BRPI0711969A2 - bacteriocinas modificadas e métodos para seu uso - Google Patents

Abstract

BACTERIOCINAS MODIFICADAS E MéTODOS PARA SEU USO. A presente invenção refere-se a formas modificadas de bacteriocinas de ocorrência natural, tais como as piocinas do tipo R de Pseudomonas aeruginosa, são descritas. As bacteriocinas são modificadas nas extremidades de suas fibras caudais em uma região responsável pela especificidade e afinidade de ligação a seus pares de ligação cognatos, ou receptores, tais como aqueles na superfície das bactérias. Métodos para o uso das bacteriocinas modificadas, tais como para ligar receptores, incluindo fatores de virulência ou aptidão, nas superfícies das bactérias, são também descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTERIO- CINAS MODIFICADAS E MÉTODOS PARA SEU USO"

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente é relacionado ao Pedido Provisório US 60/747.299, depositado em 15 de maio de 2006, que é incorporado por refe- rência como se completamente exposto.

CAMPO DA DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se às formas modificadas de bacteri- ocinas de peso molecular alto (hmw) de ocorrência natural, tais como as pio- cinas do tipo R de Pseudomonas aeruginosa. As bacteriocinas são modifica- das nas extremidades de suas fibras caudais em uma região responsável por especificidade e afinidade de ligação a seus pares de ligação cognatos, ou receptores, tais como aqueles na superfície das bactérias. Métodos para o uso das bacteriocinas modificadas, tais como para ligar receptores, inclu- indo fatores de virulência ou aptidão, nas superfícies das bactérias, são tam- bém descritos.

ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO

Correntemente atenção mais global está focalizada em ameaças de patógenos virais que de doenças bacterianas. Porém, bactérias resisten- tes a antibióticos onipresentes continuam afligindo cuidado do paciente e retenção de custo em hospitais e outras instalações de cuidados médicos. Ao mesmo tempo, há um recuo de desenvolvimento de antibióticos a favor de fármacos para doenças crônicas e melhorias do estilo de vida. Nos últi- mos vinte anos apenas duas classes novas de antibióticos (oxazolidinonas e lipopeptídios) foram introduzidas no mercado norte-americano (Wenzel, 2004).

Só nos Estados Unidos, há mais de 2 milhões de casos de in- fecções bacterianas adquiridas em hospitais a cada ano. Destes, aproxima- damente 90.000 pessoas morrerão. A estatística mais alarmante é que mais de 70% destes ofensores bacterianos são resistentes a pelo menos um fár- maco antibacteriano (Bad Bugs, No Drugs, 2004). Este número continua aumentando em uma taxa alarmante. O custo anual para a economia dos EUA destas infecções nosocomíais resistentes a antibióticos excede a 5 bi- lhões de dólares. A realidade desta situação global ameaçadora forçará um método novo para o desenvolvimento e uso de agentes antibacterianos (Tal- bot et al., 2006). Onde uso extensivo (e abuso) de antibióticos na medicina humana e animal floresceu, assim também o aparecimento de patógenos bacterianos resistentes a antibiótico, ao ponto que muitos antibióticos que eram uma vez "fármacos milagrosos" são agora clinicamente ineficazes (Mi- crobial Threats to Health, 2003).

Como um exemplo, Pseudomonas aeruginosa é um patógeno ubíquo para plantas e animais que está apresentando uma incidência de crescimento rápido de resistência a múltiplos fármacos de antibiótico (Micro- bial Threats to Health, 2003; Bad Bugs, No Drugs, 2004). P. aeruginosa é um bastonete aeróbio, móvel, gram-negativo. P. aeruginosa normalmente habita na terra, água, e vegetação. Embora raramente cause doença em pessoas saudáveis, é um patógeno oportunístico que responde por cerca de 10 % de todas as infecções nosocomiais (National Nosocomial Infection Sur- vey report-Data Summary de outubro de 1986-abril de 1996). P. aeruginosa é o patógeno mais comum que afeta pacientes com Fibrose Cística (CF) com 61 % dos espécimes de cultura positivos (Govan, J. R. W. e V. Deretic, 1996, Microbiol. Reviews, 60(3):530-574) como também um dos dois pató- genos mais comuns observados em unidades de cuidado intensivo (Jarvis, W. R. et al., 1992, J. Antimicrob. Chemother., 29(um supl.):19-24).

Mortalidade de algumas infecções por P. aeruginosa pode ser tão alta quanto 50 %. Presentemente, infecção por P. aeruginosa ainda pode ser eficazmente controlada através de antibióticos, particularmente usando uma combinação de fármacos. Porém, resistência a vários dos antibióticos comuns foi mostrada e é particularmente problemática em unidades de cui- dado intensivo (Archibald, L., et al., 1997, Clin. Infectious Dis., 24(2):211- 215; Fish, D., N., et al., 1995, Pharmacotherapy, 15(3):279-291). Adicional- mente, P. aeruginosa já demonstrou mecanismos para adquirir plasmídeos contendo múltiplos genes de resistência a antibióticos (Jakoby, G. A. (1986), The bactéria, Vol. X, The biology of Pseudomonas, páginas 265-294, J. R. Sokach (ed.) Academic Press, Londres) e no momento não há nenhuma va- cina aprovada para infecção por Pseudomonas.

Como muitas outras espécies bacterianas, a variabilidade da cepa em P. aeruginosa é bastante significativa. Variabilidade foi mostrada ocorrer por vários mecanismos diferentes, estes incluem, mas não são limi- tados a, a integração de pró-fagos em um genoma bacteriano (Zierdt, C. H. e P. J. Schmidt, 1964, J. Bacteriol. 87:1003-1010), a adição do gene de citoto- xina de bacteriófagos (Hayashi, T., et al., 1994, FEMS Microbiol. Lett. 122:239-244) e por meio de transpóson (Sinclair, M., I. e B. W. Holloway, 1982, J. Bacteriol. 151:569-579). Por meio deste tipo de diversidade, novos mecanismos patogênicos foram incorporados em P. aeruginosa. Estas e ou- tras transições tais como a conversão para o fenótipo mucóide, comumente vista em CF, claramente ilustram a necessidade por vigilância continuada.

Estas preocupações apontam para a necessidade por ferramen- tas de diagnósticos e terapêuticas visadas em identificação apropriada de cepas resistentes a fármacos e erradicação da virulência.

Muitas bactérias produzem bacteriocinas que são substâncias bactericidas durante o crescimento. As bacteriocinas são compostas de poli- peptídeos e variam em peso molecular. Embora as bacteriocinas fossem usadas para suas propriedades antibacterianas, algumas têm espectros bac- tericidas mais limitados que muitos antibióticos clinicamente usados. Por e- xemplo, algumas bacteriocinas foram relatadas como reconhecendo, e as- sim agindo apenas em, membros das mesmas espécies ou estritamente re- lacionadas por sítios de receptor de ligação em organismos sensíveis, ou suscetíveis.

Como uma classificação vasta, as bacteriocinas foram divididas em três tipos. O primeiro são moléculas pequenas que são termoestáveis. Exemplos deste primeiro tipo incluem Colicina V (onde colicinas são especí- ficas para bactérias coliformes). O segundo tipo, piocinas do tipo S produzi- das por P. aeruginosa, são moléculas de proteína de peso molecular mais alto. O terceiro tipo inclui bacteriocinas que genética e morfologicamente assemelham-se às porções caudais dos bacteriófagos. Exemplos deste últi- mo tipo incluem as piocinas do tipo F e do tipo R de P. aeruginosa como também enterocoliticina de Yersinia. Estas piocinas foram relatadas como sendo derivadas de um bacteriófago ancestral, e elas têm similaridades com a família de fago Iambda e à família de fago P2, respectivamente.

Piocinas do tipo R são similares às porções caudais não- flexíveis e contráteis dos bacteriófagos da família myoviridae e são codifica- das em um agrupamento simples de genes no genoma de Pseudomonas (Shinomiya et al., 1983). Vide Figura 1. Após especificamente ligar a uma bactéria alvo, estas piocinas formam um poro na célula bacteriana, compro- metendo a integridade de sua membrana citoplásmica e causando a despo- larização da membrana. Piocinas do tipo F são também similares a uma cauda do bacteriófago, mas elas têm uma estrutura flexível e não-contrátil semelhante a bastonetes. Piocinas são produzidas pela grande parte de ce- pas P. aeruginosa, e algumas cepas sintetizam mais de um piocina.

Piocinas do tipo R são bacteriocinas de peso molecular alto complexas produzidas por algumas cepas de Pseudomonas aeruginosa, e têm atividade bactericida contra certas outras cepas de P. aeruginosa (para uma revisão vide Michel-Briand e Baysse, 2002). Cinco piocinas do tipo R foram identificadas até agora e, com base em seus espectros alvos (vide abaixo), são denominadas R1 a R5. Cepa PA01 produz piocina R2, que é codificada em um agrupamento de gene que consiste em 16 estruturas de leitura aberta (ORFs), 12 destas apresentam similaridade de seqüência sig- nificativa às ORFs dos bacteriófagos P2, PS17, OCTX, e outros fagos seme- lhantes a P2 (Nakayama et al., 2000). Produção de piocina é induzida por dano de DNA (Matsui et al., 1993) e é regulada por RecA, que degrada PrtR, o repressor de PrtN, um regulador de transcrição positiva do agrupamento.

Indução dos genes de piocina resulta na síntese de aproximadamente 200 partículas de piocina por célula bacteriana seguido por Iise da célula através de mecanismos similares àqueles da Iise do bacteriófago. Piocinas matam rápida e especificamente as células alvo primeiro ligando ao lipopolissacarí- deo (LPS) por meio de suas fibras caudais, seguido por contração da envol- tura e penetração do núcleo através da membrana externa bacteriana, pare- de celular e membrana citoplásmica. Esta penetração compromete a integri- dade da membrana citoplásmica e a despolarização do potencial da mem- brana (Uratani e Hoshino, 1984). Em muitos aspectos, as piocinas podem ser vistas como pró-fagos defeituosos adaptados pelo hospedeiro para pro- duzir partículas antibacterianas não-infecciosas resistentes a protease e a ácido, que consistem apenas no aparelho caudal adaptado, ou seja, sem capsídeos ou DNA. A replicação dos genes de piocina requer a replicação do genoma bacteriano no qual eles estão embutidos.

As cinco especificidades diferentes do receptor de piocina estão linearmente relacionadas umas às outras com duas ramificações. (Ito et al, 1970; Meadow e Wells, 1978; Kageyama, 1975). Piocina R5 tem o espectro mais vasto e inclui as especificidades das outras quatro. Os receptores para os outros quatro tipos de R formam duas ramificações, ou famílias das espe- cificidades, que divergem de R5. Uma ramificação inclui os receptores para R3, R4, e R2, naquela ordem onde a especificidade do receptor para piocina R3 é o mais distai da superfície da célula. A segunda ramificação contém o receptor R1 que parece ter um determinante de especificidade não relacio- nado àqueles para R2, R3, e R4. As duas ramificações parecem estar vincu- ladas ao receptor para R5 uma vez que todas as cepas de P. aeruginosa que são sensíveis a quaisquer das piocinas R1-R4 são sensíveis também a R5, enquanto algumas cepas são sensíveis apenas à piocina R5. Algumas cepas de P. aeruginosa são resistentes a todas as 5 piocinas do tipo R de ocorrência natural.

Piocinas de P. aeruginosa especificamente matam principalmen- te cepas de P. aeruginosa mas também foram mostradas matar algumas cepas de espécies de Hemophilius, Neisseria e Campylobacter (Filiatrault et al., 2001; Morse et al, 1976; Morse et al, 1980; Blackwell et al., 1981, 1982).

A especificidade das piocinas do tipo R é conferida pela fibra caudal codificada por prf15. PRF15 é muito estritamente relacionado às fi- bras caudais de fagos da família Myoviridae, particularmente fagos seme- lhantes a P2 (Nakayama et al., 2000). Estas fibras caudais são homotríme- ros dispostos simetricamente em uma estrutura de placa base com seis có- pias por partícula, como mostrado na Figura 1. A região N-terminal da fibra caudal liga à placa base, e a porção C-terminal, provavelmente próxima à ponta, liga ao receptor bacteriano e assim confere especificidade de matan- ça. Uma chaperona cognata, codificada por prf16 (no caso de piocinas do tipo R) fica localizada imediatamente a jusante de prf15, e é necessária para dobramento apropriado da fibra caudal e/ou montagem das fibras caudais na estrutura de piocina. Partículas de piocina do tipo R foram descritas como imunoquímica e geneticamente similares às caudas de certos bacteriófagos de P. aeruginosa (Kageyama 1975, Kageyama et al. 1979, Shinomiya et al. 1989, e Shinomiya et al. 1983b). Foi proposto que piocinas do tipo R e bac- teriófagos de Pseudomonas, tais como PS-17 e OCTX, estejam relacionados através de um bacteriófago lisogênico ancestral comum dos quais genes que codificam as proteínas-cabeça e funções de replicação foram perdidos e os genes residuais de fago adaptados para sua função como componentes das piocinas do tipo R defensivas (Shinomiya et al. 1989).

Bacteriocinas de peso molecular alto do tipo R similares foram descritas em outras bactérias incluindo Yersinia enterocolitica (Strauch et al., 2001), Listeria monocytogenes (Zink et al, 1995), Staphylococcus aureus (Birmingham & Pattee, 1981) e Erwinia amyiovora (Jabrane et al., 2002). Classificação e nomenclatura das bacteriocinas sofreram alterações com o passar do tempo, particularmente dada evidência expansível de sua origem, química e atividades. Tipicamente, a nomenclatura das bacteriocinas é com base nas espécies produtoras. Por exemplo, E. coli produz bacteriocinas denominadas colicinas; Pseudomonas aeruginosa produz piocinas; Listeria monocytogenes produz monocinas; Yersinia enterociiiticus produz enteroco- liticinas; e assim sucessivamente. Historicamente, a classificação começou com a identificação de cerca de 20 colicinas que foram classificadas como A-V. Na maioria dos casos, cada bacteriocina parece ser específica em ação para as mesmas espécies de organismos, ou taxonomicamente relaciona- das. Cepas produtoras de piocinas são tipicamente resistentes a sua própria piocina. Um ensaio geral para a concentração de bacteriocina é descrito na patente U. S. 4.142.939. Citação dos documentos acima não é intencionada como uma admissão que qualquer do antecedente seja técnica anterior pertinente. To- das as declarações sobre a data ou representação quanto aos conteúdos destes documentos são com base na informação disponível ao requerente e não constituem nenhuma admissão quanto à exatidão das datas ou conteú- dos destes documentos.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

Esta descrição refere-se às formas engenheiradas da classe de bacteriocinas que parecem, mas são distintas das caudas dos bacteriófagos. Estas bacteriocinas incluem piocinas do tipo R, bacteriocinas semelhantes à cauda, bacteriocinas do tipo R, ou outras bacteriocinas de peso molecular alto (hmw) relacionadas às estruturas caudais dos bacteriófagos. Para facili- dade de referência, o termo "bacteriocina de hmw" será aqui usado para re- ferir-se às bacteriocinas da descrição, incluindo, mas não limitadas a, bacte- riocinas do tipo R, piocinas do tipo FeR, monocinas, enterocoliticinas, e meningocinas.

Bacteriocinas de HMW naturais são tipicamente termoestáveis, resistentes a tripsina, e podem ser induzidas por agentes que ativam o sis- tema SOS. Por exemplo, elas também foram identificadas em muitas ente- robactérias, espécies Pseudomonas, Rhizobium lupin, espécies Bacillus, espécies Yersinia, e espécies Fiavobacterium.

Uma bacteriocina de hmw engenheirada é composta de múlti- plas cópias de várias subunidades de polipeptídeo diferentes e possuem uma ou mais fibras caudais compostas de proteínas de fibra caudal. Cada fibra caudal contém um domínio de ligação de receptor (RBD) que liga a, ou interage com, um receptor para formar um par de ligação. O RBD é a porção de uma fibra caudal que compreende a propriedade de ligação das bactérias que o torna o primeiro membro do par de ligação. Um RBD como descrito aqui compreende modificação de uma proteína na fibra caudal para formar uma fibra caudal modificada. A fibra caudal modificada com as outras subu- nidades de polipeptídeo forma uma bacteriocina de hmw engenheirada (ou modificada). O receptor ao qual o RBD liga é o segundo membro do par de ligação, e pode ser igual, ou diferente, ao receptor para uma bacteriocina sem a fibra caudal modificada. Em algumas modalidades da descrição, o segundo membro de um par de ligação é um fator de virulência ou aptidão de uma bactéria patogênica. Em outras modalidades, o segundo membro é um componente da(s) camada(s) mais externa(s) de uma célula bacteriana, tais como uma membrana de célula ou, no caso de bactérias gram-positivas, componente da parede celular.

Em comparação a uma bacteriocina de hmw carecendo da fibra caudal modificada, uma bacteriocina de hmw engenheirada pode diferir no número, maneira, e resistência de ligação de suas interações com um recep- tor. Desse modo, uma bacteriocina de hmw engenheirada pode ter proprie- dades de ligação diferentes ou adicionais (por exemplo especificidades de ligação, afinidades, e/ou avidezes) em comparação a uma bacteriocina sem a modificação. Uma bacteriocina de hmw engenheirada não é uma molécula de ocorrência natural mas pode ser uma versão modificada de uma molécula de ocorrência natural. Alternativamente, uma bacteriocina de hmw engenhei- rada pode ser uma versão modificada de outra bacteriocina de ocorrência não-natural. Na maioria das modalidades, uma bacteriocina de hmw enge- nheirada permanece um agente letal para as células bacterianas que ex- pressam um receptor ligado pela bacteriocina.

Em um primeiro aspecto, a descrição inclui uma bacteriocina de hmw compreendendo uma proteína de fibra caudal com um RBD modificado. Exemplos não-limitativos de bacteriocinas de hmw incluem piocinas do tipo F e do tipo R. Em algumas modalidades, o RBD modificado compreende uma alteração na seqüência de aminoácido do domínio com relação a uma bacte- riocina de ocorrência natural. Exemplos não-limitativos de uma alteração na seqüência de aminoácido incluem substituição, inserção (adição), ou dele- ção de um ou mais aminoácidos. Combinações de uma ou mais substitui- ções, inserções (adições), e deleções podem também ser usadas.

Em outras modalidades, a fibra caudal compreende uma se- qüência heteróloga, ou de não-bacteriocina, em um ou mais dos três monô- meros de proteína de fibra caudal que compõem uma fibra caudal trimérica simples. E enquanto as fibras caudais em uma bacteriocina nativa, ou de ocorrência natural, podem ser homotriméricas para formar um RBD, a fibra caudal de uma bacteriocina de hmw engenheirada ou é heterotrimérica onde um ou dois dos monômeros de proteína é/são diferente(s) um do outro, ou homotrimérica onde todos os três monômeros de proteína são identicamente não-nativos (ocorrendo não-naturalmente). A presença de seqüência heteró- loga (ou não-nativa), em um ou mais monômeros de proteína permite o trí- mero formar uma fibra caudal com um RBD modificado.

A seqüência heteróloga é desse modo em uma parte do(s) mo- nômero(s) de modo que pelo menos o RBD da fibra caudal é alterado em um trímero montado. O RBD alterado altera as características de ligação e pro- priedades da fibra caudal e assim a atividade de ligação de uma bacteriocina de hmw contendo a fibra caudal. Em algumas modalidades, o RBD heterólo- go é derivado de outra bacteriocina ou uma proteína da cauda de um bacte- riófago ou pró-fago. Em muitos casos, o RBD heterólogo é um polipeptídeo incluindo pelo menos parte da porção C-terminal de uma proteína de fibra caudal de uma bacteriocina, uma proteína de fibra caudal de bacteriófago, ou uma proteína de fibra caudal presuntiva, a seqüência desta foi derivada de um gene de um bacteriófago lisogênico viável ou até mesmo defeituoso encontrado dentro do genoma de uma bactéria. O RBD heterólogo é fundido em um polipeptídeo contendo uma região de ligação de placa base (BPAR) de uma bacteriocina de proteína de fibra caudal de hmw. A BPAR contendo polipeptídeo pode conter toda ou parte da porção N-terminal de uma fibra caudal de bacteriocina de hmw, onde a porção N-terminal pode consistir em qualquer parte da fibra caudal exceto grandemente no término C.

Em outras modalidades, o RBD heterólogo é derivado do deter- minante de tropismo principal (Mtd) de bacteriófago de Bordetella. Exemplos não-limitativos incluem um RBD heterólogo que compreende um Mtd modifi- cado ou diversificado, opcionalmente com todo ou parte do RBD de uma fi- bra caudal de um bacteriófago. Em algumas modalidades, a fibra caudal de bacteriófago é aquela do bacteriófago semelhante ao miovírus Vibrio harveyi (VHML) ou seus derivados diversificados ou aqueles de outro pró-fago ou bacteriófago que comprometem uma estrutura de Retroelemento de Gera- ção de Diversidade (DGR).

A descrição também inclui uma porção de uma bacteriocina de hmw engenheirada onde a porção retém a atividade da bacteriocina de ligar um receptor em uma superfície de célula bacteriana e depois promover a penetração da membrana celular. Desse modo a porção pode ser qualquer que retenha as atividades de ligação (reconhecimento) e de penetração da membrana de uma bacteriocina de hmw engenheirada. Em algumas modali- dades, a porção compreende um ou mais polipeptídeos de bacteriocina que são truncados.

Em um aspecto relacionado, a descrição inclui fibras caudais modificadas que podem fazer parte de uma bacteriocina de hmw da descri- ção. A fibra caudal trimérica pode compreender uma ou mais proteínas de fibra caudal com um RBD modificado ou um RBD heterólogo. Em algumas modalidades, a proteína de fibra caudal monomérica modificada é derivada de uma bacteriocina do tipo R enquanto em outras modalidades, a proteína de fibra caudal é derivada de uma proteína de fibra caudal de bacteriófago.

A descrição também inclui seqüências de ácido nucléico que codificam uma proteína de fibra caudal modificada, como também vetores e/ou células (hospedeiras) contendo as seqüências de codificação. Os veto- res e/ou células hospedeiras podem ser usados para expressar as seqüên- cias de codificação para produzir proteínas de fibra caudal modificadas que formam fibras caudais e são incorporadas em uma bacteriocina de hmw en- genheirada da descrição. Uma seqüência que codifica uma proteína de fibra caudal modificada pode também ser introduzidas em uma célula bacteriana que produz, ou é capaz de produzir, uma bacteriocina de hmw na presença da proteína de fibra caudal modificada. Expressão da proteína de fibra cau- dal modificada resulta na produção de uma bacteriocina de hmw modificada pela célula. Se a(s) seqüência(s) de proteína de fibra caudal de bacteriocina natural for(em) inativada(s) ou removida(s), então apenas bacteriocinas de hmw modificadas serão produzidas. Se a(s) seqüência(s) de proteína de fi- bra caudal de bacteriocina natural for(em) retida(s), então bacteriocinas de hmw modificadas serão produzidos juntamente com as fibras caudais de bacteriocina natural, e as piocinas modificadas geradas podem ser misturas de piocinas modificadas e piocinas naturais. Além disso, as piocinas geradas de tais bactérias hospedeiras de produção podem conter piocinas bivalentes (multivalentes), ou seja, contêm partículas de piocina simples com uma mis- tura de dois tipos de fibras caudais, cada uma com suas propriedades de ligação específicas. Tais piocinas multivalentes têm múltiplas especificida- des, duas ou mais, de ligação ou matança dentro da mesma partícula ou molécula de piocina. As bactérias transfeccionadas podem ser propagadas para produzir bacteriocinas de hmw que impeçam ou inibam o crescimento de outras bactérias que expressam um receptor ligado pela bacteriocina de hmw modificada ou por uma das bacteriocinas de hmw da mistura de bacte- riocinas de hmw modificadas mais naturais.

Em algumas modalidades, o receptor é um fator de virulência ou aptidão de uma cepa bacteriana virulenta ou patogênica de modo que expo- sição à bacteriocina de hmw modificada impede ou inibe o crescimento da cepa virulenta ou patogênica. Exemplos não-limitativos de fatores de virulên- cia alvejados por uma bacteriocina de hmw engenheirada incluem aqueles codificados pelas seqüências descritas na patente U. S. 6.355.411 e pedido de patente publicado WO 99/27129 (Ausubel et al.), que é por este meio in- corporado por referência como se completamente exposto.

A exposição é opcionalmente por meio de contato, ou cocultivo, com bactérias transfeccionadas que expressam a bacteriocina de hmw. A descrição inclui permitir a propagação das bactérias transfeccionadas in vi- vo, sobre ou dentro de um sujeito animal ou vegetal. A aplicação in vivo das bactérias transfeccionadas fornece um estado de proteção contra bactérias que expressam um receptor de superfície alvejado pela bacteriocina de hmw engenheirada. O estado de proteção é análogo a um estado de imunidade onde as bactérias transfeccionadas essencialmente aumentam ou suple- mentam a imunidade do organismo animal ou vegetal ou outro sistema de defesa.

Em outras modalidades, a seqüência de ácido nucléico que codi- fica um RBD de uma proteína de fibra caudal monomérica modificada faz parte de um sistema genético que permite a identificação, isolamento físico e/ou seleção da seqüência de codificação. Como exemplos não-limitativos, o sistema genético pode compreender a seqüência de codificação em um fa- go, fago lisogênico, partícula transdução, cosmídeo, ou genoma de fago que permitem sua identificação, isolamento, e/ou seleção. Em algumas modali- dades, a seqüência é fundida com uma porção de um gene de fibra e ex- presso para produzir um trímero de fibra caudal modificado que fará a bacte- riocina de hmw modificada ligar à superfície e matar o organismo hospedeiro que abriga o fago lisogênico do qual a seqüência de codificação de RBD foi identificada ou isolada. Detecção de um fenótipo no trímero de fibra caudal modificado permite a seqüência ser selecionada e/ou tríada, identificada, e isolada. Em algumas modalidades, o fenótipo pode ser uma propriedade de ligação de receptor desejada, e possivelmente rara.

A descrição inclui uma biblioteca de fagos, partículas de trans- dução, cosmídeos, ou genomas de fago, contendo uma pluralidade de se- qüências de DNA e/ou de RNA, cada uma codificando uma proteína de fibra caudal modificada. Este acoplamento de fenótipo de ligação para genótipo de codificação do RBD permite a expressão de uma pluralidade de RBDs modificados de modo que as seqüências que os codificam estão representa- das dentro da biblioteca. Em algumas modalidades, os membros de uma biblioteca cada um contêm uma seqüência que codifica uma proteína de fi- bra caudal modificada de modo que as fibras caudais homotriméricas são expressadas e disponíveis para triagem ou seleção para determinar o res- pectivo fenótipo de ligação de um membro de biblioteca. Em outras modali- dades, os membros de uma biblioteca incluem aqueles com mais de uma seqüência de codificação de uma proteína de fibra caudal modificada de modo que as fibras caudais heterotriméricas descritas aqui podem ser ex- pressadas e tríadas ou selecionadas para seus fenótipos de ligação. O fenó- tipo de ligação de um membro da biblioteca é desse modo acoplado às res- pectivas seqüências de codificação. Uma vez o genótipo que codifica o RBD desejado ou vantajoso foi assim identificado, este pode ser usado para criar a fibra caudal para uma bacteriocina de hmw modificada. Desenvolvendo a função da chaperona cognata de uma fibra caudal, tal como VHML, que na- turalmente diversifica seu RBD1 pode ser assegurado de dobramento apro- priado de uma fibra caudal contendo um RBD diversificado derivado de VH-ML.

Vetores, células hospedeiras, fagos, partículas de transdução, cosmídeos, genomas de fago, e bibliotecas como descritos aqui podem ser considerados composições compreendendo uma proteína de fibra caudal que codifica molécula de ácido nucléico.

Composições adicionais da descrição compreendem uma bacte- riocina de hmw engenheirada ou uma porção antibacteriana da mesma. As composições são antibacterianas em virtude da bacteriocina de hmw, e po- dem compreender um veículo ou excipiente. Claro que o veículo ou excipien- te é um que seja adequado para uso em combinação com uma proteína complexa de subunidades múltiplas como uma bacteriocina de hmw. Em algumas modalidades, o veículo ou excipiente é farmaceuticamente aceitá- vel de modo que a composição pode ser usada clínica ou agricolamente. Em outras modalidades, o veículo ou excipiente é adequado para administração tópica, pulmonar, gastrintestinal, ou sistêmica, tal como para um animal hu- mano ou um não-humano. Em modalidades adicionais, o veículo ou excipi- ente é adequado para administração em um organismo não-animal tal como uma planta ou produto fresco de uma planta como exemplos não-limitativos.

Uma composição como descrita aqui pode compreender mais que um bacteriocina de hmw engenheirada ou compreende um ou mais a- gentes adicionais, incluindo mas não limitados a, uma bacteriocina de hmw de ocorrência natural desejada para o uso com a bacteriocina de hmw enge- nheirada. Exemplos não-limitativos de um agente adicional incluem uma en- zima, um antibiótico, um agente antifúngico, uma bactericida, um analgésico, e um agente antiinflamatório.

Em um outro aspecto, a descrição fornece métodos de usar um produto relacionado à bacteriocina de hmw descrito aqui. Modalidades da descrição incluem métodos de inibir crescimento da célula bacteriana ou in- duzir morte da célula bacteriana. Tais métodos compreendem contatar uma célula ou células bacterianas suscetíveis com uma quantidade eficaz de uma bacteriocina de hmw engenheirada, ou com uma porção antibacteriana da mesma. Alternativamente uma composição contendo a bacteriocina de hmw, ou porção antibacteriana da mesma, pode ser usada. Em alguns casos, uma quantidade eficaz pode ser equivalente a tão pouco quanto uma bacteriocina de hmw, em média, por célula bacteriana. As quantidades mais altas podem também ser usadas.

Em outras modalidades, um método de comprometer a integri- dade da membrana citoplásmica de uma bactéria é fornecido. O acordo po- de resultar na perda de potencial da membrana e/ou perda de um pouco dos conteúdos celulares. Tais métodos compreendem contatar a membrana com uma bacteriocina de hmw engenheirada, ou porção antibacteriana da mes- ma. Em muitos casos, a membrana será à das bactérias virulentas ou pato- gênicas.

Em algumas modalidades, os métodos da descrição podem compreender aplicação in vivo (ou administração) de uma bacteriocina de hmw engenheirada, ou uma porção antibacteriana da mesma, dentro de um sujeito. Alternativamente, os métodos podem compreender contato in vitro ou ex vivo.

Em um ainda aspecto adicional, a descrição fornece um método de formar bactérias não-virulentas de bactérias progenitoras virulentas. O método compreende contatar as bactérias virulentas com uma bacteriocina de hmw engenheirada, ou uma porção antibacteriana da mesma que liga um fator de virulência ou aptidão das bactérias virulentas. O contato pode ser sob condições em que nem todas as bactérias são mortas, ou completamen- te inibidas no crescimento celular, pela quantidade de bacteriocina de hmw, ou porção antibacteriana da mesma, usada. O contato fornece uma pressão seletiva que permite a bactéria alvejada sobreviver a bacteriocina de hmw engenheirada ou porção antibacteriana da mesma e propagar apenas se tiver se tornado uma progênie de bactéria não-virulenta mutante ou modifi- cada que não é suscetível (e tão resistente) à bacteriocina de hmw enge- nheirada ou porção antibacteriana da mesma. Em algumas modalidades, a resistência é devido à falta de expressão do fator ou receptor de virulência ou aptidão pela bacteriocina de hmw engenheirada, ou porção antibacteriana da mesma, assim evitando ataque pela bacteriocina de hmw engenheirada.

Em outra modalidade, a resistência pode ser devido a uma alteração no fator de virulência ou aptidão de modo que esta já não serve como um receptor eficaz para o RBD da piocina modificada e na forma alterada também com- promete sua função de virulência ou aptidão. A aquisição de resistência pela progênie sobrevivente, e a alteração resultante na virulência ou aptidão de uma bactéria antigamente virulenta, pode ser determinada in vivo ou in vitro para demonstrar sua patogenicidade comprometida.

Em um aspecto relacionado, a descrição fornece um método de manter uma população de bactérias não-virulentas mediante contato com uma bacteriocina de hmw engenheirada, ou uma porção antibacteriana da mesma, que liga e medeia seu efeito bactericida por meio de um fator de virulência ou aptidão das bactérias virulentas. A presença da bacteriocina de hmw impede crescimento (ou geração ou propagação) das bactérias virulen- tas e assim mantém a população como não-virulenta. Em algumas modali- dades, o contato pode ser pelo uso de uma célula bacteriana, como descrito aqui que expressa a bacteriocina de hmw engenheirada ou porção antibacte- riana da mesma.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da descrição estão expostos nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras caracterís- ticas, objetivos, e vantagens da descrição serão evidentes dos desenhos e descrição detalhada, e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 fornece o micrógrafo de elétron de uma partícula de piocina do tipo R revelando 4 das 6 fibras caudais no Painel A, e um esque- mático dos componentes principais de uma partícula de piocina do tipo R no Painel B.

Figura 2 fornece ensaios de diluição de mancha serial (5X) das piocinas do tipo selvagem (R2), partículas de piocina produzidas da cepa de deleção da fibra caudal (PA01 APrfI5), e piocinas complementadas com a fusão da fibra caudal R2-P2. Bactérias alvo são 13s de P. aeruginosa e C de E. coli. Partículas de piocina R2 do tipo selvagem podem matar Pseudomo- nas mas não E. coli. A cepa de deleção da fibra caudal não produz nenhuma partícula de piocina ativa, mas quando complementada in trans com a fusão da fibra caudal R2-P2, esta agora pode matar C de E. coli.

Figura 3 é complementar à estrutura de piocina R2 com uma fusão da fibra caudal R2-P2. A porção C-terminal (RBD) do gene da fibra caudal P2 foi fundida com a porção N-terminal (BPAR) da fibra caudal R2, como mostrado na parte A.

Parte B da Figura 3 mostra um esquemático da piocina R2 do tipo selvagem (esquerda). A piocina R2 é complementada com a construção de fusão de R2 (BPAR)-P2 (RBD) para produzir partículas (direita) que têm as fibras caudais quiméricas incorporadas na estrutura. As partículas de R2- P2 têm um espectro de matança alterado e agora alvejam certas cepas de E. coli.

Figura 4 fornece umas fusões de R2-P2 múltiplas e suas ativida- des bactericidas. O término N, 1-164 aminoácidos, de R2 (Região de Liga- ção de Placa Base, "BPAR") foi fundido com várias porções C-terminais de P2 (RBD). Os números representam os números residentes de aminoácidos das respectivas proteínas. A atividade bactericida das piocinas modificadas (contra C de E. coli) contendo cada uma das fibras caudais construídas é indicadas como presente (+) ou ausente (-).

Figura 5 mostra várias porções do término N da fibra caudal R2 (BPAR) fundidas à porção C-terminal 158-669 (RBD) da fibra caudal P2. Os números representam os números residentes de aminoácidos das respecti- vas proteínas. A atividade bactericida das piocinas modificadas (contra C de E. coli) contendo cada uma das fibras caudais construídas é indicada como presente (+) ou ausente (-).

Figura 6 mostra fusões de R2-P2 múltiplas e suas atividades bactericidas. Término N, 1-240 aminoácidos, de R2 (BPAR) foi fundido com várias porções C-terminais de P2 (RBD). Os números representam os núme- ros residentes de aminoácidos das respectivas proteínas. A atividade bacte- ricida das piocinas modificadas (contra C de E. colí) contendo cada uma das fibras caudais construídas é indicada como presente (+) ou ausente (-).

Figura 7 fornece várias porções do término N da fibra caudal R2 (BPAR) fundida na porção C-terminal 322-669 (RBD) da fibra caudal P2. Os números representam os números residentes de aminoácidos das respecti- vas proteínas. A atividade bactericida das piocinas modificadas (contra C de E. coli) contendo cada uma das fibras caudais construídas é indicada como presente (+) ou ausente (-).

Figura 8 mostra a complementação trans da estrutura de piocina R2 PA01Δprf15 com várias fibras caudais de piocina do tipo R, fusões de fibra caudal e chaperonas. Atividades das piocinas complementadas R1 a R5 foram avaliadas tingindo sobre a cepa indicadora de 13s de Pseudomo- nas aeruginosa que é sensível a todos os tipos de piocina. As piocinas com- plementadas R2-P2 foram testadas para atividade usando o C de E. coli co- mo o indicador, e a piocina complementada R2-L-413c foi testada em cepa de Yersinia pestis KlM.

As fibras caudais de Prf 15 R2, R3, e R4 poderiam ser comple- mentadas pelo Prf 16 endógeno da piocina R2 de PA01 àprf15. Fibras cau- dais de Prf 15 R1 e R5 que diferem no término C comparadas à R2, requere- ram, para atividade máxima, seu próprio Prf 16 cognato (que difere da con- traparte de R2). Ambas as fusões R2-P2 como R2-L-413c, que contêm o término C (RBD) das fibras caudais P2 e L-413c do fago, respectivamente, requerem suas chaperonas de montagem da fibra caudal cognata codifica- das por gene G do fago.

Figura 9 mostra o vetor de expressão da fibra caudal de piocina e da chaperona pUCP30T. Os genes, prf 15 e prf16, são expressados usan- do um vetor ponte de PseudomonaslE. coli (Schweitzer) com origens de re- plicação (ori pR01600, rep, e oriT) para ambas as espécies. Sítios de clona- gem são mostrados pelos sítios de clivagem indicados da enzima de restri- ção. O plasmídeo confere resistência de gentamicina (Gm R) e é mantido adicionando gentamicina aos meios de cultura. Transcrição de ambos os genes é dirigida pelo promotor de tac que é negativamente regulado por la- clQ. Quando transformados no Aprf15 de PA01 da cepa de Pseudomonas aeruginosa, os genes, por exemplo prf15e prf16, incorporados no plasmídeo são trans expressados após terem sido induzidos com IPTG simultaneamen- te com a indução de mitomicina C daqueles genes de piocina que permane- cem nas bactérias de produção do hospedeiro de Δprfl5 de PAO1.

Figura 10 fornece a construção de fibra caudal de piocina espe- cífica para Yersinia pestis. Similar à estratégia que foi usada para a constru- ção de R2-P2, a porção de codificação C-terminal (RBD) do gene de fibra caudal de L-413c foi fundida com uma porção N-terminal (BPAR) da fibra caudal R2. Quando expressas in trans para complementar a cepa de dele- ção da fibra caudal R2 PA01 Δprfl5, partículas de piocina modificada são produzidas contendo as fibras caudais quiméricas R2-L-413c que podem eficientemente matar Y. pestis mas não Pseudomonas.

Figura 11 provê as seqüências de aminoácido ou seqüências de ácido nucléico para SEQ ID N-: 1-59, fornecidas nas páginas 11A-11J.

DEFINIÇÕES

Como aqui usado, uma bacteriocina de hmw inclui uma piocina do tipo R, bacteriocina semelhante à cauda, bacteriocina do tipo R, piocinas do tipo F e do tipo R, monocinas, meningocinas, ou outras bacteriocinas de peso molecular alto (hmw). Uma bacteriocina de hmw inclui versões modifi- cadas das piocinas do tipo R e do tipo F, enterocoliticinas, monocinas, e me- ningocinas (vide Kingsbury "Bacteriocin production by strains of Neisseria meningitidis". J Bacteriol. 91 (5):1696-9, 1966). Uma bacteriocina de hmw modificada ou engenheirada pode ser uma piocina do tipo R modificada se- lecionada da piocina R1, R2, R3, R4, ou R5 de P. aeruginosa. Uma bacterio- cina da descrição pode ser termoestável, resistente a ácido moderado, resis- tente à tripsina, sedimentável por centrifugação em cerca de 65.000 χ g, e resolvível através de microscópio de elétron (vide Jabrane et al. Appl. Envi- ron. Microbiol. 68:5704-5710, 2002; Daw et al. Micron 27:467-479, 1996; Bradley Bacteriol. Rev. 31:230-314, 1967; e Kageyama et al. Life Sciences 9:471-476, 1962. Em muitos casos, uma bacteriocina de hmw engenheirada aqui tem um ou mais, em qualquer combinação, destas propriedades. Uma propriedade adicional comum às bacteriocinas e bacteriocinas de hmw en- genheiradas descritas aqui é que elas não contêm nenhum ácido nucléico e desse modo são deficientes em replicação de modo que elas não podem auto-reproduzirem após ou durante a matança de uma bactéria alvo como muitos bacteriófagos o fazem.

Piocinas, e outras bacteriocinas de hmw reveladas aqui, são mo- léculas complexas que compreendem múltiplas subunidades de proteína, ou de polipeptídeo, e se assemelham às estruturas caudais dos bacteriófagos da família myoviridae. Em piocinas de ocorrência natural, as estruturas de subunidade são codificadas pelo genoma bacteriano tal como aquele de P. aeruginosa e formam piocinas para servir como defesas naturais contra ou- tras bactérias (Kageyama, 1975). Uma bactéria alvo sensível pode ser morta por uma molécula de piocina simples (Kageyama, 1964; Shinomiya & Shiga, 1979; Morse et al., 1980; Strauch et al., 2001).

Uma "bactéria alvo" ou "bactérias alvo" referem-se a uma bacté- ria ou bactérias que estão ligadas por uma bacteriocina de hmw engenheira- da da descrição e/ou cujo crescimento, sobrevivência, ou replicação são por ela(s) inibidos. O termo "inibição de crescimento" ou variações do mesmo refere-se à redução ou parada da taxa da divisão de uma célula de bactéria ou cessação da divisão da célula bacteriana, ou à morte das bactérias.

Como aqui usado, um "ácido nucléico" tipicamente refere-se aos polímeros de deoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo (puros ou misturados) em forma uni ou bifilamentar. O termo pode abranger ácidos nucléicos con- tendo análogos de nucleotídeo ou resíduos modificados da cadeia principal ou ligações que são sintéticas, de ocorrência natural e de ocorrência não- natural, que têm propriedades de ligação, estruturais ou funcionais similares como o ácido nucléico de referência, e que são metabolizados de uma ma- neira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos não-limitativos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de quiral-metila, ribonucleotídeo de 2-0-metila, e ácidos peptídeo-nucléicos (PNAs). O termo ácido nucléico pode, em alguns contex- tos, ser usado alternadamente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.

Uma seqüência de ácido nucléico particular também abrange variantes de modo conservador modificadas do mesmo (tais como substitui- ções de códon degenerado) e seqüências complementares, como também a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de có- don degeneradas podem ser alcançadas gerando seqüências em que a ter- ceira posição ("oscilante") de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base misturada e/ou de deoxiinosina. Desse modo, uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência de pro- teína revelada aqui também abrange variantes modificadas da mesma como descritas aqui.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína" são tipicamen- te usados de forma alternada aqui para referirem-se a um polímero de resí- duos de aminoácido. Aminoácidos podem ser referidos aqui ou por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão da Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB.

Fatores de virulência são aquelas moléculas que contribuem pa- ra a patogenicidade de um organismo mas não sua viabilidade geral. Na perda de um fator de virulência o organismo é menos patogênico mas não necessariamente menos viável. Fatores de virulência podem ter uma dentre numerosas funções, por exemplo, regular expressão do gene, fornecer ade- são ou mobilidade, bombear para fora agentes antibióticos, ou formar reves- timentos protetores incluindo biofilmes.

Fatores de aptidão são aquelas moléculas que contribuem para a viabilidade geral do organismo, taxa de crescimento ou competitividade em seu ambiente. Na perda de um fator de aptidão, o organismo é menos viável ou competitivo e por causa deste comprometimento, indiretamente menos patogênico. Fatores de aptidão podem também possuir uma dentre numero- sas funções, por exemplo, adquirir nutrientes, íons ou água, formar compo- nentes ou protetores das membranas da célula ou paredes da célula, repli- car, reparar ou mutagenizar ácidos nucléicos, fornecer defesa ou ofensa a insultos ambientais ou competitivos.

Alguns fatores de virulência e aptidão estão presentes na super- fície da bactéria e assim acessíveis a uma bacteriocina de hmw descrita a- qui. Ligando a alguns fatores de virulência ou aptidão de superfície, uma bacteriocina de hmw pode mediar a matança perfurando as membranas da célula, comprometendo a integridade da membrana citoplásmica e/ou dissi- pando o potencial da membrana da célula. Aquelas moléculas de superfície acessíveis mais prováveis de suportar a ligação e morte da bacteriocina de hmw são proteínas, polissacarídeos, e lipopolissacarídeos da membrana externa. Conseqüentemente, alvos potenciais para bacteriocinas de hmw engenheiradas são fatores de fatores de virulência e aptidão que são proteí- nas, polissacarídeos e lipopolissacarídeos da membrana externa. Alguns exemplos não-limitativos de alvos de fatores de virulência para piocinas en- genheiradas incluem metaloproteases de protease de clivagem intramem- brana (iCLIP); Iectinas de ligação de galactose e fucose de IL e IIL; compo- nentes de superfície microbiana reconhecendo proteínas da molécula de matriz adesiva (MSCRAMM); e adesina, tais como ACE.

O último sucesso de alvejar um fator de virulência específico de- pende de sua topografia na superfície bacteriana, sua densidade na superfí- cie, talvez sua mobilidade bidimensional dentro da membrana externa, e sua prevalência em isolados clínicos ou de campo do patógeno. Por exemplo, OprM é uma proteína de membrana externa semelhante à porina envolvida em bombas de efluxo múltiplas, por exemplo o sistema de MexAB, e preva- lecente em muitas bactérias gram-negativas (Wong e Hancock, 2000). ToIC, similar a OprM, é uma proteína acessória requerida para muitas bombas de efluxo de patógenos gram-negativos (Koronakis et al., 2004; Piddock, 2006).

Além disso, vários membros da família YcrC de secretinas são proteínas de membrana externas necessárias para a translocação de proteínas efetoras patogênicas pelo sistema de secreção do tipo três ("T3SS") em que muitos patógenos gram-negativos tais como P. aeruginosa e Yersinia pestis são dependentes para intoxicar seu hospedeiro mamífero (Galan e Collmer. 1999; Koster et al., 1997; Cornelis, 2006). Além disso, os membros da famí- lia YscW são lipoproteínas também atracadas na membrana externa para ajudar a inserção das secretinsas dentro da membrana (Burghout et al., 2004).

Exemplos não-limitativos adicionais de fatores de virulência e aptidão incluem uma aquaporina, tal como o canal de água de aquaporina-Z de E. coli (vide Calamita, 2000); RetS (vide Goodman et al., 2004; e Zolfa- ghar et al., 2005); os membros da família 7TMR-DISM (vide Anantharaman et al., 2003); OprM (vide Wong et al., 2000; e SEQ ID N9: 11); proteínas bac- terianas tais como OprJ (SEQ ID N9: 12), OprN (SEQ ID Ns: 13), AprF (SEQ ID NQ: 14), OpmM (SEQ ID Ns: 15), OpmA (SEQ ID N9: 16), OpmD (SEQ ID N9: 17), OpmE (SEQ ID N9: 18), OpmQ (SE ID N9:35), OpmB (SEQ ID N9: 36), OpmJ (SEQ ID N9: 37), OpmG (SEQ ID N9: 38), Opml (SEQ ID N9: 39), OpmH (SEQ ID N9: 40), OpmK (SEQ ID N9: 41), OpmN (SEQ ID N9: 42), OpmF (SEQ ID N9: 43), ou OpmL (SEQ ID N9: 44); a família OprD das pori- nas (vide Tamber et al., 2006); ACE, ou o gene de ACE codificado por 0G1RF de E. faecalis (vide Sreedhar et al., 2000; e Rich, et al., 1999); as lectinas de ligação de galactose e fucose de PA-IL e PA-IIL (vide Mitchell et al., 2002); genes de virulência vegetais e animais descritos por He et al., 2004; metades de pirofosfato extracelular (vide Bonev et al., 2004); metalo- proteases (vide Rudner et al., 1999); e moléculas de superfície codificadas por transpóson (vide Jacobs et al., 2003).

Outros exemplos não-limitativos de fatores de virulência alveja- dos por uma bacteriocina de hmw engenheirada descrita incluem aqueles codificados pelas estruturas de leitura aberta (ORFs) descritas na patente U. S. 6.355.411 e WO 99/27129, que são por este meio incorporados em suas totalidades como se completamente expostos. Em algumas modalidades, um fator alvejado por uma bacteriocina descrita aqui é codificado pelas ORFs a seguir da patente U. S.: <table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table>

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS MODOS DE PRATICAR A DESCRIÇÃO GERAL

Bacteriocinas de hmw têm a habilidade para matar bactérias ra- pidamente. Alguns relatórios prematuros de estudos in vivo mostraram que elas podem ser eficazes em camundongos para esta aplicação (Haas et al., 1974; Merrikin e Terry, 1972). Os inventores determinaram recentemente que piocina R2 do tipo selvagem podem salvar camundongos de peritonite aguda causada por Pseudomonas aeruginosa resistente a antibióticos quan- do administrada intraperitoneal ou intravenosamente e que as piocinas R2 podem atuar em doses muito baixas, tais como 109 piocinas ou menos que 1 μg de proteína total em uma dose única (dados não mostrados).

Para as bacteriocinas de hmw serem clinicamente úteis como agentes antibacterianos, porém, o problema de seus espectros bactericidas estreitos deve ser focalizado. Embora isto possa ser visto como uma vanta- gem em que é possível especificamente alvejar uma espécie ou cepa parti- cular sem afetar a flora normal, os tipos de espécies/cepas que são sensí- veis às bacteriocinas conhecidas são limitados. Por exemplo, piocinas são conhecidas ser correntemente produzidas por algumas cepas de Pseudo- monas aeruginosa, e têm atividade contra uma faixa estreita de outras cepas de Pseudomonas e algumas outras espécies gram-negativas. Bacteriocinas do tipo R foram relatadas de outras espécies (tais como Erwinia, vide Jabra- ne 2002, e Yersinia enterocolitica, vide Strauch) mas a ocorrência parece ser limitada. Por outro lado, fagos de Myoviridae são bastante difundidos e co- muns e são encontrados ao longo da classe bacteriana.

Esta descrição demonstra que é possível alterar o espectro de uma piocina e assim qualquer bacteriocina de hmw. Um determinante princi- pal do espectro entre as piocinas e seus fagos relacionados fica na fibra caudal que especificamente liga à superfície bacteriana interagindo através de sua porção C-terminal (RBD) com um componente do LPS ou outra estru- tura de superfície da célula. O LPS pode ser altamente variável entre espé- cies diferentes, e cepas de bactérias, e fibras caudais de bacteriófago são em si altamente variáveis, particularmente nesta região C-terminal que inte- rage com a superfície da célula (Tetart, Desplats). Esta variabilidade aparen- temente reflete as adaptações constantes dos fagos às superfícies hospe- deiras variáveis. Observou-se que tipos de fago diferentes que infetam o mesmo hospedeiro (os fagos de E. coli P2, Mu, e P1) têm similaridade de seqüência na porção C-terminal da fibra caudal (Haggard-Ljungquist E, Hal- Iing C, Calendar R.), indicando que transferência horizontal nestas regiões genéticas provavelmente representa um papel na especificidade do hospe- deiro. Por exemplo, piocina R2 tem um grau muito alto de similaridade de seqüência ao fago de Pseudomonas phiCTX, um fago que é também muito estritamente relacionado ao fago de E. coli P2. Comparando as seqüências de fibra caudal da piocina R2 e P2, mais similaridade de seqüência é vista no término N (BPAR) que com o término C (RBD), sugerindo que o término C represente o papel na especificidade do hospedeiro.

Como revelado aqui, é possível alterar o espectro alvo de uma piocina ou outro bacteriocina de hmw criando a porção C-terminal do gene de fibra caudal. É notável que esta alteração de espectro pode ocorrer ao longo das barreiras das espécies, demonstrando que piocinas do tipo R na- turais e outras bacteriocinas de hmw naturais como reveladas aqui podem ser modificadas e desenvolvidas em antimicrobianos com espectros mais vastos.

BACTERIOCINAS DE HMW MODIFICADAS

A descrição provê bacteriocinas de hmw engenheiradas com especificidades e/ou afinidades de ligação alteradas. Em algumas modalida- des, uma bacteriocina de hmw da descrição liga especificamente às molécu- las de superfície exposta que atuam como fatores de virulência ou de fatores aptidão de bactérias patogênicas. O termo "especificamente (ou seletiva- mente) liga" refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da pre- sença do Iigante ligado, freqüentemente em uma população heterogênea de proteínas e outra substância biológica. Como resultado, a bacteriocina de hmw engenheirada uma vez ligada especificamente pode de modo genérico matar as bactérias patogênicas. Além disso, para se tornarem resistentes à bacteriocina de hmw engenheirada, as bactérias patogênicas alvejadas têm que perder seu sítio de reconhecimento ou de ligação para a bacteriocina de hmw. Declarado diferentemente, se a bacteriocina de hmw modificada espe- cífica e exclusivamente usar o fator de virulência ou aptidão como seu recep- tor, as bactérias seriam forçadas a perder sua virulência ou aptidão para es- capar da matança pela bacteriocina de hmw engenheirada.

Uma bacteriocina de hmw modificada da descrição se asseme- lha a uma cauda do bacteriófago mas compreende uma capacidade de liga- ção, ou domínio de ligação de receptor (RBD), que foi alterada com relação a uma bacteriocina não-alterada, de ocorrência natural, ou nativa. O RBD pode ser alterado na seqüência de aminoácido mediante o uso de técnicas de DNA recombinantes como descritas aqui. O termo "recombinante", tipi- camente usado com referência a uma célula, ou ácido nucléico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácido nucléico, proteína ou vetor, foi modificada pela introdução de um ácido nucléico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucléico nativo ou proteína, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim uma célula recombinante expressa genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não-recombinante) da cé- lula ou expressa genes nativos que são expressados anormalmente, infra- expressados, ou não expressados de modo algum.

Em muitas modalidades, o RBD pode ser modificado para ser aquele de uma fibra caudal de outra bacteriocina ou um bacteriófago. Como exemplo não-limitativo descrito aqui, o RBD de piocina R2 é modificado fun- dindo a porção C-terminal da proteína de fibra caudal (RBD) de um fago (que infeta um hospedeiro diferente) com a porção N-terminal (BPAR) da proteína de fibra caudal R2. Fundindo o término C da fibra caudal P2 a PRF15 de R2 e co-expressando o chaperona cognata de P2, o espectro da bactéria alvo da R2 é alterado para matar o C de E. coli. Vide Figura 2.

Em modalidades adicionais, bacteriocinas de hmw são do con- trário engenheirados. A descrição inclui uma bacteriocina de hmw projetada ou selecionada para reconhecer, ou alvejar, uma molécula de superfície de uma bactéria (tal como uma bactéria patogênica). A molécula de superfície pode ser considerada um receptor em uma bactéria reconhecida, ou ligada, pela bacteriocina de hmw.

A descrição é com base nas propriedades de uma fibra caudal de bacteriocina de hmw para ligar ou interagir com um receptor para formar um par de ligação. A ligação ou interação ocorre através do RBD da fibra caudal, que é o primeiro membro do par de ligação com o receptor sendo o segundo membro do par. Em muitas modalidades, o receptor é uma molécu- la de superfície de célula bacteriana ou porção da mesma. Em outras moda- lidades, o receptor é uma molécula com propriedades de um fator de viru- lência ou aptidão de uma bactéria patogênica.

Uma bacteriocina de hmw modificada ou engenheirada descrita aqui compreende uma fibra caudal tendo tanto uma região de ligação de pla- ca base (BPAR) como um RBD modificado, ou heterólogo. Como descrito aqui, a fibra caudal é uma estrutura trimérica de três subunidades de proteí- na de fibra caudal, cada uma desta também compreende um primeiro domí- nio correspondendo, e formando, a BPAR em uma fibra caudal e um segun- do domínio correspondendo, e formando, um RBD modificado ou heterólogo em uma fibra caudal.

Tipicamente, "heterólogo" quando usado com referência a por- ções de uma proteína ou seqüência de ácido nucléico indica que a seqüên- cia compreende duas ou mais subseqüências que usualmente não são en- contradas na mesma relação uma com a outra na natureza. Por exemplo, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subseqüências que não são encontradas na mesma relação uma com a ou- tra na natureza. "Heterólogo" também significa que a seqüência de aminoá- cido ou de ácido nucléico não é normalmente encontrada junto com as ou- tras seqüências ou não é normalmente contida no plasmídeo, vetor, ou hos- pedeiro selecionado. Em outras palavras, não é nativa ao sistema para o qual é agora utilizado. Por exemplo, proteínas produzidas por um organismo do qual não é a fonte do tipo selvagem daquelas proteínas.

Assim em muitas modalidades, a descrição inclui que uma prote- ína de fibra caudal de bacteriocina de hmw compreendendo um BPAR da proteína e um RBD modificado, ou heterólogo. O BPAR encontra-se tipica- mente na região N-terminal de uma proteína de fibra caudal, enquanto o RBD encontra-se tipicamente na região C-terminal. Diferente do RBD modifi- cado, ou heterólogo, a proteína de fibra caudal pode ser aquela de qualquer bacteriocina de hmw de ocorrência natural, com uma piocina, monocina, en- terocoliticina, ou meningocina que são exemplos não-limitativos. Em algu- mas modalidades, a proteína de fibra caudal de R1-piocina, R2-piocina, R3- piocina, R4-piocina, e R5-piocina, como representadas pela SEQ ID NQ: 1, 3, 5, 7, 9, respectivamente, podem ser usadas como descritas aqui. Em moda- lidades adicionais, a proteína de fibra caudal pode ser aquela ou aquelas do fago OCTX SEQ ID NQ: 45, ou aquela do fago PS17 SEQ ID NQ: 19 ou aque- la do bacteriófago de VHML SEQ ID N5: 21 e 22.

Modalidades da descrição incluem combinações de uma BPAR de proteína de fibra caudal de bacteriocina de hmw e um RBD de uma prote- ína de fibra caudal de bacteriófago, como mostradas na Figura 3. Em alguns casos, uma combinação pode incluir os aminoácidos N-terminais da posição 1 a cerca da posição 164 ou posição 240 de uma proteína de fibra caudal de bacteriocina. Este fragmento de polipeptídeo pode ser fundido com uma re- gião de uma proteína de fibra caudal do bacteriófago incluindo sua porção C- terminal contendo um RBD. A região pode ser um fragmento de polipeptídeo que carece da região N-terminal da posição 1 a cerca da posição 150, cerca da posição 170, cerca da posição 190, cerca da posição 290, cerca da posi- ção 300, ou cerca da posição 320. Usando a piocina R2 e a proteína de fibra caudal do fago P2 como exemplos não-limitativos, o fragmento contendo BPAR pode incluir os aminoácidos N-terminais da posição 1 à posição 164 ou 240. Vide Figuras 4- 7. O fragmento contendo RBD pode incluir o C-terminal, e de cerca de 347 a cerca de 755 aminoácidos em comprimento das proteínas de fibra caudal P2 ou fago relacionadas. A fusão pode ser facilmente preparada através de téc- nicas de DNA recombinante com seqüências de ácido nucléico que codifi- cam a proteína de fibra caudal R2, tal como prf15, e o gene de fato P2 H que codifica sua proteína de fibra caudal. A chaperona cognata do RBD necessi- ta ser coexpressada com os genes de fibra caudal de fusão para assegurar a montagem das fibras caudais modificadas em uma estrutura de piocina funcional. Vide figura 8.

Em outras modalidades, um RBD modificado compreende uma alteração na seqüência de aminoácido do RBD com relação a um RBD de ocorrência natural ou com relação à BPAR presente na proteína de fibra caudal. Exemplos não-limitativos de uma alteração na seqüência de aminoá- cido incluem substituição, inserção (ou adição), ou deleção de um ou mais aminoácidos.

Em modalidades compreendendo a substituição de resíduos de aminoácido de RBD, cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 %, cerca de 5 %, cerca de 6 %, cerca de 7 %, cerca de 8 %, cerca de 9 %, cerca de 10 %, cerca de 11 %, cerca de 12 %, cerca de 13 %, cerca de 14 %, cerca de 15 %, cerca de 16 %, cerca de 17 %, cerca de 18 %, cerca de 19 %, cerca de 20 %, cerca de 22 %, cerca de 24 %, cerca de 26 %, cerca de 28 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, cerca de 45 %, ou cerca de 50 %, ou mais, do término C em uma proteína de fibra caudal são substituídos. Em algumas modalidades, as substituições estão dentro de cerca de 245, cerca de 260, cerca de 275, ou cerca de 290, ou mais, resí- duos do término C.

As posições para substituição podem ser qualquer um ou mais, em qualquer combinação, dentro daquela região. Posições exemplares in- cluem, mas não são limitadas a, 448, 449, 452, 453, 454, 455, 459, 460, 462, 463, 464, 469, 472, 473, 474, 475, 478, 480, 484, 485, 486, 491, 494, 496, 497, 498, 499, 505, 506, 507, 508, 510, 512, 514, 517, 518, 519, 520, 521, 523, 527, 528, 530, 531, 533, 535, 537, 538, 541, 543, 546, 548, 561, 603, 604, 605, 606, 610, 618, 621, 624, 626, 627, 628, 629, 631, 632, 633, 638, 641, 642, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 657, 659, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, e 691, co- mo também qualquer combinação das mesmas, na SEQ ID N9: 1, 3, 5, 7, ou 9. Em algumas modalidades, a substituição é conservadora como descrita aqui. Em outras modalidades, a substituição é com uma substituição não- conservadora.

Em outras modalidades, inserções e deleções dos resíduos de aminoácido dentro da mesma região no término C de uma proteína de fibra caudal podem ser feitas.

RBD DE BACTERIÓFAGOS

Outras fontes de RBD incluem, mas não são limitadas a, fagos T-4 e outro T-par ou pseudoT-par, fagos T-3 e 1-1, supergrupo de fagos 1-1, fago Mu, fago P22, fago L-413c, e fagos lambdóides.

RBD DE DIVERSIFICAÇÃO

Em outras modalidades, uma proteína de fibra caudal compre- ende uma substituição, ou inserção, de um RBD derivado de um organismo que diversifica a estrutura desenvolvendo uma Retroelemento Gerador de Diversidade (DGR), como descrito no Pedido de Patente publicado US 2006- 0121450, publicado em 8 de junho de 2006 (incorporado aqui por referência como se completamente exposto). O determinante de tropismo principal (Mtd) do bacteriófago de Bordetella BPP-1 é uma tal estrutura. A seqüência de Mtd é representada pela SEQ ID NQ: 24 como descrita aqui. Em outras modalidades, a substituição é com parte da seqüência de Mtd, tal como, mas não limitada a, a região dos resíduos 49 a 381, dos resíduos 171 a 381, ou dos resíduos 306 a 381, da SEQ ID Ng: 24. A inserção da seqüência de Mtd, ou qualquer fragmento da mesma (tal como aqueles listados acima), à ter- minação de uma proteína de fibra caudal, tal como após a posição 691 da SEQ ID Ns: 3, está dentro das modalidades descritas aqui. A substituição da seqüência de Mtd, ou qualquer fragmento da mesma (tal como aqueles lista- dos acima), pode ser para qualquer região de não-BPAR de uma proteína de fibra caudal. Exemplos não-limitativos incluem a região da SEQ ID NQ: 1, 3, 5, 7, ou 9 começando por cerca da posição 643, 625, 562, 448, 428, 231, e 163 através do término C da seqüência (vide figuras 4-7 para exemplificação destas substituições).

Como descrito aqui, a seqüência de Mtd em uma fibra caudal pode ser diversificada para produzir uma pluralidade de RBDs modificados ou heterólogos. A seqüência de ácido nucléico que codifica Mtd compreende uma região variável (VR) que pode ser operativamente ligada, em eis ou in trans, a uma região modelo (TR) de modo que a TR é uma seqüência mode- lo que direciona mutagênese loco-específica da VR. A ligação operativa en- tre as regiões VR e TR também inclui uma ligação operativa às seqüências que codificam uma atividade de transcriptase reversa (TR) que pode estar presente in trans com relação à VR. Sítios de variabilidade na VR de Mtd correspondem aos resíduos de adenina na região modelo em geral homólo- ga, TR sendo invariante e essencial para alterações da seqüência na VR. Assim embora uma molécula inicial possa conter uma TR que é idêntica à VR, os resíduos de adenina presentes na TR resultarão no mutagênese ou diversificação das posições correspondentes na seqüência de VR. Assim se a seqüência de TR for uma repetição direta perfeita da seqüência na VR, diversificação da região VR resulta em um ou mais resíduos de adenina na VR, também encontrados na TR, sendo mutados para outro nucleotídeo, que é citosina, timina ou guanina sem alteração na seqüência de TR. Este siste- ma pode ser usado para alterar a região VR, e desse modo o RBD, de uma proteína de fibra caudal modificada como descrita aqui.

Sob diversificação, a proteína de fibra caudal pode ser variada de modo que o RBD resultante tenha pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % homologia ao determinante de tro- pismo principal (Mtd) do bacteriófago de Bordetella BPP-1, como represen- tado pela SEQ ID Ns: 24. Como descrito aqui, a proteína de fibra caudal e combinação de Mtd podem ser uma substituição, ou uma inserção, de uma seqüência de Mtd ou porção da mesma na seqüência de proteína de fibra caudal. Desse modo a proteína de fibra caudal resultante pode ser vista co- mo compreendendo uma substituição ou inserção com um domínio de Iiga- ção com pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % homologia como recitado acima.

Uma molécula de ácido nucléico que codifica uma fibra caudal e combinação de Mtd pode ser usada para diversificação e variação da se- qüência. Desse modo combinações de ácido nucléico das seqüências que codificam toda ou parte de uma proteína de fibra caudal, e toda ou parte de um Mtd, estão dentro das modalidades descritas. Outras modalidades inclu- em moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer proteína de fibra caudal com uma RBD modificado ou heterólogo como descrito aqui. Em al- gumas modalidades, RBD modificado ou heterólogo codificado compreende uma alteração na seqüência de aminoácido do RBD com relação a um RBD de ocorrência natural ou com relação ao BPAR presente na proteína de fibra caudal como descrito acima.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fibra caudal que codifica a molécula de ácido nucléico pode ser feita disponível para diversifi- cação para formar uma proteína de fibra caudal modificada descrita aqui. A molécula de ácido nucléico, sob controle de um promotor adequado, é ope- rativamente colocada 5' para uma região de atd-TR-brt. A seqüência de TR pode ser referida como TR' e preparada com base na seqüência de VR co- mo debatido abaixo. A construção de ácido nucléico resultante pode carre- gar uma deleção da estrutura de terminador de transcrição a montante do atd.

Uma região da molécula de ácido nucléico que codifica a extre- midade C-terminal da proteína de fibra caudal como descrita acima, é sele- cionada para ser a VR e depois operativamente ligada a uma seqüência de TR' que contém os resíduos de adenina nas posições, que quando variada, alterações de aminoácido variadas, diretas na seqüência codificada pela VR. Tais resíduos de adenina podem ser deliberadamente projetados para estar na primeira ou segunda posição dos códons dentro da VR. A seqüência de TR' pode ser inicialmente idêntica à VR selecionada seguida por mutagêne- se loco-direcionada ou síntese de novo de ácido nucléico para preparar a seqüência de TR' que contém os resíduos de adenina nas posições corres- pondentes para direcionar mutagênese e diversificação na proteína de fibra caudal codificada.

PREPARAÇÃO E USO DE BACTERIOCINAS DE HMW

As moléculas de ácido nucléico descritas aqui podem ser usadas para expressar e preparar proteínas de fibra caudal, incluindo proteínas mo- dificadas ou criadas, por quaisquer meios conhecidos à pessoa versada. Em algumas modalidades, a expressão é por meio do uso de um vetor que con- tém a molécula de ácido nucléico operavelmente ligada a um promotor que pode direcionar a expressão da proteína de fibra caudal codificada.

Em muitas modalidades, a expressão pode ocorrer com expres- são de um gene acessório, tal como uma seqüência de codificação de "cha- perona" relatada para várias bacteriocinas e bacteriófagos. A presença de uma chaperona facilita a montagem de uma bacteriocina de hmw da descri- ção sem necessariamente se tornar uma parte da bacteriocina. A chaperona pode ser proteína cognata, ou correspondente, para o RBD usado em uma bacteriocina de hmw da descrição tal como mostrada na figura 8. Um exem- plo não-limitativo de uma chaperona é codificado através de prf16 de R2 (SEQ ID N9: 4), e corresponde (ou é a chaperona cognata) à proteína de fi- bra caudal codificada de piocina R2 por prf15 (SEQ ID Ns: 3). Outros exem- plos incluem gene G na P2 (SEQ ID N5: 26), gene G em L-413c (SEQ ID N9: 29), a chaperona cognata, SEQ ID Ng: 20, para a fibra caudal PS17, e a Orf 38 (SEQ ID N-: 23) em bacteriófagos de VHML que são chaperonas cogna- tas para os genes de fibra caudal em cada fago. Estes genes são homólogos ao fago T4 gp38 (SEQ ID N5: 32) que é conhecido ser responsável pelo do- bramento apropriado da fibra caudal de T4 (SEQ ID N9: 31) em trímeros (Burda, Qu, Hash emolhosseni).

O uso de uma chaperona cognata é vantajoso porque uma cha- perona não-cognata pode ser insuficiente para corretamente dobrar uma proteína de fibra caudal dada e/ou ajuntá-la em uma bacteriocina de hmw, como mostrado na figura 8. Como um exemplo não-limitativo, o produto gê- nico de prf16 de R2 foi observado ser insuficiente para complementar o do- bramento de uma fibra caudal modificada comprometendo um BPAR de R2 fundido com uma porção de BRD de P2 de uma fibra caudal. Sem estar pre- so à teoria, e oferecido para melhorar a compreensão da descrição presente, acredita-se que uma chaperona possa especificamente agir na porção C- terminal de sua proteína de fibra caudal cognata e que as fibras caudais e suas chaperonas coevoluíram. Porém, Qu et al. isolou um mutante de fibra caudal de gp37 de T4 que suprime o requerimento por gp38, sua chaperona cognata. Este mutante teve em gp37 uma duplicação de um motivo de espi- ral encaracolado, que pode por si só representar um papel de dobramento. Portanto, acredita-se também que uma proteína de fibra caudal possa ser projetada para conter um tal alteração de forma que ela se dobre correta- mente sem a necessidade de coexpressar uma chaperona cognata.

Portanto, modalidades da descrição incluem uma célula bacteri- ana transfeccionada com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fibra caudal modificada ou engenheirada, opcionalmente coex- pressada com uma chaperona, como descrita aqui. Expressão da molécula de ácido nucléico, opcionalmente com uma proteína acessória (chaperona), resulta na produção de fibras caudais modificadas ou criadas da descrição. A descrição também inclui expressão de mais que proteína de fibra caudal modificada ou engenheirada através do uso de mais de uma molécula de ácido nucléico para resultar em fibras caudais homotriméricas ou até mesmo heterotriméricas misturadas. Adicionalmente, seqüências que codificam a proteína de fibra caudal e chaperona podem ser contidas dentro de uma mo- lécula de ácido nucléico simples, tal como um plasmídeo ou outro vetor, ou através de moléculas separadas. Onde uma molécula de ácido nucléico simples for usada, as seqüências opcionalmente podem estar sob o controle da(s) mesma(s) seqüência(s) reguladora(s). Alternativamente, as seqüências de codificação podem ser sob controle regulador separado.

Em algumas modalidades, a célula bacteriana é também capaz de expressar as subunidades adicionais para formar uma bacteriocina de hmw que compreende uma fibra caudal modificada ou engenheirada. Em um grupo de modalidades, a seqüência de proteína de fibra caudal de codifica- ção endógena da célula bacteriana é inativada ou deletada. Opcionalmente, as outras subunidades podem ser codificadas através das seqüências em uma molécula de ácido nucléico, tal como um plasmídeo ou outro vetor, se- parado daquela que contém uma seqüência que codifica uma proteína de fibra caudal e/ou chaperona. Desse modo a proteína de fibra caudal e/ou chaperona pode(m) ser fornecida(s) com uma ou mais moléculas de ácido nucléico in trans com relação às outras subunidades.

Os ácidos nucléicos, vetores, e células bacterianas Podem ser usados em um método de produzir uma bacteriocina de hmw modificada ou engenheirada como descrita aqui. Um tal método pode compreender cultivar células bacterianas que contêm moléculas de ácido nucléico como descritas acima sob condições que resultam na expressão e produção da fibra caudal e bacteriocina de hmw. Em algumas modalidades da descrição as condições são in vivo dentro de um animal.

Em um grupo de modalidades, um método de preparar uma bac- teriocina de hmw compreende expressar as subunidades de bacteriocina, incluindo a proteína de fibra caudal modificada ou engenheirada, em uma bactéria hospedeira, e colher a bacteriocina de hmw da cultura bacteriana. A bactéria hospedeira é uma bactéria de produção hospedeira complementar que codifica e expressa as outras subunidades necessárias para a produção da bacteriocina. O termo "bactéria hospedeira" ou "bactérias hospedeiras" refere-se a uma bactéria ou bactérias usadas para produzir uma bacteriocina de hmw descrita aqui. Bactéria ou bactérias hospedeiras podem também ser referidas como "bactéria de produção hospedeira" ou "bactérias de produção hospedeira". O "colher uma bacteriocina de hmw de uma cultura bacteriana" em geral compreende remover a bacteriocina da cultura bacteriana hospe- deira.

Em um grupo alternativo de modalidades, um método de prepa- rar uma bacteriocina de hmw com uma fibra caudal modificada como descri- ta aqui é fornecido. O método pode compreender preparar uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fibra caudal modificada por qualquer meio descrito aqui e expressar a molécula de ácido nucléico em uma célula sob condições em que uma bacteriocina de hmw é produzida.

Modalidades da descrição incluem uma bacteriocina de hmw que compreende uma proteína de fibra caudal como descrita aqui. Em um grupo de modalidades, a bacteriocina compreende uma proteína de fibra caudal compreendida em parte da seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID Ns: 1, 3, 5, 7, 9. Em outras modalidades, a bacteriocina é uma piocina, monocina, enterocoliticina, ou meningocina modificada ou engenhei- rada compreendendo uma fibra caudal com um RBD modificado heterólogo. Em muitas modalidades, o RBD modificado heterólogo liga um fator de viru- lência ou aptidão bacteriana.

Em outras modalidades, bacteriocinas de hmw engenheiradas com fibras caudais multivalentes são descritas. Mtd de bacteriófago de Bor- detella bronchiseptica BPP-1 foi descoberto através de análise cristalográfica de raio X ser um homotrímero piramidal altamente entrelaçado com os três conjuntos de doze resíduos de aminoácido variáveis que formam três sítios de ligação de receptor bastante planos com a base da pirâmide e localizados em um domínio de Iecitina do tipo C convergentemente evoluído ("CTL"). Comparação das estruturas de cinco variantes de Mtd em resolução de 1,5 angstróm mostrou que a conformação de cadeia principal dos resíduos vari- áveis é estruturalmente invariante, com inserções na CTL e montagem trimé- rica ambas contribuindo para a formação de um andaime estático para exibi- ção combinatória de resíduos variáveis, assim minimizando a incidência de desdobramento da proteína (McMahon et al., 2005). Desse modo uma fibra caudal simples pode ser gerada para conter três monômeros misturados cor- retamente dobrados uma vez que as estruturas das fibras de Mtd variantes são idênticas com exceção dos doze resíduos de aminoácido expostos a solvente não-interagentes.

A estrutura da variante de Mtd-Pl dominante ligada a seu recep- tor, o pertactina de fator de virulência de Bordetella, foi também solucionada por cristalografia e caracterizada. Um dos monômeros de Mtd liga um domí- nio estrutural em pertactina; um segundo monômero idêntico do mesmo Mtd liga um domínio estrutural diferente, não-simétrico da mesma molécula de pertactina (monomérica); um terceiro monômero de Mtd permanece não- ligado.

As estruturas de Mtd variantes acima e a interação de ligação entre Mtd e seu alvo, pertactina, podem ser aplicadas ao projeto e seleção de fibras caudais multivalentes. Por exemplo, é evidente que um monômero de Mtd pode exibir afinidades por dois domínios estruturais diferentes e ain- da em formato multimérico pode possuir avidez suficiente para realizar liga- ção e infecção de fago funcional. Além disso, nem todos os monômeros de uma fibra não necessitam estar ligados a um receptor para prover avidez adequada para ligação e infecção de fago. Estes dados e conclusões junta- mente com o conhecimento que para pelo menos bacteriófagos de T4, tam- bém myoviridae, apenas três (homotrimérica) fibras caudais necessitam es- tar ligadas a receptores para desencadear contração da envoltura da cauda e penetração do núcleo das membranas bacterianas, indicam vários meios de gerar uma bacteriocina de hmw multivalente. Tais bacteriocinas de hmw multivalentes engenheiradas têm faixas de hospedeiro mais vastas e são até mesmo capazes de ligar a mais que uma virulência simples ou fator de apti- dão no mesmo organismo bacteriano, assim tornando mais difícil para as bactérias alvejadas desenvolverem resistência por perda mutacional da ex- pressão de todos receptores alvejados relevantes. Uma bacteriocina do tipo R pode ser engenheirada para possuir dois conjuntos independentes de três fibras caudais idênticas, as fibras de um conjunto compreendidas dos mes- mos três monômeros não-idênticos, e as fibras do outro conjunto compreen- didas de três monômeros não-idênticos diferentes. Cada monômero pode possuir afinidades de ligação por dois epítopos diferentes (por exemplo dois receptores diferentes), da mesma maneira que Mtd. Assim qualquer bactéria que expressa qualquer uma ou mais das 12 moléculas de receptor alvejadas diferentes (2 "epítopos"/monômero vezes 3 monômeros/fibra caudal vezes 2 conjuntos de fibras caudais diferentes/bacteriocina do tipo R é igual a 12 re- ceptores alvejados) ligaria à bacteriocina de hmw multivalente engenheirada e desencadearia sua penetração da membrana. Tais bacteriocinas de hmw engenheiradas têm um faixa de hospedeiro não-naturalmente vasta e, além disso, tornam-se altamente improváveis que uma bactéria que expressa mais que um receptor alvejado simples pudesse ficar resistente às bacterio- cinas de hmw engenheiradas.

Em outros aspectos, métodos para o uso de uma bacteriocina de hmw da descrição são fornecidos. Em algumas modalidades, um método de comprometer a integridade da membrana citoplásmica de uma bactéria é descrito. O método pode compreender contatar uma bactéria alvo com uma bacteriocina de hmw, ou porção da mesma, como descrita aqui. Alternativa- mente, o contato pode ser com uma bacteriocina de hmw contendo a com- posição descrita aqui.

Em um grupo de modalidades, o contato ocorre in vivo dentro de um sujeito. Desse modo um método de comprometer a integridade da mem- brana de uma bactéria em um sujeito é descrito. O método pode compreen- der administrar uma bacteriocina de hmw ou uma porção da mesma como descrito aqui para o sujeito. Em outro grupo de modalidades, o contato ocor- re in vitro.

Em ainda modalidades adicionais, um método de formar progê- nie de bactéria não-virulenta ou imprópria de bactéria progenitora virulenta é fornecida. O método pode compreender contatar as bactérias virulentas com uma bacteriocina de hmw que liga um fator de virulência ou aptidão das ditas bactérias progenitoras virulentas como descritas aqui. O método depois po- de continuar permitindo a seleção da progênie de bactérias não-virulentas que já não expressam o fator de virulência ou aptidão.

Em uma modalidade alternativa, um método de manter uma po- pulação de bactérias não-virulentas é fornecido. O método pode compreen- der contatar a população com uma bacteriocina de hmw que liga um fator de virulência ou aptidão de bactérias virulentas. O método depois continua e impede a propagação de bactérias virulentas. Sem estar preso à teoria, e oferecido para melhorar a compreensão da descrição, um aparecimento de resistência bacteriana para uma bacteriocina de hmw engenheirada será acompanhado por uma virulência ou aptidão comprometida das bactérias patogênicas.

Os métodos da descrição podem também ser aplicados em um ambiente onde crescimento bacteriano não é desejado ou é considerado ser prejudicial. Exemplos não-limitativos incluem a esterilização de ambientes, incluindo ambientes médicos e instalações de sala de operação; como tam- bém áreas de preparação de alimentos, incluindo áreas onde carne ou peixe crus são manipulados. Os métodos podem também ser usados para esterili- zar objetos sensíveis a calor, dispositivos médicos, e implantes de tecidos, incluindo órgãos de transplante.

Os métodos podem ser usados como uma terapia isolada ou como uma terapia adjunta, tal como para o tratamento de populações bacte- rianas. Numerosos agentes antimicrobianos (incluindo antibióticos e agentes quimioterapêuticos) são conhecidos que seriam úteis em combinação com estes métodos para tratar condições com base em bactéria.

BACTÉRIAS ALVO

As bacteriocinas de hmw engenheiradas podem ser modificadas da descrição para alvejar um receptor em uma variedade de espécies e ce- pas bacterianas, incluindo bactérias patogênicas, tais como bactérias noso- comiais ou piogênicas, como exemplos não-limitativos. Além de alvejar os fatores de virulência de bactérias seletas como descritas aqui, as bactérias que já são suscetíveis aos bacteriófagos são um grupo não-limitativo de bac- térias que podem ser inibidas por uma bacteriocina de hmw, tais como uma piocina engenheirada, da descrição. Estas bactérias incluem as bactérias gram-negativas que são suscetíveis, como também não sensíveis, às pioci- nas de ocorrência natural. Exemplos não-limitativos adicionais incluem bac- térias gram-negativas como um grupo como também bactérias gram- positivas. Há relatórios de entidades semelhantes à bacteriocina em grama bactérias positivas (Thompson & Pattee, 1981; Birmingham & Pattee, 1981; Zink et al., 1995). Em algumas modalidades, a bactéria alvo é identificada ou diagnosticada. Exemplos não-limitativos de tais bactérias incluem aquelas do gênero Escherichia, Staphylococcus, Clostridium, Acinetobacter, Pseudomo- nas, ou Streptococcus.

Como um exemplo não-limitativo de alvejar um fator de virulên- cia, a descrição inclui o uso de uma proteína de fibra caudal de fago da qual RBD como aquela da proteína de gp37 de um fago semelhante a T-par ou RB-69 nomeado AV17 que infeta o 0157:H7 de E. coli mas não infeta uma cepa mutante derivada desta que perdeu o antígeno de 0157. (Vide Yoichi et al., 2005). A ligação deste fago parece requerer a presença do antígeno de 0157, um fator de virulência, envolvido na adesão do intestino do orga- nismo de E. coli patogênico de 0157:H7. Portanto, uma bacteriocina de hmw da descrição pode conter uma proteína de fibra caudal modificada contendo o RBD da proteína de gp37 (SEQ ID NQ: 33) do fago acima descrito AV17 de modo que a bacteriocina de hmw modificada alveja um fator de virulência, o antígeno de 0157, de 0157:H7 de E. coli. A chaperona cognata para a fibra caudal de AV17 tem SEQ ID N2: 34.

Outras bactérias alvo incluem aquelas responsáveis por infec- ções de P. aeruginosa tópicas ou localizadas em humanos. Uma "infecção" refere-se ao crescimento de bactérias, tais como em um sujeito ou tecido ou célula não-bacteriana, em que as bactérias na verdade ou potencialmente poderiam causar doença ou um sintoma no sujeito, tecido ou célula não- bacteriana. Tratamento de uma infecção pode incluir tratamento profiláctico de substâncias ou materiais. Exemplos não-limitativos incluem órgãos doa- dos, tecidos, e células; equipamento médico, como um respirador ou máqui- na de diálise; ou feridas, tais como aquelas durante ou após a cirurgia. Ou- tros usos incluem a remoção de bactérias alvo que podem causar problemas sob crescimento adicional. Em modalidades adicionais, uma bacteriocina de hmw é usada para tratar plantas ou partes de plantas colhidas com infec- ções ou contaminações bacterianas, ou tratar ocorrências ambientais das bactérias alvo, tais como em um hospital ou ambiente comercial.

A descrição provê o tratamento, por administração ou contata com uma bacteriocina de hmw descrita aqui para alvejar as bactérias, de tais infecções em tecidos e sujeitos como segue. As infecções incluem as infec- ções comuns da córnea ("ceratite" e úlceras córneas), pelo menos dois ter- ços destas são causados por P. aeruginosa. Cerca de 30 % destes patóge- nos são relatados ser resistentes a antibióticos múltiplos (Mah-Sadorra et al., 2005). Infecção bacteriana da córnea é considerada uma condição relativa- mente incomum mas séria que requer atenção médica urgente por causa do potencial para visão reduzida ou até mesmo perda de visão no(s) olho(s) afetado(s). Outras infecções comuns que podem ser tratadas, e são causa- das por P. aeruginosa resistente a antibióticos, incluem infecções da orelha, por exemplo "swimmer's ear" (Roland & Stroman, 2002), aquelas secundá- rias a queimaduras severas e ferimentos (Holder, 1993), e fibrose cística. Fibrose cística é consistentemente agravada por infecções crônicas, resis- tentes a antibiótico causadas por P. aeruginosa e seu parente próximo, Bur- kholderia cepacia (Govan & Deretic, 1996), e estes patógenos em fibrose cística podem ser tratados pelo uso de uma bacteriocina de hmw engenhei- rada. Porque as bacteriocinas como piocinas tolerarão a secagem por refri- geração (Higerd et al., 1969), a descrição inclui uma formulação secada por refrigeração de uma bacteriocina para administração para intensificar a pro- babilidade da liberação com sucesso para a via aérea superior e/ou inferior do trato respiratório.

Como descrito aqui, o tratamento de um sujeito é tipicamente tratamento de "um sujeito em necessidade de tratamento". A determinação, ou diagnose, da necessidade pelo tratamento pode ser feita por uma pessoa versada, tal como um clínico, para uso dos meios reconhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o sujeito é um animal ou planta com uma infec- ção bacteriana que é potencialmente de ameaça à vida ou que prejudica a saúde ou encurta o período de vida do organismo.

Em modalidades adicionais, um método para matar ou inibir o crescimento de bactérias em um biofilme é fornecido. Um tal método pode compreender contatar um biofilme com uma bacteriocina de hmw descrita aqui que alveja bactérias no biofilme.

Como descrito aqui, uma bacteriocina de hmw antibacteriana é usada para inibir crescimento, sobrevivência, ou replicação de uma bactéria particular. A bactéria pode ser uma cepa patogênica ou ambientalmente de- letéria, ou pode ser tratada de uma maneira profiláctica. Um microorganismo patogênico em geral causa doença, às vezes apenas em circunstâncias par- ticulares.

As bactérias podem também ser aquelas de uma infecção noso- comial (derivada de hospital), bactérias ambientais, e bactérias piogênicas (formadoras de pus). Os métodos e composições da descrição podem ser usados para inibir crescimento de bactérias nosocomiais, incluindo bactérias que povoam um ambiente de hospital típico, ou bactérias que estão presen- tes na pele humana ou no trato gastrintestinal humano, ou bactérias que in- fetam e formam pus em feridas. Infecções nosocomiais são infecções que ficam evidentes durante uma permanência em hospital ou são relacionadas a um procedimento executado em um hospital. Estas infecções relacionadas a procedimento freqüentemente ficam evidentes após os pacientes serem tido alta hospitalar. As infecções bacterianas nosocomiais mais comum são infecções do trato urinário, infecções do local cirúrgico, pneumonia, diarréia e colite da pseudomembrana associada com C. difficile, e infecções sistêmi- cas sérias em que as bactérias podem se desenvolver do sangue.

Os métodos e composições podem ser usados da descrição pa- ra inibir crescimento de bactérias gram-negativas ou gram-positivas. Exem- plos não-limitativos de bactérias gram-positivas incluem Staphylococcus (pi- ogênicas), Enterococcus (oportunísticas), Streptoeoeeus, Enteroeoeeus, Ba- cillus, Mierococeus, Myeobaeterium, Corynebaeterium, e Clostridium. Exem- plos não-limitativos de bactérias gram-negativas incluem Pseudomonas (pi- ogênicas), E. coli (oportunísticas), Salmonella (oportunísticas), Campylobac- ter (oportunísticas), Proteus (piogênicas), Klebsiella (oportunísticas), Entero- baeter (piogênicas), Citrobaeter (piogênicas), bastonetes não-fermentadores gram-negativos (tais como Aeinetobaeter), e Shigella. Os cocos piogênicos são bactérias esféricas que causam várias infecções supurativas (produtoras de pus) em animais. Inclusos estão Staphyloeoeeus aureus de cocos gram- positivos, Streptoeoeeus pyogenes, e Streptoeoeeus pneumoniae, e os cocos gram-negativos, Neisseria gonorrhoeae, e N. meningitidis. Em modalidades adicionais, os métodos revelados e composi- ções da descrição são usados para inibir crescimento, particularmente de bactérias resistentes a antibióticos. Exemplos não-limitativos incluem nume- rosos patógenos bacterianos que se tornaram resistentes a multi-fármacos (MDR).

ENGENHEIRANDO PIOCINAS COMO UM EXEMPLO REPRESENTATIVO NÂO-LIMITATIVO

François Jacob descobriu e primeiro descreveu piocinas como bacteriocinas de peso molecular alto (Jacob, 1954). Entidades semelhantes a sebacteriocina similares foram descritas em outras múltiplas bactérias gram-negativas (Coetzee et al., 1968) como também em Listeria moncyto- genes (Zink et al. 1995) e Staphylococcus aureus (Thompson e Pattee, 1981) ambos destes são organismos gram-positivos. Embora as piocinas se assemelhem morfologicamente às caudas dos bacteriófagos contráteis (myoviridae), elas não são fagos defeituosos simples; há diferenças signifi- cantes. Por exemplo, as diferenças existem na estabilidade física e química entre as piocinas e as caudas do fago (Kageyama & Egami, 1962; Nakaya- ma et al., 2000).

Embora as faixas de hospedeiro de piocinas sejam relativamente estreitas e usualmente restringidas às cepas das mesmas espécies, há ex- ceções (Morse et al, 1976; Blackwell et al., 1982). Por outro lado, bacteriófa- gos de myoviridae podem exibir faixas de hospedeiro vastas, e suas faixas de hospedeiro, como aquelas das piocinas, são determinadas pelas especi- ficidades de ligação das pontas de suas fibras caudais (Tetart et al., 2001).

Para numerosas fibras caudais de fago, o terceiro distai (3'- terminal) do gene varia nos mutantes ou variantes com faixas de hospedeiro de fago alteradas, ou "tropismos" (Ackermann, 2003). Como um exemplo não-limitativo, o determinante de tropismo principal (Mtd), a proteína Iigadora de receptor de bacteriófago de Bordetella BPP-1, varia grandemente em se- qüência (Liu et al., 2004; Doulatov et al. 2004). Variação em Mtd depende de um retroelemento codificado por fago (Retroelemento Gerador de Diversida- de, ou DGR) que pertence a uma família de DGRs implicados na geração da variação da seqüência em vários genomas de fago e bacterianos. O DGR de Bordetella pode produzir mais de 1013 variantes de seqüência diferentes de Mtd1 rivalizando as 1014-1016 possíveis seqüências de anticorpos. Variantes de Mtd são produzidas por um único processo de mutagênese adenina- específico que envolve transcriptase reversa codificada por DGR (bRT) e uma região modelo estável (TR). Variabilidade em Mtd é focalizada em 12 aminoácidos codificados por adenina que são difratados ao longo de sua região variável C-terminal (VR) (Doulatov et al. 2004). As estruturas cristali- nas 3-dimensionais de numerosas variantes de Mtd de Bordetella foram so- lucionadas e confirmadas, como descrito abaixo, que a ponta da estrutura determina a especificidade de ligação e assim o tropismo principal (faixa de hospedeiro) do fago (McMahon et al., 2005). Desse modo, como também descrito abaixo, Mtd e seu sistema de DGR relacionado pode ser usado na prática da descrição.

Muitas espécies de Pseudomonas possuem os genes para as piocinas do tipo R (Takeya et al., 1969; Kageyama, 1975). O Iocus da pioci- na do tipo R consiste em cerca de 16 grupos de complementação incluindo cerca de 10 genes estruturais mais genes reguladores e de chaperona (Shi- nomiya et. al. 1983a; Shinomiya et al., 1983b). As piocinas do tipo R morfo- lógica e geneticamente se assemelham às caudas de bacteriófagos de myo- virídae mas não têm nenhuma estrutura de cabeça e desse modo nenhum conteúdo de ácido nucléico (Kageyama, 1964; Ishii et al., 1965; Shimizu et al., 1982). Crê-se que elas tenham evoluído da estrutura caudal de fago de um antepassado relacionado com P2, mas elas não são fagos defeituosos simples, após terem sido também adaptadas para seu papel como agentes bactericidas defensivos (Nakayama et al, 2000). Similar aos bacteriófagos, porém, as piocinas se ligam aos "receptores" específicos moleculares nas bactérias alvo e penetram suas membranas com uma estrutura de "núcleo" ou semelhante a agulha (Uratani & Hoshino, 1984). Como uma conseqüên- cia imediata da penetração do núcleo das membranas, a bactéria é morta pelo comprometimento da integridade de sua membrana citoplásmica e dis- sipação de seu potencial da membrana, um evento bactericida que pode ser o resultado de um ataque por uma piocina simples (lijima, 1978; Uratani & Hoshino, 1984; Strauch et al., 2001).

O RBD1 ou Determinante de Ligação de Receptor da ligação de piocina R, de uma piocina do tipo R típica liga a uma molécula de superfície bacteriana. No caso de um isolado de piocina R2, o RBD reside na porção carbóxi-terminal de sua fibra caudal. A fibra caudal é um homotrímero do produto do gene de prf15 (Nakayama et al., 2000). Modificação do RBD no gene de prf15 e recombinação do gene de prf15 modificado em um sistema que produz piocinas do tipo R permite a produção de uma piocina engenhei- rada com especificidade de ligação modificada.

O determinante de tropismo principal (Mtd) do bacteriófago de Bordetella possui várias propriedades únicas e úteis como um domínio de ligação. A forma funcional de Mtd em bacteriófago de Bordetella é um homo- trímero que liga a proteína de fator de virulência, pertactina, em Bordetella.

Desse modo, o gene mtd pode ser fundido na extremidade distai do gene prf15 para tirar proveito das propriedades de Mtd. Assim conforme descrito aqui, um aspecto da descrição inclui construção de uma proteína de fusão entre a proteína de fibra caudal de piocina do tipo R de P. aeruginosa (Prf15) e o determinante de tropismo principal (Mtd) do fago de Bordetella, BPP-1.

Uma fusão de Prf15-Mtd pode ser usada para complementar in trans uma deleção de prf15 de piocina de PA01 de P. aeruginosa para ligar e matar Bordetella bronchiseptica de expressão de pertactina ou E. co//'de expressão de pertactina.

Adicionalmente, o bacteriófago P2 ou P4 pode ser usado como um substituto para abrigar o gene de fusão da fibra caudal de prf15-mtd de modo que o genótipo é acoplado ao fenótipo de ligação da fibra caudal. Isto permite transdução eficiente, seleção, e isolamento do gene de fibra caudal que codifica o RBD desejado.

MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

Uma bacteriocina de hmw engenheirada da descrição pode ser administrada por qualquer meio adequado. Exemplos não-limitativos incluem administração tópica, ou localizada, como também pulmonar (inalação), gas- trintestinal, por cateter ou tubo de gotejamento, ou administração sistêmica a um sujeito. Exemplos representativos, e não-limitativos, de administração sistêmica incluem administração intraperitoneal e intravenosa. Os efeitos protetores das piocinas intraperitoneal e intravenosamente administradas foram demonstrados em camundongos infetados sistemicamente com doses letais de cepas de P. aeruginosa sensíveis in vitro às piocinas administradas (Merrikin & Terry, 1972; Haas et al., 1974). Em algumas modalidades, conta- to entre uma bacteriocina de hmw descrita aqui e uma população bacteriana alvo resulta em uma diminuição na população de pelo menos 10, pelo me- nos 100, pelo menos 1000, ou pelo menos 10.000, ou mais, vezes com rela- ção à ausência da bacteriocina. Em outras modalidades, o contato pode re- sultar em uma diminuição na detectabilidade das bactérias por pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, ou pelo menos 50, ou mais, vezes com relação à ausência da bacteriocina.

Uma bacteriocina de hmw engenheirada da descrição pode ser administrada em qualquer sujeito afligido, diagnosticado como afligido, ou suspeito de estar afligido, com uma infecção ou contaminação através de bactérias suscetíveis à bacteriocina de hmw. Exemplos não-limitativos de tal um sujeito incluem espécies animais (mamífero, réptil, anfíbio, aviário, e pei- xe) como também insetos, plantas e fungos. Exemplos representativos, e não-limitativos, de espécies mamíferas incluem os seres humanos; primatas não-humanos; espécies agricolamente relevantes tais como bois, porcos, cabras, e ovelha; roedores, tais como camundongos e ratos; mamíferos para companhia, exibição ou exposição, tais como cachorros, gatos, cobaias, coelhos, e cavalos; e mamíferos para o trabalho, tais como cachorros e ca- valos. Exemplos representativos, e não-limitativos, de espécies aviárias in- cluem galinhas, patos, gansos, e pássaros para companhia ou exposição tais como papagaios e periquitos. Um sujeito animal tratado com uma bacte- riocina engenheirada da descrição pode também ser um animal quadrúpede, um bípede, um aquático, um vertebrado, ou um invertebrado, incluindo inse- tos.

Em algumas modalidades, o sujeito a ser tratado é uma criança ou outro animal jovem que ainda têm que alcançar a maturidade. Desse mo- do a descrição inclui o tratamento de condições pediátricas compreendendo infecção com bactérias ou outro microorganismo suscetível a uma bacterio- cina de hmw da descrição.

A descrição também provê o tratamento ou prevenção de uma infecção oportunística, tal como aquela sendo o resultado de um crescimen- to indesejável de bactérias que estão presentes na flora microbiana de um sujeito animal humano ou não-humano. Uma infecção oportunística pode ser o resultado de uma condição imunossuprimida em um sujeito ou o resultado de tratamento antibiótico alterando a flora comensal do trato geniturinário (GU) ou gastrintestinal (Gl). Desse modo a descrição também provê o trata- mento ou profilaxia de sujeitos imunossuprimidos e sujeitos expostos a ou- tros agentes farmacêuticos. Uma bacteriocina de hmw com sua atividade antibacteriana pode ser usada em combinação com outro agente antibacte- riano ou antimicrobiano, tal como um agente antibiótico ou antifúngico como exemplos não-limitativos. Um "agente antimicrobiano" é um agente ou com- posto que pode ser usado para inibir o crescimento ou matar organismos unicelulares. Agentes antimicrobianos incluem antibióticos, agentes quimio- terapêuticos, anticorpos (com ou sem complemento), inibidores químicos de DNA, RNA, proteína, lipídio, ou síntese ou funções da parede celular.

Em algumas modalidades, uma bacteriocina de hmw é formula- da com um excipiente ou veículo "farmaceuticamente aceitável". Um tal componente é um que seja adequado para uso com humanos, animais, e/ou plantas sem efeitos colaterais adversos impróprios. Exemplos não-limitativos de efeitos colaterais adversos incluem toxicidade, irritação, e/ou resposta alérgica. O excipiente ou o veículo são tipicamente um que sejam comensu- ráveis com uma razão razoável de benefício/risco. Em muitas modalidades, o veículo ou excipiente são adequados para administração tópica ou sistê- mica. Veículos farmacêuticos não-limitativos incluem soluções aquosas ou não-aquosas estéreis, suspensões, e emulsões. Exemplos incluem, mas não são limitados a, excipientes farmacêuticos padrões tais como uma solução salina tamponada de fosfato, água, emulsões tais como emulsão de ó- leo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Exemplos de solventes não- aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azei- te de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como etiloleato. Veículos a- quosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspen- sões, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer tratados com Iactato ou fixos. Veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólito (tais como aque- les com base na dextrose de Ringer), e outros.

Formulações e composições farmacêuticas adicionais descritas aqui compreendem uma bacteriocina de hmw isolada específica para um hospedeiro bacteriano; uma mistura de duas, três, cinco, dez, ou vinte ou mais bacteriocinas que alvejam os mesmos hospedeiros bacterianos; e uma mistura de duas, três, cinco, dez, ou vinte ou mais bacteriocinas que alvejam hospedeiros bacterianos diferentes ou cepas diferentes do mesmo hospedei- ro bacteriano.

Opcionalmente, uma composição compreendendo uma bacterio- cina de hmw da descrição pode também ser Iiofilizado usando meios bem conhecidos na técnica. Reconstituição subseqüente e uso podem ser prati- cados como conhecido no campo.

Também fornecidas são formulações compreendendo bacterio- cina de hmw microencapsulada. Em algumas modalidades, estas podem fornecer cinética de liberação contínua ou permitir ingestão oral para atra- vessar o estômago e para dentro do intestino delgado ou grande. Em geral, as composições farmacêuticas podem ser preparadas em várias formas, tais como grânulos, tabletes, pílulas, supositórios, cápsulas (por exemplo, adap- tadas para liberação oral), microcontas, microesferas, lipossomas, suspen- sões, pomadas, pastas, loções, e outros. Veículos e/ou diluentes orgânicos ou inorgânicos do tipo farmacêutico adequados para uso oral e tópico podem ser usados para compor as composições compreendendo os compostos te- rapeuticamente ativos. Agentes estabilizantes, agentes intumescentes e e- mulsificantes, sais para variar a pressão osmótica, ou tampões podem ser incluídos para garantir um valor de pH adequado.

Um bacteriocina de hmw é tipicamente usada em uma quantida- de ou concentração que são "seguras e eficazes", que refere-se a uma quantidade que é suficiente para produzir uma resposta terapêutica deseja- da sem efeitos colaterais adversos impróprios como aqueles descritos aci- ma. Uma bacteriocina de hmw pode também ser usada em uma quantidade ou concentração que são "terapeuticamente eficazes", que refere-se a uma quantidade eficaz para render uma resposta terapêutica desejada, tal como, mas não limitada a, uma quantidade eficaz para reduzir a taxa de divisão da célula bacteriana, ou causar cessação da divisão da célula bacteriana, ou causar morte ou taxa de diminuição do crescimento da população das bacté- rias. A quantidade segura e eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz variará com vários fatores mas podem ser facilmente determinadas pelo mé- dico versado sem experimentação imprópria. Exemplos não-limitativos de fatores incluem a condição particular sendo tratada, a condição física do su- jeito, o tipo de sujeito sendo tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se houver), e as formulações específicas empregadas.

Adicionalmente, e em antecipação de um possível aparecimento de resistência bacteriana a uma bacteriocina de hmw engenheirada, pode haver um comprometimento concomitante da virulência ou aptidão dos orga- nismos onde a bacteriocina alveja o fator de virulência ou aptidão das bacté- rias alvejadas. Porque um mecanismo fundamental, mas não-limitativo, pelo qual uma bactéria pode tornar-se resistente a uma bacteriocina de hmw é a perda de seu receptor para a bacteriocina, o alvejamento de um fator de vi- rulência ou aptidão como descrito aqui fornece muitas vantagens sobre os antibióticos tradicionais e bacteriófagos. A resistência a antibióticos e bacte- riófagos tradicionais pode ser o resultado de muitos mecanismos diversos diferentes da perda do receptor ou molécula alvo do agente antibacteriano. Como exemplos não-limitativos, uma bacteriocina de hmw da descrição não estaria sujeito a uma bomba de efluxo bacteriana para remover a bacterioci- na do ambiente celular e não estaria sujeito a um mecanismo de desativação do ácido nucléico bacteriano. Tendo agora em geral descrito o assunto inventivo, o mesmo será entendido mais facilmente em referência aos exemplos a seguir que são fornecidos por via de ilustração, e não são intencionados ser Iimitativos da descrição, a menos que especificado.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não limi- tar o assunto reivindicado.

EXEMPLO 1: BACTERIOCINAS DE HMW MODIFICADAS CONTENDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO

a) Sistema de complementação

Para facilitar a preparação de uma bacteriocina de hmw modifi- cada como descrita aqui, a construção de um sistema para complementar as fibras caudais in trans foi estabelecida. Usando a piocina R2 como um mo- delo representativo, criação de uma deleção da seqüência de codificação de prf15 de R2 no genoma de PA01 de P. aeruginosa foi usada para criar uma plataforma em que uma proteína de fibra caudal complementar, tal como um produto de gene de prf15 modificado, foi expressada in trans.

Em geral, a deleção foi feita pelo método de Hoang et al. criar P. cepa de aeruginosa Δprf15 de PA01. A região de codificação de prf16, SEQ ID NQ: 4, para o chaperona de R2 a extremidade do R2 prf15 gene sobrepõe através de 8 nucleotídeos e o sítio de ligação de ribossoma mente dentro da região de codificação de prf 15, SEQ ID Ng: 3. A proteína de prf16, que ne- cessariamente não é incorporada na estrutura de piocina, foi relatada ser requerida, para atividade máxima, para montagem da fibra caudal trimérica (Figura 8 e Nakayama et al., 2000). Portanto, tanto o sítio de começo de transcrição para prf16 e seu sítio de ligação de ribossoma são deixados in- tactos de modo que a chaperona seria produzida sob indução da construção de piocina modificada que codifica uma piocina defeituosa "sem-cauda" ("ta- il-less").

Brevemente, uma deleção dentro da estrutura dos códons 11- 301 de PRF15 foi feita em PA01 como segue. Um fragmento de Kpnl-Agel de 1,1 kb a montante da deleção desejada foi amplificado por PCR de DNA genômico de PA01 usando iniciadores AV085 (5'- GCTTCAATGTGCAGCGTTTGC) (SEQ ID NQ: 46), e AV088 (5'- GCCACACCGGTAGCGGAAAGGCCACCGTATTTCGGAGTAT) (SEQ ID NQ: 47), e um fragmento de AgeI-EcoRI de 2,2 kb foi amplificado usando inicia- dores AV087 (5'-ATACTCCGAAATACGGTGGCCTTTCCGCTACCGGTGT GGC) (SEQ ID NQ: 48) e AV086 (5'-TCCTTGAATTCCGCTTGCTGCCGAA GTTCTT) (SEQ ID Ng: 49). Os fragmentos de restrição resultantes foram clonados nos sítios de Kpn/ e EcoRl de pEX18Gm (Hoang et al) para fazer pEXGm-Aprf15. A construção acabada foi transformada na cepa PA01 atra- vés de eletroporação (Chuanchuen et al). Os integrantes foram selecionados com 100 pg/ml de gentamicina, e segregantes foram depois selecionados em meios contendo 5 pg/ml de sucrose e carecendo de NaCI e gentamicina. Candidatos de deleção foram confirmados por análise de PCR, indução de piocina, e seqüenciação de um fragmento amplificado por PCR.

Cepa Aprfl5 de PA01 cresce similarmente a sua cepa de ori- gem, PA01, e os genes de codificação de piocina permanecem induzíveis através da resposta de SOS, conduzindo à Iise da célula. Embora pareça haver alguma produção de produtos de gene de piocina, não pareceu que partículas de piocina de "cauda-menos" estáveis foram produzidas de Aprfl5 de PA01.

Prf15 de piocina R2 foi expressado in trans primeiro clonando a seqüência de codificação no vetor ponte de faixa de hospedeiro vasta de Pseudomonas/E. coli, pUCP30T. Vide Figura 9. Em algumas construções de inicial, a transcrição foi dirigida constitutivamente ou sob controle de Iacl do promotor tac. Mas em outras construções, a transcrição foi modificada para ser regulada com um promotor de prf 15 endógeno de modo que a expressão seria regulada pela resposta de SOS. Isto permitiu induzir a expressão do gene prf 15 modificado de forma síncrona com a expressão dos outros genes de piocina que residem no genoma de Aprfl5 de PA01.

Brevemente, o vetor de faixa de hospedeiro vasta pUCP30T (S- chweizer, Η. P et al) foi modificado preenchendo o único sítio de BspHI para formar pUCP30TABsp. Um promotor de tac foi amplificado por PCR de um vetor de expressão de Mtd (um presente de Jeffery F. Miller, UCLA) usando iniciadores AV110 (5'-TTTATTAGCGGAAGAGCCGACTGCACGGTGCACC AATG) (SEQ ID N°: 50) e AV114 (5'-CCCTCGAATTCATGAATACTGTT TCCTGTGTGAAATTG) (SEQ ID N°: 51), depois clonado em pUCP30TABsp para criar pUCP-tac.

A região de codificação de PRF15 de R2 foi amplificada de um subclone usando iniciadores AV118 (5'-CTTCCTTTCATGACGACCAAT ACTCCGAA) (SEQ ID N°: 52) e AV116 (5'-ACCACGAATTCTTCATC GTC- CAAATGCCTC) (SEQ ID N°: 53), enquanto prf15 e prf16 de R2 foram ampli- ficados usando iniciadores AV118 e AV086 (5'-TCCTTGAATTCCGCTTGC TGCCGAAGTTCTT) (SEQ ID N°: 49). Os fragmentos amplificados de prf15 e prf15/16 foram clonados em pUCPtac digerido com BspHI e EcoRI para render pUCP-tac-prf15 e PUCP-tac-prf15/16.

Para expressão usando o promotor de prf15 endógeno, prf15 e prf 16 foram amplificados juntamente com a seqüência de 1088 bp a montan- te de prf 15 de um subclone usando iniciadores AV107 (5'- CACCATCTAGACAATACGAGAGCGACAAGTC) (SEQ ID N°: 54) e AV091 (5'-TCCTCAAGCTTACGTTGGTTACCGTAACGCCGTG) (SEQ ID N°: 55) e clonados em pUCP30T digerido com Xbal e Hindlll para criar pUCP-R2p- prf15/16.

Bactérias em crescimento em suspensão de fase log e contendo os plasmídeos de expressão foram tratadas com 3 µg C/ml de mitomicina para induzir produção das piocinas. Piocinas estáveis foram produzidas sob indução com rendimentos similares aos do PA01 de tipo selvagem. As pio- cinas tiveram o mesmo espectro bactericida e nível de atividade que a pioci- na R2 produzida de PA01. Parece que a produção de um complexo de pio- cina estável requer a expressão de uma proteína de fibra caudal além de expressão dos outros genes de codificação de piocina, e expressão do gene de fibra caudal in trans é suficiente.

Quando prf15 foi expressado constitutivamente do promotor de tac, o crescimento celular foi notadamente mais lento que quando regulado por lacl ou pelo promotor endógeno. Embora pareça que a produção de PRF15 sozinho na célula seja prejudicial, os rendimentos das piocinas gera- das de ambos os promotores são comparáveis.

Uma construção de plasmídeo foi preparada da qual prf16 de R2 foi coexpressada com prf15 de R2 para assegurar prf16 de expressão tem- poral apropriada para dobramento de PRF15 expresso in trans.

b) Bacteriocinas de hmw recombinantes

Como descrito aqui, cinco piocinas de tipos R diferentes, com base nos espectros e denominadas R1-5, foram reconhecidas. Porque as seqüências de gene que codificam as proteínas de fibra caudal foram co- nhecidas apenas para R1 (SEQ ID N0: 1) e R2 (SEQ ID N5: 3), PCR foi usa- da para isolar e seqüenciar os genes de fibra caudal de piocina R3 (SEQ ID N°: 5), R4 (SEQ ID Ns: 7), e R5 (SEQ ID N° 9) juntamente com suas se- qüências de codificação de chaperona cognata presentes em suas cepas produtoras, SEQ ID Ns: 6, 8, e 10, respectivamente. Os genes de chaperona das piocinas R1 e R2 foi também clonado e seqüenciado, SEQ ID Ns: 2 e 4, respectivamente. Para confirmar a hipótese que a fibra caudal dita os espec- tros, as seqüências que codificam as proteínas de fibra caudal das piocinas R1, R3, R4, e R5 foram obtidas e expressadas in trans em Aprfl5 de PA01 de modo que elas seriam incorporadas na estrutura de piocina R2. Cada uma das cepas recombinantes resultantes foi depois induzida para produzir as piocinas e o espectro de cada um foi determinado através de ensaios de tingimento, como mostrados nas Figuras 2 e 8.

c) Proteínas de fusão como proteínas de fibra caudal

Uma fusão das seqüências de gene prf15 de fibra caudal R2 e de gene H de P2 de bacteriófago foi criada, expressada e usada para produ- zir bacteriocinas de hmw modificadas adicionais da descrição. P2 de bacte- riófago infeta muitas cepas de E. coli, tem um gene H de codificação de fibra caudal, (SEQ ID Ne: 25) que tem similaridade de seqüência significativa a prf15 de R2 (SEQ ID NQ: 3), particularmente à porção de codificação do tér- mino Ν. A porção de gene Hque codificam os resíduos de 551 aminoácidos C-terminais da proteína de fibra caudal de P2, que é a região putativa que confere especificidade alvo (RBD), foi fundida na porção de prf15 que codifi- ca a porção de ligação de placa base N-terminal de 164 aminoácidos (BPAR) de PRF15 de R2 para codificar uma proteína de fibra caudal modifi- cada (SEQ ID N9: 27).

P2 de bacteriófago também codifica uma chaperona de fibra caudal putativa, codificada pelo gene G (SEQ ID N9: 26), similar àquele codi- ficado por prf16 de piocina R2 (SEQ ID N9: 4), e as chaperonas de muitos dos outros fagos de myoviridae. Porque é provável que a chaperona codifi- cada pelo gene G seja importante para o dobramento da porção C-terminal da proteína caudal de P2 na fusão, construções foram feitas para coexpres- sar o gene G de P2.

A porção de prf15 de R-2 que codifica aminoácidos 1-164 foi amplificada de um subclone usando iniciadores AV118 e AV127 (5'- TTCTTTAAGCTTTTCCTTCACCCAGTCCTG) (SEQ ID N9: 56) e foi digerido com BspHI e Hindlll. A porção do gene Hde P2 que codifica os aminoácidos da posição 158 a 669 foi amplificada de uma matéria-prima de fago de P2 (Richard Calendar) usando iniciadores AV124 (5'- CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG) (SEQ ID N9: 57) e AV126 (5'- TCCTTCGAATTCTTACACCTGCGCAACGT) (SEQ ID N9: 58). Gene H de P2 158-669 mais gene G foi amplificado usando iniciadores AV124 e AV125 (5'-CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG) (SEQ ID N9: 59). Cada um dos produtos de PCR de P2 foi digerido com Hindlll e EcoRI. pUCP-tac-R2- P2H foi criado clonando o fragmento de prf15 que codifica o fragmento de 1- 164 aminoácidos junto com o fragmento do gene H de P2 que codifica o fragmento de 158-669 aminoácidos em pUCP-tac digerido com BspHI e E- coRI. pUCP-tac-R2-P2HG foi gerado clonando o fragmento de prf15 que co- difica o fragmento de 1-164 aminoácidos junto com o fragmento do gene H de P2 que codifica o fragmento de 158-669 aminoácidos mais gene G em pUCP-tac digerido com BspHI e EcoRI.

Brevemente, àprf15 de PA01 foi transformado com as constru- ções de fusão do gene H de prf15-P2 e produção da piocina foi induzida com mitomicina C. Partículas de piocina foram purificadas e testadas para ativi- dade através de testes de tingimento e pelo ensaio de sobrevivência bacteri- ano (vide Figura 2). As partículas de piocinas purificadas contendo a fibra caudal de fusão de R2-P2 tiveram atividade bactericida contra cepa de C1a de E. coli mas foram incapazes de matar 13s da cepa de P. aeruginosa. A- lém disso, a expressão do gene G de P2 foi necessária para produzir piocina ativa. Isto confirma a hipótese que a chaperona é requerido para dobramen- to apropriado da porção C-terminal da fibra caudal, como mostrado na Figu- ra 8.

As habilidades de uma faixa de fusões de proteína de fibra cau- dal de R2-P2 diferentes para formar piocinas funcionais que matam C1a de E. coli foram exploradas por uma série de fusões de R2-P2 diferentes. E- xemplos representativos destas fusões são mostrados nas Figuras 4-7, junto com a indicação de suas atividades bactericidas contra C1a de E. coli. d) Fusões adicionais

Uma bacteriocina de hmw adicional modificada foi produzida pa- ra alvejar Y. pestis. L-413c é um yersiniofago que infeta a maioria das cepas de Y. pestis (Richard Calendar, comunicação pessoal). A maioria do genoma de L-413c é altamente similar a P2 com a exceção notável do gene H de fibra caudal, SEQ ID Ne: 28 que divergiu consideravelmente. Sem estar pre- so à teoria, e oferecido para melhorar a compreensão da descrição, variação no gene H de fibra caudal, e desse modo na proteína codificada, é a caracte- rística que mais provavelmente conta para sua faixa de hospedeiro divergen- te.

O término N do gene H de L-413c (SEQ ID Ne: 28), porém, com- partilha similaridade de seqüência consideravelmente com sua contraparte de P2 (SEQ ID Ne: 25), provavelmente devido à sua função da ligação de placa base. Uma fusão foi construída para criar uma fibra caudal de fusão com os 1-164 aminoácidos N-terminais de PRF15 de R2 fundidos com a porção C terminal (posições 158-913) da fibra caudal de L-413c para criar uma fibra caudal modificada, como mostrado na Figura 10 (SEQ ID N-: 30). A fusão foi expressada em àprf15 de PA01 junto com a chaperona cognata de fibra caudal de L-413c, gene G (SEQ ID N-: 29), como descrito acima. Após indução, as partículas de piocinas produzidas mataram KIM de Y. pes- tis como também C de E. coli e desse modo têm um espectro de matança análogo à faixa de hospedeiro de L-413c de yersiniofago. As piocinas modi- ficadas não mataram nenhuma das cepas de Pseudomonas.

Uma partícula de piocina de hmw modificada também foi feita com uma fibra caudal de fusão nova criada entre o BPAR de fibra caudal de piocina do tipo R de P. aeruginosa (codificado por prf15) e o gene orf34 de fibra caudal e/ou o RBD do gene orf35 de fibra caudal de VHML (SEQ ID NQ: 21 e 22, respectivamente). Para criar as partículas de piocina, o gene de chaperona cognata de VHML (SEQ ID N9: 23) foi coexpressado com os ge- nes modificados da fusão da fibra caudal. Piocinas com as fibras caudais modificadas foram formadas e analisadas. A bacteriocina de hmw modifica- da resultante com o RBD derivado de VHML pode ser submetida à diversifi- cação pelo DGR natural de VHML.

O determinante de tropismo principal (Mtd) do bacteriófago de Bordetella BPP-1 tem um domínio de Iectina do tipo C (CTL) que serve como um determinante de ligação para muitos tipos diferentes de moléculas e em muitos contextos biológicos diferentes (Drickamer, 1999; McMahon et al., 2005). Em BPP-1, Mtd é incorporado como um domínio globular homotrimé- rico localizado ao término da cauda do fago onde pode ligar à proteína de superfície, pertactina, um fator de virulência expressado na superfície exter- na de Bordetella bronchiseptica e Bordetella pertussis (Liu et al., 2004). Nes- te contexto, Mtd é também o alvo da mutagênese "homing" mediada por fa- go que pode resultar no bacteriófago, que adquire um determinante de liga- ção novo para infetar seu hospedeiro variável constante.

Recentes estudos estruturais no domínio de Mtd e várias de su- as variantes diversificadas, mostraram como a ponta da fibra trimérica forma um andaime rígido que pode conter mais de 10 trilhões de ligantes de liga- ção variantes (McMahon et al. 2005). Fundindo o domínio de Mtd na proteí- na de fibra caudal de piocina e depois diversificando o domínio de Mtd usan- do o sistema de DGR descrito pelo Miller e colegas (Liu et al., 2004; Doula- tov et al., 2004), cria-se uma biblioteca muito grande de variantes, da qual para selecionar e obter os genes que codificam as caudas de piocina com especificidade de ligação alterada.

EXEMPLO 2: ENSAIOS DE PROTEÍNAS DE FUSÃO

a) Purificação e Ensaios de Piocina

PA01 e derivados foram crescidos agitando a 200 rpm a 37QC em meio suplementar G com 50 pg/ml de gentamicina quando necessário para manter plasmídeos. Quando as culturas alcançaram OD6OO de 0,250, mitomicina C foi adicionada a uma concentração final de 3 pg/ml. As culturas foram incubadas para uma adição 2,5 horas até que Iise ocorresse. Cinco μΙ de DNaseI foram adicionados, e a cultura foi deixada incubar um adicional de 30 min. Restos foram removidos por centrifugação a 12.000 rpm em um rotor de Beckman JLA-16.250 durante 1 hora. Sulfato de amônio saturado foi lentamente adicionado, a uma taxa de 1 ml/min, ao sobrenadante agitando em gelo, para um volume final adicionado de 65 ml por 100 ml do sobrena- dante do lisado. Este foi armazenado a 4Q C durante a noite. O precipitado de sulfato de amônio foi colhido através de centrifugação a 12.000 rpm du- rante 1 hora, e a pelota foi ressuspensa em 10 ml de tampão de TN50 (10 mM de tris, 50 mM de NaCI, pH 7,5). Partículas de piocina na solução res- suspensa foram depois sedimentadas a velocidade alta, 20.000 rpm (65,000 χ g) em um rotor de Beckman JA-25.50 durante 1 hora, e ressuspensas em 3-5 ml de tampão de TN50. Preps de piocina foram julgadas ser >90 % pu- ras por análise eletroforética em gel de SDS poliacrilamida.

Ensaios de piocina quantitativos foram executados contando so- brevivência bacteriana em um método ligeiramente modificado como descri- to por Kagayama et al., 1964. As amostras de piocina foram incubadas com bactérias alvo (cerca de 1x109 CFU/ml) durante 40 minutos a 37-C. As a- mostras foram depois diluídas e banhadas para contar os sobreviventes. O número de partículas de piocina é relacionado à fração de sobreviventes bacterianos em uma distribuição de Poisson, m = -InS onde m = o número médio de eventos letais / célula e S é a fração de sobreviventes. O número total de partículas de piocina ativas/ml = m χ células/ml. Strainl 3s era a Pseudomonas aeruginosa usada nestes ensaios e é um isolado clínico resis- tente a muitos antibióticos, mas sensível a todas as 5 piocinas do tipo R. O alvo de Ε. coli era C1a, gentilmente fornecido por Richard Calendar.

Ensaios semiquantitativos foram também executados por um método de mancha onde as amostras de piocina foram serialmente diluídas em tampão de TN50 e tingidas em tecidos de bactérias alvo. Após incuba- ção durante a noite a 37QC, a atividade de piocina poderia ser observada por uma zona clara de matança no tecido. Figura 2 mostra resultados represen- tativos deste formato de ensaio.

EXEMPLO 3: BACTERIÓFAGO RECOMBINANTE PARA TRIAR FIBRAS CAUDAIS ENGENHEIRADAS

O bacteriófago P4 é usado como um substituto abrigar o gene da fusão de fibra caudal com base em Prf15 de modo que o genótipo é aco- plado ao fenótipo de ligação da fibra caudal. Isto permite seleção e transdu- ção eficientes do gene de fibra caudal desejado.

Bacteriófago P2 é um colifago temperado que pode infetar ou- tras espécies entéricas, e pode replicar em, mas não infeta, P. aeruginosa (Bertani & Seis, 1988; Kahn et al., 1991). Piocinas do tipo R são genetica- mente de forma estrita e estruturalmente relacionadas a P2, e a proteína de fibra caudal P2, codificada por gene H, mostra homologia a prf15 na porção N-terminal onde a ligação da placa base ocorre (Desfigurado-Ljungquist et al., 1992; Nakayama et al., 2000). Desenvolvendo o bacteriófago P2 ou P4 como um fago substituto, no qual as fibras caudais codificadas por plasmí- deo estão incorporadas no lugar das fibras codificadas por fago de P2, per- mite a exibição e seleção das fibras de fusão em um contexto que estrita- mente se assemelha a seu contexto funcional intencionado na piocina.

O genótipo de fibra caudal pode ser acoplado fisicamente ao fenótipo de ligação em uma partícula de fago de transdução para seleção genética, similar à tecnologia de exibição de fago. Quando um fago de P2 com uma mutação ambarina em seu gene da proteína de fibra (H) infeta E. coli abrigando um plasmídeo com um sítio de empacotamento de cós, que normalmente atua como um sinal para empacotar DNA genômico de bacte- riófago (Ziermann & Calendar, 1991; Kahn et al., 1991), empacotará o plas- mídeo contendo cós nas cabeças de fago de P2 recentemente sintetizado. O plasmídeo codifica e expressa o gene de fusão de cauda com base em prf15 e confere resistência a gentamicina. A fibra caudal de fusão expressa do plasmídeo no E. coli infetado com P2 é incorporada no bacteriófago P2 no lugar do produto de gene H defeituoso (âmbar truncado) (proteína de fibra caudal de P2). Sob Iise das bactérias, as partículas de transdução com base em P2 liberadas carregam o plasmídeo contendo cós contendo o gene de fusão de cauda com base em prf15 ao invés do genoma de P2 e possui fi- bras caudais de fusão de Prf 15 ao invés de fibras caudais de P2.

Partículas de fago de transdução com a habilidade para ligar células e desencadear o mecanismo de injeção de bacteriófago depois con- ferem resistência a gentamicina para alvejar de forma bem sucedida as bac- térias, das quais o gene de fusão de fibra selecionado foi isolado do plasmí- deo após replicação das bactérias sob seleção de gentamicina. O gene de fibra caudal nos plasmídeos é também facilmente manipulado para criar mui- tas junções de fusão e diversificar o RBD a fim de reprojetar e otimizar a função do RBD de fibra caudal modificada.

Este método também supera muitas das dificuldades impostas por exibição C-terminal de uma proteína trimérica quando usar os sistemas de exibição de fago convencionais (Reteve & Sidhu, 2004). Bacteriófago P2 tem fibras caudais que genética e morfologicamente se assemelham àquelas das piocinas (Nakayama et al., 2000). Fibras caudais ligam às placas de ba- se de P2 e piocinas por meio de seus términos N, e há similaridade de se- qüência significativa dos términos N de P2 e fibras caudais de R2 (Nakaya- ma et al, 2000; Haggard-Ljungquist et al., 1992). Além disso, o gene de fibra caudal do fago relacionado a P2, PS17, pode complementar o gene de fibra caudal da piocina R-2, prf15 (Shinomiya, 1984; Shinomiya & Ina, 1989).

Alternativamente, o RBD é fundido diretamente ao domínio N- terminal da fibra caudal do gene H, ou os genes de fibra caudal do fago de VHML de Vibrio harveyii (que como BPP-1 também contém um DGR funcio- nal) são fundidos ao domínio N-terminal do gene H de P2.

EXEMPLO 4: MÉTODOS PARA RESTABELECER O GENE DE FIBRA CAUDAL DESEJADO Um bacteriófago P2, P4 ou OCTX carregando um gene de fibra caudal engenheirado atua como um substituto para acoplar o genótipo de fibra caudal da piocina ao fenótipo de ligação. Selecionando ou triando fenó- tipos de ligação específicos das bibliotecas diversificadas ou mutagenizadas dos genes de fibra caudal abrigados nos bacteriófagos substitutos, pode-se isolar os genes de fibra caudal que codificam uma especificidade de ligação desejada. A seleção pode ser realizada por ciclos de enriquecimento simples ou múltiplos de adsorver os bacteriófagos substitutos ou partículas de trans- dução em moléculas alvo de fase sólida, ou primeiro removendo aglutinantes indesejados e depois isolando, dentre os substitutos restantes, aqueles que ligam às moléculas alvo intencionadas, ou vice-versa. Alternativamente, a seleção pode ocorrer aplicando etapa de ligação sozinha. Por fim, o substitu- to que exibe o fenótipo de ligação desejado pode ser submetido à extração de DNA e isolamento do gene de fibra caudal abrigado clonando os frag- mentos da enzima de restrição ou através de reações de PCR usando inici- adores de oligonucleotídeo que ligam as seqüências de DNA específicas periféricas à porção diversificada do gene de fibra caudal.

O bacteriófago substituto desejado pode ser purificado em placa em um tecido de bactérias expressando o alvo molecular de interesse, por exemplo, um fator de virulência ou aptidão através do qual os bacteriófagos substitutos infetam o hospedeiro. As bactérias de expressão de fator podem ser o patógeno de interesse, por exemplo Pseudomonas aeruginosa, ou um não-patógeno, por exemplo E. coli engenheirado para expressar o fator de virulência ou aptidão alvejado. Técnicas de colocação em placa replicativa ou serial podem ser desenvolvidas para assegurar que o bacteriófago substi- tuto não forme placas em cepas bacterianas estritamente relacionadas que não expressam o fator alvo. Por exemplo, mutantes insercionais de Pseu- domonas aeruginosa que perderam a expressão dos fatores de virulência específicos podem ser usados para triar, depletar mediante adsorção, os bacteriófagos substitutos antes ou após formar as placas, ou panning em, suas bactérias de contraparte de expressão do fator de virulência ou aptidão (isogênicas). Embora os fagos substitutos ou partículas de transdução não formarão placas nas bactérias de expressão alvo, as bactérias infetadas ou transduzidas ainda adquirirão resistência a antibióticos juntamente com o plasmídeo ou fasmídeo abrigado e portanto podem ser seletivamente cresci- das e subseqüentemente extraídas para isolar o plasmídeo de multicópia e seu gene de fibra caudal desejado.

Estas técnicas permitem a identificação e isolamento dos bacte- riófagos substitutos ou partículas de transdução que exibem os fenótipos de ligação específicos desejados dos quais se extrai os genes de fibra caudal de bacteriocina de hmw não-naturais, específicos, desejados. Além disso, a ligação dos substitutos às moléculas, células ou tecidos mamíferos pode ser desenvolvida para depletar das bibliotecas quaisquer genes codificando as fibras caudais que poderiam causar eventos adversos se incorporados nas bacteriocinas de hmw terapêuticas.

Há uma biblioteca disponível das cepas bacterianas de Pseu- domonas aeruginosa insercionais mutantes que diferem da Pseudomonas aeruginosa de PA14 parental altamente patogênica apenas pela falta de ex- pressão de uma série de fatores de virulência específicos, perdendo-se de cada mutante não-redundante, isogênico (vide o sítio de rede em ausubel- lab.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). Estas cepas mutantes isogêni- cas provêem ferramentas para assegurar a especificidade dos bacteriófagos substitutos para os fatores de virulência alvejados e não para outras molécu- las de superfície prevalecentes. Por exemplo, a população de bacteriófagos P4 substitutos que podem ser incubados com uma cultura de densidade alta de um mutante de Pseudomonas aeruginosa perdendo um fator de virulên- cia particular alvejado a fim de adsorver e depletar de uma população de bacteriófagos substitutos ou partículas de transdução, aqueles que ligam às moléculas de superfície presentes tanto no mutante isogênico como na cepa parental virulenta. A população depletada será enriquecida em substitutos que ligam ao fator de virulência desejado. Uma vez os bacteriófagos substi- tutos que ligam e infetam as bactérias que expressam o fator de virulência ou aptidão particular são isolados, cada um pode ser triado diretamente para sua inabilidade para infetar a cepa mutante isogênica carecendo do fator alvejado. O plasmídeo selecionado pode ser recompactados nas partículas de transdução substitutos e pode reciclar qualquer número de vezes através do processo de adsorção-depleção e de infecção para também enriquecer e eventualmente purificar o plasmídeo baseado em pUC que codifica as fibras caudais desejadas para alvejar o fator de virulência ou aptidão.

EXEMPLO 5: MÉTODOS PARA PRODUZIR BACTERIOCINAS DE HMW ENGENHEIRADAS

O gene de fibra caudal modificado é recombinado ou (i) em um plasmídeo sob um promotor regulado para expressão em bactérias de pro- dução também abrigando, por exemplo em um cromossomo artificial bacteri- ano (BAC), o agrupamento de genes de piocina R (incluindo os genes de endolisina) do qual os genes prtR, prtN, prf15 e holin (prf9 ou PA0614) resi- dentes foram deletados ou do contrário invalidados, ou (ii) no agrupamento de piocinas contendo vetor de BAC em si, usando uma reação de permuta alélica mediada por plasmídeo.

Sob indução dos genes de piocina e do gene de fibra caudal en- genheirado, tais como induzindo prtN diretamente por meio de um promotor regulável engenheirado tal como lac ou tac, as células hospedeiras sinteti- zam as piocinas até seus nutrientes sejam depletados e eles deixem de crescer (Young, Ry, 2006). As bactérias produtoras não fazem lise na au- sência de clorofórmio, porque a inativação do gene holin impede o acesso da endolisina citoplásmica à parede da célula bacteriana, como é necessário para lise da célula. As células exaustas são colhidas por centrifugação ou filtração e depois congeladas até que uma deseje colher as piocinas solúveis que encheram o citoplasma celular. Ao descongelar, a membrana celular interna se rompe, liberando endolisina para lise das bactérias e assim libera- ção da coleta das piocinas modificadas. O rompimento das membranas bac- terianas pode ser acelerado ou completado se necessário mediante a adição de quantidades pequenas de clorofórmio ao solvente aquoso no qual a pasta bacteriana é descongelada. REFERÊNCIA

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Todas as referências citadas aqui são por este meio incorpora- das por referência em suas totalidades, quer previamente de modo específi- co incorporadas ou não. Como aqui usado, os termos "um", "uma", e "qual- quer" são cada intencionados a incluir tanto as formas singulares como plu- rais.

Tendo agora completamente descrito o assunto revelado, será apreciado por aqueles versados na técnica que o mesmo pode ser executa- do dentro de uma gama extensiva de parâmetros, concentrações, e condi- ções equivalentes sem abandonar o espírito e escopo da descrição e sem experimentação imprópria. Embora esta descrição tenha sido descrita com relação às modalidades específicas da mesma, será entendido que é tam- bém capaz de outras modificações. Este pedido de patente é intencionado abranger quaisquer variações, usos, ou adaptações do assunto seguindo, em geral, os princípios da descrição e incluindo tais abandonos da descrição como vem dentro de prática conhecida ou habitual dentro da técnica ao qual o assunto pertence e como podem ser aplicados às características essenci- ais anteriormente expostas. Listagem de Seqüência

<110> AvidBiotics Corporation Martin, David W. Jamieson, Andrew C. Scholl, Dean M. Williams, Steven R.

<120> "BACTERIOCINAS MODIFICADAS E MÉTODOS PARA SEU USO"

<130> 026200-000110PC

<140> PCT/US2O07/068908

<141> 2007-05-14

<150> US 60/747,299

<151> 2006-05-15

<160> 59

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211> 701 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1

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Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gln Pro 20 25 30

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375

380

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<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2

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Thr Pro

145

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<213> Pseudomonas aerugínosa <400> 3

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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (324).. (324) <223> Outra

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Met Thr Thr Asn Thr Pro Lys Tyr Gly Gly Leu Leu Thr Asp Ile Gly 1 5 10 15

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<213> Pseudomonas aerugínosa <400> 6

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145

150

<210> 7

<211> 691

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 7

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520

525

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<210> 8

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<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17) . . (17)

<223> Outra

<400> 8

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145

150

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<213> Pseudomonas aeruginosa <4 00> 9

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<210> 10 <211> 146 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 10 Met Ile Phe Phe His Ala Ala Thr Gly Gly Phe Tyr Ser Lys Asp 1 5 10 15 His Gly Asp Arg Met Pro Ile Asp Ala Arg Met Tyr Pro Leu Glu 20 25 30

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<210> 11

<211> 485

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 11

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50 55 60

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Glu Asp Pro Gln Ala 485

<210> 12 <211> 479 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 12 Met Arg Lys Pro Ala Phe Gly Val

10 15

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50 55 60

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<210> 13 <211> 472 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <4 00> 13 Met Ile His Ala Gln Ser Ile Arg

10 15

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Lys Ile Ala Leu Ser Asn Leu Glu Asn Gln Lys Glu Ser Arg Gln Leu 195 200 205

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Gln Arg Leu Pro Arg Leu His Arg Arg Ala Gly Ser Gln Ile Gly Ser 325 330 335

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Leu Val Ser Leu Val Arg Gln Ser Glu Ala Ser Arg Ala Ala Ala Gln 405 410 415

Gln Ala Ala Ile Arg Tyr Arg Glu Gly Thr Thr Asp Phe Leu Val Leu 420 425 430

Leu Asp Ala Glu Arg Glu Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Gln Ala Gln 435 440 445

Ala Glu Val Glu Leu Tyr Arg Gly Ile Val Ala Ile Tyr Arg Ser Leu 450 455 460

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<210> 14 <211> 472 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 14

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Asp Asp Val Ala Asn Asp Arg Phe Pro Val Val Thr Ser Arg Ala Ser 100 105 110

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Glu Leu Val Asp Ala Tyr Gly Gln Leu Arg Gly Ala Gln Leu Arg Glu 180 185 190

Lys Ile Ala Leu Ser Asn Leu Glu Asn Gln Lys Glu Ser Arg Gln Leu 195 200 205

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Gln Ala Glu Ala Glu Arg Ala Arg His Arg Ile Ala Thr Leu Leu Gly 245 250 255

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Gln Arg Leu Pro Arg Leu His Arg Arg Ala Gly Ser Gln Ile Gly Ser 325 330 335

Ser Ala Ala Arg Ala Trp Ser Val Gly Pro Ser Ile Ser Trp Ala Ala 340 345 350

Phe Asp Leu Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Arg Gly Ala Lys Ala Asp 355 360 365

Ala Asp Ala Ala Leu Ala Ser Tyr Glu Gln Gln Val Leu Leu Ala Leu 370 375 380

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Leu Val Ser Leu Val Arg Gln Ser Glu Ala Ser Arg Ala Ala Ala Gln 405 410 415

Gln Ala Ala Ile Arg Tyr Arg Glu Gly Thr Thr Asp Phe Leu Val Leu 420 425 430

Leu Asp Ala Glu Arg Glu Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Gln Ala Gln 435 440 445

Ala Glu Val Glu Leu Tyr Arg Gly Ile Val Ala Ile Tyr Arg Ser Leu 450 455 460

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<210> 15 <211> 451 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 15

Met Asn Arg Leu Arg Ala Cys Leu Leu Ser Ser Ala Leu Leu Ser Ala 15 10 15

Ser Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Leu Asp Ala Tyr Gln Leu Ala Val Arg His Asp Pro Thr Phe Gln Ala Ala Leu His Glu Arg Arg Ala Gly 35 40 45

Ser Glu Asn Arg Ala Ile Gly Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser Leu Arg 50 55 60

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Ala Arg Val Glu Arg Asp Tyr Arg Ser Tyr Ala Ser Thr Leu Ser Leu 85 90 95

Glu Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Glu Ala Tyr Ala Arg Tyr Arg Gln Gly 100 105 110

Glu Ala Gln Ala Leu Phe Ala Asp Glu Gln Phe Arg Gly Arg Ser Gln 115 120 125

Glu Leu Ala Val Arg Leu Phe Ala Ala Tyr Ser Glu Thr Leu Phe Ala 130 135 140

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Gln Leu Ala Phe Asn Gln Arg Ala Phe Glu Glu Gly Glu Gly Thr Arg

165 170 175

Thr Asp Leu Leu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu 180 185 190

Glu Ile Ala Ala Ser Asp Arg Ala Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu Glu 195 200 205

Ala Met Leu Gly Gln Ala Leu Glu Asp Arg Glu Leu Ala Ala Pro Ile 210 215 220

Glu Arg Phe Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Ala Thr Phe Glu Gly Trp 225 230 235 240

Arg Gln Val Ala Leu Gln Arg Ser Ala Glu Leu Gly Ala Gln Arg His 245 250 255

Ala Leu Glu Ala Ala Ala Tyr Glu Val Glu Arg Asn Arg Ala Gly His 260 265 270 Leu Pro Arg Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Ser Lys Thr His Ser Ala 275 280 285

Ser Glu Ser Thr Tyr Glu Gln Lys Tyr Asp Thr Asp Ser Val Gly Leu 290 295 300

Arg Leu Ser Leu Pro Leu Phe Glu Gly Gly Arg Val Ser Ala Ala Thr 305 310 315 320

Arg Gln Ala Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Ala Gln Ala Glu Leu Asp Ala 325 330 335

Gln Val Ala Ser Val Ile Asn Asp Leu His Ser Gln Fhe Asp Leu Thr 340 345 350

Ala Ser Ser Leu Ala Lys Val Arg Ala Tyr Glu Met Ala Val Ala Ala 355 360 365

Ala Arg Glu Gln Val Thr Ala Thr Arg Arg Ser Val Ala Gly Gly Glu 370 375 380

Arg Val Asn Arg Asp Val Leu Asp Ala Glu Gln Gln Phe Tyr Gly Ala 385 390 395 400

Arg Arg Asp Leu Ala Glu Ala Arg Tyr Ala Tyr Leu Asn Ala Trp Leu 405 410 415

Arg Leu Arg Gln Leu Ala Gly Val Leu Glu Asp Arg Asp Leu Ala Val 420 425 430

Leu Ala Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Glu Gly Arg Ala Gln Val Thr Ala 435 440 445

Ala Ile Arg 450

<210> 16 <211> 479 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <4 00> 16

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Glu Trp Ser Leu Gln Ala Ala Ala Gly Asn Pro Ser His Leu Ala Ala 35 40 45

Ala Pro Leu Ala Ala Gln Trp Trp Thr Leu Phe Asp Asp Ala Gln Leu 50 55 60

Asn Ala Leu Leu Gln Arg Val Gln Arg Ala Asn Leu Asp Leu Arg Ser 65 70 75 80

Ala Ala Ala Arg Leu Gln Gln Ser Arg Ala Ile Arg Arg Ser Leu Gly 85 90 95

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Val Glu Ala Ser Glu Asn Glu Leu Arg Asp Val Gln Val Ser Val Leu 165 170 175

Ala Glu Ala Ala Arg Asp Tyr Ile Gln Leu Arg Gly Glu Gln Asn Arg 180 185 190

Ala Ala Ile Ile Arg Asp Asn Leu Glu Thr Ala Arg Arg Ser Leu Glu 195 200 205

Leu Thr Arg Thr Arg Leu Ala Asn Gly Val Ala Thr Asp Leu Glu Val 210 215 220

Ala Gln Ala Leu Ala Gln Val Ala Ser Met Glu Ala Arg Leu Pro Glu 225 230 235 240

Val Glu Lys Asn Gln Ala His Leu Val Asn Ala Leu Gly Tyr Leu Val 245 250 255

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Ala Gln Arg Arg Pro Asp Ile Arg Arg Ala Glu Ala Arg Leu His Ala 290 295 300

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<210> 17

<211> 487

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 17 Met Lys Arg Ser Tyr Pro Asn Leu Ser Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15

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Leu Phe Gly Arg Leu Gly Arg Leu Ser Asp Ala Ala Leu Ala Arg Ala 145 150 155 160

Glu Ala Ala Asp Ala Asp Leu Arg Leu Val Arg Leu Ser Ile Ala Ala 165 170 175

Asp Thr Ala Arg Ala Tyr Phe Glu Ile Gln Gly Tyr Gln Arg Arg Leu 180 185 190

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Glu Thr Ala Gly Ala Asn Arg <210> <211> <212> <213> 18 491 PRT Pseudomonas aeruginosa <400> 18 Met Lys 1 Pro Tyr Leu Arg 5 Ser Ser Leu Ser 10 Ala Leu Ile Leu Leu 15 Gly Cys ΆΧά Ala 20 Val Gly Pro Asp Tyr 25 Ala Pro Pro Ser Ala 30 Ser Pro Ala Ser 35 Phe Gly Ala Met Pro 40 Ala Gly Ile Asp Gly 45 Ser Gly Glu Ile 50 Glu Trp Trp Arg Gly 55 Phe Asp Glu Pro Ala 60 Leu Glu Ser Ile Gln 65 Arg Ala Leu Ala 70 Ala Asn Leu Asp Ile 75 Ala Leu Ala Gly Arg Leu Asp Glu Ala 85 Lys Ala Leu Leu Arg 90 Glu Asn Arg Glu Glu 95 Leu Pro Arg Gly Gly 100 Pro Ala Phe Asp 105 Tyr Gln Ala Arg Arg 110 Arg Glu Val Glu 115 Thr Pro Ala Gly Gln 120 Gln Arg Asp Ile Glu 125 Thr Tyr Gly Ala 130 Leu Asp Ala Ser Trp 135 Glu Ile Asp Leu Phe 140 Gly Arg Val Arg Ser 145 Val Glu Ala Ala 150 Glu Ala Gln Ala Gly 155 Ser Arg Glu Ala Leu Arg Asn Val Gln 165 Ala Ser Val Ala Ala 170 Thr Val Ala Met Ser 175 Phe Gln Leu Gln 180 Gly Ile Glu Ala Glu 185 Leu Ala Val Val His 190 Asp

80

160

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Leu Gly Val Gly Asp Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Ile 275 280 285

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Glu Thr Ala Gly Leu Tyr Pro Gln Val Glu Val Arg Gly Ser Ile Gly 305 310 315 320

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<210> 19 <211> 779 <212> PRT <213> Fago PS17 <4 00> 19

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130 135 140

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Phe Thr Gly Asp Ala Thr Gly Gly Ala Ser Phe Asp Gly Ser Ala Asn 275 280 285

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Gln Ala Ala Thr Ala Val Lys Leu Ala Ser Pro Arg Thr Leu Ala Ile 355 360 365

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Ser Ile Ser Val Thr Leu Ala Asn Thr Gly Val Ala Val Gly Thr Tyr 385 390 395 400

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10 15

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<210> 21 <211> 178 <212> PRT

<213> Vibrio harveyi <400> 21

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Glu Ser

<210> 22

<211> 410

<212> PRT

<213> Vibrio harveyi <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Outra

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(22)

<223> outra

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (340)..(340)

<223> Outra

<400> 22

Met Gly Thr Ile Thr Glu Gln Ile Glu Ser Leu Lys Thr Ala Ser Ala 15 10 15

Glu Xaa Thr Ala Ala Xaa Gln Ala Leu Ala Gln Glu Val Ser Gly Lys 20 25 30

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345

350

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<210> 23

<211> 91

<212> PRT

<213> Vibrio harveyi

<400> 23

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<210> 24

<211> 381

<212> PRT

<213> Fago Bordetella BPP-1

<400> 24

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20 25 30

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Thr Gly Tyr Thr Ser Thr Thr Ala Arg Lys Val Gly Gly Phe His Tyr 130 135 140

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Gln Ile Asn Glu Tyr Ser Leu Trp Asp Ile Lys Phe Arg Pro Ala Ala 165 170 175

Leu Asp Pro Arg Gly Met Thr Leu Val Ala Gly Ala Phe Trp Ala Asp 180 185 190

Ile Tyr Leu Leu Gly Val Asn His Leu Thr Asp Gly Thr Ser Lys Tyr 195 200 205

Asn Val Thr Ile Ala Asp Gly Ser Ala Ser Pro Lys Lys Ser Thr Lys 210 215 220

Phe Gly Gly Asp Gly Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Gly Ala Trp Tyr Asn 225 230 235 240

Phe Ala Glu Val Met Thr His His Gly Lys Arg Leu Pro Asn Tyr Asn 245 250 255

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Gly Thr Asp Val Pro Thr Thr Qly Val Asn Gly Thr Gly Ala Thr Ser 275 280 285

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Cys Leu Trp Thr Trp Gly Asn Glu Phe Gly Gly Val Asn Gly Ala Ser 305 310 315 320

Glu Tyr Thr Ala Asn Thr Gly Gly Arg Gly Ser Val Tyr Ala Gln Pro 325 330 335

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<210> 25

<211> 669

<212> PRT

< 213 > Bacteriófago P2

<400> 25

Met Ser Ile Lys Phe Arg Thr Val Ile Thr Thr Ala Gly Ala Ala Lys 1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Thr Ala Pro Gly Arg Arg Lys Val Gly Ile Thr Thr 20 25 30

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Pro Ala Leu Ala Glu Gly Ser Gly Arg Trp Gln Thr Cys Arg Met Val 115 120 125

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Lys Ala His Ser His Ser Ala Ser Ala Ser Ser Thr Asp Leu Gly Thr 885 890 895

Lys Thr Thr Ser Ser Phe Asp Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Asn Ser Thr 900 905 910

Gly Gly His Thr His Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Thr Asn Gly Glu 915 920 925

His Ser His Tyr Ile Glu Ala Trp Asn Gly Thr Gly Val Gly Gly Asn 930 935 940

Lys Met Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Tyr Arg Ala Gly Gly Ser Asn Thr 945 950 955 960 Asn Ala Ala Gly Asn His Ser His Thr Phe Ser Phe Gly Thr Ser Ser 965 970 975

Ala Gly Asp His Ser His Ser Val Gly Ile Gly Ala His Thr His Thr 980 985 990

Val Ala Ile Gly Ser His Gly His Thr Ile Thr Val Asn Ser Thr Gly 995 1000 1005

Asn Thr Glu Asn Thr Val Lys Asn Ile Ala Phe Asn Tyr Ile Val 1010 1015 1020

Arg Leu Ala 1025

<210> 32

<211> 183

<212> PRT

<213> Bacteriófago T4

<400> 32

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Ala Trp Thr Phe Asn Lys Glu Glu Ile Phe Ile Ser Asp Ile Gly Ser 65 70 75 80

Pro Val Gly Ile Thr Phe Asp Glu Pro Gly Glu Phe Asp Ile Trp Thr 85 90 95

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Asn Arg Lys Ile Glu Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Gln Val Leu Asn Asn 115 120 125

Met Ile Glu Ala Ser Val Ala Asn Lys Lys Glu Lys Phe Tyr Tyr Lys 130 135 140 Asn Leu Lys Arg Phe Phe Ala Leu Leu Glu Lys His Glu His Leu Gly 145 150 155 160

Gly Glu Phe Pro Ser Trp Pro Glu Lys Glu Gln Lys Pro Trp Tyr Lys 165 170 175

Arg Leu Phe Lys His Tyr Val 180

<210> 33 <211> 1083 <212> PRT

<213> Bacteriófago AV17 <400> 33

Met Ala Thr Leu Lys Gln Ile Gln Phe Lys Arg Ser Lys Thr Ala Gly 15 10 15

Ala Arg Pro Ala Ala Ser Val Leu Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ile Asn 20 25 30

Leu Lys Asp Arg Val Leu Phe Thr Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Ile 35 40 45

Asp Leu Gly Phe Ala Lys Gly Gly Ser Ile Asp Gly Asn Val Ile His 50 55 60

Thr Gly Asn Tyr Asn Gln Thr Gly Asp Tyr Thr Leu Asn Gly Val Phe 65 70 75 80

Thr Gln Thr Gly Asn Phe Asn Leu Thr Gly Ile Ala Arg Val Thr Arg 85 90 95

Asp Ile Ile Ala Ala Gly Gln Ile Met Th:

100 105

Glu Gly Gly Glu Leu Ile 110

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Arg Glu Arg Gly Ile Ile Tyr Ala Pro Ala Asn Asp Gly Leu Thr Thr 130 135 140

Gln Val Leu Asn Ile Arg Val Gln Asp Tyr Ala Ala Gly Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Tyr Ala Phe Ser Gly Ser Gly Leu Phe Thr Ser Pro Glu Val Ser 165 170 175

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Thr Asn Asn Lys Ser Thr Gly Asp Tyr Asp Ile Tyr Ser Met Ala Asp 195 200 205

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Asp Gly Ile Thr Trp Tyr Ser Gly Asp Gly Leu Asp Ala Tyr Leu Trp 245 250 255

Ser Phe Thr Trp Ser Gly Gly Ile Lys Ser Ser His Ser Ile Ser Ile 260 265 270

Gly Leu Thr Pro Gly Asn Lys Asp Tyr Ser Ile Leu Gly Pro Ser Ser 275 280 285

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Ser Glu Thr Thr Ser Leu Arg Lys Phe Val Ala Gly Tyr Ser Thr Asn 325 330 335

Gly Thr Asp Leu Thr Thr Pro Pro Thr Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Thr 340 345 350

Val Val Thr Tyr His Asp Asn Asn Ala Phe Gly Asp Gly Gln Thr Leu 355 360 365

Leu Gly Tyr Tyr Gln Gly Gly Asn Tyr His His Tyr Phe Arg Gly Lys 370 375 380

Gly Thr Thr Asn Ile Asn Thr His Gly Gly Leu Leu Val Thr Pro Gly 385 390 395 400

Asn Ile Asp Val Ile Gly Gly Ser Val Asn Ile Asp Gly Arg Asn Asn 405 410 415

Ser Ser Thr Leu Met Phe Arg Gly Asn Thr Thr Gly Tyr Ser Ser Val 420 425 430

Asp Asn Met Asp Ile Lys Val Trp Gly Asn Thr Phe Val Asp Pro Ser 435 440 445

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Met Ser Tyr Ile Gln Arg Leu Thr Thr Gly Glu Val Glu Met Asn Val 465 470 475 480

Asn Gly Ser Phe Glu Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Asp Arg Gly Val 485 490 495

His Thr Thr Gly Glu Ile Ser Ser Gly Ala Val Asn Ala Leu Arg Ile 500 505 510

Trp Asn Ala Asp Tyr Gly Ala Ile Phe Arg Arg Ser Glu Gly Ser Leu 515 520 525

His Ile Ile Pro Thr Ala Tyr Gly Glu Gly Lys Asn Gly Asp Ile Gly 530 535 540

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Leu Lys Glu Asp Gly Ser Gln Gly His Thr Ser Arg Phe Asn Gln Asp 645 650 655 Gly Thr Val Asn Phe Pro Asp Asn Val Ser Val Gly Gly Gly Glu Ala 660 665 670

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Glu Ala Pro Val Phe Val Asp Phe Gly Asn Val Gly Asn Asp Ser Tyr 820 825 830

Tyr Pro Ile Ile Lys Gly Lys Ser Gly Ile Thr Asn Glu Gly Tyr Ile 835 840 845

Ser Gly Val Asp Phe Gly Met Arg Arg Ile Thr Asn Thr Trp Ala Gln 850 855 860

Gly Ile Ile Arg Val Gly Asn Gln Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Ala 865 870 875 880

Val Tyr Glu Phe His His Asn Gly Thr Phe Tyr Ala Pro Ser Leu Leu 885 890 895 Lys Ser Ser Arg Val Ser Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ala Trp Gly Gly 900 905 910

Pro Cys Ile Val Leu Gly Asp Asn Asp Thr Gly Leu Leu Trp Glu Asn 915 920 925

Asp Gly Ile Phe Asn Ala Tyr Ala Asn Gly Gln Gly Val Phe Ser Phe 930 935 940

Arg Pro Gly Leu Ala Gln Thr Phe Gly Asp Val Asn Phe His Cys Asn 945 950 955 960

Ala Gly Met Tyr Val Arg Asp Asn Ile Asp Val Asn Asp Val Tyr Ile 965 970 975

Arg Ser Asp Ile Arg Cys Lys Ser Glu Ile Lys Leu Ile Lys Asn Ala 980 985 990

Gln Glu Lys Ser Lys Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Tyr Leu Leu Lys Asn 995 1000 1005

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Thr Ala Ala Ile Asn Glu His Thr Asp Glu Ile Lys Glu Leu Lys 1055 1060 1065

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<210> 34

<211> 259

<212> PRT

<213> Bacteriófago AV17 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (164)..(164}

<223> Outra

<400> 34 Met AXa Val Val Gly Ile Pro Gly Trp Ile Gly Thr Ser Ala Val Ala 15 10 15

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Ile His Thr Leu Gly Ala Asp His Asn Phe Asn Gly Gln Trp Phe Arg 50 55 60

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Gly Asn Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Gly Gly Ala Gly Tyr Thr Ser Gln 195 200 205

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Ser Trp Ile

<210> 35 <211> 472 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <4 00> 35 Met Lys Asn Leu Ser Leu Ile Ser Ala Cys Leu Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15

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Trp Trp Lys Ala Phe Gly Ala Pro Glu Leu Asp Ser Leu Leu Gln Arg 50 55 60

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Ala Ser Val Gly Leu Tyr Lys Ala Leu Gly Gly Gly Trp Gln Ser Asp 450 455 460

Arg Gln Gly Leu Ala Arg Lys Asp 465 470

<210> 36 <211> 498 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 36 Met Lys His Thr Pro Ser Leu Leu

10 15

Gly Gly Cys Ala Ile Gly Pro Asp Tyr Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val 20 25 30

Pro Ala Glu Phe Lys Glu Ala Glu Gly Trp Arg Arg Ala Glu Pro Arg 35 40 45

Asp Val Phe Gln Arg Gly Ala Trp Trp Glu Leu Tyr Gly Asp Gln Thr 50 55 60

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Gln Ser Val Ala Gln Phe Arg Gln Ala Glu Ala Leu Val Arg Gly Ala 85 90 95

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Gln Leu Glu Ala Asn Gln Ala Ser Leu His Ala Ser Ala Ala Asp Leu 165

170

175

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Ser Thr Gln Ala Gln Ala Ile Asp Leu Lys Tyr Gln Arg Ala Gln Leu 245 250 255

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Glu Arg Thr Asp Glu Arg Leu Gly Arg Val Glu Glu Gly Leu Pro Pro 485 490 495

Ser Pro

<210> 37 <211> 482 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 37

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His Leu Val Ala Ala Ala Leu Arg His Asn Arg Asp Leu Ala Ala Ala 65 70 75 80

Asp Ala His Ala Arg Ala Leu Leu Gly His Leu Arg Gly Ala Gln Gly 85 90 95

Glu Arg Trp Pro Arg Thr Glu Val Gly Tyr Gly Tyr Gln Tyr Gly Arg 100 105 110 Asp Gly Asp Asp Gln Thr Leu Ala Glu Ala Thr Asp Glu Asp Leu His 115 120 125

Ser Gln Trp Lys His Thr Val Arg Leu Asp Leu Ser Tyr Gln Leu Asp 130 135 140

Leu Trp Gly Glu Val Arg Ala Arg Ile Ala Ala Ala Lys Ala Asp Ala 145 150 155 160

Glu Ala Ala Gln Ala Ala Arg Asp Leu Leu Arg Val Ser Val Ala Ser 165 170 175

Gln Thr Thr Leu Ala Tyr Val Arg Ala Cys Ala Leu Ala Arg Arg Ala 180 185 190

Glu Val Gln Arg Arg Ser Val Gly Leu Leu Asp Ala Ser Leu Ala Leu 195 200 205

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Arg Leu Leu Ala Leu Arg Glu Arg Thr Arg Ala Ala Leu Pro Met Leu 225 230 235 240

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Phe Ala Val Gly Ala Glu Thr Ser Ala Ala Thr Leu Ala Gly Leu Gly 325 330 335

Gly Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Ser Trp Arg 340 345 350

Phe Pro Asn Arg Glu Ser Ala Arg Gly Arg Leu Asp Ser Ala Ala Ala 355

360

365

Glu Arg Asp Ala Ala Leu Ala Arg Phe Asp Gly Ala Val Leu Gly Ala 370 375 380

Leu Arg Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ala Gly Glu Arg Gln 385 390 395 400

Arg Arg Ala Asp Leu Gln Arg Ala Leu Asp Glu Gln Arg His Ala Tyr 405 410 415

Arg Leu Ala Arg Ser Asn Tyr Arg Ala Gly Ala Leu Asp Ala Leu Glu 420 425 430

Leu Leu Asp Ser Gln Arg Ser Leu Val Ala Asp Arg Ala Arg Leu Val 435 ' 440 445

Asp Ala Glu Met Arg Val Ala Glu Arg Gln Val Glu Leu Phe Arg Ala 450 455 460

Leu Gly Gly Gly Trp Gln Ala Ala Ser Ser Pro Ser His Gln Glu Asn 465 470 475 480

Gly Gln

<210> <211> <212> <213> 38 4 92 PRT Pseudomonas aeruginosa <400> 38 Met Pro 1 Phe Pro Leu Leu His Pro Trp 5 Pro 10 Gln Arg Leu Ala Leu 15 Ser Ala Ile Leu Leu Ala Ala Gly Cys Val Thr Ser Glu Gly Leu

20 25 30

Pro Asn Ala Arg Leu Gln Pro Ala Gly Ala Leu Gln Ala Gly Arg Ser 35 40 45

Leu Asp Gly Val Ala Leu Ser Pro Ala Ala Trp Pro Arg Gln Asp Trp 50 55 60

Trp Thr Gly Leu Gly Asp Ara Gln Leu Asp Gln Leu Ile Gly Glu Ala

65 70 75 80 Leu Gln Gly Thr Pro Asp Leu Gln Ile Ala Glu Ala Arg Ala Arg Gln 85 90 95

Ala Ala Ala Thr Ala Gln Ala Gln Asp Ala Ala Arg Gln Pro Thr Leu 100 105 110

Asp Ala Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Ile Arg Ala Pro Thr Ser Val Ala 115 120 125

Pro Ala Pro Leu Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Ile Lys Tyr Leu Ser Leu 130 135 140

Gly Phe Asn Tyr Asp Phe Asp Leu Trp Gly Gly Glu Arg Ala Ala Trp 145 150 155 160

Glu Ala Ala Leu Gly Gln Ala Asn Ala Ala Arg Ile Asp Ser Gln Ala 165 170 175

Ala Arg Ile Gly Leu Ser Ala Ser Ile Ala Arg Ala Tyr Ser Asp Leu 180 185 190

Ala His Ala Phe Thr Val Arg Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Lys Arg 195 200 205

Ser Gln Arg Met Thr Glu Leu Ser Gln Lys Arg Met Ser Ala Gly Leu 210 215 220

Asp Ser Lys Val Gln Leu Gln Gln Thr Gln Thr Gln Leu Ala Thr Ala 225 230 235 240

Arg Gln Gln Leu Ser Ala Ala Glu Gln Asp Ile Ala Sér Ala Arg Ile 245 250 255

Ala Leu Ala Val Leu Leu Gly Lys Gly Pro Asp Arg Gly Leu Glu Leu 260 265 270

Gln Arg Pro Gln Pro Leu Asn Pro Ala Ser Leu Ser Leu Pro Ser Val 275 280 285

Leu Pro Ala Glu Leu Leu Gly Arg Arg Ala Asp Ile Val Ala Ala Arg 290 295 300

Trp Arg Val Glu Ala Ala Arg Arg Asn Ile Asp Ser Ala Lys Thr Glu 305 310 315 320 Phe Tyr Pro Asn Leu Asn Leu Gly Ala Met Ala Gly Leu Ala Ala Leu 325 330 335

His Thr Ser Asp Val Leu Gln Ala Pro Ser Arg Phe Phe Gln Val Ala 340 345 350

Pro Ala Ile Ser Leu Pro Ile Phe Asp Gly Gly Arg Arg Arg Ala Asn 355 360 365

Leu Ala Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Asp Leu Ala Val Gly Gln Tyr Asn 370 375 380

Lys Thr Leu Val Gln Ala Leu Gly Glu Val Ser Asp Asp Leu Gly Lys 385 390 395 400

Leu Arg Ser Leu Glu Gln Gln Val Ile Asp Gln Arg Gln Ala Arg Asp 405 410 415

Ile Ala Arg Ser Asn Phe Asp Leu Ala Met Arg Arg Tyr Gly Glu Gly 420 425 430

Val Gly Ser Tyr Leu Asp Ala Leu Ser Val Gln Gln Gln Leu Leu Val 435 440 445

Ala Glu Arg Gln Leu Ala Ser Leu Glu Ser Gln Gln Ile Asp Leu Ser 450 455 460

Val Gln Leu Val Gln Ala Leu Gly Gly Gly Phe Gln Pro Asp Ser Arg 465 470 475 480

Ser Ala Ala Leu Ala Thr Ala Lys Ala Pro Ala Glu 485 490

<210> 39 <211> 506 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <4 00> 39

Val Pro Arg Ala Leu Arg Lys Glu Leu Thr Leu Val Gly Ser Phe Val 1 5 10 15

Gly Phe Leu Val Val Phe Ser Ala Ile Ser Gly Cys Val Ser. Thr Gly 20 25 30

Asp Ile Ala Pro Glu Ala Ala Thr Leu Asp Ala Asn Ala Leu Ala Thr 35 40 45 Asp His Ala Ile Gln Ala Ala Ala Arg Glu Ala Gly Trp Pro Gln Ala 50 55 60

Gln Trp Trp Lys Val Tyr Ala Asp Pro Gln Leu Asp Ala Trp Ile Glu 65 70 75 80

Lys Ala Leu Asp Gly Asn Pro Gly Leu Ala Val Ala His Ala Arg Val 85 90 95

Arg Gln Ala Lys Ser Met Ala Gly Leu Val Glu Ser Ile Glu Ser Pro 100 105 110

Gln Ile Glu Gly Lys Gly Ser Leu Val Arg His Arg Trp Pro Asp Asp 115 120 125

Tyr Phe Tyr Gly Pro Gly Asp Leu Ala Arg Thr Thr Ser Trp Asn Asn 130 135 140

Ser Thr Glu Ile Gly Leu Asn Tyr Lys Leu Asp Leu Trp Gly Arg Asp 145 150 155 160

Arg Ser Asp Ser Glu Arg Ala Val Asp Leu Ala His Met Ala Ala Ala 165 170 175

Glu Ala Arg Gln Ala Gln Leu Glu Leu Glu Gly Asn Ile Val Arg Ala 180 185 190

Tyr Val Gln Leu Ser Leu Gln Tyr Ala Glu Met Asp Ile Ala Lys Ala 195 200 205

Met Leu Gln Gln Gln Arg Asp Ile Leu Ala Leu Ala Gln Arg Arg Leu 210 215 220

Arg Gly Gly Ile Gly Thr His Phe Glu Val Ser Gln Ala Glu Val Pro 225 230 235 240

Leu Pro Glu Thr Glu Arg Arg Ile Glu Val Ile Asp Glu Glu Ile Gln 245 250 255

Leu Thr Arg Asn Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Lys Gly Pro Gly Glu 260 265 270

Gly Arg Thr Ile Arg Arg Pro Ser Leu Asn Leu Ala Ala Gln Pro Ser 275 280 285 Leu Pro Ser Ala Leu Pro Ala Glu Leu Leu Gly Arg Arg Pro Asp Val 290 295 300

Val Ala Arg Arg Trp Gln Val Ala Ala Leu Ala Lys Gly Val Asp Val 305 310 315 320

Ala Arg Ala Asp Phe Tyr Pro Asn Val Asp Leu Met Ala Ser Val Gly 325 330 335

Phe Ser Ala Val Gly Gly Gly Met Leu Glu Phe Phe Arg Ser Ala Lys 340 345 350

Tyr Thr Tyr Ser Ala Gly Pro Ala Val Thr Leu Pro Ile Phe Asp Gly 355 360 365

Gly Arg Leu Arg Ser Gln Leu Gly Glu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Ala 370 375 380

Ala Val Glu Gln Tyr Asn Gln Thr Leu Val Asp Ala Leu Lys Asn Ile 385 390 395 400

Ser Asp Gln Leu Ile Arg Leu His Ser Val Asp Ile Gln Lys Asp Phe 405 410 415

Ala Ala Gln Ser Val Ala Ser Ala Gln Lys Thr Tyr Asp Ile Ala Thr 420 425 430

Leu Ala Tyr Gln Arg Gly Leu Thr Asp Tvr Leu Asn Val Leu Asn Ala 435 440 445

Gln Thr Arg Leu Phe Gln Gln Gln Leu Val Gln Glu Gln Val Gln Ala 450 455 460

Ala Arg Leu Ala Ala His Ala Ser Leu Leu Thr Ala Leu Gly Gly Gly 465 470 475 480

Val Gly Ala Gly Ala Asp Thr Pro Ala Gln Arg Lys Leu Ala Pro Glu 485 490 495

Asn Val Pro Val Arg Ala Val Ser Ser Arg 500 505

<210> 40

<211> 482

<212> PRT

<213> Pseudomonas

aeruginosa <400> 40

Met Leu Arg Arg Leu Ser Leu Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val Ala Trp Ala Ala Gln Pro Thr Pro Leu Pro Thr Lys Thr Asp Leu 20 25 30

Ile Ser Val Tyr Lys Glu Ala Val Asp Asn Asn Ala Asp Leu Ala Ala 35 40 45

Ala Gln Ala Asp Tyr Leu Ala Arg Lys Glu Val Val Pro Gln Ala Arg 50 55 60

Ala Gly Leu Leu Pro Gln Leu Gly Ala Gly Ala Arg Val Gly Asp Thr 65 70 75 80

Arg Ile Ala Phe Asp Glu Arg Pro Ala Thr Val Lys Arg Asn Ser Gln 85 90 95

Val Val Gln Ala Thr Leu Ser Gln Pro Leu Phe Arg Ala Asp Arg Trp 100 105 110

Phe Gln Trp Gln Ala Ala Lys Glu Thr Ser Asp Gln Ala Arg Leu Glu 115 120 125

Phe Ser Ala Thr Gln Gln Asp Leu Ile Leu Arg Ser Ala Glu Thr Tyr 130 135 140

Phe Thr Val Leu Arg Ala Gln Asp Asn Leu Ala Thr Ser Lys Ala Glu 145 150 155 160

Glu Ala Ala Phe Lys Arg Gln Leu Asp Gln Ala Asn Glu Arg Phe Asp 165 170 175

Val Gly Leu Ser Asp Lys Thr Asp Val Leu Glu Ala Gln Ala Ser Tyr 180 185 190

Asp Thr Ala Arg Ala Asn Arg Leu Ile Ala Glu Gln Arg Val Asp Asp 195 200 205

Ala Phe Gln Ala Leu Val Thr Leu Thr Asn Arg Asp Tyr Ser Ala Ile 210 215 220

Glu Gly Met Arg His Thr Leu Pro Val Val Pro Pro Ala Pro Asn Asp 225 230 235 240 Ala Lys Ala Trp Val Asp Thr Ala Val Gln Gln Asn Leu Arg Leu Leu 245 250 255

Ala Ser Asn Tyr Ala Val Asn Ala Ala Glu Glu Thr Leu Arg Gln Arg 260 265 270

Lys Ala Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Ala Val Ala Gln Tyr Gln Lys 275 280 285

Gly Asp Asn Asp Ala Leu Gly Phe Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Leu 290 295 300

Val His Tyr Gly Lys Tyr Val Asp Glu Arg Ser Ile Gly Leu Glu Leu 305 310 315 320

Asn Ile Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Thr Ser Ser Gln Val Arg Glu 325 330 335

Ser Tyr Gln Arg Leu Asn Gln Ser Glu Gln Ser Arg Glu Gly Gln Arg 340 345 350

Arg Gln Val Val Gln Asp Thr Arg Asn Leu His Arg Ala Val Asn Thr 355 360 365

Asp Val Glu Gln Val Gln Ala Arg Arg Gln Ala Ile Ile Ser Asn Gln 370 375 380

Ser Ser Leu Glu Ala Thr Glu Ile Gly Tyr Gln Val Gly Thr Arg Asn 385 390 395 400

Ile Val Asp Val Leu Asn Ala Gln Arg Gln Leu Tyr Ala Ala Val Arg 405 410 415

Asp Tyr Asn Asn Ser Arg Tyr Asp Tyr Ile Leu Asp Thr Leu Arg Leu 420 425 430

Lys Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Pro Ala Asp Leu Glu Ala Leu Ser 435 440 445

Ala Tyr Leu Lys Gln Asp Tyr Asp Pro Asp Lys Asp Phe Leu Pro Pro 450 455 4 60

Asp Leu Ala Lys Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Ser Lys Pro Arg Gln 465 470 475 480 Gln Tyr

<210> 41 <211> 471 <212> PRT

<213> Pseudoraonas aeruginosa <400> 41

Met Arg Ala Leu Ala Gly Leu Leu Cys Gly Leu Leu Gly Leu Val Pro 1 5 10 15

Gly Ala Ala Ala Tyr Glu Pro Asp Val Phe Gly Thr Thr Gly Gln Val 20 25 30

Ala Gly Gln Ala Val Tyr Asp Leu Gly Gly Ser Gly Leu Pro Cys Arg 35 40 45

Gly Gly Pro Pro Pro Thr Glu Leu Ser Leu Glu Glu Ala Ile Glu Arg 50 55 60

Ile Leu Cys His Asp Pro Gln Thr Arg Leu Ala Trp Ala Asn Ala Lys 65 70 75 80

Ala Gln Ala Ala Gln Val Gly Ile Gly Lys Ser Ala Tyr Leu Pro Arg 85 90 95

Leu Asp Gly Arg Leu Asp Ala Ser Arg Gly Tyr Ser Asp Met Asp Tyr 100 105 110

Arg Asp Ala Pro Tyr Leu Ser Gly Asp Gly His Arg His Arg Arg Gly 115 120 125

Ala Ser Leu Gln Leu Ser Trp Val Leu Phe Asp Phe Gly Arg Arg Ser 130 135 140

Ala Ala Leu Arg Asn Ala Gln Gln Leu Leu Leu Ala Ala Asn Ala Ser 145 150 155 160

Gln Asp Ala Thr Leu Gln Asn Thr Phe Ala Leu Ala Ala Gln Ala Tyr 165 170 175

Tyr Asp Ala Leu Ala Ala Gln Arg Ser Leu Ala Ala Ser Arg Gln Val 180 185 190

Ala Glu Leu Ala Ala Gln Asn Leu Glu Ala Ala Asp Ala Lys Tyr Arg Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ser Asp Arg Leu Gln Ala Gln Thr Ala Leu 210 215 220

Ser Gln Ala Ser Leu Ala Gln Val Arg Asp Glu Gly Ala Leu Ser Asn 225 230 235 240

Ala Leu Gly Val Ile Ala Leu Arg Met Gly Leu Ala Pro Asp Thr Pro 245 250 255

Leu Arg Leu Ser Gly Glu Leu Glu Ala Gln Pro Asp Thr Gly Phe Val 260 265 270

Lys Ala Ile Asp Glu Met Leu Ala Glu Ala Arg Arg Glu His Pro Ala 275 280 285

Leu Leu Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ser Val Glu 290 295 300

Glu Ser Arg Ala Ala Gly Arg Pro Ser Leu Ala Leu Ser Ala Asn Leu 305 310 315 320

Ala Arg Ser His Ser Asp Gln Ala Met Ala Phe Asn Gly Asp Thr Arg 325 330 335

Glu Arg Asp Arg Ser Ile Gly Leu Gln Leu Asn Ile Pro Leu Phe Glu 340 345 350

Gly Phe Glu Arg Thr Tyr Gln Val Arg Asn Ala Leu Ala Arg Arg Glu 355 360 365

Ala Ser Glu Ala Glu Leu Ala Asp Thr Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu 370 375 380

Val Trp Asn Asn Tyr Gln Ser Leu Ser Val Glu Thr Arg Ser Leu Ala

385 390 395 400

Arg Thr Arg Glu Leu Val Glu Gln Ser Arg Gln Ser Leu Glu Val Val 405 410 415

Gln Gly Arg Tyr Arg Ser Gly Val Gly Ser Met Ile Glu Leu Leu Asn 420 425 430

Ala Leu Thr Ala Tyr Ala Ser Ala Glu Asp Gln His Ile Arg Ala Leu 435 440 445 Gly Asn Trp Gln Thr Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Ser Leu Gly Arg 450 455 460

Leu Gly Phe Trp Ser Leu Arg 465 470

<210> 42 <211> 428 <212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 42

Met Pro Ile Leu Arg Pro Leu Ala Ser Ala Gly Lys Arg Ala Cys Trp 1 5 10 15

Leu Leu Met Gly Leu Cys Leu Gly Leu Pro Ala Leu Ala Asn Glu Ala 20 25 30

Pro Val Ser Phe Asn Gly Thr Ser Ile Ser Leu Glu Gln Ala Leu Glu 35 40 45

Arg Ala Leu Arg Ser Asn Pro Glu Leu Ala Ala Val Gly Arg Glu Thr 50 55 60

Glu Ile Ala Ser Gly Ala Arg Gln Gln Ala Gly Leu Ile Pro Asn Pro 65 70 75 80

Asp Leu Ser Trp Ser Val Glu Asp Thr Arg Gln Gly Asn Arg Gln Thr 85 90 95

Ser Val Ser Ile Ala Gln Pro Leu Glu Leu Gly Gly Lys Arg Gly Ala 100 105 110

Arg Val Glu Val Ala Lys Arg Gly Ser Glu Ile Ala Trp Thr Gln Leu 115 120 125

Glu Val Arg Arg Ala Glu Leu Arg Ala Gln Val Arg Gly Ala Tyr Tyr 130 135 140

Ala Ala Leu Thr Ala Gln Glu Arg Val Arg Leu Ala Lys Thr Ser Leu 145 150 155 160

Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Gln Ala Ala Asp Arg Arg Val Lys Ala 165 170 175 Gly Ser Ile Ser Ser Val Glu Arg Val Arg Ala Gln Val Leu Ala Asp 180 185 190

Asn Ala Gln Leu Asp Leu Ser Gln Ala Glu Leu Glu Gln Gln Arg Thr 195 200 205

Tyr Val Gln Leu Ser Ser Thr Trp Asp Glu Pro Gln Pro Gly Phe Ala 210 215 220

Arg Val Gly Gly Ala Leu Asp Ala Val Pro Ala Ser Ile Thr Arg Gly 225 -230 235 240

Ala Leu Leu Arg His Leu Asp Glu Ser Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala 245 250 255

Gln Glu Val Ala Arg Gly Glu Ala Gln Val Asp Leu Glu Lys Arg Gln 260 265 270

Arg Ile Pro Asn Leu Thr Val Ser Ile Gly Ser Lys Tyr Asp Gln Thr 275 280 285

Ala Arg Asp Gly Arg Gly Glu Arg Val Asn Leu Ile Gly Leu Ser Met 290 295 300

Pro Leu Pro Leu Phe Asp Arg Asn Gln Gly Asn Ile Tyr Ala Ala Gln 305 310 315 320

Ser Arg Ala Asp Gln Ala Arg Asp Leu Gln Arg Ala Thr Leu Leu Arg 325 330 335

Leu Arg Ser Glu Ala Val Gln Ala Tyr Asp Gln Leu Arg Thr Ser Glu 340 345 350

Gln Glu Leu Ala Leu Val Arg Arg Asp Leu Leu Pro Gly Ala Gln Ser 355 360 365

Ala Leu Asp Ser Met Thr Arg Gly Phe Glu Met Gly Lys Phe Asn Phe 370 375 380

Leu Asp Val Leu Asp Ala Gln Arg Thr Leu Val Gly Val Arg Ala Gln 385 390 395 400

Tyr Val Arg Ala Leu Asp Ala Ala Ala Gln Ala Arg Val Ser Met Glu 405 410 -415

Arg Leu Leu Gly Glu Asp Ile Gly Kis Leu Gly Gln 420 425

<210> 43

<211> 493

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 43

Met Asn Arg Trp Gly Leu Gly Val Leu Trp Leu Val Thr Ala Leu Pro 1 5 10 15

Val Ala Ala Ser Val Asn Pro Ala Leu Ser Pro Asp Val Pro Ser Met 20 25 30

Ala Arg Glu Gln Gly Arg Ser Val Leu Leu Ser Glu Gln Val Ile Asp 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Asp Ala Val Tyr Leu Gly Leu Arg Asn Asn Arg Gly 50 55 60

Ile Arg Ser Ala Tyr Leu Gln Arg Ile Ala Gln Lys Phe Asp Leu Arg 65 70 75 80

Val Ala Ala Asp Ala Phe Asn Pro Lys Leu Val Val Arg Gly Asp Tyr 85 90 95

Arg Ala Asn Arg Ala Thr Glu Asp Arg Thr Arg Thr Ser Asn Val Ser 100 105 110

Pro Thr Ala Thr Leu Leu Gly Glu Tyr Gly Thr Arg Phe Ser Leu Ala 115 120 125

Trp Val Lys Gln Phe Arg Thr Ala Asp Glu Ala Gly Arg Tyr Arg Ser 130 135 140

Asp Gly Leu Asp Leu Thr Val Val Gln Pro Leu Leu Arg Asp Ala Gly 145 150 155 160

Trp Asp Val Thr Thr Ala Pro Leu Arg Leu Ala Arg Leu Ser Glu Asp 165 170 175

Ala Asn Arg Leu Gln Leu Lys Ala Ser Val Ser Gln Thr Ile Ser Gln 180 185 190

Val Ile Gly Ala Tyr Arg Glu Leu Leu Arg Ala Gln Glu Gln Ala Arg 195 200 205 Ile Ala Arg Glu Ala Leu Ala Arg Thr Gln Glu Leu Leu Glu Val Asn 210 215 220

Arg Ala Met Ile Arg Ala Gly Arg Met Ala Glu Phe Glu Ile Val Gln 225 230 235 240

Thr Glu Ala Asp.-Val Ala Ser Gln Glu Leu Asn Val Glu Glu Ser Thr 245 250 255

Asn Gln Val Asp Ser Ala Arg Leu Ala Leu Leu Gln Leu Leu Ala Leu 260 265 270

Asp Leu Ser Thr Gln Ile Arg Ala Ser Asp Ala Leu Ala Ala Thr Pro 275 280 285

Ile Glu Val Asp Arg Gln Gln Ala Ile Arg Thr Ala Leu Gln Gln Gln 290 295 300

Pro Glu Tyr Leu Gln Arg Leu Ile Gly Ser Arg Gln Ala Asp Leu Asn 305 310 315 320

Leu Val Leu Ala Lys Asn Gln Arg Leu Trp Asp Val Ser Leu Val Gly 325 330 335

Gly Ala Ser Gln Ile Arg Asp Arg Tyr Ser Glu Gly Gly Gly Asp Asn 340 345 350

Ser Arg Ser Trp Asp Ser Tyr Ala Gly Val Gln Val Glu Ile Pro Ile 355 360 365

Gly Asp Leu Ser Arg Arg Gln Ala Glu Val Arg Ala Gln Val Asp Val 370 375 380

Glu Asn Gln Lys Ile Leu Ile Glu Asp Ala Arg Gln Thr Leu Glu Gln 385 390 395 400

Asn Val Ile Asp Ala Val Arg Asp Leu Gly Thr Arg Trp Arg Gln Tyr 405 410 415

Gln Ile Ala Gln Arg Ala Thr Ala Leu Ser Arg Arg Lys Leu Glu Ile 420 425 430

Glu Arg Glu Lys Leu Arg Val Gly Arg Ser Ser Asn Phe Gln Val Leu 435 440 445 Ser Phe Glu Thr Asp Leu Arg Asn Val Glu Asn Thr Gln Leu Asn Ala 450 455 460

Leu Ile Ser Phe Leu Asn Ala Gln Thr Gln Leu Asp Leu Ile Val Gly 465 470 475 480

Met Thr Leu Asp Ser Trp Glu Ile Ser Leu Asn Asp His 485 490

<210> 44

<211> 425

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 44

Met Arg Gly Arg Arg Gln Tyr Ala Arg Lys Gly Arg Arg His Gly Lys 1 5 10 15

Gly Ala Ile Trp Leu Leu Ser Leu Gly Leu Pro Met Phe Ala Ser Ala 20 25 30

Met Pro Leu Asp Gln Ala Val Arg Ala Gly Leu Ala Ile His Pro Glu 35 40 45

Val Arg Ser Ala Met Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Thr Glu Val Glu 50 55 60

Met Ala Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Ser Val Thr Met Ser Gly Gly Pro 65 70 75 80

Gln Glu Phe Asp Phe Gly Glu Ile Val Tyr Asp Leu Thr Ala Ser Gln 85 90 95

Met Leu Tyr Asp Trp Gly Arg Val Thr Ser Lys Val Asp Ser Ala Ser 100 105 110

Ala Thr Gln Arg Lys Leu Ser Glu Ala Val Leu Val Ala Arg Asp Asp 115 120 125

Ala Ala Leu Asp Ile Val Glu Thr Tyr Leu Asp Val Leu Ala Ser Glu 130 135 140

Arg Arg Val Glu Ala Val Arg Glu His Ile Gln Arg Leu Asp Gly Ile 145 150 155 160

Arg Glu Met Thr Gln Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Ala Asp Arg Ser 165 170 175 Glu Leu Asp Arg Ala Asn Leu Glu Leu Ser Arg Ala Gln Glu Gln Leu 180 185 190

Ser Leu Glu Lys Gly Asn Leu Gln Asp Ala Arg Asn Gln Tyr Ala Ile 195 200 205

Leu Val Gly Gln Glu Pro Ala Asp Leu Val Glu Pro Glu Pro Met Ser 210 215 220

Leu Gln Arg Tyr Leu Ala Ala Ser Asp Met Ala Arg Val Ile Arg Glu 225 230 235 240

Ser Pro Leu Gln Arg Lys Ala Leu Glu Asp Ala Asn Val Ala Glu Ala 245 250 255

Glu Val Arg Glu Ala Lys Ala Ser Leu Leu Pro Gln Leu Asn Leu Glu 260 265 270

Ala Ser Ala Leu Arg Arg Glu Ile Gly Gly His Pro Glu Ser Asp Ser 275 280 285

Val Val Ser Leu Arg Phe Arg Met Asp Thr Phe Gln Gly Leu Ser Asn 290 295 300

Phe Arg Arg Pro Thr Ala Ala Gln Gln Arg Leu Glu Ser Ala Lys Trp 305 310 315 320

Ser Ala Asp Ala Met Gln Arg Asp Ile Arg Arg Gln Leu Gln Asn Leu 325 330 335

Phe Asp Asn Gly Asp Thr Leu Arg Trp Arg Glu Gln Ser Leu Thr Gln 340 345 350

Gln Val Thr Glu Ser Glu Gln Val Gly Glu Leu Tyr Arg Glu Gln Phe 355 360 365

Glu Val Gly Arg Arg Asp Val Ile Asp Leu Leu Asn Val Gln Arg Glu 370 375 380

Arg Phe Glu Ala Glu Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg Ile Glu Arg Lys 385 390 355 400

Arg Ile Glu Tyr Arg Ala Ala Ala Gln Val Gly Leu Leu Gly Pro Leu 405 410 415 Leu Glu Asn Arg Leu Asn His Gly Ser 420 425

<210> 45 <211> 761 <212> PRT

<213> Bacteriófago phiCTX <400> 45

Met Thr Ser Pro Lys Tyr Gly Gly Leu Leu Thr Asp Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15

Ala Leu Ile Ala Ala Ser Glu Ala Gly Lys Lys Trp Gln Pro Thr His 20 25 30

Met Leu Ile Gly Asp Ala Gly Gly Ala Pro Gly Glu Thr Ala Asp Pro 35 40 45

Ile Pro Ser Ala Ala Gln Thr Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Ala 50 55 60

Gln Leu Asn Arg Leu Phe Val Ser Glu Gln Ser Ala Asn Val Leu Val 65 70 75 80

Ala Glu Leu Val Leu Pro Met Ala Ile Gly Gly Phe Trp Ile Arg Glu 85 90 95

Ile Gly Leu Glu Asp Ala Asp Gly Lys Phe Val Ala Val Ala Asn Cys 100 105 110

Pro Pro Ser Phe Lys Ala Ser Val Glu Ser Gly Ser Ala Arg Thr Gln 115 120 125

Thr Ile Arg Val Gln Ile Ile Leu Ser Gly Met Glu His Val Glu Leu 130 135 140

Ile Ile Asp Asp Gly Ile Val Tyr Ala Thr Gln Asp Trp Val Thr Ala 145 150 155 160

Lys Val Ala Ala Asp Phe Lys Gly Arg Lys Val Leu Ala Gly Asn Gly 165 170 175

Leu Val Gly Gly Gly Asp Leu Ser Ala Asp Arg Thr Ile Ala Leu Pro 180 185 190

Ala Ser Gly Val Gly Ala Gly Thr Tyr Arg Ala Val Thr Val Asn Ala Asn Gly Ile Val Thr Ala Gly Ser Asn Pro Thr Thr Leu Gly Gly Tyr 210 215 220

Gly Ile Thr Asp Ala Leu His Ala Ser Glu Ala Val Thr Thr Pro Thr 225 230 235 240

Ala Asn Lys Leu Leu Arg Leu Asn Ala Ala Gly Leu Leu Pro Ala Ser 245 250 255

Ile Thr Gly Asn Ala Ala Thr Ala Ser Arg Leu Ala Ala Pro Ile Thr 260 265 270

Leu Ser Ala Ser Gly Asp Ala Thr Trp Ser Ala Arg Phe Asp Gly Ala 275 280 285

Thr Asn Val Asn Gly Val Leu Thr Leu Ala Asn Ser Gly Val Thr Ala 290 295 300

Gly Thr Tyr Ala Lys Val Thr Val Asn Ala Lys Gly Leu Val Thr Gly 305 310 315 320

Ala Thr Gly Leu Val Ala Ser Asp Ile Pro Ala Leu Asp Ala Gly Lys 325 330 335

Ile Thr Ser Gly Ile Leu Pro Ala Ala Arg Gly Gly Thr Gly Asn Gly 340 345 350

Ile Gly Gln Ala Ala Thr Ala Val Lys Leu Val Ala Pro Arg Thr Ile 355 360 365

Tyr Leu Gly Gly Asp Val Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asp Gly Ser Ala 370 375 380

Asn Ala Gly Ile Thr Val Thr Leu Ala Asn Gly Val Asn Ala Gly Ser 385 390 395 400

Tyr Pro Lys Val Thr Val Asn Ala Lys Gly Leu Val Thr Gly Gly Gly 405 410 415

Gly Leu Thr Ala Ala Asp Ile Pro Ala Leu Asp Ala Ser Lys Ile Ala 420 425 430

Thr Gly Arg Leu Asp Leu Glu Arg Leu Pro Leu Val Ser Gln Gly Leu 435 440 445 Ala Thr Ala Val His Thr Ser Val Asp Pro Asn Ser Val Val Ile Pro 450 455 460

Leu Val Leu Thr Asn His Ala Asn Gly Pro Val Ala Gly Arg Tyr Tyr 465 470 475 480

Tyr Ile Gln Thr Met Phe Tyr Pro Thr Val Glu Gly Asn Ala Thr Gln 485 490 495

Ile Ala Thr Gly Tyr Ala Gly Val Ala Asp Met Tyr Val Arg Tyr Ala 500 505 510

Tyr Ala Ser Pro Ala Thr Thr Asp Ser Ser Lys Arg Glu Trp Ser Ala 515 520 525

Trp Val Arg Cys Asp Leu Gly Gly Ala Phe Ala His Ala Pro Asp Gly 530 535 540

Glu Leu Gly Gly Tyr Val Asn Leu Asp Ser Met Ile Ala Ser Gly Trp 545 550 555 560

Trp His Gln Pro Phe Thr Ala Asn Ala Lys Asn Gly Ala Asn Tyr Pro 565 570 575

Val Gly Glu Ala Gly Leu Leu Thr Val His Ala Pro Thr Ala Ser Met 580 585 590

Ile Tyr Gln Thr Tyr Arg Gly Tyr Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Trp Arg 595 600 605

Cys Arg Tyr Asn Gly Thr Trp Ser Ala Trp Tyr Arg Ala Trp Asp Ser 610 615 620

Gly Asn Phe Asn Pro Ala Asn Tyr Val Ala Lys Ser Glu Tyr Ser Trp 625 630 635 640

Ala Ser Leu Pro Gly Lys Pro Ser Asn Phe Pro Pro Ser Val His Val 645 650 655

His Ser Ala Ala Ser Arg Gly Val Ser Gly Trp Tyr Lys Asn Asn Asp 660 665 670

Thr Gly Val Ile Phe Gln Trp Val Asn Leu Ser Ile Gly Asp His Pro 675 680 685 Gly Gly Val Ile Asp Arg Val Val Thr Phe Pro Ile Ala Phe Pro Asn 690 695 700

Ala Cys Leu His Val Val Pro Thr Val Arg Glu Asn Gly Arg Pro Ala 705 710 715 720

Ile Pro Ala Ser Thr Val Thr Val Ala Glu Lys Ala Arg Thr Ala Thr 725 730 735

Asn Cys Thr Ile Val Ser Ser Glu Tyr Ile Gly Asn Val Gln Asn Phe 740 745 750

Gly Ile Asn Val Phe Ala Ile Gly Tyr 755 760

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV085

<400> 46

gcttcaatgt gcagcgtttg c 21

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV088

<400> 47

gccacaccgg tagcggaaag gccaccgtat ttcggagtat 40

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV087

<400> 48

atactccgaa atacggtggc ctttccgcta ccggtgtggc 40

<210> 49

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador AV086

<400> 49

tccttgaatt ccgcttgctg ccgaagttct t

<210> 50

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificiai

<220>

<223> IniciadorAVIIO

<400> SO

Cttattagcg gaagagccga ctgcacggtg caccaatg

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<2ΐ3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV114

<400> 51

ccctcgaatt catgaatact gtttcctgtg tgaaattg

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<2i3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV118

<400> 52

cttcctttca tgacgaccaa tactccgaa

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV116

<400> 53

accacgaatí cttcatcgtc caaatgcctc

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador AV107

<400> 54

caccatctag acaatacgag agcgacaagt c

<210> 55

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador AV091

<400> 55

tcctcaagct tacgttggtt accgtaacgc cgtg

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<2i3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciadores AV118 e AV127

<400> 56

ttctttaagc ttttccttca cccagtcctg

<210> 57

<211> 29

<212> DNA

<2i3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV124

<400> 57

cctcctgaat tcttattgcg gcatttccg

<210> 58

<211> 29

<212> DNA

<2i3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador AV126

<400> 58

tccttcgaat tcttacacct gcgcaacgt

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Iniciadores AV124 e AV125

<400> 59

cctcctgaat tcttattgcg gcatttccg

Claims (26)

1. Molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fibra caudal de bacteriocina de peso molecular alto (hmw) compreendendo uma região de ligação de placa de base (BPAR) e um domínio de ligação de re- ceptor heterólogo (RBD).

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que o dito RBD compreende uma substituição, inserção, ou deleção de um ou mais aminoácidos com relação a um RBD de ocorrência natural de uma proteína de fibra caudal.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, em que o dito RBD é de uma proteína de fibra caudal de bacteriófago.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 3, em que o dito RBD de uma proteína de fibra caudal de bacteriófago ou de bacteriocina de hmw compreende de cerca de 347 a cerca de 755 aminoáci- dos, em comprimento, incluindo o término C, da dita proteína.

5. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codi- fica uma chaperona cognata da proteína de fibra caudal.

6. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que o RBD expresso liga um receptor correspondente em uma superfície de uma célula bacteriana depois compromete a integridade de uma mem- brana citoplásmica da dita célula.

7. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que a bacteriocina é uma piocina do tipo R, monocina, enterocoliticina, ou meningocina.

8. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que o RBD expresso liga um fator de virulência ou aptidão em uma su- perfície de uma célula bacteriana.

9. Bacteriocina de hmw compreendendo uma proteína de fibra caudal codificada por uma molécula de ácido nucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1-8.

10. Bacteriocina de acordo com a reivindicação 9 em que a pro- teína de fibra caudal compreende toda ou parte da seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N5: 1, 3, 5, 7, 9, 27, e/ou 30.

11. Bacteriocina de acordo com a reivindicação 9, em que o dito RBD liga um fator de virulência ou aptidão bacteriana.

12. Porção da bacteriocina como definido na reivindicação 9, em que a porção de RBD liga um receptor em uma superfície da célula e depois compromete a integridade da membrana citoplásmica da célula.

13. Composição antibacteriana compreendendo a bacteriocina como definido na reivindicação 9, e um veículo ou excipiente.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o veículo ou excipiente é farmaceuticamente aceitável.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que o dito veículo ou excipiente é adequado para administração tópica, oral, ou sistêmica.

16. Célula bacteriana transfeccionada ou transformada com, ou contendo, uma molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

17. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 16, em que a expressão da dita proteína de fibra caudal e/ou sua chaperona cognata é regulada por um promotor sensível a prtN ou um promotor natural.

18. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 17, em que a célula codifica e é capaz de expressar a proteína de fibra caudal de bacte- riocina.

19. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 18, em que a seqüência de codificação da proteína de fibra caudal endógena da bacteri- ocina é inativada ou excluída.

20. Método de produzir uma bacteriocina de hmw, o dito método compreendendo cultivar a célula bacteriana como definido na reivindicação 16, sob condições que resultam na produção da bacteriocina.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que as ditas condições são in vivo.

22. Método de comprometer a integridade de uma membrana citoplásmica de uma célula bacteriana, o dito método compreendendo conta- tar a dita bactéria com a bacteriocina como definido na reivindicação 9.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o dito contato ocorre in vivo.

24. Método de comprometer a integridade de uma membrana citoplásmica de uma célula bacteriana em um sujeito, o dito método compre- endendo administrar uma bacteriocina como definido na reivindicação 9, ao dito sujeito.

25. Método de formar progênie de bactérias não-virulentas de bactérias progenitoras virulentas, o dito método compreendendo contatar as bactérias virulentas com uma bacteriocina como definido reivindicação 11, em que a bacteriocina liga o fator de virulência ou aptidão das ditas bactérias progenitoras virulentas, e selecionar a progênie de bactérias não-virulentas.

26. Método de manter uma população de bactérias não- virulentas, o dito método compreendendo contatar a dita população com uma bacteriocina como definido na reivindicação 11, em que a bacteriocina liga o fator de virulência ou aptidão de bactérias virulentas, para impedir a propagação das bactérias virulentas.