ES2476590T3

ES2476590T3 - P�ptidos antimicrobianos mejorados

Info

Publication number: ES2476590T3
Application number: ES07748141.4T
Authority: ES
Inventors: Artur Schmidtchen; Martin Malmsten
Original assignee: Dermagen AB; Pergamum AB
Current assignee: Dermagen AB; Pergamum AB
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2027-05-15
Also published as: NZ572376A; CN101448851B; DK2021364T3; CN101448851A; BRPI0711470A2

Abstract

Un péptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada que comprende a) un primer conjunto de residuos de aminoácido seleccionado de las SEQ ID Nos 10 y 12, y b) un segundo conjunto de residuos de aminoácido que consiste en de 3 a 8 residuos de aminoácido hidrofóbicos seleccionados del grupo que consiste en V, L, I, F, Y y W, y donde dicho segundo conjunto de residuos de aminoácido está unido al extremo aminoterminal o carboxiterminal de dicho primer conjunto de residuos de aminoácido, obteniendo de este modo dicho péptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada en comparación con el primer conjunto de residuos solo.

Description

P�ptidos antimicrobianos mejorados

Campo de la invención

La invención se refiere a un p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada que comprende a una primera secuencia de amino�cidos seleccionada entre las SEQ ID NOs 10 y 12, y un segundo conjunto de residuos de amino�cidos que cosiste en de 3 a 8 residuos de amino�cido hidrof�bicos seleccionados del grupo que consiste en V, L, I, F, Y y W, y donde dicho segundo conjunto de residuos de amino�cidos est� unido al extremo aminoterminal o carboxiterminal de dicho primer conjunto de residuos de amino�cidos, obteniéndose de este modo dicho p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada en comparación con el primer conjunto de residuos por s� solo.

Antecedentes de la invención

Varias infecciones son combatidas con éxito por el sistema inmune de un mamífero tal como un ser humano. Sin embargo, en algunos casos, las bacterias, los hongos o los virus no son siempre eliminados, lo que puede provocar infecciones agudas localizadas o generalizadas. Esto supone una serie preocupación en las unidades perinatales, de descanso o de cuidados intensivos, y en individuos inmunocomprometidos. Las infecciones agudas localizadas dan lugar a una mortalidad extensiva. Por ejemplo, la Pseudomonas aeruginosa es una causa principal de queratitis bacteriana severa y la infección es difícil de tratar con éxito con los agentes antimicrobianos actuales. En otros casos, una persistencia bacteriana continua en las superficies epiteliales puede provocar o agravar una enfermedad crónica. En humanos, los ejemplos de esto son úlceras cut�neas crónicas, dermatitis at�pica y otros tipos de eczema, acné o infecciones genitourinarias. Por ejemplo, ahora se dispone de evidencias considerables de que la colonización o la infección con la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus es un factor de activación o de exacerbaci�n en la dermatitis at�pica. Aproximadamente el 90 % de todas los pacientes de dermatitis at�pica est�n colonizados o infectados con S. aureus mientras que solo el 5 % de los individuos sanos albergan dicha bacteria. Las úlceras crónicas est�n colonizadas o infectadas por bacterias diversas, tal como P. aeruginosa y S. aureus, lo que conduce a un retraso en la curación de dichas úlceras.

Las infecciones sintom�ticas pueden ser tratadas con diversos medicamentos. Algunas enfermedades también pueden combatirse, por ejemplo, con vacunas. Sin embargo, las vacunas no son siempre la mejor opción de tratamiento y para determinados microorganismos no se dispone de vacuna. Cuando no se dispone de protección, se afronta el tratamiento de la enfermedad. A menudo el tratamiento se lleva a cabo mediante el uso de un agente antibiótico, que mata a los microbios. Sin embargo, durante los últimos años varios microbios se han vuelto resistentes a los agentes antibióticos. Con toda probabilidad, los problemas de resistencia se agravar�n en el futuro próximo. Adicionalmente, varios individuos han desarrollado alergia contra el agente antibiótico, reduciendo con ello la posibilidad de usar de forma efectiva determinados agentes antibióticos.

Las superficies epiteliales de varios organismos est�n continuamente expuestas a bacterias. Durante los últimos años se han atribuido funciones importantes al sistema inmune innato, basado en p�ptidos antibacterianos, para la eliminación inicial de bacterias en las fronteras biológicas susceptibles de infección (Lehrer, R. I., y Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11: 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16). De forma general, se cree que los p�ptidos antimicrobianos matan bacterias permeando a través de sus membranas, y por tanto la falta de diana microbiana molecular específica minimiza el desarrollo de resistencia.

En la técnica se conocen varios p�ptidos y proteínas antimicrobianos descritos, no relacionados con la presente invención.

La patente US 6.503.881 describe p�ptidos cati�nicos que son un análogo de la indolicidina para su uso como p�ptido antimicrobiano. Los p�ptidos cati�nicos se derivan de varias especies, que incluyen animales y vegetales.

La patente US 5.912.230 describe p�ptidos antif�ngicos y antibacterianos basados en histatina. Los p�ptidos se basan en porciones definidas de las secuencias de amino�cidos de las histatinas humanas naturales y en métodos para el tratamiento de infecciones f�ngicas y bacterianas.

La patente US 5.717.064 describe p�ptidos l�ticos ricos en lisina metilada. Los p�ptidos l�ticos son resistentes a digestión tr�ptica y no son naturales. Los p�ptidos l�ticos son adecuados para administración in vivo.

La patente US 5.646.014 describe un p�ptido antimicrobiano. El p�ptido se aisl� de una fracción antimicrobiana de hemolinfa de gusano de seda. El p�ptido presenta una excelente actividad antimicrobiana frente a varias cepas bacterianas, tal como Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus.

La patente WO 2004016653 describe un p�ptido basado en la secuencia 20-44 de azurocidina. Este p�ptido contiene una estructura de lazo ligada por puentes de disulfuro.

La patente US 6495516 y patentes relacionadas describen p�ptidos basados en la proteína bactericida de 55 kDa

denominada proteína bactericida/de incremento de permeabilidad (BPI, del inglés “bactericidal/permeability increasing protein”). Los p�ptidos ejercían efectos antimicrobianos y presentaban capacidad neutralizante de LPS.

La patente WO 01/81578 describe numerosas secuencias que codifican polip�ptidos relacionados con receptorprote�na acoplada-G, que pueden usarse para numerosas enfermedades.

Nordahl et al., J. Biol. Chem. 280: 24832-34839 describen una nueva actividad antimicrobiana del dominio 5 de quininogeno de unión a heparina y de unión a célula.

La patente WO 00/01427 describe material óseo para la prevención y el tratamiento de la osteomielitis, material que se proporciona como p�ptidos antimicrobianos.

Actualmente, se conocen más de 700 secuencias de p�ptidos antimicrobianos diferentes (www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm), que incluyen cecropinas, defensinas, magaininas y catelicidinas.

Incluso aunque existe un número relativamente grande de p�ptidos antimicrobianos disponibles hoy día, todavía sigue existiendo una necesidad creciente de nuevos p�ptidos antimicrobianos mejorados, que puedan usarse para combatir microbios, microbios que sean resistentes o tolerantes a agentes antibióticos y/u otros agentes antimicrobianos. De forma más importante, existe una necesidad de nuevos p�ptidos antimicrobianos, que no sean alerg�nicos cuando se introducen en mamíferos, tal como seres humanos.

Debido al potencial l�tico y a otras propiedades de los p�ptidos antimicrobianos (AMPs) contra bacterias y membranas de mamífero, uno de los retos a la hora de diseñar nuevos p�ptidos recae en el desarrollo de AMPs con una elevada especificidad contra microorganismos tales como células bacterianas o f�ngicas, es decir, un índice terapéutico elevado (concentración hemol�tica mínima/actividad antimicrobiana mínima; MHC/MEC).

Varias bacterias, tal como P. aeruginosa, E. faecalis, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes y S. aureus secretan todas proteasas que degradan varios p�ptidos antimicrobianos, tal como la catelicidina LL-37. Por tanto, los p�ptidos antimicrobianos resistentes a proteasa presentan ventajas de un punto de vista terapéutico. Adicionalmente, muchos de los p�ptidos antimicrobianos no son muy eficientes con microorganismos tales como bacterias, p.ej., S. aureus y P. aeruginosa, que frecuentemente desempeñan funciones clave en patog�nesis problem�ticas, y necesitan ser optimizados para mostrar un efecto incrementado.

Sumario de la invención

La invención se refiere a nuevos p�ptidos antimicrobianos mejorados que presentan una actividad antimicrobiana incrementada en comparación con el p�ptido correspondiente. Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que existe un número específico de amino�cidos requeridos para aumentar la actividad antimicrobiana, es decir, si hay menos de 3 o más de 8 residuos de amino�cido, la actividad antimicrobiana disminuye. La estrategia es particularmente adecuada para p�ptidos hidrof�licos, con elevada carga positiva, ya que éstos son altamente disruptivos de membrana. Podría ser que modificando el p�ptido con uno o varios amino�cidos hidrof�bicos, su capacidad de unión a la(s) membrana(s) lip�dica(s) de bacterias se viera potenciada, y la mayor unión de p�ptido resultante da como resultado un incremento de la formación de defectos de la membrana del microorganismo, y una mayor mortalidad del microorganismo. Sin embargo, esto solo es una teoría y el modo de acción puede ser diferente

o ser una combinación de diferentes modos de acción.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada que comprende una primera secuencia de amino�cidos seleccionada entre las SEQ ID NOs 10 y 12, y un segundo conjunto de residuos de amino�cido que consiste en de 3 a 8 residuos de amino�cido hidrof�bicos seleccionados del grupo que consiste en V, L, I, F, Y y W, y donde dicho segundo conjunto de residuos de amino�cido est� ligado al extremo aminoterminal o carboxiterminal de dicho primer conjunto de residuos de amino�cido, obteniéndose de este modo dicho p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada en comparación con el primer conjunto de residuos por s� solo.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición antimicrobiana/farmacéutica que comprende el p�ptido antimicrobiano y un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente aceptable.

En un aspecto adicional, la invención también se refiere a un producto que comprende dicho p�ptido antimicrobiano, siendo seleccionado dicho p�ptido del grupo que consiste en vendas, yesos, suturas, jabón, tampones, pañales, champ�s, pasta de dientes, compuestos anti-acné, cremas solares, textiles, recubrimiento de catéteres y agujas, lentes de contacto, adhesivos, incorporados en vendas para heridas, disolución de lavado o implantes.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del p�ptido antimicrobiano o a la composición antimicrobiana/farmacéutica o al producto en terapia o diagnosis.

En un aspecto final, la invención se refiere al uso del p�ptido antimicrobiano, a la composición antimicrobiana/farmacéutica o a un producto que comprende dicho p�ptido antimicrobiano para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o infección antimicrobiana, provocada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacterias, virus, parásitos, hongos y levadura.

Proporcionando dichos p�ptidos antimicrobianos, los riesgos de reacciones alérgicas frente a p�ptidos antimicrobianos pueden reducirse debido al hecho de que los p�ptidos se pueden derivar de la secuencia de polip�ptidos de proteínas y/o p�ptidos end�genos o que tengan una composición de residuos de amino�cidos similar. Usando p�ptidos cortos, la estabilidad del p�ptido aumenta y los costes de producción se reducen, en comparación con p�ptidos y proteínas de mayor tamaño, por lo que la invención puede ser ventajosa desde el punto de vista económico.

Los p�ptidos de la invención proporcionan composiciones, que facilitan una prevención, reducción o eliminación eficiente de microorganismos. Con ello, se puede incrementar la posibilidad de combatir microorganismos que sean resistentes o tolerantes a agentes antibióticos. Además, se puede tratar a mamíferos que sean alérgicos frente a los agentes antimicrobianos disponibles comercialmente. Proporcionando composiciones antimicrobianas/ farmacéuticas, que se derivan de proteínas end�genas mejoradas, se puede reducir o incluso eliminar la probabilidad de que un mamífero desarrolle alergia frente a dichos p�ptidos en particular. Esto hace que las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas sean útiles para varias aplicaciones en las que las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas entran en contacto con un mamífero, como un medicamento o como un aditivo para prevenir infecciones.

Adicionalmente, el uso de p�ptidos cortos puede mejorar la biodisponibilidad. Además, el uso de p�ptidos estructuralmente distintos con acciones específicas o preferibles sobre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas,

o sobre hongos, permite el ataque específico a varios microorganismos, minimizando de este modo el desarrollo de resistencia y problemas ecológicos. Usando p�ptidos de suplemento, que son comparables a los p�ptidos ya existentes en el mamífero, el riesgo de presión ecológica adicional por nuevos antibióticos se reduce aún más. Finalmente, estas formulaciones también pueden potenciar el efecto de p�ptidos antimicrobianos end�genos, o de sus análogos.

Los p�ptidos antimicrobianos de la invención incrementan la lista de agentes antimicrobianos, lo que ayuda en la elección para prevenir, reducir o eliminar microorganismos en todos los tipos de aplicaciones que incluyen, aunque sin limitación, las que invaden o infectan mamíferos, tal como seres humanos.

Descripci�n detallada de la invención

Definiciones

En el contexto de la presente solicitud e invención se aplican las siguientes definiciones:

El término “secuencia de nucleótidos” pretende indicar una secuencia de dos o más nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser ADN gen�mico, ADNc, ARN, de origen semisint�tico o sintético o una mezcla de los mismos. El término incluye las formas de cadena sencilla y de cadena doble de ADN o ARN.

El término “composición antimicrobiana” pretende indicar cualquier composición que contenga los p�ptidos inventados según la invención, tal como composiciones antimicrobianas o farmacéuticas útiles para combatir microorganismos, que atacan mamíferos, as� como composiciones que comprenden uno o más agentes antimicrobianos adicionales tales como antibióticos y otros agentes.

El término “sustituido” pretende indicar que un residuo de amino�cido es reemplazado por otro residuo de

amino�cido.

El término “análogos del mismo” pretende indicar que dicha parte del p�ptido, o el p�ptido entero, se basa en residuos de amino�cido no prote�nicos (sintéticos o semisint�ticos), tal como ácido aminoisobut�rico (Aib), ácido gamma-aminobut�rico (Abu) de norvalina u onitina. Ejemplos de otros residuos de amino�cido no prote�nicos se pueden encontrar en http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.htm.

El término “eliminado” pretende indicar que al menos un residuo de amino�cido ha sido eliminado, es decir, liberado

del polip�ptido sin ser reemplazado por otro residuo de amino�cido.

El término “homología” pretende indicar la homología global del polip�ptido, que no debe confundirse con la palabra “similitudes” que significa que residuos de amino�cido específicos pertenecen al mismo grupo (es decir, hidrof�bicos, hidrof�licos), o “identidad”, que significa que los residuos de amino�cido son idénticos.

El término “unido” pretende indicar “unido” mediante enlaces covalentes o químicos.

El término “p�ptido antimicrobiano” pretende indicar un p�ptido que previene, inhibe, reduce o destruye un microorganismo. La actividad antimicrobiana se puede determinar mediante cualquier método, tal como el método del EJEMPLO 1.

El término “anfip�tico” pretende indicar la distribución de residuos de amino�cido hidrof�licos e hidrof�bicos junto a las caras opuestas de una estructura de hélice α, de cadena β, lineal, circular, o de otra conformación secundaria, as� como junto a la estructura primaria del p�ptido, que da como resultado que uno o varios dominios de la molécula sean predominantemente cargados e hidrof�licos y otros sean predominantemente hidrof�bicos.

El término “cati�nico” pretende indicar una molécula que tenga una carga neta positiva en el rango de pH de entre

aproximadamente 2 y aproximadamente 12, tal como en el rango entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10.

El término “microorganismo” pretende indicar cualquier organismo vivo. Los ejemplos de microorganismos son

bacterias, hongos, virus, parásitos y levaduras.

El término “agente antimicrobiano” pretende indicar cualquier agente que prevenga, inhiba o destruya la vida de microbios.

Los ejemplos de agentes antimicrobianos se pueden encontrar en “The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy” (32�

edici�n, Antimicrobial Therapy, Inc, EE.UU.).

En el presente contexto, los nombres de amino�cidos y los nombres de átomos se usan como se define en el Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), que se basan en la nomenclatura IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names, etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)

junto con sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). El término “amino�cido” pretende indicar un

amino�cido del grupo que consiste en alanina (Ala o A), ciste�na (Cys o C), ácido asp�rtico (Asp o D), ácido glut�mico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), tript�fano (Trp o W) y tirosina (Tyr o Y), o sus derivados.

Descripci�n

P�ptido antimicrobiano

En la presente memoria se describe un p�ptido antimicrobiano que comprende un primer conjunto de residuos de amino�cido que tiene una longitud de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 36 residuos de amino�cido o análogos de los mismos unidos a un segundo conjunto que comprende al menos un residuo de amino�cido hidrof�bico o un análogo del mismo, donde dicho p�ptido obtiene una actividad antimicrobiana o una actividad antimicrobiana incrementada. Ligando un segundo conjunto de residuos de amino�cido, donde los residuos de amino�cido son hidrof�bicos, la actividad antimicrobiana del p�ptido se ve mejorada/incrementada o se obtiene. Mediante el uso de una combinación de un primer y un segundo conjuntos de residuos de amino�cido, en los que el segundo conjunto comprende residuos de amino�cido hidrof�bicos, es posible incluso hacer que un primer conjunto de residuos de amino�cido inactivo se vuelva activo contra microorganismos. El primer conjunto de residuos de amino�cido solamente presenta afinidad por el microorganismo o puede poseer actividad antimicrobiana.

En el p�ptido antimicrobiano de la invención, el segundo conjunto de residuos de amino�cido hidrof�bicos consta de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos de amino�cido y los residuos de amino�cido hidrof�bicos se seleccionan del grupo que consiste en V, L, I, F, Y y W. El segundo conjunto de residuos de amino�cido hidrof�bicos puede comprender uno y los mismos residuos de amino�cido hidrof�bicos, tal como un conjunto de W o F o ser una mezcla de diferentes residuos de amino�cido hidrof�bicos, as� como residuos de amino�cido D o residuos de amino�cido sintéticos, siempre que sean hidrof�bicos. El segundo conjunto de residuos de amino�cido puede estar ligado al primer conjunto de residuos de amino�cido en el extremo C-terminal o N-terminal o en ambos extremos de dicho primer conjunto de residuos de amino�cido. Los ejemplos de los segundos conjuntos de tres a ocho residuos de amino�cido son F(3-8), W(3-8), I(3-8), Y(3-8), V(3-8) y mezclas de dichos residuos de amino�cido o análogos de los mismos. F(3-8) pretende indicar que hay presentes entre 3 y 8 F en el segundo conjunto de residuos de amino�cido hidrof�bicos, es decir, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos de amino�cido que son uno y el mismo o una mezcla de los mismos, as� como sus análogos. Los ejemplos de mezclas de residuos de amino�cido son FWY, WWYYII, WYIV, YYVVFF, etc., es decir, el aspecto más importante es que el extremo sea un extremo hidrob�fico y que est� ligado a la otra parte y, por tanto, que le permita una actividad antimicrobiana incrementada. También se ha descubierto de forma sorprendente que hay un número específico de amino�cidos requerido para aumentar la actividad antimicrobiana, es decir, si hay menos de 3 o más de 8 residuos de amino�cido la actividad antimicrobiana disminuye. El primer conjunto puede ser una estructura lineal con residuos de amino�cido, tal como amino�cidos cati�nicos u otros residuos de amino�cido que den lugar a una estructura lineal. El primer conjunto de residuos de amino�cido puede tener en total una carga neta positiva.

El primer conjunto de residuos de amino�cido puede obtenerse de cualquier fuente siempre que el primer conjunto de residuos de amino�cido muestre unión a microorganismos y presente actividad antimicrobiana, o puede ser antimicrobiano cuando se combine con el segundo conjunto de residuos de amino�cido. El primer conjunto de residuos de amino�cido puede ser sintético y semisint�tico, as� como nativo. Los ejemplos de proteínas a partir de las cuales se puede derivar el primer conjunto de residuos de amino�cido son proteínas quinin�genas, proteínas de factor de crecimiento, glicoprote�na rica en histidina, proteínas de factor de coagulación tal como trombina, factor IX y X, factor complemento C3a, factor von Willebrand, vitronectina, inhibidor de proteína C, fibronectina, quemocinas, laminina, super�xido dismutasa, proteínas de pri�n o PRELP (proteína de repetición rica en leucina y rica en prolina arginina). Otro ejemplo es el primer conjunto de residuos de amino�cido derivado de la SEQ ID NO 1 o las secuencias presentadas en la tabla, as� como las SEQ ID NO 2-12. El tamaño del primer conjunto de residuos de amino�cido puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 � 36 residuos de amino�cido o análogos de los mismos. En el p�ptido antimicrobiano de la invención, el primer conjunto de residuos de amino�cido se selecciona de las SEQ ID NOs 10 y 12.

Adicionalmente, el p�ptido puede estar sustituido en uno o más residuos de amino�cido, tal como entre 2 y 21 residuos de amino�cido. Por ejemplo, se puede eliminar y/o sustituir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 � 20 residuos de amino�cidos.

Los p�ptidos antimicrobianos pueden extenderse en uno o más residuos de amino�cido, tal como 1-100 residuos de amino�cido, 5-50 residuos de amino�cido � 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 � 30 residuos de amino�cido. Dichos amino�cidos adicionales pueden duplicar una secuencia contigua a la secuencia del p�ptido antimicrobiano derivado de una proteína no antimicrobiana. El número a añadir depende de qué microorganismo se vaya a combatir e incluye la estabilidad del p�ptido, la toxicidad, el mamífero a tratar o en qué producto debería estar el p�ptido y en qué estructura de p�ptido se basa el p�ptido antimicrobiano. El número de residuos de amino�cido a añadir a los p�ptidos depende también de la elección de producción, p.ej., vector de expresión y hospedantes de expresión y la elección de fabricación para la composición antimicrobiana/farmacéutica. La extensión puede ser en la parte N-terminal o en la C-terminal o en ambas partes de los p�ptidos antimicrobianos, siempre que no se altere el efecto antimicrobiano del p�ptido. Los p�ptidos antimicrobianos también pueden ser una proteína de fusión, donde el p�ptido antimicrobiano est� fusionado a otro p�ptido.

Adicionalmente, los p�ptidos antimicrobianos pueden ligarse operativamente a otros p�ptidos antimicrobianos conocidos o a otras sustancias, tal como p�ptidos, lípidos, proteínas, oligosac�ridos, polisac�ridos, otros compuestos orgánicos o sustancias inorgánicas. Por ejemplo, los p�ptidos antimicrobianos se pueden acoplar a una sustancia que proteja los p�ptidos antimicrobianos de ser degradados en el interior de un mamífero antes de que los p�ptidos antimicrobianos hayan inhibido, prevenido o destruido la vida del microorganismo.

Por consiguiente, los p�ptidos antimicrobianos pueden modificarse en la parte C-terminal mediante amidaci�n o esterificaci�n y en la parte N-terminal mediante acilaci�n, acetilaci�n, PEGilaci�n, alquilaci�n y similares.

Los ejemplos de microorganismos que son inhibidos, prevenidos o destruidos por el p�ptido antimicrobiano son bacterias, tanto bacterias Gram-positivas como bacterias Gram-negativas, tal como Enterococcus faecalis, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Helicobacter pylorii, virus, parásitos, hongos y levaduras, tal como Candida albicans y Candida parapsilosi, as� como la especie Malassezia. Otros microorganismos de interés incluyen, aunque sin limitación, Citrobacter sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Morganella, Providencia, Listeria sp., Salmonella sp., Serratia sp., Shigella sp., Yersinia sp., Pasteurella sp., Vibrio sp., Campylobacter sp., Haemophilus sp., Bordetella sp., Brucella sp., Neiserria sp., Legionella sp., Mycoplasma sp. y Chalmydia sp. Otros ejemplos son virus, tal como los virus de Herpes simple, Varicela z�ster y Gripe. Los ejemplos de parásitos son endo- y ectopar�sitos, incluyendo las formas plasmodium.

Los p�ptidos antimicrobianos pueden obtenerse a partir de una fuente natural, tal como una célula humana, un ADNc, un clon gen�mico, se pueden sintetizar químicamente o se pueden obtener mediante técnicas de ADN recombinante como productos de expresión a partir de fuentes celulares.

Los p�ptidos antimicrobianos se pueden sintetizar mediante métodos químicos estándares, que incluyen la síntesis mediante un procedimiento automatizado. En general, los análogos de p�ptidos se sintetizan en base a la estrategiade protección Fmoc en fase sólida estándar con HATU (N-ÓXIDO DE N-[DIMETILAMINO-1H-1.2.3.-TRIAZOLO[4,5-B]PIRIDIN-1-ILMETILEN]-N-METILMETANAMINIO HEXAFLUOROFOSFATO) como agente de acoplamiento u otros agentes de acoplamiento tales como HOAt-1-HIDROXI-7-AZABENZOTRIAZOL. El p�ptido es separado de la resina de fase sólida con ácido trifluoroac�tico que contiene los captadores apropiados, lo que también desprotege los grupos funcionales de cadenas laterales. El p�ptido no purificado se purifica adicionalmente usando cromatograf�a preparativa de fase inversa. Se pueden usar otros métodos de purificación, tal como cromatograf�a de partición, filtración en gel, electroforesis en gel o cromatograf�a de intercambio iónico. Para producir p�ptidos equivalentes se pueden emplear otras técnicas de síntesis, conocidas en la técnica, tal como la estrategia de protección con tBOC, o el uso de diferentes reactivos de acoplamiento, o similares.

Alternativamente, los p�ptidos pueden sintetizarse mediante producción recombinante (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. N� 5.593.866). Para la producción de los análogos de p�ptidos son adecuados una variedad de sistemas hospedantes, que incluyen bacterias, tal como E. coli, levaduras, tal como Saccharomyces cerevisiae o pichia, insectos, tal como Sf9, y células de mamífero, tal como CHO � COS-7. Se dispone de muchos vectores de expresión para su uso con cada uno de los hospedantes y la invención no se limita a ninguno de ellos, siempre que el vector y el hospedante sean capaces de producir el p�ptido antimicrobiano. Los vectores y los procedimientos para clonaci�n y expresión en E. coli se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1987) y en Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995).

Finalmente, los p�ptidos pueden purificarse a partir de plasma, sangre, tejidos diversos o similares. Los p�ptidos pueden ser end�genos o se pueden generar tras digestión enzim�tica o química de la proteína purificada. Por ejemplo, se puede digerir una proteína con tripsina y los p�ptidos antibacterianos resultantes se pueden aislar adicionalmente a una escala mayor.

Se introduce una secuencia de ADN que codifica el p�ptido antimicrobiano en un vector de expresión adecuado que sea apropiado para el hospedante. En las realizaciones preferidas, el gen se clona en un vector para crear una proteína de fusión. Para facilitar el aislamiento de la secuencia de p�ptido, se usan amino�cidos susceptibles a ruptura química (p.ej., CNBr) o ruptura enzim�tica (p.ej., proteasa V8, tripsina) como puente entre el p�ptido y la pareja de fusión. Para la expresión en E. coli, la pareja de fusión preferiblemente es una proteína intracelular normal que dirija la expresión hacia la formación de cuerpos de inclusión. En dicho caso, tras la ruptura para liberar el producto final, no existe el requisito de renaturalizaci�n del p�ptido. En la presente invención, la casete de ADN, que comprende la pareja de fusión y el gen de p�ptido, se puede insertar en un vector de expresión. Preferiblemente, el vector de expresión es un pl�smido que contiene un promotor inducible o constitutivo para facilitar la transcripción eficiente de la secuencia de ADN insertada en el hospedante.

El vector de expresión se puede introducir en el hospedante mediante técnicas convencionales de transformación tales como a través de técnicas mediadas por calcio, electroporaci�n u otros métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. La secuencia que codifica el p�ptido antimicrobiano puede derivarse de una fuente natural tal como una célula de mamífero, un ADNc existente o un clon gen�mico o se puede sintetizar. Un método, que puede usarse, es la amplificación del p�ptido antimicrobiano mediante la ayuda de PCR usando cebadores de

amplificaci�n que se derivan de los extremos 5’ y 3’ de la plantilla de ADN antimicrobiana y que típicamente

incorporan sitios de restricción elegidos con respecto al sitio de clonaci�n del vector. Si es necesario, se pueden diseñar codones de inicio y terminación traduccional en las secuencias de cebador. La secuencia que codifica el p�ptido antimicrobiano puede optimizarse respecto a cod�n para facilitar la expresión en el hospedante particular, siempre que la elección de los codones se haga considerando el mamífero final que va a ser tratado. As�, por ejemplo, si el p�ptido antimicrobiano se expresa en bacterias, los codones se optimizan para bacterias.

El vector de expresión puede contener una secuencia promotora, para facilitar la expresión del p�ptido antimicrobiano introducido. Si es necesario, también se pueden incluir secuencias reguladoras, tal como uno o más potenciadores, sitio de unión a ribosoma, secuencia señal de terminación de la transcripción, secuencia señal de secreción, origen de replicaci�n, marcador seleccionable, y similares. Las secuencias reguladoras est�n ligadas operativamente unas a otras para permitir la transcripción y la posterior traducción. Si el p�ptido antimicrobiano va a expresarse en bacterias, las secuencias reguladoras son aquellas diseñadas para ser usadas dentro de bacterias, y como tal son conocidas por el especialista en la técnica. Los promotores adecuados, tal como promotores constitutivos e inducibles, se encuentran disponibles ampliamente e incluyen promotores de fagos T5, T7, T3, SP6, y los operones trp, lpp y lac.

Si el vector que contiene el p�ptido antimicrobiano va a ser expresado dentro de bacterias los ejemplos de origen son aquellos que dan lugar a un elevado número de copias o aquellos que dan lugar a un bajo número de copias, por ejemplo f1-ori y col E1 ori.

Preferiblemente, los pl�smidos incluyen al menos un marcador seleccionable que sea funcional en el hospedante, que permita que las células transformadas sean identificadas y/o cultivadas selectivamente. Los genes marcadores seleccionables adecuados para hospedantes bacterianos incluyen el gen de resistencia a ampicilina, el gen de resistencia a cloranfenicol, el gen de resistencia a tetraciclina, el gen de resistencia a canamicina y otros conocidos en la técnica.

Los ejemplos de pl�smidos para expresión en bacterias incluyen los vectores pET de expresión pET3a, pET 11a, pET 12a-c y pET 15 b (disponibles en Novagen, Madison, Wis.). Los vectores de bajo número de copias (p.ej., pPD100) pueden usarse para una sobreproducción eficiente de p�ptidos nocivos para el hospedante de E. coli (Dersch et al., FEMS Microbiol. Lett. 123:19, 1994).

Los ejemplos de hospedantes adecuados son bacterias, levaduras, insectos y células de mamífero. Sin embargo, a menudo se usan bacterias como E. coli.

El p�ptido antimicrobiano expresado se aísla mediante técnicas de aislamiento convencionales tales como cromatograf�a de afinidad, de exclusión de tamaño o de intercambio iónico, HPLC y similares. Se pueden encontrar

diferentes tácticas de purificación en “A Biologist’s Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry” (editores Wilson y Golding, Edward Arnold, Londres, o en “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons, Inc).

Por consiguiente, los p�ptidos pueden unirse y desactivar lipopolisac�ridos de diversas bacterias Gram-negativas, actuando de este modo como inhibidores de la inflamación inducida por lipopolisac�ridos. Los p�ptidos también pueden modular el crecimiento de células eucari�ticas. El p�ptido antimicrobiano de la invención puede colocarse/integrarse en un producto tal como vendas, escayolas, suturas, jabón, tampones, pañales, champ�s, pasta de dientes, compuestos anti-acné, cremas solares, textiles, adhesivos, incorporados en recubrimientos de heridas, disoluciones de lavado, lentes de contacto o implantes.

Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un p�ptido antimicrobiano como el descrito anteriormente y un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente farmac�uticamente aceptable. Se pueden incluir compuestos adicionales en las composiciones, tal como otros p�ptidos antimicrobianos, agentes inmunomodulantes, agentes antipruritus. Los ejemplos de otros p�ptidos antimicrobianos se describen en las patentes WO 2005/0611535 y WO 2005/001737. Otros ejemplos incluyen, agentes quelantes como EDTA, citrato, EGTA o glutationa. Las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas pueden prepararse de un modo conocido en la técnica que sea suficientemente estable durante el almacenamiento y adecuado para administración a humanos y animales. Las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse, p.ej., mediante secado por congelación, secado por pulverización y enfriamiento por pulverización.

“Farmac�uticamente aceptable” significa un material no tóxico que no pierde eficacia de actividad biológica de los

ingredientes activos, es decir, el(los) p�ptido(s) antimicrobiano(s). Dichos tampones, vehículos o excipientes

farmac�uticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18� edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3� edición,

A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000).

El término “tampón” pretende indicar una disolución acuosa que contiene una mezcla ácido-base con el propósito de establecer un pH. Los ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazolel�ctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.

El término “diluyente” pretende indicar una disolución acuosa o no acuosa con el propósito de diluir el p�ptido en la

preparaci�n farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de salino, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tal como aceite de alazor, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de algodón o aceite de sésamo).

El término “adyuvante” pretende indicar cualquier compuesto añadido a la formulación para aumentar el efecto biológico del p�ptido. El adyuvante puede ser uno o más de sal de cinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, aunque sin limitación, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición de acilo.

El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, pol�meros, lípidos y minerales. Los ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se añaden a la composición, p.ej., para facilitar la liofilización. Los ejemplos de pol�meros son almidón, �teres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietil celulosa, alginatos, carragenos, ácido hialur�nico y derivados del mismo, ácido poliacr�lico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copol�meros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, polivinilalcohol/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis y polivinilpirrolidona, todos de peso molecular diferente, que se añaden a la composición, p.ej., para controlar la viscosidad, para alcanzar bioadhesi�n o para proteger el lípido frente a degradación química y proteol�tica. Los ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfol�pidos, mono-, di- y tri-glic�ridos, ceramidas, esfingolipidos y glicol�pidos, todos con diferente longitud de cadena de acilo y saturación, lecitina de huevo, lecitina de soja, huevo hidrogenado y lecitina de soja, que se añaden a la composición por razones similares a las de los pol�meros. Los ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio y óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios tales como reducción de acumulación de líquidos o propiedades de pigmento ventajosas.

La formulación de la invención también puede contener uno o más mono- o disac�ridos tal como xilitol, sorbitol, manitol, lactitol, isomalta, maltitol o xil�sidos y/o monoacilgliceroles, tal como monolaurina. Las características del vehículo dependen de la ruta de administración. Una ruta de administración es la administración típica. Por ejemplo, para administración típica, un vehículo preferido es una crema emulsificada que comprende el p�ptido activo, pero se pueden usar otros vehículos comunes tal como determinados ungüentos de base vaselina/mineral y de base vegetal, as� como geles polim�ricos, fases líquidas cristalinas y microemulsiones.

Las composiciones pueden comprender uno o más p�ptidos, tal como 1, 2, 3 � 4 p�ptidos diferentes. Usando una combinación de diferentes p�ptidos se puede aumentar el efecto antimicrobiano y/o la posibilidad de que el microorganismo podría ser resistente y/o tolerante frente al agente antimicrobiano.

El p�ptido en forma de sal es un aducto ácido con ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromh�drico, ácido fosf�rico, ácido percl�rico, ácido tioci�nico, ácido bórico, etc., o con ácidos orgánicos tal como ácido f�rmico, ácido acético, ácido haloac�tico, ácido propi�nico, ácido glic�lico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succ�nico, ácido gluc�nico, ácido l�ctico, ácido mal�nico, ácido fum�rico, ácido antran�lico, ácido benzoico, ácido cinn�mico, ácido p-toluenosulf�nico, ácido naftalenosulf�nico, ácido sulfan�lico, etc. Sales inorgánicas tales como las monovalentes de sodio y potasio, o las divalentes de zinc, magnesio, cobre, calcio, todas con el correspondiente ani�n, se pueden añadir para mejorar la actividad biológica de la composición antimicrobiana.

Las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas de la invención también pueden presentarse en la forma de un liposoma, en el que el p�ptido se combina, además de con otros vehículos farmac�uticamente aceptables, con agentes anfip�ticos tales como lípidos, que existen en formas agregadas como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, aunque sin limitación, monoglic�ridos, diglic�ridos, sulf�tidos, lisolecitina, fosfol�pidos, saponina, ácidos biliares y otros similares. La preparación de dichas formulaciones liposomales se puede encontrar, por ejemplo, en la patente US 4.235.871.

Las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas de la invención también pueden encontrarse en la forma de microesferas biodegradables. Para la producción de microesferas, se han usado ampliamente como pol�meros biodegradables poli�steres alif�ticos, tal como el poli(ácido l�ctico) (PLA), poli(ácido glic�lico) (PGA), copol�meros de PLA y PGA (PLGA) o poli(caprolactona) (PCL), y polianh�dridos. Las preparaciones de dichas microesferas se pueden encontrar en las patentes US 5.851.451 y EP 0213303.

Las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas de la invención también pueden encontrarse en la forma de geles polim�ricos, donde se usan pol�meros tales como almidón, �teres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietil celulosa, alginatos, carragenos, ácido hialur�nico y derivados del mismo, ácido poliacr�lico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copol�meros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, polivinilalcohol/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis, y polivinilpirrolidona, para el espesamiento de la disolución que contiene el p�ptido. Los pol�meros también pueden comprender gelatina o col�geno.

Alternativamente, los p�ptidos antimicrobianos se pueden disolver en salino, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tal como aceite de alazor, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de algodón o aceite de sésamo), goma arábiga y/o diversos tampones. La composición farmacéutica también puede incluir iones y un pH definido para potenciar la acción de los p�ptidos antimicrobianos.

Las composiciones antimicrobianas/farmacéuticas se pueden someter a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, rellenos, etc., p.ej., como se describe en cualquier otra parte de la presente memoria.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden administrar local o sist�micamente. Las rutas para administración incluyen la típica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), oral, parenteral, vaginal y rectal. También es posible la administración desde implantes. Las formas de preparación adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, microemulsiones, definidas como sistemas �pticamente isotr�picos y termodinámicamente estables de agua, aceite y un tensioactivo, fases líquidas cristalinas, definidas como sistemas que se caracterizan por ordenamiento de largo alcance pero falta de orden a corto alcance (los ejemplos incluyen fases lamelares, hexagonales y cúbicas, tanto continuas en agua como en aceite), o sus contrapartidas dispersas, geles, ungüentos, dispersiones, suspensiones, cremas, aerosoles, gotas o disolución inyectable en forma de ampollas, y también preparaciones con liberación retardada de compuestos activos, en cuya preparación se usan de forma habitual excipientes, diluyentes, adyuvantes o vehículos como los descritos anteriormente. La composición farmacéutica también puede proporcionarse en vendas, escayolas o en suturas o similar.

Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmac�uticamente efectiva. Por “dosis farmac�uticamente efectiva” se entiende una dosis que sea suficiente para producir los efectos deseados en relación a la afección para la cual se administran. La dosis exacta depende de la actividad del compuesto, del modo de administración, de la naturaleza y la gravedad del trastorno, de la edad y peso corporal del paciente, se pueden necesitar diferentes dosis. La administración de la dosis se puede llevar a cabo mediante administración individual en la forma de una dosis unitaria individual o como varias dosis unitarias más pequeñas, y también mediante administración múltiple de dosis subdivididas a intervalos específicos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes terapéuticos, tal como agentes antibióticos, antiinflamatorios o antisépticos, tal como agentes antibacterianos, antif�ngicos, antivirales, y antiparasitarios. Alternativamente, la composición farmacéutica comprende uno o más agente(s) antibiótico(s) o antiséptico(s). Los ejemplos son penicilinas, cefalosporinas, carbacefenos, cefamicinas, carbapenenos, monobactanos, aminoglic�sidos, glicop�ptidos, quinolonas, tetraciclinas, macr�lidos y fluoroquinolonas. Los agentes antisépticos incluyen yodo, plata, cobre, clorhexidina, polihexanuro y otras biguanidas, quitos�n, ácido acético y peróxido de hidrógeno. Estos agentes pueden incorporarse como parte de la misma composición farmacéutica o pueden administrarse de forma separada. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener fármacos antiinflamatorios tales como esteroides y derivados de macrolactama.

La presente invención afecta tanto a humanos como a otros mamíferos, tal como caballos, perros, gatos, vacas, cerdos, camellos, entre otros. Por tanto, los métodos son aplicables tanto a terapia de humanos como a aplicaciones veterinarias. Los objetivos adecuados para dicho tratamiento pueden identificarse a través de síntomas claros de una infección, tal como fiebre, pus, cultivo de organismos, y similares. Las infecciones que pueden ser tratadas con los p�ptidos antimicrobianos incluyen aquellas provocadas o debidas a microorganismos. Los ejemplos de microorganismos incluyen bacterias (p.ej., Gram-positivas, Gram-negativas), hongos (p.ej., levaduras y mohos), parásitos (p.ej., protozoos, nematodos, cestodos y trematodos), virus y priones. Los organismos específicos de estas clases son bien conocidos (véase, por ejemplo, Davis et al., Microbiology, 3� edición, Harper & Row, 1980). Las infecciones incluyen, aunque sin limitación, úlceras cut�neas crónicas, heridas infectadas agudas y crónicas y quemaduras, eczema cut�neo infectado, imp�tigo, dermatitis at�pica, acné, otitis externa, infecciones vaginales, dermatitis seborreica, infecciones orales y periodontitis, intertrigo candidal, conjuntivitis y otras infecciones oculares tales como queratitis de P aeruginosa, y neumonía.

Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratamiento profiláctico de quemaduras, tras cirugía y tras un trauma cut�neo. La composición farmacéutica también se puede incluir en disoluciones destinadas a almacenamiento y tratamiento de materiales externos en contacto con el cuerpo humano, tal como lentes de contacto, implantes ortopédicos y catéteres.

Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratamiento de dermatitis at�pica, imp�tigo, úlceras cut�neas crónicas, heridas infectadas agudas y quemaduras, acné, otitis externa, infecciones f�ngicas, neumonía, dermatitis seborreica, intertrigo candidal, vaginitis candidal, candidiasis orofar�ngea, infecciones oculares (conjuntivitis bacteriana) e infecciones nasales (que incluyen carruaje MRSA).

Las composiciones farmacéuticas también se pueden usar en disoluciones de limpieza, tal como desinfectantes de lentes y disoluciones de almacenamiento de lentes, o se pueden usar para prevenir infecciones bacterianas asociadas al uso de catéteres urinarios o al uso de catéteres venosos centrales.

Adicionalmente, las composiciones se puede usar para la prevención de infecciones post-cirugía en escayolas, adhesivos, suturas, o se pueden incorporar en recubrimientos de heridas.

Los p�ptidos antimicrobianos también se pueden usar en pol�meros, textiles o similares, para crear superficies o cosméticos antibacterianos, y se pueden complementar productos de cuidado personal (jabón, champ�s, pasta de dientes, anti-acné, cremas solares, tampones, pañales, etc.) con las composiciones farmacéuticas.

Tambi�n se describe un método para tratar a un mamífero que tenga una infección microbiana o que padezca una alergia, que comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica definida anteriormente.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, aunque sin limitar, la invención en cualquier modo o forma, tanto explícita como implícitamente.

Ejemplos

P�ptidos antimicrobianos

P�ptidos. Los p�ptidos procedían de Sigma-Genosys, generados mediante una plataforma de síntesis de p�ptidos (PEPscreen�, Custom Peptide Libraries, SigmaGenosys). El rendimiento fue de ~1-6 mg, y la longitud de p�ptido de 20 amino�cidos. Se llev� a cabo una Espectrometr�a de Masas MALDI-ToF de estos p�ptidos. La Pureza Sin Purificar media de 20meros fue de ~60%. Los p�ptidos fueron suministrados liofilizados y una gradilla de tubos de 96 pocillos. Antes de la evaluación biológica, los p�ptidos PEPscreen fueron diluidos en dH2O (reserva 5 mM), y se almacenaron a -20�C. Esta disolución de reserva se us� para los experimentos posteriores.

Microorganismos

Eschericia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC29213, y el elemento f�ngico aislado Candida albicans ATCC90028 fueron obtenidos del Departamento de Bacteriolog�a, Hospital Universitario de Lund.

Ejemplo 1

Ensayo de difusión radial

Los ensayos de difusión radial (RDA) se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente (Lehrer,

R. I., Rosenman, M., Harwig, S. S., Jackson, R. & Eisenhauer, P. (1991) “Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides”, J Immunol Methods. 137, 167-73). Los resultados se muestran en la Tabla 1 a-e.

Resumidamente, se cultivaron bacterias (E. coli, S. aureus) u hongos (C. albicans) hasta la fase medio-logarítmica en 10 mL de caldo de soja de tripticasa (TBS) de fuerza completa (3% p/v) (Becton-Dickinson, Cockeysville, MD). Los microorganismos fueron lavados una vez con Tris 10 mM, pH 7,4. Se añadieron 4 x 106 bacterias/cm o 1x105 cfu f�ngicas a 5 mL de gel de agarosa subyacente, que consistía en 0,03% (p/v) de TSB, 1% (p/v) de agarosa de

bajo-electroendoosmosistipo (Bajo-EEO) (Sigma, St. Louise, MO) y una concentración final de 0,02% (v/v) de Tween 20 (Sigma). La capa subyacente fue vertida en una placa petri de 85 mm de diámetro. Una vez que la agarosa solidific�, se perforaron pocillos de 4 mm de diámetro y se añadieron 6 ÉL de muestra de ensayo a cada pocillo. Las placas fueron incubadas a 37�C durante 3 horas para permitir la difusión de los p�ptidos. El gel subyacente se cubrió 5 entonces con 5 mL de capa subyacente fundida (6% de TSB y 1% de agarosa Bajo-EEO en dH2O). La actividad antimicrobiana de un p�ptido se visualiza como una zona clara alrededor de cada pocillo tras 18-24 horas de incubaci�n a 37�C para bacterias y 28�C para Candida albicans. A continuación se muestran otros ejemplos de p�ptidos que fueron escrutados y que se observ� que mostraban un efecto incrementado contra los microorganismos mencionados anteriormente. Algunos de los resultados se muestran en la tabla 1c, que presenta

10 los efectos contra C. albicans, la tabla 1d E. coli y la tabla 1e S. aureus.

Complemento CNY1 CNY1WWW CNYITELRRQHARASHLGLAWWW CNY187 CNY187WWW CKYILLLRRQHARAWRRGLRWWW

Factores de crecimiento GKR22 GKR22WWW GKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKWWW PKR21 PKR21WWW PKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNWWW

Factor de coagulación II VFR17 VFR17WWW VFRLKKWIQKVIDQFGEWWW

Inhibidor de proteína C SEK20 SEK20WWW SEKTLRKWLKMFKKRQLELYWWW PRELP

QPT22 QPT22WWW QPTRRPRPGTGPGRRPRPRPRPWWW

LL-37 LL-37 LL-37WWW LLGDFFRKSKEKI

KEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTESWWW

Omiganan PRELP OmigananWWW ILRWPWWPWRRKWWW Ejemplo 2

Ensayo de hem�lisis

Se centrifug� EDTA-sangre a 800 g durante 10 minutos, tras lo cual se elimin� el plasma y el recubrimiento. Los eritrocitos fueron lavados tres veces y resuspendidos en 5% de PBS, pH 7,4. A continuación las células fueron incubadas con rotación extremo-sobre-extremo durante 1 h a 37�C en presencia de p�ptidos (3-60 �M). Se us� Triton X-100 (Sigma-Aldrich) como control positivo. Después las muestras fueron centrifugadas a 800 g durante 10 minutos. Se midió la absorbancia de la hemoglobina liberada a λ 540 nm y en el gráfico se expresa como % de hem�lisis inducida por Triton X-100 (Tabla 1a).

Tabla 1a

P�ptido N� Secuencia: E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 29213 Candida albicansATCC 90028 Hem�lisis (%)

24/04/2006
24/04/2006: 21/04/2006 22/04/2006 20/04/2006

Media: SD Media SD Media SD Media SD Media SD

Crecimiento interno* contabilizado: Crecimiento interno no contabilizado

1. HKHGHGHGKHKNKGKKN: 0,947 0,526 0,947 0,526 0,747 0,382 1,493 0,516 2,321 0,057

2. LHKHGHGHGKHKNKGKKN: 7,277 0,200 2,320 0,299 1,963 0,547 0,920 0,185 2,382 0,022

3. LLHKHGHGHGKHKNKGKKN: 5,977 0,474 2,820 0,095 2,900 0,332 1,927 0,555 2,394 0,059

4. LLLHKHGHGHGKHKNKGKKN: 7,450 0,385 5,933 0,352 3,607 0,179 4,483 0,382 2,425 0,059

5. HKHGHGHGKHKNKGKKNL: 5,613 0,939 2,650 0,275 2,903 0,451 3,167 0,817 2,255 0,051

6. HKHGHGHGKHKNKGKKNLL: 6,060 0,686 3,753 0,341 3,763 0,309 3,313 0,291 2,431 0,063

7. HKHGHGHGKHKNKGKKNLLL: 6,893 0,535 4,940 1,161 5,710 0,665 4,723 0,731 2,418 0,058

8. HKHGHGHGLKHKNKGKKN: 6,597 1,067 2,833 0,459 2,803 0,399 2,713 0,388 2,509 0,060

9. HKHGHGHGLLKHKNKGKKN: 5,727 0,726 3,637 0,253 2,907 0,320 3,053 0,427 2,546 0,064

10. HKHGHGHGLLLKHKNKGKKN: 5,440 0,766 3,793 0,760 3,187 0,816 3,883 0,657 2,594 0,063

11. AAAHKHGHGHGKHKNKGKKN: 2,210 0,433 2,210 0,433 2,047 0,185 1,540 0,936 2,455 0,057

12. IIIHKHGHGHGKHKNKGKKN: 7,200 0,144 4,383 0,191 4,057 0,497 4,497 0,827 2,770 0,064

13. VVVHKHGHGHGKHKNKGKKN: 3,717 1,483 3,717 1,483 4,123 0,282 4,673 0,734 2,218 0,049

14. PPPHKHGHGHGKHKNKGKKN: 2,230 0,302 2,230 0,302 0,000 0,000 4,553 0,191 2,703 0,056

15. YYYHKHGHGHGKHKNKGKKN: 7,090 0,983 7,090 0,983 4,467 0,285 5,780 0,321 2,346 0,055

16. FHKHGHGHGKHKNKGKKN: 8,883 1,495 7,927 0,957 4,357 0,255 6,110 1,819 2,425 0,056

17. FFHKHGHGHGKHKNKGKKN: 4,350 1,419 2,307 0,811 3,320 0,314 3,667 0,552 2,182 0,052

18. FFFHKHGHGHGKHKNKGKKN: 8,307 1,781 8,877 0,795 4,140 0,504 4,543 0,485 2,303 0,055

24/04/2006
24/04/2006: 21/04/2006 22/04/2006 20/04/2006

Media: SD Media SD Media SD Media SD Media SD

Crecimiento interno* contabilizado: Crecimiento interno no contabilizado

19. WHKHGHGHGKHKNKGKKN: 4,253 1,117 4,253 1,117 4,090 1,017 3,950 0,519 2,503 0,062

20. WWHKHGHGHGKHKNKGKKN: 5,087 1,050 3,460 0,455 3,633 0,229 5,080 0,609 2,709 0,066

21. WWWHKHGHGHGKHKNKGKKN: 9,000 0,479 9,000 0,479 4,710 0,661 7,037 1,653 2,812 0,070

22. Ac-LLLHKHGHGHGKHKNKGKKN: 4,597 1,085 4,597 1,085 4,580 0,866 7,480 0,807 3,200 0,070

23. Ac-FFFHKHGHGHGKHKNKGKKN: 8,007 0,276 8,007 0,276 4,187 0,025 7,450 0,408 3,091 0,071

24. Ac-WWWHKHGHGHGKHKNKGKKN: 6,860 0,546 6,860 0,546 3,900 0,122 6,253 0,599 3,243 0,081

25. HKHGHGHGKHKNKGKKNWWW: 9,237 0,318 9,237 0,318 6,847 0,657 8,780 0,036 3,625 0,087

26. HKHGHGHGKHKNKGKKNFFF: 8,087 0,598 8,087 0,598 5,070 0,654 7,593 0,660 3,031 0,064

27. LLLNKKGKNKHKGHGHGHKH: 4,880 1,264 4,880 1,264 4,027 0,329 5,857 0,081 2,625 0,068

28. NKKGKNKHKGHGHGHKHLLL: 7,943 0,189 7,943 0,189 5,957 0,818 5,663 0,211 3,261 0,087

29. WWWWHKHGHGHGKHKNKGKK: 8,343 0,068 8,343 0,068 5,077 0,475 5,793 0,226 4,334 0,108

30. FFFFHKHGHGHGKHKNKGKK: 8,137 0,530 8,137 0,530 3,907 0,361 7,663 0,356 3,340 0,093

31. LLLLHKHGHGHGKHKNKGKK: 8,113 0,388 8,113 0,388 3,917 0,156 8,177 1,028 3,006 0,082

32. IIIIHKHGHGHGKHKNKGKK: 5,877 0,556 5,877 0,556 3,423 0,525 4,747 0,651 2,534 0,062

33. HKHGHGHGKHKNKGKKN: 2,167 1,016 2,167 1,016 0,797 0,200 1,347 0,516 2,194 0,051

34. HKHGHGHGKHKNKGKKNGKH: 8,483 1,270 3,257 0,843 2,183 0,306 2,340 0,387 2,376 0,037

35. HKHGHGHLKHKNKGKKNGKH: 3,413 0,083 3,413 0,083 2,937 0,067 3,147 0,344 2,212 0,052

36. HKHGHLHLKHKNKGKKNGKH: 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 2,194 0,052

37. HKHLHLHLKHKNKGKKNGKH: 8,030 0,114 8,030 0,114 4,073 0,548 5,993 0,178 3,564 0,069

24/04/2006
24/04/2006: 21/04/2006 22/04/2006 20/04/2006

Media: SD Media SD Media SD Media SD Media SD

Crecimiento interno* contabilizado: Crecimiento interno no contabilizado

38. HKHLHGHLKHKNKLKKNGKH: 4,967 1,704 4,967 1,704 2,807 0,348 3,800 0,249 2,334 0,051

39. HKHGHLHLKHKNKLKKNGKH: 6,537 0,408 4,157 0,100 2,520 0,236 3,310 0,489 2,303 0,051

40. HKHGHGHLKHKNKLKKNGKH: 3,577 0,186 3,577 0,186 2,720 0,113 3,237 0,153 2,425 0,058

41. HKHGHGHGKHKNKLKKNGKH: 6,473 0,575 3,203 0,309 3,417 0,375 2,177 0,170 2,346 0,053

42. GKHKNKGKKNGKHNGWK: 5,513 0,408 5,513 0,408 4,303 0,267 4,280 0,359 2,461 0,059

43. LGKHKNKGKKNGKHNGWK: 3,970 0,070 3,970 0,070 2,597 0,249 3,457 0,075 3,140 0,056

44. LLGKHKNKGKKNGKHNGWK: 7,500 0,384 7,500 0,384 3,417 0,107 4,227 0,227 3,152 0,081

45. LLLGKHKNKGKKNGKHNGWK: 7,237 0,444 7,237 0,444 3,653 0,242 5,200 0,401 2,667 0,072

46. GKHKNKGKKNGKHNGWKL: 6,077 0,136 6,077 0,136 4,390 0,436 4,420 0,316 2,564 0,062

47. GKHKNKGKKNGKHNGWKLL: 10,190 0,793 10,190 0,793 4,297 0,086 5,447 0,085 2,909 0,079

48. GKHKNKGKKNGKHNGWKLLL: 9,607 0,811 9,607 0,811 4,913 0,497 4,083 0,161 3,061 0,078

49. GKHKNKGKKLNGKHNGWK: 6,793 1,198 6,793 1,198 3,490 0,384 4,047 0,470 2,467 0,061

50. GKHKNKGKKLLNGKHNGWK: 9,500 1,621 9,500 1,621 3,700 0,534 3,970 0,092 3,237 0,080

51. GKHKNKGKKLLLNGKHNGWK: 6,897 0,075 6,897 0,075 3,263 0,312 4,300 0,176 2,722 0,068

52. AAAGKHKNKGKKNGKHNGWK: 5,380 1,592 5,380 1,592 2,757 0,250 3,353 0,253 2,661 0,069

53. IIIGKHKNKGKKNGKHNGWK: 6,627 0,293 6,627 0,293 3,247 0,189 4,770 0,690 2,885 0,081

54. FFFGKHKNKGKKNGKHNGWK: 7,530 0,190 7,530 0,190 3,910 0,123 5,847 0,376 3,352 0,095

55. WWWGKHKNKGKKNGKHNGWK: 9,757 0,179 9,757 0,179 4,133 0,575 7,140 0,391 2,703 0,068

56. GKHKNKGKKNGKHNGWK: 5,910 0,075 5,910 0,075 3,237 0,292 3,807 0,253 2,109 0,046

24/04/2006
24/04/2006: 21/04/2006 22/04/2006 20/04/2006

Media: SD Media SD Media SD Media SD Media SD

Crecimiento interno* contabilizado: Crecimiento interno no contabilizado

57. Ac-LLLGKHKNKGKKNGKHNGWK: 5,743 0,061 5,743 0,061 3,757 0,040 6,237 0,644 2,812 0,071

58. Ac-FFFGKHKNKGKKNGKHNGWK: 6,573 0,317 6,573 0,317 3,970 0,387 6,493 0,559 2,709 0,069

59. Ac-WWWGKHKNKGKKNGKHNGWK: 8,043 0,172 8,043 0,172 3,953 0,454 6,187 0,701 3,685 0,099

60. GKHKNKGKKNGKHNGWKWWW: 9,350 0,282 9,350 0,282 7,187 0,471 7,757 0,659 4,298 0,117

61. GKHKNKGKKNGKHNGWKFFF: 8,487 1,186 8,487 1,186 7,200 0,321 8,033 0,775 4,776 0,134

62. HKHGHLHLKHKNKGKKNGKH: 5,537 1,380 5,537 1,380 2,743 0,544 3,123 0,663 2,437 0,059

63. HKHGHLHLKHKNKGKKNGKH: 6,003 2,117 6,003 2,117 3,057 0,345 4,033 0,362 2,170 0,052

LL-37: 6,53 0,256 0,653 0,256 4,660 0,969 4,890 1,092 21,464 0,765

Tabla 1b

Valores de RDA (mm)

E. coli ATCC 25922: S. aureus ATCC 29213 en

Secuencia: Tris HCl 10 mM (pH 7,4) Tris HCl 10 mM (pH 7,4)

T1: KNKGKKNGKH 2,56 0,33 0,00 0,00

T2: KNKGKKNGKHWWW 8,90 0,47 4,23 0,78

T3: KNKGKKNGKWWW 9,16 0,64 4,07 0,08

T4: KNKGKKNGWWW nd nd nd nd

T5: KNKGKKNWWW 8,36 0,47 2,85 0,44

T6: KNKGKKWWW 8,16 0,45 2,79 0,27

T7: KNKGKWWW 6,84 0,52 0,00 0,00

T8: KNKGKWWW 2,94 0,72 0,00 0,00

T9: KNKWWW 2,73 0,10 0,00 0,00

T10: KNWWW 2,69 0,95 0,00 0,00

T11: KWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T12: WWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T13: KNKGKKNGKHWWWWW 7,93 0,18 5,58 0,59

T14: KNKGKKNGKWWWWW 7,90 0,83 5,07 0,24

T15: KNKGKKNGWWWWW 8,03 0,04 3,90 0,52

T16: KNKGKKNWWWWW 9,09 0,06 3,83 0,55

T17: KNKGKKWWWWW 8,98 0,28 3,88 0,26

T18: KNKGKVWWVWW 8,21 0,14 1,82 0,26

T19: KNKGWWWWW 4,49 0,26 1,10 0,09

T20: KNKWWWWW 4,22 0,02 0,55 0,08

T21: KNWWWWW 1,70 0,37 0,00 0,00

T22: KWWWWW 2,18 0,27 0,00 0,00

T23: KNKGKKNGKHWWW 8,65 0,18 3,26 0,27

T24: NKGKKNGKHWWW 8,44 0,49 2,41 0,54

T25: KGKKNGKHWWW 8,87 0,23 2,55 0,17

T26: GKKNGKHWWW 7,47 0,57 1,76 0,32

T27: KKNGKHWWW 7,56 0,30 1,68 0,35

T28: KNGKHWWW 4,99 0,52 0,00 0,00

T29: NGKHWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T30: GKHWWW 3,05 0,01 0,00 0,00

T31: KHWWW 1,48 0,21 0,00 0,00

T32: HWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T33: WWWKNKGKKNGKH 7,95 0,31 2,20 0,40

T34: WWWKNKGKKNGK 4,94 0,82 0,43 0,24

T35: WWWKNKGKKNG 1,57 0,08 0,00 0,00

Valores de RDA (mm)

E. coli ATCC 25922: S. aureus ATCC 29213 en

Secuencia: Tris HCl 10 mM (pH 7,4) Tris HCl 10 mM (pH 7,4)

T36: WWWKNKGKKN 5,04 0,18 0,66 0,09

T37: WWWKNKGKK 3,28 0,06 0,11 0,06

T38: WWWKNKGK 1,42 0,15 0,00 0,00

T39: WWWKNKG 0,00 0,00 0,00 0,00

T40: WWWKNK 0,00 0,00 0,00 0,00

T41: WWWKN 0,00 0,00 0,00 0,00

T42: WWWK 0,00 0,00 0,00 0,00

T43: SNSGSSNGSH 0,00 0,00 0,00 0,00

T44: SNSGSSNGSHWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T45: WWWSNSGSSNGSH 0,00 0,00 0,00 0,00

T46: KKKKKKKKKK 5,94 0,71 1,32 0,40

T47: KKKKKKKKKKWWW 7,48 0,13 4,46 0,71

T48: KKKKKKKKKWWW 9,26 0,30 7,19 1,30

T49: KKKKKKKKWWW 7,90 0,03 5,48 1,33

T50: KKKKKKKWWW 7,82 0,26 4,90 0,69

T51: KKKKKKWWW 8,12 0,42 4,16 0,33

T52: KKKKKWWW 9,01 0,06 3,43 0,46

T53: KKKKWWW 8,11 0,44 2,85 0,33

T54: KKKWWW 4,93 0,48 2,02 0,49

T55: KKWWW 2,95 0,43 1,01 0,38

T56: KWWW 4,48 0,28 0,75 0,18

T57: SSSSSSSSSS 0,00 0,00 0,00 0,00

T58: SSSSSSSSSSWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T59: DDDDDDDDDD 0,00 0,00 0,00 0,00

T60: DDDDDDDDDDWWW 0,00 0,00 0,00 0,00

T61: KNKGKKNGKHGSGSPWWW 8,64 0,04 1,52 0,17

LL-37: 7,55 0,36 3,23 0,67

Tabla 1c Tabla 1d Tabla 1e LISTADO DE SECUENCIAS

Datos

P�ptido: P�ptido (�M) Media SD

GKR-22: 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

10: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

50: 1,04 1,08 1,01 1,04 0,04

100: 3,66 3,31 2,50 3,16 0,60

GKR-22-WWW: 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

10: 0,50 0,94 0,54 0,66 0,24

50: 1,95 1,59 1,40 1,65 0,28

100: 5,30 5,74 5,62 5,55 0,23

PKR-21: 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

10: 0,42 0,39 0,58 0,46 0,10

50: 4,66 3,95 3,51 4,04 0,58

100: 4,65 4,56 4,55 4,59 0,06

PKR-21-WWW: 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5: 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1: 0,55 0,42 0,51 0,49 0,07

5: 1,26 1,06 1,10 1,14 0,11

10: 3,54 2,82 2,97 3,11 0,38

50: 5,84 5,44 5,13 5,47 0,36

100: 6,69 7,04 7,19 6,97 0,26

Datos

P�ptido: P�ptido (�M) Media SD

GKR-22: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0 0 0 0,00 0,00

1: 0 0 0 0,00 0,00

5: 1,88 1,85 2,07 1,93 0,12

10: 2,07 3,47 2,74 2,76 0,70

50: 3,68 3,65 3,61 3,65 0,04

100: 4,5 5,24 4,19 4,64 0,54

GKR-22-WWW: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0,14 0,85 0,17 0,39 0,40

1: 2,74 3,2 2,59 2,84 0,32

5: 2,97 3,58 3,2 3,25 0,31

10: 5,67 5,68 5,48 5,61 0,11

50: 6,61 6,64 6,47 6,57 0,09

100: 7,8 8,04 8,12 7,99 0,17

PKR-21: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0,3 0,7 0,58 0,53 0,21

1: 0,56 0,97 1,02 0,85 0,25

5: 0,63 1,65 0,55 0,94 0,61

10: 0,94 1,08 1,02 1,01 0,07

50: 1,16 1,52 1,01 1,23 0,26

100: 1,34 1,37 1,39 1,37 0,03

PKR-21-WWW: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 1,26 1,05 0,84 1,05 0,21

1: 3,6 2,59 3,49 3,23 0,55

5: 4,99 5,03 4,75 4,92 0,15

10: 5,86 5,87 6,13 5,95 0,15

50: 7,71 7,97 6,98 7,55 0,51

100: 7,34 8,26 7,99 7,86 0,47

Datos

P�ptido: P�ptido (�M) Media SD

GKR-22: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0 0 0 0,00 0,00

1: 0,4 0,26 0,25 0,30 0,08

5: 1,87 1,67 2,03 1,86 0,18

10: 2,37 2,46 1,95 2,26 0,27

50: 3,03 3,09 2,96 3,03 0,07

100: 3,88 3,94 3,07 3,63 0,49

GKR-22-WWW: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0,36 0,49 0,6 0,48 0,12

1: 3,6 3,67 3,78 3,68 0,09

5: 3,87 4,57 4,53 4,32 0,39

10: 6,04 6,87 5,73 6,21 0,59

50: 7,12 8,12 7,41 7,55 0,51

100: 7,4 8,78 8,05 8,08 0,69

PKR-21: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0 0 0 0,00 0,00

1: 0 0 0 0,00 0,00

5: 0 0 0 0,00 0,00

10: 0,17 0,4 0,77 0,45 0,30

50: 1,06 1,6 1,24 1,30 0,27

100: 2,63 2,54 1,84 2,34 0,43

PKR-21-WWW: 0,1 0 0 0 0,00 0,00

0,5: 0 0 0 0,00 0,00

1: 2,56 2,59 3,06 2,74 0,28

5: 2,98 2,5 3,07 2,85 0,31

10: 3,53 4,06 3,83 3,81 0,27

50: 4,21 5,14 4,23 4,53 0,53

100: 4,77 5,67 5,02 5,15 0,46

<110> Dermagen AB

<120> Composición mejorada

<130> P5856007

<160> 12

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 83

<212> PRT

<213> Quinin�geno humano

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> quinin�geno humano

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> quinon�geno humano

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> quinin�geno humano

<400> 12

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada que comprende

a) un primer conjunto de residuos de amino�cido seleccionado de las SEQ ID Nos 10 y 12, y

b) un segundo conjunto de residuos de amino�cido que consiste en de 3 a 8 residuos de amino�cido hidrof�bicos seleccionados del grupo que consiste en V, L, I, F, Y y W, y donde dicho segundo conjunto de residuos de amino�cido est� unido al extremo aminoterminal o carboxiterminal de dicho primer conjunto de residuos de amino�cido, obteniendo de este modo dicho p�ptido antimicrobiano con actividad antimicrobiana incrementada en comparación con el primer conjunto de residuos solo.
2.

El p�ptido antimicrobiano según la reivindicación 1, donde dicho segundo conjunto comprende el mismo residuo de amino�cido hidrof�bico o una mezcla de diferentes residuos de amino�cido hidrof�bicos.
3.

El p�ptido antimicrobiano según las reivindicaciones 1-2, donde dicho segundo conjunto se selecciona del grupo que consiste en F(3-8), W(3-8), I(3-8), Y(3-8) y V(3-8).
4.

El p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho p�ptido se selecciona del grupo que consiste en el n� 4, 7, 12-13, 15, 18, 21-26, 45, 48, 53-55 y 57-61 de la tabla 1A.
5.

El p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho p�ptido antimicrobiano es modificado mediante esterificaci�n en el extremo C y/o PEGilaci�n o alquilaci�n en el extremo N.
6.

El p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde cualquiera de los amino�cidos puede ser reemplazado por el correspondiente amino�cido D.
7.

Una composición antimicrobiana/farmacéutica que comprende un p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente farmac�uticamente aceptable.
8.

La composición antimicrobiana/farmacéutica según la reivindicación 7, donde la composición antimicrobiana/farmacéutica se encuentra en la forma de gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, recubrimiento de catéteres y agujas, cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, geles, ungüentos, dispersiones, suspensiones, cremas, aerosoles, gotas o formas inyectables.
9.

Un producto que comprende el p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición antimicrobiana/farmacéutica según las reivindicaciones 7 a 8, donde el producto se selecciona del grupo que consiste en vendas, escayolas, suturas, jabón, tampones, pañales, champ�s, pasta de dientes, compuestos anti-acné, cremas solares, textiles, adhesivos, recubrimientos de heridas, disoluciones de limpieza, lentes de contacto, o implantes.
10.

El uso del p�ptido antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o de la composición según las reivindicaciones 7 a 8 � del producto según la reivindicación 9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o infección provocada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacterias, virus, parásitos, hongos y levaduras.
11.

El uso según la reivindicación 10, donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en dermatitis at�pica, imp�tigo, úlceras cut�neas crónicas, heridas infectadas agudas o crónicas y heridas por quemadura, acné, otitis externa, infecciones f�ngicas, neumonía, dermatitis seborreica, intertrigo candida, vaginitis candida, candidiasis orofar�ngea, infecciones oculares e infecciones nasales.