BRPI0607475B1

BRPI0607475B1 - PROMOTOR DE REGENERAÇÃO DE CÉLULA ß PANCREÁTICA, E PROMOTOR DE PRODUÇÃO DE INSULINA EM CÉLULA ß PANCREÁTICA

Info

Publication number: BRPI0607475B1
Application number: BRPI0607475-8A
Authority: BR
Inventors: Kenji Kangawa; Takashi Akamizu; Taiga Irako; Shuichi Koda; Naomi Wakabayashi
Original assignee: Kyoto University; Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2020-02-11
Also published as: EP1862173B1; CA2598864A1; CN101128213B; RU2403058C2; JP4843827B2; EP1862173A4; KR20070110856A; US7803768B2; JPWO2006090767A1; CA2598864C; US20090143284A1; BRPI0607475B8; AU2006216218A1; EP1862173A1; WO2006090767A1; IL184931A0; CN101128213A; IL184931A; RU2007135225A; KR101295104B1

Abstract

promotor de regeneração de célula <225> pancreática, e promotor de produção de insulina em célula <225> pancreática. a presente invenção refere-se a um fármaco para promover neogênese ou regeneração de células <225> pancreáticas que produzem e secretam insulina e para promover a produção de insulina em células <225>, compreendendo grelina ou um derivado desta como um componente efetivo.

Description

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PROMOTOR DE REGENERAÇÃO DE CÉLULA β PANCREÁTICA, E PROMOTOR DE PRODUÇÃO DE INSULINA EM CÉLULA β PANCREÁTICA

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um fármaco para a promoção de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas produtoras de insul

A presente invenção refere-se também a um método para de hiperglicemia pela promoção de de células β pancreáticas.

TÉCNICA ANTERIOR a supressão ou tratamento neogênese ou regeneração

A diabetes, também chamada de hiperglicemia, é uma anomalia metabólica que se refere principalmente com o metabolismo de glicose, a qual é provocada por exemplo por secreção sensibilidade caracterizada insuficiente insulina por nivel alto de insulina ou das células de açúcar no redução da alvo sangue.

Quando este nivel alto de açúcar no sangue é mantido por um período longo, podem ocorrer complicações sérias em vários órgãos e nervos tais como retinopatia nefropatia e neuropatia, principalmente devido à angiopatia. Por esta razão, atualmente é muito importante no diabetes o controle e manutenção do nivel tratamento de açúcar sangue dentro da faixa normal e meios para o controle de no dos níveis de açúcar no sangue têm sido convenientemente estudados.

Um teste para tolerância à glicose (uma carga oral de g de glicose) é utilizado para o diagnóstico da diabetes (hiperglicemia). Para este diagnóstico, é retirado sangue

2/61 em ήejum para se determinar os valores de insulina e açúcar no sangue, e é retirado sangue novamente após um certo período de tempo da ingestão de água contendo 7 5 g de glicose dissolvidos, de maneira a se determinar os valores de insulina e açúcar no sangue. Quando um valor (ÁIRI/ABG) de uma diferença nos valores de insulina no sangue 30 minutos depois da carga e antes da carga (AIRI) dividida por uma diferença nos valores de açúcar no sangue 30 minutos depois e antes da carga (ÁBG) não é maior é determinado que há um alto risco de exacerbação séria de hiperglicemia.

A diabetes é principalmente classificada nos tipos 1 e 2. A diabetes tipo 1 é desenvolvida com déficit absoluto de secreção de insulina provocada por debilitação ou morte de células β pancreáticas levando a nenhuma ou baixa secreção de insulina. Isto pode ser provocado por infecção viral e anomalia

A diabetes tipo auto-imune originária da infecção viral.

é desenvolvida quando a secreção de insulina pelas células pancreáticas é reduzida (insuficiência quantitativa de insulina), ou quando a ação da insulina sobre as células que absorvem insulina é reduzida (resistência à insulina) e, na medida em que a resistência à insulina aumenta, a insulina se torna relativamente quantitativamente insuficiente e os níveis de açúcar no sangue começa a aumentar. Neste último caso, a secreção de insulina pelas células β pancreáticas se torna excessiva para suprir a insuficiência quantitativa relativa de insulina, elemento quando a secreção excessiva de insulina alcança um nível máximo e é mantido por um tempo

3/61 lonao, as células β pancreáticas são finalmente exauridas e a secreção de insulina pelas células é reduzida.

Desta forma, é assumido que uma causa fundamental da diabetes (hiperglicernia) é um déficit em células β pancreáticas e uma redução na produção ou insuficiência de secreção de insulina nas células.

Embora uma formulação de insulina, agentes de biguanida, agentes de sulfoniluréia, agentes de tiazolidinodiona e semelhantes, sejam atualmente utilizados para melhorar os níveis de açúcar no sangue, os agentes hiperglicêmicos atualmente utilizados não são ainda satisfatórios em termos dos efeitos colaterais e outros. Além disto, uma vez que estes agentes são desenvolvidos para o propósito de reduzir os níveis de açúcar no sangue, os agentes podem ser utilizados para tratamento sintomático para o controle dos níveis de açúcar no sangue, mas não são ainda satisfatórios sob o ponto de vista de um tratamento curativo para melhorar a causa fundamental da diabetes como descrita acima, isto é, o déficit em células β pancreáticas em si e redução da produção ou insuficiência de secreção de insulina nas células.

Do ponto de vista descrito acima, o desenvolvimento de um agente capaz de promover a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas, suprimir a exaustão ou morte de células β pancreáticas, e adicionalmente, promover a produção de insulina em células β pancreáticas, é altamente desejável para a supressão ou tratamento da hiperglicemia.

Por outro lado, a grelina é um hormônio descoberto em estômago de rato em 1999, que é um peptideo apresentando uma estrutura química bem característica onde

3^o

4/61 aminoácido do terminal N é acilado por um ácido graxo (Nature , 4 Π 2 . ^c ^c C ’ 119 , Mr-qr r-r^' _c -- jy) . mostrou-se que α greuna tem uma função de estimulo da secreção do hormônio de crescimento a partir da glândula pituitária, e foi mostrado também em um estudo recente que tem uma função de estimulo da ingestão de alimentos, ou acúmulo de gordura para o aumento do peso corporal e melhorar a função cardíaca (Nature, 409, pp.194-198, 8001; Endocr. Rev., 25, pp.426457, 2004; Front Neuroendocrinol., 25, pp. 27-68, 2004).

A grelina foi isolada e purificada de rato como um hormônio de crescimento secretagogo endógeno (GHS) para um receptor de hormônio de crescimento secretagogo (GHS-R) São conhecidas também sequências de aminoácidos de grelina apresentando estruturas primárias similares de vertebrados outros que não ratos, por exemplo, humano, camundongo, suíno, frango, enguia, bovino, equino, ovino, rã, truta, e canino.

Humano:

GSS(n-octanoil)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 1.

GSS(n-octanoil)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 2. Rato:

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 3.

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 4.

Camundongo:

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 5. Suíno:

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR. Seqüência n° 6.

Bovino:

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR. Seqüência n° 7.

Ovino:

5/61

GSS(n-octanoil·)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR. Seqüência n° 8.

Canino :

GSS(n-octanoil)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR. Seqüência n° 9.

Enguia:

GSS(n-octanoil)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH₂. Seqüência n° 10 .

Truta :

GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH₂. Seqüência n° 11.

GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH₂. Seqüência n° 12.

Frango:

GSS(n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR. Seqüência n° 13.

GSS(n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR. Seqüência n° 14. GSS(n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH. Seqüência n° 15.

Rã-touro:

GLT(n-octanoil)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM. Seqüência n° 16. GLT(n-decanoyl)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM. Seqüência n° 16. GLT(n-octanoil)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN. Seqüência n° 17.

Tilapia :

GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH₂. Seqüência n° 18.

Bagre :

GSS(n-octanoil)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH₂. Seqüência n° 19.

GSS(n-octanoil)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG. Seqüência n° 20.

Eqüino:

GSS(n-butanoil)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR. Seqüência n° 21.

(Na notação acima, os resíduos de aminoácido são representados por letras).

O peptídeo descrito acima apresenta uma estrutura específica em que um resíduo de serina (S) ou um resíduo de treonina (T) na 3 ^a posição, contêm um grupo hidroxila acilado por um ácido graxo tal como ácido octanóico ou ácido decanóico, na cadeia lateral. Exceto pela grelina,

6/61 nao existe qualquer exemplo de peptídeo biologicamente ctivo de _um organismo, apresentando tal estrutura modificada hidrofóbica. Este peptídeo é conhecido como apresentando uma atividade potente de liberação de hormônio de crescimento e por participar na regulação da secreção do hormônio de crescimento (publicação internacional WO 01/07475).

jcz que a grelina e seu receptor (GHS-R) são também expressos no pâncreas (Endocrinology, 145, pp. 38133820, 2004; Brain Res. Mol. Brain Res., 48, pp. 23-29, 1997; J. Clin. Endocrinol. Metab., 87, pp. 1300-1308,

2002), foram realizados estudos relativos ao metabolismo de glicose ou secreção de insulina, os quais mostraram que a grelina regula a insulina e a glicose no sangue, e foram reportadas as funções da grelina no aumento do açúcar no sangue e na supressão ou promoção da secreção de insulina (Pancreas, 27, pp.161-166, 2003; Endocrinology, 144, pp. 916-921, 2003; Eur. J. Endocrinol., 146, pp. 241-244, 2002; Endocrinology, 143, pp. 185-190, 2002; J. Neuroendcrinol., 14, pp.555-560, 2002). Uma função da grelina para células β pancreáticas promoverem a neogênese ou regeneração da célula, no entanto, não foi sugerida.

Adicionalmente, embora a publicação internacional WO 2001/56592 (e as publicações de patente US 2001/0020012 Al e 2004/0063636 Al) sugira a utilização de um ligante do receptor GHS-R 1A incluindo grelina como um fármaco para o tratamento de diabetes tipo 2, não há qualquer demonstração de como a grelina pode ser utilizada como um medicamento para diabetes tipo 2 ou não, e se existe utilidade realmente conforme sugerida ou não, não é do conhecimento

7/61 des especialistas na técnica. Adicionalmente, embora a publicação internacional WO 2002/60472 descreva uma função da grelina na obesidade, a utilidade para o tratamento de diabetes não foi demonstrada.

Quanto à relação entre células β pancreáticas e a grelina, foi reconhecido um fenômeno onde células que produzem mais grelina (células ε) substituem células β pancreáticas que é suprimida a diferenciação para células β (Proc. Natl. Acad. Sci., 101, pp. 2 924-2 929, 2004). Embora tenha sido sugerida uma possibilidade dos dois tipos de célula serem derivados de um precursor celular idêntico, e tenha sido sugerida uma possibilidade futura de produzir grupos de células β puras a partir de células tronco ou semelhante, utilizando-se células produtoras de grelina para tratar diabetes a nivel celular, estas são meras possibilidades e não foram substanciadas. Adicionalmente, esta publicação não sugere ou ensina que a grelina tem uma função de promover a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas ou de promover a produção de insulina em células β pancreáticas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Problemas a Serem Solucionados pela Invenção

O propósito da presente invenção é prover um método de promover neogênese ou regeneração de células β pancreáticas produzindo ou secretando insulina, e prever um fármaco para a supressão ou tratamento de hiperglicemia pela promoção de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas que produzem e secretam insulina em hiperglicemia causada por secreção muito baixa ou nenhuma

Sy

8/61 de insulina devida á debilitação ou morte de células β pancreáticas, ou em hiperglicemia causada pela secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas.

Meios para a Solução dos Problemas

Como resultado de um estudo intenso para solucionar os problemas descritos acima, os inventores observaram que a grelina tem uma função de promover significativamente a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas, e que a grelina tem uma função de promover a produção de insulina em células β pancreáticas. A presente invenção está completamente baseada nas observações acima.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a:

(1) uma composição farmacêutica para a supressão ou tratamento de hiperglicemia, compreendendo como um componente efetivo um peptídeo selecionado do grupo consistindo em um peptídeo ou um composto não peptídeo apresentando uma atividade para aumentar a concentração de íon cálcio intracelular por ligação ao receptor de hormônio de crescimento secretagogo (GHS-R), um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1, onde o 3^o resíduo de amínoácido tem um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com a retirada, substituição e/ou adição de um ou vários aminoácidos no interior de uma seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácidos de um terminal amino, onde o 3^o

9/61 resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modi fiçado contendo um ácido graxo int roduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptideo apresenta uma atividade para aumento da concentração de ion cálcio intracelular por ligação a GHS-R, ou um sac farmaceuticamente aceitável deste;

(2) a composição farmacêutica de acordo com o item (1) acima, onde a hiperglicemia é provocada por secreção muito baixa ou nenhuma de insulina devida à debilitação ou morte de células β pancreáticas, ou provocada pela secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas;

(3) a composição farmacêutica de acordo com o item (2) acima, onde a hiperglicemia é provocada por secreção muito baixa ou nenhuma de insulina devida à debilitação ou morte de células β pancreáticas;

(4) a composição farmacêutica de acordo com o item (2) acima, onde a hiperglicemia é provocada pela secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas;

(5) a composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos itens (1) a (4) acima, onde a hiperglicemia apresenta um valor ÁIRI/ABG não maior que 0,4;

(6) a composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos itens (1) a (5) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(7) a composição farmacêutica de acordo com o item (6) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de

10/61 aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do residue de um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

(8) uma composição farmacêutica para a promoção de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas, compreendendo como um componente efetivo um peptideo selecionado do grupo consistindo em um peptideo ou um composto não peptideo apresentando atividade para aumento da concentração do ion cálcio intracelular pela ligação a GHS-R, um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1, onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácidos e o peptideo apresenta uma atividade de aumento da concentração de ion cálcio intracelular pela ligação a GHS-R, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste;

(9) a composição f armacêutica de acordo com o item (8) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição do terminal amino é um resíduo de

11/61 aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(10) a composição farmacêutica de acordo com o item (9) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é acilado com um grupo noctanoil;

(11) uma composição farmacêutica para a promoção da produção de insulina em células β pancreáticas, compreendendo como componente efetivo um peptideo selecionado do grupo consistindo em um peptideo ou um composto não peptideo apresentando uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ou 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptideo apresenta uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste;

12/61 (12) a composição farmacêutica de acordo com o item (11) acima, onde o peptideo apresenta uma sequência de aminoácidos descrita como sequência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(13) a composição farmacêutica de acordo com o item (12) acima, onde o peptideo apresenta uma sequência de aminoácidos descrita como sequência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um residuo de serina na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo noctanoil;

(14) um método para a supressão ou tratamento de hiperglicemia, compreendendo a etapa de administração a um indivíduo exibindo hiperglicemia, de um peptideo selecionado do grupo consistindo em um peptideo ou um composto não peptideo apresentando atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR, um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1, onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, e um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior de uma seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de

13/61 aminoácido e o oectídeo apresenta uma atividade de aumente da concentração de í on cálcio intracelular por 1igação a RHS-R, ou um sai farmaceuticamente aceitável deste;

(15) o método de acordo com o item (14) acima, onde a hiperglicernia é provocada por uma secreção muito baixa ou nenhuma de insulina devida à debilitação ou morte de células β pancreáticas, ou provocada pela secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas;

(16) o método de acordo com o item (15) acima, onde a hiperglicemia é provocada por uma secreção muito baixa ou nenhuma de insulina devida à debilitação ou morte de céluias β pancreáticas;

(17) o método de acordo com o item (15) acima, onde a hiperglicemia é provocada pela secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas;

(18) o método de acordo com qualquer um dos itens (14) a (17) acima, onde a hiperglicemia apresenta um valor ÁIRI/ÁBG não maior que 0,4;

(19) o método de acordo com qualquer um dos itens (14) a (18) acima, onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n^D 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(20) o método de acordo com o item (19) acima, onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

14/61 (21) ura método para a promoção de neogênese ou reueneracào H. finite β ^ieáLicas, compreendendo a etapa de administração e u indivíduo, de um peptídeo selecionado do grupo consistindo em um peptídeo ou um composto não peptídeo apresentando uma atividade de aumento da concentração de ions cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1, onde o 3^a resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, e um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido e o peptídeo apresenta uma atividade de aumento da concentração de ion cálcio intracelular por ligação a GHS-R, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste;

(22) o método de acordo com o item (21) acima, onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(23) o método de acordo com o item (22), onde o peptídeo apresenta uma seqüencia de aminoácidos descrita

15/61 como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do um ue anunoacido na 3 ^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

(24) um método para a promoção da produção de insulina em células β pancreáticas, compreendendo a etapa de administração a um indivíduo, um peptídeo selecionado do grupo consistindo em um peptídeo ou composto não peptídeo apresen^&ndc uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3 ^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^oao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptídeo apresenta atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular pela ligação a GHS-R, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste;

(25) o método de acordo com o item (24) acima, onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácido s descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado

16/61 contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do (26) o método de acordo com o item (25) , onde peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência lateral de um terminal amino (27) uso a produção de n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia de aminoácido na 3^a posição de um é acilado por um grupo n-octanoil;

de um peptídeo ou composto não peptídeo para uma composição farmacêutica para a supressão ou tratamento de hiperglicemia onde o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um peptídeo ou um composto não peptídeo apresentando atividade para aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a

GHS-R, um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3° resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo 25 introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptídeo apresenta uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR;

(28) uso de acordo com o item (27) acima, onde a hiperglicemia é provocada por uma secreção muito baixa ou η

17/61 nenhuma de insulina devida á debilitação ou morte de células β pancreáticas, ou provocada pela redução da secreção de insulina em células β pancreáticas;

(29) uso de acordo com o item (28) acima, onde a hiperglicernia é provocada por uma secreção muito baixa ou nenhuma de insulina devida à debilitação ou morte de células β pancreáticas;

(30) uso de acordo com o item (28) acima, onde a hiperglicemia é provocada pela redução da secreção de insulina em células β pancreáticas;

(31) uso de acordo com o item (27) acima, onde a hiperglicemia apresenta um valor AIRI/ABG não maior que 0,4;

(32) uso de acordo com qualquer um dos itens (27 a (31) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(33) o uso de acordo com o item (32) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

(34) uso de um peptideo ou composto não peptideo para a produção de uma composição farmacêutica para a promoção de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas, onde o peptideo é selecionado do grupo consistindo em um peptideo ou um composto não peptideo apresentando uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio

18/61 ^ntrace.i mar por ligaçao a GHS-R, um peptideo apresentando πτπα sequência de desc r ira como seqüência n° 1 onde o 3° resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n^c 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5° ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptideo apresenta uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR;

(35) o uso de acordo com o item (34) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(36) o uso de acordo com o item (35) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido na 3 ^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

(37) uso de um peptideo ou um composto não peptideo para a produção de uma composição farmacêutica para a promoção da produção de insulina em células β pancreáticas onde o peptideo é selecionado do grupo consistindo em

19/61 peptideo ou um composto não peptideo apresentando at i vidade de aumento da concentração de ion cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptideo apresentando uma sequência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptideo apresenta uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR;

(38) o uso de acordo com o item (37) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo;

(39) o uso de acordo com o item (38) acima, onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil;

(40) um método para a supressão da debilitação, morte ou desgaste de células β pancreáticas, compreendendo a

20/61

O retapa de administração a um indivíduo, de um oeotideo selecionado do grupo consistindo em de um peptideo ou um composto não peptideo apresentando uma atividade para aumento da concentração de ion cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, e um

peptideo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino onde o 3^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido e o peptideo apresenta uma atividade de aumento da concentração de ion cálcio intracelular

GHS-R, ou um sal farmaceuticamente aceitável por ligação a deste;

o método de acordo com o item (40) , onde o peptideo apresenta como seqüência n° 1 um terminal amino uma e um é um contendo um ácido graxo de uma cadeia lateral do (42) o método de seqüência de aminoácidos descrita resíduo de serina na 3^a posição de resíduo de introduzido resíduo;

acordo com aminoácido modificado em um grupo hidroxila o item onde o peptideo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência lateral de um terminal amino n° 1 e resíduo um grupo hidroxila de uma cadeia de aminoácido na 3^a posição de um é acilado por um grupo n-octanoil;

21/61

(43)	um	método	para permitir	a neogênese	ou
regeneração	de	células β	pancreáticas deixando um peptídeo
agir sobre	as	células	β pancreáticas	ou precursor	de

células de células β pancreáticas isoladas de um indivíduo, onde o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um peptídeo ou um composto não peptídeo apresentando atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHS-R, um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 onde o 3^o resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com retirada, substituição e/ou adição de um a vários aminoácidos no interior da seqüência de aminoácidos do 5^o ao 28° aminoácido de um terminal amino, onde o 3 ^o resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido e o peptídeo apresenta uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação a GHSR;

(44) método de acordo com o item (43), onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 e um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado contendo um ácido graxo introduzido em um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo; e (45) o método de acordo com o item (44) , onde o peptídeo apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita

22/61 como seqüência n° 1 e um cjrupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido na 3 ^a posição de um terminal amino é acilado por um grupo n-octanoil.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra os resultados para a análise de insulina no pâncreas no 21° dia após o nascimento. Nesta figura, A é um gráfico indicando a expressão do gene da insulina, B-D mostram os resultados da marcação imuno10 histológica de insulina (B mostra um grupo de controle, C mostra um grupo nO-STZ e D mostra um grupo nO-STZ/grelina, respectivamente, com aumento de 100 x) , e E mostra um resultado quantitativo para uma área de células marcadas positivas para insulina. Em cada um de A e B, Cont 15 indica o grupo de controle, STZ indica o grupo nO-STZ,

STZ+G indica o grupo nO-STZ/grelina, e o valor de cada grupo é o valor médio de três observações ±EP.

Adicionalmente, * indica P<0,001, ** indica P<0,01 e *** indica P<0,005.

A Fig. 2 mostra os resultados para a análise pdx-1 no pâncreas no 21° dia após o nascimento. Nesta figura, A mostra o nível de expressão de mRNA e B mostra os resultados da marcação imuno-histológica (B mostra o grupo de controle, C mostra um grupo nO-STZ e D mostra um grupo 25 nO-STZ/grelina, respectivamente, com aumento de 500 x) . Em

A Cont indica o grupo de controle, STZ indica o grupo nO-STZ, STZ+G indica o grupo nO-STZ/grelina, e um valor para cada grupo é o valor médio de três observações ±EP. Adicionalmente, * indica P<0,0005 e ** indica P<0,0001.

23/61

A Fia. 3 mostra os resultados da análise de insulina no 70° dia após o nascimento. Nesta figura A mostra uma relação entre as concentrações de glicose no sangue e de insulina, B é o gráfico indicando os níveis de expressão do gene de insulina no pâncreas, C-F mostram os resultados da marcação imuno-histológica de insulina no pâncreas (C mostra um grupo de controle, D mostra um grupo nO-STZ e E mostra um grupo nO-STZ/grelina, respectivamente, com aumento de 100 x), e F mostra um resultado de quantificação para uma área de célula marcada positiva para insulina. Em cada um de B e F, Cont indica o grupo de controle, STZ indica o grupo nO-STZ, STZ+G indica o grupo nOSTZ/grelina, e o valor de cada grupo é o valor médio de três observações ±EP. Adicionalmente, * indica P<0,001, ** indica P<0,05 e *** indica P<0,01.

A Fig. 4 mostra os resultados para a análise pdx-1 no pâncreas no 70° dia após o nascimento. Neste desenho, A mostra os niveis de expressão de mRNA e B-D mostram os resultados da marcação imuno-histológica (B mostra um grupo de controle, C mostra um grupo nO-STZ e D mostra um grupo nO-STZ/grelina, respectivamente, com aumento de 500 x) . Em A Cont indica o grupo de controle, STZ indica o grupo nO-STZ, STZ+G indica o grupo nO-STZ/grelina, e o valor para cada grupo é o valor médio de três observações ±EP. Adicionalmente, * indica P<0,001 e ** indica P<0,05.

A Fig. 5 mostra o resultado de da marcação co phospho-histone H3 para examinar a replicação de células β em ratos com 21 dias de idade. Nesta figura, A mostra um resultado de marcação imuno-histológica com phospho-histone H3 (verde) e insulina (vermelho) para um rato nO24/61 oir/greirna, e Β mostra ο incice (%) de rotulagem com phospho-histone H3 de céluΊ as β Μ#* i nnn -^r - - ,,., . ,, i uxd / . Lon V.

indica um grupo de controle, G indrca um grupo grelina, STZ indica um grupo nO-STZ, STZ+G indica um grupo nOSTZ/grelina, e * indica P<0,01.

A Fig. 6 mostra o índice (%) de rotulagem com phospho-histone H3 de células β em ratos com 70 dias de idade. Cont indica um grupo de controle, G indica um grupo grelina, STZ indica um grupo nO-STZ, STZ+G indica um grupo nO-STZ/grelina.

A Fig. 7 mostra pesos corporais (A) e pesos de pâncreas (B) no 9° dia após o nascimento. Controle: um grupo de controle normal, 8 ratos; STZ-veículo: um grupo administrado com veiculo tratado com STZ (solução 5% de manitol), 9 ratos; STZ-grelina humana: um grupo administrado com STZ tratado com grelina humana, 8 ratos. Cada valor é a média +EP. * indica P<0,05 em comparação com um grupo de controle, e # indica P<0,05 em comparação com um grupo STZ-veículo (teste de comparação múltipla de Dunnatt).

A Fig. 8 mostra pesos corporais (A) e pesos de pâncreas (B) na 9^a semana após o nascimento. Controle um grupo de controle normal, 8 ratos; STZ-veiculo: um grupo administrado com veículo tratado com STZ (solução 5% de manitol), 12 ratos; STZ-GHRP-2: um grupo administrado com STZ tratado com GHRP-2, 12 ratos. Cada valor é a média -^EP* indica P<0,05 em comparação com um grupo de controle (teste de comparação múltipla de Dunnatt), e # indica P<0,05 em comparação com um grupo STZ-veículo (teste t de Student).

A Fig. 9 mostra pesos corporais (A) e valores de glicose no sangue (B) de camundongos alimentados com dietas

25/61 normais ou dietas com alto teor de ácido graxo. A indica pesos corporais medidos em torno das 9 a.m. no 42° dia de dieta com alto teor de ácido graxo e administração da substância de teste, e B indica os valores de glicose no sangue determinados em torno das 9 a.m. no 43° dia de dieta com alto teor de gordura e a administração de substância de teste. ND: um grupo alimentado com dieta normal; HFDveiculo: um grupo administrado com veículo contendo uma dieta de alto teor de ácido graxo (solução 5% de manitol) ; HFD-grelina: um grupo administrado com 300 pg/kg de grelina humana contendo uma dieta de alto teor de ácido graxo. A substância de teste foi administrada por via subcutânea duas vezes a cada dia de semana e uma vez nos fins de semana. Cada valor é a média de 8 ratos ± erro padrão. * indica P<0,05 em comparação com um grupo ND (teste de comparação múltipla de Dunnett).

A Fig. 10 mostra as concentrações plasmáticas de insulina (A) e as concentrações plasmáticas de glicose (B) em camundongos alimentados com dietas normais ou dietas com alto teor de ácidos graxos e submetidos a administração intraperitoneal de ácido linoléico. Após 50 dias de alimentação com dieta de alto teor de ácido graxo e substância de teste de alimentação com dieta de alto teor de ácido graxo e administração de substância de teste, os camundongos foram jejuados durante uma noite e então submetidos a administração intraperitoneal de 1 ml/kg de ácido linoléico. Uma hora depois, foi retirado sangue para se determinar as concentrações plasmáticas de insulina e de glicose. ND: um grupo alimentado com dieta normal; HFDveículo: um grupo administrado com veículo contendo uma

OLA

26/61 dieta de alto teor de ácido qraxo (solução 5% de manitol); HFD-grelina: um grupo administrado com 300 pg/kg de grelina humana contendo uma dieta de alto teor de ácido graxo. Cada valor é a média de 8 camundongos ±EP. * indica P<0,05 em comparação com um grupo ND (teste de comparação múltipla de Dunnett).

MELHORES FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Um fármaco da presente invenção pode ser utilizado como um fármaco para um animal (individual) incluindo humanos. Um substância que pode ser utilizada na presente invenção inclui um hormônio de crescimento secretagogo (GHS) , um ligante para receptor de hormônio de crescimento secretagogo (GHS-R). Embora compostos peptidicos conhecidos ou compostos de baixo peso molecular possam ser utilizados como o GHS, um composto peptidico de grelina é especialmente desejável.

Conforme descrito acima, a grelina derivada de humano, bem como grelina derivada de outros animais tais como rato, camundongo, suínos e bovinos, e derivados destas podem ser utilizados como grelina.

Para cada indivíduo, a grelina derivada deste indivíduo é desejavelmente utilizada. Como exemplo, grelina derivada de humano é desejavelmente utilizada para um humano. Grelina derivada de humano é um peptídeo consistindo em 28 aminoácidos em que um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de serina na 3^a posição de um terminal amino é acilado por um ácido graxo (um grupo noctanoil) (seqüência n° 1) . Um exemplo de um derivado de grelina que pode ser utilizado é um peptídeo apresentando

27/61 uma seqüência de aminoácidos descrita como seqüência n° 1 com substituição, inserção aminoácidos nos resíduos de um aumento ligação de terminal amino da concentração (GHS-R).

ou retirada aminoácido da apresentando de íon cálcio de uma um a vários ao 28^a posição at ividade de intracelular por a receptor de hormônio de crescimento secretagogo

Uma seqüência de aminoácidos do derivado desejavelmente apresenta homologia

80%, mais preferivelmente 90% sendo 95%, quando em comparação de 70%, preferivelmente especialmente preferido com a forma natural da seqüência de aminoácidos. Isto se aplica também à grelina derivada de outros

A grelina e presente invenção animais (sequências n^os um seu podem

Como exemplo, isolamento produção por uma técnica

2-22).

derivado utilizados no fármaco da ser de de obtidos por métodos comuns.

um material bruto natural ou

DNA recombinante e/ou síntese química são possíveis.

Quando uma modificação (acilação) adicional de um resíduo de aminoácido é reação de modificação pode ser realizada meios conhecidos. Em um método de produção técnica de DNA recombinante, por exemplo, requerida de acordo utilizando é possível uma com uma se cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo o DNA que codifica um peptideo de acordo com a presente invenção, e um peptideo alvo pode ser coletado a partir da cultura para se obter a grelina ou um seu derivado de acordo com a presente invenção. A seleção da célula hospedeira pode resultar em um composto contendo o peptideo alvo modificado (acilado) na célula. Quando o peptideo não é modificado (acilado) uma reação de

28/61 modificação tal como acilação pode ser realizada conforme desejado de acordo com meios conhecidos.

Embora exemplos de um vetor para introdução de um gene pUC19 pTP5 tipo incluam vetores e semelhantes) , pC194

YRp, (retrovirus vetores manter célula de Escherichia coli (pBR322, pUC18, vetores de Bacillus subtilis (pUBUO, e semelhantes), tipo YIp), e podem ser também de forma estável hospedeira.

hospedeira apropriada.

vetores de levedura (tipo YEp, vetores de semelhantes), utilizados desde células animais quaisquer outros que o vetor possa um gene alvo no interior de uma vetor é introduzido na célula

Os métodos descritos em et al._f 1989), por exemplo método para a introdução de um um método para a introdução em

De maneira a permitir a peptídeo alvo no ser conectado a

Molecular Cloninng (Sambrook podem ser utilizados como gene alvo em um plasmídeo ou uma célula hospedeira.

expressão de um gene de um plasmídeo descrito acima, um promotor pode montante do gene para que

Qualquer promotor pode seja adequado para a expressar o gene alvo.

este funcione.

ser utilizado desde célula hospedeira

Como exemplo, um promotor trp, um promotor Ipp, um promotor recA ou semelhantes, pode ser utilizado que o promotor utilizada para promotor lac, um

ÀPL, um promotor quando a célula hospedeira a ser transformada é do gênero

Escherichia;

um promotor

SP01, um promotor

SP02 ou semelhantes pode ser utilizado em com o gênero

Bacillus; um promotor

GAP, um promotor

PHO5, um promotor

ADH ou semelhantes pode ser utilizado com uma levedura;

e um promotor derivado de SV40,

29/61 um promotor derivado de retrovirus ou semelhantes, pode ser utilizado com uma célula animal.

Uma célula hospedeira pode ser transformada utilizando-se um vetor contendo um gene alvo obtido como 5 descrito acima. Como célula hospedeira, bactérias (por exemplo, gênero Escherichia ou gênero Bacillus), leveduras (gênero Saccharomyces, gênero Pichia, gênero Candida ou semelhantes), uma célula animal (células CHO, COS ou semelhantes) ou semelhantes podem ser utilizadas. Meio líquido é adequado como meio de cultura, e é especialmente preferível que o meio inclua uma fonte de fonte de nitrogênio e outras requeridas para carbono, uma o crescimento de uma célula transformada a ser transformada. Vitaminas um fator de promoção de crescimento, soro e outros podem ser adicionados se desejado.

Para (acilado) apresentam a produção direta de um peptídeo modificado com ácido graxo uma atividade de polipeptídeo precursor do apropriada desejaveImente protease capaz peptídeo em as células de cortar um uma posição e apresentam uma atividade que permite a acilação de um resíduo de serina no peptídeo. As células hospedeiras podem ser hospedeiras codifica o apresentando selecionadas com um vetor polipeptídeo uma atividade de protease pela transformação das de expressão incluindo um precursor, como tal células cDNA que e confirmando-se que as células hospedeiras produzem um peptídeo modificado com ácido graxo apresentando atividade de aumento de cálcio ou liberação de hormônio de crescimento.

Após o cultivo, a grelina pode ser isolada e purificada a partir da cultura por um método comum. Como

30/61 exemplo, de maneira a se extrair uma substância alvo de corpos celulares cultivados ou células, os corpos celulares ou células podem ser coletados após o cultivo e suspendidos em uma solução tampão incluindo um desnaturante de proteína (tal como hidrocloreto de guanidina), e então os corpos celulares ou células podem ser homogeneizados por ultra-som ou semelhante e depois submetidos a centrifugação. Para a purificação da substância alvo a partir do sobrenadante, métodos de isolamento e purificação tais como filtração em gel, ultrafiltração, diálise, SDS-PAGE, e várias cromatografias, podem ser apropriadamente combinados e realizados considerando-se o peso molecular, solubilidade, carga (ponto isoelétrico), afinidade e outros, da substância alvo.

Grelina e um seu derivado podem ser quimicamente sintetizados por um método comum. Como exemplo, grelina e um seu derivado podem ser obtidos por condensação de aminoácidos contendo grupos protetores por um método de fase líquida e/ou um método de fase sólida para estender uma cadeia peptídica, removendo-se todos os grupos protetores com ácido, e purificando-se o produto bruto resultante com um método de purificação conforme descrito acima. Uma cadeia lateral de um aminoácido em uma posição alvo pode ser seletivamente acilada por uma enzima de acilação ou uma acil transferase.

Vários métodos para a produção de peptídeos são convencionalmente conhecidos, e a grelina pode também ser produzida facilmente de acordo com um método conhecido. Como exemplo, grelina pode ser facilmente produzida de

31/61 acordo com um método de síntese de peptideo clássico ou um método em fase sólida.

Adicionalmente, um método de produção utilizando uma combinação de uma técnica de DNA recombinante e síntese 5 química pode ser também utilizado. Grelina pode ser produzida por um método em que um fragmento incluindo um resíduo de aminoácido modificado é produzido por síntese química, enquanto que o outro fragmento não incluindo um resíduo de aminoácido modificado é produzido utilizando-se

uma técnica de DNA recombinante, e depois os fragmentos são fundidos entre si (ver publicação internacional WO

01/07475).

Um sal de grelina, e um derivado deste, que pode ser utilizado na presente invenção é preferivelmente um sal 15 farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal com uma base inorgânica, um sal com uma base orgânica, um sal com um ácido inorgânico, um sal com um ácido orgânico, ou um sal com um aminoácido básico ou ácido.

Exemplos adequados de um sal com uma base inorgânica

incluem um sal de metal alcalino tal como um sal de sódio e um sal de potássio; um como um sal de cálcio sal de metal alcalino terroso tal e um sal de magnésio; um sal de alumínio e um sal de amônio.

Exemplos adequados de um sal com uma base orgânica incluem sais com trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diiclohexilamina, N,Ν'-dibenziletilenodiamina, e outros.

Exemplos adequados de um sal com um ácido inorgânico incluem sais com ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e outros.

32/61

Exemplos adequados de um sal com um ácido orqânico incluem sais com ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido citrico, ácido succinico, 5 ácido málico, ácido metanosulfônico, ácido benzenosulfônico, ácido p-toluenosulfônico e outros.

Exemplos adequados de um sal com um aminoácido básico incluem sais com arginina lisina, ornitina, e outros, e exemplos adequados de um sal com um aminoácido ácido

incluem sais com ácido aspártico ácido glutâmico, e outros.

Entre os sais descritos acima, o sal de sódio e o sal de potássio são os mais preferidos.

No que diz respeito às ações biológicas da grelina um derivado pode ser selecionado utilizando-se a atividade de ligação para o receptor GHS-R IA que é um GHS-R, como um indicador ou as ações fisiológicas descritas na publicação mencionada acima. Um método conhecido pode ser utilizado como método de determinação da concentração de í on cálcio

intracelular e, por exemplo pode ser utilizado FLIPR (leitora de placa de imagem fluorimétrica

Molecular

Devices) utilizando uma alteração da intensidade da fluorescência de Fluo-4 AM (Molecular Probe) devida a uma alteração na concentração de ion cálcio. Adicionalmente, 25 um método conhecido pode ser utilizado para verificar se um peptídeo apresentando uma atividade de aumento de cálcio apresenta atividade de liberação de hormônio de crescimento in vitro e in vivo. No caso in vitro, por exemplo, ο peptídeo pode ser adicionado a células de glândula 30 pituitária que secretam hormônio de crescimento e que

33/61 mostram expressão de GHS-R e o hormônio de crescimento secretado no meio de cultura celular pode ser determinado por radioimunoensaio utilizando um anticorpo anti-hormônio de crescimento. Para se verificar a liberação de hormônio de crescimento in vivo, o peptídeo apresentando uma atividade de aumento de cálcio pode ser in j et ado em uma veia periférica de um animal para se determinar depois a concentração sorológica do hormônio de crescimento.

Adicionalmente, J. Med. Chem.

43, pp.

4370-4376, 2000 por exemplo, pode ser utilizada como referência para um derivado de grelina e a um método para sua preparação.

Conforme especialmente mostrado nos Exemplos do presente relatório, grelina e um seu derivado têm uma função de neogênese ou regeneração de células pancreáticas quando administrados a um indivíduo, e podem aumentar significativamente um número de células positivas para insulina nas células β pancreáticas. Grelina e um seu derivado insulina insulina têm também uma função de em células em células

Embora tenha secreção mecanismo diferente β pancreáticas β pancreáticas.

sido reportado promoção da produção e aumento do acúmulo que a grelina reduza de de de de insulina produção por células e acúmulo de β pancreáticas insulina daquele de secreção de insulina, e uma um fármaco da presente invenção pode residir na um pode ser função de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas e promoção da produção de insulina em células β pancreáticas para aumentar a quantidade de estoque de insulina e, desta forma, aumentar o potencial da secreção de insulina.

34/61

Desta forma,	pela administração	do	fármaco	da
presente invenção a	um indivíduo, pode	ser	aumentado	o
número de células β	capazes de secreção	de	insulina	no

pâncreas, e a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas apresentando função de secreção de insulina se torna possível.

Com isto, o fármaco da presente invenção apresentando uma função permitindo a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas pode ser utilizado para suprimir a debilitação, morte ou exaustão de células β pancreáticas em um indivíduo e proteger as células β pancreáticas. Adicionalmente, o desenvolvimento de diabetes pode ser prevenida pela administração do fármaco da presente invenção a um indivíduo em condição hiperglicêmica antes do desenvolvimento da diabetes. Além disto, quando a condição da diabetes não é séria, a progressão da incidência de diabetes pode ser inibida pela administração do fármaco da presente invenção a um indivíduo. Em uma situação de diabetes séria (um valor AIRI/ABG não maior que 0,4), um tratamento curativo da diabetes com neogênese ou regeneração de células β pancreáticas pode ser realizado por administração do fármaco da presente invenção a um indivíduo. A ocorrência de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas pode ser demonstrada, por exemplo, pela confirmação da expressão de pdx-1, um dos principais fatores de transcrição para a diferenciação de pâncreas.

Adicionalmente, uma terapia de regeneração, no que diz respeito às células β pancreáticas, pode ser realizado permitindo-se o fármaco da presente invenção agir sobre células β pancreáticas isoladas de um indivíduo em um tubo

35/61 de teste para promover a regeneração de células β pancreáticas e proliferação das células, e enxertando-se as células em urn local do indivíduo que sobre de debilitação ou morte de células β pancreáticas ou em um local em que a progressão da debilitação ou morte de células β pancreáticas é prevista. Métodos para a identificação e isolamento de células precursoras de células β pancreáticas são atualmente sendo estudados com vigor por muitos grupos de pesquisa em todo o mundo, e vários métodos foram desenvolvidos (ver, por exemplo, Lancet, 364, pp. 203-205, 2004). A neogênese ou regeneração de células β pancreáticas é possibilitada deixando-se a grelina ou um seu derivado agir sobre células precursoras isoladas de células β pancreáticas, e um grupo de células obtido como tal pode ser enxertado em um corpo vivo de um indivíduo para possibilitar a terapia de regeneração para células β pancreáticas.

O fármaco da presente invenção, incluindo grelina, um derivado desta ou um sal farmaceuticamente aceitável desta, como um componente efetivo, pode ser misturado com um veículo, excipiente, extensor ou semelhantes farmaceuticamente aceitáveis e utilizado para um indivíduo (por exemplo, humano, camundongo, rato, coelho, canino, felino, bovino, equino, suíno, símio, etc.). Uma dose não é especificamente limitada e pode ser selecionada conforme apropriado correspondendo a, por exemplo, um objetivo de uso do fármaco da presente invenção, ou idade, peso corporal, ou espécie do indivíduo. Para um humano adulto, uma dose de 50-200 pg como peso de grelina ou derivado desta, pode ser administrada em torno de uma ou duas vezes '4

36/61 ao dia, ou a dose pode ser administrada continuamente pode cerca de uns poucos dias ou poucas semanas.

Grelina, um derivado desta ou um sal farmaceuticamente aceitável desta, pode ser misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável e administrada oralmente ou parenteralmente como uma preparação sólida tal como um tablete, uma cápsula, grânulo ou pó, ou como uma preparação liquida tal como um xarope ou uma injeção.

Uma variedade de substâncias veículo orgânicas ou inorgânicas comumente utilizadas como material de preparação, é utilizada como veículo farmaceuticamente aceitável que é misturado, por exemplo, como excipiente, lubrificante, ligante, ou um desintegrante em uma preparação sólida, ou como solvente, adjuvante de solubilização, um agente de suspensão, um agente isotônico, um tampão, ou um agente suavizante em uma preparação liquida.

Adicionalmente, um aditivo de preparação tal como um conservante, um antioxidante, um agente corante, ou um adoçante, pode também ser utilizado conforme requerido.

Exemplos adequados de excipiente incluem lactose, sacarose, D-manitol, amido, celulose cristalina, anidrido da ácido silico leve, e outros. Exemplos adequados de lubrificante incluem estearato de magnésio, estearato de cálcio, talco, silica coloidal e outros.

Exemplos adequados de ligante incluem celulose cristalina, sacarose, D-manitol dextrina, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinil pirrolidona e outros.

ί

37/61

Exemolos adeouados de desinteqrante incluem amido, carboximetilcelulose, carboximetilcelulose de cálcio, croscarmelose sódica, carboximetilamido sódico e outros.

Exemplos adequados de solvente incluem água para injeção, um álcool, propilenoglicol, macrogol, óleo de gergelim, óleo de milho e outros.

Exemplos adequados de adjuvante de solubilização incluem polietilenoglicol, propilenoglicol, D-manitol, benzoato de benzila, etanol, trisaminometano, colesterol, trietanolamina, carbonato de sódio, citrato de sódio e outros.

Exemplos adequados de agente de suspensão incluem surfactantes tais como esteariltrietanolamina, laurilsulfato de sódio, laurilaminopropionato, lecitina, cloreto de benzalcônio, cloreto de bezetônio e monoestearato de glicerol; e polímeros hidrofílicos tais como álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose, e hidroxipropilcelulose.

Exemplos adequados de agente isotônico incluem cloreto de sódio, glicerol, D-manitol e outros.

Exemplos adequados de tampão incluem soluções tampão de fosfato, acetato, carbonato, citrato e outros.

Um exemplo adequado de um agente suavizante inclui álcool benzílico.

Exemplos adequados de conservante incluem paraoxibenzoatos, clorobutanol álcool benzilico, álcool fenetílico, ácido desidroacético, ácido sórbico, e outros.

Exemplos adequados de antioxidante incluem sulfito, ácido ascórbico e outros.

38/61

Exemplos administração administração administração de formas parenteral intravenosa, hipodérmica, outras, gotas, um transdérmica, uma inalante, enquanto de preparação adequadas incluem injeçoes para para administração intradérmica, administração intramuscular, e supositório, um agente de absorção gente de absorção transmucosa, e um que exemplos de formas de preparação adequadas para administração oral incluem uma cápsula, tablete, xarope, e outras. Como uma forma de preparação fármaco da presente invenção, entretanto, a forma um do de preparação adequada para administração parenteral, tal como uma injeção, gotas, ou um inalante , é preferida. Várias formas de preparação como tal são conhecidas dos especialistas na técnica, e os especialistas na técnica podem selecionar uma forma de preparação adequada para a administração desejada como apropriada para produzir uma preparação em uma forma de uma composição farmacêutica utilizando, quando requerido, um ou mais aditivos para preparação disponíveis na técnica.

Como um exemplo, um fármaco na forma de uma injeção ou gota pode ser preparado pela dissolução de grelina ou um derivado desta como um ou mais aditivos isotônico, um agente um componente efetivo, em conjunto com para a preparação tais como um agente de ajuste de pH, um agente suavizante, ou um conservante, em água destilada para esterilização. Adicionalmente, um fármaco uma injeção ou gota pode ser também provido injeção e então em uma forma de como um fá rmaco em uma forma liofilizada. Um fármaco como tal pode ser dissolvido imediatamente antes da utilização pela adição de água para injeção destilada, uma solução salina fisiológica

39/61 ou semelhantes, e pode gota. Adicionalmente, exemplo, um agente de então ser utilizado como injeção ou para administiação transmucosa, por administração intranasal colunár io ou um spray administração à lingual é também

Exemplos

Embora a um tal como um agente de cavidade adequado.

presente oral tal como invenção seja um agente subdescrita mais especificamente com exemplos, o escopo da presente invenção não está limitado aos exemplos a seguir.

Exemplo 1

1. Material e Método

Fêmeas ou machos de Charles River foram uma dieta com péletes

CE-2. CLEA).

uma noite, e mais tarde.

acasalamento.

de ratos Sprague Dawley, adquiridos mantidos com livre padrão para ratos

As fêmeas foram engaioladas como se segue:

onde os ratos acesso a água (352 kcal/100 com um macho g· por gravidez foi detectada por

Nascimento natural ocorreu intraperitoneal apalpação 14 dias dias após o

Foram examinados três grupos experimentais um grupo de controle (ratos Sprague recém nascidos receberam uma única de tampão citrato; um grupo nO-STZ

Dawley) inj eção em que os ratos receberam uma única injeção intraperitoneal estreptozotocina ratos receberam estreptozotocina, de (STZ); e um grupo nO-STZ/grelina em que uma única injeção e então receberam rato (doravante chamada de grelina de os intraperitoneal grelina derivada rato, seqüência n° de de

3,

100 pg/kg de peso corporal) por inj eção subcutânea duas vezes ao dia do 2^o ao 8^o dia após o nascimento por 7 dias.

40/61

A estreptozotocina (Sigma, 100 mg/kg de peso corporal) foi dissolvida em tampão citrato (0,05 mmol/1, pH 4,5) e imediatamente inj etada por rota intraperitoneal uma vez em um rato imediatamente após o nascimento. Os filhotes foram deixados com suas mães. Para cada rato neonatal foi analisado o açúcar na urina no 2 ^o dia com Multistix SG (Bayer Medical). Apenas os ratos que eram glicosúricos (valor 3+ com o teste Multistix SG) no dia 2 após o nascimento foram incluídos no grupo nO-STZ. Os animais foram sacrificados no dia 21 ou dia 70 por sangramento sob anestesia com inj eção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Foram coletadas amostras de sangue da veia cava inferior, centrifugadas imediatamente a 4 °C, e mantidas a -80°C até o momento do ensaio.

Após o corte, os pâncreas foram removidos e pesados. De maneira a se determinar o teor de insulina, os pâncreas (35-50 mg) foram homogeneizados e centrifugados em 5 ml de ácido-etanol (solução etanólica 75% (em volume) de HC1 0,15 Μ) , e os sobrenadantes foram mantidos a -80°C. Para a imunohistoquímica, pâncreas adicionais foram fixados em fixador de paraformaldeído 4% por 24 horas, e colocados em parafina.

Insulina e pdx-1 foram detectados por imunohistoquímica em seções de tecido com 3 pm de espessura utilizando-se uma técnica de marcação indireta com peroxidase. Cada seção foi incubada com um anticorpo primário (cobaia anti-insulina de suíno, DACO) ou (coelho anti-camundongo/rato IDX-1; CHEMICON) por 1 hora. A marcação foi realizada por incubação com kit de 3,3'41/61 diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) (DakoCytomation) .

Foram realizadas avaliações guantitativas de área de células β total por um procedimento de análise de imagem auxiliada por computador utilizando-se um microscópio

Olympus

BX 51 conectado a uma câmara digital

DP 12 e o programa

Mac SCOPE Versão (Mitani, Fukui

Japão).

área de células β e área total de seção pancreática foram avaliadas para cada seção marcada. Um volume relativo de células β foi determinado por um método estereológico morfológico com o cálculo da razão entre as áreas ocupadas por células imuno-reativas e aquelas ocupadas por células pancreáticas totais.

O RNA total foi extraído dos pâncreas de ratos como previamente reportado (Biochem. Biophys. Res. Commun., 214 pp. 239-246, 1995).

De maneira a sintetizar a primeira fita de cDNA, os produtos extraídos foram utilizados como moldes alvo.

método em reações contendo

Uma análise RT-PCR

RT (Invitrogen) e foi realizada de previamente reportado (Biochem.

Commun., 214, pp. 239-246, foi utilizada em análises

PCR foram utilizados os como o iniciador 3 acordo com um

Biophys. Res.

1995) . A primeira fita de cDNA

PCR subsequentes. As análises iniciadores de oligonucleotídeo se segue para cada cDNA alvo. A identidade do produto de PCR foi confirmada por eletroforese em gel de agarose.

Insulina-1:

5'-tagaccatcagcaagcaggtc (Seqüência n°

22)

3'-cacaccaggtacagagcct (Seqüência n° 23)

Insulina-2:

5'-cacttggtggaagctctctacc (Seqüência n° 24)

3'-gacagggtagtggtgggcctagt (Seqüência n° 25)

42/61

Pdx-1:

'-aggaggtgcatacgcagcag (Seqüência n° 26)

3'-gaggccgggagatgtatttgtt (Seqüência n° 27)

PCR em tempo real foi realizado como se segue. Ο cDNA (1 μΐ) foi misturado com 2xPCR Master Mix (Applied Biosystems) (25 μΐ), água destilada esterilizada (23 μΐ) , e iniciadores senso e anti-senso (10 pmol/μΐ, 0,5 μΐ) de insulina e pdx-1. Quarenta ciclos de amplificação PCR foram realizados utilizando-se o sistema thermal cycler (ABI PRISM 7700, Applied Biosystems, Japão), por 15 segundos a 95°C seguido por 60 segundos a 60°C. A concentração de cada produto mRNA foi quantificada utilizando-se curvas de calibração expressando a intensidade de fluorescência contra a quantidade de produto PCR padronizada.

Todos os dados de expressão foram normalizados para a quantidade de RNA ribossômico 18s da amostra do mesmo indivíduo.

Os níveis de plasma e glicose no sangue foram determinados com um analisador de glicose (Antsense 2, Sankyo). A insulina foi extraída dos pâncreas como descrito (Endocrinology, 140, pp. 4861-4873, 1999). As concentrações de insulina foram determinadas com um kit ELISA Lebis Insulin (Shibayagi).

Os valores medidos foram expressos como média ±EPM. As diferenças entre os ratos do grupo de controle e o grupo que recebeu STZ foram avaliadas por ANOVA, uma análise de variância.

2. Resultados

43/61

As características dos ratos com 21 dias de idade estão resumidas na Tabela 1. Os pesos corporais, as concentrações de glicose no sangue em jejum (FBG) e as concentrações de insulina não foram significativamente diferentes entre o grupo de controle e o grupo nO-STZ. O grupo nO-STZ e o grupo nO-STZ/grelina também não foram significativamente diferentes entre si no que diz respeito a estes parâmetros. As concentrações FBG no grupo nOSTZ/grelina, entretanto, foram significativamente mais baixas que as do grupo de controle (P<0,01).

(Tabela 1)

	Controle	nO-STZ	nO-STZ/grelina
Peso Corporal Cg)	37,8 ± 5,0 (20)	37,6 ± 4,8 (15)	36,3 ± 3,9 (9)
FBG (mg/dl)	114 ± 8,6 (17)	106,7 ± 16, 6 (15)	100,6 ± 7,6 (8)*¹
Insulina no	0,32 ± 0,10	0,32 ± 0,19	0,35 ± 0,17
Plasma (ng/ml)	(7)	(6)	(6)

Cada valor é a média ± EP (número de ratos) *1: P<0,01 (em comparação com o controle)

Os níveis de expressão do mRNA de insulina nos pâncreas foram marcadamente reduzidos no grupo nOSTZ/grelina quando em comparação com o grupo de controle. Estes níveis, retornaram para níveis semelhantes aos do grupo de controle depois do tratamento com grelina de rato (o grupo nO-STZ/grelina) (Fig. IA) . O nível de expressão de mRNA de insulina pancreática do grupo nO-STZ foi cerca

44/61 de 1/3 daquele do grupo nO-STZ/grelina, no entanto o qrupo nü-STZ exibiu níveis de insulina no plasma comparáveis com os do grupo de controle e do grupo nO-STZ/grelina. A imuno-marcação de insulina do pâncreas foi em concordância 5 com os resultados da expressão do gene (Figs. 1A-E) . Uma ilhota de Langerhans foi menor no grupo nO-STZ em comparação com o grupo de controle (Figs. IB, C, E) . Uma ilhota de Langerhans no grupo nO-STZ/grelina foi maior que a do grupo nO-STZ, mas menor que a do grupo de controle (Figs. 1B-E).

De maneira a explorar o mecanismo que governa a alteração examinada da expressão de insulina no pâncreas, foi a expressão de pdx-1, um dos principais fatores de transcrição para a diferenciação de um pâncreas.

Os níveis de mRNA de pdx-1 e de proteína se alteraram de maneira semelhante aos da insulina (Figs.

2A-D). Embora os níveis de expressão do gene de pdx-1 no grupo nO-STZ foram abaixo de 1/10 do nível do grupo de controle, os níveis do grupo nO-STZ/grelina após o tratamento com grelina de rato foram recuperados para os níveis similares àqueles do grupo de controle (Fig. 2A) . A marcação por imunofluorescência de pdx-1 no pâncreas foi em concordância com os resultados da marcação de insulina (Figs. 2B-D).

Desta forma, este modelo nO-STZ exibiu produção reduzida de insulina no 21° dia, enquanto que os níveis de glicose no sangue não foram alterados. A supressão de uma redução na produção de insulina neste modelo pelo tratamento com grelina de rato foi confirmada a um nível de mRNA e um nível de proteína.

45/61

So

Uma vez sabe-se que o modelo nO-STZ qradualmente desenvolve hiperglicemia depois de 8-10 semanas de idade, um efeito de longo prazo de um tratamento precoce com grelina neste modelo foi examinado. As características do grupo de controle, grupo nO-STZ e grupo nO-STZ/grelina com 10 semanas de idade são mostradas na Tabela 2.

(Tabela 2)

	Controle	nO-STZ	nO-STZ/grelina
Peso Corporal (g)	317 ± 14 (6)	285 ± 19 (5)	248 ± 40 (13)*²
FBG (mg/dl)	103,3 ± 15.6 (6)	213 ± 12,8 (5)’³	137 ± 28,7 (13) ^#1
Insulina Plasma (ng/ml)	1,05 ± 0,25 (6)	1,75 ± 0,89 (5)	0, 93 ± 0,49 (8)
Peso Pâncreas(mg)	414 ± 81 (6)	520 ± 95 (5)	556 ± 83 (13)
Insulina Pâncreas (pg/Pâncreas)	78,6 ± 19,0 (6)	39,6 ± 31,6 (5)	92,6 ± 6, 9 (8)*²

Cada valor representa a média + EP (número de ratos) *1: P<0,05, *2: P<0,01, *3: P<0, 0001; em comparação com o grupo de controle #1: P<0,0001, #2: P<0,01; em comparação com o grupo nO-STZ

O grupo nO-STZ demonstrou peso corporal e hiperglicemia reduzidos quando em comparação com o grupo de controle. Embora as concentrações de insulina no plasma deste grupo não tenham se reduzido, a concentração de 20 insulina de cada animal se mostrou como sendo relativamente baixa para concentração de glicose elevada (Tabela 2, Fig.

46/61

3A). De (Tabela 2)

Por f ato, quando outro os níveis de insulina pancreática foram em comparação com do grupo de controle lado, os níveis de FBG do grupo nOSTZ/grelina foram significativamente mais baixos grupo nO-STZ, e não foram signifícativamente os do grupo de controle. Adicionalmente, insulina pancreática quanto os do grupo grupo nO-STZ/grelina mais os foram mantidos em um nivel que os do altos que eores de tão alto de controle. Os pesos corporais do foram significativamente mais baixos que os do grupo de controle do grupo nO-STZ.

A expressão de mRNA de no grupo nO-STZ foi ainda ligeiramente recuperado.

grupo nO-STZ/grelina nivel semelhante ao do grupo mas não insulina em um foram diferentes dos no estágio de adulto nível baixo, embora por outro lado, mostrou um de controle tal como no 21° dia após o nascimento (Fig. 3B).

marcação imunohistoquímica de

Adicionalmente, quanto à insulina, uma ilhota de

Langerhans no grupo nO-STZ/grelina foi maior nO-STZ, mas menor que a do grupo de controle padrão dos níveis proteína do pdx-1 em três semelhante ao dos níveis no reduzida enquanto de expressão grupos de

21° dia após que a do grupo (Figs. 3C-F).

de mRNA e de ratos adultos foi o nascimento (Fig.

expressão do gene de pdx-1 no grupo nO-STZ foi para aproximadamente 1/3 da do que o nível no grupo nível próximo ao do grupo de marcação por imunoflucrescência grupo de controle nO-STZ/grelina retornou controle (Fig. 4A).

para pdx-1 no pâncreas ao

Na foi observado um padrão semelhante ao da insulina (Figs. 4B-D).

47/61

St

Conforme descrito acima, no modelo nO~STZ, os animais desenvolveram uma produção reduzida de Insulina no pâncreas e desenvolveram hiperglicemia em 10 semanas após o nascimento. 0 tratamento com grelina de rato foi capaz de 5 inibir esta exacerbação mantendo ou promovendo a produção de insulina. A expressão aumentada de pdx-1 pode também estar parcialmente de insulina. Uma aumentada de pdx-1, um papel pâncreas células β envolvida importante no grupo vez que um fator nesta manutenção da produção foi observada uma expressão de transcrição que representa no desenvolvimento e diferenciação nO-STZ/grelina, é sugerido que pancreáticas destruídas pela administração de do as

STZ imediatamente após o nascimento foram regeneradas pela administração de grelina, e a regeneração das células β pancreáticas pode ter contribuído para manter a produção de insulina.

Exemplo 2

1. Material e Método

Seções de pâncreas que não foram utilizadas para

estudos morfológicos foram utilizadas para examinar a replicação de células β. As seções foram submetidas a marcação dupla para phospho-histone H3 (SerlO) e insulina. As seções foram incubadas durante a noite com uma diluição vezes de anticorpo anti phospho-histone H3 (SerlO) (Cell

Signaling Technology) a 4 °C. Após o que as seções foram incubadas com anticorpo de cobaia anti-insulina à temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem com PBS por vezes, as seções foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos em uma solução de bloqueio com um anticorpo secundário conjugado com fluorescência (Alexa Fluor 488 e

48/61

546, Molecular Probe) . Após lavagem com PBS, as seções foram monradas com meio de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories) e examinadas por microscopia de varredura a laser confocal (Leica Microsystems). Pelo menos 1000 células β foram contadas por seção.

2. Resultado

De maneira a se examinar se a proliferação de célula β com grelina contribuiu para os efeitos sobre a produção

de insulina e o número de células β em um rato tratado com

STZ ou não, foi realizada uma análise imunohistoquímica com phospho-histone H3. Phospho-histone H3 é um marcador de proliferação celular por mitose (J. Clin. Invest., 113, pp.1364-137 4, 2004; Br. J. Cancer, 88, pp. 257-262, 2003) .

0 resultado é mostrado na Fig. 5A. Em ratos com 21 dias de idade as células duplamente positivas para phospho-histone

H3 e insulina aumentaram por tratamento com grelina de rato aproximadamente em 1,7 vezes e 15 vezes do grupo grelina e no nO-STZ/grelina quando em comparação com o ratos de

controle e ratos n0-STZ, respectivamente (Fig. 5B) .

Em ratos com 10 semanas de idade, embora não tenha havido diferenças significativas entre os quatro grupos, ocorreu uma tendência das células duplamente positivas para phospho-histone H3 e insulina em aumentar para o tratamento 25 com grelina de rato no modelo STZ, enquanto que as células duplamente positivas tenderam a se reduzir por tratamento com grelina no grupo de controle (Fig. 6). Uma vez que as expressões de pdx-1, insulina e phospho-histone H3 em um rato nO-STZ/grelina foram significativamente aumentadas quando em comparação com os níveis observados para um rato

49/61 nO-STZ de cont role com 21 di as de idade, foi sugerido que a grelina estimula a regeneração e replicação de células β em ratos neonatais tratados com STZ.

Exemplo 3

Uma vez que o efeito da grelina de rato foi confirmado no exemplo 1 e no exemplo 2, o efeito de grelina derivada de humano (doravante chamada de grelina humana seqüência n° foi a seguir examinado utilizando-se um modelo STZ de rato neonatal como no exemplo

1. A grelina humana é diferente da grelina de rato em dois aminoácidos.

1. Material e Método

Fêmeas grávidas de rato

Charles River, foram deixadas dieta de pélete padrão para

Sprague

Dawley adquiridas de com livre acesso a água rato (CRF-1, Oriental

Co., Ltd.), e foram permitidos partos naturais.

grupos experimentais foram estabelecidos como se grupo de controle onde os ratos receberam uma única e uma

Yeast

Três segue:

inj eção peritoneal de tampão citrato imediatamente depois do nascimento; grupo STZ-veiculo onde os ratos receberam uma única

5% de vezes dias;

injeção peritoneal de STZ, e então veiculo (solução manitol) ao dia a e grupo foi administrado por subcutânea duas partir do 2^o dia após o nascimento durante 7

STZ-grelina humana onde os ratos receberam uma única injeção peritoneal de

STZ, e então grelina humana (seqüência n° 1, 100 pg/kg de peso corporal) foi injetada por via subcutânea duas vezes ao dia a partir do 2^o dia depois do nascimento durante 7 dias.

50/61

O STZ foi preparado e administrado como no exemplo 1. Cada rato macho neonatal foi verificado para açúcar na urina no 2° dia com Pretest 3aII (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Apenas os ratos glicosúricos (valor 3+ com Pretest 3aII) no dia 2 após o nascimento foram incluídos nos estudos a seguir. Os ratos foram desmamados na noite do 20° dia após o nascimento. Foram coletadas amostras de sangue da veia da cauda enquanto acordados na 8^a semana (57° dia) após o nascimento para se determinar as concentrações de glicose e insulina no plasma. Adicionalmente, após a medida do peso corporal na 9^a semana (62° ou 63° dia) após o nascimento, foram coletadas amostras de sangue da aorta abdominal sob anestesia com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Os pâncreas totais foram removidos e pesados. Após o que, os pâncreas foram divididos em duas peças e mantidos para a determinação do teor de insulina. As amostras de sangue foram centrifugadas imediatamente a 4 °C para preparar amostras de plasma, e mantidas a -80°C até a determinação das concentrações de glicose e insulina. A concentração de glicose foi determinada utilizando-se um Glucose CII-test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), enquanto que a concentração de insulina foi determinada utilizando-se um kit de determinação de insulina altamente sensível (Morinaga Institute of Biological Science, Inc.).

2. Resultado

Foram examinados os efeitos da administração por 7 dias de grelina humana imediatamente depois da administração de STZ sobre as concentrações de glicose e

51/61 insulina no plasma na 8 ^a semana (após 4 horas de j ejum) .

Os resultados são mostrados na Tabela 3. As concentrações de glicose no plasma foram significativamente aumentadas no grupo com veiculo em comparação com o grupo de controle, enquanto que as concentrações de glicose no grupo STZgrelina humana aumentaram ligeiramente e não foram significativamente diferentes das do grupo de controle. As concentrações de insulina no plasma, por outro lado, não foram significativamente diferentes entre os grupos.

(Tabela 3)

	Controle	STZ-veiculo	STZ-grelina humana
Glicose no	116,0 ± 1,7	330,4 ± 26,5	222,1 ± 10,5
Plasma (mg/dl)	(8)	(9)*¹	(8)
Insulina no	2,44 ± 0,12	2,07 ± 0,15	2,73 ± 0,15
Plasma (ng/ml)	(8)	(9)	(8)

Cada valor é a média ± EP (número de ratos) *1: P<0,05; em comparação com o grupo de controle (teste de comparação múltipla de Dunnett).

Foram então analisados os pesos corporais, pesos dos pâncreas, e teores de insulina nos pâncreas na 9^a semana. Os resultados dos pesos corporais e pesos dos pâncreas são mostrados na Fig. 7. Embora os pesos corporais no grupo STZ-veiculo tenham sido significativamente menores que os do grupo de controle, a redução dos pesos corporais no grupo STZ-grelina humana foi suprimida e os pesos corporais foram comparáveis aos do grupo de controle. 0 grupo STZ52/61

veículo mostrou	um	valor ligeiramente	baixo	dos	pesos	dos
pâncreas quando	em	comparação com o gr	upo de	controle.	No
grupo STZ-grelina	humana, por outro	lado,	os	pesos	dos
pâncreas foram	significativamente mais altos	que os	do
grupo STZ-veícul	o.

foi dos pâncreas

Uma vez que um aumento dos pesos mostrado no grupo STZ-grelina humana, os teores de insulina nos pâncreas foram comparados. Os pâncreas foram divididos para se obter duas amostras, amostras do lado do baço

amostras do lado dos intestinos, e os teores de insulina no pâncreas foram calculados a partir do teor de insulina de cada amostra e analisado. Os resultados são mostrados na

Tabela 4. No grupo STZ-veículo, os teores de insulina nos pâncreas calculados a partir de dois locais foram 15 significativamente reduzidos quando em comparação com o grupo de controle. Embora os teores de insulina do grupo STZ-grelina humana tenham sido também significativamente mais baixos que os do grupo de controle, os teores foram cerca de duas vezes mais altos que os do grupo STZ-veículo.

(Tabela 4)

	Controle	STZ-veículo	STZ-grelina humana
Teor de Insulina (Lado do Baço) (μ g/pâncreas)	454,5 ± 31,6 (8)	67,1 + 8,9 (9)*¹	120,9 ± 14,1 (8)*¹
Teor de Insulina (Lado dos Intestinos) (pg/pâncreas)	309, 9 ± 25,8 (7)	29,4 ± 3,2 (9)*¹	63,0 ±6,7 (8)ⁿ

53/61 ό&

Cada valor é o valor médio ± EP (número de ratos) * 1: P<0,05; em comparação com o grupo de controle (teste de comparação múltipla de Dunnett).

A partir dos resultados acima, foi observado que o tratamento com grelina humana imediatamente após a administração de STZ em um modelo STZ neonatal suprime a hiperglicemia e a redução do peso corporal no estágio adulto. Uma vez que um aumento no peso do pâncreas e uma tendência em suprimir uma redução dos teores de insulina no pâncreas são também mostrados, foi sugerido que, como mostrado no exemplo 1 para grelina de rato, as células β pancreáticas destruídas pela administração de STZ imediatamente após o nascimento foram regeneradas pela administração de grelina humana e a produção de insulina foi parcialmente mantida, o que pode ter contribuído para a supressão da hiperglicemia.

Exemplo 4

Uma vez que a grelina é considerada como expressando suas funções fisiológicas via GHS-R, compostos agonistas de GHS-R outros que não a grelina (hormônio de crescimento secretagogo, doravante chamado de compostos GHS) podem também promover a regeneração de células β e suprimir o desenvolvimento de hiperglicemia ou diabetes como a grelina. Por esta razão, a seguir, uma função de um composto GHS foi examinada utilizando-se um modelo STZ neonatal. Embora vários peptídeos e compostos não peptídeo tenham sejam conhecidos como compostos GHS, um peptídeo GHS

GHRP-2 (Ala-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, Drugs of the

54/61

Future 30, pp 124-127, 2005, CAS No. 158861-67-7) foi utilizado para o exame neste exemplo.

1. Material e Método

Os materiais experimentais, métodos experimentais e métodos de avaliação foram semelhantes aos do exemplo 2.

Como substância de teste

100 pg/kg de GHRP-2 foram administrados por subcutânea duas vezes ao dia a partir do 2^o dia depois do nascimento durante 7 dias (um grupo

STZ-GHRP-2).

2. Resultado

Foram examinados os efeitos da administração precoce de GHRP-2 após o nascimento sobre as concentrações de 15 glicose e insulina no plasma na 8^a semana (após 4 horas de jejum). Os resultados são mostrados na Tabela 6. As concentrações de glicose no plasma foram significativamente aumentadas no grupo

STZ-veiculo quando em comparação com o grupo de controle, enquanto que no grupo STZ-GHRP-2 o

aumento foi brando e os niveis foram significativamente mais baixos que os do grupo STZ-veiculo.

As concentrações de insulina no plasma por outro lado não foram significativamente diferentes entre os grupos.

(Tabela 5)

	Controle	STZ-veiculo	STZ-GHRP-2
Glicose no	116,0 ± 1,7	281,6 ±18,5	145,5 ± 4,1
Plasma (mg/dl)	(8)	(12)*¹	(12) ⁿ
Insulina no	2,44 ± 0,12	2,16 + 0,10 (12)	1,89 ± 0,07
Plasma (ng/ml)	(8)		(12)

55/61

Cada valor é a média ± EP (número de ratos) * 1: P<0,05; em comparação com o grupo de controle, #1: P<0,05; em comparação com o grupo STZ-veículo, (teste de comparação múltipla de Dunnett).

Foram então analisados os pesos corporais, pesos dos pâncreas, e teores de insulina nos pâncreas na 9^a semana. Os resultados dos pesos corporais e pesos dos pâncreas são mostrados na Fig. 8. Embora os pesos corporais no grupo STZ-veículo tenham sido significativamente menores que os do grupo de controle, a redução dos pesos corporais no grupo STZ-GHRP-2 foi suprimida e os pesos corporais não foram significativamente diferentes dos do grupo de controle. O grupo STZ-veículo mostrou uma tendência na direção de uma redução nos pesos dos pâncreas quando em comparação com o grupo de controle. No grupo STZ-GHRP-2, por outro lado, os pesos dos pâncreas foram maiores que os do grupo STZ-veículo.

Foram comparados os teores de insulina nos pâncreas. Os pâncreas foram divididos de maneira a se obter duas amostras, amostras do lado do baço e amostras do lado dos intestinos, e os teores de insulina no pâncreas foram calculados a partir do teor de insulina de cada amostra e analisado, os resultados são mostrados na Tabela 6. No grupo STZ-veículo, os teores de insulina no pâncreas em cada um dos dois locais foram significativamente reduzidos quando em comparação com o grupo de controle. Os teores de insulina do grupo STZ-GHRP foram também significativamente mais baixos que os do grupo de controle, no entanto os teores foram maiores que os do grupo STZ-veículo, o que

56/61 mostrou uma tendência a manter a capacidade de produção de insulina.

(Tabela 6)

	Controle	STZ-veículo	STZ-GHRP-2
Teor de Insulina (Lado do Baço) (pg/pâncreas)	454,5 ± 31,6 (8)	96,3 ± 7,6 (12)	146,8 ± 10, 9 (12)
Teor de Insulina (Lado dos Intestinos) (pg/pâncreas)	309, 9 ± 25,8 (7)	62,1 + 5,6 (12)*¹	81,7 ± 4,6 (12)*¹

Cada valor é a média ± EP (número de casos) *1: P<0,05; em comparação com o grupo de controle (teste de comparação múltipla de Dunnett).

Conforme descrito acima, em adição à grelina de rato e grelina humana, mostrou-se que GHRP-2 apresentando ligação a GHS-R e capacidade de ativação também tende a aumentar a capacidade de produção de insulina por administração precoce no modelo STZ neonatal e suprimir o desenvolvimento de hiperglicemia no estágio adulto. Desta forma, foi sugerido que os efeitos de grelina sobre a regeneração de células β e sobre a supressão de hiperglicemia são mediados por GHS-R, e que um composto apresentando ligação a GHS-R e capacidade de ativação (GHS) também apresenta efeitos similares.

Conforme descrito acima, foi demonstrado que no modelo STZ neonatal grelina de rato, grelina humana e um

57/61 (nt composto GHS melhoraram a hiperglicemia no estágio adulto.

A seguir, foi examinado o efeito de grelina humana utilizando-se um ouro modelo de hiperglicemia.

Exemplo 5

Sabe-se que uma dieta de alto teor de gordura ao estilo ocidental é uma causa de desenvolvimento de diabetes. Adicionalmente, um ácido graxo tal como ácido linoléico é o ligante de GRP40, um dos receptores acoplados a proteína G, e foi reportado que a ativação de GRP40 por um ácido graxo promove a secreção de glicose por células β pancreáticas insulina em resposta a (Itoh Y. et al. Nature

422, pp 173-176, 2003).

Por outro lado, foi sugerido que embora uma carga de curto prazo de um ácido graxo promova a secreção de insulina, uma exposição de longo prazo reduz a capacidade de secreção de no pâncreas (Steneberg P.

2005).

alimentos linoléico

Desta forma com alto teor insulina e os teores de et al. Cell Metab camundongos de ácidos de maneira a se examinar foram graxos os insulina humana sobre a secreção de insulina

1/ PP

245-258 mantidos com contendo ácido efeitos da grelina e concentração de glicose no sangue.

1. Material e Método

Camundongos machos

Crj:CD1(ICR) (Charles River

Japão) foram deixados com livre acesso a água e a uma dieta de pélete padrão para camundongo

Co., Ltd.) (com iluminação das 21 às de controle normais foram mantidos normal, e grupo ND) . Um grupo com (CRF-1, Oriental Yeast horas). Camundongos neste condição (dieta dieta de alto teor de

58/61 ácidos graxos (High Fat Diet. - Dieta de Alta Gordura, um grupo HFD) foi deixado consumir livremente uma mistura de 5 g de CFR-1 (pó) com 1 g de ácido linoléico como dieta de alto teor de ácidos graxos a partir da 4 ^a semana após o nascimento. Como substâncias de teste, um veículo (solução 5% de manitol) (grupo HFD-veículo) ou 300 pg/kg de grelina humana (grupo HFD-grelina), foram administrados duas vezes ao dia (uma vez ao dia nos fins de semana) por cerca de 7 semanas a partir do dia do inicio da carga de dieta de alto teor em ácidos graxos. Foram monitoradas as alterações nos pesos corporais e níveis de açúcar no sangue ab lib após o início da administração da substância de teste. Adicionalmente, os camundongos foram jejuados no 5^o dia do início da administração da substância de teste, e então carregado intensamente ácido linoléico (1 ml/kg, administração intraperitoneal) no dia seguinte à determinação das concentrações de glicose no plasma e de insulina no plasma 1 hora mais tarde. O valor de açúcar no sangue foi determinado utilizando-se Antsense II (Horiba, Ltd.), enquanto que a concentração de glicose no plasma e a concentração de insulina foram determinadas utilizando-se um Glucose CII-test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e um kit de insulina Lebis (TMB para camundongo) (Shibayagi Co. Ltd.), respectivamente.

2. Resultado

Foram examinados os efeitos da administração de grelina humana sobre os pesos corporais e níveis de açúcar no sangue em camundongos alimentados com uma dieta de alto teor de ácidos graxos. A Fig. 9 mostra os pesos corporais

59/61 no 42° dia de administração e os níveis de açúcar ad lib no 43° dia de administração. Os pesos corporais dos camundongos foram maiores no grupo de HFD-veículo quando em comparação com o grupo ND e foram ainda maiores no grupo de

HFD-grelina. Adicionalmente, os níveis de açúcar no sangue do grupo HFD-veiculo foram significativamente maiores que os do grupo ND. Por outro lado, os de açúcar no sangue no grupo HFD-grelina tenderam a se reduzir quando em comparação com o grupo HFD-veiculo e não foram significativamente diferentes dos do grupo ND.

Desta forma, mostrou-se que a administração de grelina reduz a indução de hiperglicemia provocada por uma dieta em ácidos graxos.

A seguir, foram analisadas as alterações das concentrações de insulina no plasma e das concentrações de glicose no plasma após uma carga .intensa de ácido linoléico em camundongos alimentados com uma dieta de alto teor de ácidos graxos.

A Fig. 10 mostra as concentrações de insulina no plasma (A) e as concentrações de glicose no plasma (B) em camundongos alimentados com dietas normais ou dietas de alto teor de ácidos graxos e submetidos a administração intraperitoneal de 1 ml/kg de ácido linoléico. No grupo

HFD-veiculo, as carga de ácido da média quando a capacidade de dieta de longo concentrações de insulina linoléico foram reduzidas em comparação com o grupo no no

ND, plasma após a máximo em sugerindo secreção de insulina foi conturbada por prazo de ácido graxo. As concentrações insulina no grupo HFD-grelina foram mais altas que as

1/3 que uma de do grupo HFD-veiculo, e não foram significativamente

60/61 diferentes das do grupo ND (Fig, 1OA) . Por outro lado, embora quase não tenha havido qualquer diferença entre os 3 grupos nas concentrações de glicose no plasma antes da carga com ácido linoléico (grupo ND: 138 ± 5, grupo HFDveiculo: 146 ± 12, grupo HFD-grelina: 141 ± 5 mg/dl, média de 8 camundongos ± erro padrão para cada grupo) , as concentrações de glicose no plasma foram significativamente aumentadas em todos os grupos 1 hora após a administração de ácido linoléico quando em comparação com as de antes da administração (P<0,05, teste t pareado). 0 aumento das concentrações de glicose no plasma depois da administração de ácido linoléico foi mais significativo no grupo HFDveiculo quando em comparação com o grupo ND.

As concentrações de glicose no plasma após a carga de ácido linoléico no grupo HFD-grelina tenderam a serem baixas em comparação com o grupo HFD-veiculo, e não foram significativamente diferentes das do grupo ND (Fig. 10B).

Conforme descrito acima, mostrou-se que a administração repetida de grelina humana suprime um aumento nos níveis de açúcar no sangue em camundongos com dieta de alto teor de ácidos graxos. Com a alimentação com dieta de alto teor de ácidos graxos, foi observada a redução da secreção de insulina induzida por ácido linoléico, que tendeu a ser melhor no grupo que recebeu grelina humana. Desta forma, foi sugerido que a grelina humana melhorou o mal funcionamento das células β, isto é, a insuficiência da secreção de insulina devida ás dietas de alto teor de ácidos graxos, e, por isso, suprimiu o desenvolvimento de hiperglicemia.

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APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Um fármaco da presente invenção tem uma na promoção de neogênese ou regeneração de células pancreáticas produtoras e secretoras de insulina e uma função na promoção da produção de insulina em células β pancreáticas, e, desta forma, pode suprimir ou tratar hiperglicemia pela promoção de neogênese ou regeneração de células β pancreáticas produtoras e secretoras de insulina em hiperglicemia causada por falta de secreção de insulina ou secreção muito baixa de insulina devida à debilitação ou morte de células β pancreáticas ou em hiperglicemia causada por secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas.

Além disto, o fármaco pode ser também utilizado como fármaco para terapia de regeneração de células β pancreáticas apresentando uma função de produção de insulina. Uma vez que a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas produtoras e secretoras de insulina é possibilitada de acordo com a presente invenção, é uma vantagem que uma causa fundamental da hiperglicemia, isto é, deficiência das células β pancreáticas e insuficiência na produção ou secreção de insulina nas células possa ser melhorada.

Claims

(1) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 21, em que o terceiro resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido;

(1) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 21, em que o terceiro resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido;

(1) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 21, em que o terceiro resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido;

1 e 2, caracterizado pela hiperglicemia apresentar um valor AIRI/ABG não maior que 0,4.

(1) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 21, em que o terceiro resíduo de aminoácido de um terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido;

1. Uso de um composto peptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, apresentando uma atividade de aumento da concentração de íon cálcio intracelular por ligação ao receptor de secretagogo de hormônio de crescimento, em que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em:
(2) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID No. 1 em que o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado, tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido; e (3) GHRP-2, o uso caracterizado por ser para a produção de uma composição farmacêutica para a supressão da debilidade, morte ou desgaste de células β pancreáticas.

(2) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID No. 1 em que o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo

de aminoácido modificado, tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido; e (3) GHRP-2, o uso caracterizado por ser para a produção de uma composição farmacêutica para promover a produção de

insulina em células β pancreáticas ao promover a neogênese ou a regeneração de células β pancreáticas, em que a

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(2) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID No. 1 em que o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado, tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido; e

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2/5 por secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela hiperglicemia ser causada por secreção muito baixa ou nenhuma secreção de insulina devido à debilitação ou morte de células β pancreáticas, ou causada

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(2) um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como descrita na SEQ ID No. 1 em que o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amino é um resíduo de aminoácido modificado, tendo um ácido graxo introduzido a uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido, e (3) GHRP-2, o uso caracterizado por ser na produção de uma composição farmacêutica para a supressão ou tratamento de hiperglicemia, pela promoção de neogênesis ou regeneração de células β pancreáticas, em que a promoção de neogênese é a promoção de neogênese de insulina e a regeneração de células beta pancreáticas é na diabetes.
3/5 (3) GHRP-2, o uso caracterizado por ser para a produção de uma composição farmacêutica para promover a neogênese ou regeneração de células β pancreáticas, em que a promoção de neogênese é a promoção de neogênese de insulina e a regeneração de células beta pancreáticas é na diabetes.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela hiperglicemia ser causada por secreção muito baixa ou nenhuma secreção de insulina devido à debilitação ou morte de células β pancreáticas.
4/5 promoção de neogênese é a promoção de neogênese de insulina e a regeneração de células beta pancreáticas é na diabetes.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela hiperglicemia ser causada por secreção reduzida de insulina em células β pancreáticas.
5/5 introduzido a um grupo hidroxila de uma cadeia lateral do resíduo.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações
6. Uso de um composto peptídeo ou de um sal farmaceuticamente aceitável deste, apresentando uma atividade de aumento da concentração do íon cálcio intracelular por ligação ao receptor de secretagogo de hormônio de crescimento, em que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em:
7. Uso de um composto peptídeo ou de um sal farmaceuticamente aceitável deste, apresentando uma atividade de aumento da concentração do íon cálcio intracelular por ligação ao receptor de secretagogo de hormônio de crescimento, em que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em:
8. Uso de um composto peptídeo ou de um sal farmaceuticamente aceitável deste apresentando uma atividade de aumento da concentração do íon cálcio intracelular por ligação a receptor de hormônio de crescimento secretagogo, em que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em:
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo peptídeo apresentar uma seqüência de aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1 e um resíduo de serina na terceira posição de um terminal amino ser um resíduo de aminoácido modificado tendo um ácido graxo

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10. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do peptídeo apresentar uma 5 seqüência de aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1 e um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de um resíduo de serina na terceira posição de um terminal amino ser acilado por um grupo n-octanoila.