BRPI0712147A2 - polipeptìdeos estabilizados do fator do crescimento insulina-like - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEOS ESTABILIZADOS DO FATOR DO CRESCIMENTO INSULINA-LIKE. A invenção está relacionada a polipeptídeos estabilizados que possuem uma seqüência de IGF-I ou IGF-2 e uma seqüência de peptídeo-E, em que a clivagem fisiológica natural do peptídeo-E do IGF é evitada.

Description

POLIPEPTÍDEOS ESTABILIZADOS DO FATOR DO CRESCIMENTO INSULINA-LJJCE

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Fatores do crescimento insulina-IiA:e (IGFs) são parte de um sistema complexo que as células utilizam para se comunicar com seu ambiente fisiológico. Esse sistema complexo (freqüentemente denominado o eixo do fator do crescimento insulina-like) consiste em dois receptores da superfície celular (IGF-1R e IGF-2R) , dois ligantes (IGF-1 e IGF-2) , uma família de seis proteínas de ligação de IGF de alta afinidade (IGFBP 1-6) , e enzimas de degradação de IGFBP associadas (proteases). Esse sistema é importante não apenas para a regulação da fisiologia normal, mas também para diversos estados patológicos (Glass, Nat. Cell. Biol. 5: 87-90, 2003).

Foi demonstrado que o eixo do IGF participa da promoção da proliferação celular e da inibição da morte celular (apoptose). IGF-I é secretado principalmente pelo fígado em conseqüência da estimulação pelo hormônio do crescimento humano (hGH). Quase todas as células no corpo humano são afetadas pelo IGF-1, especialmente células nos músculos, cartilagem, ossos, fígado, rim, nervos, pele e pulmões. Além dos efeitos semelhantes aos da insulina, IGF- 1 também pode regular o crescimento celular. IGF-I e IGF-2 são regulados por uma família de produtos gênicos conhecidos como proteínas de ligação de IGF. Essas proteínas ajudam a modular a ação de IGF de formas complexas que envolvem tanto a inibição da ação de IGF evitando a ligação aos receptores de IGF quanto à promoção da ação de IGF por meio do auxílio da liberação aos receptores e aumento da meia-vida do IGF na corrente sangüínea. Há pelo menos seis proteínas de ligação caracterizadas (IGFBP1-6).

Em sua forma madura, IGF-1 humano (gpet lcgae lvdalgfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapgtgivdeccfrscdlrr Ie mycaplkpaksa; ID. DE SEQ. N°: 1), também denominado somatomedina, é uma pequena proteína de 70 aminoácidos que demonstrou estimular o crescimento de uma gama ampla de células em cultura. A proteína madura é inicialmente codificada por três mRNAs variantes unidos conhecidos. 0 quadro de leitura aberta de cada mRNA codifica uma proteína precursora que contém o IGF-1 de 70 aminoácidos e um peptídeo E específico no terminal C, dependendo do mRNA de IGF-1 em particular. Esses peptídeos E foram denominados peptídeos Ea (rsvragrhtdmpktgkevhlknasrgsagnknyrm; ID. DE SEQ. N°: 2), Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksgrrkgwpkthpgge gkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; ID. DE SEQ. N°: 3) e Ec (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; ID. DE SEQ. N°: 4), e com comprimentos que variam de 35 a 87 aminoácidos, e englobam uma região da seqüência comum no terminal N e uma região de seqüência variável no terminal C. Por exemplo, o quadro de leitura aberta do tipo selvagem para o IGF-I-Ea codifica um polipeptídeo de 105 aminoácidos (gpet lcgae lvdalgfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapgtgivdeccfrscdlrr Ie mycaplkpaksarsvragrhtdmpktgkevhlknasrgsagnknyrm; ID. DE SEQ. N°: 5). Na expressão fisiológica, os peptídeos E são removidos por clivagem do precursor por proteases endógenas, para gerar o IGF-1 maduro de 70 aminoácidos conhecido por ser bioativo. Em certos contextos, um a três dos aminoácidos do terminal N de IGF-1 são sabidamente clivados sob condições fisiológicas, gerando IGF-1 ativo que possui entre 67-70 aminoácidos. A expressão gênica e o processamento de IGF-2 são caracterizados por atributos similares, exceto que apenas um peptideo E (rdvstpptvlpdnf prypvgkf f gydtwkgstqr lrrglpal lrarrghvlake Ieaf reakrhrplialptqdpahggappemasnrk; ID. DE SEQ. N°: 6) para IGF-2 humano foi identificado para o precursor de 156 aminoácidos (ayrpseticggeIvdtlgfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveec cfrscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffgydtwkgstgrIrrg lpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; ID. DE SEQ. N°: 7) . IGF-I e IGF-2 parecem ser maus candidatos a fármacos, na medida em que essas proteínas são rapidamente degradadas por proteases endógenas no soro dos pacientes. Uma estratégia que tem sido empregada é a estabilização de IGF-1 como fármaco por formação de um complexo com uma de suas proteínas de ligação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se baseia no fato de que uma proteína precursora de IGF-1 ou de IGF-2 que contém substancialmente seu peptideo E é bioativa e estabilizada na presença de soro, resultando em um polipeptídeo de IGF-1 ou de IGF-2 que é útil como uma substância farmacêutica. Nas composições da invenção, a clivagem normal do peptideo E de IGF-1 é evitada, por exemplo, por mutação ou eliminação da arginina na posição 1 ou da serina na posição 2 dos peptídeos E (que correspondem às posições 71 e 72 no IGF-1 do tipo selvagem precursor). No IGF-2, a clivagem é evitada, por exemplo, por mutação ou eliminação da arginina na posição 1 ou do ácido aspártico na posição 2 do peptideo E (que correspondem às posições 68 e 69 no IGF-2 do tipo selvagem precursor). Outras modificações de uma proteína precursora de IGF podem evitar ou reduzir essa clivagem.

Além disso, modificações adicionais da seqüência de aminoácidos precursora IGF-1 podem conferir benefícios farmacêuticos adicionais. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem exibir afinidade aumentada pelo receptor de IGF-1 ou habilidade de ligação diminuída a uma proteína de ligação inibidora de IGF-1 ou IGF-2.

Para fins de clareza e consistência, a numeração dos resíduos de aminoácidos nas proteínas precursoras ou maduras de IGF-1 ou IGF-2 ao longo deste pedido e nas suas reivindicações se baseia na numeração da seqüência da proteína precursora do tipo selvagem, sem peptídeo sinalizador.

Conseqüentemente, a invenção inclui um polipeptídeo que contém uma proteína precursora de IGF-1, em que a clivagem do peptídeo E de IGF-1 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora. 0 peptídeo E pode ser o peptídeo Ea, Eb ou Ec. No terminal N do precursor, os aminoácidos Gl, P2 ou E3 da proteína precursora podem ser eliminados ou mutados, o mesmo podendo ocorrer em R3 6 (por exemplo, R3 6A) e R3 7 (por exemplo, R3 7A).

A proteína precursora pode ainda incluir a seqüência de consenso de glicosilação ligada ao N NXS/T, por exemplo, por inserção dos aminoácidos 93-102 de Ea entre os aminoácidos N95 e T96 do Eb. Em geral, a proteína precursora pode incluir um oligossacarídeo ligado covalentemente a uma cadeia lateral de aminoácido da proteína precursora, por exemplo, uma cadeia lateral de arginina da proteína precursora. Além disso, um resíduo da proteína precursora pode ser substituído por um aminoácido não natural (por exemplo, um que inclua um grupo acetileno ou azido). Esses aminoácidos não naturais podem facilitar a ligação de uma porção poli(etileno glicol) a uma cadeia lateral da proteína precursora, por meio de estratégias típicas de peguilação de proteínas bem conhecidas na técnica.

A proteína precursora pode ainda incluir um ou mais peptídeos E adicionais ligados ao terminal C da proteína precursora. Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir, do terminal N para o terminal C, (1) uma proteína precursora de IGF-1 que possui um primeiro peptídeo Eb, em que Gl, Pl e E1 são eliminados, R36 ou R37 ou ambos são mutados, R71 e S72 são eliminados, e os últimos sete aminoácidos do terminal C do primeiro peptídeo Eb são eliminados; (2) um segundo peptídeo Eb, em que R71, S72 e os últimos sete aminoácidos do terminal C do segundo peptídeo Eb são eliminados; (3) um terceiro peptídeo Eb, em que R71, S72 e os últimos sete aminoácidos do terminal C do terceiro peptídeo Eb são eliminados; e (4) um quarto peptídeo Eb, em que R71 e S72 são eliminados.

Um meio eficaz para evitar a clivagem do peptídeo E do IGF-I é a eliminação ou mutação de R71 ou S72.

Do mesmo modo, a invenção inclui uma proteína precursora de IGF-2 em que a clivagem do peptídeo E de IGF- 2 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora. Em particular, a eliminação ou mutação de R68 ou D69 pode ser um meio eficaz para evitar a digestão por protease da proteína precursora de IGF-2.

Além disso, qualquer peptídeo E de IGF-1 pode ser combinado com um IGF-2 e qualquer peptídeo E de IGF-2 pode ser combinado com IGF-I para fornecer os benefícios aqui descritos.

A invenção ainda inclui um método de tratamento de uma doença musculoesquelética, diabetes, morte de células neuronais por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da invenção. Da mesma forma, a invenção inclui o uso de um polipeptídeo da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença musculoesquelética, diabetes, morte de células neuronais ou anemia.

Em outra modalidade, a invenção inclui um IGF-1 peguilado sem um peptídeo E, mas tendo nele introduzido um aminoácido não natural como o local de peguilação. Qualquer IGF-1 modificado peguilado, contendo um aminoácido não natural, como aqui revelado, sem um peptídeo E, também está incluído na invenção.

A invenção também inclui métodos e usos veterinários da administração de uma quantidade eficaz do polipeptídeo da invenção para obter um efeito desejado.

Os usos veterinários incluem: (i) aumento da taxa e/ou da extensão do crescimento em um animal, (ii) aumento da eficiência da conversão de ração em tecido corporal, (iii) aumento da produção de leite em animais lactantes, (iv) tratamento dos sintomas de emaciação do animal associados à caquexia, trauma ou outras doenças consuptivas, e (v) tratamento de animais lactantes para melhora da saúde neonatal.

Todas as referências ou documentos citados são aqui incorporados por referência. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figs. IA-IC são Western blots de polipeptídeos da invenção e precursor de IGF-I do tipo selvagem após incubação de zero ou 16 horas na presença ou ausência de soro humano 10% a 37°C. Vetores de expressão que codificam várias construções de IGF-I foram transfectados em células Cos7, e o meio de cultura condicionado obtido. 0 "3mut" refere-se a um precursor do peptídeo E de hIGF-1 que possui os três conjuntos de modificações seguintes: eliminação de Gl, P2 e E3 ; mutação de Arg 37 para Ala (R37A) ; e eliminação de R71 e S72. A Fig. IA mostra os resultados do Western blot (com o uso do anticorpo para IGF-1) para o precursor do tipo selvagem e 3mut que contém Ea. A Fig. IB mostra os resultados do Western blot (com o uso do anticorpo para hIGF-1) para o precursor do tipo selvagem e 3mut que contém Eb. A Fig. IC mostra os resultados do Western blot (com o uso do anticorpo para hIGF-1) para o precursor do tipo selvagem e 3mut que contém Ec.

As Figs. 2A-2D são gráficos de linhas que mostram a atividade biológica de vários polipeptídeos de IGF-I ("ligantes"). A atividade biológica foi medida por estimulação de mioblastos C2C12 com polipeptídeos expressos por Cos7. As células C2C12 estimuladas foram então testadas quanto às quantidades relativas de AKT total e AKT fosforilada. Long-R3-IGF-1 é um reagente disponível comercialmente (Produto Sigma N° 1-1271) que consiste na seqüência de aminoácidos de IGF-I humano maduro, com uma mutação E3R e um peptídeo de extensão adicional de 13 aminoácidos no terminal Ν. A Fig. 2A mostra a atividade de IGF-1-Ea3mut. A Fig. 2B mostra a atividade de IGF-1-Eb3mut. A Fig. 2C mostra a atividade de IGF-1-Eab3mut, que é uma construção de 3mut na qual os aminoácidos 93 a 102 de Ea foram inseridos entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb. A Fig. 2D mostra a atividade de IGF-1-Ec3mut.

As Figs. 3A-3D e 4A-4D são gráficos de linhas que mostram se os polipeptideos precursores de IGF-I da invenção mantêm a seletividade para o receptor apropriado por avaliação da fosforilação do receptor em resposta à ligação do ligante. As Figs 3A e 3B testam a seletividade do receptor de IGF-1-Ea3mut contra o receptor de IGF-I (Fig. 3A) e contra o receptor de insulina (Fig. 3B) . As Figs. 3C e 3D testam a seletividade do receptor de IGF-I- Eb3mut contra o receptor de IGF-I (Fig. 3C) e contra o receptor de insulina (Fig. 3D) . As Figs. 4A e 4B testam a seletividade do receptor de IGF-1-Ec3mut contra o receptor de IGF-I (Fig. 4A) e contra o receptor de insulina (Fig. 4B). As Figs. 4C e 4D testam a seletividade do receptor de IGF-1-Eab3mut contra o receptor de IGF-I (Fig. 4C) e contra o receptor de insulina (Fig. 4D). "IGF1-R3" refere-se ao Long-R3-IGF-1 descrito acima. O polipeptídeo listado como "IGFlEab" refere-se à construção na qual os aminoácidos 93 a 102 de Ea foram inseridos entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb.

A Fig. 5 é um Western blot que mostra a fosforilação relativa de AKT mediante estimulação de miotubos C2C12 (como conseqüência de 3 a 4 dias de diferenciação de miõcitos C2C12) por diferentes ligantes. 0 multímero IGF-I Eb refere-se à construção mostrada esquematicamente na Fig. 6A.

As Figs. 6A e 6B são representações esquemáticas de dois dos polipeptídeos da invenção. A Fig. 6A mostra um polipeptídeo precursor de IGF-1-Eb com quatro conjuntos de modificações: eliminação de G1, P2 e E3; mutação de R37 para A; eliminação de R71 e S72; e eliminação dos últimos sete aminoácidos do terminal C. Além disso, o polipeptídeo é alongado pela adição de mais dois peptídeos Eb (mas sem R71 e S72 e sem os últimos sete aminoácidos do terminal C) e pela adição de um peptídeo Eb final (mas sem R71 e S72) no terminal C do polipeptídeo. Essa construção é freqüentemente denominada multímero de IGF-1-Eb. A Fig. 6B mostra um polipeptídeo precursor de IGF-1-Eab com quatro conjuntos de modificações: eliminação de G1, P2 e E3 ; mutação de R37 para A; eliminação de R71 e S72; e inserção de aminoácidos 93 a 102 de Ea entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb.

A Fig. 7 A é um alinhamento de seqüências do IGF-1 humano (ID. DE SEQ. N° : 1) com o IGF-1 animal correspondente. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. G1, P2, E3 estão conservados em todas as espécies analisadas, exceto Sterlet (em que S2 substitui P2). R36 e R37 estão conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 7B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com IGF-1 humano (ID. DE SEQ. N°: 1). Embaixo da árvore há uma escala que indica o número de "substituições de aminoácidos" por 100 resíduos para seqüências de proteína. A fórmula de distância de Kimura é usada para calcular os valores de distância, derivados do número de não combinações non-gap, e corrigidos para substituições silenciosas. Os valores computados são então o número médio de diferenças por local e caem entre zero e 1. Zero representa identidade completa e 1 representa ausência de identidade. A escala da árvore filogenética utiliza esses valores multiplicados por 100.

A Fig. 8A é um alinhamento de seqüências do peptideo Ea humano (ID. DE SEQ. N°: 2) com vários peptideos Ea animais. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. R71 e S72 estão conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 8B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com peptideo Ea do IGF-1 humano (ID. DE SEQ. N°: 2) .

A Fig. 9A é um alinhamento de seqüências do peptideo Eb humano (ID. DE SEQ. N° : 3) com vários peptideos Eb animais. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. R71 e S72 estão conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 9B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com o peptideo Eb do IGF-I humano (ID. DE SEQ. N°: 3).

A Fig. IOA é um alinhamento de seqüências do peptideo Ec humano (ID. DE SEQ. N°: 4) com vários peptideos Ec animais. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. R71 e S72 estão conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 10B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com o peptídeo Ec do IGF-I humano (ID. DE SEQ. N°: 4).

A Fig. 11A é um alinhamento de seqüências do IGF-2 humano (ID. DE SEQ. N° : 7) com o IGF-2 animal correspondente. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. R68 está conservado em todas as espécies analisadas; D6 9 está conservado, exceto para chimpanzé, em que uma histidina está naquela posição.

A Fig. 11B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com IGF-2 humano (ID. DE SEQ. N°: 7).

A Fig. 12A é um alinhamento de seqüências do peptídeo E do IGF-2 humano (ID. DE SEQ. N°: 6) com vários peptídeos E do IGF-2 animal. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes à seqüência são apresentados. R68 está conservado em todas as espécies analisadas; D69 está conservado, exceto para chimpanzé, em que uma histidina está naquela posição.

A Fig. 12B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas, comparadas com o peptídeo E do IGF-2 humano (ID. DE SEQ. N°: 6).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada a novos polipeptídeos precursores de IGF-I e IGF-2 que contêm substancialmente um peptídeo E que foi modificado para evitar, reduzir ou evitar a clivagem por protease típica responsável pela liberação do IGF-I ativo ou IGF-2 de seus peptídeos Ε. A utilidade dos polipeptídeos da invenção se baseia na descoberta surpreendente de que esses polipeptídeos precursores são biologicamente ativos, estáveis e benéficos como substâncias farmacêuticas.

Pesquisa por polipeptideos precursores de IGF ativos

A utilidade de qualquer polipeptideo da invenção pode ser pesquisada com o uso dos seguintes ensaios.

Estabilidade - Um polipeptideo da invenção deve ter estabilidade suficiente na presença de proteases endõgenas, por exemplo, no soro humano, para ser um fármaco eficaz. Para avaliar a estabilidade, um vetor de expressão que codifica o polipeptideo pode ser transfectado em células Cos7 (ATCC) em um meio DMEM contendo soro fetal bovino 10%, 100 U/ml de penicilina, e 100 pg/ml de estreptomicina. 0 meio de cultura contendo os polipeptideos secretados pode ser aplicado para análise posterior ou, alternativamente, o vetor de expressão pode codificar t ags facilmente disponíveis como, por exemplo, tag de hexa-histidina, no polipeptideo para facilitar a purificação eficiente dos polipeptideos expressos nas culturas de Cos7. Após ser preparada, a amostra de polipeptideo é incubada em soro humano normal (Sigma) ou em PBS por vários períodos (por exemplo, 0, 1, 5, 10 e 16 horas), submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida, colocada em nitrocelulose, e as proteínas relevantes visualizadas com o uso de um anticorpo primário contra IGF-I ou IGF-2 humano e um anticorpo secundário, por exemplo, conjugado à peroxidase de raiz- forte. Qualquer uma dentre diversas técnicas de blotting e de detecção pode ser usada, algumas com a utilização de corantes fluorescentes ou até mesmo radionuclídeos. A intensidade da banda de precursor versus a intensidade da banda de IGF-I ou IGF-2 deve indicar o grau no qual o polipeptídeo precursor é clivado sob várias condições. Um polipeptídeo da invenção que é exposto ao soro humano por 16 horas a 37°C pode exibir uma proporção de precursor não clivado para IGF maduro clivado de cerca de 1:2 a 1:0,1, por exemplo, cerca de 1:1 a 1:0,5, particularmente uma proporção de cerca de 1:1 ou uma proporção de cerca de 1:0,5. Tipicamente, o precursor deve exibir uma proporção de pelo menos 1:1.

Fosforilação de AKT - Um polipeptídeo da invenção deve manter a habilidade para sinalizar através do receptor de IGF-I (sinalizar tanto IGF-I quanto IGF-2 através do receptor de IGF-1). Para determinar essa capacidade de sinalização, pode-se avaliar se um alvo intracelular downstream, AKT, é fosforilado em resposta à ligação do ligante na superfície celular. Para análise da fosforilação de AKT, mioblastos C2C12 são subalimentados em meio sem soro, e depois estimulados com diferentes ligantes. As células são lisadas e depuradas por centrifugação. A fosforilação de AKT e os níveis totais de AKT são analisados por ELISA com a utilização do kit de ELISA em sanduíche "PathScan phospho AKT" (Ser473) e "PathScan AKT" (Cell Signaling), respectivamente.

Especificidade pelo receptor de IGF-1 - Um polipeptídeo da invenção mantém preferivelmente a especificidade pelo receptor de IGF-1, e deve se ligar ao receptor de insulina relacionado com afinidade baixa. Para avaliar a especificidade por receptor, amostras do polipeptídeo são adicionadas às células NIH3T3 desprovidas de soro que superexpressam o receptor de IGF-1 ou ao receptor de insulina, e o nível de fosforilação do receptor de IGF-I ou de fosforilação do receptor de insulina é determinado por Iise das células, e submetendo-se os lisados ao ELISA usando o kit ELISA de receptor de fosfo- IGF-I humano "DuoSet IC" e o kit de receptor de insulina (R&D Systems).

Teste in vivo em modelos de hipertrofia em camundongos

- Para determinar se um polipeptídeo da invenção pode agir para aumentar a massa de músculo esquelético sob um contexto que já leve à hipertrofia muscular, pode-se submeter animais tratados e não tratados ao exercício e determinar se os animais que receberam o polipeptídeo desenvolveram músculos maiores do que os animais não tratados.

Modelos de exercício

Um modelo conhecido na técnica se baseia no uso de uma roda de corrida voluntária com cargas variáveis pelo usuário (veja, por exemplo, Konhilas e cols., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289: H455-H465, 2005). A roda voluntária elimina as agressões físicas e psicológicas que são comuns em modelos de exercícios forçados, e é, portanto, mais adequada à avaliação de fármacos candidatos que são usados em indivíduos relativamente saudáveis para os quais é desejável o aumento da massa muscular.

Pode ser usada qualquer cepa de camundongo. Por exemplo, machos de camundongos C57B1/6J podem ser distribuídos aleatoriamente a grupos experimentais (por exemplo, que recebem o polipeptídeo precursor de IGF) e de controle. Os animais são abrigados individualmente em uma gaiola contendo uma roda de exercício; animais sedentários de controle são abrigados em gaiolas idênticas, sem uma roda. As rodas de exercício são descritas em Allen e cols., J. Appl. Physiol. 90: 1.900-1.908, 2001. Resumidamente, o sistema consiste em uma roda com 11,5 cm de diâmetro com uma superfície de corrida de 5,0 cm de largura (modelo 6208, Petsmart, Phoenix, AZ) equipada com um contador magnético digital (modelo BC 600, Sigma Sport, Olney, IL) que é ativado pela rotação da roda. Além disso, cada roda é projetada com um mecanismo de resistência que permite o ajuste da carga. Isso é obtido anexando-se uma linha de pesca de aço inoxidável no topo da gaiola e enrolando-se a linha em torno de uma polia imóvel que é fixada à roda da gaiola no eixo de rotação, de modo a não contribuir para a carga da roda. A linha é novamente fixada no topo da gaiola com uma mola e um parafuso. Esse projeto permite ajustes finos da carga da roda, que é distribuída igualmente por toda a rotação da roda. São registrados os valores diários do exercício por tempo e distância percorrida para cada animal exercitado por toda a duração do período de exercício. Todos os animais recebem água e ração sólida padronizada para roedores standard ad libitum. A corrida voluntária (exposição à roda da gaiola) pode começar em uma idade média de cerca de 12 semanas para todos os grupos. Cada grupo continua a correr sob resistência variável, dependendo do grupo experimental, por 5 0 dias, até que os animais tenham cerca de 19 semanas de idade. A carga na roda é determinada pendurando-se pesos conhecidos sobre a roda até que a roda seja ligeiramente deslocada. Todos os grupos de exercício começam sem carga na roda da gaiola na primeira semana. No entanto, a condição "sem carga" é, na verdade, de 2 g, que é determinada como a carga necessária para manter a inércia da roda e a carga do atrito. Considerando um período de aclimatação à roda de 1 semana, as cargas da roda podem ser alteradas em intervalos de uma semana, exceto para cargas maiores, quando então podem ser alteradas após 2 semanas. A gama de cargas pode variar de 2 g até 12 g. Os animais em exercício e sedentários de controle são submetidos ã eutanásia por deslocamento cervical sob anestesia inalada imediatamente após o final do período de exercício específico. A massa corporal é medida, e músculos específicos são rapidamente removidos, lavados e congelados para ensaios histológicos ou bioquímicos em uma data futura.

Modelos alternativos de hipertrofia por exercício também estão disponíveis para aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, o modelo de exercício em esteira descrito em Lerman e cols., J. Appl. Physiol. 92: 2.245-2.255, 2002.

Modelo de injeção de clenbuterol

Clenbuterol é um agonista p2-adrenérgico com propriedades que promovem o crescimento que causa um aumento documentado da massa muscular. 0 mecanismo preciso da ação do clenbuterol permanece incerto, embora tenha sido proposta uma redução da degradação da proteína muscular. Na clínica, o clenbuterol é usado como um fármaco antiasma, mas parece ser indevidamente usado principalmente como um agente de fisiculturismo para aumentar a massa muscular tanto em seres humanos quanto em exposições de animais.

Cinco camundongos recebem uma injeção diária de clenbuterol (3 mg/kg, subcutânea (s.c.)) por 3, 7 ou 14 dias para a indução de hipertrofia muscular. Camundongos injetados com PBS servem como controle negativo. Os animais são monitorados diariamente (inspeção visual) quanto a quaisquer reações adversas (ou seja, alterações do pêlo, letargia) ao tratamento. O tratamento com clenbuterol possui o potencial para tornar os camundongos mais destemidos ou agressivos e, dessa forma, os camundongos devem ser especialmente monitorados quanto a brigas, se abrigados em grupos. Os camundongos são móveis, e podem comer e beber normalmente. Eles são monitorados diariamente, até serem submetidos à eutanásia no 3°, 7° ou 14° dia, e os tecidos coletados para análise posterior.

Teste in vivo em modelos de atrofia muscular - Em vários modelos de atrofia de músculo esquelético, um polipeptídeo precursor de IGF da invenção pode ser testado quanto à habilidade para manter a massa muscular sob condições que geralmente reduzem a massa muscular. Com os exemplos de modelos descritos abaixo, aqueles habilitados na técnica podem facilmente projetar e implementar experimentos controlados que envolvem a administração e o uso de polipeptídeos precursores de IGF para determinar se esses polipeptídeos podem aumentar a massa muscular.

Por exemplo, machos de camundongos C57B16/2 são adquiridos de "The Jackson Laboratories". Os camundongos são adquiridos de modo que tenham cerca de 9 semanas no início de cada experimento. Geralmente, os camundongos são abrigados em gaiolas microisoladoras com ração para roedores normal. No início de cada experimento, os camundongos são pesados. Ao final de cada experimento, geralmente os camundongos são submetidos à eutanásia por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical, e os tecidos musculares coletados para processamento posterior. Os camundongos são pesados para fornecer o "peso corporal final". Os músculos esqueléticos que podem ser coletados são os músculos tibiais anteriores, extensor digital longo, soleares e gastrocnêmios. Outros tecidos coletados ocasionalmente são: coração, fígado, baço, rins, testículos e cérebro. Todos os músculos e tecidos são completamente dissecados e pesados em uma balança capaz de medir até 0,0001 g. Os tecidos são então imediatamente congelados em nitrogênio líquido para extração posterior de RNA e proteína, ou imediatamente congelados embebidos em OCT em um disco de cortiça. Os músculos congelados em um disco de cortiça para criossecção posterior são imersos em isopentano resfriado até um caldo espesso por nitrogênio líquido. Todas as amostras são armazenadas a -80°C.

Tratamento com dexametasona

Um método farmacológico de indução de emaciação muscular em camundongos é a injeção intraperitoneal diária com dexametasona a 20 mg/kg. A dexametasona é um membro sintético da classe de hormônios dos glicocorticóides. Ela atua como antiinflamatório e imunossupressor, com uma potência de cerca de 40 vezes a da hidrocortisona. A dexametasona é usada no tratamento de muitas condições inflamatórias e autoimunes, por exemplo, artrite reumatóide. Ela também é administrada em pacientes com câncer submetidos à quimioterapia, para se contrapor a certos efeitos colaterais de seu tratamento antitumoral. A dexametasona causa atrofia muscular tanto em camundongos quanto em pacientes humanos.

Os camundongos são injetados por via intraperitoneal (IP) com dexametasona por 3, 7 ou 14 dias. No último dia, os animais são submetidos à eutanásia com o uso de CO2, e os músculos da perna coletados. Os animais são monitorados diariamente (inspeção visual) quanto a quaisquer reações adversas (ou seja, alterações do pêlo, letargia) ao tratamento. Os camundongos são normalmente móveis, e podem comer e beber normalmente. Os camundongos injetados com PBS são o controle negativo.

Imobilização por engessamento

A não utilização física de vários grupos musculares resulta em atrofia daqueles músculos. A fixação da articulação do tornozelo ("calcanhar com pinos" ou engessamento) provou ser uma forma altamente útil e reprodutível para induzir a imobilização física da musculatura do membro posterior de ratos e camundongo.

Os camundongos são anestesiados com isofluorano para imobilização. As articulações do tornozelo e do joelho são fixadas a 90 graus com um material de engessamento de peso leve (VET-LITE) em torno das articulações. O material é embebido em água morna e depois enrolado em torno do membro, deixando os dedos do pé e a articulação do quadril livres. As articulações são mantidas em posições de 90° até a secagem do gesso. A perna contralateral serve como controle. Permite-se que os camundongos se recuperem da anestesia e eles são abrigados em gaiolas normais microisoladoras. O engessamento não gerou estresse excessivo, e os animais se movem livremente pela gaiola para se alimentar e beber. No entanto, os camundongos são monitorados diariamente quanto a quaisquer eventos adversos que afetam o peso corporal, a atividade, e geram irritações.

Após o gesso ser aplicado a um camundongo, o animal é monitorado diariamente para assegurar que o gesso permanece no lugar, já que o animal pode mastigá-lo. Os animais podem se mover, beber e se alimentar após a recuperação da anestesia, e eles não precisam de leitos ou gaiolas especiais ou qualquer outra assistência.

Denervação

Geralmente, os camundongos são anestesiados com gás isofluorano para denervação. Com a utilização de procedimentos cirúrgicos assépticos (três lavagens de betadina com uma lavagem final de etanol), o nervo ciático direito é isolado no meio da coxa e é retirado um pedaço de 2 a 5 mm. A perna contralateral serve como controle.

Mais especificamente, a incisão cutânea é fechada com um grampo de sutura, e os animais injetados com uma dose única de buprenorfina, antes de se recuperarem da anestesia. 3, 7 ou 14 dias após a cirurgia, os animais são submetidos à eutanásia por inalação de CO2, seguida por deslocamento cervical, e músculos (complexo gastrocnêmio, tibial anterior, extensor longo dos dedos, solear) são removidos para análises histológicas e bioquímicas.

Considerando que o nervo ciático é seccionado, o membro afetado se torna imóvel para induzir atrofia do músculo esquelético dos músculos envolvidos. Fora isso, o animal pode se mover, beber e se alimentar após recuperação da anestesia, e não necessita de leitos ou gaiolas especiais ou de outra assistência. No entanto, os animais são monitorados imediatamente pós-cirurgia e ao longo da recuperação (1-2 horas). Além disso, os locais de incisão e a saúde geral do animal são monitorados por 3 dias pós- cirurgia. O grampo de sutura é removido 7 a 10 dias após a cirurgia.

Modelos genéticos

Camundongos transgênicos manipulados geneticamente também podem ser usados como modelos de atrofia muscular. Por exemplo, os denominados "Mini Mice" ("The Jackson Laboratory", N0 de Estoque 003258) contêm uma mutação knock out no gene IGF-I que resulta em crescimento pós-natal anormalmente diminuído, além de peso corporal e tamanho reduzidos. Para informações adicionais, veja Powell-Braxton e cols., Genes Dev. 7: 2.609-2.617, 1993. Além disso, os denominados "Midi Mice" ("The Jackson Laboratory", Nc de Estoque 003259) contêm uma mutação diferente no gene IGF-I que resulta em um hipomorfo que exibe baixo peso corporal do adulto e outros fenótipos cardiovasculares. Para informações adicionais, veja Lembo e cols., J. Clin. Invest. 98: 2.648-2.655, 1996.

Mutações ou modificações críticas e opcionais nos precursores de IGF

Mutações críticas - A invenção se baseia, em parte, na observação de que um polipeptídeo precursor de IGF que contém substancialmente seu peptídeo E permanece bioativo e estável na presença de soro. Para assegurar que o peptídeo

E não é clivado por proteases endógenas direcionadas ao sítio dibásico de protease, em geral um dos dois aminoácidos dibásicos do terminal N do peptídeo E no precursor é eliminado, mutado, ou de algum outro modo mascarado. Em um exemplo de IGF-1, esses dois aminoácidos são R71 e S72, enquanto no outro exemplo de IGF-2 esses primeiros dois aminoácidos são R68 e D69.

Diversas modificações permitem essa prevenção da clivagem:

(1) Eliminação de um ou ambos os resíduos dibásicos.

(2) Mutação de um ou ambos os resíduos dibásicos para um aminoácido não básico, por exemplo, alanina.

(3) Inserção de um ou mais aminoácidos não básicos entre os resíduos dibásicos.

(4) Colocação de um sítio de glicosilação próximo aos resíduos dibásicos suficiente para mascarar o sítio de protease.

(5) Peguilação sítio-dirigida usando a substituição de um dos resíduos dibásicos, ou inserção próxima ou entre os resíduos dibásicos, com um aminoácido não natural, como descrito abaixo.

Além disso, parece que os resíduos K68 e K65 participam da clivagem de IGF-1/peptídeo E; conseqüentemente, mutações ou eliminações desses resíduos podem ser incorporadas em qualquer tática dirigida aos aminoácidos dibásicos, como descrito acima.

Mutações no terminal N de IGF maduro - Em certas modalidades da invenção, os polipeptídeos precursores de IGF possuem eliminações ou mutações dos primeiros poucos aminoácidos do terminal N. No caso de IGF-1, qualquer um dos primeiros três aminoácidos do terminal N pode ser eliminado ou mutado, enquanto no caso de IGF-2 qualquer um dos primeiros seis aminoácidos do terminal N pode ser eliminado ou mutado. Foi observado que certos aminoácidos do terminal N são clivados naturalmente in vivo, e a introdução dessas mutações ou eliminações minimiza as associações in vivo dos polipeptídeos da invenção com proteínas de ligação de IGF (IGFBPs) . A interação de IGF-1 e IGF-2 com o receptor de IGF-1 é regulada por IGFBPs. Demonstrou-se que todas as seis IGFBPs inibem a ação de IGF (particularmente IGFBP5), mas em alguns casos foi observado um efeito estimulador. Pelo menos 99% do IGF na circulação estão normalmente ligados às IGFBPs. O IGFBP mais abundante na circulação após o período neonatal é IGFBP3, que pode se ligar tanto ao IGF-1 quanto ao IGF-2 com afinidades similares. O IGF-1 truncado de ocorrência natural (que abriga a eliminação de Gl, P2 e E3) se liga à IGFBP3 com afinidade várias vezes menor do que o IGF-1 natural. Além disso, G3 é importante para a ligação de IGFBP, e G6 tem uma participação similar no peptídeo de IGF-2.

Conseqüentemente, em um exemplo do precursor de IGF-1, qualquer um de G1, P2 ou E3 pode ser eliminado ou mutado, isoladamente ou em combinação. Quando se deseja uma mutação, pode ser introduzida uma mutação para alanina. Em outro exemplo, em outro exemplo do precursor de IGF-2, qualquer um de P4, S5 e E6 pode ser eliminado ou mutado isoladamente ou em combinação. Quando se deseja uma mutação, pode ser introduzida uma mutação para alanina.

Mutações nos resíduos 36 e 37 - IGF-1 pode ser clivado por serina proteases. A mutação de R36 ou R37 para A pode evitar a clivagem de IGF-I nesse sítio de clivagem previsto entre R36 e R37. Em um exemplo de IGF-2, R38 pode ser mutado ou eliminado para evitar essa clivagem deletéria.

O uso de Glicosilação - A meia-vida in vivo dos polipeptídeos da invenção pode ser aumentada pela adição de sítios de glicosilação ligados ao N tanto no IGF quanto nas porções do peptídeo E do precursor, quando expresso em células de mamíferos ou em outras células eucarióticas capazes de glicosilação ligada ao N. Foi demonstrado in vitro que Ea de IGF-I é glicosilado em N92 e N100, já que essas porções de Ea se ajustam à seqüência de consenso da glicosilação ligada ao N de N-X-S/T, em que X pode ser qualquer aminoácido e o terceiro aminoácido do tripleto é S ou T. Sabe-se também que o contexto do consenso do aminoácido adjacente afetará a força na qual a asparagina é glicosilada. Portanto, uma estratégia para introduzir um sítio de glicosilação em Eb ou Ec é a inserção de aminoácidos de Ea em torno da seqüência de consenso aproximadamente na mesma parte de Eb ou Ec. Uma implementação específica dessa estratégia é ilustrada nos Exemplos abaixo. Em qualquer evento, qualquer outro sítio de glicosilação de consenso ligada ao N, incluindo aminoácidos no contexto circundante, conhecido por aqueles habilitados na técnica, pode ser inserido em um polipeptídeo precursor da invenção. Além disso, a glicosilação ligada ao 0 de um polipeptídeo da invenção pode ser obtida pela escolha do hospedeiro específico usado para a produção do polipeptídeo. Por exemplo, o uso de certas cepas de leveduras para a expressão de IGF-I resulta na adição de oligossacarídeos em serinas ou treoninas. Veja, por exemplo, Patente U.S. N0 5.273.966.

Adição de poli(etileno glicol) - A conjugação ao poli(etileno glicol) (PEG; peguilação) provou ser benéfica na prolongação da meia-vida de fármacos de proteínas terapêuticas. Espera-se que a peguilação dos polipeptídeos precursores de IGF da invenção possa resultar em vantagens farmacêuticas similares. Métodos de peguilação de IGF-I são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. 2006/0154865, que descreve as propriedades benéficas de lisina-IGF-1 monopeguilado. Essa lisina-monopeguilação pode ser adaptada aos polipeptídeos precursores de IGF da invenção. Além disso, a peguilação pode ser obtida em qualquer parte de um polipeptideo da invenção pela introdução de um aminoácido não natural. Certos aminoácidos não naturais podem ser introduzidos pela tecnologia descrita em Deiters e cols. , J. Am. Chem. Soe. 125: 11.782-11.783, 2003; Wang e Schultz, Science 301: 964- 967, 2 003; Wang e cols., Science 2 92: 498-500, 2001; Zhang e cols., Science 303: 371-373, 2004 ou na Patente U.S. N° 7.083.970. Resumidamente, alguns desses sistemas de expressão envolvem mutagênese sítio-dirigida para a introdução de um códon não senso como, por exemplo, um TAG âmbar, no quadro de leitura aberta que codifica um polipeptideo da invenção. Esses vetores de expressão são então introduzidos em um hospedeiro que pode utilizar um tRNA especifico para o códon não senso introduzido e carregado com o aminoácido não natural de escolha.

Aminoácidos não naturais específicos que são benéficos com o objetivo de conjugar porções aos polipeptídeos da invenção incluem aqueles com cadeias laterais acetileno e azido. Os polipeptídeos precursores de IGF que contêm esses novos aminoácidos podem então ser peguilados nesses sítios escolhidos na proteína. Além disso, essas moléculas de IGF peguilado sem o peptídeo E também são úteis como substâncias terapêuticas.

Multimeros de peptideos E - Em certos contextos farmacológicos, é benéfico aumentar o tamanho de um fármaco de peptídeo ou proteína para assegurar que o fármaco permaneça de um lado ou de outro da barreira hematencefãlica. Na medida em que moléculas de IGF maduro são peptideos relativamente curtos, mesmo se o peptídeo E permanecer anexado, ele poderá ser benéfico para aumentar o tamanho dos polipeptídeos da invenção. Um meio de fazê-lo é a geração de multímeros de peptideos E no terminal C do polipeptídeo precursor de IGF, como aqui ilustrado em certos Exemplos abaixo.

Eliminação do Terminal C de peptideos E - Suspeita-se que a cisteína livre na posição 81 de Eb pode resultar na homodimerização ou em outros efeitos que, quando presentes nos polipeptídeos da invenção, possam levar a fármacos de menor atividade. Dessa forma, a eliminação ou mutação de C81 em Eb pode otimizar a atividade f armacológica. Em um exemplo em particular, a eliminação dos últimos sete aminoácidos de Eb (ou seja, aminoácidos 81-87) é benéfica.

Outras mutações ou modificações - Mutações ou modificações adicionais de IGF que podem ser incorporadas nos polipeptídeos precursores de IGF da invenção são descritas na Patente U.S. N0 5.077.276; e nas Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos 2005/0287151, 2006/0211606 e 2006/0166328.

A invenção deve ser considerada como incluindo todas as seqüências precursoras conhecidas e desconhecidas de IGF-I ou IGF-2 de animal não humano que contêm substancialmente seu peptídeo E nas quais a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou reduzida de acordo com modificações da presente invenção. O tipo preferido de IGF a ser usado depende da espécie do indivíduo tratado. Prefere-se que o IGF seja compatível com a espécie; por exemplo, quando for tratada uma vaca, o tipo preferido de IGF será IGF bovino.

Embora seja provável que todas as formas de IGF tenham um efeito em diferentes indivíduos em função de homologias de seqüências elevadas, a combinação de espécies evitará complicações imunológicas potencialmente adversas decorrentes da indução de uma resposta imunológica a um IGF de uma espécie diferente.

Em uma modalidade da invenção, são fornecidas seqüências precursoras de IGF-1 modificadas de um animal não humano.

Preferem-se seqüências precursoras de IGF-1 que contêm substancialmente seu peptídeo E nas quais a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou reduzida de acordo com modificações da presente invenção de um animal vertebrado.

Por exemplo, essas seqüências incluem, sem limitação, seqüências de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, carneiro, cabra, pássaro, cão, gato, peixe, e semelhantes, de qualquer fonte, seja ela natural, sintética ou recombinante.

Em outra modalidade da invenção, são fornecidas seqüências precursoras de IGF-2 modificadas de um animal não humano.

Preferem-se seqüências precursoras de IGF-2 que contêm substancialmente seu peptídeo E nas quais a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou reduzida de acordo com modificações da presente invenção de um animal vertebrado.

Por exemplo, essas seqüências incluem, sem limitação, seqüências de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, carneiro, cabra, pássaro, cão, gato, peixe, e semelhantes de qualquer fonte, seja ela natural, sintética ou recombinante.

Uso terapêutico de polipeptídeos precursores IGF Indicações - A invenção também inclui o uso de um polipeptideo precursor de IGF da invenção na fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença musculoesquelética. Além disso, a invenção inclui o uso de polipeptídeos precursores de IGF para aumentar a massa muscular ou óssea em um indivíduo, esteja ou não esse indivíduo em risco ou possua uma doença musculoesquelética.

Em particular, a doença musculoesquelética pode ser atrofia muscular. Há muitas causas de atrofia muscular, incluindo atrofia em conseqüência de tratamento com um glicocorticóide como, por exemplo, cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona ou prednisolona. A atrofia muscular também pode ser resultado de denervação em função de trauma de nervos ou conseqüência de neuropatia degenerativa, metabólica ou inflamatória (por exemplo, síndrome de Guillan-Barré, neuropatia periférica ou exposição a toxinas ambientais ou fármacos). Além disso, a atrofia muscular pode ser resultado de uma doença de neurônios motores no adulto, atrofia muscular medular infantil, atrofia muscular medular juvenil, neuropatia motora autoimune com bloqueio condutor multifocal, paralisia em conseqüência de acidente vascular cerebral ou lesão da medula vertebral, imobilização esquelética em conseqüência de trauma, permanência prolongada no leito, inatividade voluntária, inatividade involuntária, estresse metabólico ou insuficiência nutricional, câncer, AIDS, jejum, rabdomiólise, um distúrbio da glândula tireóide, diabetes, hipotonia congênita benigna, doença nuclear central, miopatia nemalona, miopatia miotubular (centronuclear), queimaduras, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença hepática, sépsis, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva ou envelhecimento.

A doença musculoesquelética também pode ser uma sxndrome de distrofia muscular, de Duchenne, Becker, miotônica, fascioescapuloumeral, de Emery-Deifuss, oculofaríngea, escapuloumeral, das cinturas dos membros, uma distrofia muscular congênita ou uma miopatia distai hereditária. A doença musculoesquelética também pode ser osteoporose, uma fratura óssea, baixa estatura ou nanismo.

O IGF-1 é sugerido como tratamento para diabetes insensível à insulina, já que IGF-1 também pode se ligar a heterodímeros do receptor de IGF-1 e do receptor de insulina. Conseqüentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados para o tratamento de diabetes.

IGF-1 é neurotrófico e aumenta a sobrevida de neurônios. Foi sugerido que IGF-1 pode ser usado para o tratamento de casos de morte de neurônios motores, como ocorre, por exemplo, na esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia cerebral, envelhecimento e demência.

Conseqüentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados para o tratamento de condições associadas à morte neuronal, por exemplo, ALS, atrofia cerebral ou demência.

IGF-1 aumenta as populações tanto de células brancas quanto de células vermelhas, e possui um efeito aditivo à administração de eritropoietina. Conseqüentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados para o tratamento de anemia.

Como IGF-I e IGF-2 são reguladores onipresentes e essenciais da divisão celular e do crescimento de vertebrados, eles podem ser usados vantajosamente em diversos métodos veterinários para aumentar de forma exógena ou manter o crescimento em um animal. Alguns exemplos incluem, sem limitação:

(i) aumento da taxa e/ou da extensão do crescimento em um animal, por exemplo, aumento do crescimento muscular em suínos, gado, aves e peixes;

(ii) aumento da eficiência de sua conversão de ração em tecido corporal (proporção carne/gordura), por exemplo, em suínos, gado, carneiros, aves e peixes; e

(iii) aumento da produção de leite em animais lactantes, por exemplo, gado leiteiro, carneiros, cabras.

Outras aplicações terapêuticas veterinárias incluem, sem limitação:

(iv) tratamento dos sintomas de emaciação do animal associados à caquexia, trauma ou outras doenças consumptivas, por exemplo, em animais de estimação como, por exemplo, cães, gatos e cavalos; e

(v) tratamento de animais lactantes para melhora da saúde neonatal, por exemplo, porcas lactantes, para aumento do desempenho neonatal.

Métodos de administração - Os polipeptídeos da invenção podem ser liberados de diversas formas, incluindo o uso de veículos de liberação gênica. Métodos conhecidos na técnica para a liberação terapêutica de agentes como, por exemplo, proteínas ou ácidos nucléicos, podem ser usados para a liberação terapêutica de um polipeptídeo da invenção, por exemplo, transfecção celular, terapia gênica, administração direta com um veiculo de liberação, ou veículo farmaceuticamente aceitável, liberação indireta por fornecimento de células recombinantes que contêm um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo.

Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar o polipeptídeo da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomos, micropartícuias, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar a proteína, endocitose mediada por receptor (veja, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4.429-4.432, 1987), construção de um ácido nucléico como parte de um vetor retroviral, viral adeno-associado, adenoviral, poxviral (por exemplo, avipoxviral, particularmente poxviral de aves) ou outro vetor etc. Métodos de introdução podem ser enterais ou parenterais, e incluem, sem limitação, as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, pulmonar, intranasal, intra-ocular, epidural e oral. Os polipeptídeos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolo, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal etc.), e podem ser administrados juntos com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, anexado a um reservatório, por exemplo, um reservatório de Ommaya. Também pode ser empregada a administração pulmonar, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossol.

Em uma modalidade especifica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente na área que necessita de tratamento; isso pode ser obtido, por exemplo, e não como limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter, ou por meio de um implante, o implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas como, por exemplo, membranas de silástico, fibras ou substitutos cutâneos comerciais.

Em outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em uma vesícula, em particular um lipossomo (veja Langer, Science 249: 1.527-1.533, 1990). Ainda em outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser usada uma bomba. Em outra modalidade, podem ser usados materiais poliméricos (veja Howard e cols., J. Neurosurg. 71: 105, 1989). Em outra modalidade, na qual o agente ativo da invenção é um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de sua proteína codificada, por sua construção como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado, e sua administração de forma que ele se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.980.286), ou por injeção direta, ou pelo uso de bombardeamento com micropartículas (por exemplo, uma pistola gênica; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipídeos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, ou por sua administração em ligação com um peptídeo homeobox-Iike, que sabidamente penetra no núcleo (veja, por exemplo, Joliot e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1.864-1.868, 1991) etc. Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para expressão, por recombinação homóloga.

Transfecção celular e terapia gênica - A presente invenção engloba o uso de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos da invenção para a transfecção de células in vitro e in vivo. Esses ácidos nucléicos podem ser inseridos em qualquer um dentre diversos vetores bem conhecidos para transfecção de células-alvo e organismos. Os ácidos nucléicos são transfectados em células ex vivo e in vivo, por meio da interação do vetor e da célula-alvo. As composições são administradas (por exemplo, por injeção em um músculo) a um indivíduo, em uma quantidade suficiente para despertar uma resposta terapêutica.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de um local-alvo, ou seja, uma célula ou tecido- alvo de um animal, que inclui a transfecção de uma célula com um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção, em que o ácido nucléico inclui um promotor indutível ligado operacionalmente ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de fusão visado.

Terapias combinadas - Em várias modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais compostos ou terapias adicionais. Por exemplo, vários polipeptídeos podem ser co- administrados em conjunto com um ou mais compostos terapêuticos. A terapia combinada pode englobar a administração simultânea ou alternada. Além disso, a combinação pode englobar a administração aguda ou crônica.

Os polipeptídeos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes anabólicos como, por exemplo, testosterona ou moduladores específicos do receptor de androgênio (SARMs). Agentes anabólicos adicionais incluem hormônio do crescimento (GH) ou moléculas que induzem a liberação de GH. Grelina é particularmente útil em uma terapia combinada para caquexia, já que a Grelina pode causar um aumento do apetite. De forma similar, os polipeptídeos da invenção podem ser combinados com suplementos protéicos para aumentar o anabolismo, ou combinados com fisioterapia ou exercícios para aumentar o peso corporal. Qualquer molécula que iniba miostatina também é uma candidata para terapia combinada.

Composições farmacêuticas - A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem uma proteína precursora de IGF da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopéia Americana ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais ou em seres humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a substância terapêutica é administrada. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, por exemplo, água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animais, de origem vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e semelhantes. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol, e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes adoçantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. Essas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada, e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais como, por exemplo, triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos padronizados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

Em algumas modalidades, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como, por exemplo, lidocaína, para reduzir a dor no local da injeção. Quando a composição for administrada por infusão, ela poderá ser liberada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Quando a composição for administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina poderá ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados, antes da administração.

Os polipeptídeos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres como, por exemplo, aqueles derivados do ácido clorídrico, fosfõrico, acético, oxálico, tartárico etc., e aqueles formados com grupos carboxil livres como, por exemplo, aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína etc.

A quantidade de um polipeptídeo da invenção que será eficaz no tratamento de uma condição ou doença pode ser determinada por técnicas clínicas padronizadas, com base na presente descrição. Além disso, opcionalmente podem ser empregados ensaios in vitro para ajudar a identificas faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da condição, e deve ser decidida de acordo com a avaliação do profissional e de cada circunstância do indivíduo. No entanto, faixas de dosagens adequadas para administração intravenosa são geralmente de cerca de 20- 5.000 microgramas de composto ativo por quilograma de peso corporal. Faixas de dosagens adequadas para administração intranasal são geralmente de cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de um modelo animal. Em particular, um regime de dosagem possível pode ser de cerca de 60 a 120 μg/kg de peso corporal, de injeção subcutânea, duas vezes ao dia.

Uso veterinário

A dosagem pode diferir quando se administra a um animal saudável versus aqueles animais que sofrem de uma doença. Uma avaliação da dosagem apropriada pode ser feita facilmente por aqueles habilitados na técnica com a utilização de ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, o ensaio de proliferação de mioblastos (Exemplo 79) ou o ensaio de tecido epitelial mamário (Exemplo 80), como descrito abaixo. Ensaios gerais para a medida do IGF também são conhecidos na técnica como, por exemplo, aqueles no Exemplo 81.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que algumas espécies de animais exibem fertilidade sazonal influenciada pela duração do período de luz. Qualquer modalidade de um método ou uso veterinário pode opcionalmente incluir o início do método de tratamento em um momento específico dentro do ciclo reprodutivo do animal a fim de se obter o efeito desejado. Aqueles habilitados na técnica saberão que o estado e o ciclo reprodutivo podem ser facilmente determinados e, se desejado, sincronizados pelo uso de um regime apropriado.

Quando usado para indicações veterinárias, o peptídeo de IGF-I ou IGF-2 da presente invenção também pode ser usado como uma administração oral, ou um suplemento às rações orais ou sólidas para animais. A invenção é ainda descrita, mas não limitada, pelos Exemplos que serão apresentados a seguir.

Exemplos

Exemplo 1

Foi construído um vetor de expressão de DNA que codifica o polipeptídeo precursor de hIGF-l-Ea que contém as seguintes modificações: eliminação de Gl, eliminação de P2 e eliminação de E3; mutação de R37 para A; e eliminação de R71 e eliminação de S72. Essas mutações são, algumas vezes, denominadas "3mut" ao longo da presente especificação. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavrà gsagnkiiyrm

(ID. DE SEQ. N°: 8)

Células Cos7 (disponíveis por ATCC) foram mantidas em DMEM contendo soro fetal bovino 10%, 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina, e plaqueadas em uma densidade de 1 χ IO6 células por placa de 10 cm. Essas culturas de células foram transf ectadas com 8 ^ig de plasmídeo de expressão com o uso de Fugene (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quarto horas pós-transfecção, as células foram lavadas uma vez e cultivadas em meio sem soro por 48 horas. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -80°C.

A fim de avaliar a estabilidade do polipeptídeo no soro humano, sobrenadantes coletados das células Cos7 transf ectadas com hIGF-lEa do tipo selvagem (wt) e hlGF- lEa3mut foram incubados por 16 horas a 37°C, na ausência ou presença de soro humano 10% (Sigma). As amostras foram separadas por SDS-PAGE 18%, e foi realizado imunoblotting com o uso de anticorpo policlonal de cabra para IGF-I humano. Os resultados na Fig. 1A indicam que, embora o wt hIGF-lEa tenha sido substancialmente degradado após incubação com soro por 16 horas, o hIGF-lEa3mut estava estabilizado. A densitometria indicou que a proporção de IGF-I clivado para não clivado foi de cerca de 1:6,2, enquanto a proporção para hIGF-lEa3mut foi de cerca de 1:0,68, mostrando que essas mutações resultam em um polipeptídeo estabilizado.

Para confirmar que o hIGF-lEa3mut era capaz de sinalizar por meio do IGF-1R, foi medida a fosforilação de AKT de células em contato com o polipeptídeo. As células C2C12 foram adquiridas de ATCC e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro fetal bovino 10% (AMIMED) com alto teor de glicose (Invitrogen) , 100 U/ml de penicilina (Invitrogen), 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen) e 2 mM de glutamina (Invitrogen). Para análise da fosforilação de AKT, as células C2C12 foram plaqueadas em uma densidade de 0,15 χ 10^6 células por poço de uma placa de 6 poços, e foram cultivadas em meio de crescimento por 72 horas. As células ficaram em jejum por quatro horas em meio sem soro, e depois foram estimuladas com diferentes ligantes a 37°C por 30 minutos. As células foram lisadas com tampão PhosphoSafe (Cell Signaling) contendo vários inibidores de protease e depuradas por centrifugação a 14.000 χ g por 15 minutos a 4°C. A fosforilação de AKT e os níveis totais de AKT foram analisados por ELISA com o uso do kit de ELISA em sanduíche PathScan fosfo AKT (Ser4 73) e o kit de ELISA em sanduíche PathScan AKT (Cell Signaling) , respectivamente. Os resultados da fosforilação de AKT estão resumidos na Fig. 2A, indicando que o hIGF-lEa3mut foi capaz de ativar a via celular de IGF-IR em um grau similar ao reagente de controle positivo long-R3-IGF-1 e ao IGF-I recombinante. Além disso, os dados na Fig. 5 mostram diretamente que hIGF-lEa3mut leva à fosforilação de AKT.

A seguir, para assegurar que a especificidade do receptor do hIGF-lEa3mut permaneceu com o IGF-IR, foram adicionados vários ligantes às culturas de NIH3T3 que superexpressam receptor de IGF-IR ou de insulina (InsR). Essas células foram cultivadas sob as mesmas condições descritas acima para células Cos7. Para análise da fosforilação de IGF-IR e InsR, células NIH3T3-IGFIR e NIH3T3-InsR foram plaqueadas em uma densidade de 0,2 χ IO6 células por poço de uma placa de 6 poços, e foram cultivadas em meio de crescimento por 24 horas. As células ficaram em jejum por 18 horas em meio sem soro, e depois foram estimuladas com diferentes ligantes a 37°C por 10 minutos. As células foram lisadas como descrito acima para o experimento de AKT, e os niveis de fosforilação de IGF-IR e InsR foram analisados por ELISA usando o kit de ELISA DuoSet IC fosfor-IGFIR e -InsR humano (R&D Systems). Os resultados resumidos nas Figs. 3A e 3B indicam que esse polipeptídeo precursor de IGF-I retém a especificidade pelo receptor de IGF-I e deve se ligar ao receptor de insulina relacionado com baixa afinidade.

Exemplo 2

Foi construído um vetor de expressão de DNA que codifica o polipeptídeo precursor de hIGF-l-Eb que contém as seguintes mutações: eliminação de Gl, eliminação de P2 e eliminação de E3 / mutação de R37 para A; e eliminação de R71 e eliminação de S72 (ou seja, o "3mut"). Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfivkptgygsssarapqlgivdecc IrscdlrrlemycaplkpaJísavraqrhtdmpktqkyqppstnk ntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 9)

0 polipeptídeo foi testado de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. IB e o uso de densitometria indicaram que a proporção de IGF-I clivado para não clivado foi de cerca de 1:9, enquanto a proporção para hIGF-lEb3mut foi de cerca de 1:1, mostrando que essas modificações resultam em um polipeptídeo estabilizado. A Fig. 2B indica que o hIGF-lEb3mut foi capaz de ativar a via celular de IGF-IR em um grau similar ao reagente de controle positivo long-R3-IGF-I e ao IGF-I recombinante. Além disso, os dados na Fig. 5 mostram diretamente que hIGF-lEb3mut leva à fosforilação de AKT. Os resultados resumidos nas Figs. 3C e 3D indicam que esse polipeptídeo precursor de IGF-I retém a especificidade pelo receptor de IGF-I e deve se ligar ao receptor de insulina relacionado com baixa afinidade.

Exemplo 3

Foi construído um vetor de expressão de DNA que codifica o polipeptídeo precursor de hIGF-l-Ec que contém as seguintes mutações: eliminação de Gl, eliminação de P2 e eliminação de E3 ; mutação de R37 para A; e eliminação de R71 e eliminação de S72 (ou seja, o "3mut"). Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgae Ivdalq fvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrleraycaplkpaksavraq-rhtdmpktqkyqppstnkn tksqrrkgstfeerk (ID. DE SEQ. N°: 10)

O polipeptídeo foi testado de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. 1C e o uso de densitometria indicam que a proporção de IGF-I clivado para não clivado foi de cerca de 1:5, enquanto a proporção para hIGF-lEc3mut foi de cerca de 1:0,96, mostrando que essas modificações resultam em um polipeptídeo estabilizado. A Fig. 2D indica que o hlGF- 1Ec3mut foi capaz de ativar a via celular de IGF-IR em um grau similar ao do reagente de controle positivo long-R3- IGF-I e ao IGF-I recombinante. Além disso, os dados na Fig. 5 mostram diretamente que hIGF-lEc3mut leva à fosforilação de AKT. Os resultados resumidos nas Figs. 4A e 4B indicam que esse polipeptídeo precursor de IGF-I retém a especificidade pelo receptor de IGF-I e deve se ligar ao receptor de insulina relacionado com baixa afinidade.

Exemplo 4

Foi construído um vetor de expressão de DNA que codifica o polipeptídeo precursor de hIGF-1-Eab quimérico que contém as seguintes modificações ao peptídeo hIGF-1-Eb: eliminação de Gl, eliminação de P2 e eliminação de E3 ; mutação de R37 para A; eliminação de R71 e eliminação de S72 (ou seja, o "3mut"); e inserção dos aminoácidos de Ea 93 a 102 entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb. A inserção cria um suposto sinal de glicosilação ligada ao N em N92.

Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgw^

nasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaec rgkkgk (ID. DE SEQ. N°: 11).

O polipeptídeo foi testado de acordo com alguns dos procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. 2C indica que o hIGF-lEab3mut foi capaz de ativar a via celular de IGF-IR em um grau similar ao reagente de controle positivo long-R3-IGF-1 e ao IGF-1 recombinante. Os resultados resumidos nas Figs. 4C e 4D indicam que esse polipeptídeo precursor de IGF-I retém a especificidade pelo receptor de IGF-I e não ativa o receptor de insulina.

Exemplo 5

Foi construído um vetor de expressão de DNA que codifica o polipeptídeo precursor do multímero de hIGF-l-Eb que contém as seguintes mutações: eliminação de Gl, eliminação de P2, eliminação de E3, eliminação de R36, eliminação de R37, eliminação de R71, eliminação de S72, eliminação dos últimos sete aminoácidos do terminal C de Eb; e inserção ao terminal C desse precursor de dois peptídeos Eb adicionais, ambos sem a R71 e S72 e os últimos sete aminoácidos do terminal C e um quarto e último peptídeo Eb sem R71 e S72 . A Fig. 6A mostra um desenho esquemático dessa construção. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

IlcgaeIvdaIqfVcgdrgfytnkptg ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsm

kegteaslqirgkkkeqrreigsmacrsvraqrhtdmpktqkyqppslnknlksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrr eigsmaersvraqrhtdmpktqkyqppstakntksqrrkg\vpkthpggeqkegteaslqirgkkke.qiTei

(ID. DE SEQ. N°: 12)

Esse polipeptídeo foi submetido a um ensaio de fosforilação de AKT, como descrito no Exemplo 1. A Fig. 5 indica que esse multímero de hIGF-l-Eb foi capaz de sinalizar através da via de IGF-1R. Exemplo 6

Um polipeptídeo precursor de hIGF-1-Eb da invenção, como mostrado esquematicamente na Fig. 6B, pode ser expresso. Essa construção contém as seguintes modificações: eliminação de G1, eliminação de P2, eliminação de E3, eliminação de R36, eliminação de R37, eliminação de R71, eliminação de S72; e a inserção dos aminoácidos de Ea 93- 102 entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb, criando, dessa forma, um sitio de glicosilação ligado ao N na posição N92 e N100. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgae Ivd aiq fvcgdrgfy fn kptgygs ssapqtg i vde^ srgsagnkntksqrrkgwpkthpggcqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N°: 13)

Exemplo 7

Um polipeptídeo precursor de hIGF-2-Ε da invenção que possui as seguintes modificações pode ser expresso: eliminação de P4, eliminação de S5 e eliminação de E6 ; mutação de R38 para A; e eliminação de R68 e eliminação de D69. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada: ay rt i c gge I ν dt 1 q fvc gd rg f y fs^as rv s rasrgí ν eeccfr stqrlrrg]pallrarrghvlake!eaireakrhrplialptqdpahggappema$nrk

(ID. DE SEQ. N0: 14)

Exemplo 8

Um polipeptídeo precursor de hIGF-l-Ea da invenção que possui as seguintes mutações pode ser expresso: eliminação de G1 e eliminação de P2; mutação de E3 para X, em que X é um aminoácido não natural que é peguilado; mutação de R3 7 para A; e eliminação de R71 e eliminação de S72. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada: XtlcgacIvdalqfVcgdrgfy fnJtptgygsssraapqtgivdccxfrscdlrrlemycapikpaksavraqrhtdmpktqlcevhlkna srgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N°: 15)

Exemplos 9-78 (A= eliminação)

9) hIGF-l-Ea: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfiikptg>'gsssarapqtgivdeccfrscdIiTlemycaplkpaksasvraqrhtdnrpktqk rgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N°: 16)

10) hIGF-l-Ea: AGl, ΔΡ2, AE3; R36A; AS72 rlcgaelvdaíqfvcgdrgíylnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdm pktqkevhlknas rgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 17)

10) hIGF-l-Ea: AGI, AP2, AE3; R36A; AR71, AS72

Ucgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlnlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevtlk gsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 18)

11) hIGF-l-Ea: AGI, AP2, AE3; R37A; AR71

tlcgae Ivdaiqfvcgdrgfyfhkptgy gsssraapqtgivdec^^ rgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 19)

12) hIGF-l-Ea: AGI, AP2, AE3; R37A; AS72

tkgae IvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdM^ rgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 20)

13) hIGF-l-Ea: AGI, AP2, AE3, AR3 7; AR71

tlcgaclvda(qfcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpkíqk gsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N°: 21)

14) hIGF-l-Ea: AGI, AP2, AE3, AR37; AS72 Ilcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdec^ ^ gsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N°: 22)

15) hIGF-l-Ea: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; AR37; ART1, ΔΞ72

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrleinycaplkpaksavraqrlvtdmpktqkevhlknasrg sagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 23)

16) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71

tÍcgaelvdalqf\'cgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrleraycap!kpaksa

kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 24)

17) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; Δ372

tlcgaclvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccf^^^ kntksqrrkgvvpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 25)

18) hIGF-l-Eb: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71

tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeecfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdrapktqkyqppstn kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 26)

19) hIGF-l-Eb: AGI1 ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS72

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppsín

kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 27)

20) hIGF-l-Eb: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AST2

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirriemycaplkpaksavraqrhtdmpktqky ntksq rrkgwpk th pggeqke gtcas Iq i rgkkkeq rreigsrnaec rgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 28)

21) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR3 7; AR71

tlcgaelvdak]ívcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgÍvdeccfrscdIrrlemycaplkpaksasvraqrhtdnipktqkyq ntksqrrkgwpkthpggeqkegleaslqifgkkkeqrrcigsmaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 29)

22) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR31; AS72

tlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksarvraqrhldmpktqkyqpps níksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 30)

23) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqlVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdnipktqkyqppstnkn tksqiTkgvvpklhpggeqkegteasIqirgkkkeqrreígsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 31)

24) hIGF-l-Ec: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71

t[çgac!vdalqf\'cgdrgíyfekptg>'gsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak.sasvraq

kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N°: 32)

25) hIGF-l-Ec: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AS72

ílcgaelvdalqivcgdrgfyíVikptgygsssarapqtgivdcccfrscdlrrlcmycaplkpaksai^raqrhtdm

kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 33)

26) hIGF-l-EC: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71, AS72

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssarapqtgivdecclrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnk

ntksqrrkgstfccrk

(ID. DE SEQ. N0 : 34)

27) hIGF-l-Ec: AGl, ΔΡ2, ΔΕ2; R3 7A; AR71

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdnipkiqkyqppstn

kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 35)

28) hIGF-l-Ec: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdcccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 36)

29) hIGF-l-EC: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R3 7A; AR71, AS72 tlcgaclvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqt.givdecefrscd lrrlemyeaplkpaksa

Iitksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 37)

30) hIGF-l-EC: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, AR71

tlcgaelvdalqrvcgdrglyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstn

ntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 38)

31) hIGF-l-Ec: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, ΔΞ72

t Icgael vdalqtVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrleinyGaplkpaksarvraqrhtdiiipktqkyqppstnk

η tk s q rr kgstfee rk (ID. DE SEQ. N0: 39)

32) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71; inserção dos aa de Ea 93-102 entre aa 95 e 96 de Eb (ou seja, "Eab")

tlcgaelvdalqfVcgdrgíyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscd Irrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppsm knasrgsagnkntksqrrkgvvpkthpggeqkegteas Iqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N°: 40)

33) hIGF-1-Eab: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71 ílcgaelvdalqfvcgdrgfylhkptgygsssraapqtgw^

knasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreLgsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 41)

34) hIGF-1-Eab: AGI1 ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, AR71 tlcgaelvdalqlvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeecfrscdlrr^ nasrgsagnkntksqrrkgvvpkthpggeqkegteasíqirgkkkeqrrcigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 42)

35) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AS12 (Icgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssarapqtgivde

knasrgsagiikntksqn-kgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreígsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N°: 43)

36) hIGF-l-Eab: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS12

tlcgaelvdalqívcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdln-lemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstn knasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsníaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 44)

37) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, ÁR37, AS72

(Icgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqígivdeccfrscdl^ nasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeíjkcgtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 45)

38) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71, Δ372

tlcgaelvdalqfvOgdrgfyfTikptgygsssarapqtgi

nasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N°: 46)

39) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, AR71, áS12

asrgsagnkntksc|rrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkcqrfcigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 47)

40) hIGF-l-Ea: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72

gticg; srgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N°: 48)

41) hIGF-l-Eb: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, ÁS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivde^ kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 49)

42) Multímero de hIGF-l-Eb: (AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3 χ Eb ^R71, AS72, ΔΟ-termo 7 aa)-Eb(AR71, ΔΞ72)

tlcgaclvdalqf\'cgdrgf>'fnkptgygsssraapqtgivde^ct>scdlrrlcmycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnk ntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgw kegteas Iqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktq kyqppstnkntksqrrkgvvpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrrei gsrnaevraqrhtdiTipktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkcqrrcigsrnaecrgkkgk ·

(ID. DE SEQ. N0: 50)

43) Multímero de hIGF-l-Eb: (ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3 χ Eb (AR71, AS72, AC-termo 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gtlcgae]vdalqfvcgdrgf>'fnkptg>fgsssraapqtgivdeccfrscd Irrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrTkgvvpkthpggeqkegteaslqírgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpgge qkegtcaslqirgkkkeq^eigsrnáevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqÍrgkkkeqrr cigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 51)

44) hIGF-l-EC: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72

gticgaelvdalqfvcgdrgiyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 52)

45) hIGF-l-Ea: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72

gpt IcgaeI v'dalqfvcgdrgf\fnkptg>gsssraapqtgivdeccfrscd Irrlemy caplkpaksavraqrh asrgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 53)

46) hIGF-l-Eb: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72

gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdcccfrscdlrTlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppst nkntksqrrkgvvpkthpggeqkegteasIqirgkkkeqrreÍgsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 54)

47) Multímero de hIGF-1-Eb: (AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R3 7A)- 3xEb(AR71, AS72, AC-termo 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

tlcgaelvdalqfvcgd rgfyfnkptgy gsssníapqtgivdeccírscd Irrleinycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnk ntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqn-eigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeq kegteaslqirgkkkeqrreÍgsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgvvpkthpggeqkegteasIqirgkkkcqrr gsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegleaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 55)

48) Multímero de hIGF-1-Eb: (ΔΕ3; R37A) -3xEb(AR71, AS72, AC-termo 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

gptJcgaeívdalqlVcgdrgfyfnkptgygsssm^

η kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqiVgkkkeqíTeigsrnaevrdqrhtdmpktqkyqppsTnkntksqrrkg vvpkthpg

geqkegleaslqirgkkkeqrreigsriiaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeq

rreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsmaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 56)

49) hIGF-l-Ec: ΔΕ3; R3 7A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrs^ nkntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 57)

50) hIGF-l-Ea: ΔΕ3; R3 7A; AR71, Δ372 gptlcgaelvdalqfcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrr !emycaplkpaksavraqrhldmpktqkevh Ikn asrgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 58)

51) hIGF-l-Eb: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfre nkntksqrrkgwpkthpggeqkegteas Iqirgkkkeqrrcigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 59)

52) hIGF-l-Ec: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72

gptícgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivde nkntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 60)

53) hIGF-l-Eab: ΔΕ3; R37A; AR71, AS12

gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkpcgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdnipktqkyqppst nknasrgsagnkntksqn-kgwpkthpggcqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 61)

54) Multímero de hIGF-l-Eb: (ΔΕ3; R37A)-3 χ Eb (AR71, AS72, AC-termo 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

gptlcgaeivdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrleraycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppst nkntksqrrkgwpkthpggeqkegleaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpklqkyqppslnkritksqrrkgwpkthpg geqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnacvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpktíipggeqkegteaslqirgkkkeq rreigsrnaevraqrhtxJmpktqkyqppstnkntksqrrfcgw

(ID. DE SEQ. N0: 62)

55) hIGF-l-Ea: E3A; R3 7A; AR71, AS72

gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlk nasrgsagnknyrm (ID. DE SEQ. N°: 63)

56) hIGF-l-Eb: E3A; R37A; AR71, Δ372

gpatlcgaeivdalq TvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecclTscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqk^ tnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 64)

57) hIGF-l-Ec: E3A; R37A; ÁR71, AS72

gpatlcgaelvdalqfvcgdrgiyfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdlrrlernycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqpps

tnkntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N°: 65)

58) hIGF-l-Eab: E3A; R37A; AR71, AS72

gpatlcgaelvdalqfvcgdrgíNvfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdliTlemycaplkpaksavraqrhtdmpkiqky

tnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N° : 66)

59) Multímero de hIGF-l-Eb: (E3A; R37A) -3 χ Eb (AR71, AS72, AC-termo 7 aa)-Eb (AR71, AS72)

gpatlcgaclvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdecctrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdinpktqky tnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkihpg geqkegteas Jqirgkickeqrreigsrn aevraqrhtdmpktqky^

rreigsmaevraqrhtdrapktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkcqrreigsmae (ID. DE SEQ. N0: 67)

60) hIGF-l-Ea: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaclvdalqf\xgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdcccfrscdlrrlemyeaplkpaksavraqrhtdnipktqkevh Ikria

srgsagnknyrra

(ID. DE SEQ. N0: 68)

61) hIGF-l-Eb: ΔΡ2, ΔΕ3; R3 7A; AR71, AS72

gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavTaqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrrkgwpklhpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 69)

62) hIGF-l-EC: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, ΔΞ72

gtlcgaetvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqigivdeccfrscdliTlcmycaplkpaksavraqrhtdnipktqkyqppstn kntksqrrkgstfeerk (ID. DE SEQ. N0: 181)

63) hIGF-1-Eab: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaclvdalq Ivcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscd Irrlem knasrgsagnkirtksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N°: 70)

64) Multímero de hIGF-l-Eb: (ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3 χ Eb (AR71, Α3Ί2, ΔΟ-termo 7 aa)-Eb (AR71, ΔΞ72)

gtlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlcmycaplkpaksavraqrhtd kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmacvraqrlndmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpgge qkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkiitksqnkgwpkthpggeqkcgtcaíikiirgkkkeqrr eigsrnaev raqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpktlTpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaccrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 71)

65) hIGF-1-Eb: AGI, ΔΡ2; E3X; R37A; ARTl, AS12 Xtlcgaeivdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdn^ knlksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N°: 72)

66) hIGF-l-Ec: AGl, ΔΡ2; E3X; R37A; AR71, ΔΞ72

XtlcgaelvdalqfVcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrsedlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppsin kntksqnkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N°: 73)

67) hIGF-l-Eab: AGl, ΔΡ2; E3X; R37A; AR71, AS72

XticgaeI vdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdccctTscdlrrlemycaplkpaksavraqrhídmpkíqkyqppstD knasrgsagnkiitksqrrkgwpkthpggeqkegi.easlqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 74)

68) Multímero de hIGF-l-Eb: (AGI, ΔΡ2; E3X; R37A)-3 χ Eb (AR71, Asi2, AC-termo 7 aa)-Eb (AR71, Δ372)

Xtlcgaelvdalqfvcgdrg íyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpg qkegteasiqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgvvpkthpggeqkegíeaslqirgkkkeqrr eigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstiikntksqrrkgvvpkthpggeqkegteaslqírgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 75)

69) hIGF-1-Ea: AGl, ΔΡ2 , ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfy TnkptgygsssraapqTgivdecc Irscd IrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkcvh srgsagnknyrm

(ID. DE SEQ. N0: 76)

70) hIGF-l-Eb: AGl, ΔΡ2, ΔΕ3; R3 7A; AR71; S7 2X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyínkptgygsssraapqtgivdeccrrscdlrrlernycaplkpaksaXvraqrhtdtnpktqkyqppstn kníksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrretgsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N°: 77)

71) hIGF-l-Ec: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvxgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstn kntksqrrkgstfeerk

(ID. DE SEQ. N0: 78)

72) hIGF-I-Eab: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqíVcgdrgí>€nkptgygsssraapqtgtvdeccfrscdlrrlcmvcapIkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppsto knasrgsagnkfitksqrrkgwpkthpggeqkcgtcaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk

(ID. DE SEQ. N0: 79)

73) Multímero de hIGF-l-Eb: (AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-Eb(AR71 ; S72X; AC-termo 7 aa)-2 χ Eb (AR71, AS72, AC-termo 7 aa) - Eb(AR71, AS72)

tlcgaelvdakj Ivcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdl kntksqn-kgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntk qkxgteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqpp

eigsnvaeTaqrhtdmpktqkyqppsttikntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsrnaecrgkkgk (ID. DE SEQ. N0: 80)

74) hIGF-l-Ea: AGI, ΔΡ2, AE3; R37A; AR71, AS12; N92X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrr IemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhIkXas rgsagnknyrrn

(ID. DE SEQ. N0: 81)

75) hIGF-l-Eb: AGI, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72; C142X <table>table see original document page 56</column></row><table>

Exemplo 79: Ensaio de proliferação de rnioblastos

O ensaio de proliferação de rnioblastos fornece um indicador in vitro confiável da atividade de IGF, e é usado como um modelo para os fatores que afetam rnioblastos embriônicos e células satélites adultas. Os fatores ativos nesse sistema se comportam similarmente em culturas primárias de rnioblastos. O aumento da proliferação de rnioblastos in vitro por um peptideo desta invenção indica sua atividade na produção de aumento da proliferação de rnioblastos e, portanto, um aumento no número final de miofibras no útero. Além disso, um aumento similar da proliferação de rnioblastos indica que os peptídeos desta invenção podem ser usados para aumentar a hipertrofia muscular do adulto, por exemplo, por meio da estimulação de proliferação de células musculares satélites. Exemplo 80: Ensaio de tecido epitelial mamário

Em animais lactantes, a quantidade de tecido epitelial mamário é um fator limitante na produção de leite, na medida em que essas são as células que produzem e secretam o leite. Com o emprego de sistemas in vitro, células epiteliais obtidas de glândulas mamárias de animais podem ser estimuladas pelo IGF-I ou IGF-2 modificado da presente invenção para proliferar e produzir quantidades aumentadas de constituintes do leite. Pode ainda ser demonstrado que células epiteliais mamárias estimuladas para proliferar em um sistema celular in vitro desse tipo podem ser re- implantadas em coxins de gordura mamária depurada e ser estimuladas a proliferar e/ou produzir leite em fêmeas lactantes de animais.

Exemplo 81: Medida de IGF-I ou IGF-2 no sangue ou em outros líquidos corpóreos

A quantidade eficaz do peptídeo administrada por via parenteral por dose pode ser medida por uma curva de dose- resposta. Por exemplo, os peptídeos de IGF modificados da invenção podem ser. medidos no sangue ou em líquidos corporais do indivíduo a ser tratado para determinar a dosagem. Alternativamente, pode-se administrar quantidades crescentes do peptídeo ao indivíduo e verificar os níveis séricos do indivíduo em relação ao IGF-I e IGF-2 modificado. A quantidade de peptídeo a ser empregada pode ser calculada em termos molares com base nesses níveis séricos de IGF-I ou IGF-2 modificado.

Um método para determinar a dosagem apropriada do peptídeo se baseia na medida de um peptídeo de IGF da invenção em um líquido biológico como, por exemplo, um líquido corpóreo ou sangue. A medida desses níveis pode ser feita por qualquer meio, incluindo RIA e ELISA. Após a medida dos níveis de IGF, o líquido é colocado em contato com o peptídeo com o uso de doses únicas ou múltiplas. Após essa etapa de contato, os níveis de IGF são novamente medidos no líquido. Caso os níveis de IGF no líquido tenham caído em uma quantidade suficiente para produzir a eficácia desejada para a qual a molécula deve ser administrada, então a dose da molécula poderá ser ajustada para produzir eficácia máxima. Esse método pode ser realizado in vitro ou in vivo. De preferência, esse método é efetuado in vivo, ou seja, após o líquido ser extraído de um indivíduo, e os níveis de IGF medidos, o peptídeo da invenção é administrado ao mamífero com o uso de doses únicas ou múltiplas (ou seja, a etapa de contato é obtida por administração a um animal), e depois os níveis de IGF são medidos novamente do líquido extraído do animal.

Outro método para determinação da dosagem é o uso de anticorpos para o peptídeo ou outro método de detecção para o peptídeo em um formato LIFA.

Exemplo 82: Farmacocinética in vivo de hIGF-l-Ec 3mut

Machos de camundongos adultos (n = 3/grupo) receberam uma injeção intravenosa (i.v.) em bolo de rhIGF-1 a 1 mg/kg e hIGF-l-Ec 3mut (descrito no Exemplo 3) a 1,55 mg/kg. Foram coletadas amostras seriais de sangue em 5, 15, 30 e 60 minutos após a administração do material de teste. As concentrações séricas de rhIGF-1 e hIGF-l-Ec 3mut foram determinadas por ELISA. Esse ensaio é específico para hlGF-1.

Foram administradas doses eqüimolares de rhIGF-1 e de hIGF-1-Ec 3mut i.v. em camundongos. Os resultados mostram níveis significativamente maiores da proteína hIGF-l-Ec 3mut comparada com rhIGF-1 em todos os pontos do tempo examinados, indicando que o hIGF-1-Ec 3mut é metabolicamente mais estável do que o IGF-I com comprimento de 70 aminoácidos.

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Claims (44)

1. Polipeptídeo caracterizado por compreender uma proteína precursora de IGF-1 de um animal não humano, em que a clivagem do peptídeo-E de IGF-1 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora de IGF-1 de animal não humano se origina de uma espécie vertebrada não humana.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a espécie vertebrada não humana é selecionada de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, carneiro, cabra, pássaro, cão, gato ou peixe.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora compreende o peptídeo Ea.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo Ea é selecionado de uma seqüência de um animal não humano da Figura 8A.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora compreende o peptídeo Eb.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo Eb é selecionado de uma seqüência de um animal não humano da Figura 9A.

8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que os últimos sete aminoácidos do terminal C de Eb são eliminados.

9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora compreende o peptídeo Ec.

10. Polipeptxdeo, de acordo cora a reivindicação .9, caracterizado pelo fato de que o Ec é selecionado de uma seqüência de um animal não humano da Figura 10A.

11. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que Gl da proteína precursora é eliminado ou mutado.

12. Polipeptideo, de acordo cora qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que P2 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

13. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que E3 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

14. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que R36 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

15. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que R3 6 é mutado para alanina.

16. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que R37 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

17. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que R37 é mutado para alanina.

18. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15, 16 ou 17, caracterizado ainda por compreender a seqüência de consenso de glicosilação ligada ao N NXS/T.

19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado ainda por compreender os aminoãcidos 93-102 de Ea inseridos entre os aminoácidos N95 e T96 do Eb.

20. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado ainda por compreender um oligossacarídeo ligado covalentemente a uma cadeia lateral de aminoácido da proteína precursora.

21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo está ligado covalentemente a uma cadeia lateral de arginina da proteína precursora.

22. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que um resíduo da proteína precursora é substituído por um aminoácido não natural.

23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não natural compreende um grupo acetileno ou azido.

24. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizado ainda por compreender uma porção poli(etileno glicol) ligada covalentemente a uma cadeia lateral da proteína precursora.

25. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado ainda por compreender um peptídeo-E adicional ligado ao terminal C da proteína precursora.

26. Polipeptídeo caracterizado por compreender, do terminal N para o terminal C, uma proteína precursora de IGF-1 que compreende um primeiro peptídeo Eb, em que Gl, Pl e El são eliminados, R3 6 e R3 7 são eliminados, R71 e S72 são eliminados, e os últimos sete aminoácidos do terminal C do primeiro peptídeo Eb são eliminados; um segundo peptídeo Eb, em que R71, S72 e os últimos sete aminoácidos do terminal C do segundo peptídeo Eb são eliminados; um terceiro peptídeo Eb, em que R71, S72 e os últimos sete aminoácidos do terminal C do terceiro peptídeo Eb são eliminados; e um quarto peptídeo Eb, em que R71 e S72 são eliminados.

27. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que R71 ou S72 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

28. Polipeptídeo caracterizado por compreender uma proteína precursora de IGF-2 de um animal não humano, em que a clivagem do peptldeo-E de IGF-2 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora.

29. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a espécie vertebrada não humana é selecionado de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, carneiro, cabra, pássaro, cão, gato ou peixe.

30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a proteína precursora compreende o peptídeo-E de IGF-2.

31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o peptídeo-E é selecionado de uma seqüência da Figura 12A.

32. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que R68 ou D69 da proteína precursora é eliminado ou mutado.

33. Método de aumento da taxa e/ou da extensão do crescimento em um animal não humano, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da invenção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um animal produtor de carne que compreende suínos, gado, carneiros, aves e peixes.

35. Método de aumento da eficiência de conversão de ração em tecido corporal em um animal não humano, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptideo da invenção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um animal produtor de carne que compreende suínos, gado, carneiros, aves e peixes.

37. Método de aumento da produção de leite em animais lactantes não humanos, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptideo da invenção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um animal lactante que compreende gado leiteiro, suínos, carneiros e cabras.

39. Método de tratamento de um animal não humano que apresenta sintomas de emaciação associados à caquexia, trauma ou outras doenças consuptivas, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptideo da invenção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o não humano é um animal de estimação que compreende cães, gatos e cavalos.

41. Método de tratamento de animais lactantes não humanos para melhora da saúde neonatal, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptideo da invenção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um animal lactante que compreende gado leiteiro, suínos, carneiros e cabras.

43 . Uso do polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, - 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, - 29, 30, 31 ou 32, caracterizado por ser para a fabricação de uma composição veterinária para uso em um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-42.

44. Uso do polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a referida composição veterinária é uma administração oral, um suplemento para ração oral ou suplemento para ração sólida.