BRPI0711073A2 - aumento de tìtulo por vacinação em animais - Google Patents

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BRPI0711073A2
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Steven Bruce Puntenney
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Abstract

AUMENTO DE TITULO POR VACINAçãO EM ANIMAIS A invenção refere-se a uma composição adicionada á ração animal usada em combinação com uma vacina para aumentar a efetividade da vacina. Entre outros efeitos, a composição aumenta o título de anticorpos da vacina.

Description

AUMENTO DE TÍTULO POR VACINAÇÃO EM ANIMAIS
Descrição
Campo Técnico
A invenção refere-se a combinações de uma composição e uma vacina queaumenta o título de anticorpos da vacina, e métodos para usar a combinação.
Fundamento
A resposta imune envolve dois sistemas distintos: o sistema inato e osistema adquirido (mediado por anticorpos). O sistema inato é um sistema deevolução antiga que usa uma variedade de estratégias para prevenir infecção. Elesincluem as barreiras de células epiteliais propiciadas pela pele, o tratogastrintestinal e os revestimentos da glândula pulmonar e mamária. Além disto, osistema inato inclui a barreira acídica do estômago (ou abomaso em animaisruminantes) e as enzimas digestivas do estômago, do pâncreas e do intestinodelgado. Finalmente, o sistema inato inclui os glóbulos brancos, macrófagos eneutrófilos. Estas células reconhecem primeiro os agentes patogênicos por meioda apresentação de marcadores únicos na superfície dos agentes patogênicos eentão fagocita e destrói os agentes patogênicos.
O sistema inato fornece a resposta imunológica inicial e permite o temponecessário para que o sistema de anticorpos adquirido responda e desenvolva osanticorpos necessários para combater uma agente patogênico específico.Normalmente, são necessárias de uma a várias semanas para uma pessoa ou umanimal desenvolver uma resposta de anticorpos. Neste tempo de intervenção, oorganismo depende do sistema inato para eliminar a infecção.
O sistema imune adquirido pode desenvolver anticorpos em resposta a umagente patogênico específico, uma toxina, uma substância química ou qualquermolécula que o organismo reconheça como um agente patogênico (por exemplo, osistema imune reconhece o antígeno como não-próprio). Quando agentespatogênicos infectam uma pessoa ou um animal, são apresentados marcadorescelulares específicos associados com o agente patogênico às células queproduzem anticorpos. O sistema imune adquirido então passa por um processodenominado "expansão clonal". Especificamente, isto permite a produção de massade células que produzem anticorpos que são enviados em direção a um antígenoespecífico associado com o agente patogênico.Os anticorpos são sintetizados por células T e Células B. As células Tmaturam no timo e apresentam anticorpos que estão ligados a suas superfíciesextracelulares. As células T circulam então livremente no sangue e através detecidos linfáticos. A ligação da célula T a um agente patogênico via anticorpo deligação resulta assim na identificação e subseqüente destruição do agentepatogênico. Ao contrário, os anticorpos produzidos pelas células B são segregadasno sangue onde elas circulam livremente. Quando os anticorpos produzidos pelacélula B se ligam a um agente patogênico, eles iniciam uma cascata de eventosque resultam na identificação e na destruição do agente patogênico. Os anticorposque são produzidos em resposta à imunização são classificados em isótipos deanticorpos. Os três isótipos de anticorpos mais importantes incluem IgM, IgGI eIgG2. Outros isótipo incluem, por exemplo, IgA, IgD, IgG3, IgG4 e IgE e, em relaçãoa aves domésticas, o isótipo IgY.
A resposta adaptativa IgM é o primeiro anticorpo produzido pelas células T eB em resposta a um antígeno; entretanto, ele é um anticorpo relativamente "fraco"com afinidade limitada por antígeno e especificidade. Respostas mais "poderosas"de anticorpo estão contidas dentro dos isótipos IgG1 e IgG2; entretanto, odesenvolvimento dos isótipos IgG1 e IgG2 exige períodos mais longos de tempo.As respostas do isótipo IgG em indivíduos grávidos são particularmenteimportantes, pois estes são os isótipos de anticorpo que são transferidos de umamãe para o filho via colostro, no momento de nascimento, e que transfere assim aimunidade passiva para o recém-nascido.
A vacinação (também conhecida como imunização) contra doenças épraticada comumente nas indústrias médicas humanas e em rebanhos. Porexemplo, para vacinar contra um agente patogênico, é administrada uma vacina aum animal na forma de uma versão não-infecciosa do agente patogênico ou éadministrada somente uma parte do agente patogênico. O sistema imune adquiridoresponde produzindo anticorpos da vacina. Se o animal for expostosubseqüentemente ao agente patogênico vivo, os anticorpos produzidos emresposta à vacina são rapidamente mobilizados e então reconhece e mira o agentepatogênico para destruição.
A indústria da pecuária se baseia nos protocolos de imunização contradoenças específicas de rebanhos para minimizar a morbidade e mortalidadedecorrente de infecções por fungos, vírus e bactérias. Por exemplo, na indústria delaticínios, é comum vacinar animais contra E. coli, pois ele é uma das formas maiscomuns de infecções da glândula mamária (causando, por exemplo, mastite) o quecausa perda de produção e, em casos severos, a perda da vaca.
Ocorrem diversos problemas dos protocolos atuais de vacinação. Porexemplo, a eficácia de protocolos de vacinação varia de indivíduo para indivíduo.Especificamente, alguns indivíduos desenvolvem um título mais alto (concentraçãoalta de soro de anticorpos) em resposta a um protocolo de imunização específico,enquanto outros não. Como existe uma correlação direta entre o título de umanticorpo e a resposta do sistema imune a uma infecção, alguns indivíduospermanecem suscetíveis a uma infecção por um agente patogênico, mesmo quetenham sido vacinados. Conseqüentemente, haverá ainda a necessidade demelhorar a efetividade de vacinas para reduzir a incidência de doença empopulações animais.
Sumário
A invenção refere-se a combinações para aumentar a efetividade de vacinas,e métodos para usar as combinações. As combinações da divulgação usam umacomposição que possui os seguintes componentes constituintes: β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase, β-1,3 (4) glucano, terra diatomácea calcinada, uma argila minerale glucomanano. Esta composição é oferecida aos animais que estão prestes apassar por um protocolo de vacinação ou estão passando por um protocolo devacinação.
As combinações aumentam a efetividade da vacina mediante o aumento daconcentração de soro (título) de anticorpos da vacina. A concentração de soroaumentada de anticorpos permanece mesmo quando a composição é retirada dadieta dos animais.Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra os resultados de experimentos por método Western Blotque demonstram o efeito da composição na expressão de L-seletina por neutrófilo,conforme descrito no Exemplo 1.
A Figura 2 mostra os resultados por método Western Blot que demonstramos efeitos da composição em formas não aquecidas e aquecidas (peletadas) naexpressão de L-seletina por neutrófilo, conforme descrito no Exemplo 2.A Figura 3 é um gráfico resumindo os efeitos da composição na expressãode mRNA que codifica L-seletina em neutrófilo de rato, conforme descrito noExemplo 3.
A Figura 4 mostra os resultados por método Western Blot que demonstramos efeitos da composição na expressão de interleucina-ΐβ (IL-1 β) por neutrófilos,conforme descrito no Exemplo 4.
A figura 5 é um gráfico de barras que sumariza os resultados de ELISAsusado para quantificar o título de IgGI em relação à vacina J5, conforme descritono Exemplo 6.
A Figura 6 é um gráfico de barras que sumariza os resultados de ELISAsusado para quantificar o título de lgG2 em relação à vacina J5, conforme descritono Exemplo 6.
A Figura 7 é um gráfico de barras que ilustra os efeitos de uma dose baixa(15 gramas/dia) e dose alta (30 gramas/dia) da composição na expressão deinterleucina-1 β em gado para abate, conforme descrito no Exemplo 6.
A Figura 8 mostra os resultados a partir do método Western Blot quedemonstram os efeitos da composição na expressão de L-seletina por neutrófilo emgado para abate, conforme descrito no Exemplo 6.
A Figura 9 é um gráfico de barras que sumariza os resultados de ELISAsusado para quantificar o total de título de IgGI e lgG2, conforme descrito no
Exemplo 7.
Descrição das Versões Preferidas
Conforme requerido, as versões detalhadas da presente composição estãodescritas neste documento; entretanto, é importante considerar que as versõesdescritas são meros exemplos da invenção, que pode ser configurada de váriasformas diferentes. Portanto, os detalhes específicos divulgados neste documentonão devem ser interpretados como limitações, mas sim, serem usadossimplesmente como base para as reivindicações e como uma base representativade instrução para um versado na arte sobre como empregar de forma variada apresente composição em virtualmente qualquer forma apropriada.
A presente invenção trata das combinações que aumentam a funçãoimunológica em animais, e métodos para usar as combinações. De modo geral, ascombinações da divulgação usam uma combinação que possui os seguintescomponentes constituintes: β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase, β-1,3 (4) glucano,terra diatomácea calcinada, uma argila mineral e glucomanano. A composição éusada em combinação com uma vacina, de forma que a ingestão da composiçãopelo animal aumenta a efetividade da vacina. Conforme definido neste documento,uma vacina estimula o sistema imunológico, incluindo a produção de anticorposquando administrada a um animal. Uma indicação de uma efetividade aumentadade uma vacina é um título aumentado de anticorpos em resposta ao antígeno davacina no soro do animal.
A combinação pode ser usada efetivamente na ração para indivíduos ouanimais em muitas espécies, como os mamíferos, incluindo os seres humanos eespécies aviárias. Em uma versão preferida, as combinações são usadas emmamíferos de rebanho. As combinações podem ser usadas igualmente bem comruminantes e não-ruminantes. Entre os exemplos de ruminantes estão: porexemplo, gado, carneiros, cabritos, vacas, cervo, bisão e búfalo. Entre os não-ruminantes estão: suínos, cavalos, porcas e outros. Em uma versão particularmentepreferida, as composições da composição são usadas em ovinos e rebanho bovino.
Em uma versão, a composição é oferecida a um animal durante o períodoem que o animal está passando por um protocolo de vacinação. Um protocolo devacinação comum exige a administração de pelo menos uma e, normalmente,várias doses da vacina, durante um período definido, para aumentar a estimulaçãodo sistema imune e a produção dos anticorpos. Em uma versão preferida, acomposição é oferecida diariamente a um animal, começando antes do início doprotocolo de vacinação e continuando após o início do protocolo de vacinação. Emversões alternativas, a composição pode ser dada a um animal, começando após oinício do protocolo de vacinação ou simultaneamente ao início do protocolo.
A vacina da combinação pode inferir uma resposta a um agente patogênico,uma toxina, uma droga ou outras moléculas. A vacina pode ser uma vacina deDNA onde uma molécula de DNA que codifica um antígeno é injetada em umanimal, resultando em síntese de antígeno e, conseqüentemente, uma respostaimunológica ao antígeno. Em uma versão preferida, a vacina da combinaçãoestimula a produção de anticorpos para um agente patogênico que causa doença.Em uma versão particularmente preferida, a vacina estimula a produção deanticorpos contra agentes patogênicos que causa mastite. A vacina J5 é umadestas vacinas contra mastite disponíveis comercialmente (comercializada pelaPfizer).
Outros exemplos de agentes patogênicos e doenças contra os quais osseres humanos e animais são comumente vacinados e que podem se beneficiar de um protocolo que aumenta a eficácia incluem, como exemplo, ritotraqueiteinfecciosa bovina (IBR), parainfluenza tipo 3 (PI3), vírus da diarréia viral bovina(BVDV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), rotavírus, coroavírus,Campylobacter spp., Pasteurella ssp., pinkeye, Salmonella spp., Clostridium spp.,Leptospirose, Brucelose, Doença de Newcastle, em ave comestível, erisipela, cólera de ave comestível, Vírus de Doença de Marreco (MDV), Vírus de BronquiteInfecciosa (IBV), encefalomielite aviária, cocidiose, rinopneumonite, influenzaeqüina , Streptococcus equi, arterite viral eqüina, Ehrlichiose monocítica eqüina,encefalomielite, encefalite West Nile, raivas, parvovírus, adenovívus, bordetela,doença de Lyme, Giárdia, Pertussus, vírus measles, hepatite AeB, difteria e poliomielite.
Os componentes constituintes da composição são preparados por métodosconhecidos comumente na arte e podem ser obtidos de fontes comerciais. O β-1,3(4)-endo-glucano hidrolase é produzido da fermentação submersa de uma trilha deuma classe de Trichoderma longibrachiatum. A terra diatomácea está disponível como um produto lavado com ácido e disponível comercialmente com 95% de sílica(SiO2) e com seus componentes restantes não ensaiados, mas consistindo,principalmente, de cinza (minerais), conforme definido pela Associação dosQuímicos Analíticos (AOAC, 2002). O β-1,3 (4) glucano e glucomanano podem serde preparações comerciais de extrato de parede de célula de leveduras derivada, principalmente, de levedura desativada (Saccharomyees eerevisiae) com suacomposição química mostrada na Tabela 1:
TABELA 1
<table>table see original document page 7</column></row><table>As argilas minerais (aluminosilicatos) usadas nesta composição podem serqualquer uma de uma variedade de argilas disponíveis comercialmente, comoexemplos, a argila montmorilonite, bentonita e zeólita.
Em uma versão preferida da combinação β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase,terra diatomácea, glucano e glucomanano, e argila mineral são combinados pesopor peso para ficarem respectivamente na faixa de aprox. 0,05-3%, 1-40%, 1-20% e40-92%. Em outra versão preferida, β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase, terradiatomácea, glucano e glucomanano e argila mineral são combinadosrespectivamente a 0,1-3%, 5-40%, 2-15% e 40-80%. Em uma versãoespecialmente preferida, β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase, terra diatomácea,glucano, glucomanano e argila mineral são combinados, respectivamente, a0,2-3%, 20-40%, 4-10% e 50-70%.
Em uma versão, a composição é um pó seco e sem fluidez e adequado paraser inserido em uma ração disponível comercialmente, produto alimentar ou comoum suplemento a uma taxa mista total ou dieta. O pó pode ser misturado com umaração líquida ou sólida ou com água. Em outra versão, a composição é formada empeletes.
Em uma versão, quando incorporada diretamente nas rações, a composiçãopode ser adicionada em quantidades que variam de aprox. 0,1 a aprox. 20 kg portonelada (2000 libras) de ração. Em uma versão preferida, a composição éadicionada a alimentos para animais ou a alimentos em quantidades que variam deaprox. 0,5 kg a aprox. 10 kg por tonelada de ração. Em uma versão especialmentepreferida, a composição pode ser adicionada a rações em quantidades que variamentre aprox. 1 a 5 kg por tonelada de ração.
Quando expresso como uma percentagem de material seco de ração, apresente composição pode ser adicionada a alimentos de animais ou a alimentosem quantidades que variam de aprox. 0,01 a aprox. 2,5% por peso,preferencialmente de aprox. 0,0125% a aprox. 2% por peso. Em uma versãopreferida, a composição é adicionada a alimentos de animais ou a alimento emquantidades que variam de aprox. 0,05 a 1,5% de peso, preferencialmente deaprox. 0,0625% a aprox. 1 % de peso. Em uma versão especialmente preferida, apresente composição é adicionada a quantidades de aprox. 0,1 a aprox. 0,7% depeso, preferencialmente de aprox. 0,125% a aprox. 0,5% de peso de ração.Alternadamente, a composição da presente combinação pode ser oferecidadiretamente ao mamífero ou a aves como um suplemento em quantidades deaprox. 0,01 grama a aprox. 1 grama por quilograma de peso corporal vivo,preferencialmente de aprox. 0,012 grama a aprox. 0,5 gramas por quilograma depeso corporal vivo, mais preferencialmente de aprox. 0,016 grama a aprox. 0,37grama por quilograma de peso corporal vivo, por dia. Em uma versãoespecialmente preferida, a composição pode ser oferecida para uso com váriasespécies em quantidades que variam de aprox. 0,05 gramas a aprox. 0,20 gramaspor quilograma de peso corporal vivo, por dia.
Como exemplos, a composição pode ser oferecida a ovinos em uma faixa deaprox. 2 gramas por cabeça, por dia a aprox. 8 gramas por cabeça, por dia. Parabovinos, a composição pode ser oferecida em uma faixa de aprox. 10 gramas porcabeça, por dia, a aprox. 60 gramas por cabeça, por dia. Uma pessoa versada naarte pode observar que a quantidade da composição oferecida aos animais podevariar dependendo das espécies animais, do tamanho do animal e do tipo de raçãoa que a composição é adicionada.
São descritos agora exemplos que ilustram os conceitos da composição comcerto nível de especificidade.
EXEMPLO 1
Um experimento foi conduzido com ovinos com o objetivo de determinar acapacidade da composição de aumentar a expressão de L-seletina por neutrófilo,um marcador do sistema imune inato, em animais imunossuprimidos. Os animais(seis por Grupo) foram divididos em 2 Grupos: controle e Experimental. O grupo deControle recebeu uma taxa altamente calórica que consistia de feno cortadodisponível ad Iibitum (à vontade), 0,45 kg (1 Ib) de milho hidrolizado, por cabeça,por dia e 0,45 kg (1 Ib) de trigo cozido comum, por cabeça, por dia por um períodode 28 dias. Durante este tempo, eles também receberam injeções duas vezes aodia de dexametasona, uma droga imunossupressiva; O grupo Experimentalrecebeu ingestão diária da composição (5 gramas por cabeça, por dia) por 28 diase recebeu a mesma dieta e o protocolo de ingestão de dexametasona, como ogrupo de Controle. A composição do grupo Experimental foi de 65,8% em peso deargila mineral, 0,20% em peso de endo-glucano hidrolase, 9,0% em peso deglucanos e glucomanano, e 25% em peso de argila diatomácea calcinada. No finaldo estudo, as amostras de sangue foram colhidas e os neutrófilos foram purificadosusando centrifugação em gradiente de Percoll. As quantidades de expressão deL-seletina por neutrófilos foram avaliadas usando técnicas de Western Blot eanticorpos específicos para L-seletina.
Conforme mostrado na Figura 1, painel superior, os animais que nãoreceberam a composição tinham baixa e variável expressão de L-seletina.Conforme mostrado na Figura 1, painel inferior, os animais que receberam acomposição demonstraram um aumento consistente na expressão de L-seletina. Opainel inferior representa seis animais imunossuprimidos Experimental quereceberam a composição em suas dietas.
EXEMPLO 2
Neste estudo, a estimulação do sistema imune inato em ovinos foiexaminada quando a composição Experimental do Exemplo 1 foi fornecida em umadieta peletada. Uma dieta básica consistia de 21,55% de cevada, 10,0% de canola,5% de grãos de destilação, 40% de milho hidrolizado, 1,50% de calcário, 0,01% desulfato de manganês, 0,01% de microvitamina E, 4,0% de melaço, 0,25% de mono-cal, 0,25% de cloreto de potássio, 0,60% de cloreto de sódio, 0,03% de selenita desódio, 15,79% de trigo comum, 0,01% de sulfato de zinco, 0,75% de sulfato deamônia e 0,25% de sulfato de cobalto. Quando a composição Experimental foiadicionada a esta dieta, ela foi incluída a 0,6%, substituindo aquela porção de trigocomum. Vinte oito ovinos foram escolhidos para 4(quatro) tratamentos queconsistiram de um grupo de Controle, um grupo que recebeu a composiçãoExperimental em forma de pó, um grupo que recebeu a composição Experimentalem forma peletada, onde os peletes foram formados a uma temperatura de71,11° C (160° F), e um grupo que recebeu a composição Experimental em formapeletada, onde os peletes foram formados a 82,22° C (180° F). Todos os animaisforam imunossuprimidos via injeção diária de dexametisona.
O estudo foi conduzido usando métodos idênticos ao Exemplo 1, exceto pelofato de que a composição foi administrada em peletes que foram fabricados a altastemperaturas. O objetivo deste estudo foi o de determinar se o aquecimento dacomposição (conforme requerido para formação de pelete) poderia desativar acapacidade da composição de aumentar a imunidade inata. Conforme mostrado naFig. 2, os ovinos (de controle) que não receberam a composição, expressarammuito poucos níveis de L-seletina por neutrófilos. A provisão da composiçãoExperimental, mesmo na forma de pelete (aquecido), ainda assim aumentou aexpressão de L-seletina por neutrófilo.
Na Fig. 2, o painel mais superior representa a expressão de L-seletina porneutrófilo em animais imunossuprimidos alimentados com uma dieta de controlesem a composição. O segundo painel (pó) representa a expressão de L-seletina emanimais imunossuprimidos que receberam a composição Experimental em formamista livremente e não aquecida, conforme no Exemplo 1 (grupo Experimental). Ospainéis 3 e 4 representam a expressão de L-seletina por neutrófilo em animaisimunossuprimidos que receberam a composição Experimental em formaspeletadas. Os peletes usados no painel 3 foram formados mediante aquecimento a71,11° C (160° F) e no painel 4 os peletes foram aquecidos a 82,22° C (180° F)durante a fabricação das rações.
EXEMPLO 3
Um experimento foi realizado com ratos para investigar se a composiçãotinha a capacidade de aumentar a imunidade inata em um modelo não-ruminante.Neste estudo, os ratos foram escolhidos para um ou dois tratamentos: Um grupo deControle (dieta não-suplementada) e um grupo Experimental, onde a composiçãodo Exemplo 1 foi adicionada à dieta a 1% de peso seco de ração. Nesteexperimento, os ratos foram alimentados com ração de rato comum comercial comou sem composição Experimental. A imunossupressão usando os protocolos deinjeção de dexametasona não foi utilizada neste estudo. Após 14 dias, foramcoletadas amostras de sangue dos ratos anestesiados via perfuração cardíaca. Osneutrófilos foram isolados das amostras de sangue usando centrifugação emgradiente de Percoll e o RNA total foi isolado usando TriZoI.
A concentração de RNA mensageiro (mRNA) que codifica L-seletina de ratoem amostras de RNA de neutrófilo foi então determinada por reação em cadeia dapolimerase transcriptase reversa quantitativa (QRT-PCR) usando cápsulas queforam especificamente desenvolvidas para ensaio de L-seletina de rato. Asquantidades de mRNA com L-seletina foram padronizadas mostrando-as comouma proporção do mRNA da β-actina, que está expresso em todas as células emum nível razoavelmente constante. Conforme mostrado na Figura 3, e de acordocom os resultados dos Exemplos 1 e 2, a composição aumentou a expressão demRNA com L-seletiria em mais de 6 vezes (P < 0,05).
Este estudo demonstrou que a expressão aumentada de proteína deL-seletina, conforme mostrado pela técnica de Western Blot nos Exemplos 1 e 2pode ser causada por um aumento de mRNA que codifica esta proteína. Istoimplica que a composição altera a taxa de transcrição do gene que codifica aL-seletina.
EXEMPLO 4
Os neutrófilos, as células do sistema imunológico inato, são capazes desinalizar e, em conseqüência, aumentar a produção de anticorpos pelo sistemaimune adquirido através da secreção de interleucina-1β (IL-1β). Para analisar acapacidade da composição de induzir os neutrófilos a aumentarem a síntese deIL-1 β, a concentração de IL-1β foi avaliada em neutrófilos colhidos do mesmoovino, conforme descrito no Exemplo 1. Para completar o estudo, foram usados ométodo Western Blot e anticorpos específicos para IL-1β.
Conforme mostrado na Figura 4, os animais que não receberam a provisãodiária da composição continham virtualmente níveis indetectáveis de IL-1β;entretanto, a provisão da composição aos animais causou um aumento significativona expressão de IL-1β (Ρ < 0,05). Na Figura 4, o painel superior representa 6animais imunossuprimidos com ração de Controle. O painel inferior representa 6animais imunossuprimidos com ração-composição Experimental que receberam acomposição. As concentrações de IL-1β foram determinadas usando a análise porWestern Blot e um anticorpo específico para IL-1β.
Estes dados indicam que a composição possui a capacidade não somentede aumentar os marcadores de imunidade inata (por exemplo, L-seletina; Exemplos1, 2 e 3), mas também aumenta a expressão da molécula sinalizante chave (porexemplo, IL-1β) que aumenta o sistema imune adaptativo.
EXEMPLO 5
A meta deste experimento foi o de determinar quais genes foramexpressados diferencialmente em neutrófilos seguinte à alimentação dacomposição para gado leiteiro periparturiente. Neste estudo, o mecanismo(s) peloqual a composição aumentou a expressão de IL-1 β por neutrófilos foi examinado.O gado leiteiro periparturiente é um bom modelo, porque o estresse da gravidezleva à imunossupressão, tornando as vacas particularmente suscetíveis à infecção.Neste experimento 8 vacas leiteiras periparturientes foram escolhidaspara uma dieta de Controle que não tinha a composição Experimental e 8 vacasforam escolhidas para um grupo Experimental que recebeu a composição doExemplo 1 em suas dietas (56 gramas por dia, por cabeça). Os animais foramalimentados com a dieta por aprox. 28 dias até o parto. 12 a 15 horas após oparto, 500 ml de amostras de sangue foram colhidas via perfuração jugular e osneutrófilos foram preparados via centrifugação em gradiente de Percoll de largaescala.
O RNA foi isolado dos neutrófilos usando o método TriZoI e então transcrito-reverso em cDNA usando transcritase reversa. Durante a transcrição reversa,foram empregados corantes baseados em nucleotídeos coloridos diferentemente(Cy3 e Cy5)de forma que os DNAs (cDNAs) complementares sintetizados de doisgrupos de tratamentos diferentes (Controle e Experimental) incorporaram diferentescores. As amostras de cDNA dos grupos Experimental e de Controle foram entãoaplicadas a uma lâmina de microarray (que são pequenos suportes sólidos nosquais milhares de seqüências codificadoras de genes estão imobilizadas, ouligadas de forma organizada em posições conhecidas) BoTL-5. Este microarray foipreparado no Centro Genômico Funcional Animal da Universidade do Estado deMichigan e contêm 1500 genes (cada um seqüenciado 3 vezes) em uma lâmina devidro. Permitiu-se que os cDNAs gerados das amostras do Grupo Experimental ede Controle competissem para ligação aos 1500 genes no array e a expressãorelativa dos genes foram então avaliadas comparando-se a abundância relativa desinais de Cy3 e Cy5 em cada ponto no array. Os dados foram então analisadosestatisticamente para identificar aqueles genes que foram expressos de formadiferente (aqueles genes onde P < 0,05).
Os resultados mostraram que mais do que 20 genes foram expressos deforma diferente (P < 0,05) nos neutrófilos bovinos colhidos do grupo Experimental.A enzima conversora de Interleucina (ICE) foi uma destes genes aumentados. Istofoi confirmado usando QRT-PCR e cápsulas para seqüência ICE bovina. A ICE éuma enzima limitadora de taxa na conversão de pro-IL-Ιβ inativo para o ativo esecretado IL-1 β. Assim, a composição pode aumentar a imunidade adaptativa (porexemplo, aumentando o título de anticorpo) através de sua habilidade de aumentara expressão da atividade de ICE em por neutrófilo e, conseqüentemente, asecreção de IL-1 β.
EXEMPLO 6
Para testar a hipótese de que a composição aumentou a efetividade de umavacina, foi examinado o desenvolvimento de título seguinte ao protocolo devacinação. Dezoito gados de abate (seis gados em cada grupo) foram designadospara um dos 3 grupos: Controle, Tratamento 1, (15 gramas de composição na dietapor cabeça, por dia) e Tratamento 2 (30 gramas de composição por cabeça, pordia). A dieta dos animais se consistiu de uma dieta de feno de grama que foioferecida ad Iibitum (à vontade) com um suplemento diário que fornecia 14% deproteína crua, 3% de gordura crua e 20% de fibra crua (Tabela 2). Foram dadasaos animais 5,44 kg (12 Ib) deste suplemento por cabeça, por dia durante todo oexperimento. A composição Experimental do Exemplo 1 foi misturada diretamente aeste suplemento, de forma que fossem esperadas ingestões de 15 gramas porcabeça, por dia; e 30 gramas por cabeça, por dia foram administradosrespectivamente para os indivíduos do Tratamento 1 e 2.
Os animais receberam estes tratamentos de dieta por 56 dias após o que acomposição foi retirada da dieta dos Tratamentos 1 e 2. Todos os animais forammantidos na mesma dieta de controle sem a composição até o 84- dia. Nos dias 7,21 e 35 do experimento, todos os animais receberam uma vacina E. coli J5 (daPfizer). Este protocolo de vacinação (ou seja, 3 injeções, 14 dias de intervalo)seguiu as recomendações do fabricante. Esta vacina é usada comercialmente naindústria de gado leiteiro como um meio de reduzir a probabilidade de mastitecoliforme. Uma limitação a esta vacina, e a maioria das outras vacinas, é a respostavariável e limitada em título.
As amostras de sangue foram colhidas usando perfuração jugular nos dias 0,14s, 28s, 42e e 56°, e neste último dia a composição foi removida da dieta dosanimais. Todos os animais permaneceram em uma dieta comum sem acomposição até o 84- dia. Foram colhidas também amostras de sangue no 82s diapara determinar se as mudanças em título induzidas pela composição forammantidas seguinte a sua retirada da dieta. O soro de todos os animais foipreparado por centrifugação. As concentrações de anticorpos específicos para avacinação com E. Coli J5 foram avaliadas em três frações diferentes deimunoglobulina (IgM, IgGI e lgG2) usando os ensaios imunosorventes ligados àenzima (ELISAs). Para analisar os títulos de E. coli J5 nas frações deimunoglobulina IgGI e lgG2, uma cultura de E. coli (obtida do Dr. Jeanne Burton,Centro de Genômica Funcional Animal, Departamento de Ciências Animal,Universidade do Estado de Michigan) foi cultivada, colhida e usada para cobrir placas de 96 poços. Subseqüentemente, as amostras de soro (diluído 1:5000)dosanimais foram adicionadas aos poços individuais nas placas cobertas e incubadaspor uma hora para que os anticorpos no soro animal se ligasse ao antígeno E. coliJ5. As placas ELISA foram lavadas com solução salina fosfatada (PBS) contendoTween-20.
Os anticorpos secundários (peroxidase de rábano silvestre (HRP) -conjugado anti-bovino ovino) que se liga especificamente ao IgM1 IgGI ou lgG2bovino (Beth Laboratórios, Montagomery, TX) foram adicionados às placas lavadas.Os anticorpos secundários foram conjugados à peroxidase de rábano silvestre.Após a incubação por mais uma hora com os anticorpos secundários, as placas foram lavadas novamente com PBS e Tween-20. O substrato de peroxidase TMB(tetrametilbenzideno) foi adicionado às placas e a reação de cor resultante foiquantificada através da medição da absorvência a 450 nm usando uma leitora deplaca ELISA.
Conforme mostrado na Tabela 3, a composição Experimental não teve qualquer efeito (no limiar de P < 0,05) no desenvolvimento de título de E. coli J5associado com o isótipo de anticorpo IgM. Entretanto, a composição estimulou emanteve o título de J5 em isótipo de anticorpo IgGI e lgG2 conforme mostrado nasFiguras 5 e 6 e nas Tabelas 4 e 5.
O título de IgGI aumentou no 56a dia (P < 0,05) em animais que tinham recebido os tratamentos 1 e 2 (Tabela 4 e Figura 5). Até o 82- dia, o título emanimais de Controle tinha caído novamente para os níveis de pré-experimento dodia 0). Contudo, os animais que tinham sido alimentados com a ração doTratamento 1 e Tratamento 2 tinham elevado o título de J5, em comparação aosanimais de Controle (P < 0,05). De fato, os animais que tinham recebido o Tratamento 1 ou 2 não demonstraram perdas de título de IgGI, uma vez que ainvenção tinha sido removida da dieta após a 56- dia (Tabela 4 e Figura 5).
Conforme mostrado na Tabela 5 e Figura 6, com respeito à fração de lgG2, aadição de 15g por cabeça, por dia (Tratamento 1) ou 30g por cabeça, por dia(Tratamento 2) da composição causou um aumento progressivo no título de lgG2ligados a J5 no 42- dia (ou seja, a dose mais alta elevou o título em até 57% e adose menor em até 30% comparada com a de Controle), embora este efeito nãofosse importante estatisticamente a P < 0,05 (o valor de P foi 0,16). Após o 562 dia,o Tratamento 2 (o com dose mais alta da Composição) causou uma elevaçãoimportante no título de J5 (P < 0,05). O Tratamento 1 (dose menor da composição)causou uma elevação no título J5 dentro da fração de lgG2 neste intervalo detempo embora este efeito não fosse importante estatisticamente a um limiar deP < 0,05 (valor de P = 0,12). No 82a dia do estudo, após a composição ter sidoretirada da dieta, os animais alimentados com a dose mais alta da composiçãotiveram um título elevado dentro da fração lgG2 (aumento de 14% comparado aoControle); entretanto, este efeito não foi significativo no limiar de P < 0,05 (valor de P = 0,09).
Estes dados indicam que a composição conseguiu aumentar o título e, ainda,manter o título na fração de IgGI seguinte a retirada da composição da dieta(P < 0,05). A composição também conseguiu aumentar o desenvolvimento de títulodentro da fração de lgG2 (P < 0,05).
As concentrações de IL-1 β foram examinadas também nas amostras de sorodos animais do grupo de Controle, de Tratamento 1 e Tratamento 2 usando um ELISA para IL-1 β (R+D Systems Minneapolis, MN). Conforme mostrado na Figura7, os resultados indicaram que o Tratamento 1 e o Tratamento 2 aumentaram asconcentrações de soro de IL-1 β após 28 dias. Após o 56- dia, a dose menor dacomposição também elevou de forma significativa a concentração de soro de IL-1 β((P < 0,05). A dose mais alta da composição causou uma elevação numérica nosoro de IL-1 β no 562 dia do estudo; contudo, este efeito não foi significativo emP < 0,05 (valor de P = 0,23). Embora não desejando se basear somente na teoria, acomposição pode estimular o sistema imune inato (por exemplo, por meio daativação de neutrófilo) e os neutrófilos estimulam então o sistema imune adquiridopor meio da secreção de IL-1 β. O IL-1 β aumentou de forma específica acapacidade das células B de aumentarem a taxa de desenvolvimento do título delgG2 e manter o título dentro da fração de IgGI.
As concentrações de proteína de L-seletina por neutrófilos também foramanalisadas usando o método Western Blot, como mostrado na Figura 8. Aconcentração de mRNA para L-seletina também foi determinada quanto ao estudode rato (Exemplo 4), mas usando cápsulas bovinas específicas. Concluiu-se quetanto o Tratamento 1 (15 g de composição Experimental/cabeça/dia) como oTratamento 2 (30 g de composição Experimental/cabeça/dia) aumentaram asconcentrações (P < 0,05) de L-seletina por neutrófilo comparados ao tratamento deControle.
TABELA 2
<table>table see original document page 17</column></row><table>
TABELA 3
<table>table see original document page 17</column></row><table>TABELA 4
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Valores dentro de uma faixa que não compartilha significantemente uma diferençade índice superior (P < 0.05 limiar).
TABELA 5
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Valores dentro de uma faixa que não compartilha significantemente uma diferençade índice superior (P < 0,05 limiar).
EXEMPLO 7
Um experimento foi completado com ovinos para investigar a capacidade dacomposição Experimental do Exemplo 1 de aumentar a imunidade adaptativa emresposta ao protocolo de vacinação com E. coli J5 que foi empregado no Exemplo5 6. Os animais (doze animais por tratamento) foram alocados em 3 tratamentos:Controle, Tratamento 1 (3 gramas por cabeça, por dia de composição Experimentaldo Exemplo 1) ou Tratamento 2 (6 gramas por cabeça, por dia de composiçãoExperimenta! do Exemplo 1). Os animais foram alimentados com estas dietas por75 dias e foram vacinados com a vacina J5 da Pfizer no 7°, 21° e 35° dias do10 estudo. As amostras de sangue foram colhidas nos dias 0, 35° e 75° dias, Asamostras de sangue também foram colhidas no 90° dia após a composição doTratamento 1 ou Tratamento 2 terem sido retiradas da dieta para se determinar seesta composição tinha a habilidade de manter o título.
Neste estudo foi usado um anticorpo secundário (IgG de coelho anti-ovinoconjugada a peroxidase: Beth Latoratórios, Montgomery, Texas),que organizou osisótipos de ovino IgG1 e IgG2. A Tabela 6 e Figura 9 mostram os dados dasfrações de IgG1 e IgG2 de ovino combinadas. Os métodos usados no estudo paraconduzir o ELISA foram idênticos àqueles delineados no Exemplo 6, exceto quantoao fato de que foi usado um anticorpo IgG anti-ovino (VMRD, Pullman, WA).
No 35° dia, a dose alta de composição Experimental causou uma elevaçãono total de títulos de IgG1 e lgG2. No 75° dia, as doses alta e baixa da composiçãocausaram um aumento progressivo no título de J5. Especificamente, a dose baixacausou um aumento de 17% no título e a dose alta causou um aumento de 31% notítulo de J5. No 90° dia, os animais no Tratamento 1 não apresentavam umaelevação comparados com os animais do grupo de Controle. Entretanto, os animaisdo Tratamento 2 que receberam a dosa mais alta da composição apresentaramuma elevação de 24% no título de J5.
Estes dados apoiam as observações do Experimento 6 em que aadministração da composição Experimental aumentou o desenvolvimento de títulodentro da fração IgGI e IgG2 e manteve o título após a retirada da composiçãoExperimental da dieta por 15 dias adicionais.
TABELA 6
<table>table see original document page 19</column></row><table>
A invenção tendeu a aumentar o título de J5 nas frações de IgG combinadas,embora os valores de P fossem maiores do que P < 0,05 limiar.
Deve-se ficar entendido que as versões da presente composição que foramdescritas possuem caráter ilustrativo de algumas das aplicações dos princípios dapresente composição. Diversas modificações podem ser feitas por aqueles que sãoversados na arte sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da composição.As várias características que foram descritas neste documento podem ser usadasem qualquer combinação e não estão limitadas às combinações testadas e queestão destacadas especificamente neste documento.

Claims (27)

1. Uma combinação para aumentar a eficácia de uma vacina, caracterizadapor compreender:- uma vacina;- uma composição de β-glucanos, β-1,3 (4)-endo-glucano hidrolase, terradiatomácea calcinada, uma argila mineral e glucomano; eonde dita composição aumenta o título de anticorpos para a vacina em relação aotítulo de ditos anticorpos na ausência de dita composição.
2. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composição e ditavacina serem administradas a rebanho.
3. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composição seradicionada à ração de animais na faixa de aproximadamente 0,01% aaproximadamente 2,5% por peso de dita ração em uma base de peso seca.
4. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composição seradicionada à ração de animais na faixa de aproximadamente 0,01 grama porquilograma de peso corporal de dito animal a aproximadamente 1 grama porquilograma de peso corporal vivo de dito animal.
5. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por ditas vacina ecomposição serem administradas a rebanho bovino.
6. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composição seradministrada a rebanho bovino na faixa de aproximadamente 10 gramas aaproximadamente 60 gramas por dia por animal.
7. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por ditas vacina ecomposição serem administradas a rebanho ovino.
8. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composição seradministrada a rebanho ovino na faixa de aproximadamente 2 gramas aaproximadamente 10 gramas por dia por animal.
9. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita vacina estimular aprodução de anticorpos contra mastite.
10. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita vacina ser a vacinaJ5 da Pfizer.
11. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composiçãoaumentar o título das classes de anticorpos IgGI ou IgG2 em relação ao título deditos anticorpos IgGI ou lgG2 na ausência de dita composição.
12. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composiçãoaumentar o título da classe de anticorpos IgGI em relação ao título de ditosanticorpos IgG1 na ausência de dita composição.
13. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dita composiçãoaumentar o título da classe de anticorpos lgG2 em relação ao título de ditosanticorpos lgG2 na ausência de dita composição.
14. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dito título da classe deanticorpos lgG1 ou lgG2 ser mantido após a retirada de dita composição da dietade ditos animais em relação ao título de ditos anticorpos IgGI ou lgG2 na ausênciade dita composição.
15. A combinação da reivindicação 1, caracterizada por dito título da classe deanticorpos IgGI ser mantido após a retirada de dita composição da dieta de ditosanimais em relação ao título de ditos anticorpos IgGI na ausência de ditacomposição.
16. Um método para aumentar a eficácia de uma vacina, caracterizado porcompreender:a. o provimento de um ou mais indivíduos vacinados; eb. a administração de uma composição compreendendo β-glucans, β-1,3(4) - endo-glucano hidrolase, terra diatomácea calcinada, uma argila minerale glucomano ao indivíduo.
17. O método da reivindicação 16, caracterizado por dita composição seradministrada diariamente a ditos indivíduos.
18. O método da reivindicação 16, caracterizado por de dita composição seradicionada à ração do indivíduo na faixa de aproximadamente 0,01% aaproximadamente 2,5% em peso de dita ração em uma base de peso seca.
19. O método da reivindicação 16, caracterizado por dita composição seradicionada à ração de ditos indivíduos na faixa de aproximadamente 0,01 gramapor quilograma de peso corporal vivo de dito animal a 1 grama por quilograma depeso corporal vivo.
20. O método da reivindicação 16, caracterizado por dita composição aumentaro título das classes de anticorpos IgGI ou lgG2 em relação ao título de ditosanticorpos IgGI ou IgG2 na ausência de dita composição.
21. O método da reivindicação 16, caracterizado por dita composição aumentaro título da classe de anticorpos lgG2 em relação ao título de ditos anticorpos IgG2na ausência de dita composição.
22. O método da reivindicação 16, caracterizado por ditos indivíduos seremgado bovino, e uma vacina e dita composição serem administradas a dito gadobovino.
23. O método da reivindicação 16, caracterizado por ditos indivíduos seremrebanho bovino, e dita composição ser administrada ao dito rebanho bovino nafaixa de aproximadamente 10 gramas a aproximadamente 60 gramas por dia poranimal.
24. O método da reivindicação 16, caracterizado por ditos indivíduos seremovinos, e uma vacina e dita composição serem administradas a ditos ovinos.
25. O método da reivindicação 16, caracterizado por ditos indivíduos seremovinos, e dita composição ser administrada a ditos ovinos na faixa deaproximadamente 2 gramas a aproximadamente 10 gramas por dia por animal.
26. O método da reivindicação 16, caracterizado por um ou mais de ditosindivíduos vacinados terem sido vacinados com uma vacina que estimula aprodução de anticorpos contra mastite.
27. O método da reivindicação 26, caracterizado por dita vacina ser uma vacinaJ5 da Pfizer.
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