BRPI0714875A2 - meios para inibir a expressço da proteÍna cinase 3 - Google Patents

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Joerg Kaufmann
Oliver Keil
Ansgar Santel
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Silence Therapeutics Ag
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Abstract

MEIOS PARA INIBIR A EXPRESSçO DA PROTEÍNA CINASE 3. A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma estrutura bifilamentar, por meio do qual a estrutura bifilamentar compreende um primeiro filamento compreende uma primeira extensão de nucleotídeos contíguos e a dita primeira extensão é pelo menos parcialmente complementar a um ácido nucléico alvo, e por meio do qual o segundo filamento compreende uma segunda extensão de nucleotídeos contíguos e a dita segunda extensão é pelo menos parcialmente complementar à primeira extensão, por meio do qual a primeira extensão compreende uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de núcleo de nucleotídeo da sequência de ácido nucléico de acordo com a SEQ. ID. No. 1 (NM_013355), ou parte da mesma por meio do qual a sequência de núcleo de nucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 482 a 500 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 2); das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 4); das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 6); das psoições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 8); das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 12); das posições de nucleotídeo 2102 a 2120 da SEQ. ID. No. 1 )SEQ. ID. No. 14); das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 16); das posições de nucleotídeo 2761 a 2779 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 18) das posições de nucleotídeo 2763 a 2781 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 20); das posições de nucleotídeo 2764 a 2782 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 22); das posições de nucleotídeo 2843 a 2861 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 24); das posições de nucleotídeo 2844 a 2862 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 26); ou das posições de nucleotídeo 2846 a 2864 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 28), preferivelmente a sequência de núcleo de nucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 4); das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 6); das posições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 8); das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 10); das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 12); ou das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 16), por meio do qual preferivelmente a primeira extensão é adicionalmente pelo menos parcialmente complementar a uma região precedendo a terminação 5<39> da sequência de núcleo de nucleotídeo e/ou a uma região seguindo a terminação 3<39> da sequência de núcleo de nucleotídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIOS PARA INIBIR A EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CINASE 3".
A presente invenção refere-se a um ácido nucléico bifilamentar adequado para inibir a expressão de proteína cinase 3 (PKN 3) e uso do mesmo.
Oncogênese foi descrita por Foulds (Foulds, 1958) como um processo biológico de multietapa que é presentemente conhecido ocorrer pela acumulação de dano genético. Em um nível molecular, o processo de tumorigênese de multietapa envolve o rompimento de ambos efetores regu- Iadores positivos e negativos (Weinberg, 1989). A base molecular para car- cinomas de cólon humano foi postulada, por Vogelstein e coparticipantes (Fearon e Vogelstein, 1990), envolver vários oncogenes, genes supressores de tumor e genes de reparo. Similarmente, os defeitos que conduzem ao desenvolvimento de retinoblastoma foram ligados a outro gene supressor de tumor (Lee et al., 1987). Ainda outros oncogenes e supressores de tumor foram identificados em uma variedade de outras malignidades. Infelizmente, resta um número inadequado de cânceres tratáveis, e os efeitos do câncer são catastróficos - acima de meio milhão de mortes por ano somente nos Estados Unidos.
Câncer é fundamentalmente uma doença genética em que o da-
no para DNA celular leva ao rompimento dos mecanismos normais que con- trolam a proliferação celular. Dois dos mecanismos de ação pelos quais os supressores de tumor mantêm integridade genômica são através de apreen- são de célula, assim permitindo reparo de DNA danificado, ou remoção do DNA danificado através de apoptose (Ellisen e Haber, 1998). Apoptose, do contrário chamada "morte celular programada", é uma rede cuidadosamente regulada de eventos bioquímicos que atuam como um programa suicida ce- lular visado para remover células irreversivelmente danificadas. Apoptose pode ser desencadeada de vários modos incluindo ligação de fator de ne- crose tumoral, dano de DNA, privação de fatores de crescimento, e reticula- ção de anticorpo dos receptores de Fas. Embora vários genes tenham sido identificados que desempenham um papel no processo apoptótico, as vias que conduzem à apoptose não foram completamente elucidadas. Muitos investigadores tentaram identificar genes promotores de apoptose novos com o objetivo que tais genes forneceriam um meio para induzir apoptose seletivamente em células neoplásticas para tratar câncer em um paciente.
Uma abordagem alternativo para tratar câncer envolve a supressão de angi- ogênese com um agente tal como Endostatin™ ou anticorpos de antiVEGF. Nesta abordagem, o objetivo é impedir mais vascularização do tumor primá- rio e potencialmente restringir o tamanho das lesões metastáticas às quais pode suportar sobrevivência das células neoplásticas sem crescimento vas- cular substancial.
Um grupo particular de doenças oncológicas são aquelas doen- ças oncológicas que são agressivas em termos de taxa de crescimento do tumor, invasão em tecido normal, resistência à quimioterapia ou outros tra- tamentos convencionais e a formação de metástase ao longo do corpo. No caso de câncer mais agressivo, o tecido de câncer é mais diferente do tecido normal e o tumor é provavelmente espalhado. Portanto, um objetivo na in- vestigação atual de câncer é desenvolver agentes que estão inibindo o cres- cimento do tumor e/ou reduzindo a propagação das células cancerosas ao longo do corpo.
Definições para o que é uma doença oncológica agressiva po-
dem ser obtidas da página inicial do National Câncer Institute que é http://www.câncer.gov/Templates/db_alpha.aspx?CdrlD=46053. Também, para a descrição da agressividade de uma doença oncológica, tipicamente graduação é usada que é um sistema para classificar células de câncer em termos de quão anormais elas parecem quando examinadas sob um micros- cópio. O objetivo de um sistema de graduação é fornecer informação acerca da taxa de crescimento provável do tumor e sua tendência para espalha-se. Os sistemas usados para graduar tumores variam com cada tipo de câncer. Graduação representa um papel nas decisões do tratamento. Tais sistemas de graduação são conhecidos aos versados na
técnica. Um deles é a contagem de Gleason que é um sistema de graduar tecido de câncer de próstata com base em como se parece sob um micros- cópio. Contagens de Gleason variam de 2 a 10 e indicam o quanto prova- velmente é que um tumor espalhará. Uma contagem de Gleason baixa signi- fica que o tecido de câncer é similar ao tecido de próstata normal e o tumor é menos provável de espalhar-se; uma contagem de Gleason alta significa o tecido de câncer é muito diferente de normal e o tumor é mais provável de espalhar-se.
PKN3, que é também referida como proteína cinase N beta ou PKN beta, é um valioso alvo com relação a câncer e tumores. Como descrito no pedido de patente internacional WO 2004/019973 proteína cinase N beta é um alvo a jusante da via de PI-3 cinase/PTEN que está ligada à tumorigê- nese e metástase. Particularmente o último efeito parece ser relacionado fortemente à perda da função supressora, mais particularmente função su- pressora de tumor de PTEN. Como é mostrado em WO 2004/019973, a pro- teína cinase N beta será suprarregulada sob condições onde PTEN, que é um inibidor da via de PI-3 cinase, não estiver ativo. Devido à suprarregula- ção da proteína cinase N beta as células onde tal suprarregulação ocorre mostrarão um aumento no comportamento metastático e comportamento migracional. Isto significa que um inibidor da proteína cinase N beta é um meio adequado para controlar comportamento metastático e migracional das células e este é um meio adequado para o tratamento de tumores e cânce- res, mais particularmente aqueles tumores e cânceres que são metastáticos e as células destes mostram um comportamento metastático e/ou migracio- nal.
Há uma necessidade contínua na técnica por meios para o tra- tamento de doenças neoplásticas. Mais especificamente há uma necessida- de por um meio adequado para aquelas doenças neoplásticas que são a- gressivas e que mostram comportamento invasivo.
Há também uma necessidade por um meio adequado para afe- tar angiogênese, mais especificamente angiogênese envolvida no mecanis- mo patológico dando suporte a uma doença neoplástica. Estas necessida- des definem o problema inerente à presente invenção.
O problema inerente à presente invenção é solucionado pelo assunto das reivindicações independentes anexadas. Modalidades preferi- das podem ser tiradas das reivindicações dependentes.
O problema inerente à presente invenção é solucionado por uma molécula de ácido nucléico bifilamentar, - por meio do qual a estrutura bifilamentar compreende um pri-
meiro filamento e um segundo filamento,
- por meio do qual o primeiro filamento compreende uma primei- ra extensão de nucleotídeos contíguos e a dita primeira extensão é pelo me- nos parcialmente complementar a um ácido nucléico alvo, e - por meio do qual o segundo filamento compreende uma se-
gunda extensão de nucleotídeos contíguos e a dita segunda extensão é pelo menos parcialmente complementar à primeira extensão, e
por meio do qual o ácido nucléico alvo é um mRNA que codifica
para PKN3.
Mais especificamente, o problema inerente à presente invenção
é solucionado em um primeiro aspecto por uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma estrutura bifilamentar,
por meio do qual a estrutura bifilamentar compreende um primei- ro filamento e um segundo filamento, por meio do qual o primeiro filamento compreende uma primeira
extensão de nucleotídeos contíguos e a dita primeira extensão é pelo menos parcialmente complementar a um ácido nucléico alvo, e
por meio do qual o segundo filamento compreende uma segunda extensão de nucleotídeos contíguos e a dita segunda extensão é pelo me- nos parcialmente complementar à primeira extensão,
por meio do qual a primeira extensão compreende uma seqüên- cia de ácido nucléico que é pelo menos parcialmente complementar a uma seqüência de núcleo de nucleotídeo da seqüência de ácido nucléico de a- cordo com a SEQ. ID. No. 1 (NM_013355) ou parte da mesma, por meio do qual a seqüência de núcleo de nucleotídeo compre-
ende a seqüência de nucleotídeo
das posições de nucleotídeo 482 a 500 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 2);
das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 4);
das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 6);
das posições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 8);
das posições de nucleotídeo 1566 a 1584 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 10);
das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 12);
das posições de nucleotídeo 2102 a 2120 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 14);
das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 16);
das posições de nucleotídeo 2761 a 2779 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 18);
das posições de nucleotídeo 2763 a 2781 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 20);
das posições de nucleotídeo 2764 a 2782 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 22);
das posições de nucleotídeo 2843 a 2861 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 24);
das posições de nucleotídeo 2844 a 2862 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 26); ou
das posições de nucleotídeo 2846 a 2864 da SEQ. ID. No.
(SEQ. ID. No. 28),
preferivelmente a seqüência de núcleo de nucleotídeo compre- ende a seqüência de nucleotídeo
das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No. 1
(SEQ. ID. No. 4);
das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 6);
das posições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 8);
das posições de nucleotídeo 1566 a 1584 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 10);
das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 12); ou
das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 16),
por meio do qual preferivelmente a primeira extensão é adicio-
nalmente pelo menos parcialmente complementar a uma região precedendo a terminação 5' da seqüência de núcleo de nucleotídeo e/ou a uma região seguindo a terminação 3' da seqüência de núcleo de nucleotídeo.
Em uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, a primeira extensão do ácido nucléico é complementar à seqüência de nú- cleo de nucleotídeo ou uma parte da mesma.
Em uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, a primeira extensão do ácido nucléico é adicionalmente complementar à re- gião seguindo a terminação 3' da seqüência de núcleo de nucleotídeo e/ou à região precedendo a terminação 5' da seqüência de núcleo de nucleotídeo.
Em uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, a primeira extensão do ácido nucléico é complementar ao ácido nucléico alvo em 18 a 29 nucleotídeos, preferivelmente 19 a 25 nucleotídeos e mais preferivelmente 19 a 23 nucleotídeos. Em uma modalidade preferida do primeiro aspecto da presente
invenção, os nucleotídeos do ácido nucléico são nucleotídeos sucessivos.
Em uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, a primeira extensão e/ou a segunda extensão do ácido nucléico compreen- de(m) de 18 a 29 nucleotídeos sucessivos, preferivelmente 19 a 25 nucleotí- deos sucessivos e mais preferivelmente 19 a 23 nucleotídeos sucessivos.
Em uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, o primeiro filamento do ácido nucléico consiste na primeira extensão e/ou o segundo filamento do ácido nucléico consiste na segunda extensão.
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um segundo aspecto por uma molécula de ácido nucléico, preferivelmente uma molécula de ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto, compreen- dendo uma estrutura bifilamentar, por meio do qual a estrutura bifilamentar é formada por um primeiro filamento e um segundo filamento, por meio do qual o primeiro filamento compreende uma primeira extensão de nucleotídeos contíguos e o segundo filamento compreende uma segunda extensão de nucleotídeos contíguos e por meio do qual a dita primeira extensão é pelo
menos parcialmente complementar à dita segunda extensão, por meio do qual
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 3 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 2;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 5 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 4;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 7 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 6;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 9 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 8;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 11 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 10;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 13 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 12;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 15 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 14; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 17 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 16;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 19 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 18;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 21 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 20;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 23 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 22;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 25 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 24;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 27 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 26; ou
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 29 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 28;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 31 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 30;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 33 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 32;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 35 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 34;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 37 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 36;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 39 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 38;
preferivelmente
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 5 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 4;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 7 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 6;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 9 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 8;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo
de acordo com a SEQ. ID. No. 11 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 10;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 13 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 12;
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 17 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 16, ou
- a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 31 e a segunda extensão consiste em uma
seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 30;
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, a primeira extensão e/ou a segunda extensão da molécula de ácido nucléico compreende(m) uma pluralidade de grupos de nucleotí- deos modificados tendo uma modificação na posição 2' que forma um pa- drão posicionai regular, preferivelmente alternado, por meio do qual dentro da extensão cada grupo de nucleotídeos modificados é flanqueado em um ou ambos os lados por um grupo de flanqueamento de nucleotídeos, por meio do qual o(s) nucleotídeo(s) de flanqueamento) formando o grupo de flanqueamento de nucleotídeos é/são um nucleotídeo inalterado ou um nu- cleotídeo tendo uma modificação diferente da modificação dos nucleotídeos modificados.
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, a primeira extensão do ácido nucléico e/ou a segunda ex- tensão do ácido nucléico compreende(m) um padrão de grupos de nucleotí- deos modificados e/ou um padrão de grupos de flanqueamento de nucleotí- deos.
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, a primeira extensão do ácido nucléico e/ou a segunda ex- tensão do ácido nucléico compreende(m) na terminação 3' um dinucleotídeo, por meio do qual tal dinucleotídeo é preferivelmente TT. Em uma modalidade preferida do primeiro e do segundo aspecto
da presente invenção, o comprimento da primeira extensão do ácido nucléi- co e/ou da segunda extensão do ácido nucléico consiste em 19 a 21 nucleo- tídeos.
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, a primeira e/ou a segunda extensão do ácido nucléico com- preende(m) uma protuberância de 1 a 5 nucleotídeos na terminação 3'.
Em uma modalidade preferida do primeiro e do segundo aspecto da presente invenção, o comprimento da estrutura bifilamentar do ácido nu- cléico é de cerca de 16 a 24 pares de nucleotídeo, preferivelmente 20 a 22 pares de nucleotídeo.
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, o primeiro filamento do ácido nucléico e o segundo filamento do ácido nucléico são covaIentemente ligados um ao outro, preferivelmente a terminação 3' do primeiro filamento é covalentemente ligada na terminação 5' do segundo filamento.
Em uma modalidade do primeiro e do segundo aspecto da pre- sente invenção, a molécula do ácido nucléico consiste em cada um dos dois filamentos a seguir e por meio do qual os nucleotídeos sublinhados são 2'-0- metila:
PKN3 (1): agcugaagaucaaggaggg (SEQ. ID. No. 2) çcçuçcuugaucuuçagcu (SEQ. ID. No. 3) PKN3 (2): cuugaggacuuçcuggaça (SEQ. ID. No. 4) ugucçaggaaguçcucaag (SEQ. ID. No. 5) PKN3 (3): uugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 6) uuguçcaggaagucçuçaa (SEQ. ID. No. 7) PKN3 (4): aggacuuçcuggaçaaugc (SEQ. ID. No. 8) gcauugucçaggaaguçcu (SEQ. ID. No. 9) PKN3 (5): cçuggacaaugccugucac (SEQ. ID. No. 10) gugaçaggçauuguçcagg (SEQ. ID. No. 11) PKN3 (6): gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12) gaçcuuçcçaaaguguçcç (SEQ. ID. No. 13) PKN3 (7): uugggaaggucçuçcuggu (SEQ. ID. No. 14) acçaggaggaçcuuçcçaa (SEQ. ID. No. 15) PKN3 (8): cucçagcçaugçcugçuuu (SEQ. ID. No. 16) aaagçaggçauggcuggag (SEQ. ID. No. 17) PKN3 (9): auuçagaagçuçcucçaga (SEQ. ID. No. 18) ucuggaggagçuucugaau (SEQ. ID. No. 19) PKN3 (10): uçagaagçuçcucçagaag (SEQ. ID. No. 20) çuucuggaggagçuucuga (SEQ. ID. No. 21) PKN3 (11): cagaagcucçuçcagaagu (SEQ. ID. No. 22) acuuçuggaggagcuuçug (SEQ. ID. No. 23) PKN3 (12): uçuucaggaçcacçaacug (SEQ. ID. No. 24) çaguugguggucçugaaga (SEQ. ID. No. 25) PKN3 (13): cuuçaggacçaçcaacugg (SEQ. ID. No. 26) çcaguuggugguçcugaag (SEQ. ID. No. 27) PKN3 (14): uçaggacçaçcaaçuggça (SEQ. ID. No. 28) ugçcaguuggugguçcuga (SEQ. ID. No. 29) PKN3-23-V1: uuguçcaggaagucçuçaagucu (SEQ. ID. No. 31) agaçuugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 30) PKN3-23-V2:
15
PKN3-23-V3:
PKN3-23-V4:
PKN3-23-V5:
ggçauuguçcaggaagucçuçaa (SEQ. ID. No. 33)
uugaggaçuucçuggacaaugçc (SEQ. ID. No. 32)
auugucçaggaaguçcucaaguç (SEQ. ID. No. 35)
gacuugaggacuuçcuggaçaau (SEQ. ID. No. 34)
çauuguçcaggaagucçuçaagu (SEQ. ID. No. 37)
açuugaggaçuuccuggacaaug (SEQ. ID. No. 36)
gcauugucçaggaaguçcucaag (SEQ. ID. No. 39)
cuugaggacuuçcuggaçaaugc (SEQ. ID. No. 38)
preferivelmente
PKN3 (2): cuugaggacuuçcuggaça (SEQ. ID. No. 4)
ugucçaggaaguçcucaag (SEQ. ID. No. 5)
uugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 6)
uuguçcaggaagucçuçaa (SEQ. ID. No. 7)
aggacuuçcuggaçaaugc (SEQ. ID. No. 8)
gcauugucçaggaaguçcu (SEQ. ID. No. 9)
cçuggacaaugccugucac (SEQ. ID. No. 10)
gugaçaggçauuguçcagg (SEQ. ID. No. 11)
gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12)
gaçcuuçcçaaaguguçcç (SEQ. ID. No. 13)
PKN3 (8): cucçagcçaugçcugçuuu (SEQ. ID. No. 16)
aaagçaggçauggcuggag (SEQ. ID. No. 17)
uuguçcaggaagucçuçaagucu (SEQ. ID. No. 31)
agaçuugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 30)
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um terceiro aspecto por uma formulação Iipossomal compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro ou o segundo aspecto.
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um quarto aspecto por um Iipoplex compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro ou o segundo aspecto, e um lipossoma. Em uma modalidade preferida do quarto aspecto da presente
invenção, o lipossoma do Iipoplex consiste em
a) cerca de 50 % em mol tri-hidrocloreto de (p-arginil-2,3-ácido
PKN3 (3): PKN3 (4): PKN3 (5): PKN3 (6): PKN3 (8): PKN3-23-V1: diaminopropiônico-N-palmitil-N-oleil-amida, preferivelmente tri-cloridrato de A/-palmitil-A/-oleil-amida de ácido (p-(L-arginil)-2,3-L-diaminopropiônico);
b) cerca de 48 a 49 % em mol 1,2-difitanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPhyPE); e c) cerca de 1 a 2 % em mol de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-
fosfoetanolamina-polietilen-glicol, preferivelmente sal de sódio de N- (Carbonil-metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina.
Em uma modalidade mais preferida do quarto aspecto da pre- sente invenção, o potencial zeta do Iipoplex é cerca de 35 a 60 mV, preferi- velmente cerca de 45 a 50 mV.
Em uma modalidade do quarto aspecto da presente invenção, o Iipoplex tem um tamanho de cerca de 50 a 400 nm, preferivelmente de cerca de 100 a 140 nm, e mais preferivelmente de cerca de 110 nm para 130 nm, como determinado por QELS.
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um quinto aspecto por um vetor, preferivelmente um vetor de expressão, com- preendendo ou codificando para um ácido nucléico de acordo com o primeiro e o segundo aspecto. O problema inerente à presente invenção é solucionado em um
sexto aspecto por uma célula compreendendo um ácido nucléico de acordo com quaisquer dos aspectos precedentes ou vetor de acordo com quaisquer dos aspectos precedentes.
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um sétimo aspecto por uma composição, preferivelmente uma composição far- macêutica, compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro ou o segundo aspecto, uma formulação Iipossomal de acordo com o terceiro aspecto, um Iipoplex de acordo com o quarto aspecto, um vetor de acordo com o quinto aspecto e/ou uma célula de acordo com o sexto aspecto. Em uma modalidade preferida do sétimo aspecto da presente
invenção, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo também opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade mais preferida do sétimo aspecto da pre- sente invenção, a composição é uma composição farmacêutica e a dita composição farmacêutica é para o tratamento de uma doença dependente de angiogênese, preferivelmente umas doenças caracterizadas ou causadas por angiogênese insuficiente, anormal ou excessiva.
Em uma modalidade mais preferida do sétimo aspecto da pre- sente invenção, a angiogênese da composição é angiogênese de tecido adi- poso, pele, coração, olho, pulmão, intestinos, órgãos reprodutivos, osso e juntas.
Em uma modalidade do sétimo aspecto da presente invenção, a
doença é selecionada do grupo que compreende doenças infecciosas, dis- túrbios autoimunes, malformação vascular, aterosclerose, arteriopatia de transplante, obesidade, psoríase, verrugas, dermatite alérgica, síndrome ví- trea hiperplástica persistente, retinopatia diabética, retinopatia da pré- maturidade, doença macular relacionada à idade, neovascularização coroi- dal, hipertensão pulmonar primária, asma, pólipos nasais, doença inflamató- ria do intestino e peridental, ascites, adesões peritoneal, endometriose, he- morragia uterina, cistos ovarianos, ovariano, hiperestimulação ovariana, artri- te, sinovite, osteomielite, formação de osteófitos. Em uma modalidade do sétimo aspecto da presente invenção, a
composição farmacêutica é para o tratamento de uma doença neoplástica, preferivelmente uma doença oncológica, e mais preferivelmente um tumor sólido.
Em uma modalidade do sétimo aspecto da presente invenção a composição farmacêutica é para o tratamento de uma doença selecionada do grupo que compreende câncer de osso, câncer de mama, câncer de próstata, câncer do sistema digestivo, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer pulmonar, câncer de rim, câncer urogenital, câncer pancreático, cân- cer pituitário, câncer testicular, câncer orbital, câncer de cabeça e pescoço, câncer do sistema nervoso central e câncer do sistema respiratório.
O problema inerente à presente invenção é solucionado em um oitavo aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro ou o segundo aspecto, de uma formulação Iipossomal de acordo com o terceiro aspecto, de um Iipoplex de acordo com o quarto aspecto, de um vetor de acordo com o quinto aspecto e/ou uma célula de acordo com o sexto aspec- to para a fabricação de um medicamento.
O medicamento é usado para o tratamento de quaisquer das
doenças como definidas em uma modalidade do oitavo aspecto da presente invenção com relação ao sétimo aspecto da presente invenção.
Em uma modalidade preferida do oitavo aspecto da presente invenção, o medicamento é usado em combinação com uma ou várias ou- tras terapias.
Em uma modalidade mais preferida do oitavo aspecto da pre- sente invenção, a terapia é selecionada do grupo que compreende quimiote- rapia, crioterapia, hipertermia, terapia de anticorpo, terapia de radiação e terapia de antiangiogênese. Em uma modalidade mais preferida do oitavo aspecto da pre-
sente invenção, a terapia é terapia de anticorpo e mais preferivelmente uma terapia de anticorpo usando um anticorpo anti-VEGF (tal como, por exemplo, o fornecido por Genentech-Roche e comercializado sob o nome Avastin) ou anticorpo antiangiopoetina. Em uma modalidade do oitavo aspecto da presente invenção, a
terapia antiangiogênese usa um inibidor de receptor de cinase, preferivel- mente um inibidor de receptor de tirosina cinase, por meio do qual tal recep- tor é selecionado do grupo que compreende receptor de VEGF, receptor de PDGF, Tie-2, FGFR e EGFR. Exemplos para tal tipo de inibidor são Sorafe- nib (Bayer) alvejando VEGF-R e PDGF-R, e o anticorpo Erbitux (Merck/serono) alvejando EGFR. Ambos os medicamentos são considerados como modalidades antiangiogênicas.
Em uma modalidade preferida do oitavo aspecto da presente invenção, o inibidor é selecionado do grupo que compreende siRNA, molé- cuias antissentido, aptâmeros, espiegelmeros, peptídeos de ligação de afini- dade alta, aptâmeros de peptídeo, anticalinas e anticorpos.
Em uma modalidade preferida do oitavo aspecto, o medicamento é usado em combinação com uma ou várias outras terapias, preferivelmente terapias antitumor ou anticâncer.
Em uma modalidade mais preferida do oitavo aspecto, a terapia é selecionada do grupo que compreende quimioterapia, crioterapia, hiper- termia, terapia de anticorpo e terapia de radiação.
Em uma modalidade até mesmo mais preferida do oitavo aspec- to, a terapia é uma terapia antiagiogênica e mais preferivelmente uma tera- pia de anticorpo usando um anticorpo anti-VEGF ou antiangiopoetina.
Em uma outra modalidade preferida dos vários aspectos da pre- sente invenção, o mRNA é um mRNA humano de PKN3. Em uma modalida- de até mesmo mais preferida o ácido nucléico alvo é um mRNA tendo uma seqüência de ácido nucléico de acordo com a SEQ. ID. No. 1.
Como será delineado em mais detalhe aqui, as moléculas de ácido nucléico e o medicamento e formulação, respectivamente, contendo a mesma, são particularmente adequados para inibir, ou impedir ou tratar cân- cer invasivo, câncer agressivo e malignidades.
Como preferivelmente aqui usado, um câncer invasivo é um câncer que espalhou além da camada do tecido em que se desenvolveu e está crescendo em tecidos circunvizinhos, saudáveis. Também chamado câncer infiltrante.
Como preferivelmente aqui usado, um câncer agressivo é um câncer de crescimento rápido.
Como preferivelmente aqui usado, uma malignidade é um tumor canceroso que pode invadir e destruir o tecido perto e pode espalhar-se para outras partes do corpo.
Será reconhecido pelos versados na técnica que pode haver uma ou várias alterações de nucleotídeo simples no mRNA em vários indiví- duos ou grupos de indivíduos, preferivelmente em uma população, compa- rado ao mRNA tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ. ID. No. 1. Tal mRNA tendo uma ou várias alterações de nucleotídeo simples comparado ao mRNA tendo uma seqüência de ácido nucléico da SEQ. ID. No. 1 deve também ser compreendido pelo termo ácido nucléico alvo como preferível- mente aqui usado. Em ainda uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico de acordo com os vários aspectos da invenção é adequada para inibir a expressão de PKN3 e o mRNA que codifica a mesma. Mais preferi- velmente tal expressão é inibida por um mecanismo que é referido como gene de RNA interferente ou de silenciamento pós-transcricional. A molécula de siRNA e molécula de RNAi respectivamente, de acordo com a presente invenção, é desse modo adequada para desencadear a resposta de RNA interferente que resulta preferivelmente no silenciamento do mRNA para a molécula-alvo. Até então, este tipo de molécula de ácido nucléico é adequa- da para diminuir a expressão de uma molécula-alvo diminuindo a expressão ao nível de mRNA. Será reconhecido por alguém versado na técnica que pode haver outros mRNAs que codificam para PKN3 que deve também ser abrangido pelo presente pedido de patente. Mais especificamente, as posi- ções de nucleotídeo particulares identificadas aqui por referência à SEQ. ID. No. 1 podem ser identificadas em tais mRNAs também por alguém versado na técnica com base no ensinamento técnico fornecido aqui.
Será também reconhecido que o ácido nucléico bifilamentar de acordo com este aspecto da presente invenção pode ter quaisquer dos pro- jetos descritos aqui para este tipo de molécula de ácido nucléico. É para ser reconhecido, além disso, que o mecanismo descrito acima é, em uma outra modalidade preferida aplicável aos ácidos nucléicos revelados aqui com re- lação aos vários aspectos e princípios de projeto também referidos aqui co- mo subaspectos.
Interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento de gene pós-transcricional sequência-específico em animais mediada por RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Fire et al., 1998). O processo correspon- dente em plantas é comumente referido como silenciamento de gene pós- transcricional ou silenciamento de RNA e é também referido como suprimin- do fungos. O processo de silenciamento de gene pós-transcricional é julgado ser um mecanismo de defesa celular evolucionariamente conservado usado para impedir a expressão de genes estranhos que são compartilhados co- mumente pela flora e fila diversas (Fire, 1998 #263). Tal proteção de expres- são de gene estranho pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs bifilamentares (dsRNAs) derivados de infecção viral ou a integração aleatória de elementos de transpóson em um genoma hospedeiro por meio de uma resposta celular que especificamente destrói RNA unifilamentar homólogo ou RNA genômico viral. A presença de dsRNA nas células desencadeia a res- posta de RNAi1 entretanto um mecanismo tendo que ainda ser completa- mente caracterizado. Este mecanismo que também existe em células ani- mais e em particular também em células mamíferas, parece ser diferente da resposta de interferona que é o resultado da ativação mediada por dsRNA da PKR de proteína cinase e 2', 5-oligoadenilato sintetase resultando na clivagem não-específica do mRNA por ribonuclease L.
O projeto básico das moléculas de siRNA ou moléculas de RNAi1 que principalmente diferem no tamanho, é basicamente de modo que a mo- lécula de ácido nucléico compreende uma estrutura bifilamentar. A estrutura bifilamentar compreende um primeiro filamento e um segundo filamento. Mais preferivelmente, o primeiro filamento compreende uma primeira exten- são de nucleotídeos contíguos e a segunda extensão compreende uma se- gunda extensão de nucleotídeos contíguos. Pelo menos a primeira extensão e a segunda extensão são essencialmente complementares uma à outra. Tal complementaridade é tipicamente com base em pareamento de base de Watson-Crick ou outro mecanismo de pareamento de base conhecido ao versado na técnica, incluindo mas não limitado a pareamento de base de Hoogsteen e similares. Será reconhecido por alguém versado na técnica que, dependendo do comprimento de tal estrutura bifilamentar, um parea- mento perfeito em termos de complementaridade de base não é necessari- amente requerido. Porém, tal complementaridade perfeita é preferida em algumas modalidades. Em uma modalidade particularmente preferida, a complementaridade e/ou identidade é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Em uma modalidade particularmente preferida alternativa, a comple- mentaridade e/ou identidade é de modo que o complemento e/ou molécula de ácido nucléico idêntica hibrida com um dos filamentos da molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, mais preferivelmente com uma das duas extensões sob as condições a seguir: é capaz de hibridar com uma porção da transcrição de gene alvo sob as condições a seguir: 400 mM NaCI1 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, hibridização a 50°C ou 70°C por 12-16 horas, seguido por lavagem. As respectivas condições de rea- ções são, entre outras, descritas na patente européia EP 1 230 375.
Uma disparidade é também tolerável, principalmente sob a con- dição que a estrutura bifilamentar ainda é adequada para desencadear o mecanismo de RNA interferente, e que preferivelmente tal estrutura bifila- mentar ainda está estavelmente formando-se sob condições fisiológicas en- quanto prevalecendo em uma célula, tecido e organismo, respectivamente, contendo ou, em princípio, contendo tal célula, tecido e órgão. Mais preferi- velmente, a estrutura bifilamentar é estável a 37°C em um tampão fisiológi- co. Será reconhecido pelos versados na técnica que este tipo de disparidade pode preferivelmente ser contida em uma posição dentro da molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção diferente da região de núcleo.
Como preferivelmente aqui usado, o termo que uma molécula de ácido nucléico ou uma extensão ou parte da mesma é parcialmente com- plementar a uma molécula de ácido nucléico alvo preferivelmente significa que se tal ácido nucléico alvo for direta ou indiretamente alvejado por um ácido nucléico de RNA interferente (mediação) a complementaridade entre o ácido nucléico alvo e o dito ácido nucléico, extensão ou parte do mesmo, ou a estrutura bifilamentar formada por causa de tal complementaridade, é ca- paz de desencadear RNA interferente. Será entendido que tal requerimento de complementaridade não é restringido ao mecanismo de RNA interferente mas qualquer mecanismo que resulte na infrarregulação ou diminuição na atividade de uma molécula tal como um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico alvo. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico que é par- cialmente complementar à outra molécula de ácido nucléico compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 disparidades no pareamento de base de ambas as moléculas de ácido nucléico. Mais preferivelmente a molécula de ácido nucléico bifilamen- tar desse modo formada compreende 19 a 25 pares de base. A primeira extensão é tipicamente pelo menos parcialmente complementar ou pelo menos parcialmente idêntica a um ácido nucléico alvo e a segunda extensão é, particularmente dada a relação entre a primeira e segunda extensão, respectivamente, em termos de complementaridade de base, pelo menos parcialmente idêntica ou pelo menos parcialmente com- plementar ao ácido nucléico alvo. O ácido nucléico alvo é preferivelmente um mRNA, embora outras formas de RNA tais como hnRNAs são também adequadas para o propósito da molécula de ácido nucléico como revelado aqui. Como preferivelmente aqui usado o alvo é PKN3 e o ácido nucléico alvo é mais preferivelmente DNA ou RNA que codificam para PKN3, ou uma parte dos mesmos contanto que tal parte preferivelmente ainda tenha pelo menos a característica do PKN3 de comprimento total para agir como uma cinase.
Embora a RNA interferente possa ser observada em usar molé- cuias de ácido nucléico longas compreendendo várias dúzias e às vezes até mesmo várias centenas de nucleotídeos e pares de nucleotídeo, respecti- vamente, as moléculas de RNAi mais curtas são em geral preferidas. Uma faixa mais preferida para o comprimento da primeira extensão e/ou segunda extensão é de cerca de 18 a 29 nucleotídeos sucessivos, preferivelmente 19 a 25 nucleotídeos sucessivos e mais preferivelmente 19 a 23 nucleotídeos sucessivos. Mais preferivelmente, a primeira extensão e a segunda extensão têm o mesmo comprimento. Em uma outra modalidade, a estrutura bifila- mentar compreende preferivelmente entre 16 e 29, preferivelmente 18 a 25, mais preferivelmente 19 a 23 e o mais preferivelmente 19 a 21 pares de ba- se.
Embora de acordo com a presente invenção, em princípio, qual- quer parte do mRNA que codifica para PKN3 possa ser usada para o projeto de tal molécula de siRNA e molécula de RNAi, respectivamente, os invento- res presentes descobriram surpreendentemente que as seqüências iniciando com as posições de nucleotídeo 1555, 1556, 1559, 1566, 2094, 2286 do mRNA da SEQ. ID. No,. 1 tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ. ID. No. 1 são particularmente adequadas para ser tratadas por molécula(s) de medi- ação de RNA interferente.
Mais especificamente, os inventores presentes descobriram sur- preendentemente que embora estas seqüência e pontos de partida sejam seqüência alvo particularmente preferida para a inibição da expressão de PKN3, há um núcleo de nucleotídeos na redondeza destas seqüências que são particularmente eficaz até então. Este núcleo é, em uma modalidade, uma seqüência que consiste aproximadamente dos 9 a 11 últimos nucleotí- deos das seqüências de nucleotídeo acima especificadas. Iniciando dele, o núcleo pode ser estendido de modo que uma molécula de ácido nucléico bifilamentar funcionalmente ativa é obtida, por meio do qual de preferência funcionalmente ativam meios adequados para afetar a inibição da expressão de PKN3. Para tal propósito, a segunda extensão que é essencialmente i- dêntica à parte correspondente do mRNA, isto é, a seqüência de núcleo, é desse modo prolongada por um, preferivelmente vários nucleotídeos na ter- minação 5', por meio do qual os nucleotídeos desse modo adicionados são essencialmente idênticos aos nucleotídeos presentes no ácido nucléico alvo nas posições correspondentes. Também para tal propósito, o primeiro fila- mento que é essencialmente complementar ao ácido nucléico alvo, é desse modo prolongado por um, preferivelmente vários nucleotídeos na terminação 3', por meio do qual os nucleotídeos desse modo adicionados são essenci- almente complementares aos nucleotídeos presentes no ácido nucléico alvo nas posições correspondentes, isto é, na terminação 5'.
De acordo com este princípio de projeto, as seqüências de nú- cleo de acordo com a presente invenção podem ser resumidas como segue: PKN3 (2): cuugaggacuuçcuggaça (SEQ. ID. No. 4)
ugucçaggaaguçcucaag (SEQ. ID. No. 5)
PKN3 (3): uugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 6)
uuguçcaggaagucçuçaa (SEQ. ID. No. 7)
PKN3 (4): aggacuuçcuggaçaaugc (SEQ. ID. No. 8)
gcauugucçaggaaguçcu (SEQ. ID. No. 9)
PKN3 (5): cçuggacaaugccugucac (SEQ. ID. No. 10)
gugaçaggçauuguçcagg (SEQ. ID. No. 11) 10
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ΡΚΝ3 (6): gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12)
gaçcuuçcçaaaguguçcç (SEQ. ID. No. 13)
PKN3 (8): cucçagcçaugçcugçuuu (SEQ. ID. No. 16)
aaagçaggçauggcuggag (SEQ. ID. No. 17)
Mais preferivelmente, o filamento acima de cada molécula bifi- Iamentar é, nesta representação, o filamento sentido, enquanto que o fila- mento inferior é o filamento antissentido, ambos descritos na direção 5' -> 3'. Até mesmo mais preferivelmente, no filamento sentido cada segundo nucleo- tídeo iniciando com o segundo nucleotídeo é modificado na posição 2' para preferivelmente ser um nucleotídeo modificado em 2'-0-Me e no filamento antissentido cada segundo nucleotídeo iniciando com o primeiro nucleotídeo é modificado na posição 2' para preferivelmente ser um nucleotídeo modifi- cado em 2-0-Me. Este tipo de modificação ou padrão de modificação regular ou espacial pode ser percebido em modalidades preferidas em qualquer mo- lécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção.
Em uma outra modalidade da mesma, a seqüência de núcleo é idêntica à seqüência de nucleotídeo da segunda extensão da molécula de ácido nucléico bifilamentar de acordo com a presente invenção e a primeira extensão essencialmente complementar a esta. Ainda em uma outra modali- dade preferida, o comprimento da molécula de ácido nucléico bifilamentar de acordo com a presente invenção está dentro dos limites descritos aqui com relação aos vários aspectos e subaspectos, respectivamente.
Será reconhecido pelos versados na técnica que o projeto parti- cular das moléculas de siRNA e das moléculas de RNAi, respectivamente, pode variar de acordo com os princípios de projeto atuais e futuros. Por en- quanto alguns princípios de projeto existem que serão debatidos e revelados em mais detalhe no seguinte e que serão referidos como subaspectos ou subaspectos do primeiro aspecto da molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Está dentro da presente invenção que todas as características e modalidades descritas para um subaspecto particular, isto é, projeto do ácido nucléico, são também aplicáveis a qualquer outro aspecto e subaspecto do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e desse 10
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modo formam as respectivas modalidades do mesmo.
O primeiro subaspecto refere-se ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção, por meio do qual a primeira extensão compreende uma pluralidade de grupos de nucleotídeos modificados tendo uma modifi- cação na posição 2\ por meio do qual dentro da extensão cada grupo de nucleotídeos modificados é flanqueado em um ou ambos os lados por um grupo de flanqueamento de nucleotídeos, por meio do qual o(s) nucleotí- deo(s) de flanqueamento formando o(s) grupo(s) de flanqueamento de nu- cleotídeos é/são um nucleotídeo inalterado ou um nucleotídeo tendo uma modificação diferente da modificação dos nucleotídeos modificados. Tal pro- jeto é, entre outros, descrito no pedido de patente internacional WO 2004/015107. O ácido nucléico de acordo com este aspecto é preferivelmen- te um ácido ribonucléico embora, como será delineado em algumas modali- dades, a modificação na posição 2' resulte em um nucleotídeo que como tal é, de um ponto de vista químico puro, não mais longo que um ribonucleotí- deo. Porém, está dentro da presente invenção que tal ribonucleotídeo modi- ficado deva ser considerado e tratado aqui como um ribonucleotídeo e a mo- lécula contendo tal ribonucleotídeo modificado como um ácido ribonucléico.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o pri- meiro subaspecto da presente invenção, o ácido ribonucléico é de termina- ção cega, ou em um lado ou em ambos os lados da estrutura bifilamentar. Em uma modalidade mais preferida a estrutura bifilamentar compreende ou consiste em 18 a 25, preferivelmente 18 a 23 e mais preferivelmente 19, 21 ou 23 pares de base, por meio do qual tal estrutura bifilamentar é preferivel- mente de terminação cega. Em ainda uma modalidade até mesmo mais pre- ferida, o ácido nucléico consiste na primeira extensão e na segunda exten- são apenas.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a dita primeira extensão e/ou a dita segunda extensão compreende(m) uma pluralidade de grupos de nucle- otídeos modificados. Em uma outra modalidade preferida a primeira exten- são também compreende uma pluralidade de grupos de flanqueamento de 24
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nucleotídeos. Em uma modalidade preferida uma pluralidade de grupos sig- nifica pelo menos dois grupos.
Em outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a dita segunda extensão com- preende uma pluralidade de grupos de nucleotídeos modificados. Em uma outra modalidade preferida a segunda extensão também compreende uma pluralidade de grupos de flanqueamento de nucleotídeos. Em uma modali- dade preferida, uma pluralidade de grupos significa pelo menos dois grupos.
Em uma outra modalidade preferida, a primeira e a segunda ex- tensão compreendem uma pluralidade de ambos os grupos de nucleotídeos modificados e grupos de flanqueamento de nucleotídeos. Em uma modali- dade mais preferida, a pluralidade tanto dos grupos de nucleotídeos modifi- cados como dos grupos de flanqueamento de nucleotídeos forma um pa- drão, preferivelmente um padrão regular e/ou um de repetição, ou na primei- ra extensão e/ou na segunda extensão, por meio do qual é até mesmo mais preferido que tal padrão seja formado na primeira e a segunda extensão.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, o grupo de nucleotídeos modificados e/ou o grupo de nucleotídeos de flanqueamento compreende(m) vários nucleotídeos por meio do qual o número é selecionado do grupo que compreende um nucleotídeo a 10 nucleotídeos. Com relação a qualquer fai- xa especificada aqui, é para ser entendido que cada faixa descreve qualquer número inteiro individual entre as respectivas figuras usadas para definir a faixa incluindo as ditas duas figuras definindo a dita faixa. No caso presente, o grupo desse modo compreende um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos, quatro nucleotídeos, cinco nucleotídeos, seis nucleotídeos, sete nucleotídeos, oito nucleotídeos, nove nucleotídeos e dez nucleotídeos.
Em outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, o padrão de nucleotídeos modifi- cados da dita primeira extensão é igual ao padrão de nucleotídeos modifica- dos da dita segunda extensão.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo
20 com o primeiro subaspecto da presente invenção, o padrão da dita primeira extensão alinha-se com o padrão da dita segunda extensão.
Em uma modalidade alternativa do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, o padrão da dita primeira extensão é deslocada por um ou mais nucleotídeos com relação ao padrão da segunda extensão.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o pri- meiro subaspecto da presente invenção, a modificação na posição 2' é sele- cionada do grupo que compreende amino, flúor, metóxi, alcóxi e alquila. Em outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o
primeiro subaspecto da presente invenção, a estrutura bifilamentar é de ter- minação cega.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a estrutura bifilamentar é de terminação cega em ambos os lados da estrutura bifilamentar.
Em outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a estrutura bifilamentar é de ter- minação cega no lado da estrutura bifilamentar que é definida pela termina- ção 5' do primeiro filamento e pela terminação 3' do segundo filamento. Em ainda outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com
o primeiro subaspecto da presente invenção, a estrutura bifilamentar é de terminação cega no lado da estrutura bifilamentar que está definida pela terminação 3' do primeiro filamento e pela terminação 5' do segundo filamen- to.
Em outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o
primeiro subaspecto da presente invenção, pelo menos um dos dois filamen- tos tem uma protuberância de pelo menos um nucleotídeo na terminação 5'.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a protuberância consiste em pelo menos um deoxirribonucleotídeo.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, pelo menos um dos filamentos tem uma protuberância de pelo menos um nucleotídeo na terminação 3'.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico do primeiro subas- pecto, o comprimento da estrutura bifilamentar é de cerca de 17 a 23 e mais preferivelmente 18 ou 19 bases ou pares de base.
Em outra modalidade do ácido ribonucléico do primeiro subas-
pecto, o comprimento do dito primeiro filamento e/ou o comprimento do dito segundo filamento é, independentemente um do outro, selecionado do grupo que compreende as faixas de cerca de 15 a cerca de 23 bases, 17 a 21 ba- ses e 18 ou 19 bases ou pares de base e mais preferivelmente 19, 21 ou 23 pares de base.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto da presente invenção, a complementaridade en- tre o dito primeiro filamento e o ácido nucléico alvo é perfeita.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o pri- meiro subaspecto, o duplex formado entre o primeiro filamento e o ácido nu- cléico alvo compreende pelo menos 15 nucleotídeos em que há uma dispa- ridade ou duas disparidades entre o dito filamento e o ácido nucléico alvo que formam a dita primeira estrutura bifilamentar.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o pri- meiro subaspecto, o primeiro filamento e o segundo filamento cada um com- preende pelo menos um grupo de nucleotídeos modificados e pelo menos um grupo de flanqueamento de nucleotídeos, por meio do qual cada grupo de nucleotídeos modificados compreende pelo menos um nucleotídeo e por meio do qual cada grupo de flanqueamento de nucleotídeos compreendendo pelo menos um nucleotídeo com cada grupo de nucleotídeos modificados do primeiro filamento estando alinhado com um grupo de flanqueamento de nu- cleotídeos no segundo filamento, por meio do qual o nucleotídeo de 5' mais terminal do primeiro filamento é um nucleotídeo do grupo de nucleotídeos modificados, e o nucleotídeo de 3' mais terminal do segundo filamento é um nucleotídeo do grupo de flanqueamento de nucleotídeos.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto, cada grupo de nucleotídeos modificados consis- 25
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te em um nucleotídeo simples e/ou cada grupo de flanqueamento de nucleo- tídeos consiste em um nucleotídeo simples.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro filamento, o nucleotídeo que forma o grupo de flanqueamento de nucleotídeos é um nucleotídeo inalterado que é disposto em uma direção 3' com relação o nucleotídeo que forma o grupo de nucleotídeos modificados do primeiro subaspecto, e em que no segundo filamento o nucleotídeo que forma o grupo de nucleotídeos modificados é um nucleotídeo modificado que é disposto na direção 5' com relação ao nucleotídeo que forma o grupo de flanqueamento de nucleotídeos.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com o primeiro subaspecto, o primeiro filamento compreende oito a doze, preferi- velmente nove a treze, grupos de nucleotídeos modificados, e em que o se- gundo filamento compreende sete a treze, preferivelmente oito a dez, grupos de nucleotídeos modificados.
Está dentro da presente invenção que o que foi especificado a- cima é também aplicável à primeira e segunda extensão, respectivamente. Isto é, particular verdadeiro para aquelas modalidades onde o filamento con- siste na extensão apenas.
A molécula de ácido ribonucléico, de acordo com tal primeiro subaspecto, pode ser projetada para ter um grupo 5' hidroxila livre, também referido aqui como grupo 5' OH livre, no primeiro filamento. Um grupo 5' OH livre significa que o nucleotídeo mais terminal que forma o primeiro filamento está presente e é desse modo não-modificado, particularmente não por uma modificação de terminação. Tipicamente, o grupo 5'-hidróxi terminal do se- gundo filamento, respectivamente, está também presente de uma maneira inalterada. Em uma modalidade mais preferida, também a terminação 3' do primeiro filamento e a primeira extensão, respectivamente, é inalterada tal como para apresentar um grupo OH livre que é também referido aqui como grupo 3' OH livre, por meio do qual o projeto do nucleotídeo de 5' terminal é uma de quaisquer das modalidades anteriormente descritas. Preferivelmente tal grupo OH livre está também presente na terminação 3' do segundo fila-
20 mento e segunda extensão, respectivamente. Em outras modalidades das moléculas de ácido ribonucléico como previamente descrito de acordo com a presente invenção a terminação 3' do primeiro filamento e primeira extensão, respectivamente, e/ou a terminação 3" do segundo filamento e segunda ex- tensão, respectivamente, pode(m) ter uma modificação de terminação na terminação 3'.
Como aqui usado, os termos grupo 5' OH livre e grupo 3' OH também indicam que o respectivo nucleotídeo mais terminal na terminação 5' e na terminação 3' do polinucleotídeo, respectivamente, isto é, o ácido nucléico ou os filamentos e extensões, respectivamente, que formam a es- trutura bifilamentar apresentam um grupo OH. Tal grupo OH pode originar-se ou da metade de açúcar do nucleotídeo, mais preferivelmente da posição 5' no caso do grupo 5' OH e da posição 3' no caso do grupo 3' OH, ou de um grupo fosfato ligado à metade de açúcar do respectivo nucleotídeo terminal. O grupo fosfato pode ser ligado em princípio a qualquer grupo OH da meta- de de açúcar do nucleotídeo. Preferivelmente, o grupo fosfato é ligado ao grupo 5' OH da metade de açúcar no caso do grupo 5' OH livre e/ou ao gru- po 3' OH da metade de açúcar no caso do grupo 3' OH livre que ainda forne- ce o que é referido aqui como grupo 5' ou 3' OH livre. Como aqui usado com qualquer modalidade do primeiro subas-
pecto, o termo modificação de terminação significa uma entidade química acrescentada ao nucleotídeo mais 5' ou 3' do primeiro e/ou segundo filamen- to. Exemplos para tais modificações de terminação incluem, mas não são limitadas a, abásicas invertidas (deóxi), amino, flúor, cloro, bromo, CN, CF, metóxi, imidazol, caboxilato, tioato, Ci a Cio alquila inferior, alquila inferior substituída, alcarila ou aralquila, OCF3, OCN, O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N-alquenila; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterozicloalquila; heterozi- cloalcarila; aminoalquilamino; polialquilamino ou silila substituída, como, en- tre outros, descritos nas patentes européias EP O 586 520 B1 ou EP O 618 925 B1.
Como aqui usado, alquila ou qualquer termo compreendendo "alquila" significa qualquer cadeia de átomo de carbono que compreende 1 a 12, preferivelmente 1 a 6 e mais preferivelmente 1 a 2 átomos de C.
Uma modificação de terminação também é um grupo biotina. Tal
grupo biotina pode ser preferivelmente ligado ao nucleotídeo mais 5' ou mais 3' do primeiro e/ou segundo filamento ou a ambas terminações. Em uma modalidade mais preferida o grupo biotina é acoplado a um polipeptídeo ou uma proteína. Está também dentro do escopo da presente invenção que o polipeptídeo ou proteína está ligada através de quaisquer das outras modifi- cações de terminação acima mencionadas. O polipeptídeo ou proteína po- dem conferir características adicionais às moléculas de ácido nucléico inven- tivas. Entre outros o polipeptídeo ou proteína podem atuar como um Iigante para outra molécula. Se a dita outra molécula for um receptor, a função e atividade do receptor podem ser ativadas pelo Iigante da ligação. O receptor pode mostrar uma atividade de internalização que permita uma transfecção eficaz das moléculas de ácido nucléico inventivas ligadas ao ligante. Um e- xemplo para o ligante ser acoplado à molécula de ácido nucléico inventiva é VEGF e o receptor correspondente é o receptor de VEGF.
tendo tipos diferentes de modificação(ões) de terminação são apresentadas na tabela 1 a seguir.
Tabela 1: Várias modalidades do ácido ribonucléico interferente de acordo com a presente invenção
Várias possíveis modalidades do RNAi da presente invenção
filamento / 1a extensão 2o filamento / 2a extensão
1.) terminação 5' terminação 3'
2.) terminação 5' terminação 3'
modificação de termina- modificação de terminação
OH livre OH livre OH livre
OH livre OH livre OH livre
ção
3.) terminação 5' terminação 3'
4.) terminação 5' terminação 3'
modificação de termina- ção
OH livre OH livre OH livre
modificação de terminação
OH livre OH livre
OH livre
5.) terminação 5' terminação 3'
OH livre OH livre
modificação de terminação OH livre filamento /1a extensão 2o filamento / 2a extensão
6.) terminação 5' terminação 3'
7.) terminação 5' terminação 3'
8.) terminação 5' terminação 3'
OH livre modificação de termina- ção OH livre OH livre OH livre
modificação de terminação OH livre
modificação de terminação modificação de terminação modificação de terminação modificação de termina- modificação de terminação ção
As várias modificações de terminação como descritas aqui estão preferivelmente localizadas na metade de ribose de um nucleotídeo do ácido ribonucléico. Mais particularmente, a modificação de terminação pode ser ligada ou substituir quaisquer dos grupos OH da metade de ribose, incluindo mas não limitados à posição 2ΌΗ, 3ΌΗ e 5ΌΗ, contanto que o nucleotídeo desse modo modificado seja um nucleotídeo terminal. Abásicos invertidos são nucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeo não tendo uma metade de nucleobase. Este tipo de composto é, entre outros, descrito em (Sternberger et al., 2002). Quaisquer das modificações de terminação acima mencionadas
podem ser usadas com relação às várias modalidades de RNAi descritas na tabela 1. Em conexão com isso, é para ser observado que quaisquer das formas de RNAi ou modalidades descritas aqui com o filamento sentido es- tando inativado, preferivelmente tendo uma modificação de terminação mais preferivelmente na terminação 5', é particularmente vantajoso. Isto surge da inativação do filamento sentido que corresponde ao segundo filamento dos ácidos ribonucléicos descritos aqui que poderia interferir do contrário com um RNA unifilamentar não relacionado na célula. Desse modo a expressão e mais particularmente o padrão de translação do transcriptoma de uma célula é mais especificamente influenciado. Este efeito é também referido como efeito não-alvo. Referindo à tabela 1, aquelas modalidades descritas como modalidades 7 e 8 são particularmente vantajosas no sentido acima visto que a modificação resulta em uma inativação da parte - alvo não específico - do RNAi (que é o segundo filamento) desse modo reduzindo qualquer inte- ração não específica do segundo filamento com o RNA unifilamentar em um sistema celular ou similar onde o RNAi de acordo com a presente invenção vai ser usado para silenciar os ácidos ribonucléicos específicos e proteínas, respectivamente.
Em uma outra modalidade, o ácido nucléico de acordo com o primeiro subaspecto tem uma protuberância na terminação 5' do ácido ribo- nucléico. Mais particularmente, tal protuberância pode estar em princípio presente em qualquer um ou no primeiro filamento e segundo filamento do ácido ribonucléico de acordo com a presente invenção. O comprimento da dita protuberância pode ser menos de um nucleotídeo e tão longo quanto 2 a 8 nucleotídeos, preferivelmente 2, 4, 6 ou 8 nucleotídeos. Está dentro da presente invenção que a protuberância 5' pode estar localizada no primeiro filamento e/ou no segundo filamento do ácido ribonucléico de acordo com o presente pedido de patente. O(s) nucleotídeo(s) formando a protuberância pode(m) ser um/uns desoxirribonucleotídeo(s), um/uns ribonucleotídeo(s) ou . 15 uma continuação do(s) mesmo(s).
A protuberância preferivelmente compreende pelo menos um desoxirribonucleotídeo, por meio do qual o dito um desoxirribonucleotídeo é preferivelmente o mais 5'-terminal. Está dentro da presente invenção que a terminação 3' do respectivo contrafilamento do ácido ribonucléico inventivo não tem uma protuberância, mais preferivelmente não uma protuberância de desoxirribonucleotídeo. Aqui novamente, quaisquer dos ácidos ribonucléicos inventivos podem compreender um esquema de modificação de terminação como delineada com relação à tabela 1 e/ou e modificação de terminação como delineada aqui. Tirada a extensão de nucleotídeos contíguos um padrão, preferi-
velmente um padrão regular e/ou de repetição de modificação(ões) dos nu- cleotídeos formando a extensão pode ser realizado em uma modalidade de modo que um nucleotídeo simples ou grupo de nucleotídeos que estão cova- Ientemente ligados um ao outro por meio de ligações de fosforodiéster pa- drões ou, pelo menos parcialmente, através de ligações de fosforotioato, mostram tal tipo de modificação. No caso tal nucleotídeo ou grupo de nu- cleotídeos, que é também referido aqui como grupo de nucleotídeos modifi- cados, não está formando a terminação 5' ou terminação 3' da dita extensão que um nucleotídeo ou grupo de nucleotídeos segue em ambos os lados do nucleotídeo não tendo a modificação do nucleotídeo precedentes ou grupo de nucleotídeos. É para ser observado que este tipo de nucleotídeo ou grupo de nucleotídeos, porém, pode ter uma modificação diferente. Este tipo de nucleotídeo ou grupo de nucleotídeos é também referido aqui como o grupo de flanqueamento de nucleotídeos. Esta seqüência de nucleotídeo modifica- do e grupo de nucleotídeos modificados, respectivamente, e nucleotídeo i- nalterado ou diferentemente modificado ou grupo de nucleotídeos inalterado ou diferentemente modificado pode ser repetido uma ou várias vezes. Prefe- rivelmente, a seqüência é repetida mais de uma vez. Por motivo de clareza, o padrão é debatido em mais detalhe no seguinte, em geral referindo a um grupo de nucleotídeos modificados ou um grupo de nucleotídeos inalterados por meio do qual cada um do dito grupo pode compreender de fato tão pou- co quanto um nucleotídeo simples. Nucleotídeo inalterado como aqui usado significa qualquer um não tendo nenhuma das modificações anteriormente mencionadas no nucleotídeo formando o respectivo nucleotídeo ou grupo de nucleotídeos, ou tendo uma modificação que é diferente do um do nucleotí- deo modificado e grupo de nucleotídeos, respectivamente. Está também dentro da presente invenção que a modificação
do(s) nucleotídeo(s) inalterado(s), em que tal(is) nucleotídeo(s) inalterado(s) é/são na verdade modificado(s) de certo modo diferente da modificação do(s) nucleotídeo(s) modificado(s), pode ser a mesma ou até mesmo dife- rente para os vários nucleotídeos que formam ditos nucleotídeos inalterados ou para os vários grupos de flanqueamento de nucleotídeos.
O padrão de nucleotídeos modificados e inalterados pode ser de modo que o nucleotídeo 5'-terminal do filamento ou da extensão inicia com um grupo modificado de nucleotídeos ou inicia com um grupo inalterado de nucleotídeos. Porém, em uma modalidade alternativa é também possível que o nucleotídeo 5'-terminal seja formado por um grupo inalterado de nu- cleotídeos.
Este tipo de padrão pode ser percebido na primeira extensão ou na segunda extensão do RNA interferente ou em ambas. Tem que ser ob- servado que um 5' fosfato no filamento-alvo complementar do duplex de siRNA é requerido para a função de siRNA, sugerindo que as células verifi- cam a autenticidade dos siRNAs através de uma 5'-OH livre (que pode ser fosforilada) e permite apenas tais siRNAs bona fide direcionar a destruição do RNA alvo (Nykanen et al., 2001).
Preferivelmente, a primeira extensão mostra um tipo de padrão de grupos modificados ou inalterados de nucleotídeos, isto é, do(s) grupo(s) de nucleotídeos modificados e grupo(s) de flanqueamento de nucleotídeos, enquanto que a segunda extensão não mostra este tipo de padrão ou não mostra nenhum padrão. Isto pode ser até então útil visto que a primeira ex- tensão é de fato o mais importante para o processo de degradação alvo- específico fundamentando o fenômeno de RNA interferente de forma que, por razões de especificidade, a segunda extensão pode ser quimicamente modificada, assim ela não é funcional em mediar RNA interferente.
Porém, está também dentro da presente invenção que a primeira extensão e a segunda extensão têm este tipo de padrão. Preferivelmente, o padrão de modificação e não-modificação é o mesmo para a primeira exten- são e para a segunda extensão. Em uma modalidade preferida, o grupo de nucleotídeos forman-
do a segunda extensão e correspondendo ao grupo modificado de nucleotí- deos da primeira extensão é também modificado enquanto que o grupo inal- terado de nucleotídeos ou formando a segunda extensão corresponde ao grupo inalterado de nucleotídeos ou formando a primeira extensão. Outra alternativa é que há um deslocamento de fase do padrão de modificação da primeira extensão e primeiro filamento, respectivamente, com relação ao padrão de modificação da segunda extensão e segundo filamento, respecti- vamente. Preferivelmente, o deslocamento é de modo que o grupo modifica- do de nucleotídeos do primeiro filamento corresponde ao grupo inalterado de nucleotídeos do segundo filamento e vice-versa. Está também dentro da presente invenção que o deslocamento de fase do padrão de modificação não é completo mas sobrepondo. Em uma modalidade preferida, o segundo nucleotídeo ao térmi- no do filamento e extensão, respectivamente, é um nucleotídeo inalterado ou o começo do grupo de nucleotídeos inalterados. Preferivelmente, este nu- cleotídeo inalterado ou grupo inalterado de nucleotídeos está localizado na terminação 5' do primeiro e segundo filamento, respectivamente, e até mes- mo mais preferivelmente do primeiro filamento. Em uma outra modalidade preferida o nucleotídeo inalterado ou grupo inalterado de nucleotídeo está localizado na terminação 51 do primeiro filamento e primeira extensão, res- pectivamente. Em uma modalidade preferida, o padrão consiste em alternar ) nucleotídeos modificados e inalterados simples.
Em uma outra modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, o ácido ribonucléico interferente em questão compreende dois fi- lamentos, por meio dos quais um nucleotídeo modificado em 2'-0-metila e um nucleotídeo não-modificado, preferivelmente um nucleotídeo que não é modificado em 2'-0-metila, é incorporado em ambos os filamentos de uma maneira alternada que significa que todo segundo nucleotídeo é um nucleo- tídeo modificado em 2'-0-metila e um não-modificado, respectivamente. Isto significa que no primeiro filamento um nucleotídeo modificado em 2'-0-metila é seguido por um nucleotídeo não-modificado que por sua vez é seguido por nucleotídeo modificado em 2'-0-metila e assim por diante. A mesma se- qüência de modificação de 2'-0-metila e não-modificação existe no segundo filamento, por meio do qual há preferivelmente um deslocamento de fase de modo que o nucleotídeo modificado em 2'-0-metila na primeira base de fila- mento para com um/uns nucleotídeo(s) não-modificado(s) no segundo fila- mento e vice-versa. Este arranjo particular, isto é, pareamento de base de nucleotídeo(s) modificado(s) em 2'-0-metila e não-modificado(s) em ambos os filamentos é particularmente preferido no caso de ácidos ribonucléicos interferente curtos, isto é, ácidos ribonucléicos bifilamentares com bases pa- readas curtos porque é assumido, embora os inventores presentes não quei- ram estar presos por teoria, que uma certa repulsão exista entre dois nucleo- tídeos modificados em 2I-0-metila com bases pareadas que desestabiliza tal duplex, preferivelmente duplexes curtos. Sobre o arranjo particular, é prefe- rido se o filamento antissentido iniciasse com um nucleotídeo modificado em 2'-0-metila na terminação 5' por meio do qual, por conseguinte, o segundo nucleotídeo é não-modificado, o terceiro, quinto, sétimo nucleotídeos, e as- sim por diante, são desse modo novamente modificados em 2'-0-metila en- quanto que o segundo, quarto, sexto, oitavo nucleotídeos, e outros, são nu- cleotídeos não-modificados. Novamente, não querendo estar preso por qualquer teoria, parece que uma importância particular pode ser designada à segunda, e opcionalmente quarta, sexta, oitava e/ou posição(ões) similar(es) na terminação 5' terminal do filamento antissentido que não deveria compre- ender nenhuma modificação, enquanto que o nucleotídeo mais 5' terminal, isto é, o primeiro nucleotídeo 5' terminal do filamento antissentido pode exibir tal modificação com quaisquer posições ímpares tais como as primeira, op- cionalmente terceira, quinta e posição(ões) similar(es) no filamento antissen- tido podem ser modificadas. Em outras modalidades a modificação e não- modificação, respectivamente, do(s) nucleotídeo(s) modificado(s) e não- modificado(s), respectivamente, podem ser qualquer uma como descritas aqui. Em uma modalidade mais específica, a molécula de ácido nucléico bifi- Iamentar de acordo com a presente invenção consiste em um primeiro fila- mento de 19, 21 ou 23 nucleotídeos sucessivos e um segundo filamento de 19, 21 ou 23 nucleotídeos sucessivos, por meio do qual o primeiro filamento e o segundo filamento são essencialmente complementares uns aos outros. Além disso, na dita modalidade mais específica, a estrutura bifilamentar é cega na terminação em ambas terminações. O primeiro filamento que é es- sencialmente complementar ao ácido nucléico alvo, isto é, um mRNA que codifica para PKN3, começos na terminação 5' com um nucleotídeo que é metilado no grupo 2ΌΗ formando um grupo 2'0-Me. Cada segundo nucleo- tídeo deste primeiro filamento tem a mesma modificação, isto é, é metilado no grupo 2' OH. Desse modo, a primeira, terceira, quinta e assim por diante, isto é, qualquer posição de nucleotídeo ímpar do primeiro filamento é modifi- cada em um tal modo. Os nucleotídeos nas posições pares do primeiro fila- mento são nucleotídeos não-modificados ou nucleotídeos modificados, por meio do qual a modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos nas posições de nucleotídeo ímpares do primeiro filamento. O segundo filamento também preferivelmente compreendendo 19, 21 ou 23 nucleotídeos, tem um nucleotídeo modificado na segunda, quarta, sexta e assim por diante, isto é, em qualquer posição par do nucleotídeo. Quaisquer dos outros nucleotídeos são nucleotídeos não-modificados ou nucleotídeos modificados, por meio do qual a modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos nas posi- ções de nucleotídeo pares do primeiro filamento. Portanto, o segundo fila- mento começa na terminação 5' com um nucleotídeo não-modificado no sen- tido acima. Em uma modalidade mais preferida, a modificação dos nucleotí- deos modificados do primeiro e do segundo filamento é a mesma e a modifi- cação dos nucleotídeos não-modificados do primeiro e do segundo filamento é também a mesma. Em uma modalidade preferida a terminação 5' do antis- sentido, isto é, o primeiro filamento, tem um grupo OH que preferivelmente pode ser fosforilado em uma célula, preferivelmente em uma célula alvo on- de a molécula de ácido nucléico da presente invenção é para ser ativa ou funcional, ou tem um grupo fosfato. A terminação 5' do filamento sentido, isto é, o segundo filamento, é preferivelmente também modificada, mais preferi- velmente modificada como desctito aqui. Qualquer uma ou ambas das ter- minações 3' têm, em uma modalidade, um terminal de fosfato. Está dentro da presente invenção que a estrutura bifilamentar é
formada através de dois filamentos separados, isto é, o primeiro e o segundo filamento. Porém, está também dentro da presente invenção que o primeiro filamento e o segundo filamento são covalentemente ligados um ao outro. Tal ligação pode ocorrer entre quaisquer dos nucleotídeos que formam o primeiro filamento e segundo filamento, respectivamente. Porém, é preferido que a ligação entre ambos filamentos seja feita mais próxima a uma ou am- bas terminações da estrutura bifilamentar. Tal ligação pode ser formada a- través de ligações covalentes ou não-covalentes. Ligação covalente pode ser formada ligando ambos os filamentos uma ou várias vezes e em várias posições, respectivamente, por um composto selecionado do grupo compre- endendo azul de metileno e grupos bifuncionais. Tais grupos bifuncionais são preferivelmente selecionados do grupo que compreende bis(2- cloroetil)amina, N-acetil-N'-(p-glioxilbenzoil)cistamina, 4-tiouracila e psorale- no.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com quaisquer dos primeiros subaspectos da presente invenção, o primeiro fila- mento e o segundo filamento são ligados por uma estrutura de alça.
Em uma modalidade preferida do ácido ribonucléico de acordo com os primeiros subaspectos da presente invenção, a estrutura de alça é compreendida de um polímero de não-ácido nucléico.
Em uma modalidade preferida da mesma, o polímero de não- ácido nucléico é polietileno glicol.
Em uma modalidade do ácido ribonucléico de acordo com quaisquer dos primeiros subaspectos da presente invenção, o término 5' do primeiro filamento é ligado ao término 3' do segundo filamento.
Em uma outra modalidade do ácido ribonucléico de acordo com . 15 quaisquer dos aspectos da presente invenção, a terminação 3' do primeiro filamento é ligada ao término 5' do segundo filamento.
Em uma modalidade, a alça consiste em um ácido nucléico. Como aqui usado, LNA como descrito em Elayadi e Corey (Elayadi et al., 2001); (Orum e Wengel, 2001); e PNA são considerados como ácidos nu- cléicos e podem também ser usados como polímeros formadores de alça. Basicamente, o término 5' do primeiro filamento pode ser ligado ao término 3' do segundo filamento. Como uma alternativa, a terminação 3' do primeiro filamento pode ser ligada ao término 5' do segundo filamento. A seqüência de nucleotídeo que forma a dita estrutura de alça é considerada em geral não sendo crítica. Porém, o comprimento da seqüência de nucleotídeo que forma tal alça parece ser crítico por razões estéricas. Consequentemente, um comprimento mínimo de quatro nucleotídeos parece ser apropriado para formar a estrutura de alça requerida. Em princípio, o número máximo de nu- cleotídeos que formam a dobradiça ou a ligação entre ambas extensões ou filamentos a serem hibridados não está limitado. Porém, quanto mais longo um polinucleotídeo é, as estruturas provavelmente mais secundárias e terci- árias são formadas e desse modo a orientação requerida das extensões afe- tadas. Preferivelmente, um número máximo de nucleotídeos que formam a dobradiça é cerca de 12 nucleotídeos. Está dentro da revelação deste pedi- do de patente que quaisquer dos projetos descritos acima podem ser combi- nados com quaisquer dos outros projetos descritos aqui e conhecidos na técnica, respectivamente, isto é, ligando os dois filamentos covalentemente de uma maneira que um redobramento pode ocorrer através de uma estrutu- ra de alça ou estrutura similar.
Surpreendentemente foi descoberto que se a alça for colocada 3' do filamento antissentido, isto é, o primeiro filamento do(s) ácido(s) ribonu- cléico(s) de acordo com a presente invenção, as atividades deste tipo de RNAi são mais altas comparadas à colocação da alça 5' do filamento antis- sentido. Consequentemente, o arranjo particular da alça com relação ao fi- lamento antissentido e filamento sentido, isto é, o primeiro filamento e o se- gundo filamento, respectivamente, é crucial e está desse modo em contraste - 15 com a compreensão como expressa na técnica anterior onde a orientação é dita ser sem relevância. Porém, isto não parece verdadeiro dado os resulta- dos experimentais apresentados aqui. A compreensão como expressa na técnica anterior é com base na suposição que qualquer RNAi está sujeito a um processamento durante o qual RNAi ligado a não-alça é gerado. Porém, se este fosse o caso, a atividade aumentada claramente observada daque- las estruturas tendo a alça colocada 3' do antissentido não poderia ser expli- cada. Ate então um arranjo preferido na direção 5' -> 3' deste tipo de RNAi interferente pequeno é segundo filamento - alça - primeiro filamento. As res- pectivas construções podem ser incorporadas em sistemas de vetor ade- quados. Preferivelmente o vetor compreende um promotor para a expressão de RNAi. Preferivelmente o respectivo promotor é pol Ill e mais preferivel- mente os promotores são o promotor U6, H1, 7SK como descrito em Bem et al. (Bom etal., 1997) .
O segundo subaspecto do primeiro aspecto da presente inven- ção refere-se a um ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, por meio do qual a primeira extensão e/ou a segunda extensão compreende(m) na terminação 3' um dinucleotídeo, por meio do qual tal dinucleotídeo é pre- ferivelmente TT. Em uma modalidade preferida, o comprimento da primeira extensão e/ou da segunda extensão consiste em ou 19 ou 21 ou 23 nucleo- tídeos e mais preferivelmente a estrutura bifilamentar compreende 18 a 22 e mais preferivelmente 19 a 21 pares de base. O projeto do ácido nucléico de acordo com este subaspecto é descrito em mais detalhe, por exemplo, no pedido de patente internacional WO 01/75164.
O terceiro subaspecto do primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, por meio do qual a primeira e/ou a segunda extensão compreende(m) uma protube- rância de 1 a 5 nucleotídeos na terminação 3'. O projeto do ácido nucléico de acordo com este subaspecto é descrito em mais detalhe no pedido de patente internacional WO 02/44321. Mais preferivelmente tal protuberância é um ácido ribonucléico. Em uma modalidade preferida cada um dos filamen- tos e mais preferivelmente cada uma das extensões como definidas aqui tem -15 um comprimento de 19 a 25 nucleotídeos, por meio do qual mais preferivel- mente o filamento consiste na extensão. Em uma modalidade preferida, a estrutura bifilamentar do ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende 17 a 25 pares de base, preferivelmente 19 a 23 pares de base, mais preferivelmente 19, 21 ou 23 pares de base. O quarto subaspecto do primeiro aspecto da presente invenção
refere-se a um ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, por meio do qual a primeira e/ou a segunda extensão compreende(m) uma protube- rância de 1 a 5 nucleotídeos na terminação 3'. O projeto do ácido nucléico de acordo com este subaspecto é descrito em WO 02/44321. Em um quinto subaspecto do primeiro aspecto da presente in-
venção, o ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, é um ácido nucléico bifilamentar que é uma molécula de ácido nucléico interferente curto bifilamentar quimicamente sintetizado (siNA) que direciona a clivagem de um mRNA de CD31, preferivelmente por meio de RNA interferente, em que cada filamento da dita molécula de siNA é 18 a 27 ou 19 a 29 nucleotídeos em comprimento e a dita molécula de siNa compreende pelo menos um não- nucleotídeo de nucleotídeo quimicamente modificado. O projeto do ácido nucléico de acordo com este subaspecto é descrito em mais detalhe no pe- dido de patente internacional W003/070910 e patente UK 2 397 062.
Em uma modalidade da mesma, a molécula de siNA não com- preende nenhum ribonucleotídeo. Em outra modalidade, a molécula de siNA compreende um ou mais nucleotídeos. Em outra modalidade, o nucleotídeo quimicamente modificado compreende um nucleotídeo de 2'-deóxi. Em outra modalidade, o nucleotídeo quimicamente modificado compreende um nucle- otídeo de 2'-deóxi-2'-flúor. Em outra modalidade, o nucleotídeo quimicamen- te modificado compreende um nucleotídeo de 2'-0-metila. Em outra modali- dade, o nucleotídeo quimicamente modificado compreende uma ligação de internucleotídeo de fosforotioato. Em uma outra modalidade, o não- nucleotídeo compreende uma metade abásica, por meio do qual preferivel- mente a metade abásica compreende uma metade deoxiabásica invertida. Em outra modalidade o não-nucleotídeo compreende uma metade de gliceri- Ia.
Em uma outra modalidade, o primeiro filamento e o segundo fi- lamento estão conectados por meio de uma molécula de ligador. Preferivel- mente, a molécula de ligador é ligador de polinucleotídeo. Alternativamente, a molécula de ligador é um ligador de não-nucleotídeo. Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o
quinto subaspecto, os nucleotídeos de pirimidina no segundo filamento são nucleotídeos de 2'-0-metil pirimidina.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, os nucleotídeos de purina no segundo filamento são nu- cleotídeos de 2'-deóxi purina.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, os nucleotídeos de pirimidina no segundo filamento são nucleotídeos de 2'-deóxi-2'-flúor pirimidina.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, o segundo filamento inclui uma metade de tampa termi- nal na terminação 5', na terminação 3' ou na terminação 5' e na terminação 3'. Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, os nucleotídeos de pirimidina no primeiro filamento são nucleotídeos de 2'-deóxi-2' flúor pirimidina.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, os nucleotídeos de purina no primeiro filamento são nu- cleotídeos de 2'-0-metil purina.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, os nucleotídeos de purina no primeiro filamento são nu- cleotídeos de 2'-deóxi purina. Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o
quinto subaspecto, o primeiro filamento compreende uma ligação de internu- cleotídeo de fosforotioato na terminação 3' do primeiro filamento.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, o primeiro filamento compreende uma modificação de glicerila na terminação 3' do primeiro filamento.
Em uma outra modalidade do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, cerca de 19 a 23 nucleotídeos do primeiro e do segundo filamento são pareados em bases e em que preferivelmente pelo menos dois nucleotídeos do terminal 3' de cada filamento da molécula de siNA não são pareado em bases com os nucleotídeos do outro filamento. Preferivelmente, cada um dos dois nucleotídeos do terminal 3' de cada filamento da molécula de siNA são 2'-deóxi-pirimidinas. Mais preferivelmente, o 2'deóxi-pirimidina é 2' deóxi-timidina.
Em um outro aspecto do ácido nucléico de acordo com o quinto subaspecto, a terminação 5' do primeiro filamento compreende um grupo fosfato.
Em uma modalidade particularmente do quinto subaspecto do ácido nucléico de acordo com a presente invenção, uma molécula de siNA da invenção compreende nucleotídeos modificados mantendo a habilidade para mediar RNAi. Os nucleotídeos modificados podem ser usados para me- lhorar as características in vitro ou in vivo tais como estabilidade, atividade, e/ou biodisponibilidade. Por exemplo, uma molécula de siNA da invenção pode compreender nucleotídeos modificados como uma porcentagem do número total de nucleotídeos presentes na molécula de siNA. Como tal, uma molécula de siNA da invenção pode em geral compreender cerca de 5% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (por exemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% nucleotídeos modificados). A porcentagem atual dos nucleotídeos modificados presentes em uma molécula de siNA dada dependerá do número total de nucleotídeos presentes no siNA. Se a molécu- la de siNA for unifilamentar, a porcentagem de modificação pode ser com base no número total de nucleotídeos presentes nas moléculas de siNA uni- filamentares. Igualmente, se a molécula de siNA for bifilamentar, a porcenta- gem de modificação pode ser com base no número total de nucleotídeos presentes no filamento sentido, filamento antissentido, ou o filamentos senti- do e antissentido.
.15 Em um exemplo não-limitativo, a introdução dos nucleotídeos
quimicamente modificados nas moléculas de ácido nucléico particularmente do quinto subaspecto do ácido nucléico de acordo com a presente invenção provê uma ferramenta poderosa em superar as limitações potenciais da es- tabilidade in vivo e biodisponibilidade inerente às moléculas de RNA nativas que são liberadas de modo exógeno. Por exemplo, o uso das moléculas de ácido nucléico quimicamente modificadas pode permitir uma dose inferior de uma molécula de ácido nucléico particular para um efeito terapêutico dado uma vez que as moléculas de ácido nucléico quimicamente modificadas ten- dem a ter uma meia-vida mais longa em soro. Além disso, certas modifica- ções químicas podem melhorar a biodisponibilidade das moléculas de ácido nucléico em alvejar células ou tecidos particulares e/ou melhorar a absorção celular da molécula de ácido nucléico. Portanto, até mesmo se a atividade de uma molécula de ácido nucléico quimicamente modificada for reduzida quando comparada a uma molécula de ácido nucléico nativa, por exemplo, quando comparada a uma molécula de ácido nucléico de RNA integral, a atividade geral da molécula de ácido nucléico modificada pode ser maior que a da molécula nativa devido à estabilidade melhorada e/ou liberação da mo- lécula. Diferente do siNA inalterado nativo, o siNA quimicamente modificado pode também minimizar a possibilidade de ativar a atividade de interferona em seres humanos.
Preferivelmente com relação ao quinto subaspecto do ácido nu- cléico de acordo com a presente invenção, o filamento antissentido, isto é, o primeiro filamento, de uma molécula de siNA da invenção pode compreender uma ligação de internucleotídeo de fosforotioato na terminação 3' da dita região antissentido. O filamento antissentido pode compreender cerca de uma a cerca de cinco ligações de internucleotídeo de fosforotioato na termi- nação 5' da dita região antissentido. As protuberâncias do nucleotídeo 3'- terminal de uma molécula de siNA da invenção podem compreender ribonu- cleotídeos ou deoxirribonucleotídeos que são quimicamente modificados em um açúcar de ácido nucléico, base ou cadeia principal. As protuberâncias do nucleotídeo 3'-terminal podem compreender um ou mais ribonucleotídeos de - 15 base universal. As protuberâncias do nucleotídeo 3'-terminal podem com- preender um ou mais nucleotídeos acíclicos.
Será reconhecido pelos versados na técnica que particularmente a modalidade da presente invenção compreendendo uma alça feita de nu- cleotídeos é adequada para ser usada e expressada por um vetor. Preferi- velmente, o vetor é um vetor de expressão. Tal vetor de expressão é particu- lar útil em qualquer método terapêutico de gene. Consequentemente, tal ve- tor pode ser usado para a fabricação de um medicamento que é preferível para ser usado para o tratamento das doenças reveladas aqui. Porém, tam- bém ser reconhecido pelos versados na técnica que qualquer modalidade do ácido nucléico de acordo com a presente invenção que compreende qual- quer modificação de ocorrência não-natural não pode ser usada imediata- mente para expressão em um vetor e um sistema de expressão para tal ve- tor tal como uma célula, tecido, órgão e organismo. Porém, está dentro da presente invenção que a modificação pode ser adicionada ou introduzida no ácido nucléico derivado de vetor ou expressado de vetor de acordo com a presente invenção, tipicamente após a expressão do ácido nucléico pelo ve- tor. Um vetor particularmente preferido é um vetor de plasmídeo ou um vetor viral. O ensinamento técnico sobre como usar as moléculas de siRNA e as moléculas de RNAi em um vetor de expressão é, por exemplo, descrito no pedido de patente internacional WO 01/70949. Será reconhecido pelos ver- sados na técnica que tal vetor é preferivelmente útil em qualquer método terapêutico ou diagnóstico onde uma presença contínua do ácido nucléico de acordo com a presente invenção é desejada e útil, respectivamente, visto que o ácido nucléico de não-vetor de acordo com a presente invenção e em particular o ácido nucléico quimicamente modificado ou quimicamente sinte- tizado de acordo com a presente invenção é particularmente útil onde a pre- sença transiente da molécula for desejada ou útil.
Métodos para a síntese da molécula de ácido nucléico descrita aqui são conhecidos aos versados na técnica. Tais métodos são, entre ou- tros, descritos em (Caruthers et al., 1992), Thompson et al., Publicação de PCT internacional No. WO 99/54459, (Wincott et al., 1995), (Wincott e Us- man, 1997), Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, e Brennan, Pat. U. S. No. 6.001.311. Todas estas referências são incorporadas aqui por referência.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma for- mulação Iipossomal compreendendo e mais especificamente contendo uma ou várias das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente inven- ção. Preferivelmente tal formulação Iipossomal consiste em lipídio(s) definin- do um volume interno. Tal volume interno preferivelmente contém a(s) molé- cula(s) de ácido nucléico da presente invenção. Mais preferivelmente tal formulação compreende lipossomas, por meio do qual, em uma modalidade preferida, compreende o Iipossoma ou contém um ou vários lipídios catiôni- cos. Em uma modalidade mais preferida, a formulação Iipossomal contém uma ou várias da(s) molécula(s) de ácido nucléico da presente invenção de modo que a(s) molécula(s) de ácido nucléico é/são não detectável(éis) ou presente(s) na ou sobre a superfície externa do lipossoma. Como preferi- velmente aqui usado, a superfície externa do lipossoma é a superfície do lipossoma que entra em contato com o ambiente que circunda o lipossoma, particularmente em contraste com a superfície do lipossoma que entra em contato com o fluido abrangido pelo lipossoma. Em um modalidade particu- larmente preferida, a(s) molécula(s) de ácido nucléico de acordo com a pre- sente invenção é/são acondicionada(s) ou encapsulada(s) por ou no dito lipossoma e formulação lipossomal, respectivamente.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se aos Iipople-
xes compreendendo o ácido nucléico de acordo com a presente invenção, por meio do qual tais Iipoplexes consistem em uma ou várias moléculas de ácido nucléico e uma ou várias lipossomas. Em uma modalidade preferida, um Iipoplex consiste em um lipossoma e várias moléculas de ácido nucléico. O Iipoplex pode ser caracterizado como segue. O Iipoplex de
acordo com a presente invenção tem um potencial zeta de cerca de 40 a 55 mV, preferivelmente cerca de 45 a 50 mV. O tamanho do lipoplex, de acordo com a presente invenção, é cerca de 80 a 200 nm, preferivelmente de cerca de 100 a 140 nm, e mais preferivelmente de cerca de 110 nm a 130 nm, co- mo determinado por difração luminosa dinâmica (QELS) tal como, por e- xemplo, usando um analisador de tamanho de partícula submícron de N5 de Beckman Coulter de acordo com a recomendação do fabricante.
O lipossoma, como formando parte do lipoplex de acordo com a presente invenção, é preferivelmente um lipossoma positivamente carregado que consiste em
a) cerca de 50 % em mol de (tri-hidrocloreto de p-arginil-2,3- ácido diaminopropiônico-N-palmitil-N-oleil-amida, preferivelmente (tri- cloridrato de P-(L-arginil)-2,3-L-ácido diaminopropiônico-A/-palmitil-A/-oleil- amida),
b) cerca de 48 a 49 % em mol de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-
fosfoetanolamina (DPhyPE), e
c) cerca de 1 a 2 % em mol de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-polietilen-glicol, preferivelmente sal de sódio de N- (Carbonil-metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina.
O lipoplex e a composição lipídica que forma os lipossomas são preferivelmente contidos em um veículo. Porém, o lipoplex pode também estar presente em uma forma liofilizada. A composição de lipídio usualmente contida em um veículo forma uma dispersão. Mais preferivelmente, o veículo é um meio aquoso ou solução aquosa como também caracterizados aqui. A composição de lipídio tipicamente forma um Iipossoma no veículo, por meio do qual tal Iipossoma preferivelmente também contém o veículo no interior.
A composição de lipídio contida no veículo e o veículo, respecti- vamente, preferivelmente têm uma osmolaridade de cerca de 50 a 600 mosmole/kg, preferivelmente cerca de 250 - 350 mosmole/kg, e mais preferi- velmente cerca de 280 a 320 mosmole/kg.
Os Iipossomas preferivelmente formados pelo primeiro compo- nente de lipídio e opcionalmente também pelo primeiro lipídio auxiliar, prefe- rivelmente em combinação com o primeiro componente de lipídio, preferi- velmente exibem um tamanho de partícula de cerca de 20 a 200 nm, preferi- velmente cerca de 30 a 100 nm, e mais preferivelmente cerca de 40 a 80 nm.
Além disso, será reconhecido que o tamanho da partícula segue uma certa distribuição estatística.
Uma característica opcional também da composição de lipídio de acordo com a presente invenção é que o pH do veículo é preferivelmente de cerca de 4,0 a 6,0. Porém, também outras faixas de pH tal como de 4,5 a 8.0, preferivelmente de cerca de 5,5 a 7,5 e mais preferivelmente cerca de 6,0 a 7,0 estão dentro da presente invenção.
Por realizar estas características particulares várias medidas podem ser tomadas. Para ajustar a osmolaridade, por exemplo, um açúcar ou uma combinação de uns açúcares, é particularmente útil. Até então, a composição de lipídio da presente invenção pode compreender um ou vários dos açúcares a seguir: sacarose, trealose, glicose, galactose, manose, mal- tose, lactulose, inulina e rafinose, por meio do qual sacarose, trealose, inuli- na e rafinose são particularmente preferidos. Em um modalidade particular- mente preferida a osmolaridade principalmente ajustada pela adição de açú- car é cerca de 300 mosmole/kg, que corresponde a uma solução de sacaro- se de 270 mM ou uma solução de glicose de 280 mm. Preferivelmente o veí- culo é isotônico para o fluido do corpo, ao qual tal composição de lipídio será administrada. Como aqui usado aquele termo a osmolaridade é principal- mente ajustada pela adição de açúcar significa que pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos cerca de 90% da osmolaridade são forne- cidos pelo dito açúcar ou uma combinação dos ditos açúcares.
Se o pH da composição de lipídio da presente invenção for ajus- tado, este é feito usando substâncias de tampão que, como tais, são conhe- cidas basicamente a alguém versado na técnica. Preferivelmente, substân- cias básicas são usadas, que são adequadas para compensar as caracterís- ticas básicas dos lipídios catiônicos e mais especificamente do grupo amônio do grupo de cabeça catiônico. Ao adicionar substâncias básicas tais como aminoácidos básicos e bases fracas, respectivamente, a osmolaridade aci- ma será levada em conta. O tamanho de partícula de tal composição de lipí- dio e os Iipossomas formados por tal composição de lipídio é preferivelmente determinado por difração luminosa dinâmica tal como usando um analisador de tamanho de partícula de submícron de N5 de Beckman Coulter de acordo com a recomendação do fabricante.
Se a composição de lipídio contiver um ou vários ácido(s) nu- cléico(s), tal composição de lipídio usualmente forma um complexo de Iipo- plex, isto é, um complexo consistindo em um Iipossoma e um ácido nucléico. A concentração mais preferida do conteúdo de lipídio geral no Iipoplex em preferivelmente 270mM de sacarose isotônica ou 280 mM de glicose é de cerca de 0,01 a 100 mg/ml, preferivelmente 0,01 a 40 mg/ml e mais preferi- velmente 0,01 a 25 mg/ml. Será reconhecido que esta concentração pode ser aumentada para preparar uma matéria-prima razoável, tipicamente por um fator de 2 a 3. Está também dentro da presente invenção que com base nisso, uma diluição é preparada, por meio do qual tal diluição é tipicamente feita de modo que a osmolaridade fique dentro da faixa especificada acima. Mais preferivelmente, a diluição é preparada em um veículo que é idêntico ou em termos de função e mais especificamente osmolaridade similar ao veículo usado com relação à composição de lipídio ou no qual a composição de lipídio está contida. Na modalidade da composição de lipídio da presente invenção, por meio do qual a composição de lipídio também compreende um ácido nucléico, preferivelmente um ácido nucléico funcional tal como, mas não limitado a, um siRNA, a concentração do siRNA na composição de lipí- dio é cerca de 0,2 a 0,4 mg/ml, preferivelmente 0,28 mg/ml, e a concentra- ção de lipídio total é cerca de 1,5 a 2,7 mg/ml, preferivelmente 2,17 mg/ml. Será reconhecido que esta razão de massa entre a fração de ácido nucléico e a fração de lipídio é particularmente preferida, também com respeito à ra- zão de carga desse modo realizada. Com relação a qualquer outra concen- tração ou diluição da composição de lipídio da presente invenção, prefere-se que a razão de massa e a razão de carga, respectivamente, realizadas nesta modalidade particular, sejam preferivelmente mantidas apesar de tal concen- tração ou diluição.
Tal concentração como usada, por exemplo, em uma composi- ção farmacêutica, ou pode ser obtida dispersando o lipídio em uma quanti- dade adequada de meio, preferivelmente um tampão fisiologicamente acei- tável ou qualquer veículo descrito aqui, ou pode ser concentrada através de meios apropriados. Tais meios apropriados são, por exemplo, métodos de uItrafiItração incluindo uItrafiItração de fluxo cruzado. A membrana de filtro pode exibir uma largura de poro de 1.000 a 300.000 corte de peso molecular Da (MWCO) ou 5 nm a 1 pm. Particularmente preferida é uma largura de poro de cerca de 10.000 a 100.000 da de MWCO. Será também reconhecido por alguém versado na técnica que a composição de lipídio, mais especifi- camente os Iipoplexes de acordo com a presente invenção, podem estar presentes em uma forma liofilizada. Tal forma Iiofilizada é tipicamente ade- quada para aumentar a vida de prateleira de um lipoplex. O açúcar adiciona- do, entre outros, para prover a osmolaridade apropriada, é usado em relação a este como um crioprotetor. Em relação a este, será reconhecido que as características acima mencionadas de osmolaridade, pH como também con- centração de lipoplex referem-se à forma dissolvida ou suspensa ou disper- sa da composição de lipídio em um veículo, por meio do qual tal veículo é em princípio qualquer veículo descrito aqui e tipicamente veículo aquoso tal como água ou um tampão fisiologicamente aceitável, preferivelmente um tampão isotônico ou solução isotônica.
Além destas formulações particulares, as moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção podem também ser formuladas em composições farmacêuticas como são conhecidas na técnica.
Consequentemente, as moléculas de ácido nucléico de acordo
com a presente invenção podem ser preferivelmente adaptadas para o uso como medicamentos e diagnósticos, sozinhas ou em combinação com ou- tras terapias. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender um veículo de liberação, incluindo Ii- possomas, para administração a um sujeito, veículos e diluentes e seus sais, e/ou pode estar presente em formulações farmaceuticamente aceitáveis. Métodos para a liberação das moléculas de ácido nucléico são descritos em (Agrawal e Akhtar, 1995; Akhtar e Juliano, 1992), (Maurer et al., 1999) ; (Ho- fland e Huang, 1995); e Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192 to- dos estes são incorporados aqui por referência. Beigelman et al., Pat. U. S. No. 6.395.713 e Sullivan et al., PCT WO 94/02595 também descrevem os métodos gerais para liberação das moléculas de ácido nucléico. Estes proto- colos podem ser utilizados para a liberação de virtualmente qualquer molé- cula de ácido nucléico. Moléculas de ácido nucléico podem também ser ad- ministradas às células por uma variedade de métodos conhecidos àqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitados a, encapsulação em Iipos- somas, através de iontoforese, ou por incorporação em outros veículos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas (vide por exemplo Gonzalez et al., 1999), na- nocápsulas biodegradáveis, e microesferas bioadesivas, ou através de veto- res proteináceos (0'IHare e Normand1 Publicação de PCT Internacional No. WO 00/53722). Alternativamente, a combinação de ácido nucleico/veículo é liberada localmente através de injeção direta ou por uso de uma bomba de infusão. Injeção direta das moléculas de ácido nucléico da invenção, quer subcutânea, intramuscular, ou intradérmica, pode acontecer usando metodo- Iogias de agulha e de seringa padrões, ou através de tecnologias sem agu- lhas tais como aquelas descritas em (Conry et al., 1999) e Barry et al., Publi- cação de PCT internacional No. WO 99/31262. As moléculas da invenção imediata podem ser usadas como agentes farmacêuticos. Preferivelmente, os agentes farmacêuticos impedem, modulam a ocorrência, ou tratam (alivi- am um sintoma até certo ponto, preferivelmente todos os sintomas) de um estado de doença em um indivíduo.
Desse modo, a presente invenção também fornece uma compo-
sição farmacêutica que compreende um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com a presente invenção, em um veículo aceitável, tal como um estabilizan- te, tampão, e outros. Os polinucleotídeos ou (moléculas) de ácido nucléico da invenção podem ser administrados (por exemplo, RNA, DNA ou proteína) e introduzidos em um sujeito por qualquer meio padrão, com ou sem estabi- lizantes, tampões, e outros, para formar uma composição farmacêutica. Quando desejar usar um mecanismo de liberação de lipossoma, protocolos padrão para formação de Iipossomas podem ser seguidos. As composições da presente invenção podem também ser formuladas e usadas como com- - 15 primidos, cápsulas ou elixires para administração oral, supositórios para ad- ministração retal, soluções estéreis, suspensões para administração injetá- vel, e as outras composições conhecidas na técnica.
Há formulações farmaceuticamente aceitáveis fornecidas tam- bém das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Estas formulações incluem sais dos compostos acima, por exemplo, sais de adição de ácido, por exemplo, sais de ácido clorídrico, hidrobrômico, ácido acético, e benzeno sulfônico.
Uma composição farmacológica ou formulação refere-se a uma composição ou formulação em uma forma adequada para administração, por exemplo, administração sistêmica, em uma célula ou sujeito, incluindo por exemplo um ser humano. Formas adequadas, em parte, dependem do uso ou da rota de entrada, por exemplo oral, transdérmica, ou através de injeção. Tais formas não deveriam impedir a composição ou formulação de alcançar uma célula alvo (isto é, uma célula à qual o ácido nucléico negativamente carregado é desejável para liberação). Por exemplo, composições farmaco- lógicas injetadas no fluxo sangüíneo deveriam ser solúveis. Outros fatores são conhecidos na técnica, e incluem considerações tais como toxicidade e formas que impedem para a composição ou formulação de exercer seu efei- to.
Por "administração sistêmica" é preferivelmente significado ab- sorção sistêmica in vivo ou acumulação de fármacos no fluxo sangüíneo se- guido por distribuição ao longo do comprimento total. Rotas de administra- ção que conduzem à absorção sistêmica incluem, sem limitação: intraveno- sa, subcutânea, intraperitoneal, inalação, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada uma destas rotas de administração expõem as moléculas de siNA da invenção a um tecido doente acessível. A taxa de entrada de um fármaco na circulação foi mostrada ser uma função de peso molecular ou tamanho. O uso de um Iipossoma ou outro veículo de fármaco compreendendo os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção pode potencialmente localizar o fármaco, por exemplo, em certos tipos de tecido, tais como tecido(s) neo- plástico(s). Uma formulação de Iipossoma que pode facilitar a associação de - 15 fármaco com a superfície das células, tais como linfócitos e macrófagos, é também útil. Este método pode fornecer liberação intensificada do fármaco às células alvo tirando proveito da especificidade de reconhecimento imune de macrófagos e linfócitos das células anormais, tais como células que for- mam o tecido neoplástico. Por "formulação farmaceuticamente aceitável" é preferivelmente
significado uma composição ou formulação que permitem a distribuição efi- caz das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção na localização física mais adequada para sua atividade desejada. Exemplos não-limitativos de agentes adequados para formulação com as moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção incluem: inibidores de P- glicoproteína (tais como Pluronic P85) que podem intensificar a entrada de fármacos no CNS (Jolliet-Riant e Tillement, 1999); polímeros biodegradá- veis, tais como poli (DL-lactídeo-coglicolídeo) microesferas para liberação de liberação contínua após implantação intracerebral (Emerich et al., 1999) (Al- kermes, Inc. Cambridge, MA); e nanopartículas carregadas, tais como aque- las feitas de polibutilcianoacrilato, que podem liberar fármacos ao longo da barreira hematoencefálica e pode alterar os mecanismos de absorção neu- ronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry1 23, 941-949, 1999). Ou- tros exemplos não-limitativos de estratégias de liberação para as moléculas de ácido nucléico da invenção imediata incluem material descrito em (Boado et al., 1998); Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al„ 1995, PNAS USA., 92,5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15,73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; e Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.
De acordo com a presente invenção é também fornecido o uso da composição compreendendo Iipossomas modificados na superfície con- tendo lipídios com poli (etileno glicol) (lipossomas modificados com PEG, ou de circulação longa ou lipossomas Stealth). Estas formulações oferecem um método para aumentar a acumulação de fármacos em tecidos-alvos. Esta classe de veículos de fármaco resiste à opsonização e eliminação pelo sis- tema fagocitário mononuclear (MPS ou RES), assim permitindo tempos de circulação de sangue mais longos e exposição de tecido intensificada ao fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Buli. 1995, 43, 1005-1011). Tais lipossomas foram mostrados acumular seletivamente em tumores, presumivelmente através de extravazação e captura nos tecidos-alvos neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biofis. Acta, 1238, 86-90). Os lipossomas de circulação longa intensificam a farmacocinética e farmacodinâmica do DNA e RNA, particularmente comparados aos liposso- mas catiônicos convencionais que são conhecidos acumularem-se nos teci- dos do MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995,42,24864-24780; Choi et al., Pu- blicação de PCT internacional No. WO 96/10391; Ansell et al., Publicação de PCT internacional No. WO 96/10390; Holland et al., Publicação de PCT in- ternacional No. WO 96/10392). Lipossomas de circulação longa são também prováveis de proteger fármacos de degradação da nuclease em uma propor- ção maior comparados aos lipossomas catiônicos, com base em sua habili- dade para evitar acumulação em tecidos de MPS metabolicamente agressi- vos sue tem o fígado e baço.
Além do mais, são providas composições preparadas para ar- mazenamento de administração que incluem uma quantidade farmaceutica- mente eficaz dos compostos desejados em um veículo ou diluente farmaceu- ticamente aceitável. Veículos ou diluentes aceitáveis para o uso terapêutico são bem-conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gen- naro editado em 1985), por este meio incorporado aqui por referência. Por exemplo, conservantes, estabilizantes, tinturas e agentes aromatizantes po- dem ser fornecidos. Estes incluem benzoato de sódio, ésteres de ácido sór- bico e de ácido p-hidroxibenzóico. Além disso, antioxidantes e agentes de suspensão podem ser usados.
Uma dose farmaceuticamente eficaz é aquela dose requerida para impedir, inibir a ocorrência, ou ameaça (aliviar um sintoma até certo ponto, preferivelmente todos os sintomas) de um estado de doença. A dose farmaceuticamente eficaz depende do tipo de doença, da composição usa- da, da rota de administração, do tipo de mamífero sendo tratado, das carac- terísticas físicas do mamífero específico sob consideração, medicação simul- tânea, e outros fatores que aqueles versados nas técnicas médicas reco- nhecerão. Em geral, uma quantidade entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg peso do corpo/dia de ingredientes ativos são administrados dependente da potência do polímero negativamente carregado.
As moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente in- venção e formulações das mesmas podem ser administradas oral, tópica, parenteralmente, através de inalação ou pulverização, ou retalmente em formulações de unidade de dosagem contendo carreadores adjuvantes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos convencionais. O termo parenteral como aqui usado inclui técnicas injeção ou de infusão percutânea, subcutânea, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, ou in- tratecal e outras. Além disso, é fornecida uma formulação farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucléico da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma ou mais moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção podem estar presentes em associação com um ou mais veículos e/ou diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente acei- taveis nao-toxicos, e se outros ingredientes ativos desejados. As composi- goes farmaceuticas contendo moleculas de acido nucleico de acordo com a presente invengao podem ser em uma forma adequada para uso oral, por exemplo, como comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensoes aquosas ou oleosas, pos dispersaveis ou granulos, emulsao, capsulas duras ou macias, ou xaropes ou elixires.
Composigoes e em particular composigoes farmaceuticas inten- cionadas para ο uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer metodo conhecido na tecnica pela fabricagiao de composigdes farmaceuticas e tais composigoes podem conter um ou mais tais agentes adogantes, agen- tes aromatizantes, agentes de coloragao ou agentes conservantes para for- necer prepara^oes farmaceuticamente elegantes e saborosas. Comprimidos contem ο ingrediente ativo em admistao com excipientes farmaceuticamente aceitaveis nao-toxicos que sao adequados para a fabricagao de comprimi- dos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes; tais como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactose, fosfato de calcio ou fosfato de sodio; agentes granulantes e desintegrarites, por exemplo, amido de mi- lho, ou acido alginico; agentes de ligagao, por exemplo amido, gelatina ou acacia; e agentes lubrificantes, por exemplo estearato de magnesio, acido estearico ou talco. Os comprimidos podem ser nao-revestidos ou revestidos atraves de tecnicas conhecidas. Em alguns casos tais revestimentos podem ser preparados atraves de tecnicas conhecidas para tardar a desintegragao e absorgao no trato gastrointestinal e assim fornecer uma agao continua em um periodo mais longo. Por exemplo, um material de demora de tempo tal como monoesterato de glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empre- gado.
Formulagoes para ο uso oral podem tambem ser apresentadas como capsulas de gelatina duras em que ο ingrediente ativo e misturado com um diluente solido inerte, por exemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio ou caulim, ou como capsulas de gelatina macias em que ο ingrediente ativo e misturado com agua ou um meio oleoso, por exemplo oleo de amen-
doim, oleo de parafina ou azeite de oliva. Suspensoes aquosas contem os materiais ativos em uma mistu- ra com excipientes adequados para a fabricagao de suspensoes aquosas. Tais excipientes sao agentes de suspensao, por exemplo carboximetilcelulo- se sodica, metilcelulose, hidropropilmetilcelulose, alginato de sodio, polivinil- pirrolidona, goma tragacanto e goma acacia; agentes dispersantes ou umec- tantes podem ser um fosfatideo de ocorrencia natural, por exemplo lecitina, ou produtos de condensagao de um oxido de alquileno com acidos graxos, por exemplo estearato de polioxietileno, ou produtos de condensagao de oxido de etileno com alcoois aIifaticos de cadeia longa, por exemplo hepta- decaetilenooxioctanol, ou produtos de condensagao de oxido de etileno com esteres parciais derivados de acidos graxos e um hexitol tal como mono- oleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensagao de oxido de etileno com esteres parciais derivados de acidos graxos e anidridos de hexi- tol, por exemplo mono-oleato de polietileno sorbitan. As suspensoes aquo- sas podem tambem conter um ou mais conservantes, por exemplo etila, ou p-hidroxibenzoato de n-propila, um ou mais agentes de coloragao, um ou mais agentes aromatizantes, e um ou mais agentes adogantes, tais como sacarose ou sacarina.
Suspensoes oleosas podem ser formuladas suspendendo os ingredientes ativos em um oleo vegetal, por exemplo oleo de araquis, azeite de oliva, oleo de gergelim ou oleo de coco, ou em um oleo mineral tal como oleo de parafina. As suspens5es oleosas podem conter um agente espes- sante, por exemplo cera de abelha, parafina dura ou alcool cetilico. Agentes adogantes e agentes aromatizantes podem ser adicionados para fornecer prepara0es orais saborosas. Estas composites podem ser preservadas pela adigao de um antioxidante tal como acido ascorbico.
Pos e granulos dispersaveis adequados para a preparagao de uma suspensao aquosa pela adigao de agua fornecem ο ingrediente ativo em admistao com um agente dispersante ou umectante, agente de suspen- sao e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou umectantes ou agentes de suspensao adequados sao exemplificados por aqueles ja men-
cionados acima. Excipientes adicionais, por exemplo agentes adogantes, 5
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aromarizantes e corantes, podem tambem estar presentes.
Composites farmaceuticas da invengao podem tambem ser na forma de emulsoes de oleo-em-agua. A fase oleosa pode ser um oleo vege- tal ou um oleo mineral ou mistura destes. Agentes emulsificantes adequados podem ser gomas de ocorrencia natural, por exemplo goma acacia ou goma tragacanto, fosfatideos de ocorrencia natural, por exemplo soja, lecitina, e esteres ou esteres parciais derivados de acidos graxos e hexitol, anidridos, por exemplo mono-oleato de sorbitan, e produtos de condensa?§o dos ditos esteres parciais com oxido de etileno, por exemplo mono-oleato de sorbitan de polioxietileno. As emulsoes podem tambem conter agentes adogantes e aromatizantes.
Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adogan- tes，por exemplo glicerol, propileno glicol, sorbitol, glicose ou sacarose. Tais formula9oes podem tambem conter um demulcente, um conservante e agen- tes aromatizantes e corantes. As composites farmaceuticas podem ser na forma de uma suspensao aquosa ou oleaginosa injetavel esteril. Esta sus- pensao pode ser formulada de acordo com a tecnica conhecida usando a- queles agentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes de sus- Pensao que foram mencionados acima. A preparagao injetavel esteril pode tambem ser uma solugao ou suspensao injetavel esteril em um diluente ou solvente parentalmente nao-toxico aceitavel, por exemplo como uma solugao em 1,3-butanodiol. Entre os veiculos e solventes aceitaveis que podem ser empregados estao agua, solugao de Ringer e solu?ao de cloreto de sodio isotonica. Alem disso, oleos estereis, fixos sao convencionalmente empre- gados como um solvente ou meio de suspensao. Para este proposito, qual- quer oleo fixo insipido pode ser empregado incluindo mono ou diglicerideos sinteticos. Alem disso, acidos graxos tais como acido oleico encontram uso na preparagao de injetaveis.
As moleculas de acido nucleico da invengao podem tambem ser administradas na forma de supositorios, por exemplo, para administrapao retal do farmaco. Estas composi?5es podem ser preparadas misturando ο farmaco com um excipiente nao-irritante adequado que e solido em tempera- turas usuais mas Iiquido em temperatura retal e fundira, portanto, no reto para Iiberar ο farmaco. Tais materials incluem manteiga de cacau e polietile- no glicois.
Moleculas de acido nucleico da invengao podem ser administra- das parenteralmente em um meio esteril. O farmaco, dependendo do veiculo e concentragao usados, pode ser suspendido ou dissolvida no veiculo. Van- tajosamente, adjuvantes tais como anestesias locais, conservantes e agen- tes tamponantes podem ser dissolvidos no veiculo.
Niveis de dosagem para ο medicamento e composigao farma- ceutica, respectivamente, podem ser determinados por aqueles versados na tecnica atraves de experimentagao rotineira.
E entendido que ο nivel de dose especifica para qualquer sujeito particular depende de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto especifico empregado, a idade, peso do corpo, saiide geral, sexo, dieta, tempo de administragao, rota de administragao, e taxa de excregao, combinagao de farmaco e a severidade da doenga particular passando por terapia.
Para administragao do medicamento de acordo com a presente inven^ao em animais nao-humanos tais como cachorros, gatos, cavalos, vaca, porco, cabra, ovelha, camundongo, rato, hamster e cobaia, a composi- ?ao pode preferivelmente ser tambem adicionada a ra?ao ou agua potavel dos animais. Pode ser conveniente formular as composigoes da ragao e de agua potavel dos animais de forma que ο animal consuma em uma quanti- dade terapeuticamente apropriada da composigao junto com sua dieta. Pode tambem ser conveniente apresentar a composigao como uma pre-mistura para adigao a ra?ao ou agua potavel.
As moleculas de acido nucleico da presente invengao podem tambem ser administradas a um sujeito em combinagao com outros compos- tos terapeuticos para aumentar ο efeito terapeutico geral. O uso de compos- tos miiltiplos para tratar uma indicagao pode aumentar os efeitos beneficos reduzindo a presenga dos efeitos colaterais.
Em uma modalidade, as moleculas de acido nucleico, em suas varias modalidades, formas e formulates, respectivamente, podem ser u- sadas com outras terapias tais como quimioterapia, crioterapia, hipertermia, terapia de anticorpo, terapia de radiagao e terapia de antiangiogenese. Uma terapia particularmente preferida e terapia de antiangiogenese. Com relagao a terapia de antiangiogenese, aIvos particularmente preferidos sao ο recep- tor de VEGF e ο receptor de PDGF. Terapia de antiangiogenese e tipica- mente realizada usando inibidores para aIvos relacionados a angiogenese tais como ο receptor de VEGF e ο receptor de PDGF. Alem de moleculas pequenas outros tipos de compostos podem tambem ser gerados ou forne- cidos ou usados que atuam como inibidores para tais alvos. As classes a seguir de compostos podem ser consequentemente usadas: siRNA como, entre outros, descrito em WO 00/44895 ou WO 01/75164; moleculas antis- sentido como, entre outros, descritas em US 5.849.902, US 5.989.912 ou conhecidas como blocos de gene; aptameros como, entre outros, descritos em EP O 533 838 B1; spiegelmers como, entre outros, descritos em WO 98/08856; peptideos Iigantes de afinidade alta que podem ser identificados das bibliotecas de peptideos de sequencias aleatorias compreendendo 102 a 1018 peptideos que diferem em sua sequencia de aminoacido de uma manei- ra similar aos aptameros e sao, portanto, as vezes tambem referidas como aptameros de peptideo; anticalinas como, entre outros, descritas em DE 197 42 706; e anticorpos que sao, entre outros, descritos em "Antibokies: A La- boratory Manual", cold Spring Harbor Laboratory (eds. Harlow, E., e Lane D·).
Em uma modalidade, sao providas composigoes adequadas pa- ra administrar as moleculas de acido nucleico de acordo com a presente in- vengao a tipos de celula especificos, por meio do qual tais composigoes tipi- camente incorporam um ou varios dos principios a seguir e moleculas, res- pectivamente. Por exemplo, ο receptor de asialoglicoproteina (ASGPr) (Wu e Wu1 1987，J. Biol. Chem. 262, 4429-4432) e Cinico para hepatocitos e Iiga glicoproteinas galactose-terminais ramificadas, tais como asialo- orosomucoide (ASOR). Em outro exemplo, ο receptor de folato e supraex-
pressado em muitas celulas cancerosas. Ligagao de tais glicoproteinas, gli- coconjugados sinteticos, ou folatos ao receptor ocorre com uma afinidade que fortemente depende do grau de ramificagao da cadeia de oligossacari- deo, por exemplo, estruturas tria-tenarias estao Iigadas com maior afinidade que as cadeias biatenarias ou monoatenarias (Baenziger e Fiete, 1980, Cell, 22’ 611-620; Connolly et al„ 1982’ J. Biol. Chem., 257，939-945). Lee e Lee, 1987. Glycoconjugate J., 4, 317-328, obteve esta especificidade alta atraves do uso de N-acetil-D-galactosamina como a metade de carboidrato tendo afinidade mais alta pelo receptor comparada a galactose. Este "efeito de a- grupamento" foi tambem descrito para a Iigagao e absorgao de giicoprotei- nas manosil-terminais ou glicoconjugados (Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). O uso de conjugados com base em galactose, ga- lactosamina, ou folato para transportar compostos exogenos ao Iongo de membranas de eeluIa pode fornecer um metodo de Iiberagao alvejado para, por exemplo, ο tratamento de doenga do figado, canceres do figado, ou ou- tros canceres. O uso de bioconjugados pode tambem fornecer uma redu^ao na dose requerida de compostos terapeuticos requeridos para ο tratamento. Alem disso, biodisponibilidade terapeutica, farmacodinamica e parametros farmacocineticos podem ser modulados atraves do uso de bioconjugados de acido nucleico da invengao. Exemplos nao-limitativos de tais bioconjugados sao descritos em Vargeese et al·, USSN 10/201.394, depositado em 13 de agosto de 2001; e Matulic-Adamic et al., USSN 60/362.016, depositado em 6 de margo de 2002.
As moleculas de acido nucleico, em suas varias modalidades, de acordo com a presente invensao, ο vetor, celula, medicamento, composigao e em particular composigao farmaceutica contendo a mesma, tecido e ani- mal, respectivamente, de acordo com a presente invengao contendo uma tal molecula de acido nucleico podem ser usados tanto para um campo terapeu- tico como tambem no campo de diagnostico e investigagao.
Devido a distribuigao de PKN3 em varios tecidos e endotelio vascular envolvido nas doengas a seguir, a molecula de acido nucleico, de acordo com a presente invengao, pode ser usada para ο tratamento e/ou
preven?ao das ditas doengas, preferivelmente doengas que sao caracteriza- das envolvendo, preferivelmente no mecanismo patologico ou ο tecido doen- te, celulas, preferivelmente celulas tumorals que sao PTEN-negativas.
Consequentemente, as moleculas de acido nucleico como reve- Iadas aqui e os medicamentos e composi?0es farmaceuticas contendo as mesmas podem ser usadas para terapias tanto pro como antiangiogenicas incluindo doengas caracterizadas ou causadas por angiogenese insuficiente, anormal ou excessiva. Tais doengas compreendem doengas infecciosas, distiirbios autoimunes, malformagao vascular, aterosclerose, arteriopatia de transplante, obesidade, psoriase, verrugas, dermatite alergica, sindrome vi- trea hiperplastica persistente, retinopatia diabetica, retinopatia de pre- maturidade, doer^a macular relacionada a idade, neovascularizagao coroi- dal, hipertensao pulmonar primaria, asma, polipos nasais, doen?a inflamato- ria do intestino e peridental, ascites, adesoes peritoneais, endometriose, hemorragia uterina, cistos ovarianos, hiperestimulagao ovariana, ovariana, artrite, sinovite, osteomielite, formagao de osteofitos e acidente vascular ce- rebral, Cilceras, aterosclerose e artrite reumatoide.
Outras doengas sao aquelas envolvendo ou caracterizadas por um tecido neoplastico. Como preferivelmente aqui usado, ο termo tecidos neoplasticos refere-se a tecidos que sao gerados por um organismo, tecido ou celulas de tal organismo que nao sao intencionadas ser geradas e que sao julgadas como patologicas, isto e, nao presentes em um sujeito que nao sofre de uma tal respectiva doenga. Tambem, como preferivelmente aqui usado, uma doenga neoplastica e qualquer doenga que, direta ou indireta- mente, surge da presenga de um tecido neoplastico, por meio do qual prefe- rivelmente tal tecido neoplastico surge do crescimento desregulado ou des- controlado, preferivelmente autonomo de um/o tecido. O termo doengas ne- oplasticas preferivelmente tambem compreende doenpas neoplasticas be- nignas como tambem malignas. Mais preferivelmente, as doengas neoplasti- cas sao selecionadas do grupo que compreende qualquer cancer, por e- xemplo, de osso, mama, prostata, sistema digestivo, colorretal, figado, pul- mao, rim, urogenital, pancreatico, pituitario, testicular, orbital, cabega e pes-
οοςο, sistema nervoso central, respiratorio. Outras doensas especificas que, em principio, podem ser trata- das usando a composi^ao farmaceutica e ο medicamento de acordo com a presente invengao, compreendendo tal composi^ao de Iipidio e lipoplex, res- pectivamente, podem ser tiradas da Iista a seguir: Leucemia Linfoblastjca Aguda1 (Adulta), Leucemia Linfoblastica Aguda, (InfantiI)1 Leucemia Mieloide Aguda, (Adulta), Leucemia Mieloide Aguda, (lnfantil), Carcinoma Adrenocor- tical, Carcinoma Adrenocortical, (lnfantil), Canceres Relacionados a AIDS, Linfoma Relacionado a AIDS, Cancer Anal, Astrocitoma, (lnfantil), Astrocito- ma Cerebelar, (lnfantil) Cerebral, Cancer do Duto Biliar, Extra-Hepatico, Cancer da Bexiga, Cancer da Bexiga, (lnfantil), Cancer de Osso, Osteossar- coma/Histiocitoma Maligna Fibrosa, Glioma do Tronco Cerebral, (lnfantil), Tumor Cerebral, (Adulto), Tumor Cerebral, Glioma do Tronco Cerebral, (ln- fantil), Tumor Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, (lnfantil), Tumor Cerebral, Astrocitoma/GNoma Maligno Cerebral, (lnfantil), Tumor Cerebral, Ependimo- ma, (lnfantil), Tumor Cerebral, Meduloblastoma, (lnfantil), Tumor Cerebral, Tumores Neuroectodermicos Primitivos Supratentoriais, (lnfantil), Tumor Ce- rebral, Glioma da Via Visual e Hipotalamica, (lnfantil), Tumor Cerebral, (ln- fantil), Cancer de Mama, Cancer de Mama, (lnfantil), Cancer de Mama, Mas- culino, Adenomas/Carcinoides Bronquiais, (lnfantil), Linfoma de Burkitt, Tu- mor Carcinoide, (lnfantil), Tumor Carcinoide, Gastrointestinal, Carcinoma Desconhecido Primario1 Linfoma do Sistema Nervoso Central, Primario1 As- trocitoma Cerebelar, (lnfantil), Astrocitoma/Glioma Maligno Cerebral, (lnfan- til), Cancer Cervical, Leucemia Linfocitica Cronica, Leucemia Mielogenosa Cronica, DistCirbios Mieloproliferativos Cronicos, Cancer de Colon, Cancer Colorretal, (lnfantil), Linfoma de Celulas T Cutaneas, Cancer Endometrial, Ependimoma, (lnfantil), Cancer Esofagiano, Cancer Esofagiano1 (lnfantil), Familia de Tumores de Ewing, Tumor de Celula Germinal Extracraniana, (lnfantil), Tumor de Celula Germinal Extragonadal, Cancer do Duto Biliar Ex- tra-Hepatico, Cancer de Olho1 Melanoma Intraocular, Cancer de Olho1 Reti- noblastoma, Cancer da Vesicula Biliar, Cancer Gastrico (Estomago), Cancer Gastrico (Estomago), (lnfantil), Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumor de
Celula Germinal, Extracraniano1 (lnfantil), Tumor de Celula Germinal, Extra- gonadal, Tumor de Celula Germinal, Ovariano, Tumor Trofoblastico Gesta- cional, Glioma, (AduIta)1 Glioma, (InfantiI) Tronco Cerebral, Glioma, (InfantiI) Astrocitoma Cerebral, Glioma, (InfantiI) Via Visual e Hipotalamica, Leucemia de Celula Pilosa, Cancer de Cabega e Pescogo1 Cancer Hepatocelular (Fi- gado), (AduIta) (Primario), Cancer Hepatocelular (Figado), (InfantiI) (Prima- rio), Linfoma de Hodgkin, (Adulta), Linfoma de Hodgkin, (lnfantil), Cancer Hipofaringeo1 Glioma Hipotalamica e Via Visual, (lnfantil), Melanoma Intrao- cular, Carcinoma de Celulas da Ilhota (Pancreas Endocrino), Sarcoma de Kaposi, Cancer de Rim (Celula Renal), Cancer de Rim, (lnfantil), Cancer La- ringeo, Cancer Laringeo1 (lnfantil), Leucemia Linfoblastica Aguda, (Adulta), Leucemia, Agudo Linfoblastica, (lnfantil), Leucemia, Aguda Mieloide, (Adul- ta), Leucemia, Aguda Mieloide1 (lnfantil), Leucemia, Cronica Linfocitica Leu- cemia, Cronica Mielogenosa, Leucemia, Celula Pilosa, Cancer de Labio e Cavidade Oral, Cancer do Figado, (Adulta) (Primario), Cancer do Figado, (lnfantil) (Primario), Cancer Pulmonar1 Celula Nao-Pequena1 Cancer Pulmo- nar, Celula Pequena, Linfoma, Relacionado a AIDS, Linfoma1 de Burkitt1 Lin- foma, Celulas T Cutaneas, Linfoma, Hodgkin, (Adulta), Linfoma, Hodgkin, (lnfantil), Linfoma, Nao-Hodgkin1 (Adulta), Linfoma, Nao-Hodgkin, (lnfantil), Linfoma, Sistema Nervoso Central Primario, Macroglobulinemia, Histiocitoma Fibroso Maligno de Waldenstrom do Osso/Osteossarcoma, Meduloblastoma, (lnfantil), Melanoma, Melanoma, Intraocular (Olho), Carcinoma de Celula de Merkel, Mesotelioma, (Adulta) Maligno, Mesotelioma, (lnfantil), Cancer de Pescogo Escamoso Metastatico Com Sindrome de Neoplasia Endocrina MCiItipIa Oculta Primaria1 (lnfantil), Mieloma/Neoplasma de Celula do Plasma Multiplo, Micose Fungoide, Sindromes Mielodisplasticas, Doengas Mielodis- plasticas / Mieloproliferativas, Leucemia Mielogenosa, Cronica, Leucemia Mieloide, (Adulta) Aguda, Leucemia Mieloide, (lnfantil) Aguda, Mieloma, ΜύΙ- tiplo, DistCirbios Mieioproliferativos, Cronicos1 Cancer da Cavidade Nasal e Seio Paranasal, Cancer Nasofaringeo, Cancer Nasofaringeo, (lnfantil), Neu- roblastoma, Linfoma de Nao-Hodgkin, (Adulto), Linfoma de Nao-Hodgkin, (lnfantil), Cancer de Celula Nao-Pequena Pulmonar, Cancer Oral, (lnfantil),
Cancer de Cavidade Oral, Cancer de Labio e Orofaringeo, Osteossarco- ma/Histiocitoma Maligno Fibroso de Osso1 Cancer Ovariano, (lnfantil), Can- cer Epitelial Ovariano, Tumor de Celula Germinal Ovariana, Tumor de Po- tencial Maligno Ovariano Baixo, Cancer Pancreatico, Cancer Pancreatic。, (lnfantil), Cancer Pancreatico, Celulas da IIhota, Cancer de Seio Paranasal e da Cavidade Nasal, Cancer de Paratiroide, Cancer Peniano, Feocromocito- ma, Pineoblastoma e Tumores Neuroectodermicos Primitivos Supratentori- ais, (lnfantil), Tumor Pituitario, Neoplasma de Celula Plasmatica/Mieloma MCiltiplo, Blastoma Pleuropulmonar, Gravidez e Cancer de Mama, Gravidez e Linfoma de Hodgkin, Gravidez e Linfoma de Nao-Hodgkin1 Linfoma do Sis- tema Nervoso Central Primario, Cancer de Prostata, Cancer Retal, Cancer de Celula Renal (Rim), Cancer de Celula Renal (Rim), (lnfantil), Pelvis Renal e Ureter, Cancer de Celula Transicional, Retinoblastoma, Rabdomiossarco- ma, (lnfantil), Cancer de Glandula Salival, Cancer de Glandula Salival, (ln- fantil), Sarcoma, de Ewing, Sarcoma, de Kaposi, Sarcoma, de Tecido Macio, (Adulta), Sarcoma, de Tecido Macio1 (lnfantil), Sarcoma, Uterino, Sindrome de Sezary, Cancer de Pele (Nao-Melanoma), Cancer de Pele1 (lnfantil), Can- cer de Pele (Melanoma), Carcinoma de Pele, Celula de Merkel, Cancer de Celula Pequena Pulmonar, Cancer de Intestino Delgado1 Sarcoma de Tecido Macio, (Adulto), Sarcoma de Tecido Macia, (lnfantil), Carcinoma de Celula Escamosa1 Cancer de Pescogo Escamosa Com Cancer de Estomago Me- tastatico Oculto Primario (Gastrico), Cancer de Estomago (Gastrico), (lnfan- til), Tumores Neuroectodermicos Primitivos Supratentoriais1 (lnfantil), Linfo- ma de Celulas T, Cutaneas, Cancer Testicular, Timoma, (lnfantil), Timoma e Carcinoma Timico, Cancer da Tiroide Cancer Tiroide1 (lnfantil), Cancer de Ceiula Transitiva da Pelvis Renal e Ureter, Tumor Trofoblastico, Gestacional, Ureter e Pelvis Renal, Cancer de Celula Transicional, Cancer Uretral1 Cancer Uterino, Endometrial, Sarcoma Uterina, Cancer Vaginal, Glioma da Via Visu- al e Hipotalamica, (lnfantil), Cancer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Tumor de Wilms. Alem de PKN3 estar envolvida em angiogenese, mais especifi-
camente na inibigao de motilidade de celulas endoteliais que contribuem pa-
ra a angiogenese tumoral e migragao dos tumores, mais especificamente no caso de cancer da prostata (c.f. Leenders et al., 2004, EMBO J., 23 (16):3303-3313), PKN3 faz parte da via de PI3-cinase.
A via de PI3-cinase e caracterizada por uma atividade de PI3- cinase sob indugao do fator de crescimento e uma via de sinalizagao parale- la. Estimulagao do fator de crescimento das celulas leva a ativagao de seus receptores cognatos a membrana celular que por sua vez associa-se e ativa as moleculas de sinalizagao intracelulares tais como Pl 3-cinase. Ativagao de Pl 3-cinase (consistindo em uma subunidade p85 reguladora e uma p110 catalitica) results na ativagao de Akt atraves de fosforilagao, assim supor- tando respostas celulares a jusante tais como proliferagao, sobrevivencia ou migragao tambem. PTEN e desse modo um supressor de tumor que esta envolvido na via de fosfatidilinositol (PI) 3-cinase e que foi extensivamente estudada no passado por seu papel na regulagao de crescimento das celu- las e transformagao (para revis5es vide, Stein, R. C. e Waterfield1 M. D. (2000). PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today 6, 347-357; Vazquez, F. e Sellers, W. R. (2000). The PTEN tumor suppres- sor protein: an antagonist of phosphoinositide 3- kinase signaling. Biochim Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D. e Siegers, H. (2001). Phosphatidy- Iinositol 3-kinases in tumor progression. Eur J Biochem 268，487-498). O PTEN supressor de tumor funciona como um regulador negativo de Pl 3- cinase invertendo a reagao catalisada por Pl 3-cinase e assim assegura que a ativagao da via ocorra de uma maneira transiente e controlada. Hiperativa- ς§ο cronica da sinalizagao de Pl 3-cinase e causada por inativagao funcional de PTEN. Atividade de Pl 3-cinase pode ser bloqueada por adigao do inibi- dor de molecula pequena LY294002. A atividade e respostas a jusante da sinalizagao de MEK cinase que atua em uma via paralela, pode, por exem- plo, ser inibida pelo inibidor de molecula pequena PD98059.
Uma ativapao cronica da via de Pl 3-cinase atraves da perda da fungao de PTEN e uma contribuinte principal para tumorigenese e metasta- se, indicando que este supressor de tumor represents um ponto de verifica- gao importante para uma proliferagao controlada das celulas. Celulas des-
providas de PTEN mostram caracteristicas similares como celulas em que a via de Pl 3-cinase foi cronicamente induzidas por meio de formas ativadas de Pl 3-cinase (Di Cristofano1 A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C. e Pandolfi, P. P. (1998). PTEN is essential for embryonic development and tumour sup- pression. Nat Genet 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo1 Μ. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, Μ. A., Kavanaugh, W. M. e Williams, L. T. (1998). Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic trans- formation. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K·, Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. and Fukui, Y. (1999). De- differentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-
kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4874-4879).
Dediferenciagao de adenocarcinomas por ativagao de fosfatidilinositol 3-cinase. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4874-4879).
PTEN esta envolvido em varias vias que sao tambem referidas como vias relacionadas a PTEN tais como a via de PI3K/PTEN, a via de Akt1 a alga autocrina relacionada a EGF e a via de mTOR. Uma via de PI3-cinase e de fato qualquer via que envolva Pl 3-cinase, direta ou indiretamente. Pl 3- cinase ou pode agir como um inibidor ou como um ativador em tal via, ou pode tambem ser regulada por outros elementos da via. Ha muito da tecnica anterior descrevendo doengas e condigdes
que envolvem a via de Pl 3-cinase. Qualquer uma destas condigoes e doen- ?as pode ser desse modo tratada pelos metodos inventivos e os farmacos e agentes diagnosticos, ο projeto, triagem ou fabrica^ao dos mesmos sao en- sinados aqui. Por motivo de ilustragao, mas nao limitagao, refere-se as se- guintes: cancer endometrial, carcinomas colorretais, gliomas, canceres en- dometrials, adenocarcinomas, hiperplasia endometrials, sindrome de Cow- den, carcinoma colorretal de nao-polipose hereditaria, sindrome de Li- Fraumene, cancer de mama-ovariano, cancer de prostata (Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11，07 de junho de 2000，pagi- nas 861 - 863)，sindrome de Bannayan-Zonana1 LDD (sindrome de Lhermit- te-Duklos) (Macleod, K., supra) doengas de hamartoma-macrocefalia inclu- indo doenga da Vaca (CD) e sindrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR),
Iesoes mucocutaneas (por exemplo triquilemonmas), macrocefalia, retarda- mento mental, harmatomas gastrointestinais, lipomas, adenomas tiroides, doenga fibrocistica da mama, gangiiocitoma displasico cerebelar e maligni- dades da mama e tiroide (Vazquez, F., Sellers, W. R., supra).
Em vista disto, PKN3 e um alvo de farmaco valioso a jusante da via de Pl 3-cinase que pode ser tratada por farmacos que terao menos efei- tos colaterais que outros farmacos direcionados a alvos a montante de PKN3. Tendo controle nesta fragao particular de moleculas efetoras, isto e, a proteina PKN3 e qualquer molecula tambem a jusante envolvida na via, a- penas um niimero muito Iimitado de ramifica?5es paralelas das mesmas ou tambem ο alvo a montante na cascata de sinalizagao e provavel de causar efeitos indesejados. Portanto, as outras atividades da via de PI-3 kina- se/PTEN relacionado ao ciclo celular, reparo de DNA1 apoptose, transporte de glicose, translagao nao serao influenciadas. Tambem, a sinalizagao de insulina nao e induzida que significa que as respostas diabeticas ou outros efeitos colaterais observados com relagao ao uso de LY294002 sao de fato evitados. LY294002 (2-(4-morfolinil)8-fenilcromona) e um dos varios deriva- dos de inibidor de cromona de molecula pequena desenvolvido por Lilly Re- search Laboratlories (Indianapolis) como um inibidor para PI-3K (Vlahos et al. 1994，JBC 269’ 5241 - 5248). Ele alveja sua subunidade catalitica da mo- Iecula de PI-3K, p110 e funciona competindo com Iigagao de PAD no centro catalitico. Porem, LY294002 nao pode distinguir entre as isoformas diferen- tes de p110 (alfa, beta, gama, delta) que sao sugeridas ter fungoes celulares diferentes.
PKN3 e tambem mais a jusante de mTOR que e tratado atraves de rapamicina. mTOR (Alvo de Rapamicina mamifero), tambem conhecido como Raft ou FRAP, esta agindo a jusante de Pl 3-cinase para regular os processos tais como a entrada dependente de pp70 S6 cinase no ciclo celu- lar. mTOR atua como um sensor para fator de crescimento e disponibilidade de nutriente para controlar translagao ativando pp70 S6 cinase e fator de iniciagao 4E. Fungao de mTOR e inibida pelo macrolideo bacteriano, rapa- micina, que bloqueia ο crescimento das celulas T e certas celulas tumorals
(Kuruvilla e Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136). O fato que rapamicina e seus derivados sao farmacos adequa- dos que sao correntemente usados nas provas clinicas que um aIvo de far- maco e ο mais Citil e tern os menores efeitos colaterais, ο mais especifico e para um mecanismo molecular particular como, por exemplo, demonstrado por Yu et al. (Yu, K., et al (2001) Endrocrine-ReIatCanc 8, 249).
PKN3 e um membro da familia de proteina cinase C, todos estas sao ditos ser proteina-serina/treonina cinases. Tipicamente, este tipo de pro- teina cinase compreende um regulador e uma subunidade cataIitica e usa ions de calcio e fosfolipideos como co-fatores. Glicerois de ciacila atuam como ativador deste tipo de familia de proteina cinase. Membros da familia de proteina cinase C estao envolvidos em varias vias de sinalizagao Iigadas a hormonios ou neurotransmissores. Estas proteina cinases regulam a ativi- dade de suas proteinas aIvo atraves de fosforilagao. έ conhecido na tecnica que ativagao nao-fisiologica continuada da proteina cinase C resulta no feno- tipo celular transformado que poderia Ievar a geragao de cancer.
A sequencia com ρ Ieta de PKN3 como mRNA esta disponivel em ban cos de dados, por exemplo, sob niimeros de acesso gi 7019488 ou NM—013355. Usando ο codigo genetico, a sequencia de aminoacido particu- lar pode ser deduzida deste mRNA. Tambem, a sequencia de aminoacido de PKN3 esta disponivel em bancos de dados sob ο niimero de acesso gi 7019489 ou NP—037487.1.
Homologos para PKN3 humano podem ser encontrados, entre outros, em M. musculus, R. norvegicus, A. thaliana, C. elegans, D. melano- gaster e S. cerevisiae. O porcentual de identidade e comprimento da regiao alinhada sao 67% e 279 aminoacidos, 51% e 866 aminoacidos, 38% e 305 aminoacidos, 36% e 861 aminoacidos, 63% e 296 aminoacidos e 44% e 362 aminoacidos, respectivamente, para as varias especies mencionadas antes. Sera reconhecido pelos versados na tecnica que qualquer um destes ou ou- tros homologos serao, em principio, adequados para a pratica da presente invengao, a menos que ο farmaco gerado usando tal homologo ainda possa interagir com a proteina cinase humana N beta ou qualquer outra proteina
cinase N beta intencionada. A sequencia de amino治cido humana pode tambem ser tirada de ProtEST’ nOmero de acesso pir: JC7083 onde a respectiva proteina cinase N beta e referido como proteina cinase JC7083. O gene para proteina cinase humana N beta esta Iocalizado no cromossomo humano nOmero 9. Fontes de cDNA para proteina cinase N beta sao em geral varies canceres e varies tecidos fetais ou embrionarios, mais particularmente, entre outros, estomago, adenocarcinoma, cerebro, mama, burkitt, linfoma, cerviz, condrossarcoma, c0lon’ olhos fetais, Iente fetal, segmento anterior do olho fetal, nervo otico fetal, retina fetal, fovea da retina fetal, coraide fetal macular fetal, fibroteoma, Iinha germinal, cabepa e pesco?o, coragao, rim, carcinoma de celula grande’ Ieiomiossarcoma condrossarcoma metastatico, ovario, paratiroide, retino- blastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de celula pequena, carcinoma de celula escamosa, testiculos, e utero. Desta Iista e obvio que ο farmaco, que e tambem referido aqui como um medicamento, pode alem de quaisquer das outras doengas como reveladas aqui e as condigoes de doenga como reve- Iadas aqui tambem ser usado para ο tratamento e/ou prevengao, de quais- quer destas doengas ou qualquer doen?a envolvendo as celulas especificas, tecidos ou orgaos. Estas doen?as e condigoes de doen?a devem tambem ser compreendidas pelo termo "doen^a como descrita aqui".
A(s) doen?a(s) como descrita(s) aqui como tambem a(s) condi- ?§o(des) da doen?a como descrita(s) aqui que pode(m) ser tratada(s) e/ou impedida(s) pelas moleculas de acido nucleico e medicamentos contendo as mesmas, de acordo com a presente invenpao, tambem compreendem tumo- rigenese e metastase. Isto se aplica particularmente as doen?as como des- critas aqui e as condigoes de doenga como descritas aqui, onde as celulas envolvidas em tais doengas ou condi^es de doen?a sao negativas de PTEN que significa que ο PTEN supressor de tumor nao e ativo ou tem um nivel reduzido da atividade. As doengas tambem compreendem aquelas doengas em que a via de Pl 3-cinase esta envolvida em geral. Alem dos tumores me- tastaticos em particular, diabetes pertence a este tipo de doengas e condi- ？0es de doen?a, respectivamente. Portanto, celulas, particularmente aquelas que estao envolvidas na doenga ou condigao de doenga como descrita aqui e que sao PTEN negativos, sao suscetiveis ao tratamento por um farmaco, ο modo de agao e tal como reduzir ou eliminar a atividade de PKN3 nas res- pectivas celulas envolvidas. Consequentemente1 pacientes por cujos tumo- res sao caracterizados por uma via de Pl 3-cinase preferivelmente hiperati- vada, incluindo mas nao Iimitada a, ou atraves de amplificagao ou mutagao de genes que codificam componentes da via de Pl 3-cinase (p110, Akt) ou sao PTEN negativos ou que tem celulas que sao PTEN negativas, particu- Iarmente se estas celulas estiverem envolvidas na doenga como descrita aqui ou na condigao de doenga como descrita aqui, podem vantajosamente ser tratados usando os ditos farmacos. Tal redugao na atividade pode origi- nar-se de uma redugao para ο nivel de transcrigao ou para ο nivel da trans- lagao, isto e, a atividade enzimatica de PKN3. Sem querer estar preso a qualquer teoria, ο aspecto posterior, isto e, modificagao da atividade do PKN3 e tambem causada pelas caracteristicas de PKN3, a saber, que a ati- vidade enzimatica de PKN3 pode tambem ser supra e infrarregulada, mais preferivelmente infrarregulada.
Um grupo tambem de pacientes que podem ser vantajosamente tratados usando os ditos farmacos sao aqueles que sofrem de canceres ten- do uma incidencia aIta para perda de fungao de PTEN1 especialmente em tumores de estagio tardio (Cantley e Neel, 1999). Perda de PTEN correlata com comportamento agressivo e invasivo aumentado das respectivas celu- las tumorals.
έ para ser reconhecido que as varias doengas descritas aqui para ο tratamento e prevenpao das quais a composigao farmaceutica de a- cordo com a presente inveng§o pode ser usada, sao tambem aquelas doen- gas para a prevengao e/ou tratamento das quais ο medicamento descrito aqui pode ser usado, e vice-versa.
Como aqui usado ο termo tratamento de uma doen9a deve tam- bem compreender prevenpao de tal doenga. Mais caracteristicas, modalidades e vantagens podem ser tira-
das das figuras a seguir.
Figura 1 - e um diagrama esquematico ilustrando ο envolvimento de PKN3 na via de 3-PI.
Figura 2 - mostra ο resuItado de uma analise de Western blot de um experimento de "knockdown" usando siRNAs especificos para PKN3 em Iinhagens celulares humanas (HeLa, HUVEC) e uma Iinhagem celular de camundongo (EOMA).
Figura 3 - mostra ο resultado de um experimento de knockdown usando concentragoes diferentes de molecula de siRNA especifica para PKN3 formulada como um Iipoplex para determinar a IC 50 das moleculas de siRNA em celulas HeLa e HUVEC. Figura 4 - mostra ο resultado de uma analise de Western blot de
um experimento de "knockdown" usando uma molecula de siRNA especifica para PKN3 e uma molecula antissentido especifica para PKN3 como um controle, por meio do qual a eficacia das ditas moleculas em termos de po- tencia de knockdown foi avaliada em pontos de tempo diferentes. Figura 5 - mostra ο resultado de uma analise de Western blot de
um experimento de "knockdown", por meio do qual concentragoes diferentes de Iipoplexes de siRNA especificos para PKN3 foram usadas que exibiram um grupo fosfato na terminagao 3' ou nao.
Figura 6 - mostra ο resultado de uma analise de Western blot de um experimento de "knockdown" usando moleculas de siRNA especificas para PKN3 diferente (Figura 6A) e fotomicrograficos ilustrando a fungao de perda-de-PKN3 no crescimento de HUVEC em matriz extracelular (Figura 6B).
Figura 7 - ilustra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo de moleculas de siRNA especificas para PKN3 (Figura 7A) e ο impacto de tais moleculas no volume do tumor (Figura 7B) e peso do corpo (Figura 7C) em um modelo de camundongo de tumor de xenoenxerto de PC-3 s. c.
Figura 8 - ilustra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo de uma molecula de siRNA especifica para PKN3 (Figura 8A) e ο im- pacto de doses diferentes de tal molecula de siRNA expressa como porcen- tagem de peso do corpo ou volume do tumor (Figura 8B), e ο impacto de
diferentes programas de tratamento usando tal molecula expressa como porcentagem de peso do corpo ou volume do tumor (Figura 8C) em um mo- delo de camundongo de tumor de xenoenxerto de PC-3 s. c.
Figura 9 - ilustra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo de uma molecula de siRNA especifica para PKN3 (Figura 9A), ο impac- to da dita molecula no volume do tumor de prostata e metastases de Iinfono- do (Figura 9B) e ο impacto da dita molecula na redugao de mRNA de PKN-3 e de Tie2 em tecido pulmonar em um modelo de camundongo de tumor de xenoenxerto de PC-3 intraprostatico (Figura 9C).
Figura 10 - ilustra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo de esquemas de tratamento diferentes usando uma molecula de siRNA especifica sob administragao sistemica (Figura 10A) e ο impacto de tais es- quemas de tratamento diferentes no volume do tumor de prostata (Figura 10 B) e no volume da metastases de Iinfonodo (Figura 10C) em um modelo de camundongo de tumor de xenoenxerto de PC-3 intraprostatico. Figura 11 - ilustra ο projeto experimental para testar a eficacia in
vivo de varias doses de uma molecula de siRNA especifica para PKN-3 sob administrate sistemica (Figura 11A) e ο impacto das ditas varias doses no volume do tumor de prostata (Figura 11 B) e no volume da metastases de Iinfonodo (Figura 11 C). Figura 12A - mostra os compostos que formam ο lipoplex.
Figura 12B - mostra um esquematico ilustrando a estrutura dos Iipoplexes de acordo com a presente invengao comparados aos lipossomas.
Figura 13 - mostra ο resuItado de uma analise de Western blot de um experiment。de "knockdown" usando uma molecula de siRNA especi- fica para PKN3 tendo 19 pares de base ou 23 pares de base.
Figura 14 - mostra ο resultado de uma Analise de Western blot de um experimento de "knockdown" usando moleculas de siRNA especificas para PKN3 diferentes.
Figural 5 - mostra ο resultado de uma Analise de Western blot de um experimento de "knockdown" usando moleculas de siRNA tendo 19 pares de base ou 23 pares de base em tres Iinhagens celulares diferentes, por meio do qual as moleculas de siRNA sao usadas em concentragoes dife- rentes.
Figura 16 - mostra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo das moleculas de siRNA especificas para PKN3 (Figura 16A) e ο im- pacto de tais moleculas de siRNA especificas para PKN3 tendo 19 pares de base ou 23 pares de base, na redugao em volume do tumor de prostata (Fi- gura 16B), volume das metastases de Iinfonodo (Figura 16C) e propagapao metastatica de Iinfonodo (Figura 16D) em um modelo de camundongo de cancer de prostata ortotopico.
Figura 17 - mostra ο projeto experimental para testar a eficacia in vivo de varias doses de uma molecula de siRNA especifica para PKN3 compreendendo 23 pares de base (Figura 17A) e ο impacto de tais varias doses na redugao em volume do tumor de prostata (Figura 17B), volume das metastases de Iinfonodo (Figura 17C) e propaga^ao metastatica de Iinfonodo (Figura 17D) em um modelo de camundongo de cancer de prostata ortotopi- co.
EXEMPLO 1: MATERIAIS e METODOS ‘ TRANSFECCAO IN VITRO e IMUNOTINGIMENTO; ANTICORPOS
Linhagens celulares foram transfeccionadas com siRNA usando os Iipossomas cationicos descritos acima. Brevemente, cerca de 12 horas apos semeadura das celulas, quantidades diferentes de solu^ao de siRNA- Iipoplex diluida em 10% de meio contendo soro foram acrescentadas as ce- lulas para alcan^ar concentragoes de transfecgao em uma faixa de 1-50 nM de siRNA. Apos transfecgao (48 h), as celulas foram Iisadas e submetidas ao imunotingimento como descrito (Klippel et al.’ 1998). Concentragao da prote- ina foi determinada com um DC Protein Assay (BioRad) e quantidades iguais foram carregadas para analise de imunotingimento usando os anticorpos a seguir: anti-PTEN de coelho (Ab-2, Neomarkers), Akt-1, antiPKN3 de coelho (Leenders et al., 2004). LINHAGENS CELULARES Linhagens celulares PC-2, HeLa1 HUVEC (celulas endoteliais
humanas da veia umbilical), e EOMA foram e cultivadas de acordo com a
recomendagao da ATCC. XENOENXERTO DO Tl JM门P Camundongos Hsd:NMRI-nu/nu (8 semanas de idade) foram USad0S neste estud0. Para terapia dos experimentos de tumor em xenoen- XertOS de tumor estabelecidos, um total de 5,0 χ 106 celulas de tumor/100 μΙ de PBS) foi implantado subcutaneamente. Volume do tumor foi determinado USand0 um calibrador e calculado de acordo com a formula: volume = (com- Priment0 x lar9ura2)/2· Para terapia dos experimentos do tumor, solu9ao de siRNA-lipoplex foi administrada i.v. atraves de injegao da veia caudal de bai- xa pressao, baixo volume. No modelo de tumor ortotopico, 2,0 χ 106 celulas de PC-3/30口丨 de PBS foram injetadas no Iobulo dorsolateral esquerdo da gl^ndula Prost^tica sob anestesia total (Stephenson et al„ 1992). Os animais foram mortos 50 dias pos-operagao e os volumes dos tumores (glandula prostatica) e metastase regionais (metastases de Iinfonodo caudal, Iombar e renal) foram determinados como mencionado acima.
Para tratamento i.v., siRNA-lipoplexes foram executados admi- nistrando Iipoplexes de siRNA intravenosamente atraves de injegao Onica da veia caudal de 200 μΙ de solu?ao a uma dose final de 1,88 mg/kg de siRNA e
14’5 mg/kg de Iipidio ou para doses variantes de horarios diferentes das mesmas (como indicado). ANALISE ESTATiSTICA
Dados sao expressados como media ± s.e.m· Significagao esta- tistica das diferengas foi determinada pelo teste U de Mann-Whitney. Valores P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. ENSAIO DE MATRIGEI
Para crescimento das celulas do ensaio em matriz de Matrigel, HUVEC foram transfeccionados com siRNAs por 48 h. Apos tripsinizagao, as celulas foram semeadas em duplicatas em placas de 24 pogos (110.000 ce- Iulas por pogo) pre-revestidos com 250 μΙ de matriz de membrana de base de Matrigel) e fotografias microscopicas foram tiradas em ampliagao de x1’25 ou de x2,5 com uma camera Axiocam Iigada a um microscopio Axio- vert S100 20 horas p0s-coloca?ao na placa. EXEMPLQ 2: MOLECULAS siRNA DE PKN.? As moleculas de acordo com a presente invengao que sao tam- bem referidas aqui como moleculas de siRNA (AtuRNAi, vide Tabela 1a e 1b.) e em que foram usadas neste estudo sao como descritas em (Czauder- na et al.’ 2003) e foram sintetizadas por BioSpring (Frankfurt a. M., Alema- nha).
Os duplexes da ditas moleculas sao formados pelos respectivos filamentos sentido e antissentido que sao cada indicados na Tabela 1a e 1b entre na dire^ao 5' -> 3'. Portanto, a molecula bifilamentar e formada combi- nando ο respectivo filamento sentido e antissentido, por exemplo PKN3-hm- 1s e PKN3-hm-1as formando uma molecula tendo uma estrutura bifilamen- tar, que esta no exemplo especifico tambem referida aqui como PKN3 (1). Porem, as moleculas sao de terminagao cega, cada filamento formando a molecula bifilamentar tern um fosfato Iigado a termina^ao 3·, mais especifi- camente a terminagao 3ΌΗ terminal. As moleculas sao estabilizadas quimi- camente alternando a modificagao de a^car de 2'-0-metila em ambos os filamentos, por meio do qual face de nucleotideos inalterados modificada no filamento oposto como tambem pode ser obtida da Tabela 1a. Estas molecu- las bifilamentares sao modalidades particularmente preferidas das moleculas do acido nucleico de acordo com a presente invengao. Tabela 1a:
PKN3 (1): s agcugaagaucaaggaggg (SEQ. ID. No. 2) as cccuccuugaucuucagcu (SEQ. ID. No. 3) PKN3 (2): s cuugaggacuuccuggaca (SEQ. ID. No. 4) as uguccaggaaguccucaag (SEQ. ID. No. 5) PKN3 (3): s uugaggacuuccuggacaa (SEQ. ID. No. 6) as uuguccaggaaguccucaa (SEQ. ID. No. 7) PKN3 (4): s aggacuuccuggacaaugc (SEQ. ID. No. 8) as gcauuguccaggaaguccu (SEQ. ID. No. 9) PKN3 (5): s ccuggacaaugccugucac (SEQ. ID. No. 10) as gugacaggcauuguccagg (SEQ. ID. No. 11) PKN3 (6): s gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12) as gaccuucccaaaguguccc (SEQ. ID. No. 13) PKN3 (7): S uugggaagguccuccuggu (SEQ. ID. No. 14) as accaggaggaccuucccaa (SEQ. ID. No. 15) PKN3 (8): S cuccagccaugccugcuuu (SEQ. ID. No. 16) as aaagcaggcauggcuggag (SEQ. ID. No. 17) PKN3 (9): S auucagaagcuccuccaga (SEQ. ID. No. 18) as ucuggaggagcuucugaau (SEQ. ID. No. 19) PKN3 (10): S ucagaagcuccuccagaag (SEQ. ID. No. 20) as cuucuggaggagcuucuga (SEQ. ID. No. 21) PKN3 (11): S cagaagcuccuccagaagu (SEQ. ID. No. 22) as acuucuggaggagcuucua (SEQ. ID. No. 23) PKN3 (12): S ucuucaggaccaccaacug (SEQ. ID. No. 24) as caguuggugguccugaaga (SEQ. ID. No. 25) PKN3 (13): S cuucaggaccaccaacugg (SEQ. ID. No. 26) as ccaguuggugguccugaag (SEQ. ID. No. 27) PKN3 (14): S ucaggaccaccaacuggca (SEQ. ID. No. 28) as ugccaguuggugguccuga (SEQ. ID. No. 29) Nucleotideos com modificagdes de : Γ-Ο-metila estao sublinha
dos; de tal sublinhar e evidente que todo segundo nucleotideo tem este tipo de modificagao, por meio do qual tal modificapao inicia com ο primeiro nu- cleotideo no filamento antissentido, e com ο segundo nucleotideo no fila- mento sentido (sob a condigao que ο filamento sentido e ο filamento antis- sentido sao descritos na forma de diregao de 5' - 3' da esquerda para a direi- ta).
s represents ο filamento sentido que e tambem referido aqui co- mo ο segundo filamento; e como colocado para ο filamento antissentido que e tambem referido aqui como ο primeiro filamento por meio do qual ο primei- ro filamento compreende uma primeira extensao de nucleotideos contiguos e a dita primeira extensao e pelo menos parcialmente complementar a um acido nucleico aIvo por meio do qual ο alvo nucleico e, como aqui usado, preferivelmente ο acido nucleico que sera degradado ou destilizados.
Estas moleculas sao tambem referidas aqui como siRNAs espe- cificos para PKN3 e foram triadas em duas Iinhagens eeluIares humanas, a saber HeLa1 HUVEC1 e uma Iinhagem celular de camundongo (EOMA). 20 nM de siRNAs foram transfeccionados e imunotingimentos executados de Iisados de eeluIa inteira 48 h pos transfecgao como descrito no exemplo 1. Os resultados estao descritos na Figura 2. Como pode ser deduzido da Figu- ra 2, particularmente preferidas sao moleculas de acido nucleico PKN3 (2), PKN3 (3), PKN3 (4), PKN3 (5)，PKN3 (6), PKN3 (8).
Uma molecula ate mesmo mais preferida e PKN3 (3) que foi feita submetendo a outros estudos.
Com base em PKN3 (3) outras moleculas de siRNA foram proje- tadas que sao apresentadas na tabela 1b a seguir e sao anotadas como PKN3-23-v1 para a molecula que consiste nas moleculas de PKN3-hm- 3A23v1 e PKN3-hm-3B23v1，isto e, filamentos simples, como PKN3-23-v2 para a molecula que consiste nas moleculas de PKN3-hm-3A23v2 e PKN3- hm-3B23v2, isto e, filamentos simples, como PKN3-23-v3 para a molecula que consiste nas moleculas de PKN3-hm-3A23v3 e PKN3-hm-3B23v3, isto e, filamentos simples, como PKN3-23-v4 para a molecula que consiste nas moleculas de PKN3-hm-3A23v4 e PKN3-hm-3B23v4, isto e, filamentos sim- ples, e como PKN3-23-v5 para a molecula que consiste nas moleculas de PKN3-hm-3A23v5 e PKN3-hm-3B23v5, isto e, filamentos simples. O modo que estas moleculas de siRNA sao apresentadas e pro-
jetadas e igual ao descrito com relagao as moleculas de siRNA contidas na tabela 1a. Como pode ser deduzido da tabela 1b, a partir de PKN3 (3), refe- rido na tabela 1b como PKN3-hm-3A19/PKN3-hm-3B19, um total de quatro nucleotideos foi adicionado na terminagao 3' do filamento sentido e na ter- minagao 5' do filamento antissentido (PKN3-23-v1), um total de quatro nu- cleotideos na terminagao 5' do filamento sentido e um total de quatro nucleo- tideos na terminagao 3' do filamento antissentido (PKN3-23-v2), um nucleo- tideo na terminagao 5' e tres nucleotideos na terminagao 3' do filamento sen- tido e tres nucleotideos na terminagao 5' e um nucleotideo na terminagao 3' do filamento antissentido (PKN3-23-v3), dois nucleotideos na terminagao 5' e dois nucleotideos na terminagao 3' do filamento sentido e dois nucleoti-
deos na terminagao 5' e dois nucleotideos na terminagao 3' do filamento 5
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sentido (PKN3-23-v4), e tres nucleotideos na terminagao 5' e um nucleotideo na terminagao 3' do filamento sentido e um nucleotideo na terminagao 5, e tres nucleotideos na terminapao 3' do filamento antissentido (PKN3-23-v5). Os nucleotideos recentemente adicionados sao mostrados na tabela 1b em italico.
Tabela 1b PKN3 (3)
PKN3-hm-3B19 s PKN3-hm-3A19 as PKN3-23-V1 PKN3-hm-3A23v1 as PKN3-hm-3B23v1 s PKN3-23-V2 PKN3-hm-3A23v2 as PKN3-hm-3B23v2 s PKN3-23-v3 PKN3-hm-3A23v3 as PKN3-hm-3B23v3 s PKN3-23-V4 PKN3-hm-3A23v4 as PKN3-hm-3B23v4 s PKN3-23-V5 PKN3-hm-3A23v5 PKN3-hm-3B23v5
uugaggacuuccuggacaa uuguccaggaaguccucaa
uuguccaggaaguccucaagucu agacuugaggacuuccuggacaa
agcauuguccaggaaguccucaa uugaggacuuccuggacaaugcc
auuguccaggaaguccucaagt/c gacuugaggacuuccuggacaai/
cauuguccaggaaguccucaagu acuugaggacuuccuggacaat/g
as s
SEQ. SEQ.
SEQ. SEQ.
SEQ. SEQ.
SEQ. SEQ.
SEQ. SEQ. ID. ID. ID. ID. ID. ID. ID. ID. ID. ID.
No. 6) No. 7)
No. 31) No. 30)
No. 33) No. 32)
No. 35) No. 34)
No. 37) No. 36)
30
gcauuguccaggaaguccucaag (SEQ. ID. No. 39) cuugaggacuuccuggacaauac (SEQ. ID. No. 38) As moleculas de siRNA da tabela 1b foram testadas para sua eficacia de "knockdown" e comparadas a um do siRNA especifico para PKN3 tendo um comprimento de 19 nucleotideos, mais especificamente PKN3 (3). Para tal proposito, celulas B de HeLa foram banhadas em 6 pogos (40 k), transfeccionadas 16h depois com 20 nM e Iisadas para extragao de proteina 48 h apos transfecgao. Se nao explicitamente do contrario indicado, as tecnicas e procedimentos usados com relafao a estas moleculas de siR-
NA sao aqueles descritas aqui na parte de exemplo e mais especificamente 5
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descritas no exemplo 1.
Uma Western blot de Iisados com sonda com anticorpo de anti- PKN3 e anticorpo de anti-PTEN, com ο Liltimo atuando como controle de carga, e descrita na Figura 13. Como pode ser deduzido da Figura 13, PKN3-23-v1 e particularmente eficaz, seguido, em termos de eficacia, por PKN3-23-V4, PKN3-23-V5, PKN3-23-v2 e PKN3-23-v3. Uma molecula de siRNA especifica para Iuciferase compreendendo como ο filamento sentido Luc-siRNA-2B (cguacgcggaauacuucga, SEQ. ID. No 56) e como ο filamento antissentido Luc-siRNA-2A (ucgaaguauuccgcguacg, SEQ. ID. No 57) era usado como controle (KO).
Outras moleculas de siRNA potenciais foram triadas que sao descritas na Tabela 2, por meio do qual ο modo de apresentagao e modifica- ?ao e igual ao descrito nas moleculas de siRNA de conexao mostradas aci- ma nas Tabelas 1a e 1b. Tabela 2
Sequencia
Nome
PKN3-23-19
PKN3-23-hmr-19A
PKN3-23-hmr-19B
PKN3-23-20
PKN3-23-hmr-20A
PKN3-23-hmr-20B
PKN3-23-21
PKN3-23-hmr-21A
PKN3-23-hmr-21B
PKN3-23-22
PKN3-23-hmr-22A
PKN3-23-hmr-22B
PKN3-23-23
PKN3-23-hmr-23A
PKN3-23-hmr-23B
as caguuggugguccugaagaaugg (SEQ. ID. No. 41)
s ccauucuucaggaccaccaacug (SEQ. ID. No. 40)
as ugccaguuggugguccugaagaa (SEQ. ID. No. 43)
s uucuucaggaccaccaacuggca (SEQ. ID. No. 42)
as cuucuggaggagcuucugaauga (SEQ. ID. No. 45)
s ucauucagaagcuccuccagaag (SEQ. ID. No. 44)
as accaggaggaccuucccaaagug (SEQ. ID. No. 47)
s cacuuugggaagguccuccuggu (SEQ. ID. No. 46)
as acuucuggaggagcuucugaaug (SEQ. ID. No. 49)
s cauucagaagcuccuccagaagu (SEQ. ID. No. 48)
PKN3-23-24 5
10
15
20
25
30
PKN3 -23-hmr-24A PKN3 -23-hmr-24B PKN3 -23-25 PKN3- -23-hmr-25A PKN3- -23-hmr-25B PKN3- -23-26 PKN3- -23-hmr-26A PKN3- -23-hmr-26B
as agcuuccucuccuugggggugcc (SEQ. ID. No. 51) s ggcacccccaaggagaggaagcu (SEQ. ID. No. 50)
as aggaccuucccaaaguguccccg (SEQ. ID. No. 53) s cggggacacuuugggaagguccu (SEQ. ID. No. 52)
as agcugcuccaggcggcgguugga (SEQ. ID. No. 55) s uccaaccgccgccuggagcagcu (SEQ. ID. No. 54) Estas moleculas de siRNA descritas na tabela 2 foram triadas em uma triagem primaria em celulas de HUVEC como descritas acima. As eelulas foram banhadas em 6 pogos (40k), transfeccionadas 16h depois com nM de siRNA e 1 pg/ml de AtuFECTOI e Iisadas para extragao de protei- ns 72h apos transfecgao. Um Western blot dos Iisados sondados com anti- PKN3 e anti-PTEN, com ο Ciltimo atuando como controle de carga, e descrito na Figura 14, por meio do qual ut representa sem tratar; Luci representa siRNA de Luciferase como definido acima; e co3 e PKN3-23-V1
PKN3-hm-3A23v1 as uuguccaggaaguccucaagucu PKN3-hm-3B23v1 s agacuugaggacuuccuggacaa
Se nao explicitamente indicado ao contrario, as tecnicas e pro- cedimentos usados com relagao a estas moleculas de siRNA sao aqueles descritos aqui na parte de exemplo e mais especificamente descritos no e- xemplo 1.
EXEMPLO 3: FORMULACAO DE LIPOPLEX DE MOLECULAS DE siRNA ESPECiFICAS PARA PKN3
A formula?百ο de Iipoplex foi preparada como essencialmente descritos em Santel (Santel et al. 2006).
O Iipidio cationico AtuFECTOI (tri-hidrocloreto de p-L-arginil-2,3- L-acido diaminopropi0nico-A/-palmitil-A/-oleil-amida, Atugen AG), ο fosfolipi- deo 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina neutro (DPhyPE) (Avanti Po- lar Lipids Inc., Alabaster, AL) e ο Iipidio sal de sodio de N-(Carbonil-
metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina PEGiIado (DSPE-PEG) (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha) foram mis- turados em uma razao molar de 50/49/1 atraves de re-hidratagao do filme de Iipidio em 300 mM de solugao de sacarose Iivre de RNase esteril para uma concentragao de Iipidio total de 4,34 mg/ml. Se nao indicado ao contrario, tipicamente uma injegao Cinica i. v. para um camundongo de 30 g foi realiza- da a uma dose padrao de 1,88 mg/kg de siRNA e 14.5 mg/kg de lipidio. Tambem, se nao indicou ao contrario, a molecula de siRNA especifica para PKN3 e a molecula de PKN3 (3) como definida no exemplo 2. Os varios compostos que formam os Iipoplexes de acordo com a presente inven^ao, incluindo PKN3 (3), sao descritos na Figura 12A por meio do qual sera en- tendido que a molecula de siRNA especifica pode, em principio, ser qualquer molecula de siRNA como revelada aqui, preferivelmente qualquer molecula de siRNA como mostrado nas tabelas 1a e 1b.
Figura 12B mostra um esquematico ilustrando ο Iipoplex de siR- ΝΑ, isto e, ο complexo formado entre as moleculas de siRNA junto com os Iipidios acima mencionados, isto e, ο lipidio cationico, ο DPhyPE que e tam- bem referido como lipidio auxiliar, e ο lipidio PG, isto e, DSPE-PEG. Os nu- cleotideos em negrito do siRNA especifico para PKN3 indicam uma modifi- capao de 2'-0-metila do nucleotideo individual. EXEMPLO 4: DETERMINACAO DE IC50
A IC50 do Iipoplex formado por moleculas de PKN3 (3) junto com os Iipidios especificados no exemplo 3, que e tambem referido como siRNA-PKN3(3)-lipoplex, foi determinada apos transfecgao em eelulas HeLa e HUVEC. Lisados da proteina foram preparados 48 h pos transfecgao e imunotingimentos com anticorpos especificos para PKN3 e PTEN.
As concentragoes da molecula tratada com Iipoplex (formulado em um lipoplex) de siRNA ("siRNA-PKN3 (3)") foram 1, 5，10 e 20 nM.
Os resultados estao descritos na Figura 3.
Da Figura 3 pode ser deduzido que em celulas HeLa ja uma concentragao de 5 nM de PKN3 de siRNA (3) e adequada para significati- vamente "knockdown" PKN3 no nivel de proteina. O mesmo e tambem ver-
dadeiro para celulas HUVEC, por meio do qual uma concentra?ao Iigeira- mente mais aIta e necessaria para alcangar a extensao muito parecida de "knockdown" como em celulas HeLa. PTEN foi usado como um controle de carga.
Adicionalmente, Iipoplexes formados por moleculas de PKN3 como descritos na tabela 1b aqui, mais especificamente PKN3-23-v1, foram submetidos a titulagao de dose em comparagao a PKN3 (3) sendo um 19mer, em Iinhagens celulares HUVEC e EOMA1 respectivamente. Como descrito nos exemplos precedentes, celulas foram banhadas em 6 pogos (40k), transfeccionadas 16h depois com a concentragao indicada de siRNA e Iisadas para extra?ao de proteina 48h apos transfecgao. Um Western blot dos Iisados sondados com anticorpo de anti-PKN3 e anticorpo de anti-PTEN, com ο Ciltimo atuando como controle de carga, e descrito na Figura 15.
Como pode ser deduzido da Figura 15’ ο siRNA de PKN3-23-v1 e comparavel em eficacia ao PKN3 (3). A IC50 da molecula de 19 mer e 23 mer e avaliada por experimentos de transfecgao de cuItura de celulas segui- do por imunotingimento semiquantiativo e mostrou potencia similar (IC50 - 5 nM) para tres Iinhagens celulares diferentes. Vale a pena destacar que EO- MA e uma Iinhagem celular endotelial derivada de camundongo indicando a atividade para camundongo e ser humano. EXEMPLO 5: EFEITO TRANS旧NTE DAS MOLECULAS DE siRNA ESPE- CIFICAS PARA PKN3
Para mostrar ο carater transiente do efeito de "knockdown" de uma molecula de siRNA especifica para PKN3, a saber siRNA-PKN-3 (3), e de uma molecula antissentido especifica para PKN3 (controle de GB) (Leen- ders et al., 2004) estes moleculas foram transfeccionadas em celulas HeLa. Lisados de proteina onde preparado a 48h, 96h, 144h e 192h. Em cad a ca- so, as celulas foram expostas aos Iipoplexes de siRNA contendo as molecu- las de PKN3 (3), como descritas no exemplo 3 por 24 h e os ditos Iipoplexes de siRNA foram removidos apos as ditas 24 horas. Os resultados estao descritos na Figura 4.
Da Figura 4 que pode ser deduzido que um efeito do PKN3 de
siRNA(3) em PKN3 no nivel de proteina pode ser observado ate 96h, por meio do qual apos 144h a eficacia da molecula de siRNA particular parece ser reduzida e apos 192h essencialmente ο efeito de "knockdown" ja nao pode ser observado. Comparado ao controle de GB, a molecula de siRNA de acordo com a presente invengao, mostra desse modo uma atividade dura- doura mais Ionga comparada a uma molecula antissentido ο "knockdown" desta e diminuindo significativamente ja apos as 96h. EXEMPLO 6: IMPACTO DE UM GRUPO FOSFATO LIGADO NA TERMI- NACAO 3' DE UMA MOLECULA DE SIRNA DE ACORDO COM A PRE- SENTE INVENCAO
Neste exemplo, ο impacto de uma modificagao de 3-fosfato na
termina^ao 3' do filamento sentido e antissentido formando a estrutura bifi- Iamentar ou molecula de acordo com a presente invengao foi estudado, por meio do qual PKN3 (3) foi usado como a molecula de acido nucleico que medeia "knockdown" e a dita molecula de acido nucleico foi formulada para formar os respectivos Iipoplexes como descritos no exemplo preparado 3. Os Iipoplexes desse modo obtidos foram testados em celulas HeLa1 por meio do qual quantidades diferentes da dita molecula foram transfeccionadas de siRNA e lipoplexes, respectivamente, e Iisados de proteina foram prepara- dos 48h pos transfec^ao. Imunotingimentos foram analisados como descritos aqui e os resultados estao mostrados na Figura 5.
Como pode ser deduzido da Figura 5, a modificagao de fosfato de fato nao tem nenhum impacto na eficacia da molecula de siRNA e dos lipoplexes contend。a mesma.
EXEMPLO 7: PERDA DA FUNCAO DE PKN3 SOB CRESCIMENTO DE HUVEC EM MATRIZ EXTRACELULAR
Para tambem mostrar que ha tambem algumas alteragoes fisio- Iogicas e morfologicas em "knockdown" de PKN3 usando as moleculas de acordo com a presente invengao, um ensaio de crescimento de matriz extra- celular foi usado (Leenders et al., 2004). Mais especificamente, HUVECs foram transfeccionadas com 4
lipoplexes de PKN3 de siRNA diferentes, conterido PKN3 individual e sepa-
radamente (1), PKN3 (3), PKN3 (4) e PKN3 (5) como a molecula de siRNA, e com Iipoplex de siRNA Luc (20 nM) como um controle. As celulas foram mantidas crescendo para confluencia dentro das primeiras 48 horas de transfecgao. Apos 48 horas, as celulas foram tripsinadas, recolocadas em placa com niimeros de celula iguais (110.000 celulas) e banhadas em mati- gel contendo 24 pogos.
Fotografias microscopicas representativas foram tiradas para monitorar as alteragoes no crescimento de celula HUVEC a 20 h pos recolo- cagao em placa. Os resuItados estao descritos na Figura 6.
Como esperado, no caso de Iipoplexes de PKN3 de siRNA po- tentes, preferivelmente Iipoplexes de PKN3 (3) e Iipoplexes de PKN3 (5), uma inibigao pronunciada de crescimento foi observada. EXEMPLO 8: INIBICAO DE CRESCIMENTO DO TUMOR DE XENOEN- XERTO DE PC-3 S.C SUBCUTANEO.
Um modelo de tumor de xenoenxerto de PC-3 foi gerado por in- jegao subcutanea das celulas de PC3. O tumor desse modo gerado foi sub- sequentemente tratado com os Iipoplexes descritos no exemplo 3. A molecu- Ia de siRNA contida em tal Iipoplex era PKN3 (3). O projeto experimental basico e descrito na Figura 7A. Um total de tres grupos de tratamento dife- rentes foi estabelecido com cada grupo consistindo em seis camundongos. O primeiro grupo recebeu sacarose apenas, ο segundo grupo recebeu Iipo- plexes contendo siRNA contra Iuciferase (lipolex de siRNALuc) e ο terceiro grupo recebeu Iipoplexes contendo siRNA especifico para PKN3 (lipoplex de PKN3 de siRNA).
Apos inoculagao das celulas tumorals, os varios agentes foram administrados come?ando de 25 ao dia 35 em diante. As injegoes foram e- xecutadas oito vezes por dia i.v. As doses de lipoplex de siRNA foram 1,88 mg/kg de siRNA e 14,5 mg/kg do Iipidio total (Santel et al., 2006a; Santel et al.’ 2006b).
Em paralelo, a molecula de siRNA de PKN3-23-v1 foi avaliada em comparagao a PKN3 (3). O respectivo projeto experimental basico e descrito na Figura 16A, por meio do qual apos inoculagao das celulas tumo-
rals os varios agentes, isto e, sacarose, PKN3 (3) e PKN3-23-v1, foram ad- ministrados comegando do dia 29 ao dia 47 em diante, por meio do qual a administragao foi de modo que 10 χ injegoes i.v. foram executadas a cada segundo dia (em um grupo de doze camundongos). A dose de Iipoplex de siRNA foi 2,8 mg/kg de siRNA e 21,7 mg/kg de Iipidio total (Santel et al.， 2006a, Santel et al., 2006b).
O resultado de tal esquema de tratamento esta descrito na Figu- ra 7B e Figura 7C para PKN3 (3) e nas Figuras 16B a 16D para a molecula de siRNA de PKN3-23-v1 em comparapao ao PKN3 (3).
Como pode ser Ievado da Figura 7B, ο crescimento de xenoen- xertos estabelecidos de PC-3 foi inibido significativamente com Iipoplexes de PKN3 de siRNA (diamantes) comparado com Iipoplex de siRNA Luc (triangu- los) tratado como indicado (dose padrao 1,88 mg/kg/dia de siRNA; 14,5 mg/kg/dia de lipidio; seta) ou sacarose isot0nica (esferas solidas). As aIteragoes em pesos do corpo foram monitoradas durante ο tratamento co- mo mostrado na Figura 7B. Os dados individuals representam a media de volume de tumor diario s.e.m. Apenas uma pequena diminuigao em peso do corpo poderia ser observada sob administragao dos varios lipoplexes, con- firmando que ha apenas um impacto minimo, se houver, do componente de lipidio dos lipoplexes na saude do animal. Como pode ser Ievado das Figuras 16B, 16C e 16D, que ambas
as moleculas de siRNA testadas, isto e, PKN3 (3), isto e, ο "19mer", e PKN3- 23-v1, isto e, ο "23mer", mostram a mesma eficacia neste model。de tumor de prostata como expresso em redugao de volume do tumor de prostata (Fi- gura 16B), redu^ao em volume das metastases de Iinfonodo (Figura 16C) e propagagao metastatica de Iinfonodo (Figura 16D).
EXEMPLO 9: INIBICAO DE CRESCIMENTO DE TUMOR DE XENOEN- XERTO DE PC-3 SUBCUTANEO: IMPACTO DE DOSES DE LIPOPLEX Dl- FERENTES
O experimento subjacente foi realizado para investigar ο impacto de doses de Iipoplex diferentes na inibigao de crescimento de tumor de xe- noenxerto de PC-3 subcutaneo. Mais especificamente, lipoplexes de PKN3(3) de siRNA foram usados. Os lipoplexes foram preparados como descrito no exemplo 3. O projeto experimental pode ser obtido da Figura 8A. Os grupos de tratamento consistiram em 6 camundongos, por meio do qual um grupo de animais recebeu sacarose como um controle negativo, enquan- to que ο outro grupo recebeu Iipoplexes de PKN3 de siRNA, mais especifi- camente Iipoplexes de PKN3 de siRNA (3). Apos inoculagao s.c. da celula tumoral, os animais foram administrados do dia 22 a 38 em onze injegoes i.v. diariamente e a sobrevivencia foi avaliada ate ο dia 67.
A formula?ao da formulagao de Iipoplex de siRNA foi como se- gue: 1,88 mg/kg de siRNA + 14,5 mg/kg de atuFect01/1% PEG; as doses de Iipoplex diferentes foram como segue:
-0,94 mg/kg de siRNA diariamente d22 - 32 -1,88 mg/kg de siRNA diariamente d22 - 32 -1,88 mg/kg de siRNA duas vezes ao dia 50% de dose d22 - 28 -1,88 mg/kg a cada 2° dia d22 - 38 O resultado e descrito na Figura 8B. Pode ser deduzido da Figu-
ra 8B que uma dose de 1,88 mg/kg diaria resultou em uma diminui^ao signi- ficativa do volume do tumor, por meio do qual ο peso do corpo alterou ape- nas Iigeiramente e nenhum efeito negativo pode ser observado para as for- mulagoes de Iipoplex como tais. EXEMPLO 10: INIBICAO DE CRESCIMENTO DE TUMOR DE XENOEN- XERTO DE PC-3 SUBCUTANEO: IMPACTO DE REGIME DE TRATAMEN- TO DIFERENTE
O projeto experimental foi como descrito com relagao ao exem- plo 8.
Os resultados sao descritos na Figura 8C. Mais especificamente
pode ser deduzido da Figura 8C que ο efeito do programa de tratamento in- vestigado neste exemplo nao difere em termos de impacto do volume de tumor. Porem, ο programa de tratamento que consiste duas vezes ao dia, diariamente e a cada segundo dia mostrou a mesma inibigao de crescimento de tumor, indicando que um tratamento com ο Iipoplex de PKN3-siRNA a cada segundo dia e suficiente para manter os efeitos terapeuticos. Alem dis-
so, um tratamento duas vezes diariamente resultou em uma diminuigao sig- nificativa no peso do corpo sugerindo uma dose Iimitadora de dose sem be- neficio terapeutico adicional (Santel et al.’ 2006a).
EXEMPLO 11: TRATAMENTO SISTgMICO DE CAMUNDONGOS COM U- POPLEXES DE PKN3 DE SIRNA(3) EM UM MODELO DE TUMOR DE XE- NOENXERTQ ORTOT0PICO
Este experimento foi realizado a fim de estudar ο impacto do tra- tamento sistemico de camundongos com Iipoplexes de PKN3 de siRNA e mais especificamente Iipoplexes de PKN3 de siRNA (3) sobre ο crescimento de tumor em um modelo de tumor de xenoenxerto ortotopico, (para detalhes experimentais vide (Santel et al., 2006a)).
O projeto experimental para analisar a eficacia do tratamento de Iipoplex de PKN3 de siRNA em um modelo de tumor de prostata de PC-3 ortotopico e metastases de Iinfonodo e descrito na Figura 9A. Um total de quatro grupos de tratamento cada consistindo em 9 camundongos foram definidos, a saber grupos recebendo sacarose, Iipoplex de siRNA Luc, Iipo- plex de PKN3 de siRNA e Iipoplex de siRNA Tie2. Apos inoculagao das celu- Ias tumorals intraprostaticas, doses de Iipoplex de siRNA que consistem em 1,88 mg/kg de siRNA e 14,5 mg/kg de atuFect01/1% PEG sao injetadas do dia 35 a 49 com oito inje^oes i.v. a cada segundo dia. No dia 35 foi executa- do um controle de pre-tratamento.
Deste experimento, uma diminuigao no volume do tumor de PC- 3 de prostata e metastases de Iinfonodo em camundongos apos tratamento com os Iipoplexes de siRNA indicados foi observada comparado aos grupos tratados com sacarose ou moleculas de siRNA especificas para Iuciferase (siRNALuc) que mais especificamente e descrita na Figura 9B (tamanho de volume de tumor de prostata e volume de metastases de linfonodo).
O volume de metastases de tumor antes do comego do trata- mento e indicado na esquerda (d35, controle). Significagao estatistica e indi- cada por asterisco. Como pode ser deduzido das ditas figuras, a molecula de siRNA especifica para PKN3, mais especificamente ο Iipoplex contendo a mesma, foi altamente eficaz com respeito em reduzir tanto ο volume do tu-
mor de prostata como ο volume das metastases de linfonodo. Para demonstrar RNA interferente in vivo por administra^ao i.v. de Iipoplex de PKN3-siRNA ο "knockdown" de mRNA em tecido pulmonar foi analisado. Mais especificamente, a redu^ao dos niveis de mRNA de PKN-3 e Tie2 em tecido pulmonar de camundongos tratados com Iipoplexes de siRNA correspondente como revelado por reagao de cadeia de polimerase de transcri^ao reversa TaqMan quantitativa e descrita na Figura 9C. A quan- tidade media relativa dos niveis de mRNA de Tie2 ou PKN3 no pulmao nor- malizado para mRNA de CD34 e mostrada para demonstrar interferencia mediada por Iipoplex in vivo. Um Iipoplex de siRNA especifico para receptor de TIE-2 de controle foi testado em paralelo demonstrando quao bem uma redu^ao de mRNA especifica aIvo (Figura 9, painel direito) mas nao revelou uma inibigao significativa do crescimento de tumor ou formagao de metasta- ses de linfonodo, quando comparado a um Iipoplex de siRNA especifico para Luciferase negativo. Estes dados indicam um efeito terapeutico especifico para ο gene alvo com ο Iipoplex de PKN3-siRNA.
EXEMPLO 12: TRATAMENTO SIST£MIC0 DE CAMUNDONGOS COM Ll- ‘ POPLEXES DE SIRNA-PKN3(3) EM UM MODELO DE TUMOR DE XENO- ENXERTQ QRTOT0PICO:旧PACTO DO PROGRAMA DE TRATAMENTO Este experimento foi executado para testar diferentes programas de tratamento com relagao ao tratamento sistemico de camundongos com Iipoplexes de PKN3 de siRNA e mais especificamente Iipoplexes de PKN3 de siRNA (3) em um modelo de tumor de xenoenxerto ortotopico.
O conjunto experimental acima e descrito na Figura 10A. Havia dois grupos de tratamento com cada grupo consistindo em nove camundon- gos que foram administrados com sacarose ou Iipoplex de PKN3 de siRNA. Apos inocula^ao das celulas tumorals intraprostaticas, havia 10/7x inje^aes i.v. a cada segundo ou terceiro dia do dia 35 ao 53 em diante. Foram empre- gadas duas doses de Iipoplex de siRNA diferentes, como segue: 1,88/2,8 mg/kg de siRNA 14,5/21,7 mg/kg de atuFect01/1% PEG, isto e, com 14,5/21,7 mg/kg de Iipidio total.
Os resultados sao descritos como volume de tumor de prostata
(Figura 10B) e como volume de metastases de linfonodo (Figura 10C). Para ambos parametros de volume de tumor e formagao de metastase de LN, uma inibigao foi observada, porem nenhum aumento significativo na eficacia foi observado com um tratamento a cada segundo dia quando comparado a um tratamento a cada terceiro dia. Porem com a dose diaria mais alta (2,8 mg/kg de siRNA) uma inibigao mais pronunciada da formagao de metastase e observada. Estes dados mostram que a jnibigao mediada por siRNA nao e restringida a uma administragao i.v. diaria e ο efeito terapeutico pode ser alcangado com tratamentos a cada segundo dia.
exemplo 13: tratamento sistemico de camundqngos com ll- poplexes de sirna-pkn3(3) em um modelo de tumor de xeno- enxerto ortot0pico: impacto de doses diferentes
Este experimento foi executado para testar doses diferentes de Iipoplexes de PKN3 de siRNA com relagao ao tratamento sistemico de ca- mundongos com tais Iipoplexes e mais especificamente Iipoplexes de PKN3 de siRNA (3) (Figura 11) e PKN3 de siRNA-23-v1 (Figura 17) em um model。 de tumor de xenoenxerto ortotopico.
O conjunto experimental e descrito acima na Figura 11 A. Havia tres grupos de tratamento com cada grupo consistindo em dez camundon- gos que foram administrados com sacarose, Iipoplex de PKN3 de siRNA ou Iipoplex apenas. Apos inoculagao de celula tumoral intraprostatica, houve 10 χ injegoes i.v. a cada segundo dia do dia 28 a 46 em diante. As doses de Iipoplex de siRNA foram como segue: 0,7/1,4/2,8 mg/kg de siRNA; 5,4/10,9/21,7 mg/kg de Iipidio total (no lipoplex, todos ο tres juntos: atu- FectOI/lipidio auxiliar/1% PEG). Os tres regimes de dosagem foram adminis- trados por injegao i.v. a cada segundo dia.
Os resultados sao descritos como volume de tumor de prostata (Figura 11B) e como volume de metastases de Iinfonodo (Figura 11 C). Em ambos os casos, uma inibigao significativa e observada com doses diarias de 2,8 mg ou 1,4 mg de siRNA/kg indicando uma janela terapeutica para estas moleculas de siRNA.
Tambem no caso do lipoplex de PKN3 de siRNA compreenden-
do PKN3-23-v1 como especies de siRNA ao inves de PKN3 (3), havia tres grupos de tratamento diferentes com cada grupo consistindo em 7 a 8 ca- mundongos aos quais sacarose, Iipoplex de PKN3 de siRNA ou Iipoplex a- penas foi administrado. Apos inoculagao de celula tumoral intraprostatica, houve 15 χ injegoes i.v. a cada 4° dia do dia 7 a dia 63 em diante. As doses de Iipoplex de siRNA foram 1,4 mg/kg de siRNA (10,9 mg de Iipidio total/kg) e 0,7 mg/kg de siRNA (5,4 mg de Iipidio total/kg), respectivamente.
Os resultados sao descritos como volume de tumor de prostata (Figura 17B) e como volume de metastases de Iinfonodo (Figura 17C). Em ambos os casos, uma inibigao significativa e observada com doses de 1,4 mg/kg e 0,7 mg/kg de siRNA, respectivamente, indicando uma janela tera- peutica para estas doses de molecula de siRNA.
Adicionalmente, ο peso do corpo dos camundongos pos desafio celular foi registrado e descrito na Figura 17D. Desta figura, pode ser dedu- zido que sob tal regime de tratamento ο peso do corpo dos camundongos nao e decrescente nao indicando nenhum efeito toxico geral com peso do corpo sendo um indicador geral da saCide do animal. REFERgNCIAS
A medida que se refere aqui a varios documentos da tecnica an- terior, tais documentos os dados bibliograficos completos destes lidos como segue, sao incorporados aqui em sua totalidade por referencia.
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As caracteristicas da presente invengao descrita no relatorio descritivo, nas reivindicagoes, na Iistagem de sequencia e/ou nos desenhos podem separadamente e em qualquer combina9§o das mesmas ser material
para reaIizar a invengao em varias formas da mesma. LISTAGEM DE SEQUfiNCIA <110> Atugen AG
10
15
20
25
30
<120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>
ggctcccgcg tgagcgtcca cccgggtact ggacctcggg cgcgggccag ggaagtttca gagaggaggg gggccgagcc gagctgaaga ttgggccatg gagctgcggg cctgtggcct ctccggaggc acgtgcgcca cgggacagcc gggtccccgg gaggcagctg
Meios para inibir a expressSo da proteina cinase 3 A 19032 EP 57
PatentIn versao 3.1 1
3385 DNA
Homo sapiens
mRNA
(1)..(3385) proteina cinase 3 1
ggcgcgcggc ggggaaggcc
aaccgggggt gggcccagaa cgtggggtcc cgggtctcgg agtttgaaag ccccaagcgg agtggccccc tcaaggaggg tgcagcagct agctgcacgc caggaccccg agctgcatgt gtggcacccc agctgaaggt agccagggcc tggctgaggg
gaggcgcggt tcccgcggaa cgggcgctgg gagggggcgc tcctggcgga ccggagcggc agaggatgag ggtggagaac gctgcggtcc ccgaatcctg gccgtgggca ggagctgaag caaggagagg ggccctgctg tgagctgctg cgccaagaac
agaggacctg cacgcccagc ttttggatcc atcggcgcgg ccgatcccgc gggtctgcgg gccatggagg aaggaggtga ctgcggcgcg tccaaccgcc ctgcccggcc gagcagctca gtgaagcagg aagctcctgg cggatgaaga gcggaggagc gtggtgaaac
ggcgcgggcg gggaaccgca gagggaggcg acgggaggcg gtctccggcg cttccgggac agggggcgcc tccgccgggc tggccacaga gcctggagca ctgggcctgg gggctcggca gggctgagaa cagctgccca tcagcagcct tacagcatcg tgcttagtag
atgtgcctcc ggcgccgaag ctggggcgcg gcgctggtcc ccgcttcccg cggagtggct gcggcagcct catccagaaa ccgccgccac gctgcatggc cccagctgag cctagaggct catgacccac gcagatgctg ggaggccagt actgcacgtt ccggagaaca
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 10
15
20
25
30
caggaccgca aggcactggc tgaggcccag gcccagctac aggagtcctc tcagaaactg 1080 gacctcctgc gcctggcctt ggagcagctg ctggagcaac tgcctcctgc ccaccctttg 1140 cgcagcagag tgacccgaga gttgcgggct gcggtgcctg gataccccca gccttcaggg 1200 acacctgtga agcccaccgc cctaacaggg acactgcagg tccgcctcct gggctgtgaa 1260 cagttgctga cagccgtgcc tgggcgctcc ccagcggccg cactggccag cagcccctcc 1320 gagggctggc ttcggaccaa ggccaagcac cagcgtggcc gaggcgagct tgccagcgag 1380 gtgctggctg tgctaaaggt ggacaaccgt gttgtggggc agacgggctg ggggcaggtg 1440 gccgaacagt cctgggacca gacctttgtc atcccactgg agcgagcccg tgagctggag 1500 attggggtac actggcggga ctggcggcag ctatgtggcg tggccttcct gagacttgag 1560 gacttcctgg acaatgcctg tcaccaactg tccctcagcc tggtaccgca gggactgctt 1620 tttgcccagg tgaccttctg cgatcctgtc attgagaggc ggccccggct gcagaggcag 1680 gaacgcatct tctctaaacg cagaggccag gacttcctga gggcttcgca gatgaacctc 1740 ggcatggcgg cctgggggcg cctcgtcatg aacctgctgc ccccctgcag ctccccgagc 1800 acaatcagcc cccctaaagg atgccctcgg accccaacaa cactgcgaga ggcctctgac 1860 cctgccactc ccagtaattt cctgcccaag aagaccccct tgggtgaaga gatgacaccc 1920 ccacccaagc ccccacgcct ctacctcccc caggagccaa catccgagga gactccgcgc 1980 accaaacgtc cccatatgga gcctaggact cgacgtgggc catctccacc agcctccccc 2040 accaggaaac cccctcggct tcaggacttc cgctgcttag ctgtgctggg ccggggacac 2100 tttgggaagg tcctcctggt ccagttcaag gggacaggga aatactacgc catcaaagca 2160 ctgaagaagc aggaggtgct cagccgggac gagatagaga gcctgtactg cgagaagcgg 2220 atcctggagg ctgtgggctg cacagggcac cctttcctgc tctccctcct tgcctgcttc 2280 cagacctcca gccatgcctg ctttgtgact gagtttgtgc ctggtggtga cctcatgatg 2340 cagatccacg aggatgtctt ccccgagccc caggcccgct tctacgtggc ttgtgttgtc 2400 ctggggctgc agttcttaca cgagaagaag atcatttaca gggacctgaa gttggataac 2460 cttctgctgg atgcccaggg attcctgaag atcgcagact ttggactctg caaggaaggg 2520 atcggcttcg gggaccggac tagcaccttc tgtggcaccc cggagttcct ggctcccgag 2580 gtgctgaccc aggaggcata cacacgggct gtggactggt gggggctggg tgtgctgctc 2640 tacgagatgc tggtgggtga gtgcccgttc ccaggggaca cagaggaaga ggtgtttgac 2700 tgcatcgtca acatggacgc cccctacccc ggctttctgt cggtgcaagg gcttgagttc 2760 attcagaagc tcctccagaa gtgcccggag aagcgcctcg gggcaggtga gcaggatgcc 2820 gaggagatca aggtccagcc attcttcagg accaccaact ggcaagccct gctcgcccgc 2ΘΘ0 accatccagc cccccttcgt gcctaccctg tgtggccctg cggacctgcg ctactttgag 2940 10
15
20
25
30
ggcgagttca cagggctgcc gcctgccctg accccacctg caccccacag cctcctcact 3000 gcccgccaac aggccgcctt ccgggacttc gactttgtgt cagagcgatt cctggaaccc 3060 tgagggcatc tcctggcacc tctgtcccct tcccccacag actgttagag cctctgctcg 3120 ttcacccgtg cgccctgcct ggaggtccag gccttgctgg gtacttctga gcccttggga 3180 ttcaaagtgg cagccatggg gccactgttg tgggctttgc tcagtgtcac tgggcaaagt 3240 gtgtcccttc cccctccagc tcgccctctt ctacctccca gcgagacct? gcccagaaag 3300 ggtgccgcag caaggagtga tatggtttgt ctttttaaga ctggacttgc tttatattaa 3360 atttgtaaaa gtgtgcaaaa aaaaa 3385 <210> 2
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
agcugaagau <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
cccuccuuga <210> <211> <212> <213> <220>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica 2
caaggaggg 3
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica
3
ucuucagcu
4
19 RNA
Artificial
19
19
<221>
caracteristica mista 10
<223> sintStica
<400> 4
cuugaggacu uccuggaca <210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220> <221> <223> <400>
uguccaggaa <210>
19
15
20
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
uugaggacuu ccuggacaa <210> 7
caracteristica mista sint^tica
5
guccucaag
6
19 RNA
Artificial
19
caracteristica mista
sint^tica
6
19
<212> <213> <220> <221> <223> <400> uuguccagga <210>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint6tica
7
aguccucaa
8
19
19 <212> <213> <220> <221> <223> <400>
aggacuuccu <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
RNA
Artificial
caracteristica mista
sint^tica
8
ggacaaugc 19
9
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica 9
gcauugucca ggaaguccu 19
<210> 10 <2H> 19
RNA
Artificial
<212> <213> <220> <221> <223> <400> ccuggacaau <210> <211> <212> <213>
<220> <221>
caracteristica mista sint6tica 10
gccugucac 19
11 19 RNA
Artificial caracteristica mista
<223>
sint^tica <400> 11 gugacaggca uuguccagg <210> 12 <211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220> <221> <223> <400>
gggacacuuu <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
gaccuuccca aaguguccc <210> 14
caracteristica mista sint^tica 12
gggaagguc 13 19 RNA
Artificial
caracteristica mista
sint^tica
13
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
uugggaaggu <210>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista
sint^tica
14
ccuccuggu
19
<212>
RNA 10
15
20
25
30
<213> <220> <221> <223> <400>
accaggagga <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
cuccagccau gccugcuuu <210> 17
Artificial
caracteristica mista sint^tica
15
ccuucccaa
16 19 RNA
Artificial
19
caracteristica mista
sint^tica
16
19
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
aaagcaggca <210>
<212> <213> <220> <221> <223>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint4tica
17
uggcuggag
18 19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica
19
<400>
18 auucagaagc uccuccaga <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
ucuggaggag <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
ucagaagcuc cuccagaag <210> 21
19 19 RNA
Artificial
caracteristica mista sintStica
19
cuucugaau
20 19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica 20
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
cuucuggagg <210> <211> <212>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica 21
agcuucuga 22 19 RNA
<213>
Artificial <220> <221> <223> <400>
cagaagcucc <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
acuucuggag gagcuucug <210> 24
caracteristica mista sint^tica 22
uccagaagu 23 19 RNA
Artificial
caracteristica mista
sint^tica
23
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
ucuucaggac <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica
24
caccaacug
25 19 RNA
Artificial
caracteristica mista
sint^tica
25
caguuggugg uccugaaga 10
15
20
25
30
<210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
cuucaggacc <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
ccaguuggug <210>
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
ucaggaccac caacuggca <210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
26 19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica 26
accaacugg 27 19 RNA
Artificial
caracteristica mista sint^tica
27
guccugaag
28 19 RNA
Artificial
19
19
caracteristica mista sint6tica 28
19
<220> <221> característica mista <223> sintética
<400> 29 ugccaguugg ugguccuga
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial <220>
<221> característica mista
<223> sintética
<400> 30 agacuugagg acuuccugga caa
<210> 31
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial <220>
<221> característica mista
<223> sintética
<400> 31
uuguccagga aguccucaag ucu
<210> 32
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> característica mista
<223> sintética
<400> 32 uugaggacuu ccuggacaau gcc
<210> 33 10
15
20
25
30
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
23 RNA
Artificial
característica mista sintética 33
ggcauugucc aggaaguccu caa <210> 34
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 34
gacuugagga cuuccuggac aau <210> 35
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 35
auuguccagg aaguccucaa guc <210> 36
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221>
23
23
23
característica mista 10
15
20
25
30
<223> sintética
<400> 36
acuugaggac uuccuggaca aug <210> 37
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 37
cauuguccag gaaguccuca agu <210> 38
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 38
cuugaggacu uccuggacaa ugc <210> 39
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 39
gcauugucca ggaaguccuc aag <210> 40
<211> 23
23
23
23
23 10
15
20
<212> <213> <220> <221> <223> <400>
ccauucuuca <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
caguuggugg <210> <211> <212> <213> <220>
RNA
Artificial
característica mista sintética
40
ggaccaccaa cug
41 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
41
uccugaagaa ugg
42 23 RNA
Artificial
23
23
25
30
<221> característica mista
<223> sintética
<400> 42
uucuucagga ccaccaacug gca <210> 43
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221>
23
característica mista 10
15
20
25
30
<223> sintética
<400> 43
ugccaguugg ugguccugaa gaa <210> 44
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220>
<221> característica mista
<223> sintética
<400> 44
ucauucagaa gcuccuccag aag <210> 45
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 45
cuucuggagg agcuucugaa uga <210> 46
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 46
cacuuuggga agguccuccu ggu <210> 47
<211> 23
23
23
23
23 <212> <213> <220> <221> <223> <400>
accaggagga <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
cauucagaag <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400> acuucuggag <210> <211> <212> <213>
<220> <221> <223>
RNA
Artificial
característica mista sintética
47
ccuucccaaa gug
48 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
48
cuccuccaga agu
49 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
49
gagcuucuga aug
50 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
23
23
23 10
15
20
25
30
<400>
ggcaccccca <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
agcuuccucu <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
cggggacacu <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
aggaccuucc <210> <211> <212>
50
aggagaggaa gcu
51 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
51
ccuugggggu gcc
52 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
52
uugggaaggu ccu
53 23 RNA
Artificial
característica mista sintética
53
caaagugucc ccg
54 23 RNA
23
23
23
23 10
15
20
25
30
<213> <220> <221> <223> <400>
Artificial
característica mista
sintética
54
uccaaccgcc gccuggagca gcu <210> 55
23 RNA
Artificial
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
característica mista sintética 55
agcugcucca ggcggcgguu gga <210> 56
<211> 19
<212> KNA
<213> Artificial
<220> <221> <223> <400>
característica mista
sintética
56
cguacgcgga auacuucga <210> 57
<211> <212> <213> <220> <221> <223> <400>
19 RNA
Artificial
característica mista
sintética
57
23
23
19 Ucgaaguauu ccgcguacg

Claims (37)

1. Molécula de ácido nucléico compreendendo uma estrutura bifilamentar, por meio do qual a estrutura bifilamentar compreende um primei- ro filamento e um segundo filamento, por meio do qual o primeiro filamento compreende uma primeira extensão de nucleotídeos contíguos e a dita primeira extensão é pelo menos parcialmente complementar a um ácido nucléico alvo, e por meio do qual o segundo filamento compreende uma segunda extensão de nucleotídeos contíguos e a dita segunda extensão é pelo me- nos parcialmente complementar à primeira extensão, por meio do qual a primeira extensão compreende uma seqüên- cia de ácido nucléico que é pelo menos parcialmente complementar a uma seqüência de núcleo de nucleotídeo da seqüência de ácido nucléico de a- cordo com a SEQ. ID. No. 1 (NM_013355) ou parte da mesma, por meio do qual a seqüência de núcleo de nucleotídeo compre- ende a seqüência de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 482 a 500 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 2); das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 4); das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 6); das posições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 8); das posições de nucleotídeo 1566 a 1584 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 10); das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 12); das posições de nucleotídeo 2102 a 2120 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 14); das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 16); das posições de nucleotídeo 2761 a 2779 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 18); das posições de nucleotídeo 2763 a 2781 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 20); das posições de nucleotídeo 2764 a 2782 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 22); das posições de nucleotídeo 2843 a 2861 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 24); das posições de nucleotídeo 2844 a 2862 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 26); ou das posições de nucleotídeo 2846 a 2864 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 28), preferivelmente a seqüência de núcleo de nucleotídeo compreende a se- quência de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 1555 a 1573 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 4); das posições de nucleotídeo 1556 a 1574 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 6); das posições de nucleotídeo 1559 a 1577 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 8); das posições de nucleotídeo 1566 a 1584 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 10); das posições de nucleotídeo 2094 a 2112 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 12); ou das posições de nucleotídeo 2286 a 2304 da SEQ. ID. No. 1 (SEQ. ID. No. 16), por meio do qual preferivelmente a primeira extensão é adicionalmente pelo menos parcialmente complementar a uma região precedendo a terminação 5' da seqüência de núcleo de nucleotídeo e/ou a uma região seguindo a ter- minação 3' da seqüência de núcleo de nucleotídeo.
2. Ácido nucléico como definido na reivindicação 1, por meio do qual a primeira extensão é complementar à seqüência de núcleo de nucleo- tídeo ou uma parte da mesma.
3. Ácido nucléico como definido na qualquer uma das reivindica- ções 1 a 2, por meio do qual a primeira extensão é adicionalmente comple- mentar à região seguindo a terminação 3' da seqüência de núcleo de nucleo- tídeo e/ou à região precedendo a terminação 5' da seqüência de núcleo de nucleotídeo.
4. Ácido nucléico como definido na qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, por meio do qual a primeira extensão é complementar ao ácido nucléico alvo em 18 a 29 nucleotídeos, preferivelmente 19 a 25 nucleotídeos e mais preferivelmente 19 a 23 nucleotídeos.
5. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 4, por meio do qual os nucleotídeos são nucleotídeos sucessivos.
6. Ácido nucléico como definido na reivindicação 1, por meio do qual a primeira extensão e/ou a segunda extensão compreende(m) de 18 a 29 nucleotídeos sucessivos, preferivelmente 19 a 25 nucleotídeos sucessi- vos e mais preferivelmente 19 a 23 nucleotídeos sucessivos.
7. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, por meio do qual o primeiro filamento consiste na primeira ex- tensão e/ou o segundo filamento consiste na segunda extensão.
8. Molécula de ácido nucléico, preferivelmente uma molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo uma estrutura bifilamentar, por meio do qual a estrutura bifi- Iamentar é formada por um primeiro filamento e um segundo filamento, por meio do qual o primeiro filamento compreende uma primeira extensão de nucleotídeos contíguos e o segundo filamento compreende uma segunda extensão de nucleotídeos contíguos e por meio do qual a dita primeira ex- tensão é pelo menos parcialmente complementar à dita segunda extensão, por meio do qual - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 3 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 2; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 5 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 4; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 7 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 6; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 9 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 8; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 11 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 10; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 13 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 12; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 15 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 14; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 17 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 16; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 19 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 18; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 21 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 20; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 23 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 22; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 25 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 24; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 27 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 26; ou - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 29 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 28; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 31 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 30; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 33 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 32; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 35 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 34; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 37 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 36; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 39 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 38; preferivelmente - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 5 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 4; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 7 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 6; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 9 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 8; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 11 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 10; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 13 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 12; - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 17 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 16 ou - a primeira extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 31 e a segunda extensão consiste em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ. ID. No. 30.
9. Molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, por meio do qual a primeira extensão e/ou a se- gunda extensão compreende(m) uma pluralidade de grupos de nucleotídeos modificados tendo uma modificação na posição 2' que forma um padrão po- sicionai regular, preferivelmente alternado, por meio do qual preferivelmente dentro da extensão cada grupo de nucleotídeos modificados é flanqueado em um ou ambos os lados por um grupo de flanqueamento de nucleotídeos, por meio do qual o(s) nucleotídeo(s) de flanqueamento formando o grupo de flanqueamento de nucleotídeos é/são um nucleotídeo inalterado ou um nu- cleotídeo tendo uma modificação diferente da modificação dos nucleotídeos modificados.
10. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, por meio do qual primeira extensão e/ou a segunda extensão compreende(m) um padrão de grupos de nucleotídeos modificados e/ou um padrão de grupos de flanqueamento de nucleotídeos.
11. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, preferivelmente reivindicações 1 a 8, por meio do qual a pri- meira extensão e/ou a segunda extensão compreende(m) na terminação 3' um dinucleotídeo, por meio do qual tal dinucleotídeo é preferivelmente TT.
12. Ácido nucléico como definido em reivindicação 11, por meio do qual o comprimento da primeira extensão e/ou da segunda extensão con- siste em 19 a 21 nucleotídeos.
13. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, preferivelmente 1 a 8, por meio do qual a primeira e/ou a se- gunda extensão compreende(m) uma protuberância de 1 a 5 nucleotídeos na terminação 3'.
14. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 13, por meio do qual o comprimento da estrutura bifilamentar é de cerca de 16 a 24 pares de nucleotídeo, preferivelmente 20 a 22 pares de nucleotídeo.
15. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, por meio do qual o primeiro filamento e o segundo filamento são covalentemente ligados um ao outro, preferivelmente a terminação 3' do primeiro filamento é covalentemente ligada à terminação 5' do segundo fila- mento.
16. Ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, por meio do qual a molécula consiste em cada um dos dois filamentos a seguir e por meio do qual os nucleotídeos sublinhados são 2'-0- metila: PKN3 (1): agcugaagaucaaggaggg (SEQ. ID. No. 2) çcçuçcuugaucuuçagcu (SEQ. ID. No. 3) PKN3 (2): cuugaggacuuçcuggaça (SEQ. ID. No. 4) ugucçaggaaguçcucaag (SEQ. ID. No. 5) PKN3 (3): uugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 6) uuguçcaggaagucçuçaa (SEQ. ID. No. 7) PKN3 (4): aggacuuçcuggaçaaugc (SEQ. ID. No. 8) gcauugucçaggaaguçcu (SEQ. ID. No. 9) PKN3 (5): cçuggacaaugccugucac (SEQ. ID. No. 10) gugaçaggçauuguçcagg (SEQ. ID. No. 11) PKN3 (6): gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12) gaçcuuçcçaaaguguçcç (SEQ. ID. No. 13) PKN3 (7): uugggaaggucçuçcuggu (SEQ. ID. No. 14) acçaggaggaçcuuçcçaa (SEQ. ID. No. 15) ΡΚΝ3 (8): ΡΚΝ3 (9): ΡΚΝ3 (10): ΡΚΝ3 (11): ΡΚΝ3 (12): ΡΚΝ3 (13): ΡΚΝ3 (14): PKN3-23-V1: PKN3-23-V2: PKN3-23-V3: PKN3-23-V4: PKN3-23-V5: preferivelmente PKN3 (2): PKN3 (3): PKN3 (4): PKN3 (5): cucçagcçaugçcugçuuu aaagçaggçauggcuggag auuçagaagçuçcucçaga ucuggaggagçuucugaau uçagaagçuçcucçagaag çuucuggaggagçuucuga cagaagcucçuçcagaagu acuuçuggaggagcuuçug uçuucaggaçcacçaacug çaguugguggucçugaaga cuuçaggacçaçcaacugg çcaguuggugguçcugaag uçaggacçaçcaaçuggça ugçcaguuggugguçcuga uuguçcaggaagucçuçaagucu agaçuugaggaçuucçuggacaa ggçauuguçcaggaagucçuçaa uugaggaçuucçuggacaaugçc auugucçaggaaguçcucaaguç gacuugaggacuuçcuggaçaau çauuguçcaggaagucçuçaagu açuugaggaçuuccuggacaaug gcauugucçaggaaguçcucaag cuugaggacuuçcuggaçaaugc cuugaggacuuçcuggaça ugucçaggaaguçcucaag uugaggaçuucçuggacaa uuguçcaggaagucçuçaa aggacuuçcuggaçaaugc gcauugucçaggaaguçcu cçuggacaaugccugucac (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. (SEQ. ID. No. 16 ID. No. 17 ID. No. 18 ID. No. 19 ID. No. 20 ID. No. 21 ID. No. 22 ID. No. 23 ID. No. 24 ID. No. 25 ID. No. 26 ID. No. 27 ID. No. 28 ID. No. 29 ID. No. 31 ID. No. 30 ID. No. 33 ID. No. 32 ID. No. 35 ID. No. 34 ID. No. 37 ID. No. 36 ID. No. 39 ID. No. 38 (SEQ. ID. No. 4) (SEQ. ID. No. 5) (SEQ. ID. No. 6) (SEQ. ID. No. 7) (SEQ. ID. No. 8) (SEQ. ID. No. 9) (SEQ. ID. No. 10) PKN3-23-V1: ΡΚΝ3 (8): ΡΚΝ3 (6): gugacaggcauuguccagg (SEQ. ID. No. 11) gggacacuuugggaagguc (SEQ. ID. No. 12) gaçcuuçcçaaaguguçcç (SEQ. ID. No. 13) cucçagcçaugçcugçuuu (SEQ. ID. No. 16) aaagçaggçauggcuggag (SEQ. ID. No. 17) uuguçcaggaagucçuçaagucu (SEQ. ID. No. 31) agaçuugaggaçuucçuggacaa (SEQ. ID. No. 30)
17. Formulação Iipossomal compreendendo um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Lipoplex compreendendo um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e um lipossoma.
19. Lipoplex de acordo com a reivindicação 18, em que o lipos- soma consiste em a) cerca de 50 % em mol de (tri-cloridrato de N-palmitil-N-oleil- amida de ácido arginil-2,3-diaminopropiônico, preferivelmente (tri-cloridrato de A/-palmitil-A/-oleil-amida de ácido p-(L-arginil)-2,3-L-diaminopropiônico); b) cerca de 48 a 49 % em mol de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPhyPE); e c) cerca de 1 a 2 % em mol de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-polietileno-glicol, preferivelmente sal de sódio de N- (Carbonil-metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina.
20. Lipoplex de acordo com a reivindicação 19, em que o poten- cial zeta do Iipoplex é cerca de 3540 a 6055 mV, preferivelmente cerca de 45 a 50 mV.
21. Lipoplex de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que o Iipoplex tem um tamanho de cerca de 50 a 400 nm, preferivelmente de cerca de 100 a 140 nm, e mais preferivelmente de cerca de 110 nm a 130 nm, con- forme determinado por QELS.
22. Vetor, preferivelmente um vetor de expressão, compreen- dendo ou codificando para um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
23. Célula compreendendo um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes ou vetor de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes.
24. Composição preferivelmente uma composição farmacêutica, compreendendo um ácido nucléico como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, uma formulação Iipossomal de acordo com a reivindica- ção 17, um Iipoplex de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, um vetor de acordo com a reivindicação 22 e/ou uma célula de acordo com a reivindicação 23.
25. Composição de acordo com a reivindicação 24, por meio do qual a composição é uma composição farmacêutica opcionalmente também compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, por meio do qual a composição é uma composição farmacêutica e a dita composição farmacêutica é para o tratamento de uma doença dependente de angiogê- nese, preferivelmente umas doenças caracterizadas ou causadas por angio- gênese insuficiente, anormal ou excessiva.
27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, por meio do qual a angiogênese é angiogênese de tecido adiposo, pele, co- ração, olho, pulmão, intestinos, órgãos reprodutivos, osso e juntas.
28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que a doença é selecionada do grupo compreendendo doenças infecciosas, distúrbios autoimunes, malformação vascular, aterosclerose, arteriopatia de transplante, obesidade, psoríase, verrugas, dermatite alérgi- ca, síndrome vítrea hiperplástica persistente, retinopatia diabética, retinopa- tia da pré-maturidade, doença macular relacionada à idade, neovasculariza- ção coroidal, hipertensão pulmonar primária, asma, pólipos nasais, doença inflamatória do intestino e peridental, ascites, adesões peritoneal, endome- triose, hemorragia uterina, cistos ovarianos, ovariana, hiperestimulação ova- riana, artrite, sinovite, osteomielite, formação de osteófitos.
29. Composição farmacêutica como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 28, preferivelmente reivindicação 25, para o trata- mento de uma doença neoplástica, preferivelmente uma doença oncológica, e mais preferivelmente um tumor sólido.
30. Composição farmacêutica como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 29, preferivelmente reivindicação 29, para o trata- mento de uma doença selecionada do grupo compreendendo câncer de os- so, câncer de mama, câncer de próstata, câncer do sistema digestivo, cân- cer colorretal, câncer de fígado, câncer pulmonar, câncer de rim, câncer uro- genital, câncer pancreático, câncer pituitário, câncer testicular, câncer orbital, câncer de cabeça e pescoço, câncer do sistema nervoso central e câncer do sistema respiratório.
31. Uso de um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, de uma formulação Iipossomal de acordo com a reivindicação 17, de um Iipoplex de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 18 a 21, de um vetor de acordo com a reivindicação 22 e/ou uma célula de acordo com a reivindicação 23 para a fabricação de um medica- mento.
32. Uso de acordo com a reivindicação 31, por meio do qual o medicamento é para o tratamento de quaisquer das doenças como definidas em qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
33. Uso de acordo com a reivindicação 32, por meio do qual o medicamento é usado em combinação com uma ou várias outras terapias.
34. Uso de acordo com a reivindicação 33, em que a terapia é selecionada do grupo compreendendo quimioterapia, crioterapia, hipertermi- a, terapia de anticorpo, terapia de radiação e terapia de antiangiogênese.
35. Uso de acordo com a reivindicação 34, por meio do qual a terapia é terapia de anticorpo e mais preferivelmente uma terapia de anticor- po usando um anticorpo de anti-VEGF ou anticorpo de antiangiopoetina.
36. Uso de acordo com a reivindicação 34, por meio do qual a terapia de antiangiogênese usa um inibidor de receptor de cinase, preferi- velmente um inibidor de receptor de tirosina cinase, por meio do qual tal re- ceptor é selecionado do grupo compreendendo receptor de VEGF, receptor de PDGF, Tie-2, FGFR e EGFR.
37. Uso de acordo com a reivindicação 36, por meio do qual < inibidor é selecionado do grupo compreendendo siRNA, moléculas antissen tido, aptâmeros, "spiegelmers", peptídeos de ligação de afinidade alta, ap tâmeros de peptídeo, anticalinas e anticorpos.
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