ES2340492T3 - Metodos de modulacion inmunitaria en animales. - Google Patents

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Eric M. Weaver
Barton S. Borg
Louis E. Russell
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John D. Arthington
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Abstract

El uso de plasma animal de una fuente animal en la fabricación de un medicamento para la administración oral para intensificar la función inmunitaria en canes de edad avanzada.

Description

Métodos de modulación inmunitaria en animales.
Antecedentes de la invención
La principal fuente de nutrientes para el organismo es la sangre, que está compuesta por proteínas altamente funcionales que incluyen inmunoglobulina, albúmina, fibrinógeno y hemoglobina. Las inmunoglobulinas son productos de las células B maduras (células plasmáticas) y existen cinco inmunoglobulinas diferentes referidas como clases: M, D, E, A y G. La IgG es la principal clase de inmunoglobulina de la sangre. La administración intravenosa de productos de inmunoglobulina ha sido utilizada desde hace mucho tiempo para intentar regular o potenciar el sistema inmunitario. La mayor evidencia referente a los efectos de la IgG intravenosa sobre el sistema inmunitario sugiere que la porción de la fracción constante (Fc) de la molécula juega una función reguladora. Las propiedades de unión al antígeno específico de una molécula de IgG individual son conferidas por una disposición estérica tridimensional inherente a las secuencias de aminoácidos de la región variable de las dos cadenas ligeras y dos pesadas de la molécula. La región constante puede estar separada de la región variable si la molécula intacta es escindida por una enzima proteolítica tal como la papaína. Semejante tratamiento proporciona dos fracciones con especificidad para el anticuerpo (fracciones Fab) y una fracción relativamente constante (Fc). Numerosas células del organismo tienen distintos receptores de membrana para la porción Fc de una molécula de IgG (Fcr). Aunque algunos receptores Fcr se unen a la IgG libre, la mayoría se unen a ésta más eficazmente si un antígeno está unido a la molécula de anticuerpo. La unión al antígeno da como resultado un cambio de configuración en la región Fc que facilita la unión al receptor. Una compleja interacción de señales proporciona equilibrio y oportunidad a una respuesta inmunitaria generada en cualquier momento dado en respuesta a un antígeno. Las respuestas específicas para un antígeno se inician cuando las células presentadoras de antígenos especializadas introducen un antígeno, que forma un complejo con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad en los receptores de las células T inductoras coadyuvantes específicas capaces de reconocer ese complejo. La IgG parece estar implicada en la regulación de las reacciones tanto alérgicas como autoinmunitarias. Durante mucho tiempo se ha propuesto la inmunoglobulina intravenosa para la manipulación inmunitaria pero se han obtenido resultados mixtos en el tratamiento de las enfermedades. Se describe una revisión detallada del uso de inmunoglobulina intravenosa como terapia con fármacos para la manipulación del sistema inmunitario en el Vol. 326, Núm. 2, páginas 107-116, New England Journal of Medicine, Dwyer, John M; QUIGLEY J.D. ET AL, PET FOOD FORUM 2002, páginas 1-22, describen los efectos del plasma secado por pulverización en las dietas de animales de compañía.
A medida que se realizan mejoras en la dieta y el cuidado de la salud de los animales de compañía, aumenta su esperanza de vida. Desafortunadamente, la población de mascotas geriátricas tiende a tener numerosos problemas de salud, tales como un equilibrio microbiano intestinal menos deseable y una disminución de la capacidad inmunitaria (Kearns et al., 1998; Shultz, 1984). El alivio de estos problemas de salud por medio de una modulación dietética es un posible modo de mejorar la longevidad y la calidad de vida de los animales de compañía de edad avanzada.
Se propone que la microflora colónica juega un importante papel en el desarrollo y mantenimiento del sistema inmunitario del anfitrión (Gaskins, 2001). Tanto en seres humanos como en perros, un incremento en las concentraciones fecales de bacterias potencialmente nocivas, tales como Clostridium perfringens, y una reducción de las bacterias beneficiosas, tales como Bifidobacterium, ha sido asociado con el aumento de la edad (Mitsuoka, 1992; Bemo et al., 1992). Las respuestas inmunitarias normales aumentan durante los períodos fetal y neonatal temprano; alcanzan su máximo después de la pubertad, y después disminuyen notablemente con el aumento de la edad (Schultz, 1984). Las capacidades inmunitarias tanto humoral como celular están reducidas en los animales más mayores en comparación con los animales adolescentes o juveniles (Schultz, 1984).
Existen un esfuerzo y una necesidad continuos en la técnica de composiciones y métodos mejorados para la modulación inmunitaria de animales. La inmunomodulación apropiada es esencial para mejorar la respuesta a patógenos, vacunaciones, para incrementar la ganancia de peso y mejorar la eficacia alimenticia, mejorar la salud y para el tratamiento de enfermedades por disfunción inmunitaria.
La presente solicitud describe métodos y composiciones farmacéuticas para tratar animales con enfermedades con disfunción inmunitaria.
La presente solicitud describe métodos y composiciones para la inmunomodulación de animales incluyendo seres humanos para optimizar la respuesta a los antígenos presentados en protocolos de vacunación.
La presente solicitud describe métodos para incrementar la ganancia de peso, mejorar la salud general y mejorar la eficacia alimenticia de animales mediante la modulación apropiada del sistema inmunitario de dichos animales.
Un objeto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica novedosa que comprende plasma purificado, sus componentes o derivados, que puede ser administrada oralmente para crear una respuesta de las IgG del suero.
La presente solicitud describe métodos para modular el sistema inmunitario y la respuesta microbiana intestinal en animales por medio de un suplemento alimenticio.
Otro objeto de la invención es proporcionar métodos para la modulación dietética para potenciar la función inmunitaria en perros de edad avanzada.
Otro objeto de la presente invención es alterar las poblaciones microbianas colónicas de los perros de edad avanzada.
Estos y otros objetos de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
Breve resumen de la invención
De acuerdo con una realización de la invención, los solicitantes han identificado purificado y aislado plasma, sus componentes y derivados, que son útiles como composición farmacéutica para la modulación inmunitaria de animales incluyendo seres humanos. De acuerdo con una realización, una composición de plasma que comprende inmunoglobulina, cuando se administra oralmente, induce una disminución de los niveles de IgG en suero en relación con los animales a los que no se ha administrado oralmente inmunoglobulina. Una composición de plasma administrada oralmente que comprende inmunoglobulina afecta al estado inmunitario general de los animales cuando se exponen a un antígeno, en protocolos de vacunación, y en el tratamiento de enfermedades con disfunción inmunitaria.
Los solicitantes han demostrado inesperadamente que la administración oral de proteínas del plasma puede inducir cambios en la inmunoglobulina del suero. Esto resulta inesperado ya que tradicionalmente se pensaba que las proteínas del plasma, tales como las inmunoglobulinas deben ser introducidas intravenosamente para afectar a la concentración de IgG circulante. En contraste, los solicitantes han demostrado que la globulina oral es capaz de tener impacto sobre los niveles de IgG en suero circulante. Esto simplifica enormemente la administración de composiciones moduladoras de la dieta, tales como inmunoglobulina, ya que estas composiciones de acuerdo con la invención pueden ser añadidas ahora simplemente al pienso o incluso al agua para modular la vacunación, para modular la exposición a una enfermedad, tratar animales con enfermedades con disfunción inmunitaria, potenciar la función inmunitaria de un animal, o alterar las poblaciones microbianas colónicas.
También de acuerdo con la invención, los solicitantes han demostrado que la modulación de la IgG del suero tiene impacto sobre la respuesta del sistema inmunitario a la estimulación como en los protocolos de vacunación o en los trastornos con disfunción inmunitaria. La modulación de la IgG del suero, de acuerdo con la invención permite que el sistema inmunitario de los animales responda más eficazmente a la exposición permitiendo una respuesta de regulación al alza más significativa en presencia de una enfermedad o una presentación de antígeno. Adicionalmente esta regulación inmunitaria tiene impacto sobre la velocidad y la eficacia de la ganancia, ya que el coste bioenergético asociado con el aumento de la función inmunitaria requiere cantidades significativas de energía que se desvían de asuntos tales como el crecimiento celular y la ganancia de peso. La modulación del sistema inmunitario permite utilizar energía y nutrientes para otras funciones productivas tales como el crecimiento y la lactancia. Véase, Buttgerut et al., "Bioenergetics of Immune Functions: Fundamental and Therapeutic Aspects", Immunology Today, Abril 2000, Vol. 21, Núm. 4, págs. 192-199.
Los solicitantes han identificado adicionalmente que mediante consumo oral, la región Fc de la composición de globulina es esencial para la comunicación y/o la posterior modulación de la IgG sistémica del suero. Esto es único, ya que ésta es la porción inmunitaria no específica de la molécula que después del consumo oral modula la IgG sistémica del suero sin administración intravenosa como se ha observado antes (Dwyer, 1992). Las fracciones específicas del anticuerpo producían una pequeña respuesta sin la estructura terciaria de Fc. Adicionalmente, la porción de globulina con confirmación intacta proporcionó una reacción mejor que las cadenas pesada y ligera cuando se separaron.
La presente invención está dirigida a métodos de modulación dietética de animales. Más específicamente, la presente invención está dirigida a métodos para intensificar la capacidad inmunitaria de un animal y alterar otras poblaciones microbianas colónicas en perros de edad avanzada. El método comprende administrar a un animal de edad avanzada una cantidad eficaz de un suplemento que comprende plasma animal de una fuente animal. Según se utiliza en la presente memoria, una cantidad eficaz representa una cantidad que potencia la función inmunitaria o altera las poblaciones microbianas colónicas de animales de compañía de edad avanzada cuando se administra el suplemento a una concentración de 0,5-2,0% de la dieta.
Asimismo se proporciona un suplemento animal potenciador de la inmunidad donde el suplemento comprende una cantidad eficaz de una proteína animal.
En otra realización, una composición de plasma que comprende inmunoglobulina, cuando es administrada oralmente, induce una disminución de los niveles de IgG en suero con respecto a los animales no alimentados con inmunoglobulina. Una composición de plasma administrada oralmente que comprende inmunoglobulina afecta al estado general del animal cuando se expone a un antígeno, en protocolos de vacunación, para el tratamiento de enfermedades con disfunción inmunitaria, y en la alteración de poblaciones microbianas colónicas en perros de edad avanzada.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa el efecto de la administración oral de proteína del plasma sobre las respuestas de anticuerpos a una vacunación primaria y secundaria con rotavirus.
La Figura 2 es un gráfico que representa el efecto de la administración oral de proteínas del plasma sobre las respuestas de anticuerpos a una vacunación primaria y secundaria con PRRS.
Las Figuras 3A y 3B son gráficos que representan el peso corporal de grupos tratados con agua y tratados con plasma respectivamente después de una exposición a una enfermedad respiratoria.
La Figura 4 es un gráfico que representa el porcentaje de pavos que quedan después de la exposición a la enfermedad respiratoria.
La Figura 5 es un gráfico que representa el porcentaje de pavos que quedan antes de la exposición a la enfermedad respiratoria.
La Figura 6 es un gráfico que representa el título de hemaglutinación por parvovirus canino de perros de edad avanzada alimentados con un suplemento dietético ampliado con plasma secado por pulverización donde los valores son las medias cuadráticas mínimas de los perros que responden a la exposición de la vacuna, n = 3, 5, 2 y 2 perros para los niveles de suplemento 0, 0,5, 1, y 2%, respectivamente. NS = no significativamente diferente (P > 0,15).
La Figura 7 es un gráfico que representa la concentración de glóbulos blancos periféricos totales para perros de edad avanzada alimentados con una dieta extrudida con un suplemento de plasma secado por pulverización donde los valores son las medias cuadráticas mínimas de los perros que responden a la exposición de la vacuna. Los días 0, 2, 4, 6, 8 y 10, n = 3, 5, 2, y 2 para los niveles de suplemento 0, 0,5, 1, y 2%, respectivamente. NS = no significativamente diferente (P > 0,15). El día 20, n = 3, 5, 2, y 1 para niveles de suplemento de 0, 0,5, 1, y 2%, respectivamente. NS = no significativamente diferente (P > 0,15).
Descripción detallada de la realización preferida
De acuerdo con la invención, el Solicitante ha proporcionado en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende componentes purificados y concentrados de plasma animal que son útiles en la práctica de los métodos de la invención. De acuerdo con la invención se administra oralmente gamma-globulina aislada de fuentes animales tales como suero, plasma, huevo, o leche junto con protocolos de vacunación, para el tratamiento de diferentes enfermedades con disfunción inmunitaria para modular la estimulación del sistema inmunitario. Bastante sorprendentemente se ha descubierto que la administración oral de esta composición disminuye los niveles de IgG en suero con respecto a la no administración de la composición farmacéutica. Partiendo de un estado menos estimulado, el sistema inmunitario es capaz de montar una respuesta más agresiva tras la exposición. Además, las enfermedades asociadas con niveles elevados de IgG mejoran. Según se utilizan en la presente memoria en referencia a la composición de la invención, se utilizarán los términos "plasma", "globulina", "gamma-globulina", e "inmunoglobulina". Se pretende que todos describan una composición purificada a partir de fuentes animales incluyendo sangre, huevo, o leche que conserva la región Fc de la molécula de inmunoglobulina. Esto también incluye inmunoglobulinas recombinantes transgénicas purificadas a partir de bacterias, plantas o animales transgénicos. Ésta se puede administrar por medio de plasma secado por pulverización, o globulina que se ha purificado adicionalmente a partir de allí, o cualquier otra fuente de globulina del suero que sea asequible. Una de tales fuentes de globulina purificada es NUTRAGAMMAX® o IMMUNOLIN® asequibles de Proliant Inc. La globulina puede ser purificada de acuerdo con cualquiera de los numerosos métodos disponibles en la técnica, incluyendo aquellos descritos por Akita, E.M. y S. Nakai, 1993. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. Journal of Immunological Methods 160:207-214; Steinbuch, M. y R. Audran. 1969. The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Archives of Biocehmistry and Biophysics 134:279-284; Lee, Y., T. Aishima, S. Nakai, y J.S. Sim. 1987. Optimization for selective fractionation of bovine blood plasma proteins using poly(ethylene glycol). Journal of Agricultural and Food Chemistry 35:958-962; Polson, A., G.M. Potgieter, J.F. Langier, G.E.F. Mears, y F.J. Toubert. 1964. Biochem. Biophys. Acta. 82:463-475.
Los plasmas animales de los cuales se puede aislar la gamma-globulina incluyen plasma de cerdo, bovino, ovino, de volatería, equino, o de cabra. Adicionalmente, los solicitantes han identificado que las fuentes de especies cruzadas de las gamma-globulinas todavía proporcionan los efectos de la invención.
Se pueden obtener productos concentrados del producto mediante secado por pulverización, liofilización, o cualquier otro método de secado, y los productos concentrados se pueden utilizar en su forma líquida o congelada. El ingrediente activo también puede ser microencapsulado, protegiéndolo y estabilizándolo frente a la temperatura elevada, los oxidantes, humedad de tipo pH, etc. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser comprimidos, cápsulas, ampollas para uso oral, polvo granulado, crema, tanto en forma de ingrediente único como asociado con otros excipientes o compuestos activos, o incluso como aditivo alimentario.
Un método para lograr un producto concentrado de composición de gamma-globulina de la invención es el siguiente aunque la globulina puede ser liberada como componente del plasma.
El producto concentrado de inmunoglobulina deriva de sangre animal. La fuente de sangre puede ser cualquier animal que tenga sangre que incluya plasma e inmunoglobulinas. Por conveniencia, se prefiere sangre de plantas de procesamiento de ganado vacuno, porcino, y volatería. Se añade anticoagulante a la sangre completa y después la sangre se centrifuga para separar el plasma. Se puede utilizar cualquier anticoagulante para este fin, incluyendo citrato de sodio y heparina. Los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente tales anticoagulantes. Después se añade calcio al plasma para promover la coagulación, la conversión de fibrinógeno en fibrina; no obstante son aceptables otros métodos. Esta mezcla se centrifuga después para separar la porción de fibrina.
Una vez que se ha separado la fibrina del plasma dando como resultado el suero, se puede utilizar el suero como fuente principal de Ig. Alternativamente, se podría inactivar también esta porción del mecanismo de coagulación utilizando diferentes anticoagulantes.
El plasma desfibrinado se trata a continuación con una cantidad de compuesto salino o polímero suficiente para precipitar la fracción de albúmina o globulina del plasma. Los ejemplos de los compuestos de fosfato que se pueden utilizar para este fin incluyen todos los polifosfatos, incluyendo hexametafosfato de sodio y polifosfato de potasio. La globulina también puede ser aislada por medio de la adición de polietilenglicol o sulfato de amonio.
Después de la adición del compuesto de fosfato, se disminuye el pH de la solución de plasma para estabilizar el producto precipitado de albúmina. El pH no se debe disminuir por debajo de 3,5, ya que esto hará que las proteínas del plasma sean dañadas. Se puede utilizar cualquier tipo de ácido para este fin, con tal que sea compatible con la solución de plasma. Los expertos en la técnica pueden lograr fácilmente tales ácidos. Los ejemplos de los ácidos adecuados son HCl, ácido acético, H_{2}SO_{4}, ácido cítrico, y H_{2}PO_{4}. El ácido se añade en una cantidad suficiente para disminuir el pH del plasma al intervalo designado. Generalmente, la cantidad oscilará entre una razón de aproximadamente 1:4 a 1:2 de ácido con respecto a plasma. El plasma se centrifuga después para separar la fracción de globulina de la fracción de albúmina.
La siguiente etapa en el procedimiento consiste en elevar el pH de la fracción de globulina con una base hasta que ya no sea corrosivo para el instrumental de separación. Las bases aceptables para este fin incluyen NaOH, KOH, y otras bases alcalinas. Tales bases son fácilmente constatables por los expertos en la técnica. El pH de la fracción de globulina se eleva hasta que está en un intervalo no corrosivo que estará generalmente entre 5,0 y 9,0. La fracción de inmunoglobulina se microfiltra después preferiblemente para separar cualquier bacteria que pueda estar presente.
El producto concentrado de inmunoglobulina final puede ser secado por pulverización opcionalmente a un polvo. El polvo permite un empaquetamiento más fácil y el producto permanece estable durante un período de tiempo más largo que el producto concentrado de globulina de partida en forma líquida o congelada. Se ha encontrado que el polvo de producto concentrado de inmunoglobulina contiene aproximadamente 35-50% de IgG.
Además de la administración con portadores convencionales, los ingredientes activos se pueden administrar mediante una variedad de mecanismos de liberación de fármacos especializados que son conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiten la invención.
Los expertos en las técnicas médicas apreciarán fácilmente que las dosis y programas de la inmunoglobulina variarán dependiendo de la edad, la salud, el sexo, el tamaño y el peso del paciente más que de la administración, etc. Estos parámetros se pueden determinar para cada sistema mediante procedimientos y análisis bien establecidos p. ej., en pruebas clínicas en fase I, II y III.
Para semejante administración se puede combinar el producto concentrado de globulina con un portador farmacéuticamente aceptable tal como un vehículo o excipiente líquido adecuado y uno o varios aditivos auxiliares opcionales. Los vehículos y excipientes líquidos son convencionales y se encuentran disponibles en el mercado. Son ilustrativos de los mismos el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones acuosas de dextrosa y similares.
En general, además de los compuestos activos, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener excipientes y agentes auxiliares adecuados que facilitan la elaboración de los compuestos activos en preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. Las formas de dosificación oral incluyen comprimidos, grageas, y cápsulas.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican de una manera que es, por sí misma, bien conocida en la técnica. Por ejemplo las preparaciones farmacéuticas se pueden elaborar por medio de procedimientos de mezclado, granulado, elaboración de grageas, disolución, liofilización convencionales. Los procedimientos que se van a utilizar dependerán por último de las propiedades físicas de los ingredientes activos utilizados.
Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, fosfato tricálcico o hidrogenofosfato de calcio, así como aglutinantes tales como almidón, pasta, utilizando por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como los almidones mencionados antes así como carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o una de sus sales, tal como alginato de sodio. Los agentes auxiliares son agentes reguladores del flujo y lubricantes, por ejemplo, tales como sílice, talco, ácido esteárico o sus sales, tales como estearato de magnesio o estearato de calcio y/o polietilenglicol. Los núcleos de las grageas pueden estar provistos de recubrimientos adecuados que, si se desea, pueden ser resistentes a los jugos gástricos.
Para este fin se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas disolventes adecuados. Con el fin de producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos, se pueden añadir soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, colorantes y pigmentos a los recubrimientos de comprimidos y grageas, por ejemplo, para su identificación con el fin de caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto.
Otras preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas de ajuste mediante presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas, blandas hechas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste mediante presión pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden estar mezclados con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se disuelven o suspenden preferiblemente en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además se pueden añadir estabilizadores.
Se encontró que las dosis orales de globulina o proteína del plasma de acuerdo con la invención modulan la respuesta inmunitaria primaria y secundaria a vacunaciones con rotavirus y PRRS ayudando a modular la IgG y el sistema inmunitario.
Los métodos de la invención también incluyen la prevención y el tratamiento de enfermedades e infecciones gastrointestinales, síndrome de mala absorción, e inflamación del intestino, y la mejora de los estados autoinmunitarios y la reducción de las reacciones inflamatorias generalizadas en seres humanos y animales. Las composiciones de fármaco, alimento y preparaciones dietéticas serían válidas para mejorar el estado inmunitario en seres humanos y animales, para enfermedades asociadas con una disfunción reguladora inmunitaria, para el apoyo y tratamiento de procesos de mala absorción en seres humanos y animales, y para el tratamiento de situaciones clínicas en las que los seres humanos y animales padecen malnutrición. Entre estos procesos de mala absorción se incluyen el síndrome del intestino delgado, la diarrea no tratable de origen autoinmunitario, el linfoma, la post-gastrectomía, la esteatorrea, el carcinoma de páncreas, la resección pancreática amplia, la insuficiencia vascular mesentérica, el escleroderma, la enteritis eosinofílica. Las situaciones clínicas asociadas con la malnutrición incluirían colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, cocaquexia cancerosa debida a enteritis crónica a partir de tratamiento por quimio- o radio-terapia, y patología médica e infecciosa que comprende mala absorción grave tal como SIDA, fibrosis quística, fístula enterocutánea de bajo débito, e insuficiencia renal infantil.
Los usos clínicos de la composición incluirían típicamente enfermedades asociadas con una disfunción inmunitaria, concretamente enfermedades asociadas con estimulación inmunitaria crónica. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no están limitados a, miastenia grave, esclerosis múltiple, lupus, polimiositis, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide, diabetes mellitus insulino-dependiente, pénfigo buloso, enfermedad ocular relacionada con tiroides, ureitis, síndrome de Kawasaki, síndrome de fatiga crónica, asma, enfermedad de Crohn, enfermedad injerto frente a anfitrión, virus de la inmunodeficiencia humana, trombocitopenia, neutropenia, y hemofilia.
La administración oral de IgG tiene tremendas ventajas sobre la administración parenteral. Las más obvias son los riesgos asociados con la administración intravenosa que incluyen: reacciones alérgicas, incremento del riesgo de contagiar enfermedades de la sangre humana tales como VIH o Hepatitis, requerimiento de una fuente de la misma especie, coste de administración, y los beneficios de la IgG oral son una mayor neutralización de endotoxinas y estimulación "basal" del sistema inmunitario; uso potencial de IgG xenogénica. La invención de los solicitantes proporciona un método no invasivo para modular la respuesta inmunitaria. Esto se puede utilizar para tratar trastornos autoinmunitarios (p. ej., reacciones Rhesus, Lupus, artritis reumatoide, etc.) y otras afecciones en las que el resultado deseado es la inmunomodulación, inmunosupresión o inmunorregulación (transferencia de órganos, trastornos inmunoestimuladores crónicos, etc.).
En otra realización se puede utilizar la invención para la inmunoterapia oral (utilizando anticuerpos) como alternativa a la IVIG. Pero, antes de la invención de los solicitantes, no se podían producir las cantidades masivas de anticuerpos requeridas para el tratamiento sostenido puesto que la IVIG requería IVIG humana. Con la administración oral de anticuerpo, se puede utilizar una fuente de una especie diferente, sin la amenaza de una reacción alérgica. Esto abre la puerta a la leche, calostro, suero, plasma, huevos, etc. de cerdos, ovejas, cabras, ganado vacuno, etc. como medio de producción de las cantidades relativamente grandes de inmunoglobulina que serían necesarias para el tratamiento sostenido.
La administración de anticuerpo puede:
1) Modular la respuesta inmunológica a la exposición a un antígeno parecido/similar. Los datos producidos a partir de la inmunización de cerdos con rotavirus o PRRS demuestran que la administración oral de inmunoglobulina porcina modifica la posterior respuesta inmunitaria al antígeno administrado intramuscularmente. Se produce comunicación a través de los efectos de la IgG sobre las células inmunitarias localizadas en el tracto GI (principalmente el epitelio intestinal y el tejido linfático). El plasma administrado a los animales tradicionalmente contenía anticuerpo tanto para PRRS como para rotavirus. La investigación previa ha demostrado que el calostro (anticuerpo materno) tiene el mismo efecto cuando se administra antes del cierre intestinal. El solicitante ha demostrado que el anticuerpo puede modular la respuesta inmunitaria en un animal después del cierre intestinal.
2) Las concentraciones de IgG del suero son inferiores con la administración oral de proteínas plasmáticas. Este efecto proporciona beneficios para la prevención o tratamiento de afecciones muy diferentes (p. ej., enfermedad de Crohn, IBD, IBS, sepsis, etc.) que los efectos inmunosupresores de anticuerpos específicos. Este efecto no es específico del anticuerpo. Si bien no se desea estar ligado a ninguna teoría se postula que las proteínas plasmáticas pueden neutralizar una cantidad significativa de endotoxina en el lumen del intestino. En el cerdo recién destetado, esa función de la barrera del intestino está comprometida y "se filtrará" endotoxina. La endotoxina (LPS) es uno de los compuestos inmunoestimuladores más potentes conocidos. De este modo como ayuda post-destete, esta invención puede mejorar la respuesta del animal a la endotoxina modulando el sistema inmunitario previniendo la estimulación excesiva.
La ruta de alimentación es importante para los diferentes efectos. La alimentación parenteral aumenta la permeabilidad del intestino y se sabe que aumenta esencialmente la probabilidad de sepsis y endotoxemia cuando se compara con la alimentación parenteral. El suministro oral de inmunoglobulina mejora la función de la barrera del intestino y reduce la absorción de endotoxina. La disminución de la absorción de endotoxina reduciría la cantidad de endotoxina unida en plasma lo que aumentaría la capacidad neutralizadora del plasma cuando se comparara con los animales de control.
La invención del solicitante describe la inmunomodulación, en consonancia con las observaciones de los efectos de la IVIG de las publicaciones. Adicionalmente, se observó el efecto de inmunomodulación de la IgG con fuentes de IgG de diferentes especies administradas oralmente. Esto es muy importante para la medicina humana, concretamente paras las afecciones autoinmunitarias (o casos en los que se desea una inmunomodulación).
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Ejemplo 1 Método de Fabricación Preferido de Producto Concentrado de Globulina
Lo siguiente ilustra un método preferido de fabricación del producto concentrado de globulina de la presente invención:
1
Ejemplo 2 Necesidad de Globulina Intacta
La investigación previa demuestra que el consumo oral de plasma mejora el rendimiento de los cerdos destetados (Coffey y Cromwell, 1995). Los datos indican que la fracción de elevado peso molecular presente en el plasma influye en el comportamiento del cerdo (Cain, 1995; Owen et al., 1995; Pierce et al., 1995, 1996; Weaver et al., 1995). La fracción de elevado peso molecular está compuesta principalmente por la proteína IgG. La proteína inmunoglobulina G es un compuesto con un peso molecular de aproximadamente 150.000 que consiste en dos cadenas polipeptídicas con un peso molecular de 50.000 denominadas cadenas pesadas y dos cadenas de 25.000, denominadas cadenas ligeras (Kuby, 1997). Se ha demostrado en el laboratorio un enfoque de la hidrólisis de la IgG intacta con la enzima pepsina. Una breve digestión con la enzima pepsina producirá un fragmento de peso molecular 100.000 compuesto por dos fragmentos de tipo Fab (Fab = unión al antígeno). El fragmento Fc de la molécula intacta no es recuperado ya que es digerido en múltiples fragmentos (Kuby, 1997). Un segundo tipo de tratamiento del producto concentrado rico en globulina es la reducción de los enlaces disulfuro con el posterior bloqueo para evitar la formación de nuevo de los enlaces disulfuro. Las secciones reducidas resultantes de la molécula de globulina son las cadenas pesadas y ligeras intactas libres.
En el primer ejemplo el objetivo fue cuantificar el impacto mediante consumo oral de diferentes fracciones de plasma y globulina de plasma hidrolizada con pepsina sobre la ganancia diaria media, la ingestión de alimento diaria media, la morfología intestinal, los parámetros sanguíneos, y la actividad enzimática intestinal en cerdos destetados.
Materiales y Métodos
Animales y Dietas. Se asignaron 64 cerdos albergados individualmente con un promedio de 6,85 kg de peso corporal y 21 días de edad para cuatro tratamientos dietéticos en un diseño por bloques completamente al azar. Se utilizaron dos estancias de 32 corrales. Las guarderías contenían previamente animales de la misma piara de origen y no se limpiaron antes de la ubicación de los animales de ensayo para estimular un entorno de sensibilización. Se dejó que los cerdos tuvieran libre acceso al agua y al alimento.
Los tratamientos dietéticos se representan en la Tabla 1 que consiste en: 1) control; 2) plasma secado por pulverización al 6%; 3) globulina secada por pulverización al 3,6%; y 4) globulina digerida con pepsina secada por pulverización al 3,6%. Las dietas están basadas en harina de maíz y soja-suero en polvo remplazando la harina de pescado de menhaden por plasma sobre una base de proteína equivalente. Se incluyeron fracciones de plasma, con respecto al plasma, sobre una base de la fracción de plasma equivalente. Se formularon dietas que contenían 1,60% de lisina para un perfil de aminoácido ideal (Chung y Baker, 1992). Las dietas se peletizaron a 54,4ºC o menos y se administraron 0-14 días después del destete.
Recopilación de Datos. Se recogieron los pesos de los cerdos individuales los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, y 14 después del destete. Se recogieron diariamente la ingestión de alimento y la puntuación de diarrea desdel el día 0 al 14 después del destete. La sangre se recogió los días 0, 7 y 14 después del destete. La sangre se centrifugó y el suero se congeló para su posterior análisis. Una vez completado el estudio (día 14), se sacrificaron seis cerdos/tratamiento seleccionados al azar para obtener muestras para la medición de la altura de la vellosidad, la profundidad de las criptas, la actividad enzimática intestinal, y los pesos de los órganos (intestino, hígado, pulmón, corazón, bazo, timo, riñón, estómago, y páncreas). Inmediatamente después de la eutanasia, se abrió la cavidad corporal y se localizó la coyuntura íleocecal. Se separó el intestino delgado y se diseccionó libre del anclaje mesentérico. A un metro del cráneo hacia la coyuntura ileocecal, se separaron 10 cm de intestino (íleon) y se fijaron en formalina tamponada con fosfato para las mediciones histológicas posteriores. A partir de la sección media del duodeno, se raspó la mucosa, se pesó, y se congeló para el posterior análisis enzimático.
Histología. Las muestras del yeyuno se embebieron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se analizaron utilizando microscopía óptica para medir la profundidad de las criptas y la altura de la vellosidad. Se midieron cinco sitios para la profundidad de las criptas y la altura de la vellosidad de cada cerdo.
Análisis enzimático. Se midieron la actividad lactasa y maltasa de los raspados de la mucosa de acuerdo con Dahlqvist, 1964.
Análisis del suero. Se analizaron la proteína total y la albúmina de acuerdo con los kits de Diagnóstico de ROCHE para un sistema COBAS MIRA. Se analizó la IgG en suero de acuerdo con Etzel et al. (1997).
Análisis Estadístico. Se analizaron los datos con un diseño de bloques completos al azar. Los cerdos fueron albergados individualmente y el corral fue la unidad experimental. Se realizó el análisis de la varianza utilizando los procedimientos GLM de SAS (SAS/STAT Versión 6.11 SAS Institute, Cary, NC). El modelo de la suma de cuadrados consistió en los bloques y tratamientos, utilizando un peso inicial como covarianza. Se informa de las medias cuadráticas mínimas para los tratamientos.
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Resultados
La ganancia diaria media (GDM) y la ingestión de alimento diaria media (IADM) se presentan en la Tabla 2. No se observaron diferencias para GDM o IADM entre los días 0 y 6. Entre los días 0 y 14, el plasma y la globulina mejoraron (P < 0,05) la GDM y la IADM en comparación con el control, mientras el tratamiento con globulina digerida con pepsina fue intermedio. Se registraron los pesos de los órganos y se expresaron como g/kg de peso corporal (Tabla 3). No se observaron diferencias en el corazón, riñón, hígado, pulmón, intestino delgado, estómago, timo, o bazo; no obstante, el peso del páncreas aumentó (P < 0,05) debido a la inclusión de globulina y globulina digerida con pepsina en comparación con el control. El tratamiento con plasma fue intermedio. Los parámetros de la sangre se presentan en la Tabla 4. En comparación con el control, la IgG en suero de los cerdos alimentados con globulina (día 14) fue inferior (P < 0,08), mientras la de los tratamientos con plasma y globulina digerida con pepsina fue intermedia. No se observaron diferencias (P < 0,10) en la proteína total. La albúmina del suero aumentó (P < 0,08) el día 14 con el tratamiento con globulina y plasma en comparación con el control, mientras la del grupo con globulina digerida con pepsina fue intermedia. La actividad enzimática, la morfología intestinal, y la puntuación fecal se presentan en la Tabla 5. No se observaron diferencias (P > 0,10) en la altura de la vellosidad y la profundidad de las criptas. La actividad lactasa y maltasa duodenal aumentó (P < 0,07) debido al consumo de globulina digerida con pepsina en comparación con la dieta de control, mientras en los otros tratamientos dietéticos fue intermedia. La puntuación fecal se redujo (P < 0,07; representando una deposición más firme) debido a la adición de globulina digerida con pepsina en comparación con el control mientras que la puntuación fecal con plasma y globulina fue intermedia.
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(Tabla pasa a página siguiente)
Tablas 
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TABLA 1 Composición de las dietas experimentales (como cantidad ingerida, %)^{a} 
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TABLA 2 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados por pulverización sobre la ganancia diaria media y la ingestión de alimento (kg/d)^{1}
3
TABLA 3 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados por pulverización sobre los pesos de los órganos (g/kg de peso corporal)^{1}
4
TABLA 4 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados por pulverización sobre los parámetros de la sangre^{1,2}
5
TABLA 5 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados por pulverización sobre las actividades enzimáticas, la morfología intestinal, y la puntuación fecal^{1}
6
Ejemplo 3 Cantidad e Impacto de la Inclusión en la Dieta de Fracciones de Plasma Variables
En el segundo experimento el objetivo fue cuantificar el impacto de la inclusión en la dieta de diferentes fracciones de plasma y el efecto de separar las cadenas pesadas y ligeras de la IgG sobre la ganancia diaria media, la ingestión de alimentos diaria media, los pesos de los órganos, y los parámetros en sangre de cerdos destetados.
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Materiales y Métodos
Animales y Dietas. Noventa y seis cerdos alojados individualmente que promediaban 5,89 kg de peso corporal y de 21 días de edad se asignaron a cuatro tratamientos dietéticos en un diseño de bloques completos al azar. Los animales se dispusieron en bloques durante un tiempo entre tres guarderías no desinfectadas. A los cerdos se les permitió el libre acceso a agua y alimento.
Los tratamientos dietéticos (Tabla 6) consistieron en: 1) control; 2) plasma secado por pulverización al 10%; 3) globulina secada por pulverización al 6%; y 4) material rico en globulina al 6% tratado para reducir los enlaces disulfuro de la molécula de IgG (H+L). Las dietas estuvieron basadas en suero de leche en polvo con harina de maíz-soja remplazando la harina de soja por plasma sobre una base equivalente de lisina. Se añadieron las fracciones de plasma con respecto al plasma sobre una base de la fracción equivalente de plasma. Las dietas contenían lisina al 1,60% y se formularon para un perfil de aminoácidos ideal (Chung and Baker, 1992). Las dietas estuvieron en forma de harina y se suministraron a partir de los días 0-14 desde el destete.
Recopilación de Datos. Los pesos individuales de los cerdos se recopilaron los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 desde el destete. Las puntuaciones de ingestión de alimento y diarrea se recopilaron diariamente a partir de 0 a 14 días desde el destete. La sangre se recogió los días 0, 7 y 14 desde el destete. La sangre se centrifugó y las muestras de suero se congelaron para su posterior análisis. Una vez completado el estudio (día 14), se sacrificaron nueve cerdos/tratamiento para obtener los pesos de los órganos (intestino, corazón, hígado, bazo, timo, pulmón, riñón, estómago y páncreas).
Análisis del Suero. La proteína, la albúmina, y el nitrógeno de ureico totales se analizaron de acuerdo con los kits de Diagnóstico de ROCHE para un sistema COBAS MIRA. La IgG en suero se analizó de acuerdo con Etzel et al. (1997).
Análisis Estadístico. Los datos se analizaron en forma de un diseño en bloques completo al azar utilizando los procedimientos GLM de SAS (SAS/STAT Version 6.11 SAS Institute, Cary NC). Los cerdos se albergaron individualmente y el corral fue la unidad experimental. La suma de cuadrados en el modelo consistió en bloque y tratamiento, utilizando el peso inicial como covarianza. Se informa sobre las medias cuadráticas mínimas para los tratamientos.
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Resultados
A partir de los días 0-6 (Tabla 7), el plasma aumentó (P < 0,10) IADM en comparación con el control y H+L, mientras que la globulina fue intermedia. A partir de los días 7-14, el plasma aumentó (P < 0,10) IADM en comparación con los tratamientos de control y H+L. La ingestión media diaria de alimento de los cerdos alimentados con globulina aumentó en comparación con el control. A partir de los días 0-14, el plasma y la globulina aumentaron (P < 0,10) IADM en comparación con los tratamientos dietéticos de control y H+L. La ganancia diaria media se presenta en la Tabla 8. La ganancia diaria media fue similar a IADM para los días 0-6. A partir de los días 7-14 y 0-14, el plasma y la globulina aumentaron (P < 0,10) GDM en comparación con el control, mientras que H+L fue intermedia. Los parámetros en sangre se presentan en la Tabla 9. La IgG en suero y el nitrógeno ureico (día 14) fueron inferiores (P < 0,05) mediante la inclusión en la dieta de plasma y globulina en comparación con el control. El efecto de H+L fue intermedio. El tratamiento en la dieta no tuvo efecto sobre la proteína del suero. La seralbúmina (día 7) disminuyó (P < 0,05) debido a la inclusión de plasma en comparación con otros tratamientos dietéticos. No se observaron diferencias en la puntuación fecal. La longitud intestinal y los pesos de los órganos se presentan en la Tabla 10. No se observaron diferencias en los pesos de los órganos y la longitud intestinal debido al tratamiento dietético.
Tablas TABLA 6 Composición de las dietas experimentales (como % alim.)^{1}
7 
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TABLA 7 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados mediante pulverización sobre la ingestión media de alimento diaria (g/d)^{1}
8
TABLA 8 Efecto del plasma y fracciones de plasma secados mediante pulverización sobre la ganancia diaria media (g/d)^{1}
9 
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TABLA 9 Efectos de las fracciones de plasma secadas mediante pulverización sobre los parámetros en sangre^{1,2}
10
TABLA 10 Efecto del plasma y las fracciones de plasma secados mediante pulverización sobre la longitud intestinal (centímetros) y el peso de los órganos (g/kg de peso corporal)^{1}
11 
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Discusión
En consonancia con la investigación publicada (Coffey y Cromwell, 1995) estos datos indican que cuando se incluían en la dieta el plasma y la globulina aumentaban el rendimiento (GDM, IADM) en comparación con el control. Las fracciones de globulina digerida con pepsina y H+L dieron como resultado una mejora intermedia del rendimiento. La actividad enzimática (lactasa y maltasa) aumentó y la puntuación fecal mejoró con la adición de todas las fracciones de plasma (plasma, globulina, globulina digerida con pepsina, H y L) en comparación con el control.
La concentración de IgG en suero y BUN fueron inferiores tras el consumo de los tratamientos de plasma o globulina en comparación con el control, globulina digerida con pepsina o H y L. La capacidad de la administración oral de plasma o globulina para lograr una respuesta generalizada según se demostró mediante una IgG en suero inferior en comparación con el control fue inesperada.
Las diferencias observadas entre las fracciones de plasma y globulina en comparación con la globulina digerida con pepsina o H+L es que la estructura terciaria de la región Fc está intacta sólo en las fracciones de plasma y globulina. La globulina digerida con pepsina tiene digerida la región Fc, mientras que en la fracción H+L, la región Fc permanece intacta pero sin conformación terciaria. La región Fab todavía está intacta en la globulina digerida con pepsina. La región variable todavía es capaz de unirse al antígeno en la preparación H+L (APC, datos no publicados). De este modo, los resultados indican que la interacción anticuerpo-antígeno (región Fab) es importante para los efectos locales (reducción de la puntuación fecal, aumento de la actividad lactasa y maltasa), mientras que la región Fab y Fc intacta de las fracciones de plasma y globulina es importante para modular la respuesta de la IgG del suero generalizada.
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Ejemplo 4 Efecto de las Dosis Orales de Proteína Plasmática sobre las Respuestas Inmunitarias Activas a Vacunaciones con Rotavirus y PRRS Primarias y Secundarias en Lechones Visión General
Examen de la influencia de la proteína plasmática suplementaria sobre las respuestas inmunitarias activas después de vacunaciones con rotavirus y PRRS primarias y secundarias.
Métodos
Se utilizaron diez cerdas inducidas al parto en el mismo momento. Los tratamientos se asignaron al azar a cada camada. El reparto del tratamiento se produjo dos veces a la semana (a intervalos de 3 o 4 días) a través de un aplicador en tubo al estómago. Se produjeron una serie de 7 aplicaciones antes de la vacunación y el destete finales. Los tratamientos consistieron en: control (10 mL de solución salina) e IgG de plasma (0,5 g repartidos a un volumen final de 8 mL). Todos los cerdos recibieron una vacunación primaria (oralmente = rotavirus; inyección = PRRS) 10 días antes del destete. Se suministró una vacunación secundaria en el momento del destete a través de inyección intramuscular. Las muestras de sangre se recogieron antes de la vacunación primaria (10 días antes del destete), antes de la vacunación secundaria (en el destete), y a intervalos de 3 días hasta 12 días post-destete.
Resultados
Los cerdos medicados con proteína plasmática experimentaron descensos significativos (P < 0,05) de los títulos de anticuerpo específicos después de la vacunación de refuerzo. Esta respuesta se observó para los títulos de anticuerpo de ambos rotavirus (Figura 1) y PRRS (Figura 2).
Discusión
Estos datos proporcionan una indicación excelente del efecto de la proteína plasmática oral en el cerdo joven. La activación inmunitaria actúa como un gran sumidero de energía y nutrientes. Cuando se activa el sistema inmunitario la energía y los nutrientes son canalizados a la formación de productos inmunitarios (inmunoglobulina, citoquinas, proteínas en fase aguda, etc.) y se desvinculan del crecimiento. El plasma oral puede modular el sistema inmunitario, permitiendo de ese modo redireccionar la energía y los nutrientes a otras funciones productivas tales como el crecimiento.
Ejemplo 5 Evaluación del Plasma Liberado Vía Agua en Pavos Bajo Exposición a Enfermedad Visión General
La evaluación de la sangre o sus fracciones tales como suero, plasma o porciones purificadas de allí que contienen inmunoglobulina, cuando se administran a animales, en concreto volatería, y específicamente a pavos a través de su agua, afecta a las bajas por muerte de una manera positiva cuando los pavos se exponen a la enfermedad. La invención demuestra la mejora del comportamiento de los pavos específicamente durante el período de inicio si han consumido proteínas plasmáticas en el agua. En general, la liberación de proteínas plasmáticas a través del agua aumenta la eficacia de la alimentación y el porcentaje restante (supervivencia) después de la exposición respiratoria y ayuda a los pavos en su inicio.
Materiales y Métodos
Ochenta pollos de pavo Nicholas de un día de edad se asignaron al tratamiento con agua. El peso corporal inicial fue de 59 g. Los tratamientos se aplicaron en un diseño factorial que consistía en 1) exposición a la enfermedad o no exposición a la enfermedad y 2) agua tratada con plasma o agua de consumo. Los pollos de pavo se alojaron como 6 o 7 pavos por corral utilizando un total de 12 corrales con suelo. Los pavos expuestos se separaron de los pavos no expuestos para paliar la contaminación cruzada. El peso corporal, la ingestión de alimento y las ingestiones de agua se midieron diariamente. A los pavos se les ofrecieron dietas asequibles comercialmente. Se ofrecieron diariamente tratamientos con agua de nueva aportación. Las concentraciones de plasma en el agua tratada se alteraron regularmente consistiendo en 1,3%, 0,65%, 0,325%, y 1,3% para los días 0-7, 7-14, 14-21, y 21-49, respectivamente. Los pavos se expusieron el día 35 a pasteurella para inducir una sensibilización respiratoria. Las señales clínicas y las bajas por muerte se
registraron diariamente desde los días 0-49. El día 49, se terminó el estudio y se hicieron necropsias a todos los pavos.
Los datos se analizaron en forma de un diseño factorial utilizando los procedimientos GLM de SAS (SAS/STAT Version 8, SAS Institute, Cary, NC). La suma de cuadrados modelo consistió en la exposición y el tratamiento con agua. Se informa sobre las medias cuadráticas mínimas. Las bajas por muerte después de la exposición se analizaron utilizando el análisis de supervivencia de SAS.
Resultados
Los datos de comportamiento antes de la exposición se presentan en la Tabla 11. Puesto que los pavos no se expusieron antes del día 35, sólo se informa de los efectos principales. La inclusión de plasma a través del agua aumentó (P < 0,001) la ganancia diaria media (GDM) a partir de los días 0-7, mientras que no se observaron mejoras adicionales en la ganancia hasta el día 35. No se observaron diferencias (P > 0,05) en la ingestión de alimento diaria media (IADM) desde los días 0-35. La desaparición de agua aumentó (P < 0,05) desde los días 0-7, 0-14, y 0-21 a partir del consumo de plasma a través del agua en comparación con los controles de agua no tratada con alimento. La eficacia de la alimentación (G/F) aumentó (P < 0,05) a partir de los días 0-7, 7-14, 0-14, y 0-28 debido al consumo de agua tratada con plasma en comparación con el agua no tratada. Se observaron diferencias (P > 0,05) en la G/F y la desaparición de agua durante el resto del estudio hasta el día 35. Los datos de comportamiento después de la exposición se presentan en la Tabla 12. No se observaron diferencias (P > 0,05) en GDM, IADM, y la desaparición de agua a partir del consumo de agua tratada con plasma en comparación con el agua tratada para los grupos expuestos o no expuestos. La eficacia de alimentación aumentó (P < 0,05) en los pavos expuestos desde los días 35-42 y los días 35-49 debido al consumo de agua tratada con plasma en comparación con el agua no tratada; mientras que no se observaron diferencias (P > 0,05) en los pavos no expuestos debido al consumo de agua tratada con plasma.
Los pesos corporales de los grupos no tratados y tratados con plasma después de la exposición se muestran en las Figuras 3A y 3B. Se retiraron siete pavos que consumieron agua no tratada después de la exposición o murieron desde la exposición como se representa en la Figura 3A. Un pavo que consumió agua tratada después de la exposición perdió peso y murió debido a la sensibilización como se muestra en la Figura 3B. La Figura 4 muestra el porcentaje restante después de la sensibilización, mientras que la Figura 5 muestra el porcentaje restante antes de la exposición. No se observaron diferencias (P > 0,05) en el porcentaje restante después del período de sensibilización en los pavos no expuestos, mientras que los pavos expuestos que consumieron agua tratada con plasma tuvieron un aumento (P < 0,05) del porcentaje restante en comparación con los pavos expuestos que consumieron agua no tratada (Figura 4). No se observaron diferencias (P > 0,05) en el porcentaje restante antes de la exposición (d 0-35) debido al consumo de agua tratada (Figura 5).
Discusión
El estudio actual demuestra la mejora del rendimiento de los pavos durante el período de partida debido al consumo de proteínas plasmáticas en el agua. Además, después de una sensibilización respiratoria, el consumo de proteínas plasmáticas a través del agua mejoró la supervivencia y disminuyó las retiradas. En general, el reparto de proteínas plasmáticas a través del agua aumenta la eficacia de la alimentación y el porcentaje restante (supervivencia) después de la sensibilización respiratoria y ayuda a los pavos en su inicio.
Tablas TABLA 11 Efecto principal del tratamiento del agua sobre el rendimiento en pavos
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TABLA 12 Efecto del tratamiento con agua y de la sensibilización sobre el rendimiento de los pavos 
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Ejemplo 6 Respuestas Inmunológica y Microbiana del Intestino de Perros de Edad Avanzada a Plasma Secado mediante Pulverización Suplementario Materiales y Métodos
Animales y Dietas. En este experimento se utilizaron cuarenta perros de edad avanzada de las líneas de sangre beagle (11-12 años) o pointer (7-12 años). Los perros se albergaron individualmente en corrales de interiores con acceso a corredores exteriores individuales (de aproximadamente 1,2 x 1,5 m las interiores y 1,2 x 3,0 m las exteriores) en una instalación controlada medioambientalmente. A todos los perros se les permitió libre acceso a agua mientras se encontraban en interiores.
A los perros se les alimentó con una dieta desmenuzada extrudida con harina de volatería como fuente de proteína primaria y arroz cervecero como fuente de carbohidratos primaria. Véase la Tabla 13.
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TABLA 13 Composición de ingredientes de la mezcla basal y composición química de las dietas experimentales suministradas a los perros de edad avanzada^{1}
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Las dietas contenían aproximadamente 34% de proteína bruta y 25% de grasa. El plasma secado mediante pulverización se solubilizó en grasa de volatería y se añadió al exterior del producto desmenuzado extrudido a las siguientes concentraciones: 0, 0,5, 1, y 2% PSP. A los beagle se les ofrecieron 500 g y a los pointer 600 g de su dieta respectiva diariamente.
Diseño experimental y procedimientos de muestreo. A los perros se les asignó al azar el tratamiento dietético en un diseño en paralelo. Antes de la administración del tratamiento, se recogieron muestras de sangre del estado basal vía punción yugular o radial en tubos evacuados que contenían EDTA para el recuento de sangre completa (RSC) y la diferenciación de los glóbulos blancos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos, y monocitos). Además, se recogió una muestra fecal recién evacuada dentro de los 15 minutos de la defecación y se colocó inmediatamente una submuestra en un recipiente para medios de transporte Carey-Blair (Meridian Diagnostics, Inc., Cincinnati, OH) pesado previamente para la posterior enumeración de las siguientes bacterias: bifidobacterias, lactobacilos, Escherichia coli, y Clostridium perfringens.
Después de un período de adaptación a la dieta de 7 días, a los perros se les administró una sensibilización de vacuna en un intento de determinar los efectos del PSP sobre la capacidad inmunitaria del perro de edad avanzada. El día 0 del período de sensibilización se recogieron muestras de todos los perros antes de la vacunación. A todos los perros se les administró después subcutáneamente una dosis de 1 ml de una vacuna que contenía vacunas de moquillo canino, adenovirus, coronavirus de tipo 2, parainfluenza, y parvovirus y bacterina de leptospira (Duramune, Max 5-CvK/4L, Fort Dodge Laboratories, Inc., Fort Dodge Iowa). Los perros no habían recibido esta vacunación previa durante un mínimo de 12 meses. Se recogieron muestras de sangre subsiguientes a los 2, 4, 6, 8, 10, y 21 días de la vacunación vía punción yugular o radial en tubos que contenían 1) EDTA para recuento de la sangre completa (RSC) y diferenciación de los glóbulos rojos, o 2) sin anticoagulante para la cuantificación del anticuerpo anti-parvovirus canino en suero.
Análisis Químicos. Las concentraciones microbianas se determinaron en muestras fecales frescas mediante dilución seriada en diluyente anaeróbico antes de la inoculación en las placas Petri respectivas de agar estéril. El medio selectivo para las bifidobacterias spp. se preparó anaeróbicamente utilizando agar BIM-25 (BBL Microbiology Systems, Cockeyville, MD) de acuerdo con el método descrito por Muñoa y Pares (1988). Los lactobacilos se cultivaron en agar Rogosa SL (Difco Laboratories, Detroit, MI), Escherichia coli se enumeró utilizando agar EMB (Difco Laboratories, Detroit, MI), mientras que C. perfringens se enumeró en un agar triptosa-sulfito-cicloserina (TSC) con yema de huevo (FDA, 1992).
Los agares se inocularon utilizando una pipeta de repetición para dispensar 7 gotas de 10 \mul cada una de las diluciones apropiadas. Después de que el agar adsorbió las gotas, las placas se invirtieron y se incubaron a 38ºC anaeróbicamente (bifidobacterias, lactobacilos, y C. perfringens; 75% N_{2}, 20% CO_{2}, 5% H_{2}) o aeróbicamente (E. coli). Los recuentos de las colonias se realizaron de 24 a 48 horas después de la incubación. Una unidad formadora de colonia (UFC) se definió como una colonia clara que medía al menos 1 mm de diámetro.
Los recuentos de sangre completa y las distribuciones diferenciales de glóbulos blancos (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, y basófilos), se determinaron en muestras de sangre completa. Además, la sangre recogida en tubos sin anticoagulante se centrifugó a 2060 x g durante 20 min a 4ºC. Las muestras de suero se almacenaron a -80ºC hasta la cuantificación de los anticuerpos anti-parvovirus canino vía pruebas de inhibición de la hemaglutinación (Carmichael et al., 1980).
Análisis Estadísticos. Los datos se analizaron como un sistema completamente al azar utilizando el procedimiento de Modelos Lineales Generales de SAS (SAS Institute, Cary, NC). Puesto que la cantidad de alimento ofrecida a los beagle difirió de la de los pointer, el análisis estadístico se realizó para cada raza. El peso individual de los animales se utilizó como una covarianza en el análisis de ingestión de alimento. Los datos del pretratamiento bacteriano y del análisis de sangre el día 0 desde la sensibilización también se utilizaron como una covarianza en los análisis de datos post-tratamiento apropiados. La comparación entre el control y los tratamientos PSP individuales se realizó utilizando contrastes no ortogonales. Las comparaciones se consideraron estadísticamente diferentes a P < 0,05. Las comparaciones con P = 0,06 a 0,15 se consideraron tendencias debido a la variabilidad asociada con muchos de los criterios evaluados.
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Resultados y Discusión
Ingestión de alimento. El efecto de PSP sobre la ingestión de alimento se evaluó durante los períodos de estado basal (día 3 final), la post-vacunación inmediata (días 0 a 6), y la sensibilización global (días 0 a 21) (Tabla 14).
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TABLA 14 Ingestión de alimento tal cual de perros de edad avanzada se suministró una dieta extrudida con un suplemento de plasma secado mediante pulverización al 0, 0,5, 1, o 2%^{1}
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La inclusión de PSP no afectó a la ingestión de alimentos en el estado basal en los beagle. Durante el período del estado basal, los pointer alimentados con dietas que contenían PSP al 0,5 o 1,0% tuvieron una ingestión de alimento menor que los pointer alimentados con el control o con dietas de PSP al 2%, dando como resultado un efecto cuadrático (P = 0,06) de suplementación con PSP en la ingestión de alimento. Durante los períodos de post-vacunación y sensibilización global inmediatos, la ingestión media de alimento de los perros de todos los tratamientos disminuyó. Esto podía estar debido a una respuesta inmunológica a la vacunación o al aumento de manipulación de los perros para la recogida de sangre durante este período. La suplementación de PSP no afectó a la ingestión de alimento de los pointer durante los períodos de post-vacunación y sensibilización global inmediatos y tendió (P = 0,13) a aumentar linealmente la ingestión de alimento de los beagle durante el período de sensibilización global.
Poblaciones Microbianas. Los resultados de los análisis microbianos fecales se presentan en la Tabla 15 siguiente.
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TABLA 15 Concentraciones microbianas fecales seleccionadas para perros de edad avanzada alimentados con una dieta extrudida suplementada con plasma secado mediante pulverización^{1} al 0, 0,5, 1, o 2% 
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En general, la suplementación de la dieta con PSP no afectó (P > 0,05) a las concentraciones fecales de lactobacilos pero tendieron (P = 0,13) a disminuir las concentraciones de bifidobacterias en comparación con los perros de control. Las poblaciones microbianas del intestino juegan un papel crítico en el desarrollo del sistema inmunitario, la resistencia a bacterias patógenas, y la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en el intestino. La presencia de poblaciones microbianas concretas puede ser beneficiosa o perjudicial para el anfitrión. Tanto las bifidobacterias como los lactobacilos son poblaciones bacterianas beneficiosas en el tracto gastrointestinal. El aumento de las concentraciones de estos organismos ha sido asociado con el descenso de concentraciones fecales de bacterias potencialmente patógenas (Araya-Kojima et al., 1995; Gibson y Wang, 1994) y el descenso de concentraciones de compuestos carcinogénicos y putrefactivos en la digesta (Hara et al., 1994; Mitsuoka, 1982). Si bien el PSP tendía a disminuir la concentración de bifidobacterias, numéricamente las diferencias fueron pequeñas y de una significación biológica cuestionable.
Las concentraciones fecales de E. coli y C. perfringens no fueron diferentes (P > 0,05) entre los grupos de tratamiento. Escherichia coli exhibe efectos tanto nocivos (esto es, producción de carcinógenos) como beneficiosos (esto es, estimulación de la fracción inmunitaria) en el intestino (Gibson y Roberfroid, 1995). Una reducción del número de clostridios en el intestino es beneficiosa para el perro puesto que este organismo es patógeno y puede ejercer efectos nocivos sobre el anfitrión (Gibson y Roberfroid, 1995). En general, según se evaluó en este estudio, el PSP no tuvo un impacto significativo sobre la ecología microbiana del intestino.
Características Inmunitarias. En un esfuerzo para determinar el efecto del PSP sobre la capacidad inmunitaria de los perros de edad avanzada, se determinaron las respuestas de producción de leucocitos y de anticuerpos a una sensibilización mediante vacunación. Si bien hacía más de un año que estos perros se habían vacunado contra parvovirus, 28 perros tuvieron títulos de anticuerpos pre-vacunación muy altos (1:80 a 1:320). Se ha determinado que un título de anticuerpo de 1:80 o mayor para parvovirus es protector (Murphy et al., 1999). Puesto que los efectos potenciales de la suplementación de la dieta con PSP sobre la respuesta del título de anticuerpo pueden haber sido reducidos en estos animales, y ya estaban en un estado de protección, sus datos no se incluyeron en el análisis estadístico de la distribución de glóbulos blancos o de los títulos de anticuerpo para parvovirus.
Los efectos de la suplementación con PSP sobre los títulos de hemaglutinación de parvovirus canino se presentan en la Figura 6. La suplementación con plasma secado mediante pulverización no afectó al nivel de los títulos los días, 2, 4, 6, 10, o 20, pero el día 8 los perros con un suplemento de PSP tendían (P = 0,11) a tener un título superior al de los perros que no recibieron suplemento. Estos resultados implican que el día 8 los perros que recibieron suplemento de PSP tendían a tener una mayor capacidad para armar una respuesta inmunitaria a esta vacuna, o a una sensibilización a parvovirus real que se había producido.
El descenso del número total de glóbulos blancos, neutrófilos, y linfocitos con el envejecimiento del perro (Strasser et al., 1993), dio como resultado una reducción potencial de las defensas inmunológicas del perro anciano. Los efectos de la suplementación con PSP sobre las concentraciones de glóbulos blancos periféricos para los perros de edad avanzada se presentan en la Figura 7. Después de la fase de adaptación a la dieta de 7 días, la suplementación con PSP aumentó linealmente (P > 0,05) las concentraciones de GB el día 0 del período de sensibilización. Esta diferencia se aumento mediante vacunación, de manera que el día 2 post-vacunación, los perros a los que se añadió un suplemento de PSP al 2% tenían una concentración 61% superior de GB en comparación con los perros de control. Se observaron aumentos lineales (P < 0,05) de las concentraciones de GB debido a la suplementación con PSP los días 0, 2, 8, y 20 post-vacunación. Por añadidura, las concentraciones totales de GB para los perros de control aumentaron (P < 0,05) o tendieron a aumentar (P < 0,15) todos los días en comparación con los perros que recibieron suplementación de
PSP.
En un esfuerzo para caracterizar adicionalmente los efectos de la suplementación con PSP sobre los GB periféricos, se llevaron a cabo análisis diferenciales (Tabla 16).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 16 Distribución de Glóbulos blancos para perros de edad avanzada alimentados con dieta extrudida con un suplemento de plasma secado por pulverización al 0, 0,5, 1, o 2%^{1} 
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El plasma secado por pulverización aumentó (P < 0,05) las concentraciones de neutrófilos los días 0, 2, 6, y 8 después de la vacunación, y tendió (P < 0,15) a incrementar la concentración de neutrófilos los días 4, 10, y 20. En general, los incrementos observados fueron lineales. El plasma secado por pulverización tendió (P = 0,12) a afectar a las concentraciones de linfocitos periféricos el día 0 antes de la vacunación y el día 4 después de la vacunación (P = 0,02). Se observó un descenso lineal (P = 0,05) en la concentración de linfocitos el día 10 y se detectaron cambios cuadráticos los días 0 y 4 después de la vacunación en perros a los que se había administrado un suplemento de PSP. Las concentraciones de monocitos fueron afectadas cuadráticamente por el suplemento con PSP el día 2 después de la vacunación. En este momento, los perros a los que se había administrado un suplemento de PSP al 0,5 y 1,0% tenían un aumento de concentración de monocitos (0,93 y 1,41 x 10^{3} células/\mul), respectivamente en comparación con los perros de control (0,75 x 10^{3} células/\mul). No se observaron diferencias (P > 0,05) en la concentración de monocitos periféricos ningún otro día durante el período de sensibilización. Estos datos demuestran que el PSP afectaba claramente a la concentración de GB, concretamente después de una sensibilización inmunitaria.

Claims (7)

1. El uso de plasma animal de una fuente animal en la fabricación de un medicamento para la administración oral para intensificar la función inmunitaria en canes de edad avanzada.
2. El uso de la reivindicación 1, donde dicho plasma animal administrado es plasma secado por pulverización.
3. El uso de la reivindicación 2, donde dicho plasma animal está en forma solubilizada.
4. El uso de la reivindicación 3, donde dicho plasma animal se añade a una fuente de alimento.
5. El uso de la reivindicación 1, donde la fuente de plasma animal se selecciona del grupo que consiste en plasma de cerdo, bovino, ovino, de volatería, equino y de cabra.
6. El uso de la reivindicación 1, donde dicho can tiene una edad de aproximadamente 7 a aproximadamente 12 años.
7. Plasma animal de una fuente animal para su uso en la intensificación de la función inmunitaria en canes de edad avanzada donde dicho plasma animal es para la administración oral.
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