BRPI0711635A2 - formulação de vacina de nicotina-veìculo - Google Patents
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Abstract
FORMULAçãO DE VACINA DE NICOTINA-VEìCULO. A presente invenção refere-se aos campos de medicina, saúde pública, vacina e formulação de fármaco. A invenção proporciona formulações de composições que compreendem um conjugado de nicotina-veículo e um estabilizador, em que o dito estabilizador compreende um dissacarídeo não-redutor e um tensoativo náo-iónico. As formulações de composições são estáveis após um longo tempo de armazenagem na temperatura ambiente.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- ÇÃO DE VACINA DE NICOTINA-VEÍCULO".
Antecedentes da Invenção Campo da Invenção
A presente invenção refere-se aos campos de medicina, vacina
e formulação farmacêutica. A invenção proporciona formulações que com- preendem um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus e um estabili- zador, onde o dito estabilizador compreende um dissacarídeo não-redutor e um tensoativo não-iônico. As formulações Iiofilizadas são estáveis após um longo tempo de armazenagem na temperatura ambiente. Técnica Relacionada
As vacinas para o tratamento ou a prevenção da dependência de nicotina têm atraído recentemente a atenção do público. Estas vacinas tipicamente contêm moléculas de nicotina que estão covalentemente ligadas a um veículo, visto que a nicotina é um composto orgânico de baixo peso molecular e não é capaz de produzir uma resposta imune sozinha. Além dis- so, uma vez que a nicotina não possui grupos funcionais adequados para tal ligação a um veículo, a introdução de uma seqüência de ligação nas molécu- las de nicotina é tipicamente requerida. O desenvolvimento de diversas vaci- nas foi recentemente descrito, por exemplo, em US 5.876.727, US 6.232.082, US 6.656.469 e US 6.932.971. Os conjugados descritos não somente variam na natureza do veículo, como também na natureza da seqüência de ligação e no local onde a seqüência de ligação é introduzida na nicotina.
A US 6.932.971 descreve o acoplamento das moléculas de nico- tina a uma partícula similar a vírus (VLP) por uma seqüência de ligação com uma funcionalidade de éster, que forma um conjugado de nicotina-veículo ordenado e repetitivo e resulta na produção de alto título de anticorpos es- pecíficos para a nicotina. Os mesmos autores mostraram recentemente que uma vacina compreendendo uma partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA Οβ, ao qual estão covalentemente ligadas moléculas de nicotina por uma seqüência de ligação com uma funcionalidade de éster, pode ser eficaz para a cessação de fumar em seres humanos (Maurer et al, Eur. J. Immun. 2005 35:2031-40).
A exigência das composições de vacina de serem estáveis e minimizarem ou evitarem a degradação química e/ou física implica a neces- sidade de desenvolvimento de formulações que satisfaçam tais exigências.
Sumário da Invenção
Surpreendentemente foi descoberta uma formulação liofilizada que estabiliza os conjugados de nicotina-partícula similar a vírus, os quais contêm moléculas de nicotina covalentemente ligadas à partícula similar a vírus por meio de uma seqüência de ligação, a qual compreende pelo menos uma funcionalidade ae éster carboxíiico. Aiém disso, descobriu-se surpreen- dentemente que esta formulação liofilizada é estável durante um longo perí- odo de tempo de armazenagem na temperatura ambiente ou mesmo em temperatura acelerada (40 °C). Ademais, a formulação liofilizada da presente invenção compreende uma composição de estabilizador simples e econômi- ca devido a um número mínimo de excipientes incluídos nela.
Assim, em um aspecto, a invenção proporciona uma formulação liofilizada compreendendo (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador compreen- dendo: (c) pelo menos um dissacarídeo não-redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não-redutor é de 0,5% a 15% (p/v) em termos da con- centração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a 6,6 antes da liofilização.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um processo para preparar a formulação liofilizada da invenção.
Ainda em um outro aspecto, a invenção proporciona uma formu- lação reconstituída compreendendo a formulação Iiofilizada da invenção dis- solvida e/ou suspensa em uma solução fisiológica aceitável ou em água es- téril, preferivelmente em água para injeção (WFI). Em uma modalidade pre- ferida adicional, a formulação reconstituída adicionalmente compreende um adjuvante.
Descrição Detalhada da Invenção
A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém de versado na técnica à qual pertence esta invenção.
Adjuvante: O termo "adjuvante", como usado neste documento, refere-se a estimuladores não específicos da resposta imune ou substâncias que permitem a geração de um depósito no hospedeiro, que, quando combi- nadas com a vacina e a composição farmacêutica, respectivamente, da pre- sente invenção, podem proporcionar uma resposta imune ainda mais au- mentada. Pode ser usada uma variedade de adjuvantes. Os exemplos inclu- em o adjuvante de Freund completo e incompleto, o hidróxido de alumínio e o dipeptídeo de muramila modificado. Os adjuvantes adicionais são os géis minerais, tais como o hidróxido de alumínio, as substâncias tensoativas, tais como a lisolecitina, os polióis pluronic, os poliânions, os peptídeos, as emul- sões de óleos, as hemocianinas de lapas de buraco da fechadura, o dinitro- fenol, e os adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como o BCG (ba- cilo de Calmette Guerin) e o Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bastante conhecidos na técnica. Os adjuvantes adicionais que po- dem ser administrados com as composições da invenção incluem, porém não estão limitados ao imunomodulador de lipídio de monofosforila, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, Sais de alumínio (Alúmen), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294, e a Tecnologia de adjuvante virossômico. Os adjuvantes podem também compreender uma mistura destas substâncias. A VLP tem sido, em geral, descrita como um adjuvante. Entretanto, o termo "adjuvante", como usado dentro do contexto deste pedido, refere-se a um adjuvante não sendo a VLP usada para a formulação inventiva, preferivelmente além da dita VLP.
Proteína de cobertura: O termo "proteína de cobertura", e o ter- mo usado de modo intercambiável "proteína de capsídio" dentro deste pedi- do, refere a uma proteína viral, preferivelmente uma subunidade de um cap- sídio natural de um vírus, preferivelmente de um bacteriófago de RNA, que é capaz de ser incorporada em um capsídio de vírus ou uma VLP.
Formulação antes da liofilização: O termo "formulação antes da liofilização" refere-se à formulação líquida da presente invenção, a qual é submetida ao processo de liofilização, típica e preferivelmente dentro de 24 horas, e adicionalmente, típica e preferivelmente dentro de 8 horas, e ainda mais típica e preferivelmente dentro de 2 a 4 horas. O termo "processo de liofilização" e o termo "processo de dessecação por congelamento" são usa- dos de modo intercambiável neste documento e serão considerados como sinônimos.
Formulação liofilizada: o termo "formulação liofilizada" refere-se à composição que é obtida ou obtenível pelo processo de dessecação por congelamento de uma formulação líquida. Típica e preferivelmente, ela é uma composição sólida tendo um teor de água de menos do que 5%, prefe- rivelmente de menos do que 3%. De preferência, o termo "formulação Iiofili- zada" refere-se à composição obtida ou obtenível pelo processo de preparar a formulação liofilizada da presente invenção.
Formulação reconstituída: o termo "formulação reconstituída" refere-se à formulação líquida que resultou da dissolução e/ou suspensão da formulação liofilizada em uma solução fisiologicamente aceitável.
Seqüência de ligação: o termo "seqüência de ligação", conforme usado neste documento, refere-se a uma entidade molecular que liga cova- lentemente a molécula de nicotina à partícula similar a vírus.
Temperatura ambiente: o termo "temperatura ambiente", con- forme usado neste documento, refere-se a uma temperatura de 15°C a 30 °C, preferivelmente de 20°C a 27°C, mais preferivelmente 25°C.
Estável: o termo "estável", como usado neste documento, refere- se ao estado da formulação liofilizada da invenção compreendendo conjuga- dos de nicotina-VLP, preferivelmente compreendendo conjugados de nicoti- na-VLP de bacteriófago de RNA Οβ, e ainda mais preferivelmente compre- endendo Nic-Οβ, no qual, até 15 semanas, preferivelmente até 20 semanas, mais preferivelmente até 25 semanas de armazenagem na temperatura am- biente ou em temperatura acelerada (40SC), (i) a quantidade total de nicotina e derivados de nicotina livres é menos do que 7%, preferivelmente menos do que 5%, mais preferivelmente menos do que 3%, ainda mais preferivelmente menos do que 2%, da quantidade total de nicotina na formulação, e (ii) a quantidade da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP, preferi- velmente da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP de bacterió- fago de RNA Qp, preferivelmente da soma de Nic-oligômeros e agregados de Οβ, não aumenta mais do que 10%, preferivelmente 7%, mais preferivel- mente 4% em comparação com a quantidade da soma de nicotina- oligômeros e agregados de VLP, preferivelmente da soma de nicotina- oligômeros e agregados de VLP de bacteriófago de RNA Οβ, preferivelmen- te da soma de Nic-oligômeros e agregados de Οβ, na formulação antes da liofilização. A quantidade da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP na formulação após a armazenagem subtraída a quantidade da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP antes da liofilização dá a por- centagem de aumento, como usado neste documento. Por exemplo, se na formulação antes da liofilização houver 1% de Nic-oligômeros e agregados de Οβ e, após a liofilização de acordo com a presente invenção e 15 sema- nas de armazenagem, houver 4% de Nic-oligômeros e agregados de Οβ na formulação reconstituída, então a porcentagem de aumento é 3%. O termo "nicotina e derivados de nicotina livres", conforme usado neste documento, refere-se à nicotina e aos derivados de nicotina que não estão covalente- mente ligados à partícula similar a vírus da invenção. O método para deter- minar a quantidade total de nicotina, bem como de nicotina ou derivados de nicotina livres, é preferivelmente o ensaio de RP-HPLC, como descrito no EXEMPLO 1 aqui contido. O método para determinar a quantidade da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP, preferivelmente da soma de nicotina-oligômeros e agregados de VLP de bacteriófago de RNA Οβ, prefe- rivelmente da soma de Nic-oligômeros e agregados de Qβ, é preferível o ensaio de fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4), co- mo descrito no EXEMPLO 1 aqui contido, em que as frações contendo partí- culas maiores do que os monômeros e os dímeros de nicotina-VLP, preferi- velmente maiores do que os monômeros e os dímeros de nicotina-VLP de bacteriófago de RNA Qβ, preferivelmente maiores do que os monômeros e os dímeros de Nic-Qβ, são combinadas no cálculo.
Oligômero: O termo "oligômero", conforme usado no termo "nico- tina-oligômero de VLP", "nicotina-oligômero de VLP de bacteriófago de RNA Qβ" e "Nic-oligômero de Qβ", refere-se à agregação de pelo menos três e até dez VLPs ou VLPs de Qβ, respectivamente.
Agregado: O termo "agregado", conforme usado no termo "nico- tina-agregado de VLP", "nicotina-agregado de VLP de bacteriófago de RNA Qβ" e "Nic-agregado de Qβ", refere-se à agregação de pelo menos dez VLPs ou VLPs de Οβ, respectivamente.
Partícula de vírus: O termo "partícula de vírus", conforme usado neste documento, refere-se à forma morfológica de um vírus. Em alguns ti- pos de vírus, compreende um genoma circundado por um capsídio de prote- ína; outros têm estruturas adicionais (p.ex., cápsulas, caudas, etc.).
A partícula similar a vírus (VLP), conforme usada neste docu- mento, refere-se a uma partícula de vírus não replicativa ou não-infecciosa, preferivelmente uma não replicativa e não-infecciosa, ou refere-se a uma estrutura não replicativa ou não-infecciosa, preferivelmente uma não replica- tiva e não-infecciosa, que se parece com uma partícula de vírus, preferivel- mente um capsídio de um vírus. O termo "não replicativa", conforme usado neste documento, refere-se a ser incapaz de replicar o genoma compreendi- do pela VLP. O termo "não-infecciosa", conforme usado neste documento, refere-se a ser incapaz de entrar na célula hospedeira. De preferência, uma partícula similar a vírus de acordo com a invenção é não replicativa e/ou não-infecciosa visto que não tem todo o, ou parte do, genoma ou função do genoma viral. Em uma modalidade, uma partícula similar a vírus é uma par- tícula de vírus, na qual o genoma viral tenha sido física ou quimicamente inativado. De modo típico e mais preferivelmente, uma partícula similar a vírus não tem todos os, ou parte dos, componentes replicativos e infecciosos do genoma viral. Uma partícula similar a vírus de acordo com a invenção pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma. Uma modalidade típica e preferida de uma partícula similar a vírus de acordo com a presente inven- ção é um capsídio viral, tal como o capsídio viral do vírus, do bacteriófago, preferivelmente do fago de RNA, correspondente. Os termos "capsídio viral" ou "capsídio" referem-se a um agrupamento macromolecular composto de subunidades de proteínas virais. Tipicamente, existem 60, 120, 180, 240, 300, 360 e mais do que 360 subunidades de proteínas virais. Típica e prefe- rivelmente, as interações destas subunidades resultam na formação de cap- sídio viral ou estrutura similar ao capsídio viral com uma organização repeti- tiva inerente, onde a dita estrutura é, tipicamente, esférica ou tubular. Por exemplo, os capsídios de fagos de RNA ou HBcAgs têm uma forma esférica de simetria icosaédrica. O termo "estrutura similar a capsídio", conforme u- sado neste documento, refere-se a um agrupamento macromolecular com- posto de subunidades de proteínas virais que se parecem com a morfologia do capsídio no sentido acima definido, porém que se desviam do agrupa- mento simétrico típico, ao mesmo tempo mantendo um grau suficiente de ordem e repetição. Uma característica comum da partícula de vírus e da par- tícula similar a vírus é seu arranjo altamente ordenado e repetitivo de suas subunidades.
Partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA: Conforme usado neste documento, o termo "partícula similar a vírus de um bacteriófa- go de RNA" refere-se a uma partícula similar a vírus compreendendo, ou preferivelmente consistindo essencialmente em, ou consistindo em, proteí- nas de cobertura, mutantes ou fragmentos delas, de um bacteriófago de RNA. Além disso, partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA que se parece com a estrutura de um bacteriófago de RNA, que é não replicativa e/ou não-infecciosa, e que não tem pelo menos o gene ou os genes que co- dificam para o mecanismo de replicação do bacteriófago de RNA, e tipica- mente também que não tem o gene ou os genes codificando a proteína ou as proteínas responsáveis pela união viral ao, ou entrada no, hospedeiro. Esta definição deve, entretanto, também incluir as partículas similares a ví- rus de bacteriófagos de RNA, nas quais o gene ou os genes antes mencio- nados ainda estão presentes, porém inativos, e, portanto, também resultan- do em partículas similares a vírus não replicativas e/ou não-infecciosas de um fago de RNA. As VLPs preferidas derivadas de bacteriófagos de RNA exibem simetria icosaédrica e consistem em 180 subunidades. Dentro desta presente divulgação, os termos "subunidade" e "monômero" são usados de modo intercambiável e equivalente dentro deste contexto. Os métodos prefe- ridos para tornar uma partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA não replicativa e/ou não-infecciosa é por inativação física, química, tal como irradiação de UV1 tratamento com formaldeído, típica e preferivelmente por manipulação genética.
Um ou uma: quando os termos "um" ou "uma" são usados nesta descrição, eles significam "pelo menos um(a)" ou "um(a) ou mais", a não ser que de outro modo indicado.
Em um aspecto, a invenção proporciona uma formulação Iiofili- zada compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador compreen- dendo: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não- redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não-redutor é de 0,5% a 15% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um, preferivelmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a 6,6 antes da liofili- zação. Como se sabe na técnica que a liofilização da composição de proteí- na normalmente resulta em um produto que é mais estável e, portanto, tem uma vida útil mais longa. Além disso, a formulação liofilizada tem uma esta- bilidade aumentada da funcionalidade de éster presente no conjugado de nicotina-VLP e uma estabilidade aumentada do componente de RNA.
Alternativamente, em um outro aspecto, a invenção proporciona uma formulação líquida compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabili- zador compreendendo: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissa- carídeo não-redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não-redutor é de 0,5% a 15% (p/v) em termos da concentração na dita formulação; (d) pelo menos um, preferivelmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concen- tração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concentração na dita formulação; e onde a dita composição de estabiliza- dor tem um valor de pH de 5,4 a 6,6. Além disso, a invenção proporciona uma formulação obtenível por um método de liofilização que compreende a etapa de congelar a dita formulação líquida e secar a dita formulação líquida.
Em um outro aspecto alternativo, a invenção proporciona uma formulação líquida compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicoti- na-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita VLP por uma se- qüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma fun- cionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador compreendendo ou consistindo em: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concentração na dita formulação; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a 6,6.
Em uma modalidade preferida, a formulação líquida ou liofilizada da invenção compreende somente um carboidrato, preferivelmente somente um açúcar, o açúcar é preferivelmente um dissacarídeo não-redutor. Em uma modalidade preferida, a formulação líquida ou Iiofilizada da invenção não compreende um aminoácido adicionado. Isto significa que nenhum ami- noácido adicional é adicionado à formulação. Entretanto, a formulação pode compreender uma quantidade mínima de aminoácidos devido à degradação da partícula similar a vírus.
Em uma modalidade preferida, a formulação líquida ou Iiofilizada da invenção não compreende um soro albumina bovina ou uma soro albumi- na humana. Em uma modalidade preferida adicional, a formulação da inven- ção não compreende qualquer tipo de uma proteína do soro. A exclusão do soro vantajosamente evita o problema potencial de contaminação do soro.
Em uma modalidade preferida, a formulação líquida ou Iiofilizada da invenção, em particular a formulação Iiofilizada da invenção, não compre- ende o cloreto de sódio. A exclusão do NaCI evita a osmolaridade alta des- necessária na formulação. Além disso, a exclusão do sal adicionalmente e- limina o efeito adverso possível do sal sobre a estabilidade da proteína du- rante a liofilização.
Em uma modalidade preferida, o pelo menos um, preferivelmen- te um único, dissacarídeo não-redutor é a sacarose ou a trealose. Em uma modalidade preferida adicional, o dissacarídeo não-redutor é a trealose.
Em uma modalidade preferida, a concentração do pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor é de 3% a 15% (p/v), preferivelmente de 5% a 12% (p/v), preferivelmente de 5% a 10% (p/v), pre- ferivelmente de 7,5% a 10% (p/v), preferivelmente 10% (p/v) em termos de concentração na formulação líquida, ou com relação à formulação liofilizada, em termos da concentração na formulação antes da liofilização. A concen- tração de trealose expressa no pedido inteiro, a não ser que de outro modo explicitamente indicado, refere-se à concentração de diidrato (2H20) de trea- lose. É conhecimento geral para uma pessoa versada converter entre a con- centração de diidrato de trealose e a concentração de trealose sem água. Por exemplo, 10% de diidrato de trealose são iguais a 9% de trealose sem água. Em uma modalidade preferida, a composição de estabilizador da formulação líquida ou Iiofilizada da invenção, preferivelmente da formulação liofilizada, adicionalmente compreende pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa. Em uma modalidade preferida adicional, a concen- tração total do dito dissacarídeo não-redutor e do dito agente de massa é de 0,5% a 15% (p/v), com a condição que a concentração do dito dissacarídeo não-redutor seja pelo menos 0,5% (p/v), preferivelmente pelo menos 1% (p/v), em termos da concentração na formulação líquida, ou com relação à formulação liofilizada, em termos da concentração na formulação antes da iiofiüzação. Ainda em uma modalidade preferida adicional, a concentração total do dito pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não- redutor e do dito pelo menos um, preferivelmente um único, agente de mas- sa é de 3% a 10%, preferivelmente de 3% a 8% (p/v), preferivelmente de 3% a 7%, preferivelmente de 4,5% a 7%, mais preferivelmente de 4,5% a 6% (p/v) na formulação líquida, ou com relação à formulação liofilizada, em ter- mos da concentração na formulação antes da liofilização.
Em uma modalidade preferida, a concentração total do dito pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor e do dito pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa é de 3% a 10% (p/v), preferivelmente de 4,5% a 7% (p/v) na formulação antes da liofilização, onde a concentração do dito dissacarídeo não-redutor é pelo menos 1% (p/v). De preferência, a osmolaridade da formulação é de 250 a 350 mosm/Kg, mais preferivelmente cerca de 300 mosm/Kg.
Em uma modalidade preferida, a concentração total do dito pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor e do dito pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa é de 3% a 10% (p/v), preferivelmente de 4,5% a 7% (p/v) na formulação antes da liofilização, onde a concentração do dito agente de massa é pelo menos 1% (p/v). De preferência, a osmolaridade da formulação é de 250 a 350 mosm/Kg, mais preferivelmente cerca de 300 mosm/Kg.
Em uma modalidade preferida, a concentração total do dito pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor e do dito pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa é de 3% a 10% (p/v), preferivelmente de 4,5% a 7% (p/v) na formulação antes da liofilização, onde a concentração do dito agente de massa é pelo menos 1% (p/v) e a concentração do dito dissacarídeo não-redutor é pelo menos 1% (p/v). De preferência, a osmolaridade da formulação é de 250 a 350 mosm/Kg, mais preferivelmente cerca de 300 mosm/Kg.
Em uma modalidade preferida, o dissacarídeo não-redutor é a trealose e o agente de massa é o manitol.
Em uma modalidade muito preferida, a concentração total do dito peio menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor e do dito pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa é de 5,0 a 6,5% (p/v) na formulação antes da liofilização. Em uma modalidade prefe- rida adicional, a razão entre o agente de massa e o dissacarídeo não-redutor é de 3,5:1 a 4,5:1, preferivelmente 4:1. Ainda em uma modalidade preferida adicional, o dissacarídeo não-redutor é a trealose e o agente de massa é o manitol. Em uma modalidade muito preferida, a concentração de trealose é 1,1% (p/v) e a concentração de manitol é 4,4% (p/v), na formulação antes da liofilização.
Em uma modalidade preferida, o agente de massa é o manitol ou a glicina. Em uma modalidade preferida adicional, o agente de massa é o manitol. A inclusão do agente de massa, preferivelmente o manitol, contribui para a obtenção de uma estrutura de torta estável e pode permitir uma tem- peratura de secagem primária mais elevada no processo de liofilização, o que vantajosamente reduz o custo de produção.
Em uma modalidade preferida, o pH da composição de estabili- zador é de 5,4 a 6,6, preferivelmente de 5,6 a 6,4, preferivelmente de 5,8 a 6,4, preferivelmente de 6,0 a 6,4, preferivelmente 6,2. Em uma modalidade preferida adicional, o pH está a 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5 e 6,6.
Em uma modalidade preferida, o tensoativo não-iônico é de 0,0025% a 0,02% (p/v), preferivelmente 0,0025%-0,01% (p/v), preferivelmen- te 0,005% (p/v), na formulação líquida, ou com relação à formulação Iiofiliza- da, em termos da concentração na formulação antes da liofilização.
Em uma modalidade preferida, o tensoativo não-iônico é o polis- sorbato 20 ou o polissorbato 80. Em uma modalidade preferida, o tensoativo não-iônico é o polissorbato 20.
As partículas similares a vírus podem ser de qualquer vírus co- nhecido na técnica tendo uma estrutura ordenada e repetitiva. Os vírus de DNA ou RNA ilustrativos, cuja proteína de cobertura ou de capsídio pode ser usada para a preparação das VLPs, foram descritos no WO 2004/009124 na página 25, linhas 10-21, na página 26, linhas 11-28, e na página 28, linha 4, até a página 31, linha 4. Estas descrições são incorporadas neste documen- to como forma de referência.
Em uma modalidade preferida adicional, a partícula similar a ví- rus é de um vírus selecionado a partir de um grupo que consiste em: a) bac- teriófagos de RNA; b) bacteriófagos; c) vírus da Hepatite B, preferivelmente a sua proteína de capsídio (Ulrich, et al, Virus Res. 50:141-182 (1998)) ou a sua proteína de superfície (WO 92/11291); d) vírus do sarampo (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) vírus de Sindbis; f) rotavírus (US 5.071.651 e US 5.374.426); g) vírus da febre aftosa (Twoméy, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) vírus de Nonwalk (Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); i) Alfavírus; j) retrovírus, preferivelmente a sua proteína GAG (WO 96/30523); k) retrotransposon Ty, preferivelmente a proteína p1; I) vírus do papiloma humano (WO 98/15631); m) vírus do polioma; n) vírus do mosaico do tabaco; o) vírus do mosaico do feijão-de-corda; e p) Vírus Flock House; q) Vírus do Mosqueado Clorótico do Feijão-de-Corda; e r) um Vírus do Mosaico da Alfafa. Os métodos para produzir a VLP de Vírus Mosqueado Clorótico de Feijão-de-Corda, Vírus do Mosaico da Alfafa e vírus do mosaico do feijão-de- corda foram descritos em US 2005/0260758 e em W005067478.
Em uma modalidade preferida, a partícula similar a vírus é de um bacteriófago de RNA. Em uma modalidade preferida adicional, o bacteri- ófago de RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em a) bacterió- fago Οβ; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bac- teriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; I) bacteriófago PP7 e m) bacteriófa- go AP205. Em uma modalidade preferida, a partícula similar a vírus é uma partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA Οβ. Os métodos para a produção de VLP de um bacteriófago de RNA1 em particular VLP de bacteri- ófago Οβ e VLP de bacteriófago AP205, foram descritos nas páginas 37-47 do WO 04009124 e nos seus EXEMPLOS 1 e 21.
Em uma modalidade preferida, a partícula similar a vírus é de bacteriófago de RNA Οβ. em uma modalidade preferida adicional, a partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ é expressa de modo recombinan- te em E. coli.
Em uma modalidade preferida, o conjugado de nicotina-VLP é de 0,1 mg/ml a 2,5 mg/ml na formulação líquida, ou com relação à formula- ção liofilizada, em termos de concentração na formulação antes da Iiofiliza- ção. Em uma modalidade preferida, o conjugado de nicotina-VLP é de 0,2 mg/ml a 2 mg/ml na formulação líquida, ou com relação à formulação liofili- zada, em termos da concentração na formulação antes da liofilização. Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a concentração do conjugado de nicotina-VLP na formulação líquida, típica e preferivelmente em termos de concentração na formulação antes da liofilização, é 0,2 mg/ml, 0,6 mg/ml, 1,0 mg/ml ou 2 mg/ml. Em uma outra modalidade preferida no- vamente da presente invenção, a concentração do conjugado de nicotina- VLP na formulação líquida, típica e preferivelmente em termos de concentra- ção na formulação antes da liofilização, é 0,2 mg/ml ou 0,6 mg/ml, preferi- velmente 0,2 mg/ml.
Diversas seqüências de ligação, que compreendem uma funcio- nalidade de éster carboxílico com a qual as moléculas de nicotina podem ser ligadas covalentemente a um veículo, foram descritas em US 5876727, US 6656469 e US 6932971. Estes ensinamentos específicos são incorporados neste documento como referência. As seqüências de ligação utilizáveis para a presente invenção e compreendendo uma funcionalidade de éster são, por exemplo, as seqüências de ligação chamadas CJ2, CJ2.1, CJ2.2, CJ2.3, CJ4, CJ4.1, CJ5, CJ5.1, CJ8, CJ8.1, CJ9 e CJ11, conforme descrito na co- luna 17 da US5876727.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, a seqüên- cia de ligação compreende A-X-CO(O)-Y-Z-B1 onde A representa a molécula de nicotina e onde B representa a partícula similar a vírus, e onde X = (CH2)m, com m = 1-4, Y = (CH2)n, com m = 1-8, e Z = C(O).
Em uma modalidade muito preferida, a seqüência de ligação compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em: CH2OCO(CH2)nCO, onde η = 1-8, preferivelmente η = 1-4, preferivelmente η = 1 ou 2, e mais preferivelmente η = 2. Novamente em uma modalidade mui- to preferida, a seqüência de ligação consiste em A-CH2OCO(CHa)2CO-B, onde A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partícula similar a vírus.
A seqüência de ligação pode estar covalentemente ligada à piri- dina ou ao anel de pirrolidina da molécula de nicotina. Os exemplos sobre isso são, em particular, descritos em US 5876727, US 6656469 e US 6932971. Em uma modalidade muito preferida, a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina.
A totalidade das moléculas de nicotina covalentemente ligadas está presente na mesma configuração absoluta, isto é, todas as moléculas de nicotina têm a configuração (ft) ou todas as moléculas de nicotina têm a configuração (S) de ocorrência natural, ou elas estão presentes em qualquer mistura destas. De preferência, as moléculas de nicotina estão covalente- mente ligadas como, por exemplo, aproximadamente uma mistura igual ou uma mistura igual tanto da configuração (R) quanto da configuração (S) de ocorrência natural está presente. Em uma modalidade muito preferida, o conjugado de nicotina-VLP compreendido pelas formulações inventivas é obtenível ou obtido usando uma mistura racêmica de moléculas de nicotina ou derivados de nicotina, típica e preferivelmente usando uma mistura racê- mica de moléculas de nicotina ou derivados de nicotina compreendendo as moléculas de nicotina com a dita seqüência de ligação covalentemente liga- da a elas, para a reação de acoplamento à partícula similar a vírus, resultan- do no conjugado de nicotina-partícula similar a vírus de acordo com a inven- ção.
Em uma modalidade preferida, o conjugado de nicotina-VLP, preferivelmente nicotina-VLP de bacteriófago de RNA Qβ, preferivelmente NicQβ, é formado a partir do material de partida 0-succinil-3'-hidroximetil- nicotina e do material de partida VLP de Qβ.
Em uma modalidade preferida, a composição de estabilizador compreende um agente de tamponamento tal como Succinato, Acetato, Ma- leato, Citrato, Lactato, Tartarato1 Tris, Bis-tris, Trietanolamina, Tricina, Bicina, Histidina, Aspartato, Glicinato1 Glutamato, Lisina, Ftalato, Formiato, Alanina, Fenilalanina1 Arginina e Prolina.
Em uma modalidade preferida, o agente de tamponamento é selecionado a partir do grupo consistindo em fosfato de sódio, fosfato de po- tássio e histidina/histidina HCI, acetato de sódio, succinato de sódio. Em uma modalidade preferida adicional, a concentração do agente de tampo- namento é de 10-20 mM em termos de concentração na formulação líquida, ou com relação à formulação liofilizada, em termos de concentração na for- mulação antes da liofilização. Em uma modalidade preferida adicional, o a- gente de tamponamento é o fosfato de sódio ou o fosfato de potássio, prefe- rivelmente o fosfato de sódio. Em uma modalidade preferida, o agente de tamponamento é histidina/histidina HCI. Em uma modalidade preferida, o agente de tamponamento é o acetato de sódio. Em uma modalidade preferi- da, o agente de tamponamento é o succinato de sódio.
Em uma modalidade preferida, a formulação líquida ou liofilizada da invenção adicionalmente compreende o cloreto de sódio de 0 a 90 mM, preferivelmente de 0 a 60 mM, mais preferivelmente de 0 a 30 mM. De prefe- rência, a inclusão do cloreto de sódio é para estabilizar a solução líquida ou para ajustar a osmolaridade das formulações líquidas ou Iiofilizadas da in- venção.
Em uma modalidade muito preferida adicional, a invenção pro- porciona uma formulação liofilizada da invenção que compreende, ou alter- nativamente consiste essencialmente em, ou consiste em: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma par- tícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita par- tícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador consistindo em: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não- redutor é de 0,5% a 15% (p/v), preferivelmente de 3% a 12% (p/v), em ter- mos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um, preferivelmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concen- tração na formulação antes da liofilização; (e) um agente de tamponamento, onde o dito agente de tamponamento é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de sódio, fosfato de potássio, acetato de sódio, succinato de sódio e Histidina/Histidina HCl; (f) opcionalmente 0-30 mM de NaCl em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a 6,6 antes da liofilização.
Em uma modalidade alternativamente preferida, a invenção pro- porciona uma formulação Iiofilizada da invenção que compreende, ou alter- nativamente consiste essencialmente em, ou consiste em: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo (a) uma par- tícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita par- tícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador consistindo em: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não- redutor é de 0,5% a 15% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um, preferivelmente um único, agente de massa, onde a concentração total do dito dissacarídeo não-redutor e do dito agente de massa é de 0,5% a 15% (p/v) com a condição que a concen- tração do dito dissacarídeo não-redutor seja pelo menos 0,5% (p/v), em ter- mos da concentração na formulação antes da liofilização, (e) pelo menos um, preferivelmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da concen- tração na formulação antes da liofilização; (f) um agente de tamponamento, onde o dito agente de tamponamento é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de sódio, fosfato de potássio, acetato de sódio, succinato de sódio e Histidina/Histidina HCI; (g) opcionalmente 0-30 mM de NaCI em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a "6,6 antes da liofilização.
Em uma modalidade muito preferida, a invenção proporciona uma formulação Iiofilizada da invenção que compreende, ou alternativamen- te consiste essencialmente em, ou consiste em: (i) pelo menos um conjuga- do de nicotina-partícula similar a vírus, preferivelmente pelo menos um con- jugado de nicotina-partícula similar a vírus de um bacteriófago de RNA, pre- ferivelmente pelo menos um de nicotina-partícula similar a vírus de bacterió- fago de RNA Qp, ainda preferivelmente um conjugado de NicQp, compreen- dendo (a) uma partícula similar a vírus, preferivelmente uma partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Qβ, onde a concentração do dito conjugado é preferivelmente de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml, preferivelmente de 0,2 mg/ml a 1 mg/ml, em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus, prefe- rivelmente à dita partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Qβ, por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador consis- tindo em: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não- redutor, preferivelmente a trealose, onde a concentração do dito dissacarí- deo não-redutor é de 5% a 12%, preferivelmente 10% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um, prefe- rivelmente um único, tensoativo não-iônico, preferivelmente o polissorbato 20, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,005% a 0,1% (p/v), preferivelmente 0,005% (p/v), em termos da concentração na formula- ção antes da liofilização; (e) um agente de tamponamento, onde o dito agen- te de tamponamento é preferivelmente o fosfato de sódio, o fosfato de po- tássio, o acetato de sódio, o succinato de sódio ou a Histidina/Histidina HCI; mais preferivelmente é a Histidina/Histidina HCI, e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,6 a 6,2 antes da liofilização.
A presente invenção proporciona uma formulação Iiofilizada compreendendo ou alternativamente consistindo em: (i) pelo menos um con- jugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) partícula si- milar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalente- mente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação consiste em A-CH2OCO(CH2)2CO-B, e on- de A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partí- cula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ, e onde a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina; e (ii) uma composição de estabilizador compreendendo: (c) um dissacarídeo não-redutor, onde o dito dissacarídeo não-redutor é a trealose, e onde a concentração de trealose é 10% (p/v) em termos da concentração na formu- lação antes da liofilização; (d) um tensoativo não-iônico, onde o dito tensoa- tivo não-iônico é o polissorbato 20, e onde a concentração de polissorbato 20 é 0,005% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofili- zação; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 6,2 antes da liofilização.
A presente invenção proporciona uma formulação Iiofilizada compreendendo ou alternativamente consistindo em: (i) pelo menos um con- jugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) partícula si- milar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalente- mente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação consiste em A-CH2OCO(CH2)2CO-B, e on- de A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partí- cula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ, e onde a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina; e (ii) uma composição de estabilizador consistindo essencialmente em, ou consistindo em: (c) um dissacarídeo não-redutor, onde o dito dissacarídeo não-redutor é a trealose, e onde a concentração de trealose é 10% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) um tensoati- vo não-iônico, onde o dito tensoativo não-iônico é o polissorbato 20, e onde a concentração de polissorbato 20 é 0,005% (p/v) em termos da concentra- ção na formulação antes da liofilização; (e) um agente de tamponamento, onde o dito agente de tamponamento é o fosfato de sódio ou a Histidi- na/Histidina HCI, e onde a concentração do dito fosfato de sódio ou da dita Histidina/Histidina HCI é 20 mM; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 6,2 antes da liofilização.
Em uma modalidade muito preferida adicional, a invenção pro- porciona uma formulação liofilizada da invenção que compreende, ou alter- nativamente consiste essencialmente em, ou consiste em: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma par- tícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita par- tícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador consistindo em: (c) pelo menos um, preferivelmente um único, dissacarídeo não-redutor, onde a concentração do dito dissacarídeo não- redutor é de 5% a 15% (p/v), preferivelmente 10% (p/v), em termos da con- centração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um, preferi- velmente um único, tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito ten- soativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v), preferivelmente 0,005% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (e) um a- gente de tamponamento, onde o dito agente de tamponamento é preferivel- mente selecionado a partir de acetato de sódio, succinato de sódio e Histidi- na/Histidina HCI; (f) opcionalmente 0-30 mM de NaCI em termos da concen- tração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de es- tabilizador tem um valor de pH de 6,0 a 6,4, preferivelmente 6,2, antes da liofilização.
Em uma modalidade preferida, a formulação Iiofilizada da inven- ção é estável por pelo menos 15 semanas, preferivelmente pelo menos 25 semanas, na temperatura ambiente ou mesmo na temperatura acelerada (409C).
Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma formula- ção reconstituída compreendendo a composição Iiofilizada da invenção dis- solvida e/ou suspensa em uma solução fisiologicamente aceitável ou em água estéril, preferivelmente em água para injeção. Em uma outra modalida- de preferida, a solução é a solução de NaCI. De preferência, a formulação reconstituída tem um valor de osmolaridade fisiologicamente aceitável.
Em uma modalidade preferida, a formulação reconstituída adi- cionalmente compreende um adjuvante. Em uma modalidade preferida adi- cional, o adjuvante são os géis hidratados de hidróxido de alumínio ou os géis hidratados de fosfato de alumínio.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo para preparar a formulação Iiofilizada da invenção, compreendendo as eta- pas de: (i) congelamento da formulação antes da liofilização por redução da temperatura de prateleira abaixo de -359C, preferivelmente abaixo de -389C, preferivelmente abaixo de -40SC, preferivelmente abaixo de -45SC e preferi- velmente abaixo de -509C; (ii) secagem primária da formulação na tempera- tura de prateleira de -45QC a -15SC, preferivelmente de -40SC a -20SC, prefe- rivelmente de -359C a -25eC, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar); (iii) secagem secundária da dita formulação na temperatura de prateleira de IO9C a 409C, preferivelmente de IO9C a 309C, com a pres- são da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar). O processo opcional- mente compreende uma etapa de secagem da formulação na temperatura de prateleira a -30eC até -159C, preferivelmente a -209C, após a etapa (ii), com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar).
Em uma modalidade preferida, a pressão da câmara durante a secagem primária e secundária é de 0,005 χ 105 mPa (0,005 mbar) a 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar), preferivelmente de 0,020 χ 105 mPa (0,020 mbar) a 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar); preferivelmente de 0,03 χ 105 a 0,1 χ 105 mPa (0,03 a 0,1 mbar), preferivelmente de 0,040 χ 105 a 0,05 χ 105 mPa (0,040 a 0,05 mbar).
Em uma outra modalidade preferida, a redução da temperatura de prateleira é efetuada na taxa de 0,1 °C a 1,0°C/min, preferivelmente de 0,5°C a 1,0°C/min.
Em uma modalidade específica, o processo da invenção com- preende as etapas de: (i) congelamento da formulação antes da liofilização por redução da temperatura de prateleira abaixo de -40°C, preferivelmente abaixo de -50°C; (ii) secagem primária da formulação na temperatura de pra- teleira de -35°C por pelo menos 10 horas, preferivelmente por 20 horas, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar); (iii) secagem se- cundária da dita formulação na temperatura de prateleira de 10°C a 30°C, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar). O processo opcionalmente compreende uma etapa de secagem da formulação na tem- peratura de prateleira a -20°C após a etapa (ii), com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar).
Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um processo para preparar a formulação Iiofilizada da invenção compreen- dendo as etapas de: (i) congelamento da formulação antes da liofilização por redução da temperatura de prateleira abaixo de -40°C, preferivelmente até - 50°C; (ii) secagem primária da formulação na temperatura de prateleira a - 35°C, preferivelmente por 25 horas; elevação da temperatura de prateleira e secagem da formulação na temperatura de prateleira a -20°C, preferivelmen- te por 10 horas, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar); preferivelmente a 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar); (iii) secagem se- cundária da dita formulação na temperatura de prateleira a 20°C, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar). preferivelmente a 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar).
Em uma modalidade preferida, o processo da invenção compre- ende uma etapa de anelamento adicional, preferivelmente a -10 até -20SC, tipicamente por duas a cinco horas, após o congelamento da formulação por um dos processos de congelamento como descritos na invenção. Tal etapa de anelamento é preferivelmente usada quando a composição de estabiliza- dor da invenção compreender pelo menos um agente de massa, tal como o manitol ou a glicina. Em uma outra modalidade preferida, a presente inven- ção proporciona um processo para a preparação da formulação Iiofilizada da invenção, compreendendo as etapas de: (i) congelamento da formulação antes da liofilizaçãó por redução da temperatura de prateleira abaixo de - 409C, preferivelmente até -50QC, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar), preferivelmente a 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar); (ii) opcionalmente anelamento a -159C; (iii) secagem primária da formulação na temperatura de prateleira a -15QC, preferivelmente por 20 horas; (iv) seca- gem secundária da formulação na temperatura de prateleira a 40SC, com a pressão da câmara abaixo de 0,2 χ 105 mPa (0,2 mbar), preferivelmente a 0,007 χ 105 mPa (0,007 mbar). Exemplos Exemplo 1 Materiais e métodos
"NicQP" - O termo "NicQP", conforme usado neste documento, deve referir-se a pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo (a) uma partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo me- nos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação con- siste em A-CH2OCO(CH2)2CO-B, e onde A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Qp, e onde a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina. O NicQp foi produzido conforme descrito no EXEMPLO 1 da US 6.932.971. A substância de fármaco de NicQp foi descongelada na temperatura ambiente. Protocolos da dessecação por congelamento Tabela 1: Processo de dessecação por congelamento I.
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Tabela 2: Processo de dessecação por congelamento II.
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Reconstituição dos Iiofilizados
Conforme conhecido para a pessoa versada, para algumas das análises descritas abaixo, os Iiofilizados necessitam ser colocados em solu- ção aquosa. Assim, os Iiofilizados foram reconstituídos com água filtrada estéril, típica e preferivelmente com água filtrada estéril de um volume para ajustar até o volume total da formulação antes da liofilização. Como exemplo, se a formulação antes do processo de liofilização consistisse em 0,7 ml por frasco pequeno, então a torta preferivelmente formada, resultante do pro- cesso de liofilização, é reconstituída em um volume tal de água estéril de modo tal que a composição final novamente consista em 0,7 ml.
Medições de fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4) para determinar os agregados de VLP
As medições de AF4 foram conduzidas usando um canal de se- paração Wyatt com um espaçador de 350 μπι, sistema de separação Eclip- se2 (Wyatt Technology Corporation), bomba isocrática Agilent 1100 G1310A, removedor de gases Agilent 1100 G1379A, autoamostrador Agilent 1100 G1329A, termostato para o autoamostrador Agilent 1100 G1330B, detector de MWD Agilent 1100 G1365B, detector de Rl Agilent 1100 G1362A e detec- tor Wyatt DAWN EOS MALS.
O fluxo de canal era 1,5 ml/min. O fluxo cruzado era 2,0 ml/min por 18 minutos, subseqüentemente reduzido para 0,15 ml/min em 15 minu- tos e mantido por 5 minutos a 0,15 ml/min. Em uma etapa final, o fluxo cru- zado era 0,0 ml/min por 5 minutos.
A concentração de VLP foi determinada a 260 nm com o detec- tor de MWD. O detector Wyatt DAWN EOS MALS foi usado para a determi- nação do raio hidrodinãmico e do peso molecular da amostra de VLP. Uma quantidade de aproximadamente 20 μg de VLP a partir das formulações lí- quidas e dos Iiofilizados reconstituídos (reconstituídos com água, como des- crito acima) foi injetada no AF4, respectivamente.
Medições de calorimetria por varredura diferencial (DSC) para determinar a temperatura de transição vítrea
As medições de DSC foram conduzidas com um Calorímetro de Varredura Diferencial Netzsch 204 Phoenix. Tipicamente, 1 a 25 mg da a- mostra foram pesados para panelas de alumínio. As panelas foram então firmemente fechadas com uma tampa de alumínio, usando uma prensa de fechamento universal. A panela de referência permaneceu vazia e foi prepa- rada no mesmo modo. As panelas foram colocadas na célula de medição. A célula foi inundada com nitrogênio. As amostras foram medidas em uma taxa de aquecimento de 109C/min.
A temperatura de transição vítrea, Tg1 dos Iiofilizados foi deter- minada por meio de varreduras individuais do DSC. Análise do teor de água
As medições do teor de umidade dos Iiofilizados foram conduzi- das com um aparelho de titulação Karl Fischer coulométrico, com um forno de espaço superior (Analytic Jena AG). Os Iiofilizados foram medidos exa- tamente no frasco pequeno de vidro 2R em uma temperatura do espaço su- perior de 80SC. As amostras foram aquecidas na câmara do forno por pelo menos 5 minutos.
Medições da difusão de luz dinâmica (DLS) para determinar a homogenei- dade da formulação
As medições de difusão de luz dinâmica foram conduzidas com um aparelho Zetasizer Nano ZS. 0,5 a 1,0 ml da formulação líquida ou dos liofilizados reconstituídos (reconstituídos conforme descrito acima) foi pipe- tado para microcubetas de UV Plastibrand e medido aplicando-se um proto- colo padrão LMU Munich validado (SOP protein_m_99%). O índice de poli- dispersidade PI, a proporção do pico principal de NicQb e o tamanho de pico principal aplicando-se os modelos de conversão de volume e intensidade foram calculados.
Medições do bloqueio de luz para determinar a contaminação da partícula e os agregados de VLP
As medições do bloqueio de luz foram calculadas com um apa- relho PAMAS SVSS-C. O sistema foi inundado com uma parte da formula- ção e subseqüentemente 0,1 - 0,3 ml da formulação líquida ou dos Iiofiliza- dos reconstituídos foi avaliado quanto à contaminação da partícula. A solu- ção foi removida através da célula de medição e a quantidade de partículas maiores do que 1,10 e 25 μιτι, calculada por ml, foi determinada. SE-HPLC - integridade do RNA
As partículas foram homogeneizadas em Reagente TRI (uma combinação de fenol e tiocianato de guanidina em uma solução de mono- fase para inibir a atividade da RNase), seguido por extração do RNA com o 1 -bromo-3-cloropropano (BCP) - Reagente de Separação de Fases. O RNA extraído foi precipitado com isopropanol e o precipitado lavado com etanol O RNA foi então dissolvido em DEPC-H2O e analisado por HPLC (monitora- mento efetuado a A26onm, eluição isocrática). O tempo de retenção do RNA extraído foi determinado em relação a um tRNA padrão, analisado na mes- ma série.
RP-HPLC - nicotina livre
Os derivados de nicotina solúveis hidroximetil-nicotina (devido à hidrólise da ligação de éster) e succinil-hidroximetil-nicotina (devido à degra- dação da ligação de amida) foram separados do NicQp por filtração em fli- tros de rotação. O fluxo foi analisado por RP-HPLC (A260nm - comprimento de ondas de absorção da nicotina e dos derivados de nicotina). A concentração dos derivados de nicotina foi calculada a partir da regressão de uma curva padrão de nicotina efetuada em paralelo. Os valores da nicotina livre foram dados em porcentagem de nicotina total.
RP-HPLC - nicotina total
A porção de nicotina ligada covalentemente à proteína Qβ foi clivada quantitativamente durante a incubação de 3 h, a 40°C e pH > 11, a- pós o que as proteínas foram precipitadas. O produto da hidrólise Hidroxime- til-Nicotina permaneceu no sobrenadante e foi quantificado por RP-HPLC (A26o nm) usando uma curva padrão de nicotina, visto que tanto o produto da hidrólise quanto a nicotina compartilham o mesmo cromóforo.
SE-HPLC - integridade da VLP
A SE-HPLC é um método analítico para separar diferentes com- postos em uma amostra de acordo com o seu tamanho. Assim, as partículas Οβ grandes podem ser separadas das moléculas menores, por exemplo, os monômeros de proteína de cobertura Οβ ou os fragmentos de ácidos nucléi- cos e, portanto, o método foi usado para confirmar a integridade da VLP. O método foi também usado para confirmar a pureza da substância de fármaco. Como um controle, uma VLP padrão foi analisada com a amostra na mesma série. A detecção foi efetuada a 260 nm. As impurezas relacionadas ao pro- duto podem ser agregados de proteínas, produtos da clivagem menores e/ou ácidos nucléicos. Todas estas impurezas relacionadas ao produto foram de- tectadas por SE-HPLC, que tinha sido mostrada ser capaz de separar estas impurezas do pico de produto. Para a detecção, é usado um comprimento de ondas de 260 nm.
Medições da turbidez
O grau de opalescência das soluções de amostras líquidas foi determinado usando um turbidímetro de laboratório (2100 AN, empresa HA- CH). As medições da turbidez foram efetuadas por turbidimetria da razão, a qual determina a razão de luz transmitida e luz difundida pelas partículas na solução de amostra. O instrumento foi calibrado usando suspensões padrão de turbidez da formazina em células de amostras definidas. Para medir os volumes das amostras de 1-5 ml em tubos de teste menores, uma curva de calibração definida pelo usuário foi estabelecida em uma faixa de 0-200 NTU. 1 ml de amostra foi medido em tubos de teste de vidro descartáveis aos quais tinha sido aplicado o óleo de silício para reduzir os efeitos de difusão causados pelo vidro.
Medições de Transmissão de VIS
As medições de transmissão foram conduzidas com um Espec- trofotômetro de UV/Visível de feixe duplo UV1 (Thermo Spectronic). 0,5 a 1,0 ml da formulação líquida foi pipetado para micro cubetas de UV Plastibrand. A transmissão a 600 nm foi determinada.
Exemplo 2
Efeito do pH sobre a estabilidade do NicQB
A estabilidade do NicQp foi analisada em dez pH's diferentes na faixa de 4,6 a 8,2. O pH do produto em massa foi ajustado usando uma so- lução de NaOH a 0,1 N ou uma solução de H3PO4 a 0,1 N. Todas as amos- tras foram diluídas até uma concentração de 1 mg/ml de NicQp usando água. As amostras foram armazenadas na temperatura ambiente até 14 dias. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Resultados - Estudo do pH sobre a Estabilidade do NicQB
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A estabilidade química do ΝicQβ foi investigada usando os mé- todos de RP-HPLC e SE-HPLC. A instabilidade química do NicQβ resulta na degradação da VLP em monômeros ou multímeros da proteína de cobertura Qβ e/ou na dissociação entre a nicotina e a VLP de Qβ.
O teor dos derivados de nicotina livres aumentou com os valores de pH crescentes. Entre pH 4,6 e 6,2, somente pequenos aumentos dos de- rivados de nicotina livres foram detectados. Acima de pH 6,2, a quantidade dos derivados de nicotina livres aumentou rapidamente durante o tempo de armazenagem. Ademais, a integridade da VLP foi influenciada negativamen- te pelos valores de pH crescentes. Em pH igual ou maior do que 7,4, a inte- gridade do capsídio de Οβ diminuiu drasticamente após 7 dias, como medido por SE-HPLC. O teor relativo de ΝicQβ em pH 7,0, após 7 dias na tempera- tura ambiente, foi aproximadamente 96%, enquanto que em pH 7,4, aproxi- madamente 91 %.
A estabilidade física de ΝicQβ foi investigada por medições de bloqueio da luz, DLS e Transmissão de VIS. Estabilidade física de Νic-Qβ: o termo "estabilidade física de Νic-Qβ", conforme usado neste documento, re- fere-se à agregação das VLPs de Qp. Todos os três métodos analíticos mos- traram que o NicQp tendeu a agregar-se em valores de pH iguais e abaixo de 5,8. A medição de DLS mostrou que a proporção do pico principal diminu- iu, enquanto que o pico compreendendo os agregados e os oligômeros de VLP aumentou e o índice de polidispersidade (PI) aumentou em valores de pH iguais e abaixo de 5,8. Os resultados obtidos pelas medições do bloqueio de luz e Transmissão de VIS validaram a verificação que, com um pH de- crescente, o NicQp tendia à agregação. Exemplo 3
Efeito das condições de tensão de congelamento descongelamento sobre a estabilidade do NicQB
Um total de 36 formulações diferentes de NicQp foi submetido aos ciclos de congelamento/descongelamento. As amostras foram congela- das a -80SC e descongeladas a 20eC até 25SC. Estes ciclos de congelamen- to/descongelamento foram repetidos por 5 vezes. As formulações foram ana- lisadas antes e depois dos ciclos de congelamento/descongelamento por medições de DLS e por medições de bloqueio da luz.
Efeito da trealose e da adição de polissorbato 20 - As formula- ções compreendiam 0,2 mg/ml de NicQp, 0 ou 10% de trealose, pH = 6,4, NaCI a 30 mM, com ou sem 0,005% de polissorbato 20. Os resultados das medições de DLS obtidos com as formulações contendo trealose sem o po- lissorbato mostraram uma ligeira diminuição do pico principal e um aumento do PI. Assim, a trealose resultou em um ligeiro aumento no nível de agrega- ção de NicQp. Entretanto, este efeito pôde ser impedido pela adição de po- lissorbato 20. Os resultados do bloqueio da luz suportaram as medições de DLS. Um número menor significativo de partículas > 1 μm foi detectado na formulação contendo polissorbato 20 após o congelamen- to/descongelamento, em comparação com o número de partículas > 1 μπι nas formulações sem polissorbato.
Efeito da concentração diferente de NaCI e da adição de polis- sorbato 20 - As formulações compreendiam 0,2 mg/ml de NicQp, 10% de trealose, pH = 6,4, diversas concentrações de NaCI, com ou sem 0,005% de polissorbato 20. Os resultados da medição de DLS mostraram que o NaCI teve uma influência sobre o nível de agregação do NicQβ após ter congela- do/descongelado. Os PI1S das soluções aumentaram com as concentrações crescentes de NaCI após os ciclos de congelamento/descongelamento. As- sim, a estabilidade física do NicQβ foi significativamente reduzida com as concentrações crescentes de NaCI. Entretanto, com a adição de polissorbato 20, esta instabilidade física pôde ser compensada para as concentrações de NaCI iguais e abaixo de 90 mM. Estes resultados foram suportados pela medição de bloqueio da luz. Após o congelamento/descongelamento, as formulações sem o polissorbato mostraram um aumento significativo de par- tículas maiores do que 1 μm, o que indicou uma quantidade maior de agre- gados. A adição de polissorbato 20 impediu a agregação, visto que quase nenhuma partícula maior do que 1 μm foi detectada.
Efeito dos diferentes pH's e da adição de polissorbato 20 - O efeito do pH variando de 5,4 a 7,2 sobre a estabilidade das formulações, na presença ou na ausência de polissorbato 20, foi investigado. As formulações compreendiam 0,2 mg/ml de NicQβ, 10% de trealose, diversos pHs, NaCI 30 mM, com ou sem 0,005% de polissorbato 20. Os resultados suportaram as verificações a partir do estudo do pH sobre a estabilidade descrito no E- XEMPLO 2. Já durante a preparação das soluções de formulação, a propor- ção do pico principal de NicQβ foi diminuindo com o pH decrescente, como determinada por medições de DLS usando o modelo de conversão de volu- me. Por outro lado, o Pl estava aumentando. A adição de polissorbato 20 impediu a agregação do NicQp nos valores de pH testados de 6,4 e 7,2. A- lém disso, a adição de polissorbato 20 reduziu a agregação de NicQp em pH 5,4. Além das medições de DLS, os resultados obtidos pela medição do blo- queio da luz suportaram estas verificações. As observações acima descritas, feitas no curso deste estudo de pH por medições de DLS e bloqueio da luz, estavam consistentes para as concentrações de NaCI de 30, 60, 90 e 150 mM.
Exemplo 4
Influência das composições variadas sobre a estabilidade do NicQβ durante a dessecação por congelamento
O ΝicQβ foi descongelado na temperatura ambiente. Diversas formulações (como mostrado na figura. 1) com concentrações variadas de NicQp, trealose, polissorbato, NaCI e com sistema de tamponamento variado foram produzidas pipetando-se o NicQβ para as soluções de estoque de ex- cipientes. As soluções foram agitadas sobre um agitador magnético IKA por 5-10 minutos. As soluções de fármacos finais foram filtradas estéreis (filtro de membrana de 0,22 μm) e foram então liofilizadas.
Resumidamente, as soluções de estoque foram despejadas em frascos pequenos de vidro 2R estéreis. A partir das formulações F29RL, F48RL e F49RL, 0,7 ml foi despejado por frasco pequeno. A partir das outras formulações, 0,6 ml foi despejado por frasco pequeno. O polidimetilsiloxano e as tampas de liofilização revestidas com ETFE (Etilenotetrafluoretileno) (West Pharmaceutical Services) foram colocados sobre os frascos pequenos. Os frascos pequenos foram transferidos para a câmara de liofilização de uma secadora por congelamento Christ Epsilon 2-12 D (Martin Christ Gefri- ertrocknungsanlagen GmbH), a Temperatura de prateleira foi diminuída a 0,5°C a 1,0°C/min para -40°C e mantida abaixo de -40°C por 3 horas. A pressão da câmara foi então reduzida para 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar), a prateleira foi reduzida para -35°C a 1sC/min e mantida por 20 horas. Depois, a temperatura de prateleira foi elevada para -20°C a 0,1°C/min e mantida por 10 horas. Subseqüentemente, a temperatura de prateleira foi elevada para 20°C a 0,5°C/min e mantida por 10 horas. A câmara de liofilização foi então aerada com o nitrogênio seco filtrado para 800 χ 105 mPa (800 mbar) e os frascos pequenos foram tampados na câmara de liofilização. Os frascos pe- quenos foram removidos da câmara e vedados com vedações Flip-Off®. A- pós a dessecação por congelamento, os liofilizados estáveis foram obtidos, uma estrutura de torta suficiente foi dada.
Os resultados são mostrados na figura. 2. Assim, todos os liofili- zados a partir das formulações antes da liofilização, com concentrações va- riadas de Nic-Qb (testado a partir de 0,2 mg/ml até 2,0 mg/ml), trealose (tes- tada a partir de 5% até 10%), polissorbato (testado de 0,005 até 0,01%), NaCl (a partir de O até 60 mM), tiveram um teor de umidade menor do que 1 %. A soma das quantidades de oligômeros de NicQp e agregados de ΝicQβ das formulações acima mencionadas não aumentou mais do que 1% após a dessecação por congelamento, em comparação com a formulação antes da dessecação por congelamento, como analisado por AF4. As medi- ções de DLS mostraram que estas formulações tinham índices de polidis- persidade (PI) tipicamente iguais e abaixo de 0,2 e a proporção do pico prin- cipal de NicQp era maior do que 98,5%, respectivamente, como determinada usando o modelo de conversão de volume. As medições analíticas efetua- das resultaram na conclusão que estas formulações acima mencionadas eram capazes de estabilizar o NicQb na concentração a partir de 0,20 mg/ml até 2 mg/ml.
A F22RL, que não continha o polissorbato 20, teve um valor de índice de polidispersidade (PI) em torno de 0,35. Além disso, a soma das quantidades de oligômeros de NicQp e agregados de NicQp aumentou cerca de 5,5% após a dessecação por congelamento, em comparação com a for- mulação antes da dessecação por congelamento. Estes resultados mostra- ram que o tensoativo não-iônico é necessário para a prevenção da agrega- ção de VLP.
A F08RL, a F39RL, a F37RL, a F38RL compreendiam 30 mM, 60 mM, 90 mM e 150 mM de cloreto de sódio, respectivamente. Embora a presença de polissorbato 20 compensasse o efeito do NaCI (em uma con- centração igual e abaixo de 60 mM) sobre a estabilidade física do NicQp (a F08RL e a F39RL não tiveram nenhum aumento substancial das quantida- des de oligômeros de NicQP e agregados de NicQp após a liofilização), a presença do polissorbato 20 somente compensou parcialmente o efeito do NaCI nas concentrações de NaCI iguais e maiores do que 90 mM, visto que a soma das quantidades de oligômeros de NicQp e agregados de NicQp aumentou 2,8 e 3,5% após a dessecação por congelamento. Além disso, a presença de NaCl igual ou maior do que 90 mM resultou em valores de os- molaridade maiores do que 400 mosm/kg. Exemplo 5
Teste das composições de manitol/trealose como estabilizadores para o NicQβ durante a dessecacão por congelamento
Tabela 4: Formulações
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Quatro formulações (F30RL, F32RL, F42RL, F54RL na figura. 1) foram produzidas substancialmente iguais como descrito no EXEMPLO· 4. O volume de despejo dos frascos pequenos foi 0,6 ml. As formulações F30RL, F32RL e F42RL foram liofilizadas rapidamente sob as seguintes condições: A temperatura de prateleira foi diminuída a 1 ,0°C/min para -50°C e mantida em -50°C por 3 horas. A pressão da câmara foi então reduzida para 0,045 x 105 mPa (0,045 mbar), a prateleira foi reduzida para -15°C a 0,15°C/min e mantida por 20 horas. Alternativamente, as formulações F42RL e F54RL foram liofilizadas aplicando-se o mesmo processo de dessecação por conge- lamento, porém incluindo-se uma etapa de anelamento conduzida a -15°C por 2 horas. Subseqüentemente, a pressão da câmara foi reduzida para 0,007 x 10L5 mPa (0,007 mPa) e a prateleira foi reduzida para 40°C a 0,15°C/min e mantida por mais 10 horas. A câmara de liofilização foi então aerada com nitrogênio seco filtrado para 800 x 10"5 mPa (800 mbar) e os frascos pequenos foram tampados na câmara de liofilização. Os frascos pe- quenos foram removidos da câmara e vedados com as vedações Flip-Off®.
Os resultados foram parcialmente mostrados na figura. 2. Após a liofilização, os liofilizados estáveis foram obtidos e uma estrutura de torta suficiente foi obtida. O teor de umidade das três formulações Iiofilizadas es- tava tipicamente abaixo de 0,3 %. A osmolaridade das formulações estava tipicamente na faixa de 250 a 340 [mosm/kg]. A osmolaridade aumentou com as concentrações crescentes de trealose e manitol.
A fração de manitol nas formulações F30RL, F32RL e F42RL produzidas sem a aplicação de uma etapa de anelamento era amorfa ou parcialmente amorfa. A fração de manitol das formulações F42RL e F54RL produzidas por aplicação de uma etapa de anelamento era cristalina após a dessecação por congelamento.
As formulações F30RL, F32RL e F42RL não mostraram nenhum aumento claro significativo da soma das quantidades de oligômeros de NicQβ e agregados de NicQβ após a dessecação por congelamento, como analisado por medições de AF4. As medições de DLS mostraram que as três formulações tinham índices de polidispersidade (PI) abaixo de 0,2 e a pro- porção do pico principal de NicQβ era tipicamente maior do que 99 %, como determinada usando o modelo de conversão de volume. Para a formulação F54RL, um aumento da soma das quantidades de oligômeros de NicQβ e agregados de NicQβ após a dessecação por congelamento pôde ser deter- minado via AF4.
As medições de bloqueio da luz mostraram que a contaminação de partículas dos liofilizados reconstituídos era tipicamente de 100 partículas > 10 μm por ml e a quantidade de partículas > 1 μm estava tipicamente a- baixo de 2000 partículas por ml. Estes resultados mostraram que uma mistu- ra de trealose e um agente de massa, tal como o manitol, pode estabilizar o NicQβ durante a dessecação por congelamento.
Exemplo 6
Estudos da estabilidade das formulações de NicQβ dessecadas por conge- lamento
Cinco formulações F42RL, F35RL, F10RL, F16RL e F54RL fo- ram produzidas substancialmente iguais como descrito no EXEMPLO 4 e no
EXEMPLO 5. O volume de despejo dos frascos pequenos foi 0,6 ml.
As formulações contendo trealose somente (F35RL, F10RL, F16RL) foram liofilizadas sob as seguintes condições: A temperatura de pra- teleira foi diminuída a 1,09C/min para -50SC e mantida a -50°C por 3 horas. A pressão da câmara foi então reduzida para 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar), a prateleira foi reduzida para -359C a 1,0°C/min e mantida por 25 horas. Subse- qüentemente, a temperatura de prateleira foi elevada para -20°C a 0,19C/min e mantida por 10 horas. Subseqüentemente, a temperatura de prateleira foi elevada para 209C a 0,59C/min e mantida por 10 horas.
A formulação contendo tanto a trealose quanto o manitol (F42RL) foi liofilizada sob as seguintes condições: A temperatura de pratelei- ra foi diminuída a 1,09C/min para -50eC e mantida a -50°C por 3 horas. A" pressão da câmara foi então reduzida para 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar), a prateleira foi reduzida para -159C a 0,159C/min e mantida por 20 horas. Sub- seqüentemente, a pressão da câmara foi reduzida para 0,007 χ 105 mPa (0,007 mbar) e a prateleira foi reduzida para 409C a 0,159C/min e mantida por mais 10 horas.
A formulação contendo somente o manitol (F54RL) foi liofilizada sob as seguintes condições: A temperatura de prateleira foi diminuída a 1,09C/min para -50eC e mantida a -509C por 2 horas. Uma etapa de anela- mento a -159C foi aplicada por 2 horas. A temperatura de prateleira foi dimi- nu ida para -509C e mantida a -50°C por 2 horas. A pressão da câmara foi então reduzida para 0,045 χ 105 mPa (0,045 mbar), a prateleira foi reduzida para -159C a 0,159C/min e mantida por 20 horas. Subseqüentemente, a pressão da câmara foi reduzida para 0,007 χ 105 mPa (0,007 mbar) e a pra- teleira foi reduzida para 409C a 0,159C/min e mantida por mais 10 horas.
Após a liofilização, os Iiofilizados estáveis foram obtidos com todas as formulações dessecadas por liofilização e uma estrutura de torta suficiente foi obtida.
As amostras'foram armazenadas a 2 a 8°C, 25°C e 40°C até 25 semanas. Os resultados analíticos foram parcialmente mostrados na figura. 3. A estrutura de torta dos liofilizados de todas as formulações à base de trealose ou trealose/manitol era estável durante a armazenagem, mesmo em temperaturas aceleradas. Isto foi observado para todas as condições de ar- mazenagem e pontos de tempo. A temperatura de transição vítrea dos Iiofili- zados sem o manitol estava tipicamente na faixa de 609C a 1105C e não foi alterada significativamente durante a armazenagem. A osmolaridade das formulações estava na faixa de 300 a 350 [mosm/kg].
O teor de umidade inicial das formulações Iiofilizadas estava a- baixo de 1,0 %. O teor de umidade dos Iiofilizados armazenados a 2-8sC e 25QC foi estável por toda a armazenagem, por 25 semanas, com um aumen- to de teor de água de menos do que 0,5%. Os Iiofilizados armazenados a 40SC resultaram em teores de umidade ligeiramente aumentados; o teor de água após a armazenagem estava tipicamente abaixo de 1,7%, comparado a aproximadamente 1% antes da armazenagem.
A soma das quantidades de oligômeros de NicQp e agregados de NicQp não aumentou nas formulações à base de trealose ou trealo- se/manitol após a dessecação por congelamento, como analisada por medi- ções de AF4. Após a armazenagem, observou-se um ligeiro aumento de menos do que 3 % em comparação com as formulações antes da liofilização, como analisado por AF4. A formulação à base de manitol mostrou um claro aumento da soma das quantidades de oligômeros de NicQp e agregados de NicQp.
As medições de bloqueio da luz mostraram que a contaminação de partículas dos Iiofilizados reconstituídos após a armazenagem estava tipi- camente abaixo de 500 partículas > 10 μιτι por ml por todas as formulações, condições de armazenagem e pontos de tempo.
As medições de DLS mostraram que os Iiofilizados reconstituí- dos após armazenagem a partir das quatro formulações à base de trealose ou trealose/manitol tinham índices de polidispersidade (PI) tipicamente abai- xo de 0,2 e a proporção do pico principal de NicQp era tipicamente maior do que 98,5 %, respectivamente, como determinada usando o modelo de con- versão de volume. Isto foi observado para todas as formulações, condições de armazenagem e pontos de tempo. A formulação F54RL mostrou um au- mento do índice de polidispersidade até 0,24 na armazenagem por 6 sema- nas, a 40SC. As medições de IEF, SE-HPLC (integridade do RNA), RP-HPLC (nicotina total), Espectrometria (teor de RNA), turbidez e LDS-Page não mostraram nenhuma alteração significativa de todas as formulações à base de trealose e trealose/manitol para todas as condições de armazenagem e pontos de tempo. As partículas similares a vírus de Οβ produzidas de modo recombinante tipicamente contêm moléculas de RNA hospedeiras, as quais estão normalmente no espaço interno das partículas similares a vírus.
O teor dos derivados de nicotina livres estava, para todas as formulações à base de trealose e trealose/manitol, todas as condições de armazenagem e pontos de tempo, tipicamente abaixo de 1,5% da nicotina acoplada total, como determinado com medições de RP-HPLC. A quantida- de de derivados de nicotina livres foi aumentada até 4,2 % na formulação F54RL na armazenagem a 40eC por 6 semanas.
As medições de SE-HPLC (integridade da VLP) mostraram que o teor relativo de ΝιοΟβ era maior do que 97 % por todas as formulações à base de trealose e trealose/manitol, pontos de tempo e condições de arma- zenagem. O teor relativo de NicQP foi reduzido para 93 % na formulação F54RL, após a armazenagem a 40eC por 6 semanas.
As medições analíticas efetuadas resultaram na conclusão que todas as formulações à base de trealose e trealose/manitol são capazes de estabilizar o NicQp durante a liofilização e após a armazenagem, mesmo em temperaturas aceleradas (40QC).
Claims (16)
1. Formulação liofilizada compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, onde a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente liga- da à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação compreende uma funcionalidade de éster; e (ii) uma composição de estabilizador compreendendo: (c) pelo menos um dissacarídeo não-redutor, onde a concentra- ção do dito dissacarídeo não-redutor é de 0,5% a 15% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) pelo menos um tensoativo não-iônico, onde a concentração do dito tensoativo não-iônico é de 0,0005% a 0,1% (p/v) em termos da con- centração na formulação antes da liofilização; e onde a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 5,4 a 6,6 antes da liofilização.
2. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1, em que o dito dissacarídeo não-redutor é a sacarose ou a trealose.
3. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde o dito dissacarídeo não-redutor é a trealose.
4. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a concentração do dito pelo menos um dissacarídeo não-redutor é de 3% a 12% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização, e em que preferivelmente a concentra- ção do dito pelo menos um dissacarídeo não-redutor é 10% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização.
5. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a dita composição de estabilizador adicio- nalmente compreende um agente de massa.
6. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 5, em que a concentração total do dito dissacarídeo não-redutor e do dito agente de massa é de 0,5% a 15% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização, com a condição que a concentração do dito dissacarí- deo não-redutor seja pelo menos 0,5% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização.
7. Formulação Iiofilizada de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que o dito agente de massa é o manitol.
8. Formulação Iiofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a concentração do dito tensoativo não- iônico é de 0,0025% a 0,01% (p/v), preferivelmente 0,005% (p/v), em termos da concentração na formulação antes da liofilização.
9. Formulação Iiofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que o dito tensoativo não-iônico é o polissorba- to 20.
10. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a dita partícula similar a vírus é uma partí- cula similar a vírus de um bacteriófago de RNA, e onde preferivelmente a dita partícula similar a vírus é uma partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Qβ.
11. Formulação Iiofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a dita seqüência de ligação consiste em A- CH2OCO(CH2)2CO-B, em que A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partícula similar a vírus.
12. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 11, em que a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina.
13. Formulação Iiofilizada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a dita composição de estabilizador adicio- nalmente compreendendo um agente de tamponamento selecionado a partir de fosfato de sódio, fosfato de potássio e Histidina/Histidina HCI, e em que preferivelmente a dita composição de estabilizador adicionalmente compre- endendo um agente de tamponamento que é a Histidina/Histidina HCI.
14. Formulação Iiofilizada compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, em que a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, onde a dita seqüência de ligação consiste em A-CH2OCO(CH2)2CO-B, e em que A representa a dita molécula de nicotina e onde B representa a dita partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ, e em que a dita seqüência de ligação está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina; e (ii) uma composição de estabilizador compreendendo: (c) um dissacarídeo não-redutor, em que o dito dissacarídeo não-redutor é a trealose, e em que a concentração de trealose é 10% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) um tensoativo não-iônico, em que o dito tensoativo não- iônico é o polissorbato 20, e em que a concentração do polissorbato 20 é 0,005% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; e em que a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 6,2 an- tes da liofilização.
15. Formulação Iiofilizada compreendendo: (i) pelo menos um conjugado de nicotina-partícula similar a vírus compreendendo: (a) uma partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Οβ; e (b) pelo menos uma molécula de nicotina, em que a dita pelo menos uma molécula de nicotina está covalentemente ligada à dita partícula similar a vírus por uma seqüência de ligação, em que a dita seqüência de ligação consiste em A-CH2OCO(CH2)2CO-B, e em que A representa a dita molécula de nicotina e em que B representa a dita partícula similar a vírus de bacteriófago de RNA Qβ, e onde a dita seqüência de liga- ção está covalentemente ligada à posição 3' da dita molécula de nicotina; e (ii) uma composição de estabilizador compreendendo: (c) um dissacarídeo não-redutor, em que o dito dissacarídeo não-redutor é a trealose, e onde a concentração de trealose é 10% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (d) um tensoativo não-iônico, em que o dito tensoativo não- iônico é o polissorbato 20, e em que a concentração do polissorbato 20 é -0,005% (p/v) em termos da concentração na formulação antes da liofilização; (e) um agente de tamponamento, em que o dito agente de tam- ponamento é a Histidina/Histidina HCI, e em que a concentração da dita His- tidina/Histidina HCl é 20 mM; e em que a dita composição de estabilizador tem um valor de pH de 6,2 an- tes da liofilização.
16. A formulação Iiofilizada de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita formulação Iiofilizada é estável na temperatura ambiente por pelo menos 15 semanas, preferivelmente por pelo menos 25 semanas.
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