BRPI0712368A2 - método para inibir o crescimento de um tumor em um paciente pediátrico - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE UM TUMOR EM UM PACIENTE PEDIáTRICO Métodos de terapia de combinação de tratar tumores pediátricos pela administração de um antagonista de EGFR e um agente quimioterapêutico são divulgados. Os métodos também incluem tratar tumores pediátricos refratários.

Description

"MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE UM TUMOR EM UM PACIENTE PEDIÁTRICO"

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de patente provisório U.S. Ser. N2 60/833.487, depositado em 27 de julho de 2006, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao tratamento de tumores em pacientes pediátricos pela administração de uma combinação de um antagonista de EGFR e um agente quimioterapêutico.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nos Estados Unidos, 11.900 crianças e adolescentes abaixo da idade dos 20 anos foram diagnosticados com câncer em 2001 e cerca de 2.200 morreram da doença. Os tumores sólidos são responsáveis por aproximadamente 30 % dos casos de cânceres na infância. Os cânceres cerebrais e do sistema nervoso invasivos são responsáveis por 17 % de todos os cânceres pediátricos, em segundo lugar apenas para a leucemia linfocítica aguda. Cerca de metade dos casos diagnosticados de tumores cerebrais são malignos. Outros cânceres comuns na infância incluem sarcoma de Ewing, leucemia, neuroblastoma, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de tecido mole, e tumores de Wilms.

Um dos maiores obstáculos no tratamento de tumores cerebrais em crianças é que o cérebro ainda está passando por desenvolvimento rápido e é vulnerável às toxicidades dos tratamentos tais como radiação ou quimioterapia. Os obstáculos também surgem no tratamento de outros tipos de cânceres na infância. Portanto, novas terapias para tratar tumores em pacientes pediátricos são necessárias.

A família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é expressada ou super-expressada em vários cânceres e está no geral envolvido na tumorigênese. A família do EGFR inclui o receptor de EGF (EGFR, também conhecido como erbB-1/HER1), HER2 (também conhecido como cneu/erB-2), erbB-3/HER3, e erbB-4/HER4. Por exemplo, EGFR e HER2 são considerados desempenhar um papel crítico em processos que regulam o crescimento e sobrevivência de célula de tumor. Em particular, EGFR foi implicado em vários caminhos que afetam a sobrevivência e proteção da apoptose, desdiferenciação e metástase (incluindo a migração e invasão celulares). Entre estes cânceres que expressam EGFR estão alguns dos mais prevalecentes incluindo da cabeça e pescoço, colorretal, pancreático, ovariano, de célula renal, pulmonar de célula não pequena e gliomas. O prognóstico para muitos destes cânceres é deficiente se não diagnosticados em um estágio inicial e a terapia para a doença avançada é limitada.

Existem vários inibidores para o EGFR correntemente em testes clínicos para o tratamento de alguns destes cânceres. Um tal exemplo é o ERBITUX® (cetuximab) (fabricado pela ImClone Systems Inc.), que é um anticorpo monoclonal quimérico (ser humano/camundongo) que bloqueia a ligação de ligando ao EGFR, impede a ativação do receptor e inibe o crescimento de células em cultura. Um outro exemplo é ABX-EGF, que é um anticorpo monoclonal totalmente humano específico para EGFR que supostamente bloqueia a ligação do fator de crescimento transformador alfa (TFG-α) e fator de crescimento epidérmico (EGF), dois ligandos que são conhecidos ligar ao EGFR. HERCEPTIN® (trastuzumab) é um anticorpo humanizado aprovado para o tratamento de câncer de mama metastático positivo em HER2, que é planejado para alvejar e bloquear a função da expressão excessiva da proteína HER2.

Além disso, testes clínicos estão correntemente sendo conduzidos em vários inibidores de EGFR de molécula pequena. Um exemplo de um inibidor da tirosina cinase é IRESSA®, que é um inibidor da tirosina cinase de EGFR de molécula pequena que supostamente inibe a atividade da tirosina cinase de EGFR, é citostática contra uma faixa de células de câncer humano que expressa EGFR funcional e pode inibir a proliferação de célula de tumor por intermédio da supra-regulagem de p27.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em certas formas de realização, a presente invenção fornece um método para inibir o crescimento de um tumor em um paciente pediátrico tratando-se o paciente pediátrico com uma quantidade eficaz de um antagonista de EGFR e um agente quimioterapêutico. Em uma forma de realização preferida, o antagonista de EGFR é um anticorpo de EGFR que especificamente se liga ao domínio extracelular de EGFR e neutraliza a sua ativação. Em uma forma de realização preferida, o agente quimioterapêutico é irinotecano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos de tratar tumores em pacientes pediátricos pela administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de EGFR e um agente quimioterapêutico. Pacientes pediátricos, de acordo com a presente invenção, são pacientes do nascimento até 18 anos de idade. O tratamento inclui: (1) prevenir a doença de ocorrer em um paciente que possa estar predisposto à doença mas ainda não experienciou ou demonstrou sintomas da doença; por exemplo, prevenção do afloramento dos sintomas clínicos; (2) inibir o crescimento do tumor, por exemplo, impedindo o seu desenvolvimento; ou (3) aliviar o tumor, por exemplo, causando a regressão dos sintomas do tumor. Inibir o crescimento do tumor inclui diminuir ou deter o crescimento, assim como causar a regressão do tumor. Uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença significa que a quantidade que, quando administrada a um paciente em necessidade desta, é suficiente para efetuar o tratamento, como definido acima, da doença.

Os tumores que são tratados de acordo com a presente invenção são qualquer um dos tumores que expressam EGFR. Tais tumores incluem blastomas, incluindo hepatoblastomas e neuroblastomas; carcinomas, incluindo adenocarcinomas; gliomas, incluindo ependimomas, astrocitomas, oligodendrogliomas e gliomas mistos; sarcomas, incluindo rabdomiossarcomas e adenossarcomas; e adenomas. Os tumores podem ocorrer virtualmente em todas as partes do corpo, incluindo, por exemplo, os de mama, coração, pulmão, esôfago, intestino delgado, cólon, reto, estômago, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, laringe, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, osso, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cerviz ou fígado. Em uma forma de realização preferida, os tumores são tumores do sistema nervoso tais como gliomas e neuroblastomas. Os tumores a serem tratados incluem tumores primários e metastáticos, assim como tumores refratários. "Tumores refratários" incluem tumores que falham em responder ou são resistentes ao tratamento com agentes quimioterapêuticos sozinhos, anticorpos sozinhos, radiação sozinhos ou combinações destes. Tumores refratários também abrangem tumores que parecem ser inibidos pelo tratamento com tais agentes, mas voltam em até cinco anos, algumas vezes até dez anos ou mais depois que o tratamento é interrompido.

Um antagonista de EGFR, de acordo com a presente invenção pode ser um antagonista extracelular ou um antagonista intracelular e mais do que um antagonista pode ser utilizado. Antagonistas extracelulares incluem, mas não são limitados às proteínas ou outras moléculas biológicas que se ligam ao EGFR. Em certas formas de realização da invenção, um antagonista extracelular liga-se ao domínio extracelular de EGFR e inibe a ligação de EGFR a um ou mais de seus ligandos e/ou neutraliza a ativação induzida por ligando de EGFR. Ligandos para EGFR incluem EGF, TFG-α, anfirregulina, EGFR que se liga à heparina (HB-EGF) e betacelulina. Antagonistas extracelulares de EGFR também podem incluir substâncias que inibem a dimerização de EGFR com outras subunidades do receptor de EGFR (isto é, homodímeros de EGFR) ou heterodimerização com outros receptores do fator de crescimento (por exemplo, HER2).

Em uma forma de realização preferida, o antagonista de EGFR é um anticorpo que se liga ao EGFR e bloqueia a ligação de ligando. Um exemplo de um anticorpo de EGFR é cetuximab (IMCC225) (Acesso no GenBank N° 1NQLA), que é um anticorpo monoclonal de IgG quimérico (ser humano/camundongo). Ver por exemplo, a Patente U.S. N° 4.943.533 (Mendelsohn et al); Patente U.S. N° 6.217.866 (Schlessinger et al.); Pedidos U.S. N° 08/973.065 (Goldstein et al.) e 09/635.974 (Teufel); WO 99/60023 (Waksal et al.) e WO 00/69459, todos os quais são aqui incorporados por referência. Cetuximab especificamente liga-se ao EGFR e bloqueia a ligação de um ligando, tal como EGF. Cetuximab Fab contêm o fragmento Fab de Cetuximab, isto é, as seqüências da região variável de cadeia pesada e leve de anticorpo de murino M225 (Pedido U.S. Ser. N° 2004/0006212, aqui incorporada por referência) com os domínios constantes de cadeia pesada CH1 e leve capa de IgG1 humana. (Cetuximab inclui todos os três domínios constantes de cadeia pesada de IgG1). As regiões CDR da cadeia pesada de cetuximab têm as seguintes seqüências: uma região CDRl com uma seqüência de N Y G V H (SEQ ID NO: 1), uma região de CDR2 com uma seqüência deVIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 2) e uma região CDR3 com uma seqüência deALT YYD YEF AY (SEQ ID NO: 3). As regiões de CDR da cadeia leve de cetuximab têm as seguintes seqüências: uma região de CDRl com uma seqüência deRASQSIGTNI H (SEQ ID NO: 4), uma região CDR2 com uma seqüência de Y A S E S I S (SEQ ID NO: 5) e uma região CDR3 com uma seqüência deQQNNNWP TT (SEQ ID NO: 6).

Um outro exemplo de um anticorpo de EGFR é ABX-EGF, que é um anticorpo monoclonal de IgG2 totalmente humano específico para EGFR. ABX-EGF liga EGFR com alta especificidade, bloqueando a ligação de EGFR a ambos dos seus ligandos, EGF e TGF-α. Ver por exemplo, Figlin et al., Abstract 1102 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, São Francisco, CA, 12 a 15 de maio de 2001, que é aqui incorporada por referência. A seqüência e caracterização de ABX-EGF, que foi anteriormente conhecido como clone E7.6.3, são divulgadas na Patente U.S. N2 6.235.883 (Abgenix, Inc.) na coluna 28, linha 62 até a coluna 29, linha 36 e na Fig. 29- 34, que é aqui incorporada por referência. (Ver também Yang et al., Criticai Rev. Oncol./Hematol., 38(1): 17-23, 2001, que é aqui incorporada por referência).

Um outro exemplo de um anticorpo de EGFR é HERCEPTIN® (trastuzumab), que é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de RNA recombinante que seletivamente liga-se com alta afinidade em um ensaio com base em célula (Kd de 5 nM) ao domínio extracelular da proteína EGFR2 humana, HER2. O anticorpo é um IgGi capa que contenha regiões de matriz humanas com as regiões determinadoras de complementaridade de um anticorpo de murino (4D5) que se liga ao HER2. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional N2 WO 01/89566 (Mass), que é aqui incorporada por referência.

Outros anticorpos de EGFR incluem EMD 72000 (Merck KGaA), que é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal anti-EGFR de murino EMD 55900; h-R3 (TheraCIM), que é um anti-anticorpo monoclonal de EGFR humanizada; Yl0, que é um anticorpo monoclonal de murino e foi incitado contra um homólogo de murino da mutação EGFRvIII humana; e MDX-447 (Medarex). Ver a Patente U.S. N25 5.558.864 (Bendig et al.), 5.884.093 (Kettleborough et al.) e 5.891.996 (Mateo de Acosta dei Rio et al.), todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Os antagonistas intracelulares de EGFR podem ser moléculas biológicas, mas são usualmente moléculas pequenas, tais como inibidores de cinase sintéticos que atuam diretamente no domínio citoplasmático de EGFR para inibir a transdução de sinal mediada por EGFR. Um exemplo de um antagonista de EGFR de molécula pequena é IRESSA® (ZD1939), que é um derivado de quinozalina que funciona como um mimético de ATP para inibir EGFR. Ver a Patente U.S. N- 5.616.582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) na p. 4; ver também, Rowinsky et al., Abstrato 5 apresentado na 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12 a 15 de maio de 2001; Anido et al., Abstrato 1712 apresentado na 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12 a 15 de maio de 2001. Um outro exemplo de um antagonista de EGFR de pequena molécula é TARCEVA® (OSI774), que é um inibidor de EGFR derivado de 4-(substituído fenilamino)- quinozalina [Cloridreto de 6,7-Bis(2-metoxietoxi)-quinazolin-4-il]-(3-etinil- fenil)amina]. Ver a WO 96/30347 (Pfizer Inc.), por exemplo, na página 2, linha 12 até a página 4, linha 34 e página 19, linhas 14 a 17. Ver também Moyer et al., Câncer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al., J. Pharmacol., 291: 739-48 (1999). TARCEVA® pode funcionar pela inibição da fosforilação de EGFR e seus caminhos de transdução de sinal da cinase a jusante de PI31Akt e MAP (proteína ativada por mitógeno) que resulta na parada do ciclo celular mediado por p27. Ver Hidalgo et al., Abstract 281 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12 a 15 de maio de 2001.

Outras moléculas pequenas também são relatadas inibir EGFR, muitas das quais são consideradas serem específicas para o domínio da tirosina cinase de um EGFR. Alguns exemplos de tais antagonistas de EGFR de molécula pequena são descritos na WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited). WO 97/30034 (Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company) e WO 00/31048 (Warner Lambert Company). Os exemplos de antagonistas de EGFR de molécula pequena específicos incluem Cl 1033 (Pfizer), que é um inibidor de (N-[4-(3-cloro-4-fluoro-fenilamino)-7-(3-morfolin-4-il-propóxi)- quinazolin-6-il]-acrilamida) quinozalina de tirosina cinases, particularmente EGFR e é descrito na WO 00/31048 na página 8, linhas 22-6; PKI166 (Novartis), que é um inibidor de pirrolopirimidina de EGFR e é descrito na WO 97/27199 nas páginas 10 a 12; GW2016 (GlaxoSmithKline), que é um inibidor de EGFR e HER2; EKB569 (Wyeth), que é relatada inibir o crescimento de células de tumor que superexpressam EGFR ou HER2 in vitro e in vivo; AG-1478 (Tryphostin), que é uma molécula pequena de quinazolina que inibe a sinalização tanto de EGFR quanto de erbB-2; AG-1478 (Sugen), que é um inibidor de bissubstrato que também inibe a proteína cinase CK2; PD 153035 (Parke-Davis) que é relatado inibir a atividade de EGFR cinase e o crescimento de tumor, induzir a apoptose em células em cultura e realçar a citotoxicidade de agentes quimioterapêuticos citotóxicos; SPM-924 (Schwarz Pharma), que é um inibidor da tirosina cinase alvejado para o tratamento de câncer da próstata; CP-546,989 (OSI Pharmaceuticals), que é supostamente um inibidor da angiogênese para o tratamento de tumores sólidos; ADL-681, que é um inibidor da EGFR cinase alvejado para o tratamento de câncer; PD 158780, que é uma piridopirimidina que é relatada inibir a taxa de crescimento de tumor de xenoenxertos A4431 em camundongos; CP-358.774, que é uma quinzolina que é relatada inibir a autofosforilação em xenoenxertos HN5 em camundongos; ZD1839, que é uma quinzolina que é relatada ter atividade antitumor em modelo de xenoenxerto de camundongo incluindo cânceres vulvar, NSCLC, prostrático, ovariano e colorretal; CGP 59326A, que é uma pirrolopirimidina que é relatada inibir o crescimento de xenoenxertos positivos em EGFR em camundongos; PD 165557 (Pfizer); CGP54211 e CGP53353 (Novartis), que são dianilnofltalimidas. Os inibidores da tirosina cinase de EGFR naturalmente derivados incluem genisteína, herbimicina A, quercetina e erbstatina.

Outras moléculas pequenas relatadas inibir EGFR e que estão portanto dentro do escopo da presente invenção são compostos tricíclicos tais como os compostos descritos na Patente U.S. N- 5.679.683; derivados de quinazolina tais como os derivados descritos na Patente U.S. Ne 5.616.582; e compostos de indol tais como os compostos descritos na Patente U.S. N° 5.196.446.

Será avaliado que a molécula pequena útil a ser usada na invenção são inibidores de EGFR, mas não precisam ser completamente específicos para EGFR.

Em uma forma de realização preferida, o antagonista de EGFR é um anticorpo de anti-EGFR que exibe uma ou mais das seguintes propriedades:

1) O anticorpo liga-se ao domínio externo de EGFR e inibe a ligação de ligando. A inibição pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação direta usando receptor purificado ou ligado a membrana. Nesta forma de realização, os anticorpos da presente invenção ou fragmentos destes, preferivelmente ligam EGFR pelo menos tão fortemente quanto os ligandos naturais de EGFR (EGF, TFG-a).

2) Os anticorpos neutralizam EGFR. A ligação de um ligando a um domínio extracelular, externo de EGFR estimula a atividade da tirosina cinase e fosforilação de receptor e/ou a fosforilação de outras proteínas envolvidas nos vários caminhos de sinalização. A neutralização de EGFR inclui a inibição, diminuição, inativação e/ou rompimento de uma ou mais das atividades normalmente associadas com a transdução de sinal. A neutralização pode ser determinada in vivo, ex vivo ou in vitro usando, por exemplo, tecidos, célula cultivada ou componentes celulares purificados.

Uma medida da neutralização de EGFR é a inibição da atividade de tirosina cinase do receptor. A inibição da tirosina cinase pode ser determinada usando métodos bem conhecidos; por exemplo, medindo-se o nível de autofosforilação de receptor da cinase recombinante e/ou fosforilação de substratos naturais ou sintéticos. Assim, os ensaios de fosforilação são úteis na determinação de anticorpos neutralizadores no contexto da presente invenção. A fosforilação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo específico para fosfotirosina em um ensaio de ELISA ou em um western blot. Alguns ensaios para a atividade de tirosina cinase são descritas em Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) e Batley et al., Life Sei. 62: 143-50 (1998). Os anticorpos da invenção causam uma diminuição na fosforilação da tirosina de EGFR de pelo menos cerca de 75 %, preferivelmente de pelo menos cerca de 85 % e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 90 % em células que respondem ao ligando.

Uma outra medida da neutralização de EGFR é a inibição da fosforilação de substratos a jusante de EGFR. Conseqüentemente, o nível de fosforilação de MEK e ERK pode ser medido. A diminuição na fosforilação é de pelo menos cerca de 40 % e pode ser de pelo menos cerca de 60 % ou pelo menos cerca de 80 %.

Além disso, métodos para a detecção da expressão de proteína podem ser utilizados para determinar a neutralização de EGFR, em que as proteínas que são medidas são reguladas pela atividade da tirosina cinase de EGFR. Estes métodos incluem imunoistoquímica (IHC) para a detecção da expressão da proteína, hibridização in situ fluorescência (FISH) para a detecção da amplificação de gene, ensaios de ligação de radioligando competitiva, técnicas de manchamento de matriz sólida, tais como Northern e Southern blots, transcriptase reversa-reação da cadeia da polimerase (RT- PCR) e ELISA. Ver, por exemplo, Grandis et al., Câncer, 78: 1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Câncer Res., 85: 567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. 25 Path., 148: 1047-53 (1996); Collins, Glia 15: 289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Câncer Res. 1: 19-31 (1995); Petrides et al., Câncer Res. 50: 3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17: 4419-26 (1997); Wikstrand et al., CancerRes. 55: 3140-48 (1995).

Os ensaios ex vivo também podem ser utilizados para determinar a neutralização de EGFR. Por exemplo, a inibição do receptor de tirosina cinase pode ser observada pelos ensaios mitogênicos usando linhagens celulares estimuladas com ligando de receptor na presença e ausência de inibidor. Um exemplo de um tal ensaio mitogênico é um ensaio mitogênico de células 3T3 (células 3T3 (clone A31-714) da American Type Culture Collection (Manassas, VA)). Um outro método envolve testar quanto a inibição do crescimento de células de tumor que expressam EGFR ou células transfectadas para expressar EGFR. A inibição também pode ser observada usando modelos de tumor, por exemplo, células de tumor humanas injetadas em um camundongo.

Os anticorpos da presente invenção não são limitados por nenhum mecanismo particular de neutralização de EGFR. Os anticorpos anti- EGFR da presente invenção podem ligar-se externamente ao receptor de superfície de célula EGFR, bloquear a ligação de ligando e a transdução de sinal subseqüente mediada por intermédio da tirosina cinase associada a receptor e impedir a fosforilação do EGFR e outras proteínas a jusante na cascata da transdução de sinal.

3) Os anticorpos infra modulam EGFR. A quantidade de EGFR presente na superfície de uma célula depende da produção internalização e degradação de proteína receptora. A quantidade de EGFR presente na superfície de uma célula pode ser medida indiretamente, detectando-se a internalização do receptor ou uma molécula ligada ao receptor. Por exemplo, a internalização de receptor pode ser medida contatando-se células que expressam EGFR com um anticorpo rotulado. O anticorpo ligado à membrana é depois riscado, coletado e contado. Anticorpo internalizado é determinado lisando-se as células e detectando o rótulo nos lisados.

Um outro modo é medir diretamente a quantidade do receptor presente na célula a seguir do tratamento com um anticorpo anti-EGFR ou outra substância, por exemplo, pela análise de classificação de célula ativada por fluorescência de células tingidas quanto a expressão de superfície de EGFR. As células tingidas são incubadas a 37° C e a intensidade de fluorescência medida com o tempo. Como um controle, parte da população tingida pode ser incubada a 4o C (condições sob as quais a internalização de receptor é parada).

Uma outra medida da infra-modulação é a redução da proteína receptora total presente em uma célula e reflete a degradação de receptores internos. Conseqüentemente, o tratamento de células (particularmente células cancerosas) com anticorpos da invenção resulta em uma redução no EGFR celular total. Em uma forma de realização preferida, a redução é de pelo menos cerca de 70 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 %.

Para o tratamento de pacientes humanos, anticorpos de acordo com a invenção são preferivelmente humanos. Alternativamente, os anticorpos podem ser de primatas não humanos ou outros mamíferos ou podem ser anticorpos humanizados ou quiméricos.

Os fragmentos de anticorpo de acordo com a invenção podem ser produzidos pela clivagem de um anticorpo integral ou pela expressão de DNA que codifica o fragmento. Fragmentos de anticorpos podem ser preparados pelos métodos descritos por Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) e por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tais fragmentos podem conter um ou ambos fragmentos Fab ou o fragmento F(ab1)2. Tais fragmentos também podem conter anticorpos da região variável de fragmento de cadeia única, isto é, scFv, dicorpos ou outros fragmentos de anticorpo. Métodos de produzir tais equivalentes funcionais são divulgados no Pedido PCT WO 93/21319, Pedido de Patente Europeu Na EP 239400; Pedido PCT WO 89/09622; Pedido de Patente Europeu EP 338745; e Pedido de Patente Europeu EP 332424. As células hospedeiras preferidas para a transformação de vetores e expressão dos anticorpos da presente invenção são células de mamífero, por exemplo, células COS-7, células do ovário do hamster chinês (CHO) e linhagens celulares de origem linfóide tais como linfoma, mieloma (por exemplo, NSO) ou células de hibridoma. Outros hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras, podem ser alternativamente usados.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas pelos métodos conhecidos na técnica em um meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono (carboidratos tais como glicose ou lactose), nitrogênio (aminoácidos, peptídeos, proteínas ou seus produtos de degradação tais como peptonas, sais de amônio ou coisa parecida) e sais inorgânicos (sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio). O meio além disso contém, por exemplo, substâncias que promovem o crescimento, tais como elementos traço, por exemplo ferro, zinco, manganês e outros.

Os anticorpos anti-EGFR de alta afinidade de acordo com a presente invenção podem ser isolados de uma biblioteca de demonstração de fago construída de genes da região variável de cadeia pesada e cadeia leve humana. Por exemplo, um domínio variável da invenção pode ser obtido a partir de um linfócito sangüíneo periférico que contém um gene da região variável rearranjado. Alternativamente, as porções de domínio variável, tais como as regiões CDR e FW, podem ser obtidas de fontes diferentes e recombinadas. Além disso, as porções dos domínios variáveis (por exemplo, as regiões FW) podem ser seqüências de consenso sintéticas.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser obtidos, por exemplo, a partir de anticorpos que ocorrem naturalmente ou Fab ou diga-se bibliotecas de demonstração de fago. E entendido que, para fabricar um anticorpo de domínio único a partir de um anticorpo que compreende um domínio Vh e um VL, certas substituições de aminoácido fora das CDRs podem ser desejadas para realçar a ligação, expressão ou solubilidade. Por exemplo, pode ser desejável modificar resíduos de aminoácido que de outro modo estariam ocultos na interface VH- VL.

Além disso, anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos pela tecnologia de hibridoma padrão (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), que é aqui incorporada por referência) usando camundongos transgênico (por exemplo, camundongos KM da Medarex, San Jose, Calif.) que produzem as cadeias pesada gama e leve capa da imunoglobulina humana. Em uma forma de realização preferida, uma porção substancial do genoma que produz o anticorpo humano é inserida no genoma do camundongo e é tornado deficiente na produção de anticorpos de murino endógenos. Tais camundongos podem ser subcutaneamente imunizados (s.c.) com PDGFRa (usualmente no adjuvante de Freund completo) com reforços como necessário. Os métodos de imunização são bem conhecidos na técnica.

Anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção incluem imunoglobulinas completas, fragmentos de ligação de antígeno de imunoglobulinas, assim como proteínas de ligação de antígeno que compreendem domínios de ligação de antígeno de imunoglobulinas. Os fragmentos de ligação de antígeno de imunoglobulinas incluem, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2. Outros formatos de anticorpo foram desenvolvidos que retêm a especificidade de ligação, mas têm outras características que podem ser desejáveis, incluindo por exemplo, biespecificidade, multivalência (mais do que dois sítios de ligação), tamanho compacto (por exemplo, apenas domínios de ligação).

Os anticorpos de cadeia única carecem de algum ou todos dos domínios constantes dos anticorpos inteiros a partir dos quais eles são derivados. Portanto, estes podem superar alguns dos problemas associados com o uso de anticorpos inteiros. Por exemplo, anticorpos de cadeia única tendem a ser livres de certas interações indesejadas entre as regiões constantes de cadeia pesada e outras moléculas biológicas. Adicionalmente, os anticorpos de cadeia única são consideravelmente menores do que os anticorpos inteiros e podem ter maior permeabilidade do que os anticorpos inteiros, permitindo que os anticorpos de cadeia única se localizem e se liguem para alvejar sítios de ligação de antígeno mais eficientemente. Além disso, o tamanho relativamente pequeno de anticorpos de cadeia única os torna menos prováveis de provocar uma resposta imune indesejada em um receptor do que os anticorpos inteiros.

Os anticorpos de cadeia única múltiplos, cada cadeia única tendo um domínio VH e um VL covalentemente ligados por um primeiro ligador peptídico, pode ser covalentemente ligado por pelo menos um ou mais ligadores peptídicos para formar um anticorpo de cadeia única multivalente, que podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos. Cada cadeia de um anticorpo de cadeia única multivalente inclui um fragmento de cadeia leve variável e um fragmento de cadeia pesada variável e é ligado por um ligador peptídico a pelo menos uma outra cadeia. O ligador peptídico é composto de pelo menos quinze resíduos de aminoácido. O número máximo de resíduos de aminoácido é de cerca de cem.

Dois anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar um diacorpo, também conhecido como um dímero bivalente. Os diacorpos têm duas cadeias e dois sítios de ligação e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Cada cadeia do diacorpo inclui um domínio VH conectado a um domínio VL. Os domínios são conectados com ligadores que são curtos o bastante para prevenir o emparelhamento entre domínios na mesma cadeia, dirigindo assim o emparelhamento entre domínios complementares nas cadeias diferentes para recriar os dois sítios de ligação de antígeno. Três anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar triacorpos, também conhecidos como trímeros trivalentes. Os Triacorpos são construídos com o término de aminoácido de um domínio VL ou VH diretamente fundido ao terminal carboxila de um domínio VL ou VH, isto é, sem qualquer seqüência ligadora. O triacorpo tem três pontas Fv com os polipeptídeos dispostos em uma maneira cíclica de ponta a ponta. Uma conformação possível do triacorpo é planar com os três sítios de ligação localizados em um plano em um ângulo de 120 graus um do outro. Os triacorpos podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou triespecíficos.

Assim, os anticorpos da invenção e fragmentos destes incluem, mas não são limitados aos anticorpos que ocorrem naturalmente, fragmentos bivalentes tais como (Fab')2, fragmentos monovalentes tais como Fab, anticorpos de cadeia única, Fv de cadeia única (scFv), anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única multivalentes, diacorpos, triacorpos e outros que se ligam especificamente com antígenos.

De acordo com a presente invenção, um antagonista de EGFR é administrado em combinação com um ou mais agentes anti-neoplásticos. Como aqui utilizado, o termo, agente "anti-neoplástico" exclui um antagonista de EGFR, a menos que de outro modo especificado. Qualquer agente anti-neoplástico adequado pode ser usado, tal como um agente quimioterapêutico, radiação ou combinações destes. O agente anti-neoplástico pode ser um agente de alquilação ou um anti-metabólito. Os exemplos de agentes de alquilação incluem, mas não são limitados à, cisplastina, ciclofosfamida, melfalan e dacarbazina. Os exemplos de anti-metabólitos incluem, mas não são limitados à doxorrubicina, daunorrubicina, paclitaxel e gencitabina.

Em uma forma de realização preferida, o agente anti- neoplástico é um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos preferidos incluem amifostina (etiol), cisplatina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostarda nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina Iipo (doxil), gencitabina (gemzar), daunorrubicina, daunorrubicina Iipo (daunoxoma), procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotrexato, 5-fluorouracila, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginase, busulfan, carboplatina, cladribina, camptotecina, CPT-11, 10- hidróxi-7-etil-camptotecina (SN38), dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiuréia, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferon alfa, interferon beta, irinotecano, mitoxantrona, topotecano, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentoestatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposida, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorrelbina, clorambucila e combinações destes. Em uma forma de realização mais preferida, o agente quimioterapêutico é irinotecano.

Um agente anti-neoplástico, incluindo um agente quimioterapêutico e/ou um anti-metabólito, é administrado em uma dose e em um programa de acordo com as diretrizes da embalagem e/ou a resposta clínica do paciente. Tais doses estarão evidentes a uma pessoa de habilidade comum e não requer experimentação indevida. Por exemplo, Irinotecano é preferivelmente administrado na faixa de dose recomendada de cerca de 50 a cerca de 350 mg/m2, embora a dose possa ser mais alta ou mais baixa, dependendo da resposta clínica do paciente. Outros agentes têm faixas de dosagem de cerca de 1 a cerca de 1.000 mg/m2 por administração e/ou regime de tratamento. O tratamento por radiação é administrado com base nos protocolos de tratamento clínico apropriado e/ou experiência clínica de uma pessoa habilitada na técnica.

Em uma terapia de combinação, o antagonista de EGFR é administrado antes, durante ou depois de iniciar a terapia com um outro agente, assim como qualquer combinação destes, isto é, antes e durante, antes e depois, durante e depois ou antes, durante e depois de iniciar a terapia com agente anti-neoplástico. Por exemplo, um anticorpo de EGFR pode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferivelmente 3 e 20 dias, mais preferivelmente entre 5 e 12 dias antes de iniciar a terapia com radiação. Em uma forma de realização preferida da invenção, a quimioterapia é administrada concorrentemente com ou, mais preferivelmente, subseqüente à terapia com anticorpo.

Na presente invenção, qualquer método ou via adequados podem ser usados para administrar os antagonistas da invenção e opcionalmente, co-administrar os agentes anti-neoplásticos e/ou antagonistas de outros receptores. Os regimes de agente anti-neoplástico utilizados de acordo com a invenção, incluem qualquer regime acreditado ser otimamente adequado para o tratamento do tumor do paciente. Os tumores diferentes podem requerer o uso de anticorpos anti-tumor específicos e agentes anti- neoplásticos específicos, que serão determinados em uma base de paciente para paciente. As vias de administração incluem, por exemplo, a administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A dose de antagonista administrada depende de numerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de antagonistas, o tipo e gravidade do tumor que é tratado e da via de administração dos antagonistas. Deve ser enfatizado, entretanto, que a presente invenção não é limitada a nenhum método ou via de administração particulares.

Uma pessoa de habilidade na técnica entenderia que as dosagens e freqüências de tratamento dependem da tolerância do paciente individual e das propriedades farmacológicas e farmacocinéticas de agente bloqueador ou inibidor usado. Idealmente, deseja-se obter farmacocinéticas saturáveis para o agente usado. Uma dose de carga para um anti-anticorpo de EGFR pode variar, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 1000 mg/m2, preferivelmente de cerca de 200 a cerca de 400 mg/m2. Isto pode ser seguido por diversas dosagens diária ou semanalmente adicionais variando, por exemplo, de cerca de 200 a cerca de 400 mg/m2. O paciente é monitorado quanto aos efeitos colaterais e o tratamento é interrompido quando tais efeitos colaterais são graves.

Uma pessoa de habilidade na técnica também saberia como monitorar o progresso do tratamento de modo a determinar uma dose eficaz. Por exemplo, um tal modo é monitorar MRI, CT ou outras varreduras cerebrais.

EXEMPLOS

Exemplo 1: O seguinte exemplo divulga um método de tratar tumores refratários sólidos pela administração de uma combinação de irinotecano e um anticorpo de EGFR.

De agosto de 2005 a março de 2006, 20 pacientes pediátricos com tumores refratários sólidos e expectativa de vida de pelo menos 8 semanas foram administrados irinotecano e níveis de dose diferentes de cetuximab. Os pacientes foram divididos em dois grupos (idades de 1 a 12 = Ramo A e 13 a 18 = Ramo B) com os seguintes tipos de tumor: glioma da haste cerebral/astrocitoma (10), hepatoblastoma, osteossarcoma (1), ependimoma (1), neuroblastoma (1), rabdomiossarcoma (1) e outros (5). Irinotecano foi administrado a uma dose de 20 mg/m2/dia como uma infusão de 60 minutos por 5 dias χ 2 semanas, a cada 21 dias. Os programas de dose e o número de pacientes com toxicidades limitantes da dose (DLTs) são fornecidos na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 20</column></row><table> Devido à DLTs experimentadas por dois dos seis pacientes no Ramo A o nível de dose 2 que foi julgado estar relacionado com o irinotecano, o irinotecano foi diminuído para 16 mg/m2.

Um paciente no Ramo B experimentou uma reação de infusão de Grau 3 e o tratamento foi interrompido. Outro observou toxicidades incluídas exantema de grau 1.

Um paciente com um glioma de grau alto negativo em EGFR (grupo A nível de dose 1) obteve uma resposta parcial e está correntemente no ciclo 13. Um paciente com Neuroblastoma (grupo A nível de dose 1) experienciou uma resposta menor e está correntemente recebendo o ciclo 9. Sete pacientes tiveram uma melhor resposta de doença estável para uma média de 3,4 meses (variando de 2 a 7+ mo).

Em conclusão, a combinação de cetuximab e irinotecano mostra atividade anticâncer promissora em tumores sólidos pediátricos.

A descrição e exemplo precedentes foram apresentados meramente para ilustrar a invenção e não são intencionados como sendo limitantes. Cada um dos aspectos divulgados e formas de realização da presente invenção pode ser considerado individualmente ou em combinação com outros aspectos, formas de realização e variações da invenção. Além disso, embora certas características de formas de realização da presente invenção possam ser mostradas apenas em certas figuras, tais características podem ser incorporadas em outras formas de realização mostradas em outras figuras embora permaneçam dentro do escopo da presente invenção. Além disso, a menos que de outro modo especificado, nenhuma das etapas dos métodos da presente invenção são confinadas a qualquer ordem particular de execução. Modificações das formas de realização divulgadas que incorporam o espírito e substância da invenção podem ocorrer às pessoas habilitadas na técnica e tais modificações estão dentro do escopo da presente invenção. Além disso, todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência em sua totalidade. LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> IMCLONE SYSTEMS, INC.

<120> TRATAMENTO DE TUMORES EM PACIENTES PEDIÁTRICOS COM

ANTAGONISTAS DO RECEPTOR DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO

<130> 1017.52210-PCT

<140> <141>

<150> 60/833,487 <151> 2006-37-27

<160> 6

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1 <21x> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 1

Asn Tyr Gly Val His 1 5

<210> 2 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <400> 2

Vsl Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Pbe Thr Ser IS 10 IS

<210> 3 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223 > Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 3

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Slu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT

<2I3> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <40C> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ilo Gly Thr Asn lie His 1 5 10

<210> 5 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<222> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <400> 5

Tyr Ala Ser Glu Êer IIe Ser

<210> 6 <211> 9 <212> PBT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético

<400> 6

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

Claims (14)

1. Método para inibir o crescimento de um tumor em um paciente pediátrico, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o paciente pediátrico com uma quantidade eficaz de um antagonista do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e um agente quimioterapêutico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor refratário.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tumor é um glioma.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tumor é um neuroblastoma.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antagonista é um anticorpo ou fragmento do mesmo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo especificamente liga-se ao domínio extracelular de EGFR.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo inibe a ligação de um ligando de EGFR a um EGFR e neutraliza a sua ativação.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é cetuximab.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é monoclonal.

10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é quimérico.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é humanizado.

12. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é humano.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterapêutico é irinotecano.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar a radiação ao paciente pediátrico.