BRPI0710668A2 - alfa-galactosil ceramidas modificadas para marcar e estimular células t matadoras naturais - Google Patents

Abstract

<244>-GALACTOSIL CERAMIDAS MODIFICADAS PARA MARCAR E ESTIMULAR CéLULAS T MATADORAS NATURAIS. Compostos de glicolipídeo modificados são fornecidos. Também divulgados são métodos para a ativação de uma célula NKT, métodos de estimuiar uma resposta imune em um paciente, e métodos adequados para marcar células NKT.

Description

"α-GALACTOSIL CERAMIDAS MODIFICADAS PARA MARCAR E ESTIMULARCÉLULAS T MATADORAS NATURAIS"INTRODUÇÃO

Células T matadoras naturais ("células NKT") são uma população de células dememória tipo inata/efetoras que expressam tanto receptores matadores naturais (NK)quanto um receptor de célula T conservado, semi-invariante (TCR), (Va14-Ja18Λ/β8 emcamundongos e Va24-Ja18/Vpi1 em seres humanos). Células NKT foram implicadas emsupressão de auto-imunidade e rejeição do enxerto, promoção de resistência aospatógenos, e promoção de imunidade tumoral.

Células NKT reconhecem antígenos lipídicos estranhos e próprios apresentadospelo membro CD1d da família de moléculas associadas à p2-microglobulina. Uma variedadede lipídeos com estruturas diferentes foi mostrada para ligar moléculas CD1 d em umamaneira única que acomoda uma cadeia de ácido graxo em cada uma das duas bolsas deligação hidrofóbíca (A' e F) da molécula CD1d. Espécies de lipídeo capazes de ligarmoléculas CD1d incluem ácidos micólicos, diacilgliceróis, esfingolipídeos, poliisoprenóides,lipopeptídeos, fosfomicocetídeos e compostos hidrofóbicos pequenos. A conservaçãoevolutiva de células NKT é evidente, como células NKT de camundongo reconhecem CD1dhumano mais antígeno glicolipídico e vice-versa.

Células NKT respondem com vigorosa produção de citocina dentro de horas daativação do TCR liberando-se citocinas tipo THi, incluindo IFN-γ e TNF1 assim comocitocinas tipo TH2, incluindo IL-4 e IL-13. Assim, células NKT exibem uma dupla função: elasagem como células imunossupressoras por intermédio de sua produção de citocinas tipoTh2; e também agem como promotores imunes para realçar a imunidade mediada por célulapor intermédio da produção de citocinas tipo THi.

Células NKT foram estudadas primeiramente no contexto da apresentação deCD1d de uma α-galactosil ceramida (aGC), denominada KRN7000, a um glicolipídeo nãoconsiderado ser um antígeno natural para células NKT. O isolamento e quantificação decélulas NKT responsivas ao CD1d por citometria de fluxo comumente foram realizadosusando tetrâmeros de CD1d marcados com fluoróforo carregados com KRN7000. KRN7000também é usada em estudos das influências de estimulação da célula NKT em estados dedoença específicos. Entretanto, fornecimentos de KRN7000, que é derivada de uma esponjamarinha, foram limitados e este glicolipídeo tem solubilidade relativamente deficiente emsolventes aquosos ou orgânicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

α-Galactosil ceramidas modificadas fornecidas pela invenção foram descobertaspara estimular células NKT mais eficazmente do que KRN7000, tanto in vitro quanto in vivo.Além disso, estas moléculas podem apresentar solubilidade aumentada e cargaintensificada em tetrâmeros de CD1d.

Em um aspecto, a invenção fornece um composto representado pela fórmulaestrutural (I):

<formula>formula see original document page 3</formula>

onde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são definidos aqui abaixo.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um composto, denominado "PBS-57,"representado pela fórmula estrutural (II)

<formula>formula see original document page 3</formula>

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de ativar uma célula NKTcompreendendo contatar a célula NKT com o composto da fórmula (I) na presença de ummonômero ou tetrâmero de CD1 d.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método de estimular umaresposta imune em um paciente. O método inclui uma etapa de administrar ao paciente umaquantidade eficaz do composto da fórmula (I). Alternativamente, o método de estimular umaresposta imune em um paciente compreende uma etapa de administrar ao paciente umapopulação de células NKT ativadas contatando-se as células NKT com o composto dafórmula (I) na presença de uma molécula CD1. Como uma terceira alternativa, o método deestimular uma resposta imune em um paciente compreende administrar ao paciente umapopulação de células apresentadoras de antígeno CD1+ contatadas com o composto dafórmula (I).

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendoum composto da fórmula (I) e um veículo fisiologicamente aceitável.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de marcar uma célula NKTem um meio compreendendo etapas de complexar um composto da fórmula (I) com umtetrâmero de CD1d para formar um complexo, contatar o complexo com a célula NKT,remover o complexo não ligado do meio, e detectar o complexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

AS FIGS. 1A, 1B e 1C representam um esquema sintético adequado para PBS-57.

A FIG. 2 representa as estruturas de um composto prototípico da invenção,denominado "PBS-57," e KRN7000.

A FIG. 3 representa a marcação de células Va14/NKT de populações de célula dotimo (A-C) e baço (D-F) do camundongo com anti-TCRp-FITC e PBS-57 (C e F), KRN7000(B e E) ou veículo sozinho (A e D).

A FIG. 4 representa a ligação de tetrâmeros de CD1d carregados com PBS-57 àslinhagens de célula de hibridoma NKT no contexto de variar TCR Vp expressado pela célulaNKT. Tetrâmeros de CD1d carregados com um glicolipídeo não estimulante (a-galactosicolesterol) foram usados como um controle negativo.

A FIG. 5 representa a marcação de células NKT responsivas ao CD1d usandotetrâmeros de CD1 d de camundongo e humano carregado com PBS-57 em amostras desangue de primata humano e não humano.

A FIG. 6 representa a liberação de citocina a partir de esplenócitos de camundongoB6 estimulados com PBS-57 (quadrados pretos) ou KNR7000 (quadrados brancos).

A FIG. 7 representa concentrações de soro de INF-γ a partir de camundongosintravenosamente injetadas com quantidades indicadas de glicolipídeos PBS-57 (barraspretas) ou KRN7000 (barras brancas).

A FIG. 8 mostra estruturas para várias formas de realização adequadas decompostos da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE VÁRIAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

Em um esforço para encontrar compostos que ativam células NKT, os inventoressintetizaram e estudaram uma série de α-galactosil ceramidas modificadas ("aGCs"). Comoum resultado deste trabalho, foi determinado que uma modificação adequada para aGC éuma adição de uma ligação dupla eis na cadeia acila na porção ceramida do ácido graxo.Esta modificação foi mostrada para aumentar a solubilidade em compostos completamentesaturados e facilitar o carregamento do glicolipídeo no sítio de ligação de CD1d. Uma outramodificação adequada substitui o grupo hidroxila na posição C6 da galactose em aGC comuma amida ligada a uma molécula pequena. Estas modificações foram encontradas paraproduzir compostos que retêm a capacidade para estimular liberação de citocina por célulasNKT em níveis comparáveis a KRN7000.

Um composto prototípico da invenção, PBS-57 (mostrado na FIG. 1), que inclui asmodificações descritas acima, marca células NKT de camundongo e humanas assim comoKRN7000 e apresenta solubilidade relativamente alta. Estudos in vitro e in vivo daspropriedades de estímulo da célula NKT de PBS-57 indicaram que isto estimula células NKTmais eficazmente do que KRN7000.

Compostos

Compostos da invenção são glicolipídeos representados pela fórmula I, mostradaabaixo:

<formula>formula see original document page 5</formula>

em que:

R1 é selecionado de:

(i) C(O) R13;

(ii) C(R13)R14, em que R14 é -H1 ou R13 ou R14 e R2 tomados juntos, formam umaligação dupla entre os átomos de carbono e nitrogênio a que eles são ligados; ou

(iii) SO2R13;

em que R13 é halo; hidróxi, OR9; ORi0; amino, NHR9; N(R9)2; NHR10; N(R10)2;aralquilamino; ou alquila C1-C12 opcionalmente substituído com halo, hidroxila, oxo, nitro,OR9, OR10, acilóxi, amino, NHR9, N(R9)2, NHR10, N(R10)2, aralquilamino, mercapto, tioalcóxi,S(O)R9l S(O)R10l SO2R9l SO2R10, NHSO2R9, NHSO2R10, sulfato, fosfato, ciano, carboxila,C(O)R9l C(O)R10l C(O)OR9l C(O)NH2l C(O)NHR9, C(O)N(R9)2, cicloalquila C3-C10 contendoR11 0-3, heterocicila C3-C10 contendo R11 0-3, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, cicloalquenilaC5-C10, heterocicloalquenila C6-C10, arila C6-C20 contendo R12 0-3, ou heteroarila contendoR12 0-3; ou cicloalquila C3-C10, heterociclila C3-C10, cicloalquenila C6-C10, ouheterocicloalquenila C5-C10 opcionalmente substituído com um ou mais halo hidroxila, oxo,OR9l OR10, acilóxi, nitro, amino, NHR9l N(R9)2, NHR10l N(R10)2l aralquilamino, mercapto,tioalcóxi, S(O)R9l S(O)R10l SO2R9l SO2R10lNHSO2R9, NHSO2R10, sulfato, fosfato, ciano,carboxila, C(O)R9, C(O)R10, C(O)OR9, C(O)NH2, C(O)NHR10, C(O)N(R10)2, alquila,haloalquila, cicloalquila C3-C10 contendo R11 0-3, heterociclila C3-C10 contendo R11 0-3,alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, cicloalquenila C5-C10, heterocicloalquenila C5-C10, arilheteroarila C6-C20 contendo R12 0-3, ou heteroarila C6-C20 contendo R12 0-3; ou alquenilaC2-C6, alquinila C2-C6, arila, ou heteroarila opcionalmente substituído com um ou mais halo,hidroxila, OR9, OR10l acilóxi, nitro, amino, NHR9, N(Rg)2, NHR10l N(R10)2, aralquilamino,mercapto, tioalcóxi, S(O)R9, S(O)R10, SO2R9, SO2R10, NHSO2R10l sulfato, fosfato, ciano,carboxila, C(O)R9, C(O)R10, C(O)OR9, C(O)NH2, C(O)NHR9, C(O)N(R9)2, alquila, haloalquila,cicloalquila C3-C10 contendo R11 0-3, heterocicila C3-C10 contendo Rn 0-3, alquenila C2-C6,alquinila C2-C6, cicloalquenila C6-C10, heterocicloalquenila C5-C10, arila C6-C20 contendo R120-3, ou heteroarila C6-C20 contendo R12 0-3;

R2 é -H ou alquila C1-C6;

R3 é -H se R4 for -OH1 ou R3 é -OH se R4 for -H;

R4 é -H se R3 for -OH, ou R4 é -OH se R3 for -H;

R5 é selecionado de:

(i) -(CH2)XCH=CH(CH2)YCH3; ou

(ii) -(CH2)xCH=CH(CH2)YCH=CH(CH2)zCH3, em que X, Y e Z são números inteirosindependentemente selecionados de 1 a cerca de 14;

R6 é -OH ou forma uma ligação dupla com R7;

R7 é -H ou forma uma ligação dupla com R6;

R3 é um hidrocarboneto saturado ou insaturado tendo de cerca de 5 a cerca de 15átomos de carbono;

cada R9 é independentemente um alquila C1-C20 opcionalmente substituído comhalo, hidroxila, alcóxi, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato;

cada R10 é independentemente um arila opcionalmente substituído com halo,30 haloalquila, hidróxi, alcóxi, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato;

cada R11 é independentemente halo, haloalquila, hidróxi, alcóxi, oxo, amino,alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato; e

cada R12 é independentemente halo, haloalquila, hidróxi, alcóxi, nitro, amino,alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato.

Em formas de realização particulares de compostos da fórmula I, R5 é (i), X é 13 eY é 7. Em outras formas de realização adequadas, R1 é -CH3. Ainda em outras formas derealização, R1 é (i) e R13 é -CH3; R5 é (i), e X é 13, e Y é 7; R6 é -OH; R7 é -H; e R8 é C14H29.Em outras formas de realização, se R1 é (i) então R13 não é -CH3; se R5 é (i) então χ e y nãosão 13 e 7, respectivamente; R6 não é -OH; R7 não é -H; e R8 não é C14H29. Estruturas paravários exemplos adequados de compostos da invenção são mostradas na FIG. 8.

Termos usados na descrição acima de glicolipídeos da invenção são definidoscomo segue:

O termo "glicolipídeo" refere-se a qualquer composto contendo um ou maisresíduos de monossacarídeo (porção "glico") unidos por uma ligação glicosídica a umaporção hidrofóbica tal como um acilglicerol, um esfingóide, uma ceramida (N-acilesfingóide)ou um prenilfosfato (porção "lipídeo"). Em formas de realização particulares, um ou maissacarídeos são ligados a uma porção ceramida.

O termo "halo" ou "halogênio" refere-se a qualquer radical de flúor, cloro, bromo ouiodo.

O termo "alquila" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que pode ser umacadeia reta ou cadeia ramificada, contendo o número indicado de átomos de carbono. Porexemplo, alquila C1-C12 indica que o grupo pode ter de 1 a 12 (inclusive) átomos de carbononele. Os termos "arilalquila" ou "aralquila" referem-se a uma porção alquila em que umátomo de alquil hidrogênio é substituído por um grupo arila, por exemplo grupos benzila ou9-fluorenila. O termo "alquilamino" e "dialquilamino" referem-se a radicais -NH(alquil) e -NH(alquil)2 respectivamente. O termo "alcóxi" refere-se a um radical -O-alquila. O termo"mercapto" refere-se a um radical SH. O termo "tioalcóxi" refere-se a um radical -S-alquila.

O termo "arila" refere-se a um sistema de anel de hidrocarboneto monocíclico,bicíclico, ou tricíclico aromático, em que qualquer átomo do anel capaz de substituição podeser substituído por um substituinte, tais como, mas não limitados a, fenila, naftila, eantracenila.

O termo "cicloalquila" como utilizado aqui inclui grupos de hidrocarboneto cíclico,bicíclico, tricíclico, ou policíclico saturado tendo 3 a 12 carbonos, em que qualquer átomo doanel capaz de substituição pode ser substituído por um substituinte. Exemplos de porçõescicloalquila incluem, mas não são limitados a, cicloexila e adamantila.

O termo "heterociclila" refere-se a um sistema de anel de 3 a 10 membrosmonocíclico, 8 a 12 membros bicíclico, ou 11 a 14 membros tricíclico não aromático tendo 1a 3 heteroátomos se monocíclico, 1 a 6 heteroátomos se bicíclico, ou 1 a 9 heteroátomos setricíclico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N, ou S (por exemplo, átomos decarbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de N, O, ou S se monocíclicos, bicíclicos, outricíclicos, respectivamente), em que qualquer átomo do anel capaz de substituição pode sersubstituído por um substituinte.

O termo "cicloalquenila" como utilizado aqui inclui grupos de hidrocarboneto cíclico,bicíclico, tricíclico, ou policíclico, não aromático, parcialmente insaturado tendo 5 a 12carbonos, preferivelmente 5 a 8 carbonos, em que qualquer átomo do anel capaz desubstituição pode ser substituído por um substituinte. Exemplos de porções cicloalquilaincluem, mas não são limitados a cicloexenila, cicloexadienila, ou norbornenila.

O termo "heterocicloalquenila" refere-se a um sistema de anel de 5 a 10 membrosmonocíclico, 8 a 12 membros bicíclico, ou 11 a 14 membros tricíclico, não aromático,parcialmente saturado tendo 1 a 3 heteroátomos se monocíclico, 1 a 6 heteroátomos sebicíclico, ou 1 a 9 heteroátomos se tricíclico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N,ou S (por exemplo, átomos de carbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de N, O, ou Sse monocíclicos, bicíclicos, ou tricíclicos, respectivamente), em que qualquer átomo do anelcapaz de substituição pode ser substituído por um substituinte.

O termo "heteroarila" refere-se a um sistema de anel de 5 a 8 membrosmonocíclico, 8 a 12 membros bicíclico, ou 11 a 14 membros tricíclico aromático tendo 1 a 3heteroátomos se monocíclico, 1 a 6 heteroátomos se bicíclico, ou 1 a 9 heteroátomos setricíclico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N, ou S (por exemplo, átomos decarbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de N, O, ou S se monocíclicos, bicíclicos, outricíclicos, respectivamente), em que qualquer átomo do anel capaz de substituição pode sersubstituído por um substituinte.

O termo "oxo" refere-se a um átomo de oxigênio, que forma um carbonila quandoligado ao carbono, um N-óxido quando ligado ao nitrogênio, e um sulfóxido ou sulfonaquando ligado ao enxofre.

O termo "acila" refere-se a um substituinte alquilcarbonila, cicloalquilcarbonila,arilcarbonila, heterociclilcarbonila, ou heteroarilcarbonila, qualquer dos quais pode ser aindasubstituído por substituintes.

O termo "substituintes" refere-se a um grupo "substituído" em um grupo alquila,cicloalquila, alquenila, alquinila, heterociclila, heterocicloalquenila, cicloalquenila, arila, ouheteroarila em qualquer átomo desse grupo. Substituintes adequados incluem, semlimitação, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, halo, hidróxi, ciano, nitro, amino, SO3H, sulfato,fosfato, perfluoroalquila, perfluoroalcóxi, metilenodióxi, etilenodióxi, carboxila, oxo, tioxo,imino (alquila, arila, aralquila), S(0)nalquila (onde η é 0 a 2), S(0)narila (onde η é 0 a 2),S(0)nheteroarila (onde η é 0 a 2), S(0)nheterociclila (onde η é 0 a 2), amina (mono-, di-,alquila, cicloalquila, aralquila, heteroaralquila, e combinações destes), éster (alquila,aralquila, heteroaralquila), amida (mono-, di-, alquila, aralquila, heteroaralquila, ecombinações destes), sulfonamida (mono-, di-, alquila, aralquila, heteroaralquila, ecombinações destes), arila não substituído, heteroarila não substituído, heterociclila nãosubstituído, e cicloalquila não substituído. Em um aspecto, os substituintes em um grupo sãoindependentemente qualquer um sozinho, ou qualquer subconjunto dos substituintesanteriormente mencionados.Um glicolipídeo particularmente adequado da invenção, designado "PBS-57," érepresentado pela fórmula estrutural II:

Como com a maioria dos glicolipídeos, problemas de solubilidade são os principaispara o manejo dos compostos. Os compostos são usualmente solubilizados em DMSO, edepois diluídos para realizar concentrações em soluções aquosas. Os presentes compostosforam mostrados ser mais solúveis em DMSO do que KRN7000, desse modo fornecendobaixas concentrações residuais de DMSO nas soluções de trabalho. Em formas derealização adequadas, os compostos da invenção são pelo menos cerca de 10 mg/ml_ emDMSO sob condições ambientes (aproximadamente 20 °C). Em mais formas de realizaçãoadequadas, os compostos da invenção são pelo menos cerca de 20 mg/mL em DMSO natemperatura ambiente. Em outras formas de realização adequadas, os compostos dainvenção são pelo menos 80 %, pelo menos dobrados, ou pelo menos quadruplicados emrelação à solubilidade de KRN7000 em DMSO na temperatura ambiente.

Em formas de realização particulares, compostos da invenção são capazes de ligarum monômero ou tetrâmero de CD1d. O monômero de CD1d pode ser solúvel, imobilizadoem uma superfície sólida, ou expressado na superfície de uma célula NKT. Tetrâmeros deCD1d são bem conhecidos e comercialmente disponíveis. Como usado aqui, "capaz de ligarum monômero ou tetrâmero de CD1d" significa a capacidade do composto ligar CD1d emum ensaio de ligação de lipídeo, isto é, um ensaio de competição de um glicolipídeocarregado e um controle e resolução não carregados de moléculas CD1 carregadas comglicolipídeo por eletroforese com IEF (focalização isoelétrica), como descrito em Cantu et al.,The Paradox of Imune Molecular Recognition of α-Galactosylceramide: Low Affinity, LowSpecificity for CD1d, High Affinity for apTCRs, Journal of Immunology, 2003, 170:p. 4673-4682, a divulgação de que é incorporada aqui por referência. Como determinado por IEF, aligação do composto às moléculas CD1d pode ser quantificada em relação à ligação de umglicolipídeo não carregado a moléculas CD1d. A ligação do composto a CD1d pode sertitulada para saturação e quantificada a partir de géis para IEF para determinar constantesde ligação de equilíbrio. Um composto será considerado capaz de ligar uma molécula CD1dse ela apresentar um K0 menor do que 1mM quando determinado usando o ensaio emCantu et al. citado acima.

Outros métodos para avaliar a capacidade de um composto ligar um monômero outetrâmero de CD1d são conhecidos e incluem, por exemplo, cromatografia de filtração emgel, eletroforese em gel, ressonância superficial com plasmon e ELISA. A ligação tambémpode ser avaliada marcando-se células NKT com compostos complexados a tetrâmeros deCD1d, como descrito em Liu, Y. et al., J. Immun. Methods 2006, 312: 34-39, incorporadoaqui por referência.

Usando qualquer ensaio adequado, a capacidade de um composto ligar-se àsmoléculas CD1d pode ser comparada às capacidades de ligação de KRN7000.Adequadamente, o composto exibe pelo menos 80 % da capacidade de ligação do CD1d deKRN7000, mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos odobro, mais preferivelmente pelo menos o quádruplo da capacidade de ligação do CD1d deKRN7000.

Em outras formas de realização, compostos da invenção são capazes de ativaruma célula NKT. A ativação de células NKT pode ser avaliada, por exemplo, como descritoabaixo e nos exemplos.

Métodos de ativar células NKT

"Estimulação de uma célula NKT" e "ativação de uma célula NKT" são usadaspermutavelmente aqui para referirem-se à indução de um efeito observável em uma célulaNKT que é compatível com uma resposta celular para o ajuste do TCR da célula NKT comum antígeno apresentado no contexto da molécula CD1d. Efeitos observáveis de ativaçãode células NKT incluem secreção de citocinas, proliferação clonal e supra-regulação daexpressão de marcadores de superfície celular, por exemplo, moléculas CD69, receptoresIL-12 e/ou moléculas CD40L. Para ativar uma célula NKT de acordo com os presentesmétodos, a célula NKT é contatada com um composto da invenção na presença de ummonômero ou tetrâmero de CD1d. Adequadamente, um composto da invenção estimulauma célula NKT quando o composto é complexado com, ou ligado a, um monômero outetrâmero de CD1d. A ativação da célula NKT resulta da contatação do TCR da célula NKTcom o complexo, desse modo obtendo uma resposta observável, tal como, por exemplo,expressão da citocina modificada. "Um receptor de célula T de uma célula NKT", como otermo é usado aqui, refere-se ao TCR conservado, semi-invariante de células NKTcompreendendo por exemplo, Va14-Ja18/Vpi1 em seres humanos e Va14-Ja/Vp8 emcamundongos.

Como usado aqui, "contatar uma célula NKT" refere-se à adição in vitro de umcomposto da invenção às células NKT em cultivo, opcionalmente na presença demonômeros ou tetrâmeros de CD1d solúveis, ou insolúveis, imobilizados ou célulasapresentadoras de antígeno (APCs) expressando moléculas CD1d, ou à administração invivo de um composto da invenção a um paciente. O composto pode ser apresentado aoTCR da célula NKT por moléculas CD1d na superfície de uma célula apresentadora deantígeno (APC)1 tal como uma célula dendrítica (DC) ou macrófago. Alternativamente,moléculas CD1d podem ser plaqueadas e as células NKT e um composto da invençãopodem ser adicionados às moléculas CD1d in vitro.

Exemplos de citocinas que podem ser secretadas por células NKT ativadas deacordo com a invenção podem incluir, mas não são limitadas a, IL-10, IL-4, e IL-12, IL-13,GM-CSF1 IFN-γ, IL-2, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, e TGF-β. É avaliado que combinações dequalquer uma das citocinas observadas acima podem ser secretadas por células NKT naativação. Métodos para detectar e medir níveis de citocinas secretadas são bem conhecidosna técnica. Como será apreciado, a avaliação da ativação da célula NKT é adequadamenterealizada medindo-se a expressão da citocina pela célula NKT em relação a um controleadequado.

A proliferação da célula NKT também pode ser induzida contatando-se células NKTcom um ou mais compostos da invenção. A proliferação é adequadamente medida in vitropor métodos padrão, por exemplo, ensaios de incorporação de 3H-timidina ou de BrdU.

A supra-regulação de marcadores de superfície celular também é adequadamenteobservada na ativação de células NKT. Por exemplo, receptores CD69, CD25, CD40L e IL-12 são supra-regulados na ativação de células NKT. Métodos imunológicos, tais comoFACS, podem ser usados para detectar a supra-regulação de marcadores de superfíciecelular, assim como outros métodos comumente utilizados na técnica. Efeitos à jusante daativação da célula NKT, tais como indução da maturação da DC, também são observáveis,por exemplo, medindo-se a supra-regulação de CD80 e/ou CD86 em DCs.

A ativação in vivo e ex vivo de células NKT é especificamente considerada além daativação in vitro. A apresentação de compostos da invenção a células NKT no contexto demoléculas CD1d resulta na ativação da célula NKT e maturação da célula dendrítica.Consequentemente, estes compostos estimulam respostas imunes contra antígenosnominais assim como agentes infecciosos e malignidades neoplásticas, incluindo tumoressólidos e hematológicos. Tanto a imunidade celular quanto a humoral pode ser estimuladaadministrando-se compostos agonistas de célula NKT, como ainda descrito abaixo.

Métodos de estimular uma célula NKT in vivo, isto é, em um paciente, incluemadministrar um composto agonista de célula NKT ao paciente. A administração a umpaciente de acordo com alguns métodos da invenção pode incluir primeiro formular ocomposto agonista de célula NKT com um veículo e/ou excipiente fisiologicamente aceitávelpara fornecer dosagens desejadas, estabilidade, etc. Formulações adequadas parapreparações de vacina e compostos terapêuticos são conhecidas na técnica. Métodos deestimular uma célula NKT ex vivo podem incluir o uso de métodos de transferência adotadoscom base em administrar células que foram contatadas com compostos agonistas de célulaNKT ex vivo para estimular células NKT em um paciente. Em algumas formas de realização,as células podem ser células NKT que são estimuladas ex vivo e injetadas em um paciente.

Em outras formas de realização, as células podem ser APCs que foram contatadas comcompostos da invenção ex vivo para permitir o carregamento das moléculas CD1dexpressadas na superfície com o composto para apresentação às células NKT. As célulasNKT estimuladas ex vivo ou APCs carregadas depois podem ser administradas, porexemplo, por injeção no paciente.

Métodos de estimular uma resposta imune

Algumas formas de realização da invenção fornecem um método de estimular umaresposta imune em um paciente. Um "paciente" é um vertebrado, adequadamente ummamífero, mais adequadamente um ser humano. Como será avaliado, para propósitos deestudo, o paciente é adequadamente um modelo animal, por exemplo, um camundongo. "Aestimulação de uma resposta imune" inclui, mas não é limitada a, indução de um efeitoterapêutico ou profilático que é mediado pelo sistema imune do paciente. Maisespecificamente, estimular uma resposta imune no contexto da invenção refere-se a obteruma resposta de célula NKT em um paciente administrando-se uma quantidade eficaz deum composto da invenção ao paciente, desse modo induzindo efeitos à jusante tais comoprodução de anticorpos, permuta de classe da cadeia pesada do anticorpo, maturação deAPCs1 e estimulação de células T citolíticas, células auxiliares T e tanto células de memóriaT quanto B. Alternativamente, a estimulação de uma resposta imune em um paciente podeser realizada administrando-se ao paciente uma população de células NKT que foramativadas como descrito acima ou uma população de células apresentadoras de antígenoCD1d+ que foram contatadas com um composto da invenção. Adicionalmente, qualquercombinação dos métodos acima de estimular uma resposta imune pode ser adequada.

Em algumas formas de realização, a resposta imune estimulada de acordo com ainvenção pode ser uma resposta imune antimicrobiana. Uma tal resposta imune promoveadequadamente a liberação de um agente infeccioso ou permite controle imune do agentetal que os sintomas da doença são reduzidos ou resolvidos, por exemplo, uma infecçãopersistente ou latente.

Em outras formas de realização, a resposta imune realçada pode ser uma respostaimune anti-câncer ou anti-tumor. Uma tal resposta imune promove adequadamente rejeiçãodo tumor, reduz o volume do tumor, reduz a carga tumoral, previne a metástase, e/ouprevine o retorno do tumor. O tumor pode ser qualquer tumor sólido ou hematológico,incluindo mas não limitado a leucemia, limfoma, cânceres relacionados à AIDS, cânceres deosso, cérebro, mama, sistema gastrointestinal, sistema endócrino, olho, trato geniturinário,células germinais, órgãos reprodutivos, cabeça e pescoço, sistema musculoesquelético,pele, sistema nervoso ou sistema respiratório. Como é avaliado na técnica, uma respostaimune específica ao câncer pode ser monitorada por vários métodos, incluindo: 1) medircitotoxicidade de células efetoras, usando, por exemplo, um ensaio de liberação de cromo;2) medir a secreção de citocina por células efetoras; 3) avaliar as especificidades doreceptor de célula T (TCR), por exemplo, usando-se multímeros de peptídeo-MHC; 4) medira composição clonal da resposta de célula T; e/ou 5) medir a desgranulação da célula T.

Uma resposta imune realçada também é adequadamente avaliada pelo ensaios taiscomo, por exemplo, ativação de células NKT, indução da produção de citocina, indução damaturação de APCs1 realce de funções da célula T citolíticas e auxiliares, realce dorecrutamento de célula T CD8+ e CD4+, realce da produção de anticorpo, indução dapermuta de classe de anticorpo e tolerância à quebra.

A estimulação de uma resposta imune em um paciente de acordo com a invençãopode ser realizada administrando-se ao paciente uma composição incluindo um compostoda invenção e em algumas formas de realização, um antígeno. O composto e o antígenopodem ou não induzir uma resposta imune detectavelmente realçada quando administradosa um paciente independentemente.

Adequadamente, o composto e o antígeno são co-administrados para estimularuma resposta imune em um paciente. O termo "co-administração" é significado para referir-se a qualquer protocolo de administração em que um composto da invenção e um antígenosão administrados a um paciente. O composto e o antígeno podem estar nas mesmasformulações de dosagem ou formulações separadas. Onde o composto e o antígeno estãoem formulações de dosagem separadas, eles podem ser administrados concorrente,simultânea ou seqüencialmente (isto é, a administração de um pode diretamente suceder aadministração do outro ou eles podem ser fornecidos periodicamente, isto é, um pode serfornecido em um período seguido pelo outro em um período posterior, por exemplo, dentrode uma semana), contanto que eles sejam fornecidos em uma maneira suficiente parapermitir que ambos obtenham quantidades terapêutica ou profilaticamente eficazes nopaciente. O composto e o antígeno também podem ser administrados por vias diferentes,por exemplo, um pode ser administrado intravenosamente enquanto o segundo éadministrado intramuscular, intravenosa ou oralmente.

Em algumas formas de realização, o composto é adequadamente adicionado a umacomposição de vacina ou é co-administrado com uma composição de vacina. A adição deum composto da invenção a uma composição de vacina ou a co-administração com umacomposição de vacina pode ser particularmente adequada em casos onde o antígeno temuma taxa baixa de eficácia como uma vacina e/ou pode ser administrado em umaquantidade ou em uma dose maior do que aquela que pode ser considerada ideal devido aefeitos colaterais, custo e/ou disponibilidade do antígeno, etc. Exemplos de tais vacinaspodem incluir, mas não são limitados a vacinas contra o papilomavírus humano, vacinacontra otite média aguda (PREVNAR®), vacinas contra gripe, vacinas contra cólera e avacina contra telomerase que causa câncer.

A administração a um paciente pode ser realizada por qualquer método adequado,incluindo absorção intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transcutânea,oral, nasofaríngea ou transmucosal, entre outras. Adequadamente, um composto dainvenção é administrado em uma quantidade eficaz para ativar uma célula NKT ou célulastal que um efeito profilático ou terapêutico é obtido no paciente, por exemplo, uma respostaimune anti-tumor ou resposta imune antimicrobiana.

A administração a um paciente também inclui o uso de métodos de transferênciaadotados com base na administração de células que foram contatadas com um composto dainvenção ex vivo para estimular ou realçar uma resposta imune em um paciente. Emalgumas formas de realização, as células podem ser células NKT que são ativadas ex vivo einjetadas em um paciente para fornecer ou realçar uma resposta imune a, por exemplo,células cancerosas ou agentes infecciosos. Em algumas formas de realização, as célulaspodem ser APCs que foram contatadas com um composto da invenção ex vivo para permitiro complexo com as moléculas CD1d expressado pela APC. Células apresentadoras deantígeno depois podem ser administradas, por exemplo, por injeção no paciente, parafornecer uma resposta imune adequada. Este método de administração leva em conta aestimulação da resposta imune com mínima exposição do paciente ou das células dopaciente aos compostos.

A administração de compostos da invenção a um paciente de acordo com ainvenção mostra-se para exibir efeitos benéficos em uma maneira dependente da dose.Assim, dentro de limites amplos, a administração de grandes quantidades dos compostos éesperada para ativar maiores números de células NKT ou ativar células NKT a um maiorgrau do que faz a administração de uma quantidade menor. Além disso, a eficácia também éconsiderada em dosagens abaixo do nível em que a toxicidade é observada.

Será avaliado que a dosagem específica administrada em qualquer caso dado seráajustada de acordo com o composto ou compostos sendo administrados, a doença a sertratada ou prevenida, a condição do paciente, e outros fatores médicos relevantes quepodem modificar a atividade do composto ou a resposta do paciente, como é bem conhecidopor aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, a dose específica para um pacienteparticular depende da idade, peso corpóreo, estado geral de saúde, dieta, o tempo e modode administração, a taxa de excreção, medicamentos usados em combinação e aseveridade do distúrbio particular a que a terapia é aplicada. Dosagens para um pacientedado podem ser determinadas usando considerações convencionais, por exemplo, porcomparação habitual das atividades diferenciais do composto da invenção e de um agenteconhecido tal como aGalCer, tal como por meio de um protocolo farmacológico ou profiláticoconvencional apropriado.

A dosagem máxima para um paciente é a dosagem mais alta que não causa efeitoscolaterais indesejáveis ou intoleráveis. O número de variáveis no que diz respeito a umregime profilático ou de tratamento do indivíduo é grande, e uma faixa considerável dedoses é esperada. É esperado que dosagens do composto de acordo com a presenteinvenção prevenirão ou reduzirão sintomas pelo menos 50 % comparadas aos sintomas dopré-tratamento. É especificamente considerado que preparações de vacina e composiçõesda invenção podem paliar ou aliviar sintomas da doença sem fornecer uma cura, ou, emalgumas formas de realização, podem ser usadas para curar ou prevenir a doença oudistúrbio.

Quantidades de dosagem eficazes adequadas para administrar os compostospodem ser determinadas por aqueles de habilidade na técnica, mas tipicamente variam decerca de 1 micrograma a cerca de 10.000 microgramas por quilograma de peso corpóreosemanalmente, embora elas estejam tipicamente a cerca de 1.000 microgramas ou menospor quilograma de peso corpóreo semanalmente. Em algumas formas de realização, aquantidade de dosagem eficaz varia de cerca de 10 a cerca de 5.000 microgramas porquilograma de peso corpóreo semanalmente. Em uma outra forma de realização, aquantidade de dosagem eficaz varia de cerca de 50 a cerca de 1.000 microgramas porquilograma de peso corpóreo semanalmente. Em uma outra forma de realização, aquantidade de dosagem eficaz varia de cerca de 75 a cerca de 500 microgramas porquilograma de peso corpóreo semanalmente. As quantidades de dosagem eficazesdescritas aqui referem-se a quantidades totais administradas, isto é, se mais do que umcomposto é administrado, as quantidades de dosagem eficazes correspondem à quantidadetotal administrada. O composto pode ser administrado como uma dose única semanalmenteou como doses divididas.

Em algumas formas de realização, um antígeno de tumor e o composto são co-administrados a um paciente para induzir uma resposta imune anti-tumor no paciente.Adequadamente, a co-administração do antígeno com o composto realça a resposta anti-tumor e resulta na inibição do crescimento do tumor, redução da carga tumoral e tratamentode câncer, como descrito acima.

Composições

Os compostos da invenção, como descrito acima, são adequadamente incluídos emuma composição com um veículo fisiologicamente aceitável. Um veículo "fisiologicamenteaceitável" é qualquer veículo que é adequado para administração in vivo (por exemplo,administração oral, transdérmica ou parenteral) ou uso in vitro, isto é, cultura celular.Veículos fisiologicamente aceitáveis adequados para administração in vivo incluem água,soluções tamponadas e soluções de glicose, entre outros. Um veículo adequado paracultura celular são meios celulares comercialmente disponíveis. Componentes adicionaisdas composições adequadamente podem incluir excipientes tais como estabilizadores,preservantes, diluentes, emulsificadores ou lubrificantes, além do veículo fisiologicamenteaceitável e um ou mais compostos da invenção. Em particular, excipientes adequadosincluem, mas não são limitados a, Tween 20, DMSO, sacarose, L-histadina, polisorbato 20 esoro.

Adequadamente, composições compreendendo compostos da invenção podem serformuladas para o uso in vivo, isto é, administração terapêutica ou profilática a um paciente.Em algumas formas de realização, as composições são formuladas para administraçãoparenteral. Uma forma de dosagem adequada para administração parenteral é umainjetável. Uma forma de dosagem injetável pode ser uma solução ou suspensão isotônica epode ser preparada usando um agente de dispersão, agente umectante ou agente desuspensão adequados, como conhecido na técnica. Em outras formas de realização, ascomposições são formuladas para administração oral. Formas de dosagem oral adequadasincluem tabletes, cápsulas, xaropes, comprimidos e pastilhas, entre outros. Formulações dedosagem oral adequadamente incluem lactose, amido, derivados de celulose, estearato demagnésio, ácido esteárico, glicóis, e outros. Será avaliado que as composições da invençãonão são limitadas a qualquer forma de dosagem exemplificada particular, mas podem serformuladas em qualquer maneira descrita na técnica, por exemplo, em Remington'sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., (2000), que é incorporada aqui porreferência.

Além do composto da invenção e um veículo fisiologicamente aceitável, algumasformas de realização da invenção ainda incluem monômeros ou tetrâmeros de CD1d.Nestas composições, pelo menos uma porção do composto presente na composição éligada a pelo menos uma porção dos monômeros ou tetrâmeros de CD1d. Opcionalmente,quantidades de moléculas CD1d e concentração do composto da invenção podem serotimizadas tal que substancialmente todas as moléculas CD1 d na composição são ligadaspelo composto da invenção.

Em outras formas de realização, o composto da invenção (ou o composto ligado porum monômero ou tetrâmero de CD1d) e um antígeno são adequadamente co-formuladosem uma composição. Antígenos incluídos na composição podem ser porções polipeptídeoou carboidrato, ou combinações destas, por exemplo, glicoproteínas. O antígeno pode serderivado de um agente infeccioso (por exemplo, um microorganismo patogênico), um tumor,uma molécula endógena (por exemplo, uma "auto"- molécula), ou, para propósitos deestudo, um antígeno nominal, tal como ovalbumina. A composição também pode serformulada como uma vacina usando uma variedade de métodos preparativos conhecidosàqueles de habilidade na técnica. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co., (2000), que é incorporada aqui por referência.

Em algumas formas de realização, antígenos para inclusão em composições dainvenção são adequadamente derivados de agentes infecciosos enfraquecidos ou mortos.Será entendido que todos os microorganismos ou porções destes (por exemplo, espectrosde membrana; preparações de membrana bruta, Iisatos e outras preparações demicroorganismos) podem ser adequadamente incluídos como um antígeno. Agentesinfecciosos adequados dos quais um antígeno pode ser derivado incluem, mas não sãolimitados a, vírus e microorganismos patogênicos. Em alguns contextos, antígenosadequados são obtidos ou derivados de um patógeno viral que está associado com doençahumana incluindo, mas não limitada a, HIV/AIDS (Retroviridae, por exemplo, moléculasgp120 para isolados de HIV-1 e HIV-2, HTLV-I1 HTLV-11), os vírus da gripe(Orthomixoviridae, por exemplo, tipos A, B e C), herpes (por exemplo, os vírus do herpessimples, HSV-1 e HSV-2, glicoproteínas gB, gD e gH), infecções pelo rotavírus (Reoviridae),infecções respiratórias (parainfluenza e vírus sinciciais respiratórios), Poliomielite(Picornaviridae, por exemplo, poliovírus, rinovírus), sarampo e caxumba (Paramyxoviridae),Rubéola (Togaviridae, por exemplo, vírus da rubéola), hepatite (por exemplo, vírus dahepatite tipos A, B, C, D, E e/ou G), citomegalovírus (por exemplo, gB e gH), gastroenterite(Caliciviridae), febre Amarela e do Nilo Ocidental (Flaviviridae), Raiva (Rhabdoviridae), febrehemorrágica Coreana (Bunyaviridae), febre Venezuelana (Arenaviridae), verrugas(Papillomavirus), vírus da imunodeficiência símia, vírus da encefalite, vírus varicela-zóster,vírus Epstein-Barr, e outras famílias de vírus, incluindo Coronaviridae, Birnaviridae eFiloviridae.

Antígenos bacterianos e parasíticos adequados também podem ser obtidos ouderivados de agentes bacterianos conhecidos responsáveis por doenças incluindo, mas nãolimitadas a, difteria, coqueluche, tétano, tuberculose, pneumonia bacteriana ou fúngica, otitemédia, gonorréia, cólera, febre tifóide, meningite, mononucleose, peste, disenteriabacteriana ou salmonelose, doença dos Legionários, doença de Lyme, hanseníase, malária,ancilostomíase, Oncocercose, Esquistossomose, Tripanossomíase, Leishmaniose,giardíase, amebíase, filaríase, Borrélia, e triquinose. Outros antígenos ainda podem serobtidos ou derivados de patógenos não convencionais tais como os agentes causadores dekuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), scrapie, encefalopatia transmissível da marta, edoenças consuntivas crônicas, ou de partículas protéicas infecciosas tais como príons queestão associados com a doença da vaca louca.

Patógenos específicos dos quais antígenos podem ser derivados incluem M.tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonellal Vibrio cholerae, Treponemapallidum, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Francisella tularensis, Helicobacterpylori, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (tiposA e Β), pneumococo, meningococo, Haemophilus influenza (tipo b), Toxoplasmagondii, Moraxella catarrhalis, donovanose, e actinomicose; patógenos fúngicos incluemcandidíase e aspergilose; patógenos parasíticos incluem Tênia, dactilogirose,nematelmintos, amebíase, giardíase, Cryptosporidium, Sehistosoma, Pneumoeystis earinii,tricomoníase e triquinose. A presente invenção também pode ser usada para fornecer umaresposta imune adequada contra numerosas doenças veterinárias, tais como febre aftosa,coronavírus, Pasteurella multoeida, Helieobaeter, Strongylus vulgaris, Actinobacilluspleuropneumonia, Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV)1 Klebsiella pneumoniae, E. eoli, eBordetella pertussis, parapertussis e broehiseptiea.

Em algumas formas de realização, antígenos para inclusão em composições dainvenção são adequadamente antígenos derivados de tumor ou células tumorais totaisautólogas ou alogenéicas. Adequadamente, o antígeno de tumor é um antígeno específicode tumor (TSA) ou um antígeno associado ao tumor (TAA). Vários antígenos de tumor eseus padrões de expressão são conhecidos na técnica e podem ser selecionados com baseno tipo de tumor a ser tratado. Exemplos não Iimitantes de antígenos de tumor incluem cdk4(melanoma), β-catenina (melanoma), caspase-8 (carcínoma de célula escamosa), MAGE-1 eMAGE-3 (melanoma, mama, glioma), tirosinase (melanoma), idiotipo da Ig de superfície (porexemplo, BCR) (limfoma), Her-2/neu (mama, ovariano), MUC-1 (mama, pancreático) e HPVE6 e E7 (carcinoma cervical). Antígenos de tumor adequados adicionais incluem antígenoprostático específico (PSA), sialil-Tn (STn), proteínas de choque térmico e peptídeos detumor associados (por exemplo, gp96), moléculas de gangliosídeo (por exemplo, GM2, GD2,e GD3), Antígeno carcino-embrionário (CEA) e MART-1.

Marcação de células NKT

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método para marcarcélulas NKT em um meio. O método pode ser usado para identificar células NKT em ummeio a partir de outros tipos de célula. Em uma primeira etapa, um composto da invenção écomplexado a tetrâmero de CD1d solúvel. O tetrâmero é adequadamente marcado. Uma"marcação," como usado aqui, é qualquer entidade que possa ser avaliada. Marcaçõesadequadas incluem, mas não são limitadas a estrepavidina, biotina e fluoróforos, tais como,por exemplo, PE ou FITC. As células NKT são marcadas por contato com o complexocomposto marcado/tetrâmero de CD1d em um meio adequado. Um meio adequado podeser solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio celular comercialmente disponível,como conhecido na técnica. Complexos glicolipídeo/tetrâmero não ligados podem serremovidos do meio por qualquer recurso conhecido na técnica, por exemplo, lavagem ecentrifugação das células e remoção do meio. Células marcadas com o complexo podemser detectadas por qualquer meio adequado conhecido na técnica, tais como citometria defluxo ou microscopia de fluorescência.

Os exemplos seguintes são fornecidos para auxiliar em uma compreensão adicionalda invenção. Os materiais e condições particulares utilizados são intencionados a seremainda ilustrativos da invenção e não são Iimitantes no escopo razoável desta.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Síntese e solubilidade de PBS-57

PBS-57 foi sintetizado como mostrado na FIG. 1. Reagentes correspondentes àFIG. 1A são como segue (rendimentos em parênteses): (a) PPh3, DPPA1 DIAD (79 %). (b)AcCl, MeOH (81 %). (c) BnBr1 NaH1 DMF (47 %). (d) AcOH1 HCI (rendimento de 69 %). (e)DAST1 CH2CI2 (87 %). Reagentes correspondentes à FIG. 1B são como segue (rendimentosem parênteses): (a) Ácido nervônico, DCC1 NHS1 THF; Ac2O1 Et2N1 DMAP1 (48 %). (b)MeONa1 MeOH1 (71 %). (c) Cloreto de dimetiltexilsilila, piridina; Ac2O1 DMAP1 (80 %). (d)THF1 HF1 (83 %). Reagentes correspondentes à FIG. 1C são como segue (rendimentos em15 parênteses): (a) AgCIO4, SnCI2l CH2CI2l (56 %). b) PPh3ZH2O1 THF. c) Ac2O1 Piridina1 DMAP1(total de 80 %) (d) Na01 NH3l -78 0C (47 %).

A preparação dos intermediários na via sintética mostrada na FIG. 1 é descrita abaixo.

Preparação de 2: Composto 1 (3,00 g, 11,3 mmols) foi dissolvido em THF seco (20mL), esfriado a O °C, e PPh3 (5,95 g, 22,6 mmols) foi adicionado à solução, seguido porDIAD (5 mL, 22,6 mmols), depois DPPA (3,7 ml, 22,6 mmols). A mistura foi deixada aqueceraté a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi concentrada sobpressão reduzida, depois dissolvida em EtOAc (200 ml), lavada com 5 % de HCI (80 ml),continuou a ser lavada com NaHCO3 saturado, os extratos foram concentrados a vácuo, e oproduto foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2l EtOAc:hexanos 1:5) fornecendoum vidro transparente (2,61 g, rendimento de 79 %). RMN (1H, CDCI3) d 5,55 (d, J = 5,0 Hz,1 H), 4,63 (dd, J = 2,5, 8,0 Hz1 1 H), 4,34 (dd, J = 2,5, 5,0 Hz1 1 H), 4,20 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz,1 H), 3,93 - 3,90 (m, 1 H), 3,51 (dd, J = 9,0, 12,5 Hz1 1 H), 3,36 (dd, J = 5,5, 13,0 Hz, 1 H),1,55 (s, 3 H), 1,46 (s, 3 H), 1,34 (s, 3 H); 13C RMN (500 Hz, CDCI3) d 109,8, 108,9, 96,5,77,2, 77,0, 67,17, 50,8, 26,2, 26,1, 25,1, 24,6.

Preparação de 4: Composto 2 (3,71 g, 13,0 mmols) foi dissolvido em MeOH (40mL), esfriado a 0 °C, e AcCI (8,6 mL) foi adicionado. A mistura foi deixada aquecer até atemperatura ambiente e agitada durante a noite. O solvente foi removido sob pressãoreduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia (SiO2, 10 % de MeOH em CH2CI2)35 produzindo 3 (como mistura de anômeros) como um sólido branco (2,31 g, rendimento de 81%). A uma solução de 3 (1,5 g, 6,9 mmols) em DMF (60 mL) foi adicionado hidreto de sódioem óleo (1,26 g, 60 % em óleo mineral). A mistura foi agitada durante 5 min a 0 °C, depoisbrometo de benzila (4,9 mL, 41,4 mmols) foi adicionado às gotas. A agitação foi continuadadurante 12 h na temperatura ambiente, e depois metanol (10 mL) foi adicionado. O solventefoi removido a vácuo e o sólido resultante foi dissolvido/colocado em suspensão em CH2CI2-A mistura foi lavada com HCI 2 M e água, seca (Na2SO4)1 e concentrada. Cromatografia emcoluna (SiO2, EtOAc:hexanos 1:6) forneceu 4 como um vidro transparente (1,6 g, rendimentode 47 %). RMN (1H1 CDCI3) d 7,40 - 7,25 (m, 15 H), 5,02 - 4,62 (m, 7 H), 4,14 - 3,76 (m, 4 H),3,57 - 3,48 (m, 1 H), 3,39 (s, 3 H), 2,94 (dd, J = 2,4, 4.4 Hz, 1 H); RMN (13C, CDCI3) d

138.65, 138,58, 138,34, 128,68, 128,61, 128,32, 128,12, 128,01, 127,87, 127,78, 99,01,79,16, 76,48, 75,45, 74,81, 73,89, 69,98, 55,71, 51,64; HRFAB-MS (matriz tioglicerol + H+)m/e ([M + H]+) 490,2347, calculado 490,2342.

Preparação de 5: Composto 4 (1,6 g, 3,2 mmols) foi dissolvido em ácido acético:HCI 6 M (50 mL:7 mL). A mistura foi agitada a 85 0C durante 1 h, e a solução foiconcentrada sob pressão reduzida. O produto foi extraído com clorofórmio (100 mL) elavado com água fria (2 χ 50 mL), e os extratos combinados foram secos em Na2SO4 econcentrados a vácuo. Depois da cromatografia (SiO2, EtOAc:hexanos 1:4), composto 5 (1,0g, rendimento de 69 %) foi obtido como um óleo claro. RMN (1H, CDCI3) d 7,39 - 7,28 (m, 15H), 6,38 (d, J = 3,5 Hz, 1 H), 5,02 - 4,58 (m, 6 H), 4,17 (dd, J = 11,0, 4.0 Hz1 1 H), 3,91 -3,88(m, 3 H), 3,47 (dd, J = 12,5, 7,0 Hz1 1 H), 3,15 (dd, J = 12,5, 7,0 Hz, 1 H), 2,12 (s, 3 H); RMN(13C, CDCI3) d 169,55, 138,59, 138,13, 138,00, 128,68, 128,62, 128,57, 128,56, 128,53,128,51, 128,18, 128,13, 128,10, 128,03, 127,98, 127,85, 127,79, 127,60, 90,65, 78,67,75,45, 75,31, 74,95, 74,69, 74,60, 74,42, 73,57, 73,53, 71,89, 50,85, 21,28; HRFAB-MS(matriz tioglicerol + Na+) m/e ([M + Na]+) 540,2112 (100 %), calculado 540,2111.

Preparação de 6: Composto 5 (3,09 g, 5,7 mmols) foi dissolvido em 200 mL deCH2CI2, seguido por adição às gotas de DAST (0,906 mL). A solução foi agitada natemperatura ambiente durante 30 min antes que a reação fosse extinta com H2O (30 mL). Amistura depois foi diluída com CH2CI2 e lavada com água e salmoura, a camada orgânica foiseca e concentrada a vácuo. O produto desejado (2,7 g, rendimento de 87 %) foi obtidocomo um óleo claro depois da cromatografia (SiO2l EtOAc:hexanos 1:6). RMN (1H1 CDCI3) d7,40 - 7,25 (m, 15 H), 5,63 (dd, J = 54,0, 2,5 Hz, 1 H), 5,00 (d, J = 11,5 Hz, 1 H), 4,88 - 4,72(m, 4 H), 4,61 (d, J = 11,0 Hz, 1 H), 4,01 - 3,88 (m, 4 H), 3,51 (dd, J = 12,5, 7,5 Hz, 1 H),3,13 (dd, J = 12,0, 6,0 Hz, 1 H); RMN (13C ,CDCI3) d 138,38, 138,09, 138,07, 128,74, 128,71,

128.66, 128,56, 128,23, 128,20, 128,16, 128,04, 127,80, 107,12, 105,32, 78,45, 75,85,75,67, 74,99, 74,48, 73,99, 73,67, 72,14, 72,11, 50,96; HRFAB-MS (matriz tioglicerol + Na+)m/e ([M + Na]+) 500,1956 (100 %), calculado 500,1962.

Preparação de 8. Ácido nervônico (3,0 g, 8,2 mmols) foi dissolvido em THF anidro(100 mL) a 5 0C seguido por NHS (1,88 g, 16,3 mmols) e DCC (3,38 g, 16,3 mmols). Amistura foi aquecida ao refluxo durante 2 h. Fitoesfingosina dissolvida em THF e piridinaforam adicionadas à mistura de reação e submetidas ao refluxo durante 12 h. Anidridoacético (9 mL) foi adicionado seguido por trietilamina (9 mL), DMAP (300 mg), e a mistura foiagitada durante 2 h. O solvente foi removido a vácuo. Triacetato 7 (3,4 g, rendimento de48,6 %) foi isolado por cromatografia (SiO2, EtOAc:Hexano 1:8). Metal sódio (230 mg, 10mmols) foi adicionado a MeOH (100 mL). Triacetato 7 (3,4 g, 4,4 mmols) foi adicionado, e amistura foi agitada durante 1 h, depois centrifugada (3000 rpm, 5 m) para fornecer um sólidobranco. O sobrenadante foi removido, e o sólido enxaguado com MeOH fresco (80 mL) pararemover qualquer base remanescente. Depois da remoção do sobrenadante, o sólidobranco bruto (2,1 g, 71 %) foi seco sob vácuo. RMN (1H, CDCl3) d 6,14 (d, J = 9,5, 1 H), 5,34(m, 2 H), 5,12 (dd, J = 3, 8,5 Hz, 1 H), 4,93 (m, 1 H), 4,50 (m, 1 H), 4,29 (dd, J = 5, 11,5 Hz,1 H), 4,0 (dd, J = 3,0, 11,5 Hz1 1 H), 2,21 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,08 (s, 3 H), 2,05 - 1,99 (m, 10H), 1,66 - 1,60 (m, 4 H), 1,33 - 1,22 (m, 56 H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 6 H); RMN (13C, CDCI3) d178,25, 173,19, 171,31, 170,99, 170,20, 129,99, 73,15, 71,92, 63,05, 60,52, 47,50, 36,81,34,11, 32,05, 29,91, 29,83, 29,80, 29,74, 29,67, 29,51, 29,45, 29,39, 29,26, 28,10, 27,33,25,80, 25,68, 24,92, 22,82, 21,13, 20,88, 20,84, 14,30, 14,24. HRFAB-MS (matriz tioglicerol+ Na+) m/e ([M + Na]+) 814,6526, calculado 814,6537.

Preparação de 10. Triol 8 (2,1 g, 3,09 mmols) foi dissolvido em piridina (15 mL), ecloreto de dimetiltexilsilila (0,606 ml, 3,09 mmols) foi adicionado. Depois de 5 min, anidridoacético (1,16 mL, 12,3 mmols), e DMAP (200 mg) foram adicionados, e a mistura foi agitadadurante 2 h. Purificação por cromatografia (SiO2, EtOAciHex 1:20) produziu 9 (2,0 g,rendimento de 80 %) como um óleo claro. Composto 9 (2,0 g, 2,4 mmols) foi dissolvido emTHF (5 mL) em um tubo centrifugador (plástico), seguido por adição de HF aquoso (5 mL).Depois da conclusão da reação, a mistura foi vertida em NaHCO3 saturado (80 mL), depoisextraída com EtOAc (100 mL χ 2). A camada orgânica foi seca e concentrada, depoispurificada por cromatografia (SiO2, EtOAc.Hexano 1:2) para produzir 10 como sólido branco(1,5 g, 83 %). (1H, CDCI3) d 6,66 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,34 (t, J = 4,0 Hz, 1 H), 5,10 (dd, J =2,0, 9,0 Hz, 1 H), 4,95 - 4,92 (m, 1 H), 4,20 - 4,14 (m, 1 H), 3,61 - 3,55 (m, 2 H), 2,22 (t, J =8,0 Hz, 2 H), 2,13 (s, 3 H), 2,04 - 1,99 (m, 7 H), 1,66 - 1,60 (m, 4 H), 1,34 - 1,22 (m, 56 H),0,89 - 0,86 (m, 6 H). RMN (13C, CDCI3) d 173,44, 171,52, 171,45, 130,08, 73,54, 72,49,61,61, 49,74, 36,93, 32,15, 32,13, 29,94, 29,90, 29,84, 29,78, 29,76, 29,64, 29,56, 27,87,27,42, 25,97, 25,93, 22,91, 21,27, 21,09, 14,36. HRFAB-MS (matriz tioglicerol + Na+) m/e([M + Na]+) 772,6429, calculado 772,6431.

Preparação de 11. Composto 6 (112 mg, 0,21 mmol) e composto 10 (75 mg, 0,10mmol) foram dissolvidos em CH2CI2 (15 mL), e peneiras moleculares de 4 Λ empoadas (900mg) foram adicionadas. A mistura foi esfriada a 0 °C, agitada durante 10 min, e AgCIO4 (62mg, 0,30 mmol) e SnCI2 (57 mg, 0,30 mmol) foram introduzidos. A mistura foi deixadaaquecer até a temperatura ambiente com agitação durante 3 h, depois filtrada através decelite e lavada com CH2CI2. O filtrado combinado foi concentrado sob pressão reduzida. Oresíduo foi purificado por cromatografia (SiO2, EtOAc:hexanos 1:7) para fornecer 11 (68 mg,rendimento de 56 %). RMN (1H1 CDCI3) d 7,42 - 7,19 (m, 15 H), 6,67 (d , J = 9,5 Hz1 1 H),5,37 - 5,33 (m, 2 H), 5,24 - 5,22 (m, 1 H), 4,98 (dd, J = 11,0 Hz, 3,0, 1 H), 4,93 (dt, J = 10,5Hz, 3,0 Hz, 1 H), 4,86 - 4,55 (m, 6 H), 4,37 - 4,31 (m, 1 H), 4,03 (dd, J = 10,5 Hz1 3,0 Hz1 1H), 3,92 - 3,77 (m, 4 H), 3,60 - 3,56 (m, 2 H), 3,05 (dd, J = 4,5 Hz, 12,5 Hz, 1 H), 2,14 (t, J =8,0 Hz, 2 H), 2,06-2,00 (m, 10 H), 1,67- 1,59 (m, 4 H), 1,38-1,25 (m, 56 H), 0,91 -0,87 (m,6 H); RMN (13C, CDCI3) d 173,20, 171,22, 170,38, 138,76, 138,40, 138,23, 130,14, 128,78,128,67, 128,36, 128,23, 128,11, 127,85, 127,67, 100,81, 78,73, 75,01, 74,90, 73,71, 73,42,71,64, 70,59, 60,80, 51,50, 48,40, 36,96, 32,16, 29,96, 29,68, 29,57, 27,75, 27,46, 25,96,25,88, 22,94, 21,26, 21,17, 14,38; HRFAB-MS (matriz tioglicerol + Na+) m/e ([M + Na]+)1229,8448, calculado 1229,8433.

Preparação de 12. A uma solução de 11 (68 mg, 0,056 mmol) em THF (3 mL),foram adicionados H2O (0,6 ml) e trifenilfosfina (23 mg, 0,085 mmol). A mistura de reação foiagitada na temperatura ambiente durante a noite. A solução foi concentrada sob pressãoreduzida. O resíduo foi dissolvido em THF (5 mL) e Ac2O (0,1 ml), Et3N (0,1 mL), e DMAP (5mg) foram adicionados. A mistura foi agitada durante 2 h. A solução foi concentrada, ecromatografia em coluna forneceu 13 (55 mg, rendimento de 80 %). RMN (1H, CDCI3) d 7,41- 7,27 (m, 15 H), 6,73 (d, J = 10,0 Hz, 1 H), 6,12 (t, J = 6,5 Hz, 1 H), 5,36 - 5,34 (m, 2 H),5,24 (dd, J = 3,0 Hz, 13,5 Hz, 1 H), 4,96 (d, J = 11,5 Hz, 1 H), 4,86 (tt, J = 10,5, 3,0 Hz1 1 H),4,82 - 4,65 (m, 6 H), 4,38 (tt, J = 3,0, 9,5 Hz, 1 H), 4,04 (dd, J = 3,0, 10,5 Hz, 1 H), 3,93 (dd,J = 3,0, 11,5 Hz, 1 H), 3,87 - 3,78 (m, 3 H), 3,53 - 3,46 (m, 2 H), 3,32 - 3,27 (m, 1 H), 2,13 (t,J = 8,0 Hz, 2 H), 2,06-2,00 (m, 10 H), 1,88 (s, 3 H), 1,72 - 1,57 (m, 4 H), 1,38 - 1,22 (m, 56H), 0,90 - 0,87 (m, 6 H); RMN (13C, CDCI3) d 173,49, 171,74, 170,51, 170,40, 138,89,138,64, 138,56, 130,13, 129,21, 128,65, 128,31, 128,11, 127,77, 100,91, 79,14, 76,64,74,91, 73,84, 73,64, 71,32, 71,10, 70,27, 48,68, 40,24, 36,84, 32,14, 29,94, 29,90, 29,86,29,82, 29,76, 29,68, 29,60, 29,55, 27,89, 27,45, 25,94, 25,79, 23,37, 22,92, 21,41, 21,19,14,35; HRFAB-MS (matriz tioglicerol + Na+) m/e ([M + Na]+) 1245,8634, calculado1245,8633.

Preparação de PBS57. Na0 (21 mg, 0,91 mmol) foi adicionado a NH3 líquido (20 ml)sob N2 a -78 0C, e a mistura foi agitada durante 5 min. Composto 13 (55 mg, 0,045 mmol) foidissolvido em THF seco (2 mL). A solução foi adicionada ao NH3 líquido azul e agitadadurante 2 h. A reação foi extinta com MeOH. Depois que a amônia foi removida, a soluçãofoi concentrada, e cromatografia em coluna forneceu PBS57 (18 mg, 47 %). RMN (1H, 10 %de MeOD em CDCI3), d 5,35 (t, J = 5,0 Hz, 2 H), 4,87 (d, J = 3,0 Hz, 1 H), 4,16 - 4,13 (m, 1H), 3,85 - 3,51 (m, 9 H), 3,24 - 3,21 (m, 1 H), 2,1 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,03 - 1,98 (m, 7 H),1,64 - 1,52 (m, 4 H), 1,38 - 1,22 (m, 56 H), 0,89 - 0,86 (m, 6 H); RMN (13C, 10 % de MeODem CDCI3) d 174,61, 172,60, 129,96, 99,57, 74,71, 72,16, 69,92, 69,12, 68,88, 67,14, 50,53,49,48, 49,30, 49,13, 48,96, 48,79, 48,62, 39,70, 36,58, 32,70, 31,97, 29,83, 29,77, 29,65,29,56, 29,50, 29,45, 29,42, 29,39, 29,36, 27,25, 25,95, 25,91, 22,72, 22,58, 14,10; HRFAB-MS (matriz tioglicerol + Na+) m/e ([M + Na]+) 891,7014, calculado 891,7014.

A solubilidade de KRN7000 em DMSO é <5 mg/mL enquanto que a solubilidade dePBS-57 em DMSO foi de 20 mg/mL (22,4 mM).

Exemplo 2: Marcação de células NKT Va14i com tetrâmeros de CD1d carregadoscom PBS-57

Um meio típico para isolar e quantificar células NKT responsivas ao CD1 é através de citometria de fluxo usando tetrâmeros de CD1 d marcados com fluoróforo carregados comesfingoglicolipídeos. Para testar a capacidade de PBS-57 facilitar a marcação de tetrâmerode CD1d, tetrâmeros de CD1d carregados com glicolipídeo foram formados. MoléculassCD1d de camundongo biotiniladas (em PBS) foram misturadas com PBS-57 ou KRN7000em uma razão molar de 1:3 (proteína:lipídeo) e incubadas durante a noite na temperatura ambiente. No dia seguinte, 80 μg de estreptavidin-PE (Pharmagen) foram adicionados a 200μg da mistura de CD1-glicolipídeo e incubados na temperatura ambiente durante 4 horas.Tetrâmeros foram armazenados a 4 0C até o uso.

Suspensões de células únicas de timócitos e esplenócitos foram isoladas decamundongos C57BL/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) como conhecido na técnica. O repertório do TCR das células NKT foi limitado com uma subunidade Va invariável(Va14 em camundongos) e subunidades Vβ variadas. Células 106 foram incubadas com 200μL do meio de marcação (2 % de BSA, 1 % de NaN3, 10 mM de EDTA em PBS) com 2,4G2(1:100; ATCC, Manassas, VA) e Neutravidina (5 μg/200 μl; Sondas Moleculares, Eugene,OR) durante 20 minutos em gelo. Células foram peletizadas e recolocadas em suspensão no meio de marcação com anti-TCRp FITC (1:100; H57-597 BD-Pharmingen, San Diego,CA) e tetrâmeros carregados com CD1/glicolipídeo ou veículo (sem glicolipídeo) conjugadoscom estreptavidin-PE (1:400) e incubadas em gelo durante 45 minutos. Células foramlavadas duas vezes no meio de marcação, fixadas com 1 % de paraformaldeído em PBS eanalisadas por citometria de fluxo. Como observado na FIG. 3, PBS-57 marcou células NKT no baço e timo similar a KRN7000.

Exemplo 3: PBS-57 é capaz de facilitar a marcação de células NKT que expressamuma ampla variedade de subunidades do TCR Vβ.

O TCR expressado em células NKT é limitado a uma subunidade Va invariável, euma subunidade Vβ variável que responde a apresentação de glicolipídeo por CD1d. Para determinar se tetrâmeros carregados com PBS-57 foram específicos da subunidade Vβ emsua capacidade de ligação, hibridomas de célula NKT expressando Vβ diferente, foramtestadas quanto a sua capacidade para ligar tetrâmeros de CD1d carregados com PBS-57.Hibridomas de NKT foram estabelecidas nos laboratórios Bendelac e Hayakawa comodescrito previamente (Zhou et al., Lysosomal glycoshingolipid recognition by NKT cells,Science, 2004, 306:p. 1786 - 1788, e Gui et al., TCR beta chain influences but does notsolely control autoreactivity of V alpha 14J281T cells, Journal of Immunology, 2001, 167:p.6239 - 6246).

Para marcação de hibridomas de célula NKT, tetrâmeros de CD1d solúveis (sCD1d)foram carregados com PBS-57 ou KRN7000 pelo procedimento seguinte. Reagentes deestoque dos seguintes foram preparados: sCD1d (1 mg/ml em solução salina tamponadacom fosfato (PBS)); PBS-57 (1 mg/ml em DMSO); Tween 20 (0,5 % em PBS); eestreptavidin-APC (80 µg/mL em PBS). 10 µL de estoque de sCD1d, 1 µLde estoque dePBS-57, e 10 µL de estoque de Tween 20 foram misturados, e 79 µL de PBS foramadicionados para levar o volume até 100 µL. A solução foi incubada a 37 °C durante 3 horas.Para separar glicolipídeo não ligado, a mistura foi aplicada a um filtro Microcon YM30(MiIiporo) que foi previamente umedecido com PBS (400 µL). A membrana carregada foicentrifugada até que apenas -10 µL de solução permaneceu. O volume depois foiaumentado para 100 µL por adição de PBS. A solução foi agitada para auxiliar na liberaçãoda proteína a partir do filtro. A unidade Microcon foi invertida em um tubo Eppendorf fresco eos teores foram centrifugados no tubo. Uma alíquota de 10 µL da solução foi removida e asolução de estreptavidin-APC (5 µL) foi adicionada. A solução resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas.

Hibridomas de célula NKTforam colocadas em suspensão em PBS e estreptavidina(1 µg/mL) para bloquear a biotina da superfície das células durante 20 minutos natemperatura ambiente. sCD1d-estreptavidin-cicromo não carregado foi usado para avaliar aligação não específica de tetrâmeros de CD1d vazios não carregados por incubação durante20 minutos na temperatura ambiente. A marcação de células NKT foi pré-formada a 37 °Cdurante 4 horas usando o complexo glicolipídeo-sCD1d-estreptavidin-APC. As células foramlavadas por PBS e avaliadas por intermédio de citometria de fluxo.

Como observado na FIG. 4, variações na subunidade Vp do TCR na célula NKT nãoafetaram a ligação de tetrâmeros de CD1d carregados com PBS-57, e assim PBS-57 podeser um Iigante "universal" para células NKT.

Exemplo 4: Capacidade de PBS-57 facilitar a marcação de tetrâmero de CD1d decélulas NKT em amostras de sangue de primata humano e não humano.

Para testar se PBS-57 pode facilitar a ligação de célula NKT em amostras desangue tanto de primatas humanos quanto não humanos, tetrâmeros de CD1d humano e decamundongo foram carregados com PBS-57 como descrito no Exemplo 2. Uma maioria dasamostras de sangue humano continham células NKT suficientes (>0,08 % de células CD3-positivas) para observar a marcação (separadas 14 de 17 amostras), enquanto que algumasamostras também continham poucas células NKT para permitir a detecção da marcação(Lee et ai, 2002). Entre os primatas não humanos, a marcação de célula NKT significantefoi observada com uma maioria de amostras de sangue de chimpanzé (separadas 6 de 10amostras) e um quarto de amostras de macacos-reso (12 amostras). Manchas pontosrepresentativos da marcação de célula NKT em seres humanos, chimpanzé e macacos-resosão mostrados na FIG. 5. Nenhuma marcação foi observada em amostras de macacos rabode porco ou mangabeys cinza-escuros, isto pode ser devido à população limitada de célulasNKT circulando no sangue e o tamanho da amostra pequeno.

Exemplo 5: Liberação de citocina em resposta ao complexo PBS-57/tetrâmero deCD1 d invitro.

Para determinar se PBS-57 estimulou a liberação de citocina por células NKT invitro, esplenócitos de camundongo 5 χ 105 isolados de camundongos B6 foram incubadosem reservatórios separados com 105, 104, 103, 100, 10 e 1 pg/mL de PBS-57 ou KRN7000no meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM deglutamina e antibióticos. Depois de 48 horas, níveis de IL-4 e IFNy foram medidos por ELISA(BD Pharmingen). Como observado na FIG. 6, citocina responde ao nível de PBS-57 emaproximadamente 100 pg/mL, como comparado a 1000 pg/mL para KRN7000. PBS-57 foicapaz de induzir tanto secreção de citocina Th1 quanto de Th2.

Exemplo 6: Liberação de citocina em resposta ao complexo PBS-57/tetrâmero deCD1 d in vivo.

Para examinar se PBS-57 obteve uma resposta imune in vivo, a capacidade dePBS-57 e KRN7000 obter um aumento em níveis de citocina em um camundongo foiavaliada. 1 Mg/ml de soluções estoque de PBS-57 e KRN7000 em DMSO foi preparado. Assoluções de PBS-57 e KRN7000 foram diluídas com PBS a 1, 100, 104 e 106 pg/mL. 100 μίde cada solução foi injetado por via intravenosa em camundongos B6 com 6 semanas deidade. Amostras de soro foram isoladas dos camundongos em 24 horas, e a concentraçãode INF-γ foi avaliada por ELISA (BD Pharmingen). A FIG. 7 demonstra as concentrações deINF-γ no soro, e PBS-57 aparece para obter o nível de citocina igual a ou maior do queKRN7000.

Embora as composições e métodos desta invenção sejam descritos em termos deformas de realização exemplares, será evidente àqueles habilitados na técnica quevariações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na seqüência deetapas dos métodos descritos aqui sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção.Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão relacionados tantoquímica quanto fisiologicamente podem ser substituídos no lugar dos agentes descritos aquienquanto os mesmos ou resultados similares seriam obtidos. Considera-se que todos essessubstitutos similares e modificações evidentes àqueles habilitados na técnica estão dentrodo espírito, escopo e conceito da invenção. Além disso, todas as patentes e publicaçõeslistadas ou descritas aqui são incorporadas em sua totalidade por referência.

Como usado neste relatório descritivo e as reivindicações anexas, as formas nosingular "um(a)," e "o(a)" incluem referentes no plural a menos que o conteúdo claramentedite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a uma composição contendo "umpolinucleotídeo" inclui uma mistura de dois ou mais polinucleotídeos. Também deve serobservado que o termo "ou" geralmente é utilizado no seu sentido incluindo "e/ou" a menosque o conteúdo claramente dite de outro modo. Todas as publicações, patentes e pedido depatentes referenciados neste relatório descritivo são indicativos do nível de habilidadecomum na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações, patentes e pedidode patentes são aqui expressamente incorporados por referência à mesma extensão comose cada publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmenteindicado por referência. No caso de conflito entre a presente divulgação e as patentes,publicações e referências incorporadas, a presente divulgação deve guiar.

Também é especificamente entendido que qualquer valor numérico relatado aquiinclui todos os valores do valor inferior ao valor superior, isto é, todas as combinaçõespossíveis de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enumeradosdevem ser consideradas serem expressamente estabelecidas neste pedido.

Claims (22)

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela fórmulaestrutural (I):<formula>formula see original document page 27</formula>em que:R1 selecionado de:(i) C(O) R13;(ii) C(R13)R14, em que R14 é -H1 ou R13 ou R14 e R2 tomados juntos formam umaligação dupla entre os átomos de carbono e de nitrogênio a que eles são ligados; ou(iii) SO2R13;em que R13 é halo; hidróxi, OR9; OR10; amino, NHR9; N(R9)2; NHR10; N(R10)2;aralquilamino; ou alquila C1-C12 opcionalmente substituído com halo, hidroxila, oxo, nitro,OR9, OR10, acilóxi, amino, NHR9, N(R9)2, NHR10, N(R10)2, aralquilamino, mercapto, tioalcóxi,S(O)R9, S(O)R10, SO2R9, SO2R10, NHSO2R9, NHSO2R10, sulfato, fosfato, ciano, carboxila,C(O)R9, C(O)R10, C(O)OR9, C(O)NH2, C(O)NHR9, C(O)N(R9)2, cicloalquila C3-C10 contendoR11 0-3, heterocicila C3-C10 contendo R11 0-3, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, cicloalquenilaC5-C10, heterocicloalquenila C5-C10, arila C6-C20 contendo R12 0-3, ou heteroarila contendoR12 0-3; ou cicloalquila C3-C10, heterociclila C3-C10, cicloalquenila C5-C10, ouheterocicloalquenila C5-C10 opcionalmente substituído com um ou mais halo hidroxila, oxo,OR9, OR10, acilóxi, nitro, amino, NHR9, N(R9)2, NHR10, N(R10)2, aralquilamino, mercapto,tioalcóxi, S(O)R9, S(O)R10, SO2R9, SO2R10, NHSO2R9, NHSO2R10, sulfato, fosfato, ciano,carboxila, C(O)R9, C(O)R10, C(O)OR9l C(O)NH2l C(O)NHR10, C(O)N(R10)2l alquila,haloalquila, cicloalquila C3-C10 contendo R11 0-3, heterociclila C3-C10 contendo R11 0-3,alquenila C2-C6, alquinila C2-C6l cicloalquenila C5-C10, heterocicloalquenila C5-C10, arilheteroarila C6-C20 contendo R12 0-3, ou heteroarila C6-C20 contendo R12 0-3; ou alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, ou heteroarila opcionalmente substituído com um ou mais halo,hidroxila, OR9, OR10, acilóxi, nitro, amino, NHR9, N(R9)2, NHR10, N(R10)2l aralquilamino,mercapto, tioalcóxi, S(O)R9, S(O)R10, SO2R9, SO2Ri0. NHSO2R10, sulfato, fosfato, ciano,carboxila, C(O)R9l C(O)R10l C(O)OR9l C(O)NH2l C(O)NHR9l C(O)N(R9)2l alquila. haloalquila,cicloalquila C3-C10 contendo R11 0-3, heterocicila C3-C10 contendo R11 0-3, alquenila C2-C6,alquinila C2-C6, cicloalquenila C5-C10, heterocicloalquenila C5-C10l arila C6-C20 contendo R120-3, ou heteroarila C6-C20 contendo R12 0-3;R2 é -H ou alquila C1-C6;R3 é -H se R4 for -OH, ou R3 é -OH se R4 for -H;R4 é -H se R3 for -OH, ou R4 é -OH se R3 for -H;R5 é selecionado de(i) -(CH2)xCH=CH(CH2)yCH3; ou(ii) -(CH2)xCH=CH(CH2)yCH=CH(CH2)zCH3i em que X1 Y e Z são números inteirosindependentemente selecionados de 1 a cerca de 14;R6 é -OH ou forma uma ligação dupla com R7;R7 é -H ou forma uma ligação dupla com R6;R8 é um hidrocarboneto saturado ou insaturado tendo de cerca de 5 a cerca de 15átomos de carbono;cada R9 é independentemente um alquila C1-C20 opcionalmente substituído comhalo, hidroxila, alcóxi, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato;cada R10 é independentemente um arila opcionalmente substituído com halo,haloalquila, hidróxi, alcóxi, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato;cada R11 é independentemente halo, haloalquila, hidróxi, alcóxi, oxo, amino,alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato; ecada R12 é independentemente halo, haloalquila, hidróxi, alcóxi, nitro, amino,alquilamino, dialquilamino, sulfato, ou fosfato.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queR5 é (i), Xé13eYé7.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queR1 é -CH3.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque:R1 é (i) e R13 é -CH3;R5 é (i), eXé 13, e Yé7;R6 é -OH;R7 é -H; eR8 é C14H29.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque:se R1 é (i) então R13 não é -CH3;se R5 é (i) então χ e y não são 13 e 7, respectivamente;R6 não é -OH;R7 não é -H; eR8 não é C14H2^

6. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela fórmulaestrutural (II)<formula>formula see original document page 29</formula>

7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6,CARACTERIZADO pelo fato de que a solubilidade do composto é pelo menos cerca de 20mg/mL em DMSO.

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é capaz de ligar um monômero outetrâmero de CD1d.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é capaz de ativar uma célula NKT.

10. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o composto deacordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 e um veículo fisiologicamenteaceitável.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fatode que compreende ainda um monômero ou tetrâmero de CD1d, em que o composto éligado ao monômero ou tetrâmero de CD1d.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADA pelofato de que compreende ainda um antígeno.

13. Método de ativar uma célula NKT, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende contatar a célula NKT com o composto de acordo com a reivindicação 9 napresença de um monômero ou tetrâmero de CD1 d.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de queo composto é ligado ao monômero ou tetrâmero de CD1d.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de queo monômero ou tetrâmero de CD1 d é solúvel.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de queo monômero de CD1d é expressado em uma superfície da célula.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea célula é uma célula apresentadora de antígeno.

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de quea ativação da célula NKT é caracterizada por expressão de citocina modificada em relação aum controle.

19. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de quea célula NKT é ativada in vitro.

20. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de quea célula NKT é ativada in vivo.

21. Método de estimular uma resposta imune em um paciente, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de: a) ocomposto de acordo com a reivindicação 9; b) uma população de células NKT ativadas deacordo com o método da reivindicação 13; c) uma população de células apresentadoras deantígeno CD1d+ contatadas com o composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6; ou d) qualquer combinação de a), b) e c).

22. Método de marcar uma célula NKT em um meio CARACTERIZADO pelo fatode que compreende:a) complexar o composto de acordo com a reivindicação 9 com um tetrâmero deCD1d para formar um complexo;b) contatar a célula NKT com o complexo;c) remover o complexo não ligado do meio; ed) detectar o complexo.