras são comuns e disponíveis comercialmente por meio deempresas tais como EPICENTRE® (Madison, Wl), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA),Stratagene (La Jolla, CA) e New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Tipicamente, ovetor ou conjunto contém seqüências que dirigem a transcrição e tradução do generelevante, marcador selecionáve! e seqüências que permitem a reproduçãoautônoma ou integração cromossômica. Vetores apropriados compreendem região 5'do gene que abriga controles de início de transcrição e região 3' do fragmento deDNA que controla o término da transcrição. As duas regiões de controle podem serderivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada, embora deva-secompreender que essas regiões de controle podem também ser derivadas de genesque não são nativos das espécies específicas selecionadas como hospedeiro deprodução.
Promotores ou regiões de controle de início, que são úteis paradirigir a expressão das regiões de codificação de processos relevantes nacélula hospedeira desejada, são numerosos e familiares para os técnicos noassunto. Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir esses elementosgenéticos é apropriado para a presente invenção, incluindo, mas sem limitar-sea CYC1, HIS3, GALIi GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1,URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD e GPM (úteis para expressão emSaccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia); e lac, ara, tet, trp, IPL,IPr, 77, tac e trc (úteis para expressão em Escherichia coli, Alcaligenes ePseudomonas)\ os promotores amy, apr e npr e vários promotores de fagosúteis para expressão em Bacillus subtilis, Bacillus Iieheniformis e Paenibacillusmaeerans] nisA (útil para expressão em bactérias grama-positivas, Eichenbaumet al, Appl. Environ. Mierobioi 64 (8): 2763-2769 (1998)); e o promotor P11sintético (útil para expressão em Lactobacillus plantarum, Rud et al,Mierobiology 152: 1011 -1019 (2006)).
Regiões de controle de término podem também ser derivadasde vários genes nativos para os hospedeiros preferidos. Opcionalmente,local de término pode ser desnecessário, mas é de maior preferência seincluído.
Certos vetores são capazes de reproduzir-se em ampla sériede bactérias hospedeiras e podem ser transferidos por meio deconjugação. A seqüência completa e anotada de pRK404 e três vetoresrelacionados, pRK437, pRK442 e pRK442 (H)1 são disponíveis.Comprovou-se que estes derivados são ferramentas valiosas paramanipulação genética em bactérias gram-negativas (Scott et al, Plasmid 50(1): 74-79 (2003)). Vários derivados de plasmídeos de plasmídeo RSF1010Inc P4 de ampla faixa de hospedeiros também são disponíveis compromotores que podem funcionar em uma série de bactérias gram-negativas. Os plasmídeos pAYC36 e pAYC37 possuem promotores ativosjunto com diversos locais de clonagem para permitir a expressão de genesheterólogos em bactérias gram-negativas.
Ferramentas de substituição de genes cromossômicos tambémsão amplamente disponíveis. Variante termossensível da réplica com amplafaixa de hospedeiros pWV101, por exemplo, foi modificada para construirplasmídeo pVE6002 que pode ser utilizado para criar substituição de genes emuma série de bactérias grama-positivas (Maguin et al, J. Bacteriol. 174 (17):5633-5638 (1992)). Além disso, transposomos in vitro são disponíveis paracriar mutações aleatórias em uma série de genomas a partir de fontescomerciais tais como EPICENTRE®.
A expressão da via biossintética de 1-butanol -em várioshospedeiros microbianos preferidos é descrita com mais detalhes abaixo.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em e. coliVetores ou conjuntos úteis para a transformação de £ coli são comunse disponíveis comercialmente por meio das empresas relacionadas acima. Os genesda via biossintética de 1-butanol podem ser isolados, por exemplo, a partir de váriaslinhagens de Clostrídium, clonados em vetor pUC19 modificado e transformados emE. coli NM522, conforme descrito no Exemplo 11. A expressão da via biossintética de1-butanol em várias outras linhagens de E. coli é descrita no Exemplo 13.Expressão da via biossintética de 1-butanol em Rhodococcus erythropolis
Uma série de vetores de impulso de E. coli-Rhodococcus é disponívelpara expressão em R. erythropolis, incluindo, mas sem limitar-se a pRhBR17 epDA71 (Kostichka et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 61-68 (2003)). Além disso,uma série de promotores é disponível para expressão de genes heterólogos em R.erythropolis (vide, por exemplo, Nakashima et al, AppI. Envir. Microbiol. 70: 5557-5568 (2004) e Tao et al, AppI. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064). Pode-se criar rompimento genético dirigido de genes cromossômicosem R. erythropolis utilizando o método descrito por Tao et al, acima, e Brans et al(Appl. Envir. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000)).
Os genes heterólogos necessários para a produção de 1-butanol,conforme descrito acima, podem ser clonados inicialmente em pDA71 ou pRhBR71 etransformados em E. coli. Os vetores podem ser transformados em seguida em R.erythropolis por meio de eletroporação, conforme descrito por Kostichka et al, acima.Os recombinantes podem ser cultivados em meio sintético que contém glicose e aprodução de 1-butanol pode ser seguida utilizando métodos conhecidos na técnica.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Bacillus subtilis
Métodos de expressão genética e criação de mutações em B.subtilis também são bem conhecidos na técnica. Os genes da via biossintética de1-butanol podem ser isolados, por exemplo, a partir de diversas linhagens deClostridium, clonados em vetor pUC19 modificado e transformados em Bacillussubtilis BE1010, conforme descrito no Exemplo 12. Além disso, os seis genes davia biossintética podem ser divididos em dois operadores para expressão,conforme descrito no Exemplo 14. Os três primeiros genes do processo (thl, hbdecrt) foram integrados ao cromossomo de Bacillus subtilis BE1010 (Payne eJackson, J. BacterioL 173: 2278-2282 (1991)). Os três últimos genes (EgTER, a/de bdhB) foram clonados em plasmídeos de expressão e transformados nalinhagem de Bacillus que conduz os genes de 1-butanol integrados.Expressão da via biossintética de 1-butanol em Bacillus ucheniformis
A maior parte dos plasmídeos e vetores de impulso que sereproduzem em B. subtilis pode ser utilizada para transformar B.Ucheniformis por meio de transformação de protoplastas ou eletroporação.
Os genes necessários para a produção de 1-butanol podem ser clonados,por exemplo, nos plasmídeos derivados de pBE20 ou pBE60 (Nagarajan etal, Gene 114: 121-126 (1992)). Métodos de transformação de B.Ucheniformis são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Fleming et al,Appl. Environ. Microbiol., 61 (11): 3775-3780 (1995). Os plasmídeosconstruídos para expressão em B. subtilis podem também sertransformados em B. Ucheniformis para produzir hospedeiro microbianorecombinante que produz 1-butanol.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Paenibacillus maceransPlasmídeos podem ser construídos conforme descrito acima paraexpressão em B. subtilis e utilizados para transformar Paenibacillus maceranspor meio de transformação de protoplastas para produzir hospedeiromicrobiano recombinante que produz 1-butanol.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Alcaligenes (Ralstonia)eutrophus
Métodos de expressão genética e criação de mutações emRalstonia eutrophus são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Taghavi etal, Appi Environ. Microbiol. 60 (10): 3585-3591 (1994)). Os genes para a viabiossintética de 1-butanol podem ser clonados em qualquer dos vetores deampla faixa de hospedeiros descritos acima e eletroporados para gerarrecombinantes que produzam 1-butanol. O processo de polihidróxi butirato emRalstonia foi descrito em detalhes, uma série de métodos genéticos para modificar ogenoma de Ralstonia eutrophus é conhecida e estas ferramentas podem seraplicadas para elaborar a via biossintética de 1-butanol.Expressão da via biossintética de 1-butanol em Pseudomonas putida
Métodos de expressão genética em Pseudomonas putida sãoconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ben-Bassat et al, Patente Norte-Americana n° 6.586.229, que é incorporada ao presente como referência).
Os genes de processo de butanol podem ser inseridos, por exemplo, empPCU18 e este DNA ligado pode ser eletroporado em células dePseudomonas putida DOT-T1 C5aAR1 eletrocompetentes para gerarrecombinantes que produzem 1-butanol.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Saccharomyces cerevisiae
Métodos de expressão genética em Saccharomyces cerevisiae sãoconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Methods in Enzymology, Volume 194,Guide to Yeast Genetics an Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, ChristineGuthrie e Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego CA). Aexpressão de genes em levedura necessita tipicamente de promotor, seguido pelogene de interesse, e término de transcrição. Pode-se utilizar uma série depromotores de leveduras na construção de conjuntos de expressão para genes quecodificam a via biossintética de 1-butanol, incluindo, mas sem limitar-se aospromotores constitutivos FBA, GPD e GPM e os promotores indutíveis GAL1,GAL10 e CUP1. Términos de transcrição apropriados incluem, mas sem limitar-se aFBAt, GPDt, GPMt, ERGIOt e GAL1t. Promotores apropriados, términos detranscrição e os genes da via biossintética de 1-butanol podem ser clonados emplasmídeos de dois micra (2μ) de levedura, conforme descrito no Exemplo 17.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Lactobacillus plantarum
O gênero Lactobacillus pertence à família dos Lactobacillales emuitos plasmídeos e vetores utilizados na transformação de Bacillus subtilis eStreptococcus podem ser utilizados para Lactobacillus. Exemplos não limitadoresde vetores apropriados incluem pAM/31 e seus derivados (Renault et al, Gene 183:175-182 (1996); e O'Sullivan et al, Gene 137: 227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800,derivado de pMBB1 (Wyckoff et al, Appl. Environ. Microbiol. 62: 1481-1486(1996)); pMG1, plasmídeo conjugativo (Tanimoto et al, J. Bacterioi 184: 5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al, Appl. Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1899-1903(1994)). Diversos plasmídeos de Lactobacillus plantarum foram também relatados(tais como van Kranenburg, R., Golic, N., Bongers, R., Leer, R. J., de Vos W. M.,Siezen, R. J., Kleerebezem, M., Appl. Environ. Microbiol. março de 2005, 71 (3):1223-1230). A expressão da via biossintética de 1-butanol em Lactobacillus plantarum é descrita, por exemplo, no Exemplo 18.
Expressão da via biossintética de 1-butanol em Enterococcus faecium,Enterococcus galunarium ε Enterococcus faecalisO gênero Enterococcus pertence à família Lactobacillales e muitosplasmídeos e vetores utilizados na transformação de Lactobacillus, Bacillus subtilis e Streptococcus podem ser utilizados para Enterococcus. Exemplos nãolimitadores de vetores apropriados incluem ρΑΜβΙ e seus derivados (Renault etal, Gene 183: 175-182 (1996); e 0'Sullivan et al, Gene 137: 227-231 (1993));pMBB1 e pHW800, derivado de pMBB1 (Wyckoff et al, Appl. Environ. Microbiol.62: 1481-1486 (1996)); pMG1, plasmídeo conjugativo (Tanimoto et al, J. Bacterioi 1 84: 5800-5804 (2002); pNZ9520 (Kleerebezem et al, Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1899-1903 (1994)). Vetores de expressão para E. faecalis utilizando o gene nisA a partirde Lactococcus podem também ser utilizados (Eichenbaum et al, Appl. Environ. Microbiol. 64: 2763-2769 (1998)). Além disso, podem ser utilizados vetores desubstituição genética no cromossomo de E. faecium (Nallaapareddy et al, Appl.Environ. Microbiol. 72: 334-345 (2006)). A expressão da via biossintética de 1-butanol em Enterococcus faecalis, por exemplo, é descrita no Exemplo 19.Meios de fermentação
Os meios de fermentação de acordo com a presente invenção devemconter substratos de carbono apropriados. Os substratos de carbono podem incluir,mas sem limitar-se a monossacarídeos tais como glicose e frutose, oligossacarídeostais como Iactose ou sacarose, polissacarídeos tais como amido, celulose ou suasmisturas e misturas não purificadas de estoques de alimentação renováveis tais comopermeado de soro de queijo, líquido de maceração de milho, melaço de beterraba deaçúcar e malte de cevada. Além disso, o substrato de carbono pode também sersubstrato de um carbono tal como dióxido de carbono, ou metanol para o qual setenha demonstrado conversão metabólica em intermediários bioquímicos chave.Além de substratos de um ou dois carbonos, organismos metilotróficos também sãoconhecidos por utilizarem uma série de outros compostos que contêm carbono taiscomo metilamina, glucosamina e uma série de aminoácidos para atividademetabólica. Leveduras metilotróficas, por exemplo, utilizam conhecidamente ocarbono de metilamina para formar trehalose ou glicerol (Bellion et al, Microb. GrowthC1 Compd. (Simp. Int.), 7o (1993), 415-32. Editor(es): Murrellf J. Collin; Kelly, Don P.Editora: Intercept1 Andover, Reino Unido). De forma similar, várias espécies deCandida metabolizarão alanina ou ácido oléico (Sulter et al, Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Contempla-se, desta forma, que a fonte de carbono utilizada na presenteinvenção pode englobar ampla variedade de substratos que contêm carbono esomente será limitada pela seleção de organismo.
Embora se contemple que todos os substratos de carbonomencionados acima e suas misturas são apropriados na presente invenção, ossubstratos de carbono preferidos são glicose, frutose e sacarose.
Além de fonte de carbono apropriada, os meios de fermentaçãodevem conter minerais apropriados, sais, cofatores, tampões e outros componentesconhecidos dos técnicos no assunto, apropriados para o crescimento dos cultivos epromoção do processo enzimático necessário para a produção de 1-butanol.Condições de cultivo
Tipicamente, as células são cultivadas sob temperatura na faixade cerca de 25 °C a cerca de 40 °C em meio apropriado. Os meios decrescimento apropriados na presente invenção são meios preparadoscomercialmente comuns tais como caldo Luria Bertani (LB)1 caldo DextroseSabouraud (SD) ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios decrescimento sintéticos ou definidos podem também ser utilizados e o meioapropriado de crescimento do microorganismo específico será conhecido dostécnicos no assunto de microbiologia ou ciência da fermentação. O uso deagentes conhecidos por modularem a repressão de catabólitos direta ouindiretamente, tais como 2':3'-monofosfato de adenosina cíclica, pode tambémser incorporado ao meio de fermentação.
Faixas de pH apropriadas para a fermentação são de pH 5,0 a pH9,0, em que pH 6,0 a pH 8,0 é preferida como condição inicial.
Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ouanaeróbicas, em que são preferidas condições anaeróbicas ou microaeróbicas.
A quantidade de 1-butanol produzida no meio de fermentaçãopode ser determinada utilizando uma série de métodos conhecidos na técnica,tais como cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC) oucromãtografia de gases (GC).
Fermentações contínuas e em bateladas industriais
O processo do presente emprega método de fermentação embateladas. Fermentação em bateladas clássica é sistema fechado em que acomposição do meio é definida no início da fermentação e não sujeita aalterações artificiais durante a fermentação. Desta forma, no início dafermentação, o meio é inoculado com o(s) organismo(s) desejado(s) e permite-se que a fermentação ocorra sem a adição de nada ao sistema. Tipicamente,entretanto, fermentação em "bateladas" é batelada com relação à adição defonte de carbono e são freqüentemente realizadas tentativas de controle defatores tais como pH e concentração de oxigênio. Em sistemas de bateladas,as composições de biomassa e metabólitos do sistema alteram-seconstantemente até o momento em que a fermentação é suspensa. Em cultivosde bateladas, as células são moderadas através de fase de revestimentoestático até fase de registro em alto crescimento e, por fim, até faseestacionária, em que a velocidade de crescimento é reduzida ou suspensa.Caso não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. Ascélulas em fase de registro geralmente são responsáveis pelo volume degeração de produto final ou intermediário.
Variação do sistema de bateladas padrão é o sistema deBateladas Alimentadas. Os processos de fermentação de BateladasAlimentadas também são apropriados na presente invenção ecompreendem sistema de bateladas típico com exceção de que osubstrato é adicionado em parcelas à medida que a fermentação progride.Sistemas de Bateladas Alimentadas são úteis quando a repressão decatabólitos é apta a inibir o metabolismo das células e quando fordesejável ter quantidades limitadas de substrato nos meios. A medição daconcentração de substratos real em sistemas de Bateladas Alimentadas édifícil e, portanto, estimada com base nas alterações de fatoresmensuráveis tais como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gasesresiduais tais como CO2. Fermentações em bateladas e bateladasalimentadas são comuns, bem conhecidas na técnica e exemplos podemser encontrados em Thomas D. Brock1 Biotechnology: A Textbook ofIndustrial Microbiology, segunda edição (1989), Sinauer Associates Inc.,Sunderland MA, ou Deshpande, Mukund V., AppI. Biochem. Biotechnol.36: 227 (1992), incorporados ao presente como referência.
Embora a presente invenção seja realizada em modo debateladas, contempla-se que o método seria adaptável a métodos defermentação contínua. Fermentação contínua é sistema aberto em que meiode fermentação definido é adicionado continuamente a biorreator equantidade igual de meios condicionados é removida simultaneamente paraprocessamento. Fermentação contínua geralmente mantém os cultivos emdensidade alta constante, em que as células encontram-se principalmenteem crescimento de fase de registro.
Fermentação contínua permite a modulação de um fator ouqualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou aconcentração do produto final. Um método manterá, por exemplo, nutrientelimitador tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio em taxa fixae permitirá a moderação de todos os demais parâmetros. Em outrossistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser alteradacontinuamente enquanto a concentração celular, medida pela turvação dosmeios, é mantida constante. Sistemas constantes lutam para mantercondições de crescimento em estado estável e, desta forma, a perdacelular devido à retirada do meio deve ser equilibrada contra a taxa decrescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientese fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bemcomo métodos de maximização da velocidade de formação de produto sãobem conhecidos na técnica de microbiologia industrial e uma série demétodos é detalhada por Brock, acima.
Contempla-se que a presente invenção pode ser praticadautilizando processos contínuos, de bateladas ou de bateladas de alimentação eque qualquer modo de fermentação conhecido seria adequado. Além disso,contempla-se que células podem ser imobilizadas sobre substrato na forma decatalisadores de células inteiras e submetidas a condições de fermentaçãopara a produção de 1-butanol.Métodos de isolamento de 1-butanol a partir do meio de fermentação
O 1-butanol bioproduzido pode ser isolado a partir do meio defermentação utilizando métodos conhecidos na técnica. Sólidos podem serremovidos do meio de fermentação, por exemplo, por meio de centrifugação,filtragem, decantação ou similares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isoladodo meio de fermentação, que tenha sido tratado para remover sólidos conformedescrito acima, utilizando métodos tais como destilação, extração de líquido-líquido ou separação com base em membrana. Como 1-butanol forma misturaazeotrópica com baixo ponto de ebulição com água, a destilação somente podeser utilizada para separar a mistura até a sua composição azeotrópica. Pode-seutilizar destilação em combinação com outro método de separação para obterseparação em volta do azeotropo. Métodos que podem ser utilizados emcombinação com destilação para isolar e purificar 1-butanol incluem, mas semlimitar-se a decantação, extração de líquido-líquido, adsorção e métodos com baseem membranas. Além disso, 1-butanol pode ser isolado utilizando destilaçãoazeotrópica empregando transportador (vide, por exemplo, Doherty e Malone,Conceptual Design of Distillation Systems, Mc Graw Hill1 Nova Iorque, 2001).
A mistura de 1-butanol e água forma azeotropo heterogêneo, deforma que a destilação possa ser utilizada em combinação com decantaçãopara isolar e purificar o 1-butanol. Neste método, o caldo de fermentação quecontém 1-butanol é destilado até perto da composição azeotrópica. Emseguida, a mistura azeotrópica é condensada e o 1-butanol é separado do meiode fermentação por meio de decantação. A fase aquosa decantada pode serdevolvida para a primeira coluna de destilação na forma de refluxo. A faseorgânica decantada rica em 1-butanol pode ser adicionalmente purificada pormeio de destilação em segunda coluna de destilação.
O 1-butanol pode também ser isolado do meio de fermentaçãoutilizando extração de líquido-líquido em combinação com destilação.Neste método, o 1-butanol é extraído do caldo de fermentação utilizandoextração de líquido-líquido com solvente apropriado. A fase orgânica quecontém 1-butanol é destilada em seguida para separar o 1-butanol dosolvente.
Destilação em combinação com adsorção pode também serutilizada para isolar 1-butanol do meio de fermentação. Neste método, ocaldo de fermentação que contém o 1-butanol é destilado até perto dacomposição azeotrópica e, em seguida, a água remanescente é removidautilizando adsorvente, tal como peneiras moleculares (Aden et al,Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics UtiiizingCo-Current Diiute Aeid Prehydrolysis and Enzymatie Hydrolysis for CornStover, Relatório NREL/TP-510-32438, Laboratório Nacional de EnergiaRenovável, junho de 2002).
Além disso, destilação em combinação com pervaporação podeser utilizada para isolar e purificar o 1-butanol do meio de fermentação. Nestemétodo, o caldo de fermentação que contém o 1-butanol é destilado até pertoda composição azeotrópica e, em seguida, a água remanescente é removidapor meio de pervaporação através de membrana hidrofílica (Guo et al, J.Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)).
Exemplos
A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos aseguir. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquemrealizações preferidas da presente invenção, são fornecidos unicamente comoforma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, ostécnicos no assunto podem determinar as características essenciais dapresente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizarvárias mudanças e modificações da presente invenção para adaptá-la a váriosusos e condições.Métodos gerais
Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinantepadrão utilizados nos Exemplos são bem conhecidos na técnica e descritospor Sambrook, J., Fritsch1 E. F. e Maniatis1 T., Molecular Cloning: ALaboratory Manual·, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold SpringHarbor (1989) (Maniatis) e por T. L. Silhavy1 M. L. Bennan e L. W. Enquist1Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor1 Nova Iorque (1984) e por Ausubel1 F. M. et al, CurrentProtocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. eWiley-Interscience (1987).
Os materiais e métodos apropriados para a manutenção ecrescimento de cultivos bacterianos são bem conhecidos na técnica. Métodosapropriados para uso nos exemplos a seguir podem ser encontrados conformedescrito em Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt1 R.G. E. Murray1 Ralph N. Costilow1 Eugene W. Nester1 Willis A. Wood1 Noel R.Krieg e G. Briggs Phillips, eds.), Sociedade Norte-Americana de Microbiologia1Washington DC (1994)) ou por Thomas D. Brock em Biotechnology: ATextbook of Industrial Microbiology, segunda edição, Sinauer Associates, Inc.,Sunderland MA (1989). Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiaisutilizados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foramobtidos por meio da Aldrich Chemicals (Milwaukee Wl), BD Diagnostic Systems(Sparks MD), Life Technologies (Rockville MD) ou Sigma Chemical Company(St. Louis MO), a menos que especificado em contrário.
Os primers de oligonucleotídeos utilizados para clonagem nosExemplos a seguir são fornecidos na Tabela 4. Os primers utilizados paraseqüenciar ou selecionar os genes clonados são fornecidos na Tabela 5. Todosos primers de oligonucleotídeos foram sintetizados por Sigma-Genosys(Woodlands TX).Tabela 4
Primers de Clonagem de Oligonucleotídeos
<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>Tabela 5
Primers de Seleção de PCR ε Seqüenciamento
<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>Métodos de determinação da concentração de 1-butanol em meios decultivo
A concentração de 1-butanol nos meios de cultivo pode serdeterminada por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Métodode cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC) específico utilizou,por exemplo, coluna Shodex SH-1011 com coluna de guarda Shodex SH-G,ambos adquiridos da Waters Corporation (Milford MA) com detecção do índicede retração (RI). Atingiu-se separação cromatográfica utilizando 0,01 M H2SO4como fase móvel com velocidade de fluxo de 0,5 mL/min e temperatura decoluna de 50 °C. 1-ButanoI apresentou tempo de retenção de 52,8 min sob ascondições utilizadas. Alternativamente, são disponíveis métodos decromatografia de gás (GC). Método GC específico utilizou, por exemplo, colunaHP-INNOWax (30 m χ 0,53 mm diâmetro interno, espessura de filme de 1 pm,Agilent Technologies, Wilmington DE) com detector de ionização de chama(FID). O gás veículo foi hélio em velocidade de fluxo de 4,5 mL/min, medida a150 °C com pressão superior constante; a divisão do injetor foi de 1:25 a 200°C; a temperatura do forno foi de 45 °C por um minuto, 45 a 220 °C a 10 °C/mine 220 °C por cinco minutos; e empregou-se detecção de FID a 240 °C com 26mL/min de gás de composição de hélio. O tempo de retenção de 1-butanol foide 5,4 min. Também foi utilizado métodorGC similar utilizando coluna CBVarian CP WAX 58 (FFAP) (25 m χ 0,25 mm diâmetro interno χ espessura defilme de 0,2 pm, Varian, Inc., Palo Alto CA).
O significado das abreviações é o seguinte: "s" indica segundo(s),"min" indica minuto(s), "h" indica hora(s), "psi" indica libras por polegadaquadrada, "nm" indica nanômetros, "d" indica dia(s), "pL" indica microlitro(s),"mL" indica mililitro(s), "L" indica litro(s), "mm" indica milímetro(s), "nm" indicananômetros, "mM" indica milimolar, "M" indica molar, "mmol" indica milimol(es),"pmol" indica micromol(es), "g" indica grama(s), "pg" indica micrograma(s) e "ng"indica nanograma(s), "PCR" indica reação em cadeia de polimerase, "OD" indicadensidade ótica, "OD6oo" indica a densidade ótica medida em comprimento de ondade 600 nm, OD550" indica a densidade ótica medida em comprimento de onda de550 nm, "kDa" indica quilodaltons, "g" indica a constante da gravidade, "rpm" indicarevoluções por minuto, "bp" indica par(es) de bases, "kbp" indica par(es) dequilobases, "% p/v" indica percentual peso/volume, "% v/v" indica percentualvolume/volume, "HPLC" indica cromatografia de líquidos de alto desempenho e"GC" indica cromatogafia de gases.
Exemplo 1Clonagem ε Expressão de Acetil-CoA Acetiltransferase
O propósito deste Exemplo foi de expressar a enzima acetil-CoAacetiltransferase, também denominada no presente acetoacetil-CoA tiolase, emE. coli. O gene acetoacetil-CoA tiolase thIA foi clonado a partir de C.acetobutylicum (ATCC 824) e expresso em E. coli. O gene thIA foi amplificadoa partir de DNA genômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) utilizando PCR,resultando em produto de 1,2 kbp.
O DNA genômico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) foiadquirido da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos (ATCC, ManassasVA) ou foi isolado a partir de cultivos de Clostridium acetobutylicum (ATCC824), conforme descrito abaixo. -
DNA genômico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) foipreparado a partir de culturas cultivadas anaerobicamente. A linhagem de
Clostridium foi cultivada em 10 ml_ de meio de crescimento de Clostridial(Lopez-Contreras et al, Appi Env. Microbioi 69 (2), 869-877 (2003)) em frascosde soro Bellco de 100 ml_ tampados e revirados (Bélico Glass Inc., VinelandNJ) em câmara anaeróbica a 30°C. O inoculado foi colônia isolada de placa 2XYTG (Kishii et al, Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 47 (1), 77-81 (2003))cultivada em 2,5 L de MGC AnaeroPak® (Mitsubishi Gas Chemical America46
Inc., Nova Iorque NY) a 37 °C.
DNA genômico foi preparado utilizando o kit Gentra Puregene®(Gentra Systems, Inc., Mineápolis MN; catálogo n° D-6000A) com modificaçõesdas instruções do fabricante (Wong et al, Current Microbiology, 32, 349-356(1996)). O gene thIA foi amplificado a partir de DNA genômico de Clostridiumacetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando os primers N7 e N8(vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 21 e 22, respectivamente. Outrosreagentes de amplificação de PCR foram fornecidos em kits dos fabricantes,tais como DNA Polimerase Kod HiFi (Novagen Inc., Madison Wl; catálogo n°71805-3) e utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. Amplificação foiconduzida em Termociclizador de DNA GeneAmp 9700 (PE AppliedBiosystems, Foster City CA).
Para estudos de expressão, utilizou-se a tecnologia de clonagemGateway (Invitrogen Corp., Carlsbad CA). O vetor de entrada pENTR/SD/D-TOPO permitiu clonagem direcional e forneceu seqüência Shine-Dalgarno parao gene de interesse. O vetor de destino pDEST14 utilizou promotor T7 paraexpressão do gene sem marca. O primer frontal incorporou quatro bases(CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitirclonagem direcional para pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) para gerar oplasmídeo pENTRSDD-TOPOthIA. A construção pENTR foi transformada emcélulas TopIO de E. coli (Invitrogen) e colocadas em placas de acordo com asrecomendações do fabricante. Transformadores foram cultivados por uma noitee DNA de plasmídeo foi preparado utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep(Qiagen, Valencia CA; catálogo n° 27106) de acordo com as recomendaçõesdo fabricante. Clones foram submetidos a seqüenciamento com primers Frontale Reverso M13 (vide Tabela 5), fornecidos como SEQ ID N0 45 e 46,respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos na orientaçãocorreta e para confirmar a seqüência. Primers de seqüenciamento adicionais,N7SeqF1 e N7SeqR1 (vide Tabela 5), fornecidos como SEQ ID N0 47 e 48,respectivamente, foram necessários para seqüenciar completamente o produtode PCR. A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) paraeste gene e a seqüência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidascomo SEQ ID N0 1 e SEQ ID N0 2, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene thIA foi transferido para ovetor pDEST 14 por meio de recombinação para gerar pDEST14thlA. O vetorpDEST14thlA foi transformado em células BL21-AI. Transformadores foraminoculados em meio LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina e cultivadospor uma noite. Parcela do cultivo por uma noite foi utilizada para inocular 50 mLde LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina. O cultivo foi incubado a 37°C com agitação até que OD6oo atingisse 0,6 a 0,8. O cultivo foi dividido em doiscultivos de 25 mL e adicionou-se arabinose a um dos frascos até concentraçãofinal de 0,2% em peso. O frasco de controle negativo não foi induzido comarabinose. Os frascos foram incubados por quatro horas a 37 °C com agitação.Células foram colhidas por meio de centrifugação e as pelotas celulares foramnovamente suspensas em 50 mM de MOPS, tampão com pH 7,0. As célulasforam rompidas por meio de sonicação ou de passagem através de Célula dePressão Francesa. O lisato de células inteiras foi centrifugado, gerando osobrenadante de extrato livre de células e a pelota ou a fração insolúvel.Parcela de cada fração (lisato de células inteiras, extrato livre de células efração insolúvel) foi novamente suspensa em tampão de carga SDS (MES)(Invitrogen), aquecida a 85 °C por dez minutos e submetida a análise SDS-PAGE (NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Gel, catálogo n° NP0322Box, Invitrogen).Proteína com o peso molecular esperado de cerca de 41 kDa, conformededuzido da seqüência de ácidos nucléicos, estava presente no cultivoinduzido, mas não no controle não induzido.
A atividade de acetoacetil-CoA tiolase nos extratos de célulaslivres foi medida como a degradação de complexo de Mg2+-acetoacetil-CoAmonitorando-se a redução da absorção a 303 nm. Condições de teste padrãoforam de 100 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM de DTT (ditiotreitol) e 10 mM deMgCb- O coquetel foi equilibrado por cinco minutos a 37 0C; em seguida,adicionou-se o extrato livre de células. A reação foi iniciada com a adição de0,05 mM de acetoacetil-CoA mais 0,2 mM de CoA. A concentração deproteínas foi medida por meio do método Bradford ou do Kit Bicinchoninic(Sigma, catálogo n° BCA-1). Albumina de soro bovino (Bio-Rad, Hercules CA)foi utilizada como padrão nos dois casos. Em teste típico, a atividade específicada proteína ThIA no cultivo induzido foi determinada como sendo de 16,0 μιτιοΙmg"1 min"1 em comparação com 0,27 μιτιοΙ mg"1 min"1 no cultivo não induzido.
Exemplo 2
Clonagem ε Expressão de Acetil-CoA Acetiltransferase
O propósito deste Exemplo foi de expressar a enzima acetil-CoAacetiltransferase, também denominada no presente acetoacetil-CoA tiolase, emE. coli. O gene acetoacetil-CoA tiolase thlB foi clonado a partir de C.acetobutylicum (ATCC 824) e expresso em E. coli. O gene thlB foi amplificadoa partir de DNA genômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) utilizando PCR.
O gene thlB foi clonado e expresso da mesma forma que o genethIA descrito no Exemplo 1. O DNA genômfco de C. acetobutylicum (ATCC824) foi amplificado por meio de PCR utilizando os primers N15 e N16 (videTabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 27 e 28, respectivamente, criandoproduto de 1,2 kbp. O primer frontal incorporou quatro bases (CCAC)imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitirclonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) para gerar oplasmídeo pENTRSDD-TOPOthIB. Os clones foram submetidos aseqüenciamento com primers Frontal e Reverso M13, fornecidos como SEQ IDN° 45 e 46, respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos naorientação correta e para confirmar a seqüência. Primers de seqüenciamentoadicionais, N15SeqFq1 e N16SeqR1 (vide Tabela 5), fornecidos como SEQ IDN0 49 e 50, respectivamente, foram necessários para seqüenciarcompletamente o produto de PCR. A seqüência de nucleotídeos do quadro deleitura aberta (ORF) para este gene e a seqüência de aminoácidos prevista daenzima são fornecidas como SEQ ID N0 3 e SEQ ID N0 4, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene thlB foi transferido para ovetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerar pDEST14thlB. Ovetor pDEST14thlB foi transformado em células BL21-AI e a expressão do promotorT7 foi induzida por meio da adição de arabinose. Proteína com o peso molecularesperado de cerca de 42 kDa, conforme deduzido da seqüência de ácidosnucleicos, estava presente no cultivo induzido, mas não no controle não induzido.Testes de enzimas foram realizados conforme descrito no Exemplo 1. Em testetípico, a atividade específica da proteína ThIB no cultivo induzido foi determinadacomo sendo de 14,9 pmol mg"1 min"1 em comparação com 0,28 pmol mg"1 min"1 nocultivo não induzido.
Exemplo 3
Clonagem ε Expressão de 3-Hidroxibutiril-CoA Desidrogenase
O propósito deste Exemplo foi de clonar o gene hbd de C.acetobutylicum (ATCC 824) e expressá-lo em E. coli. O gene hbd foi-amplificado a partir de DNA genômico de C. acetobutylicum (ATCC 824)utilizando PCR.
O gene hbd foi clonado e expresso utilizando o métododescrito no Exemplo 1. O gene hbd foi amplificado a partir de DNAgenômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando osprimers N5 e N6 (vide Tabela 4) fornecidos como SEQ ID N0 19 e 20,respectivamente, criando produto com 881 bp. O primer frontal incorporouquatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início detradução para permitir clonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOhbd. Clones foramsubmetidos a seqüenciamento com primers M13 Frontal e Reverso,fornecidos como SEQ ID N° 45 e 46, respectivamente, para confirmar queos genes foram inseridos na orientação correta e para confirmar aseqüência. Primers de seqüenciamento adicionais, N5SeqF2 e N6SeqR2(vide Tabela 5), fornecidos como SEQ ID N° 51 e 52, respectivamente,foram necessários para seqüenciar completamente o produto de PCR. Aseqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) para estegene e a seqüência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidascomo SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene hbd foi transferido parao vetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerarpDEST14hbd.O vetor pDEST14hbd foi transformado em células BL21-AI ea expressão do promotor T7 foi induzida por meio de adição de arabinose,conforme descrito no Exemplo 1. Proteína com o peso molecular esperadode cerca de 31 kD conforme deduzido da seqüência de ácidos nucleicos,estava presente no cultivo induzido, mas estava ausente no controle nãoinduzido.
A atividade de hidroxibutiril-CoA desidrogenase foi determinadamedindo-se a velocidade de oxidação de NADH conforme medido pela reduçãoda absorção a 340 nm. Mistura de teste padrão continha 50 mM de MOPS, pH7,0, 1 mM de DTT e 0,2 mM de NADH. O coquetel foi equilibrado por cincominutos a 37 °C e, em seguida, adicionou-se o extrato livre de células. Reaçõesforam iniciadas pela adição do substrato, 0,1 mM de acetoacetil-CoA. Em testetípico, a atividade específica da proteína BHBD no cultivo induzido foideterminada como sendo de 57,4 pmol mg"1 min"1 em comparação com 0,885pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.Exemplo 4
Clonagem E Expressão de Crotonase
O propósito deste Exemplo foi de clonar o gene grt a partir de C.acetobutylicum (ATCC 824) e expressá-lo em E. coli. O gene crt foi amplificadoa partir de DNA genômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) utilizando PCR.
O gene crt foi clonado e expresso utilizando o método descrito noExemplo 1. O gene caí foi amplificado a partir de DNA genômico de C. acetobutylicum(ATCC 824) por meio de PCR utilizando os primers N3 e N4 (vide Tabela 4),fornecidos como SEQ ID N0 17 e 18, respectivamente, criando produto com 794 bp.O primer frontal incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códonde início de tradução para permitir a clonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOcrt. Clones foram submetidosa seqüenciamento com primers M13 Frontal e Reverso, fornecidos como SEQ ID N045 e 46, respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos na orientaçãocorreta e para confirmar a seqüência. A seqüência de nucleotídeos do quadro deleitura aberta (ORF) para este gene e sua seqüência de aminoácidos prevista sãofornecidas como SEQ ID N0 7 e SEQ ID N0 8, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene crt foi transferido para o vetorpDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerar pDEST14crt. O vetorpDEST14crt foi transformado em células BL21-AI e a expressão do promotor T7 foiinduzida por meio da adição de arabinose, conforme descrito no Exemplo 1.Proteína com o peso molecular esperado de cerca de 28 kDa, deduzida daseqüência de ácidos nucléicos, estava presente em quantidades muito maiores nocultivo induzido que no cultivo não induzido.
A atividade de crotonase foi testada conforme descrito por Stem(,Methods Enzymol. 1, 559-566 (1954)). Em teste típico, a atividade específica daproteína crotonase no cultivo induzido foi determinado como sendo de 444 μmol mg"1 min"1 em comparação com 47 pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.Exemplo 5
Clonagem ε Expressão de Butiril-CoA Desidrogenase
O propósito deste Exemplo foi de expressar a enzima butiril-CoAdesidrogenase, também denominada no presente trans-2-Enoil-CoA reductase,em E. coli. O gene CAC0462, suposto homólogo de trans-2-enoil-CoAreductase, foi clonado a partir de C. acetobutylicum (ATCC 824) e expresso emE. coli. O gene CAC0462 foi amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) utilizando PCR.
O gene CAC0462 foi clonado e expresso utilizando o métododescrito no Exemplo 1. O gene CAC0462 foi amplificado a partir de DNAgenômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando osprimers N17 e N21 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 29 e 30,respectivamente, criando produto com 1,3 kbp. O primer frontal incorporouquatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início detradução para permitir clonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen)para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TC)POCAC0462. Clones foram submetidosa seqüenciamento com primers M13 Frontal e Reverso, fornecidos como SEQID N0 45 e 46, respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridosna orientação correta e para confirmar a seqüência. Primers deseqüenciamento adicionais, N22SeqF1 (SEQ ID-N0 53), N22SeqF2 (SEQ ID N054), N22SeqF3 (SEQ ID N0 55), N23SeqR1 (SEQ ID N0 56), N23SeqR2 (SEQID N0 57) e N23SeqR3 (SEQ ID N0 58) (vide Tabela 5) foram necessários paraseqüenciar completamente o produto de PCR. A seqüência de nucleotídeos doquadro de leitura aberta (ORF) para este gene e a seqüência de aminoácidosprevista da enzima são fornecidas como SEQ ID N0 9 e SEQ ID N0 10,respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene CAC0462 foi transferidopara o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerarpDEST 14CAC0462. O vetor pDEST 14CA0462 foi transformado em célulasBL21-AI e a expressão do promotor T7 foi induzida por meio de adição dearabinose, conforme descrito no Exemplo 1. Análise por meio de SDS-PAGEnão exibiu proteína sobreexpressa com o peso molecular esperado no controlenegativo ou no cultivo induzido. O gene CAC0462 de C. acetobutylicum utilizoumuitos códons de E. coli raros. Para superar problemas com o uso de códons,o plasmídeo pRARE (Novagen) foi transformado em células BL21-AI queabrigam o vetor pDEST14CAC0462. Estudos de expressão com inibição dearabinose foram repetidos com cultivos que conduzem o vetor pRARE.Proteína com o peso molecular esperado de cerca de 46 kDa estava presenteno cultivo induzido, mas não no cultivo não induzido.
A atividade de trans-2-enoil-CoA reductase foi testada conformedescrito por Hoffmeister et al (J. Biol. Chem. 280, 4329-4338 (2005)). Em testetípico, a atividade específica da proteína TER CAC0462 no cultivo induzido foideterminada como sendo de 0,694 μιτιοΙ mg"1 min"1 em comparação com0,0128 pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.
Exemplo 6
Clonagem ε Expressão de Butiraldeído Desidrogenase (Acetilacão)
O propósito deste Exemplo foi o de clonar o gene ald de C.beijerinckii (ATCC 35702) e expressá-lo em E. coli. O gene ald foi -amplificado a partir de DNA genômico de C. beijerinckii (ATCC 35702)utilizando PCR.
O gene ald foi clonado e expresso utilizando o método descrito noExemplo 1. O gene ald foi amplificado a partir de DNA genômico de C.beijerinckii (ATCC 35702) (preparado a partir de culturas cultivadasanaerobicamente, conforme descrito no Exemplo 1) por meio de PCR utilizandoos primers N27 F1 e N28 R1 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 31 e32, respectivamente, criando produto com 1,6 kbp. O primer frontal incorporouquatro baes (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de traduçãopara permitir clonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) paragerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOald. Clones foram submetidos aseqüenciamento com primers M13 Frontal e Reverso, fornecidos como SEQ IDN0 45 e 46, respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos naorientação correta e para confirmar a seqüência. Primers de seqüenciamentoadicionais, N31SeqF2 (SEQ ID N0 59), N31SeqF3 (SEQ ID N0 60), N31SeqF4(SEQ ID N0 61), N32SeqR1 (SEQ ID N0 72), N31SeqR2 (SEQ ID N0 62),N31SeqR3 (SEQ ID N0 63), N31SeqR4 (SEQ ID N0 64) e N31SeqR5 (SEQ IDN0 65) (vide Tabela 5) foram necessários para seqüenciar completamente oproduto de PCR. A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta(ORF) para este gene e a seqüência de aminoácidos prevista da enzima sãofornecidas como SEQ ID N0 11 e SEQ ID N0 12, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene ald foi transferido parao vetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerarpDEST14ald. O vetor pDEST14ald foi transformado em células BL21-AI ea expressão do promotor T7 foi induzida por meio de adição de arabinose,conforme descrito no Exemplo 1. Proteína com o peso molecularesperado de cerca de 51 kDa, conforme deduzido da seqüência de ácidosnucléicos, estava presente no cultivo induzido, mas não no controle nãoinduzido.
Atividade de aldeído desidrogenase acilante foi determinadamonitorando-se a formação de NADH, conforme medido pelo aumento daabsorção a 340 nm, conforme descrito por Husemann et al (-App/. Microbiol.Biotechnol. 31: 435-444 (1989)). Em teste típico, a atividade específica daproteína Ald no cultivo induzido foi determinada como sendo de 0,106 pmolmg"1 min"1 em comparação com 0,01 pmol mg"1 min"1 no cultivo nãoinduzido.Exemplo 7
Clonagem ε Expressão de Butanol Desidrogenase
O propósito deste Exemplo foi o de clonar o gene bdhB de C.acetobutylicum (ATCC 824) e expressá-lo em E. coli. O gene bdhB foiamplificado a partir de DNA genômico de C. acetobutylicum (ATCC 824)utilizando PCR.
O gene bdhB foi clonado e expresso utilizando o métodoexpresso no Exemplo 1. O gene bdhB foi amplificado a partir de DNAgenômico de C. acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando osprimers N11 e N12 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N° 25 e 26,respectivamente, criando produto com 1,2 kbp. O primer frontal incorporouquatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início detradução para permitir clonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPObdhB. O códon deinício de tradução também foi alterado de "GTG" para "ATG" pelaseqüência de primers. Clones foram submetidos para seqüenciamento comprimers M13 Frontal e Reverso, fornecidos como SEQ ID N° 45 e 46,respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos naorientação correta e para confirmar a seqüência. Primers deseqüenciamentoradicionais, N11SeqF1 (SEQ ID N° 66), N11SeqF2 (SEQID N° 67), N12SeqR1 (SEQ ID N° 68) e N12SeqR2 (SEQ ID N° 69) (videTabela 5), foram necessários para seqüenciar completamente o produto dePCR. A seqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) paraeste gene e a seqüência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidascomo SEQ ID N° 13 e SEQ ID N° 14, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene bdhB foi transferidopara o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerarpDEST14bdhB. O vetor pDEST14bdhB foi transformado em células BL21-Al e induziu-se expressão do promotor T7 por meio de adição dearabinose, conforme descrito no Exemplo 1. Proteína com o pesomolecular esperado de cerca de 43 kDa, conforme deduzido da seqüênciade ácidos nucléicos, estava presente no cultivo induzido, mas não nocontrole não induzido.
A atividade de butanol desidrogenase foi determinada a partir davelocidade de oxidação de NADH conforme medido pela redução da absorçãoa 340 nm conforme descrito por Husemann e Papoutsakis, acima. Em testetípico, a atividade específica da proteína BdhB no cultivo induzido foideterminada como sendo de 0,169 pmol mg"1 min"1 em comparação com 0,022pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.
Exemplo 8
Clonagem ε Expressão de Butanol Desidrogenase
O propósito deste Exemplo foi de clonar o gene bdhA de C.acetobutylicum 824 e expressá-lo em E. coli. O gene bdhA foi amplificado apartir de DNA genômico de C. acetobutylicum 824 utilizando PCR.
O gene bdhA foi clonado e expresso utilizando o método descritono Exemplo 1. O gene bdhA foi amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum 824 por meio de PCR utilizando os primers N9 e N10 (videTabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 23 e 24, respectivamente, criandoproduto com 1,2 kbp. O primer frontal incorporou quatro bases (CACC)imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitirclonagem direcional em pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) para gerar oplasmídeo pENTRSDD-TOPObdhA. Clones, fornecidos como SEQ ID N0 45 e46, respectivamente, para confirmar que os genes foram inseridos naorientação correta e para confirmar a seqüência. Primers de seqüenciamentoadicionais, N9SeqF1 (SEQ ID N0 70) e N10SeqR1 (SEQ ID N0 71) (vide Tabela5), foram necessários para seqüenciar completamente o produto de PCR. Aseqüência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) para este gene ea seqüência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidas como SEQ IDN0 15 e SEQ ID N0 16, respectivamente.
Para criar clone de expressão, o gene bdhA foi transferido para ovetor pDEST 14 (Invitrogen) por meio de recombinação para gerarpDEST14bdhA. O vetor pDESTbdhA foi transformado em células BL21-AI e aexpressão do promotor T7 foi induzida por meio de adição de arabinose,conforme descrito no Exemplo 1. Proteína com o peso molecular esperado decerca de 43 kDa, conforme deduzido da seqüência de ácidos nucléicos, estavapresente no cultivo induzido, mas não no controle não induzido.
A atividade de butanol desidrogenase foi determinada a partir da taxade oxidação de NADH conforme medido pela redução da absorção a 340 nm,conforme descrito por Husemann e Papoutsakis, acima. Em teste típico, a atividadeespecífica da proteína BdhA no cultivo induzido foi determinada como sendo de 0,102pmol mg"1 min"1 em comparação com 0,028 pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.
Exemplo 9
Construção de Vetor de Transformação para os Genes na viaBiossintética de 1-butanol - processo inferior
Para construir vetor de transformação que compreende os genes quecodificam as seis etapas da via biossintética de 1-butanol, os genes que codificamas seis etapas do processo foram divididos em dois operadores. O processosuperior compreende as primeiras quatro etapas catalisadas por acetil-CoAacetiltransferase, 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, crotonase e butiril-CoAdesidrogenase. O processo inferior compreende as duas últimas etapas, catalisadaspor butiraldeído desidrogenase e butanol desidrogenase.
O propósito deste Exemplo foi o de construir o operador de processoinferior. A construção do operador de processo superior é descrita no Exemplo 10.
Os genes individuais foram amplificados por meio de PCR comprimers que incorporaram locais de restrição para clonagem posterior e os primersfrontais continham local de união de ribossomos de E. coli otimizado (AAAGGAGG).Os produtos de PCR foram clonados por TOPO no vetor pCR 4Blunt-T0P0 etransformados em células TopIO de E. coli (Invitrogen). DNA de plasmídeo foipreparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dos genes foi verificada.Enzimas de restrição e T4 DNA Iigase (New England Biolabs, Beverly MA) foramutilizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Para experimentos declonagem, fragmentos de restrição foram purificados por meio de eletroforese de gelutilizando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen).
Após a confirmação da seqüência, os genes foram subclonados emvetor pUC19 modificado como plataforma de clonagem. O vetor pUC19 foimodificado por meio de digestão de Hindlll/Sapl, criando pUC19dHS. O digeridoremoveu o promotor de Iac adjacente ao MCS (local de clonagem múltipla),evitando a transcrição dos operadores no vetor.
O gene ald foi amplificado a partir de DNA genômico de C. beijerinckiiATCC 35702 por meio de PCR utilizando os primers N58 e N59 (vide Tabela 4),fornecidos como SEQ ID N0 41 e 42, respectivamente, criando produto de 1,5 kbp. Oprimer frontal incorporou os locais de restrição Aval e BstEII e RBS (local de união deribossomos). O primer reverso incorporou os locais de restrição Aval e BstEII e RBS(local de união de ribossomos). O primer reverso incorporou o local de restrição deHpal. O produto de PCR foi clonado em pCRBIunt II-TOPO criando pCRBIuntll-ald.DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dosgenes foi verificada com os primers M13 Frontal (SEQ ID N0 45), M13 Reverso (SEQID N0 46), N31SeqF2 (SEQ ID N0 59), N31SeqF3 (SEQ ID N0 60), N31SeqF4 (SEQID N0 61), N32SeqR1 (SEQ ID N0 72), N31SeqR2 (SEQ ID N0 62), N31SeqR3 (SEQID N0 63), N31 SeqR4 (SEQ ID N0 64) e N31SeqR5 (SEQ ID N0 65) (vide Tabela 5).
O gene bdhB foi amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando os primers N64 e N65(vide Tabela 4) fornecidos como SEQ ID N0 43 e 44, respectivamente, criandoproduto de 1,2 kbp. O primer frontal incorporou local de restrição de Hpal e RBS.O primer reverso incorporou local de restrição de Pmel e Sphl. O produto de PCRfoi clonado em pCRBIunt II-TOPO criando pCRBIuntll-bdhB. DNA de plasmídeo foipreparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dos genes foi verificadacom os primers M13 Frontal (SEQ ID N0 45), M13 Reverso (SEQ ID N0 46),N11 SeqFI (SEQ ID N0 66), N11SeqF2 (SEQ ID N0 67), N12SeqR1 (SEQ ID N068) e N12SeqR2 (SEQ ID N0 69) (vide Tabela 5).
Para construir o operador de processo inferior, fragmento de Hpale Sphl de 1,2 kbp de pCRBIuntll-bdhB, fragmento de Sphl e Hpal de 1,4 kbp depCRBIuntll-ald e o fragmento grande de digestão de Aval e Sphl de pUC19dHSforam ligados entre si. A ligação de três vias criou pUC19dHS-ald-bdhB.
O vetor pUC19dHS-ald-bdhB foi digerido com BstEII e Pmel, liberandofragmento de 2,6 kbp que foi clonado em pBenBP, vetor de impulso de E. coli eBacillus subtilis. O plasmídeo pBenBP foi criado por meio de modificação do vetorpBE93, que é descrito por Nagarajan, WO 93/24631 (Exemplo 4). O promotor deprotease neutra de Bacillus amyloliquefaciens (NPR), seqüência de sinais e o genephoA foram removidos de pBE93 com digestão de Ncol/Hindlll. O promotor de NPRfoi amplificado por PCR a partir de pBE93 pelos primers BenF e BenBPR, fornecidospor SEQ ID N0 73 è 75, respectivamente. O primer BenPBR incorporou os locaisBstEII, Pmel e Hindlll abaixo no fluxo do promotor. O produto de PCR foi digeridocom Ncol e Hindlll e o fragmento foi clonado nos locais correspondentes no vetorpBE93 para criar pBenBP. O fragmento operador inferior foi subclonado nos locaisBstEII e Pmel em pBenBP, criando pBen-ald-bdhB.
Testes de atividade de butiraldeído desidrogenase e butanoldesidrogenase foram conduzidos sobre extratos brutos utilizando os métodosdescritos acima. As atividades das duas enzimas foram demonstradas emníveis acima da linhagem controle que continha vetor vazio.Exemplo 10 (Profético)Construção de Vetor de Transformação para os Genes na via
biossintética de 1-butanol - processo superior
O propósito deste Exemplo profético é o de descrever comomontar o operador de processo superior. A abordagem geral é a mesmadescrita no Exemplo 9.
O gene thIA é amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N44 eN45 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 33 e 34, respectivamente,criando produto de 1,2 kbp. O primer frontal incorpora local de restrição de Sphle local de união de ribossomos (RBS). O primer reverso incorpora locais derestrição de Ascl e Pstl. O produto de PCR é clonado em pCR4 Blunt-TOPO,criando pCR4 Blunt-TOPO-thIA. DNA de plasmídeo é preparado a partir dosclones de TOPO e a seqüência dos genes é verificada com os primers M13Frontal (SEQ ID N0 45), M13 Reverso (SEQ ID N0 46), N7SeqF1 (SEQ ID N047) e N7SeqR1 (SEQ ID N0 48) (vide Tabela 5).
O gene hbd é amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N42 eN43 (vide Tabela 4) fornecidos como SEQ ID N0 35 e 36, respectivamente,criando produto de 0,9 kbp. O primer frontal incorpora local de restrição de Salle RBS. O primer reverso incorpora local de restrição de SphI. O produto dePCR é clonado em pCR4 Blunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-hbd. DNA deplasmídeo é preparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dos genesverificada com primers M13 Frontal (SEQ ID N0 45), M13 Reverso (SEQ ID N046), N5SeqF2 (SEQ ID N0 51) e N6SeqR2 (SEQ ID N0 52) (vide Tabela 5).
O gene CAC0462 é otimizado por códons para expressão em E.coli como hospedeiro primário e B. subtilis como hospedeiro secundário. Ogene novo denominado CaTER, fornecido como SEQ ID N0 76, é sintetizadopela Genscript Corp. (Piscataway NJ). O gene CaTER é clonado no vetorpUC57 na forma de fragmento de BamHI-SaII e inclui RBS1 produzindo oplasmídeo pUC57-CaTER.
O gene crt é amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N38 eN39 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID N0 39 e 40, respectivamente,criando produto de 834 bp. O primer frontal incorpora locais de restrição deEcoRI e Mlul e RBS. O primer reverso incorpora local de restrição de BamHI. Oproduto de PCR é clonado em pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 BIunt-TOPO-crt. O DNA de plasmídeo é preparado a partir dos clones de TOPO e aseqüência dos genes é verificada com os primers M13 Frontal (SEQ ID N0 45)e M13 Reverso (SEQ ID N0 46) (vide Tabela 5).
Após a confirmação da seqüência, os genes são subclonados emvetor pUC19 modificado como plataforma de clonagem. O vetor pUC19 foimodificado por digestão de Sphl/Sapl, criando pUC19dSS. O digerido removeuo promotor de Iac adjacente ao MCS1 de forma a evitar a transcrição dosoperadores no vetor.
Para construir o processo superior, o operador pCR4 Blunt-TOPO-crt é digerido com EcoRI e BamHI, liberando fragmento de crt com 0,8kbp. O vetor pUC19dSS também é digerido com EcoRI e BamHI liberandofragmento de vetor com 2,0 kbp. O fragmento de crt e o fragmento de vetor sãoligados entre si utilizando T4 DNA Iigase (New England Biolabs) para formarpUC19dSS-crt. O gene CaTER é inserido em pCU19dSS-crt por meio de digestãode pUC57-CaTER com BamHI e Sall, liberando fragmento de CaTER com 1,2 kbp.O pUC19dSS-crt é digerido com BamHI e Sall e o fragmento de vetor grande éligado com o fragmento de CaTER, criando pUC19dSS-crt-CaTER. Para completaro operador, fragmento de Sall e Sphl com 884 bp de pCR4 Blunt-TOPO-hbd,fragmento de Sphl e Pstl thIA de 1,2 kb de pCR4 Blunt-TOPO-thIA e o fragmentogrande de digestão de Sall e Pstl de pUC19dSS-crt-CaTER são ligados. O produtoda ligação de três vias é pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA.
O vetor pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA é digerido com Mlul eAscl liberando fragmento com 4,1 kbp que é clonado em derivado de pBE93(Caimi, WO 2004/018645, págs. 39-40), vetor de impulso de E. colieB. subtilis,denominado pBenMA. O plasmídeo pBenMA foi criado por meio demodificação do vetor de pBE93. O promotor de protease neutra (NPR) deBacillus amyloliquefaciens, seqüência de sinais e o gene phoA são removidosde pBE93 com digestão de Ncol/HindIII. O promotor de NPR é amplificado porPCR a partir de pBE93 pelos primers BenF e BenMAR, fornecidos como SEQID N0 73 e 74, respectivamente. O primer BenMAR incorpora os locais Mlul,Ascl e HindIII abaixo no fluxo do promotor. O produto de PCR foi digerido comNcol e HindIII e o fragmento é clonado nos locais correspondentes no vetorpBE93, criando pBenMA. O fragmento de operador superior é subclonado noslocais Mlul e Ascl em pBenMA, criando pBen-crt-hbd-CaTER-thIA.
Exemplo 11 (Profético)Expressão da via biossintética de 1-Butanol em e. coli
O propósito deste Exemplo profético é o de descrever comoexpressar a via biossintética de 1-butanol em E. coli.
Os plasmídeos pBen-crt-hbd-CaTER-thIA e pBen-ald-bdhB,construídos conforme descrito nos Exemplos 10 e 9, respectivamente, sãotransformados em E. coli NM522 (ATCC 47000) e a expressão dos genes emcada operador é monitorada por meio de análise SDS-PAGE, teste de enzimase análise Western. Para Westerns, anticorpos são elevados para peptídeossintéticos por meio de Sigma-Genosys (The Woodlands, TX). Apósconfirmação da expressão de todos os genes, pBen-ald-bdhB é digerido comEcoRI e Pmel para liberar o fragmento de ald-bdhB-promotor de NPR. Adigestão de EcoRI do fragmento possui extremidades obtusas utilizando ofragmento Klenow de DNA polimerase (New England Biolabs, catálogo n°M0210S). O plasmídeo pBen-crt-hbd-CaTER-thIA é digerido com Pvull paracriar fragmento de vetor com extremidades obtusas linearizado. O vetor e ofragmento de NPR-ald-bdhB são ligados, criando p1B1 0.1 e p1B1 0.2, quecontêm a via biossintética de 1-butanol completo com o fragmento de ald-bdhBpromotor de NPR em orientações opostas. Os plasmídeos p1B1 0.1 e p1B10.2 são transformados em E. coli NM522 e a expressão dos genes émonitorada conforme descrito anteriormente.
E. coli linhagem NM522/p1B1 0.1 ou NM522/p1B1 0.1 éinoculado em frasco de agitação de 250 mL contendo 50 mL de meio e agitadoa 250 rpm e 35 °C. O meio é composto de dextrose, 5 g/l; MOPS, 0,05 M;sulfato de amônio, 0,01 M; fosfato de potássio, monobásico, 0,005 M; misturade metais S10, 1% (v/v); extrato de levedura, 0,1% (p/v); casamino ácidos,0,1% (p/v); tiamina, 0,1 mg/L; prolina, 0,05 mg/L; e biotina, 0,002 mg/L, e étitulado até pH 7,0 com KOH. Mistura de metais S10 contém: MgCI2, 200 mM;CaCl2, 70 mM; MnCI2, 5 mM; FeCI3, 0,1 mM; ZnCI2, 0,1 mM; cloridrato detiamina, 0,2 mM; CuSO4, 172 μΜ; CoCI2, 253 μΜ; e Na2MoO4, 242 μΜ. Apósdezoito a 24 horas, 1-butanol é detectado por meio de análise HPLC ou GC,conforme descrito no capítulo Métodos Gerais.
Exemplo 12 (Profético)
Expressão da via biossintética de 1-Butanol em Bacillus subtilis
O propósito deste Exemplo profético é o de descrever comoexpressar a via biossintética de 1-butanol em Bacillus subtilis. É utilizada amesma abordagem descrita no Exemplo 11.
São utilizados os operadores superior e inferior construídosconforme descrito nos Exemplos 10 e 9, respectivamente. Os plasmídeos p1B10.1 e p1B1 0.2 são transformados em Bacillus subtilis BE1010 (J. Bacteriol.173: 2278-2282 (1991)) e a expressão dos genes em cada operador émonitorada conforme descrito no Exemplo 11.
B. subtilis linhagem BE1010/p1B1 0.1 ou BE1010/p1B1 0.2 éinoculado em frasco de agitação de 250 ml_ que contém 50 ml_ de meio e agitado a250 rpm e 35 0C por dezoito horas. O meio é composto de: dextrose, 5 g/l; MOPS10,05 M; ácido glutâmico, 0,02 M; sulfato de amônio, 0,01 M; fosfato de potássio,tampão monobásico, 0,005 M; mistura de metais S10 (conforme descrito noExemplo 11), 1% (v/v); extrato de levedura, 0,1% (p/v); casaminoácidos, 0,1% (p/v);triptofano, 50 mg/L; metionina, 50 mg/L; e lisina, 50 mg/L, e é titulado até pH 7,0com KOH. Após dezoito a 24 horas, 1-butanol é detectado por meio de análiseHPLC ou GC, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais.
Exemplo 13
Produção de 1-Butanol a Partir de Glicose utilizando e. coli
Recombinante
Este Exemplo descreve a produção de 1-butanol em E. coli. Aexpressão dos genes que codificam as seis etapas da via biossintética de 1-butanol foi dividida em três operadores. O processo superior compreendeu asquatro primeiras etapas codificadas por thIA, hbd, crt e EgTER em umoperador. A etapa a seguir, codificada por a/d, foi fornecida por segundooperador. A última etapa do processo, codificada por yqhD, foi fornecida emterceiro operador. A produção de 1-butanol foi demonstrada em linhagens de E.coli que compreendem os três operadores.
A menos que indicado em contrário no texto, os primers declonagem descritos neste Exemplo são indicados pelo seu SEQ ID N0 naTabela 4 e os primers de seleção de PCR e seqüenciamento são indicadospelo seu SEQ ID N0 na Tabela 5.
Acetil-CoA acetiltransferase
O gene thIA foi amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N44 eΝ45 (vide Tabela 4), fornecidos como SEQ ID Nº 33 e 34, respectivamente,criando produto com 1,2 kbp. O primer frontal incorporou local de restrição de Sphle local de união de ribossomos (RBS). O primer reverso incorporou locais derestrição Ascl e Pstl. O produto de PCR foi clonado em pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad CA), criando pCR4Blunt-TOPO-thlA. DNA de plasmídeofoi preparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dos genes foi verificadacom os primers M13 Frontal (SEQ ID Nº 45), M13 Reverso (SEQ ID Nº 46),N7SeqF1 (SEQ ID Nº 47) e N7SeqR1 (SEQ ID Nº 48) (vide Tabela 5).
3-Hidroxibutiril-CoA desidrogenase O gene hbdfo\ amplificado a partir de DNA genômico de C.acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N42 eN43 (vide Tabela 4) fornecido como SEQ ID Nº 35 e 36, respectivamente, criandoproduto com 0,9 kbp. O primer frontal incorporou local de restrição de Sall e RBS. Oprimer reverso incorporou local de restrição de Sphl. O produto de PCR foi clonado em pCR4Blunt-TOPO criando pCR4Blunt-TOPO-hbd. DNA de plasmídeo foipreparado a partir dos clones de TOPO e a seqüência dos genes foi verificada comos primers M13 Frontal (SEQ ID Nº 45), M13 Reverso (SEQ ID Nº 46), N5SeqF2(SEQ ID Nº 51) e N6SeqR2 (SEQ ID Nº 52) (vide Tabela 5).
Crotonase
O gene crt foi amplificado a partir de DNA genômico de C.
acetobutylicum (ATCC 824) por meio de PCR utilizando o par de primers N38 eN39 (vide Tabela 4), fornecido como SEQ ID Nº 39 e 40, respectivamente,criando produto com 834 bp. O primer frontal incorporou locais de restriçãoEcoRI e Mlul e RBS. O primer reverso incorporou local de restrição de BamHI. O produto de PCR foi clonado em pCR4Blunt-TOPO, criando pCR4Blunt-TOPO-crt. DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones de TOPO e aseqüência dos genes foi verificada com os primers M13 Frontal (SEQ ID Nº 45)e M13 Reverso (SEQ ID Nº 46) (vide Tabela 5).Butiril-CoA desidrogenase (trans-2-enoil-CoA reductase)
O gene CAC0462 foi sintetizado para uso de códons aprimoradoem E. coli como hospedeiro primário e B. subtilis como hospedeiro secundário.O gene novo (CaTER, SEQ ID ºN 76) foi sintetizado e clonado pela GenscriptCorporation (Piscataway NJ) no vetor pUC57 na forma de fragmento deBamHI-SaII e inclui RBS.
Gene alternativo para butiril-CoA desidrogenase de Euglenagracilis (TER, GenBank n° Q5EU90) foi sintetizado para uso de códonsaprimorado em E. coli e Bacillus subtilis. O gene foi sintetizado e clonado pelaGenScript Corporation em pUC57 criando pUC57::EgTER. Os primers N85 eN86 (SEQ ID N0 80 e 81, respectivamente), junto com pUC57::EgTER comoDNA modelo, forneceram fragmento de PCR que compreende 1224 bp depUC57::EgTER DNA. A seqüência de 1224 bp é fornecida como SEQ ID N0 77,em que bp 1-1218 é a seqüência de codificação (cds) de EgTER(opt).EgTER(opt) é gene TER otimizado por códons, que não contém a seqüênciaprévia mitocôndrica normal para que seja funcional em E. coli (Hoffmeister etal, J. Bioi Chem. 280: 4329 (2005)).
EgTER(opt) foi clonado em pCR4Blunt-TOPO e a sua seqüênciafoi confirmada com os primers M13 Frontal (SEQ ID Nº 45) e M13 Reverso(SEQ ID Nº 46). Os primers de seqüenciamento adicionais N62SeqF2 (SEQ ID N0114), N62SeqF3 (SEQ ID Nº 115), N62SeqF4 (SEQ ID Nº 116), N63SeqR1 (SEQID N0 117), N63SeqR2 (SEQ ID N0 118), N63SeqR3 (SEQ ID Nº 119) e N63SeqR4(SEQ ID Nº 120) foram necessários para seqüenciar completamente o produto dePCR. A seqüência EgTER(opt) com 1,2 kbp foi extirpada em seguida com HincW ePmel e clonada em pET23+ (Novagen) Iinearizado com HincW. Orientação do geneEgTER(opt) para o promotor foi confirmada por meio de seleção de PCR de colôniacom os primers Primer T7 e N63SeqR2 (SEQ ID N0 82 e 118, respectivamente). Oplasmídeo resultante, pET23+::EgTER(opt), foi transformado em BL21 (DE3)(Novagen) para estudos de expressão.
A atividade de trans-2-enoil-CoA reductase foi testada conformedescrito por Hoffmeister et al, J. Biol. Chem. 280: 4329 (2005). Em teste típico,determinou-se que a atividade específica da proteína EgTER(opt) no cultivoinduzido de BL21 (DE3)/pET23+::EgTER(opt) é de 1,9 pmol mg"1 min"1 emcomparação com 0,547 pmol mg"1 min"1 no cultivo não induzido.
O gene EgTER(opt) foi clonado em seguida no vetor pTrc99a sobo controle do promotor de trc. O gene EgTER(opt) foi isolado na forma de fragmentode BamHI/SalI com 1287 bp a partir de pET23+::EgTER(opt). O vetor pTrc99a com4,2 kpb foi Iinearizado com BamHI/SalI. O vetor e o fragmento foram ligados criandoo pTrc99a-EgTER(opt) com 5,4 kbp. Clones positivos foram confirmados por meiode PCR de colônia com os primers Trc99aF e N63SeqR3 (SEQ ID N0 83 e 119,respectivamente), gerando produto com 0,5 kb.
Construção de plasmídeo pTrc99a-E-C-H-T que compreende genes quecodtflcam acetil-CoA acetiltransferase (thlA), 3-hidroxibutiril-CoAdesidrogenase íhbd). crotonase (cr71 e butiril-CoA desidrogenase (trans-2-enoil-CoA reductase. EgTER(opt))
Para iniciar a construção de operador de quatro genes quecompreende o processo superior (EgTER(opt), crt, hbd e thlA), pCR4Blunt-TOPO-crt foi digerido ct»m EcoRI e BamHI, liberando fragmento crt com 0,8kbp. O vetor pUC19dSS (descrito no Exemplo 10) também foi digerido comEcoRI e BamHI, liberando fragmento de vetor com 2,0 kbp. O fragmento crt e ofragmento de vetor foram ligados entre si utilizando T4 DNA Iigase (NewEngland Biolabs) para formar pUC19dSS-crt. O gene CaTER foi inserido empUC19dSS-crt por meio de digestão de pUC57-CaTER com BamHI e Sall,liberando fragmento de CaTER com 1,2 kbp. O pUC19dSS-crt foi digerido comBamHI e Sall e o fragmento de vetor grande foi ligado ao fragmento de CaTER,criando pUC19dSS-crt-CaTER. Para completar o operador, fragmento de Sall eSphl com 884 bp de pCR4Blunt-TOPO-hbd, fragmento de Sphl e Pstl thIA com1,2 kb de pCR4Blunt-TOPO-thlA e o fragmento grande de digestão Sall e Pstlde pl)C19dSS-crt-CaTER foram ligados. O produto da ligação de três vias foidenominado pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA ou pUC19dss::Operador 1.
A atividade de butiril-CoA desidrogenase superior foi obtida a
partir de pTRc99a-EgTER(opt) e não de construções de CaTER e, desta forma,foi construído operador derivado de pTrc99a-EgTER(opt). O gene CaTER foiremovido de pUC19dss::Operador 1 por meio de digestão com BamHI/Sall epurificação com gel do fragmento de vetor de 5327 bp. O vetor foi tratado comKlenow e novamente ligado, criando pUC19dss::Operador 1 ACaTer. O fragmentode crt-hbd-thIA (C-H-T) com 2934 bp foi isolado em seguida na forma de fragmentode EcoRI/Pstl a partir de pUC19dss:Operador 1 ∆CaTer. O fragmento de C-H-T foitratado com Klenow para tornar as extremidades obtusas. O vetor pTrc99a-EgTER(opt) foi digerido com Sall e as extremidades foram tratadas com Klenow. Ovetor com extremidades obtusas e o fragmento de C-H-T com extremidadesobtusas foram ligados para criar pTrc99a-E-C-H-T. Reações de PCR de colôniaforam realizadas com os primers N62SeqF4 e N5SeqF4 (SEQ ID N° 116 e 84,respectivamente) para confirmar a orientação do inserto.
Construção de plasmídeos pBHRT7-ald ε pBHR-Ptrc-ald(opt) que
COMPREENDEM GENES QUE CODIFICAM BUTIRALDEIDO DESIDROGENASE(ALD EALD(OPT))
O operador PT7-ald foi subclonado a partir de pDEST14-ald(Exemplo 6) no plasmídeo pBHR1 com ampla faixa de hospedeiros (MoBitec,Goettingen, Alemanha) para criar pBHR1 PT7-ald. O plasmídeo pBHR1 écompatível com os plasmídeos pUC19 ou pBR322, de forma que pBHR1 PT7-ald possa ser utilizado em combinação com derivados de pUC19 ou pBR322que conduzem o operador de processo superior para a produção de 1-butanolem E. coli. O plasmídeo de pDEST14-ald foi digerido com Bgl Il e tratado com ofragmento Klenow de DNA polimerase para elaborar extremidades obtusas. Oplasmídeo foi digerido em seguida com EcoRI e fragmento de PT7-ald com2245 bp foi purificado com gel. O plasmídeo pBHR1 foi digerido com Scal eEcoRI e o fragmento com 4883 bp foi purificado com gel. O fragmento de PT7-ald foi ligado ao vetor pBHR1, criando pBHR T7-ald. Amplificação por PCR decolônia de transformadores com os primers T-ald (BamHI) e B-ald (EgTER)(SEQ ID N0 85 e 86, respectivamente) confirmou o produto de PCR com 1,4 kb.Mapeamento por restrição de clones pBHR T7-ald com EcoRI e Drdl confirmouos fragmentos de 4757 e 2405 bp esperados.
Para testes de atividade de butiraldeído desidrogenase, o plasmídeopBHR T7-ald foi transformado em células BL21Star® (DE3) (Invitrogen) e aexpressão do promotor T7 foi induzida por meio de adição de L-arabinose conformedescrito no Exemplo 1. A atividade de aldeído desidrogenase acilante foideterminada monitorando-se a formação de NADH, conforme medido pelo aumentoda absorção a 340 nm, conforme descrito no Exemplo 6.
Seqüência de DNA alternativa para o gene ald de Clostridiumbeijerinckii ATCC 35702 foi sintetizada (otimizando para uso do códon em E.coli e Bacillus subtilis) e clonada em pUC57 pela GenScript Corporation(Piscataway NJ), criando o plasmídeo pUC57-ald(opt). pUC57-ald(opt) foidigerido com Sacl e Sall para liberar fragmento de 1498 bp que compreende ogene otimizado por códons, ald(opt) e RBS já para E. coli. A seqüência dofragmento de 1498 bp é fornecida como SEQ ID N° 78.
pTre99a foi digerido com Sacl e Sall, gerando fragmento de vetorde 4153 bp, que foi ligado ao fragmento a/d(opt) de 1498 bp para criar pTrc-ald(opt). A expressão do gene sintético, a/d(opt), encontra-se sob o controle dopromotor de Ptrc indutível por IPTG.
O operador Ptrc-ald(opt) foi subclonado no plasmídeo com amplafaixa de hospedeiros pBHR1 (MoBitec), para que seja compatível com oplasmídeo de processo superior descrito acima. O fragmento de Ptrc-ald(opt)foi amplificado por PCR a partir de pTrc99A::ald(opt) com T-Ptrc(BspEI) e B-aldopt(Scal) (SEQ ID N0 87 e 88, respectivamente), incorporando locais derestrição de BspEI e Scal nos primers correspondentes. O produto de PCR foidigerido com BspEI e Seal. O plasmídeo pBHR1 foi digerido com Scal e BspEIe o fragmento de 4883 bp foi purificado com gel. O fragmento de Ptrc-ald{opt)foi ligado ao vetor pBHR1, criando pBHR-PcatPtrc-ald(opt). Mapeamento derestrição dos clones pBHR-PcatPtrc-ald(opt) com Scal e BspEI confirmou osfragmentos de 4883 e 1704 bp esperados. Para remover a região promotoracat originária de plasmídeo (Pcat), o plasmídeo pBHR-PcatPtrc-ald(opt) foidigerido com BspEI e Aatll e o fragmento de 6172 bp foi purificado com gel. T-BspEIAatII e B-BspEIAatII (SEQ ID N0 89 e 90, respectivamente) forammisturados em solução que contém 50 mM de NaCI1 10 mM de Tris-HCI e 10mM de MgCI2 (pH 7,9) até concentração final de 100 μΜ e hibridizados pormeio de incubação a 75°C por cinco minutos e lento resfriamento àtemperatura ambiente. Os oligonucleotídeos hibridizados foram ligados aofragmento de 6172 bp, criando pBHR-Ptrc-ald(opt).
Construção de linhagens de e. coli que expressam butanol desidrogenaseIyqhD)
E. coli contém gene nativo (yqhD) que foi identificado como 1,3-propanodiol desidrogenase (Patente Norte-Americana n° 6.514.733). O geneyqhD possui 40% de identidade para o gene adhB em Clostridiuim, provávelbutanol desidrogenase dependente de NADH. O gene yqhD foi colocado sob aexpressão constitutiva de variante do promotor de glicose isomerase 1.6GI(SEQ ID N0 91) em E. coli linhagem MG1655 1.6yqhD::Cm (WO 2004/033646)utilizando tecnologia Vermelho λίϋβίεβηΚο e Wanner1 Proc. Nati Acad. Sei. U.S. A. 97: 6640 (2000)). De forma similar, o promotor nativo foi substituído pelopromotor 1.5GI (WO 2003/089621) (SEQ ID N0 92), criando a linhagemMG1655 1.5GI-yqhD::Cm, de forma a substituir o promotor 1.6GI de MG16551.6yqhD::Cm com o promotor 1.5GI.
Lisato de P1 foi preparado a partir de MG1655 1.5GI yqhD::Cm eo conjunto moveu-se para linhagens de expressão, MG1655 (DE3), preparadasa partir de linhagem de E. coli MG1655 e kit de lisogenização Iambda DE3(Invitrogen) e BL21 (DE3) (Invitrogen) criando MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cme BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm, respectivamente.
Demonstração da produção de 1-butanol a partir de E. coli recombinante
E. coli linhagem MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm foi transformadocom plasmídeos pTrc99a-E-C-H-T e pBHR T7-ald para produzir a linhagem,MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald. Dois isoladosindependentes foram cultivados inicialmente em meio LB que contém 50 μg/mL de canamicina e 100 pg/mL de carbenicilina. As células foram utilizadaspara inocular frascos de agitação (volume total de cerca de 175 mL) contendo15, 50 e 150 mL de meio TM3a/glicose (com antibióticos apropriados) pararepresentar condições de alto, médio e baixo oxigênio, respectivamente. Meiode TM3a/glicose continha (por litro): 10 g de glicose, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 gde monoidrato de ácido cítrico, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g de MgS04-7H20, 0,2g de CaCI2-2H20, 0,33 g de citrato de amônio férrico, 1,0 mg de tiamina-HCI,0,50 g de extrato de levedura e 10 mL de solução de elementos de traço,ajustados a pH 6,8 com NH4OH. A solução de elementos de traço continha:ácido CitriCo H2O (4,0 g/l), MnSO4 H2O (3,0 g/l), NaCI (1,0 g/L), FeS04-7H20(0,10 g/L), CoCI2-6H20 (0,10 g/L), ZnSO4TH2O (0,10 g/L), CuSO4 SH2O (0,010g/L), H3BO3 (0,010 g/L) e Na2Mo04-2H20 (0,010 g/L). Os frascos foraminoculados a OD6oo inicial < 0,01 unidades e incubados a 34 0C com agitação a300 rpm. Os frascos contendo 15 e 50 mL de meio foram tampados comtampas ventiladas; os frascos contendo 150 mL foram tampados com tampasnão ventiladas para minimizar a troca de ar. Adicionou-se IPTG atéconcentração final de 0,04 mM; Οϋβοο dos frascos no momento da adição foi £0,4 unidades.
Cerca de quinze horas após a indução, parcela do caldo foianalisada por meio de HPLC (coluna de Açúcar Shodex SH1011) comdetecção de índice de refração (RI) e GC (coluna CB Varian CP-WAX 58(FFAP), 25 m χ diâmetro interno de 0,25 mm χ espessura de filme de 0,2μm) com detecção de ionização de chama (FID) para determinar o teor de1-butanol, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais. Os resultadosdas determinações de 1-butanol são fornecidos na Tabela 6.
Tabela 6
Produção de 1-Butanol por e. coli Linhagem MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald
<table>table see original document page 73</column></row><table>
Os valores foram determinados por meio de análise HPLC.
Os sufixos de linhagens "a" e "b" indicam isoladosindependentes.
Os dois isolados independentes de MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald foram testados para determinar aprodução de 1-butanol de maneira idêntica, exceto pelo fato de que o meiocontinha 5 g/l de extrato de levedura. Os resultados são exibidos na Tabela 7.73
Tabela 7
Produção de 1-Butanol por e. cou Linhagem MG1655 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHRT7-ald
<table>table see original document page 74</column></row><table>
Valores quantitativos foram determinados por meio de análise HPLC."-" = não detectado.
Os sufixos de linhagem "a" e "b" indicam isolados independentes.E. coli linhagem BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD::Cm foi transformado com osplasmídeos pTrc99a-E-C-H-T e pBHR T7-ald para produzir a linhagem, BL21 (DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald. Dois isolados independentesforam testados para determinar a produção de 1-butanol exatamente conformedescrito acima. Os resultados são fornecidos nas Tabelas 8 e 9.
Tabela 8
Produção de 1-Butanol por e. cou Linhagem BL21 (DE3) 1.5GI-yqhD: :Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald
<table>table see original document page 74</column></row><table>Valores quantitativos foram determinados por meio de análiseHPLC.
"-" indica não detectado.
"+" indica identificação qualitativa positiva por GC com limite dedetecção mais baixo que com HPLC.
Os sufixos de linhagem "a" e "b" indicam isolados independentes.
Tabela 9
Produção de 1-Butanol por E. cou Linhagem BL21 (DE3) 1.5GI-yqh D:: Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBH R T7-ald
<table>table see original document page 75</column></row><table>
Valores quantitativos foram determinados por meio de análiseHPLC.
"-" indica não detectado.
"+" indica identificação qualitativa positiva por meio de GC comlimite de detecção inferior a HPLC.
Os sufixos de linhagem "a" e "b" indicam isolados independentes.
E. coli linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm foi transformado complasmídeos pTrc99a-E-C-H-T e pBHR-Ptrc-ald(opt) para produzir a linhagemMG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt). Dois isoladosforam cultivados inicialmente em meio LB contendo 50 μg/mL de canamicina e100 μg/mL de carbenicilina. As células foram utilizadas para inocular frascos deagitação (volume total de cerca de 175 mL) contendo 50 e 150 mL de meio deTM3a/glicose (com antibióticos apropriados). Os frascos foram inoculados emOD550 inicial de < 0,04 unidades e incubados conforme descrito acima, com e semindução. Adicionou-se IPTG até concentração final de 0,4 mM; OD550 dos frascosno momento da adição foi de 0,6 a 1,2 unidades. Neste caso, a indução não foinecessária para expressão genética do processo de 1-butanol devido à falta depromotores indutíveis de IPTG e à natureza constitutiva do promotor 1.5GI;indução forneceu, entretanto, faixa de expressão mais ampla.
Cerca de quinze horas após a indução, parcela do caldo foi analisadapor meio de GC com detecção de ionização de chama para teor de 1-butanol,conforme descrito acima. Os resultados são fornecidos na Tabela 10. Para aslinhagens de E. coli recombinantes, 1-butanol foi produzido em todos os casos; emexperimentos separados, demonstrou-se que linhagens de E. coli do tipo selvagemnão produzem 1-butanol detectável (dados não exibidos).
Tabela 10
Produção de 1-Butanol porE. coli Linhagem MG1655 1.5GI-YQHD::Cm/pTRC99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)
<table>table see original document page 76</column></row><table>
Os sufixos de linhagem "a" e "b" indicam isolados separados.Exemplo 14
Produção de 1 -Butanol a Partir de Glicose Utilizando b. subtilisRecombinante
Este Exemplo descreve a produção de 1-butanol em Bacillussubtilis. Os seis genes da via biossintética, que codificam seis atividades deenzimas, foram divididos em dois operadores para expressão. Os trêsprimeiros genes do processo (thl, hbd e c/f) foram integrados ao cromossomode Bacillus subtilis BE1010 (Payne e Jackson1 J. Bacterioi 173: 2278-2282(1991)). Os últimos três genes (EgTER, ald e bdhB) foram clonados emplasmídeo de expressão e transformados na linhagem de Bacillus que conduzos genes de 1-butanol integrados.
A menos que indicado em contrário no texto, os primers declonagem descritos neste Exemplo são indicados pelo seu SEQ ID N0 naTabela 4 e os primers de seleção de PCR e seqüenciamento são indicadospelo seu SEQ ID N0 na Tabela 5.
Plasmídeo de integração
O plasmídeo pFP988 é vetor de integração de Bacillus que contémréplica de E. coli de pBR322, marcador de antibiótico ampicilina para seleção em £coli e duas seções de homologia para o gene sacB no cromossomo de Bacillus quedirige a integração do vetor e seqüência interveniente por meio-de recombinaçãohomóloga. Entre as regiões de homologia de sacB, encontra-se o promotor Pamy ea seqüência de sinais que pode dirigir a síntese e secreção de gene clonado, marcaHis e eritromicina como marcador selecionável para Bacillus. O promotor Pamy e aseqüência de sinal são de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens. A regiãopromotora também contém a seqüência IacO para regulagem de expressão porproteína repressora de Iacl. A seqüência de pFP988 (6509 bp) é fornecida comoSEQ ID N0 79.
Como os genes de processo de 1-butanol deveriam ser expressosno citoplasma, a seqüência de sinal de amilase foi excluída. O plasmídeopFP988 foi amplificado com primers Pamy/lacO F e Pamy/lacO R criandoproduto de 317 bp (0,3 kbp) que continha o promotor Pamy/lacO. Aextremidade 5' do primer Pamy/lacO F incorporou local de restrição de BsrGIseguido por local EcoRI. A extremidade 5' do primer Pamy/lacO R incorporoulocal de restrição de BsrGI seguido por local de restrição de Pmel. O produtode PCR foi clonado TOPO em pCR4Blunt-TOPO criando pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO. DNA de plasmídeo foi preparado a partir de cultivos por uma noitee submetido a seqüenciamento com primers Frontal M13 e Reverso M13 (SEQID N0 45 e SEQ ID N0 46, respectivamente) para garantir que nenhumamutação havia sido introduzida no promotor. Clone de pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO foi digerido com BsrGI e o fragmento de 0,3 kbp foi purificado comgel. O vetor pFP988 foi digerido com BsrGI1 resultando em exclusão de 11 bp apartir da região de homologia 5' sacB e remoção do promotor de Pamy/lacO eseqüência de sinais e marca His. O vetor digerido por BsrGI de 6 kbp foipurificado com gel e ligado com inserto BsrGI de Pamy/lacO. Os plasmídeosresultantes foram selecionados com primers Pamy SeqF2 e Pamy SeqR paradeterminar a orientação do promotor. O clone correto restaurou o promotorPamy/lacO à sua orientação original e foi denominado pFP988Dss.
O conjunto com genes thl-crt foi construído por meio de SOE(divisão por extensão sobreposta). Os genes foram amplificados utilizandocomo modelo pUC19dss:Operador 1. Os primers thl foram TF Superior e TRInferior que amplificam produto com 0,9 kbp. Os primers caí foram CF Superiore CR Inferior que amplificam produto com 1,3 kbp. Os dois genes foram unidospor SOE com amplificação por PCR utilizando os primers TF Superior e CRInferior, gerando produto de 2,1 kbp que foi clonado TOPO em pCR4Blunt-TOPO, criando pCR4Blunt-TOPO-T-C. Os clones foram submetidos aseqüenciamento para confirmar a seqüência. Ό plasmídeo pCR4Blunt-T0P0-T-C foi digerido com BstEII e Pmel1 liberando fragmento de 2,1 kbp que foipurificado com gel. O inserto foi tratado com polimerase Klenow para tornarobtuso o local BstEII. O vetor pFP988Dss foi digerido com Pmel e tratado comfosfatase alcalina de intestino de bezerro (New England BioLabs) para evitarautoligação. O fragmento thl-crt de 2,1 kbp e o pFP988Dss digerido foramligados e transformados em células TopIO de E. coli. Os transformadoresforam selecionados por meio de amplificação de PCR com Pamy SeqF2 eN7SeqR2 para produto com 0,7 kbp. O produto correto foi denominadopFP988Dss-T-C.
A construção do conjunto thl-crt criou locais Sall e Spelexclusivos entre os dois genes. Para adicionar o gene hbd ao conjunto, ogene hbd foi subclonado a partir de pCR4Blunt-TOPO-hbd na forma defragmento de Sall/Spel com 0,9 kbp. O vetor pFP988Dss-T-C foi digeridocom Sall e Spel e o fragmento de vetor com 8 kbp foi purificado com gelo.O vetor e o inserto hbd foram ligados e transformados em células TopIO deE. coli. Transformadores foram selecionados por meio de amplificação dePCR com os primers Pamy SeqF e N3SeqF3 para fragmento de 3,0 kbp. Oplasmídeo resultante foi denominado pFP988Dss-T-H-C.
O promotor de Pamy foi substituído em seguida com opromotor de Pspac do plasmídeo pMUTIN4 (Vagner et al, Microbiol. 144:3097-3104 (1998)). O promotor de Pspac foi amplificado a partir depMUTIN4 com os primers Spac F e Spac R na forma de produto com 0,4kbp e clonado TOPO em pCR4Blunt-TOPO. Os transformadores foramselecionados por meio de amplificação de PCR com primers M13 Frontal eM13 Reverso pela presença de inserto de 0,5 kbp. Clones positivos foramsubmetidos a seqüenciamento com os mesmos primers. O plasmídeopCR4Blunt-TOPO-Pspac foi digerido com Smal e Xhol e o fragmento de0,3 kbp foi purificado com gel. O vetor pFP988Dss-T-H-C foi digerido comSmal e Xhol e o vetor de 9 kbp foi isolado por meio de purificação com gel.O vetor digerido e o inserto de Pspac foram ligados e transformados emcélulas Top10 de E. coli. Os transformadores foram selecionados por meiode amplificação de PCR com os primers SpacF Seq e N7SeqR2. Clonespositivos geraram produto com 0,7 kbp. DNA de plasmídeo foi preparado apartir de clones positivos e adicionalmente selecionado por meio deamplificação de PCR com os primers SpacF Seq e N3SeqF2. Clonespositivos geraram produto de PCR de 3 kbp e foram denominadospFP988DssPspac-T-H-C..
INTEGRACAO EM B. SUBTILIS BE1010 PARA FORMAR B. SUBTILIS △SACB::T-H-C::ERM N° 28 QUE COMPREEENDE GENES THL, HBD E CRT EXOGENOS
Células competentes de B. subtilis BE1010 foram preparadasconforme descrito em Doyle et al, J. Bacteriol. 144: 957-966 (1980). Célulascompetentes foram colhidas por meio de centrifugação e as pelotas celularesforam novamente suspensas em pequeno volume do sobrenadante celular. Aum volume de células competentes, foram adicionados dois volumes de meioSPII-EGTA (Methods for General and Molecular Bacteriology1 P. Gerhardt et al,Eds., Sociedade Norte-Americana de Microbiologia, Washington DC (1994)).Parcelas de 0,3 mL de células foram liberadas em tubos de ensaio e oplasmídeo pFP988DssPspac-T-H-C foi adicionado aos tubos. As células foramincubadas por trinta minutos a 37 0C com agitação, após o quê adicionou-se0,1 mL de extrato de levedura a 10% a cada tubo e as células foramadicionalmente incubadas por sessenta minutos. Os transformadores foramcolocados em placas para seleção sobre placas de eritromicina LB utilizando ométodo de sobreposição de agar dupla (Methods for General and MolecularBacteríology, acima). Os transformadores foram selecionados inicialmente pormeio de amplificação de PCR com os primers Pamy SeqF e N5SeqF3. Clonespositivos que amplificaram o produto de PCR de 2 kbp esperado foramselecionados adicionalmente por meio de amplificação de PCR. Caso ainserção do conjunto no cromossomo houvesse ocorrido por meio de evento decruzamento duplo, o conjunto de primers sacB Up e N7SeqR2 e o conjunto deprimers sacB Dn e N4SeqR3 amplificariam produto de 1,7 kbp e 2,7 kbp,respectivamente. Clone positivo foi identificado e denominado B. subtilis△sacB::T-H-C::erm #28.
Expressão de plasmídeos de EgTER, genes ald ε bdhB
Os três genes de 1-butanol restantes foram expressos peloplasmídeo pHT01 (MoBitec). O plasmídeo pHT01 é vetor de impulso deBacillus e E. coli que se reproduz por meio de mecanismo teta. Proteínasclonadas são expressas a partir do promotor GroEL fundido a seqüência delacO. Abaixo no fluxo de lacO, encontra-se o RBS eficiente a partir do genegsiB seguido por MCS. O gene ald foi amplificado por meio de PCR com osprimers AF BamHI e AR Aat2 utilizando pl)C19dHS-ald-bdhB (descrito noExemplo 9) como modelo, criando produto de 1,4 kbp. O produto foi clonadoTOPO em pCR4-TOPO e transformado em células TopIO de E. coli. Ostransformadores foram selecionados com primers M13 Frontal e M13 Reverso.Clones positivos amplificaram produto de 1,6 kbp. Os clones foram submetidosa seqüenciamento com primers M13 Frontal e M13 Reverso, N31SeqF2,N31SeqF3, N32SeqR2, N32SeqR3 e N32SeqR4. O plasmídeo foi denominadopCR4TOPO-B/A-ald.
O vetor pHT01 e o plasmídeo pCR4TOPO-B/A-ald foram ambosdigeridos com BamHI e AatlI. O fragmento de vetor de 7,9 kbp e o fragmentode ald com 1,4 kbp foram ligados entre si para criar pHT01-ald. A ligação foitransformada em células TopIO de E. coli e os transformadores foramselecionados por meio de amplificação de PCR com os primers N31 SeqFI eHT R para produto com 1,3 kbp.
Para adicionar as duas últimas etapas do processo ao vetorpHT01, foram projetados dois esquemas de clonagem. Para os dois esquemas,EgTER e bdhB foram amplificados juntos por SOE. Em seguida, o fragmentode EgTER-òd/7 foi clonado em pHT01-ald criando pHT01-ald-EB ou clonado empCR4-TOPO-B/A-ald, criando pCR4-TOPO-ald-EB. O fragmento de ald-EgTer-bdhB do vetor TOPO foi clonado em seguida em pHT01, criando pHT01-AEB.
Fragmento de EgJER-bdhB foi amplificado por meio de PCRutilizando os primers Frontal 1 (E) e Reverso 2 (B)1 utilizando DNA demodelo fornecido como SEQ ID N0 208. O produto de PCR de 2,5 kbpresultante foi clonado TOPO em pCR4Blunt-TOPO, criando pCR4Blunt-TOPO-E-B. A reação de TOPO foi transformada em células TopIO de E.coli. Colônias foram selecionadas com primers M13 Frontal e M13 Reversopor meio de amplificação de PCR. Clones positivos geraram produto com2,6 kbp. Clones de pCR4-Blunt-TOPO-E-B foram submetidos aseqüenciamento com primers M13 Frontal e Reverso, N62SeqF2,N62SeqF3, N62SeqF4, N63SeqR1, N63SeqR2, N63SeqR3, N11SeqF1 eN11SeqF2, N12SeqR1 e N12SeqR2.
O plasmídeo pCR4Blunt-TOPO-E-B foi digerido com Hpal eAatll para liberar fragmento de 2,4 kbp. O fragmento de E-B foi tratado compolimerase Klenow para tornar obtusa a extremidade e foi purificado comgel em seguida. O plasmídeo pHT01-ald foi digerido com Aatll e tratadocom polimerase Klenow para tornar as extremidades obtusas. O vetor foitratado em seguida com fosfatase alcalina de intestino de bezerro e foipurificado com gel. O fragmento de E-B foi ligado ao vetor IinearizadopHT01-ald, transformado em células TopIO de E. coli e selecionado sobreplacas LB contendo 100 pg/mL de ampicilina. Transformadores foramselecionados por meio de amplificação de PCR com primers N3SeqF1 eN63SeqR1 para gerar produto com 2,4 kbp. O plasmídeo resultante,pHT01-ald-EB, foi transformado em células JM103, linhagem de E. colirecA+. Plasmídeos preparados a partir de linhagens recA+ formam maismultímeros que linhagens recA'. Bacillus subtilis transforma maiseficientemente com multímeros de plasmídeos em vez de monômeros(Methods for General and Molecular Bacteriology, acima). DNA deplasmídeo foi preparado a partir de JM103 e transformado em B. subtiliscompetente AsacB::T-H-C::erm n° 28 formando linhagem B. subtilisAsacB::T-H-C::erm n° 28/pHT01-ald-EB. Células competentes forampreparadas e transformadas conforme descrito anteriormente.Transformadores foram selecionados sobre placas LB contendo 5 pg/mLde cloranfenicol e selecionados por meio de PCR de colônia com osprimers N31 SeqFI e N63SeqR4 para produto com 1,3 kbp.
Na estratégia de clonagem alternativa, pCR4Blunt-TOPO-E-Bfoi digerido com Hpal e Aatll, liberando fragmento de 2,4 kbp que foipurificado com gel. O plasmídeo pCR4-TOPO-B/A-ald foi digerido comHpal e Aatll e o fragmento de vetor com 5,4 kbp foi purificado com gel. Ofragmento de vetor de pCR4-TOPO-B/A-ald foi ligado ao fragmento deHpal-Aatll E-B criando pCR4-TOPO-ald-EB. A ligação foi transformada emcélulas TopIO de E. coli e os transformadores resultantes foramselecionados por meio de amplificação por PCR com os primers N11SeqF2- e N63SeqR4 para produto com 2,1 kbp. O plasmídeo pCR4-TOPO-ald-EBfoi digerido com BamHI, Aatll e Sphl. A digestão de BamHI/Aatll liberafragmento de ald-EB com 3,9 kbp que foi purificado com gel. O propósitoda digestão de Sphl foi de cortar o vetor restante em fragmentos menores,de forma que não comigrasse sobre gel com o inserto de ald-EB. O vetorpHT01 foi digerido com BamHI e Aatll e o fragmento de vetor de 7,9 kbp foipurificado com gel. O vetor e os fragmentos de inserto de ald-EB foramligados para formar plasmídeo pHT01-AEB e transformados em célulasTop10 de E. coli. Colônias foram selecionadas por meio de amplificação dePCR com os primers N62SeqF4 e HT R para produto com 1,5 kbp. Oplasmídeo foi preparado e transformado em JM103. DNA de plasmídeo foipreparado a partir de JM103 e transformado em B. subtilis competenteAsacB::T-H-C::erm n° 28, formando a linhagem B. subtilis AsacB::T-H- C::erm n° 28/pHT01-AEB. Células BE1010 competentes foram preparadase transformadas conforme descrito anteriormente. Transformadores deBaciHus foram selecionados por meio de amplificação de PCR com osprimers N31 SeqFI e N63SeqR4 para produto com 1,3 kbp.
Demonstração da produção de 1 -butanol a partir de b. subtilisRECOMBINANTE
Três isolados independentes de cada linhagem de B. subtilisΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB e B. subtilis AsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB foram inoculados em frascos de agitação (cerca de 175 ml_ de volume total)contendo 15 mL de meio. Linhagem BE1010 de B. subtilis que não contém o processo de seis genes de 1-butanol exógeno também foi incluída como controlenegativo. O meio continha (por litro): 10 mL de 1 M (NH4)2SO4; 5 mL de 1 M tampãofosfato de potássio, pH 7,0; 100 mL de 1 M tampão MOPS/KOH, pH 7,0; 20 mL de 1M ácido L-glutâmico, sal de potássio; 10 g de glicose; 10 mL de 5 g/L cada de L-metionina, L-triptofano e L-lisina; 0,1 g cada de extrato de levedura e casamino ácidos; 20 mL de mistura de metais; e antibióticos apropriados (5 mg de cloranfenicole eritromicina para as linhagens recombinantes). A mistura de metais continha 200mM de MgCI2, 70 mM de CaCI2, 5 mM de MnCI2, 0,1 mM de FeCI3, 0,1 mM de ZnCI2,0,2 mM de cloridrato de tiamina, 172 μΜ de CuSO4, 253 μΜ de CoCI2 e 242 μΜ deNa2MoO4. Os frascos foram inoculados em OD6OO inicial de < 0,1 unidades, vedados com tampas não ventiladas e incubados a 37 0C com agitação a cerca de 200 rpm.
Cerca de 24 horas após a inoculação, parcela do caldo foi analisadapor meio de HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecção do índice derefração (RI) e GC (coluna CB Varian CP-WAX 58 (FFAP), 0,25 mm χ 0,2 pm χ 25m) com detecção de ionização de chama (FID) para determinar o teor de 1-butanol,conforme descrito no capítulo Métodos Gerais. Os resultados das determinações de1-butanol são fornecidos na Tabela 11.
Tabela 11
Produção de 1-Butanol pelas Linhagens b. subtilis AsacB::T-H-C::erm #
28/PHT01-ald-EB e b. subtius asacB::T-H-C::erm N° 28/PHT01-AEB
<table>table see original document page 85</column></row><table>
* Concentração determinada por meio de GC.
Os sufixos de linhagem "a", "b" e "c" indicam isolados separados.
Exemplo 15
Produção de 1-Butanol a Partir de Glicose ou Sacarose por e. coli
Recombinante
Para fornecer a E. coli MG1655 a capacidade de uso de sacarosecomo fonte de carbono e energia para a produção de 1-butanol, conjunto genéticode utilização de sacarose (cscBKA) do plasmídeo pScrl (descrito abaixo) foisubclonado em pBHR-Ptrc-ald(opt) (descrito no Exemplo 13) neste organismo. Osgenes de utilização de sacarose (csc/\, cscK e cscB) codificam sacarose hidrolase(CscA)1 fornecida como SEQ ID N0 157, D-frutoquinase (CscK)1 fornecida comoSEQ ID N0 158, e sacarose permease (CscB), fornecida como SEQ ID N0 159. Parapermitir a expressão constitutiva dos três genes a partir do seu promotor natural, ogene repressor específico de sacarose, cscR, que regula o conjunto genético nãoestá presente na construção.Clonagem ε expressão do conjunto genético de utilização de sacarosecscBKA no plasmídeo pBHR-Ptrc-ald (opt)
O conjunto genético de utilização de sacarose cscBKA, fornecidocomo SEQ ID N0 156, foi isolado a partir de DNA genômico de linhagem de E.
coli que utiliza sacarose derivada de E. coli linhagem ATCC 13281. O DNAgenômico foi digerido até o término com BamHI e EcoRI. Fragmentos quepossuem tamanho médio de cerca de 4 kbp foram isolados a partir de gel deagarose, ligado ao plasmídeo pl_itmus28 (New England Biolabs, Beverly MA),que foi digerido em seguida com BamHI e EcoRI. O DNA resultante foitransformado em E. coli TOPIOF' ultracompetente (Invitrogen, Carlsbad CA).Os transformadores foram colocados sobre placas agar MacConkey contendo1% sacarose e 100 pg/mL de ampicilina e selecionados para determinarcolônias púrpura. DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos transformadorespúrpura e seqüenciados utilizando os primers M13 Frontal (SEQ ID N0 45), M13Reverso (SEQ ID N0 46), scr1 (SEQ ID N0 160), scr2 (SEQ ID N0 161), scr3(SEQ ID N0 162) e scr4 (SEQ ID N0 163). O plasmídeo que contém genescscB, cscKe cscA (cscBKA) foi denominado pScrl.
O plasmídeo pScrl foi digerido com Xhol e tratado com ofragmento Klenow de DNA polimerase para elaborar extremidades20 abruptas. O plasmídeo foi digerido em seguida com Agel e o fragmento deconjunto genético cscBKA de 4179 bp foi purificado com gel. O plasmídeopBHR-Ptrc-ald(opt) foi preparado conforme descrito no Exemplo 13 edigerido com Agel e Nael. O fragmento de pBHR-Ptrc-ald(opt) com 6003 bpresultante foi purificado com gelo. O fragmento de cscBKA foi ligado aopBHR-Ptrc-ald(opt), gerando pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB. O plasmídeopBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB foi transformado em células eletrocompetentesde E. coli NovaXG (Novagen, Madison Wl) e a utilização de sacarose foiconfirmada por meio de colocação dos transformadores sobre placas agarMcConkey contendo 2% sacarose e 25 pg/mL de canamicina. Naconstrução de pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB, os genes de utilização desacarose foram clonados abaixo no fluxo de Ptrc-ald(opt) na forma defragmento separado na ordem cscA, cscK e cscB.
Alternativamente, os genes de utilização de sacarose foramclonados na direção oposta em pBHR-Ptrc-ald(opt). O plasmídeo pBHR-Ptrc-ald(opt) foi digerido com Scal e Agel e o fragmento de pBHR-Ptrc-ald(opt) com 5971 bp foi purificado com gel. O fragmento de cscBKA com4179 bp, preparado conforme descrito acima, foi ligado com o fragmentode pBHR-Ptrc-ald(opt), gerando pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA. O plasmídeopBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA foi transformado em células eletrocompetentesde E. coli NovaXG (Novagen, Madison Wl) e a utilização de sacarose foiconfirmada por meio de colocação dos transformadores sobre placas agarMcConkey contendo 2% sacarose e 25 pg/mL de canamicina. Naconstrução pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA, os genes de utilização desacarose foram clonados na forma de fragmento separado abaixo no fluxode Ptrc-ald(opt) na ordem cscB, cscKe cscA.
Demonstração da produção de 1-butanol a partir de glicose ou sacaroseutilizando E. COLIrecombinante
E. coli linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm (descrito noExemplo 13) foi transformado com plasmídeos pTrc99a-E-C-H-T(preparados conforme descrito no Exemplo 13) e pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB ou pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA para produzir duas linhagens,MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB n°9 e MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKAn° 1. Cultivos iniciais das duas linhagens foram preparados por meio decultivo das células em meio LB contendo 25 pg/mL de canamicina e 100pg/mL de carbenicilina. Estas células foram utilizadas em seguida parainocular frascos de agitação (volume total de cerca de 175 mL) contendo50, 70 e 150 mL de meio TM3a/glicose (com antibióticos apropriados) pararepresentar condições de alto, médio e baixo teor de oxigênio,respectivamente, conforme descrito no Exemplo 13. Terceira linhagem, E.coli MG1655/pScr1, cultivada em meio TM3a/glicose contendo 100 µg/mLde carbenicilina, foi utilizada como controle negativo. Para cada uma daslinhagens, conjunto idêntico de frascos foi preparado com meioTM3a/sacarose (com antibióticos apropriados). O meio TM3a/sacarose éidêntico ao meio TM3a/glicose, exceto pelo fato de que sacarose (10 g/l)substitui glicose. Os frascos foram inoculados em OD550 inicial de < 0,03unidades e incubados conforme descrito no Exemplo 13. Com exceção dosfrascos de controle negativo, adicionou-se IPTG aos frascos (concentraçãofinal de 0,04 mM) quando os cultivos atingiram OD550 de 0,2 a 1,8unidades. As células foram colhidas quando o OD550 dos cultivos aumentoupelo menos três vezes.
Cerca de 24 horas após a inoculação, parcela do caldo foianalisada por meio de HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecçãode índice de refração (RI) e GC (coluna HP-INNOWax, 30 m χ diâmetrointerno de 0,53 mm, espessura de filme de 1 μm) com detecção deionização de chama (FID) para teor de 1-butanol, conforme descrito nocapítulo Métodos Gerais.
As concentrações de 1-butanol em cultivos após ocrescimento nos meios que contêm glicose e sacarose são fornecidas naTabela 12 e na Tabela 13, respectivamente. As duas linhagens de E. colirecombinantes que contêm a via biossintética de 1-butanol produziram 1-butanol a partir de glicose e sacarose sob todas as condições deoxigênio, enquanto a linhagem controle negativa não produziu 1-butanoldetectável.Tabela 12
Produção de 1-Butanol a Partir de Glicose por Linhagens de e. coliRecombinantes MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB N0 9 ε MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA N° 1
<table>table see original document page 89</column></row><table>
Tabela 13
Produção de 1 -Butanol a Partir de Sacarose por Linhagens de E. couRecombinantes
<table>table see original document page 89</column></row><table>
Exemplo 16
Produção de 1-Butanol a Partir de Sacarose Utilizando b. subtilisRecombinante
Este exemplo descreve a produção de 1-butanol a partir de sacaroseutilizando Bacillus subtilis recombinante. Dois isolados independentes de B. subtilislinhagem AsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-ald-EB (Exemplo 14) foram examinadospara determinar a produção de 1-butanol essencialmente conforme descrito noExemplo 14. As linhagens foram inoculadas em frascos de agitação (volume total decerca de 175 ml_) contendo 20 ml_ ou 100 ml_ de meio para simular condições de altoe baixo teor de oxigênio, respectivamente. O Meio A foi exatamente conformedescrito no Exemplo 14, exceto pela substituição de glicose por 5 g/l de sacarose. OMeio B foi idêntico ao meio TM3a/glicose descrito no Exemplo 13, exceto pelasubstituição de glicose por 10 g/l de sacarose e o meio foi suplementado com 10 mLpor litro de solução de 5 g/l de cada um dentre L-metionina, L-triptofano e L-lisina. Osfrascos foram inoculados em OD550 inicial de < 0,1 unidades, tampados com tampasventiladas e incubados a 34 0C mediante agitação a 300 rpm.
Cerca de 24 horas após a inoculação, parcela do caldo foi analisadapor meio de GC (coluna HP-INNOWax, 30 m χ diâmetro interno de 0,53 mm,espessura de filme de 1,0 pm) com detecção de FID para determinar o teor de 1-butanol, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais. Os resultados dasdeterminações de 1-butanol são fornecidos na Tabela 14. A linhagem de Bacillusrecombinante que contém a via biossintética de 1-butanol produziu níveis detectáveisde 1-butanol sob condições de alto e baixo teor de oxigênio nos dois meios.
Tabela 14
Produção de 1-Butanol a Partir de Sacarose por b. subtius LinhagemΔasacB : :T-H-C:: erm #28/pHT01 -ald-EB
<table>table see original document page 90</column></row><table>1 Concentração determinada por meio de GC.
2 "+" indica presença qualitativa de 1-butanol.
Os sufixos de linhagem "a" e "b" indicam isolados separados.
Exemplo 17
Produção de 1-Butanol a Partir de Glicose ε Sacarose Utilizando
Saccharomyces cerevisiae Recombinante
Este Exemplo descreve a produção de 1-butanol na leveduraSaccharomyces cerevisiae. Dos seis genes que codificam enzimas quecatalisam as etapas na via biossintética de 1-butanol, cinco foram clonados emtrês plasmídeos de dois micra (2μ) compatíveis e coexpressos emSaccharomyces cerevisiae. O "processo superior" é definido como as trêsprimeiras etapas enzimáticas, catalisadas por acetil-CoA acetiltransferase (thIA,tiolase), 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd) e crotonase (cri). O processoinferior é definido como as quarta (butil-CoA desidrogenase, ter) e quinta(butiraldeído desidrogenase, ald) etapas enzimáticas do processo. A últimaetapa enzimática do processo de 1-butanol é catalisada por álcooldesidrogenase, que pode ser codificada por genes de leveduras endógenos,tais como adhl e adhll.
A expressão de genes em levedura exige tipicamente promotor,seguido pelo gene de interesse, e terminal de transcrição. Uma série depromotores de leveduras constitutivos foi utilizada na construção de conjuntosde expressão para genes que codificam a via biossintética de 1-butanol,incluindo promotores de FBA, GPD e GPM. Alguns promotores indutíveis, taiscomo GAL1, GAL10 e CUP1 também foram utilizados em construção deplasmídeos intermediários, mas não na linhagem de demonstração final. Váriosterminais de transcrição foram utilizados, incluindo FBAt, GPDt, GPMt1 ERGIOte GAL1t. Os genes que codificam a via biossintética de 1-butanol foramsubclonados em primeiro lugar em plasmídeo de levedura ladeado porpromotor e terminal, que geraram conjuntos de expressão para cada gene.Conjuntos de expressão foram opcionalmente combinados em um único vetorpor meio de clonagem de reparo de lacunas, conforme descrito abaixo. Os trêsconjuntos genéticos que codificam o processo superior foram subclonados, porexemplo, em plasmídeo 2μ de levedura. Os genes ter e ald foram expressosindividualmente nos plasmídeos 2μ. Cotransformação de todos os trêsplasmídeos em uma única linhagem de levedura resultou em via biossintéticade 1-butanol funcional. Alternativamente, vários fragmentos de DNA quecodificam promotores, genes e terminais foram combinados diretamente em umúnico vetor por meio de clonagem de reparo de lacunas.
Métodos de construção de plasmídeos e linhagens em leveduraSaccharomyces cerevisiae. Protocolos de biologia molecular de levedurabásica, que incluem transformação, crescimento celular, expressão genética,recombinação de reparo de lacunas etc., são descritos em Methods inEnzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and CellBiology (Parte A, 2004, Christine Guthrie e Gerald R. Fink (Eds.), ElsevierAcademic Press, San Diego CA).
Os plasmídeos utilizados neste Exemplo foram vetores de impulsode E. coli- S. cerevisiae, pRS423, pRS424, pRS425 e pRS426 (Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Rockville MD), que contêm origem dereprodução de E. coli (tal como pMB1), origem de reprodução 2μ de levedura emarcador de seleção nutricional. Os marcadores de seleção para estes quatrovetores são His3 (vetor pRS423), Trpl (vetor pRS424), Leu2 (vetor pRS425) eUra3 (vetor pRS426). Estes vetores permitem propagação de linhagens em E.coli e linhagens de levedura. Linhagem haplóide de levedura BY4741 (MATahis3A 1 leu2A0 met15A0 ura3A0) (Research Genetics, Huntsville AL,também disponíveis por meio da ATCC 201388) e linhagem diplóide BY4743(MATa/alfa his3A1/his3A1/leu2A0/leu2A0 lys2A0/LYS2 MET15lmet15AOura3Δ0/ura3Δ0) (Research Genetics, Huntsville AL, também disponíveis pormeio da ATCC 201390) foram utilizados como hospedeiros para expressão eclonagem de genes. A construção de vetores de expressão para genes quecodificam enzimas da via biossintética de 1-butanol foi realizada por meio de métodos de clonagem molecular padrão em E. coli ou por meio do método derecombinação de reparo de lacunas em levedura.
A abordagem de clonagem de reparo de lacunas utiliza-se darecombinação homóloga altamente eficiente em levedura. Tipicamente, DNAde vetor de levedura é digerido (tal como no seu local de clonagem múltipla) para criar "lacuna" na sua seqüência. Uma série de DNAs de insertos é geradacontendo seqüência > 21 bp nas extremidades 5' e 3' que se sobrepõemseqüencialmente entre si e com o terminal 5' e 3' do DNA de vetor. Paraconstruir vetor de expressão de leveduras para o "Gene X", por exemplo,promotor de levedura e terminal de levedura são selecionados para o conjunto de expressão. O promotor e o terminal são amplificados a partir do DNAgenômico de levedura e o Gene X é amplificado por PCR a partir do seuorganismo fonte ou obtido a partir de vetor de clonagem que compreendeseqüência de Gene X. Existe seqüência sobreposta de pelo menos 21 bp entrea extremidade 5' do vetor Iinearizado e a seqüência promotora, entre o promotor e o Gene X, entre o Gene Xea seqüência terminal e entre o terminale a extremidade 3' do vetor linearizado. O vetor "com lacunas" e os DNAs deinserto são cotransformados em seguida em linhagem de levedura, colocadosem placas sobre o meio de deposição mínimo SD e são selecionadas colôniaspara crescimento de cultivos e mini preparações para DNAs de plasmídeos. A presença de combinações de insertos corretas pode ser confirmada por meiode mapeamento de PCR. O DNA de plasmídeo isolado a partir de levedura(normalmente com baixa concentração) pode ser transformado em seguida emlinhagem de E. coli, tal como TOPIO, seguido por mini preparações emapeamento de restrição para verificar adicionalmente a construção deplasmídeo. Por fim, a construção pode ser verificada por meio de análise deseqüências. Transformadores de levedura de plasmídeos positivos sãocultivados em meio SD para realizar testes de enzimas para caracterizar asatividades das enzimas expressas pelos genes de interesse.
Cultivos de levedura foram cultivados em meio complexo YPD oumeio de deposição Mínimo Sintético que contém glicose (meio SD) e as misturasde compostos apropriadas que permitem a complementação dos marcadores deseleção nutricional sobre os plasmídeos (Methods in Enzymology, Volume 194,Guide to Yeast Genetics and Molecularand Cell Biology, 2004, Parte A, págs. 13-15). O componente de açúcar no meio de deposição SD foi glicose a 2%. Para aprodução de 1-butanol, cultivos de leveduras foram também cultivados em meiode deposição Mínimo Sintético com 2% sacarose (meio SS).
Para análise da atividade enzimática, uma única colônia de cadalinhagem foi riscada sobre placa nova contendo meio de deposição mínimo SDe incubada a 30°C por dois dias. As células sobre esta placa foram utilizadaspara inocular 20 mL de meio de gotejamento SD e em frasco de agitação de125 mL e cultivadas por uma noite a 30°C com agitação a 250 rpm. Adensidade ótica (OD6oo) do cultivo por uma noite foi medida e o cultivo foidiluído até OD600 de 0,8 a 1,0. As células foram colhidas em seguida por meiode centrifugação a 2000 χ g por dez minutos e novamente suspensas em 20mL de 50 mM tampão Tris-HCl, pH 8,5. Testes de enzimas foram realizadosconforme descrito acima.
Construção de plasmídeo pNY102 para coexpressão de thlA ε hbd
Uma série de vetores de expressão dupla foi construída para acoexpressão de genes thlA e hbd. O gene Saccharomyces cerevisiae ERG10 éortólogo funcional do gene thlA. Inicialmente, vetor duplo de ERG10 e hbd foiconstruído utilizando o promotor duplo divergente GAL1-GAL10 de levedura, oterminal GAL1 (GALIt) e o terminal ERG10 (ERGIOt). O fragmento de DNA deERG10t-gene ERG10 foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico deSaccharomyces cerevisiae linhagem BY4743, utilizando os primers OT731(SEQ ID N0 164) e OT732 (SEQ ID N0 165). O promotor divergente GAL1-GAL10 de levedura também foi amplificado por meio de PCR a partir de DNAgenômico BY4743 utilizando os primers OT733 (SEQ ID N0 166) e OT734(SEQ ID N0 167). O gene hbd foi amplificado a partir de plasmídeo de E. colipTrc99a-E-C-H-T (descrito no Exemplo 13) utilizando os primers de PCROT735 (SEQ ID N0 168) e OT736 (SEQ ID N0 169). GALIt foi amplificado apartir de DNA genômico de BY4743 utilizando os primers OT737 (SEQ ID N0170) e OT738 (SEQ ID N0 171). Quatro fragmentos de PCR1 erg10-ERGIOt,promotores GAL1-GAL10, hbd e GAL1t, foram obtidos desta forma comseqüências de sobreposição de cerca de 25 bp entre cada fragmento de PCRadjacente. GALIt e fragmentos de ERG10-ERG10t contêm cada umseqüências de sobreposição de cerca de 25 bp com o vetor de levedurapRS425. Para reunir estas seqüências por meio de recombinação de reparo delacunas, os fragmentos de DNA foram cotransformados na linhagem delevedura BY4741 junto com o vetor pRS425 que foi digerido com enzimasBamHI e Hindlll. Colônias foram selecionadas a partir de placas mínimas SD-Leu e clones com insertos foram identificados por meio de amplificação dePCR. O novo plasmídeo foi denominado pNY6 (pRS425.ERG10t-erg10-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t). Realizou-se confirmação adicional por meio demapeamento de restrição.
A linhagem de levedura BY4741 (pNY6), preparada por meio datransformação de plasmídeo pNY6 em S. cerevisiae BY4741, exibiu boaatividade de Hbd mas nenhuma atividade de tiolase. Devido à falta de atividadede tiolase, o gene ERG10 foi substituído com o gene thIA por meio derecombinação de reparo de lacunas. O gene thIA foi amplificado a partir devetor de Ε. coli pTrc99a-E-C-H-T por meio de PCR utilizando os primers OT797(SEQ ID N0 172) que adiciona local de restrição de Sphl e OT798 (SEQ ID N0173) que adiciona local de restrição de Ascl. O plasmídeo pNY6 foi digeridocom enzimas de restrição Sphl e Pstl1 purificado com gel e cotransformado emBY4741 de levedura junto com o produto de PCR de thIA. Devido àsseqüências de sobreposição de 30 bp entre o produto de PCR de thIA e opNY6 digerido, o gene thIA foi recombinado em pNY6 entre o promotor GAL10e o terminal ERG10t. Isso gerou o plasmídeo pNY7 (pRS425.ERG10t-thlA-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t), que foi verificado por meio de PCR e mapeamentode restrição.
Em etapa de clonagem subseqüente com base em recombinaçãode reparo de lacunas, o promotor GAL10 em pNY7 foi substituído com opromotor CUP1 e o promotor GAL1 foi substituído com o promotor GPD forte.Este plasmídeo, pNY10 (pRS425.ERG10t-thlA-CUP1-GPD-hbd-GAL1t) permitea expressão do gene thIA sob CUP1, promotor indutível por cobre, e aexpressão do gene hbd sob o promotor GPD. A seqüência promotora de CUP1foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico BY4743 de levedurautilizando os primers OT8O6 (SEQ ID N0 174) e OT807 (SEQ ID N0 175). Opromotor de GPD foi amplificado a partir de DNA genômico BY4743 utilizandoos primers OT8O8 (SEQ ID N0 176) e QT809 (SEQ ID N0 177). Produtos dePCR dos promotores GPD e CUP1 foram combinados com plasmídeo pNY7digerido com enzimas de restrição Ncol e Sphl. A partir desta etapa declonagem de reparo de lacunas, foi construído o plasmídeo pNY10, que foiverificado por meio de PCR e mapeamento de restrição. Linhagem BY4741 delevedura que contém pNY10 apresentou atividade de Hbd, mas nenhumaatividade de ThIA. A atividade de Hbd sob promotor GPD foi significativamenteaprimorada em comparação com a atividade de Hbd controlada por promotorde GAL1 (1,8 U/mg χ 0,40 U/mg). Análise de seqüenciamento revelou que ogene thIA em pNY10 apresentou exclusão de uma base perto da extremidade3', que resultou em proteína truncada. Isso explica a falta de atividade detiolase na linhagem.
O plasmídeo pNY12 foi construído com a seqüência genética thIAcorreta. O gene thIA foi cortado do vetor pTrc99a-E-C-H-T por meio de digestãocom Sphl e Ascl. O promotor de FBA1 foi amplificado por PCR a partir de DNAgenômico de BY4743 utilizando os primers OT799 (SEQ ID N0 178) e OT761(SEQ ID N0 179) e digerido com enzimas de restrição Sall e Sphl. O fragmentogenético thIA e o fragmento de promotor FBA1 foram ligados ao plasmídeopNY10 nos locais Ascl e Sall1 gerando o plasmídeo pNY12 (pRS425.ERGIOt-thlA-FBA1), que foi confirmado por meio de mapeamento de restrição. pNY12foi transformado em linhagem de levedura BY4741 e o transformador resultanteexibiu atividade de ThIA de 1,66 U/mg.
O fragmento de gene thlA-promotor de FBA1 de pNY12 foinovamente subclonado em pNY10. O vetor pNY10 foi cortado com a enzima derestrição Ascl e ligado com o fragmento de gene thlA-promotor de FBA1digerido por Ascl isolado do plasmídeo pNY12. Isso criou plasmídeo novo comduas orientações de inserção possíveis. Os clones com promotores GPD eFBA1 em locais adjacentes entre si em orientação oposta foram selecionados eeste plasmídeo foi denominado pNY102. pNY102 (pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t) foi verificado por meio de mapeamento de restrição. Alinhagem DPD5206 foi elaborada por meio de transformação de pNY102 emlinhagem de levedura BY4741. A atividade de ThIA de DPD5206 foi de 1,24U/mg e a atividade de Hbd foi de 0,76 U/mg.
Construção de plasmídeo pNY1 1 para expressão de crto conjunto de expressão de gene crt foi construído por meiode combinação do promotor GPM1, gene crt e terminal GPMIt no vetorpRS426 utilizando recombinação de reparo de lacunas em levedura. Opromotor GPM1 foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico delevedura BY4743 utilizando os primers OT803 (SEQ ID N0 180) e OT8Ü4(SEQ ID N0 181). O gene crt foi amplificado utilizando os primers de PCROT785 (SEQ ID N0 182) e OT786 (SEQ ID N0 183) de plasmídeo de E. colipTrc99a-E-C-H-T. O terminal GPMIt foi amplificado por PCR a partir deDNA genômico de levedura BY4743 utilizando OT787 (SEQ ID N0 184) eOT805 (SEQ ID N0 185). O vetor de levedura pRS426 foi digerido comBamHI e Hindlll e foi purificado com gel. Este DNA foi cotransformado comos produtos de PCR do promotor GPM1, o gene crt e o terminal GPM1 emcélulas competentes de levedura BY4741. Clones com os insertos corretosforam verificados por meio de PCR e mapeamento de restrição e alinhagem de levedura resultante BY4741 (pNY11: pRS426-GPM1-crt-GPM1t) apresentou atividade de Crt de 85 U/mg.
Construção de plasmídeo PNY103 para coexpressão de thlA, hbd ε crt
Para a coexpressão das enzimas de processo de 1-butanolsuperior, o conjunto de gene crt de pNY11 foi subclonado no plasmídeopNY102 para criar vetor de expressão hbd, thlA e crt. Fragmento de DNAde 2347 bp que contém o promotor GPM1, o gene crt e o terminal GPM1foi cortado do plasmídeo pNY11 com enzimas de restrição Sacl e Notl eclonado no vetor pNY102, que foi digerido com Notl e parcialmentedigerido com Saci, produzindo o vetor de expressão pNY103 (pRS425.ERG10t-thlA-FBA1 -GPD-hbd-GAL1 t-GPM1t-crt-GPM1). Após aconfirmação da presença de todos os três conjuntos em pNY103 por meiode digestão com Hindlll1 o plasmídeo foi transformado em células delevedura BY4743 e a linhagem de levedura transformada foi denominadaDPD5200. Quando cultivada sob condições padrão, DPD5200 exibiuatividades de enzimas ThlA, Hbd e Crt de 0,49 U/mg, 0,21 U/mg e 23,0U/mg, respectivamente.Construção de plasmídeo pNY8 para expressão de ald
Gene otimizado por códons denominado tery (SEQ ID N° 186)que codifica a proteína Ter (SEQ ID N° 187) e gene otimizado por códonsdenominado aldy (SEQ ID N° 188), que codifica a proteína Ald (SEQ ID N° 189)foram sintetizados utilizando códons preferidos de Saccharomyces cerevisiae.O plasmídeo pTERy que contém o gene ter otimizado por códon e pALDy quecontém o gene ald otimizado por códon foram elaborados por meio de DNA 2.0(Paio Alto CA).
Para reunir pNY8 (pRS426.GPD-ald-GPDt), três fragmentos deinsertos que incluem produto de PCR do promotor GPD (sintetizado a partir dosprimers OT8OO (SEQ ID N° 190) e OT758 (SEQ ID N° 191) e DNA genômico deBY4743), fragmento de gene aldy extirpado de pALDy por meio de digestão comNcol e Sfil (SEQ ID N0 188) e produto de PCR do terminal GPD (sintetizado a partirdos primers OT754 (SEQ ID N° 192) e OT755 (SEQ ID N° 193) e DNA genômico deBY4743) foram recombinados com o vetor pRS426 digerido por BamHI1 Hindlll pormeio de clonagem de recombinação de reparo de lacunas. Os clones detransformação de levedura BY4741 foram analisados por meio de mapeamento dePCR. O novo plasmídeo construído desta forma, pNY8, foi adicionalmenteconfirmado por meio de mapeamento de restrição. Os transformadores de leveduraBY4741 que contêm pNY8 foram analisados para determinar a atividade de Ald e aatividade específica para butiril-CoA foi de cerca de 0,07 U/mg.
Construção de plasmídeos pΝΥ9 ε pNY13 para expressão de ter
O gene tery otimizado por códons foi clonado no vetor pRS426sob controle do promotor FBA1 por meio de clonagem de reparo delacunas. O promotor FBA1 foi amplificado por PCR a partir do DNAgenômico de levedura BY4743 utilizando os primers OT760 (SEQ ID N°194) e OT792 (SEQ ID N° 195). O gene tery foi obtido por meio de digestãodo plasmídeo pTERy por enzimas de restrição Sphl e Notl que resultou nofragmento fornecido como SEQ ID N0 186. O fragmento de PCR doterminal FBA1 foi gerado por meio de PCR a partir do DNA genômico delevedura BY4743 utilizando os primers OT791 (SEQ ID N° 196) e OT765(SEQ ID N° 197). Três fragmentos de DNA1 o promotor FBA1, o gene ter eo terminal FBA1, foram combinados com o vetor pRS426 digerido porBamHI, Hindlll e transformados em levedura BY4741 por meio derecombinação de reparo de lacunas. O plasmídeo resultante, pNY9(pRS426-FBA1-tery-FBA1t) foi confirmado por meio de mapeamento dePCR1 bem como digestão por restrição. O transformador de leveduraBY4741 de pNY9 produziu atividade Ter de 0,26 U/mg.
Para elaborar a linhagem de via biossintética de 1-butanolfinal, foi necessário construir linhagem de expressão de levedura quecontinha vários plasmídeos, cada qual com marcador de seleçãonutricional exclusivo. Como o vetor parental pRS426 continha marcador deseleção de Ura, o conjunto de expressão de ter foi subclonado no vetorpRS423, que continha marcador His3. Fragmento de 3,2 kb contendo oconjunto de FBA1-tery-FBA1t foi isolado a partir do plasmídeo pNY9 pormeio de digestão com enzimas de restrição Sacl e Xhol e ligado ao vetorpRS423 que foi cortado com estas mesmas duas enzimas. O novoplasmídeo, pNY13 (pRS423-FBA1-tery-FBA1t), foi mapeado por meio dedigestão de restrição. pNY13 foi transformado em linhagem BY4741 e otransformador foi cultivado em meio SD-His para gerar linhagem comatividade Ter de 0,19 U/mg.
Construção de linhagem de levedura que contém genes de via biossintéticade 1-butanol para demonstração da produção de 1-butanol
Conforme descrito acima, a linhagem de levedura DPD5200foi construída por meio de transformação do plasmídeo pNY103 em S.cerevisiae linhagem BY4743, que permite a coexpressão de genes thIA,hbd e crt. Células competentes de leveduras de DPD5200 forampreparadas conforme descrito acima e os plasmídeos pNY8 e pNY13foram cotransformados em DPD5200, gerando a linhagem DPD5213.DPD5213 permite a expressão constitutiva simultânea de cinco genes navia biossintética de 1-butanol, thIA, hbd, crt, ter e ald. A linhagemDPD5212 (S. cerevisiae linhagem BY4743 transformada com plasmídeosvazios, pRS425 e pRS426) foi utilizada como controle negativo. Quatroisolados independentes de linhagem DPD5213 foram cultivados sobremeio mínimo de deposição SD-Ura1 Leu, His na presença de 2% glicoseou 2% sacarose para permitir a complementação de crescimento de todosos três plasmídeos. Isolado único de DPD5212 foi cultivado de formasimilar em meio apropriado.
Para demonstrar a produção de 1-butanol por cultivosaeróbicos, uma única colônica de cada linhagem foi riscada sobre placaagar nova contendo meio de crescimento de deposição mínimo SD(contendo 2% glicose) ou meio de crescimento de deposição mínimo SS(contendo 2% sacarose) e incubada a 30 °C por dois dias. Células destasplacas foram utilizadas para inocular 20 mL do meio de deposição mínimo(SD ou SS) em frascos de agitação plásticos de 125 mL e foram cultivadaspor uma noite a 30 °C com agitação a 250 rpm. A densidade ótica (OD600)do cultivo por uma noite foi medida, o cultivo foi diluído até OD600 de 0,1em 25 mL do mesmo meio em frasco de agitação de 125 mL e cultivado a30 °C mediante agitação a 250 rpm.
Parcelas do cultivo foram removidas após 24 horas e 48 horaspara análise GC de produção de 1-butanol (coluna HP-INNOWAX, 30 m χdiâmetro interno de 0,53 mm, espessura de filme de 1 μηι) com detecção deFID, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais. Os resultados da análiseGC são fornecidos na Tabela 15.Tabela 15Produção de 1-Butanol a Partir de Glicose ε Sacarose por S. cerevisiaeLinhagem DPD5213
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1 Os isolados independentes são indicados por a-d.
2 Concentração determinada por meio de GC.
Exemplo 18 (Profético)Expressão da via biossintética de 1-Butanol em Lactobacillus Plantarum
O propósito deste Exemplo profético é o de descrever comoexpressar a via biossintética de 1-butanol em Lactobacillus plantarum. Os seisgenes do processo de 1-butanol, que codificam seis atividades de enzimas, sãodivididos em dois operadores para expressão. Os três primeiros genes doprocesso {thl, hbd e crt, que codificam as enzimas acetil-CoA acetiltransferase,3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase e crotonase, respectivamente) sãointegrados ao cromossomo de Lactobacillus plantarum por meio derecombinação homóloga utilizando o método descrito por Hols et al (Appl.Environ. Microbiol. 60: 1401-1413 (1994)). Os últimos três genes (EgTER, aldebdhB, que codificam as enzimas butiril-CoA desidrogenase, butiraldeídodesidrogenase e butanol desidrogenase, respectivamente), são clonados emplasmídeo de expressão e transformados na linhagem de Lactobacillus queconduz os genes de 1-butanol do processo superior integrados. Lactobacillus écultivada em meio MRS (Difco Laboratories, Detroit Ml) a 37 °C. DNAcromossômico é isolado de Laetobaeillus plantarum conforme descrito porMoreira et al (BMC Microbiol. 5: 15 (2005)).
Integração
O conjunto thl-hbd-ert sob o controle do promotor P11 sintético(Rud et al, Microbiology 152: 1011-1019 (2006)) é integrado aocromossomo de Laetobaeillus plantarum ATCC BAA-793 (NCIMB 8826) nolocal IdhLI por meio de recombinação de homólogos. Para elaborar o vetorde direcionamento de integração IdhL, fragmento de DNA de Laetobaeillusplantarum (Genbank NC 004567) com homologia para IdhL é amplificadopor PCR com os primers LDH EcoRV F (SEQ ID N0 198) e LDH AatIIR(SEQ ID N0 199). O fragmento de PCR com 1986 bp é clonado empCR4Blunt-TOPO e seqüenciado. O clone pCR4Blunt-TOPO-ldhL1 édigerido com EcoRV e Aatll liberando fragmento de IdhLI com 1982 bp queé purificadorcom gel. O vetor de integração pFP988, descrito no Exemplo14, é digerido com Hindlll e tratado com DNA polimerase de Klenow paratornar as extremidades obtusas. O plasmídeo Iinearizado é digerido emseguida com Aatll e o fragmento de vetor com 2931 bp é purificado comgel. O fragmento de EcoRV/Aatll IdhLI é ligado ao fragmento de vetorpFP988 e transformado em células TopIO de E. eoli. Os transformadoressão selecionados sobre placas agar LB que contêm ampicilina (100 pg/mL)e selecionados por meio de PCR de colônia para confirmar a construção depFP988-ldhL.Para adicionar marcador selecionável ao DNA de integração,o gene Cm com o seu promotor é amplificado por PCR a partir de pC194(Genbank NC_002013) com os primers Cm F (SEQ ID N0 200) e Cm R(SEQ ID N° 201), amplificando produto de PCR com 836 bp. O amplicon éclonado em pCR4-Blunt-TOPO e transformado em células TopIO de E.coli, criando pCR5-Blunt-TOPO-Cm. Após seqüenciamento para confirmarque nenhum erro é introduzido por meio de PCR, o conjunto Cm édigerido a partir de pCR4Blunt-TOPO-Cm na forma de fragmento deMLul/Swal com 828 bp e é purificado com gel. O vetor de integração quecontém homologia com IdhL pFP988-ldhL é digerido com Mlul e Swal e ofragmento de vetor com 4740 bp é purificado com gel. O fragmento deconjunto Cm é ligado com o vetor pFP988-ldhL criando pFP988-DldhL::Cm.
Por fim, o conjunto thl-hbd-crt de pFP988Dss-T-H-C, descritono Exemplo 14, é modificado para substituir o promotor de amilase com opromotor P11 sintético. Em seguida, o operador completo é movido parapFP988-DldhlL::Cm. O promotor P11 é elaborado por meio de combinaçãode oligonucleotídeos com o primer P11F (SEQ ID N° 202) e P11R (SEQID N0 203). O oligonucleotídeo combinado é purificado com gel sobre gel6% Ultra PAGE (Embi Tec, San Diego CA). O plasmídeo pFP988Dss-T-H-C é digerido com Xhol e Smal e o fragmento de vetor com 9 k bp épurificado com gel. O fragmento de P11 isolado é ligado com opFP988Dss-T-H-C digerido para criar ρ FP988-P11-T-H-C. O plasmídeopFP988-P11-T-H-C é digerido com Xhol e BamHI e o fragmento de P11-T-H-C com 3034 bp é purificado com gel. pFP988-DldhL::Cm é digeridocom Xhol e BamHI e o fragmento de vetor com 5558 bp é isolado. Ooperador de processo superior é ligado com o vetor de integração paracriar pFP988-DldhL-P11-THC::Cm.Integração de pFP988-DldhL-P1 1-THC::Cm em L. plantarum BAA-793 paraformar L. plantarum aldhli ::T-H-c"cm que compreende genes thl, hbd ecrtexógenos
Células eletrocompetentes de L. plantarum são preparadasconforme descrito por Aukrust, T. W. et al (em Electroporation Protocols forMicroorganisms\ Nickoloff1 J. A., ed.; Methods in Molecular Biology, vol. 47;Humana Press1 Inc., Totowa NJ1 1995, págs. 201-208). Após aeletroporação, as células são cultivadas em meio MRSSM (meio MRSsuplementado com 0,5 M sacarose e 0,1 M MgCI2) conforme descrito porAukrust et al, acima, por duas horas a 37 0C sem agitação. Célulaseletroporadas são colocadas para seleção sobre placas MRS que contêmcloranfenicol (10 pg/mL) e incubadas a 37 0C. Transformadores sãoselecionados inicialmente por meio de amplificação de PCR de colôniapara confirmar a integração e clones positivos iniciais são selecionadosmais rigorosamente em seguida por meio de amplificação de PCR combateria de primers.
Expressão de plasmídeq de genes EgTER. ald ε bdhB
Os três genes de 1-butanol restantes são expressos a partir doplasmídeo pTRKH3 (0'Sullivan, D. J. e Klaenhammer, T. R., Gene 137: 227-231 (1993)) sob o controle do promotor IdhL de L. plantarum (Ferain et al, J. -Bacteríol. 176: 596-601 (1994)). O promotor IdhL é amplificado por PCR a partirdo genoma de L. plantarum ATCC BAA-793 com os primers PIdhL F (SEQ IDN0 204) e PIdhL R (SEQ ID N0 205). O produto de PCR com 369 bp é clonadoem pCR4-Blunt-TOPO e seqüenciado. O plasmídeo resultante, pCR4-Blunt-TOPO-PIdhL1 é digerido com Sacl e BamHI, liberando o fragmento de PIdhLcom 359 bp.
pHT01-ald-EB, descrito no Exemplo 14, é digerido com Sacl eBamHI e o fragmento de vetor com 10503 bp é recuperado por meio depurificação com gel. O fragmento de PIdhL e o vetor são ligados, criandopHT101-Pldhl-ald-EB.
Para subclonar o conjunto de promotor de IdhL1 ald, EgTER ebdh, pHT01-Pldhl-ald-EB é digerido com Mlul e as extremidades sãotratadas com DNA polimerase Klenow. O vetor Iinearizado é digerido comSall e o fragmento com 4270 bp que contém o fragmento de PIdhL-AEB épurificado com gel. O plasmídeo pTRKH3 é digerido com Sall e EcoRV e ofragmento de vetor purificado com gel é ligado com o fragmento de PIdhL-AEB. A mistura de ligação é transformada em células TopIO de E. coli etransformadores são colocados sobre placas com Infusão do Coração eCérebro (BHI1 Difco Laboratories, Detroit Ml) que contêm eritromicina (150mg/l). Transformadores são selecionados por meio de PCR para confirmara construção de pTRKH3-ald-E-B. O plasmídeo de expressão, pTRKH3-ald-E-B, é transformado em L. plantarum AldhLI::T-H-C::Cm por meio deeletroporação, conforme descrito acima.
L. plantarum △IdhLI::T-H-C::Cm contendo pTRKH3-ald-E-B éinoculado em frasco de agitação com 250 mL que contém 50 mL de meio MRSmais eritromicina (10 pg/mL) e cultivado a 37°C por 18 a 24 horas semagitação. Após 18 a 24 horas, 1-butanol é detectado por meio de análise GC ouHPLC, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais.
Exemplo 19 (Profético)
Expressão da via biossintética de 1-Butanol em Enterococcus faecalis
O propósito deste Exemplo profético é o de descrever comoexpressar a via biossintética de 1-butanol em Enterococcus faecalis. Aseqüência de genoma completo de Enterococcus faecalis linhagem V583, queé utilizada como a linhagem hospedeira para a expressão da via biossintéticade 1-butanol neste Exemplo, foi publicada (Paulsen et al, Science 299: 2071-2074 (2003)). O plasmídeo pTRKH3 (O'Sullivan, D. J. e Klaenhammer, T. R.,Gene 137: 227-231 (1993)), vetor de impulso de E. coli/Grama-positivo, éutilizado para expressão dos seis genes (thIA, hbd, crt, EgTER, ald, bdhB) doprocesso de 1-butanol em um operador. pTRKH3 contém origem dereprodução p15A de plasmídeo de E. coli e a réplica de ρΑΜβ 1 e doismarcadores de seleção de resistência a antibióticos, resistência a tetraciclina eresistência à eritromicina. Resistência à tetraciclina somente é expressa em E coli ea resistência à eritromicina é expressa em E. coli e bactérias Grama-positivas. Osderivados do plasmídeo ρΑΜβΙ podem reproduzir-se em E. faecalis (Poyart et al,FEMS Microbiol. Lett. 156: 193-198 (1997)). O promotor de nisA indutível (PnisA)1que vem sendo utilizado para o controle eficiente de expressão genética por nisinaem uma série de bactérias Grama-positivas que incluem Enterococcus faecalis(Eichenbaum et al, Appl. Environ. Microbiol. 64: 2763-2769 (1998)) é utilizado paracontrolar a expressão dos seis genes desejados que codificam as enzimas da viabiossintética de 1-butanol.
O fragmento de DNA linear (215 bp) que contém o promotor nisA(Chandrapati et al, Moi Microbiol. 46 (2): 467-477 (2002)) é amplificado porPCR a partir de DNA genômico de Lactococcus Iactis com os primers F-PnisA(EcoRV) (SEQ ID N0 206) e R-PnisA (Pmel BamHI) (SEQ ID N0 207). Ofragmento de PCR com 215 bp é digerido com EcoRV e BamHI e o fragmentode PnisA resultãnte é purificado com gel. O plasmídeo pTRKH3 é digerido comEcoRV e BamHI e o fragmento de vetor é purificado com gel. O pTRKH3Iinearizado é ligado com o fragmento de PnisA. A mistura de ligação étransformada em células TopIO de E. coli por meio de eletroporação e ostransformadores são selecionados após crescimento por uma noite a 37 0Csobre placas agar LB que contêm eritromicina (25 pg/ml). Os transformadoressão selecionados por meio de PCR de colônia com primers F-PnisA (EcoRV) eR-PnisA (BamHI) para confirmar o clone correto de pTRKH3-PnisA.
O plasmídeo pTRKH3-PnisA é digerido com Pmel e BamHI e ovetor é purificado com gel. O plasmídeo ρΗΊΟλ-ald-EgTER-bdhB é construídoconforme descrito no Exemplo 14 e é digerido com Smal e BamHI e ofragmento de ald-EgTER-bdhB com 2973 bp é purificado com gel. O fragmentode ald-EgTER-bdhB com 2973 bp é ligado ao vetor pTRKH3-PnisA nos locaisPmel e BamHI. A mistura de ligação é transformada em células TopIO de E.coli por meio de eletroporação e os transformadores são selecionados apósincubação a 37 0C por uma noite sobre placas agar LB que contêm eritromicina(25 pg/mL). Os transformadores são selecionados em seguida por meio dePCR de colônia com os primers primer ald frontal N27F1 (SEQ ID N0 31) eprimer bdhB reverso N65 (SEQ ID N0 44). O plasmídeo resultante édenominado pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB (= pTRKH3-A-E-B).
O plasmídeo pTRKH3-A-E-B é purificado a partir do transformadore utilizado para clonagem adicional dos genes remanescentes (thIA, hbd, crt)no local BamHI localizado abaixo no fluxo do gene bdhB. O plasmídeopTRKH3-A-E-B é digerido com BamHI e tratado com o fragmento Klenow deDNA polimerase para elaborar extremidades obtusas. O plasmídeopFP988Dss-thlA-hbd-crt (= pFP988Dss-T-H-C) é construído conforme descritono Exemplo 14 e é digerido com Smal e BamHI. O fragmento de thIA-hbd-crtcom 2973 bp resultante é tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerasepara elaborar extremidades obtusas e é purificado com gel. O fragmento dethIA-hbd-crt com 2973 bp é ligado com o pTRKH3-A-E-B linearizado. A misturade ligação é transformada em células TopIO de E. coli por meio deeletroporação e os transformadores são selecionados após crescimento poruma noite a 37 0C sobre placas agar LB que contêm eritromicina (25 pg/mL).Os transformadores são selecionados em seguida por meio de PCR de colôniacom os primers primer frontal thIA N7 (SEQ ID N0 21) e primer reverso crt N4(SEQ ID N0 18). O plasmídeo resultante é denominado pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB-thlA-hbd-crt (= pTRKH3-A-E-B-T-H-C). O plasmídeo pTRKH3-A-E-B-T-H-C é preparado a partir dos transformadores de E. coli e transformadoem células E. faecalis V583 eletrocompetentes por meio de eletroporaçãoutilizando métodos conhecidos na técnica (Aukrust, T. W. et al emElectroporation Protocols for Microorganisms; Nickoloff, J. A., Ed.; Methods inMolecular Biology, Vol. 47; Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1995, págs. 217-226), resultando em E. faecalis V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C.
O segundo plasmídeo que contém genes reguladores nisA, nisR enisK, o gene de resistência à espectinomicina add9 e a origem de reproduçãode pSH71 é transformado em E. faecalis V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C por meiode eletroporação. O plasmídeo que contém a origem de reprodução de pSH71é compatível com derivados de ρΑΜβΙ em E. faecalis (Eichenbaum et al,acima). Transformadores resistentes a drogas duplos são selecionados sobreplaca agar LB contendo eritromicina (25 pg/mL) e espectinomicina (100 pg/mL).
A linhagem de E. faecalis V583B resultante que abriga doisplasmídeos, ou seja, plasmídeo de expressão (pTRKH3-A-E-B-T-H-C) eplasmídeo regulador (pSH71-nisRK), é inoculada em frasco de agitação com250 mL que contém 50 mL de caldo Todd-Hewitt suplementado com extrato delevedura (0,2%) (Fischetti et al, J. Exp. Med. 161: 1384-1401 (1985)), nisina (20pg/mL (Eichenbaum et al, acima), eritromicina (25 pg/mL) e espectinomicina(100 pg/mL). Ò frasco é incubado sem agitação a 37 °C por 18 a 24 horas, -após o quê a produção de 1-butanol é medida por meio de análise GC ouHPLC, conforme descrito no capítulo Métodos Gerais.Listagem de Seqüências
<110> E.i. du Pont de Nemours and Co.
<120> Produção Fermentativa de Álcoois
<130> CL3241 PCT
<160> 208
<170> Patentln version 3.3
<210> <211> <212> <213> 1 1179 DNA Ciostridium acetobutylicum
<400> 1 atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa 120gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt 180ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca 240gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa 300attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt 420gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca 480gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt 540gcatcacaaa aaaaagctga agaagctata aaatcaggtc aatttaaaga tgaaatagtt 600cctgtagtaa ttaaaggcag aaagggagaa actgtagttg atacagatga gcaccctaga 660tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca 720gttacagctg gtaatgcatc aggattaaat gactgtgcag cagtacttgt aatcatgagt 780gcagaaaaag ctaaagagct tggagtaaaa ccacttgcta agatagtttc ttatggttca 840gcaggagttg acccagcaat aatgggatat ggacctttct atgcaacaaa agcagctatt 900gaaaaagcag gttggacagt tgatgaatta gatttaatag aatcaaatga agcttttgca 960gctcaaagtt tagcagtagc aaaagattta aaatttgata tgaataaagt aaatgtaaat 1020ggaggagcta ttgcccttgg tcatccaatt ggagcatcag gtgcaagaat actcgttact 1080cttgtacacg caatgcaaaa aagagatgca aaaaaaggct tagcaacttt atgtataggt 1140ggcggacaag gaacagcaat attgctagaa aagtgctag 1179
<210> 2
<211> 392
<212> PRT
<213> ciostridium acetobutylicum
<400> 2Met Lys Glu vai vai Ile Ala ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly ser1 5 10 15
Tyr Gly Lys ser Leu Lys Asp Val Pro Ala vai Asp Leu Gly Ala Thr20 25 30
Ala lie Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val35 40 45
Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn50 55 60
Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro65 70 75 80
Ala Met Thr Ile Asn Lys vai Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val ser85 90 95
Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala100 105 110
Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala115 120 125
Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile130 135 140
Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr145 150 155 160
Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile ser Arg GTu Glu Gln Asp165 170 175
Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu GTu Ala Ile Lys Ser180 185 190
Gly Gln Phe Lys Asp-Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys195 200 205
Gly Glu Thr vai Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr210 215 220
Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr225 230 235 240
vai Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu245 250 255
Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu260 265 270Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly vai Asp Pro Ala Ile Met275 280 285
Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly290 295 300
Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala305 310 315 320
Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys325 330 335
Val Asn vai Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala340 345 350
Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg355 360 365
Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly37 375 380
Thr Ala lie Leu Leu Glu Lys Cys385 390
<210> 3<211> 1179<212> DNA<213> ciostridium acetobutylicum
<400> 3
atgagagatg tagtaatagt aagtgctgta agaactgcaa taggagcata tggaaaaaca 60
ttaaaggatg tacctgcaac agagttagga gctatagtaa taaaggaagc tgtaagaaga 120
gctaatataa atccaaatga gattaatgaa gttatttttg gaaatgtact tcaagctgga 180
ttaggccaaa acccagcaag acaagcagca gtaaaagcag gattaccttt agaaacacct 240
gcgtttacaa tcaataaggt ttgtggttca ggtttaagat ctataagttt agcagctcaa 300
attataaaag ctggagatgc tgataccatt gtagtaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360
tcaccatatt tgattaacaa tcagagatgg ggtcaaagaa tgggagatag tgaattagtt 420
gatgaaatga taaaggatgg tttgtgggat gcatttaatg gatatcatat gggagtaact 480
gcagaaaata ttgcagaaca atggaatata acaagagaag agcaagatga attttcactt 540
atgtcacaac aaaaagctga aaaagccatt aaaaatggag aatttaagga tgaaatagtt 600
cctgtattaa taaagactaa aaaaggtgaa atagtctttg atcaagatga atttcctaga 660
ttcggaaaca ctattgaagc attaagaaaa cttaaaccta ttttcaagga aaatggtact 720
gttacagcag gtaatgcatc cggattaaat gatggagctg cagcactagt aataatgagc 780
gctgataaag ctaacgctct cggaataaaa ccacttgcta agattacttc ttacggatca 840tatggggtag atccatcaat aatgggatat ggagcttttt atgcaactaa agctgcctta 900
gataaaatta atttaaaacc tgaagactta gatttaattg aagctaacga ggcatatgct 960
tctcaaagta tagcagtaac tagagattta aatttagata tgagtaaagt taatgttaat 1020
ggtggagcta tagcacttgg acatccaata ggtgcatctg gtgcacgtat tttagtaaca 1080
ttactatacg ctatgcaaaa aagagattca aaaaaaggtc ttgctactct atgtattggt 1140
ggaggtcagg gaacagctct cgtagttgaa agagactaa 1179
<210> 4<211> 392<212> PRT
<213> ciostridium acetobutyIicum<400> 4
Met Arg Asp Val Val Ile Val Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ala1 5 10 15
Tyr Gly Lys Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ala Ile20 25 30
Val Ile Lys Glu Ala Val Arg Arg Ala Asn Ile Asn Pro Asn Glu Ile35 40 45
Asn Glu Val Ile Phe Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn50 55 60
Pro Ala Arg Gln Ala Ala Val Lys Ala Gly Leu Pro Leu Glu Thr Pro65 70 75 80
Ala Phe Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Ser Ile Ser85 90 95
Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ile Val Val100 105 110
Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ser Pro Tyr Leu Ile Asn Asn Gln115 120 125
Arg Trp Gly Gln Arg Met Gly Asp Ser Glu Leu Val Asp Glu Met Ile130 135 140
Lys Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Gly Tyr His Met Gly Val Thr145 150 155 160
Ala Glu Asn Ile Ala Glu Gln Trp Asn Ile Thr Arg Glu Glu Gln Asp165 170 175
Glu Phe Ser Leu Met Ser Gln Gln Lys Ala Glu Lys Ala Ile Lys Asn180 185 190Gly Glu Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Lys Thr Lys Lys195 200 205
Gly Glu Ile Val Phe Asp Gln Asp Glu Phe Pro Arg Phe Gly Asn Thr210 215 220
Ile Glu Ala Leu Arg Lys Leu Lys Pro Ile Phe Lys Glu Asn Gly Thr225 230 235 240
Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu245 250 255
Val ile Met ser Ala Asp Lys Ala Asn Ala Leu Gly Ile Lys Pro Leu260 265 270
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Gly Tyr Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Leu Asp Lys Ile Asn290 295 300
Leu Lys Pro Glu Asp Leu Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Tyr Ala305 310 315 320
Ser Gln ser Ile Ala Val Thr Arg Asp Leu Asn Leu Asp Met Ser Lys325 330 335
Val Asn vai Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala340 345 350
Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu Tyr Ala Met Gln Lys Arg355 360 365
Asp Ser Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly370 375 380
Thr Ala Leu vai Val Glu Arg Asp385 390
<210> 5<211> 849<212> DNA
<213> ciostridium acetobutylicum<400> 5
atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt 420aatccagctc ctgttatgaa. gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840tcaaaataa 849
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<211> 282
<212> PRT
<213> ciostridium acetobutyIicum
<400> 6
Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile1 5 10 15
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Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro130 135 140
Val Met Lys Leu Val Glu vai Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu
145 150 155 160Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro165 170 175
val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile180 185 190
Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala ser195 200 205
Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met210 215 220
Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala225 230 235 240
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Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr ser Lys275 280
<210> 7<211> 786<212> DNA<213> Clostridíum acetobutylicum
<400> 7
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<210> 8<211> 261<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum<400> 8
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Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly130 135 140
Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln145 150 155 160
Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile165 170 175
Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala180 185 190
Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys195 200 205
Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr210 215 220
Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu
225 230 235 240Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu245 250 255
Gly Phe Lys Asn Arg260
<210> 9<211> 1197<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylícum
<400> 9
atgatagtaa aagcaaagtt tgtaaaagga tttatcagag atgtacatcc ttatggttgc 60agaagggaag tactaaatca aatagattat tgtaagaagg ctattgggtt taggggacca 120aagaaggttt taattgttgg agcctcatct gggtttggtc ttgctactag aatttcagtt 180gcatttggag gtccagaagc tcacacaatt ggagtatcct atgaaacagg agctacagat 240agaagaatag gaacagcggg atggtataat aacatatttt ttaaagaatt tgctaaaaaa 300aaaggattag ttgcaaaaaa cttcattgag gatgcctttt ctaatgaaac caaagataaa 360gttattaagt atataaagga tgaatttggt aaaatagatt tatttgttta tagtttagct 420gcgcctagga gaaaggacta taaaactgga aatgtttatá cttcaagaat aãaaacaatt 480ttaggagatt ttgagggacc gactattgat gttgaaagag acgagattac tttaaaaaag 540gttagtagtg ctagcattga agaaattgaa gaaactagaa aggtaatggg tggagaggat 600tggcaagagt ggtgtgaaga gctgctttat gaagattgtt tttcggataa agcaactacc 660atagcataçt cgtatatagg atccccaaga acctacaaga tatatagaga aggtactata 720ggaatagcta aaaaggatct tgaagataag gctaagctta taaatgaaaa acttaacaga 780gttataggtg gtagagcctt tgtgtctgtg aataaagcat tagttacaaa agcaagtgca 840tatattccaa CttttCCtCt ttatgcagçt attttatata aggtcatgaa agaaaaaaat 900attcatgaaa attgtattat gcaaattgag agaatgtttt ctgaaaaaat atattcaaat 960gaaaaaatac aatttgatga caagggaaga ttaaggatgg acgatttaga gcttagaaaa 1020gacgttcaag acgaagttga tagaatatgg agtaatatta ctcctgaaaa ttttaaggaa 1080ttatctgatt ataagggata caaaaaagaa ttcatgaact taaacggttt tgatctagat 1140ggggttgatt atagtaaaga cctggatata gaattattaa gaaaattaga accttaa 1197
<210> 10
<211> 398
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylícum
<400> 10
Met Ile vai Lys Ala Lys Phe Val Lys lGly Phe Ile Arg Asp Val His1 5 10 15Pro Tyr Gly Cys Arg Arg Glu Val Leu Asn Gln lie Asp Tyr Cys Lys20 25 30
Lys Ala Ile Gly Phe Arg Gly Pro Lys Lys Val Leu Ile Val Gly Ala35 40 45
Ser Ser Gly Phe Gly Leu Ala Thr Arg Ile ser Val Ala Phe Gly Gly50 55 60
Pro Glu Ala His Thr Ile Gly Val Ser Tyr Glu Thr Gly Ala Thr Asp65 70 75 80
Arg Arg Ile Gly Thr Ala Gly Trp Tyr Asn Asn Ile Phe Phe Lys Glu85 90 95
Phe Ala Lys Lys Lys Gly Leu Val Ala Lys Asn Phe Ile Glu Asp Ala100 105 110
Phe Ser Asn Glu Thr Lys Asp Lys Val Ile Lys Tyr Ile Lys Asp Glu115 120 125
Phe Gly Lys Ile Asp Leu Phe Val Tyr Ser Leu Ala Ala Pro Arg Arg130 135 140
Lys Asp Tyr Lys Thr Gly Asn Val Tyr Thr Ser Arg Ile Lys Thr Ile145 150 155 160
Leu Gly Asp Phe Glu Gly Pro Thr Ile Asp Val Glu Arg Asp Glu Ile165 170 175
Thr Leu Lys Lys Val Ser Ser Ala Ser Ile Glu Glu Ile Glu Glu Thr180 185 190
Arg Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Gln Glu Trp Cys Glu Glu Leu195 200 205
Leu Tyr Glu Asp Cys Phe Ser Asp Lys Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ser210 215 220
Tyr Ile Gly Ser Pro Arg Thr Tyr Lys Ile Tyr Arg Glu Gly Thr Ile225 230 235 240
Gly Ile Ala Lys Lys Asp Leu Glu Asp Lys Ala Lys Leu Ile Asn Glu245 250 255
Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Gly Arg Ala Phe Val Ser Val Asn Lys260 265 270
Ala Leu Val Thr Lys Ala Ser Ala Tyr Ile Pro Thr Phe Pro Leu Tyr
275 280 285Ala Ala Ile Leu Tyr Lys Val Met Lys Glu Lys Asn Ile His Glu Asn290 295 300
Cys Ile Met Gln Ile Glu Arg Met Phe Ser,Glu Lys Ile Tyr ser Asn305 310 315 320
Glu Lys Ile Gln Phe Asp Asp Lys Gly Arg Leu Arg Met Asp Asp Leu325 330 335
Glu Leu Arg Lys Asp vai Gln Asp Glu vai Asp Arg Ile Trp ser Asn340 345 350
Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Lys Gly Tyr Lys355 360 365
Lys Glu Phe Met Asn Leu Asn Gly Phe Asp Leu Asp Gly Val Asp Tyr
Ser Lys Asp Leu Asp Ile Glu Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro385 390 395
<210> 11<211> 1407<212> DNA
<213> Clostridium beijerinckii<400> 11
atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60
aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggagtatt cgaaaatgtt 120
gaaaatgcta taagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180
gagcaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattacaaaa taaagaggtc 240
ttggctacaa tgattctaga agaaacacat atgggaagat atgaggataa aatattaaaa 300
catgaattgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcttggtca 360
ggtgataatg gtcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttatagg tgcaataact 420
ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca taggcatgat agctgctgga 480
aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540
atgataaata aggcaattat ttcatgtggc ggtcctgaaa atctagtaac aactataaaa 600
aatccaacta tggagtctct agatgcaatt attaagcatc cttcaataaa acttctttgc 660
ggaactgggg gtccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720
gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780
aggagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840
gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960
gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattctta 1020
gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca taatctgcga agtaaatgca 1080
aatcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat tgccaattgt aagagttaaa 1140
gatatagatg aagctattaa atatgcaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200
tatatttatt ctaaaaatat agacaaccta aatagatttg aaagagaaat agatactact 1260
atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttaca 1320
actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggaataacct ctgcaaggaa ttttacaaga 1380
caaagaagat gtgtacttgc cggctaa 1407
<210> 12
<211> 468
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 12
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Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val115 120 125
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Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly145 150 155 160
Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys cys Val Ala165 170 175Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile ser Cys Gly Gly Pro180 185 190
Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp195 200 205
Ala Ile Ile Lys His Pro ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly210 215 220
Pro Gly Met vai Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly225 230 235 240
Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val lie vai Asp Asp Thr Ala Asp Ile245 250 255
Glu Lys Ala Gly Arg ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn260 265 270
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Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val420 425 430Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe435
Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly ser Thr
440
445
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Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys460
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455
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<213> Clostridium acetobutylicum<400> 13
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agtataaaga gaaatggaat atatgataaa gctgtaagta tacttgaaaa aaacagtatt 180
aaattttatg aacttgcagg agtagagcca aatccaagag taactacagt tgaaaaagga 240
gttaaaatat gtagagaaaa tggagttgaa gtagtactag ctataggtgg aggaagtgca 300
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gtgttagatg gctcaaaaat aaaaagggtg cttcctatag ctagtatatt aaccattgct 420
gcaacaggat cagaaatgga tacgtgggca gtaataaata atatggatac aaacgaaaaa 480
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tataccgtac ctaccaatca aacagcagca ggaacagctg atattatgag tcatatattt 600
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ttaagaactt gtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggca 720
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gacactaatt ggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataaca 840
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cactatgaca tagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtacta 1020
ggtttaccat ctagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggca 1080
aaggaatcag taaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaaçgcctcc 1140
gaagtcctac aaatattcaa aaaatctgtg taaaacgcct ccgaagtcct acaaatattc 1200
aaaaaatctg tgtaa 1215
<210> 14
<211> 390
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 14Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys1 5 10 15
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Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr35 40 45
Asp Lys Ala Val ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu50 55 60
Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr vai Glu Lys Gly65 70 75 80
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Gly Gly ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu100 105 110
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Glu Met Asp Thr Trp Ala Val lie Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys145 150 155 160
Leu Ϊ1e Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp165 170 175
Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr180 185 190
Ala Asp Ile Met ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys210 215 220
Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala225 230 235 240
Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala ser ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu245 250 255
Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu260 265 270Leu ser Ala Tyr Tyr Asp lie Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu275 280 285
Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys290 295 3Ò0
Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn305 310 315 320
His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe325 330 335
Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly lie Glu340 345 350
Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly355 360 365
Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln
Ile Phe Lys Lys Ser Val385 390
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ttaagaacat gtataaagta tggaaaaata gcaatggaga agactgatga ttacgaggct 720
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<211> 389
<212> PRT
<213> ciostridium acetobutyIicum
<400> 16
Met Leu Ser Phe Asp Tyr ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys1 5 10 15
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Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Met Glu Lys Thr Asp Asp Tyr Glu Ala225 230 235 240
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Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu275 280 285
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Phe Val Ser Tyr Gly Ile Asn vai Trp Gly Ile Asp Lys Asn Lys Asp305 310 315 320
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Asn Ser Leu Gly Ile Pro Ser Lys Leu Arg Glu VaT Gly Ile Gly Lys340 345 350
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Phe Lys Lys Ser Tyr
385
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<211> 29
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<212> DNA
<21Β> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 18
cctcctatct atttttgaag ccttc
<210> 19
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<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 19
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<210> 20
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<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 20
catttgataa tggggattct tgt
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Primer
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<210> 22
<211> 26
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<220>
<223> Primer
<400> 22
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<223> Primer<400> 29
caccatgata gtaaaagcaa agtttg
<210> 30
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<223> Primer
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<210> 31
<211> 27
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<223> Primer
<400> 31
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<210> 32
<211> 24
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<223> Primer
<400> 32
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<210> 33
<211> 35
<212> DNA
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<223> Primer
<400> 33
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<210> 34
<211> 38
<212> DNA
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<223> Primer
<400> 34
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<220>
<223> Primer
Artificial
<400> 35
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<211> 28
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<223> Primer
<400> 36
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<211> 44
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 37
catagatctg gatccaaagg agggtgagga aatgatagta aaag
<210> 38
<21í> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 38
catgtcgacg tgcagccttt ttaaggttct
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer<400> 40
gtcggatccc ttacctccta tctatttttg
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 41
catgcccggg ggtcaccaaa ggaggaatag ttcatgaata aa
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 42
catggttaac aagaagttag ccggcaagta ca
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 43
catggttaac aaaggagggg ttaaaatggt tgatttcgaa t
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 44
catggcatgc gtttaaacgt aggtttacac agatttt
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 45
gtaaaacgac ggccagt<210> 46<211> 16<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 46aacagctatg accatg
16
<210> 47<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 47
gcaggagatg ctgacgtaat aa
22
<210> 48<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer<400> 48
ccaacctgct ttttcaatag ctgc 24
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 49
cagagatggg gtcaaagaat g
21
<210> 50<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 50
gtggttttat tccgagagcg
20
<210> 51<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer<400> 51
ggtctatact tagaatctcc
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 52
cggaacagtt gaccttaata tggc
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 53
gcctcatctg ggtttggtct tg
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 54
cgcctaggag aaaggactat aaaactgg
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 55
cagagttata ggtggtagag cc
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 56
ccatcccgct gttcctattc ttct
<210> 57<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer<400> 57
ccaatcctct ccacccatta cc
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 58
cgtccatcct taatcttccc
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 59
ccaactatgg aatccctaga tgc
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 60
gcatagtctg cgaagtaaat gc
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 61
ggatctactg gtgaaggcat aacc
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer
Artificial
<400> 62ggcatcatga gttctgtcat gac
<210> 63<211> 25<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer<400> 63
gccttcaatg atactcttac cagcc
<210> 64<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer<400> 64
gcatttccag cagctatcat gc
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 65
ccttcccata tgtgtttctt cc
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 66
gttgaagtag tactagctat ag
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 67
gacataacac acggcgtagg gc
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 68
taagtgtaca ctccaattag tg 22
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 69
gccatctaac acaatatccc atgg 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 70
gcgatacatg ggacatggtt aaag 24
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213>- Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 71
tgcacttaac tcgtgttcca ta 22
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 72
gttagccggc aagtacacat c 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 73
actttctttc gcctgtttca c 21<210> 74
<211> 47
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 74
catgaagctt ggcgcgccgg gacgcgtttt tgaaaataat gaaaact 47
<210> 75
<211> 79
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer
<400> 75
catgaagctt gtttaaactc ggtgaccttg aaaataatga aaacttatat tgttttgaaa 60ataatgaaaa cttatattg 79
<210> 76
<211> 1197
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Codon otimizado do gene CAC0462 do Clostridium acetobutylicum
<400> 76
atgattgtga aagcaaaatt cgtgaaagga ttcattcgcg atgtgcaccc ttatgggtgc 60cgccgtgaag ttctgaatca gatcgactac tgcaaaaaag ccattggctt tcgcggccca 120aagaaagtgc tgatcgttgg tgcttcctct ggcttcggtc tggctacccg catttccgtg 180gcgttcggtg gcccagaagc ccacactatc ggcgtcagct atgaaaccgg tgcgaccgat 240cgccgtattg gcacagcagg gtggtataac aatattttct ttaaagaatt tgccaaaaag 300aaaggcctgg tggcaaaaaa ctttatcgaa gacgccttct cgaacgaaac caaggacaaa 360gtcatcaaat atattaaaga cgaatttggc aaaatcgatc tgttcgttta ctcgctggca 420gcaccgcgtc gtaaggatta taagactggg aacgtttata cctcacgtat taaaacgatc 480ctgggtgatt ttgaagggcc gactatcgat gtggaacgtg atgaaattac actgaaaaag 540gtctcatctg cgtcaatcga agagattgaa gaaacccgta aggtgatggg cggcgaagat 600tggcaagagt ggtgtgaaga actgctgtac gaagattgtt tcagtgataa agccaccacc 660atcgcctatt cctatatcgg ttctcctcgc acctacaaaa tctaccgcga aggcactatc 720ggcattgcga aaaaggatct ggaagataag gcaaaactga tcaacgagaa gctgaatcgc 780gtcattggcg ggcgcgcatt cgttagcgtg aataaagccc tggttactaa ggcgagcgca 840tatattccga cctttcctct gtacgccgca attctgtata aagttatgaa agaaaagaat 900attcacgaaa actgcattat gcaaattgaa cgcatgtttt ccgagaaaat ttattcaaat 960gaaaagattc aatttgatga taaaggtcgt ctgcgtatgg atgacctgga gctgcgtaag 1020gatgttcagg atgaagtaga ccgtatttgg agcaatatta caccggagaa ttttaaggaa 1080ctgagcgact ataaaggcta caaaaaagaa tttatgaacc tgaatggatt tgatctggac 1140ggcgtggatt attcaaagga tctggacatt gaactgctgc gcaaactgga accataa 1197
<210> 77 <211>
1224
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<223> Códon otimizado EgTER
<400> 77
atggcgatgt ttacgaccac cgcaaaagtt attcagccga aaattcgtgg ttttatttgc 60accaccaccc acccgattgg ttgcgaaaaa cgtgttcagg aagaaatcgc atacgcacgc 120gcgcacccgc cgaccagccc gggtccgaaa cgtgtgctgg ttattggctg cagtacgggc 180tatggcctga gcacccgtat caccgcggcc tttggttatc aggccgcaac cctgggcgtg 240tttctggcag gcccgccgac caaaggccgt ccggccgcgg cgggttggta taatacggtt 300gcgttcgaaa aagccgccct ggaagcaggt ctgtatgcac gttctctgaa tggtgatgcg 360ttcgattcta ccacgaaagc ccgcaccgtg gaagcaatta aacgtgatct gggtaccgtt 420gatctggtgg tgtatagcat tgcagcgccg aaacgtaccg atccggccac cggcgtgctg 480cataaagcgt gcctgaaacc gattggtgca acctacacca atcgtacggt gaacaccgat 540aaagcagaag ttaccgatgt gagtattgaa ccggccagtc cggaagaaat cgcagatacc 600gtgaaagtta tgggtggcga agattgggaa ctgtggattc aggcactgag cgaagccggc 660gtgctggccg aaggcgcaaa aaccgttgcg tattcttata ttggcccgga aatgacgtgg 720ccggtgtatt ggagtggcac cattggcgaa gccaaaaaag atgttgaaaa agcggcgaaa 780cgcatcaccc agcagtacgg ctgtccggcg tatccggttg ttgccaaagc gctggtgacc 840caggccagta gcgccattcc ggtggtgccg ctgtatattt gcctgctgta tcgtgttatg 900aaagaaaaag gcacccatga aggctgcatt gaacagatgg tgcgtctgct gacgacgaaa 960ctgtatccgg aaaatggtgc gccgatcgtg gatgaagcgg gccgtgtgcg tgttgatgat 1020tgggaaatgg cagaagatgt tcagcaggca gttaaagatc tgtggagcca ggtgagtacg 1080gccaatctga aagatattag cgattttgca ggttatcaga ccgaatttct gcgtctgttt 1140ggctttggta ttgatggtgt ggattacgat cagccggttg atgttgaagc ggatctgccg 1200agcgccgccc agcagtaagt cgac 1224
<210> 78
<211> 1498
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Códon otimizado do gene ALD<400> 78
cggtacctcg cgaatgcatc tagatccaat catgcccggg ggtcaccaaa ggaggaatag 60ttcatgaata aagatacgct gattccgacc acgaaagatc tgaaagtgaa aaccaacggt 120gaaaatatca acctgaaaaa ttataaagat aatagcagct gcttcggcgt gtttgaaaat 180gttgaaaacg ccatttcttc tgccgttcac gcacagaaaa tcctgtctct gcactatacc 240aaagaacagc gcgaaaaaat cattaccgaa attcgcaaag cggccctgca gaataaagaa 300gttctggcga ccatgatcct ggaagaaacc catatgggtc gttacgaaga taaaatcctg 360aaacatgaac tggtggcgaa atacacgccg ggtacggaag atctgaccac gaccgcatgg 420agcggtgata acggtctgac cgtggtggaa atgtctccgt atggcgttat tggcgcaatt 480acgccgagca cgaatccgac cgaaacggtt atttgtaaca gtattggcat gattgcagcc 540ggtaatgcag tggttttcaa tggtcatccg tgcgccaaaa aatgtgtggc gtttgccgtt 600gaaatgatta acaaagcgat tattagctgc ggtggcccgg aaaatctggt gacgacgatt 660aaaaacccga ccatggaaag tctggatgcg attattaaac atccgtctat taaactgctg 720tgtggtaccg gcggtccggg tatggtgaaa accctgctga attctggcaa aaaagcaatt 780ggcgcgggtg cgggtaatcc gccggttatc gttgatgata ccgcggatat tgaaaaagca 840ggccgcagta ttattgaagg ttgtagcttt gataataacc tgccgtgcat tgccgaaaaa 900gaagtgtttg ttttcgaaaa tgtggcggat gatctgatca gcaacatgct gaaaaataac 960gccgtgatta ttaacgaaga tcaggtgtct aaactgattg atctggttct gcagaaaaac 1020aacgaaacgc aggaatattt cattaataaa aaatgggttg gtaaagatgc gaaactgttc 1080ctggatgaaa tcgatgtgga aagtccgagc aacgtgaaat gtatcatctg cgaagtgaat 1140gccaaccatc cgtttgttat gacggaactg atgatgccga ttctgccgat tgttcgtgtt 1200aaagatattg atgaagccat caaatatgcg aaaattgcgg aacagaaccg caaacacagc 1260gcatatattt acagtaaaaa catcgataac ctgaaccgtt tcgaacgtga aattgatacc 1320accatctttg tgaaaaatgc caaaagtttt gcgggtgttg gctatgaagc cgaaggcttt 1380accacgttca ccattgcagg ttctaccggc gaaggtatta ccagcgcgcg taattttacc '1440cgccagcgcc gctgtgtgct ggcgggttaa gttaacccaa tatcggatcc cgggcccg 1498
60
120
<210> 79<211> 6509<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> pIasmideo PFP988<400> 79
tcgaggcccc gcacatacga aaagactggc tgaaaacatt gagcctttga tgactgatgatttggctgaa gaagtggatc gattgtttga gaaaagaaga agaccataaá aataccttgtctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaatagga 180ataaaggggg gttgttatta ttttactgat atgtaaaata taatttgtat aaggaattgt 240gagcggataa caattcctac gaaaatgaga gggagaggaa acatgattca aaaacgaaag 300cggacagttt cgttcagact tgtgcttatg tgcacgctgt tatttgtcag tttgccgatt 360acaaaaacat cagccggatc ccaccatcac catcaccatt aagaattcct agaaactcca 420agctatcttt aaaaaatcta gtaaatgcac gagcaacatc ttttgttgct cagtgcattt 480tttattttgt acactagata tttcttctcc gcttaaatca tcaaagaaat ctttatcact 540tgtaaccagt ccgtccacat gtcgaattgc atctgaccga attttacgtt tccctgaata 600attctcatca atcgtttcat caattttatc tttatacttt atattttgtg cgttaatcaa 660atcataattt ttatatgttt cctcatgatt tatgtcttta ttattatagt ttttattctc 720tctttgatta tgtctttgta tcccgtttgt attacttgat cctttaactc tggcaaccct 780caaaattgaa tgagacatgc tacacctccg gataataaat atatataaac gtatatagat 840ttcataaagt ctaacacact agacttattt acttcgtaat taagtcgtta aaccgtgtgc 900tctacgacca aaactataaa acctttaaga actttctttt tttacaagaa aaaagaaatt 960agataaatct ctcatatctt ttattcaata atcgcatccg attgcagtat aàatttaacg 1020atcactcatc atgttcatat ttatcagagc tcgtgctata attatactaa ttttataagg 1080aggaaaaaat atgggcattt ttagtatttt tgtaatcagc acagttcatt atcaaccaaa 1140caaaaaataa gtggttataa tgaatcgtta ataagcaaaa ttcatataac caaattaaag 1200agggttataa tgaacgagaa aaatataaaa cacagtcaaa actttattac ttcaaaacat 1260aatatagata aaataatgac aaatataaga ttaaatgaac atgataatat ctttgaaatc 1320ggctcaggaa aaggccattt tacccttgaa ttagtaaaga ggtgtaattt cgtaactgcc 1380attgaaatag accataaatt atgcaaaact acagaaaata aacttgttga tcacgataat 1440ttccaagttt taaacaagga tatattgcag tttaaatttc ctaaaaacca atcctataaa 1500atatatggta atatacctta taacataagt acggatataa tacgcaaaat tgtttttgat 1560agtatagcta atgagattta tttaatcgtg gaatacgggt ttgctaaaag attattaaat 1620acaaaacgct cattggcatt acttttaatg gcagaagttg atatttctat attaagtatg 1680gttccaagag aatattttca tcctaaacct aaagtgaata gctcacttat cagattaagt 1740agaaaaaaat caagaatatc acacaaagat aaacaaaagt ataattattt cgttatgaaa 1800tgggttaaca aagaatacaa gaaaatattt acaaaaaatc aatttaacaa ttccttaaaa 1860catgcaggaa ttgacgattt aaacaatatt agctttgaac aattcttatc tcttttcaat 1920agctataaat tatttaataa gtaagttaag ggatgcagtt catcgatgaa ggcaactaca 1980gctcaggcga caaccatacg ctgagagatc ctcactacgt agaagataaa ggccacaaat 2040acttagtatt tgaagcaaac actggaactg aagatggcta ccaaggcgaa gaatctttat 2100ttaacaaagc atactatggc aaaagcacat cattcttccg tcaagaaagt caaaaacttc 2160tgcaaagcga taaaaaacgc acggctgagt tagcaaacgg cgctctcggt atgattgagc 2220taaacgatga ttacacactg aaaaaagtga tgaaacCgct gattgcatct aacacagtaa 2280cagatgaaat tgaacgcgcg aacgtcttta aaatgaacgg caaatggtac ctgttcactg 2340actcccgcgg atcaaaaatg acgattgacg gcattacgtc taacgatatt tacatgcttg . 2400gttatgtttc taattcttta actggcccat acaagccgct gaacaaaact ggccttgtgt 2460taaaaatgga tcttgatcct aacgatgtaa cctttactta ctcacacttc gctgtacctc 2520aagcgaaagg aaacaatgtc gtgattacaa gctatatgac aaacagagga ttctacgcag 2580acaaacaatc aacgtttgcg ccaagcttgc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa 2640ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 2700aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 2760cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 2820gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa 2880tacattcaaa tatgtatccg ctcatgctcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac 2940cctgtggaac acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc 3000tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg 3060catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta 3120cccccatgaa cagaaattcc cccttacacg gaggcatcaa gtgaccaaac aggaaaaaac 3180cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa 3240cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga 3300gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 3360gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 3420gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 3480tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 3540catatgcgcjt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct 3600tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 3660gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 3720atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3780ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 3840cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 3900tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 3960gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 4020aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 4080tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 4140aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 4200aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 4260ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 4320ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 4380atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 4440atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 4500tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 4560gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 4620tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 4680gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 4740cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 4800gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc 4860atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 4920aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 4980atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 5040aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 5100aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 5160gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 5220gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 5280gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 5340ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 5400ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 5460atatttgaat gtatttagaa: aaatãaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 5520gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 5580atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 5640cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 5700cagggcgcgt cagcgggtgt tcatgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa acaggagggc 5760tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa 5820aaagtttgca aaacaagcaa cagtattaac ctttactacc gcactgctgg caggaggcgc 5880aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat aaggaaacat acggcatttc 5940ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag caaaaaaatg aaaaatatca 6000agttcctgaa ttcgattcgt ccacaattaa aaatatctct tctgcaaaag gcctggacgt 6060ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtc gcaaactatc acggctacca 6120catcgtcttt gcattagccg gagatcctaa aaatgcggat gacacatcga tttacatgtt 6180
ctatcaaaaa gtcggcgaaa cttctattga cagctggaaa aacgctggcc gcgtctttaa 6240
agacagcgac aaattcgatg caaatgattc tatcctaaaa gaccaaacac aagaatggtc 6300
aggttcagcc acatttacat ctgacggaaa aatccgttta ttctacactg atttctccgg 6360
taaacattac ggcaaacaaa cactgacaac tgcaeaagtt aacgtatcag catcagacag 6420
ctctttgaac atcaacggtg tagaggatta taaatcaatc tttgacggtg acggaaaaac 6480
gtatcaaaat gtacagcatg ccacgcgtc 6509
<210> 80
<211> 46
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer Ν85
<400> 80
catagatctg gatccaaagg agggtgagga aatggcgatg tttacg 46
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer N86
<400> 81
gtcgacttac tgctgggcgg 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> T7 primer
<400> 82
taatacgact cactataggg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Trc99af
<400> 83
ttgacaatta atcatccggc 20
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<22Β> Primer N5SeqF4<400> 84
ggtcaactgt tccggaaatt c
<210> 85<211> 46<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Primer T-ALD (BamHI)<400> 85
tgatctggat ccaagaagga gcccttcacc atgaataaag acacac
<210> 86<211> 54<212> DNA
Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer B-ALD (ETGER)<400> 86
catcgccatt tcctcaccct cctttttagc cggcaagtac acatcttctt tgtc
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer T-Ptrc (BspEI)
<400> 87
ttccgtactt ccggacgact gcacggtgca ccaatgcttc tg
<210> 88
<211> 43
<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Primer B-aldopt(BspEI)
<400> 88
cggatcttaa gtactttaac ccgccagcac acagcggcgc tgg
<210> 89<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer T-BspEIAatII<400> 89
ccggatcatg ataataatgg tttcttagac gt<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer B-BspEIAatII
<400> 90
ctaagaaacc attattatca tgat
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<21-3> Seqüência Artificial
<223> Promotor 1. 6GI
<400> 91
gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
<210> 92
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Promotor 1. 5GI
<400> 92
gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
<210> 93
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer AFBamHI
<400> 93
cattggatcc atgaataaag acacactaat acctacaac
<210> 94
<211> 39 -
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer ARAat2
<400> 94
catgacgtca ctagtgttaa caagaagtta gccggcaag
<210> 95
<211> 50
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Primer seguinte 1 (E)<400> 95
catgttaaca aaggaggaaa gatctatggc gatgtttacg accaccgcaa
<210> 96
<211> 43
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer inferior reverso 1 (E)
<400> 96
cccctccttt ggcgcgcctt actgctgggc ggcgctcggc aga
<210> 97
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer superior seguinte 2 (B)
<400> 97
gcccagcagt aaggcgcgcc aaaggagggg ttaaaatggt tgatttcgaa t
<210> 98
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer reverso 2 (B)
<400> 98
gtcgacgtca tactagttta cacagatttt ttgaatattt gt
<210> 99
<211> 47
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Pamy/lacOF
<400> 99
cattgtacag aattcgagct ctcgaggccc cgcacatacg aaaagac
<210> 100
<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Pam/la cOR
<400> 100
cattgtacag tttaaacata ggtcaccctc attttcgtag gaattgttat cc
<210> 101<211> 52<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer Spac F
<400> 101cattgtacag tttaaacata ggtcaccctc attttcgtag gaattgttat cc
<210> 102<211> 36<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220><223> Primer Spac R
<400> 102catgtttaaa cggtgaccca agctggggat ccgcgg
<210> 103<211> 44<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220><223> Primer superior TF
<400> 103cattggtcac cattcccggg catgcaaagg aggttagtag aatg
<210> 104<211> 51<212> DNA<213> seqüência Artificial
<220><223> Primer inferior TR
<400> 104cctttacgcg accggtacta gtcaagtcga cagggcgcgc ccaatacttt c
<210> 105<211> 57<212> DNA<213> seqüência Artificial
<220><223> Primer superior CF
<400> 105cgcgccctgt cgacttgact agtaccggtc gcgtaaagga ggtattagtc atggaac
<210> 106<211> 38<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220><223> Primer inferior CR<400> 106
catcgtttaa acttggatcc agatccctta cctcctat
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N3SeqFl
<400> 107
ccatcatacc atactgaccc
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N3SeqF2
<400> 108
gctactggag cattgctcac
<210> 109<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N3SeqF3<400> 109
ccattaacag ctgctattac aggc
11020
DNA "
Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N4SeqR3<400> 110
ggtctcggaa taacacctgg
<210><211><212><213>
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N5seqF3
<400> 111
caagcttcat aacaggagct gg
<210> 112<211> 22<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N7SeqR2<400> 112
atcccacaat ccgtcagtga tc
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N31SeqFl
<400> 113
ctgagataag aaaggccgca
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N62SeqF2
<400> 114
caaccctggg cgtgtttctg
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N62SeqF3
<400> 115
gtggcgaaga ttgggaactg
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220> r
<223> Primer N62SeqF4
<400> 116
gggaaatggc agaagatgtt cagc
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N63seqRl
<400> 117
cggtctgata acctgcaaaa tcgc<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer N63SeqR2
<400> 118
caccagcgct ttggcaacaa c
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer N63SeqR3
<400> 119
gaacgtgcat acagacctgc ttc
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer N63seqR4
<400> 120
cggctgaata acttttgcgg
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer Pamy seqF2
<400> 121
gcctttgatg actgatgatt tggc 24
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Pamy SeqF
<400> 122
tctccggtaa acattacggc aaac 24
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Pamy seqR<400> 123
cggtcagatg caattcgaca tgtg
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer SpacF Seq
<400> 124
gaagtggtca agacctcact
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer sacB Up
<400> 125
cgggtttgtt actgataaag cagg
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer sacB Dn
<400> 126
cggttagcca tttgcctgct ttta
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer HT R
<400> 127
acaaagatct ccatggacgc gt
<210> 128<211> 1185<212> DNA
<213> Escherichia coli<400> 128
atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttcactcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgtgcaaaaatcg attcacaaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt acaagccgggctggggcaaa atccggcgcg tcaggcactg ttaaaaagcg ggctggcaga aacggtgtgc 240ggattcacgg tcaataaagt atgtggttcg ggtcttaaaa gtgtggcgct tgccgcccag 300gccattcagg caggtcaggc gcagagcatt gtggcggggg gtatggaáaa tatgagttta 360gccccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600gtcccggtaa atgttgtcac tcgaaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660aaagcgaatt caacggctga agcgttaggt gcattgcgcc cggccttcga taaagcagga 720acagtcaccg ctgggaacgc gtctggtatt aacgacggtg ctgccgctct ggtgattatg 780gaagaatctg cggcgctggc agcaggcctt acccccctgg ctcgcattaa aagttatgcc 840agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgccac gcaaaaagcg 900ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960gctgcacagt tccttgccgt tgggaaaaac ctgggctttg attctgagaa agtgaatgtc 1020aacggcgggg ccatcgcgct cgggcatcct atcggtgcca gtggtgctcg tattctggtc 1080acactattac atgccatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actgtgcatt 1140ggcggcggtc agggaattgc gatggtgatt gaacggttga attaa 1185
<210> 129<211> 394<212> PRT
<213> Escherichia coli<400> 129
Met Lys Asn Cys vai Ile Val sér Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser15 10 15
Phe Asn Gly ser Leu Ala Ser Thr Ser Ala Ile Asp Leu Gly Ala Thr20 25 30
Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu Arg Ala Lys Ile Asp Ser Gln His Val35 40 45
Asp Glu Val Ile Met Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn50 55 60
Pro Ala Arg Gln Ala Leu Leu Lys Ser Gly Leu Ala Glu Thr Val Cys65 70 75 80
Gly Phe Thr Val Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ser Val Ala85 90 95
Leu Ala Ala Gln Ala Ile Gln Ala Gly Gln Ala Gln ser Ile Val Ala
100 105 · 110Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Leu Ala Pro Tyr Leu Leu Asp Ala Lys115 120 125
Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Leu Gly Asp Gly Gln Val Tyr Asp Val Ile130 135 140
Leu Arg Asp Gly Leu Met Cys Ala Thr His Gly Tyr His Met Gly Ile145 150 155 160
Thr Ala Glu Asn vai Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Met Gln165 170 175
Asp Glu Leu Ala Leu His Ser Gln Arg Lys Ala Ala Ala Ala Ile Glu180 185 190
ser Gly Ala Phe Thr Ala Glu Ile Val Pro Val Asn Val Val Thr Arg195 200 205
Lys Lys Thr Phe Val Phe Ser Gln Asp Glu Phe Pro Lys Ala Asn Ser210 215 220
Thr Ala Glu Ala Leu Gly Ala Leu Arg Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly225 230 235 240
Thr vai Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Ile Asn Asp Gly Ala Ala Ala245 250 255
Leu Val Ile Met Glu Glu ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Thr Pro260 265 270
Leu Ala Arg Ile Lys ser Tyr Ala ser Gly Gly vai Pro Pro Ala Leu275 280 285
Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Thr Gln Lys Ala Leu Gln Leu Ala290 295 300
Gly Leu Gln Leu Ala Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Phe305 310 315 320
Ala Ala Gln Phe Leu Ala Val Gly Lys Asn Leu Gly Phe Asp ser Glu325 330 335
Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly340 345 350
Ala Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Ala Met Gln Ala355 360 365Arg Asp Lys Thr Leu Gly Leu Ala Thr Leu Cys He Gly Gly Gly Gln370 375 380
Gly lie Ala Met Val Ile Glu Arg Leu Asn385 390
<210> 130
<211> 1182
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 130
ttaatgaacc tgcactaaga cggcgtctcc ctgtgctgcc ccgctgcaaa tagcggcaac 60gcccagaccc cctccccgtc gctttaattc ataaacaagc gtcatgagaa ttctcgcacc 120gctcgcgccg atcgggtggc cgagcgcgat cgcaccgcca ttcacattta ctttttcaag 180atcgaaacct acgatttttt cacatgtcaa aacaactgaa gcaaaagctt catttacttc 240aaacaagtca atatcttgga cagttaaacc attctttttc aggagcttgt taatagcaaa 300ccctggcgct gccgccagct cgtgcgctgg cattcccgta gttgaaaaac caagaattgt 360agccagaggc cgtttgccaa gctcagcagc tttttcctca gacatcagca cgaacgcgcc 420ggctccgtca ttgactccag gagcattgcc ggctgtgata gaaccgtcac ttgcataaat 480cggagcaagt tttgcgagct gatccagact tgtgtcacgg cgaatcgctt catctttatc 540aacaacgttt ggttttcctt ttcgaccgat ccagttgacg ggaacaattt catcctgaaa 600cttcccttca tcggcggcct tagctgccct tgcatgactt ctcaacgccc attcgtcctg 660ctctcttcgt gagattgcat attccttggc agctgtattt ccgtgaacag ccatgtgcac 720ctcgtcaaat gcgcacgtta atccgtcata caccattaag tccctaagct cgccgtcccc 780catccgtgct ccccagcgcc cggcgggaac ggcatacgga atattgctca tgctttccat 840cccccccgca acaagtatgt ccgcatcctg cgcccgaatc atttgatcac ataaagtgac 900agcgcgaagg ccggaagcac agactttatt cagtgtttct gacggcacac tccaaggcat 960tcccgccaga cgggcagctt gacgggaagg tatctgccct gagccggcct ggacaaccat 1020gcccatgacg tttccttcta catcatctcc agagactcca gcctgttgca gcgcctcctt 1080catcacaatg cccccaagct cagcagcttt cacctctttc aaaactccgc cgaatttgcc 1140aaatggagtt cttgcagcac ttacaatgac tgttttcctc at 1182
<210> 131<211> 393<212> PRT
<213> Bacillus subtilis<400> 131
Met Arg Lys Thr Val Ile Val Ser Ala Ala Arg Thr Pro Phe Gly Lys1 5 10 15
Phe Gly Gly Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Glu Leu Gly Gly Ile
20 25 30Val Met Lys Glu Ala Leu Gln Gln Ala Gly Val Ser Gly Asp Asp Val35 40 45
Glu Gly Asn Val Met Gly Met Val Val Gln Ala Gly Ser Gly Gln lie50 55 60
Pro Ser Arg Gln Ala Ala Arg Leu Ala Gly Met Pro Trp Ser Val Pro65 70 75 80
Ser Glu Thr Leu Asn Lys Val Cys Ala ser Gly Leu Arg Ala vai Thr85 90 95
Leu Cys Asp Gln Met Ile Arg Ala Gln Asp Ala Asp Ile Leu Val Ala100 105 110
Gly Gly Met Glu Ser Met ser Asn Ile Pro Tyr Ala Val Pro Ala Gly115 120 125
Arg Trp Gly Ala Arg Met Gly Asp Gly Glu Leu Arg Asp Leu Met Val130 135 140
Tyr Asp Gly Leu Thr Cys Ala Phe Asp Glu Val His Met Ala Val His145 150 155 160
Gly Asn Thr Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Ile ser Arg Arg Glu Gln Asp165 170 175
Glu Trp Ala Leu Arg ser His Ala Arg Ala Ala Lys Ala Ala Asp Glu180 185 190
Gly Lys Phe Gln Asp Glu Ile vai Pro Val Asn Trp Ile Gly Arg Lys195 200 205
Gly Lys Pro Asn Val Val Asp Lys Asp Glu Ala Ile Arg Arg Asp Thr210 215 220
Ser Leu Asp Gln Leu Ala Lys Leu Ala Pro Ile Tyr Ala ser Asp Gly225 230 235 240
Ser Ile Thr Ala Gly Asn Ala Pro Gly Val Asn Asp Gly Ala Gly Ala245 250 255
Phe Val Leu Met Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Lys Arg Pro260 265 270
Leu Ala Thr Ile Leu Gly Phe Ser Thr Thr Gly Met Pro Ala His Glu275 280 285Leu Ala Ala Ala Pro Gly Phe Ala Ile Asn Lys Leu Leu Lys Lys Asn290 295 300
Gly Leu Thr Val Gln Asp Ile Asp Leu Phe Glu vai Asn Glu Ala Phe
Ala Ser Val Val Leu Thr Cys Glu Lys Ile Val Gly Phe Asp Leu Glu325 330 335
Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly340 345 350
Ala ser Gly Ala Arg Ile Leu Met Thr Leu Val Tyr Glu Leu Lys Arg355 360 365
Arg Gly Gly Gly Leu Gly vai Ala Ala Ile Cys ser Gly Ala Ala Gln370 1 375 380
Gly Asp Ala Val Leu Val Gln vai His385 90
<210> 132<211> 1197<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae<400> 132
atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagãaccc caattggttc attccagggt 60
tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg cgccttggct 120
aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg taacgttctt 180
tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg tttgagtaat 240
catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc aatcattttg 300
ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg ttgtgaatct 360
atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt tggccaaact 420
gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg tctagccatg 480
ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca acaagacaat 540
tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa attcgacaat 600
gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca agtcacgaag 660
gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac tgttttccaa 720
aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg tgctgcagcc 780
gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt ggctattatc 840
aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc atctcttgca 900
gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga ttactttgaa 960
ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa gctagaccca 1020tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg ttgttctggt 1080gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa gatcggtgtt 1140gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatga 1197
<210> 133
<211> 398
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 133
Met Ser Gln Asn Val Tyr Ile Val Ser Thr Ala Arg Thr Pro Ile Gly1 5 10 15
Ser Phe Gln Gly Ser Leu Ser Ser Lys Thr Ala Val Glu Leu Gly Ala20 25 30
Val Ala Leu Lys Gly Ala Leu Ala Lys Val Pro Glu Leu Asp Ala Ser35 40 45
Lys Asp Phe Asp Glu Ile Ile Phe Gly Asn Val Leu Ser Ala Asn Leu50 55 60
Gly Gln Ala Pro Ala Arg Gln Val Ala Leu Ala Ala Gly Leu Ser Asn65 70 75 80
His Ile Val Ala Ser Thr Val Asn Lys Val Cys Ala Ser Ala Met Lys85 90 95
Ala IleIle Leu Gly Ala Gln ser Ile Lys Cys Gly Asn Ala Asp Val100 105 110
Val Val Ala Gly Gly Cys Glu ser Met Thr Asn Ala Pro Tyr Tyr Met115 120 125
Pro Ala Ala Arg Ala Gly Ala Lys Phe Gly Gln Thr Val Leu Val Asp130 - 135 140
Gly Val Glu Arg Asp Gly Leu Asn Asp Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Met145 150 155 160
Gly Val His Ala Glu Lys Cys Ala Arg Asp Trp Asp Ile Thr Arg Glu165 170 175
Gln Gln Asp Asn Phe Ala Ile Glu ser Tyr Gln Lys Ser Gln Lys ser180 185 190
Gln Lys Glu Gly Lys Phe Asp Asn Glu Ile1Val Pro Val Thr Ile Lys195 200 205Gly Phe Arg Gly Lys Pro Asp Thr Gln Val rnr Lys Asp Glu Glu Pro210 215 220
Ala Arg Leu His Val Glu Lys Leu Arg Ser Ala Arg Thr Val Phe Gln225 230 235 240
Lys Glu Asn Gly Thr Val Thr Ala Ala Asn Ala Ser Pro Ile Asn Asp245 250 255
Gly Ala Ala Ala vai Ile Leu Val Ser Glu Lys Val Leu Lys Glu Lys260 265 270
Asn Leu Lys Pro Leu Ala Ile Ile Lys Gly Trp Gly Glu Ala Ala His275 280 285
Gln Pro Ala Asp Phe Thr Trp Ala Pro Ser Leu Ala Val Pro Lys Ala290 295 300
Leu Lys His Ala Gly Ile Glu Asp Ile Asn ser vai Asp Tyr Phe Glu305 310 315 320
Phe Asn Glu Ala Phe Ser Val Val Gly Leu vál Asn Thr Lys Ile Leu325 330 335
Lys Leu Asp Pro ser Lys Val Asn Val Tyr Gly Gly Ala Val Ala Leu340 345 350
Gly His Pro Leu Gly Cys Ser Gly Ala Arg Val vai Val Thr Leu Leu355 360 365
Ser lie Leu Gln Gln Glu Gly Gly Lys Ile Gly Val Ala Ala Ile Cys370 375 380
Asn Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ser Ile Val Ile Glu Lys Ile385 390 395
<210> 134<211> 864 <212> DNA<213> Bacillus subtilis<400> 134
atggaaatca aacaaatcat ggtagctggc gcaggtcaga tggggagcgg aattgctcaa 60acagccgccg acgcgggctt ttatgtgcgg atgtatgatg tgaatccaga ggccgcggag 120gcaggattga aacggctgaa gaaacagctg gcccgtgatg ctgagaaagg aaaaaggacc 180gagacggaag tgaagagcgt aatcaaccgc atttcgattt ctcaaacact tgaggaggca 240gagcatgcgg acattgtgat tgaggctatc gcagaaaaca tggcggcaaa aactgagatg 300tttaaaacac ttgatcgcat ttgcccgcct catacgattt tggccagcaa tacatcttcc 360ttgcctatta cagaaatcgc tgctgtaaca aaccggcctc aacgggttat tggcatgcat 420tttatgaatc ccgtccctgt aatgaagctg gtagaagtga ttcgaggctt ggctacatca 480gaagaaacgg ccttagatgt tatggcatta gcggaaaaga tggggaaaac agcggtagaa 540gtcaatgatt ttcctgggtt tgtttccaac cgtgtgcttc ttccaatgat taatgaagcc 600atctattgcg tgtatgaggg agtggcgaag ccggaggcaa tagatgaagt gatgaagctg 660ggcatgaatc atccgatggg tccgcttgca ttagcggatt ttatcggact ggatacgtgt 720ttatcaatta tggaagtcct tcactcaggc cttggcgatt ccaaataccg tccttgcccg 780ctgctccgca agtatgtcaa agcaggctgg cttggcaaaa agagcggacg cggtttttat 840gactatgagg agaagacttc ctga 864
<210> 135
<211> 287
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 135
Met Glu Ile Lys Gln Ile Met Val Ala Gly Ala Gly Gln Met Gly Ser1 5 10 15
Gly Ile Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ala Gly Phe Tyr Val Arg Met Tyr20 25 30
Asp Val Asn Pro Glu Ala Ala Glu Ala Gly Leu Lys Arg Leu Lys Lys35 40 45
Gln Leu Ala Arg Asp Ala Glu Lys Gly Lys Arg Thr Glu Thr Glu Val50 55 60
Lys Ser Val Ile Asn Arg Ile Ser Ile Ser Gln Thr Leu Glu Glu Ala65 70 75 80
Glu His Ala Asp Ile Val Ile Glu Ala Ile Ala Glu Asn Met Ala: Ala85 90 95
Lys Thr Glu Met Phe Lys Thr Leu Asp Arg Ile Cys Pro Pro His Thr100 105 110
lie Leu Ala ser Asn Thr ser Ser Leu Pro Ile Thr Glu Ile Ala Ala115 120 125
Val Thr Asn Arg Pro Gln Arg Val Ile Gly Met His Phe Met Asn Pro130 135 140
Val Pro Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Leu Ala Thr ser145 150 155 160
Glu Glu Thr Ala Leu Asp Val Met Ala Leu Ala Glu Lys Met Gly Lys165 170 175Thr Ala Val Glu Val Asn Asp Phe Pro Gly Phe Val Ser Asn Arg Val180 185 190
Leu Leu Pro Met Ile Asn Glu Ala Ile Tyr Cys-Val Tyr Glu Gly Val195 200 205
Ala Lys Pro Glu Ala Ile Asp Glu Val Met Lys Leu Gly Met Asn His210 215 220
Pro Met Gly Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Ile Gly Leu Asp Thr Cys225 230 235 240
Leu Ser lie Met Glu Val Leu His Ser Gly Leu Gly Asp Ser Lys Tyr245 250 255
Arg Pro Cys Pro Leu Leu Arg Lys Tyr Val Lys Ala Gly Trp Leu Gly
Lys Lys Ser Gly Arg Gly Phe Tyr Asp Tyr Glu Glu Lys Thr Ser275 280 285
<210> 136<211> 855<212> DNA
<213> Ralstonia eutropha<400> 136
atggcaatca ggacagtggg catcgtgggt gccggcacca tgggcaacgg catcgcgcag 60gcttgtgcgg tggtgggcct ggacgtggtg atggtggata tcagcgacgc agcggtgcag 120aagggcatcg ccaccgtcgc cggcagcctg gaccgcctga tcaagaagga caagatcagc 180
gaagccgaca agatgactgc gctcgcgcgc atccacggca gcaccgcgta tgacgacctg 240aagaaggccg atatcgtgat cgaggccgcc accgagaact ttgacctgaa ggtcaagatc 300
ctcaagcaga tcgacagcat cgtcggcgag aacgtcatca ttgcttcgaa cacgtcgtcg 360atctcgatca ccaagctggc cgccgtgacg agtcgccccg agcgcttcat cggcatgcac 420ttcttcaacc cggtgccggt gatggcgctg gtggaactga tccgcggcct gcagaccagc 480gacgcggctc acgccgatgt cgaggcgctg gccaaggaac tgggcaagta cccgatcacc 540gtcaagaaca gcccgggctt cgtcgtcaac cgcatcctgt gcccgatgat caacgaagcc 600ttctgcgtgc tcggtgaagg cctggcctcg ccggaagaga tcgacgaagg catgaagctc 660
ggctgcaacc atccgatcgg ccccctggca ctggccgaca tgatcggcct ggacaccatg 720
ctggcagtga tggaagtgct gtacacagaa tttgccgacc cgaagtatcg tccggccatg 780ctgatgcgcg agatggtggc tgcggggtat ctgggccgca agactggccg tggcgtgtac 840
gtctacagca agtaa 855<210> 137<211> 284<212> PRT
<213> Ralstonia eutropha<400> 137
Met Ala Ile Arg Thr Val Gly Ile Val Gly Ala Gly Thr Met Gly Asn1 5 10 15
Gly Ile Ala Gln Ala Cys Ala Val Val Gly Leu Asp Val Val Met Val20 25 30
Asp Ile Ser Asp Ala Ala Val Gln Lys Gly Ile Ala Thr Val Ala Gly35 40 45
Ser Leu Asp Arg Leu Ile Lys Lys Asp Lys Ile Ser Glu Ala Asp Lys50 55 60
Met Thr Ala Leu Ala Arg Ile His Gly Ser Thr Ala Tyr Asp Asp Leu65 70 75 80
Lys Lys Ala Asp Ile Val Ile Glu Ala Ala Thr Glu Asn Phe Asp Leu85 90 95
Lys Val Lys Ile Leu Lys Gln Ile Asp Ser Ile Val Gly Glu Asn Val. 100 105 110
Ile Ile Ala Ser Asn Thr Ser Ser Ile Ser Ile Thr Lys Leu Ala Ala115 120 125
Val Thr ser Arg Pro Glu Arg Phe Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro130 135 140
Val Pro Val Met Ala Leu Val Glu Leu Ile Arg Gly Leu Gln Thr Ser145 150 155 160
Asp Ala Ala His Ala^Asp Val Glu Ala Leu Ala Lys Glu Leu Gly Lys165 " 170 175
Tyr Pro Ile Thr Val Lys Asn Ser Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile180 185 190
Leu Cys Pro Met Ile Asn Glu Ala Phe Cys Val Leu Gly Glu Gly Leu195 200 205
Ala Ser Pro Glu Glu Ile Asp Glu Gly Met Lys Leu Gly Cys Asn His210 215 220
Pro Ile Gly Pro Leu Ala Leu Ala Asp Met Ile Gly Leu Asp Thr Met225 230 235 240Leu Ala Val Met Glu Val Leu Tyr Thr Glu Phe Ala Asp Pro Lys Tyr245 250 255
Arg Pro Ala Met Leu Met Arg Glu Met Val Ala Ala Gly Tyr Leu Gly260 265 270
Arg Lys Thr Gly Arg Gly Val Tyr Val Tyr Ser Lys275 280
<210> 138
<211> 741
<212> DNA
<213> Alcaligenes eutrophis
<400> 138 atgactcagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggtg gtatcggaac cgccatttgc 60cagcggctgg ccaaggatgg ctttcgtgtg gtggccggtt gcggccccaa ctcgccgcgc 120cgcgaaaagt ggctggagca gcagaaggcc ctgggcttcg atttcattgc ctcggaaggc 180aatgtggctg actgggactc gaccaagacc gcattcgaca aggtcaagtc cgaggtcggc 240gaggttgatg tgctgatcaa caacgccggt atcacccgcg acgtggtgtt ccgcaagatg 300acccgcgccg actgggatgc ggtgatcgac accaacctga cctcgctgtt caacgtcacc 360aagcaggtga tcgacggcat ggccgaccgt ggctggggcc gcatcgtcaa catctcgtcg 420gtgaacgggc agaagggcca gttcggccag accaactact ccaccgccaa ggccggcctg 480catggcttca ccatggcact ggcgcaggaa gtggcgacca agggcgtgac cgtcaacacg 540gtctctccgg gctatatcgc caccgacatg gtcaaggcga tccgccagga cgtgctcgac 600aagatcgtcg cgacgatccc ggtcaagcgc ctgggcctgc cggaagagat cgcctcgatc 660tgcgcctggt tgtcgtcgga ggagtccggt ttctcgaccg gcgccgactt ctcgctcaac 720ggcggcctgc atatgggctg a 741
<210> 139<211> 246<212> PRT
<213> Alcaligenes eutrophus
<400> 139
Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly15 10 15
Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg vai Val Ala20 25 30
Gly cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln35 40 45
Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala ser Glu Gly Asn vai Ala Asp50 55 60Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys ser Glu Val Gly65 70 75 80
Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val85 90 95
Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn100 105 110
Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala115 120 125
Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln130 135 140
Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu145 150 155 160
His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val165 170 175
Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys180 185 190
Ala lie Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val195 200 205
Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu210 215 220
Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn225 230 235 240
Gly Gly Leu His Met Gly245
<210> 140<211> 768<212> DNA
<213> Escherichia colí<400> 140
atgagcgaac tgatcgtcag ccgtcagcaa cgagtattgt tgctgaccct taaccgtccc 60gccgcacgta atgcgctaaa taatgccctg ctgatgcaac tggtaaatga actggaagct 120gcggctaccg ataccagcat ttcggtctgt gtgattaccg gtaatgcacg cttttttgcc 180gctggggccg atctcaacga aatggcagaa aaagatctcg cggccacctt aaacgataca 240cgtccgcagc tatgggcgcg attgcaggcc tttaataaac cacttatcgc agccgtcaat 300ggttacgcgc ttggggcggg ttgcgaactg gcattgttgt gcgatgtggt ggttgccgga 360gagaacgcgc gttttgggtt .gccggaaatc actctcggca tcatgcctgg cgcaggcgga 420acgcaacgtt taatccgtag tgtcggtaaa tcgttagcca gcaaaatggt gctgagcgga 480gaaagtatca ccgctcagca agcacagcag gccgggctgg ttagcgacgt cttccccagc 540gatttaaccc tcgaatacgc cttacagctg gcatcgaaaa tggcacgtca ctcgccgctg 600gccttacaag cggcaaagca agcgctgcgc cagtcgcagg aagtggcttt gcaagccgga 660cttgcccagg agcgacagtt attcaccttg ctggcggcaa cagaagatcg tcatgaaggc 720atctccgctt tcttacaaaa acgcacgccc gactttaaag gacgctaa 768
<210> 141<211> 255<212> PRT
<213> Escherichia colí<400> 141
Met Ser Glu Leu Ile Val Ser Arg Gln Gln Arg Val Leu Leu Leu Thr1 5 10 15
Leu Asn Arg Pro Ala Ala Arg Asn Ala Leu Asn Asn Ala Leu Leu Met20 25 30
Gln Leu Val Asn Glu Leu Glu Ala Ala.Ala Thr Asp Thr Ser Ile Ser35 40 45
Val Cys Val Ile Thr Gly Asn Ala Arg Phe Phe Ala Ala Gly Ala Asp50 55 60
Leu Asn Glu Met Ala Glu Lys Asp Leu Ala Ala Thr Leu Asn Asp Thr65 70 75 80
Arg pro Gln Leu Trp Ala Arg Leu Gln Ala Phe Asn Lys Pro Leu Ile85 90 95
Ala Ala Val Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Ala Gly Cys Glu Leu Ala Leu100 105 110
Leu cys Asp Val Val Val Ala Gly Glu Asn Ala Arg Phe Gly Leu Pro115 120 125
Glu Ile Thr Leu Gly Ile Met Pro Gly Ala Gly Gly Thr Gln Arg Leu130 135 140 .
Ile Arg ser Val Gly Lys ser Leu Ala Ser Lys Met Val Leu Ser Gly145 150 155 160
Glu Ser lie Thr Ala Gln Gln Ala Gln Gln Ala Gly Leu Val Ser Asp165 170 175
Val Phe Pro Ser Asp Leu Thr Leu Glu Tyr Ala Leu Gln Leu Ala Ser
180 185 190Lys Met Ala Arg His ser Pro Leu Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala195 200 205
Leu Arg Gln ser Gln Glu vai Ala Leu Gln Ala Gly Leu Ala Gln Glu210 215 220
Arg Gln Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Thr Glu Asp Arg His Glu Gly225 230 235 240
Ile Ser Ala Phe Leu Gln Lys Arg Thr Pro Asp Phe Lys Gly Arg245 250 255
<210> 142<211> 783<212> DNA
<213> Bacillus subtilis<400> 142
atgggagatt ctattctttt tactgttaaa aatgaacata tggcgttgat caccttaaac 60aggcctcagg cagcaaatgc tctttcagcg gaaatgctta gaaacctgca aatgattatc 120caggaaattg aatttaactc aaacatccgt tgcgtcatcc tcacaggcac cggtgaaaaa 180gcgttttgtg caggggcaga cctgaaggaa cggataaaac tgaaagaaga tcaggttctg 240gaaagtgtat ctctcattca aagaacggcg gctttacttg atgccttgcc gcagccggtc 300atagctgcga taaatggaag cgcattaggc ggcggactag aattggcatt ggcatgcgac 360cttcgaatcg caactgaagc agctgtgctg ggacttccgg aaacagggtt agctattatc 420ccgggcgctg gagggaccca aaggctgccc cggctgattg gcagaggaaa agcaaaagaa 480ttcatttata caggcagacg cgtgaccgca cacgaagcaa aagaaatcgg ccttgtagag 540catgtcacgg ctccttgtga ccttatgcca aaagcagagg aactggccgc agccatttct 600gccaacggac cgatcgctgt ccgtcaggct aaatttgcaa tcaataaagg attggagaca 660gatcttgcta caggccttgc gattgaacaa aaagcgtatg aacaaaccat cccgacaaaa 720gacaggagag aagggcttca ggcctttcaa gaaaaaagac gggccgtata caagggaata 780taa 783
<210> 143<211> 260<212> PRT
<213> Bacillus subtilis<400> 143
Met Gly Asp Ser Ile Leu Phe Thr Val Lys Asn Glu His Met Ala Leu15 10 15
lie Thr Leu Asn Arg Pro Gln Ala Ala Asn Ala Leu Ser Ala Glu Met20 25 30Leu Arg Asn Leu Gln Met lie Ile Gln Glu Ile Glu Phe Asn Ser Asn35 40 45
Ile Arg Cys Val Ile Leu Thr Gly Thr Gly Glu Lys Ala Phe Cys Ala50 55 60
Gly Ala Asp Leu Lys Glu Arg Ile Lys Leu Lys Glu Asp Gln Val Leu65 70 75 80
Glu Ser Val ser Leu Ile Gln Arg Thr Ala Ala Leu Leu Asp Ala Leu85 90 95
Pro Gln Pro Val Ile Ala Ala Ile Asn Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly100 105 110
Leu Glu Leu Ala Leu Ala Cys Asp Leu Arg Ile Ala. Thr Glu Ala Ala115 120 125
Val Leu Gly Leu Pro Glu Thr Gly Leu Ala Ile Ile Pro Gly Ala Gly130 135 140
Gly Thr Gln Arg Leu Pro Arg Leu Ile Gly Arg Gly Lys Ala Lys Glu145 150 155 160
Phe Ile Tyr Thr Gly Arg Arg Val Thr Ala His Glu Ala Lys Glu Ile165 170 175
Gly Leu Val Glu His Val Thr Ala Pro Cys Asp Leu Met Pro Lys Ala180 185 190
Glu Glu Leu Ala Ala Ala Ile Ser Ala Asn Gly Pro Ile Ala Val Arg195 200 205
Gln Ala Lys Phe Ála lie Asn Lys Gly Leu Glu Thr Asp Leu Ala Thr210 215 220
Gly Leu Ala Ile Glu Gln Lys Ala Tyr Glu Gln Thr Ile Pro Thr Lys225 230 235 240
Asp Arg Arg Glu Gly Leu Gln Ala Phe Gln Glu Lys Arg Arg Ala Val245 250 255
Tyr Lys Gly Ile260
<210> 144<211> 405<212> DNA
<213> Aeromonas caviae<400> 144 atgagcgcac aatccctgga agtaggccag aaggcccgtc tcagcaagcg gttcggggcg 60gcggaggtag ccgccttcgc cgcgctctcg gaggacttca accccctgca cctggacccg 120gccttcgccg ccaccacggc gttcgagcgg cccatagtcc acggcátgct gctcgccagc 180ctcttctccg ggctgctggg ccagcagttg ccgggcaagg ggagcatcta tctgggtcaa 240agcctcagct tcaagctgcc ggtctttgtc ggggacgagg tgacggccga ggtggaggtg 300accgcccttc gcgaggacaa gcccatcgcc accctgacca cccgcatctt cacccaaggc 360ggcgccctcg ccgtgacggg ggaagccgtg gtcaagctgc cttaa 405
<210> 145
<211> 134
<Ζ12> PRT
<213> Aeromonas caviae
<400> 145
Met Ser Ala Gln Ser Leu Glu Val Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Lys1 5 10 15
Arg Phe Gly Ala Ala.Glu Val Ala Ala Phe Ala Ala Leu Ser Glu Asp20 25 30
Phe Asn Pro Leu His Leu Asp Pro Ala Phe Ala Ala Thr Thr Ala Phe35 40 45
Glu Arg Pro Ile Val His Gly Met Leu Leu Ala ser Leu Phe Ser Gly50 55 60
Leu Leu Gly Gln Gln Leu Pro Gly Lys Gly Ser Ile Tyr Leu Gly Gln65 70 75 80
Ser Leu Ser Phe Lys Leu Pro Val Phe vai Gly Asp Glu Val Thr Ala85 90 95
Glu Val Glu vai Thr Ala Leu Arg Glu Asp Lys Pro Ile Ala Thr Leu100 105 110
Thr Thr Arg lie Phe Thr Gln Gly Gly Ala Leu Ala Val Thr Gly Glu115 120 125
Ala Val Val Lys Leu Pro130
<210> 146<211> 1912<212> DNA
<213> Euglena gracilis<400> 146
ttttcgcccg tgcaccacga tgtcgtgccc cgcctcgccg tctgctgccg tggtgtctgc 60cggcgccctc tgcctgtgcg tggcaacggt attgttggcg actggatcca accccaccgc 120cctgtccact gcttccactc gctctccgac ctcactggtc cgtggggtgg acaggggctt 180gatgaggcca accactgcag cggctctgac gacaatgaga gaggtgcccc agatggctga 240gggattttca ggcgaagcca cgtctgcatg ggccgccgcg gggccgcagt gggcggcgcc 300gctcgtggcc gcggcctcct ccgcactggc gctgtggtgg tgggccgccc ggcgcagcgt 360gcggcggccg ctggcagcgc tggcggagct gcccaccgcg gtcacccacc tggccccccc 420gatggcgatg ttcaccacca cagcgaaggt catccagccc aagattcgtg gcttcatctg 480cacgaccacc cacccgatcg gctgtgagaa gcgggtccag gaggagatcg cgtacgcccg 540tgcccacccg cccaccagcc ctggcccgaa gagggtgctg gtcatcggct gcagtaccgg 600ctacgggctc tccacccgca tcaccgctgc cttcggctac caggccgcca cgctgggcgt 660gttcctggcg ggccccccga cgaagggccg ccccgccgcg gcgggctggt acaacaccgt 720ggcgttcgag aaggccgccc tggaggccgg gctgtacgcc cggagcctta atggcgacgc 780cttcgactcc acaacgaagg cgcggacggt cgaggcgatc aagcgggacc tcggcacggt 840ggacctcgtg gtgtacagca tcgccgcccc gaagcggacg gaccctgcca ccggcgtcct 900ccacaaggcc tgcctgaagc ccatcggcgc cacgtacacc aaccgcactg tgaacaccga 960caaggcggag gtgaccgacg tcagcattga gccggcctcc cccgaagaga tcgcggacac 1020ggtgaaggtg atgggcgggg aggactggga gctctggatc caggcgctgt cggaggccgg 1080cgtgctggcg gagggggcca agacggtggc gtactcctac atcggccccg ágatgacgtg 1140gcctgtctac tggtccggca ccatcgggga ggccaagaag gacgtggaga aggctgccaa 1200gcgcatcacg cagcagtacg gctgcccggc gtacccggtg gtggccaagg ccttggtcac 1260ccaggccagc tccgccatcc cggtggtgcc gctctacatc tgcctgctgt accgcgttat 1320gaaggagaag ggcacccacg agggctgcat cgagcagatg gtgcggctgc tcaccacgaa 1380gctgtacccc gagaacgggg cccccatcgt cgatgaggcc ggacgtgtgc gggtggatga 1440ctgggagatg gcggaggatg tgcagcaggc tgttaaggac ctctggagcc aggtgagcac 1500tgccaacctc aaggacatct ccgacttcgc tgggtatcaa actgagttcc tgcggctgtt 1560cgggttcggc attgacggcg tggactacga ccagcccgtg gacgtggagg cggacctccc 1620cagtgctgcc cagcagtagg tgctggacgc cgcctctctc cggggggtct gccaaaatgg 1680tcgctccccc aacccaaccc cctgcccacc atcggggtcc cgcgggtgaa tgcggccccc 1740acccaaaggc aaaggtcaag gccggggccc caccgccaaa gggtaacaca tatgtatccg 1800tcgggggctg atccgcgtgc gacacgggcc ataattgtgc cccacgggat gtccatgcgc 1860ctaagacaac tgccccggcc gacagtcgct accgccttga gttccccagg ca 1912
<210> 147
<211> 539
<212> PRT
<213> Euglena gracilis<400> 147
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Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Leu Trp Trp Trp Ala Ala Arg Arg100 105 110
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Pro Ala Ala Ala Gly Trp Tyr Asn Thr Val Ala Phe Glu Lys Ala Ala225 230 235 240
Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ala Phe Asp245 250 255Ser Thr Thr Lys Ala Arg Thr Val Glu Ala lie Lys Arg Asp Leu Gly260 265 270
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<213> Sreptomyces collinus
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<210> 149
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<212> PRT
<213> Streptomyces collinus
<400> 149
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Val Leu Cys Leu Ala Pro Glu Glu Gly Leu Gly Val Arg Asp Ala Glu420 425 430
Met Arg Ala Gln His Ile Asp Ala Ile Asn Arg Phe Arg Asn Val435 440 445
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<210> 151<211> 447<212> PRT
<213> streptomyces coelicolor<400> 151
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Asn Arg Tyr Leu Trp Met Ser Leu Lys Arg lie Ile Gly Ser His Phe355 360 365
Ala Asn Tyr Arg Glu Ala Trp Glu Ala Asn Arg Leu Ile Ala Lys Gly370 375 380
Arg lie His Pro Thr Leu Ser Lys Val Tyr Ser Leu Glu Asp Thr Gly385 390 395 400Gln Ala Ala Tyr Asp Val His Arg Asn Leu His Gln Gly Lys Val Gly405 410 415
Val Leu Cys Leu Ala Pro Glu Glu Gly Leu Gly Val Arg Asp Arg Glu420 425 430
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<210> 152
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<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 152
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ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240
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ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540
ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600
tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660
gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720
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gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200
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ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320
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aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc 1440tttatagtta ctgatagtga cccctataat ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata 1500cttgagcacc tagatattga ttttaaagta tttaataagg ttggaagaga agctgatctt 1560aaaaccataa aaaaagcaac tgaagaaatg tcctccttta tgccagacac tataatagct 1620ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca aagctaatgt gggtactata tgaacatcca 1680gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa tttatggaca taagaaagag aatatatact 1740ttcccaaaac tcggtaaaaa ggctatgtta gttgcaatta caacttctgc tggttccggt 1800tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta 1860gcagattatg aaatgacacc aaatatggca attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg 1920ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata gatgcactag taaatagtat agaagcatac 1980acatccgtat atgcttcaga atacacaaac ggactagcac tagaggcaat acgattaata 2040tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt 2160cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata 2340aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 2400ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580caaccttaa 2589
<210> 153
<211> 862
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutyIicum
<400> 153
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Lys Lys Asn Glu Leu Asp Lys Val Arg Glu Val Ile Phe Lys Asp Gly275 280 285
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Lys Asn Gly Arg Thr Asn Glu Lys Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala690 695 700
ser Thr Met Ala Gly Met Ala Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Cys705 710 715 720
His ser Met Ala Ile Lys Leu Ser Ser Glu His Asn Ile Pro Ser Gly725 730 735
Ile Ala Asn Ala Leu Leu lie Glu Glu vai Ile Lys Phe Asn Ala Val740 745 750
Asp Asn Pro Val Lys Gln Ala Pro Cys Pro Gln Tyr Lys Tyr Pro Asn755 760 765
Thr Ile Phe Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Asp Tyr lie Lys Leu Gly Gly770 775 780
Asn Thr Asp Glu Glu Lys vai Asp Leu Leu Ile Asn Lys Ile His Glu785 790 795 800
Leu Lys Lys Ala Leu Asn Ile Pro Thr ser Ile Lys Asp Ala Gly Val805 810 815
Leu Glu Glu Asn Phe Tyr ser Ser Leu Asp Arg Ile ser Glu Leu Ala820 825 830
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<213> Escherichia coli<400> 155
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i
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<210> 180
<211> 68
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer ΟΤ803<400> 180
ccctcactaa agggaacaaa agctggagct cgatatcggc gcgcccacat gcagtgatgcacgcgcga
<210> 181
<211> 49
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer ΟΤ804
<400> 181
aaggatgaca ttgtttagtt ccatggttgt aatatgtgtg tttgtttgg
<210> 182
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT785
<400> 182
cacacatatt acaaccatgg aactaaacaa tgtcatcctt gaaaaggaag g
<210> 183
<211> 63
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT786
<400> 183
atcattcatt ggccattcag gccttatcta tttttgaagc cttcaatttt tcttttctctàtg
<210> 184
<211> 65
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT787
<400> 184
caaaaataga taaggcctga atggccaatg aatgatttga tgatttcttt ttccctccatttttc
<210> 185
<211> 77
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer ΡΤ805<400> 185
gaattgggta ccgggccccc cctcgaggtc gacttatagt attatatttt ctgatttggt 60tatagcaagc agcgttt 77
<210> 186
<211> 1269
<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Códon otimizado TER
<400> 186
actagtacca taaccaagta atacatattc agcatgctag tgaaggccaa gttcgtcaag 60ggctttatta gagatgttca tccgtatggg tgtaggagag aagtgttaaa ccagattgac 120tactgcaaga aagcaattgg ctttaggggc cctaaaaagg ttcttattgt aggtgcttct 180tcaggcttcg gactagctac tagaatatct gttgcattcg gagggcctga agcccataca 240atcggtgttt catacgagac tggagctaca gacagaagga taggtacggc tgggtggtac 300aataatatct tctttaaaga attcgctaag aagaaaggtt tggtggcaaa gaatttcata 360gaagatgcat tttcgaatga aaccaaggat aaagtgataa agtatataaa ggacgaattt 420ggtaaaattg atttattcgt atattcttta gctgctccta gaagaaagga ctacaaaacc 480ggtaatgttt atacctcaag aattaaaaca attctaggtg actttgaagg gcctactatt 540gacgtagaaa gagatgaaat aactttaaag aaggtatctt ctgctagtat cgaggaaatc 600gaagaaacac gtaaagtaat gggcggagaa gactggcagg agtggtgtga ggagttatta 660tacgaagatt gtttttctga taaagctaca accatcgctt attcctatat tggcagtcct 720agaacttata aaatatatcg tgaaggaacc attgggattg ctaagaagga tttagaagac 780aaagccaagt tgatcaacga aaagcttaat agagtcatag gaggtagggc atttgtgtct 840gttaacaaag ctttagtaac caaggcatct gcttatattc caaccttccc tctatacgct 900gccatattat ataaagtaat gaaagaaaag aacattcacg aaaattgtat tatgcaaatt 960gagcgtatgt tctcagagaa aatatactcc aacgaaaaga ttcagttcga tgataagggc 1020cgtcttagaa tggacgattt agaactaaga aaggatgttc aggatgaagt tgacagaatt 1080tggtctaaca taacaccaga aaacttcaag gagcttagtg actacaaggg gtataagaaa 1140gagtttatga atctaaatgg ttttgattta gatggagttg attattccaa ggatcttgat 1200attgaattac ttagaaaact agagccttaa gcggccgcgt taattcaaat taattgatat 1260agtactagt 1269
<210> 187
<211> 398
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Proteína TER modificada<400> 187
Met Leu Val Lys Ala Lys Phe Val Lys Gly Phe Ile Arg Asp Val His1 5 10 15
Pro Tyr Gly Cys Arg Arg Glu Val Leu Asn Gln Ile Asp Tyr Cys Lys20 25 30
Lys Ala Ile Gly Phe Arg Gly Pro Lys Lys Val Leu Ile Val Gly Ala35 40 45
ser Ser Gly Phe Gly Leu Ala Thr Arg Ile Ser Val Ala Phe Gly Gly50 55 60
Pro Glu Ala His Thr Ile Gly vai Ser Tyr Glu Thr Gly Ala Thr Asp65 70 75 80
Arg Arg Ile Gly Thr Ala Gly Trp Tyr Asn Asn Ile Phe Phe Lys Glu85 90 95
Phe Ala Lys Lys Lys Gly Leu Val Ala Lys Asn Phe Ile Glu Asp Ala100 105 110
Phe ser Asn Glu Thr Lys Asp Lys Val Ile Lys Tyr Ile Lys Asp Glu115 120 125
Phe Gly Lys Ile Asp Leu Phe Val Tyr ser Leu Ala Ala Pro Arg Arg130 135 140
Lys Asp Tyr Lys Thr Gly Asn Val Tyr Thr Ser Arg Ile Lys Thr Ile145 150 155 160
Leu Gly Asp Phe Glu Gly Pro Thr Ile Asp Val Glu Arg Asp Glu Ile165 170 175
Thr Leu Lys Lys Val Ser Ser Ala Ser Ile Glu Glu Ile Glu Glu Thr180 185 190
Arg Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Gln Glu Trp cys Glu Glu Leu195 200 205
Leu Tyr Glu Asp Cys Phe Ser Asp Lys Ala Thr Thr Ile Ala Tyr Ser210 215 220
Tyr Ile Gly Ser Pro Arg Thr Tyr Lys Ile Tyr Arg Glu Gly Thr Ile225 230 235 240
Gly Ile Ala Lys Lys Asp Leu Glu Asp Lys Ala Lys Leu Ile Asn Glu
245 250 255Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Gly Arg Ala Phe Val ser Val Asn Lys260 265 270
Ala Leu Val Thr Lys Ala Ser Ala Tyr lie Pro Thr Phe Pro Leu Tyr275 280 285
Ala Ala Ile Leu Tyr Lys Val Met Lys Glu Lys Asn Ile His Glu Asn290 295 300
Cys Ile Met Gln lie Glu Arg Met Phe ser Glu Lys Ile Tyr Ser Asn305 310 315 320
Glu Lys lie Gln Phe Asp Asp Lys Gly Arg Leu Arg Met Asp Asp Leu325 330 335
Glu Leu Arg Lys Asp Val Gln Asp Glu vai Asp Arg Ile Trp ser Asn340 345 350
Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Glu Leu ser Asp Tyr Lys Gly Tyr Lys355 360 365
Lys Glu Phe Met Asn Leu Asn Gly Phe Asp Leu Asp Gly Val Asp Tyr370 375 380
Ser Lys Asp Leu Asp Ile Glu Leu Leu Arg Lys Leu Glu Pro385 390 395
<210> 188 <211> 1484 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Códon otimizado ALD <400> 188 actagttcga ataaacacac ataaacaaac accatggata aagatacctt aatcccaacc 60accaaagact tgaaagtgaa gactaatggt gaaaacatcã acttaaagaa ttacaaagat 120aactcttcat gttttggagt atttgaaaat gttgagaatg ccatttcttc tgcagtacat 180gcacaaaaga ttctttccct acactacaca aaggaacaaa gagagaaaat aatcaccgaa 240ataagaaaag ccgcattaca gaataaagag gtcttagcca caatgatcct ggaggaaacc 300cacatgggaa ggtatgagga taaaatcttg aaacatgaat tagtggccaa gtatacccca 360ggcactgaag atctgacaac aacagcatgg tccggcgata atggactaac agtggttgaa 420atgagtccat acggagttat cggcgctata actccaagca cgaatccaac agaaaccgtt 480atctgcaatt ctataggtat gatagctgcg gggaatgcag ttgtatttaa tggtcaccca 540tgcgccaaaa agtgtgtcgc tttcgcagta gaaatgataa acaaagccat aattagctgt 600ggtggacctg aaaaccttgt cactactata aagaacccaa ctatggaaag tttagacgct 660attatcaaac atccatccat aaaattgttg tgcggtacgg gtggcccggg tatggtaaaa 720acccttctta attctggtaa aaaggccatc ggagctggcg cgggtaatcc tccggttatt 780gtagacgata cagcagatat cgagaaggcc ggcagaagca ttattgaagg ttgttcgttt 840gacaacaatc ttccttgtat cgcggaaaaa gaagtgttcg tgtttgaaaa cgttgcagat 900gatctgatct ctaacatgtt gaaaaacaac gccgtcatta tcaatgaaga ccaagtatcc 960aagctgatag accttgttct tcaaaagaac aatgaaactc aagaatattt cattaataag 1020aagtgggttg gtaaggacgc taaactgttt ttggatgaaa tagatgtaga gtcaccaagt 1080aatgtaaagt gtattatttg tgaagtcaac gcaaaccatc cgttcgttat gacggagttg 1140atgatgccaa ttttgcctat agttagagtg aaggacattg atgaagccat taaatacgcc 1200aagatagctg agcagaatag aaaacattcc gcctacattt attctaagaa catcgataac 1260cttaatagat tcgaacgtga aattgataca actatctttg ttaagaatgc aaagtcattt 1320gcaggtgtcg gttatgaagc tgagggtttc acaaccttta caattgccgg atccacaggt 1380gaaggaatca cgtcagc-tag aaactttacc aggcaaagac gttgtgtcct agcaggttag 1440ggcctgcagg gccgtgaatt tactttaaat cttgcattac tagt 1484
<210> 189
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ALD Modificado<400> 189
Met Asp Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys15 10 15
Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser ser20 25 30
Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val35 40 45
His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu50 55 60
Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val65 70 75 80
Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp85 90 95
Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu
100 105 110Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val115 120 125
Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn130 135 140
Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly145 150 155 160
Asn Ala Val vai Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala165 170 175
Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro180 185 190
Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp195 200 205
Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly210 215 220
Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly225 230 235 240
Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile245 250 255
Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys ser Phe Asp Asn Asn260 265 270
Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala275 280 285
Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile lie Asn290 295 300
Glu Asp Gln vai Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn305 310 315 320
Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp vai Gly Lys Asp Ala325 330 335
Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu ser Pro Ser Asn Val Lys340 345 350
Cys Ile Ile Cys Glu Val Asn Ala Asn His Pro Phe Val Met Thr Glu355 360 365Leu Met Met Pro lie Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu370 375 380
Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala385 390 395 400
Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu405 410 415
Ile Asp Thr Thr lie Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val420 425 430
Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr43 5 440 445
Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys450 455 460
Val Leu Ala Gly465
<210> 190<211> 69<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer PT800<400> 190
gggaacaaaa gctggagctc caccgcggtg gggcgcgccc tatttitcgag gaccttgtcaccttgagcc
<210> 191
<211> 50
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT758
<400> 191
ttaaggtatc tttatccatg gtgtttgttt atgtgtgttt attcgaaact
<210> 192
<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT754
<400> 192
ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac tggccattaa tctttcccat at
<210> 193<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer ΟΤ755
<400> 193
tgtgtcctag caggttaggg cctgcagggc cgtgaattta ctttaaatct tg 52
<210> 194
<211> 50
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT760
<400> 194
cgaaaatagg gcgcgccact ggtagagagc gactttgtat gccccaattg 50
<210> 195<211> 71<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT792<400> 195
cccttgacga acttggcctt cactagcatg ctgaatatgt attacttggt tatggttata 60tatgacaaaa g
<210> 196<211> 71<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT791<400> 196
cccttgacga acttggcctt cactagcatg ctgaatatgt attacttggt tatggttata 60tatgacaaaa g 71
<210> 197<211> 73<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer OT765<400> 197
ggaacaaaag ctggagctcc accgcggtgg tttaacgtat agacttctaa tatatttctc 60catacttggt att 73
<210> 198<211> 29<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer LDHEcoRV F
<400> 198
gacgtcatga ccacccgccg atccctttt 29
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer LDH AatlR
<400> 199
gatatccaac accagcgacc gacgtattac 30
<210> 200
<211> 47
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer Cm F
<400> 200
atttaaatct cgagtagagg atcccaacaa acgaaaattg gataaag 47
<210> 201
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer Cm R
<400> 201
acgcgttatt ataaaagcca gtcattagg 29
<210> 202
<211> 62
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Primer P11 F
<400> 202
tcgagagcgc tatagttgtt gacagaatgg acatactatg atatattgtt gctatagcgc 60cc 62
<210> 203
<211> 58
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer P11 R<400> 203
gggcgctata gcaacaatat atcatagtat gtccattctg tcaacaacta tagcgctc 58
<210> 204
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer PldhL F
<400> 204
gagctcgtcg acaaaccaac attatgacgt gtctgggc 38
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> seqüência Artificial<220>
<223> Primer PldhL R
<400> 205
ggatcctacc atgtttgtgc aaaataagtg 30
<210> 206
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primèr f-PnisA CecoRV)
<400> 206
ttcagtgata tcgacatact tgaatgacct agtc 34
<210> 207
<211> 48
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Primer R-PnisACPmel BamHl)
<400> 207
ttgattagtt taaactgtag gatcctttga gtgcctcctt ataattta 48
<210> 208<211> 2460<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> DNA Modelo<400> 208
tgatccaaag gagggtgagg aaatggcgat gtttacgacc accgcaaaag ttattcagcc 60gaaaattcgt ggttttattt gcaccaccac ccacccgatt ggttgcgaaa aacgtgttca 120ggaagaaatc gcatacgcac gcgcgcaccc gccgaccagc ccgggtccga aacgtgtgct 180ggttattggc tgcagtacgg gctatggcct gagcacccgt atcaccgcgg cctttggtta 240tcaggccgca accctgggcg tgtttctggc aggcccgccg accaaaggcc gtccggccgc 300ggcgggttgg tataatacgg ttgcgttcga aaaagccgcc ctggaagcag gtctgtatgc 360acgttctctg aatggtgatg cgttcgattc taccacgaaa gcccgcaccg tggaagcaat 420taaacgtgat ctgggtaccg ttgatctggt ggtgtatagc attgcagcgc cgaaacgtac 480cgatccggcc accggcgtgc tgcataaagc gtgcctgaaa ccgattggtg caacctacac 540caatcgtacg gtgaacaccg ataaagcaga agttaccgat gtgagtattg aaccggccag 600tccggaagaa atcgcagata ccgtgaaagt tatgggtggc gaagattggg aactgtggat 660tcaggcactg agcgaagccg gcgtgctggc cgaaggcgca aaaaccgttg cgtattctta 720tattggcccg gaaatgacgt ggccggtgta ttggagtggc accattggcg aagccaaaaa 780agatgttgaa aaagcggcga aacgcatcac ccagcagtac ggctgtccgg cgtatccggt 840tgttgccaaa gcgctggtga cccaggccag tagcgccatt ccggtggtgc cgctgtatat 900ttgcctgctg tatcgtgtta tgaaagaaaa aggcacccat gaaggctgca ttgaacagat 960ggtgcgtctg ctgacgacga aactgtatcc ggaaaatggt gcgccgatcg tggatgaagc 1020gggccgtgtg cgtgttgatg attgggaaat ggcagaagat gttcagcagg cagttaaaga 1080tctgtggagc caggtgagta cggccaatct gaaagatatt agcgattttg caggttatca 1140gaccgaattt ctgcgtctgt ttggctttgg tattgatggt gtggattacg atcagccggt 1200tgatgttgaa gcggatctgc cgagcgccgc ccagcagtaa gtcaacaaag gaggggttaa 1260aatggttgat ttcgaatatt caataccaac tagaattttt ttcggtaaag ataagataaa 1320tgtacttgga agagagctta aaaaatatgg ttctaaagtg cttatagttt atggtggagg 1380aagtataaag agaaatggaa tatatgataa agctgtaagt atacttgaaa aaaacagtat 1440taaattttat gaacttgcag gagtagagcc aaatccaaga gtaactacag ttgaaaaagg 1500agttaaaata tgtagagaaa atggagttga agtagtacta gctataggtg gaggaagtgc 1560aatagattgc gcaaaggtta tagcagcagc atgtgaatat gatggaaatc catgggatat 1620tgtgttagat ggctcaaaaa taaaaagggt gcttcctata gctagtatat taaccattgc 1680tgcaacagga tcagaaatgg atacgtgggc agtaataaat aatatggata caaacgaaaa 1740actaattgcg gcacatccag atatggctcc taagttttct atattagatc caacgtatac 1800gtataccgta cctaccaatc aaacagcagc aggaacagct gatattatga gtcatatatt 1860tgaggtgtat tttagtaata caaaaacagc atatttgcag gatagaatgg cagaagcgtt 1920attaagaact tgtattaaat atggaggaat agctcttgag aagccggatg attatgaggc 1980aagagccaat ctaatgtggg cttcaagtct tgcgataaat ggacttttaa catatggtaa 2040agacactaat tggagtgtac acttaatgga acatgaatta agtgcttatt acgacataac 2100acacggcgta gggcttgcaa ttttaacacc taattggatg gagtatattt taaataatga 2160tacagtgtac aagtttgttg aatatggtgt aaatgtttgg ggaatagaca aagaaaaaaa 2220
tcactatgac atagcacatc aagcaataca aaaaacaaga gattactttg taaatgtact 2280
aggtttacca tctagactga gagatgttgg aattgaagaa gaaaaattgg acataatggc 2340
aaaggaatca gtaaagctta caggaggaac cataggaaac ctaagaccag taaacgcctc 2400
cgaagtccta caaatattca aaaaatctgt gtaaacctac gtttaaactt acgcgtatga 2460

Claims (57)

1. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNAque codifica polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãoselecionada a partir do grupo que consiste de:a. acetil-CoA em acetoacetil-CoA;b. acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA;c. 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA;d. crotonil-CoA em butiril-CoA;e. butiril-CoA em butiraldeído; ef. butiraldeído em 1-butanol;em que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para amencionada célula hospedeira microbiana e em que a mencionada célulahospedeira microbiana produz 1-butanol.
2. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato paraproduzir a conversão de acetil-Coa em acetoacetil-CoA é acetil-CoAacetiltransferase.
3. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato paraproduzir conversão de acetoacetiI-Coa em 3-hidroxibutiril-CoA é 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase.
4. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato paraproduzir conversão de 3-hidroxibutiril-Coa em crotonil-CoA é crotonase.
5. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato paraproduzir conversão de crotonil-CoA em butiril-CoA é butiril-CoA desidrogenase.
6. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzirconversão de butiril-CoA em butiraldeído é butiraldeído desidrogenase.
7. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato paraproduzir conversão de butiraldeído em 1-butanol é butanol desidrogenase.
8. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada a partir do grupo queconsiste de bactéria, cianobactéria, fungo filamentoso e levedura.
9. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a célula é membro do gênero selecionado a partir dogrupo que consiste de Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella,Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes,Klebsiellal Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebaeteríum, Brevibacterium, Piehia,Candida, Hansenula e Saccharomyees.
10. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Escherichia coli.
11. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Alcaligenes eutrophus.
12. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Bacillus licheniformis.
13. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Paenibacillus macerans.
14. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Rhodococcus erythropolis.
15. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Pseudomonas putida.
16. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Bacillus subtilis.
17. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Lactobacillus plantarum.
18. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada a partir do grupo que consistede Enterococcus faeeium, Enteroeoeeus gallinarium e Enterococcus faeealis.
19. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a célula é Saccharomyees eerevisiae.
20. CÉLULA HOSPEDEIRA de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a acetil-CoA acetiltransferase possui seqüênciade aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 2,SEQ ID N0 4, SEQ ID N0 129, SEQ ID N0 131 e SEQ ID N0 133.
21. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase possuiseqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQID N0 6, SEQ ID N0 135, SEQ ID N0 137 e SEQ ID N0 139.
22. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a crotonase possui seqüência de aminoácidosselecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 8, SEQ ID N0 141, SEQ IDN0 143 e SEQ ID N0 145.
23. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a butiril-CoA desidrogenase possui seqüênciade aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 10,SEQ ID N0 147, SEQ ID N0 149, SEQ ID N0 151 e SEQ ID N0 187.
24. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a butiraldeído desidrogenase possui seqüênciade aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 12,SEQ ID N0 153 e SEQ ID N0 189.
25. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a butanol desidrogenase possui seqüência deaminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N0 14, SEQID N0 16, SEQ ID N0 153, SEQ ID N0 155 e SEQ ID N0 157.
26. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é anaeróbio facultativo.
27. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 1-BUTANOL, caracterizadopelo fato de que compreende:i. fornecimento de célula hospedeira microbianarecombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codificapolipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversão selecionado apartir do grupo que consiste de:a. acetil-CoA em acetoacetil-CoA;b. acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA;c. 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA;d. crotonil-CoA em butiril-CoA;e. butiril-CoA em butiraldeído; ef. butiraldeído em 1-butanol;em que a pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para amencionada célula hospedeira microbiana; eii. contato da célula hospedeira de (i) com substrato decarbono fermentável sob condições por meio das quais é produzido 1-butanol.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o substrato de carbono fermentável é selecionado a partir dogrupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.
29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o substrato de carbono é selecionado a partir do grupo queconsiste de glicose, sacarose e frutose.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que as condições por meio das quais é produzido 1-butanol sãoanaeróbicas.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que as condições por meio das quais é produzido 1-butanol sãomicroaeróbicas.
32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é colocada em contato com o substrato decarbono em meios mínimos.
33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãode acetil-CoA em acetoacetil-CoA é acetil-CoA acetiltransferase.
34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversão deacetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA é 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãode 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA é crotonase.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãode crotonil-CoA em butiril-CoA é butiril-CoA desidrogenase.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãode butiril-CoA em butiraldeído é butiraldeído desidrogenase.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo que catalisa substrato para produzir conversãode butiraldeído em 1-butanol é butanol desidrogenase.
39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo queconsiste de bactéria, cianobactéria, fungo filamentoso e levedura.
40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é membro de gênero selecionado a partirdo grupo que consiste de Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella,Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus,Alcaligenes, Klebsiella1 Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium,Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula e Saccharomyces.
41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Escherichia coli.
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Alcaligenes eutrophus.
43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Bacillus licheniformis.
44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Paenibacillus macerans.
45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Rhodococcus erythropolis.
46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a cétula hospedeira é Pseudomonas putida.
47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é Bacillus subtilis.
48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula é Lactobacillus plantarum.
49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula é selecionada a partir do grupo que consiste deEnterococcus faecium, Enterococcus gallinarium e Enterococcus faecalis.
50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a célula é Saccharomyces cerevisiae.
51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a acetil-CoA acetiltransferase possui seqüência deaminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 2, SEQID N° 4, SEQ ID N° 129, SEQ ID N° 131 e SEQ ID N° 133.
52. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase possui seqüência deaminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 6, SEQID N° 135, SEQ ID N° 137 e SEQ ID N° 139.
53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a crotonase possui seqüência de aminoácidos selecionada apartir do grupo que consiste de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 141, SEQ ID N° 143 eSEQ ID N° 145.
54. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que a butiril-CoA desidrogenase possui seqüência de aminoácidosselecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 147,SEQ ID N° 149, SEQ ID N° 151 e SEQ ID N° 187.
55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que a butiraldeído desidrogenase possui seqüência deaminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 12, SEQID N° 153 e SEQ ID N° 189.
56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que a butanol desidrogenase possui seqüência de aminoácidosselecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 16,SEQ ID N° 153, SEQ ID N° 155 e SEQ ID N° 157.
57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é anaeróbio facultativo.
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