ES2548392T3

ES2548392T3 - Bacteriocinas modificadas y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2548392T3
Application number: ES11154069.6T
Authority: ES
Inventors: David W. Martin Jr.; Andrew C. Jamieson; Dean M. Scholl; Steven R. Williams
Original assignee: AvidBiotics Corp
Current assignee: AvidBiotics Corp
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2015-10-16
Anticipated expiration: 2027-05-14
Also published as: ES2387722T3; WO2007134303A3; PL2021358T3; EP2021358B1; US20080113406A1; EP2021358A2; JP5603070B2; US7732586B2; CA2652450A1; AU2007249199A1; EP2371842A1; JP2009537146A; DK2371842T3; BRPI0711969A2; CA2652450C; ATE551354T1; EP2371842B1; WO2007134303A2; DK2021358T3; AU2007249199B2

Abstract

Una proteína bacteriocina de fibra caudal de elevado peso molecular (epm) que comprende una región de anclaje a placa base (BPAR) y un dominio de unión a receptor heterólogo (RBD), en la que RBD es de una fibra caudal de un bacteriófago o protofago o una fibra caudal de otra bacteriocina que muestre características de unión diferentes de aquellas de la bacteriocina del BPAR y en la que BPAR comprende los aminoácidos 1-164 o 1-240 de una piocina de tipo R.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

La Figura 8 muestra la complementación en trans de la estructura de piocina PA01 Δprf15 R2 con diversas fibras caudales de piocina de tipo R, fusiones de fibra caudal y chaperonas. Las actividades de las piocinas R1 a R5 complementadas se evaluaron punteando sobre la cepa indicadora Pseudomonas aeruginosa 13s, que es sensible a todos los tipos de piocinas. Las piocinas R2-P2 complementadas se ensayaron con respecto a su actividad usando

E. coli C como indicador y se ensayó la piocina R2-L-413c complementada en la cepa de Yersinia pestis KIM.

Las fibras caudales de R2, R3 y R4 Prf15 se pudieron complementar mediante el Prf16 endógeno de la piocina PA01 Δprf15 R2. Las fibras caudales de R1 y R5 Prf15, que difieren en el extremo C-terminal en comparación con R2, requirieron, para su actividad máxima, su propio Prf16 afín (que a su vez difiere de su homólogo de R2). Las fusiones tanto R2-P2 como R2-L-413c, que contienen el extremo C-terminal (RBD) del fago P2 y fibras caudales de L-413c, respectivamente, requieren sus chaperonas de ensamblaje de la fibra caudal afines codificadas por el gen G del fago.

La Figura 9 muestra el vector de expresión de la fibra caudal de piocina y de la chaperona pUCP30T. Los genes, prf5 y prf16, se expresan usando un vector lanzadera de Pseudomonas/E. coli (Schweitzer) con orígenes de replicación (ori pRO1600, rep y oriT) para ambas especies. Los sitios de clonación se muestran mediante los sitios de escisión de enzima de restricción indicados. El plásmido confiere resistencia a gentamicina (Gm R) y se mantiene añadiendo gentamicina al medio de cultivo. La transcripción de ambos genes se dirige por el promotor tac que está regulado negativamente por lacIQ. Cuando se transforma en la cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO 1Δprf15, los genes, por ejemplo, prf15 y prf16, incorporados en el plásmido se expresan in trans después de inducirse con IPTG simultáneamente con la inducción de mitomicina C de aquellos genes de piocina que permanecen en las bacterias hospedadoras de producción de PAO1 Δprf15.

La Figura 10 proporciona la construcción de la fibra caudal de piocina específica de Yersinia pestis. De manera similar a la estrategia que se usó para construir R2-P2, la porción codificante C-terminal (RBD) del gen de fibra caudal L-413c se fusionó a una porción N-terminal (BPAR) de la fibra caudal de R2. Cuando se expresa in trans para complementar a la cepa de eliminación de fibra caudal de R2 PA01Δprf15, se producen partículas de piocina modificadas que contienen las fibras caudales quiméricas de R2-L-413c que pueden eliminar de manera eficaz a Y. pestis pero no a Pseudomonas.

La Figura 11 proporciona las secuencias de aminoácidos o las secuencias de ácidos nucleicos para las SEC ID Nº: 1-59, proporcionadas en las páginas 11A-11J.

DEFINICIONES

Tal como se usa en el presente documento, una bacteriocina de epm incluye una piocina de tipo R, bacteriocina similar a cola, bacteriocina de tipo R, piocinas de tipo F y de tipo R, monocinas, meningocinas u otras bacteriocinas de elevado peso molecular (epm). Una bacteriocina de epm incluye versiones modificadas de las piocinas de tipo R y de tipo F, enterocoliticinas, monocinas y meningocinas (véase Kingsbury "Bacteriocin production by strains of Neisseria meningitidis." J. Bacteriol. 91 (5):1696-9, 1966). Una bacteriocina de epm modificada o diseñada por ingeniería genética puede ser una piocina de tipo R modificada seleccionada entre piocina R1, R2, R3, R4, o R5 de

P. aeruginosa. Una bacteriocina de la divulgación puede ser termolábil, resistente a ácidos débiles, resistente a tripsina, sedimentable mediante centrifugación a aproximadamente 65.000 x g y resoluble mediante microscopía electrónica (véase Jabrane et al. Appl. Environ. Microbiol. 68:5704-5710, 2002; Daw et al. Micron 27:467-479, 1996; Bradley Bacteriol. Revs. 31:230-314, 1967; y Kageyama et al. Life Sciences 9:471-476, 1962. En muchos casos, una bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética divulgada en el presente documento tiene una o más, en cualquier combinación, de estas propiedades. Una propiedad adicional común a las bacteriocinas y bacteriocinas epm diseñadas por ingeniería genética divulgadas en el presente documento es que no contienen ácido nucleico y por lo tanto son deficientes en replicación, de tal forma que no pueden reproducirse por sí mismas después o durante la eliminación de la bacteria diana, como sí pueden hacer muchos bacteriófagos.

Las piocinas y otras bacteriocinas epm divulgadas en el presente documento son moléculas complejas que comprenden múltiples subunidades de proteína, o polipéptido, y se asemejan a las estructuras de la cola de los bacteriófagos de la familia myoviridae. En las piocinas de origen natural, las estructuras de subunidad están codificadas por el genoma bacteriano, tal como aquel de P. aeruginosa y forman piocinas para que sirvan como defensas naturales contra otras bacterias (Kageyama, 1975). Una bacteria diana sensible puede eliminarse por una sola molécula de piocina (Kageyama, 1964; Shinomiya y Shiga, 1979; Morse et al., 1980; Strauch et al., 2001).

Una "bacteria diana" o "bacterias diana" se refieren a una bacteria o bacterias que están unidas mediante una bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética de la divulgación y/o cuyo crecimiento, supervivencia o replicación se inhibe de este modo. La expresión "inhibición del crecimiento" o variaciones de la misma se refiere al freno o detención de la velocidad de división celular bacteriana o al cese de la división celular bacteriana, o a la muerte de las bacterias.

Tal como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico" se refiere típicamente a polímeros de desoxirribonucleótido o de ribonucleótido (puros o mixtos) en forma mono o bicatenaria. El término puede abarcar ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos o restos o enlaces estructurales modificados, que son

imagen7

E11154069

25-09-2015

(véase Mitchell et al., 2002); genes de virulencia animal y vegetal descritos por He et al., 2004; restos de pirofosfato extracelulares (véase Bonev et al., 2004); metaloproteasas (véase Rudner et al., 1999); y moléculas de superficie codificadas por transposón (véase Jacobs et al., 2003).

Otros ejemplos no limitantes de factores de virulencia usados como diana por una bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética divulgada incluyen aquellos codificados por las fases abiertas de lectura (ORF) divulgadas en la Patente de Estados Unidos 6.355.411 y el documento WO 99/27129. En algunas realizaciones, un factor usado como diana por una bacteriocina divulgada en el presente documento es uno codificado por las siguientes ORF de la Patente de Estados Unidos:

Número de ORF: Codifica

5: Desconocido

9: Desconocido

21: Posiblemente un receptor

23: Posiblemente un transportador ABC

33: Desconocido

41: Posiblemente similar a mucina

43: Desconocido

51: Desconocido

53: Posiblemente similar a mucina

85: Desconocido

89: Posiblemente receptor de lipoproteína

91: Desconocido

95: Posiblemente proteofosfoglucano, superficie celular

107: Posiblemente ABC

110: Posiblemente glucosiltransferasa de membrana

113: Posiblemente la proteína de resistencia multifármaco MexA

132: Posiblemente muc d

134: Posiblemente 6-UDP manosa deshidrogenasa

149: Posiblemente diana potencial de transportador MDR

150: Posiblemente la proteína de resistencia multifármaco MexA

203: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

204: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

205: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

206: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

207: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

208: Posiblemente componente de ATPasa de transportador ABC

209: Posiblemente ABC; Posiblemente Na+/H+ y K+/H+ de tipo NhaP

213: antiportadores

215: Desconocido

227: Posiblemente un receptor

239: Posiblemente desoxicitidina trifosfato desaminasa

241: Posiblemente UTPasa

249: Desconocido

255: Desconocido

E11154069

25-09-2015

Número de ORF: Codifica

261: Posiblemente 6-fosfogluconato deshidrogenasa

263: Posiblemente un transportador ABC

273: Desconocido

277: Posiblemente miembro de la familia PE-PGRS

289: Posiblemente 6-fosfogluconato deshidrogenasa

291: Posiblemente glucosil transferasa

297: Posiblemente igA

301: Posiblemente glucosil transferasa

309: Posiblemente bomba de salida de cationes/multifármaco

323: Desconocido

327: Desconocido

331: Posiblemente sensor con supuesta PilR cinasa

333: Posiblemente transporte de proteína Tonb

341: Posiblemente Pil R

349: Posiblemente Pil A o R

363: Posiblemente orfz

365: Posiblemente un transportador ABC

375: Posiblemente mucina

377: Posiblemente fimT pilus

381: Posiblemente antígeno de inmovilización H1

383: Posiblemente fimU

387: Posiblemente PilV pilus

393: Posiblemente pilW et

401: Posiblemente pil X

403: Posiblemente antígeno cd3

411: Desconocido

413: Desconocido

419: Posiblemente pil E

421: Posiblemente pyl y2

427: Posiblemente antígeno de membrana externa PE-PGRS

437: Posiblemente ligA de ABC

Descripción detallada de modos para poner en práctica la divulgación

General

Las bacteriocinas epm tienen la capacidad de eliminar rápidamente a las bacterias. Unos cuantos de los primeros

5 informes de estudios in vivo han demostrado que pueden ser eficaces en ratones para esta aplicación (Haas et al., 1974; Merrikin y Terry, 1972). Los inventores han determinado recientemente que la piocina R2 de tipo silvestre puede rescatar a los ratones de una peritonitis aguda causada por Pseudomonas aeruginosa resistente a antibióticos cuando se administra bien intraperitonealmente o bien por vía intravenosa y que las piocinas R2 pueden actuar a dosis muy bajas, tales como 109 piocinas o menos de 1 µg de proteína total en una sola dosis (datos no

10 mostrados).

Para que las bacteriocinas epm sean clínicamente útiles como agentes antibacterianos, sin embargo, hay que abordar el problema de su estrecho espectro bactericida. Aunque esto puede verse como una ventaja en tanto que

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

La divulgación se basa en las propiedades de una fibra caudal de bacteriocina de epm para que se una a, o interactúe con, un receptor para formar un par de unión. La unión o interacción sucede mediante el RBD de la fibra caudal, que es el primer miembro del par de unión, siendo el receptor el segundo miembro del par. En muchas realizaciones, el receptor es una molécula de la superficie de una célula bacteriana o una porción de la misma. En otras realizaciones, el receptor es una molécula con propiedades de un factor de virulencia o aptitud de una bacteria patógena.

Una bacteriocina de epm modificada o diseñada por ingeniería genética divulgada en el presente documento comprende una fibra caudal que tiene tanto una región de unión a una placa base (BPAR) y un RBD modificado o heterólogo. Tal como se describe en el presente documento, la fibra caudal es una estructura trimérica de tres subunidades de proteína de fibra caudal, cada una de las cuales comprende también un primer dominio correspondiente a, y que forma, el BPAR en una fibra caudal y un segundo dominio que corresponde a, y forma, un RBD modificado o heterólogo en una fibra caudal.

Típicamente, "heterólogo" cuando se usa en referencia a porciones de una proteína o de una secuencia de ácido nucleico indica que la secuencia comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran normalmente en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos

o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. "Heterólogo" también significa que la secuencia de aminoácidos no se encuentra normalmente en conjunción con las otras secuencias o normalmente no está contenido en el plásmido, vector u hospedador seleccionado. En otras palabras, no es nativo para el sistema en el que ahora se utiliza. Por ejemplo, proteínas producidas por un organismo que no es la fuente de tipo silvestre para esas proteínas.

La divulgación incluye una proteína de fibra caudal de bacteriocina de epm que comprende un BPAR de la proteína y un RBD modificado o heterólogo. El BPAR está en la región N-terminal de una proteína de fibra caudal, mientras que el RBD está en la región C-terminal. En vez del RBD modificado o heterólogo, la proteína de fibra caudal puede ser la de cualquier bacteriocina de epm de origen natural, siendo ejemplos no limitantes una piocina, monocina, enterocoliticina o meningocina. En algunas realizaciones, la proteína de fibra caudal de piocina R1, piocina R2, piocina R3, piocina R4 y piocina R5, tal como se representa por las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, respectivamente, pueden usarse tal como se describe en el presente documento. En realizaciones adicionales, la proteína de fibra caudal puede ser aquella o aquellas de SEC ID Nº: 45 del fago ΦCTX, o aquella del fago PS 17 de SEC ID Nº: 19 o aquella del bacteriófago VHML de SEC ID Nº: 21 y 22.

Las realizaciones de la divulgación incluyen combinaciones de un BPAR de una proteína de fibra caudal de bacteriocina de epm y un RBD de una proteína de fibra caudal de bacteriófago, tal como se muestra en la Figura 3. En algunos casos, una combinación puede incluir los aminoácidos N-terminales desde la posición 1 hasta aproximadamente la posición 164 o la posición 240 de una proteína de fibra caudal de bacteriocina. Este fragmento polipeptídico puede fusionarse a una región de una proteína de fibra caudal de bacteriófago que incluye su porción C-terminal que contiene un RBD. La región puede ser un fragmento polipeptídico que carece de la región N-terminal desde la posición 1 hasta aproximadamente la posición 150, aproximadamente la posición 170, aproximadamente la posición 190, aproximadamente la posición 290, aproximadamente la posición 300, o aproximadamente la posición

320.

Usando la piocina R2 y la proteína de fibra caudal del fago P2 como ejemplos no limitantes, el fragmento que contiene BPAR puede incluir los aminoácidos N-terminales desde la posición 1 hasta la posición 164 o 240. Véanse las Figuras 4-7. El fragmento que contiene RBD puede incluir el extremo C-terminal y desde aproximadamente 347 hasta aproximadamente 755 aminoácidos de longitud de proteínas de fibra caudal del fago P2 o relacionadas. La fusión puede prepararse fácilmente mediante técnicas de ADN recombinante con secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fibra caudal de R2, tales como prf15 y el gen H de fago P2 que codifica su proteína de fibra caudal. La chaperona afín del RBD necesita expresarse conjuntamente con los genes de fibra caudal de fusión para asegurar el ensamblaje de las fibras caudales modificadas en una estructura de piocina funcional. Véase la Figura 8.

RBD de bacteriófagos

Otras fuentes de RBD incluyen, pero sin limitación, fagos T-4 y otros fagos T-par o seudoT-par, fagos T-3 y T-7, supergrupo de fagos T-7, fago Mu, fago P22, fago L-413c y fagos lamboides.

RED de diversificación

En realizaciones adicionales, una proteína de fibra caudal comprende una sustitución con, o una inserción de, un RBD derivado de un organismo que diversifica la estructura desplegando un retroelemento generador de diversidad (DGR), tal como se ilustra en la Solicitud de Patente publicada US 2006-0121450, publicada el 8 de junio de 2006. El determinante principal de tropismo (Mtd) de bacteriófago de Bordetella BPP-1 es una de dichas estructuras. La secuencia de Mtd está representada por SEC ID Nº: 24, tal como se divulga en el presente documento. En otras realizaciones, la sustitución es con parte de la secuencia Mtd, tal como, pero sin limitación, la región desde el resto 49 al 381, del resto 171 al 381, o desde los restos 306 a 381, de SEC ID Nº: 24. La inserción de la secuencia Mtd, o cualquier fragmento de la misma (tal como aquellos listados anteriormente), al extremo de una proteína de fibra

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

caudal, tal como después de la posición 691 de SEC ID Nº: 3, se encuentra dentro de las realizaciones divulgadas en el presente documento. La sustitución de la secuencia Mtd, o cualquier fragmento de la misma (tales como aquellos listados anteriormente), puede ser para cualquier región no-BPAR de una proteína de fibra caudal. Los ejemplos no limitantes incluyen la región de las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 o 9 que comienzan aproximadamente en la posición 643, 625, 562, 448, 428, 231 y 163 hasta el extremo C-terminal de la secuencia (véanse las Figuras 4-7 para una ejemplificación de estas sustituciones).

Tal como se describe en el presente documento, la secuencia Mtd en la fibra caudal puede diversificarse para producir una diversidad de RBD modificados o heterólogos. La secuencia de ácido nucleico que codifica Mtd comprende una región variable (VR) que puede unirse operativamente, en cis o en trans, a una región molde (TR) de tal forma que la TR sea una secuencia molde que dirija la mutagénesis de sitio específico de la VR. La unión operativa entre las regiones VR y TR también incluye un enlace operativo a secuencias que codifican una actividad de transcriptasa inversa (RT), que puede estar presente en trans en relación a la VR. Los sitios de variabilidad en la VR de Mtd corresponden a restos de adenina en la región molde generalmente homóloga, TR, que en sí es invariable y esencial para alteraciones de secuencia en la VR. Por lo tanto, aunque una molécula inicial pueda contener una TR que sea idéntica a la VR, los restos de adenina presentes en la TR darán como resultado la mutagénesis o diversificación de las posiciones correspondientes en la secuencia VR. Por lo tanto, si la secuencia de TR es una repetición directa perfecta de la secuencia en la VR, la diversificación en la VR da como resultado uno

o más restos de adenina en la VR, también encontrados en la TR, mutándose a otro nucleótido, que es citosina, timina o guanina, sin cambios en la secuencia de TR. Este sistema puede usarse para alterar la región VR y por lo tanto el RBD, de una proteína de fibra caudal tal como se describe en el presente documento.

Tras la diversificación, la proteína de fibra caudal puede variarse de tal forma que el RBD resultante tenga al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, o al menos un 95% de homología con el determinante principal de tropismo (Mtd) del bacteriófago BPP-1 de Bordetella, tal como se representa por la SEC ID Nº: 24. Tal como se describe en el presente documento, la combinación de proteína de fibra caudal y Mtd puede ser una sustitución o una inserción de una secuencia Mtd o una porción de la misma en la secuencia de proteína de fibra caudal. Por lo tanto, puede verse que la proteína de fibra caudal comprende una sustitución o inserción con un dominio de unión con al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, o al menos un 95% de homología, tal como se ha indicado anteriormente.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una combinación de fibra caudal y Mtd puede usarse para diversificación y variación de secuencia. Por lo tanto, las combinaciones de ácidos nucleicos que secuencias que codifican la totalidad o parte de una proteína de fibra caudal y la totalidad o parte de un Mtd, se encuentran dentro de las realizaciones divulgadas. Otras realizaciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier proteína de fibra caudal con un RBD modificado o heterólogo, tal como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, el RBD modificado o heterólogo codificado comprende un cambio en la secuencia de aminoácidos del RBD en relación a un RBD de origen natural o en relación al BPAR presente en la proteína de fibra caudal tal como se ha descrito anteriormente.

En realizaciones adicionales, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fibra caudal puede hacerse disponible para diversificación para formar una proteína de fibra caudal modificada divulgada en el presente documento. La molécula de ácido nucleico, bajo el control de un promotor adecuado, está situada de manera operativamente en 5' de una región atd-TR-brt. La secuencia TR puede citarse como TR' y prepararse basándose en la secuencia VR tal como se ha discutido anteriormente. La construcción de ácido nucleico resultante puede portar una eliminación de la estructura de terminador de la transcripción cadena arriba del atd.

Una región de la molécula de ácido nucleico que codifica el extremo C-terminal de la proteína de fibra caudal tal como se ha descrito anteriormente, se selecciona para que sea la VR y después se une operativamente a una secuencia TR' que contiene restos de adenina en posiciones que cuando se cambian, dirigen cambios de aminoácidos en la secuencia codificada por la VR. Dichos restos de adenina pueden diseñarse deliberadamente para que sean la primera o la segunda posición de los codones en la VR. La secuencia TR' puede ser inicialmente idéntica a la VR seleccionado seguido de mutagénesis de sitio dirigido o síntesis de ácidos nucleicos de novo para preparar una secuencia TR' que contenga restos de adenina en las posiciones correspondientes para dirigir la mutagénesis y la diversificación en la proteína de cola codificada.

Preparación y uso de bacteriocinas epm

Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden usarse para expresar y preparar proteínas de fibra caudal, incluyendo proteínas modificadas o diseñadas por ingeniería genética, por cualquier medio conocido para el experto en la materia. En algunas realizaciones, la expresión es mediante el uso de un vector que contiene la molécula de ácido nucleico unida operativamente a un promotor que puede dirigir la expresión de la proteína de cola codificada.

En muchas realizaciones, la expresión puede suceder con la expresión de un gen opcional, tal como una secuencia codificante de una "chaperona" comunicada para varias bacteriocinas y bacteriófagos. La presencia de una chaperona facilita el montaje de una bacteriocina de epm de la divulgación sin convertirse necesariamente en una

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E11154069

25-09-2015

de fibra caudal compuesta en parte de la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9. En otras realizaciones, la bacteriocina es una piocina, monocina, enterocolicina o meningocina modificada o diseñada por ingeniería genética que comprende una fibra caudal con un RBD modificado heterólogo. En muchas realizaciones, el RBD modificado heterólogo se une a un factor de virulencia o aptitud bacteriano.

En realizaciones adicionales, se divulgan bacteriocinas epm diseñadas por ingeniería genética con fibras caudales multivalentes. Se ha descubierto mediante análisis cristalográfico de rayos X que Mtd de bacteriófago de Bordetella bronchiseptica BPP-1 es un homotrímero piramidal elevadamente entrecruzado con los tres conjuntos de doce restos de aminoácidos variables que forman tres sitios de unión bastante planos en la base de la pirámide y localizados en un dominio de lectina de tipo C ("CTL") evolucionado de manera convergente. La comparación de las estructuras de cinco variantes de Mtd a una resolución de 1,5 Amstrong demostró que la conformación principal de cadena de los restos variables es estructuralmente invariable, con inserciones en el CTL y conjunto trimérico, ambas contribuyendo a la formación de un andamio estático para una presentación combinatoria de restos variables, de este modo minimizando la incidencia de mal plegamiento de la proteína (McMahon et al., 2005). Por lo tanto puede generarse una única fibra caudal para que contenga tres monómeros mixtos plegados adecuadamente ya que las estructuras de las fibras de Mtd variantes son idénticas excepto en los doce restos de aminoácidos expuestos a disolvente que no interactúan.

La estructura de la variante dominante Mtd-P1 unida a su receptor, el factor de virulencia pertactina de Bordetella, también se ha resuelto mediante cristalografía y se ha caracterizado. Uno de los monómeros de Mtd se une a un dominio estructural en pertactina; un segundo monómero idéntico del mismo Mtd se une a un dominio estructural diferente no simétrico de la misma molécula de pertactina (monomérica); un tercer monómero de Mtd permanece no unido.

Las estructuras variantes de Mtd y la interacción de unión entre Mtd y su diana, pertactina, pueden aplicarse al diseño y selección de fibras caudales multivalentes. Por ejemplo, es evidente que un monómero de Mtd puede mostrar afinidades para dos dominios estructurales diferentes y aún en formato multimérico posee suficiente avidez para efectuar la unión funcional e infección del fago. Además, no todos los monómeros de una fibra necesitan estar unidos a un receptor para proporcionar la avidez adecuada por la unión e infección del fago. Estos datos y conclusiones, junto con el conocimiento que para al menos los bacteriófagos T4, también myoviridae, solo necesitan unirse tres fibras caudales (homotriméricas) a receptores para activar la contracción de la vaina de cola y la penetración al núcleo de las membranas bacterianas, indica varios medios para generar una bacteriocina de epm multivalente. Dichas bacteriocinas epm multivalentes diseñadas por ingeniería genética tienen rangos de hospedador más amplios y son capaces de unirse a más de un solo factor de virulencia o aptitud incluso en el mismo organismo bacteriano, haciendo de este modo más difícil que las bacterias usadas como diana desarrollen resistencia mediante pérdida mutacional de la expresión de todos los receptores diana relevantes. Puede diseñarse por ingeniería genética una bacteriocina de tipo R para que contenga dos conjuntos independientes de tres fibras caudales idénticas, comprendiendo las fibras de un conjunto los mismos tres monómeros no idénticos y comprendiendo las fibras del otro conjunto tres monómeros diferentes no idénticos. Cada monómero puede poseer afinidades de unión para dos epítopos diferentes (por ejemplo, dos receptores diferentes), del mismo modo que hace Mtd. De este modo, cualquier bacteria que expresa una cualquiera o más de las 12 moléculas de receptor diferentes usadas como diana (2 "epítopos"/monómero por 3 monómeros/fibra caudal por 2 conjuntos de diferentes fibras caudales/bacteriocina de tipo R es igual a 12 receptores usados como diana) podrían unirse a la bacteriocina de epm multivalente diseñada por ingeniería genética y activar su penetración de membrana. Dichas bacteriocinas epm diseñadas por ingeniería genética tienen un intervalo de hospedador innaturalmente elevado, además, hacen elevadamente improbable que una bacteria que expresa más de un solo receptor usado como diana pueda hacerse resistente a las bacteriocinas epm diseñadas por ingeniería genética.

En otros aspectos, se proporcionan métodos para el uso de una bacteriocina de epm de la divulgación. En algunas realizaciones, se divulga un método para comprometer la integridad de la membrana citoplasmática de una bacteria. El método puede comprender poner en contacto una bacteria diana con una bacteriocina de epm, o una porción de la misma, tal como se divulga en el presente documento. Como alternativa, el contacto puede ser con una composición que contiene la bacteriocina de epm divulgada en el presente documento.

En un grupo de realizaciones, el contacto sucede in vivo en un sujeto. Por lo tanto, se divulga un método para comprometer la integridad de membrana de una bacteria en un sujeto. El método puede comprender administrar una bacteriocina de epm o una porción de la misma tal como se describe en el presente documento al sujeto. En otro grupo de realizaciones, el contacto sucede in vitro.

En otras realizaciones adicionales más, se proporciona un método para formar progenie de bacteria no virulenta o no apta a partir de bacterias progenitoras virulentas. El método puede comprender poner en contacto bacterias virulentas con una bacterocina epm que se une a un factor de virulencia o aptitud de dicha bacteria progenitora virulenta tal como se divulga en el presente documento. El método puede entonces continuar permitiendo la selección de progenie de bacterias no virulentas que ya no expresan el factor de virulencia o aptitud.

En una realización alternativa, se proporciona un método para mantener una población de bacterias no virulenta. El método puede comprender poner en contacto a la población con una bacteriocina de epm que se une a un factor de

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

respiratorio.

Tal como se describe en el presente documento, el tratamiento de un sujeto es típicamente el tratamiento de "un sujeto que necesite tratamiento". La determinación, o diagnóstico, de la necesidad de tratamiento puede efectuarse por un experto en la materia, tal como un clínico, usando medios reconocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal o una planta con una infección bacteriana que tiene potencialmente riesgo de muerte o que deteriora la salud o acorta la esperanza de vida del organismo.

En realizaciones adicionales, se proporciona un método para eliminar o inhibir el crecimiento de bacterias en una película biológica. Dicho método puede comprender poner en contacto una película biológica con una bacteriocina de epm divulgada en el presente documento que usa las bacterias en la película biológica como diana.

Tal como se describe en el presente documento, una bacteriocina de epm antibacteriana se usa para inhibir el crecimiento, supervivencia, o replicación de una bacteria particular. La bacteria puede ser una cepa patógena o ambientalmente perjudicial, o puede tratarse de manera profiláctica. Un microorganismo patógeno causa generalmente enfermedades, en ocasiones solo en circunstancias particulares.

Las bacterias pueden ser las de una infección nosocomial (hospitalaria), bacterias ambientales y bacterias piogénicas (formadoras de pus). Los métodos y composiciones de la divulgación pueden usarse para inhibir el crecimiento de bacterias nosocomiales, incluyendo bacterias que pueblas un ambiente hospitalario típico, o bacterias que están presentes en la piel humana o en el tracto gastrointestinal humano, o bacterias que infectan y forman pus en heridas. Las infecciones nosocomiales son infecciones que se hacen evidentes durante un ingreso hospitalario o están relacionadas con un procedimiento llevado a cabo en un hospital. Estas infecciones relacionadas con el procedimiento a menudo se hacen evidente después de que los pacientes hayan sido dados de alta del hospital. Las infecciones bacterianas nosocomiales más comunes son infecciones del tracto urinario, infecciones de la zona quirúrgica, neumonía, diarrea asociada con C. difficile y colitis seudomembranosa, e infecciones sistémicas graves en las que las bacterias crecen en la sangre.

Los métodos y composiciones de la divulgación pueden usarse para inhibir el crecimiento de bacterias gram negativas o gram positivas. Los ejemplos no limitantes de bacterias gram positivas incluyen Staphylococcus (piogénica), Enterococcus (oportunista), Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Corynebacterium y Clostridium. Los ejemplos no limitantes de bacterias gram negativas incluyen Pseudomonas (piogénica), E. coli (oportunista), Salmonella (oportunista), Campylobacter (oportunista), Proteus (piogénica), Klebsiella (oportunista), Enterobacter (piogénica), Citrobacter (piogénica), bacilos gram negativos no fermentadores (tales como Acinetobacter) y Shigella. Los cocos piogénicos son bacterias esféricas que causan diversas infecciones supurantes (productoras de pus) en animales. Se incluyen los cocos gram positivos Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, y los cocos gram negativos, Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis.

En realizaciones adicionales, los métodos y composiciones divulgados de la divulgación se usan para inhibir el crecimiento, particularmente de bacterias resistentes a antibióticos. Los ejemplos no limitantes incluyen numerosos patógenos bacterianos que se han hecho resistentes a diversos fármacos (MDR).

Diseño de piocinas por ingeniería genética como ejemplo representativo no limitante

Francois Jacob descubrió y describió por primera vez las piocinas como bacteriocinas de elevado peso molecular (Jacob, 1954). Se han descrito entidades similares a bacteriocinas en otras muchas bacterias gram negativas (Coetzee et al., 1968) así como en Listeria moncytogenes (Zink et al. 1995) y Staphylococcus aureus (Thompson y Pattee, 1981), los cuales son ambos organismos gram positivos. Aunque las piocinas se asemejan morfológicamente a las colas de bacteriófagos contráctiles (myoviridae), estas no son simplemente fagos defectuosos; hay diferencias significativas. Por ejemplo, existen diferencias en la estabilidad física y química entre piocinas y colas de fago (Kageyama y Egami, 1962; Nakayama et al., 2000).

Aunque los abanicos de hospedador de las piocinas son relativamente estrechos y normalmente restringidos a cepas de la misma especie, hay excepciones (Morse et al, 1976; Blackwell et al., 1982). Por otro lado, los bacteriófagos de myoviridae pueden mostrar amplios intervalos de hospedador y sus intervalos de hospedador, al igual que los de las piocinas, están determinados por las especificidades de unión de las puntas de sus fibras caudales (Tetart et al., 2001).

Para numerosas fibras caudales de fago, el tercio distal (3'-terminal) del gen varía en mutantes o variantes con intervalo de hospedador de fago alterado, o "tropismos" (Ackermann, 2003). Como ejemplo no limitante, el determinante principal de tropismo (Mtd), la proteína de unión a receptor del bacteriófago de Bordetella BPP-1, varía en secuencia ampliamente (Liu et al., 2004; Doulatov et al. 2004). La variación en Mtd depende de un retroelemento codificado por fago (retroelemento generador de diversidad, o DGR) que pertenece a una familia de DGR implicada en la generación de variación de secuencia en diversos genomas de fago y bacterianos. El DGR de Bordetella puede producir más de 1013 variantes de secuencia diferentes de Mtd, que rivalizan con las 1014-1016 posibles secuencias de los anticuerpos. Las variantes de Mtd se producen por un proceso único de mutagénesis específica de adenina que implica una transcriptasa inversa codificada por el DGR (bRT) y una región molde estable (TR). La

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

mediante el cual una bacteria puede hacerse resistente a una bacteriocina de epm es la pérdida de su receptor para la bacteriocina, el uso de un factor de virulencia o aptitud tal como se divulga en el presente documento como diana proporciona muchas ventajas frente a los antibióticos y bacteriófagos tradicionales. La resistencia a los antibióticos y bacteriófagos tradicionales puede ser el resultado de muchos mecanismos distintos de la pérdida del receptor o molécula diana para el agente antibacteriano. Como ejemplos no limitantes, una bacteriocina de epm de la divulgación no sería objeto de una bomba de salida bacteriana para eliminar la bacteriocina del ambiente celular y no sería objeto de un mecanismo de desactivación de ácido nucleico bacteriano.

Habiendo descrito de manera general la materia objeto de la invención, esta se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la divulgación, a menos que se especifique.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar la materia objeto reivindicada.

Ejemplo 1: Bacteriocinas epm modificadas que contienen una proteína de fusión

a) Sistema de complementación

Para facilitar la preparación de una bacteriocina de epm modificada tal como se describe en el presente documento, se estableció la construcción de un sistema para complementar las fibras caudales in trans. Usando la piocina R2 como modelo representativo, se usó la creación de una eliminación de la secuencia codificante prf15 de R2 en el genoma de P. aeruginosa PAO1 para crear una plataforma en la que se expresó una proteína de fibra caudal complementaria, tal como un producto génico de prf15 modificado, in trans.

Generalmente, la eliminación se efectuó mediante el método de Hoang et al. para crear la cepa Δprf15 de P. aeruginosa PAO1. La región codificante de prf16, SEC ID Nº: 4, para la chaperona de R2 se superpone al gen prf15 de R2 en 8 nucleótidos y el sitio de unión a ribosoma se encuentra dentro de la región codificante de prf15, SEC ID Nº: 3. La proteína Prf16, que no se incorpora necesariamente en la estructura de la piocina, se comunicó como necesaria para actividad máxima, para el ensamblaje de la fibra caudal trimérica (Figura 8 y Nakayama et al., 2000). Por lo tanto, se dejaron intactos tanto el sitio de inicio de la transcripción para prf16 como su sitio de unión a ribosoma de tal forma que la chaperona se produciría tras la inducción de la construcción de piocina modificada que codifica una piocina defectuosa "sin cola".

En resumen, se efectuó una eliminación de los codones 11-301 en fase de PRF15 en PAO1 del modo siguiente. Se amplificó un fragmento de Kpnl-Agel de 1,1 kb cadena arriba de la eliminación mediante PCR a partir de ADN genómico de PA01 usando los cebadores AV085 (5'-GCTTCAATGTGCAGCGTTTGC) (SEC ID Nº: 46) y AV088 (5'-GCCACACCGGTAGCGGAAAGGCCACCGTATTTCGGAGTAT) (SEC ID Nº: 47) y se amplificó un fragmento de Agel-EcoRI de 2,2 kb usando los cebadores AV087 (5'-ATACTCCGAAATACGGTGGCCTTTCCGCTACCGGTGTGGC) (SEC ID Nº: 48) y AV086 (5'-TCCTTGAATTCCGCTTGCTGCCGAAGTTCTT) (SEC ID Nº: 49). Los fragmentos de restricción resultantes se clonaron en los sitios de KpnI y EcoRI de pEX18Gm (Hoang et al) para producir pEXGm-Δprf15. La construcción terminada se transformó en una cepa de PAO1 mediante electroporación (Chuanchuen et al). Se seleccionaron los integrantes con gentamicina 100 µg/ml y los segregados se seleccionaron posteriormente en medios que contenían sacarosa 5 µg/ml y que carecían de NaCl y gentamicina. Los candidatos de eliminación se confirmaron mediante análisis PCR, inducción de piocinas y secuenciación de un fragmento amplificado mediante PCR.

La cepa PAO1 Δprf15 crece de manera similar a la de su cepa parental, PAO1 y los genes codificantes de piocina permanecen inducibles a través de la respuesta SOS, que da lugar a la lisis de la célula. Aunque parece haber algo de producción de los productos génicos de piocina, no pareció haber producción de partículas de piocina "sin cola" a partir de PAO1 Δprf15.

La piocina R2 Prf15 se expresó in trans clonando en primer lugar la secuencia codificante en el vector lanzadera de Pseudomonas/E. coli de amplio intervalo de hospedador, pUCP30T. Véase la Figura 9. En algunas construcciones iniciales, la transcripción se dirigió de manera constitutiva o bajo el control de lacI a partir del promotor tac. Pero en otras construcciones, se modificó la transcripción para que estuviese regulada con un promotor endógeno de prf15 de tal forma que la expresión estuviese regulada a través de la respuesta SOS. Esto permitió la expresión del gen prf15 modificado para que se indujese de manera sincronizada con la expresión de los otros genes de piocina residentes en el genoma de PAO1 Δprf15.

En resumen, se modificó el vector de amplio intervalo de hospedador pUCP30T (Schweizer, H.P et al) rellenando el sitio único para BspHI para formar pUCP30TΔBsp. Se amplificó un promotor tac mediante PCR a partir de un vector de expresión de Mtd (un presente de Jeffery F. Miller, UCLA) usando los cebadores AV110 (5'-TTTATTAGCGGAAGAGCCGACTGCACGGTGCACCAATG) (SEC ID Nº: 50) y AV114 (5'-CCCTCGAATTCATGAATACTGTTTCCTGTGTGAAATTG) (SEC ID Nº: 51) y después se clonó en pUCP30TΔBsp para crear pUCP-tac.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E11154069

25-09-2015

La región codificante de PRF15 de R2 se amplificó a partir de un subclon usando los cebadores AV118 (5'-CTTCCTTTCATGACGACCAATACTCCGAA) (SEC ID Nº: 52) y AV 116 (5'-ACCACGAATTCTTCATCGTCCAAATGCCTC) (SEC ID Nº: 53), mientras que los prf15 y prf16 de R2 se amplificaron usando los cebadores AV118 y AV086 (5'-TCCTTGAATTCCGCTTGCTGCCGAAGTTCTT) (SEC ID Nº: 49). Los fragmentos amplificados de prf15 y prf15/16 se clonaron en pUCPtac digerido con BspHI y EcoRI para producir pUCP-tac-prf15 y PUCP-tac-prf15/16.

Para la expresión usando el promotor endógeno de prf15, se amplificaron prf15 y prf16 junto con la secuencia de 1088 pb cadena arriba de prf15 a partir de un subclon usando los cebadores AV107 (5'-CACCATCTAGACAATACGAGAGCGACAAGTC) (SEC ID Nº: 54) y AV091 (5'-TCCTCAAGCTTACGTTGGTTACCGTAACGCCGTG) (SEC ID Nº: 55) y se clonaron en pUCP30T digerido con XbaI y HindIII para crear pUCP-R2p-prf15/16.

Las bacterias en crecimiento en suspensión en fase logarítmica y que contenían los plásmidos de expresión se trataron con 3 µg de mitomicina C/ml para inducir la producción de piocina. Se produjeron piocinas estables tras la inducción con rendimientos similares a los de PAO1 de tipo silvestre. Las piocinas tenían el mismo espectro bactericida y nivel de actividad que la piocina de R2 producida a partir de PAO1. Parece que la producción de una piocina estable compleja requiere la expresión de una proteína de fibra caudal además de la expresión de los otros genes codificantes de piocina y es suficiente la expresión de los genes de fibra caudal in trans.

Cuando se expresó prf15 de manera constitutiva a partir del promotor tac, el crecimiento celular fue destacadamente más lento que cuando se reguló mediante lacI o el promotor endógeno. Aunque parece que la producción de PRF15 solo en la célula es perjudicial, los rendimientos de piocinas generadas a partir de ambos promotores son comparables.

Se preparó una construcción de plásmido a partir de la cual se expresó conjuntamente prf16 de R2 con prf15 de R2 para asegurar la expresión temporal adecuada de prf16 para el plegamiento de PRF15 expresada in trans.

b) Bacteriocinas epm recombinantes

Tal como se describe en el presente documento, se han reconocido cinco piocinas de tipo R diferentes, basándose en sus espectros y se han denominado R1-5. Debido a que las secuencias génicas que codifican las proteínas de fibra caudal solo se conocían para R1 (SEC ID Nº: 1) y R2 (SEC ID Nº: 3), se usó PCR para aislar y secuenciar genes de fibra caudal de piocina de R3 (SEC ID Nº: 5), R4 (SEC ID Nº: 7) y R5 (SEC ID Nº: 9) junto con su chaperona afín presente en sus cepas productoras, SEC ID Nº: 6, 8 y 10, respectivamente. Los genes de chaperona de las piocinas R1 y R2 también se clonaron y secuenciaron, SEC ID Nº: 2 y 4, respectivamente. Para confirmar la hipótesis de que la fibra caudal dicta el espectro, se obtuvieron y expresaron las proteínas de fibra caudal de piocina R1, R3, R4 y R5 in trans en PAO1 Δprf15 de tal forma que se incorporarían en la estructura de piocina R2. Cada una de las cepas recombinantes resultantes se indujeron para producir piocinas y se determinó el espectro de cada una mediante ensayos de puntos, tal como se muestra en las Figuras 2 y 8.

c) Proteínas de fusión como proteínas de fibra caudal

Se creó una fusión del gen de fibra caudal de R2, prf15, y de secuencias de gen H de P2, se expresó y se usó para producir bacteriocinas epm adicionales de la divulgación. El bacteriófago P2, que infecta a muchas cepas de E. coli, tiene un gen H codificante de fibra caudal, (SEC ID Nº: 25) que tiene una similitud de secuencia significativa con prf15 de R2 (SEC ID Nº: 3), particularmente en la región codificante en el extremo N-terminal. La porción del gen H que codifica los 551 restos de aminoácidos C-terminales de la proteína de fibra caudal de P2, que es la región supuesta que confiere especificidad de diana (RBD), se fusionó a la porción de prf15 que codifica la región de placa base de unión (BPAR) de 164 aminoácidos N-terminales de R2 PRF15 para codificar una proteína de fibra caudal modificada (SEC ID Nº: 27).

El bacteriófago P2 también codifica una supuesta chaperona de fibra caudal, codificada por el gen G (SEC ID Nº: 26), similar a la codificada por prf16 de piocina R2 (SEC ID Nº: 4) y las chaperonas de muchos de los otros fagos de myoviridae. Debido a que es probable que la chaperona codificada por el gen G sea importante para el plegamiento de la porción C-terminal de la proteína de fibra caudal de P2 en la fusión, se produjeron construcciones para expresar conjuntamente el gen G de P2.

Se amplificó la porción de aminoácidos 1-164 codificantes de prf15 de R-2 a partir de un subclon usando los cebadores AV 118 y AV 127 (5'-TTCTTTAAGCTTTTCCTTCACCCAGTCCTG) (SEC ID Nº: 56) y se digirió con BspHI y HindIII. La porción del gen H de P2 que codifica los aminoácidos desde la posición 158-669 se amplificó a partir de una reserva de fago P2 (Richard Calendar) usando los cebadores AV124 (5'-CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG) (SEC ID Nº: 57) y AV126 (5'-TCCTTCGAATTCTTACACCTGCGCAACGT) (SEC ID Nº: 58). El gen H de P2 158-669 más el gen G se amplificaron usando los cebadores AV124 y AV125 (5'-CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG) (SEC ID Nº: 59). Cada uno de los productos de PCR de P2 se digirió con HindIII y EcoRI. Se creó pUCP-tac-R2-P2H clonando el fragmento de prf15 que codifica el fragmento de 1-164 aminoácidos junto con el fragmento del gen H de P2 que codifica el fragmento de 158-669 aminoácidos en pUCP-tac digerido con BspHI y EcoRI. pUCP-tac-R2-P2HG se generó

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

Claims

imagen1