BRPI0713252B1

BRPI0713252B1 - processo para a recuperação de fator de crescimento endotelial vascular (vegf) recombinante reenovelado

Info

Publication number: BRPI0713252B1
Application number: BRPI0713252A
Authority: BR
Inventors: Sanchez Ailen; H Schmelzer Charles; Pizarro Shelly
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2018-12-18
Also published as: BRPI0713252B8; CA2656835A1; KR20090039772A; WO2008008975A2; KR101520105B1; TW200813093A; RU2009105080A; US9200030B2; WO2008008975A3; US9994612B2; NZ573639A; JP2009543882A; MY169472A; AU2007272412B2; CN101506222A; US20080125580A1; WO2008008975A8; IL196004A; BRPI0713252C1; CA2656835C

Abstract

processos para a recuperação de uma proteína recombinante reenovelada e método para purificar uma proteína recombinante. são fornecidos processos para a recuperação e purificação de proteínas recombinantes reenoveladas produzidas em células hospedeiras heteróloga, que inclui a etapa de reenovelamento da proteína em um tampão de ph elevado.

Description

“PROCESSO PARA A RECUPERAÇÃO DE FATOR DE CRESCIMENTO

ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) RECOMBINANTE REENOVELADO”

Pedidos Relacionados [001] Este é um pedido que reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente US 60/830.831, depositado em 14 de julho de 2006, o qual é incorporado especificamente ao presente pedido pela referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção esta relacionada aos métodos para obtenção de proteínas recombinantes heterólogas produzidas em cultura de células. A presente invenção inclui métodos para recuperar e purificar proteínas recombinantes reenoveladas, que tenham sido produzidas em células hospedeiras procarióticas e estão presentes nessas células, normalmente no espaço periplasmático ou espaço intracelular. As proteínas recombinantes, produzidas em células hospedeiras procarióticas também podem ser encontradas como proteínas solúveis ou como uma mistura de proteínas solúveis e insolúveis.

Antecedentes da Invenção [003] Muitas proteínas recombinantes e relevantes terapeuticamente são produzidas em uma variedade de organismos hospedeiros. A maioria das proteínas pode ser expressa na sua forma nativa em hospedeiros eucarióticos, tais como células CHO. Culturas celulares de origem animal geralmente requerem tempo de crescimento prolongado para alcançar a densidade máxima de células e, em última análise, atingem menor densidade de células do que culturas celulares de procariotas (Cleland, J. (1993) ACS Symposium Series 526, Protein Folding: In Vivo and In Vitro, American Chemical Society). Além disso, culturas de células de origem animal necessitam muitas vezes de meios de cultura caros que contenham

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2/59 componentes de crescimento e que podem interferir na recuperação da proteína desejada. Sistemas de expressão em hospedeiros bacterianos fornecem uma alternativa eficaz em termos de custos para a fabricação de proteínas recombinantes em produção de larga escala. Existem diversas patentes US relacionadas em geral com a expressão de proteínas recombinantes em bactérias, inclusive as Patentes US 4.565.785, US 4.673.641, US 4.795.706 e US 4.710.473. Uma grande vantagem do método de produção é a capacidade de isolar o produto facilmente a partir dos componentes celulares por centrifugação ou microfiltração. Vide, por exemplo, Kipriyanov e Little, (1999) Molecular Biotechnology, 12:173-201; e, Skerra e Pluckthun, (1988) Science, 240: 1038-1040.

[004] Entretanto, tais como sistemas de expressão bacteriana, tal como de bactérias E. coli carecem da maquinaria celular para facilitar o reenovelamento adequado das proteínas e, geralmente, não resulta na secreção de proteínas grandes para os meios de cultura. Proteínas recombinantes expressas em células hospedeiras bacterianas são frequentemente encontradas como corpos de inclusão nos organismos constituídos por densas massas de proteínas menores parcialmente enoveladas e enoveladas incorretamente. Vide, por exemplo, Baneyx, (1999) Current Opin. B/otecbno/ogy 10:411-421; e, Villaverde e Carrio, (2003) Biotech. Letts. 25:1385-1395. As proteínas também podem ser expressas sem a formação de corpos de inclusão. Vide, por exemplo, Id. Tipicamente, em corpos de inclusão, as proteínas recombinantes são geralmente inativas.

[005] Adicionalmente, muitas vezes o reenovelamento produz um enovelamento incorreto, e dímeros, trímeros, e multímeros ligados por pontes dissulfeto. (Morris et al., (1990) Biochem. J., 268:803-806; Toren et al., (1988) Anal. Biochem., 169:287-299). Este fenômeno de associação é muito comum durante o reenovelamento da proteína, especialmente em altas concentrações

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3/59 de proteína, e parece muitas vezes envolver a associação, através da interação hidrofóbica de intermediários enovelados parcialmente (Cleland e Wang, (1990)

Biochemistry, 29:11072-11078).

[006] O enovelamento incorreto ocorre na célula durante a fermentação ou durante o processo de isolamento. Proteínas recuperadas a partir do espaço periplasmático ou espaço intracelular devem ser solubilizadas e as proteínas solúveis reenoveladas no estado nativo. Vide, por exemplo, Rudolph, Renaturation of Recombinant, Disulfide-Bonded Proteins From “Inclusion Bodies” em Modern Methods in Protein- and Nucleic Acid Research (Walter de Gruyter Nova Iorque, 1990) Págs. 149-172. Métodos in vitro para o reenovelamento das proteínas na conformação correta e biologicamente ativa são essenciais para a obtenção de proteínas funcionais. Típicos processamentos à jusante de proteínas recuperadas de corpos de inclusão incluem a dissolução do corpo de inclusão em uma concentração elevada desnaturante, como a ureia, seguida pela diluição do desnaturante para permitir que o reenovelamento ocorra (Vide, Patentes US 4512922, US 4511502 e US 4511503). Vide também, por exemplo, Rudolph e Lilie, (1996) FASEB J. 10:49-56; Fischer et al., (1993), de Biotecnologia e Bioengenharia, 41:3-13; Misawa & Kumagai, (1999) Biotechnology and Bioengineering, 41:313; Misawa & Kumagai, (1999) Biopolymers 51:297-307; e, Clark, (1998) Current Opinion in Biotechnology, 9:157-163; e , Tsumoto et al., (2003) Protein Expression and Purification 28:1-8. Tais métodos de recuperação são considerados como sendo aplicáveis universalmente, com pequenas modificações, para a recuperação das proteínas recombinantes biologicamente ativas a partir de corpos de inclusão. Estes métodos foram aplicados na proteína de ligação a heparina (HBP), tais como VEGF (Siemeister et al. (1996) supra). Estes métodos visam eliminar ligações dissulfeto aleatórias antes de atrair a proteína recombinante na sua conformação biologicamente ativa

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4/59 através das suas outras forças estabilizadoras e pode não eliminar intermediários indevidamente enovelados, fornecendo uma população homogênea de produto enovelado adequadamente, ou fornecendo uma quantidade suficiente de produto enovelado adequadamente.

[007] Reversão de micelas ou cromatografia de troca iônica têm sido utilizadas para auxiliar o reenovelamento de proteínas desnaturadas anexando uma única proteína dentro de micelas ou isolando-as em resina e, em seguida, eliminando o desnaturante (Hagen et al., (1990) Biotechnol. Bioeng. 35:966 -- 975; Creighton (1985), Protein Structure Folding and Design (Oxender, DL Ed.) Pp.249-251, Nova Iorque: Alan R. Liss, Inc.). Estes métodos são úteis na prevenção da agregação proteica e facilitam um reenovelamento apropriado. Para alterar a taxa ou a extensão do reenovelamento, reenovelamentos de conformação específica têm sido realizadas com ligantes e anticorpos para a estrutura de proteínas nativas (Cleland e Wang, (1993), em Biotecnology, (Rehm H.-J., e Reed G . Eds.) 528-555, Nova Iorque, VCH). Por exemplo, a creatina quinase foi reenovelada na presença de anticorpos para a estrutura nativa (Morris et al., (1987) Biochem. J. 248:53-57). Além disso, anticorpos, ligantes e co-fatores ligantes foram utilizados para melhorar o reenovelamento. Essas moléculas seriam mais propensas a interagir com o enovelamento da proteína após a formação da proteína nativa. Portanto, o equilíbrio do enovelamento poderia ser orientado para o estado nativo. Por exemplo, a taxa de reenovelamento do ferricitocromo c foi melhorado pelo ligante extrínseco para a posição axial do ferro heme (Brems e Stellwagon, (1983) J. Biol. Chem. 258:3655-3661). Proteínas chaperonas e catalisadores de enovelamento também foram utilizados para auxiliar o enovelamento proteico. Vide, por exemplo, Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421; & Carrio & Villaverde, (2003) FEBS Letters 537:215-221. No entanto, estes métodos não são eficientes nem suficientes para produzir produtos de proteína em

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5/59 quantidade.

[008] Existe uma necessidade de métodos novos e mais eficientes de enovelamento e/ou recuperação de proteínas recombinantes, a partir de uma cultura de célula hospedeira, por exemplo, um método eficiente e econômico para a produção de proteínas recombinantes, em cultura de células bacterianas. Estes métodos novos e mais eficazes são fornecidos para uma recuperação melhorada de uma proteína reenovelada corretamente, biologicamente ativa e altamente purificada, e que é geralmente aplicável na produção de proteínas em larga escala. A presente invenção aborda estas e outras necessidades, que serão evidentes sob a análise da seguinte divulgação.

Descrição Resumida da Invenção [009] A presente invenção fornece um método de recuperação e purificação de proteínas recombinantes reenoveladas a partir de cultura celular. Em particular, a presente invenção fornece um método para a recuperação de uma proteína recombinante a partir de células hospedeiras procarióticas, por exemplo, células bacterianas. Os processos da presente invenção são globalmente aplicáveis às proteínas recombinantes. Em certos exemplos de realização, a proteína recombinante é um fator de crescimento, por exemplo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em um exemplo de realização, o fator de crescimento é VEGF165.

[010] Em um exemplo de realização, um processo inclui: (a) isolamento da mencionada proteína recombinante a partir da cultura de células procarióticas; (b) solubilização da mencionada proteína em uma primeira solução tamponada, com pH superior a 9, que compreende um primeiro agente caotrópico; (c) reenovelamento da mencionada proteína solubilizada em uma segunda solução tamponada, de pH > 9, porém <11, que compreende um segundo agente caotrópico, dois ou mais agentes redutores e adição de ar ou

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6/59 oxigênio por um tempo determinado e sob condições tais que ocorra o reenovelamento da proteína recombinante; e (d) recuperação da mencionada proteína recombinante reenovelada. Em um exemplo de realização, a primeira solução tampão e/ou a segunda solução tampão contém ainda arginina. Em um exemplo de realização, a primeira solução tampão contém uma concentração final de ureia de 1M, arginina 300 mM, CHES 10 mM, EDTA 5 mM, em pH 11. Em outro exemplo de realização, a primeira solução tampão contém uma concentração final de ureia 1M, arginina 300 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, em pH 11. Em outro exemplo de realização, a segunda solução tampão contém dois ou mais agentes redutores, por exemplo, DTT e cisteína. Em um exemplo de realização, a segunda solução tampão contém em uma concentração final; ureia 1M, cisteína 15 mM, DTT 2mM, arginina 100 mM, CHES 10 mM, EDTA 5 mM, em pH 10,. Em outro exemplo de realização, a segunda solução tampão contém em uma concentração final: ureia 1M, cisteína 15 mM, DTT 0,5-2 mM, arginina 100 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, em pH 10.

[011] Em um exemplo de realização, um processo inclui: (a) isolamento da mencionada proteína recombinante a partir da cultura de células procarióticas; (b) solubilização e reenovelamento da mencionada proteína em uma solução tamponada combinada, com pH > 9 e < 11, com adição de ar ou oxigênio; e (c) recuperação da mencionada proteína recombinante reenovelada. Em um exemplo de realização, a solução tamponada combinada contém na concentração final: ureia 1M, cisteína 15 mM, DTT 2 mM, arginina 100 mM, CHES 10 mM, EDTA 5 mM, pH 10. Em outro exemplo de realização, a solução tamponada combinada contém em uma concentração final: ureia 1M, cisteína 15 mM, DTT 0,5-2 mM, arginina 100 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, pH 10.

[012] O oxigênio ou ar para a reação de reenovelamento pode ser fornecido por uma fonte de ar ou um gás comprimido enriquecido com

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7/59 oxigênio. Em um exemplo de realização, um ki_a de 0,004min'¹ é utilizado, por exemplo, que representa uma velocidade de mistura de 200-400rpm e taxa de difusão de 0,3cc/min/L em um recipiente de 2,5L contendo propulsor do tipo marinho. Em outros exemplos de realizações, ki_a = 0,01 min^-1 ou 0,1 min^-1 são utilizados para produzir proteínas reenoveladas.

[013] A solubilização e/ou reenovelamento podem ser realizados em várias temperaturas. Em um exemplo de realização, a temperatura de incubação para a solubilização e/ou reenovelamento é a temperatura ambiente. O tempo de incubação pode variar de acordo com a proteína recombinante a ser recuperada e reenovelada. Em um exemplo de realização, a proteína recombinante é incubada com a primeira solução tamponada por pelo menos 1 hora, ou de 1 a 2 horas. Em um exemplo de realização, a proteína solubilizada é incubada com a segunda solução tamponada por cerca de 3 a 24 horas. Em um exemplo de realização, a proteína recombinante isolada é incubada com a solução tamponada combinada por cerca de 3 a 24 horas.

[014] A presente invenção fornece adicionalmente processos e métodos de reenovelamento de proteínas recombinantes, tanto na forma isolada quanto na forma ligada a um recuperador da proteína recombinante, conforme descrito a seguir. Em um exemplo de realização específico, os métodos de purificação incluem o clareamento da solução contendo a proteína recombinante e permitindo o contato da mencionada proteína recombinante reenovelada com a solução de clareamento com um suporte de modo misto, um suporte cromatográfico catiônico, um primeiro suporte cromatográfico de interação hidrofóbica e, opcionalmente, um segundo suporte cromatográfico de interação hidrofóbica ou um suporte de troca iônica; e a recuperação seletivamente ou a eluição da proteína recombinante reenovelada a partir de cada suporte. Em um exemplo de realização, o clareamento da solução compreende a adição de detergente para uma concentração final de 1%,

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8/59 ajustando-se o pH a cerca 8,5-9,5, e incubando-se a solução por 1 a 10 horas a 25-30°C, centrifugando-se a solução; e filtrando-se o líquido recuperado a partir da etapa de centrifugação. Em um exemplo de realização, o pH é de cerca de 8,7. Em outro exemplo de realização, o pH é cerca de 9,0. Contempla-se que os passos para as etapas de recuperação podem ser realizados em qualquer ordem, por exemplo, sequencialmente ou alterando-se a ordem dos suportes cromatográficos. Em certos exemplos de realização da presente invenção, são fornecidos métodos para recuperação e purificação de proteínas recombinantes reenoveladas a partir de cultura celulares em escala de fabricação ou produção industrial.

Breve Descrição das Figuras [015] A Figura 1 exibe um estudo temporal do processo de reenovelamento como descrito no presente pedido, que foi avaliado por cromatografia rpHPLC.

[016] A Figura 2 exibe uma cromatografia do VEGF produzido pela cepa bacteriana W3110 carregado em uma coluna CaptoMMC™. A coluna foi equilibrada com 25 mM de HEPES, pH 9,0. O VEGF foi eluído isocraticamente a partir da coluna MMC com arginina 1mM/ HEPES 25 mM, pH 6-9.

[017] A Figura 3 exibe uma cromatografia do VEGF produzido pela cepa bacteriana W3110 carregado em uma coluna SPHP. A coluna SPHP é, por exemplo, equilibrada em 50 mM de HEPES, pH 7,5. A coluna é eluída usando um gradiente linear entre 0,0-1,2 M de acetato de sódio em 50 mM de HEPES, pH 7,5 sobre o volume de 1 coluna. O eluente é monitorado a 280 nm. A proteína é recuperada a partir de frações com o maior valor de absorbância a 280 nm (ODmax a ~ 42mS/cm), que normalmente contêm > 90% de VEGF, e são reunidos em um grupo para tratamento posterior.

[018] A Figura 4 exibe uma cromatografia do VEGF produzida

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9/59 pela cepa bacteriana W3110 carregada em uma coluna HiPropyl.

[019] A Figura 5 exibe uma cromatografia do VEGF produzida pela cepa bacteriana W3110 carregada em uma coluna Phenyl Sepharose.

[020] A Figura 6 exibe o efeito de ureia e arginina nas condições de reenovelamento.

[021] A Figura 7 exibe o efeito do N2 na estabilização do grupo de reenovelados por até 48 horas conforme avaliados pelo estudo temporal por rpHPLC, quando N2 foi adicionado 6 horas após o reenovelamento começar.

[022] A Figura 8 exibe o efeito da variação da taxa de difusão do ar sobre as condições de reenovelamento.

[023] A Figura 9 exibe um ensaio de coluna, no qual é utilizado um HPLC de troca catiônica para avaliar o reenovelamento do VEGF.

[024] A Figura 10 exibe a sequência de aminoácidos do VEGF165 com as pontes de bissulfeto indicadas.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições [025] A expressão “polipeptídeo”, da forma utilizada no presente, refere-se geralmente aos peptídeos e proteínas a partir de qualquer fonte de células possuindo mais do que dez aminoácidos. Polipeptídeos heterólogos são aqueles polipeptídeos estranhos à célula hospedeira que estão sendo utilizados, tais como uma proteína humana produzida por E. coli. Apesar de o polipeptídeo heterólogo poder ser procariótico ou eucariótico, será preferencialmente eucariótico, mais preferencialmente de mamíferos e mais preferencialmente humano. Em certos exemplos de realização, este é produzido por métodos recombinantes (por exemplo, um polipeptídeo recombinante ou proteína recombinante).

[026] Exemplos de polipeptídeos de mamíferos incluem moléculas como, por exemplo, fator de crescimento; fator de crescimento de

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10/59 ligação a heparina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), por exemplo, VEGF-A (isoformas), VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D; um receptor e anticorpo para VEGF, como rhuFab V2 e bevacizumab, ranibizumab; um anticorpo para receptores de VEGF; renina, hormônio de crescimento, incluindo o hormônio do crescimento humano (hGH); hormônio do crescimento bovino; fator liberador do hormônio do crescimento; hormônio da paratireóide; hormônio estimulante da tiróide; lipoproteínas; antitripsina-1; cadeia-a da insulina; cadeia-b da insulina; pró-insulina; trombopoietina; hormônio folículo estimulante; calcitonina, hormônio luteinizante; glucagon; receptores do hormônio do crescimento; proteína de liberação do hormônio do crescimento (GHRP); LIV-1 (PE 1263780); TRAIL; fatores de coagulação tais como fator Vlllc, fator IX, fator tecidual, Fator von Willebrand; Fator VIII, domínio do Fator VIIIB; anti-fator tecidual; anti-fatores de coagulação, tal como a Proteína-C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; ativador do plasminogênio, como a uroquinase ou urina humana ou ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) e variantes destes; bombesina; trombina; fator hematopoiético de crescimento, fator de necrose tumoral-alfa e beta; anticorpos para o(s) domínio(s) ErbB2, encefalinase; albumina, tal como albumina humana; fator inibidor mülleriano; cadeia A da relaxina; cadeia-B da relaxina; prórelaxina; peptídeo de camundongo associado à gonadotrofinas; uma proteína microbiana, tais como beta-lactamase; DNase; inibina; ativina; receptores de hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A ou D; fatores reumatóides, tais como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3 , NT-4, NT-5 ou NT-6), ou fator de crescimento neural, tais como NGF; cardiotrofinas (fator de hipertrofia cardíaca), como cardiotrofina-1 (CT-1), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (A, B, C ou D), fator de crescimento de fibroblasto, aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de transformação do crescimento (TGF), como o TGF-alfa e

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TGF-beta, incluindo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, ou TGF-5; fator de crescimento semelhante à insulina-l e-ll (IGF-I e IGF-II) e seus receptores, como o IGFBP-1-IGFBP-6; des (1 -3)-IGF-l (IGF-I cérebro), proteínas de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD, tais como CD-3, CD-4, CD-8 e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon, como interferon-alfa, -beta e -gama; albumina, tais como a albumina humana (HSA) ou albumina do soro bovino (BSA); fatores estimulantes de colônia (CSF), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, de IL-1 a IL-10; anticorpo anti-HER-2; ligante de Apo2; superóxido dismutase; anti-CD20; heregulina, anti-lgE, anti-CD11a, anti-CD18; fator de necrose tumoral (TNF) e anticorpos para o mesmo, receptor de TNF e e anticorpos para o mesmo, TNF-receptorIgG, fatores associados ao receptor de TNF (TRAFs) e seus inibidores, receptores de células T; proteínas de superfície da membrana; fatores de aceleração do decaimento “decay accelerating factor¹’·, anti-TGF tal como antiTGF-beta; anti-ativina; anti-inibina; anticorpos anti-Fas; inibidor do ligante de Apo-2; receptor de Apo-2; Apo-3; fatores apoptóticos; Ced-4; DcR3; anticorpos agonistas de receptor de mote (DR4, DR5); linfotoxina (LT), prolactina, receptor de prolactina; proteínas SOB; WISP (proteínas secretadas induzida por wnt); anti-NGF; DNase; antígeno da hepatite; antígeno da herpes simplex; leptina; proteína Toll, ligantes de TIE, anti-CD40 e CD40, imunoadesinas, subtilisina, fator de crescimento de hepatócitos (FGH), trombopoietina (TPO); antígeno da célula-tronco prostática (PSCA); antígeno viral, como, por exemplo, uma porção do envelope do vírus da AIDS; proteínas de transporte; receptores “homing”·, adressinas; proteínas reguladoras; anticorpos; e fragmentos de qualquer um dos polipeptídeos acima citados. O termo “anticorpo” é utilizado no presente no sentido mais amplo e inclui especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo,

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12/59 anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Em certos exemplos de realização da presente invenção, o polipeptídeo recombinante é um fator de crescimento. Em um exemplo de realização, o polipeptídeo recombinante é o polipeptídeo VEGF de mamífero. Em outro exemplo de realização, o polipeptídeo recombinante é VEGF humana (por exemplo, VEGF165). Em um exemplo de realização, o polipeptídeo recombinante não é angiostatina. Em um exemplo de realização, o polipeptídeo recombinante não é IGF-1.

[027] O termo “fator de crescimento endotelial vascular” ou “VEGF”, da forma como utilizado no presente refere-se a um fator de crescimento de mamífero derivado originalmente células foliculares pituitária de bovinos tendo sua sequência de aminoácidos divulgada em Castor, CW, et al., (1991) Methods in Enzymol . 198:391-405; juntamente com seus derivados funcionais com a atividade biológica qualitativa de um VEGF nativo correspondente, incluindo, mas não se limitado a, sequência de aminoácidos do VEGF humano como descrito em Houck et al., (1991) Mol. Endocrin. 5:1806-1814. Vide também, Leung et al. (1989) Science, 246:1306, e, Robinson & Stringer, (2001) Journal of Cell Science, 144 (5):853-865, Patente US 5332671. Este também é referido como VEGF-A. Outros membros da família são indicados por letras, no final do VEGF, por exemplo, VEGF-B, VEGF-C ou VEGF-D. A forma predominante de VEGF ou VEGF-A é uma sequência homodimérica de 165 aminoácidos contendo dezesseis resíduos de cisteína que formam 7 pontes de bissulfeto intramoleculares e duas pontes de bissulfeto intermoleculares. Um splicing alternativo está envolvido na formação de vários polipeptídeos VEGF humano constituído de 121, 145, 165, 189 e 206 aminoácidos, porém a variante VEGF121 carece do domínio de ligação com a heparina das outras variantes. Todas as isoformas de VEGF compartilham um

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13/59 domínio amino-terminal, mas diferem no comprimento da porção carboxiterminal da molécula. A forma ativa preferida de VEGF, é VEGF165, que tem pontes de bissulfeto entre os resíduos de aminoácido Cys26-Cys68; Cys57Cys104; Cys61-Cys102; Cys117-Cys135; Cys120-Cys137; Cys139-Cis158; Cys146-Cys160 em cada monômero. Consulte a Fig. 10. Vide também, por exemplo, Keck et al., (1997) Archives of Biochemistry and Biophysics 344 (1):103-113. A molécula de VEGF165 é composta por dói domínios: um domínio amino-terminal de ligação ao receptor (aminoácidos 1-110 homodímero ligado por pontes de bissulfeto) e um domínio carboxi-terminal de ligação com a heparina (resíduos 111-165). Vide, por exemplo, Keyt et al., (1996) J. Biol. Chem., 271 (13):7788-7795. Em certos exemplos de realização da presente invenção, o VEGFws isolado e purificado não está glicosilado no resíduo 75 (ASN). Vide, por exemplo, Yang etal., (1998) Journal of Pharm. & Experimental Therapeutics, 284:103-110. Em exemplos de realização específicos, o VEGFws isolado e purificado é substancialmente não desaminado no resíduo Asn10. Em certos exemplos de realização, o VEGFws isolado e purificado é uma proteína com mistura de desaminado (pelo resíduo Asn10) e não desaminado, normalmente com a maioria das proteínas sendo não desaminado. Visto que VEGF165 é um homodímero, a desaminação pode ocorrer em uma ou nas duas cadeias polipeptídicas.

[028] O termo proteínas de ligação à heparina, da forma utilizada na presente invenção refere-se a um polipeptídeo capaz de se ligar a heparina (como definido no presente). A definição inclui formas maduras, pré, pré-pró, e pro formas de proteínas de ligação à heparina nativas e produzidas por métodos recombinantes. Exemplos típicos de proteínas de ligação à heparina são fatores de crescimento ligantes de heparina incluindo, mas não se limitado a; fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento derivado plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF),

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14/59 fator de crescimento de fibroblasto ácido (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócitos (FGH) (também conhecido fator de dispersão “scatter factor”, SF), fator de crescimento neuronal (NGF), IL-8, etc.

[029] Heparina (também denominado ácido heparínico) é um grupo heterogêneo de mucopolissacarídeos de cadeia linear aniônica, altamente sulfatada denominados glicosaminoglicanos. Embora outros possam estar presentes, os principais açúcares na heparina são: ácido a-L-idurônico 2sulfato, 2-deoxi-2-amino sulfamina-a-glicose 6-sulfato, ácido β-D-glucurônico, 2-acetamido-2 -deoxi-a-D-glicose e ácido L-idurônico. Estes e opcionalmente outros açúcares, são unidos por ligações glicosídicas, formando polímeros de tamanhos variados. Devido à presença de suas ligações covalentemente de sulfato e grupos de ácido carboxílico, a heparina é fortemente ácida. O peso molecular da heparina varia entre cerca de 3000 a cerca de 20000 daltons dependendo da fonte e do método de determinação. A heparina nativa é um constituinte de diversos tecidos, principalmente do fígado, pulmão e mastócitos em várias espécies de mamíferos. A heparina e os sais heparina (heparina sódica) são disponíveis comercialmente e são principalmente utilizadas como anticoagulantes em diversas situações clínicas.

[030] Conforme utilizado no presente, VEGF ou outras proteínas recombinantes e similares enovelado corretamente ou biologicamente ativo refere-se a uma molécula com uma conformação biologicamente ativa. Um técnico hábil no assunto irá reconhecer que proteínas intermediárias enoveladas incorretamente ou com pontes de bissulfeto desorganizadas podem ter atividade biológica. Nesse caso o VEGF corretamente enovelado ou biologicamente ativo ou o padrão de enovelamento nativo corresponde do VEGF (descrito acima) ou outras proteínas recombinantes. Por exemplo, o VEGF corretamente enovelado tem os pares de pontes de bissulfeto citados

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15/59 acima, além de duas pontes de bissulfeto intermoleculares na molécula dimérica, no entanto outros intermediários podem ser produzidos por cultura de células bacterianas. Para o VEGF corretamente enovelado, as duas ligações de pontes de bissulfeto intermoleculares ocorrem entre os mesmos resíduos, Cys51 e Cys60, de cada monômero. Vide, por exemplo, documento WO98/16551. As atividades biológicas do VEGF incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, estimulando a permeabilidade vascular, estimulando o crescimento de células endoteliais vasculares, ligando-se a um receptor VEGF, ligando-se e sinalizando através de um receptor VEGF (vide, por exemplo, Keyt et al., (1996 ) Joumal of Biological Chemistry, 271 (10) :56385646), induzindo a angiogênese e etc.

[031] Os termos purificado ou proteína recombinante pura e similares referem-se a um material isento de substâncias que o acompanha como é normalmente encontrado em sua produção recombinante e, especialmente, na cultura de células bacteriana ou procariótica. Assim, os termos referem-se a uma proteína recombinante que é livre de contaminação de DNA, proteínas de células hospedeiras ou outras moléculas associadas com o seu ambiente in situ. Os termos referem-se a um grau de pureza que é pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95% ou pelo menos, cerca de 98% ou mais.

[032] Os termos corpos de inclusão ou corpos refringentes referem-se a massas intracelulares densas de agregados do polipeptídeo de interesse, que constituem uma parcela significativa do total de proteínas celulares, incluindo todos os componentes celulares. Em alguns casos, mas nem em todos os casos, estes agregados de polipeptídeos podem ser reconhecidos como pontos brilhantes delimitados dentro das células visíveis sob um microscópio de contraste de fase em magnificação a baixo de 1000x.

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16/59 [033] O termo proteína “enovelada incorretamente” da forma com é utilizado no presente, refere-se a polipeptídeos precipitados ou agregados que estão contidos nos corpos refringentes. Conforme utilizado no presente, o termo VEGF ou outra proteína recombinante “insolúvel” ou “enovelada incorretamente” refere-se a VEGF ou outra proteína recombinante precipitadas ou agregadas que estão contidas dentro do periplasma ou espaço intracelular das células hospedeiras procarióticas, ou está de outra forma associada a célula hospedeira procariótica, e assume uma conformação biologicamente inativa com pontes de bissulfetos inadequadas ou ausentes. A proteína recombinante insolúvel está, em geral, mas não necessariamente, dentro dos corpos refringentes, ou seja, ele pode ou não ser visível sob um microscópio de contraste de fase.

[034] Conforme utilizado no presente, agente caotrópico referese a um composto que, em uma concentração adequada, em solução aquosa, é capaz de mudar a configuração espacial ou de conformação de polipeptídeos mediante alterações na superfície deste, e assim tornar o polipeptídeo solúvel no meio aquoso. As alterações podem ocorrer, alterando, por exemplo, o estado de hidratação, o ambiente do solvente, ou a interação de superfície solvente. A concentração do agente caotrópico irá afetar diretamente a sua força e eficácia. Uma solução caotrópica fortemente desnaturante contendo um agente caotrópico em grandes concentrações, que, na solução, irá desenovelar efetivamente um polipeptídeo presente na solução eliminando as estruturas secundárias da proteína. O desenovelamento será relativamente extenso, porém reversível. A solução de desnaturação moderadamente caotrópica contém um agente caotrópico que, em concentrações suficientes na solução, permite o enovelamento parcial de um polipeptídeo a partir da conformação que o polipeptídeo assumiu através de intermediários solúveis na solução, para a conformação espacial em que se encontram quando estão operativamente

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17/59 ativos sob a sua forma endógena ou em condições fisiológicas homólogas. Exemplos de agentes de caotrópico incluem cloridrato de guanidina, ureia, bem como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. Agentes caotrópicos incluem uma combinação destes reagentes, tais como uma combinação de hidróxido com ureia ou cloridrato de guanidina.

[035] Conforme utilizado no presente, um agente redutor referese a um composto que, em uma concentração adequada, em solução aquosa, mantém grupos sulfidrila livres para que as ligações de pontes de bissulfeto intra-ou intermoleculares sejam quimicamente perturbadas. Exemplos representativos de agentes redutores adequado incluir ditiotreitol (DTT), dithoertritol (DTE), beta-mercaptoetanol (BME), cisteína, cisteamina, tioglicolato, glutationa, e borohidreto de sódio.

[036] Conforme utilizado no presente, solução tampão refere-se a uma solução que resiste a mudanças de pH por ação dos seus componentes conjugados ácido-base.

[037] O termo bactéria para os propósitos da presente invenção inclui eubacterias e archaebacterias. Em exemplos específicos da presente invenção, são utilizadas nos métodos e processos descritos a seguir, eubacterias, que incluem bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas. Em um exemplo de realização, são usadas bactérias gram-negativas, por exemplo, da família Enterobacteriaceae. Exemplos de bactérias pertencentes a família Enterobacteriaceae incluem: Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsíella, Proteus, Salmonella, Serratia e Shigella. Outros tipos de bactérias adequadas incluem Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobia, Vitreoscilla, e Paracoccus. Em um exemplo de realização da presente invenção, é utilizada a E. coli. E. coli hospedeira adequadas incluem E. co/í W3110 (ATCC 27325), E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B, X1776 e E. coli (ATCC 31537). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes, e a cepa W3110 é apenas um

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18/59 exemplo. Células mutantes de qualquer uma das bactérias acima mencionadas também podem ser utilizadas. Torna-se evidente a necessidade para selecionar bactérias levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células bacteriana. Por exemplo, E. coli, Serratia, ou espécies de Salmonella podem ser convenientemente utilizadas como hospedeiras utilizando plasmídeos bem conhecidos, tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 que são utilizados para o fornecimento do replicon. Vide mais sobre os exemplos de céluals hospedeiras bacterianas abaixo.

[038] Conforme utilizado no presente, as expressões célula, linhagem celular, cepa e cultura de células são utilizadas de forma intercambiável e todas essas denominações incluem suas progênies. Assim, a expressão transformantes e células transformadas, incluem o a célula principal e as culturas de células derivadas destas, sem especificar o número de transferências. Por outro lado, é compreensível que todos os descendentes podem não ser exatamente idênticas quanto ao conteúdo do DNA, devido às mutações deliberadas ou involuntárias. Também estão incluídas progênies mutantes, que tem a mesma função ou possuem atividade biológica semelhante ao de células inicialmente selecionadas para a transformação. Onde denominações diferentes são propostas, estas serão evidentes a partir do contexto.

[039] Uma coluna mista refere-se a uma coluna com uma resina que possui tanto propriedades de troca catiônica quanto interação hidrofóbica.

Proteínas Recombinantes [040] Proteínas recombinantes, por exemplo, fatores de crescimento de fibroblasto ácido e fatores de crescimento de fibroblasto básico e fator de crescimento endotelial vascular foram recuperados e purificados a partir de diversas fontes, incluindo bactérias (Salter D.H. et al., (1996) Labor. Invest 74 (2) :546-556 (VEGF); Siemeister et al., (1996) Biochem. Biophys.

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Res. Commun. 222 (2) :249-55 (VEGF); Cao et al., (1996) J. Biol. Chem. 261 (6) :3154-62 (VEGF), Yang et al., (1994) Gaojishu Tongxun, 4:28-31 (VEGF); Anspach et al., (1995) J. Chromatogr. A 711 ( 1) :129-139 (aFGF e bFGF); Gaulandris (1994) J Cell. Physiol. 161 (1) :149-59 (bFGF); Estape e Rinas (1996) Biotech. Tech. 10 (7): 481-484 (bFGF), McDonald et al., (1995) FASEB J. 9 (3): A410 (bFGF)). Por exemplo, a forma ativa predominante do VEGF é um homodímero de dois polipeptídeos de 165 aminoácidos (VEGF-165). Nesta estrutura, cada subunidade contém 7 pares de pontes de bissulfeto intracadeias e dois pares adicionais que efetuam a a ligação covalente das duas subunidades (Ferrara et al., (1991) J. Cell. Biochem. 47:211-218). A conformação nativa inclui um domínio fortemente básico que foi demonstrado por se ligar facilmente a heparina (Ferrara et al (1991) supra). Enquanto a dimerização covalente do VEGF é necessária para a ligação efetiva ao receptor e atividade biológica (Põtgens et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:32879-32885; Claffey etal., (1995) Biochim. Et Biophys. Acta 1246 :1-9), o produto bacteriano contém potencialmente vários intermediários enovelados incorretamente e pontes de bissulfeto desorganizadas. Procedimentos fornecidos são úteis para o isolamento, purificação e reativação de proteínas que aparecem nas células hospedeiras sob a forma de corpos refringentes e, também como proteínas solúveis.

Isolando Proteínas Recombinantes [041] Proteína recombinante insolúvel, enoveladas incorretamente são isoladas de células hospedeiras procarióticas que expressam a proteína por qualquer uma de uma série de técnicas padrões disponível no estado da arte. Por exemplo, a proteína recombinante insolúvel é isolada em um tampão de isolamento adequado, expondo as células a um tampão de força iônica adequada para solubilizar mais as proteínas, em que a proteína é uma proteína substancial mente insolúvel, ou rompendo as células

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20/59 de modo a liberar o os corpos de inclusão ou proteínas no periplasma ou espaço intracelular e torná-las disponíveis para a recuperação, por exemplo, por centrifugação. Esta técnica é bem conhecida e está descrita em, por exemplo, Patente US 4.511.503. Kleid et al., divulgaram a purificação dos corpos refringentes por homogeneização seguida por centrifugação (Kleid et al., (1984), em Developments in Industrial Microbiology, (Society for Industrial Microbiology, Arlington, VA) 25:217-235). Vide também, por exemplo, Fischer et al., (1993) Biotechnology and Bioengineering 41:3-13.

[042] A patente US 5410026 descreve um método típico de recuperação de proteína a partir de corpos de inclusão e é resumido da seguinte forma. As células procarióticas são suspensas em um tampão adequado. Normalmente o tampão compreende um agente de tamponamento adequado para tamponar um pH entre 5 a 9, ou cerca de 6 a 8 e um sal. Qualquer sal adequado, incluindo NaCI, é útil o suficiente para manter uma força iônica na solução tampão. Normalmente a força iônica empregada é de cerca de 0,01 a 2 M, ou 0,1 a 0,2 M. As células, enquanto e suspensão neste tampão, são rompidas ou lisadas utilizando técnicas comumente empregadas como, por exemplo, métodos mecânicos, por exemplo, um homogeneizador (Manton-Gaulin press, Microfluidizer, ou Niro-Soavi), uma prensa francesa, um moinho de microesferas, ou um oscilador sônico, ou por métodos químicos ou enzimáticos.

[043] Exemplos de métodos químicos ou enzimáticos de rompimento de células incluem a esferoplastização, o qual implica a utilização de lisozima para lisar a parede bacteriana (Neu H. et al., (1964) Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215), e choque osmótico, que envolve o tratamento de células viáveis com uma solução de alta tonicidade e com uma lavagem em água gelada de fraca tonicidade para liberar os polipeptídeos (Neu H. et al., 1965 J. Biol. Chem., 240 (9): 3685 -3692). A sonegação é utilizada geralmente

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21/59 para o rompimento das bactérias contidas em volumes de escala analítica em caldo de fermentação. Em escalas maiores normalmente é utilizada a homogeneização por altas pressões.

[044] Após o rompimento das células, a suspensão é normalmente centrifugada em baixa velocidade, geralmente em torno de 500 a 15.000 xg, por exemplo, em um exemplo de realização da presente invenção foi utuilizada uma velocidade de cerca de 12.000 xg, em uma centrifuga padrão por um tempo suficiente para sedimentar substancialmente todas as proteínas insolúveis. Esses tempos podem ser determinados de forma simples e dependerão do volume a ser centrifugado, bem como do tipo de centrifuga. Normalmente cerca de 10 minutos a 0,5 horas é suficiente para sedimentar proteínas insolúveis. Em um exemplo de realização, a suspensão é centrifugada a 12.000 xg durante 10 minutos.

[045] O sedimento resultante contém praticamente toda a fração de proteínas insolúveis. Se o processo de rompimento da célula não está completo, o sedimento também pode conter células intactas ou fragmentos celulares quebrados. O rompimento celular total pode ser analisado pela ressuspensão do sedimento em uma pequena quantidade da mesma solução tampão e a análise da suspensão com um microscópio de contraste de fase. A presença de fragmentos de células ou de células inteiras indica que mais sonicação ou outros meios de rompimento é necessário para remover as células ou fragmentos destas e os polipeptídeos associados não refrativos. Após essa nova etapa de lise, se necessário, a suspensão é novamente centrifugada e o sedimento recuperado, ressuspenso e reexaminado. O processo é repetido até que o exame visual revele a ausência de fragmentos celulares no material peletizado ou ainda até o tratamento para reduzir o tamanho do pellet resultante falhar.

[046] O processo acima pode ser empregado se a proteína

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22/59 insolúvel é intracelular ou está no espaço periplasmático. Em um exemplo de realização da presente invenção, as condições fornecidas no presente para isolar a proteína recombinante são direcionadas para corpos de inclusão precipitados no espaço periplasmático ou intracelular e estão relacionadas especificamente ao VEGF. No entanto, imagina-se que os processos e procedimentos podem ser aplicáveis às proteínas recombinantes, em geral, com pequenas modificações como citado ao longo de todo o texto seguinte. Em certos exemplos de realização, os processos e procedimentos são aplicáveis na fabricação ou produção em escala industrial, reenovelamento e purificação da proteína recombinante.

[047] Em um exemplo de realização, a proteína recombinante isolada no pellet é incubada é uma primeira solução tamponada suficiente para solubilizar substancialmente a proteína recombinante. Esta incubação é realizada sob condições de concentração, tempo de incubação e temperatura de incubação que permitirá a solubilização da quantidade desejada ou substancialmente toda a proteína recombinante.

[048] A primeira solução tamponada compreende um agente de tamponamento adequado para manter o pH do tampão entre, pelo menos, cerca de 9 ou mais, normalmente entre 9-11. Em um exemplo de realização, o pH para VEGF é pH 11. Exemplos de tampões adequados que proporcionarão um pH dentro deste último intervalo inclui; tampão TRIS (Tris[hidroximetil] aminometano), HEPPS (N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[3-propano-sulfónico]), CAPSO (3-[Ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-ácido), a AMP (2-Amino-2-metil-1propanol), CAPS (ácido 3-[Ciclohexilamino]-1), CHES (ácido etanosulfônico 2[N-Ciclohexilamino]), arginina, lisina, e borato de sódio. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui tampão CHES e arginina, em pH -11. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui tampão Tris e arginina, com pH em cerca de 11. Em outro exemplo de realização, a presente

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23/59 invenção inclui o tampão CHES com pH em cerca de 11. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui tampão Tris com pH em cerca de 11. Em um exemplo de realização específico, a primeira solução tampão inclui um agente caotrópico.

[049] Agentes caotrópicos adequados para a prática da presente invenção incluem, por exemplo, ureia e sais de tiocianato ou guanidina, por exemplo, ureia, cloridrato de guanidina, tiocianato de sódio, etc. A quantidade de agente caotrópico necessário para o tampão é uma quantidade suficiente para desenovelar as proteínas recombinantes na solução. Em certos exemplos de realização da presente invenção, um agente caotrópico está presente em uma concentração de cerca de 0,5 a 5 molar. Em um exemplo de realização da presente invenção, o agente caotrópico é a ureia, em uma concentração de cerca de 1 M.

[050] A concentração da proteína na solução tampão deve ser tal que a proteína será substancialmente solubilizada conforme determinado pela densidade ótica. A quantidade exata empregada dependerá, por exemplo, das concentrações e tipos de outros componentes da solução tampão, e especificamente da concentração de proteína, agente caotrópico, e pH do tampão. Em um exemplo de realização da presente invenção, a concentração de proteína recombinante está na faixa de 0,5-5,5 mg/ml, ou 1,5-5,0 mg/ml. A solubilização é habitualmente realizada a cerca de 0-45 °C, ou cerca de 2-40 °C, ou cerca de 20-40 °C, ou cerca de 23-37 °C, ou cerca de 25-37 °C, ou cerca de 25 °C durante, pelo menos, cerca de uma a 24 horas. Normalmente, a temperatura não é aparentemente afetada pelos níveis de sal, agente redutor e agente caotrópico. Em certos exemplos de realização, a solubilização é realizada a pressão atmosférica.

[051] A mensuração do grau de solubilização na solução tampão pode ser determinada e é realizado adequadamente, por exemplo, pela

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24/59 determinação da turbidez, por meio da análise de fracionamento entre o sobrenadante e sedimento após a centrifugação, redução em gel SDS-PAGE, por ensaio de proteínas (por exemplo, kit de ensaio da proteína da Bio-Rad) ou por HPLC.

[052] Opcionalmente, as células rompidas não são centrifugadas, mas são diluídas, por exemplo, 1:4, 1:6, 1:8, em uma segunda solução tampão descrita no presente (tampão de reenovelamento). Esta incubação é realizada sob condições de concentração, tempo de incubação e temperatura de incubação que permitirá a solubilização e reenovelamento da proteína recombinante. Em um exemplo de realização, cerca de 30% ou mais de proteínas recombinantes são solubilizadas e reenoveladas.

Reenovelamento de Proteínas Recombinantes [053] Após o polipeptídeo ser solubilizado ou, alternativamente, as células serem rompidas, ele é colocado ou diluído em uma segunda solução tampão contendo pelo menos um agente redutor, e um agente caotrópico, em uma concentração que permita o reenovelamento da proteína recombinante, juntamente com o adição de ar ou oxigênio, por exemplo, usando um coeficiente volumétrico de transferência de massa Ki_a = 0,004 a 0,1 min^-1 (por exemplo, para um recipiente de 2,5L contendo propulsor do tipo marinho, a taxa de difusão do ar é de 0,3-10 cc/min/L, 0,3-3 cc/min/L, ou 1 cc/min/L, ou 25 cc/min/L, com velocidade de mistura de 200-400 rpm). O oxigênio ou ar para a reação de reenovelamento pode ser fornecida por uma fonte de ar ou um gás comprimido enriquecido com oxigênio. A eficiência da transferência de massa da fase gasosa para a fase líquida é controlada pela agitação, difusão e pressurização e é captada pelo coeficiente volumétrico de transferência de massa, Ki_a. Vide, por exemplo, Blanch, & Clark, Biochemical engineering, Marcei Dekker, Nova Iorque, 1997; e, Aunins, & Henzler, Aeration in cell culture bioreactors, em Biotechnology: A multi-volume comprehensive treatise, G.

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Stephanopoulos, Ed., Weinheim, Nova Iorque, 1993, págs. 219-281. Em um exemplo de realização, um Ki_a de 0,004min'¹ é utilizado representando uma velocidade de mistura de 200-400rpm e taxa de difusão de 0,3cc/min/L em um recipiente de 2.5L com um propulsor do tipo marinho. Em outros exemplos de realização, um Ki_a = 0,01 min^-1 ou 0,1 min^-1 é utilizado para produzir proteínas enovelada corretamente.

[054] Em certos exemplos de realização da presente invenção, a segunda solução tampão contém dois ou mais agentes redutores. O polipeptídeo pode ser diluído com o tampão de reenovelamento, por exemplo, por pelo menos cinco vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes, ou cerca de 20 vezes, ou cerca de 40 vezes. As condições desta segunda incubação da proteína solúvel não enovelada se realizarão, geralmente, em quantidades ou reenovelamento substancial ou completo da proteína desejada. As condições exatas dependerão, por exemplo, do pH do tampão e dos tipos e concentrações de agentes caotrópicos e agentes redutores presentes. A temperatura de incubação é geralmente de cerca de 0-40 °C e a incubação será geralmente realizada por, pelo menos, 1 hora, a cerca de 48 horas para o efeito de reenovelamento. Em certos exemplos de realização, a reação é realizada, por exemplo, a uma temperatura de cerca de 0-45 °C, ou cerca de 240 °C, ou cerca de 20-40 °C, ou cerca de 23-37 °C, ou cerca de 25-37 °C, ou cerca de 25 °C, durante pelo menos 3 horas, ou pelo menos, cerca de 10 horas, ou aproximadamente entre 3 e 30 horas, ou aproximadamente entre 3 e 24 horas. Em certos exemplos de realização, a reação é realizada à pressão atmosférica.

[055] A segunda solução tampão compreende um agente de tamponamento adequado para manter o pH do tampão entre, pelo menos, cerca de 9 ou mais, normalmente entre 9-11. Em um exemplo de realização, o pH para VEGF é pH 10. Exemplos de tampões adequados que proporcionarão

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26/59 um pH dentro deste último intervalo inclui; tampão TRIS (Tris[hidroximetil] aminometano), HEPPS (N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[3-propano-sulfónico]), CAPSO (3-[Ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-ácido), a AMP (2-Amino-2-metil-1propanol), CAPS (ácido 3-[Ciclohexylamino]-1), CHES (ácido etanosulfônico 2[N-Ciclohexilamino]), arginina, lisina, e borato de sódio. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui tampão CHES e arginina, em pH ~10(em uma concentração final de cerca de 100 mM a 10 mM, respectivamente), com dois ou mais agentes redutores e pelo menos um agente caotrópico. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui tampão Tris e arginina, em pH ~10(em uma concentração final de cerca de 100 mM a 10 mM, respectivamente), com dois ou mais agentes redutores e pelo menos um agente caotrópico.

[056] Arginina (ou outro aminoácido carregado positivamente), por exemplo, L-arginina/HCI, pode estar presente na primeira e na segunda solução tampão. Em certos exemplos de realização da presente invenção, a concentração de arginina é de, por exemplo, cerca de 50-500 mM, cerca de 75300 mM, cerca de 100-300 mM, cerca de 100 mM ou cerca de 300 mM na concentração final, etc. Em exemplos de realização específicos, a proteína está na primeira solução tampão com pH superior a 9 e 0,5-3 M de ureia, 50-500 mM de arginina e 5 mM de EDTA (concentração final). Em um exemplo de realização, é utilizada uma concentração fina de 10 mM de CHES. Em outro exemplo de realização, é utilizado uma concentração final de Tris 10 mM. Em um exemplo de realização, a primeira solução tampão compreende Ureia 1M, arginina 300 mM, CHES 10 mM, EDTA 5 mM, pH 11, na concentração final. Em outro exemplo de realização, a proteína está na segunda solução tampão (solução tampão de reenovelamento) em pH> 9, mas < 11 M contendo ureia 0.5-3M, arginina 50-500 mM, DTT 0,25-1 mM, cisteína 5-20mM, e EDTA 2.10 mM, na concentração final. Em um exemplo de realização, é utilizada uma

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27/59 concentração final de CHES 10 mM. Em outro exemplo de realização, é utilizada uma concentração final de Tris 10 mM. Em um exemplo de realização, a proteína está na solução tampão de reenovelamento com ureia 1M, cisteína 15 mM, DTT 2 mM, arginina 100 mM, CHES 10 mM, EDTA 5 mM em pH 9-10, na concentração final. Em outro exemplo de realização, a proteína está na solução tampão de reenovelamento com ureia 1M, cisteína 15 mM,, cisteína 15 mM, DTT 0,5-2 mM, arginina 100 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM em pH 9-10, na concentração final.

[057] Como se observa, a solução também contém pelo menos um agente redutor. Exemplos de agentes redutores adequados incluem, mas não estão limitados a, ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol (BME), cisteína, DTE, etc A quantidade de agente redutor presente no tampão vai depender principalmente do tipo de agente de redução e agente caotrópico, o tipo de tampão e o pH empregado, a quantidade de oxigênio introduzido a partir da solução, e a concentração de proteínas no tampão. Por exemplo, o agente redutor é devidamente selecionado de entre os agentes descritos acima, no intervalo de concentração de cerca de 0,5 a cerca de 20 mM para cisteína, 0,25-3,0 mM para DTT (por exemplo, 0,5-2 mM DTT), e menos de cerca de 0,2 mM para BME. Em um exemplo de realização, são utilizados dois ou mais agentes redutores, por exemplo, DTT, a cerca de 0,5-2 mM e cisteína a cerca de 0,5-20 mM. Considerando que DTT e BME podem ser usados juntamente com os procedimentos previstos no presente para proteínas recombinantes, em geral, uma combinação de cisteína, cerca de 15 mM e DTT como descrito acima é um exemplo para a recuperação do VEGF. Em um exemplo de realização, o agente redutor é o DTT, 2 mM, com 15 mM de cisteína, na concentração final. Em outro exemplo de realização, o agente redutor é DTT, cerca de 0,5 mM, com 15 mM de cisteína, na concentração final.

[058] A segunda solução tampão contém pelo menos um agente

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28/59 caotrópico em uma concentração tal que ocorre o reenovelamento da proteína recombinante. Geralmente um agente caotrópico está presente em uma concentração final entre cerca de 0,5 e 2 molar. Em um exemplo de realização, o agente caotrópico é a ureia, em uma concentração final de cerca de 0,5-2 M, 0.5-2 M, ou 1M. Em outro exemplo de realização, o agente caotrópico é o cloridrato de guanidina, em uma concentração final de cerca de 0,1-1 M.

[059] O tampão de reenovelamento pode opcionalmente conter outros agentes, como qualquer um de uma série de detergentes não-iônicos, como TRITON™ X-100, NONIDET™ P-40, série Tween™ e série BRIJ ™. O detergente não iônico está presente em uma concentração final entre cerca de 0,01% e 1,0%. Em um exemplo, o detergente não iônico está presente em uma concentração final entre cerca de 0,025% e 0,05%, ou cerca de 0,05%.

[060] O grau de reenovelamento é devidamente determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando, por exemplo, a análise de coluna de cromatografia rpHPLC, HPLC de troca catiônica (gel de coluna SP-5PW TSK, Tosoh Bioscience LLC), ou outras colunas adequadas com afinidade para a heparina. O aumento correto do tamanho dos picos da proteína recombinante reenovelada no ensaio de HPLC de troca catiônica ou ensaio de HPLC de ligação à heparina se correlaciona com as quantidades crescentes de proteína recombinante reenovelada, biologicamente ativa presente no tampão. A incubação é realizada a maximizar corretamente a relação de proteína recombinante enovelada corretamente por proteína recombinante enovelada incorretamente recuperada, conforme determinado pelo ensaio de rpHPLC.

[061] Em um exemplo de realização, a qualidade e a quantidade de VEGF enovelado corretamente são avaliadas utilizando um teste de ligação à heparina. Amostras contendo proteínas recombinantes diluídas são carregadas, por exemplo, em uma coluna Heparina-5PW (7,5 x 75 mm, Tosoh

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Biosciences LLC, Tóquio, Japão) ou outra coluna de afinidade à heparina adequada. Por exemplo, a coluna Heparina-5PW é equilibrada em 10 mM de fosfato de sódio, pH 7,4 contendo 0,15 M de cloreto de sódio. Com uma velocidade de fluxo de 1 ml/min ou 2 ml/min, a coluna é eluída usando um gradiente linear de cloreto de sódio 0,15-2 M em, fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4 durante 10 minutos. O eluente é monitorado a 280 nm. Em um exemplo de realização, a proteína é recuperada em um único pico correspondente ao VEGF biologicamente ativo, reenovelado corretamente. Em um exemplo de realização, um ensaio para determinar corretamente o VEGF biologicamente ativo, reenovelado corretamente é o rpHPLC. Pontes de bissulfeto podem opcionalmente ser confirmados pelo mapa de peptídeo. O dicroísmo circular também pode ser utilizado para a determinação da estrutura 2 e 3D / enovelada.

[062] Em um exemplo de realização, a solubilização e reenovelamento é realizado em uma etapa. Após a obtenção do pellet de células rompidas, este é colocado ou diluído na segunda solução tampão descrito acima (neste caso, a solução tampão denominada combinada). O polipeptídeo pode ser diluído com solução tamponada combinada por, por exemplo, pelo menos cinco vezes, pelo menos dez vezes, ou cerca de 20 vezes, ou cerca de 40 vezes. As condições desta incubação do pellet serão, em geral, tal que a quantidade desejada de solubilização total e reenovelamento da proteína serão atingidas, com a adição de ar ou oxigênio. Em um exemplo de realização, um Ki_a de 0,004min'¹ é utilizado representando uma velocidade de mistura de 200-400rpm e taxa de difusão de 0,3cc/min/L em um recipiente de 2.5L contendo um propulsor do tipo marinho. Em outros exemplos de realização, um Ki_a = 0,01 min^-1 ou 0,1 min^-1 é utilizado para produzir proteínas enovelada corretamente. As condições exatas dependerão, por exemplo, do pH do tampão e dos tipos e concentrações de agentes

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30/59 caotrópicos e agentes redutores presentes. A temperatura de incubação é, geralmente de cerca de 0-40 °C e a incubação será geralmente realizada por, pelo menos, 1 hora, a cerca de 48 horas para o efeito de reenovelamento. Em certos exemplos de realização, a reação é realizada, por exemplo, a uma temperatura de cerca de 0-45 °C, ou cerca de 2-40 °C, ou cerca de 20-40 °C, ou cerca de 23-37 °C, ou cerca de 25-37 °C, ou cerca de 25 °C, durante pelo menos 3 horas, ou pelo menos, cerca de 10 horas, ou aproximadamente entre 3 e 30 horas, ou aproximadamente entre 3 e 24 horas. Em certos exemplos de realização, a reação é realizada à pressão atmosférica.

Recuperação e Purificação de Proteínas Recombinantes [063] Embora a recuperação e purificação de proteínas recombinantes possam empregar diversos métodos e procedimentos conhecidos para a separação de tais proteínas como, por exemplo, fracionamento de sal e solvente, adsorção com materiais coloidais, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, cromatografia por imunoafinidade, eletroforese e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), um exemplo de etapa de clareamento e um procedimento cromatográfico multi-etapa. A etapa de clareamento compreende o adicionamento de detergente para uma concentração final de 1 % (por exemplo, Triton-X100), ajustando o pH para cerca de 8,5-9,5 (ou cerca de 8,7 ou cerca de 9), incubando solução por cerca de 1 a 10 horas a 25-30°C, centrifugando a solução; e filtrando os líquidos recuperados a partir da etapa de centrifugação. O procedimento cromatográfico multi-etapa compreende o contato da proteína recombinante reenovelada mencionada com uma resina mista, um suporte cromatográfico catiônico, um primeiro suporte cromatográfico de interação hidrofóbica e, opcionalmente, um segundo suporte cromatográfico de interação hidrofóbica ou suporte cromatográfico de troca iônica; e recuperando seletivamente ou eluindo a proteína recombinante de cada suporte. ContemplaPetição 870180024361, de 26/03/2018, pág. 44/77

31/59 se que as etapas de qualquer procedimento possam ser realizadas em qualquer ordem. Em um exemplo de realização da presente invenção, as etapas são executadas sequencialmente.

[064] Uma primeira etapa adequada na recuperação e purificação adicional da proteína recombinante fornecida para a concentração da proteína recombinante e redução no volume da amostra. Por exemplo, a segunda etapa de incubação descrita acima, pode resultar em um grande aumento no volume da proteína recombinante recuperada e concomitantes diluições das proteínas do tampão de reenovelamento. O primeiro suporte cromatográfico adequado fornece uma redução no volume da proteína recombinante recuperada e pode proporcionar vantajosamente alguma purificação da proteína a partir de proteínas indesejadas contaminantes. A primeira etapa cromatográfica adequada inclui suportes cromatográficos que pode ser eluídos e carregadas diretamente em um segundo suporte cromatográfico.

[065] Exemplos de primeiro suporte cromatográfico incluem, mas não se limitam a, resinas de modo misto (por exemplo, CaptoMMC™, GE Healthcare, ou MEP Hypercel, Pall Corporation), suporte cromatográfico de hidroxiapatita, por exemplo, CHT cerâmica tipo I e tipo II (formalmente conhecido como MacroPrep ceramic), Bio-Gel HT, Bio-Gel HTP, Bio-Rad, Hercules, CA, etc.; cromatográfica por metal imobilizado constituído por uma resina inerte dos íons metálicos imobilizados, como cobre, níquel, etc, bem como géis sílica não derivatizados. Em um exemplo de realização, o primeiro suporte cromatográfico para a purificação e recuperação do VEGF é um suporte cromatográfico misto de troca iônica. A eluição a partir do primeiro suporte cromatográfico é realizada de acordo com as técnicas padrões realizadas e conhecidas no estado da arte. As condições adequadas de eluição e tampão irão facilitar o carregamento da proteína recombinante eluída

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32/59 diretamente sobre o suporte cromatográfico catiônico como descrito abaixo.

[066] Vários constituintes aniônicos podem ser associados às matrizes, a fim de formar suportes catiônicos para cromatografia. Constituintes aniônicos incluem carboximetil, grupos sulfetila, grupos sulfopropil, fosfato e sulfonato (S). Resinas celulósicas de troca iônica como a SE52 SE53, SE92, CM32, CM52, CM92, P11, DE23, DE32, DE52, EXPRESS ION™ S e EXPRESS ION™ C são disponíveis pela Whatman LTD, Maidstone Kent Reino Unido; SEPHADEX™ SEPHAROSE™ baseados e reticulados a permutadores de íons, também conhecidos sob as denominações CM SEPHADEX™ C-25, CM SEPHADEX™ C-50 e SP SEPHADEX™ C-25 SP SEPHADEX™ C-50 e SP-SEPHAROSE™, SP-SEPHAROSE™-XL SP-SEPHAROSE™ Fast Flow, CM-SEPHAROSE™ Fast Flow, e CM-SEPHAROSE™, CL-6B, todos disponíveis pela Pharmacia AB. Exemplos de colunas de troca iônica para a prática da presente invenção incluem mas não estão limitados a, por exemplo, colunas de troca iônica sob as denominações MACROPREP™ como, por exemplo, MACROPREP™ S support, MACROPREP™ High S support e MACROPREP™ CM support da BioRad, Hercules, Califórnia.

[067] A eluição a partir do suporte de cromatografia catiônica é geralmente realizada através do aumento da concentração de sal. Pois a eluição das colunas iônicas envolve a adição de sal e porque, como aqui mencionados, HIC é melhorada na concentração salina a introdução da etapa HIC seguinte a etapa iônica ou outra etapa salina é usada opcionalmente. Em um exemplo de realização da presente invenção, um a etapa cromatográfica de troca catiônica precede, pelo menos, a etapa de HIC, por exemplo, um primeiro suporte cromatográfico de interação hidrofóbica e/ou uma segunda interação hidrofóbica.

[068] Colunas hidrofóbicas podem ser utilizadas na purificação da proteína recombinante, por exemplo, na 2^a, 3^a, e/ou 4^a etapa de purificação.

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Cromatografia de interação hidrofóbica é bem conhecida no estado da arte e está baseada na interação hidrofóbica de porções da molécula interagindo com ligantes hidrofóbicos anexados aos suportes cromatográficos. Um ligante hidrofóbico acoplado a uma matriz é várias vezes referido como um suporte cromatográfico HIC, gel HIC, ou coluna HIC e similares. É mais apreciado ainda que a força de interação entre a proteína e a coluna HIC não seja apenas em função da proporção não-polar e polar sobre a superfície da proteína, mas também sobre a distribuição da superfície não-polar.

[069] Uma série de matrizes pode ser empregada na preparação de colunas HIC. A agarose é a mais amplamente utilizada, apesar da sílica e resinas de polímeros orgânicos poderem ser utilizadas. Ligantes hidrofóbicos úteis incluem, mas não estão limitadas a, grupos alquila tendo desde 2 até cerca de 10 átomos de carbono como, por exemplo, butil, propilparabeno, ou octil, grupos aril ou como fenil. Suportes HIC convencionais para géis e colunas podem ser obtidos comercialmente de fornecedores como a Pharmacia, Uppsala, Suécia sob as denominações; buty-SEPHAROSE™-Fast Flow, phenyl-SEPHAROSE™ CL-4B, octyl SEPHAROSE™ FF e phenyl SEPHAROSE™ FF e Tosoh Corporation, Tóquio, Japão sob as denominações dos produtos; TOYOPEARL™ butyl 650M (Fractogel TSK Butyl-650) ou TSKGEL phenyl 5PW.

[070] A densidade do ligante é um parâmetro importante em que, este influencia não só a força de interação das proteínas, mas também a capacidade da coluna. A densidade do ligante dos géis fenil ou octil fenil disponíveis comercialmente está na ordem de 5-40 pmoles/ml de gel. A capacidade de gel é uma função da proteína particular em questão, bem como o pH, a temperatura e a concentração de sal, mas geralmente pode-se esperar que estejam no intervalo entre 3-20 mg/ml de gel.

[071] A escolha do gel específico pode ser determinada pelo

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34/59 técnico hábil no assunto. Em geral a força da interação da proteína e do ligante HIC aumenta com o comprimento da cadeia dos ligantes alquila, mas são mais adequados ligantes com cerca de 4 a cerca de 8 átomos de carbono para a maioria das separações. Um grupo fenil tem aproximadamente a mesma hidrofobicidade assim com um grupo pentil, embora a seletividade possa ser diferente, devido à possibilidade da interação pi-pi com grupos aromáticos da proteína.

[072] Adsorção da proteína para coluna HIC é favorecida pela alta concentração de sal, mas a concentração atual pode variar amplamente dependendo da natureza da proteína e do ligante HIC particular escolhido. Em geral são úteis concentrações de sal entre 1 e 4 M.

[073] A eluição de um suporte HIC, quer seja na forma passo a passo ou quer seja sob a forma de gradiente, pode ser realizada de diversas maneiras, tal como; a) alterando a concentração de sal, b) mudando a polaridade do solvente, ou c) adicionando detergentes. Pela diminuição das concentrações de sal adsorvidas as proteínas são eluídas em ordem crescente de hidrofobicidade. Alterações na polaridade podem ser efetuadas por adição de solventes, como etileno-glicol ou isopropanol diminuindo assim a força da interação hidrofóbica. Funções detergentes como deslocadores de proteínas tem sido utilizados principalmente em conexão com a purificação de proteínas de membrana.

[074] Exemplos de métodos de purificação do VEGF estão descritos abaixo no presente, vide, por exemplo, os exemplos IV e V.

Expressando Proteínas Recombinantes [075] Em resumo, vetores de expressão capazes de replicação autônoma e expressão proteica em relação a células hospedeiras procarióticas são introduzidos no genoma da célula hospedeira. A construção de vetores de expressão adequados é bem conhecida no estado da arte, incluindo as

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35/59 sequências de nucleotídeos a proteínas recombinantes, descritas no presente. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, Nova Iorque) (2001); Ausubel et al., Short protocols in Molecular Biology, Current protocols John Wiley & Sons (New Jersey) (2002); e, Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421. Células procarióticas apropriadas, incluindo bactérias, e vetores de expressão são comercialmente disponíveis, por, por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland. Métodos para o crescimento de células procarióticas em grande escala, e em especial para a cultura de células bacterianas são bem conhecidas no estado da arte e estes métodos podem ser utilizados no contexto da presente invenção.

[076] Por exemplo, células hospedeiras procarióticas são transfectadas com vetores recombinantes de expressão ou clonagem que codificam as proteínas de interesse e cultivadas em meios nutritivos convencionais modificados, quando necessário para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar genes que codificam as sequências desejadas. O ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse é convenientemente RNA, cDNA, ou DNA genômico a partir de qualquer fonte, desde que este codifique o(s) polipeptídeo(s) de interesse. Métodos para seleção de ácidos nucléicos adequados para a expressão heteróloga de polipeptídeos (incluindo as variantes destes) em bactérias hospedeiras são bem conhecidos. Moléculas de ácido nucléico que codificam o polipeptídeo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos no estado da arte. Por exemplo, O DNA que codifica VEGF é isolado e sequenciado, por exemplo, através de sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente ao gene codificador do VEGF.

[077] O ácido nucléico heterólogo (por exemplo, cDNA ou DNA

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36/59 genômico) é inserido adequadamente em um vetor de expressão replicável no microrganismo sob o controle de um promotor adequado. Muitos vetores estão disponíveis para esta proposta, e a seleção do vetor adequado vai depender principalmente do tamanho do ácido nucléico a ser inserido no vetor e, especialmente, da célula hospedeira a ser transformada pelo vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da célula hospedeira específica com o qual é compatível. Dependendo do tipo específico da célula hospedeira, os componentes do vetor incluem, geralmente, mas sem limitar-se a, um ou mais dos seguintes: sequência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição.

[078] Em geral, vetores plasmidiais contendo replicon e sequências controle derivadas de espécies que são compatíveis com a célula hospedeira são utilizados em associação com hospedeiros microbianos. O vetor normalmente transmite uma replicação local, bem como as sequências marcadoras que são capazes de fornecer a seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, A E. coli é tipicamente transformada utilizando-se pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli (vide, por exemplo, Bolivar et al., (1977) Gene, 2: 95). O pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e, portanto, proporciona meios de fácil identificação para células tranformantes. O plasmídeo pBR322, ou outro plasmídeo bacteriano ou fago, também contém geralmente, ou é modificado para conter, promotores que podem ser utilizados pela célula hospedeira para a expressão de genes marcadores selecionáveis.

íi) Sequência de Sinal [079] Os polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser produzidos de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como polipeptídeos de fusão com polipeptídeos heterólogos, que é

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37/59 tipicamente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de divagem específico no N-terminal do polipeptídeo ou proteína madura. A sequência de sinal heteróloga preferencialmente selecionada é uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam a sequência de sinal do polipeptídeo nativo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procarionte selecionada, por exemplo, a partir do grupo composto de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor.

(ii) Componente de Origem de Replicação [080] Vetores de expressão contêm uma sequência de ácido nucléico que permite a replicação do vetor em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de micróbios. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maioria das bactérias gram-negativas, como, por exemplo, a E. coli.

(ui) Componente de Gene de Seleção [081] Os vetores de expressão contêm geralmente um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Este gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou o crescimento das células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não iram sobreviver no meio de cultura. Este marcador selecionável é distinto do utilizado como marcador genético e definido pela presente invenção. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementam deficiências auxotróficas além daquelas causadas pelo marcador genético ou (c) fornecem nutrientes importantes nãoPetição 870180024361, de 26/03/2018, pág. 51/77

38/59 disponíveis a partir de meios complexos, tais como o gene codificador de Dalanino racemase para Bacilli.

[082] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Neste caso as células que são transformadas com sucesso com um ácido nucléico de interesse produzem uma polipeptídeo que confere resistência à droga e, portanto, sobrevive ao regime de seleção. Exemplos desta seleção dominante utilizam as drogas neomicina (Southern et al., (1982) J. Molec. Appl. Genet., 1: 327), ácido micofenólico(Mulligan et al., (1980) Science 209: 1422) e higromicina (Sugden et al., (1985) Mol. Cell. Biol., 5: 410-413). Os três exemplos acima referidos empregam genes bacterianos sob controle de eucariótico para transmitira resistência aos medicamentos adequados G418 ou neomicina (geneticin), xgpt (ácido micofenólico), ou hygromycin, respectivamente.

(iv) Componente Promotor [083] Os vetores de expressão para a produção da proteína recombinante de interesse contém um promotor adequado que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse. Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose (Chang et al., (1978) Nature, 275:615; Goeddel et al., (1979) Nature, 281:544), fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, (1980) Nucleic Acids Res., 8:4057; EP 36.776], e promotores híbridos tais como o promotor tac (deBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25. Entretanto, outros promotores bacterianos conhecidos são também adequados. Suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguem operativamente estas ao DNA que codifica o polipeptídeo de

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39/59 interesse (Siebenlist et al, (1980) Cell, 20: 269) utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários. Vide também, Sambrook etal., supra-, e Ausubel etal., supra.

[084] Promotores para uso em sistemas bacterianos também apresentarão uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptídeo de interesse. O promotor pode ser removido do DNA bacteriano fonte por digestão enzimática com enzimas de restrição e inserida no vetor contendo o DNA desejado.

(v) Construção e Análise de Vetores [085] A construção dos vetores apropriados que contêm um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas padrão de ligação. Os plasmídeos isolados ou os fragmentos de DNA clivados, costurados e religados na forma desejada para gerar os plasmídeos desejados.

[086] Para a análise a fim de confirmar as sequências corretas nos plasmídeos construídos, misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar a E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31.446) de transformantes bem sucedidos selecionados pela resistência a ampicilina ou tetraciclina quando apropriado. Plasmídeos para os transformantes são preparados e analisados por digestão e restrição de endonucleases e/ou utilizando técnicas de sequenciamento pelo método de Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463-5467 ou Messing et al., (1981) Nucleic Acids Res., 9: 309, ou pelo método de Maxam et al., (1980) Methods in Enzymology, 65: 499. Vide também, Sambrook etal., supra-, e Ausubel etal., supra.

[087] O ácido nucléico que codifica a proteína recombinante de interesse é inserido nas células hospedeiras. Normalmente, isto é realizado por transformar as células hospedeiras com os vetores de expressão acima descritos e cultivando as células hospedeiras em meio nutritivo convencional modificado, quando necessário para induzir os diversos promotores.

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Cultivando Células Hospedeiras [088] Células hospedeiras apropriadas para a prática da presente invenção são bem conhecidas no estado da arte. Células hospedeiras que expressam a proteína recombinante abundantemente sob a forma de corpos de inclusão ou no espaço periplasmático ou espaço intracelular são normalmente utilizadas. Procariotas adequados incluem bactérias como, por exemplo, eubactérias tais como, bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas, por exemplo, E. coli, Bacilli, por exemplo, B. subtilis, espécies de Pseudomonas como, por exemplo, P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, ou Serratia marcescens. Um exemplo de E. coli hospedeira é E. coli 294 (ATCC 31,446). Outras cepas, por exemplo, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) também são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. A cepa W3110 é uma típica hospedeira, porque é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante. Em um aspecto da presente invenção, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada por uma mutação genética nos genes que codificam proteínas, desse tipo, como exemplo de tais hospedeiras, incluindo E. coli W3110 cepas 1A2, ΤΪΚΙ, 27B4, 27C7 e descrito na Patente US 5410026 depositada em 25 de abril de 1995. Por exemplo, uma cepa para a produção de VEGF é a E.coli cepa W3110 com o genótipo ίοηΑΔ ptr3 phoAAE15 A(argF-lac)169 degP41 ilvg designada 49B3, Vide também, a tabela que abrange as páginas 23-24 do documento W02004/092393.

[089] As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos de acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos no estado da técnica e são apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas incluindo os meios geralmente descritos em Sambrook et a!., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

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Laboratory Press (Cold Spring Harbor, Nova Iorque) (2001). Meios que são apropriados para bactérias incluem, mas não estão limitados a, meio AP5, caldo nutriente, caldo Luria-Bertani (LB), médio mínimo de Neidhardt, meio mínimo ou completo C.R.A.P., acrescido de suplementos nutricionais necessários. Em certos exemplos de realização, os meios também contêm um agente de seleção, escolhidos com base na construção do vetor de expressão, para permitir o crescimento seletivo das células que contêm a expressão do vetor procariótico. Por exemplo, a ampicilina é adicionada ao meio para o crescimento de células que expressam gene que confere resistência à ampicilina. Quaisquer suplementos necessários além de carbono, nitrogênio, fosfato inorgânico e fontes também podem ser incluídas em concentrações adequadas introduzidas sozinhas ou em mistura com outros complementos ou meios, tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo composto por glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[090] Exemplos de meios adequados são fornecidos nas patentes US 5.304.472 e US 5.342.763. Meio limitado de fosfato C.R.A.P. consiste de 3,57 g (Nhk) 2 (SO4), 0,71 g de citrato desódio-2H2O, 1,07 g KCI, 5,36 g extrato de levedura (certificado), 5,36 g HycaseSFTM-Sheffield, com pH ajustado para 7,3 com KOH, o volume ajustado para 872 ml com H2O deionizada e autoclavada; resfriada a 55°C. e suplementada com 110 ml de Mops 1M pH 7,3, 11 ml de glicose 50%, 7 ml MgSO4 1M). Carbenicilina pode, então, ser acrescentada para a indução da cultura, a uma concentração de 50 mg / ml.

[091] As células são procarióticas hospedeiras são cultivadas em temperaturas adequadas. A temperatura de crescimento da E. coli, por exemplo, a oscila entre, por exemplo, cerca de cerca 39°C a 20°C, ou cerca de

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25°C a 37°C, ou cerca de 30°C.

[092] Quando o promotor da fosfatase alcalina é empregado, a células de E. coli utilizadas para produzir o polipeptídeo de interesse da presente invenção são cultivadas em meio adequado no qual o promotor da fosfatase alcalina pode ser parcial ou totalmente induzido como descrito geralmente em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, Nova Iorque) (2001). É necessário que nunca falte fontes de fosfato inorgânico na cultura. Inicialmente, o meio contém fosfato inorgânico, em uma quantidade acima do nível de indução de síntese proteica e suficiente para o crescimento da bactéria. Como as células em crescimento utilizam fosfato, elas diminuem o nível de fosfato do meio, causando assim a indução da síntese do polipeptídeo.

[093] Se o promotor é um promotor induzível, para que ocorra a indução, como normalmente acontece, as células são cultivadas até que certa densidade ótica seja alcançada, por exemplo, um A550 de cerca de 200 usando um processo de alta densidade celular, a ponto que é iniciada a indução (por exemplo, pela adição de um indutor, pelo depleção de um componente do meio, etc), para induzir a expressão do gene que codifica o polipeptídeo de interesse.

[094] Quaisquer suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto, introduzidos sozinhos ou misturados com outro suplemento ou meio, como uma fonte de nitrogênio complexa. O pH do meio pode ser qualquer pH em torno de 5-9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH é de, por exemplo, cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou cerca de 7,0.

Uso de Proteínas Recombinantes [095] O polipeptídeo assim recuperado pode ser formulado em um veículo farmaceuticamente aceitável e é utilizada para diversas ferramentas

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43/59 de diagnosticas, terapêuticas ou em outros usos para essas moléculas conhecidas. Por exemplo, as proteínas descritas na presente invenção podem ser usadas em imunoensaios, como o imunoensaio enzimático.

[096] Aplicações terapêuticas para as proteínas recombinantes, obtidas utilizando os métodos descritos a seguir são também contempladas. Por exemplo, um fator de crescimento ou hormônios, por exemplo, o VEGF pode ser utilizado para melhorar o crescimento desejado. Por exemplo, o VEGF pode ser utilizado para promover a cicatrização, por exemplo, uma ferida aguda (por exemplo, queimadura, ferida cirúrgica, ferida normal, etc) ou uma ferida crônica (por exemplo, úlcera diabética, úlcera de pressão, úlcera de decúbito, úlcera venosa, etc), para promover o crescimento de pêlos, para promover o crescimento e reparo no tecido, etc.

[097] Formulações terapêuticas das proteínas recombinantes utilizadas de acordo com a presente invenção são preparadas para o armazenamento através da mistura de uma molécula, por exemplo, polipeptídeo que tenha o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remingtorfs Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Osol, A. Ed. (1995)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil- ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e meta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros

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44/59 hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos nãoiônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG).

[098] Em certos exemplos de realização, as formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente obtido por filtração através das membranas de filtração, na liofilizada ou como uma forma de solução aquosa ou gel. O pH das preparações com a proteína recombinante pode ser, por exemplo, de cerca de 4 a 8 (em uma realização o pH é 5,0), embora valores altos ou baixos de pH possam também ser apropriados em certas circunstâncias. Será compreendido que a utilização de alguns dos excipientes, veículos ou estabilizantes possam resultar na formação de sais da proteína recombinante.

[099] A via de administração do polipeptídeo está de acordo com métodos conhecidos, como por exemplo, administração tópica, por injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial ou intralesional, ou de liberação sustentada por sistemas como descrito abaixo. O polipeptídeo pode ser administrado por infusão contínua ou bolus por injeção.

[0100] Normalmente, para cicatrização de feridas, a proteína recombinante é formulada para entrega específica local. Quando aplicado topicamente, a proteína recombinante é devidamente combinada com outros componentes, tais como veículos e/ou adjuvantes. Não há limitações quanto à natureza desses outros ingredientes, com exceção de que devem ser farmaceuticamente aceitáveis e eficazes para a sua administração, e não

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45/59 podem degradar significativamente a atividade dos ingredientes ativos da composição. Exemplos de veículos adequados incluem pomadas, cremes, géis, aerossóis, ou suspensões, com ou sem colágeno purificado. As composições também pode estar impregnadas em curativos estéreis, sistemas transdérmicos, gessos e bandagens e, opcionalmente na forma de líquidos ou semi-líquidos.

[0101] Para a obtenção de uma formulação em gel, a proteína recombinante formulada em uma composição líquida pode ser misturada com uma quantidade total de polissacarídeo solúvel em água ou polímeros sintéticos, como o polietileno glicol para formar um gel de viscosidade adequada para ser aplicado topicamente. Os polissacarídeos que podem ser utilizados incluem, por exemplo, derivados da celulose, como derivados da celulose eterificados, incluindo a alquíl celulose, hidroxialquíl celulose e celulose alquilidroxialquilica, por exemplo, metilcelulose, hidroxietilcelulose, carboximetil celulose, hidroxipropil metilcelulose, e hidroxipropil celulose, amido e amido fracionado; ágar; ácido algínico e algínato; goma arábica; pullullarr, agarose; carragenina; dextran; dextrina; frutanos; inulina; manana; xilana; arabinana; quitosanas; glicogenas; glicanas; biopolímeros e sintéticos, bem como gomas, tais como goma xantana; goma guar, goma de alfarroba, goma arábica, goma adragante, goma caraia; e seus derivados e misturas. Em certos exemplos de realização, o agente gelificante é um agente aquele que é, por exemplo, inerte para sistemas biológicos, atóxico, simples de preparar e/ou fluído ou não muito viscoso, e que não desestabiliza a proteína recombinante contida dentro dela.

[0102] Em exemplos específicos da presente invenção, o polissacarídeo é um derivado de celulose eterificado, em outro exemplo é um que seja bem definido, purificado e listado na USP, por exemplo, a metilcelulose e hidroxialquil celulose e derivados, tais como

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46/59 hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose, e hidroxipropil metilcelulose. Em um exemplo de realização, o polissacarídeo é metilcelulose.

[0103] O polietileno glicol útil para gelificação é tipicamente uma mistura de polietileno glicol de baixo e alto peso molecular para obter a viscosidade adequada. Por exemplo, uma mistura de polietileno glicol de peso molecular ente 400-600 com um peso molecular de 1500 seria eficaz para os propósitos do presente, quando misturados na proporção adequada para obter uma pasta.

[0104] O termo hidrossolúvel, tal como aplicado ao polissacarídeo e polietileno glicol refere-se a soluções e dispersões coloidais. Em geral, a solubilidade da celulose é determinada pelo grau de substituição dos grupos éter, e estabilizantes derivados úteis no presente devem ter uma quantidade suficiente de tais grupos éter por unidade de anidro-glicose na cadeia de celulose para se tornarem derivados hidrossolúveis. Um grau de substituição do éter de pelo menos 0,35 grupos éter por unidade de anidroglicose é geralmente suficiente. Além disso, a celulose pode estar sob a forma álcali de sais metálicos, por exemplo, sais de Li, Na, K, ou Cs.

[0105] Se a metilcelulose é utilizada no gel, esta compreende, por exemplo, cerca de 2-5%, ou cerca de 3%, ou cerca de 4%, ou cerca de 5%, de gel, e a proteína recombinante está presente em uma quantidade de cerca de 300-1000 mg por ml de gel.

[0106] Os ingredientes ativos podem também ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas coacervação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington’s

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Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Osol, A. Ed. (1995). Vide também, Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:12211223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Ed Powell e Newman, (Plenum Press: Nova Iorque, 1995), págs.. 439-462; documento WO 97/03692, documento WO 96/40072, documento WO 96/07399; e patente US 5.654.010.

[0107] Podem ser elaborados como preparações de liberação sustentada. Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o agente ativo, matrizes estas que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool (poli)-vinílico, polilactídeos (Patente US 3.773.919)), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, etilenovinilacetato nãodegradável, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico degradável tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) ácido poli-lático coglicólico (PLGA) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando as proteínas permanecem encapsuladas no organismo por um longo período de tempo, elas podem ser desnaturadas ou agregadas como resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando na perda da atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o

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48/59 mecanismo de agregação for descoberto por ser causado pela formação de pontes S-S intermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização pode ser alcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle do teor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições matrizes de polímero específicas.

[0108] As composições de polipeptídeos de liberação sustentada incluem polipeptídeos armazenados em lipossomos Os lipossomos que contêm a proteína são preparados por meio de métodos conhecidos no estado da arte, conforme descrito, por exemplo, em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patentes EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142.641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Patentes US 4,485,045 e US 4,544,545; e EP 102,324. Normalmente os lipossomos são do tipo pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) unilamelar, em que o teor de lipídios é maior do que cerca de 30 mol. % de colesterol, a proporção selecionada será ajustada para a terapia mais efetiva com o polipeptídeo.

[0109] Uma quantidade eficaz de proteína recombinante para ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração, bem como da condição do paciente. Sendo assim, será necessário que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração como necessário para se obter um efeito terapêutico mais benéfico. Uma dose diária pode normalmente variar entre cerca de 1 mg/kg, a 10 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Normalmente, o médico irá administrar o polipeptídeo até que seja obtida uma dose que alcance o efeito desejado. Um paciente também pode administrar o polipeptídeo sob a orientação do médico. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por testes convencionais.

[0110] Os exemplos seguintes são oferecidos com o objetivo de

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49/59 ilustrar e não são destinados a limitar a presente invenção.

Exemplos Exemplo I Resolubilização e Reenovelamento do VEGF Humano Recombinante Expresso Em Escherichia coli

Métodos

Γ01111 P/asm/deo para a expressão de VEGFies - O plasmídeo pVEGF171 foi projetado para a expressão do VEGF165 humano (vide, por exemplo, Leung et al., (1989) Science, 246:1306-1309) no periplasma da E. coli. A transcrição da sequência que codifica o do VEGF é colocado sob um controle rígido do promotor da fosfatase alcalina (AP) (vide, por exemplo, Kikuchi et al., (1981) Nucleics Acids Research, 9:5671-8), enquanto que sequências necessárias para a tradução inicial são fornecidos pela região trp Shine-Dalgarno (vide por exemplo, Yanofsky et al., (1981) Nucleics Acids Research, 9:6647-68). A sequência codificante do VEGF é fundida à jusante da sequência sinalizadora da Enterotoxina termo-estável tipo II (STII) (vide, por exemplo, Lee et al., (1983) Infect. Immun. 42:264-8; e, Picken et al. (1983) Infect. Immun. 42:269-75) para posterior secreção para o periplasma da E. coli. Modificações no códon da sequência sinal STII fornecem um nível ajustado de tradução, o que resulta em um nível ótimo de acumulo de VEGF no periplasma (vide, por exemplo, Simmons e Yansura, (1996) Nature Biotechnoloy, 14:62934). O lambda para o terminador de transcrição (vide, por exemplo, Scholtissek e Grasse, (1987) Nucleics Acids Research, 15:3185) está localizada à jusante do códon de terminação da tradução de VEGF. A origem de replicação, e ambos os genes de resistência a tetraciclina e ampicilina, são fornecidos pelo plasmídeo pBR322. Vide , por exemplo, Bolivar etal., (1977) Gene 2:95-113.

[0112] Preparação do homogeneizado de células e corpos refringentes:

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- Todo caldo celular a partir das células de Escherichia coli que produzem as proteínas recombinantes são homogeneizadas com um ou microfluidizador Niro Soavi a pressões superiores a 8000 psi. O homogenato é diluído 1:1 com 160mM de MgSCU, 0,0375 de sulfato de dextran e 1% de Triton X-100 antes da coleta do sedimento por centrifugação (centrífuga BTUX, da Alfa Lavai, Suécia).

[0113] Solubilização e Reenovelamento:

- O sedimento (por exemplo, 1 grama) é suspenso em 4 volumes (por exemplo, 4 ml) de tampão de solubilização: ureia 1M / arginina 300 mM, Tris ou CHES 10 mM, EDTA 5 mM e pH 11 na concentração final, (4L/kg sedimento). A suspensão é bem misturada por 1-2 horas em temperatura ambiente (15-30°C). O reenovelamento é iniciado através da adição de 3 volumes (1:4 v/v) de tampão por volume de tampão de solubilização, o que resulta na concentração final de tampão de reenovelamento sendo 1M de ureia, 15 mM de cisteína, 0,5-2 mM de DTT, 100 mM de arginina, 10 mM de Tris ou CHES, 5 mM de EDTA em pH 9-10. A mistura é agitada com a adição de ar ou oxigênio a um coeficiente volumétrico de transferência de massa constante (por exemplo, por uma difusão de ar em um recipiente de 2,5L, com Ki_a = 0,004 a 0,1 min'¹, taxa de difusão do ar de 0,3-3 cc/min/L, com velocidade de mistura de 200-400 rpm) por 6-24 horas em temperatura ambiente. Vide a Figura 1 para o tempo de reenovelamento. Opcionalmente, o VEGF pode ser estabilizado no tampão de reenovelamento, acrescentando nitrogênio (por exemplo, 0.3-3 cc/min/L no recipiente de 2,5L), em substituição ao ar após 6 horas. Vide a Figura 7. O reenovelamento é monitorado por SDS-PAGE, cromatografia HPLC de troca catiônica e rpHPLC, e/ou HPLC Heparina.

[0114] Uma redução significante no processo do volume (5vezes), mantendo o rendimento do dímero VEGF recuperado é observado em um tampão de pH alto contendo níveis leves de desnaturantes e redutores.

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Espera-se que esse método seja aplicável no reenovelamento de outras proteínas recombinantes, por exemplo, outros fatores de crescimento.

Exemplo II

SOLUBILIZAÇÃO DE ETAPA ÚNICA E REENOVELAMENTO DO VEGF HUMANO Recombinante Expresso em Escherichia coli [0115] Solubilização e Reenovelamento:

- O sedimento é suspenso em um volume 10-39 litros de tampão de reenovelamento (neste caso, denominado solução tamponada combinada) por cada kg de sedimento celular, onde a solução tamponada combinada contém um concentração final de 1M de ureia, 15 mM de cisteína, 0,5 ou 2 mM de DTT, 100 mM de arginina, 10 mM de Tris ou CHES, 5 mM de EDTA, pH 9,510,5. Vide a Figura 6 para o efeito da adição de ureia e arginina na solução tampão de reenovelamento. A Figura 6 apresenta os resultados do reenovelamento do sedimento em uma etapa (solução tamponada combinada), conforme descrito neste exemplo, em pH 9,5 durante 15 horas à temperatura ambiente. As concentrações de desnaturante variaram da seguinte forma: (1) 1M de ureia e 100 mM de arginina; (2) 1 M de ureia (e 0 mM de arginina); (3) 2M de ureia (e 0 mM de arginina), enquanto todos os outros componentes do tampão (por exemplo, Tris ou CHES, DTT, etc.) permanecem na mesma concentração. O título do VEGF extraído a partir destes são equivalente, conforme determinado pelo ensaio de HPLC de troca catiônica. A Figura 6 exibe que os perfis de rpHPLC são comparáveis com ou sem a presença da arginina.

[0116]A incubação de solubilização e reenovelamento são realizadas em temperatura ambiente por 3-24 horas e agitadas com a adição de ar a usando um coeficiente volumétrico de transferência de massa Ki_a = 0,004 a 0,1 min'¹ (por exemplo, para um recipiente de 2,5L contendo um propulsor do tipo marinho, a taxa de difusão do ar é de 0,3-10 cc/min/L, 0,3-3

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52/59 cc/min/L, ou 1 cc/min/L, ou 25 cc/min/L, com velocidade de mistura de 200-400 rpm).Vide a Figura 8, para os efeitos da variação da difusão de ar sobre a condições de reenovelamento. Por exemplo, o sedimento contendo o VEGF foi adicionado a solução tamponada combinada em pH 10 na proporção de 1:39 (Kg de sedimento/ L de tampão). Três tanques de reação de 2,5L foram preparados e a taxa de difusão do ar variou para cada um para alcançar um Ki_a de (a) 0,004, (b) 0,01, (c) 0,1 min'¹. As velocidades de mistura testadas em cada tanque foram de 314rpm enquanto que o intervalo para a dispersão de ar foi de 1 cc/L/min a 25 cc/L/min. As reações foram monitoradas por todo o período para o rendimento e a qualidade do produto. Os perfis de rpHPLC apresentados na Figura 8 exibe a qualidade comparável dos produtos para o VEGF reenovelado resultante após 12 horas. Opcionalmente, a incubação pode ser realizada em temperatura ambiente por até cerca de 48 horas. Opcionalmente, o VEGF pode ser estabilizado no tampão de reenovelamento, acrescentando, nitrogênio ao invés de ar, na mesma taxa de difusão e mistura após 6 horas. Consulte a Figura 7, que exibe os resultados de um reenovelamento do sedimento em duas etapas (conforme descrito no Exemplo I), na presença de ar (por exemplo, Ki_a = 0,004 ou 0,3-10 cc/min/L, para um tanque de 2,5L), onde às 6 horas o pico monômero é diminuído (indicando assim que a reação de reenovelamento foi substancialmente completa). A dispersão de ar é substituída por N2 (por exemplo, Ki_a = 0,004 min'¹) por até 48 horas. Como pode ser observado na Figura 7, o material permanece estável como mostrado pelo ensaio de rpHPLC. O reenovelamento é monitorado por SDS-PAGE, colunas de cromatografia em HPLC de troca catiônica e rpHPLC, e/ou HPLC Heparina.

Exemplo III

Reenovelamento de Proteína Recombinante Não Sedimentada [0117] Toda células de Escheríchia coli do caldo que produziu a

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53/59 proteína recombinante é homogeneizado, em um homogeneizador modelo 15 M Gaulin (pequena escala) ou M3 (larga escala) (Gaulin Corporation, Everett, MA) e diluído 1:4 (v/v) em tampão de reenovelamento por volume de homogenato e o ar foi difundido a um coeficiente de transferência de massa Ki_a = 0,004 a 0,1 min'¹ (por exemplo, para um recipiente de 2,5L contendo um propulsor do tipo marinho, a taxa de difusão do ar é de 0,3-3 cc/min/L, 0,3-1 cc/min/L, ou 1 cc/min/L, ou 3 cc/min/L, enquanto misturados a 200-400 rpm). O tampão de reenovelamento contém um concentração final de 1M de ureia, 15 mM de cisteína, 2 mM de DTT, 100 mM de arginina, 10mM de Tris ou CHES, 5mM de EDTA em pH 9-10. A incubação de reenovelamento é realizada em temperatura ambiente por 3-24 horas. Opcionalmente, o VEGF pode ser estabilizado no tampão de reenovelamento, acrescentando, nitrogênio ao invés de ar após 3 horas da incubação de reenovelamento. O reenovelamento é monitorado por SDS-PAGE, colunas de cromatografia em HPLC de troca catiônica e rpHPLC, e/ou HPLC Heparina.

Exemplo IV

Purificação do VEGF Humano Recombinante (rhVEGF) após o Reenovelamento [0118] Purificação:

- O grupo reenovelado é clarificado, acrescentando Triton X-100 a uma concentração final de 1%, ajustando o pH para 9 e, em seguida, centrifugando (10.000 xg durante 20 minutos a uma temperatura de 4°C). O sobrenadante é então filtrado (filtro de membrana Cuno de + 0,22 ou 0,45μ) antes da captura na resina de modo misto (CaptoMMC®, da GE Healthcare, Piscataway, NJ), em 9 pH e condutividade <10 mS/cm. Opcionalmente, o grupo reenovelado é diluído a pelo menos 1:5 em tampão de equilíbrio de carregamento e, em seguida filtrado (filtro de membrana Cuno de + 0,22 ou 0,45μ) antes da captura em resina de modo misto (CaptoMMC®, da GE

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Healthcare, Piscataway, NJ), em pH 9 e condutividade <10 mS/cm. A coluna embalada é equilibrada com 25 mM de HEPES pH 9 antes do carregamento da amostra na coluna. O VEGF é eluído da coluna MMC por eluição isocrática com 1M de arginina / 25 mM de HEPES, em pH 6-9 (por exemplo, pH 7,5). Vide a Figura 2.

[0119] O grupo no CaptoMMC® é ajustado para um pH de7,5 com hidróxido de sódio 0,1N e diluído com WFI para uma condutividade de 20mS/cm antes do carregamento na coluna SP-Sepharose HP (equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,5). O VEGF é eluído usando um gradiente linear de sal composto por 50 mM HEPES/0-1,2 M de acetato de sódio pH 7,5 sobre 10-20 volumes de coluna (por exemplo, volume de 15colunas) e as frações são coletadas (volume de 1 coluna). As frações com maiores absorbância @ 280 nm (OD max a ~ 42mS/cm) contêm normalmente > 90% do VEGF e são agrupadas para tratamento posterior. Vide a Figura 3.

[0120] A terceira etapa de cromatografia inclui uma resina hidrofóbica (por exemplo, Hi Propil, J.T. Baker, Phenyl Sepharose Fast Flow (low sub), da GE Healthcare, Piscataway, NJ). A eluição do grupo na SPSepharose HP é condicionada à uma condutividade de 50mS/cm utilizando tanto acetato de sódio quanto sulfato de sódio antes do carregamento do na coluna equilibrada (50 mM de HEPES, 1,2 M de acetato de sódio em pH 7,5). Vide a Figura 4. O VEGF foi eluído isocraticamente em 50 mM HEPES, pH 7,5 e o grupo analisado pela permanência de impurezas e agregados solúveis de célula hospedeira. As frações são coletadas e aquelas contendo o VEGF com reenovelamento correto, conforme determinado pelos ensaios descritos no presente são agrupadas. Opcionalmente, uma etapa de cromatografia adicional é realizada, por exemplo, utilizando uma segunda resina hidrofóbica (por exemplo, Phenyl TSK) ou resina de troca iônica.

[0121] Ultrafiltração / Diafiltração:

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- O VEGF agrupado pode ser ultrafiltrado em uma membrana de celulose para 5kD em um sistema de filtração Labscale TFF para uma concentração de 6 g/L (UF1). A amostra é diafiltrada com 7-14 DV (Diavolume) com 5 mM sucinato de sódio via sistema TFF para uma concentração de 10g/L e, em seguida, formulada a 5g/L para o armazenamento a -80°C. O tampão de formulação utilizado é de 5 mM de sucinato de sódio / 275 mM de hidrato de trihalose / 0,01 polissorbato 20 em pH 5,0.

ExemploV

Purificação do VEGF Humano Recombinante (rhVEGF) após o Reenovelamento [0122] Purificação:

- O grupo reenovelado é clarificado, acrescentando Triton X-100 a uma concentração final de 1%, ajustando o pH em 8,5-8,5 (por exemplo, 8,7) e mantido a 25-30°C por 1 a 10 horas antes da centrifugação. Após o processamento na centrifuga (10.000 xg durante 20 minutos a uma temperatura de 4°C) para remover as partículas de grande densidade, o líquido recuperado (centrate) passa através de uma série de filtros de profundidade e filtros para manter estéril (membranas de 0,22 ou 0,45pm) para remover as partículas finas. O rhVEGF é então captado em uma resina de modo misto (CaptoMMC®, da GE Healthcare, Piscataway, NJ), em 8,7 pH e condutividade <10 mS/cm. A coluna embalada é equilibrada com 25 mM de HEPES pH 8,7 antes do carregamento da amostra na coluna. O VEGF é eluído da coluna MMC por eluição isocrática com 0,9M de L-arginina HCI/ 25 mM de HEPES, em pH 6-9 (por exemplo, pH 7,5).

[0123] O grupo no CaptoMMC® é ajustado para um pH de7,5 com hidróxido de sódio 0,1 N e diluído com WFI para uma condutividade de 20mS/cm antes do carregamento na coluna SP-Sepharose HP (equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,5). O VEGF é eluído usando um gradiente linear de sal composto

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56/59 por 50 mM HEPES/0-1,2 M de acetato de sódio pH 7,5 sobre 10-20 volume da coluna (por exemplo, volume de 15 colunas) e as frações são coletadas (volume de 1 coluna). As frações com maiores absorbância @ 280 nm (OD max a ~ 42mS/cm) contêm normalmente > 90% do VEGF e são agrupadas para tratamento posterior. A terceira etapa de cromatografia inclui uma resina hidrofóbica (por exemplo, Hi Propil, J.T. Baker, Phenyl Sepharose Fast Flow (low sub), da GE Healthcare, Piscataway, NJ). A eluição do grupo na SP-Sepharose HP é carregada diretamente na coluna HIC (25 mM de HEPES, 0,75 M de acetato de sódio em pH 7,5). Vide a Figura 5. O VEGF foi eluído isocraticamente em 50 mM HEPES, pH 7,5 e o grupo analisado pela permanência de impurezas e agregados solúveis de célula hospedeira. As frações são coletadas e aquelas contendo o VEGF com reenovelamento correto, conforme determinado pelos ensaios descritos no presente são agrupadas. Opcionalmente, uma etapa de cromatografia adicional é realizada para remover impurezas adicionais das hospedeiras, por exemplo, utilizando uma segunda resina hidrofóbica (por exemplo, Phenyl TSK) ou resina de troca iônica.

[0124] Ultrafiltração / Diafiltração:

- O VEGF agrupado pode ser ultrafiltrado em uma membrana de celulose regenerada para 5kD em um sistema TFF comercial (Pellicon 2 casettes, Millipore, Billerica, MA) para uma concentração de 10g/L, em seguida, diafiltrado com 7-14 diavolumes (por exemplo, 10DV) no tampão de formulação. O condicionamento final produz uma solução contendo 5 g/L de VEGF em 5 mM de sucinato de sódio / 275 mM de hidrato de trihalose / 0,01 polissorbato 20 em pH 5,0 que pode ser armazenado a -80°C.

Exemplo VI

Ensaios para a Determinação de Proteína Recombinante Enovelada e/ou Purificada [0125] Nos métodos e processos descritos no presente, a pureza

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57/59 e/ou atividade final pode ser avaliada pelo mapeamento de peptídeo, mapeamento de bissulfetos, SDS-PAGE (tanto reduzido quanto não-reduzido), dicroísmo circular, lisado de amebócitos de límulo (LAL), HPLC de troca catiônica, HPLC de heparina (por exemplo, HPLC Heparina pode ser usado para determinar a concentração de dímero de VEGF e o nível de espécies enoveladas incorretamente), HPLC de fase reversa (rp) (por exemplo, rpHPLC das amostras reduzidas pode ser utilizado para determinar a concentração total de VEGF em que rpHPLC das amostras nativas pode avaliar a qualidade de VEGF reenovelado), ligação a receptores (para o VEGF, por exemplo, ligação ao receptor KDR bioanalítico da R&D, e/ou ligação a receptores Flt1), Análise por SEC, ensaios celulares, ensaios de potência com HUVEC, ensaios de ELISA com anticorpos para VEGF, análise por espectrometria de massa e etc.

Ensaio para Determinar a Expressão Total de VEGF [0126] (1) rpHPLC das amostras reduzidas:

- A quantidade de VEGF expressa é mensurada utilizando um ensaio de HPLC de fase reversa sobre uma coluna C18 (Júpiter C18 column (4,6 x 250 mm, 5 mícron, da Phenomenex, Torrance, CA). A coluna é equilibrada em 0,22% de ácido trifluoroacético e eluída usando um gradiente linear de 25% a 45% de acetonitrila contendo 0,2% de ácido trifluoroacético por 30 minutos com uma vazão de 1mL/min. O eluente é monitorado a 280nm. A amostra é tratada e totalmente reduzida em guanidina e DTT antes da injeção. A proteína VEGF reduzida eluída por cerca de 26 minutos, e a área de pico é usada para calcular a quantidade total de VEGF na amostra a partir de uma curva padrão conhecida.

Ensaios para VEGF Reenovelado [0127] (1) Ensaio de HPLC de troca catiônica:

- A quantidade de dímeros de VEGF com reenovelamento correto é determinado por meio de uma coluna de troca catiônica analítica, por

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58/59 exemplo, coluna SP-5PW (TSK gel 5PW-SP, 7,5 x 75 mm, 10 microns, da Tosoh Biosciences LLC, Japão). A coluna é equilibrada em fosfato de sódio 50mM a pH 7,5. Em uma velocidade de fluxo de 1 mL/min, a coluna é eluída usando um gradiente linear de 0 a 2 M de cloreto de sódio em tampão de equilíbrio por mais de 60 min. O eluente é monitorado a 280 nm ou 214nm. Normalmente, a maioria das proteínas é eluída nos primeiros 30 min e o VEGF é eluída em torno de 40 min. Vide a Figura 9.

[0128] (2) Ensaio de rp-HPLC:

- A qualidade de VEGF com reenovelamento correto é determinado por meio de uma coluna Zorbax 300SB-C8 (4,6 x 150 mm, 3,5mícron, da Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia). A coluna é equilibradas em 0,1% de ácido trifluoroacético e eluída usando um gradiente linear de 0 a 50% de acetonitrila contendo 0,08% de ácido trifluoroacético por mais de 50 min com uma velocidade de fluxo de 1 mL/min. O eluente é monitorado a 214nm. Normalmente, o VEGF é eluído em cerca de 35 min e o perfil dos picos é avaliada pela percentagem do conteúdo de espécies hidrofóbicas das bordas em relação ao pico principal. Monômero de VEGF não enovelados são eluídos em 2-3 min.

[0129] (3) Ensaio de HPLC de ligação à heparina:

- A qualidade e quantidade de VEGF com reenovelamento correto é determinado por meio de uma coluna contendo heparina imobilizada. A coluna Heparina-5PW (7,5 x 75 mm, 10 microns, TSK gel da Tosoh Biosciences LLC, Japão) é equilibrada em 10 mM de fosfato de sódio, pH 7,4 contendo 0,15 M de cloreto de sódio. Em uma velocidade de fluxo de 1 mL/min, a coluna é eluída usando um gradiente linear de 0,15 M a 1,6 M de cloreto de sódio em tampão de equilíbrio durante 20 min. Em alguns ensaios, eluição é feita em 16 min. O eluente é monitorado a 280 nm. Normalmente, a maioria das proteínas são eluídas no volume vazio e 3 classes de VEGF podem ser

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59/59 identificados. A de mais alta afinidade, espécies ultimamente eluídas são identificadas como o VEGF com reenovelamento correto e por vezes são identificadas como pico 3 do VEGF.

[0130] Entende-se que os depósitos, exemplos e realizações descritas no presente são apenas de caráter ilustrativo e que várias modificações ou alterações em função desse fato seriam sugeridas pelos técnicos conhecedores do assunto e estão incluídas dentro do espírito e da competência do presente pedido e dentro do escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, citações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento, são incorporadas ao presente pela referência, em sua totalidade para todos os fins.

Claims

Reivindicações

1. PROCESSO PARA A RECUPERAÇÃO DE FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) RECOMBINANTE REENOVELADO, a partir de cultura de células procarióticas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) isolamento de VEGF recombinante a partir da cultura de células procarióticas;

(b) solubilização do mencionado VEGF em uma primeira solução por 1 a 2 horas a uma temperatura de 2 a 40°C, em que o pH da primeira solução é superior a 9, em que a primeira solução compreende: (i) uma concentração final de 1M de ureia, 300 mM de arginina, 10 mM de CHES ou TRIS, 5 mM de EDTA;

(c) reenovelamento do mencionado VEGF solubilizado em uma segunda solução por 3 a 24 horas a uma temperatura de 2 a 40°C, em que o pH da segunda solução é > 9, porém < 11, em que a segunda solução compreende: (i) uma concentração final de 1M de ureia, 15 mM de cisteína, 2 mM de DTT, 100 mM de arginina, 10 mM de CHES, 5 mM de EDTA, ou (ii) uma concentração final de 1M de ureia, 15 mM de cisteína, 0,5-2 mM de DTT, 100 mM de arginina, 10 mM de TRIS, 5 mM de EDTA, e adição de ar ou oxigênio de modo que ocorra o reenovelamento do VEGF recombinante, e (d) recuperação do mencionado VEGF recombinante reenovelado.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o VEGF é o VEGF165.
3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a adição de ar ou oxigênio é fornecida a um Ki_a = 0,004 até 0,1 min'¹.
4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a estabilização do

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VEGF recombinante reenovelado pela adição de nitrogênio.
5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada etapa de recuperação (d) inclui o clareamento da segunda solução com o VEGF recombinante e sequencialmente permitir o contato do mencionado VEGF recombinante reenovelado com um suporte cromatográfico de modo misto, um suporte cromatográfico de troca catiônica, e um primeiro suporte cromatográfico hidrofóbico, e eluir seletivamente o VEGF recombinante reenovelado a partir de cada suporte.
6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de clareamento compreende: a adição de detergente para a segunda solução até uma concentração final de 1%, ajustando-se o pH para 8,5 a 9,5, incubação da segunda solução por 1 a 10 horas a uma temperatura entre 25-30°C, centrifugação da segunda solução; e filtração do líquido recuperado a partir da etapa de centrifugação.
7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o processo compreende adicionalmente o contato do mencionado VEGF recombinante reenovelado a um segundo suporte cromatográfico hidrofóbico ou um suporte de troca iônica e eluição seletiva do VEGF recombinante reenovelado a partir do suporte.
8. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 5 ou 7, caracterizado pelo fato de que os mencionados primeiro e segundo suportes cromatográficos de interação hidrofóbica são selecionados a partir de um grupo que consiste de resinas agarose -butil, -propil, -octil, -fenil e -aril.
9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de recuperação (d) compreende sequencialmente o contato do VEGF recombinante com um suporte cromatográfico de modo misto, um suporte cromatográfico catiônico, e um

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3/3 primeiro suporte cromatográfico de interação hidrofóbica, e eluição seletiva do

VEGF recombinante a partir de cada suporte.
10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o processo compreende adicionalmente o contato do VEGF recombinante com um segundo suporte cromatográfico hidrofóbico ou um suporte de troca iônica, e a eluição seletiva do VEGF recombinante a partir do suporte.