BRPI0711145A2 - detecção de doenças venosas tromboembólicas pela medição de nìveis de fibrina solúvel e dìmeros d - Google Patents

Abstract

DETECçãO DE DOENçAS VENOSAS TROMBOEMBOLICAS PELA MEDIçãO DE NìVEIS DE FIBRINA SOLúVEL E DìMEROS D. O presente pedido refere-se a um método e a um teste para detecção da ativação da coagulação, especialmente quando ela é responsável por doenças venosas tromboembólicas, empregando ensaio de dímeros D e da fibrina solúvel produzida durante um processo de fibrinólise ativado em uma amostra de sangue. O método da invenção diz respeito à comparação do nível de dímeros D correspondendo à degradação da fibrina solúvel e do nível de dímeros D da amostra com valores limite normais. O teste da invenção também pode ser usado para determinar se a anticoagulação é suficiente em um paciente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "DETECÇÃO DE DOENÇAS VENOSASTROMBOEMBÓLICAS PELA MEDIÇÃO DE NÍVEIS DEFIBRINA SOLÚVEL E DÍMEROS D".".

O presente pedido refere-se a um método e a umteste para detecção da ativação da coagulação, especialmentequando ela está relacionada a doenças venosas tromboembólicas,usando um ensaio de Dímeros D e ensaiando a fibrina solúveldurante um processo de ativação de coagulação no sangue.

A fibrinólise é o processo de degradação dafibrina no sangue. Ela está envolvida em uma série de processosfisiopatológicos, sendo desencadeada em situações em que oativador de plasminogênio tecidual e o plasminogênio se ligam àfibrina, formando um complexo fibrina-plasminogênio ternáriodentro do qual o t-PA tem alta afinidade pelo plasminogênio,acarretando geração de plasmina, uma enzima que degrada afibrina em Dímeros D. Na ausência da fibrina, o t-PA tem poucaafinidade pelo plasminogênio, explicando o fato de que a fibrinacirculante não é degradada.

A degradação da fibrina, ou fibrinólise, leva àformação de produtos de degradação, compreendendoprincipalmente fragmentos de "dímeros D". Esses Dímeros Destão associados ao fragmento E da degradação de outra moléculade monômero de fibrina formando o complexo DDE, mas mesmonessa forma, eles são normalmente chamados de Dímeros D.A fibrina passando pelo processo de fibrinóliseé formada pela conversão do fibrinogênio sob a ação de umaenzima de coagulação, chamada trombina. Durante a ativação dacoagulação, a trombina assim gerada induz a formação dedepósitos de fibrina, que irão constituir o trombo e a formação defibrina solúvel. Para tanto, ã trombina ataca quatro ligaçõespeptídicas do fibrinogênio localizado, respectivamente, nas duascadeias alfa A e nas duas cadeias beta B, provocando a liberaçãode dois flbrinopeptídeos A das duas cadeias alfa Aea liberaçãode dois flbrinopeptídeos B das cadeias beta B, resultando naformação de monômeros de fibrina que se polimerizamespontaneamente na forma de um polímero por meio das ligaçõesde hidrogênio estabelecidas pela interação entre os sítios depolimerização AeB desmascarados durante a liberação dosflbrinopeptídeos A e B e os sítios a e b que estão disponíveis nasextremidades das cadeias gama e beta, respectivamente. Opolímero da fibrina é então estabilizado imediatamente pelo fatorXIII(a). A geração da trombina é muito maior durante os ensaiosin vitro do que a que ocorre in vivo. Por essa razão, a geração demonômeros de fibrina é muito mais lenta no processo de ativaçãode coagulação in vivo do que nos gerados in vitro, o que faz comque parte dos monômeros se polimerizem para produzir fibrinainsolúvel constituindo o trombo e outra parte dos ditosmonômeros reaja com fibrinogênio em que os sítios a e b sãoacessíveis, ou com produtos de degradação de fibrinogênio paraproduzir fibrina solúvel em que os monômeros da fibrina sãoassociados ao fibrinogênio.

A determinação da concentração da fibrinasolúvel é importante para confirmar a ativação da coagulação emum paciente. Essa determinação pode ser realizada usandoamostras de sangue ou plasma obtido de uma amostra de sangueretirada de um paciente.

Foi demonstrado que o ensaio da fibrina solúvelé um complemento útil para ensaiar os produtos de degradação dafíbrinólise, visto que a fibrina solúvel é capaz de detectar aativação da coagulação que está em curso enquanto que aconcentração de Dímeros D indica a degradação de um trombo,mesmo se o processo de coagulação de ativação estiver parado.

Em suma, o nível de Dímeros D no plasma éaumentado enquanto o coágulo de fibrina se degrada in vivo. Porconseqüência, se o trombo estiver presente e sofrendodegradação, o nível de Dímeros D é elevado, mesmo que acoagulação persista ou esteja parada. Em contrapartida, o nível defibrina solúvel aumenta apenas se a coagulação persistir.

Comparado ao nível de Dímeros D, a mediçãoespecífica do nível de fibrina solúvel no plasma permite, dessaforma, determinar se ocorre coagulação em um paciente nomomento que a amostra a ser ensaiada é obtida, junto com umaavaliação do equilíbrio coagulolítico.

A determinação do nível de Dímeros D naamostra, chamado de nível base, é, portanto, uma reflexão dadegradação do trombo que ocorre in vivo, enquanto que adeterminação do nível de Dímeros D obtidos após a adiçãoexógena de um agente trombolítico específico da fibrinarepresenta a soma dos Dímeros D de base e dos Dímeros Doriginados da degradação da fibrina solúvel, também chamada defibrina circulante.

O pedido de patente internacionalWO-A-02/18628 descreve um método para ensaiar a fibrinasolúvel em uma amostra de sangue, o qual requer colocar oplasma em contato com um ativador de plasminogênio com altaafinidade pela fibrina solúvel (PA-Fb sp), seguido dadeterminação do nível dos produtos de degradação da fibrina(Dímeros D). A diferença entre a concentração de Dímeros D emuma amostra tratada com PA-Fb sp e a dos Dímeros D de basedeterminados no plasma não tratado com PA-Fb sp representa,portanto, os Dímeros D associados à degradação da fibrinasolúvel. Os inventores observaram agora que o método propostono pedido Internacional W0-A-02/18628 do estado da técnicapode ser vantajosamente suplementado para ser realizado nocontexto do diagnóstico de doenças venosas tromboembólicas,bem como no diagnóstico e monitoração de coagulaçõesintravasculares disseminadas (DIVC). Ele também permitedeterminar se o tratamento com anticoagulantes será eficaz.

As doenças venosas tromboembólicascompreendem principalmente trombos venosos dos membros e doembolismo pulmonar, este resultando de uma complicação dasprimeiras tromboses. Também são encontradas tromboses venosasalém daquelas nos membros, uma vez que todas as regiõesvenosas estão sujeitas a uma trombose. As veias renais e as veiasmesentéricas podem ser citadas especificamente dentre as que estão na origem das patologias. Doenças tromboembólicas, comoa trombose venosa profunda (TVP) e/ou o embolismo pulmonar(PE) são doenças fatais e representam grande proporção dasinvalidezes e mortes nos países industrializados, sendo vital oestabelecimento do diagnóstico dessas doenças para concluir investigações por exames de imagens, como imagens de ultra-som, para o diagnóstico de tromboses venosas, e a cintigrafia ouangiografia para diagnosticar embolismos pulmonares. Essesmétodos investigativos são de difícil realização e nem semprepodem ser realizados com a rapidez necessária.

Como conseqüência, há a necessidadepermanente de definir um teste que permita rápido diagnóstico dedoenças tromboembólicas em um paciente, esse diagnósticoincluindo a possibilidade de descartar essa doença sem ter derecorrer necessariamente a investigações adicionais.

Na área do diagnóstico de doenças relacionadasà coagulação, a capacidade do uso de Dímeros D, caso seus níveisestejam normais, é conhecida por ser um indicador negativo datrombose, uma vez que o princípio de que a formação de umtrombo envolve tanto a ativação da coagulação quanto a fibrinólise é reconhecido.No entanto, a única contagem de Dímeros Dmedida até agora carece de especificidade e não permite que sechegue a uma conclusão precisa de se houve formação de umtrombo intravascular, uma vez que os Dímeros D presentes nacirculação podem se originar da degradação dos depósitos defibrina vascular extra. Os Dímeros D formados in situ podementão passar para a circulação, produzindo, por conseqüência, umalto nível de Dímeros D circulantes. No contexto da presenteinvenção, os inventores avaliaram a pertinência de um diagnósticobaseado no teste de Dímeros D em associação com um testerápido para determinar a fibrina solúvel, que representa a ativaçãoda coagulação intravascular. Essa combinação de ensaiosdemonstrou ser vantajosa no contexto de um diagnóstico datrombose venosa profunda (TVP) e/ou do embolismo pulmonar(EP), bem como no texto de um diagnóstico da coagulaçãointravascular disseminada (CID). O teste de fibrina solúvelrealizado, denominado SDF para a fibrina degradável solúvel,permite que a fibrina solúvel seja ensaiada determinando-se osprodutos de degradação gerados durante sua degradação peloativador de plasminogênio tecidual (ou outro agente trombolítico,tal como um ativador de plasminogênio específico da fibrina)fornecido de forma exógena a uma amostra.

Dessa forma, a invenção diz respeito a ummétodo in vitro para o diagnóstico da ativação da coagulaçãopartindo de uma amostra de sangue obtida de um paciente,compreendendo:i) medir a quantidade de produtos de degradaçãoda fibrina contidos na amostra de teste, consistindo em medir aquantidade de Dímeros D presentes na amostra £ constituir o nívelde base dos Dímeros D;

ii) tratar a amostra por incubação com umativãdor de plasminogênio com alta afinidade pela fibrina (Pa-Fbsp) sob condições que permitem a degradação da fibrina solúvelcontida na amostra em produtos de degradação sem resultar nadegradação do fibrinogênio, e medir a quantidade de Dímeros Dcontidos na amostra tratada;

iii) calcular a diferença entre a quantidade deDímeros D medidos após a ativação pelo ativador Pa-Fb sp naetapa ii) e a quantidade de Dímeros D antes da referida ativaçãomedida na etapa i), a referida diferença constituindo o grau dedegradação da fibrina solúvel (SDF);

iv) comparar o nível de Dímeros D medido naetapa i) com um valor limite normal determinado para o referidoproduto de degradação e comparar o nível de SDF calculado naetapa iii) com um valor limite normal determinado para o SDF.

Quando o método de ensaio é realizado,partindo de uma amostra, é possível determinar o risco de doençatromboembólica: existe o risco de que se pelo menos um dosníveis calculados do referido produto de degradação da fibrina ouSDF (Dímeros D) for maior do que o valor normal, e esse risco éeliminado quando o nível calculado do referido produto dedegradação da fibrina e o nível de SDF são menores do que osrespectivos valores limite normais.

O método de diagnóstico da invenção éaplicável ao diagnóstico de coagulação sangüínea, seja o processode coagulação localizado (tais como tromboses venosasprofundas) ou generalizado (como no caso da CID).

Caso seja apropriado, antes de adicionar oativador de plasminogênio na etapa a)ii) acima, uma mistura deácido cítrico e citrato de sódio é adicionada à porção da amostrana qual os produtos de degradação da fibrina solúvel sãodeterminados.

O reagente utilizado para ensaiar os produtos dedegradação é selecionado para medir um certo grupo de produtosde degradação. Como exemplo, utilizam-se anticorpos com umaespecificidade predeterminada com um tipo específico deprodutos de degradação da fibrina.

Quando a concentração dos Dímeros D de basemedida na etapa i) tem um valor maior do que o valor limite de500 ng/mL [nanogramas/mililitro], o Nível de Dímeros D éconsiderado como aumentado. Quando a concentração deDímeros D correspondendo à degradação da fibrina solúvel e queé calculada na etapa iii) tem um valor maior do que o valor limitede 300 ng/mL determinado em pacientes saudáveis, ela éconsiderada como aumentada.

Os referidos valores limite foram determinadoscom um reagente constituído por um anticorpo do teste "Lia" daDiagnostica Stago ou do teste VIDAS da Bio-Mérieux. Para osoutros reagentes, o valor limite deve ser determinado pelacomparação com os resultados obtidos com os referidosreagentes.

Quando as medições de Dímeros D e asmedições da fibrina degradável solúvel tiverem sido realizadas,pressupõe-se que no paciente cuja amostra de sangue está sendotestada, existe um risco de doença tromboembólica quando onível de (Dímeros D) produzidos degradação da fibrina de base éde 500 ng/mL ou maior ou quando o nível de fibrina solúveldeterminado pela diferença entre o nível de Dímeros D presentesno plasma tratado com o ativador de plasminogênio específico dafibrina e o do Nível de base de Dímeros D é maior do que o valorlimite, por exemplo, 300 mg/mL.

A amostra biológica é, de preferência, umlíquido biológico, por exemplo, um plasma ou amostra de sangue,ou um líquido de punção, contanto que o nível de plasminogênionesse líquido seja idêntico ao do plasma. No caso de líquidos depunção contendo pouco plasminogênio, a adição de Glu-plasminogênio deve ser considerada de modo que a concentraçãode plasminogênio fique próxima à do plasma.

O ativador de plasminogênio com alta afinidadepela fibrina (isto é, que ativa apenas o plasminogênio na fibrina)utilizado no método para ensaio da fibrina solúvel pela geração deprodutos de degradação específicos pode ser selecionado dentrediversos compostos conhecidos por serem ativadores deplasminogênio. No entanto, alguns deles degradam tanto ofibrinogênio quanto a fibrina, tal como a estreptoquinase e auroquinase. Esses compostos não são adequados para uso nométodo da invenção, pois resultam na degradação da fibrina,dando origem a produtos de degradação de fibrinogênio queinterferem naqueles originados da degradação da fibrina.

Outro grupo de ativadores de plasminogênio éconstituído por compostos descritos como tendo altaespecificidade pela degradação da fibrina, se comparado aofibrinogênio. O método da invenção utiliza de forma vantajosa aespecificidade desse outro grupo de compostos para realizá-la eutilize, por exemplo:

• o ativador de plasminogênio tecidual (t-PA)ou seus derivados, tal como TNK-tPA, que é um mutante de t-PAque possui altíssima especificidade pela fibrina (Cannon CPecol, "TNK tissue plasminogen activator compared with írontloaded altephase in acute myocardial infarction results of theTIMI IOB trial", Thrombolysis in Myocardial Infarction (TIMI)IOB Investigators, Circulation 98 (25), 2805-14, 1998);

• o ativador originado de Desmodus rotundus(bat-tpa ou vPA = ativador de plasminogênio da glândula salivarde morcego-vampiro) ou seus derivados:DSPAs = APs de saliva de Desmondus rotundus, FEKP = DSPAalfa 1 e alfa 2, EKP = DSPA beta, KP = DSPA gama (Bringmanne col: "Structural features mediating fibrin selectivity of vampirebat plasminogen activators", J Biol Chem 270, 25596-603, 1995),estafiloquinase (SAK), um polipeptídeo secretado porStaphylococcus aureus (Collen D: "Staphylokinase: a potent,uniquely fibrin-selective thrombolytie agent", Nat Med, 4-279-84,1998; Sakharov DVe col: "Fibrin speeifieity of a plasminogenactivator affects the effleieney of fibrinolysis and responsivenessto ultrasound: comparison of nine plasminogen activators invitro". Thromb Haemos, 81, 605-12, 1999) ou um de seusmutantes (Collen D e col., "Recombinant staphylokinase variantswith altered immunoreactivity. I: Construetion andcharacterization". Cireulation 94, 197-206, 1996).

Para realizar o método de diagnóstico descritoacima, anticorpos anti-Dímeros D são utilizados para realizar osdois ensaios (Dímeros D de base e Dímeros D após a ação doativador de plasminogênio específico da fibrina) do método dainvenção. Os referidos anticorpos foram descritos no estado datécnica e também se encontram comercialmente disponíveis, porexemplo, pela Diagnostica Stago sob o nome "Lia-test" ou sob onome "Vidas" da Bio-Mérieux.

De modo a serem comparados, os ensaios dasetapas i) e ii) devem utilizar o mesmo anticorpo anti-Dímeros D.

Os dímeros D originados da degradação dafibrina solúvel na presença de Pa-Fb sp podem ser ensaiadosusando qualquer técnica de ensaio analítico rotineira, como osmétodos do tipo ELISA, métodos de aglutinação em partículas delátex sensíveis (do tipo usado no teste Lia), métodosimunocromatográficos, etc. Exemplos dos vários testes de ensaiode dímeros D comercialmente disponíveis que podem ser citadosincluem ASSERACHROM D-Di ou STA LIATEST D-Di, ambosvendidos pela Diagnostic Stago. No entanto, no contexto dapresente invenção, as condições para uso do teste ELISA deASSERACHROM D-Di foram modificadas vantajosamente paraencurtar o teste (15 min de incubação com anticorpo imobilizadoe 15 minutos com anticorpo marcado com peroxidase).

De forma vantajosa, o método de diagnóstico invitro da invenção também compreende o tratamento de umaamostra de controle positivo, em especial um plasma de controlepositivo.

Para obter o plasma de controle positivo, oplasma é primeiramente incubado com uma pequena quantidadede trombina por um período predeterminado para permitir aformação de fibrina solúvel, sem a formação de um coágulo defibrina. O processo de coagulação que foi desencadeado é entãobloqueado pela adição de um inibidor de trombina para impedirque a reação continue. Como inibidor, pode-se utilizar, porexemplo, hirudina ou heparina.

O tempo de incubação do plasma e asconcentrações de trombina e do inibidor para bloqueio sãodeterminadas vantajosamente de modo a obter a ativação dacoagulação, resultando na geração de fibrina solúvel sem formarum coágulo de fibrina.

A incubação na presença do ativador decoagulação (trombina) é, de preferência, realizada por um períodode incubação de 2 minutos à temperatura ambiente. O inibidor éentão adicionado em grande excesso para assegurar o bloqueio dacoagulação.

• se ele for a hirudina, esta é utilizadapreferencialmente a uma concentração final de 100 μg/mL parauma concentração final de trombina de 0,18 U/mL;

• se ele for a heparina, esta é utilizada a umaconcentração final de 500 U/mL quando a concentração final detrombina utilizada for 0,18 U/mL.

Em outra implementação vantajosa da invenção,o método de diagnóstico in vitro também compreende otratamento de uma amostra de controle negativo, em especial umplasma de controle negativo. Uma descrição voltada para aspreparações dos referidos controle é apresentada nos exemplos,junto com detalhes complementares.

A avaliação da fibrina solúvel de acordo com apresente invenção emprega uma primeira etapa para degradaçãoda fibrina solúvel por Pa-Fb sp, seguido da medição dos produtosde degradação específicos originados da ação de Pa-Fb sp.

E vital que os resultados do método da invençãosejam obtidos o mais rápido possível, enquanto sendorepresentativos da quantidade de fibrina solúvel presente naamostra. Para esse fim, as condições de uso da Pa-Fb sp devemser determinadas de modo que a degradação da fibrina solúvelseja rápida e não seja acompanhada pela "contaminação" dadegradação do fibrinogênio plasmático circulante, dando origem aprodutos de degradação que interferem nos da fibrina solúvel noensaio.

As doses de Pa-Fb sp a serem utilizadas e operíodo de incubação com o plasma são, dessa forma,selecionados para induzir um aumento no nível dos produtos dedegradação de fibrina, que é maior nos controles positivos, e umaumento praticamente nulo nos controles negativos (isto é,aqueles que não foram sujeitos ao tratamento com um ativador decoagulação).

Vários ativadores da fibrinólise permitindo adegradação específica da fibrina solúvel podem ser utilizados nocontexto da presente invenção. De forma vantajosa, a Pa-Fb ssp éselecionada dentre um grupo constituído pelos ativadores citadosacima, a saber: t-PA ou seus derivados, VPA ou seus derivado eestafiloquinase ou um de seus mutantes. De preferência, utiliza-set-PA ou estafiloquinase, mais preferencialmente t-PA.

Sob as condições em que as amostras sãoincubadas por 15 minutos a 37°C, a concentração final daestafiloquinase testada está na faixa de 1 a 12 μg/mL. Aconcentração final retida é, preferencialmente, de 10 μg/mL. Operíodo de incubação pode ser modificado e sua variação édeterminada em função da natureza e da concentração da Pa-Fbsp utilizada.

O t-PA é preferencialmente usado em uma faixade concentração final de 1 a 2,5 μg/mL. De preferência, o t-PA éusado em uma concentração de 2 μg/mL por um período deincubação de 15 minutos a 37°C.

Em uma implementação específica da invenção,a degradação da fibrina solúvel pelo ativador de plasminogêniosem a degradação do fibrinogênio pode ser bloqueada após adegradação da fibrina solúvel adicionando-se um inibidor deplasmina, por exemplo, aprotinina. Características particularespara o uso de aprotinina ou de outro inibidor da plasmina deforma equivalente são apresentadas nos exemplos. A quantidadede aprotinina utilizada é, por exemplo, equivalente à quantidadede ativador de plasminogênio utilizada. Sendo assim, o inibidorde plasmina é adicionado após 15 minutos de incubação a 37°Ccom o ativador de plasminogênio.

Em uma implementação particular da invenção,antes de adicionar o ativador de plasminogênio, umanticoagulante, tal como uma solução contendo ácido cítrico ecitrato de sódio, pode ser adicionada tanto à amostra ensaiadaquanto às amostras-controle. As quantidades e modo de adição doácido cítrico e do citrato de sódio são indicados nos exemplos.

No contexto da presente invenção, o método dediagnóstico descrito acima é aplicado à investigação da formaçãode um trombo venoso.

Em uma aplicação particular do método dediagnóstico da invenção, o método é realizado para exclusãodiagnostica de uma trombose venosa profunda.Em uma implementação específica da invenção,o método de diagnóstico é realizado para exclusão diagnostica deum embolismo pulmonar.

Em uma implementação particular da invenção,o método é realizado em uma amostra de sangue retirada de umpaciente antes de realizar um tratamento com anticoagulante.

Em princípio, o ensaio da fíbrina solúvel para aexclusão diagnostica de uma trombose venosa deve ser realizadoantes de qualquer tratamento com anticoagulante. Se o pacientefor submetido a tratamento com anticoagulantes, a concentraçãoda fíbrina solúvel se reduz muito rapidamente e atinge valoresnormais. Nos pacientes tratados, a determinação da concentraçãode fíbrina solúvel no plasma pode determinar apenas se oanticoagulante foi eficaz.

Em uma concretização específica do método, oensaio de fíbrina solúvel é realizado usando t-PA como ativadorde plasminogênio.

Outras características da invenção se tornarãovisíveis nos exemplos seguintes e nas figuras.

As Figuras 1 e 2 mostram, respectivamente,uma comparação dos dímeros D e SDF em pacientes comsuspeito de embolismo pulmonar ou com suspeita de trombosevenosa profunda. Em cada caso, os círculos pretos correspondemaos pacientes doentes e os círculos brancos aos pacientes normais.A linha demarca o limite superior do valor normal.

EXEMPLOSExemplo n° 1:

Seleção da concentração de trombina utilizadapara obter um controle de plasma positivo compreendendo fibrinasolúvel:

O plasma de controle positivo foi preparadousando o seguinte protocolo:

Plasma normal 200 μL.

Trombina humana (Stago, ref 00896), 0,5 a 1U/mL (dependendo do plasma utilizado) 20 μL,

Incubação por 2 min à temperatura dolaboratório.

Hirudina(Knoll) 100 μg/mL (concentraçãofinal)

ou

Heparina(Choay) 5000 IU/mL (concentraçãofinal) 20 μL.

Para verificar:

• se não há formação de coágulo no tubo;

• se um teste de detecção de fibrina solúvelcomercial é positivo (por exemplo, o teste FS da StagoLaboratories).

<table>table see original document page 18</column></row><table>Exemplo n° 2

Determinação da quantidade de Pa-Fb sp a serutilizada sob condições de incubação definidas

Para realizar o método da invenção, aquantidade de ativador a ser adicionada à amostra de teste deveset tal que induza a geração de muitos dímeros D no plasma decontrole positivo conforme obtido no exemplo n° 1, com umageração insignificante de dímeros D no plasma de controlenegativo (controle não tratado com trombina).

Dessa forma, realizou-se a incubação dosplasmas-controle e dos plasmas de controle positivo (n = 21) comdiferentes doses de Pa-Fb sp por 15 minutos a 37°C. Ao términodo período de incubação, os dímeros D foram determinados peloteste Lia ou por ELISA rápida (D-Di Stago) (incubação por 15minutos a 37°C com anticorpo de captura e 15 minutos a 37°Ccom anticorpo revelador).

Os resultados mostrados na Tabela II foramobtidos com o teste ELISA

Resultados substancialmente análogos foramobtidos com o teste Lia (n = 5).

Tabela II: Degradação da fibrina solúvel peloaumento das quantidades de t-PA e SAK.

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>

*fibrina solúvel = Nível de dímeros D após a

adição de t-PA ou estafiloquinase - dímeros D de base antes daadição de t-PA ou estafiloquinase.

A dose selecionada de Pa-Fb sp é a que produz:

• um aumento de <300 μg/mL em plasmas decontrole não tratado (controles negativos);

• o maior aumento nos plasmas de controlepositivo.

Com base nesses resultados, sucede-se que asconcentrações finais preferidas de Pa-Fb sp a serem utilizadassão:

• 2 μg/mL, para t-PA: sob essas condições, adose de t-PA que pode ser neutralizada pelos inibidores doativador de plasminogênio (POI) é desprezível;

• 10 μg/mL para doses menores de SAKinduziram degradabilidade insatisfatória da fibrina solúvel emcertos pacientes ou em certos controles positivos, maisprovavelmente devido à presença de anti-estafíloquinase naamostra, anti-estafíloquinase esta que pode aparecer após ainfecção por estafílococos).

Exemplo n°3: Ensaio de dímeros D e fibrinasolúvel

Na investigação, os dímeros Dea fibrinasolúvel foram ensaiados em 87 pacientes consecutivosconsultados em unidades emergenciais com suspeito de trombosevenosa e/ou embolismo pulmonar e que não receberam tratamentoprévio. Nesses pacientes, uma investigação por ultra-som foirealizada para diagnosticar tromboses venosas profundas; umacintigrafia ou angiografla pulmonar foi realizada para diagnosticarembolismo pulmonar. Os níveis de dímeros D e de fibrinasolúvel degradável (SDF) foram determinados antes de se iniciaro tratamento com anticoagulantes. Foi demonstrado que asensibilidade do ensaio da fibrina solúvel degradável foi similar àdo ensaio de dímeros D (96% para dímeros D e para fibrinadegradável solúvel). Curiosamente, os "falsos negativos" para osníveis de dímeros D e fibrina degradável solúvel foramobservados em diferentes pacientes. Portanto, combinar os doistestes poderia aumentar a sensibilidade do diagnóstico datrombose (100%). Além do mais, a especificidade da fibrinadegradável solúvel no diagnóstico de doenças venosastromboembólicas é maior (86% e 87%, respectivamente, para oembolismo pulmonar e para a trombose venosa profunda) do quea dos dímeros D (36% e 42%, respectivamente, para o embolismopulmonar e a trombose venosa profunda).

Observou-se rápida normalização da fibrinadegradável solúvel em pacientes sob tratamento comanticoagulantes a uma dose terapêutica. Assim que o tratamentocom anticoagulantes foi instituído, houve queda no nível defibrina solúvel. Como resultado, a fibrina degradável solúvel nãopode ser usada como teste de diagnóstico em pacientes já tratadoscom anticoagulantes. Entretanto, a fibrina degradável solúvelpode ser útil para monitorar o tratamento com anticoagulantes.Em conclusão, é indicado que o nível de fibrina degradávelsolúvel, em associação com o dos dímeros D, é um meio clínicoútil para prognosticar ou descartar o embolismo pulmonar e/ou atrombose venosa profunda.

A fibrina solúvel está presente durante aativação da coagulação. Seu aumento é observado desde osestágios iniciais da referida ativação.

No estado da técnica, diversos testes já foramdesenvolvidos para avaliar a fibrina solúvel em pacientesapresentando uma trombose, mas, por causa da variabilidade nosresultados dos testes disponíveis, a importância da determinaçãoda fibrina solúvel em um diagnóstico excluindo doenças venosastromboembólicas ainda não tinha sido estabelecida (1-21).

O objetivo do presente estudo é o de avaliar apossível utilização de um novo teste baseado na determinação donível de fibrina degradável solúvel que seja simples, rápido,sensível e altamente específico para os polímeros de fibrinasolúvel plasmática.

Esse teste se baseia na avaliação dos dímeros Dgerados após a incubação do plasma com t-PA sob condições queinduzem a degradação da fibrina solúvel, mas que não induzem adegradação do fibrinogênio plasmático. Dessa forma, esse testefoi chamado de teste de fibrina degradável solúvel (SDF). Defato, apesar do pequeno número de monômeros de fibrina nafibrina solúvel, os monômeros de fibrina são reticulados uns aosoutros porque a ativação do fator XIII coincide com a liberaçãodo fibrinopeptído A, e além disso, a ativação do fator XIII pelatrombina é acelerada pela presença da fibrina (22). A fibrinadegradável solúvel foi selecionada a partir de marcadores para ageração da trombina in vivo, tal como o fibrinopeptídeo A (ΗΡΑ,meia-vida 3 minutos (23) ou o complexo trombina-antitrombina(TAT, meia-vida 15 minutos (24)), pois sua medição pode sermais sensível já que é menos sensível a anomalias de medição.

O presente estudo foi realizado com o intuito deavaliar o desempenho do teste de diagnóstico baseado em umacombinação dos níveis de dímeros D e da fibrina solúveldegradável em pacientes consecutivos não tratados com suspeitaclínica de embolismo pulmonar (n = 38) ou trombose venosaprofunda (n = 49) levados a unidades emergenciais de 3 centrosdiferentes. No caso de suspeito de trombose venosa profunda, odiagnóstico foi confirmado pelo exame da compressão com ultra-som; um diagnóstico de embolismo pulmonar foi confirmadotanto por cintigrafia como por angiografía pulmonar. O valorlimite para a fibrina degradável solúvel para um teste que foiconsiderado positivo foi 300 ng/mL.

Neste estudo, com o objetivo de analisar osefeitos da anticoagulação, os perfis da mudança da fibrinadegradável solúvel e dos dímeros D também foram examinadosnos pacientes sofrendo de embolismo pulmonar e/ou trombosevenosa profunda, após iniciar o tratamento com anticoagulantes,para testar a eficácia da terapia na doença tromboembólica.

Método e aparelho

Amostras de plasma: O sangue foi coletado emcitrato 0,13 M (1 parte de citrato por 9 partes de sangue). Apóscentrifugação a 2500 g por 15 minutos, o plasma foi coletado econgelado a -20°C até o uso.

No entanto, quando o nível de fibrinadegradável solúvel estava muito alto, como acontece nacoagulação intravascular (CID), a fibrina degradável solúvel podeformar um complexo insolúvel durante as etapas de congelamentoe degelo, e como conseqüência, recomenda-se que esse teste sejarealizado com plasma recém-coletado.

O sangue foi obtido de voluntários saudáveis oude pacientes de ambulatório que tinham se apresentado a unidadesde emergência. Os pacientes que receberam um tratamento comanticoagulantes foram considerados apenas para monitoração. Apopulação de pacientes consistia de pacientes consecutivosapresentando sinais clínicos de embolismo pulmonar ou trombosevenosa profunda que tinham sido diagnosticados por análise deultra-som da compressão das veias proximais da perna, porcintigrafia pulmonar e por angiografía pulmonar para verificar odiagnóstico.

Testes biológicos

Determinação dos dímeros D

Os dímeros D foram medidos por aglutinação demicropartículas de látex revestidas com anticorpos monoclonaiscontra dímeros D usando o teste Lia (Diagnostica Stago) em umaparelho STA ou por ELISA utilizando-se VIDAS (bio-Mérieux).

Medição da fibrina degradável solúvel:realizada em 3 etapas

1 - degradação da fibrina: 20 μΙ. de t-PA, 20μg/ml (plasma tratado) ou 20 μΐ, de soro fisiológico (plasma nãotratado) foram adicionados a 200 μΐ, de plasma. Após incubaçãopor 15 minutos a 37°C, a plasmina gerada foi bloqueadaadicionando-se 20 μL de aprotinina (Pentapharm), 12,5 TIU/mL.

2- A concentração de dímeros D foi entãodeterminada usando o teste de dímeros D Lia-test da DiagnosticaStago.

3- O nível de fibrina degradável solúvel foicalculado como a diferença entre a concentração de dímeros D noplasma tratado e aqueles presentes no plasma não tratado.

Quando o nível de dímeros D no plasma foimaior do que 4000 ng/mL, a amostra foi diluída após a etapa dedegradação.A fibrina solúvel usada como controle positivofoi obtida por incubação do plasma normal com pequenas dosesde trombina por um curto período, após o que a trombina foibloqueada com heparina.

O plasma da amostra a ser testada, e também ocontrole positivo e o controle negativo para ensaiar a fibrinasolúvel, foram ensaiados da forma apresentada na Tabela III.

TABELA III

<table>table see original document page 26</column></row><table> A adição de aprotinina bloqueou a plasmina emum tempo predeterminado, levando à degradação da fibrinasozinha e não do fibrinogênio.

• os controles positivos e negativos foramreconstituídos com ACd, isto é, AC diluído em 1:5.

Preparação do AC:

Ácido cítrico, H2O MWt = 210,14 0,16 g

Citrato trissódico, 2 H2O MWt = 294,10 0,44 g

H2O 20 mL

Resultados

Especificidade das medições• Em voluntários saudáveis normais (n = 180),o nível de fibrina solúvel foi muito pequeno, de 300 ng/mL ouinferior.

• Além disso, não houve correlação entre aconcentração plasmática de fibrina solúvel e a dos dímeros D,uma vez que, após tratar os pacientes com heparina, aconcentração de fibrina caiu muito rapidamente, enquanto que aconcentração de dímeros D caiu muito mais lentamente, poisreflete a degradação do coágulo que persiste após o bloqueio daativação da coagulação.

Níveis de dímeros D e nível de fibrina solúvelem pacientes com suspeita de doença venosa tromboembólica ouembolismo pulmonar

Em voluntários saudáveis normais (n = 180):O valor médio foi de 80 ± 106 ng/mL e dos 180voluntários testados, 140 tiveram um nível não detectável defibrina degradável solúvel. O valor limite considerado para umteste positivo foi de 300 ng/mL.

Em pacientes com suspeita de embolismopulmonar ou trombose venosa profunda

Dos 38 pacientes com suspeita de embolismopulmonar, 23 eram positivos de acordo com a análise de imagense de 49 com suspeita de trombose venosa profunda, 25 erampositivos, de acordo com a observação da compressão anormaldas veias proximais da perna em ultra-som.Dos dois grupos de pacientes, aqueles queapresentavam embolismo pulmonar (n = 23) ou uma trombosevenosa profunda (25), dois tinham contagens de fibrina solúvelque também eram falsos negativos, um do grupo apresentandoembolismo pulmonar (confirmado por angiografia) e o outro nogrupo de pacientes apresentando trombose venosa profunda(confirmado por ultra-som); no entanto, esses dois pacientestinham níveis de dímeros D bem maiores do que o valor limite de500 ng/mL. Em contrapartida, os níveis de dímeros D eramnormais (<500 ng/mL) em 2 pacientes (um do grupo comembolismo pulmonar e o outro no grupo de pacientesapresentando trombose venosa profunda), enquanto que os níveisde fibrina degradável solúvel eram > 300 ng/mL. Esses níveis dedímeros D que eram falsos negativos foram observados quando onível de dímeros D foi determinado pelo teste Lia® ou pelo testeVidas®.

Com uma combinação de dímeros D e fibrinasolúvel, não foram detectados falsos negativos nos valoresbiológicos.

Os índices de pertinência (sensibilidade,especificidade, valor preditivo positivo e negativo) para osdímeros D e para a fibrina solúvel degradável foram calculados.

TABELA III: Sensibilidade, especificidade,valor preditivo positivo e negativo dos dímeros D e da fibrinadegradável solúvel<table>table see original document page 29</column></row><table>

VPN = valor preditivo negativo

EP = embolismo pulmonar

TVP = trombose venosa profunda

SDF = fibrina degradável solúvel

Alteração nos níveis de dímeros D e fibrinadegradável solúvel em pacientes sob tratamento de anticoagulação

Observou-se rápida normalização da fibrinadegradável solúvel em pacientes sob heparina não fracionada ousob heparina de baixo peso molecular administrada em uma doseterapêutica. Após o primeiro dia, os níveis de fibrina degradávelsolúvel estavam normais ou no limite superior do normal. Aanálise diária dos níveis mostrou que a fibrina degradável solúvelpermaneceu dentro dos parâmetros normais durante o tratamentocom heparina. Em contrapartida, os níveis de dímeros Dreduziram lentamente e os níveis não atingiram níveis normaisdurante o tratamento com heparina. Em um paciente, a fibrinasolúvel foi aumentada ainda mais durante o tratamentoterapêutico, indicando um efeito terapêutico insuficiente.

DiscussãoHá a necessidade de uma ferramenta dediagnóstico não invasiva adequada para o diagnóstico doembolismo pulmonar e/ou da trombose venosa profunda quepossa permitir a tomada de uma decisão imediata na maioria doscasos quanto ao tratamento a ser dado.

O presente estudo visou determinar se acombinação de dímeros D e fibrina degradável solúvel poderia serútil para o diagnóstico do embolismo pulmonar e/ou da trombosevenosa profunda e para avaliar a eficiência de um tratamento deanticoagulação para inibir a trombogênese.

Quanto à sensibilidade das medições noembolismo pulmonar e na trombose venosa profunda: Os 2pacientes apresentando resultados falsos negativos relacionadosao nível de dímeros D (um do grupo com embolismo pulmonar eo outro do grupo de pacientes apresentando trombose venosaprofunda) tinham níveis de fibrina degradável solúvel muitomaiores que o limite superior do valor limite. Isso pode terocorrido por causa de uma estrutura de coágulo de fibrinaanormal (congênita ou adquirida), tornando os coágulosanormalmente resistentes à fibrinólise. Essa anomalia poderiacontribuir diretamente para um risco maior de trombose devido àtrombólise imperfeita.

Essa hipohibrinólise pode explicar os 3% a 5%de casos de "falsos negativos" para dímeros D em pacientesapresentando uma trombose constituída. Ao determinar a fibrinadegradável solúvel, a fibrina já está imediatamente acessível ásenzimas flbrinolíticas. Já a fibrina do trombo, quando formada defibrinas finas e muito rígidas é menos acessível às enzimasflbrinolíticas, explicando os 3% a 5% de falsos negativos dosdímeros D observados nas tromboses. Os níveis negativosrelativos à fibrina degradável solúvel foram detectados em doispacientes (um do grupo apresentando embolismo pulmonar e ooutro no grupo de pacientes apresentando trombose venosaprofunda), enquanto que o nível de dímeros D nesses doispacientes foi maior do que 500 ng/mL. Isso poderia indicar que atrombogenicidade é um processo não evolutivo, uma vez que aatividade da trombina é transitória.

Os inventores demonstraram que umacombinação dos dois testes (fibrina solúvel degradável e dímerosD) pode ser utilizada para distinguir um diagnóstico deembolismo pulmonar da trombose venosa profunda em pacientes.

Na maioria dos casos, os dímeros D plasmáticossatisfazem aos critérios exigidos para um diagnóstico doembolismo pulmonar e da trombose venosa profunda, pois sãomarcadores sensíveis para a trombose, mas carecem deespecificidade (26-35).

Atualmente, está bem estabelecido que osdímeros D não podem ser usados para realizar um diagnósticopositivo de doenças venosas tromboembólicas, uma vez que oteste não é específico o suficiente. No entanto, quando o nível dedímeros D é normal, o diagnóstico da doença tromboembólicapode ser efetuado em 95% dos pacientes.Neste estudo, foi demonstrado que aespecificidade da fibrina solúvel é muito superior a dos dímerosD. Essa baixa especificidade para as medições de dímeros D nodiagnóstico de doenças venosas tromboembólicas pode ser devidoà degradação das enzimas fibrinolíticas locais da fibrina presentenos tecidos. Os produtos da degradação da fibrina solúvelformada localmente nos tecidos se difunde no sangue por causade seu peso molecular relativamente baixo. Isso é reforçado pelaobservação de que o nível de dímeros D é geralmente alto nospacientes com doenças inflamatórios.

Neste estudo, também foi demonstrado que onível de fibrina degradável solúvel é aumentado em eventostrombóticos; porém, assim que os tratamentos anticoagulantes sãoadministrados, a concentração de fibrina degradável solúveldiminui a um valor normal em poucas horas. Isso indica que osfármacos anticoagulantes são capazes de bloquear de maneiraeficaz o processo trombótico. A persistência do nível elevado dedímeros D se deve à degradação do trombo formado antes dotratamento anticoagulante. Como conseqüência, propomos que adeterminação da fibrina degradável solúvel para seguir a eficáciado tratamento anticoagulante ou teste a eficácia ou testar aeficácia de novos fármacos antitrombóticos seja de importância.

Em conclusão, os resultados desse estudoindicam que a determinação da fibrina degradável solúvel emassociação com a dos dímeros D pode ser considerada um recursoclínico útil para o diagnóstico da trombose venosa profunda e doembolismo pulmonar, e também de outros eventos trombóticos.Ademais, sugere-se que a fibrina degradável solúvel pode ser útilna monitoração dos efeitos de um tratamento anticoagulante.

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Claims (17)

1. Método in vitro para o diagnóstico daativação da coagulação partindo de uma amostra de sangueremovida de um paciente, caracterizado por compreender:i) medir a quantidade de produtos de degradaçãoda fibrina contidos na amostra de teste, consistindo da medição daquantidade de dímeros D presentes na amostra e da constituiçãodo nível de base dos dímeros D;ii) tratar a amostra por incubação com umativador de plasminogênio com alta afinidade pela fibrina (Pa-Fbsp) sob condições que permitem a degradação da fibrina solúvelcontida na amostra em produtos de degradação sem resultar nadegradação do fibrinogênio, e medir a quantidade de dímeros Dcontidos na amostra tratada;iii) calcular a diferença entre a quantidade dedímeros D medida após a ativação pelo ativador Pa-Fb sp na etapaii) e a quantidade de dímeros D antes da referida ativação medidana etapa i), a referida diferença constituindo o grau de degradaçãoda fibrina solúvel (SDF);iv) comparar o nível de dímeros D medido naetapa i) com um valor limite normal determinado para o referidoproduto de degradação e comparar o nível de SDF calculado naetapa iii) com um valor limite normal determinado para o SDF;o risco de doença tromboembólica existindo sepelo menos um dos níveis de dímeros D medidos na etapa i) ou onível calculado de SDF for maior do que o respectivo valornormal determinado, e o referido risco sendo descartado quando onível de dímeros D obtido na etapa i) e o nível de SDF obtido naetapa iii) forem menores que os respectivos valores limitenormais.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por ser para a investigação de uma doença venosatromboembólica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1ou 2, caracterizado por ser aplicado à investigação da formação de um trombo venoso.

4. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para o diagnóstico deuma trombose venosa profunda.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para o diagnóstico deum embolismo pulmonar.

6. Método de diagnóstico, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato deque a amostra de sangue é uma amostra de plasma.

7. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a amostra desangue é a de um paciente sendo beneficiado por uma terapiaanticoagulante.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o ativador deplasminogênio Pa-Fb sp é t-PA.

9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a degradaçãode fibrinogênio é impedida pela adição de um inibidor deplasmina.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o inibidor de plasmina é aaprotinina, que é adicionada após incubar a amostra por 15minutos a 37°C com o ativador de plasminogênio Pa-Fb.

11. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que antes daincubação da amostra com o ativador de plasminogênio Pa-Fb,um anticoagulante, tal como uma composição de ácido cítrico ecitrato trissódico, é adicionado à amostra.

12. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, caracterizado por adicionalmentecompreender ensaiar os produtos de degradação da fíbrina solúvelem uma amostra de controle negativo e em uma amostra decontrole positivo.

13. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os dímeros Dsão medidos usando um anticorpo monoclonal anti-dímeros D.

14. Método de diagnóstico, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado poradicionalmente compreender medir a SDF presente em umaamostra de controle positivo constituída por uma amostra deplasma normal por meio de etapas que compreendem:i) incubar uma amostra de plasma com umativador de coagulação para permitir a formação de flbrinasolúvel sem formar um coágulo de fibrina, o ativador sendo, porexemplo, uma pequena quantidade de trombina para induzir aformação de fibrina solúvel;ii) incubar a amostra tratada com um inibidor decoagulação em uma quantidade suficiente para bloquear acoagulação, o inibidor sendo heparina ou hirudina, por exemplo;iii) colocar a amostra preparada compreendendoo monômeros de fibrina solúvel em contato com um ativador deplasminogênio com alta afinidade pela fibrina (Pa-Fb sp),especialmente t-PA, sob condições que permitem a degradação dafibrina solúvel contida na amostra em seus produtos dedegradação, especialmente dímeros D, sem degradar ofibrinogênio.

15. Método de diagnóstico, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato deque o valor limite normal para a quantidade de dímeros D é de500 ng/mL e o valor limite normal para SDF é de 300 ng/mL, umdiagnóstico descartando doenças tromboembólicas sendo feitoquando os valores medidos da amostra de teste forem menores doque os dois respectivos valores limite.

16. Kit para o diagnóstico de doençastromboembólicas usando um método de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender:• anticorpos monoclonais anti-dímeros D;• um ativador de plasminogênio com altaespecificidade para fibrina (Pa-Fb sp);• uma amostra de controle positivo para fibrinasolúvel e, caso convenha, uma amostra de controle negativo.

17. Kit, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado por adicionalmente compreender um inibidor deplasmina.