BRPI0711646A2 - método e composições para tratar neoplasias malignas hematológicas - Google Patents

Abstract

MéTODO E COMPOSIçõES PARA TRATAR NEOPLASIAS MALIGNAS HEMATOLóGICAS. Um composto de fórmula (1) e/ou seus sais, tautómeros e solvatos é usado para tratar neoplasias malignas hematológicas. Em uma modalidade, um sal de ácido orgânico do composto 1 é provido para uso geral no tratamento de neoplasmas, e em uma modalidade adicional o sal é estabilizado com carboidrato.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR NEOPLASIAS MALIGNAS HEMATOLÓ- GICAS".

Antecedentes da Invenção

N-6 ciclopropilPMEDAP ("cpr-PMEDAP") tem demonstrado ser eficaz produzindo um efeito induzido antiproliferativo e diferenciação em cul- tura de células in vitro contra uma variedade de linhas de células de tumor (Naessens et alv "Biochem. Pharmacol. 1999 Jul 15;58(2):311-23). Entretan- to, quando cpr- PMEDAP e outros compostos PMEDAP Νβ-substituídos fo- ram empregados em um modelo in vivo de neoplasias malignas hematológi- cas de ratos endógamos Sprague-Dawley (Valerianova et al. "Anticancer Res. 2001 May-Jun;21(3B):2057-64), os autores concluíram que os "fosfona- tos de nucleosídeo acíclico substituído na posição não parecem ser fárma- cos promissores para o trattamento de neoplasias malignas hematológicas" devido à "toxidade alta".

Vários ésteres de amidato de bi- e mono-aminoácido de cpr- PMEDAP (e seu uso como agentes antiproliferativos) têm sido descritos. Veja WO 05/066189. WO 02/08241 descreve um método para triagem de pró-fármacos análogos de neucleotídeo metoxifosfonato que são úteis para tratar neoplasias malignas hematológicas malignas com toxicidade reduzida.

As neoplasias malignas hematológicas são amplamente defini- das como distúrbios proliferativos das células sangüíneas e/ou seus progeni- tores, em que essas células proliferam de maneira descontrolada. Anatomi- camente, as neoplasias malignas hematológicas são divididas em dois gru- pos principais: os linfomas - massas malignas de células linfóides, que ocor- rem primariamente, mas não exclusivamente, em linfonodos, e as leucemias - neoplasias que derivam tipicamente de células linfóides ou mielóides e que afetam primariamente a medula óssea e o sangue periférico. Os linfomas podem ser subdivididos em doença de Hodgkin e linfoma Não-Hodgkin (L- NH). Este último grupo compreende várias entidades distintas, que podem ser diferenciadas clinicamente (por exemplo, linfoma agressivo, linfoma indo- lente), em nível histológico {por exemplo, linfoma folicular, linfoma de células do manto) ou com base na origem da célula maligna (por exemplo, linfócito B, linfócito T). As Ieucemias e neoplasias malignas relacionadas incluem a leucemia mielógena aguda (LMA), a leucemia mielógena crônica (LMC), a leucemia linfoblástica aguda (LLA) e a leucemia linfocítica crônica (LLC).

Outras neoplasias malignas hematológicas incluem as discrasias de plasmó- citos, incluindo o míeloma múltiplo, e as síndromes mielodisplásicas.

Enquanto a introdução de novos agentes, tais como o imatinibe (Gleevec®), o bortezomibe (Velcade®) e o rituximabe (Rituxin®), melhorou o desfecho de várias neoplasias malignas hematológicas, continua havendo uma necessidade médica não atendida de novos agentes terapêuticos efica- zes. Por exemplo, existe uma necessidade médica não suprida para pacien- tes que sofrem de LNH refratário ao tratamento/recidivado, visto que a inci- dência de LNH aumentou substancialmente no decorrer dessas últimas cin- co décadas nos Estados Unidos.

As Ieucemias acometem um número menor de pacientes. Entre- tanto, continua havendo uma necessidade médica substancial não atendida, como, por exemplo, para o tratamento da leucemia mielógena aguda (LMA) e da leucemia linfocítica crônica (LLC), como ilustram as taxas precárias de sobrevida de 5 anos.

Existe uma necessidade de agentes antimetabólicos multiespe- cíficos ou amplamente ativos, com melhor janela terapêutica em relação às modalidades de tratamento existentes, passíveis de serem usados como monoterapia, isoladamente, ou em associação com outros agentes terapêu- ticos. Os antimetabólitos interferem, em maioria, nas enzimas envolvidas na síntese de DNA, tais como as enzimas relacionadas com a biossíntese de timidina ou de purina, e/ou são incorporados no DNA recém-sintetizado. Os análogos de nucleobases, nucleosídeos e nucleotídeos constituem uma im- portante classe de agentes citotóxicos eficazes, que são amplamente usa- dos para o tratamento das Ieucemias e dos linfomas. Alguns desses agen- tes, a 5-fluorouracila, a capecitabina e, especialmente, a gencitabina, tam- bém estão sendo usados para o tratamento de tumores sólidos. Três análo- gos da adenosina, a fludarabina, a cladribina e a clofarabina, estão indicados para a LLC, a leucemia de células pilosas e a LLA pediátrica, respectivamen- te. O análogo de purina, a pentostatina (2'-desoxicoformicina), um inibidor da adenosina desaminase, possui atividade clínica contra as neoplasias linfói- des malignas. A nelarabina é um pró-fármaco do análogo da desoxiguanosi- na, ara-G, que é resistente ao catabolismo pela purina nucleosídeo fosforila- se e que demonstrou ter atividade contra as neoplasias de células T. Entre os análogos da pirimidina, a citarabina (ara-C) foi avaliada; é ativa em diver- sas neoplasias malignas hematológicas e constitui um dos agentes usados no tratamento da leucemia mielógena aguda.

Todavia, as terapias existentes possuem limitações, por exem- plo, quanto à sua segurança, eficácia e facilidade de uso. Não é incomum que os tratamentos sejam, no início, bem sucedidos; a seguir, as neoplasias malignas hematológicas freqüentemente sofrem recidiva com o decorrer do tempo.

Por conseguinte, continua havendo necessidade de novos nu- cleosídeos/nucleotídeos com melhor janela terapêutica e/ou utilidade com- plementar em relação aos compostos existentes dessa classe.

Os requerentes procuraram um composto apropriado para o tra- tamento de neoplasias malignas hematológicas com melhor PK e cargá, me- Ihor janela terapêutica e/ou menor resistência farmacológica. Em particular, desejava-se identificar um composto capaz de se concentrar nas células sangüíneas, em particular nas PBMC. Espera-se que a concentração do composto nessas células-alvo irá alargar a janela terapêutica ao reduzir a exposição dos outros tecidos do paciente ao composto.

WO 05/066189 descreve üm composto tendo a estrutura 1:

<formula>formula see original document page 4</formula> Essa invenção relaciona-se com o composto 1. Relaciona-se também com o diastereômero do mesmo, em que o aminoácido bis substitu- ído no átomo do fósforo é um L aminoácido, bem como esse diastereômero substancialmente desprovido de D aminoácido.

Até agora, os compostos de fórmula 1 têm sido empregados na forma da base livre. Entretanto, os requerentes determinaram que a base livre não é comercialmente ideal para formulação em uma forma posológica, visto a base livre é higroscópica. Por conseguinte, os requerentes procura- ram uma forma do composto 1 que pudesse facilitar os processos de fabri- cação para formas posológicas terapêuticas.

Sumário da Invenção

Os requerentes constataram que a natureza do alquil éster no grupo carboxila do éster de aminoácido da classe de cpr-PMEDAP bisamida- to de compostos é fundamental na distribuição preferencial do composto nas PBMC. Inesperadamente, foi constatado que a administração do bis(etil) és- ter (isto é, composto 1) resultou em uma distribuição altamente preferencial de cpr- PMEDAP nas PBMC em relação o plasma. A distribuição foi bem superior àquela obtida com o bis(isopropil) éster estreitamente relacionado sob os demais aspectos. Além disso, foi determinado que os sais de ácidos orgânicos do composto 1 eram menos higroscópicos do que a base livre, facilitando, assim, a fabricação de produtos contendo o composto 1. Por fim, foi determinado que a estabilidade desses sais (particularmente em formula- ções por via parenteral) era intensificada ao incluir um carboidrato nas for- mulações.

Por conseguinte, uma modalidade da invenção é um sal de áci- do orgânico do composto 1 e/ou seus tautômeros e solvatos.

Outra modalidade da invenção é uma composição que compre- ende (a) um sal de ácido orgânico do composto 1 e/ou seus tautômeros e solvatos e (b) um carboidrato, por meio do qual a estabilidade de armaze- namento do sal é intensificada.

Outra modalidade da invenção é um método para o tratamento de um paciente que apresenta uma neoplasia maligna hematológica, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeutica- mente eficaz co composto

<formula>formula see original document page 6</formula>

e/ou seus sais, tautômeros e solvatos.

Uma modalidade adicional da invenção é uma combinação que compreende o composto

<formula>formula see original document page 6</formula>

e/ou seus sais, tautômeros e solvatos em um recipiente apropriado para uso na administração parenteral do composto.

Uma modalidade adicional da invenção é um método que com- preende a preparação de um sal de ácido orgânico do composto

<formula>formula see original document page 6</formula>

e um carboidrato em uma solução aquosa estéril e o armazenamento de dita solução por um período que exceda cerca de 1 hora. Uma modalidade adicional da invenção é uma composição em- balada, que compreende uma solução aquosa estéril de um carboidrato e de um sal de ácido orgânico do composto

<formula>formula see original document page 7</formula>

juntamente com uma descrição (por exemplo, nota inserida para pacientes) de que a solução é opcionalmente armazenada por um período de mais de cerca de 1 hora.

Os ácidos orgânicos apropriados para a preparação dos sais dessa invenção são tipicamente compostos que contêm pelo menos um gru- po carboxila, incluindo aminoácidos (de ocorrência natural ou sintéticos), tais como ácido glutâmico e ácido aspártico, e ácidos C1-16 alquil e C6-16 aril and C4-I6 heteroaril carboxílicos, ais como os ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, malônico, glutárico, tartárico, cítrico, fumárico, succínico, málico, maléico, hidroximaléico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico, salicílico e 2-fenoxibenzóico. Juntamente com qualquer derivado (excluindo ésteres onde nenhuma carboxila permanece livre) dos mesmos apresentan- do a mesma raiz (por exemplo, "ácido acetoacético"), descritos na tabela "Constantes Físicas dos Compostos Orgânicos" páginas 3-12 a 3-523 do índice Merck 74a Edição, 1993. Os ácidos orgânicos dicarboxílicos são de interesse particular. Está dentro do escopo dessa invenção empregar mais de um ácido orgânico em combinação. Os sais são preparados em analogia ao procedimento apresentado no exemplo 1, adiante.

Tipicamente, a relação molar entre o ácido orgânico e o compos- to 1 é de cerca de 1:1.

Entretanto, a relação pode ser tão grande quanto 1 mol de com- posto 1 para o número de grupos de ácido no caso de ácidos poliorgânicos, como, por exemplo, uma relação de 2:1 entre o composto 1 e o sal para um sal de ácido dicarboxílico. Todavia, a proporção é variável, variando de 1:1 ou menos, dependendo do enriquecimento da funcionalidade do ácido e de seu grau de substituição com funcionalidades ácidas.

As formulações apropriadas do composto 1, sejam elas para uso veterinário ou para uso em seres humanos, compreendem opcionalmente um ou mais transportadores aceitáveis. 0(s) transportador(es) deve(m) ser "aceitáveis", no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e fisiologicamente inócuos para o paciente.

As formulações irão opcionalmente conter excipientes, tais como aqueles apresentados no "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986). Os excipientes incluem, opcionalmente, o ácido orgânico e outros antioxi- dantes, agentes quelantes, como o EDTA, carboidratos, tais como dextrina, manitol ou dextrose, tampões (por exemplo, citrato), sais de metais alcalinos, agentes de deslizamento, agentes de volume e outras substâncias conven- cionalmente encontradas em comprimidos, em cápsulas, em soluções ou em outras composições apropriadas ou destinadas para uso terapêutico. Tipi- camente, as formulações não irão conter excipientes para comprimidos con- vencionais, visto que são habitualmente formuladas para uso parenteral. As formulações serão idealmente estéreis. Além disso, as preparações parente- rais serão substancialmente isotônicas. O pH das formulações varia opcio- nalmente de cerca de 5-10, habitualmente de cerca de 6-9, tipicamente de cerca de 5-6.

As soluções parenterais (aquosas estéreis) dos sais de ácido orgânico do composto 1 compreendem opcionalmente uma quantidade es- tabilizadora de carboidrato, tipicamente um sacarídeo (mono, di ou polissa- carídeos), glicosídeo ou álcool de açúcar (alditóis). Os polissacarídeos de- vem ser biodegradáveis com a sua injeção parenteral ou infusão e incluem dextrinas e amidos, tipicamente de 3-10 unidades. Os carboidratos repre- sentativos incluem hexoses, aldoses, aldo-hexoses, aldotrioses (por exem- plo, gliceraldeído), aldotetroses (por exemplo, eritrose), aldopentoses (por exemplo, arabinose), cetoses, ceto-hexoses (por exemplo, frutose), cetopen- toses (por exemplo, ribulose), maltose, sacarose, lactose, ribose, xilose, lixo- se, alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose e talose. De particular interesse são os carboidratos usados convencionalmente em for- mulações parenterais, como, por exemplo, manitol ou dextrose. O caráter óptico do carboidrato não é crítico, porém é desejável que, para a configura- ção, seja de tal modo que o carboidrato seja biodegradável após a sua ad- ministração parenteral. Por exemplo, a dextrose a 5% (por peso de solução; pH de cerca de 4,2, não tamponado) permite o armazenamento do succinato de composto 1 a 40°C durante 60 horas sem degradação significativa. Por outro lado, o armazenamento em soluções tamponadas em pH de 2, 7 e 9 sob as mesmas condições leva a uma degradação substancial do composto 1: Cerca de 100%, 18% e 76% por peso, respectivamente.

A quantidade estabilizante de carboidrato é variável e irá depen- der das condições esperadas de armazenamento e do prazo de validade desejado, da escolha do tampão, do pH, da quantidade de composto 1, e de outros fatores que irão ser apreciados por aquele versado na técnica. Em geral, serão usados cerca de 0,5% a 5% por peso de solução. Tipicamente, a quantidade ideal de carboidratos será determinada por experimentação de rotina, porém a quantidade geralmente não irá exceder (juntamente com os tampões, o cloreto de sódio e similares) uma quantidade que proporcione isotonicidade à solução. Entretanto, os concentrados hiperisotônicos são aceitáveis, quando se espera a diluição da composição parenteral antes ou durante a sua infusão. A solução parenteral é opcionalmente tamponada (tipicamente com tampão de citrato) em um pH de cerca de 4 a 6.

A presença de carboidrato estabiliza os sais do composto 1 em solução aquosa para armazenamento (incluindo tempo de administração) durante pelo menos cerca de 60 horas, até 1 semana, 1 mês ou 1 ano, ou qualquer período intermediário, dependendo dos fatores assinalados acima para a concentração de carboidrato, como, por exemplo, a temperatura de armazenamento e similares.

As composições terapêuticas são opcionalmente administradas por vias parenterais (incluindo as vias subcutânea, intramuscular, intraveno- sa, intradérmica, intratecal e epidural), visto que são as mais convenientes para o tratamento de neoplasias malignas. As infusões intravenosas consti- tuem, em geral, o método de administração de escolha.

As formulações são apresentadas em recipientes de dose unitá- ria ou múltiplas doses, como, por exemplo, ampolas, frascos ou bolsas de infusão flexíveis. Os recipientes serão opcionalmente de vidro ou de plástico rígido, porém tipicamente serão recipientes semi-rígidos ou flexíveis fabrica- dos com poliolefinas (polietileno) ou polivinilcloreto plastificado. O recipiente é tipicamente de uma única câmara. Esses recipientes apresentam pelo me- nos um orifício estéril integral para facilitar a entrada estéril de um dispositivo no recipiente para ter acesso ao conteúdo (habitualmente seringas ou uma agulha de equipo intravenoso). O orifício proporciona um acesso estéril para a solução solubilizante (se necessária) e saída da solução parenteral. Uma sobrebolsa (habitualmente de poliolefina) é opcionalmente fornecida para recipiente.

A formulação está presente no recipiente na forma de uma solu- ção ou em forma seca. Se for armazenada em uma forma substancialmente anidra, por exemplo, liofilizada, a formulação irá apenas necessitar da adição do transportador líquido estéril, como, por exemplo, água, para injeção, ime- diatamente antes do uso. As soluções incluem agentes de estabilização de tonicidade, como cloreto de sódio ou um açúcar, tais como manitol ou dex- trose. Uma vantagem inesperada do carboidrato ou açúcar é um aumento na estabilidade do sal do composto 1 em soluções aquosas armazenadas. Os recipientes são preenchidos com solução estéril ou são preenchidos e, a seguir, esterilizados, por exemplo, pelo calor ou por agentes químicos, de acordo com processos conhecidos. Em geral, uma solução estéril da formu- lação é colocada esterilizada em um recipiente flexível e, depois disso, op- cionalmente liofilizada. A tecnologia apropriada para a produção dos produ- tos do recipiente dessa invenção é encontrada em Avis et al., Pharmaceuti- cal Dosage Forms: Parenteral Medications vols. 1 e 3 (1984).

Os recipientes parenterais irão conter uma dose diária ou uma subdose diária unitária do composto 1, de modo descrito abaixo, ou uma fração apropriada da mesma.

O composto 1, os sais de ácido orgânico do Composto 1, ou so- luções aquosas dos mesmos estabilizadas com carboidrato, são opcional- mente empregados para o tratamento de qualquer neoplasia, incluindo não apenas neoplasias malignas hematológicas, mas também tumores sólidos de todos os tipos, como, por exemplo, câncer da cabeça e pescoço, de pul- mão, rim, fígado, osso, cérebro e outros, particularmente câncer e displasia uterinas e cervicais, melanoma, e cânceres de mama, de cólon, de próstata, pulmonares (de células pequenas e de células não-pequenas) e do pân- creas.

As formulações dessa invenção são administradas na forma de monoterapia ou em associação com outros agentes para o tratamento de neoplasias malignas hematológicas. A formulação dessa invenção é opcio- nalmente administrada ao paciente substancialmente ao mesmo tempo que outro(s) agente(s) antineoplásico(s), ou o(s) agente(s) são combinados com a formulação dessa invenção e, a seguir, administrados simultaneamente ao paciente. Os agentes antineoplásicos típicos úteis com o composto 1 (seja combinados com ele em quantidades terapeuticamente eficazes ou adminis- trados concomitantemente) incluem qualquer um dos agentes terapêuticos atualmente empregados no tratamento de neoplasias malignas, incluindo aqueles usados para neoplasias malignas hematológicas que são mencio- nados acima, nas considerações básicas. Esses agentes associados são administrados (a) substancialmente ao mesmo tempo, porém por diferentes vias de administração, (b) são combinados com a formulação dessa inven- ção e administrados concomitantemente, ou (c) são administrados em perío- dos alternativos (por exemplo, durante um período de repouso do tratamento com o composto 1). Em geral, In general, se for usada em combinação, a formulação dessa invenção é terapeuticamente combinada com outro agente antineoplásico selecionado a partir de uma classe distinta, como, por exem- plo, um anticorpo monoclonal.

O tratamento do LNH inclui tipicamente a ciclofosfamida, a do- xorrubicina, a vincristina, a prednisona e o rituximabe. Quando usado em combinação, o Composto 1, é administrado em um ciclo de terapia junta- mente com, ou na forma de reposição de, um ou mais dos agentes prece- dentes. O Composto 1 também pode ser administrado em combinação com o rituximabe. Para a terapia da LLC1 administrar o Composto 1 na forma de monoterapia ou em associação com outros agentes, tais como ciclofosfami- da e/ou rituximabe. Outros agentes terapêuticos apropriados para uso com o composto 1 incluem etoposídeo, melfalano, nitrosuréia, bussulfano, comple- xos de platina, agentes alquilantes não-clássicos, tais como procarbazina, antimetabólitos tais como folato, purinas, análogos da adenosina, análogos da pirimidina, alcalóides da vinca, e similares.

Com base em observações sobre a toxicologia de uma dose Cí- nica em cães, é razoável assumir que uma dose do composto 1 entre 1 mg/kg/dia e 3 mg/kg ou mais, até cerca de 10 mg/kg por dia, seria eficaz em cães (com o uso de um sal de ácido orgânico do composto 1, a dose seria ajustada para levar em conta o peso adicional do sal). Pressupondo que o perfil de PK do composto nos seres humanos seja semelhante àqueles ob- servado em cães, os achados até o momento sugerem que uma dose eficaz do composto 1 (corrigida para a área de superfície por um fator de 0,54) en- tre 0,54 mg/kg por via IV e 1,62 mg/kg por via IV ou mais, administrada em dose única, com dose repetida a intervalos de aproximadamente 1 a 14 dias, em geral, semanalmente ou a cada 2 semanas, tipicamente semanalmente para 2 doses, dependendo da condição do paciente e da tolerância à infu- são, entre outros fatores. Como se deve esperar uma considerável variação nas doses apropriadas, devido à natureza singular de cada câncer individual, à condição do paciente, à tolerância do paciente e outras questões conheci- das do oncologista, a faixa de doses eficazes será maior do que o modelo experimental central. Por conseguinte, espera-se que uma faixa de doses de cerca de 0,5 a 5,4 mg/kg/dia seja apropriada. Uma dose única é apropriada, porém são antecipados múltiplos ciclos de doses como típicos, com um pe- ríodo de repouso de cerca de 10-30, habitualmente 23 dias entre os ciclos, dependendo, novamente, da condição do paciente e da tolerância ao agente terapêutico, como será aparente para aquele normalmente versado na técni- ca.

A literatura AU e as citações de patentes acima são aqui expres- samente incorporadas por referência. A invenção tem sido descrita com de- talhes suficientes para permitir que aquele normalmente versado na técnica faça e utilize o assunto das seguintes reivindicações. Os exemplos que se seguem exemplificam a presente invenção, e não devem ser inferidos para limitar a presente invenção.

Exemplo 1

Uma mistura de cPrPMEDAP (1,64 g, 5 mmol), Ala-etil éster HCI (4,62 g 30 mmol) e TEA (8,36 mL, 60 mmol) foi tratada com 10 mL de piridi- na anidra e aquecida a 60°C para atingir uma solução homogênea. Foi adi- cionada uma solução de Aldritiol-2 (7,78 g, 35 mmol) e trifenilfosfina (9,18 g, 35 mmol) em 10 mL de piridina anidra. A mistura resultante foi aquecida a 60°C durante a noite. Após resfriamento, a solução de cor amarelo brilhante foi despejada em bicarbonato de sódio aquoso saturados e extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com salmoura, em seguida seca- da em sulfato de sódio. Após a remoção do solvente, o resíduo bruto foi puri- ficado por cromatografia instantânea usando 100% de acetato de etila, em seguida deslocada par 10-15% de MeOH/DCM para eluir o produto desejado (1,12 g, rendimento de 43%). Formação do sal succinato:

O pró-fármaco neutro (2,60 g) foi dissolvido em uma solução de ácido succínico (583 mg) em etanol (15 mL). Após a adição de 50% por v/v de n- heptano/etanol (20 mL), o sal desejado foi isolado por filtragem (2,26 g; M.P. 130°C). <table>table see original document page 14</column></row><table>

Exemplo 2

A Tabela 1 mostra a EC5O de antiproliferação do composto 1 e de seus metabólitos, cpr-PMEDAP (9- (2-fosfonilmetoxietil)-N*-ciclopropil 1- 2,6-diaminopurina), PMEG (9-(2-fosfonilmetoxietil) guanina), E PMEDAP (9- (2-fosfonilmetoxietil)-2,6-diaminopurina). Uma variedade de compostos usa- dos para o tratamento de neoplasias malignas hematológicas também foram testados, incluindo um inibidor da DNA polimerase (ara-C), inibidores da DNA polimerase/ribonucleotídeo redutase (cladribina, clofarabina, fludarabi- na, gencitabina), um inibidor da adenosina desaminase (desoxicoformicina), um inibidor da metilação do DNA (decitabina), um alquilante do DNA (doxor- rubicina), e um inibidor da mitose (vincristina). Os compostos AU1 à exceção da doxorrubicina e da vincristina, são análogos de nucleosídeos; a ara- C1 a gencitabina, e a decitabina são análogos da citosina, e o restante consiste em análogos da adenosina. A cpr-PMEDAP e a PMEG podem ser conside- radas, respectivamente, análogos da adenosina e da guanosina. Os com- postos foram testados usando Iinfoblastos humanos e caninos (estimulados com um mitógeno de células T, a fitoemaglutinina (PHA), ou um mitógeno de células Β, o mitógeno da erva-dos-cancros (pokeweed) (PWM)), duas linha- gens de células linfóides T derivadas de pacientes com leucemia linfocítica aguda (CEM e Molt- 4), duas linhagens de células mielóides derivadas de pacientes com leucemia mielógena aguda (KG-I e HL-60), duas linhagens de células linfóides B derivadas do linfoma de Burkitt (Daudi e Raji), uma linha- gem de células linfóides B do linfoma não-Hodgkin (RL), uma linhagem de células linfóides T do linfoma T cutâneo (PM-I),e uma linhagem de células monocíticas do linfoma histiocítico (U937).

O composto 1 exibiu atividade antiproliferativa em uma varieda- de de linfoblastos e linhagens celulares de leucemia/linfoma. A faixa de EC50 foi entre 27 e 1043 nM, semelhante àquelas da clofarabina (25 - 418 nM) e ara-C (23 - 1820 nM), dois análogos de nucleosídeos comumente usados no tratamento de neoplasias malignas hematológicas. Entre outros nucleosí- deos, a gencitabina foi o mais potente (3,4 - 18 nM), enquanto a desoxico- formicina foi a menos potente (> 200.000 nM). Entre todos os compostos, a vincristina (0,6 - 5,3 nM) foi a que exibiu maior potência. Não houve diferen- ça significativa na atividade do composto 1 em células humanas e caninas. Além disso, nenhuma diferença foi observada entre blastos com PHA (pre- dominantemente células T) e blastos com PWM (predominantemente células B) ou entre linhagens de células linfóides T e células linfóides B. Por conse- guinte, ao contrário de outro análogo da guanosina, a nelarabina, que é ape- nas eficaz contra linfomas de células Τ, o composto 1 pode ser eficaz nos linfomas tanto de células T quanto de células B

Na maioria dos tipos celulares testados, a cpr-PMEDAP, que é o produto hidrolisado do composto 1, foi significativamente menos potente do que o composto 1, sugerindo que o pró-fármaco fosforamidato intensificou a entrada do fármaco nas células, e que o componente pró-fármaco foi clivado no interior das células. A PMEG, o produto desáminado da cpr-PMEDAP, foi significativamente mais potente do que produto desalquilado PMEDAP, compatível com a hipótese de que a molécula ativa para a atividade antiproli- ferativa do composto 1 é PMEGpp. Tabela 1

<table>table see original document page 16</column></row><table> <table>table see original document page 17</column></row><table> Os linfoblastos estimulados por PHA foram gerados pela incuba- ção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com o mitógeno de células T PHA, (1 pg/mL) durante 3 dias, seguida de incubação com 10 U/mL de interleucina-2 por 4 dias. Os Iinfoblastos estimulados por PWM fo- ram gerados pela incubação de células B (purificadas de PBMC usando es- feras magnéticas conjugadas com CD19) com PWM (20 pg/mL), durante 7 dias.

Os Iinfoblastos (150.000 células por cavidade de microtítulo) e as linhagens celulares de leucemia/linfoma (30.000 células por cavidade) foram incubados com diluições 5 vezes seriadas de compostos durante 3 dias. O ensaio para BrdU foi realizado da seguinte maneira: Os Iinfoblastos foram incubados com diluições 5 seriadas de compostos em placas de mi- crotítulo (150.000 células por cavidade) durante 3 dias. No Dia 3, as células foram marcadas com 10 μΜ de BrdU durante 3 horas, e a quantidade de BrdU incorporada no DNA celular foi quantificada pelo ensaio Imunoabsor- vente ligado a Enzima 5 (ELISA). Alternativamente, as células foram incuba- das com 1 mg/mL de reagente XTT (ácido sódio 3,3'-[l[(fenilamino) carbonil]- 3,4- tetrazólio]-bis(4-metoxi-6-nitro) benzeno sulfônico hidratado) e 1% de PMS (metossulfato de fenazina) durante 2 horas, e a mudança de cor (a de- sidrogenase mitocondrial reduz o reagente XTT de cor amarela em sal de formazana de cor laranja) 10 foi quantificada. Os dados experimentais foram usados para gerar curvas de dose-resposta sigmoidais, e os valores de con- centração eficaz de 50% (EC5o) foram calculados usando o software Graph- Pad Prism versão 4,00 para Windows (GraphPad Software, San Diego Cali- fórnia USA). Os ensaios foram repetidos 2 - 20 vezes, até o erro padrão da média (SEM) se tornar menos de 50 % do valor médio 15.

Na maioria dos casos, os ensaios foram repetidos 2- 20 vezes até o SEM se tornar menor do que 50% do valor médio. * Dados variáveis (SEM > 0,5 EC50 média). N.D; não efetuado.

Exemplo 3

Distribuição de Pró-Fármacos Entre PBMC e o Plasma em Cães

Foram administrados a cães vários pró-fármacos de cpr- PMEDAP, na forma de infusões de 0,2 mg/kg por via IV durante 30 minutos. Os pró-fármacos 1-4 foram monoamidatos (o fósforo também foi substituído com fenoxi), enquanto os últimos dois 25 compostos eram bis(amidatos). Os compostos A e B foram enantiômeros substancialmente isolados no centro quiral do átomo de fósforo, enquanto o monoAlatBU foi o racemato nesse sítio. A alanina foi o L isômero.

• Uma amostra de sangue foi colhida em EDTA potássio e separada por cen- trifugação. As células mononucleares sangüíneas primárias (PBMC) foram coletadas utilizando tubos CPT (citrato de sódio).

• Para análise, as amostras de plasma foram precipitadas pela adição de 100 μL de acetonitrila contendo padrões internos (D4AP e TDF) a 100 μL de plasma para análise dos pró-fármacos. Após precipitação das proteínas por centrifugação, 100 μL foram transferidos em outro tubo para secagem e, a seguir, foram reconstituídos em 100 pL de água com 0,2% de ácido fórmico. Uma alíquota de 20 μL foi injetada na coluna para análise LC/MS/MS. A aná- lise foi efetuada usando uma coluna Synergi Fusion-RP 80A de 150 χ 2,0 mm, 4 pm (Phenomenex) e um gradiente linear de múltiplo estágio de 0,5 a 99% de acetonitrila na presença de 0,2% de ácido fórmico, em 0,25 mL/min. Os analitos foram detectados usando um espectômetro de massa Sciex API- 4000, utilizando ionização por electrospray em modo MRM positivo. As a- mostras foram analisadas para GS-327260, -8369, -0573, e -0438.

• As amostras de PBMC foram Iisadas em 70% de MeOH. Alíquotas separa- das de células de cada ponto de tempo re-suspensas em 100% de soro fo- ram usadas para estabelecer as quantidades de células em cada amostra.

• As amostras de células foram normalizadas para 15 χ 106 células por amos- tra. Foram observados graus variáveis de hemólise. O material celular extra- ído contendo 70% de MeOH foi dividido de duas maneiras para análises di- retas e desfosforilação e secados separadamente.

• Após secagem, as amostras para análises diretas foram re-suspensas em 20% de acetonitrila contendo padrões internos (TDF e D4AP) e analisadas para GS-327260, -8369. Foram injetados 20 μL para análise LC/MS/MS u- sando uma coluna Synergi Hydro-RP 80A de 50 χ 2,0 mm, 4 pm (Phenome- nex) e um gradiente linear de múltiplo estágio de 0 a 95% de acetonitrila na presença de 0,2% de ácido fórmico em 1,0 mL/min. Os analitos foram detec- tados usando um espectômetro de massa Sciex API-4000 utilizando a ioni- zação por electrospray em modo MRM positivo.

Após secagem, as amostras para desfosforilação foram tratadas com 1 U de fosfatase intestinal de bezerro (fosfatase alcalina, Sigma) duran- te 2 horas em tampão fornecido pelo fabricante. A seguir, as amostras foram ajustadas para 60% de acetonitrila, secadas e re-suspensas em 60% de acetonitrila contendo padrões internos (TDF e D4AP) e analisadas para cpr- PMEDAP conforme descrito para análise direta de PBMC.

Tabela: Comparação da Exposição de Plasma e PBMC ao cpr-PMEDAP (CPMEDAP) seguindo a administração de pró-fármaco ao ca- chorro Beagle por 30 minutos de infusão intravenosa.

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Claims (21)

1. Sal de ácido orgânico do composto <formula>formula see original document page 21</formula> e/ou seus tautômeros and solvatos.

2. Sal da reivindicação 1, em que o ácido orgânico é o ácido succínico.

3. Solução aquosa estéril compreendendo o sal da reivindicação -1 e um carboidrato.

4. Método compreendendo a administração a um paciente com neoplasia de uma dose terapêutica eficaz do sal da reivindicação 1.

5. Combinação compreendendo (a) um recipiente apropriado para o produto farmacêutico por via parenteral e disposto nesse particular (b) uma dose terapeuticamente eficaz do composto <formula>formula see original document page 21</formula> e/ou de seus sais, tautômeros e solvatos.

6. Combinação da reivindicação 5 em que o composto está em uma solução aquosa substancialmente isotônica.

7. Combinação da reivindicação 5 em que o composto é um sal com pelo menos um ácido orgânico.

8. Combinação da reivindicação 7 em que o ácido orgânico é o ácido succínico.

9. Combinação da reivindicação 5 em que o recipiente compre- ende um orifício estéril.

10. Combinação da reivindicação 5 em que o recipiente é um frasco ou uma bolsa flexível.

11. Método para o tratamento de um paciente que apresenta uma neoplasia maligna hematológica, compreendo a administração ao paci- ente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e/ou de seus sais, tautômeros e solvatos.

12. Método da reivindicação 11 em que a neoplasia maligna he- matológica é o mieloma múltiplo ou a síndrome mielodisplásica.

13. Método da reivindicação 11 em que a neoplasia maligna he- matológica é uma leucemia ou linfoma.

14. Método da reivindicação 11 em que um sal de ácido orgânico do composto é administrado.

15. Método da reivindicação 11 em que o composto é adminis- trado por via parenteral.

16. Composto compreendendo o composto <formula>formula see original document page 23</formula> e/ou seus sais, tautômeros e solvatos, e pelo menos outro agente útil para o tratamento de uma neoplasia maligna hematológica.

17. Método compreendendo a preparação de um sal de ácido orgânico do composto <formula>formula see original document page 23</formula> e um carboidrato em uma solucao aquosa esteril, e o armazenamento de dita solução por um período excedendo cerca de 1 hora.

18. Composição embalada compreendendo uma solução aquosa estéril de (a) um carboidrato e (b) um sal de ácido orgânico do composto <formula>formula see original document page 24</formula> e/ou seus tautômeros e solvatos, juntamente com a descrição de que a solu- ção é opcionalmente armazenada por um período de mais de cerca de 1 hora.

19. Kit compreendendo (a) um recipiente apropriado para um produto farmacêutico por via parenteral, (b) uma dose terapeuticamente efi- caz do composto <formula>formula see original document page 24</formula> e/ou seus sais, tautômeros e solvatos; e (c) instruções para o uso do com- posto e do recipiente.

20. Uso de um composto tendo a estrutura <formula>formula see original document page 25</formula> e/ou seus sais, tautômeros e solvatos, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma neoplasia maligna hematológica.

21. Composto ou método conforme descrito aqui.