BRPI0711470A2 - peptìdeo antimicrobiano, composição antimicrobiana/ farmacêutica, produto, uso do peptìdeo antimicrobiano, da composição farmacêutica ou do produto, e, método para tratar um mamìfero apresentando uma infecção ou doença microbiana para tratamento profilático - Google Patents

Abstract

PEPTìDEO ANTIMICROBIANO, COMPOSIçãO ANTIMICROBIANA/FARMACêUTICA, PRODUTO, USO DO PEPTìDEO ANTIMICROBIANO, DA COMPOSIçãO FARMACêUTICA OU DO PRODUTO, E, MéTODO PARA TRATAR UM MAMìFERO APRESENTANDO UMA INFECçãO OU DOENçA MICROBIANA PARA TRATAMENTO PROFILáTICO. A invenção refere-se a um peptídeo antimicrobiano compreendendo um primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresentando um comprimento de cerca de 2 a cerca de 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos ligados à extremidade amino ou carbóxi-terminal e um segundo conjunto compreendendo de 3 a 8 radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogo dos mesmos, sendo que referido peptídeo apresenta uma atividade antimicrobiana.

Description

"PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO, COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA/ FARMACÊUTICA, PRODUTO, USO DO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO, DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU DO PRODUTO, E, MÉTODO PARA TRATAR UM MAMÍFERO APRESENTANDO UMA INFECÇÃO OU DOENÇA MICROBIANA PARA TRATAMENTO PROFILÁTICO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um peptídeo antimicrobiano compreendendo um primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresentando um comprimento de cerca de 2 a cerca de 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos ligado à extremidade amino- ou carbóxi-terminal e um segundo conjunto compreendendo de 3 a 8 radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos, sendo que referido peptídeo apresenta uma atividade antimicrobiana.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Diversas infecções são combatidas com êxito pelo sistema imune de um mamífero, como um ser humano. No entanto, em alguns casos, bactérias, fungos, ou vírus nem sempre são eliminados, o que pode causar infecções agudas localizadas ou generalizadas. Esta é uma preocupação séria em unidades de tratamento intensivas, perinatais ou de queimados, e em indivíduos imunocomprometidos. Infecções agudas localizadas dão origem a morbidez extensiva. Por exemplo, Pseudomonas aeruginosa é uma causa importante de queratite bacteriana grave e a infecção é difícil de tratar com êxito com os agentes antimicrobianos correntes. Em, outros casos, uma persistência bacteriana contínua em superfícies epiteliais pode causar ou agravar doença crônica. Em humanos, isto é exemplificado por úlceras crônicas da pele, dermatite atópica e outros tipos de eczema, acne, ou infecções genitourinárias. Por exemplo, existe agora uma evidência considerável de que a colonização ou infecção com a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus é um fator disparador ou exacerbador na dermatite atópica. Aproximadamente 90% de todos os pacientes são colonizados ou infectados por S. aureus enquanto que apenas 5% dos indivíduos saudáveis abrigam aquela bactéria. Ulceras crônicas são colonizadas ou infectadas por diversas bactérias, como P. aeruginosa, e S. aureus, levando ao retardo da cura destas úlceras.

Infecções sintomáticas podem ser tratadas com diversas drogas. Algumas doenças também podem ser combatidas com, por exemplo, vacinas. No entanto, vacinas nem sempre são a melhor opção de tratamento e, para determinados microorganismos, nenhuma vacina encontra-se disponível. Quando nenhuma proteção está disponível, prossegue-se com o tratamento da doença. Freqüentemente o tratamento é realizado por meio do uso de um agente antibiótico, que mata o micróbio. No entanto, durante os últimos anos vários micróbios se tornaram resistentes contra agente antibióticos. Da forma mais provável, problemas de resistência aumentarão no futuro próximo. Adicionalmente, diversos indivíduos desenvolveram alergia contra o agente antibiótico, reduzindo com isso a possibilidade de usar eficazmente determinados agentes antibióticos.

Superfícies epiteliais de diversos organismos são expostos continuamente a bactérias. Durante os anos mais recentes, com base em peptídeos antibacteriânos, atribuiu-se ao sistema imunológico inato importantes papéis na eliminação inicial de bactérias em limites biológicos suscetíveis a infecção (Lehrer, R. L, e Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11: 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16). Geralmente considera-se que peptídeos antimicrobianos matam bactérias ao permearem suas membranas, e, assim, a falta de um alvo microbiano molecular específico minimiza o desenvolvimento de resistência.

Diversas proteínas e peptídeos antimicrobianos, não relacionados aqui, peptídeos descritos são conhecidos na técnica. A US 6.503.881 revela peptídeos catiônicos que são um análogo de indolicidina a ser usados como um peptídeo antimicrobiano. Os peptídeos catiônicos são derivados de diferentes espécies, incluindo animais e plantas.

A US 5.912.230 revela peptídeos antifungicos e anti- bacterianos à base de histatina. Os peptídeos baseiam-se em porções definidas das seqüências de aminoácidos de histatinas humanas naturalmente ocorrentes e métodos para tratamento de infecções fungicas e bacterianas.

A US 5.717.064 revela peptídeos líticos ricos em lisina metilada. Os peptídeos líticos são resistentes a digestão tríptica e não-naturais. Os peptídeos líticos são vantajosos para administração in vivo.

A US 5.646.014 revela um peptídeo antimicrobiano. O peptídeo foi isolado de uma fração antimicrobiana do hemolinfa do bicho-da- seda. O peptídeo apresenta excelente atividade antimicrobiana contra várias cepas bacterianas, como Escherichia eoli, Staphylococcus aureus e Baeillus eereus.

W02004016653 revela um peptídeo baseado na seqüência de 20-44 da azurocidina. O peptídeo contém uma estrutura em alça ligada por pontes dissulfeto.

A US 6495516 e patentes relacionadas revelam peptídeos baseados na proteína incrementadora de permeabilidade/atividade bactericida de proteína bactericida com 55 kDa (BPI, baeterieidal/permeability inereasing). Os peptídeos exerceram efeitos antimicrobianos e também apresentaram capacidade neutralizadora de LPS.

WO 01/81578 revela numerosas seqüências que codificam polipeptídeos relacionados com receptor de proteína acoplado com G, que podem ser usados para numerosas doenças.

Presentemente, conhece-se mais de 700 diferentes seqüências de peptídeos antimicrobianos (www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm). incluindo cecropinas, defensinas magaininas e catelicidinas.

Embora haja um número relativamente grande de peptídeos antimicrobianos disponíveis hoje em dia, ainda há uma grande necessidade de novos peptídeos antimicrobianos aperfeiçoados, que possam ser usados para combater micróbios, micróbios que são resistentes ou tolerantes a agentes antibióticos e/ou outros agentes antimicrobianos. O mais importante é que há uma necessidade de novos peptídeos antimicrobianos, que são não- alergênicos quando introduzidos em mamíferos, como seres humanos.

Devido às potenciais propriedades líticas e outras de AMPs contra membranas bacterianas e também mamíferas, um dos desafios no projeto de novos peptídeos baseia-se no desenvolvimento de AMPs com elevada especificidade contra microorganismos, como células bacterianas ou fungicas, i.e., um alto índice terapêutico (concentração hemolítica mínima/atividade antimicrobiana mínima; MHC/MEC).

Várias bactérias, como P. aeruginosa, E. faecalis, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes e S. aureus secretam proteases que degradam diversos peptídeos antimicrobianos, como a catelicidina LL-37. Assim, peptídeos antimicrobianos resistentes a protease são vantajosos de um ponto de vista terapêutico. Adicionalmente, muitos dos peptídeos antimicrobianos não são muito eficientes na exposição de microorganismos, como bactérias, p. ex., S. aureus e P. aeruginosa, que freqüentemente desempenham papéis-chaves em patogêneses problemáticas, e precisam ser otimizados para mostrar um efeito maior.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a peptídeos antimicrobianos novos aperfeiçoados apresentando uma atividade antimicrobiana incrementada em comparação com o peptídeo correspondente. Surpreendentemente, verificou- se que são necessários números específicos de aminoácidos para aumentar a atividade antimicrobiana, i.e., se houver menos de 3 ou mais de 8 radicais de aminoácidos a atividade antimicrobiana é diminuída. A abordagem é particularmente vantajosa para peptídeos hidrofílicos, altamente carregados positivamente, porque estes são altamente disruptivos da membrana. Pode ser que modificando o peptídeo com um ou vários aminoácidos hidrofóbicos, sua capacidade de ligação com a(s) membrana(s) lipídica(s) de bactérias seja incrementada, e a resultante maior ligação de peptídeo resulta em maior formação de defeitos da membrana do microorganismo, e em maior mortalidade do microorganismo. No entanto, isto é apenas uma teoria, e o modo de ação pode ser diferente ou pode ser uma combinação de diferentes modos de ação.

Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um peptídeo antimicrobiano compreendendo um primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresentando um comprimento de cerca de 2 a cerca de 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos ligado à extremidade amino- ou carbóxi-terminal e um segundo conjunto compreendendo de 3 a 8 radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos, sendo que referido peptídeo obtém uma atividade antimicrobiana ou uma maior atividade antimicrobiana.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição antimicrobiana/farmacêutica compreendendo o peptídeo antimicrobiano e um diluente, veículo, adjuvante, excipiente ou tampão aceitável.

Em um aspecto adicional a invenção também se refere a um produto compreendendo referido peptídeo antimicrobiano, sendo que o mesmo é selecionado do grupo que consiste de bandagens, emplastros, suturas, sabão, tampões, fraldas, xampus, dentifrício, compostos anti-acne, cremes solares, produtos têxteis, revestimento de cateteres e agulhas, lentes de contato, adesivos, incorporados em curativos de feridas, soluções limpadoras ou implantes.

Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso do peptídeo antimicrobiano ou à composição antimicrobiana/farmacêutica ou o produto na terapia ou diagnóstico.

Em um aspecto final, a invenção refere-se ao uso do peptídeo antimicrobiano, composição antimicrobiana/farmacêutica ou um produto compreendendo referido peptídeo antimicrobiano para a fabricação de uma droga para o tratamento de uma doença ou antimicrobiana, causada por um microorganismo selecionado do grupo que consiste de bactérias, vírus, parasitas, fungo e levedura.

Proporcionando-se referidos peptídeos antimicrobianos, os riscos de reações alérgicas a peptídeos antimicrobianos podem ser reduzidos devido ao fato de que os peptídeos podem ser derivados da seqüência de polipeptídeo de proteínas endógenas e/ou peptídeos ou apresentando uma composição similar de radicais de aminoácidos. Com o uso de peptídeos curtos, aumenta-se a estabilidade do peptídeo e reduz-se os custos de produção, em comparação com proteínas e peptídeos mais longos, sendo que a invenção pode ser economicamente vantajosa.

Os peptídeos da invenção proporcionam composições que facilitam prevenção, redução ou eliminação eficiente de microorganismos. Com isto, pode aumentar a possibilidade de combater microorganismos, que são resistentes ou tolerantes contra os agentes antibióticos. Além disso, é possível tratar mamíferos, que são alérgicos contra agentes antimicrobianos comercialmente obteníveis. Proporcionando composições

antimicrobianas/farmacêuticas, que são derivadas de proteínas endógenas aperfeiçoadas, a probabilidade de um mamífero desenvolver alergia contra estes peptídeos particulares pode ser reduzida ou mesmo eliminada. Isto torna as composições antimicrobianas/farmacêuticas úteis para diversas aplicações em que as composições antimicrobianas/farmacêuticas contactam um mamífero, seja como uma droga ou como um aditivo para prevenir infecções.

Adicionalmente, o uso de peptídeos curtos pode melhorar a biodisponibilidade. Adicionalmente, o uso de peptídeos estruturalmente distintos com ações específicas ou preferíveis sobre fungos ou bactérias Gram-negativas e Gram-positivas permite a objetivação específica de diversos microorganismos, minimizando desta forma o desenvolvimento de resistência e de problemas ecológicos. Usando peptídeos de suplemento, que são comparáveis a peptídeos já existentes no mamífero, diminui-se adicionalmente o risco de pressão ecológica adicional por parte de antibióticos inéditos. Por fim, estas formulações também podem aumentar o efeito de peptídeos antimicrobianos endógenos ou de análogos dos mesmos.

Os peptídeos antimicrobianos inventivos aumentam a lista de agentes antimicrobianos, que auxiliam na escolha para prevenir, reduzir ou eliminar microorganismos em todo o tipo de aplicações incluindo, embora sem limitação, aqueles que invadem ou infectam mamíferos, como o ser humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

No contexto do presente pedido e invenção, aplicam-se as definições a seguir:

O termo "seqüência nucleotídica" deve significar uma seqüência de dois ou mais nucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser de cDNA, RNA, DNA genômico, de origem semissintética ou sintética, ou uma mistura dos mesmos. O termo inclui formas de RNA ou DNA de filamento simples e duplo.

O termo "composição antimicrobiana" deve significar qualquer composição contendo os peptídeos inventados de acordo com a invenção, como composições antimicrobianas ou farmacêuticas úteis para combater microorganismos, que atacam mamíferos e também composições compreendendo um ou mais agentes antimicrobianos adicionais, como antibióticos e também outros agentes. O termo "substituído" deve significar que um radical de aminoácido é substituído por outro radical de aminoácido.

O termo "análogos do mesmo" deve significar que parte de, ou todo o peptídeo se baseia em radicais de aminoácidos não-protéicos (sintéticos ou semissintéticos), como ácido aminoisobutírico (Aib)5 ácido norvalina gama-aminobutírico (Abu) ou ornitina. Exemplos de outros radicais de aminoácidos não-protéicos podem ser encontrados em http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polvam/po00008.htm.

O termo "removido" deve significar que pelo menos um radical de aminoácido foi removido, i.e., liberado do polipeptídeo sem ser substituído por outro radical de aminoácido.

O termo "homologia" deve significar que a homologia global do polipeptídeo, não devendo ser confundido com a expressão "similaridades" significando que radicais de aminoácidos específicos pertencem ao mesmo grupo (i.e. hidrofóbico, hidrofílico), ou "identidade", significado que radicais de aminoácidos são idênticos.

O termo "ligado" deve significar "ligado" com ligações covalentes ou químicas.

O termo "peptídeo antimicrobiano" deve significar um peptídeo, que previne, inibe, reduz ou destrói um microorganismo. A atividade antimicrobiana pode ser determinada por meio de qualquer método, como o método no EXEMPLO 1.

O termo "anfifático" deve significar a distribuição de radicais de aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos ao longo de faces opostas de uma estrutura de hélice a, filamento β, linear, circular, ou outra conformação secundária, e também ao longo da estrutura primária do peptídeo, que resultam em um ou vários domínios da molécula serem carregados predominantemente e hidrofílico e o outro sendo predominantemente hidrofóbico. O termo "catiônico" deve significar uma molécula, que apresenta uma carga positiva pura dentro da faixa de pH de cerca de 2 a cerca de 12, como dentro da faixa de cerca de 4 a cerca de 10.

O termo "microorganismo" deve significar qualquer microorganismo vivo. Exemplos de microorganismos são bactérias, fungos, vírus, parasitas e leveduras.

O termo "agente antimicrobiano" deve significar qualquer agente, que previne, inibe ou destrói a vida de micróbios. Exemplos de agentes antimicrobianos podem ser encontrados na obra The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy (32a edição, Antimicrobial Therapy, Inc, E.U.A.).

No presente contexto, nomes de aminoácidos e nomes de átomos são usados como definido pelo Protein DataBank (PNB) (www.pdb.org), que se baseia na nomenclatura IUPAC (IUPAC, Nomenclatura e Simbolismo para Aminoácidos e Peptídeos (nomes de radicais, nomes de átomos etc.), Eur J Bioehem., 138, 9-37 (1984) em conjunto com suas correções em Eur J Bioehem., 152, 1 (1985). O termo "aminoácido" deve indicar um aminoácido do grupo que consiste de alanina (Ala ou A), cisteína (Cys ou C), ácido aspártico (Asp ou D), ácido glutâmico (Glu ou E), fenilalanina (Phe ou F), glicina (Gly ou G), histidina (His ou H), isoleucina (He ou I), lisina (Lys ou K), leucina (Leu ou L), metionina (Met ou M), asparagina (Asn ou N), prolina (Pro ou P), glutamina (Gln ou Q), arginina (Arg ou R), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), valina (Val ou V), triptofano (Trp ou W) e tirosina (Tyr ou Y), ou seus derivados.

Descrição

Peptídeo antimicrobiano

Em uma primeira concretização a invenção refere-se a um peptídeo antimicrobiano compreendendo um primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresentando um comprimento de cerca de 2 a cerca de 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos ligados a um segundo conjunto compreendendo pelo menos um radical de aminoácido hidrofóbico ou análogo do mesmo, sendo que referido peptídeo proporciona uma atividade antimicrobiana ou uma atividade antimicrobiana incrementada. Por meio de ligação de um segundo conjunto de radicais de aminoácidos, em que os radicais de aminoácidos são hidrofóbicos, a atividade antimicrobiana do peptídeo é melhorada/incrementada ou obtida. Por meio do uso de uma combinação de um primeiro e um segundo conjunto de radicais de aminoácidos, em que o segundo conjunto compreende radicais de aminoácidos hidrofóbicos é até mesmo possível preparar um primeiro conjunto inativo de radicais de aminoácidos ativos contra microorganismos. O primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresenta afinidade apenas por microorganismos ou pode apresentar atividade antimicrobiana.

O segundo conjunto de radicais de aminoácidos hidrofóbicos pode ser de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos e os radicais de aminoácidos hidrofóbicos podem ser selecionados do grupo que consiste de V, L, I, F, Y e W. O segundo conjunto de radicais de aminoácidos hidrofóbicos pode compreender um e os mesmos radicais de aminoácidos hidrofóbicos, como um conjunto de W ou F ou pode ser uma mistura de diferentes radicais de aminoácidos hidrofóbicos e também radicais de aminoácidos D ou radicais de aminoácidos sintéticos desde que também sejam hidrofóbicos. O segundo conjunto de radicais de aminoácidos pode ser ligado ao primeiro conjunto de radicais de aminoácidos na extremidade C ou N ou em ambas as extremidades de referido primeiro conjunto de radicais de aminoácidos. Exemplos dos segundos conjuntos de três a oito radicais de aminoácidos são F(3-8), W(3-8), 1(3-8), Y(3-8) V(3-8), e misturas de referidos radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos. F(3-8) deve significar que há de 3 a 8 F presentes no segundo conjunto de radicais de aminoácidos hidrofóbicos, i.e., 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 radicais de aminoácidos sendo um e o mesmo ou uma mistura dos mesmos e também análogos dos mesmos. Exemplos de misturas de radicais de aminoácidos são FWY5 WWYYII, WYIV, YYWFF etc, i.e., sendo que o aspecto mais importante é que a extremidade é uma extremidade hidrofóbica sendo ligada à outra parte e permitindo, com isso, uma atividade antimicrobiana incrementada. Verificou- se com surpresa que um número específico de aminoácidos é requerido para aumentar a atividade antimicrobiana, i.e., havendo menos de 3 ou mais de 8 radicais de aminoácidos a atividade antimicrobiana é diminuída. O primeiro conjunto pode ser uma estrutura linear com radicais de aminoácidos, como aminoácidos catiônicos ou outros radicais de aminoácidos que dão origem a uma estrutura linear. O primeiro conjunto de radicais de aminoácidos pode apresentar, ao todo, uma carga positiva pura.

O primeiro conjunto de radicais de aminoácidos pode ser obtido de qualquer fonte, desde que o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresente ligação a microorganismo ou atividade antimicrobiana ou possa ser antimicrobiano quando combinado com o segundo conjunto de radicais de aminoácidos. O primeiro conjunto de radicais de aminoácidos pode ser sintética e também semi-sintético e também nativo. Exemplos de proteínas de que o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos se deriva são proteínas de quininogênio, proteínas de fator de crescimento, glicoproteína rica em histidina, proteínas de fator de coagulação, como trombina, fator IX e X, fator de complemento C3a, fator de von Willebrand, vitronectina, inibidor de proteína C, fibronectina, quimiocinas, laminina, superóxido dismutase, proteínas de príon, ou PRELP (proline arginine-rich end leucine-rich repeat proteirí). Outro exemplo é o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos derivado de SEQ ID NO 1 ou as seqüências encontradas na tabela e também de SEQ ID NO 2-12. O tamanho do primeiro conjunto de radicais de aminoácidos pode ser de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos. Adicionalmente, o peptídeo pode ser substituído em um ou mais radicais de aminoácidos, como de 2-21 radicais de aminoácidos. Por exemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 radicais de aminoácidos podem ser removidos e/ou substituídos.

Os peptídeos antimicrobianos podem ser estendidos em um ou mais radicais de aminoácidos, como de 1 a 100 radicais de aminoácidos, de 5 a 50 radicais de aminoácidos ou 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 radicais de aminoácidos. Referidos aminoácidos adicionais podem duplicar uma seqüência contígua à seqüência do peptídeo antimicrobiano derivado de uma proteína não- antimicrobiana. O número a ser adicionado depende do microorganismo a ser combatido, incluindo a estabilidade do peptídeo, toxicidade, o mamífero a ser tratado ou em que produto o peptídeo deveria encontrar-se, e em que estrutura de peptídeo o peptídeo antimicrobiano se baseia. O número de radicais de aminoácidos a serem adicionados aos peptídeos também depende da escolha de produção, p. ex., vetor de expressão e hospedeiros de expressão, e da escolha de fabricação da composição antimicrobiana/farmacêutica. A extensão pode ser na parte N- ou C-terminal ou em ambas as partes dos peptídeos antimicrobianos desde que isso não interrompa o efeito antimicrobiano do peptídeo. Os peptídeos antimicrobianos também podem ser uma proteína de fusão, sendo que o peptídeo antimicrobiano encontra-se fundido a outro peptídeo.

Adicionalmente, os peptídeos antimicrobianos podem ser ligados operacionalmente a outros peptídeos antimicrobianos conhecidos ou outros substâncias, como outros peptídeos, lipídios, proteínas, oligossacarídeos, polissacarídeos, outros compostos orgânicos, ou substâncias inorgânicas. Por exemplo, os peptídeos antimicrobianos podem ser acoplados a uma substância que protege os peptídeos antimicrobianos de serem degradados em um mamífero antes que os peptídeos antimicrobianos tenham inibido, prevenido ou destruído a vida do microorganismo.

Assim, os peptídeos antimicrobianos podem ser modificados na parte C-terminal por meio de amidação ou esterificação e na parte N- terminal por meio de acilação, acetilação, PEGuilação, alquilação e análogos.

Exemplos de microorganismos que são inibidos, prevenidos ou destruídos pelo peptídeo antimicrobiano são bactérias, tanto bactérias Gram- positivas e Gram-negativas, como Enterococcus faecalis, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Helicobacter pylorii, vírus, parasitas, fungo e levedura, como Candida albicans e Candida parapsilosi e também espécies de Malassezia. Outros microorganismos de interesse incluem, embora sem limitação, Citrobacter sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Morganella, Providencia, Listeria sp., Salmonella sp., Serratia sp., Shigella sp., Yersinia sp., Pasteurella sp., Vibrio sp., Campylobacter sp., Haemophilus sp., Bordetella sp., Brucella sp., Neiserria sp., Legionella sp., Mycoplasma sp., e Chalmydia sp. Outros exemplos são vírus, como Herpes Simplex, Varizella Zooster, Influenza vírus. Exemplos de parasitas são endo- e ectoparasitas, incluindo formas de Plasmodium.

Os peptídeos antimicrobianos podem ser obtidos de uma fonte naturalmente ocorrente, como de uma célula humana, um c-DNA, clone genômico, sintetizados quimicamente ou obtidos por meio de técnicas de DNA recombinante como produtos de expressão de fontes celulares.

Os peptídeos antimicrobianos podem ser sintetizados por meio de métodos químicos convencionais, incluindo a síntese por meio de procedimento automatizado. Em geral, análogos de peptídeos são sintetizados com base na estratégia de proteção de Fmoc de fase sólida convencional com HATU (N- [dimetilamino-1H-1.2.3.-triazolo[4,5-b]piridin-1-ilmetilelo]-N- metilmetanamônio hexafluorofosfato N-óxido) como o agente de acoplamento ou outros agentes de acoplamento, como HOAt-l-hidróxi-7- azabenzotriazol. O peptídeo é clivado da resina de fase sólida com ácido trifluoroacético contendo aglutinadores apropriados, que também desprotege grupos funcionais de cadeia lateral. Peptídeo bruto é purificado adicionalmente usando-se cromatografia preparativa de fase invertida. E possível usar outros métodos de purificação, como cromatografia de partição, filtração em gel, eletroforese em gel, ou cromatografia de troca iônica. Outras técnicas de síntese, conhecidas na técnica, como a estratégia de proteção de tBoc, ou o uso de diferentes reagentes de acoplamento diferentes ou análogos podem ser empregadas para produzir peptídeos equivalentes.

Peptídeos podem ser sintetizados alternativamente por meio de produção recombinante (ver, p. ex., Patente dos Estados Unidos n° 5.593.866). Uma variedade de sistemas hospedeiros é vantajosa para a produção dos análogos de peptídeo, incluindo bactérias, como E. coli, levedura, como Saccharomyces eerevisiae ou pichia, insetos, como Sf9, e células mamíferas, como CHO ou COS-7. Há muitos vetores de expressão disponíveis para serem usados para cada um dos hospedeiros e a invenção não é limitada a qualquer dos mesmos desde que o vetor e hospedeiro sejam capazes de produzir o peptídeo antimicrobiano. Vetores e procedimentos para a clonagem e expressão em E. coli podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et ai. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1987) e Ausubel et ai. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995).

Finalmente, os peptídeos podem ser purificados de plasma, sangue, diversos tecidos ou análogos. Os peptídeos podem ser endógenos, ou gerados após digestão enzimática ou química da proteína purificada. Por exemplo, uma proteína pode ser digerida com tripsina, e os resultantes peptídeos antibacterianos isolados adicionalmente em escala maior.

Uma seqüência de DNA codificando o peptídeo antimicrobiano é introduzido em um vetor de expressão vantajoso apropriado para o hospedeiro. Em concretizações preferidas, o gene é clonada em um vetor para criar uma proteína de fusão. Para facilitar o isolamento da seqüência peptídica, usa-se aminoácidos suscetíveis à clivagem química (p. ex., CNBr) ou clivagem enzimática (p. ex., V8 protease, tripsina) para ligar em ponte o peptídeo e o parceiro de fusão. Para expressão em E. coli, o parceiro de fusão é, de preferência, uma proteína intracelular normal que dirige a expressão no sentido da formação de corpos. Em um caso destes, após a clivagem para liberar o produto final, não há exigência quanto à renaturação do peptídeo. Na presente invenção, a cassete de DNA, compreendendo parceiro de fusão e gene de peptídeo, pode ser inserido em um vetor de expressão. De preferência, o vetor de expressão é um plasmídeo que contém um promotor induzível ou constitutivo para facilitar a transcrição eficiente da seqüência de DNA inserida no hospedeiro.

O vetor de expressão pode ser introduzido no hospedeiro por meio de técnicas de transformação convencionais, como por meio de técnicas mediadas com cálcio, eletroporação, ou outros métodos bem conhecidos por aqueles conhecidos na técnica. A seqüência que codifica o peptídeo antimicrobiano pode ser derivada de uma fonte natural, como uma célula mamífera, um cDNA existente ou clone genômico ou sintetizado. Um método que pode ser usado, é a amplificação do peptídeo antimicrobiano com o auxílio de PCR usando-se iniciadores de amplificação que são derivados das extremidades 5' e 3' do modelo de restrição do modelo de DNA antimicrobiano e incorporam tipicamente sítios de restrição selecionados com relação ao sítio de clonagem do vetor. Se necessário, códons de terminação e de iniciação de tradução podem ser manipulados nas seqüências de iniciadores. A seqüência que codifica o peptídeo antimicrobiano pode ser otimizada para códon para facilitar a expressão no hospedeiro particular desde que a escolha dos códons seja feita considerando o mamífero final a ser tratado. Assim, por exemplo, se o peptídeo antimicrobiano for expresso em bactérias, os códons são otimizados para bactérias.

O vetor de expressão pode conter uma seqüência promotora, para facilitar a expressão do peptídeo antimicrobiano introduzido. Se necessário, seqüências reguladoras também podem ser incluídas, como um ou mais acentuadores, sítio de ligação de ribossoma, seqüência-sinal de terminação de transcrição, seqüência-sinal de secreção, origem de replicação, marcador selecionável, e análogos. As seqüências reguladoras são ligadas operacionalmente uma à outra para permitir a transcrição e subseqüente tradução. Se o peptídeo antimicrobiano tiver que ser expresso em bactérias, as seqüências reguladoras são aquelas que são projetadas para, e usadas em, bactérias e elas são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Promotores vantajosos, como promotores constitutivos e induzíveis, são amplamente obteníveis e incluem promotores de fagos T5, T7, T3, SP6, e os óperons trp, lpp, e lac.

Se o vetor contendo o peptídeo antimicrobiano tiver que ser expresso em bactérias, exemplos de origem compreendem, ou aqueles que dão origem a um elevado número de cópias ou aqueles que dão origem a um baixo [número] de cópias, por exemplo fl-ori e col El ori.

De preferência, os plasmídeos incluem pelo menos um marcador selecionável que é funcional no hospedeiro, que permite que células transformadas sejam identificadas e/ou desenvolvidas de forma seletiva. Genes marcadores selecionáveis vantajosos para hospedeiros bacterianos incluem o gene da resistência à ampicilina, gene da resistência ao cloranfenicol, gene da resistência à tetraciclina e outros conhecidos na técnica.

Exemplos de plasmídeos para expressão em bactérias incluem os vetores de expressão de pET [a saber] pET3a, pET 11a, pET 12a-c, e pET 15b (obteníveis da Novagen, Madison, Wis.). Vetores com baixo número de cópias (ρ. ex., pPD100) podem ser usados para superprodução eficiente de peptídeos deletérios para o hospedeiro E. colí (Dersch et al., FEMS Microbiol. Lett 123:19, 1994).

Exemplos de hospedeiros vantajosos compreendem bactérias, levedura, insetos e células mamíferas. No entanto, freqüentemente usa-se bactérias, como E. coli.

O peptídeo antimicrobiano expresso é isolado por meio de técnicas de isolamento convencionais, como cromatografia de afinidade, exclusão de tamanho, ou de troca iônica, HPLC e análogos. E possível encontrar diferentes técnicas em A Biologist's Guide to Principies and Techniques of Practieal Bioehemistry (eds. Wilson e Golding, Edward Arnold, London, ou em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc).

Assim, os peptídeos podem ligar e inativar lipopolissacarídeos de várias bactérias Gram-negativas, desta forma atuando como inibidores de inflamação induzida com lipopolissacarídeo. Os peptídeos também podem modular o crescimento de células eucarióticas. O peptídeo antimicrobiano inventado pode ser colocado/integrado em um produto, como bandagens, emplastros, suturas, sabão, tampões, fraldas, xampus, dentifrício, compostos anti-acne, cremes solares, produtos têxteis, adesivos, incorporados em curativos de feridas, soluções limpadoras, lentes de contato ou implantes.

Adicionalmente, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo um peptídeo antimicrobiano como descrito acima e um diluente, veículo, adjuvante, excipiente ou tampão farmacêutico aceitável. Compostos adicionais podem ser incluídos nas composições, como outros peptídeos antimicrobianos, agentes imunomoduladores, agentes antiprurido. Exemplos de outros peptídeos antimicrobianos são revelados no WO 2005/061535 e WO 2005/001737. Outros exemplos incluem, agentes quelantes, como EDTA, citrato, EGTA ou glutationa. As composições antimicrobianas/farmacêuticas podem ser preparadas de uma maneira conhecida na técnica para que sejam suficientemente estáveis ao armazenamento e vantajosas para administração a humanos e animais. As composições farmacêuticas podem ser liofilizadas, p. ex., por meio de secagem por congelamento, secagem por spray ou resfriamento com spray.

"Farmaceuticamente aceitável" significa um material não- tóxico que não diminui a efetividade da atividade biológica dos ingredientes ativos, i.e., o(s) peptídeo(s) antimicrobiano(s). Referidos tampões, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) e Handbook of Pharmaceutical Exeipients, 3a edição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000).

O termo "tampão" deve significar uma solução aquosa contendo uma mistura de ácido-base com o objetivo de estabilizar pH. Exemplos de tampões compreendem Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartarato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazoleláctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO e TES.

O termo "diluente" deve significar uma solução aquosa ou não-aquosa com o objetivo de diluir o peptídeo na preparação farmacêutica. O diluente pode ser um ou mais dentre solução salina, água, polietileno glicol, propileno glicol, etanol ou óleos (como óleo de açafrão, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de gergelim).

O termo "adjuvante" deve significar qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do peptídeo. O adjuvante pode ser um ou mais dentre sais de zinco, cobre ou prata com diferentes ânions, por exemplo, mas sem limitação, fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartarato, e acetatos de diferente composição de acila.

O excipiente pode ser um ou mais dentre carboidratos, polímeros, lipídeos e minerais. Exemplos de carboidratos incluem lactose, sacarose, manitol, e ciclodextrinas, que são adicionados à composição, p. ex., para facilitar a liofilização. Exemplos de polímeros são amido, éteres de celulose, carboximetil celulose, hidroxipropilmetil celulose, hidroxietil celulose, etilidroxietil celulose, alginatos, carragenanos, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, ácido poliacrílico, polissulfonato, polissulfonato, copolímeros de polietilenoglicol/óxido de polietileno, óxido de polietileno/óxido de polipropileno, álcool de polivinila/acetato de polivinila de diferente graus de hidrólise, e polivinilpirrolidona, todos com diferentes pesos moleculares, que são adicionados à composição, p. ex., para controle da viscosidade, para proporcionar bioadesão, ou para proteger o lipídio contra degradação química e proteolítica. Exemplos de lipídeos compreendem ácidos graxos, fosfolipídeos, mono-, di-, e triglicerídeos, ceramidas, esfingolipídeos e glicolipídeos, todos com diferentes comprimentos e saturação de cadeia acila, lecitina de ovo, lecitina de soja, ovo hidrogenado e lecitina de soja, que são adicionados à composição por razões similares àquelas no caso de polímeros. Exemplos de minerais são talco, óxido de magnésio, óxido de zinco e óxido de titânio, que são adicionados à composição para se obter benefícios, como redução do acúmulo de líquido ou propriedades pigmentares vantajosas.

A formulação inventada também pode conter um ou mais de mono- ou dissacarídeos, como xilitol, sorbitol, manitol, lactitiol, isomalte, maltitol ou xilosídeos, e/ou monoacilgliceróis, como monolaurina. As características do veículo são dependentes da via de administração. Uma via de administração é a administração tópica. Por exemplo, para administrações tópicas, um veículo preferido é um creme emulsificado compreendendo o peptídeo ativo, mas também é possível usar outros veículos comuns, como determinados ungüentos à base de petrolato-mineral e à base de vegetais, e também géis de polímero, fases cristalinas líquidas e microemulsões.

As composições podem compreendem um ou mais peptídeos, como 1, 2, 3 ou 4 peptídeos diferentes. Usando-se a combinação de diferentes peptídeos, o efeito antimicrobiano pode ser aumentado e/ou a possibilidade de que o microorganismo poderia ser resistente e/ou tolerante contra o agente antimicrobiano.

O peptídeo como um sal pode ser um produto de adição química de ácido com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido sulfurico, ácido nítrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido perclórico, ácido tiociânico, ácido bórico etc. ou com ácido orgânico, como ácido fórmico, ácido acético, ácido haloacético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido glucônico, ácido láctico, ácido malônico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido sulfanílico etc. É possível adicionar sais inorgânicos, como sódio monovalente, potássio ou zinco divalente, magnésio, cobre cálcio, todos com um ânion correspondente, para melhorar a atividade biológica da composição antimicrobiana.

As composições antimicrobianas/farmacêuticas da invenção também podem encontrar-se em forma de um lipossoma, em que o peptídeo é combinado, adicionalmente a outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfifáticos, como lipídeos, que existem em formas agregadas como micelas, monocamadas insolúveis e cristais líquidos. Lipídios vantajosos para formulação lipossômica incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos biliares, e análogos. A preparação de referidas formulações lipossômicas pode ser encontrada, por exemplo, na US 4.235.871. As composições antimicrobianas/farmacêuticas da invenção também podem encontrar-se em forma de microesferas biodegradáveis. Poliésteres alifáticos, como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero de PLA e PGA (PLGA) ou poli(caprolactona) (PCL), e polianidridos têm sido amplamente usadas como polímeros biodegradáveis na produção de microesferas. Preparações de referidas microesferas podem ser encontradas nas US 5.851.451 e naEP0213303.

As composições antimicrobianas/farmacêuticas da invenção também podem encontrar-se em forma de géis de polímero, sendo que se usa polímeros, como amido, éteres de celulose, celulose carboximetilcelulose, hidroxipropilmetil celulose, hidroxietil celulose, etilidroxietil celulose, alginatos, carragenanos, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, ácido poliacrílico, polissulfonato, copolímeros de polietilenoglicol/óxido de polietileno, óxido de polietileno/óxido de polipropileno, álcool de polivinila/acetato de polivinila com diferentes graus de hidrólise, e polivinilpirrolidona são usados para o espessamento da solução contendo o peptídeo. Os polímeros também podem compreender gelatina ou colágeno.

Alternativamente, os peptídeos antimicrobianos podem ser dissolvidos em solução salina, água, polietileno glicol, propileno glicol, etanol ou óleos (como óleo de açafrão, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de gergelim), goma tragacanto, e/ou vários tampões. A composição farmacêutica também pode incluir íons e um pH definido para potencialização da ação de peptídeos antimicrobianos.

As composições antimicrobianas/farmacêuticas podem ser submetidas a operações farmacêuticas convencionais, como esterilização e/ou podem conter adjuvantes convencionais, como conservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes, tampões, cargas, etc., p. ex., como divulgado alhures aqui.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas localmente ou sistemicamente. Vias de administração incluem administração tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutânea, e intramuscular), oral, parenteral, vaginal e retal. Também é possível a administração de implantes. Formas de preparação vantajosas compreendem, por exemplo, grânulos, pós, tabletes, tabletes revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, microemulsões, definidos como sistemas opticamente isotrópicos termodinamicamente estáveis consistindo de água, óleo e tensoativo, fases cristalinas líquidas, definidos como sistemas caracterizados por meio de ordem de longo alcance, mas desordem de curto alcance (exemplos incluem fases lamelares, hexagonais e cúbicas, contínuas em água ou óleo), ou suas contrapartes dispersas, géis, ungüentos, dispersões, suspensões, cremes, aerossóis, gotícuias ou solução injetável em forma de ampola e também preparações com liberação prolongada de compostos ativos, naqueles excipientes, diluentes, adjuvantes ou veículos de preparação que são usados comumente como descrito acima. A composição farmacêutica também pode ser proporcionada em bandagens, emplastros ou em suturas ou análogos.

As composições farmacêuticas serão administradas a um paciente em uma dose farmaceuticamente eficaz. Por "dose farmaceuticamente eficaz" compreende-se uma dose que é suficiente para produzir os efeitos desejados com relação à condição para a qual ele é administrado. A dose exata é dependente da atividade do composto, da maneira de administração, natureza e gravidade da desordem, idade e peso corporal do paciente, podendo ser necessárias doses diferentes. A administração da dose pode ser realizada tanto por meio de administração simples em forma de uma unidade de dosagem individual ou, então, como várias unidades de dosagens menores e também por meio de administração múltipla de doses subdivididas em intervalos específicos.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros agentes terapêuticos, como agentes antibióticos, antiinflamatórios ou anti-sépticos, como agentes anti-bacterianos, antifungicidas, agentes antivirais, e agentes anti-parasíticos. Alternativamente, a composição farmacêutica compreende um ou mais agente(s) antibiótico(s) ou anti-séptico(s). Exemplos compreendem penicilinas, cefalosporinas, carbacefemas, cefamicinas, carbapenemas, monobactamas, aminoglicosídeos, glicopeptídeos, quinolonas, tetraciclinas, macrólidos, e fluoroquinolonas. Agentes anti-sépticos incluem iodo, prata, cobre, cloroexidina, poliexanida e outras biguanidas, quitosano, ácido acético, e peróxido de hidrogênio. Estes agentes podem ser incorporados como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente. As composições farmacêuticas também podem conter drogas antiinflamatórias, como esteróides e derivados de macrolactama.

A presente invenção refere-se tanto a humanos e outros mamíferos, como cavalos, cães, gatos, vacas, porcos, camelos, entre outros. Assim, os métodos são aplicáveis em aplicações de terapia humana e veterinária. Os objetos, vantajosos para um tratamento do tipo referido podem ser identificados por característica s bem estabelecidas de uma infecção, como febre, pulso, cultura de organismos, e análogos. Infecções que podem ser tratadas com os peptídeos antimicrobianos incluem aquelas causadas por, ou devidas a, microorganismos. Exemplos de microorganismos incluem bactérias (p. ex., Gram-positivas, Gram-negativas), fungos, (p. ex., levedura e mofos), parasitas (p. ex., protozoários, nematódeos, cestódeos e trematódeos), vírus, e príons. Organismos específicos nestas classes são bem conhecidos (ver, por exemplo, Davis et al., Microbiology, 3a edição, Harper & Row, 1980). Infecções incluem, embora sem limitação, úlceras crônicas da pele, feridas crônicas e agudas infectadas, e feridas de queimaduras, eczema de pele infectado, impetigo, dermatite atópica, acne, otite externa, infecções vaginais, dermatite seborréica, infecções orais e parodontite, intertrigo candidal, conjuntivite e outras infecções dos olhos, como queratite por P. aeruginosa, e pneumonia.

Assim, as composições farmacêuticas podem ser usadas para o tratamento profilático de feridas de queimaduras, após cirurgia e após trauma da pele. A composição farmacêutica também pode ser incluída em soluções destinadas a armazenamento e tratamento de materiais externos em contato com o corpo humano, como lentes de contato, implantes ortopédicos, e cateteres.

Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser usadas para tratamento de dermatite atópica, impetigo, úlceras crônicas da pele, ferida infectada aguda e feridas de queimaduras, acne, otite externa, infecções fungicas, pneumonia, dermatite seborréica, intertrigo candidal, vaginite candidal, candidíase orofaringeal, infecções dos olhos (conjuntivite bacteriana), e infecções nasais (incluindo o porte de MRSA (n.t.: S. aureus resistente à meticilina)).

As composições farmacêuticas também podem ser usadas em soluções limpadoras, como desinfetantes de lentes e soluções de armazenamento ou usadas para prevenir infecção bacteriana em associação com o uso de cateter urinário, ou o uso de cateteres venosos centrais.

Adicionalmente, as composições podem ser usadas para prevenção de infecção pós-cirúrgica em emplastros, adesivos, suturas, ou podem ser incorporadas em curativos de feridas.

Os peptídeos antimicrobianos também podem ser usados em polímeros, produtos têxteis ou análogos para criar superfícies antibacterianas ou cosméticas, e produtos para tratamento pessoal (sabão, xampus, dentifrício, anti-acne, cremes solares, tampões, fraldas, etc) podem ser suplementados com as composições farmacêuticas.

Finalmente, a invenção refere-se a um método de tratar um mamífero apresentando uma infecção microbiana ou que sofre de alergia compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica definida acima.

Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar, mas não limitar, a invenção de qualquer maneira, formato, ou forma, seja explicitamente ou implicitamente.

EXEMPLOS

Peptídeos antimicrobianos

Peptídeos. Peptídeos foram da Sigma-Genosys, gerados por meio de uma plataforma de síntese de peptídeos (PEPscreen®, Custom Peptide Libraries, SigmaGenosys). O rendimento foi de ~ 1 a 6 mg, e o comprimento do peptídeo foi de 20 aminoácidos. Realizou-se espectrometria de massa MALDI-ToF nestes peptídeos. A pureza bruta média de 20 mers foi de -60%. Peptídeos foram fornecidos liofilizados e em um suporte de tubos de 96 poços. Antes dos testes biológicos os peptídeos PEPscreen foram diluídos em dH20 (solução de consumo 5 mM), e armazenados a -20°C. Esta solução de consumo foi usada para os experimentos subseqüentes.

Microorganismos

Escherichia eoli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC29213, e o isolado fungico Candida albieans ATCC90028 foram obtidos junto ao Departamento de Bacteriologia, Hospital da Universidade de Lund.

EXEMPLO 1

Ensaio de difusão radial

Realizou-se ensaios de difusão radial (RDA, Radial Diffusion Assays) substancialmente como descrito previamente (Lehrer, R. L, Rosenman, M., Harwig, S. S., Jackson, R. & Eisenhauer, P. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides, J Immunol Methods. 137, 167-73.). Resultados são mostrados na Tabela 1 a-e. Em resumo, bactérias (E. eoli, S. aureus) ou fungos (C. albieans) foram desenvolvidos a fase semi-logarítmica em 10 ml de caldo de soja tripticase (TSB, trypticase soy broth) de intensidade plena (3% peso/volume) (Becton- Dickinson, Cockeysville, MD). Os microorganismos foram lavados uma vez com 10 mM de Tris, pH 7,4. Adicionou-se 4x106 cfu bacterianas ou 1x105 cíu fungicas a 5 ml do substrato de gel de agarose, consistindo de 0,03% (peso/volume) de TSB, 1% (peso/volume) de agarose com baixo teor de eletroendoosmese-tipo (baixa-EEO) (Sigma, St Louise MO) e uma concentração final de 0,02% (v/v) de Tween 20 (Sigma). O substrato foi despejado em um disco de Petri com diâmetro de 85 mm. Depois de a agarose solidificar, estampou-se poços com diâmetro de 4 mm e adicionou-se 6 μl de amostra de teste em cada poço. Placas foram incubadas a 37°C durante 3 horas para permitir a difusão dos peptídeos. O gel de substrato foi então coberto com 5 ml de superstrato fundido (6% de TSB e 1% de agarose baixo- EEO em dH2O). A atividade antimicrobiana de um peptídeo é visualizada como uma zona transparente em torno de cada poço após de 18 a 24 horas de incubação a 37°C para bactérias e a 28°C para Candida albicans. Outros exemplos de peptídeos que foram selecionados, e que se verificou mostram um efeito incrementado contra o microorganismo mencionado acima, encontram-se listados abaixo. Alguns dos resultados são mostrados na tabela 1c apresentando os efeitos contra C. albicans, tabela 1d E. coli e tabela 1e S. aureus.

Complemento

CNY1

CNY1WWW CNYITELRRQHARASHLGLAWWW

CNY187

CNY187WWW CKYILLLRRQHARA WRRGLR WWW

Fatores de crescimento

GKR22

GKR22WWW GKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKWWW PKR21

PKR21WWW PKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNWWW

Fator de coagulação II

VFR1 7

VFR17 WWW VFRLKK WIQKVIDQFGEWWW

Inibidor de proteína C

SEK20

SEK20WWW SEKTLRK WLKMFKKRQLEL YWWW

PRELP

QPT22

QPT22WWW QPTRRPRPGTGPGRRPRPRPRPWWW

LL-37

LL-37

LL-37 WWW LLGDFFRK SKEKI

KEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTESWWW

Omiganano

OmigananoWWW ILRWPWWPWRRKWWW

EXEMPLO 2

Ensaio de hemólise

EDTA-sangue foi centrifugado a 800 g durante 10 min, após o que se removeu plasma e creme leucocitário. Os eritrócitos foram lavados três vezes e ressuspensos em 5% de PBS, pH 7,4. As células foram então incubadas com rotação extremidade sobre extremidade durante lha 37°C na presença de peptídeos (de 3 a 60 μΜ). 2% de Triton X-100 (Sigma- Aldrich) serviram como controle positivo. As amostras foram então centrifugadas a 800 g durante 10 min. A absorbância da liberação de hemoglobina foi medida a λ 540 nm e encontra-se no gráfico expressa como% de hemólise induzida com TritonX-100 (Tabela la). Tabela 1a

<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table> Tabela 1b

<table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> Tabela 1d

<table>table see original document page 34</column></row><table> Tabela 1e

<table>table see original document page 35</column></row><table> LISTAGEM DE SEQUENCIAS

<110> Dermagen AB <120> Composição aperfeiçoada <130> P5856007 <160> 12

<170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 83 <212> PRT

<213> quininogênio humano <400> 1

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg Asp Gln Gly His 1 5 10 15

Gly His Gln Arg Gly His Gly Leu Gly His Gly His Glu Gln Gln His

20 25 30

Gly Leu Gly His Gly His Lys Phe Lys Leu Asp Asp Asp Leu Glu His

35 40 45

Gln Gly Gly His Val Leu Asp His Gly His Lys His Lys His Gly His

50 55 60

Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn 65 70 75 80

Gly Trp Lys

<210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 2

Phe Phe Phe His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys 1 5 10 15

Gly Lys Lys Asn 20

<210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 3

Trp Trp Trp His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys 1 5 10 15

Gly Lys Lys Asn 20

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 4

His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15

Asn Trp Trp Trp 20

<210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 5

His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15

Asn Phe Phe Phe 20

<210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 6

Phe Phe Phe Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His 1 5 10 15

Asn Gly Trp Lys 20

<210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 7

Trp Trp Trp Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His 1 5 10 15

Asn Gly Trp Lys 20

<210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 8

Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn Gly Trp 1 5 10 15

Lys Trp Trp Trp 20

<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <400> 9

Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn Gly Trp 1 5 10 15

Lys Phe Phe Phe 20

<210> 10 <211> 17 <212> PRT

<213> quininogênio humano <400> 10

His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15

Asn

<210> 11 <211> 20 <212> PRT

<213> quininogênio humano <400> 11

His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15

Asn Gly Lys His 20

<210> 12 <211> 17 <212> PRT

<213> quininogênio humano <400> 12

Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn Gly Trp 1 5 10 15

Lys

Claims (23)

1. Peptídeo antimicrobiano, caracterizado pelo fato de que compreende a) um primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresentando um comprimento de cerca de 2 a cerca de 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos, ligado à extremidade amino e/ou carbóxi-terminal e b) um segundo conjunto compreendendo de 3 a 8 radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos, obtendo-se peptídeo apresentando uma atividade antimicrobiana.

2. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido primeiro conjunto de radicais de aminoácidos apresenta atividade antimicrobiana.

3. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido segundo conjunto compreende 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos.

4. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido radical de aminoácido hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste de, V, L, I, F, Y, W, radicais sintéticos de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos.

5. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido segundo conjunto compreende os mesmos radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou uma mistura de diferentes radicais de aminoácidos hidrofóbicos ou análogos dos mesmos.

6. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido segundo conjunto é selecionado do grupo que consiste de F(3.8), W(3.8), I(3.8), Y(3.8), V(3-8), e misturas de referidos radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos.

7. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos é derivado de proteínas de quininogênio, proteínas de fator de crescimento, PRELP, proteínas do sistema de coagulação, fator de complemento C3a, fator de von Willebrand, vitronectina, superóxido dismutase, proteínas de príon, inibidor de proteína C, fibronectina, laminina, quimiocinas, e glicoproteína rica em histidina.

8. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos tem um comprimento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, -8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, -29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos.

9. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto de radicais de aminoácidos, no total, possui uma carga positiva pura.

10. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que de 1 a 21 radicais de aminoácidos do primeiro conjunto de radical/radicais de aminoácido(s) foi/foram substituído(s) por outro radical/radicais de aminoácido(s).

11. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido primeiro conjunto de radicais de aminoácidos é ligado a de cerca de 1 a cerca de 100 radicais de aminoácidos adicionais, como ligado a de cerca de 5 a cerca de 50 radicais de aminoácidos ou análogos dos mesmos.

12. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é modificado por meio de amidação, esterificação, acilação, acetilação, PEGuilação, alquilação ou os radicais de aminoácidos podem ser radicais D de aminoácidos.

13. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano é selecionado do grupo que consiste de SEQID NO:l, de 10 a 12.

14. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano é selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO: de 2 a 9.

15. Composição antimicrobiana/farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a) um peptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 e b) um diluente, veículo, adjuvante, excipiente ou tampão aceitável.

16. Composição antimicrobiana/farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos antimicrobianos.

17. Composição antimicrobiana/farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 16, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um ou mais agente(s) antibiótico(s) e/ou anti-séptico(s) e/ou agentes imunomoduladores e/ou agentes antiprurido agentes e/ou esteróides.

18. Composição antimicrobiana/farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana/farmacêutica encontra-se em forma de grânulos, pós, tabletes, tabletes revestidos, revestimento de cateteres e agulhas, cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, géis, ungüentos, dispersões, suspensões, cremes, aerossóis, gotículas ou formas injetáveis.

19. Produto, caracterizado pelo fato de que compreende o peptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 ou a composição antimicrobiana/farmacêutica de como definida nas reivindicações de 15 a 18, em que o produto é selecionado do grupo que consiste de bandagens, emplastros, suturas, sabão, tampões, fraldas, xampus, dentifrício, compostos anti-acne, cremes solares, produtos têxteis, adesivos, incorporados em curativos de feridas, soluções limpadoras, lentes de contato, ou implantes.

20. Uso do peptídeo antimicrobiano como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 ou da composição farmacêutica como definida nas reivindicações de 15 a 18 ou do produto como definido na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser na terapia ou diagnóstico.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma droga para o tratamento de uma doença ou antimicrobiana ou para tratamento profilático, causada por um microorganismo selecionado do grupo que consiste de bactérias, vírus, parasitas, fungo e levedura.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença ou infecção ou para o tratamento profilático selecionado do grupo que consiste de dermatite atópica, impetigo, úlceras crônicas da pele, feridas crônicas e agudas infectadas e feridas de queimaduras, acne, otite externa, infecções fungicas, pneumonia, dermatite seborréica, intertrigo candidal, vaginite candidal, candidíase orofaringeal, infecções oculares e infecções nasais, ou para o tratamento profilático de feridas de queimaduras, após cirurgia e após trauma da pele.

23. Método para tratar um mamífero apresentando uma infecção ou doença microbiana para tratamento profilático, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 15 a 19.