BRPI0712066A2

BRPI0712066A2 - meio de contraste para ressonáncia magnética usando polietilenoglicol e método para captação de imagens de ressonáncia magnética

Info

Publication number: BRPI0712066A2
Application number: BRPI0712066-4A
Authority: BR
Inventors: Suzuki Yoshikazu; Miura Iwao; Iida Mitsuro
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2011-12-20
Also published as: CA2652264C; KR101463634B1; EP2020244B1; KR20090019842A; TWI400091B; WO2007132806A1; CN104324393A; JPWO2007132806A1; CN101448529A; JP5435940B2; EP2020244A4; AU2007250851A1; ES2454968T3; EP2020244A1; TW201336515A; CA2652264A1; TW200812624A; US20090162291A1; TWI501780B

Abstract

MEIO DE CONTRASTE PARA RESSONáNCIA MAGNéTICA USANDO POLIETILENOGLICOL E MéTODO PARA CAPTAçãO DE IMGENS DE RESSONáNCIA MAGNéTICA. Um objeto da invenção é fornecer uma técnica que é segura e quantitativa, e é capaz de obter uma imagem de ressonância magnética com um tempo de repetição curto. Um agente de contraste para ressonância magnética que com- preende um polietilenoglicol que contém ^ 13^C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, é usado para obter continuamente sinais de ressonância magnética aplican- do pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIO DE CONTRASTE PARA RESSONÂNCIA MAGNÉTICA USANDO POLIETILE- NOGLICOL E MÉTODO PARA CAPTAÇÃO DE IMGENS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a agentes de contraste para res- sonância magnética, usando polietilenoglicol, e mais particularmente, agen- tes de contraste para ressonância magnética usados para obter continua- mente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos (de preferência, 1 segun- do ou menos, mais preferivelmente 250 milissegundos ou menos, e particu- larmente de preferência 100 milissegundos ou menos). A invenção refere-se também a um método para obter sinais de ressonância magnética e um mé- todo de reprodução de imagens por ressonância magnética, usando o agen- te de contraste para ressonância magnética.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Na recente reprodução de imagens diagnosticas que utiliza a- gentes de contraste, as técnicas de reprodução de imagens que usam pósi- trons ou agentes de contraste marcados radioativamente (tais como PET, SPECT, e similares) e MRI (reprodução de imagens por ressonância magné- tica) que utiliza ressonância magnética nuclear têm estado em uso prático. Embora ela seja capaz de obter informações quantitativas sobre uma lesão usando PET ou SPECT, estas técnicas são desvantajosas pelo fato de que os agentes de contraste não podem ser estocados de forma estável porque as radioatividades dos agentes de contraste decaem com sua meia-vida.

Estas técnicas também não são desejáveis para indivíduos porque os com- postos radioativos podem ter um efeito adverso sobre o corpo humano. Por outro lado, a MRI, que mede os núcleos de isótopos estáveis, é uma técnica de reprodução de imagens que é segura para o corpo humano, pode tam- bém obviar vantajosamente a instabilidade problemática dos radioisótopos. Por estas razões, espera-se que o uso de MRI expanda ainda mais.

MRI tem empregado tipicamente 1H como os núcleos-alvo da ressonância magnética nuclear, e os agentes de contraste conhecidos para ela incluem agentes de contraste de Gd, que são compostos de coordena- ção de gadolínio (Gd), preparações coloidais de oxido de ferro superpara- magnético (SPIO), usando partículas de oxido de ferro, e similares. Estes agentes de contraste utilizam o princípio de que o tempo de atenuação de 1H da molécula de água presente em um indivíduo é encurtado para desta forma visualizar indiretamente a presença de 1H. Entretanto, a MRI que utili- za 1H como núcleos-alvo da ressonância magnética nuclear não tem uma linearidade perfeita de sinais de ressonância magnética a partir de 1H e a concentração do agente de contraste, tornando difícil obter imagens que permitem a análise quantitativa na reprodução de imagens moleculares. Quanto aos nuclídeos diferentes de um próton, os núcleos 19Fi, que são quase iguais em sensibilidade a próton, estão sendo estudados com uma visão na direção de aplicações em reprodução de imagens moleculares, u- sando MRI; entretanto, 19F não está ainda em uso prático por causa de pro- blemas tais como a dificuldade em sintetizar compostos que contêm flúor. Além disso, quando são usados agentes de contraste que usam oxido de ferro ou gadolínio, ou agentes de contraste que usam átomos tais como flú- or, sua toxicidade deve ser considerada até algum grau.

A reprodução de imagens por MRI pode ser realizada introduzin- do moléculas que contêm 13C no corpo do indivíduo, e depois medindo os sinais de ressonância magnética a partir do 13C; assim sendo, as moléculas que contêm 13C são reconhecidamente utilizáveis como agentes de contras- te para MRI. Os sinais de ressonância magnética a partir de 13C têm um ní- vel de fundo baixo no indivíduo em comparação com os sinais de 1H, e são, portanto, considerados utilizáveis para obter imagens usadas para avalia- ções quantitativas. O sinal de ressonância magnética a partir de —C, entre- tanto, é facilmente afetado pela estrutura da molécula. Portanto, quando uma pluralidade de núcleos de 13C é introduzida em uma única molécula pa- ra intensificar os sinais de ressonância magnética a partir de 13C, o desloca- mento químico de cada núcleo de 13C na molécula pode ser dispersado para baixar a precisão da medição. Além disso, anexar uma molécula que contém 13C a uma proteína com um peso molecular relativamente baixo, tal como um anticorpo, pode causar a atenuação de sinais de ressonância magnética a partir de 13C.

Além disso, a reprodução de imagens por MRI foi necessária para obter imagens de ressonância magnética em um curto período de tem- po, por exemplo, para diminuir o incômodo para o paciente; portanto, o uso de moléculas com um tempo de relaxamento T1 adequadamente curto (rela- xamento longitudinal) como agentes de contraste para MRI PE considerado eficaz. Entretanto, quando se obtém sinais de ressonância magnética usan- do uma molécula que contém 13C, o tempo de relaxamento T1 depende grandemente da estrutura molecular e similares; contudo, as moléculas com uma estrutura que tem um tempo de relaxamento T1 curto e é eficaz para obter continuamente imagens de ressonância magnética em um período de tempo curto têm sido desconhecidas.

Tendo em vista as técnicas anteriores descritas acima, o desen- volvimento de uma técnica que é altamente segura, utilizável para avalia- ções quantitativas, e capaz de obter continuamente sinais de ressonância magnética em um período de tempo curto tem sido desejado.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA A SER SOLUCIONADO PELA INVENÇÃO

É um objeto da invenção fornecer um agente de contraste que é seguro e quantitativo, e capaz de obter continuamente sinais de ressonância magnética com um tempo de repetição curto, e fornecer um método para obter sinais de ressonância magnética e um método para reproduzir ima- gens de ressonância magnética, usando o agente de contraste. MEIO PARA SOLUCIONAR O PROBLEMA

Os presentes inventores conduziram uma pesquisa extensa para solucionar o objetivo supramencionado, e descobriram que o uso de um a- gente de contraste que compreende um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que do que a abundância natural, ou um com- posto marcado com o polietilenoglicol, permite que sinais de ressonância magnética a partir de 13C sejam medidos de forma quantitativa continuamen- te pela aplicação repetida de pulsos de excitação, com um tempo de repeti- ção de 60 segundos ou menos (de preferência 1 segundo ou menos, e mais preferivelmente, 100 milissegundos ou menos), e desta forma obter imagens de ressonância magnética utilizáveis para análise quantitativa em um perío- do de tempo curto. A presente invenção foi realizada baseado nesta desco- berta e outros aperfeiçoamentos dela.

Um aspecto da invenção fornece um agente de contraste como definido abaixo.

Item 1. Um agente de contraste para ressonância magnética, que é usado para obter continuamente sinais de ressonância magnética a- plicando pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos;

o agente de contraste para ressonância magnética compreende um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural ou um composto marcado com o polietilenoglicol.

Item 2. O agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com o Item 1, onde a proporção de 13C no polietilenoglicol é entre 20 e100% dos átomos de carbono totais.

Item 3. O agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com o Item 1, onde o polietilenoglicol tem um peso molecular ponde- rai médio de 470 a 10.000.000.

Item 4. O agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com o Item 1, onde o composto é um anticorpo marcado com o polie- tilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundân- cia natural.

Outro aspecto da invenção fornece um método de ressonância magnética como definido abaixo.

Item 5. Um método para reproduzir imagens de ressonância magnética que compreende aplicar a um indivíduo que recebeu a adminis- tração de um agente de contraste para ressonância magnética que compre- ende um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos, obtendo desta forma continuamente sinais de res- sonância magnética para obter uma imagem.

Item 6. O método de reprodução de imagens por ressonância magnética, de acordo com o Item 5, onde a proporção de 13C no polietileno- glicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

Item 7. O método para reproduzir imagens de ressonância mag- nética, de acordo com o Item 5, onde o polietilenoglicol tem um peso mole- cular ponderai médio de 470 a 10.000.000.

Item 8. O método de reprodução de imagens de ressonância magnética, de acordo com o Item 5, onde o composto é um anticorpo mar- cado com o polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural.

Ainda outro aspecto da invenção fornece um método para obter sinais de ressonância magnética, como definido abaixo.

Item 9. Um método para obter sinais de ressonância magnética, compreendendo aplicar a um indivíduo que recebeu um agente de contraste para ressonância magnética que compreende um polietilenoglicol que con- tém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, pulsoss de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos, obten- do desta forma continuamente sinais de ressonância magnética.

Item 10. O método, de acordo com o Item 9, onde a proporção de 13C no polietilenoglicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

Item 11.0 método, de acordo com o Item 9, onde o polietileno- glicol tem um peso molecular ponderai médio de 470 a 10.000.000.

Item 12. O método, de acordo com o Item 9, onde o composto é um anticorpo marcado com o polietilenoglicol que contém 13C em uma pro- porção mais alta do que a abundância natural.

Ainda outro aspecto da invenção fornece o uso de um polietile- noglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural ou um composto marcado com o polietilenoglicol, como definido a- baixo.

Item 13. Uso de um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, para a produção de um agente de contraste de res- sonância magnética usado para obter continuamente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos para obter imagens.

Item 14. O uso, de acordo com o Item 13, onde a proporção de 13C no polietilenoglicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

Item 15. O uso de acordo com o Item 13, onde o polietilenoglicol tem um peso molecular ponderai médio de 470 a 10.000.000.

Item 16. O uso de acordo com o Item 13, onde o composto é um anticorpo marcado com o polietilenoglicol que contém 13Ciem uma proporção mais alta do que a abundância natural.

Item 17. Uso de um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol para obter continuamente sinais de ressonância mag- nética, a fim de obter uma imagem aplicando pulsos de um campo magnéti- co de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos.

Item 18. O uso de acordo com o Item 17, onde a proporção de 13C no polietilenoglicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

Item 19. O uso de acordo com o 17, onde o polietilenoglicol tem um peso molecular ponderai médio de 470 a 10.000.000.

Item 20. O uso de acordo com o Item 17, onde o composto é um anticorpo marcado com o polietilenoglicol que contém 13C em uma propor- ção mais alta do que a abundância natural.

EFEITOS DA INVENÇÃO

O agente de contraste da presente invenção torna possível obter sinais de ressonância magnética altamente precisos mesmo quando pulsos de excitação são aplicados com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos (de preferência 1 segundo ou menos, mais preferivelmente 250 milis- segundos ou menos, e particularmente de preferência 100 milissegundos ou menos), e é portanto útil para obter imagens de ressonância magnética níti- dos em alta velocidade.

Muito embora o polietilenoglicol para uso no agente de contraste da invenção contenha uma pluralidade de núcleos de 13C, o deslocamento químico de cada núcleo de 13C não é dispersado e se concentra em um des- locamento químico, permitindo a obtenção de sinais de ressonância magné- tica altamente precisos. Além disso, o agente de contraste da invenção utili- za sinais de ressonância magnética de 13C1 que têm um baixo nível de fundo no indivíduo, em comparação com os sinais de 1H, permitindo assim a ob- tenção de imagens que permitem avaliações quantitativas.

Além disso, o polietilenoglicol que contém 13C em uma propor- ção mais alta do que a abundância natural, mesmo quando ele está anexado a outros compostos com alto peso molecular, tais como proteínas e simila- res, dificilmente afeta os sinais de ressonância magnética. Conseqüente- mente, a presente invenção permite, por exemplo, o diagnóstico, determina- ção, e visualização como descrito nos Itens (1) a (4) que se seguem a serem realizados em um período de tempo curto.

(1) O polietilenoglicol é anexado a um anticorpo que reconhece especifi- camente uma lesão específica, e o composto resultante é usado como

um agente de contraste para visualizar a lesão a fim de fazer o diag- nóstico.

(2) O polietilenoglicol é anexado a um anticorpo que reconhece especifi- camente células específicas, e o composto resultante é usado como um agente de contraste para visualizar a dinâmica das células in vivo.

(3) O polietilenoglicol ou um composto que tem o polietilenoglicol anexado a ele é incorporado em uma preparação de DDS, tal como uma prepa- ração de lipossoma, e a preparação resultante é administrada para de- terminar grau de acumulação da preparação no sítio-alvo.

(4) Um polietilenoglicol que contém 13C é administrado diretamente a um ser humano para permitir que o polietilenoglicol acumule em um órgão

ou sítio específico, por um certo período de tempo, e desta forma, visu- alizar o órgão ou sítio específico. Além disso, devido ao fato de que o agente de contraste da in- venção usa 13C, ele é altamente seguro e estável mesmo depois de passar um tempo, e em comparação com agentes de contraste que contêm com- postos radioativos, como utilizados em PET, SPECT, etc.; e portanto, o agen- te de contraste permite vantajosamente que uma longa extensão de tempo para a reprodução de imagens por ressonância magnética.

MELHOR MODO PARA CONDUZIR A INVENÇÃO

O agente de contraste da invenção compreende um polietileno- glicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância na- tural (aqui doravante referido como "13C-PEG"), ou um composto marcado com o 13C-PEG.

O 13C-PEG para uso na invenção pode ser qualquer um que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural (isto é, cerca de 1% ou mais dos átomos de carbono totais). Para intensificar a sen- sibilidade da detecção de sinais de ressonância magnética, a proporção de 13C nos átomos de carbono totais é entre 20 e 100%, de preferência 50 a 100%, mais preferivelmente 90 a 100%, e particularmente de preferência quase 100%. O polietilenoglicol é constituído da unidade repetida - CH2CH2O-, e tem o mesmo ambiente químico para todos os átomos de car- bono. Portanto, o polietilenoglicol é vantajoso pelo fato de que, mesmo se existe uma pluralidade de núcleos de 13C em uma molécula, o deslocamento químico de cada núcleo de 13C não é dispersado e se concentra em um des- locamento químico, permitindo a detecção de sinais de ressonância magné- tica intensificados.

O peso molecular do 13C-PEG para uso na invenção nõ é limita- do, e pode ser ajustado adequadamente de acordo com a proporção de 13C e similares. Por exemplo, quando a proporção de 13C é baixa, o peso mole- cular do 13C-PEG é de preferência alto, enquanto que quando a proporção de 13C é alta, o peso molecular de 13C-PEG pode ser baixo. Um exemplo de 13C-PEG para uso na invenção é um 13C-PEG com um peso molecular pon- derai médio de 470 a 10.000.000, e de preferência 6.000 a 2.000.000.

Embora o 13C-PEG descrito acima possa ser usado ele próprio, um compost marcado com o 13C-PEG (aqui doravante referido como "com- posto de 13C-PEG modificado") também pode ser usado. O termo "compost de 13C-PEG modificado" neste caso denota um composto ao qual o 13C-PEG está anexado diretamente ou por intermédio de um grupo ligante. Nesses compostos de 13C-PEG modificados, os exemplos de compostos marcados com (anexados) 13C-PEG incluem anticorpos tais como anticorpos monoclo- nais e anticorpos policlonais; os fragmentos Fab destes anticorpos; proteínas séricas tais como albumina e transferrina; proteínas farmacologicamente ativas tais como interferon, eritropoietina, interleucina, M-CSF, G-CSF1 insuli- na, e adipocina; compostos de baixo peso molecular tais como EP-1873 (E- pix Pharma), Azul de Evans, Vermelho do Congo, tioflavina-S, (E,E)-1- bromo-2,5-bis-(3-hidróxi-carbonil-4-hydróxi)-estiril-benzeno (BSB), e (E1E)-I- flúor-2,5-bis-(3-hidróxi-carbonil-4-hidróxi)-estiril-benzeno (FSB); compostos que formam Iipossomas capazes de encerrar produtos farmacêuticos; etc. Por exemplo, um composto de 13C-PEG modificado que tem um anticorpo capaz de se ligar especificamente a uma lesão específica (tal como, por e- xemplo, câncer, arteriosclerose, ou inflamação) anexado a ele pode visuali- zar a lesão específica. Além disso, o uso de um composto de 13C-PEG modi- ficado que tem uma proteína farmacologicamente ativa anexada a ele permi- te que o grau de acumulação da proteína farmacologicamente ativa no sítio- alvo seja tratado.

O composto de 13C-PEG modificado é preparado anexando 13C- PEG a um composto a ser marcado,de acordo com um processo conhecido.

Quando o composto a ser marcado tem um grupo amino (mais especificamente, quando o composto é um anticorpo ou proteína farmacolo- gicamente ativa), um exemplo apropriado de um processo inclui converter o polietilenoglicol em um éster ativado, usando N-hidróxi-succinimida (NHS) para formar uma ligação amida com o composto a ser marcado.

No composto de 13C-PEG modificado, o número de 13C-PEGs anexados ao composto a ser marcado não é limitado, desde que a atividade desejada do composto a ser marcado não seja prejudicada. Por exemplo, o composto de 13C-PEG modificado pode ter um ou mais 13C-PEGs anexados ao composto a ser marcado.

O agente de contraste da invenção é preparado dissolvendo o 13C-PEG ou o composto de 13C-PEG modificado em um solvente farmacolo- gicamente ou quimicamente aceitável, tal como uma solução salina, um tampão de fosfato isotônico, ou similares. A concentração do polietilenoglicol ou do composto de 13C-PEG modificado no agente de contraste pode ser adequadamente ajustada de acordo com o método de formação de imagens, com o método de medição, local a ser medido, e similares. Por exemplo, a concentração do 13C-PEG ou do composto de 13C-PEG modificado pode ser entre 0,0001 e 100% em peso, de preferência 0,001 a 50% em peso, e mais preferivelmente, 0,01 a 10% em peso, baseado na quantidade total do agen- te de contraste.

O agente de contraste da invenção pode compreender ainda, além dos componentes descritos acima, aditivos tais como um auxiliar de solubilização, um emulsificante, um modificador de viscosidade, um tampão, e similares.

O agente de contraste é administrado a um indivíduo por via in- travenosa, subcutânea, intramuscular, oral, ou por intermédio de outras vias. A dose do agente de contraste é ajustada de acordo com o teor de 13C do 13C-PEG ou do composto de 13C-PEG modificado, o sítio a ser medido, u- sando reprodução de imagens por ressonância magnética, e similares. Por exemplo, a dose do agente de contraste pode ser ajustada de tal modo que o número de átomos de 13C do 13C-PEG ou do composto de 13C-PEG modi- ficado no sítio a ser medido é entre 1x10"12 mol ou mais, de preferência 1x10 8 mol ou mais, e mais preferivelmente, 1x10'6 mol ou mais, por 1 cm3.

O agente de contraste da invenção é usado para obter continu- amente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de um campo magnético de excitação (ondas de RF) com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos. O termo "tempo de repetição" (TR) neste caso refere- se à extensão total de tempo necessária para uma única seqüência de pul- sos. Especificamente, TR refere-se ao intervalo de tempo desde o início de uma seqüência de pulsos até o início da próxima seqüência de pulsos na obtenção repetitiva do sinal de ressonância. O 13C-PEG ou o composto de 13C-PEG modificado no agente de contraste da invenção apresenta vantajo- samente um tempo de relaxamento T1 curto, permitindo assim que as ima- gens de ressonância magnética sejam obtidas continuamente, com o tempo de repetição ajustado tão curto quanto descrito acima. Para obter continua- mente sinais de ressonância magnética em uma velocidade ainda mais alta, o agente de contraste da invenção permite que o tempo de repetição seja ajustado de preferência em 1 segundo ou menos, mais preferivelmente 250 milissegundos, e particularmente de preferência entre 60 e 100 milissegun- dos. O agente de contraste permite assim um tempo de repetição curto e a obtenção contínua de sinais de ressonância magnética, tornando-o apropri- ado para uso em reprodução de imagens em alta velocidade.

Os sinais de ressonância magnética obtidos usando o agente de contraste podem ser usados diretamente para um diagnóstico e similares.

Os sinais de ressonância magnética podem ser também conver- tidos em imagens de ressonância magnética que podem ser usados para vários diagnósticos.

Outras condições para obter sinais de ressonância magnética usando o agente de contraste da invenção, tais como o tempo de duração do pulso de uma campo magnético de excitação ou o método de medição dos sinais de ressonância magnética, podem ser selecionadas adequada- mente a partir das condições empregadas genericamente para obter sinais de ressonância magnética. No caso de reprodução de imagens com sinais de ressonância magnética, as condições podem ser selecionadas adequa- damente entre aquelas empregadas genericamente para obter imagens de ressonância magnética.

Conseqüentemente, o agente de contraste da invenção pode ser aplicado a m'todos de reprodução de imagens conhecidos e, mais especifi- camente, métodos tais como reprodução de imagens por deslocamento químico, reprodução de imagens por deslocamento químico com detecção de prótons de 13C, método de eco spin rápido, método de gradiente de eco, e similares. EXEMPLOS

A presente invenção será descrita detalhadamente abaixo fa- zendo referência aos exemplos; entretanto, a invenção não está limitada a estes exemplos. Nos exemplos que se seguem, a proporção (%) fornecida antes da notação "13C-PEG" refere-se à proporção de 13C no 13C-PEG por átomos de carbono totais. O valor numérico fornecido depois da notação "13C-PEG" refere-se ao peso molecular do 13C-PEG.

Exemplo 1

Os experimentos que se seguem foram conduzidos para exami- nar as características espectrais de RMN de 13C-PEGs. 13C-PEG6000 (aqui doravante "99%13C-PEG6000", adquirido na Cambridge Isotope Laboratori- es, Inc. (CIL)), no qual quase todos os átomos de carbono são 13C, foi dis- solvido em água pesada (D2O) até uma concentração de 2,2 mg/mL, e o es- pectro de RMN da amostra resultante foi medido. Além disso, o 13C- PEG6000 que contém 13C na abundância natural (1%) (aqui doravante "1 %13C-PEG6000") foi dissolvido em água pesada (D2O) até uma concentra- ção de 2,2 mg/mL,e o espectro de RMN da amostra resultante foi medido.

O espectrômetro de RMN e as condições das medições foram as seguintes:

Sistema: um espectrômetro de RMN de alta resolução

Console: Varian Unity INOVA

Magneto: Oxford 300 MHz

Condições de Medição: freqüência observada: 75 MHz, temperatura medida: 23°C, um método de único pulso (desacoplamento de prótons), retardamen- to da obtenção: 1 s., medido com pulsos de 45°

Os resultados estão ilustrados na Figura 1. Embora 99%13C- PEG6000 seja uma macromolécula, ele apresentou um sinal de RMN muito nítido (vide Figura. 1a). Além disso, 99%13C-PEG6000 tem o mesmo ambi- ente químico para todos os átomos de carbono, permitindo que seus deslo- camentos químicos se concentrem em um ponto, resultando em uma alta intensidade dos sinais. Por outro lado, 1%13C-PEG6000 com uma concen- tração 10 vezes mais alta do que aquela de 99%13C-PEG6000 apresentou uma intensidade de sinais de cerca de um décimo daquela de 99%13C- PEG6000. Isto confirmou que a intensidade dos sinais derivados de 13C é proporcional ao número de núcleos de 13C, e é extremamente quantitativa.

Exemplo 2

99%13C-PEG6000 foi dissolvido em solvente água pesada (D2O) até uma concentração de 2,5 mg/mL, e usando a amostra resultante, o efeito de reduzir um intervalo do retardamento da obtenção que se segue à radiação de pulsos (pulsos de 90°) e obtenção de FID (1,3 s) (o tempo ne- cessário para completar o tempo de obtenção do eco para a próxima excita- ção; tempo morto; retardamento de obtenção) sobre a intensidade do sinal foi examinado sob as condições de medição indicadas abaixo. Para compa- ração, 13C-ácido pirúvivo (piruvato de sódio (1-13C, 99%), da CIL) foi dissol- vido em água pesada até uma concentração de 25 mg/mL, e uma glicose na qual o carbono da posição 1 é 13C (D-Glicose (1-13C, 99%), da CIL; aqui do- ravante referida como "13C-glicose") foi dissolvido em a'gua pesada até uma concentração de 2,2 mg/mL. Cada uma destas soluções resultants foi testa- da como amostras da mesma maneira que acima.

Sistema: um espectrômetro de RMN de alta resolução

Console: Varian Unity INOVA

Magneto: Oxford 300 MHz

Condições de Medição: freqüência observada: 75 MHz, temperatura medida: 23°C, um método de um único pulso (desacoplamento de prótons), medido com pulsos de 45°

Os resultados estão ilustrados nas Figuras 2 e 3. Como ilustrado na Figura 2a, com o 13C-ácido pirúvivo, a intensidade do sinal diminui abrup- tamente reduzindo o retardamento da obtenção até 60 segundos ou menos. Por isso é que o tempo de relaxamento T1 do 13C-ácido pirúvico é muito lon- go (o tempo de relaxamento T1 do carbono ao qual os prótons não estão anexados diretamente é longo). Em contraste, com 99%13C-PEG6000, como ilustrado nas Figuras 2b e 3b, muito embora o intervalo de retardamento da obtenção tenha sido reduzido até cerca de 20 ms, a intensidade do sinal difi- cilmente diminuiu. Acredita-se que isto se deve ao fato de que o tempo de relaxamento T1 de 99%13C-PEG6000 é relativamente curto.

Com 13C-glicose, os sinais para o carbono dos isômeros D e D da glicose foram observados. Devido ao fato de que ambos isômeros têm prótons ligados de forma diretamente covalente a ele, os tempos T1 destes isômeros são mais curtos do que aquele do ácido pirúvico. Assim sendo, embora o intervalo de retardamento da obtenção fosse reduzido, não havia um decréscimo abrupto como observado no ácido pirúvico em um intervalo de 60 segundos ou menos. Contudo, as intensidades dos sinais para o car- bono da posição 1 de ambos isômeros DeD apresentaram decréscimos devido aos intervalos de retardamento da obtenção encurtados (vide Figura 3a). A soma das intensidades dos sinais do carbono de ambos isômeros D D da glicose apresentou um decréscimo de 21% quando o intervalo de retar- damento da obtenção foi reduzido de 200 segundos para 20 milissegundos, enquanto que a intensidade do sinal de 99%13C-PEG6000 oapresentou ape- nas um pequeno decréscimo de 3,9%. Portanto, o fenômeno observado em 99%13C-PEG6000, que a intensidade do sinal não diminui reduzindo o inter- valo de retardamento da obtenção para 20 milissegundos, acredita-se que seja devido ao tempo de relaxamento T1 característico de 13C-PEG.

Exemplo 3

99%13C-PEG6000 foi dissolvido em água pesada (D2O) solven- te até uma concentração de 2,5 mg/mL, e usando a amostra resultante, o efeito de aplicação de pulsos com um tempo de repetição de 60 a 200 milis- segundos sobre a intensidade do sinal foi examinado usando um sistema de MRI em uma força do campo de 7 Tesla, sob as condições indicadas abaixo. Para comparação, 13C-glicose foi dissolvida em água pesada até uma con- centração de 2,2 mg/mL, e a amostra resultante foi testada similarmente.

Sistema: um sistema MRI (força do campo: 7 Tesla)

Console: Varian Unity INOVA

Magneto: JASTEC 7T

Condições de Medição: freqüência observada: 75 MHz1 temperatura medida: 23°C, um método de um único pulso (desacoplamento de prótons), medido com pulsos de 40° Os resultados estão ilustrados na Figura 4. Como fica evidente a partir da Figura 4, nas médicos que usam pulsos de 40°, a intensidade do sinal da glicose apresentou um decréscimo de cerca de 30% quando o inter- valo pulsos foi reduzido de 200 milissegundos para 100 milissegundos, en- quanto que a intensidade do sinal de 99%13C-PEG6000 apresentou um de- créscimo de apenas cerca de 4%, mesmo quando o intervalo de pulsos foi reduzido para 100 milissegundos. Estes resultados revelaram que também em um sistema MRI1 a capacidade de 13C-PEG6000 para encurtar o tempo de repetição pode ser utilizada.

Exemplo 4

IgG foi marcada com 1%13C-PEG5000NHS e 1%13C- PEG20000NHS (ambos da Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), que foram obtidos convertendo um grupo hidroxila terminal de 1% 13C-PEG em um grupo NHS. Depois da reação de marcação, o produto resultante foi submetido a etapas de purificação usando filtração em gel e uma coluna de Proteína A, para des- ta forma remover 1%13C-PEG não-reagido (vide Figura 5a). Como fica evi- dente a partir da imagem de SDS-PAGE ilistrada na Figura 5a, várias ban- das foram observadas na faixa de alto peso molecular, confirmando que 1%13C-PEG tinha sido realmente marcado em IgG por intermédio de uma ligação covalente.

A IgG marcada com 1%13C-PEG5000 assim obtida foi dissolvida em água pesada até uma concentração de 14,1 mg/mL, e a IgG marcada com 1%13C-PEG20000 foi dissolvida em a'gua pesada até uma concentra- ção de 5,1 mg/mL. O espectro de RMN de cada uma das amostras resultan- tes foi então medido. O espectrômetro de RMN e as condições de medição foram as seguintes:

Sistema: um espectrômetro de RMN de alta resolução

Console: Varian Unity INOVA

Magneto: Oxford 300 MHz

Condições de Medição: freqüência observada: 75 MHz, temperatura medida: 23°C, um método com um único pulso (desacoplamento de pró- tons),retardamento da obtenção: 1 s, medido com pulsos de 45° Os resultados estão ilustrados nas Figuras 5b e 6. Como fica evidente a partir da Figura 5b, confirmou-se que 1%13C-PEG5000 e 1%13C- PEG20000 anexados a IgG, da mesma forma que com os casos não anexa- dos a IgG, apresentaram sinais muito nítidos que se concentraram em um deslocamento químico. Além disso, como pode ser observado a partir da Figura 6, a meia-amplitude do sinal de 1%13C-PEG5000 foi dificilmente afe- tada pela anexação de 1%13C-PEG5000 a IgG. Estes resultados revelaram que anexar PEGs a proteínas macromoleculares, tais como IgG, não causa problemas tais como intensidade reduzida do sinal de PEG, espectros ampli- ados, etc.

Exemplo 5

A mudança na intensidade e meia-amplitude de um sinal de RMN junto com um aumento no peso molecular do PEG molecular foi exa- minada usando PEGs que contêm 13C em abundância natural (1%). Três tipos de PEGs, com pesos moleculares médios de 35.000, 500.000, e 2.000.000, foram usados. As medições espectrais da RMN foram conduzidas usando um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de alta resolu- ção. As condições de medição foram as seguintes. Sistema: JEOL JNM-ECA500

Magneto: Oxford (11.7 Tesla, 500 MHz)

Condições de Medição

Freqüência observada: 125 MHz

Temperatura: 25°C

Amplitude observada: 31 KHz

Ponto de Dados: 32 K

Seqüência de pulsos: desacoplamento de um único pulso

Ângulo de Inclinação (flip): 45°

Retardamento da Obtenção: 2 s

Tempo de Obtenção de Dados: 1 s

Os resultados estão ilustrados na Figura 7. Todos PEGs com diferentes pesos moleculares tinham concentração de 0,5 mg/mL (solvente: D2O). 13C-alanina 0,5 mM (da CIL, o carbono do ácido carboxílico é 13C) foi adicionada a cada amostra como um controle internol, e depois as medições foram conduzidas. O sinal do carbono do ácido carboxílico da 13C-alanina foi observado em 176,5 ppm, e os sinais de todos PEGs com diferentes pesos moleculares foram observados perto de 69,5 ppm (com um desvio de cerca de 0,1 ppm, dependendo do peso molecular). O sinal de cada PEG foi muito nítido, e a medição da meia-amplitude do sinal de RMN de cada PEG reve- lou que PEG35.000, PEG500.000, e PEG2.000.000 apresentaram meias- amplitudes de 2,99, 3,03, e 3,25 Hz, respectivamente, apresentando que a meia-amplitude dificilmente mudou, muito embora o peso molecular tenha aumentado. Quando a intensidade do sinal de RMN de cada PEG foi avalia- da em termos de altura do sinal, presumindo o sinal do ácido carboxílico de 13C-alanina como sendo 1, cada um dos PEGs apresentou uma intensidade de sinal (uma altura de pico) entre cerca de 8 e cerca de 10, e não houve diferença significativa na intensidade do sinal (altura de pico) devido a dife- renças do peso molecular entre as soluções dos PEGs das amostras com a mesma concentração ponderai (Figuras 7a, 7b, e 7c). Especificamente, de- monstrou-se experimentalmente que muito embora o PEG tenha um peso molecular tão alto quanto cerca de 2.000.000, a intensidade do sinal de RMN do carbono na molécula não é em nada atenuada. Em termos de concentra- ção molar, as concentrações das amostras de PEG35.000, PEG500.000, e PEG2.000.000 foram 14,2 DM1 1,0 DM1 e 0,25 DM, respectivamente. Quan- do a altura do sinal por molécula de cada PEG foi avaliada baseado nestas concentrações molares, presumindo a altura do sinal de 13C-alanina como sendo 1, as alturas dos sinais de PEG35.000, PEG500.000, e PEG2.000.000 foram calculadas como sendo 283, 4.000, e 19.400, respectivamente. O re- sultado demonstra que a intensidade do sinal (altura de pico) aumentou de forma substancialmente proporcional ao peso molecular do PEG. Estes re- sultados revelaram que a intensidade do sinal (altura de pico) do sinal de RMN de PEG aumenta de forma substancialmente proporcional ao peso mo- lecular do PEG, desde que a viscosidade da solução não precise ser consi- derada.

Exemplo 6 99% 13C-PEG6.000 foi dissolvido em água pura (H2O) até uma concentração de 33 mg/mL, e a solução foi usada como amostra. 0,1 mLda amostra foi injetado no músculo temporal de ratos (ratos SD machos com 14 semanas de idade, adquiridos na CLEA Japan), e as imagens de MRI foram obtidas sob as seguintes condições.

Sistema: console de RM Varian Unity INOVA, magneto: JASTEC 7T

Seqüência de pulsos: próton desacoplado 13C 2D reprodução de imagens por deslocamento químico (nenhuma seleção de fatia)

Fase codificadora: 8x8

Campo de fotografia (FOV): 50x50 mm2

Tempo de repetição: 1 s

Matriz: 32x32

Número de acumulação: oito

Tempo total de medição: 8 min, 32 s

Os resultados estão ilustrados na Figura 8. Estes resultados con- firmaram que 99% 13C-PEG6.000 torna possível obter imagens nítidas no músculo temporal de ratos e visualizá-las, mesmo quando o tempo de repe- tição é tão curto quanto 1 segundo.

Exemplo 7

99% 13C-PEG6.000 foi dissolvido em solução salina até 0,05 mg/mL, 0,5 mg/mL, ou 5 mg/mL, e 1 mL de cada uma destas amostras foi adicionado a cubetas de 1 cm2. As imagens de MRI das cubetas que contêm cada solução de 99%13C-PEG6.000 foram obtidas sob as condições indica- das abaixo. Para compação, as imagens de MRI foram obtidas similarmente usando uma solução salina que contém 10% em peso de 13C-glicose ou uma solução salina sem nada.

Sistema: Console de RM Varian Unity INOVA, magneto: JASTEC 7T

Fase codificadora: 8x8

Campo fotográfico (FOV): 50x50 mm2

Matriz: 32x32 Tempo de repetição: 250 milissegundos

Número de acumulação: 128

Tempo total de medição: 34 min

Os resultados estão ilustrados na Figura 9. Como pode ser ob- servado a partir da Figura 9, as soluções de 99%13C-PEG6.000 a 5 mg/mL e 0,5 mg/mL contidas em cubetas de 1 cm2 foram visualizadas com um con- traste suficiente. Por outro lado, a solução de 99%13C-PEG6.000 a 0,05 mg/mL apresentou um decréscimo considerável na razão de sinal para inter- ferência (ruído), mas foi contudo visualizada até um grau de tal modo que as posições das cubetas que contêm 99%13C-PEG6.000 pudessem ser sufici- entemente observadas.

Exemplo 8

Usando soluções aquosas de 99%13C-PEG6.000, as imagens de MRI foram obtidas usando alguns métodos de reprodução de imagens e as imagens resultantes foram comparadas. Mais especificamente, 99%13C- PEG6.000 foi dissolvido em água pura (H2O) até uma concentração de 30 mg/mL ou 5 mg/mL, e cubetas de 1 cm3 foram carregadas com uma destas soluções, e depois as suas imagens foram obtidas. Quatro tipos de métodos de reprodução de imagens, isto é, reprodução de imagens com deslocamen- to químico de 13C (13C-CSI), reprodução de imagens por deslocamento quí- mico de 13C com detecção de prótons (13C-CSI detectado com 1H), gradien- te de eco de 13C (13C-GRE), e eco de spin rápido de 13C (13C-FSE), foram empregados. A reprodução de imagens usando cada um destes métodos foi realizada sob as seguintes condições.

13C-CSI: matriz: 8x8, FOV: 50x50 mm2, tempo de repetição: 1 s, tempo de medição: 128 s

13C SCI detectado com 1H: matriz: 8x8, FOV: 50x50 mm2, tempo de repeti- ção: 1 s, tempo de medição: 128 s

13C-GRE: matriz: 64x64, FOV: 50x50 mm2, tempo de repetição: 30 ms, tem- po de medição: 123 s, desacoplamento de prótons

13C-FSE: matriz: 32x32, FOV: 50x50 mm2, tempo de repetição: 1 s, trem do eco: 8, espaço do eco: 5 ms, obtenção central, tempo de medição: 64 s, de- sãcoplamento de prótons

Os resultados estão ilustrados na Figura 10. A Figura 10a ilustra uma imagem obtida usando o método de reprodução de imagens por deslo- camento químico de 13C (13C-CSI); a Figura 10b ilustra uma imagem obtida usando a reprodução de imagens com deslocamento químico de 13C e de- tecção de prótons (13C-CSI detectado por 1H); a Figura 10c ilustra uma ima- gem obtida usando o método de gradiente de eco de 13C (13C-GRE); e a Fi- gura 10d ilustra uma imagem obtida usando o método de eco de spin rápido de 13C (13C-FSE). Cada uma das imagens ilustradas nas Figuras 10a a 10d inclui uma cubeta superior carregada com a solução a 5 mg/mL de 99%13C- PEG6.000 e uma cubeta inferior carregada com a solução a 30 mg/mL de 99%13C-PEG6.000.

Embora cada uma das cubetas carregadas com a solução a 5 mg/mL ou 30 mg/mL de 99%13C-PEG6.000 foi visualizada, a solução a 30 mg/mL foi confirmada como sendo visualizada mais claramente sob as con- dições de reprodução de imagens em período curto como neste caso. Uma comparação entre 13C-CSI (Figura 10a) e 13C-CSI detectada com 1H (Figura 10b) não indicou uma diferença significativa em termos de razão de de sinal para interferência (ruído) (SN), resolução, e similares. Por outro lado, as i- magens obtidas usando 13C-GRE e 13C-FSE permitiram reconhecer clara- mente o formato quadrado das cubetas. Estes resultados confirmaram que as medições usando 13C-GRE e 13C-FSE permitem a obtenção de imagens de alta resolução em um período integral igual ou mesmo mais curto, em comparação com 13C-CSI e 13C-CSI detectada com 1H. Os resultados pre- cedentes demonstram que quando 13C-PEG é usado como agente de con- traste, imagens de alta resolução podem ser obtidas em um tempo mais cur- to aplicando adequadamente um método tal como 13C-GRE ou 13C-FSE.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama que ilustra os espectros de 13C-RMN de 99%13C-PEG6.000 (2,2 mg/mL) e 1%13C-PEG6.000 (22 mg/mL) medidos no Exemplo 1.

A Figura 2 é um diagrama que ilustra os resultados das medi- ções feitas no Exemplo 2, isto é, a relação entre a intensidade do sinal de 13C-RMN e o retardamento de obtenção para cada um entre 13C-ácido pirú- vivo e 99%13C-PEG6.000.

A Figura 3 é um diagrama que ilustra os resultados das medi- ções feitas no Exemplo 2, isto é, a relação entre a intensidade do sinal de 13C-RMN e o retardamento de obtenção para cada um entre 13C-glicose e 99%13C-PEG6.000.

A Figura 4 é um diagrama que ilustra os resultados das medi- ções feitas no Exemplo 3, isto é, as intensidades dos sinais de 13C-RMN de 13C-glicose e 99%13C-PEG6.000 quando o tempo de repetição foi variado entre 60 e 960 milissegundos, usando pulsos de 40°.

A Figura 5a ilustra uma fotografia da eletroforese em gel de poli- acrilamida SDS (SDS-PAGE) de amostras de IgG marcada com 1%13C- PEG20.000, obtidas em várias etapas de purificação, onde a fileira mais à esquerda iluustra o marcador de peso molecular, a fileira subseqüente ilustra IgG não-marcada IgG ("IgG" na figura), a fileira subseqüente ilustra IgG mar- cada com 1%13C-PEG20.000 filtrada em gel (Sephacryl S-200; Pharmaci- aDdepois da reação de marcação ("gelfilt" na figura), e a fileira subseqüente ilustra IgG marcada com 1%13C-PEG20.000 obtida por purificação de afini- dade da amostra filtrada em gel, usando uma coluna de Proteína A ("Pro A" na figura); e a Figura 5b ilustra os resultados dos espectros em 13C-RMN de IgG marcada com 1%13C-PEG5.000 e IgG marcada com 1%13C-PEG20.000, medidos no Exemplo 4.

A Figura 6 ilustra diagramas que comparam as meias-amplitudes dos sinais de IgG marcada com 99%13C-PEG6.000 e 1%13C-PEG5.000.

A Figura 7 ilustra diagramas que indicam os espectros de RMN obtidos no Exemplo 5, onde a Figura 7a ilustra o espectro de RMN de 1 %13C-PEG35.000, 0,5 mg/mL (14,2 DM); a Figura 7b ilustra os espectros de RMN de 1%13C-PEG500.000, 0,5 mg/mL (1,0 dM); e a Figura 7c ilustra o espectro de RMN de 1%13C-PEG2.000.000, 0,5 mg/mL (0,25 DM).

A Figura 8 ilustra imagens de MRI obtidas no Exemplo 6, onde a Figura 8a ilustra uma imagem de prótons; a Figura 8b ilustra uma imagem com deslocamento químico de 13C de 99%13C-PEG6.000, apresentada em azul; a Figura 8c ilustra uma imagem de deslocamento químico de 13C da gordura endógena do músculo temporal do rato, exibida em vermelho; a Fi- gura 8d ilustra a imagem de deslocamento químico de 13C de 99% 13C- PEG6.000 e a imagem de deslocamento químico de 13C da gordura endóge- na sobreposta à imagem de prótons; a Figura 8e exibe a imagem de deslo- camento químico de 13C de 99% 13C-PEG6.000 sobreposta à imagem de pró- tons; e a Figura. 8f ilustra a imagem de deslocamento químico de 13C da gordura interna sobreposta à imagem de prótons.

A Figura 9 ilustra imagens de MRI obtidas no Exemplo 7, onde a Figura 9a ilustra uma imagem de 5 mg/mL de 99%13C-PEG6.000 (a fotogra- fia superior é uma imagem de prótons; a cubeta esquerda superior contém 10% em peso de 13C-glicose, a cubeta direita superior contém 5 mg/mL de 13C-PEG6.000, e a cubeta inferior contém uma solução salina. A fotografia inferior é uma imagem em CSI de 13C-PEG6.000). A Figura 9b ilustra uma imagem de 0,5 mg/mL de 99%13C-PEG6.000 (a fotografia superior é uma imagem de prótons; a cubeta esquerda contém uma solução salina, e a cu- beta direita contém 0,5 mg/mL de 13C-PEG6.000. A fotografia inferior é uma imagem em CSI de 13C-PEG6.000). A Figura 9c ilustra uma imagem de 0,05 mg/mL de 99%13C-PEG6.000 (a fotografia superior é uma imagens de pró- tons; a cubeta esquerda contém uma solução salina, e a cubeta direita con- tém 0,05 mg/mL de 99%13C-PEG6.000. A fotografia do meio é uma imagem em CSI de 99%13C-PEG6.000. A fotografia inferior é uma imagem obtida baixando o nível de ruído da imagem do meio usando processamento de imagens; a imagem permite reconhecer claramente a presença de 0,05 mg/mL de 99%13C-PEG6.000).

A Figura 10 ilustra imagens de MRI obtidas no Exemplo 8, onde a Figura 10a é uma imagem obtida usando o método de deslocamento quí- mico de 13C (13C-CSI); a Figura 10b é uma imagem obtida usando o método de reprodução de imagens por deslocamento químico de 13C com a detec- ção de prótons (13C-CSI detectada com 1H); a Figura 10c ilustra uma ima- gem obtida usando o método de gradiente de eco de 13C (13C-GRE); e a Fi- gura 10d ilustra uma imagem obtida usando o método de eco spin rápido de 13C (13C-FSE); em cada uma das imagens de 10a a 10d, duas cubetas são colocadas verticalmente, a cubeta superior contendo 5 mg/mL de 99%13C- PEG6.000, e a cubeta inferior contendo 30 mg/mL de 99%13C-PEG6.000.

Claims

1. Agente de contraste para ressonância magnética, que é usado para obter continuamente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos; o agente de contraste para ressonância magnética compreen- dendo um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol.

2. Agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com a reivindicação 1, onde a proporção de 13C no polietilenoglicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

3. Agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com a reivindicação 1, onde o polietilenoglicol tem um peso molecular pon- derai médio de 470 a 10.000.000.

4. Agente de contraste para ressonância magnética, de acordo com a reivindicação 1, onde o compost é um anticorpo marcado com o polie- tilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundân- cia natural.

5. Método de reprodução de imagens por ressonância magnéti- ca, compreendendo aplicar, a um indivíduo que recebeu administração de um agente de contraste para ressonância magnética que compreende um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abun- dância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 se- gundos ou menos, obtendo desta forma continuamente sinais de ressonân- cia magnética para obter uma imagem.

6. Método de reprodução de imagens por ressonância magnéti- ca, de acordo com a reivindicação 5, onde a proporção de 13C no polietile- noglicol é entre 20 e 100% dos átomos de carbono totais.

7. Método de reprodução de imagens por ressonância magnéti- ca, de acordo com a reivindicação 5, onde o polietilenoglicol tem um peso molecular ponderai médio de 470 a 10.000.000.

8. Método de reprodução de imagens por ressonância magnéti- ca, de acordo com a reivindicação 5, onde o composto é um anticorpo mar- cado com o polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural.

9. Método para obter sinais de ressonância magnética, compre- endendo aplicar, a um indivíduo que recebeu administração de um agente de contraste para ressonância magnética que compreende um polietilenoglicol que contém 13C em uma proporção mais alta do que a abundância natural, ou um composto marcado com o polietilenoglicol, pulsos de um acampo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos, onten- do desta forma continuamente sinais de ressonância magnética.

10. Uso de um polietilenoglicol que contém 13C em uma propor- ção mais alta do que a abundância natural, ou de um composto marcado com o polietilenoglicol, para a produção de um agente de contraste para res- sonância magnética usado para obter continuamente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos.

11. Uso de um polietilenoglicol que contém 13C emu ma propor- ção mais alta do que a abundância natural, ou de um composto marcado com o polietilenoglicol, para obter continuamente sinais de ressonância magnética aplicando pulsos de um campo magnético de excitação com um tempo de repetição de 60 segundos ou menos.