BRPI0714669A2

BRPI0714669A2 - derivados de camptotecina com atividade antitumor

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Publication number: BRPI0714669A2
Application number: BRPI0714669-8A
Authority: BR
Inventors: Gabriele Fontana; Ezio Bombardelli; Carlo Manzotti; Arturo Battaglia; Cristian Samori
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2006-07-26
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2013-04-24
Also published as: RU2009102229A; WO2008011992A1; JP5198447B2; BRPI0714669B1; US20100063082A1; MX2009000903A; CN101495484B; EP2044078A1; EP2044078B1; US8076351B2; AU2007278587A1; WO2008011992A8; HK1135693A1; KR101398591B1; PT2044078E; RU2441009C2; KR20090040304A; CN101495484A; NO20090350L; CA2659050A1

Abstract

DERIVADOS DE CAMPTOTECINA COM A ATIVDADE ANTITUMOR. A presente invenção refere-se a derivados de compotencina da fórmula (1) possuindo atividade antitumor, processo para preparação dos mesmos, uso dos mesmos como fármacos antitumor e composições farmacêuticas contendo os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOS DE CAMPTOTECINA COM ATIVIDADE ANTITUMOR".

A presente invenção refere-se aos novos derivados de campto- tecina possuindo atividade antitumor, aos processos para preparação dos mesmos, ao em emprego como fármacos antitumor e às composições far- macêuticas contendo os mesmos. Fundamentos da Invenção

A camptotecina é um alcalóide extraído da Camptotheca acumi- nata (Nyssaceae) descrita primeiramente por Wall e Wani em 1966 (J. Am.

Chem. Soe. 1966, 88, 3888-3890). A camptotecina, embora possua atividade antitumor de amplo espectro, especialmente contra tumor do cólon e outros tumores sólidos e leucemias, não sendo empregada na terapia devido a sua alta toxicidade, que é especificamente manifestada na forma de cistite he- morrágica, toxicidade gastrintestinal e mielossupressão.

Vários análogos da camptotecina foram sintetizados, a fim de

obter compostos possuindo baixa toxicidade e alta solubilidade. No presente, dois fármacos são empregados na prática clínica, a saber, CPT-11 e topote- cano. Outros derivados, tais como, belotecano, rubitecano, exatecano, gima- tecano, pegamotecano, lurtotecano, carenitecina, afeletecano, homocampto-

tecina, diflomotecano e muitos outros estão passando por experimentação clínica. O composto CPT-11 é um profármaco amplamente usado para 10- hidróxi-7-etilcamptotecina (geralmente conhecida como SN-38), aprovada para o tratamento de muitos tumores sólidos e ascites (linfoma colo retal, de pele, estômago, pulmão, cérvice, ovário e não-Hodgkin).

O topotecano é um composto solúvel na solução fisiológica, ati-

vo contra tumores do pulmão, estômago, fígado, ovário, mama, próstata, esôfago, reto, sarcomas de tecidos moles, pescoço e cabeça, glioblastoma, leucemias mielocíticas crônicas e agudas. O topotecano mostra, contudo, efeitos colaterais importantes, tais como, neutropenia e trombocitopenia.

O Lurtotecano é um derivado mais solúvel, possuindo atividade

nos tumores do pescoço, ovário, mama, colo-retal e microcitoma pulmonar. Contudo, o Lurtotecano também possui toxicidade hemática. O rubitecano é um profármaco para uso oral, eficaz contra tumo- res do pâncreas, ovário e mama.

A camptotecina e seus análogos, sendo o caso com os inibido- res da topoisomerase I, são eficazes contra tumores resistentes aos fárma- cos convencionais, incluindo inibidores de topoisomerase II; mantêm altos níveis de topoisomerase durante todo o ciclo celular; não induzem resistên- cia a múltiplos fármacos (Pgo ou MRP) ou metabolismo desintoxicante me- diado pela enzima.

As pesquisas estão focadas agora nos novos inibidores de to- poisomerase I possuindo toxicidade inferior aquela dos fármacos usados presentemente.

Os derivados de camptotecina de anel aberto mostram alta liga- ção de proteína (especificamente com albumina) e baixa distribuição nos tecidos tumorais. Como uma consequencia, o produto se acumula no corpo e os tumores são fracamente afetados.

De forma diferente, a alta Iipofilicidade da forma Iactona promove a adesão dos derivados de camptotecina às membranas celulares, especifi- camente eritrócitos, afetando a taxa de distribuição de tecido/plasma. Por essa razão, a pesquisa está focada em duas abordagens alternativas: a) projeto de produtos de ligação e proteína baixa ainda possuindo boa solubi- lidade; b) projeto de produtos altamente potentes possuindo efeito terapêuti- co mesmo em doses extremamente baixas.

Modificações nas posições 7-, 9-, 10- e 11- geralmente obtive- ram boa tolerabilidade, enquanto não afetando a estabilidade do complexo ternário de DNA-topoisomerase l-camptotecina, a formação do mesmo sen- do responsável pela atividade antitumor dos compostos.

Os produtos com configuração 20R provaram ser inativos ou muito menos ativos que os produtos com configuração 20S, o que coincide com a configuração natural. Como uma regra, as modificações na posição 5 são considera-

das desfavoráveis para a formação do complexo ternário, considerando-se que as modificações nos anéis D e E da piridona foram reportadas como sendo prejudiciais à atividade do produto. Descrição da Invenção

Em um primeiro aspecto, a invenção se refere aos derivados de camptotecina da fórmula geral I:

R1 R

em que:

R é alquila, aminoalquila, hidroxialquila, nitrila, alcoximino, arilo- ximino, sililalquila;

R1 é hidrogênio, hidróxi, alcóxi, aminoalquila;

R2 é hidrogênio, hidróxi, alcóxi, aminoalquila, hidroxila opcio- nalmente protegida;

em que os grupos alquila, alcóxi, aminoalquila ou alcoximino po- dem conter 1 a 8, preferivelmente 1 a 4 átomos de carbono em uma cadeia linear ou ramificada, considerando-se que o grupo ariloximino pode conter 5 a 10 átomos de carbono; os sais farmaceuticamente aceitáveis, isômeros, enantiômeros,

diastereômeros dos mesmos e misturas correspondentes.

Os compostos da invenção mostram ligação de proteína baixa e possuem boa solubilidade e potência alta mesmo em doses muito baixas.

A via sintética preferida para a preparação dos compostos da invenção é ilustrada no esquema que se segue e envolve substancialmente as seguintes etapas:

OH o

(D

V

a) proteção dos grupos hidróxi precursores;

b) derivatização em 5 com hidrazina N,N-di protegida;

c) conversão opcional do anel piridiona no anel tiopiridona d) remoção dos grupos protetores com ciclização concomitante,

e) aromatização opcional do anel pirazole

Rt R

íL. o

jfW/

Ή

N S .

HO O

.0

a)

b)

RJ-

Rl R ..,NHSoc

j Y BtxiT

C X JQg^f

P \

^hC

O, o PO

C)

Rl R D ^NHBoc BocN

d)

10

é)

No esquema, R, R1 e R2 possuem os significados descritos a- cima e PG é um grupo de proteção hidróxi.

As hidroxilas são preferivelmente protegidas por meio de grupos acila facilmente cliváveis, preferivelmente tricloroacetato e Troc ou grupos silila, preferivelmente trietilssilila.

A derivatização em 5- com hidrazida protegida pode ser obtida por tratamento do precursor com uma base orgânica forte, tal como, LiHMDS e reação do carbânion resultante com um aza dicarboxilato, tal como, di-t- butóxi aza dicarboxilato ou dibenzoilóxi aza dicarboxilato. A conversão do anel de piridona em anel tiopiridina pode ser obtida por reação com dissulfe- to de 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,2,3,4-ditiafosfetano-2,4 (geralmente conhecido como reagente de Lawesson) (Cava P.M. e outros, Tetrahedron 1985, 41, 5061; Cherkasov RA e outros, Tetrahedron 1985, 41, 2567; Ghattas AAG e outros, Sulfur Lett. 1982, 1, 69; Yde B e outros, Tetrahedron 1984, 40. 2047) ou com um reagente equivalente. O reagente de Lawesson é o preferido.

A finalidade da conversão opcional na tiopiridona é promover o

fechamento do anel, uma vez que a hidrazina tenha sido desprotegida. Con- tudo, foi observado que a dita reação de fechamento é espontânea e imedia- ta, mesmo sem ativação da piridina carbonila, por exemplo, como tiocarboni- la.

Quando os grupos de proteção hidróxi são sililas e aquelas no

nitrogênio são carbamatos, eles são geralmente removidos com ácido trifluo- racético. Em um procedimento alternativo, as etapas b) e c) podem ser re- vertidas.

Os compostos da invenção foram testados em um ensaio de ci- totoxicidade em um amplo espectro de células tumorais. Por meio de exem- plo, os dados de citotoxicidade na linhagem de célula NCI-H460 (câncer NSCL) se referindo aos dois compostos da fórmula (I) são reportados, usan- do camptotecina e os fármacos Topotecano e SN-38 como referências:

Nome fórmula NCI-H460 IC 50 (μρ/ΓϊΐΙ.) contagem celular captotecina Il ι ι Η~·χ FW =348.36 \ C20HÍ6N204 0,115 + 0,0174 topotecano I fN^ HOvAt^s3. o ι ^ N FW - 421 H04-./ C23K23N30S ZJ 0, 63 ± 0,44 SN38 hYTtW Ü FW =392.42 HO-f^í C22H20N205 ° 0, 0865 ± 0,0049 Nome Fórmula NCI-H460 IC50 (Mg/mL) contagem celular IDN 6132 H rrV> FW =363.38 M0"7— C20M17N304 -' O 17 ±4,25 IDN 6137 CCxf? FW «358,36 HO /—^ r.7r>Hi4Nám — O 3,8+1,08

Os compostos mais ativos foram avaliados em um ensaio de clivagem de DNA medindo a concentração ativa e persistência da lesão (vi- de a seção "Exemplos"). Os derivados da fórmula (I) mostram persistência surpreendentemente maior no bloqueio da replicação do DNA em relação ao padrão de referência (especificamente topotecano e camptotecina), enquan- to mantendo uma atividade citotóxica eficaz.

Em um aspecto adicional, a invenção se refere às composições farmacêuticas contendo um composto da fórmula (I) em conjunto com veícu- los e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formas farmacêuticas apropriadas para a administração oral ou parenteral dos compostos (I) po- dem ser sólidas, preferivelmente cápsulas, comprimidos e grânulos ou líqui- da, preferivelmente soluções injetáveis ou infusões.

Os compostos adequadamente formulados da invenção podem ser empregados para tratamento dos tumores sólidos e leucemias, especifi- camente nos tumores do pulmão, ovário, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecido mole, cabeça e pescoço, esôfago, pâncreas, cólon, reto, glioblastoma, leucemias mielocíticas crônicas e agudas. Exemplos

Exemplo 1 - 20-QTES-camptotecina Camptotecina (0,100 g, 0,278 mmol) foi suspensa em dimetil-

formamida anidra (3 mL), sob atmosfera inerte, e a suspensão resultante é adicionada com imidazole (0,980 g, 1,44 mmol). A mistura e agitada por 10 minutos, subsequentemente cloreto de trietilssilila (TES-CI) (0,193 mL, 1,15 mmol) e gotejado, seguido por adigao de 4-dimetilamino piridina (DMAP) (0,040 g, 0,287 mmol). Apos 46 horas, a mistura de reagao e evaporada sob vacuo, (controle de TLC do desaparecimento completo do reagente, eluente CH2CI2/MeOH = 30/1). O solido e subsequentemente removido em CH2CI2 e Iavado com H2O e NH4CI saturado. A fase aquosa e extra id a com CH2Cb (2 χ 10 mL). As fases organicas sao combinadas e secas sobre Na2S04, fiItra- das e concentradas sob vacuo, pelo que, obtendo ο produto desejado (0,133 g, 0,287 mmol) como um solido amarelo palido.

iH NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8.37 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7,92 (d’ 1 H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.82 (t, 1 H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.65 (t, 1 H, = 8.4 Hz, Ar), 7.57 (s, 1 H, H-14). 5.67 (d, 1 H, J = 16.4 Hz. H-17), 5.29 (s, 2 H, H-5), 5.25 (d, 1 HyJ= 16.4 Hz, H-17), 2.00-1.84 (rn, 2 H, H-19), 1.03-0.93 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H). 1^C NMR (CDCI3l 100 MHz) δ 171.7, 157,6, 152.5, 151.5, 149.0. 145,9，130.9, 130.4, 130.0. 128.4, 128.1, 128,0. 127,9, 118.9, 94,4, 75.3, 66.0. 50.0, 33.2, 7.9, 7.2, 6.4. Exemplo Il - Preparacao de 5-di-f-butoxicarbonilidrazino-20-QTES- camptotecina

Camptotecina 20OTES (0,100 g, 0,216 mmol) e dissolvida em THF anidro (6 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, entao resfriada a uma temperatura de -78°C e uma solugao de LiHMDS a 1 ,OM em THF (0,281 mL, 0,281 mmol) e gotejada. Apos 20 minutos, di-t-butilazo dicaboxilato (DTBAC) (0,075 g, 0,324 mmol) em THF anidro (2 mL) e adicionado. Apos 4 horas a - 78°C, ο desaparecimento do reagente e monitorado por TLC (Hexano/AcOEt =3/1). A formagao de dois diastereomeros e observada. A reagao e satura- da por adigao de NH4CI saturado. A fase aquosa e extraida com CH2CI2 (3 χ mL) e as fases organicas sao combinadas, secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas sob vacuo. O residuo e purificado por cromatografia instan- tanea (Si02, Hexano/AcOEt = 3/1), pelo que obtendo uma mistura de dois

isomeros (0,145 g, 0,210 mmol, 97%). Os dois isomeros sao separados por cromatografia adicional. Na ordem de eluigao: Primeiro diastereomero

1H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8.80 (br s, 1 H» Ar),

8.23 (d, 1 H1 J= 8.4 Hz, Ar), 8.01 (br d, 1 H, Ar), 7.90-7.71 (m, 2 H, Ar), 7.70-7.45 (m, 2 H1 Ar + H-14), 6.52 (br s, 1 H, H-5), 5.61 (d, 1 H, J= 16.8 Hz, H-17), 5.23 (d, 1 H, J= 16.8 Hz, H-17), 2.03-1.81 (m, 2 H, H-W), 1.79-1.08 (br s, 18 H), 1.06-0.92 (m, 12 H), 0,80-0,70 (m, 6 H). NMR (CDCl3, 100

Segundo diastereomero 1H NMR (CDCb, 400 MHz) δ 8.79 (br s.1 H, Ar), 8.23

(d, 1 H, J= 8.4 Hz, Ar), 8,01 (brd, 1 H, Ar), 7.85-7.76 (m, 2 H, Ar), 7.65 (br t. 1 H, J= 8 4 Hz, Ar), 7.52 (s, 1 H, H-14), 6 54 (br s, 1 H, H-5), 5.61 (d, 1 H1 J =16 8 Hz, H-17), 5.22 (d, 1 H1 J= 16.8 Hz, H-17), 2.03-1,82 (m, 2 H, H-19), 1.76-1.08 (br S, 18 H), t.04-0.92 (m, 12 H), 0.80-0,70 (m, 6 H). "C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 171.5’ 157,9, 155.5, 155.5, 152.3, 152.0. 151.2, 149,4, 145.1, 132.1, 130.6, 130.0. 128.7, 128,4, 127.9, 119.9, 98.2’ 82.9, 81.5, 79,6, 75.2, 65,8, 33.3, 28.3, 27,4, 7.8, 7.2, 6.4,

Exemplo III - Preparacao de 5-di-f-butoxicarbonilidrazino-20-QH- camptotecina - primeiro diastereomero

5-di-t-Butoxicabonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol) primeiro diastereomero e dissolvida em THF anidro (4 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, subsequentemente EGN.3HF (0,088 mL, 0,542 mmol) e gotejado. A mistura de reagao e reagida por 35 horas a tem- peratura ambiente, monitorando por TLC ο desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 3/2). O solvente e evaporado sob vacuo e ο residuo e puri- ficado por cromatografia instantanea (S1O2, Hexano/AcOEt = 3/2), pelo que, obtendo ο composto desejado (0,041 g, 0,071 mmol, 98%) como um solido amarelo palido.

O produto e adicionalmente purificado por cristalizagao a partir de CH2CI2/Pentano = 1/50. 1H NMR (CDCb, 400 MHz) δ 8.77 (br s, 1 H1 Ar), 8,16 (br d, 1 H1 J = 8.0 Hz, Ar), 7.97 (br s, 1 H, Ar), 7.86-7.50 (m. 4 H, Ar), 6.51 (br s, 1 H, H-5), 5,66 (d, 1 H, J- 16.4 Hz, H-17), 5.24《d, 1 H, J- 16.4 Hz. H-17), 3.86 (br s, 1 H, OH), 2.00-1.80 (m, 2 H, H-19), 1.79-1.13 (br S, 18 H), 1.03 (t, 3 H, J =

7.6 Hz, Me). 13C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 173.7, 157.9, 155.5, 155,5, 152.1, 151.3, 150.7, 149.6, 145.7, 132.3, 130.7, 129.9, 128,7, 127.9, 127.6, 120.0. 97.9, 82.8, 81.6, 79,7, 72,7, 66.1, 31.8, 28.3, 27.7, 7.7. Exemplo IV - Preparacao de 5-di-f-butoxicarbonilidrazino-20-QH- camptotecina - segundo diastereomero

5-di-t-Butoxicabonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,072 g, 0,072 mmol) segundo diastereomero e dissolvida em THF anidro (4,5 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, subsequentemente EbN.3HF (0,088 mL, 0,542 mmol) e gotejado. A mistura de reagao e reagida por 35 horas a tem- peratura ambiente, monitorando por TLC ο desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 3/2). O solvente e evaporado sob vacuo e ο residuo e puri- ficado por cromatografia instantanea (S1O2, Hexano/AcOEt = 3/2), pelo que, obtendo ο composto desejado (0,040 g, 0,069 mmol, 96%) com um solido amarelo palido.

O produto e adicionalmente purificado por cristaIizagao a partir de CH2CI2/Pentario = 1/50.

m NMR (CDCi3, 400 MHz) δ 8.79 (br s, 1 H’ Ar), 8.22 (br d, 1 H, J = 8.4 Hz1 Ar), 7.99 (br s, 1 H, Ar), 7.88-7.50 (m, 4 H, Ar), 6.53 (br s, 1 H, H-5), 5.65 (d, 1 H, J= 16.4 Hz, H-17), 5,26 (d, \ H, J= 16.4 Hz, H-17), 3.80 (br s, 1 H, OH), 2.00-1.80 (m, 2 H1 H-19), 1.79-1.13 (bf s, 18 H), 1.03 (t, 3 H, J~ 7.2 Hz, Me). ^C NMR (CDCb, 100 MHz) δ 173.6, 157.9, 155.4, 155.4. 152.1, 151.3, 150.8, 149.5, 145.6, 132.3, 130.8, 129.8, 128.7, 127.9, 127.8, 119.8. 98.0. 83.0. 81.5, 79.7, 72.7, 66,3, 31.8, 28,3, 27.7, 7.8. Exemplo V - Preparacao de 5-dibenziloxicarbonilidrazino-20-QTES- camptotecina

Camptotecina 20OTES (0,100 g, 0,216 mmol) e dissolvida em THF anidro (6 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, entao resfriada a uma temperatu- ra de -78°C e uma solugao de LiHMDS a 1’0M em THF (0,281 mL, 0,281 mmol) e gotejada. Apos 20 minutos, dibenzil azodicaboxilato (0,097 g, 0,324 mmol) em THF anidro (2 mL) e adicionado. Apos 3 horas a -78°C, a tempe- rature se eleva para 25°C e ο desaparecimento do reagente e monitorado por TLC (Hexano/AcOEt = 3/1). A formagao de dois diastereomeros e obser- vada. Apos 90 minutos a temperatura ambiente, a reagao e saturada por adi^ao de NH4CI saturado. A fase aquosa e extraida com ChbCI2 (3x15 mL) e as fases organicas sao combinadas, secas sobre Na2S04, filtradas e con- centradas sob vacuo. O residuo e purificado por cromatografia instantanea (SiO2, Hexano/AcOEt = 4/1 entao 7/2), pelo que obtendo um solido amarelo palido (0,161 g, 0,212 mmol, 98%). Os dois isomeros sao separados por cromatografia adicional. Na ordem de eluigao:

Primeiro diastereomero

1H NMR (CDCJ3, 400 MHz) δ 8.70 (br s, 1 Ht Ar),

8,39 (br s 1 H, Ar), 8,22 (br d, 1 H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.95 (br d, 1 H, J= 7.6 Hzf Ar), 7.83 (br t, 1 H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.65 (br t, 1 H, J= 7.6 Hzf Ar), 7.64- 7 00 (m, 11 H, Ar-»- H-14), 6.49 (br s, 1 H, H-5), 5.57《d, 1 H, J= 16.4 Hz, H- 17), 5.47-4.44 (m, 5 H), 1.98-1.82 (m, 2 H, H-19)’ 1.02-0.89 (m, 12 H), 0.80- 0.70 (m, 6 H). ”C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 171.6, 158.0. 156.3, 156.3, 153.0. 152.2, 151.0, 149.6, 144.8, 135.3, 132.1, 130.6, 130.0. 128.6-127.8 《11 C), 119.9, 98.4, 79.5, 75.2, 68.4, 67.9, 65.6, 33,0. 7.9, 7.2, 6.4.

Segundo diastereomero

1H NMR (CDCi3, 400 MHz) δ 8.85 (br s, 1 H, Ar),

8.58 (br s 1 H, Ar), 8.20 (br S1 1 H, Ar), 7.93 (br S, Ar), 7,81 (br t, 1 H, J = 7,6

Hz1 Ar), 7.63 (br t, 1 H1 J =7.6 Hz1 Ar), 7.56-6.90 (m, 11 H, Ar + H-14), 6.52

(hr Sj 1 H, H-5), 5.55 {d, 1 H, J = 16.B Hz, H 17), 5.44-4.71 (m, S H),

1.98-1.80 (m, 2 H, H-19), 1.05-0.90 (m, 12 H), 0.81-0.70 (m, 6 H). ^C NMR

(CDCb, 100 MHz) δ 171.5, 157.9, 156.4, 156.4, 152.9, 152.4, 150.9, 149.4,

144.8, 135.3, 132.1, 130.6, 129.9, 128.6-127.8 (11 C), 119.9, 98.5, 79.3,

75.2, 68.4, 67.8, 65.6, 32.9, 7,8, 7.2, 6.4. Exemplo Vl - Preparacao de 5-dibenziloxicarbonilidrazino-20-QH- camptotecina - primeiro diastereomero

5-Dibenziloxicabonilidrazino-20-OTES-camptotecina primeiro diastereomero (0,140 g, 0,184 mmol) e dissolvida em THF anidro (6 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, subsequentemente Et3N.3HF (0,225 mL, 1.380 mmoles) e gotejado. A mistura de reagao e reagida por 52 horas a temperatura ambiente, monitorando por TLC ο desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 1/3). O solvente e evaporado sob vacuo e ο residuo e puri- ficado por cromatografia instantanea (S1O2, Hexano/AcOEt = 1/1, entao 2/3), pelo que, obtendo (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) do composto desejado como um solido amarelo palido. O produto e adicionalmente purificado por cristali- zagao a partir de CH2CI2/Pentano = 1/50.

iH NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8.67 (br s, 1 H, Ar), 8.39 (br s t H, Ar), 8.12 (br d, 1 H, ^= 7.6 Hz, Ar), 7,95 (br s. 1 H, Ar), 7.74 (br t, 1 H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.65-6.66 (m. 12 H, Ar 令 H-14), 6.48 (br s, 1 H, H-5), 5.55 (d, 1 H, J: 16.0 Hz1 H-17), 5.42-4.44 (m, 5 H), 3.86 (br s, 1 H, OH), 1,92-1.72 {m, 2 H, H-19), 0.95 (t, 3 H, J- 7.6 Hz, Me), ^C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 173.5, 158.0. 156.2, 156.0. 153.0. 150.9, 150.9, 149.5, 145.3, 135.4, 132.2, 130.7, 129.8, 128.7-127.8 (11 C), 119.9, 98,2, 79.6, 72.7, 68.5, 68.0. 65.9, 31.6, 7.8.

Exemplo Vll - Preparacao de 5-dibenziloxicarbonilidrazino-20-QH- camptotecina - segundo diastereomero 5-Dibenziloxicabonilidrazino-20-OTES-camptotecina - segundo

diastereomero (0,140 g, 0,184 mmol) e dissolvida em THF anidro (6 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, subsequentemente Et3N.3HF (0,150 mL, 0,921 mmol) e gotejado. A mistura de reagao e reagida por 55 horas a tem- peratura ambiente, monitorando por TLC ο desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 3/2). O solvente e evaporado sob vacuo e ο residuo e puri- ficado por cromatografia instantanea (SiO2, Hexano/AcOEt = 1/1), pelo que, obtendo ο composto desejado (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) como um solido

amarelo palido. O produto e adicionalmente purificado por cristaIizagao a partir de CH2CI2/Pentano = 1/50.

1H NMR (CDCb, 400 MHz) δ 8.71 (br s, 1 H, Ar), 8.34 (br s 1 H, Ar), 8.18 (br s, 1 H, Ar), 7.94 (br s. 1 H, Ar), 7.79 (br t, 1 H, J - 7.6 Hz, Ar). 7.70-6.70 (m. 12 H, Ar + H-14), 6.52 (br s, 1 H, H-5), 5.53 (d, 1 H, J= 16.4 Hz, H-17), 5.44-4.48 (m, 5 H), 3.87 (br S, 1 H, OH), 1.90-1.70 (m, 2 H, H-19), O 99 (t, 3 H, J= 7.6 Hz, Me). 13C NMR (CDCb, 100 MHz) δ 173.4, 158.0. 156.3, 156.1, 153.0. 151.0. 150.9, 149.6, 145,3, 135,5, 132.3, 130.8, 129,8, 128.7-127.8 (11 C), 119.8, 98.4, 79.5, 72.7, 68.5, 67.8, 66.0. 31.6, 7.7. Exemplo Vlll - Preparacao do sal de TFA de 4.5-diidro-triazolf5,4-c116a- desoxocamptotecina

5-di-t-Butoxicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,225 g, 0,324 mmol, mistura diastereomerica 1:1) e dissolvida em 1,2-dicloroetano anidro (DCE) (8 mL) com agitagao sob atmosfera inerte, subsequentemente acido trifluoracetico (TFA) (0,895 mL, 11,67 mmoles) e gotejado. A mistura de reagao e reagida por 20 horas a temperatura ambierite, monitorando por TLC ο desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 1/3)，entao refluxada por 4 horas. O solvente e evaporado sob vacuo e ο residuo e purificado por cromatografia instantanea (SiO2, CH2C^MeOH = 30/1), pelo que, obtendo ο composto desejado (0,084 g, 0,178 mmol, 55%) como ο sal trifluoracetato. A mistura de 1:1 dos dois diastereomeros e adicionalmente purificada por cro- matografia instantanea (S1O2, Tolueno/AcOEt = 1/1).

1H NMR (CDCb, 400 MHz) δ 10.61 (br s, 0.5 H, N5-NH=C16a), 10.39 (br s, 0.5 H, N5-NH=C16a), 8.67 (s, 1 H1 Ar, H-7), 8.22-8.15 (m, 1 H, Ar), 7.96-7.92 (m, 1 H. Ar), 7,88-7.78 (m, 1 H, Ar), 7.69-7.60 (m, 2 H1 Ar}, 6.38-6.36 (m, 1 H, Ar, H-5), 5.72-5,62 (m, 1 H, Ar, H-17), 5.32-5.20 (m, 2 H, Ar, H-17 + N5H), 4.08-3 86 (br s, 1 H, OH), 1.96-1.74 (m, 2 H, H-19), 1.05-0.98 (tr 3 H1 7 = 7.6 Hzf Me). '3C NMR (CDCI3l 100 MHz) δ 173.8 (0.5 C), 173.4 (0.5 C), 159.1, 159.0. 156.7 (q CF3COOH), 156.5 (q CF3COOH) 151.5, 151.3, 150.7, 150,5, 150.1, 149.9’ 144.8, 144.7, 134.0. 133.8, 131.6, 131,5, 129.9, 129.8, 128.7, 128.7, 128.4, 128.4, 128.2. 128.2, 127丄 126.9, 120.5, 120.3, 99.1(2 C), 78,9, 78.6, 72.7’ 72.7, 66.0 {2 C), 31.7 (2 C), 7.7, 7.7.

Exemplo IX - Preparapao de triazol[5,4-c116a-desoxocamptotecina

O sal de TFA de 4,5-triidro-triazol[5,4-c]16a-desoxocamptotecina (0,020 g, 0,042 mmol) e dissolvido em CH2CI2 anidro (4 mL) com agita^ao sob atmosfera inerte, sendo adicionado ao mesmo, subsequentemente, a 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona (DDQ) (0,025 mg, 0,110 mmol). A mistura de reagao e reagida por 31 horas a temperatura ambiente, monito- rando por TLC ο desaparecimento do reagente (CH2CI2/MeOH = 30/1). A reagao e saturada por adigao de H2O. A fase aquosa e extraida com CH2CI2 (3x15 mL) e as fases organicas sao combinadas, secas sobre Ns^SO4, fil- tradas e concentradas sob vacuo. O residuo e purificado por cromatografia instantanea (SiO2, CH2CI2/MeOH = 45/1), pelo que, obtendo um solido ama- relo (0,014 g, 0,039 mmol, 94%).

1H NMR (CDCb, 400 MHz) δ 8.89 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.20《d, 1 H, J = 6.4 Hz, Ar), 8.00 (d, 1 H1 J= 8.4 Hz, Ar), 7.88 (t, 1 H, J= 8.4 Hz, Ar), 7.79 (s, 1 H1 Ar H-14). 7.69 (t, 1 H, J: 8.4 Hz, Ar), 5.70 (d, 1 H, J- 17.2 Hz, H-17), 5.28 (d, λ H1 J= 17.2 Hz, H-17), 3,83 (br s, 1 H, OH), 2.00-1,74 (m, 2 Hf H- 19). 1.08 (t. 3 H. J= 7.6 Hz5 We), ^c NMR (CDCI?, 100 MHz) δ 172.6, 157.4,

152.5, 150.8, 148.9, 143.7, 134.9, 132.5, 132.4, 130.0. 129.5, 128.7, 127.5,

122.6, 121.4, 101.2» 72,4, 66.0, 31,6, 7,7. Exemplo X - Ensaio de inibicao de crescimento celular

Celulas H460 de tumor pulmonar de celula grande humano fo- ram cultivadas em meio RPM卜1640 contendo 10% de soro fetal de bezerro. A sensibilidade celular foi determinada por ensaio de inibigao de crescimento celular apos 1 ou 72 horas de exposigao ao farmaco. As celulas no cresci- mento Iogaritmo foram coletadas e semeadas em duplicada em placas de 6 pogos. Vinte e quatro horas apos a semeadura, as celulas foram expostas aos farmacos e contadas com um contador Coulter, 72 horas apos a exposi- gao aos farmacos, para a determinagao dos IC50. O IC50 e definido como a inibigao de concentragao em 50% de crescimento celular, quando compara- do ao crescimento dos controles nao tratados.

Exemplo Xl - Ensaio de ruptura de DNA dependente de Topoisomerase-I

As rupturas de DNA foram determinadas usando um gel purifi- cado de 751 pares de base BamH卜EcoRI DNA SV40 (Beretta GL, Binaschi Μ, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Cancer Res. 1999; 59:3689-97). Os fragmentos de DNA fo- ram marcados apenas em 3，· A reagao de ruptura de DNA (20.000 cpm/amostra) foi realizada em 10 mL de Tris-HCI a 10 mM (pH 7,6), KCI a 150 mM, MgCI2 a 5 mM, 15 pg/mL de BSA1 tiotreitol a 0,1 mM e a enzima recombinante humana (comprimento pleno topi) por 30 minutos a 37°C. As reagoes foram bloqueadas usando SDS a 0,5% e 0,3 mg/mL de K proteinase por 45 minutos a 42°C. A persistencia de Iesao ao DNA foi testada em tem- pos diferentes adicionando-se NaCI a 0,6 M apos 30 minutos de incubagao com 10 μΜ do farmaco. Apos precipitagao, ο DNA foi ressuspenso no tam- pao de desnaturagao (80% formamida, NaOH a 10 mM, 0,01 M EDTA e 1 mg/mL de corante) antes da semeadura no gel desnaturante (poliacrilamida a 7% em tampao TBE). Todos os niveis de ruptura de DNA foram medidos por meio de um Phospholmager modelo 425 (Molecular Dynamics) (Dallaval- Ie S, Ferrari A, Biasotti B e outros, Novel 7-oxyiminomethyl camptothecin derivatives with potent in vitro and in vivo antitumor activity J. Med. Chem. 2001; 44:3264-74).

Persistencia do DNA a Iesao (%)

Compostos tempo (minutos) 0 1 5 10 topotecano 100 65 20 10 camptoteci 门 a 100 58 23 20 SN38 100 60 33 28 IDN 6132 100 45 32 20

Claims

1 · Compostos da formula geral (I): <formula>formula see original document page 16</formula> em que: R e alquila, aminoalquila, hidroxialquila, nitrila, alcoximino, arilo- ximino, sililalquila; R1 e hidrogenio, hidroxi, alcoxi, aminoalquila; R2 e hidrogenio, hidroxi, alcoxi, aminoalquila, hidroxila opcio- nalmente protegida; em que os grupos alquila, alcoxi, aminoalquila ou alcoximino po- dem conter 1 a 8, preferivelmente 1 a 4 atomos de carbono em uma cadeia linear ou ramificada, considerando-se que ο grupo ariloximino pode conter 5 a 10 atomos de carbono; os sais farmaceuticamente aceitaveis, isomeros, enantiomeros, diastereomeros dos mesmos e misturas correspondentes.

2. Composto da formula (I) de acordo com a reivindicagao 1, que e selecionado do grupo consistindo em: a) 4,5-diidro-triazol[5,4-c]16a-desoxocamptotecina, b) triazol[5,4-c]16a-desoxocamptotecina.

3. Processo para preparagao dos compostos da formula (I), ο processo compreendendo substancialmente as eta pas (a)-(e) mostradas no esquema que se segue: <formula>formula see original document page 17</formula> em que: a) protegao dos grupos hidr0xi precursores; b) derivatizagao em 5 com hidrazina N,N-diprotegida; c) conversao opcional do anel piridiona no anel tiopiridona d) remogao dos grupos protetores com ciclizagao concomitante, e) aromatizagao opcional do anel pirazole e onde R, R1 e R2 possuem os significados descritos acima, enquanto PG e um grupo de protegao hidroxi.

4. Processo para preparagao dos compostos da formula (I), de acordo com a reivindicagao 3，em que a ordem das etapas (b) e (c) e inverti- da.

5. Composigao farmaceutica contendo um composto da formula (I) em conjunto com os veiculos e excipientes farmaceuticamente aceitaveis.

6. Composigao farmaceutica de acordo com a reivindicagao 5, que esta na forma apropriada para administragao oral ou parenteral.

7. Uso de um composto como definido nas reivindicagoes 1-2 ou de uma composigao como definido nas reivindicagoes 5-6 para preparagao de um farmaco para tratamento de tumores.

8. Uso de acordo com a reivindicagao 7, onde ο dito farmaco e usado para tratamento de tumores solidos e leucemias, especificamente tu- mores de pulmao, ovario, mama, estomago, figado, prostata, sarcomas de tecidos moles, esofago, pancreas, cabepa e pescogo, glioblastoma, leucemi- as mielociticas cronicas e agudas.