BRPI0714953A2 - mÉtodos para atenuar a liberaÇço de mediadores inflamatàrios e peptÍdeos éteis nesse sentido - Google Patents

mÉtodos para atenuar a liberaÇço de mediadores inflamatàrios e peptÍdeos éteis nesse sentido Download PDF

Info

Publication number
BRPI0714953A2
BRPI0714953A2 BRPI0714953-0A2A BRPI0714953A BRPI0714953A2 BR PI0714953 A2 BRPI0714953 A2 BR PI0714953A2 BR PI0714953 A BRPI0714953 A BR PI0714953A BR PI0714953 A2 BRPI0714953 A2 BR PI0714953A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
peptide
amino acid
seq
inflammatory
group
Prior art date
Application number
BRPI0714953-0A2A
Other languages
English (en)
Inventor
Indu Parikh
Original Assignee
Biomarck Pharmaceuticals Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomarck Pharmaceuticals Ltd filed Critical Biomarck Pharmaceuticals Ltd
Publication of BRPI0714953A2 publication Critical patent/BRPI0714953A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

MÉTODO PARA ATENUAR A LIBERAÇçO DE MEDIADORES INFLAMATàRIOS E PEPETÍDEOS éTEIS NESSE SENTIDO.A presente invenção inclui métodos de inibição ou de supressão de processos secretórios celulares. Mais especificamente, a presente invenção se refere à inibição ou redução da liberação dos mediadores inflmatórios a partir de células inflamatórias pela inibição do mecanismo associado com a liberação dos mediadores inflamatórios a partir de grânulos nas células inflamatórias. Sob este aspecto, a presente invenção revela um mecanismo de sinalização intracelular que ilustra vários novos alvos intracelulares para intervenção farmacológica em distúrbios envolvendo a secreção de mediadores inflamatórios a partir de vesículas nas células inflamatórias. Fragmentos de peptídeos e suas variantes de peptídeo MANS conforme revelados na presente invenção são úteis em tais métodos.

Description

"MÉTODOS PARA ATENUAR A LIBERAÇÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PEPTÍDEOS ÚTEIS NESSE SENTIDO"
Referência cruzada ao pedido relacionado
O presente pedido reivindica prioridade ao Americano No. de Série: 60/833.239, re- querido em 26 de julho de 2006, o qual é aqui incorporado na sua totalidade por referência.
Campo da invenção
A presente invenção se refere às composições peptídicas e métodos de seus usos para atenuar (ou inibir ou reduzir) a liberação estimulada de mediadores de inflamação das células inflamatórias durante a inflamação. A presente invenção também se refere ao uso desses peptídeos ou composições peptídicas para modular um mecanismo de sinalização intracelular regulando a secreção de mediadores inflamatórios das células inflamatórias.
Antecedentes da Invenção
Leucócitos inflamatórios sintetizam uma variedade de mediadores inflamatórios que são intracelularmente isolados e armazenados em grânulos ligados à membrana citoplasmá- tica. Exemplos de tais mediadores incluem, porém não estão limitados, a mieloperoxidase [MPO] em neutrófilos (ver, por exemplo, Borregaard N, Cowland JB. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 1997; 89: 3503-3521), peroxidase eosinofí- Iica [EPO] e proteína básica principal [MBP] em eosinófilos (ver, por exemplo, Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651- 663), Iisozima em monócitos/macrófagos (ver, por exemplo, Hoff T, Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt- Struebe M. Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52: 173-182; e Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium-independent phospholipase A2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170: 5276-5280), e granzima em células natural killer (NK) e em linfócitos citotóxicos (ver, por exemplo, Bochan MR1 Goebel WS, Brahmi Z. Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated Iytic ability. Cell Immunol 1995; 164: 234- 239; Gong JH., Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell Iine (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8: 652-658; Maki G, Klingemann HG, Martinson JA1 Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369- 383; e Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphocyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104: 183-190). Tais mediadores são liberados em seus sítios de injúria e contribuem para a inflamação e reparo tecidual, tal como no pulmão e em outros locais. Sabe-se que os Ieu- cócitos liberam esses grânulos através de um mecanismo exocitótico (ver, por exemplo, Burgoyne RD1 Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol Rev 2003; 83: 581-632; e Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R. Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932), porém moléculas regulatórias e vias específicas envolvidas no processo exo- citótico não foram totalmente descritos.
Vários estímulos exógenos podem provocar a desgranulação dos leucócitos através de uma via que envolve a ativação da proteína quinase C e os subsequentes eventos de fosforilação (ver, por exemplo, Burgoyne RD1 Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol Rev 2003; 83: 581-632; Logan MR1 Odemuyiwa SO, Moqbel R. Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932; Smolen JE, Sandborg RR. Ca2+-induced secretion by electropermeabilized human neutrophils: the roles of Ca2+, nucleotides and protein kinase C. Biochim Biophys Acta 1990; 1052: 133-142; Niessen HW, Verhoeven AJ. Role of protein phosphorylation in the degranulation of electropermeabilized human neutrophils. Biochim. Biophys. Acta 1994; 1223: 267-273; e Naucler C, Grinstein S, Sundler R., Tapper H. Signaling to Iocalized degranulation in neutrophils adherent to immune complexes. J Leukoc Biol 2002; 71: 701-710).
Proteína MARCKS (onde MARCKS, conforme aqui utilizado, significa "Substrato de quinase C rico em alanina miristoilada") é um alvo de fosforilação onipresente da proteína quinase C (PCK)1 e é altamente expresso em leucócitos (ver, por exemplo, Aderem AA, Al- bert KA1 Keum MM1 Wang JK1 Greengard P, Cohn ZA. Stimulus-dependent myristoylation of a major substrate for protein kinase C. Nature 1988; 332: 362-364; Thelen M, Rosen A, Nairn AC, Aderem A. Regulation by phosphorylation of reversible association of a myristoylated protein kinase C substrate with the plasma membrane. Nature 1991; 351: 320- 322; e Hartwig JH1 Thelen M. Rosen A, Janmey PA, Nairn AC1 Aderem A. MARCKS is an actin filament crosslinking protein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin. Nature 1992; 356:618-622. A proteína MARCKS está mecanisticamente envolvida num pro- cesso de secreção exocitótica da mucina por células caliciformes que se alinham nas vias respiratórias (ver, por exemplo, Li et al., J Biol Chem 2001 ; 276: 40982-40990; e Singer et al., Nat Med 2004; 10: 193-196). MARCKS é miristoilada através de uma ligação amida no aminoácido N-terminal na seqüência de aminoácidos da proteína MARCKS na posição alfa- amino da glicina, a qual reside no N-terminal (isto é, na posição 1) da seqüência de aminoá- cidos. Nas células epiteliais das vias aéreas, a região N-terminal miristoilada da MARCKS aparenta estar integral no processo secretório. Pelo N-terminal da proteína MARCKS se entende o peptídeo MANS1 o qual contém MiristoiI-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), os quais são L-aminoácidos. Adicionalmente, os fragmentos de peptídeo do peptídeo MANS aqui revelados, são também preferivelmente compostos de L-aminoácidos. O mecanismo aparenta envolver a ligação de MARCKS1 uma proteína miristoilada, com as membranas dos grânulos intracelulares. Um peptídeo miristoilado N-terminal do N-terminal de MARCKS foi demonstrado como bloqueador tanto da secreção de mucina quanto da ligação de MARCKS nas mem- branas do grânulo de mucina nas células caliciformes (ver, por exemplo, Singer et al., Nat Med 2004; 10: 193-196). Esse peptídeo contém 24 aminoácidos da proteína MARCKS inici- ando com a glicina N-terminal da proteína MARCKS, a qual é miristoilada através de uma ligação amida e é conhecida como seqüência alfa-N-terminal miristoilada (MANS); isto é, MiristoiI-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1). Também Vergeres et al., J. Biochem. 1998, 330; 5-11, revela que o resíduo de glicina N-terminal das proteínas MARCKS é miristoilado através de uma reação catalisada por miristoil CoA:proteína N- miristoil transferase (NMT).
Em doenças inflamatórias, tais como asma, DPOC e bronquite crônica; em doenças genéticas, tal como fibrose cística; em condições alérgicas (atopia, inflamação alérgica); em bronquiectasia; e numa variedade de doenças respiratórias infecciosas agudas tais como pneumonia, rinite, influenza ou resfriado comum, artrite ou doenças auto-imunes, as células inflamatórias são geralmente encontradas na ou migram para áreas de injúria ou infecção associada com estados de doenças inflamatórias, especialmente em ou para as passagens respiratórias ou vias aéreas dos pacientes que sofrem de tais doenças. Essas células infla- matórias podem contribuir muito para a patologia das doenças através do dano tecidual feito por mediadores da inflamação liberados a partir dessas células. Um exemplo de tal dano ou destruição tecidual através dessa inflamação crônica ocorre em pacientes com fibrose císti- ca onde os mediadores liberados a partir dos neutrófilos (por exemplo, mieloperoxidase [MPO]) induzem a descamação do tecido epitelial das vias aéreas.
MARCKS, uma proteína de aproximadamente 82 KD, tem três regiões evolucionari- amente conservadas (Aderem et al, Nature 1988; 332: 362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351: 320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356: 618-622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18797-18802): uma N-terminal, um domínio de sítio de fosforilação (ou PSD) e um do- mínio de homologia múltipla 2 (MH2). DNAc e proteína MARCKS é conhecida e reportada por Harlan et al., J. Biol. Chem. 1991, 266: 14399 (No. de Acesso Genbank M68956) e tam- bém por Sakai et al, Genomics 1992,14: 175. Essas seqüências também são fornecidas em WO 00/50062, a qual é incorporada na sua totalidade por referência. O N-terminal, uma se- qüência de alfa-aminoácido compreendendo 24 resíduos de aminoácidos com uma porção de ácido mirístico ligada através de uma ligação amida no resíduo de glicina N-terminal está envolvido na ligação das MARCKS nas membranas nas células (Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18797-18802) e possivelmente na calmodulina (Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278: 48898-48902). Essa seqüência de 24 aminoácidos é conhecida como o peptídeo MANS.
Resumo da invenção O envolvimento da proteína MARCKS na liberação dos mediadores inflamatórios dos grânulos de leucócitos infiltrantes é relevante para a inflamação em doenças em todos os tecidos e órgãos, incluindo doenças de pulmão caracterizadas pela inflamação das vias aéreas, tais como asma, DPOC e fibrose cística. Entretanto, inflamação e secreção de muco nas vias aéreas são dois processos separados e independentes (Li et al., J Biol Chem 2001; 276: 40982-40990; Singer et al., Nat Med 2004; 10: 193-196). enquanto que a produção de muco e a secreção podem ser provocadas por uma variedade de fatores, incluindo mediado- res liberados pelas células inflamatórias, não há ligação direta por meio da qual o excesso de muco cause inflamação. Num aspecto dessa invenção, o peptídeo MANS pode desempenhar um papel na
redução da taxa e/ou quantidade de liberação de grânulos ou vesículas mediadoras inflama- tórias em leucócitos.
Em outro aspecto, os peptídeos derivados da MARCKS N-terminal, especialmente da seqüência N-terminal de 24 aminoácidos, isto é, fragmentos de peptídeos contíguos ati- vos derivados da seqüência de 1 a 24 aminoácidos N-terminal de MARCKS com uma glicina na posição 1, assim como amidas N-terminais de tais fragmentos, tais como amidas de áci- do acético N-terminal de tais fragmentos, e/ou assim como amidas C-terminais de tais frag- mentos, tais como amidas C-terminais de amônia, podem inibir ou reduzir a taxa e/ou quan- tidade de liberação de mediadores inflamatórios a partir de leucócitos inflamatórios. Tal ini- bição ou redução na liberação compreende a inibição de uma liberação de mediadores in- flamatórios relacionada com MARCKS a partir de leucócitos inflamatórios.
Em outro aspecto, os peptídeos derivados do N-terminal MARCKS, especialmente da seqüência N-terminal de 1 a 24 aminoácidos, isto é, fragmentos peptídicos contíguos ativos derivados da seqüência de 1 a 24 aminoácidos N-terminal de MARCKS com uma gli- cina na posição 1, assim como amidas N-terminais de tais fragmentos, tais como amidas de ácido acético N-terminais de tais fragmentos, e assim como amidas C-terminais de tais fragmentos, tais como amidas C-terminais de amônia, podem inibir a taxa de liberação e/ou quantidade de liberação de mediadores inflamatórios, tais como aqueles aqui identificados nessa invenção, pela inibição do processo de desgranulação em leucócitos inflamatórios. Em outro aspecto, o peptídeo MANS e seus fragmentos ativos, e amidas ativas de
tais fragmentos conforme aqui descrito, podem competir pela ligação à membrana em célu- las inflamatórias com proteína MARCKS natural para atenuar (diminuir ou reduzir) a libera- ção relacionada com MARCKS dos mediadores da inflamação a partir dos grânulos ou vesí- culas contendo tais mediadores de inflamação em tais células inflamatórias. Tipos de células de leucócitos e tipos de células modelo que secretam conteúdos
de grânulos específicos em resposta à ativação induzida por éster forbol de PKC são úteis para a demonstração in vivo da eficácia dos peptídeos dessa invenção e de peptídeos subs- tituídos (por exemplo, alfa-N-amidas, ésteres e amidas C-terminais) dessa invenção.
A atenuação de liberação dos mediadores inflamatórios ligados à membrana pelos compostos e composições dessa invenção podem ser demonstrados usando linhagens celu- lares de leucócitos humanos. Por exemplo, os neutrófilos isolados do sangue humano po- dem ser usados para demonstrar a atenuação ou inibição de liberação da mieloperoxidase (MPO). O clone HL-60 da linhagem celular promielocítica humana 15 pode ser usado para demonstrar a atenuação da liberação ou inibição da liberação da secreção de eosinófilo pe- roxidase (EPO) pelos compostos e composições dessa invenção (ver, por exemplo, Fisch- koff SA. Graded increase in probability of eosinophilic differentiation of HL-60 promyelocytic Ieukemia cells induced by culture under alkaline conditions. Leuk Res 1988; 12: 679-686; Rosenberg HF1 Ackerman S J, Tenen DG. Human eosinophil cationic protein: molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin with ribonuclease activity. J Exp Med 1989; 170: 163-176; Tiffany HL, Li F, Rosenberg HF. Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic Ieukemia cell Iine and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J Leukoc Biol 1995; 58:49-54; e Badewa AP, Hudson CE, Heiman AS. Regulatory effects of eotaxin, eotaxin-2, and eotaxin-3 on eosinophil degranulation and superoxide anion generation. Exp Biol Med 2002; 227: 645-651). A linhagem de células de leucemia monocí- ticsa U937 podem ser usadas para demonstrar a atenuação da liberação de inibição da libe- ração ou secreção da Iisozima pelos compostos e composições dessa invenção (ver, por exemplo, Hoff T, Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt-Stmebe M. Effects of glucocorti- coids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52: 173-182; Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium-independent phospholipase A2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170: 5276-5280; e Sundstrom C, Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic Iymphoma cell Iine (U-937). Int J Câncer 1976; 17: 565-577). A linhagem de células natural killer linfocíticas NK-92 pode ser usada para demonstrar atenuação ou inibição da liberação da granzima pelos compostos e composições dessa invenção (ver, por exemplo, Gong JH., Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell Iine (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8: 652-658; Maki G, Klingemann HG1 Martinson JA, Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369-383; e Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphoeyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104: 183-190). Num método in vitro para inibir ou atenuar a liberação de um mediador de inflamação, tais como aqueles aqui descritos, cada um dos tipos celulares é pré-incubado com um composto peptídico ou composição peptídica dessa invenção numa faixa de con- centrações seguido pela incubação dessas células por um estimulador de liberação dos me- diadores inflamatórios, tal como éster forbol. A porcentagem de inibição de liberação de um mediador de inflamação é determinada em comparação com a liberação do mediador na ausência do composto peptídeo ou composição peptídica, tal como numa leitura espectrofo- tométrica de uma concentração do mediador liberado.
Para demonstrar a importância do posicionamento da seqüência de aminoácidos relativo nos peptídeo da invenção, a capacidade relativa de inibir ou reduzir a quantidade de mediador inflamatório liberado por um peptídeo o qual é idêntico à seqüência de 24 aminoá- cidos da região N-terminal da proteína MARCKS (isto é, o peptídeo da seqüência alfa-N- terminal miristoilada MANS) foi comparada com a capacidade de inibir ou reduzir a quanti- dade de mediador inflamatório liberado por um peptídeo contendo os mesmos 24 resíduos de aminoácidos presentes em MANS, porém os quais são sequenciados numa ordem alea- tória (isto é, um peptídeo RNS1 referido de outro modo como um "peptídeo de seqüência N- terminal aleatório") em relação à ordem da seqüência em MANS. Em cada um dos tipos ce- lulares examinados, o peptídeo MANS, porém não o peptídeo RNS, atenuou a liberação de mediadores inflamatórios de um modo dependente de concentração num período de tempo de 0,5 a 3,0 horas. Esses resultados sugerem que o posicionamento da seqüência de ami- noácidos relativo nos peptídeos da invenção, os quais estão na ordem encontrada na prote- ína MARCKS, especificamente sua região N-terminal, e mais especificamente sua região N- terminal de 24 resíduos de aminoácidos estão envolvidos em pelo menos uma via intracelu- lar que lida com a inibição da desgranulação de leucócitos. A invenção se refere ao novo uso para a seqüência de peptídeos de 24 aminoáci-
dos, e à seqüência de peptídeos acetilada alfa-N-terminal, ao polipeptídeo miristoilado, tam- bém conhecido como peptídeo MANS, e aos seus fragmentos ativos, cujos fragmentos ati- vos podem ser selecionados do grupo de peptídeos com de 4 a 23 resíduos de aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos do peptídeo MANS1 e cujos fragmentos podem ser N-terminalmente miristoilados se eles não começarem com a glicina N-terminal na posição 1 na SEQ ID NO: 1, ou os quais podem ser N-terminalmente acetilados com grupos acil de C2 a C12, incluindo N-terminal acetilado, e/ou C-terminal amidado com um grupo NH2.
A invenção também se refere a um novo método para bloquear os processos secre- tórios celulares relacionados com MARCKS, especialmente aqueles que envolvem a Iibera- ção relacionada com MARCKS dos mediadores inflamatórios das células inflamatórias, cu- jas vias estimulatórias envolvem a proteína MARCKS substrato da proteína quinase C (PKC) e a liberação dos conteúdos das vesículas ou grânulos intracelulares.
A presente invenção é direcionada a um método de inibição da liberação exocitótica de pelo menos um mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória compreen- dendo o contato de pelo menos uma célula inflamatória, cuja célula compreende pelo menos um mediador inflamatório contido numa vesícula dentro da célula, com pelo menos um pep- tídeo selecionado do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo seu conforme descrito aqui nua quantidade eficaz para reduzir a liberação do mediador da célula inflamatória em comparação com a liberação do mediador inflamatório do mesmo tipo de célula inflamatória que poderia ocorrer na ausência de pelo menos um peptídeo.
A presente invenção é ainda direcionada a um método de inibição da liberação de pelo menos um mediador inflamatório a partir de pelo menos uma célula inflamatória num tecido ou fluido de um indivíduo compreendendo a administração ao tecido e/ou fluido do indivíduo, a qual compreende pelo menos uma célula inflamatória compreendendo pelo me- nos um mediador inflamatório contido numa vesícula dentro da célula, uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um pep- tídeo selecionado do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo seu numa quantidade terapeuticamente eficaz para reduzir a liberação do mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória em comparação com a liberação do mediador infla- matório a partir de pelo menos um do mesmo tipo de célula inflamatória que poderia ocorrer na ausência de pelo menos um peptídeo. Mais especificamente, a inibição da liberação de um mediador inflamatório compreende o bloqueio ou redução da liberação de um mediador inflamatório da célula inflamatória.
Mais particularmente, a presente invenção inclui um método de redução da inflama- ção num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo MANS (isto é, Miristo- il-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1)) ou um fragmento ativo seu. O frag- mento ativo é de pelo menos quatro e preferivelmente de pelo menos seis aminoácidos de comprimento. Conforme aqui utilizado, um "fragmento ativo" de uma proteína MARCKS é uma que afeta (inibe ou reduz) a liberação mediada pela proteína MARCKS, tal como a libe- ração mediada pela proteína MARCKS de um mediador inflamatório. Um fragmento ativo pode ser selecionado do grupo consistindo de GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID NO: 2); GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 4); GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 7); GAQ FS KTAAKG EAAAE RPG E (SEQ ID NO: 11) GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 16); GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO 22); GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 29); GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 37) GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 46); GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 56) GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 67); GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 79) GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 92); GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106); GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121); GAQFSKTA (SEQ ID NO: 137); GAQFSKT (SEQ ID NO: 154); GAQFSK (SEQ ID NO: 172); GAQFS (SEQ ID NO: 191) e GAQF (SEQ ID NO: 211). Esses peptídeos, ao invés de conter uma porção miristoil no aminoácido N-terminal, ou não contém a porção química ou uma porção química não-miristoil no aminoácido N-terminal e/ou uma porção química no aminoácido C-terminal, tal como um grupo acetil N-terminal e/ou um grupo ami- da C-terminal, conforme aqui descrito. A presença da porção miristoil N-terminal hidrofóbica nos peptídeos MANS e dos fragmentos miristoilados N-terminais seus pode intensificar a sua compatibilidade com e, presumivelmente, sua permeabilidade com as membranas plasmáticas, e potencialmente permite que os peptídeos sejam captados pelas células. A inserção hidrofóbica de um grupo miristoil numa membrana de bicamada lipídica pode pro- porcionar um coeficiente de partição ou constante de associação aparente com lipídeos de até 104 M1 ou uma energia de ligação livre de Gibbs unitária de cerca de 8 Kcal/mol (ver, por exemplo, Peitzsch, R. M., e McLaughIin1 S. 1993, Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32: 10436- 10443), a qual é suficiente, pelo menos em parte, para permitir uma divisão do peptídeo MANS e dos fragmentos de peptídeo MANS miristoilados na membrana plasmática de uma célula, enquanto que grupos funcionais adicionais e suas interações no peptídeo MANS (o qual é miristoilado) _ e nos fragmentos de peptídeo MANS miristoilados podem potencializar suas permeabilidades de membrana relativas. Cada um dos fragmentos pode exibir coefici- entes de partição e afinidades de membrana que são representativas de suas estruturas respectivas. Os fragmentos podem ser preparados por métodos de síntese de peptídeos conhecidos na técnica, tais como por síntese de peptídeo em fase sólida (ver, por exemplo, os métodos descritos em Chan, Weng C. e White, Peter D. Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, New York (2000); e Lloyd-Williams, P. et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (1997)) e purificados pelos métodos conhecidos na técnica, tal como por cromatografia lí- quida de alta pressão. O peso molecular de cada peptídeo pode ser confirmado por espec- trometria de massa com cada uma apresentando um pico com uma massa molecular apro- priada. A eficácia dos peptídeos individuais e das combinações de peptídeos individuais (por exemplo, combinações de 2 dos peptídeos, combinações de 3 dos peptídeos, combinações de 4 dos peptídeos) nos métodos dessa descoberta podem ser prontamente determinados sem experimentação demasiada usando os procedimentos descritos nos exemplos aqui revelados. Uma combinação preferida irá compreender dois dos peptídeos: uma proporção molar preferida dos peptídeos pode ser de 50:50 (isto é, 1:1) até 99,99 para 0,01, cuja pro- porção pode ser prontamente determinada usando os procedimentos descritos nos exem- plos aqui revelados.
Preferivelmente, o peptídeo MANS ou seu fragmento ativo está contido numa com- posição farmacêutica a qual é útil para bloquear a inflamação. A presente invenção também inclui métodos para inibir um processo secretório celular num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu, que inibe um mediador inflamatório num indivíduo. A administração é geralmente selecionada do grupo consistindo de administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmonar, inalação e administração nasal ou oral, em que administração pulmonar geralmente inclui ou um ae- rossol, ou um inalador de pó seco, um inalador de dose medida ou um nebulizador.
A administração de uma composição compreendendo uma quantidade inibidora de desgranulação do peptídeo MANS ou de uma quantidade inibidora da desgranulação de um fragmento ativo seu, tal como uma composição farmacêutica do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo seu, para uso humano ou animal, proporciona o peptídeo MANS ou o frag- mento ativo seu pelo menos no sítio dentro ou em um tecido ou a uma camada contendo fluido em contato com a superfície de um tecido onde resíduos de uma célula granulocítica inflamatória ou no qual uma célula granulocítica inflamatória irá invadir, permitindo dessa forma que o peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu entre em contato com a célula gra- nulocítica inflamatória. Num aspecto, a administração de tal composição pode ser feita no primeiro acesso da primeira detecção de inflamação ou na primeira percepção de inflama- ção pelo humano ou animal ou na primeira alteração perceptível no nível da inflamação num humano ou animal para reduzir a quantidade de inflamação que poderia, de outra forma, ocorrer na ausência do peptídeo MANS ou fragmento ativo seu. Num aspecto, a administra- ção pode ser feita durante uma inflamação adiantada de um tecido no humano ou animal para reduzir a quantidade de inflamação adicional que poderia, de outra forma, ocorrer na ausência do peptídeo MANS ou fragmento ativo seu. Enquanto que a quantidade e frequên- cia da dose pode ser determinada por avaliação clínica e ser uma função da doença ou fon- te de inflamação e da extensão de tecido envolvido e da idade e tamanho do paciente, é antecipado que a dosagem de uma composição farmacêutica pode ser repetida depois de 3 a 8 horas, preferivelmente depois de 6 a 8 horas depois da primeira administração da com- posição farmacêutica.
A presente invenção também inclui métodos de redução da inflamação num indiví-
duo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS de mediadores inflamatórios, por meio do que a liberação de pelo menos um mediador inflamatório no indivíduo é reduzida em comparação com aquela a qual poderia ocorrer na ausência do referido tratamento. Con- forme aqui utilizado, "reduzindo" significa de um modo geral a uma redução dos efeitos da inflamação. Preferivelmente, a liberação dos mediadores inflamatórios é inibida ou bloquea- da pelos métodos revelados.
Outra modalidade da presente invenção inclui métodos para reduzir a inflamação num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS dos mediadores inflamató- rios, por meio do que a inflamação no indivíduo é reduzida em comparação com aquela a qual poderia ocorrer na ausência do referido tratamento. A presente invenção também des- creve métodos para reduzir ou inibir inflamação num indivíduo compreendendo a adminis- tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo MANS ou de um frag- mento ativo seu eficaz para inibir um mediador inflamatório no sítio de inflamação. O termo "inibindo" significa uma redução na quantidade de secreção de mediador inflamatório. O termo "inibindo completamente" significa uma redução até zero na quantidade de secreção do mediador inflamatório. Novamente, conforme estabelecido acima, o fragmento ativo a - presenta pelo menos quatro e preferivelmente pelo menos seis aminoácidos de comprimen- to. O termo "processo exocitótico" significa exocitose, isto é, um processo de secreção celu- lar ou excreção no qual as substâncias contidas numa vesícula, cuja vesícula reside dentro da célula, são descarregadas da célula por fusão da membrana vesicular da vesícula com a membrana celular externa. "Desgranulação" significa a liberação dos conteúdos dos grânu- Ios celulares. O termo "inibição da desgranulação" significa uma redução na liberação dos mediadores inflamatórios contidos nos grânulos da célula inflamatória. Deste modo, uma quantidade inibidora da desgranulação do peptídeo MANS e/ou de um fragmento ativo seu é a quantidade desses peptídeos que é suficiente para reduzir a liberação dos mediadores inflamatórios contidos nos grânulos em comparação com a liberação na ausência do mesmo peptídeo.
No peptídeo de referência, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1), na posição N-terminal do peptídeo de referência, G está na posição 1; adjacente ao G na posição 1 está o A na posição 2; adjacente ao A na posição 2 está o Q na posição 3; adja- cente ao Q na posição 3 está o F na posição 4; adjacente ao F na posição 4 está o S na posição 5; adjacente ao S na posição 5 está o K na posição 6; adjacente ao K na posição 6 está o T na posição 7; adjacente ao T na posição 7 está o A na posição 8; adjacente ao A na posição 8 está o A na posição 9; adjacente ao A na posição 9 está o K na posição 10; adja- cente ao K na posição 10 está o G na posição 11; adjacente ao G na posição 11 está o E na posição 12; adjacente ao E na posição 12 está o A na posição 13; adjacente ao A na posi- ção 13 está o A na posição 14; adjacente ao A na posição 14 está o A na posição 15; adja- cente ao A na posição 15 está o E na posição 16; adjacente ao E na posição 16 está o R na posição 17; adjacente ao R na posição 17 está o P na posição 18; adjacente ao P na posi- ção 18 está o G na posição 19; adjacente ao G na posição 19 está o E na posição 20; adja- cente ao E na posição 20 está o A na posição 21; adjacente ao A na posição 21 está o A na posição 22; adjacente ao A na posição 22 está o V na posição 23; adjacente ao V na posi- ção 23 está o A na posição 24, em que a posição 24 é a posição C-terminal do peptídeo de referência.
Uma "variante" de um peptídeo de referência ou uma variante do segmento de ami-
noácido de 4 a 23 de um peptídeo de referência é um peptídeo o qual tem uma seqüência de aminoácidos a qual difere da seqüência de aminoácidos do peptídeo de referência ou da seqüência de aminoácidos do segmento do peptídeo de referência, respectivamente, em pelo menos uma posição de aminoácidos no peptídeo de referência ou na seqüência de aminoácidos do segmento do peptídeo de referência, respectivamente, porém a qual retém a atividade inibidora da mucina ou muco, cuja atividade está tipicamente entre 0,1 a 10 ve- zes a atividade do peptídeo de referência ou segmento, respectivamente, preferivelmente entre 0,2 a 6 vezes a atividade do peptídeo de referência ou segmento, respectivamente, mais preferivelmente entre 0,3 a 5 vezes a atividade do peptídeo de referência ou segmento, respectivamente. Uma "variante" de uma seqüência de aminoácidos de referência ou uma variante de um segmento de 4 a 23 aminoácidos de uma seqüência de aminoácidos de refe- rência é uma seqüência de aminoácidos que difere de pelo menos um aminoácido da se- qüência de aminoácidos de referência ou do segmento da seqüência de aminoácidos de referência, respectivamente, porém que tem uma seqüência de aminoácidos de um peptídeo e que retém a atividade inibitória de mucina ou muco do peptídeo ou segmento, respectiva- mente, codificado pela seqüência de aminoácidos de referência, cuja atividade está tipica- mente entre 0,1 a 10 vezes a atividade do peptídeo ou segmento, respectivamente, da se- qüência de referência, preferivelmente entre 0,2 a 6 vezes a atividade do peptídeo ou seg- mento da seqüência de referência, respectivamente, mais preferivelmente entre 0,3 a 5 ve- zes a atividade do peptídeo ou segmento da seqüência de referência, respectivamente. Uma substituição de pepetídeo variante ou uma substituição de seqüência de aminoácido varian- te pode variar (isto é, diferir) de um peptídeo de referência ou da seqüência de aminoácidos de referência por uma ou mais substituições de aminoácidos na seqüência de aminoácidos de referência; um peptídeo variante de anulação ou uma seqüência de aminoácidos variante de anulação pode variar (Isto é, diferir) de um peptídeo de referência ou de uma seqüência de aminoácidos de referência por uma ou mais anulações de aminoácidos na seqüência de aminoácidos de referência; e um peptídeo variante de adição ou uma seqüência de aminoá- cidos variante de adição pode variar (isto é, diferir) de uma seqüência de peptídeo de refe- rência ou de uma seqüência de aminoácidos de referência por uma ou mais adições de a- minoácidos na seqüência de referência. Um peptídeo variante ou seqüência de aminoácidos variante pode resultar de uma substituição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substi- tuição de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) numa seqüência de referência, ou pode resultar de uma anulação de um ou mais aminoácidos (por exemplo, anulação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) numa seqüência de referência, ou pode resultar de uma adição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, adição de pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) numa seqüência de referência, ou uma combinação destes em qualquer ordem. Uma variante de substituição de um segmento peptídico de 4 a 23 aminoá- cidos ou uma variante de substituição de uma seqüência de um segmento de4 a 23 aminoá- cidos pode variar (isto é, diferir) de um segmento de peptídeo de 4 a 23 aminoácidos ou de uma seqüência de segmento de 4 a 23 aminoácidos de referência por uma ou mais substitu- ições de aminoácidos na seqüência de segmento de aminoácido de referência; uma variante de anulação de um segmento peptídico de 4 a 23 aminoácidos ou uma seqüência de um segmento de aminoácidos variante da anulação de 4 a 22 aminoácidos pode variar (Isto é, diferir) de um segmento peptídeo de referência de 5 a 23 ou de uma seqüência de segmento de aminoácido de referência de 5 a 23 aminoácidos por uma ou mais anulações de aminoá- cidos na seqüência de segmento de aminoácidos de referência; e um peptídeo variante de adição de 4 a 23 aminoácidos ou uma seqüência de aminoácidos variante de adição pode variar (isto é, diferir) de uma seqüência de peptídeo de referência de 4 a 22 aminoácidos ou uma seqüência de aminoácidos de referência de 4 a 22 aminoácidos por uma ou mais adi- ções de aminoácidos na seqüência de referência. Um peptídeo variante de 4 a 23 aminoáci- dos ou uma seqüência de aminoácidos variante de 4 a 23 aminoácidos pode resultar de uma substituição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, substituição de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) num segmento de 4 a 23 aminoácidos de uma seqüência de aminoácidos de referência, ou pode resultar de uma anulação de um ou mais aminoáci- dos (por exemplo, anulação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) numa se- qüência de aminoácidos de referência respectivamente maior, ou pode resultar da adição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, da adição de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ami- noácidos) numa seqüência de aminoácidos de referência respectivamente menor, ou de uma combinação destes. Preferivelmente, um peptídeo variante ou seqüência de aminoáci- dos varia de um peptídeo de referência ou de um segmento de um peptídeo de referência ou de uma seqüência de aminoácidos de referência ou de um segmento de uma seqüência de aminoácidos de referência, respectivamente, por menos do que 10 substituições, anula- ções e/ou adições de aminoácidos; mais preferivelmente, por menos do que 8 substituições, anulações e/ou adições de aminoácidos; ainda mais preferivelmente, por menos do que 6 substituições, anulações e/ou adições de aminoácidos; e ainda mais preferivelmente, por menos do que 5 substituições, anulações e/ou adições de aminoácidos; e ainda mais prefe- rivelmente por menos do que 4 substituições, anulações e/ou adições de aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de aminoácido variante difere de um peptídeo de referência ou de um segmento de uma seqüência de aminoácidos por um ou dois ou três aminoácidos.
"Identidade de seqüência" significa, em relação às seqüências de aminoácidos dos dois peptídeos, a quantidade de posições com aminoácidos idênticos dividido pela quanti- dade de aminoácidos na mais curta das duas seqüências.
"Substancialmente idêntico" significa, em relação à comparação das seqüências de aminoácidos dos dois peptídeos ou comparação das seqüências de aminoácidos dos dois segmentos de peptídeos (por exemplo, segmentos de uma seqüência de aminoácidos do peptídeo de referência), que a seqüência de aminoácidos dos peptídeos ou segmentos de peptídeos tem pelo menos 75% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 80% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de seqüência.
O termo "peptídeo", conforme aqui utilizado, inclui o peptídeo, assim como sais far- maceuticamente aceitáveis do peptídeo.
Um peptídeo "isolado", conforme aqui utilizado, significa um peptídeo de ocorrência natural que tenha sido separado ou substancialmente separado dos componentes celulares (por exemplo, ácidos nucléicos e outros peptídeos) que o acompanham naturalmente por purificação, síntese recombinante ou síntese química, e também engloba peptídeos recom- binantemente ou quimicamente sintetizados de ocorrência não-natural que tenham sido puri- ficados ou substancialmente purificados a partir dos componentes celulares, materiais bioló- gicos, precursores químicos ou outras substâncias químicas.
As seguintes abreviações de aminoácidos de três letras e de uma letra são usadas por todo o texto: alanina: (Ala) A; arginina: (Arg) R; Asparagina: (Asn) N; ácido aspártico: (Asp) D; Cisteína (Cys) C; Glutamina: (GIn) Q; Ácido glutâmico: (GIu) E; Glicina: (GIy) G; Histidina: (His) H; lsoleucina: (IIe) I; Leucina: (Leu) L; Lisina: (Lys) K; Metionina: (Met) M; Fenilalanina: (Phe) F; Prolina: (Pro) P; Serina: (Ser) S; Treonina: (Thr) T; Triptofano: (Trp) W; Tirosina: (Tyr) Y; Valina: (VaI) V. Símbolos de três letras adicionais úteis aqui incluem, entre parênteses, (Hyp) para hidroxiprolina, (NIe) para norleucina, (Orn) para ornitina, (Pyr) para ácido piroglutâmico e (Sar) para sarcosina. Por convenção, a extremidade amino (ou N-terminal) de um peptídeo aparece na extremidade esquerda de uma seqüência de amino- ácidos escrita do peptídeo e a extremidade carbóxi (ou C-terminal) aparece na extremidade direita de uma seqüência de aminoácidos escrita. A seqüência de aminoácidos de um peptí- deo pode ser escrita com símbolos de uma única letra para representar os aminoácidos os quais são covalentemente ligados por ligações amido peptídicas no peptídeo.
Fragmentos ativos do peptídeo MANS podem ser úteis na prevenção ou redução na quantidade de inflamação num tecido num animal causada por mediadores inflamatórios. Fragmentos ativos do peptídeo MANS também podem ser úteis na prevenção ou redução na quantidade do dano tecidual num animal produzida ou causada por mediadores inflama- tórios. Um fragmento ativo do peptídeo MANS é composto de pelo menos 4 aminoácidos contíguos e por não mais do que 23 aminoácidos contíguos do peptídeo MANS (SEQ ID NO: 1). O termo "fragmento ativo" no contexto da presente invenção é tencionado a englo- bar aqueles fragmentos dos peptídeos MANS que são capazes de prevenir ou reduzir a libe- ração de mediadores inflamatórios a partir de uma célula inflamatória. A redução da Iibera- ção dos mediadores inflamatórios pelos fragmentos ativos pode variar de uma redução de pelo menos 5% até pelo menos 99% em comparação com um peptídeo de referência, tal como um peptídeo MANS. Tabela 1 contém uma lista das seqüências de aminoácidos no formato de abrevia- ção com uma única letra juntamente com o número do peptídeo respectivamente corres- pondente e SEQ ID NO. A seqüência de aminoácidos do peptídeo de referência (peptídeo MANS) está listada como peptídeo 1. Seqüências de aminoácidos dos peptídeos da inven- ção com uma seqüência de aminoácidos de 4 a 23 aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos de referência estão listadas como peptídeos 2 a 231, juntamente com a se- qüência de aminoácidos de uma seqüência N-terminal aleatória (RNS) compreendendo a - minoácidos do peptídeo MANS como peptídeo 232. Seqüências de aminoácidos das varian- tes representativas das seqüências de aminoácidos dos peptídeos da invenção, conforme descrito aqui, e são também listadas como peptídeos 233 a 245 e 247 a 251. Esses peptí- deos variantes listados não são tencionados a serem um grupo Iimitante de peptídeos, estão presentes somente para servir como exemplos representativos de peptídeos variantes da invenção. É também apresentado uma seqüência de aminoácidos reversa representativa (peptídeo 246) e uma seqüência de aminoácidos aleatória representativa do peptídeo (pep- tídeo 232) da invenção. As seqüências de aminoácidos reversa e aleatória na tabela não são tencionadas a serem representativas da invenção.
Tabela 1 contém uma listagem de peptídeos dessa invenção e suas respectivas seqüências de aminoácidos e SEQ ID NOS. Correspondentes.
Tabela 1 Seqüências de aminoácidos e peptídeos
No. do Peptídeo Seqüência Seqüência ID NO. Peptídeo 1 GAQ FS KTAAKG EAAAE RPG EAAVA SEQ ID NO. 1 Peptídeo 2 GAQ FS KTAAKG E AAAERPG EAAV SEQ ID NO. 2 Peptídeo 3 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 3 Peptídeo 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 4 Peptídeo 5 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 5 Peptídeo 6 QFSKT AAKGEAAAERPGEAA VA SEQ ID NO. 6 Peptídeo 7 GAQFSKT AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 7 Peptídeo 8 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 8 Peptídeo 9 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 9 Peptídeo 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 10 Peptídeo 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 11 Peptídeo 12 AQ FS KTAAKG EAAAE RPG EA SEQ ID NO. 12 Peptídeo 13 QFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 13 Peptídeo 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 14 Peptídeo 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 15 Peptídeo 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 16 Peptídeo 17 AQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 17 Peptídeo 18 QFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 18 Peptídeo 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 19 Peptídeo 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 20 Peptídeo 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 21 Peptídeo 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 22 Peptídeo 23 AQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 23 Peptídeo 24 QFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 24 Peptídeo 25 FSKT AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 25 Peptídeo 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 26 Peptídeo 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 27 Peptídeo 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 28 Peptídeo 29 GAQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 29 Peptídeo 30 AQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 30 Peptídeo 31 QFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 31 Peptídeo 32 FSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 32 Peptídeo 33 SKT AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 33 Peptídeo 34 KTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 34 Peptídeo 35 TAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 35 Peptídeo 36 AAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 36 Peptídeo 37 GAQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 37 Peptídeo 38 AQFSKT AAKGEAAAER SEQ ID NO. 38 Peptídeo 39 QFSKT AAKGEAAAERP SEQ ID NO. 39 Peptídeo 40 FSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 40 Peptídeo 41 SKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 41 Peptídeo 42 KTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 42 Peptídeo 43 TAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 43 Peptídeo 44 AAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 44 Peptídeo 45 AKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 45 Peptídeo 46 GAQFSKT AAKGEAAA SEQ ID NO. 46 Peptídeo 47 AQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 47 Peptídeo 48 QFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 48 Peptídeo 49 FSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 49 Peptídeo 50 SKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 50 Peptídeo 51 KTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 51 Peptídeo 52 TAAKG EAAAE RPG EA SEQ ID NO. 52 Peptídeo 53 AAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 53 Peptídeo 54 AKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 54 Peptídeo 55 KGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 55 Peptídeo 56 GAQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 56 Peptídeo 57 AQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 57 Peptídeo 58 QFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 58 Peptídeo 59 FSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 59 Peptídeo 60 SKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 60 Peptídeo 61 KTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 61 Peptídeo 62 TAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 62 Peptídeo 63 AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 63 Peptídeo 64 AKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 64 Peptídeo 65 KGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 65 Peptídeo 66 GEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 66 Peptídeo 67 GAQFSKT AAKGEA SEQ ID NO. 67 Peptídeo 68 AQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 68 Peptídeo 69 QFSKT AAKGEAAA SEQ ID NO. 69 Peptídeo 70 FSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 70 Peptídeo 71 SKTAAKGEAAAER SEQ ID NO. 71 Peptídeo 72 KTAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 72 Peptídeo 73 TAAKGEAAAERPG SEQ ID NO. 73 Peptídeo 74 AAKG EAAAE RPGE SEQ ID NO. 74 Peptídeo 75 AKGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 75 Peptídeo 76 KGEAAAERPGEAA SEQ ID NO. 76 Peptídeo 77 GEAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 77 Peptídeo 78 EAAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 78 Peptídeo 79 GAQ FSKTAAKG E SEQ ID NO. 79 Peptídeo 80 AQ FS KTAAKG EA SEQ ID NO. 80 Peptídeo 81 QFSKT AAKGEAA SEQ ID NO. 81 Peptídeo 82 FSKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 82 Peptídeo 83 SKTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 83 Peptídeo 84 KTAAKG EAAAE R SEQ ID NO. 84 Peptídeo 85 TAAKGEAAAERP SEQ ID NO. 85 Peptídeo 86 AAKG EAAAE RPG SEQ ID NO. 86 Peptídeo 87 AKGEAAAERPGE SEQ ID NO. 87 Peptídeo 88 KGEAAAERPGEA SEQ ID NO. 88 Peptídeo 89 G EAAAE RPG EAA SEQ ID NO. 89 Peptídeo 90 EAAAERPGEAAV SEQ ID NO. 90 Peptídeo 91 AAAERPGEAAVA SEQ ID NO. 91 Peptídeo 92 GAQFSKTAAKG SEQ ID NO. 92 Peptídeo 93 AQFSKT AAKGE SEQ ID NO. 93 Peptídeo 94 QFSKTAAKGEA SEQ ID NO. 94 Peptídeo 95 FSKTAAKGEAA SEQ ID NO. 95 Peptídeo 96 SKTAAKGEAAA SEQ ID NO. 96 Peptídeo 97 KTAAKGEAAAE SEQ ID NO. 97 Peptídeo 98 TAAKGEAAAER SEQ ID NO. 98 Peptídeo 99 AAKGEAAAERP SEQ ID NO. 99 Peptídeo 100 AKGEAAAERPG SEQ ID NO. 100 Peptídeo 101 KGEAAAERPGE SEQ ID NO. 101 Peptídeo 102 GEAAAERPGEA SEQ ID NO. 102 Peptídeo 103 EAAAERPGEAA SEQ ID NO. 103 Peptídeo 104 AAAE RPG EAAV SEQ ID NO. 104 Peptídeo 105 AAERPGEAAVA SEQ ID NO. 105 Peptídeo 106 GAQ FS KTAAK SEQ ID NO. 106 Peptídeo 107 AQFSKTAAKG SEQ ID NO. 107 Peptídeo 108 Q FS KTAAKG E SEQ ID NO. 108 Peptídeo 109 FSKTAAKGEA SEQ ID NO. 109 Peptídeo 110 SKTAAKGEAA SEQ ID NO. 110 Peptídeo 111 KTAAKGEAAA SEQ ID NO. 111 Peptídeo 112 TAAKGEAAAE SEQ ID NO. 112 Peptídeo 113 AAKGEAAAER SEQ ID NO. 113 Peptídeo 114 AKGEAAAERP SEQ ID NO. 114 Peptídeo 115 KGEAAAERPG SEQ ID NO. 115 Peptídeo 116 GEAAAERPGE SEQ ID NO. 116 Peptídeo 117 EAAAERPGEA SEQ ID NO. 117 Peptídeo 118 AAAERPGEAA SEQ ID NO. 118 Peptídeo 119 AAERPGEAAV SEQ ID NO. 119 Peptídeo 120 AERPGEAAVA SEQ ID NO. 120 Peptídeo 121 GAQFSKTAA SEQ ID NO. 121 Peptídeo 122 AQFSKTAAK SEQ ID NO. 122 Peptídeo 123 QFSKTAAKG SEQ ID NO. 123 Peptídeo 124 FSKTAAKGE SEQ ID NO. 124 Peptídeo 125 S KTAAKG EA SEQ ID NO. 125 Peptídeo 126 KTAAKGEAA SEQ ID NO. 126 Peptídeo 127 TAAKGEAAA SEQ ID NO. 127 Peptídeo 128 AAKGEAAAE SEQ ID NO. 128 Peptídeo 129 AKGEAAAER SEQ ID NO. 129 Peptídeo 130 KGEAAAERP SEQ ID NO. 130 Peptídeo 131 GEAAAERPG SEQ ID NO. 131 Peptídeo 132 EAAAERPGE SEQ ID NO. 132 Peptídeo 133 AAAERPGEA SEQ ID NO. 133 Peptídeo 134 AAERPGEAA SEQ ID NO. 134 Peptídeo 135 AERPGEAAV SEQ ID NO. 135 Peptídeo 136 ERPGEAAVA SEQ ID NO. 136 Peptídeo 137 GAQFSKTA SEQ ID NO. 137 Peptídeo 138 AQ FS KTAA SEQ ID NO. 138 Peptídeo 139 QFSKTAAK SEQ ID NO. 139 Peptídeo 140 FSKTAAKG SEQ ID NO. 140 Peptídeo 141 SKTAAKGE SEQ ID NO. 141 Peptídeo 142 KTAAKGEA SEQ ID NO. 142 Peptídeo 143 TAAKGEAA SEQ ID NO. 143 Peptídeo 144 AAKGEAAA SEQ ID NO. 144 Peptídeo 145 AKGEAAAE SEQ ID NO. 145 Peptídeo 146 KGEAAAER SEQ ID NO. 146 Peptídeo 147 GEAAAERP SEQ ID NO. 147 Peptídeo 148 EAAAERPG SEQ ID NO. 148 Peptídeo 149 AAAERPGE SEQ ID NO. 149 Peptídeo 150 AAERPGEA SEQ ID NO. 150 Peptídeo 151 AERPGEAA SEQ ID NO. 151 Peptídeo 152 ERPGEAAV SEQ ID NO. 152 Peptídeo 153 RPGEAAVA SEQ ID NO. 153 Peptídeo 154 GAQFSKT SEQ ID NO. 154 Peptídeo 155 AQFSKTA SEQ ID NO. 155 Peptídeo 156 QFSKTAA SEQ ID NO. 156 Peptídeo 157 FSKTAAK SEQ ID NO. 157 Peptídeo 158 SKTAAKG SEQ ID NO. 158 Peptídeo 159 KTAAKGE SEQ ID NO. 159 Peptídeo 160 TAAKGEA SEQ ID NO. 160 Peptídeo 161 AAKGEAA SEQ ID NO. 161 Peptídeo 162 akgeaaa SEQ ID NO. 162 Peptídeo 163 kgeaaae SEQ ID NO. 163 Peptídeo 164 geaaaer SEQ ID NO. 164 Peptídeo 165 eaaaerp SEQ ID NO. 165 Peptídeo 166 aaaerpg SEQ ID NO. 166 Peptídeo 167 aaerpge SEQ ID NO. 167 Peptídeo 168 aerpgea SEQ ID NO. 168 Peptídeo 169 erpgeaa SEQ ID NO. 169 Peptídeo 170 rpgeaav SEQ ID NO. 170 Peptídeo 171 pgeaava SEQ ID NO. 171 Peptídeo 172 GAQFSK SEQ ID NO. 172 Peptídeo 173 AQFSKT SEQ ID NO. 173 Peptídeo 174 QFSKTA SEQ ID NO. 174 Peptídeo 175 FSKTAA SEQ ID NO. 175 Peptídeo 176 SKTAAK SEQ ID NO. 176 Peptídeo 177 KTAAKG SEQ ID NO. 177 Peptídeo 178 TAAKGE SEQ ID NO. 178 Peptídeo 179 AAKGEA SEQ ID NO. 179 Peptídeo 180 AKGEAA SEQ ID NO. 180 Peptídeo 181 kgeaaa SEQ ID NO. 181 Peptídeo 182 GEAAAE SEQ ID NO. 182 Peptídeo 183 EAAAER SEQ ID NO. 183 Peptídeo 184 AAAERP SEQ ID NO. 184 Peptídeo 185 AAERPG SEQ ID NO. 185 Peptídeo 186 AERPGE SEQ ID NO. 186 Peptídeo 187 ERPGEA SEQ ID NO. 187 Peptídeo 188 RPGEAA SEQ ID NO. 188 Peptídeo 189 PGEAAV SEQ ID NO. 189 Peptídeo 190 GEAAVA SEQ ID NO. 190 Peptídeo 191 GAQFS SEQ ID NO. 191 Peptídeo 192 AQFSK SEQ ID NO. 192 Peptídeo 193 QFSKT SEQ ID NO. 193 Peptídeo 194 FSKTA SEQ ID NO. 194 Peptídeo 195 SKTAA SEQ ID NO. 195 Peptídeo 196 KTAAK SEQ ID NO. 196 Peptídeo 197 TAAKG SEQ ID NO. 197 Peptídeo 198 AAKGE SEQ ID NO. 198 Peptídeo 199 AKGEA SEQ ID NO. 199 Peptídeo 200 KGEAA SEQ ID NO. 200 Peptídeo 201 GEAAA SEQ ID NO. 201 Peptídeo 202 EAAAE SEQ ID NO. 202 Peptídeo 203 AAAER SEQ ID NO. 203 Peptídeo 204 AAERP SEQ ID NO. 204 Peptídeo 205 AERPG SEQ ID NO. 205 Peptídeo 206 ERPGE SEQ ID NO. 206 Peptídeo 207 RPGEA SEQ ID NO. 207 Peptídeo 208 PGEAA SEQ ID NO. 208 Peptídeo 209 GEAAV SEQ ID NO. 209 Peptídeo 210 EAAVA SEQ ID NO. 210 Peptídeo 211 GAQF SEQ ID NO. 211 Peptídeo 212 AQFS SEQ ID NO. 212 Peptídeo 213 QFSK SEQ ID NO. 213 Peptídeo 214 FSKT SEQ ID NO. 214 Peptídeo 215 SKTA SEQ ID NO. 215 Peptídeo 216 KTAA SEQ ID NO. 216 Peptídeo 217 TAAK SEQ ID NO. 217 Peptídeo 218 AAKG SEQ ID NO. 218 Peptídeo 219 AKGE SEQ ID NO. 219 Peptídeo 220 KGEA SEQ ID NO. 220 Peptídeo 221 GEAA SEQ ID NO. 221 Peptídeo 222 EAAA SEQ ID NO. 222 Peptídeo 223 AAAE SEQ ID NO. 223 Peptídeo 224 AAER SEQ ID NO. 224 Peptídeo 225 AERP SEQ ID NO. 225 Peptídeo 226 ERPG SEQ ID NO. 226 Peptídeo 227 RPGE SEQ ID NO. 227 Peptídeo 228 PGEA SEQ ID NO. 228 Peptídeo 229 GEAA SEQ ID NO. 229 Peptídeo 230 EAAV SEQ ID NO. 230 Peptídeo 231 AAVA SEQ ID NO. 231 Peptídeo 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF SEQ ID NO. 232 Peptídeo 233 G KQ FS KTAAKG E SEQ ID NO. 233 Peptídeo 234 GAQ FSKTKAKG E SEQ ID NO. 234 Peptídeo 235 GKQFSKTKAKGE SEQ ID NO. 235 Peptídeo 236 GAQASKTAAK SEQ ID NO. 236 Peptídeo 237 GAQASKTAAKGE SEQ ID NO. 237 Peptídeo 238 GAEFSKTAAKGE SEQ ID NO. 238 Peptídeo 239 GAQFSKTAAAGE SEQ ID NO. 239 Peptídeo 240 GAQFSKTAAKAE SEQ ID NO. 240 Peptídeo 241 GAQFSKTAAKGA SEQ ID NO. 241 Peptídeo 242 AAQ FS KTAAK SEQ ID NO. 242 Peptídeo 243 GAAFSKTAAK SEQ ID NO. 243 Peptídeo 244 GAQ FAKTAAK SEQ ID NO. 244 Peptídeo 245 GAQ FS ATAAK SEQ ID NO. 245 Peptídeo 246 KAATKSFQAG SEQ ID NO. 246 Peptídeo 247 GAQFSKAAAK SEQ ID NO. 247 Peptídeo 248 GAQFSKTAAA SEQ ID NO. 248 Peptídeo 249 GAQ FSATAAA SEQ ID NO. 249 Peptídeo 250 GAQASKTA SEQ ID NO. 250 Peptídeo 251 AAGE SEQ ID NO. 251 Peptídeo 252 G KASQ FAKTA SEQ ID NO. 252
Uma seqüência de aminoácidos de um peptídeo listada na Tabela 1 pode ser qui-
micamente modificada. Por exemplo, se uma seqüência de aminoácidos de um peptídeo listado na Tabela 1 for quimicamente modificada na amina N-terminal para formar uma ami- da com um ácido carboxílico, o peptídeo resultante é, algumas vezes, referido aqui por uma combinação de um identificador para o ácido carboxílico como um prefixo ligado por um hí- fen ao número do peptídeo. Por exemplo, em relação ao peptídeo 79 como um exemplo, um peptídeo miristoilado N-terminal 79 pode, algumas vezes, ser aqui referido como "peptídeo miristoilado 79" ou "myr-peptídeo 79"; um peptídeo acetilado 79 N-terminal pode algumas vezes ser referido aqui como "acetil-peptídeo 79" ou "AC-peptídeo 79". Uma versão cíclica do peptídeo 79 pode ser referida como "peptídeo cíclico 79" ou "cyc-peptídeo 79". Também, por exemplo, se uma seqüência de aminoácidos de um peptídeo listado na Tabela 1 for quimicamente modificada no grupo carboxílico C-terminal, por exemplo, por uma amina, tal como amônia para formar uma amida C-terminal, o peptídeo resultante é algumas vezes aqui referido por uma combinação de um identificador para o resíduo amina como um sufixo ligado por um hífen ao número do peptídeo. Deste modo, por exemplo, uma amida C- terminal do peptídeo 79 pode ser algumas vezes referida como "peptídeo-NH2". Quando a amina N-terminal do peptídeo (por exemplo, peptídeo 79) é quimicamente modificada, por exemplo, por um grupo miristoil e o grupo carboxílico C-terminal é modificado, por exemplo, por um grupo amonia para formar uma amida conforme acima, ο peptideo resultante pode ser algumas vezes referido usando tanto a notagao de prefix。quanto de sufixo, como "myr- peptideo 79-NH2”·
A invengao envolve peptideos com sequencias de amino^cidos compreendendo menos do que 24 amino^cidos com sequencias de amino^cidos relacionadas com a se- quencia de amino^cidos do peptideo MANS (isto έ, ο peptideo MANS έ ο peptideo miristoil 1 e a sequ§ncia de 24 amino^cidos de refer§ncia do peptideo MANS έ ο peptideo 1). Os peptideos da atual invengao consistem de sequencias de aminoacidos contendo menos do que 24 aminoacidos, e podem consistir de 8 a 14, de 10 a 12, de 9 a 14, de 9 a 13, de 10 a 13, de 10 a 14, pelo menos 9’ pelo menos 10 ou semelhantes aminoacidos. Os peptideos sao tipicamente cadeias lineares, por6m tamb^m podem da mesma forma ser peptideos ciclicos. AI6m disso, os peptideos podem ser peptideos isolados.
Em relagao ao peptideo 1 (SEQ ID NO: 1), a sequencia com 24 aminoacidos de re- ferencia, um segmento de 23 aminoacidos continuos da sequencia de aminoacidos de refe- rencia ό, algumas vezes, referida aqui como 23-mer. Analogamente, um segmento de 22 aminoacidos contiguos da sequencia de referencia e algumas vezes aqui referido como um 22-mer; uma sequencia de 21 aminoacidos como 21-mer; uma sequencia de 20 aminoaci- dos como 20-mer; uma sequencia de 19 aminoacidos como 19-mer; uma sequencia de 18 aminoacidos como 18-mer; uma sequencia de 17 aminoacidos como 17-mer; uma sequ§n- cia de 16 aminoacidos como 16-mer; uma sequencia de 15 aminoacidos como 15-mer; uma sequencia de 14 aminoacidos como 14-mer; uma sequencia de 13 aminoacidos como 13- mer; uma sequencia de 12 aminoacidos como 12-mer; uma sequencia de 11 aminoacidos como 11-mer; uma sequencia de 10 aminoacidos como 10-mer; uma sequencia de 9 amino- acidos como 9-mer; uma sequencia de 8 aminoacidos como 8-mer; uma sequencia de 7 aminoacidos como 7-mer; uma sequencia de 6 aminoacidos como 6-mer; uma sequencia de aminoacidos como 5-mer; uma sequencia de 4 aminoacidos como 4-mer; Num aspecto, qualquer uma dessas sequencias de aminoacidos "4 a 23 mer", as quais sao por si so pepti- deos (algumas vezes aqui denotado como H2N-peptideo-COOH) pode ser independente- mente quimicamente modificada, por exemplo, por modificagao quimica, cuja modificagao quimica pode ser selecionada do grupo consistindo de (i) formagao de amida no grupo ami- na N-terminal (H2N-peptideo-) tal como com, por exemplo, um C1 ou preferivelmente com um acido carboxilico de C2 (acido acetico) ate C22; (ii) formagao de amida no grupo carbo- xilico C-terminal (-peptideo-COOH) tal como com, por exemplo, amonia ou com uma amina primaria ou secundaria de C1 a C22; e (iii) uma combinagao destas. Os peptideos tem uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo
de (a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos da sequencia
de referencia, peptideo 1; (b) uma sequencia substancialmente similar a sequencia de ami- nodcidos definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a), cuja variante έ selecionada do grupo consistindo de uma variante de substituigao, de uma variante de anula^ao, de uma variante de adigSo e combina^Ses destas. Em algumas moda- lidades, os peptideos tem uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de (a): uma sequencia de aminoacidos com de 8 a 14 aminoacidos contiguos da sequencia de referencia, peptideo 1 ； (b) uma sequencia substancialmente identica έ sequencia definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a), cuja variante έ se- lecionada do grupo consistindo de uma variante de substituigao, de uma variante de anula- ς§ο, de uma variante de adigao e combinag5es destas. Ainda em outras modalidades, os peptideos tem uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de: (a): uma sequencia de aminoacidos com de 10 a 12 aminoacidos contiguos da sequencia de referencia, peptideo 1; (b) uma sequencia substancialmente identica έ sequencia definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a), cuja variante έ se- lecionada do grupo consistindo de uma variante de substituigao, de uma variante de anula- gao, de uma variante de adi?ao e combinagdes destas. Em outras modalidades, os pepti- deos tem uma sequencia de aminoacidos com pelo menos 9, pelo menos 10, de 9 a 14, de 9 a 13, de 10 a 13, de 10 a 14 aminoacidos contiguos ou semelhantes da sequencia de refe- renda, peptideo 1; uma sequencia de aminoacidos substancialmente identica a ela; ou uma variante sua,m cuja variante έ selecionada do grupo consistindo de uma variante de substi- tuigao, de uma variante de anula^ao, de uma variante de adigao e combinagdes destas. Conforme adicionalmente explicado abaixo, um ou mais dos aminoacidos dos peptideos (por exemplo, os aminoacidos N-terminais e/ou C-terminais) podem ser opcionalmente inde- pendentemente quimicamente modificados; em algumas modalidades, um ou mais aminoa- cidos de um peptideo serao quimicamente modificados, enquanto que em outras modalida- des nenhum dos aminoacidos do peptideo serao quimicamente modificados. Num aspecto, a modificagao preferida pode ocorrer no grupo amina (-NH2) do amino^cido N-terminal do peptideo ou segment。peptidico (cujo grupo amina poderia formar uma Iigagao amida pepti- deo, caso presente internamente numa sequencia de peptideo ao inv6s de na posigao N- terminal). Em outro aspecto, a modificagao preferida pode ocorrer no grupo carbbxi (-COOH) do aminoacido C-terminal do peptideo ou segmento de peptideo (cujo grupo carboxi poderia formar uma Iiga^ao amida peptideo, caso presente internamente numa sequencia de pepti- deo ao inves de na posigao C-terminal). Em outro aspecto, a modificagao preferida pode ocorrer tanto no grupo amina N-terminal (-NH2) quanto no grupo carboxilico C-terminal (- COOH).
Em algumas modalidades, a sequencia de aminoacidos do peptideo comega a par-
tir do aminoacido N-terminal do peptideo da sequencia de referencia 1. Por exemplo, os
peptideos podem ter uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de (a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 amino^cidos contiguos da sequencia de refer§ncia, peptideo 1, em que a sequencia de aminoacidos comega a partir do amino^cido N-terminal da sequencia de referencia (isto έ, peptideo 2, peptideo 4, peptideo 7, peptideo 11, peptideo 16, peptideo 22’ peptideo 29’ peptideo 37’ peptideo 46’ peptideo 56, peptideo 67, peptideo 79, peptideo 92, peptideo 106, peptideo 121, peptideo 137, peptideo 154, pep- tideo 172, peptideo 191 ou peptideo 211); (b) uma sequencia substancialmente similar έ sequencia de aminoacidos definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a). Esses peptideos nao contem porgao quimica ou uma porgao quimica na giicina N-terminal diferente de um grupo miristoil. Preferivelmente, a porgao quimica έ um grupo acil, na forma de uma IigagSo amida, tal como um grupo acetil, ou um grupo alquil.
Em outras modalidades, a sequencia de aminoacidos do peptideo termina no aml· noacido C-terminal da sequencia de referencia peptideo 1. Por exemplo, os peptideos po- dem ter uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de (a) uma se- quencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos da sequencia de referencia, peptideo 1, em que a sequencia de aminoacidos termina no amino^cido C-terminal da se- quencia de referencia (isto e, peptideo 3, peptideo 6, peptideo 10, peptideo 15, peptideo 21, peptideo 28, peptideo 36, peptideo 45, peptideo 55, peptideo 66, peptideo 78, peptideo 91, peptideo 105, peptideo 120, peptideo 136, peptideo 153, peptideo 171, peptideo 190, pepti- deo 210 ou peptideo 231); (b) uma sequencia substancialmente similar έ sequencia de aml· noacidos definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a).
Em outras modalidades, a sequencia de aminoacidos do peptideo nao se inicia no aminoacido N-terminal da sequencia de referencia, peptideo 1 (SEQ ID NO: 1), ao contrario, se inicia no aminoacido na posigao 2 atraves do aminoacido na ροβϊςέίο 21 da sequencia de referencia, peptideo 1. Por exemplo, os peptideos podem ter uma sequencia de amino^ci- dos selecionada do grupo consistindo de (a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos da sequencia de referencia, peptideo 1, em que a sequencia de a- minoacidos inicia em qualquer aminoacido entre a posigao 2 ate a posigao 21 da sequencia de referencia. Esses peptideos podem ser de 4 a 23 aminoacidos contiguos de comprimento e podem representar peptideos no meio da sequencia de referencia, peptideo 1 ； (b) uma sequencia substancialmente similar έ sequencia de aminoacidos definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a). Esses peptideos sao revelados nas Tabelas 1 ou 2. Esses peptideos podem nao conter porgdes quimicas covalentemente Iiga- das ou uma porgao quimica no aminoacido N-terminal a qual nao e a giicina N-terminal de ou equivalente a giicina N-terminal da sequencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1. Preferivel- mente, a porgao quimica e um grupo acil, tal como um grupo acetil ou um grupo miristoil, na forma de uma Iigagao amida, ou um grupo alquil.
Sequencias de aminoacidos do peptideo, as quais sao Citeis na atual ίηνβης§ο para inibir a hipersecreg§o de mucina num mamifero, e as quais sao Citeis para reduzir a quanti- dade de hipersecregao de mucina num mamifero, e as quais sao Citeis nos metodos de inibi- gao da hipersecreg§o de mucina e nos m6todos de redugao da hipersecregao de mucina incluem sequencias de amino^cidos dos peptideos isolados e sequ各ncias de amino^cidos dos peptideos os quais opcionalmente contem grupos quimicamente modificados N- terminais e/ou C-terminais da atual invengao, cujas sequencias de aminoacidos do peptideo sao selecionadas do grupo consistindo dos 23-mers (isto έ, peptideos com uma sequencia de 23 aminoacidos): peptideo 2; e peptideo 3; os 22-mers (isto 6, peptideos com uma se- quencia de 22 aminoacidos): peptideo 4; peptideo 5; e peptideo 6; os 21-mers (isto e, pepti- deos com uma sequencia de 21 aminoacidos): peptideo 7; peptideo 8; peptideo 9; e pepti- deo 10; os 20-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 20 aminoacidos): peptideo 11; peptideo 12; peptideo 13; peptideo 14; e peptideo 15; os 19-mers (isto 6’ peptideos com uma sequencia de 19 aminoacidos): peptideo 16; peptideo 17; peptideo 18; peptideo 19; peptideo 20; e peptideo 21; os 18-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 18 amino- acidos): peptideo 22; peptideo 23; peptideo 25; peptideo 26; peptideo 27; e peptideo 28; os 17-mers (isto έ, peptideos com uma sequencia de 17 aminoacidos): peptideo 29; peptideo 30; peptideo 31; peptideo 32; peptideo 33; peptideo 34; peptideo 35; e peptideo 36; os 16- mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 16 aminoacidos): peptideo 37; peptideo 38; peptideo 39; peptideo 40; peptideo 41 ； peptideo 42; peptideo 43; peptideo 44; e peptideo 45; os 15-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 15 aminoacidos): peptideo 46; peptideo 47; peptideo 48; peptideo 49; peptideo 50; peptideo 51 ； peptideo 52; peptideo 53; peptideo 54; e peptideo 55; os 14-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 14 amino- acidos): peptideo 56; peptideo 57; peptideo 58; peptideo 59; peptideo 60; peptideo 61 ； pep- tideo 62; peptideo 63; peptideo 64; peptideo 65; e peptideo 66; os 13-mers (isto έ, pepti- deos com uma sequencia de 13 aminoacidos): peptideo 67; peptideo 68; peptideo 69; pep- tideo 70; peptideo 71 ； peptideo 72; peptideo 73; peptideo 74; peptideo 75; peptideo 76; pep- tideo 77; e peptideo 78; os 12-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 12 aminoaci- dos): peptideo 79; peptideo 80; peptideo 81 ； peptideo 82; peptideo 83; peptideo 84; pepti- deo 85; peptideo 86; peptideo 87; peptideo 88; peptideo 89; peptideo 90; e peptideo 91 ； os 11-mers (isto έ, peptideos com uma sequencia de 11 aminoacidos): peptideo 92; peptideo 93; peptideo 94; peptideo 95; peptideo 96; peptideo 97; peptideo 98; peptideo 99; peptideo 100; peptideo 101; peptideo 102; peptideo 103; peptideo 104; e peptideo 105; os 10-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 10 aminoacidos): peptideo 106; peptideo 107; peptideo 108; peptideo 109; peptideo 110; peptideo 111; peptideo 112; peptideo 113; pepti- deo 114; peptideo 115; peptideo 116; peptideo 117; peptideo 118; peptideo 119; e peptideo 120; os 9-mers (isto e, peptideos com uma sequencia de 9 aminoacidos): peptideo 121; peptideo 122; peptideo 123; peptideo 124; peptideo 125; peptideo 126; peptideo 127; pepti- deo 128; peptideo 129; peptideo 130; peptideo 131; peptide。132; peptideo 133; peptideo 134; peptideo 135; e peptideo 136; os 8-mers (isto έ, peptideos com uma sequencia de 8 amino^cidos): peptideo 137; peptideo 138; peptideo 139; peptideo 140; peptideo 141; pep- tideo 142; peptideo 143; peptideo 144; peptideo 145; peptideo 146; peptideo 147; peptideo 148; peptideo 149; peptideo 150; peptideo 151; peptideo 152; e peptideo 153; os 7-mers (isto έ, peptideos com uma sequ§ncia de 7 aminodcidos): peptideo 154; peptideo 155; pep- tideo 156; peptideo 157; peptideo 158; peptideo 159; peptideo 160; peptideo 161; peptideo 162; peptideo 163; peptideo 164; peptideo 165; peptideo 166; peptideo 167; peptideo 168; peptideo 169; peptideo 170; e peptideo 171; os 6-mers (isto έ, peptideos com uma sequen- cia de 6 amino^cidos): peptideo 172; peptideo 173; peptideo 174; peptideo 175; peptideo 176; peptideo 177; peptideo 178; peptideo 179; peptideo 180; peptideo 181 ； peptideo 182; peptideo 183; peptideo 184; peptideo 185; peptideo 186; peptideo 187; peptideo 188; pepti- deo 189; e peptideo 190; os 5-mers (isto έ, peptideos com uma sequencia de 5 amino^ci- dos): peptideo 191; peptideo 192; peptideo 193; peptideo 194; peptideo 195; peptideo 196; peptideo 197; peptideo 198; peptideo 199; peptideo 200; peptideo 201; peptideo 202; pepti- deo 203; peptideo 204; peptideo 205; peptideo 206; peptideo 207; peptideo 208; peptideo 209; e peptideo 210; e os 4-mers (isto 6, peptideos com uma sequencia de 4 aminoiicidos): peptideo 211; peptideo 212; peptideo 213; peptideo 214; peptideo 215; peptideo 216; pepti- deo 217; peptideo 218; peptideo 219; peptideo 220; peptideo 221; peptideo 222; peptideo 223; peptideo 224; peptideo 225; peptideo 226; peptideo 227; peptideo 228; peptideo 229; peptideo 230; e peptideo 231.
Sequencias de aminoacidos preferidas dos peptideos isolados e de peptideos qui- micamente modificados N-terminais e/ou C-terminais da atual invengao sao selecionadas do grupo consistindo dos 23-mers: peptideo 2; e peptideo 3; os 22-mers: peptideo 4; peptideo 5; e peptideo 6; os 21-mers: peptideo 7; peptideo 8; peptideo 9; e peptideo 10; os 20-mers: peptideo 11 ； peptideo 12; peptideo 13; peptideo 14; e peptideo 15; os 19-mers: peptideo 16; peptideo 17; peptideo 18; peptideo 19; peptideo 20; e peptideo 21; os 18-mers: peptideo 22; peptideo 23; peptideo 24; peptideo 25; peptideo 26; peptideo 27; e peptideo 28; os 17- mers: peptideo 29; peptideo 30; peptideo 31; peptideo 32; peptideo 33; peptideo 34; pepti- deo 35: e peptideo 36; os 16-mers: peptideo 37; peptideo 38; peptideo 39; peptideo 40; pep- tideo 41; peptideo 42; peptideo 43; peptideo 44; e peptideo 45; os 15-mers: peptideo 46; peptideo 47; peptideo 48; peptideo 49; peptideo 50; peptideo 51; peptideo 52; peptideo 53; e peptideo 54; os 14-mers: peptideo 56; peptideo 57; peptideo 58; peptideo 59; peptideo 60; peptideo 61; peptideo 62; peptideo 63; e peptideo 64: os 13-mers: peptideo 67; peptideo 68; peptideo 69; peptideo 70; peptideo 71; peptideo 72; peptideo 73; peptideo 74; e peptideo 75; os 12-mers: peptideo 79; peptideo 80; peptideo 81; peptideo 82; peptideo 83; peptideo 84; peptideo 85; peptideo 86; e peptideo 87; os 11-mers: peptideo 92; peptideo 93; peptideo 94; peptideo 95; peptideo 96; peptideo 97; peptide。98; peptideo 99; e peptide。100; os 10- mers: peptideo 106; peptideo 107; peptideo 108; peptideo 109; peptideo 110; peptideo 111; peptideo 112; peptideo 113; e peptideo 114; os 9-mers: peptideo 122; peptideo 123; pepti- deo 124; peptideo 125; peptideo 126; peptideo 127; peptideo 128; e peptideo 129; os 8- mers: peptideo 139; peptideo 140; peptideo 141 ； peptideo 142; peptideo 143; peptideo 144; e peptideo 145; os 7-mers: peptideo 157; peptideo 158; peptideo 159; peptideo 160; pepti- deo 161; e peptideo 162; os 6-mers: peptideo 176; peptideo 177; peptideo 178; peptideo 179; e peptideo 180; os 5-mers: peptideo 196; peptideo 197; peptideo 198; e peptideo 199; e os 4-mers: peptideo 217; e peptideo 219. Sequencias de aminoacidos mais preferidas dos peptideos isolados e de peptideos
quimicamente modificados N-terminais e/ou C-terminais da atual invengao sao selecionadas do grupo consistindo dos 23-mers: peptideo 2; e peptideo 3; os 22-mers: peptideo 4; pepti- deo 5; e peptideo 6; os 21-mers: peptideo 7; peptideo 8; peptideo 9; e peptideo 10; os 20- mers: peptideo 11 ； peptideo 12; peptideo 13; peptideo 14; e peptideo 15; os 19-mers: pep- tide。16; peptideo 17; peptideo 18; peptideo 19; peptideo 20; e peptideo 21; os 18-mers: peptideo 22; peptideo 23; peptideo 24; peptideo 25; peptideo 26; peptideo 27; e peptideo 28; os 17-mers: peptideo 29; peptideo 30; peptideo 31 ； peptideo 32; peptideo 33; peptideo 34; peptideo 35; e peptideo 36; os 16-mers: peptideo 37; peptideo 38; peptideo 39; peptideo 40: peptideo 41 ； peptideo 42; peptideo 43; peptideo 44; e peptideo 45; os 15-mers: peptideo 46; peptideo 47; peptideo 48; peptideo 49; peptideo 50; peptideo 51 ； peptideo 52; peptideo 53; e peptideo 54; os 14-mers: peptideo 56; peptideo 57; peptideo 58; peptideo 59; peptideo 60; peptideo 61 ； peptideo 62; peptideo 63; e peptideo 64; os 13-mers: peptideo 67; pepti- deo 68; peptideo 69; peptideo 70; peptideo 71; peptideo 72; peptideo 73; peptideo 74; pep- tideo 80; peptideo 81; peptideo 82; peptideo 83; peptideo 84; peptideo 85; peptideo 86; e peptideo 87; os 11-mers: peptideo 92; peptideo 93; peptideo 94; peptideo 95; peptideo 96; peptideo 97; peptideo 98; peptideo 99; e peptideo 100; os 10-mers: peptideo 106; peptideo 108; peptideo 109; peptideo 110; peptideo 111; peptideo 112; peptideo 113; e peptideo 114; os 9-mers: peptideo 124; peptideo 125; peptideo 126; peptideo 127; peptideo 128; e pepti- deo 129; os 8-mers: peptideo 141; peptideo 142; peptideo 143; peptideo 144; e peptideo 145; os 7-mers: peptideo 159; peptideo 160; peptideo 161; e peptideo 162; os 6-mers: pep- tideo 178; peptideo 179; e peptideo 180; os 5-mers: peptideo 198; e peptideo 199; e os 4- mer: peptideo 219.
Ainda em outras modalidades, a sequencia de aminoacidos do peptideo inclui os res id uos contiguos A, K, G e E como no peptideo 219 da sequencia de referenda, peptideo 1. Por exemplo, os peptideos podem ter uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de (a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos conti-
guos da sequencia de referenda, peptideo 1, em que a sequencia de aminoacidos do pepti- deo inclui os residuos contiguos A, K, G e E como no peptideo 219 do peptide。de referen- da 1 (por exemplo, peptideo 219, peptideo 45, peptideo 79’ peptideo 67, peptideo 80, etc.)；
(b) uma sequencia substancialmente similar έ sequencia de amino^cidos definida em (a); e
(c) uma variante da sequ§ncia de amino^cidos definida em (a).
Exemplos dos segmentos de peptideo os quais contem a sequencia de amino^ci-
dos AKGE da sequencia de amino^cidos do peptideo de referenda, peptideo 1, incluem (a) os 23-mers: peptideo 2; e peptideo 3; os 22-mers: peptideo 4; peptideo 5; e peptideo 6; os 11 -mers: peptideo 7; peptideo 8; peptideo 9; e peptideo 10; os 20-mers: peptideo 11 ； pep- tideo 12; peptideo 13; peptideo 14; e peptideo 15; os 19-mers: peptideo 16; peptideo 17; peptideo 18; peptideo 19; peptideo 20; e peptideo 21; os 18- mers: peptideo 22; peptideo 23; peptideo 24; peptideo 25; peptideo 26; peptideo 27; e peptideo 28; os 17-mers: peptideo 29; peptideo 30; peptideo 31 ； peptideo 32; peptideo 33; peptideo 34; peptideo 35; e pepti- deo 36; os 16-mers: peptideo 37; peptideo 38; peptideo 39; peptideo 40; peptideo 41; pepti- deo 42; peptideo 43; peptideo 44; e peptideo 45; os 15-mers: peptideo 46; peptideo 47; pep- tideo 48; peptideo 49; peptideo 50; peptideo 51; peptideo 52; peptideo 53; e peptideo 54; os 14-mers: peptideo 56; peptideo 57; peptideo 58; peptideo 59; peptideo 60; peptideo 61; peptideo 62; peptideo 63; e peptideo 64; os 13-mers: peptideo 67; peptideo 68; peptideo 69; peptideo 70; peptideo 71; peptideo 72; peptideo 73; peptideo 74; e peptideo 75; os 12-mers: peptideo 79; peptideo 80; peptideo 81; peptideo 82; peptideo 83; peptideo 84; peptideo 85; peptideo 86; e peptideo 87; os 11 -mers: peptideo 93; peptideo 94; peptideo 95; peptideo 96; peptideo 97; peptideo 98; peptideo 99; e peptideo 100; os 10-mers: peptideo 108; pepti- deo 109; peptideo 110; peptideo 111 ； peptideo 112; peptideo 113; e peptideo 114; os 9- mers: peptideo 124; peptideo 125; peptideo 126; peptideo 127; peptideo 128; e peptideo 129; os 8-mers: peptideo 141 ； peptideo 142; peptideo 143; peptideo 144; e peptideo 145; os 7-mers: peptideo 159; peptideo 160; peptideo 161; e peptideo 162; os 6-mers: peptideo 178; peptideo 179; e peptideo 180; os 5-mers: peptideo 198; e peptideo 199; e os 4-mer: peptideo 219, (b) uma sequencia substancialmente similar a sequencia de aminoacidos de- finida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a), cuja variante έ selecionada do grupo consistindo de uma variante de substituigao, de uma variante de anulagao, de uma variante de adigao e suas combinagoes, em que ο segmento compreende ou consiste de 4 a 23 aminoacidos contiguos.
Em outra modalidade, as sequencias de peptideo preferidas tem uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de (a) uma sequencia de aminoacidos de 10 a 23 aminoacidos contiguos da sequencia de referenda, peptideo 1; (b) uma sequencia substancialmente similar a sequencia de aminoacidos definida em (a); e (c) uma variante da sequencia de aminoacidos definida em (a), cuja variante e selecionada do grupo consistindo de uma variante de substitui^ao, de uma variante de anula^ao, de uma variante de adigao e suas combinagdes, em que as sequ§ncias de aminoacidos preferidas compreendem ο 23- mer: peptideo 2; os 22-mer: peptideo 4; os 21 -mer: peptideo 7; os 20- mer: peptideo 11 ； os 19-mer: peptideo 16; os 18-mer: peptideo 22; os 17-mer: peptideo 29; os 16-mer: pepti- deo 37; os 15-mer: peptideo 46; os 14-mer: peptideo 56; os 13-mer: peptideo 67; os 12-mer: peptideo 79; os 11-mer: peptideo 92; e os 10-mer: peptideo 106.
Em outras modalidades, a sequ§ncia de aminoacidos do peptideo comega no ami- no^cido N-terminal da sequencia de referenda peptideo 1 e inclui os residuos contiguos A, K, G e E como no peptideo 219 da sequencia de referencia peptideo 1, enquanto que em outras modalidades a sequencia de aminoacidos do peptideo termina no amino白cido C- terminal da sequencia de referencia peptideo 1 e inclui os residuos contiguos A, K, G e E como no peptideo 219 da sequencia de referencia peptideo 1.
Os peptideos podem incluir uma ou mais anula^des, substituigdes e/ou adigdes de aminoacidos em relagao k sequencia de aminoacidos de referencia. Preferivelmente, as substituigoes podem ser substitui^Ses de aminoacidos conservatives, ou as substituigoes podem ser substituigdes de aminc^cidos nao-conservativas. Em algumas modalidades, os peptideos, incluindo os peptideos com sequencias de aminoacidos que sao substancialmen- te identicas ^is variantes da sequencia de aminoacidos de referencia, nao terao anulagoes ou adigdes em compara?ao com os aminoacidos contiguos correspondentes da sequ§ncia de aminoacidos de referencia, por6m podem ter substitui^des conservativas ou nao- conservativas. Substituigdes de aminoacidos que podem ser feitas έι sequencia de aminoa- cidos de referencia nos peptideos da invengao incluem, porem nao estao limitadas, as se- guintes: alanina (A) pode ser substituida com Iisina (K), valina (V), Ieucina (L) ou isoleucina (I); acido glutamico (E) pode ser substituido com ^cido aspartico (D); glicina (G) pode ser substituida com prolina (P); Iisina (K) pode ser substituida com arginina (R)1 glutamina (Q) ou asparagina (N); fenilalanina (F) pode ser substituida com Ieucina (L)1 valina (V), isoleuci- na (I) ou alanina (A); prolina (P) pode ser substituida glicina (G); glutamina (Q) pode ser substituida com 0cido glutamico (E) ou asparagina (N); arginina (R) pode ser substituida com Iisina (K), glutamina (Q) ou asparagina (N); serina (S) pode ser substituida com treonl· na; treonina (T) pode ser substituida com serina (S); e valina (V) pode ser substituida com Ieucina (L)1 isoleucina (I), metionina (M), fenilalanina (F)1 alanina (A) ou norleucina (Nle). Por exemplo, substituiQdes que possam ser feitas na sequencia de aminoacidos de referencia nos peptideos da invengao incluem a substitui^ao de alanina (A) por fenilalanina (F) (por exemplo, na posi^ao de aminoacido 4 da sequencia de aminoacido de refer§ncia), acido glutamico (E) por glutamina (Q) (por exemplo, na posiQao de aminoacido 3 da sequencia de aminoacido de referencia), Iisina (K) por alanina (A) (por exemplo, nas posig5es 2 e/ou 8 da sequencia de aminoacido de referencia), e/ou serina (S) por treonina (T) (por exemplo, na
posigao de aminoacidos 7 da sequencia de aminoacido de referencia). Quando substituiQoes sao incluidas nas sequencias dos amino^cidos dos peptideos da invengao (cujos peptideos compreendem nao-modificados, assim como peptideos os quais sao quimicamente modificados, por exemplo, por modificagdes N-terminais e/ou C- terminais tal como por forma^ao de amida) em relagao a sequencia de amino^cidos de refe- r§ncia, existe preferivelmente pelo menos 80% de identidade de sequencia entre a sequen- cia de amino^cidos do peptideo e a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 5 a 23 aminoacidos e incluindo uma substituigao de amino^cido em relagao έ se- quencia de aminoacidos de referencia terao cerca de 80% at6 cerca de 96% (isto έ, -95,7%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 10 a 23 aminoacidos e incluindo uma substitui^ao de amino甴cido em relagao δ sequ§ncia de aminoacidos de referencia terao cerca de 90% at0 cerca de 96% (isto έ, -95,7%) de 卜 dentidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de a 23 aminoacidos e incluindo uma substituigSo de amino^cido em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 95% at6 cerca de 96% (isto 6, ~95,7%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de a 23 aminoacidos e incluindo duas substitui?5es de aminoacidos em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 80% at6 cerca de 92% (isto §, ~91,3%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 16 a 23 aminoacidos e incluindo duas substituiQoes de aminoacidos em relagao έι se- quencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 87,5% ate cerca de 92% (isto έ, ~91,3%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Pepti- deos com de 20 a 23 aminoacidos e incluindo duas substituigoes de aminoacidos em rela- gao έ sequencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 90% at§ cerca de 92% (isto έ, -91,3%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 15 a 23 aminoacidos e incluindo tres substituig5es de aminoacidos em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 80% at§ cerca de 87% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 20 a 23 aminoacidos e incluindo tres substituigoes de aminoacidos em relagao it sequencia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 85% ate cerca de 87% de i- dentidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de a 23 aminoacidos e incluindo quatro substituigdes de aminoacidos em relagao a sequen- cia de aminoacidos de referencia terao entre cerca de 80% ate cerca de 83% (isto e, -82,6%) de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos de referencia.
Nos peptideos da atual inveng;§o, em relagao a sequencia de aminoacidos contigua do peptideo de referencia (o qual e um 24-mer) a substituigao de um aminoacido numa se- quencia de 23 aminoacidos contigua (um 23-mer) selecionada da sequencia de 24 aminoa- cidos de referencia fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 95,65% (ou ~96%) de identidade de sequencia com ο segmento de amino^cidos no pepti- deo de referenda, com ο qual ο 23-mer tem identidade. Analogamente, a substituigao de dois, tr§s, quatro e cinco aminoacidos no referido 23-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 91,30% (ou -91%), 86,96% (ou -87%), 82,61% (ou -83%) e 78,27% (ou -78%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de refer§ncia. Analogamente, a substitui^ao de um, dois, tres, quatro e cinco aminoacidos em 22-mer fornece um peptideo com uma sequencia de amino- acidos a qual tenha 95,45% (ou -95%), 90,91% (ou -91%), 86,36% (ou -86%), 81,82% (ou ~82%) e 77,27% (ou ~77%) de identidade de sequ§ncia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois, tres, quatro e cinco aminoacidos em 21-mer fornece um peptideo com uma sequencia de amino- acidos a qual tenha 95,24% (-95%), 90,48 (-91%), 85,71% (~86%), 80,95 (-81%) e 76,19% (-76%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substitui^ao de um, dois, tres, quatro e cinco ami- no^icidos em 20-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 95,00% (95%), 90,00% (90%), 85,00% (85%), 80,00% (80%) e 75,00% (75%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois, tres, quatro e cinco aminoacidos em 19-mer for- nece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 94,74% (~95%), 89,47% (-89%), 84,21% (-84%) e 78,95% (-79%) de identidade de sequencia, respectiva- mente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substi- tui^ao de um, dois, tres e quatro aminoacidos em 18-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 94,44% (-94%), 88,89% (-89%), 83,33% (-83%), e 77,78% (~78%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoa- cidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois, tres e quatro aminoacidos em 17-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 94,12% (-94%), 88,23% (-88%), 82,35% (-82%) e 76,47% 卜76%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois, tres e quatro aminoacidos em 16-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 93,75% (~94%), 87,50% (-88%), 81,25% (-81%) e 75,00% (75%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a se- quencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois e tres aminoacidos em 15-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoaci- dos a qual tenha 93,33% (-93%), 86,67% (-87%), e 80,00% (80%) de identidade de se- quencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Ana- logamente, a substituigao de um, dois e tres aminoacidos em 14-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 92,86% (-93%), 85,71% (-86%) e 78,57% (79%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois e tr§s aminoacidos em 13- mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 92,31% (-92%), 84,62% (-85%), e 76,92% (-77%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a se- quencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um, dois e tres aminoacidos em 12-mer fornece um peptideo com uma sequencia de amino^d- dos a qual tenha 91,67% (-92%), 83,33% (-83%) e 75,00% (75%) de identidade de se- quencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referenda· Ana- logamente, a substituigao de um e dois aminoacidos em 11-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 90,91 % (-91 %) e 81,82% (-82%) de identi- dade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de refe- rencia. Analogamente, a substituigao de um e dois aminoacidos em 10-mer fornece um pep- tideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 90,00% (90%) e 80,00% (80%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigSo de um e dois aminoacidos em 9-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 88,89% (-89%) e 77,78% (-78%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoacidos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituigao de um e dois aminoacidos em 8-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual tenha 87,50% (~88%) e 75,00% (75%) de identidade de sequencia, respectivamente, com a sequencia de aminoaci- dos do peptideo de referencia. Analogamente, a substituiQao de um amino^cido em 7-mer, 6-mer, 5-mer e 4-mer fornece um peptideo com uma sequencia de aminoacidos a qual te- nha 85,71% (-86%), 83,33% (-83.3%), 80,00% (80%) e 75,00% (75%) de identidade de sequencia, respectivamente, com ο peptideo de referencia. As sequencias de aminoacidos preferidas dessa invengao tem 80% de identidade de sequencia com a sequencia de amino- acidos na sequencia de referencia, mais preferivelmente entre 81% e 96% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos na sequencia de referencia, e mais preferivel· mente entre 80% e 96% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoacidos na sequencia de referencia. As sequencias de aminoacidos preferidas podem ser opcionalmen- te quimicamente N-terminalmente Iigadas no grupo amino peptideo terminal a uma porgao de acido carboxilico alifatico linear de C2 a C22, mais preferivelmente a uma porgao de ^ci- do carboxilico alifatico de C2 a C16 linear, mais preferivelmente a uma porgao de acido car- boxilico alifatico de C2 a C16 linear por uma IigaQao amida, e opcionalmente C- terminalmente quimicamente Iigada no grupo carboxilico peptideo terminal numa amina, tal como amonia ou uma amina primaria ou secundaria, tal como uma amina alifatica primaria linear de C1 a C16, por uma Iigagao amida.
Exemplos de variantes de substituigao do peptideo 79, um 12-mer, incluem, por e- xemplo, ο peptideo 238, onde Q na posig^o 3 no peptideo 79 foi substituido por E na se- quencia 238; peptideo 233’ onde A na posiQao 2 no peptideo 79 foi substituido por K no peptideo 223; peptideo 234, onde A na posigao 8 no peptideo 79 foi substituido por K no peptideo 234; peptideo 235, onde A nas posigdes 2 e 8 no peptideo 79 foi substituido por K no peptideo 235; peptideo 237, onde F na posiQao 4 no peptideo 79 foi substituido por A no peptideo 237; peptideo 239, onde K na posiggo 10 no peptideo 79 foi substituido por A no peptideo 239; peptideo 240, onde G na posigao 11 no peptideo 79 foi substituido por A no peptideo 240; e peptideo 241, onde E na posigao 12 no peptideo 79 foi substituido por A no peptideo 241.
Exemplos de variantes de substituigao do peptideo 106, um 10-mer, incluem, por
exemplo, peptideo 236, onde F na posigSo 4 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 236; peptideo 242, onde G na posiQao 1 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 242; peptideo 243, onde Q na posiQao 3 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 243; peptideo 244, onde S na posigao 5 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 244; peptideo 245, onde K na posiQao 6 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 245; peptideo 247, onde T na posigao 7 no peptideo 106 foi substituido por A no pepti- deo 247; peptideo 248’ onde K na posigao 10 no peptideo 106 foi substituido por A no pep- tideo 248; peptideo 249, onde K nas posi^des 6 e 10 foram ambas substituidas, cada uma por A1 no peptideo 249.
Exemplos de uma variante de substituigao do peptideo 137, um 8-mer, incluem, por
exemplo, ο peptideo 250, onde F na posigao 4 no peptideo 137 foi substituido por A no pep- tideo 250.
Exemplos de uma variante de substituigSo do peptideo 219’ um 4-mer, incluem, por exemplo, ο peptideo 251, onde K na posigao 2 no peptideo 219 foi substituido por A no pep- tideo 251.
Um peptideo variante de substituigao, tal como aqui descrito, pode estar na forma de um peptideo isolado ou na forma de um peptideo quimicamente modificado tal como, por exemplo, uma amida N-terminal tal como miristoilamida, uma acetilamida e semelhantes, conforme aqui descrito, e tal como, por exemplo, uma amida C-terminal tal como uma amida formada com amonia, e tal como tanto como uma amida N-terminal e uma amida C-terminal.
Quando anulagoes sao incluidas nas sequencias de aminoacidos dos peptideos da invengao em rela^ao a sequencia de aminoacidos de referenda, existe preferivelmente pelo menos 80% de identidade de sequencia entre a sequencia de aminoacidos do peptideo de referenda com a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 5 a 23 amino- acidos e incluindo uma anulagao de aminoacidos em rela^ao ao peptideo de referencia te- rao entre 80% ate cerca de 96% (isto e, -95,7%) de identidade de sequencia em relagao έ sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 10 a 23 aminoacidos e incluindo uma anula^ao de amino^cidos em re\agao ao peptideo de referenda terao entre cerca de 90% at6 cerca de 96% (isto έ, -95,7%) de identidade de sequ§ncia em relagao έ sequencia de amino^cidos de refer各ncia· Peptideos com de 20 a 23 amino^cidos e incluindo uma anu- Iagao de amino^cidos em relagao ao peptideo de referenda terao entre cerca de 95% at6 cerca de 96% (isto e, ~95,7%) de identidade de sequencia em relagao a sequencia de ami- no^cidos de referencia. Peptideos com de 10 a 23 aminoacidos e incluindo duas anulagdes de aminoacidos em relagSo ao peptideo de referencia terao entre cerca de 80% at6 cerca de 92% (isto e, ~91,3%) de identidade de sequencia em relag§o a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 16 a 23 aminoacidos e incluindo duas anulag5es de ami- no^cidos em relagao ao peptideo de referencia terao entre cerca de 87,5% at^ cerca de 92% (isto έ, -91,3%) de identidade de sequencia em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 20 a 23 aminoacidos e incluindo duas anulagdes de ami- noacidos em relagao ao peptideo de refer§ncia terao entre cerca de 90% ate cerca de 92% (isto e, ~91,3%) de identidade de sequencia em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 15 a 23 aminoacidos e incluindo tres anulagdes de aminoaci- dos em relagao ao peptideo de referencia terao entre cerca de 80% ate cerca de 87% de identidade de sequencia em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 20 a 23 aminoacidos e incluindo tres anulagdes de aminoacidos em relagao ao pep- tideo de referencia terao entre cerca de 85% at6 cerca de 87% de identidade de sequencia em relagao έ> sequ§ncia de aminoacidos de referencia. Peptideos com de 20 a 23 aminoaci- dos e incluindo quatro anulagoes de aminoacidos em relagao ao peptideo de referencia te- rao entre cerca de 80% ate cerca de 83% (isto e, -82,6%) de identidade de sequencia em relagao a sequencia de aminoacidos de referencia.
Conforme estabelecido acima, um ou mais dos aminoacidos dos peptideos pode ser quimicamente modificado. Quaisquer modificag5es de aminoacidos conhecidas na tecni- ca podem ser feitas aos aminoacidos dos peptideos usando qualquer metodo conhecido na tecnica.
Em algumas modalidades, ο aminoacido N-terminal ou C-terminal pode ser modifi- cado. Por exemplo, ο aminoacido alfa-N-terminal dos peptideos pode ser alquilado, amidado ou acilado no grupo amino (alfa-H2N) alfa-N-terminal (N-terminal) e, por exemplo, ο aminoa- cido C-terminal dos peptideos pode ser amidado ou esterificado no grupo carbbxi (-COOH) C-terminal. Por exemplo, ο grupo amino N-terminal pode ser modificado por acilagao para incluir um grupo acil ou acil graxo para formar uma amida, incluindo um grupo acetil (isto e, CH3-C(=0)- ou um grupo miristoil, ambos sendo grupos atualmente preferidos). Em algu- mas modalidades, ο grupo amino N-terminal pode ser modificado para incluir um grupo acil com formula -C(O)R1 em que R e um grupo alquil linear ou ramificado com de 1 a 15 ato- mos de carbono, ou pode ser modificado para incluir um grupo acil com fdrmula -C(O)RI, em que R1 έ um grupo alquil linear com de 1 a 15 atomos de carbono. A N-amida tamb6m pode ser uma formamida (R=H). O aminodcido C-terminal dos peptideos tamb6m pode ser quimicamente modificado. Por exemplo, ο grupo carboxil C-terminal do amino^cido C- terminal pode ser quimicamente modificado pela conversao a um grupo carboxamida no Iugar do grupo carboxil (isto έ, amidado). Em algumas modalidades, os amino甴cidos N- terminais e/ou C-terminais nao sao quimicamente modificados. Em algumas modalidades, ο grupo N-terminal έ modificado e ο grupo C-terminal nao έ modificado. Em algumas modali- dades, tanto os grupos N-terminal quanto ο C-terminal sao modificados.
O peptideo pode ser acilado no grupo amino do amino^cido N-terminal para formar uma amida N-terminal com um ^cido selecionado do grupo consistindo de:
(i-a) um cicido carboxilico (saturado ou opcionalmente insaturado) C2 (acetil) ou C13 alifatico (por exemplo, uma amida N-terminal com ^cido acetico (o qual έ um grupo pre- ferido), com acido propanoico, com ^cido butanoico, com dicido hexanoico, com acido octa- noico, com ^cido decan6ico, com acido dodecanoico) ο qual pode ser linear, ramificado (maior do que C3) ou compreender um anel (maior do que C3);
(i-b) um acido carboxilico alifatico C14 saturado, ο qual pode ser linear, ramificado ou compreender um anel;
(i-c) um acido carboxilico alifatico C14 insaturado, ο qual pode ser linear, ramificado ou compreender um anel;
(i-d) acido carboxilico (saturado ou opcionalmente insaturado) alifatico C15 a C24, ο qual pode ser linear, ramificado ou compreender um anel (por exemplo, com ^cido tetrade- canoico (iicido miristico, ο qual e um grupo preferido), com acido hexadecanoico, com acido 9-hexadecan0ico, com acido octadecanoico, com acido 9-octadecan0ico, com acido 11- octadecanoico, com acido 9,12-octadecadien0ico, com ^cido 9,12,15-octadecatrien0ico, com acido 6,9,12-octadecatrien0ico, com acido eicosanbico, com acido 9-eicosen0ico, com acido 5,8,11,14-eicosatetraenoico, com acido 5,8,11,14,17-eicosapentaen0ico, com acido docosanoico, com acido 13-docosen0ico, com acido 4,7,10113,16,19-docosaexaen0ico, com acido tetracosanoico e semelhantes);
(ii) acido trifluoracetico;
(iii) acido benzoico; e
(iv-a) um acido alquilsulfonico alifatico C1 a C12 ο qual forma uma alquilsulfonami- da alifatica, em que ao estrutura de cadeia alquilcarbdnica alifatica de C1 a C12 do acido sulfonico e analoga aquela das cadeias do acido alquilcarboxilico aIifaticos nos acidos al- quilcarboxilicos alifaticos descritos acima. Por exemplo, um peptideo pode ser acilado usan- do um grupo acido carboxilico representado como alquil-(C1 -C11 J-C(O)OH atraves do aco- plamento por desidratagao atraves da ativagao do grupo acido carboxilico para formar uma amida representada como (alquil C1-C1 l-C(O)-NH-peptideo). Analogamente, uma sulfona- mida pode ser formada pela reagao de uma especie de ^cido sulfonico (representada como (C1 -C12)-alquil-S(02)-X, por exemplo, onde X έ halogenio ou 0CH3 ou outro grupo de sai- da compativel) com um grupo amino N-terminal para formar uma sulfonamida representada como alquil(C1-C12)-alquil-S(02)-NH-peptideo.
(iv-b) um ^cido alquilsulfonico alifatico C14 a C24 ο qual forma uma alquilsulfona-
mida alifatica , em que a estrutura de cadeia carbdnica alquilica C14 a C24 do acido sulffini- co έ an^loga Squela das cadeias de acido alquilcarboxilico ali伯ticas nos ^cidos alquilcarbo- xilicos alifaticos descritos acima... Por exemplo, um peptideo pode ser acilado usando um grupo acido carboxilico representado como alquil C13-C23)-C(0)0H atraves do acoplamen- to por desidrata5§o atraves da ativagao do grupo acido carboxilico para formar uma amida representada como alquil (C13-C23)-C(0)-NH-peptideo. Analogamente, uma sulfonamida pode ser formada pela rea?ao de uma especie de acido sulfonico (representada como alquil (C14-C24)-S(02)-X, por exemplo, onde X έ halogenio ou 0CH3 ou outro grupo de saida compativel) com um gruo amino N-terminal para formar uma sulfonamida representada co- mo alquil-(C14-C24)-S(02)-NH-peptideo.
Como outro exemplo, ο grupo amino N-terminal do aminoacido N-terminal pode ser alquilado com um grupo alquil alifatico C1 a C12, a estrutura do referido grupo alquil alifatico sendo conforme descrito acima. A alquila^ao pode ser efetuada, por exemplo, usando um alquil haleto alifatico ou um ester do ^icido alquilsulfonico alifatico (mesilato, tosilato, etc.). preferivelmente usando um alquil haleto prim^rio ou um ester do acido alquilsulfdnico prim^- rio. O aminoacido N-terminal pode tambem ser modificado no aminoterminal para incluir um grupo de acido graxo acil ou acil alifatico como uma amida, incluindo um grupo acetil (isto έ, -C(O)CH3, ο qual e um grupo preferido), um grupo miristoil (o qual έ um grupo preferido), um grupo butanoil, um grupo hexanoil, um grupo octanoil, um grupo decanoil, um grupo dode- canoil, um grupo tetradecanoil, um grupo hexadecanoil, um grupo 9-hexadecenoil, um grupo octadecanoil, um grupo 9-octadecenoil, um grupo 11-octadecenoil, um grupo 9,12- octadecadienoil, um grupo 9,12,15-octadecatrienoil, um grupo 6,9,12-octadecatrienoil, um grupo eicosanoil, um grupo 9-eicosenoil, um grupo 5,8,11,14-eicosatetraenoil, um grupo 5,8,11,14,17-eicosapentaenoil, um grupo docosanoil, um grupo 13-docosenoil, um grupo 4,7,10,13,16,19-docosaexaenoil, um grupo tetracosanoil, cujos grupos sao covalentemente Iigados ao grupo amino terminal do peptideo por uma Iigagao amida.
O grupo acido carboxilico C-terminal do aminoacido C-terminal dos peptideos da invengao tambem pode ser quimicamente modificado. Por exemplo, ο aminoacido C- terminal pode ser quimicamente modificado pela reagao do grupo acido carboxilico C- terminal do peptideo com uma amina para formar um grupo amida, tal como uma amida de amonia a qual e um grupo preferido; uma amida de uma alquilamina alifatica C1 a C12, pre- ferivelmente uma alquilamina alifatica linear; uma amida de uma alquilamina alifatica C2 a C12 hidroxilsubstituida; uma amida de um grupo 2-(alquil alif^tico C1 a C12) linear oxietila- mina; e uma amida de um grupo 0mega-metoxipoli(etilen0xi)n-etilamina (tambem referida como um grupo 0mega-met0xi-PEG-alfa-amina ou um grupo omega-metdxi- (polietilenoglicol)amina, onde η 6 de O a 10. O grupo Scido carboxilico C-terminal do amino- acido C-terminal do peptideo tamb6m pode estar na forma de um 6ster selecionado do gru- po consistindo de um ester de um alcool alquilalifatico C1 a C12 e um 6ster de um grupo 2- (omega-metoxipoli(etilen0xi)n)-etanol (MPEG), onde η έ de O a 10. Num aspect。，um com- ponente polietilenoglicol, tal como num ester PEG, um 6ster MPEG, uma amida PEG, uma amida MPEG e semelhantes preferivelmente tem um peso molecular de cerca de 500 at6 40.000 Daltons1 mais preferivelmente de 1000 a 25.000 Daltons, e mais preferivelmente de cerca de 1000 at6 cerca de 10.000 Daltons.
O grupo acido carboxilico C-terminal no peptideo, ο qual pode ser representado pe- Ia formula peptideo-C(0)OH, tambem pode ser amidado pela conversao numa forma ativada tal como um haleto de cicido carboxilico, anidrido de acido carboxilico, 6ster N- hidroxissuccinimidinico, ester pentafluorfenilico (OPfp)1 ^ster 3-hidr0xi-2,3-diidro-4- oxobenzotriazonico (ODhbt) e semelhantes para faciIitar a reagao com amonia ou uma ami- na primaria ou secundaria, preferivelmente amonia ou uma amina primaria, e preferivelmen- te enquanto quaisquer outros grupos reativos no peptideo sao protegidos por grupos prote- tores quimicamente compativeis sinteticos bem conhecidos na tecnica da sintese de pepti- deos, especialmente da sintese de peptideos em fase solida, tal como um 6ster benzilico, um 6ster t-butilico, um ester fenilico, etc. Uma amida de peptideo resultante poderia ser re- presentada pela f0rmula peptideo-C(0)-NR3R4 (a amida estando na extremidade C-terminal do peptideo) em que R3 e R4 sao independentemente selecionados do grupo consistindo de hidrogenio; alquil C1 a C12 tal como metil, etil, butil, isobutil, ciclopropilmetil, hexil, dodecil e opcionalmente superiores, por exemplo, de C14 a C24, tal como tetradecil e semelhantes, conforme descrito acima.
O ^cido carboxilico C-terminal do amino^icido C-terminal tamb6m pode ser conver- tido na amida de uma alquilamina alifatica C2 a C12 hidroxil substituida (o grupo hidroxil estando Iigado a um atomo de carbono ao inv6s de um atomo de nitrogenio da amina) tal como 2-hidroxietilamina, 4-hidroxibutilamina e 12-hidroxidodecilamina, e semelhantes.
O ^icido carboxilico C-terminal tambem pode ser convertido numa amida de uma a卜 quilamina alifatica C2 a C12 hidroxil substituida, em que ο grupo hidroxila pode ser acilado para formar um ester com um acido carboxilico alifdtico C2 a C12 conforme descrito acima. Preferivelmente, no peptideo amida na extremidade C-terminal do peptideo representado pela formula peptideo-C(0)NR5R6, R5 e hidrogenio e R6 e selecionado do grupo consistin- do de hidrogenio, alquil C1 a C12 e alquil C2 a C12 substituido com hidroxila.
O acido carboxilico C-terminal do aminoacido C-terminal tambem pode ser conver- tido numa amida de uma (alquil alifatico C1 a C12)oxietilamina linear. Tal amida pode ser preparada, por exemplo, pela reagao de um ^lcool alifatico C1 a C12 linear com Ndreto de pot^ssio em diglima com 2-cloroetanol para fornecer um etanol alquil alifatico C1 a C12, ο qual pode ser convertido numa amina por oxidagao a um aldeido, seguido pela amina?ao redutiva numa amina (por exemplo, usando amonia) ou pela conversao a um haleto de a卜 quila (por exemplo, usando cloreto de tionila) seguido pelo tratamento com uma amina, tal como amonia.
O acido carboxilico C-terminal do aminodcido C-terminal pode ser convertido numa amida de uma PEG-amina linear (por exemplo, 6mega-hidr0x卜PEG-alfa-amina; Smega- PEG(C1 a C12)-alfa-amina, tal como 0mega-met6x卜 PEG-alfa-amina, isto e, MPEG-amina). Num aspecto, ο polietilenoglicol ou componente PEG preferivelmente tem um peso molecu- lar de cerca de 500 at6 40.000 Daltons, mais preferivelmente de 1000 a 25.000 Daltons, e mais preferivelmente de cerca de 1000 at6 cerca de 10.000 Daltons.
O ^cido carboxilico C-terminal do amino^cido C-terminal pode tamb6m ser conver- tido numa amida de uma 5mega-met0xi-poli(etilen0xi)n-etilamina, onde η 6 de 0 a 10, a qual pode ser preparada a partir do 0mega-met0xi-poli(etilen0xi)n-etanol correspondente, por exemplo, pela conversao do alcool numa amina conforme descrito acima.
Em outra modalidade, ο carboxil C-terminal pode ser convertido numa amida repre- sentada pela formula peptideo-C(0)-NR7R8, em que R7 έ hidrogenio e R8 6 um grupo 2- (alquil alifatico C1 a C120oxietilico, em que a porgao alquil alifatica C1 a C12 e conforme descrita acima e inclui grupos tais como metoxietil (isto e, CH30-CH2CH2-), 2-dodeciloxietil e semelhantes; ou R7 e hidrogenio e R8 e um grupo 0mega-met0xi-poli(etilen0xi)n-etilico, onde ο η da porgao poli(etilen0xi) e de 0 a 10, tal como 2-metoxietil (isto 6, CH30-CH2CH2- ),omega-metoxietoxietil (isto e, CH30-CH2CH20-CH2CH2-) ate CH30-(CH2CH20)10- CH2CH2-.
O grupo ^cido carboxilico C-terminal do aminoacido C-terminal do peptideo tamb^m pode estar na forma de um ester de um ^lcool alquilico alifatico C1 a C12, a porgao alquil alifatica do alcool conforme descrita acima. O grupo acido carboxilico C-terminal do aminoa- cido C-terminal do peptideo tambem pode estar na forma de um ester de um grupo 2- (0mega-metoxipoli(etilen0xi)n)-etanol, onde η § de 0 a 10, ο qual pode ser preparado a partir da reag§o de 2-metoxietanol como um 2-metoxietanolato de sodio com quantidades este- quiometricas de oxido de etileno, a quantidade estequiometrica sendo dependente do tama- nho de n.
Uma cadeia lateral num aminoacido dos peptideos tambem pode ser quimicamente modificada. Por exemplo, um grupo fenil em fenilalanina ou tirosina pode ser substituido com um substituinte selecionado do grupo consistindo de:
Um grupo alquil alifatico de C1 a C24 (isto e, linear ou ramificado, e/ou saturado ou insaturado, e/ou contend。um grupo ciclico) tal como metil (preferido), etil, propil, isopropil, butil, isobutil, ciclopropil, 2-metilciclopropil, cicloexil, octil, decil, dodecil, hexadecil, octadecil, eicosanil, docosanil, tetracosanil, 9-hexadecenil, 9-octadecenil, 11-octadecenil, 9,12- octadecadienil, 9,12,15-octadecatrienil, 6,9,12-octadecatrienil, 9-eicosenil, 5,8,11,14- eicosatetraenil, 5,8,11,14,17-eicosapentaenil, 13-docosenil e 4,7,10113,16,19-docosaexaenil;
um grupo alquil alifatico C1 a C12 substituido com um grupo hidroxil pelo menos um ^tomo de carbono de distancia de um sitio de insaturaQSo, exemplos dos quais grupos hi- droxialqui! incluem hidroximetil, hidroxietil, hidroxidodecil e semelhantes;
um grupo alquil C1 a C12 substituido com um grupo hidroxil que έ esterificado com um grupo carboxil alifatico C2 a C25 de um Scido, tal como acido ac6tico, ^cido butan6ico, ^cido hexanoico, acido octanoico, acido decanoico, cicido dodecanoico, acido tetradecanbi- co, ^cido hexadecanoico, acido 9-hexadecen6ico, acido octadecanbico, ^cido 9- octadecenoico, acido 11-octadecen0ico, acido 9,12-octadecadien6ico, acido 9,12,15- octadecatrienoico, ^cido 6,9’12-octadecatrien0ico, acido eicosanoico, ^cido 5,8,11,14- eicosatetraenoico, acido 5,8,11,14,17-eicosapentaen0ico, ^cido docosarioico, acido 13- docosenoico, acido 4,7,10,13,16,19-docosaexaen0ico, acido tetracosanoico e semnelhan- tes, um acido dicarboxilico tal como acido succinico, ou um hidroxiacido tal como dicido Iati- co, em que a quantidade total de atomos de carbono do substituinte ester esta entre 3 e 25; halogenio tal como fliior-, cloro-, bromo- e iodo-; nitro-; amino- tal como NH2, metilamino, dimetilamino; trifluormetil-;
carboxil (-COOH);
um alcoxi C1 a C24 (tal como pode ser formado pela alquilagao da tirosina) tal co- mo metoxi, etoxi, propiloxi, isopropiloxi, butil6xi, isobutiloxi, ciclopropiloxi, 2- metoxiciclopropiloxi, cicloexiloxi, deciloxi, dodecil6xi, hexadecil6xi, octadecil6xi, eicosaniloxi, docosaniloxi, tetracosaniloxj, 9-hexadecenil0xi, 9- octadeceniloxi, H-octadeceniloxi, 9,12- octadecadieniloxi, 9,12,15-octadecatrienil0xi, 6,9,12-octadecatrienil0xi, 9-eicosenil0xi, 5,8,11,14-eicosatetraenil0xi, 5,8,11,14,17- eicosapentaeniloxi, 13-docoseniloxi e 4,7,10,13,16,19-docosaexaeniloxi; e
um hidroxialquil0xi C2 a C12 tal como 2-hidroxietil0xi e seus esteres com acidos carboxilicos, conforme descrito acima, ou com acido trifluoracetico.
Um grupo hidroxil de serina pode ser esterificado com um substituinte selecionado do grupo consistindo de:
um grupo acido carboxilico alifatico C2 a C12, tal como descrito acima; um grupo acido trifluoracetico; e um grupo acido benzoico.
O grupo amino epsilon na Iisina pode ser quimicamente modificado, por exemplo, pela formagao de amida com: um grupo acido carboxilico alifatico C2 a C12 (por exemplo, pela reagao da amina com uma forma quimicamente ativada de um acido carboxilico, tal como um cloreto de ^cido, um anidrido, um ester de N-hidroxissuccinimida, um 6ster penta- fluorfenilico (OPfp)1 um 6ster 3-hidr0x卜2,3-diidrO"4"。xobenzotriaz6nico (ODhbt), e semelhan- tes) tal como descrito acima, ou um grupo ^cido benz6ico, ou um grupo de amino^cido. Adi- cionalmente, ο grupo ^psilon amino na Iisina pode ser quimicamente modificado pela alqui- Iagao com de um a dois grupos alquil a隨icos C1 a C4.
O grupo ^cido carboxilico no dcido glutamico pode ser modificado pela formagao de uma amida com uma amina, tal como: amonia; uma alquilamina alif^tica prim^ria C1 a C12 (a porgao alquil da qual έ conforme descrito acima) incluindo com metilamina; ou um grupo amino de um aminoacido.
O grupo ^cido carboxilico no ^cido glutamico pode ser modificado pela formagao de um ester com um grupo hidroxialquil alif^tico C1 a C12 conforme descrito acima, preferivel· mente um ester com um alcool prim^rio de um alquil alifatico C1 a C12, tal como metanol, etanol, propan-1-ol, n-dodecanol e semelhantes, conforme descrito acima. Numa modalidade preferida, a presente invengao compreende um metodo de inibi-
gao da Iiberagao de pelo menos um mediador inflamatorio a partir de um granulo em pelo menos uma celula inflamatoria num tecido e/ou num fluido de um individuo compreendendo a administragao ao referido tecido e/ou fluido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composigao farmaceutica compreendendo pelo menos um peptideo com uma sequen- cia de aminoacidos selecionada do gruo consistindo de:
(a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos de uma sequencia de referencia, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1);
(b) uma sequencia de aminoacidos com a sequencia GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); e
(c) uma sequencia de aminoacidos substancialmente identica a sequencia definida
em (a), em que ο aminoacido C-terminal do peptideo e opcionalmente independentemente quimicamente modificado, e ο aminoacido N-terminal do peptideo e independentemente quimicamente modificado por acilagao com um acido carboxilico selecionado do grupo con- sistindo de um acido carboxilico alifatico insaturado ou saturado de C2 a C13, um acido car- boxilico alifatico insaturado ou saturado de C14 (acido miristico), um acido carboxilico alifati- co insaturado ou saturado de C15 a C24 e acido trifluoracetico, ou nao έ quimicamente mo- dificado, com a condigao de que ο referido peptideo pode ser modificado por acilagao quan- do sua sequencia de aminoacido comega com a sequencia GAQF da sequencia de referen- cia pela acilagao somente com um acido carboxilico selecionado do grupo consistindo de um acido carboxilico alifatico saturado ou insaturado C2 a C13, um acido carboxilico alifatico insaturado de C14, um acido carboxilico alifatico insaturado ou saturado de C15 a C24 e acido trifluoracetico, ou nao e quimicamente modificado, em que ο referido peptideo, opcio- nalmente combinado com um veiculo farmaceuticamente aceitevel, e numa quantidade re- dutora de Iibera^ao de mediador inflamat6rio terapeuticamente eficaz para reduzir a Iibera- gao do referido mediador inflamatorio a partir de pelo menos uma celula inflamatoria em comparagao com a libera?§o do referido mediador inflamatorio a partir de pelo menos um dentre ο mesmo tipo de celula inflamatoria que poderia ocorrer na ausencia do referido pelo menos um peptideo.
O m6todo preferivelmente emprega um peptideo que pode ser acetilado no amino- ^cido N-terminal. Esse peptideo pode consistir de pelo menos dez residuos de amino^cidos contiguos e esta preferivelmente incorporado por acetil-peptideo 106 (SEQ ID NO: 106). O metodo tambem emprega um peptideo consistindo de pelo menos quatro resi-
duos de aminoacidos contiguos e, mais preferivelmente, de pelo menos seis residuos de aminodcidos contiguos. AI6m disso, ο peptideo pode ser miristoilado no aminoacido alfa-N- terminal quando ο peptideo. O metodo tamb6m pode utilizar peptideo que pode ser amidado com amonia no aminoacido alfa-C-terminal. O metodo numa outra modalidade utiliza um peptideo que compreende uma se-
quencia de aminoacidos de (a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos de uma sequencia de referencia, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1)’ em que ο aminoacido N-terminal da sequencia de aminoacidos de (a) e selecionada da posi?ao de aminoacido 2 ate 21 da sequencia de referencia, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1). Alem disso, esses peptideos podem ser miristoilados no aminoacido N-terminal e tambem podem ser amidados com amonia no aminoacido alfa-C-terminal.
O metodo de administragao de acordo com a presente inven?§o define a redugao da Iiberagao de um mediador inflamatdrio como bloqueador ou inibidor do mecanismo que libera um mediador inflamatorio da celula inflamatoria no referido individuo.
O metodo de administragao inclui a incorporagao ou mistura dos peptideos revela- dos com um veiculo farmaceuticamente aceitavel para formar uma composigao farmaceuti- ca.
O metodo de administragao da presente invengao libera pelo menos uma quantida- de redutora de Iiberagao de mediador inflamatorio para reduzir a Iiberagao do referido medi- ador inflamat0rio a partir de pelo menos uma celula inflamatdria em comparagao com a Iibe- ragao do referido mediador inflamatorio a partir de pelo menos um dentre ο mesmo tipo de celula inflamatoria que poderia ocorrer na ausencia do referido pelo menos um peptideo. A celula inflamatoria no referido individuo pode ser um leuc0cito, um granulocito, um basofilo, um eosinofilo, monocito, macrofago ou uma combinagao desses.
O mediador inflamatorio Iiberado a partir de pelo menos um granulo de pelo menos uma celula inflamatoria e selecionado do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO)1 eo- sinofilo peroxidase (EPO), proteina b^sica principal [MBP], lisozima, granzima, histamina, proteoglicana, protease, um fator quimiotdtico, citocina, um metab6lito do ^cido araquidoni- co, defensina, proteina intensificadora da permeabiiidade a bactericida (BPI), elastase, ca- tepsina G1 catepsina B, catepsina D1 beta-D-glucuronidase, alfa-manosidase, fosfolipase A2, condroitina-4-sulfato, proteinase 3, lactoferrina, colagenase, ativador do complemento, re- ceptor do complemento, receptor de N-formilmetionilleucilfenilalanina (FMLP), receptor de laminina, citocromo b558, fator quimiotdtico de monbcito, histaminase, proteina de Iigagao έ vitamina B12, gelatinase, ativador de plasminogenio, beta-D-glucuronidase β uma combina- gao desses. Preferivelmente, ο mediador inflamatorio έ selecionado do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO)1 eosin0filo peroxidase (EPO)1 proteina b^sica principal (MBP), liso- zima, granzima e uma combinagao desses.
O m6todo de acordo com a Reivindicagao 13’ em que a referida quantidade reduto- ra de Iiberagao de mediador inflamatorio efetiva do referido peptideo compreende uma quantidade inibidora de desgranulagao do peptideo que reduz a quantidade de um mediador inflamatorio Iiberada a partir de pelo menos uma celula inflamatoria a partir de cerca de 1% at6 cerca de 99%, ou preferivelmente de cerca de 5 a 50% ate cerca de 99%, em compara- gao com a quantidade Iiberada a partir de pelo menos uma celula inflamatoria na aus§ncia do peptideo.
O m^todo da presente invengao έ Citil para ο tratamento de um individuo afligido por ou sofrendo de uma doenga respiratoria. A doenga respiratdria pode ser asma, bronquite cronica, doenga pulmonar obstrutiva cronica (DPOC) e fibrose cistica. Os individuos que podem ser tratados pela presente invengao sao preferivelmente mamiferos, tais como hu- manos, caninos, equinos e felinos.
O metodo de administra^ao dos peptideos da presente invengao sao por adminis- tragao topica, administragao parenteral, administra?§o retal, administragao pulmonar, admi- nistragao nasal e administragao oral. Mais preferivelmente, a administraQao pulmonar com- preende um aerossol, ο qual pode ser gerado a partir de um inalador de ρό seco, um inala- dor de dose medida ou nebulizador. Adicionalmente1 a administragao ao individuo pode ain- da incluir a administragSo de uma segunda mol^cula selecionada do grupo consistindo de um antibiotico, de um composto antiviral, de um composto antiparasitico, de um composto antiinflamatorio e de um imunomodulador.
O metodo tambem e Citil para ο tratamento de um individuo ο qual e afligido por ou sofrendo de uma doenga selecionada do grupo consistindo de uma doenga do intestino, uma doenga de pele, uma doenga auto-imune, uma sindrome do panic。e suas combina- g5es. Mais especificamente, a doenga do intestino e selecionada do gruo consistindo de colite ulcerativa, doenga de Crohn e sindrome do intestino irritavel. Doengas de pele tam-
bem trataveis pela presente invengao incluem rosacea, eczema, psoriase e acne severa. Adicionalmente um individuo sofrendo de artrite tamb6m pode ser tratado pela presente in- vengao.
A presente invengao, em uma modalidade, engloba a administragao dos peptideos compreendendo uma sequencia de aminodcidos substancialmente identica έ sequ§ncia de amino^cidos de (a) com de 4 a 23 amino^cidos contiguos de uma sequencia de referenda, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1). Esses peptideos sao preferivelmente selecionados do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240’ 241, 242’ 243, 244’ 245’ 247, 248, 249’ 250’ 251 e 252. Esses peptideos podem ser ainda acetilados no aminoacido alfa-N-terminal ou miristoilados no amino否cido alfa-N-terminal e opcionalmente amidados com amonia no aminoacido alfa-C-terminal.
O m6todo da presente invengao tambem 6 Citil para reduzir a hipersecre^ao mucosa num individuo pela administragao dos peptideos da presente invengao, conforme aqui des- crito, tamb6m para reduzir a hipersecregao de muco relacionada com MARCKS a partir de pelo menos uma celula ou tecido secretor de muco no individuo, por meio do que a hiperse- cregao de muco no individuo e reduzida em comparagao com aquela a qual poderia ocorrer na ausencia da referida administra^ao do referido peptideo.
A presente invengao 6 direcionada a um peptideo isolado com uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo de:
(a) uma sequencia de aminoacidos com de 4 a 23 aminoacidos contiguos de uma sequencia de referenda, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1);
(b) uma sequencia de aminoacidos com a sequencia GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); e
(c) uma sequencia de aminoacidos substancialmente identica a sequencia definida
em (a),
em que ο aminoacido C-terminal do peptideo e opcionalmente independentemente
quimicamente modificado, e ο aminoacido N-terminal do peptideo e independentemente quimicamente modificado por acilagao com um acido carboxilico selecionado do grupo con- sistindo de um acido carboxilico alifatico insaturado ou saturado de C2 a C13, um 0cido car- boxilico alifatico insaturado ou saturado de C14, um acido carboxilico alifatico insaturado ou saturado de C15 a C24 e ^cido trifluoracetico, ou nao έ quimicamente modificado, com a condigao de que ο referido peptideo έ modificado por acilagao quando sua sequencia de aminoacido comega com a sequencia GAQF da sequencia de referenda pela acilagao so- mente com um acido carboxilico selecionado do grupo consistindo de um acido carboxilico alifatico saturado ou insaturado C2 a C13, um acido carboxilico alifatico insaturado de C14, um acido carboxilico alifatico insaturado ou saturado de C15 a C24 e acido trifluoracetico, ou nao e quimicamente modificado, em que ο referido peptideo, opcionalmente combinado com um veiculo farmaceuticamente aceitavel, e numa quantidade redutora de Iiberagao de medi- ador inflamatorio terapeuticamente eficaz para reduzir a IiberagSo do referido mediador in- flamat6rio a partir de pelo menos uma c^lula inflamat0ria em comparagao com a Iiberagao do referido mediador inflamatbrio a partir de pelo menos um dentre ο mesmo tipo de c^lula inflamatoria que poderia ocorrer na ausencia do referido pelo menos um peptideo.
O peptideo isolado pode ser acilado no amino^icido alfa-N-terminal. O peptideo iso-
Iado consiste de pelo menos dez residuos de aminodcidos contiguos e preferivelmente έ um peptideo isolado que consiste de acetil-peptideo 106 (SEQ ID NO: 106).
Numa outra modalidade, ο peptideo consiste de pelo menos quatro residuos de a- mino^cidos contiguos ou ο peptideo consiste de pelo menos seis residuos de amino^cidos contiguos.
O peptideo tambem pode ser miristoilado no aminoacido N-terminal e/ou ο peptideo pode ser amidado com amonia no aminoacido C-terminal.
O peptideo isolado pode ainda compreender uma sequencia de amino^cidos de (a) descrita acima, (a) uma sequencia de amino^cidos com de 4 a 23 amino^cidos contiguos de uma sequencia de refergncia, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1); em que ο aminoacido N-terminal da sequencia de amino^cidos de (a) έ selecionado da posigao de aminoacidos 2 a 21 da sequencia de referenda, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1). Esse peptideo pode ser ainda miristoilado ou acetilado no aminoacido alfa-N- terminal ou opcionalmente amidado com amonia no aminoacido alfa-C-terminal. O peptideo isolado em uma outra modalidade, em que a sequencia de aminoacidos
e substancialmente identica έ sequencia de aminoacidos de (a) com de 4 a 23 aminoacidos contiguos de uma sequencia de referenda, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1). Esses peptideos sao preferivelmente selecionados do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251 e 252. Esses peptideos podem ser adicionalmente acetilados no aminoacido alfa-N- terminal ou miristoilados no aminoacido alfa-N-terminal opcionalmente amidados com amo- nia no aminoacido alfa-C-terminal. Sequencia de aminoacido de (c) substancialmente identi- ca a sequencia de aminoacidos de (a) έ selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 233, 234’ 235, 236, 237, 238, 239’ 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248’ 249’ 250, 251 e 252.
A invengao tamb6m engloba uma composigao compreendendo um peptideo isolado conforme descrito nos paragrafos acima e aqui descrita como um excipiente. A invengao tambem engloba uma composigao farmaceutica compreendendo um peptideo isolado e m peptideo isolado conforme descrito nos paragrafos acima e aqui descrita e m veiculo farma- ceuticamente aceitavel. A composigao farmaceutica tambem pode preferivelmente ser este- ril, esterilizavel ou esterilizada. Esses peptideos podem estar contidos num kit com reagen- tes Liteis para administragao. Breve descrigao dos desenhos
FIGS. 1A - 1B ilustram que a fosforiIagao dependente de PKC libera MARCKS a partir da membrana plasmatica para ο citoplasma.
FIGS. 2A - 2C mostram que PKG inclui a desfosforilagao de MARCKS pela ativa- ?ao de PP2A.
FIG. 3 apresenta gr^ficos de barra que demonstram que PP2A έ um componente essencial da via secretbria de mucina.
FIG. 4 έ um gel que ilustra que MARCKS se associa com actina e miosina no cito- plasma.
FIG. 5 demonstra um mecanismo de sinalizagao controlando a secregSo de MPO
nos neutrofilos.
FIG. 6 e um gr^fico de barras demonstrando a habilidade de peptideo MANS secre- tar a mieloperoxidase em blocos a partir de neutrofilos caninos isolados.
FIG. 7 e um grafico de barras demonstrando a capacidade do peptideo MANS de bloquear a secregao da mieloperoxidase a partir dos neutr6filos humanos isolados.
FIG. 8 έ um grafico de barras demonstrando que PMA estimula um pequeno au- mento na secregao de MPO a partir de neutrbfilos humanos estimulados por LPS, a qual 6 aumentada de um modo dependente de concentragao pela co-estimulagao com 8-Br-cGMP.
FIG. 9 e um grafico em barras demonstrando que a estimulagao de 8-Br-cGMP tem pouco efeito na secregao de MPO a partir de neutrofilos humanos estimulados por LPS at6 a co-estimulagao com PMA ocorrer de um modo dependente de concentragao.
FIG. 10 e um grafico em barras demonstrando que PMA estimula um pequeno au- mento na secregao de MPO a partir de neutrofilos caninos estimulados por LPS, a qual e intensificada de um modo dependente de concentragao pela co-estimulagao com 8-Br- cGMP.
FIG. 11 e um grafico em barras demonstrando que a estimulag§o por 8-Br-cGMP tem pouco efeito na secregao de MPO a partir de neutrofilos caninos estimulados por LPS at6 a co-estimulagao com PMA ocorrer de um modo dependente de concentragao.
FIG. 12 έ um grafico de barras demonstrando que a co-estimulagao com PMA + 8- Br-cGMP 6 requerida para a maxima secregao de MPO a partir dos neutrofilos caninos esti- mulados por LPS.
Descrigao detalhada da invengao
A presente invengao ser^ agora descrita de modo mais completo de agora em dian- te com referencia as figuras associadas, nas quais as modalidades preferidas da invengao sao ilustradas. Essa invengao pode, entretanto, ser incluida em diferentes formas e nao de- ve ser construida como Iimitante das modalidades aqui estabelecidas. Ao inves disso, essas
modalidades sao fornecidas de modo que essa descoberta seja perfeita e completa, e ir0 totalmente Ievar ο escopo da invengao ate as pessoas versadas na tecnica.
A nao ser que seja defmido de outra forma, todos os termos t§cnicos e cientificos aqui usados tern ο mesmo significado que os comumente entendidos por uma pessoa nor- malmente versada na tecnica, έ qual essa inven^ao pertence. Todas as publica^oes, pedi- dos de patentes, patentes e outras referencias aqui mencionadas sao incorporadas por refe- renda na sua totalidade. O uso das palavras “um” ou "uma" aqui para descrever qualquer aspect。da presente inven?§o e para ser interpretado como indicando um ou mais.
A presente invengao έ direcionada a um m6todo de inibigao da Iiberagao exocitoci- tica de pelo menos um mediador inflamat0rio a partir de pelo menos uma c6lula inflamat6ria compreendendo ο contato de pelo menos uma c6lula inflamatdria, cuja c^lula compreende pelo menos um mediador inflamat0rio contido numa vesicula dentro da celula, com pelo me- nos um peptide。selecionado do grupo consistindo de um peptideo MANS e um fragment。 ativo seu numa quantidade eficaz para reduzir a IiberaQao do mediador inflamatorio a partir da c6lula inflamatoria em comparagao com a Iiberagao do mediador inflamat0rio a partir do mesmo tipo de celula inflamatoria que poderia ocorrer na ausencia de pelo menos um pepti- deo.
A presente ίηνβηςδο έ ainda direcionada a um metodo de inibigao da Iiberagao de pelo menos um mediador inflamatorio a partir de pelo menos uma c6lula inflamatoria num tecido ou fluido de um individuo compreendendo a administragao ao tecido do individuo e/ou fluido, ο qual compreende pelo menos ma celula inflamatoria compreendendo pelo menos um mediador inflamatorio contido numa vesicula dentro da celula, uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de uma composigao farmaceutica compreendendo pelo menos um pepti- deo selecionado a partir do grupo consistindo de um peptideo MANS um fragmento ativo seu numa quantidade terapeuticamente eficaz para reduzir a Iiberagao do mediador inflama- torio a partir de pelo menos uma celula inflamatoria em comparagao com a Iiberagao do me- diador inflamatorio a partir de pelo menos um dentre ο mesmo tipo de celula inflamatoria que poderia ocorrer na ausencia e pelo menos um peptideo. Mais especificamente, a redugao da IiberagSo de um mediador inflamatorio compreende ο bloqueio ou inibigao do mecanismo que libera um mediador inflamatorio a partir da celula inflamatoria. A presente inver^o e direcionada ao contato e/ou admiriistragao do peptideo des-
crito acima e por toda essa especificagao com qualquer celula inflamatoria conhecida que possa estar contida no tecido ou fluido de um individuo, a qual cont^m pelo menos um me- diador inflamatorio contido numa vesicula dentro da celula. A celula inflamatoria e preferi- velmente um leucocito, mais preferivelmente um granulocito, ο qual pode ser adicionalmente classificado como um neutrofilo, um basofilo, um eosinofilo ou uma combina9§o desses. As celulas inflamatorias contactadas no presente metodo tambem pode ser um monoci-
to/macrofago. A presente invengao έ direcionada para reduzir a Iiberagao dos mediadores infla- matorios contidos nas vesiculas das celulas inflamat0rias e esses mediadores inflamat6rios sao selecionados a partir do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinbfilo peroxi- dase (EPO), proteina basica principal (MBP), lisozima, granzima, histamina, proteoglicana, protease e fator quimiot^itico, citocina, um metabolito do 0cido araquidonico, defensina, pro- teina intensificadora da permeabilidade bactericida (BPI)1 elastase, catepsina G1 catepsina B1 catepsina D, beta-D-glucuronidase, alfa-manosidase, fosfolipase A2, condroitina-4-sulfato, proteinase 3, lactoferrina, colagenase, ativador do complement。，receptor do complement。, receptor de N-formilmetionil-leucilfenilalanina (FMLP), receptor de laminina, citocromo b558, fator quimiotatico de mondcito, histaminase, proteina de Iigagao έ vitamina B12, gelatinase, ativador de plasminog§nio, beta-D-glucuronidase e uma combinagao desses. Preferivelmen- te, esses mediadores inflamat0rios sao selecionados do grupo consistindo de mieloperoxi- dase (MPO), eosinofilo peroxidase (EPO)1 proteina basica principal (MBP)1 lisozima, granzi- ma e uma combinagao desses. A presente invengao envolve uma quantidade eficaz do peptideo com uma celula
inflamatoria, em que a quantidade eficaz e definida como uma quantidade inibidora de des- granulagao do peptideo MANS ou de fragmento ativo seu que reduz a quantidade de um mediador inflamatorio Iiberado a partir de pelo menos uma celula inflamatoria a partir de cer- ca de 1% at6 cerca de 99% em comparagao com a quantidade Iiberada a partir de pelo me- nos uma celula inflamatoria na ausencia do peptideo MANS ou de um fragmento ativo seu. Essa quantidade tambem 6 conhecida como uma quantidade redutora de Iiberagao do me- diador inflamatorio eficaz. Mais preferivelmente, essa quantidade eficaz do peptideo em con- tato compreende ma quantidade inibidora de desgranula?ao do peptideo MANS ou de um fragmento ativo seu que reduz a quantidade de um mediador inflamatdrio Iiberado a partir de pelo menos uma celula inflamatoria a partir de entre cerca de 5 a 50% ate cerca de 99% em comparagao com a quantidade Iiberada a partir de pelo menos uma celula inflamat0ria na ausencia do peptideo MANS ou de um fragmento ativo seu.
A presente invengao, numa modalidade, e direcionada a administraQao de pelo me- nos um peptideo compreendendo um peptideo MANS e um fragmento ativo seu numa quan- tidade terapeuticamente eficaz no tecido ou fluido de um individuo, onde ο individuo έ afligi- do por uma doenga respiratoria, a qual e preferivelmente asma, bronquite cronica ou DPOC. Numa outra modalidade, ο individuo pode ser afligido por uma doenga do intestino, uma doenga de pele, uma doenga autoimune, uma sindrome de dor e suas combinagdes. A do- enga do intestino pode ser colite ulcerativa, doenga de Crohn ou sindrome do intestino irrit^- vel. O individuo pode ser afligido com uma doenga de pele, tal como rosacea, eczema, pso- riase ou acne severa. O individuo tambem pode ser afligido com art rite, tal como artrite reu-
matoide, artrite psoriatica, Iupos eritematoso sistemico. Individuos afligidos pela fibrose cisti- ca pode tamtam ser tratada pelo presente m6todo e peptideos. O m6todo presente e prefe- rivelmente Citil para ο tratamento de individuos, tais como mamiferos, e preferivelmente hu- manos, caninos, equinos e felinos.
O presente m^todo de tratamento dos individuos έ pela administragao de um ou mais peptideos incluindo ο peptideo MANS ou um fragment。ativo descrito aqui para incluir administragao topica, administragao parenteral, administraQao retal, administrag§o pulmo- nar, administragao nasal ou administragao oral. Mais especificamente, a administra?ao pul- monar έ selecionada do gaipo de aerossol, inalador de ρό seco, inalador de dose medida e nebulizador. Adicionalmente, ο m§todo revelado pode ainda compreender a administragio a um individuo de uma segunda molecula selecionada do grupo consistindo de um antibi0tico, um composto antiviral, um composto antiparasitico, um composto antiinflamat0rio e um imu- nomodulador.
Num aspecto, a invengao se refere a um metodo de administragao de uma compo- sigao farmaceutica. A composigao farmaceutica compreende ma quantidade terapeutica- mente eficaz de um composto conhecido e de um veiculo farmaceuticamente aceitavel. Uma quantidade "terapeuticamente eficaz", conforme aqui utilizada, e uma quantidade de um composto que e suficiente para melhorar os sintomas exibidos por um individuo. A quanti- dade terapeuticamente eficaz ira variar com a idade e condigao fisica do paciente, com a severidade da condigao do paciente sendo tratado, com a duragao do tratamento, com a natureza de qualquer tratamento concorrente, com ο veiculo farmaceuticamente aceitavel usado e fatores semelhantes dentro do conhecimento e habilidade das pessoas versadas na tecnica. Veiculos farmaceuticamente aceitaveis sao preferivelmente formas de dosagem solidas, tais como comprimidos ou c^psulas. Preparag5es Iiquidas para administragao oral tambem podem ser usadas e podem ser preparadas na forma de xaropes ou suspens5es, por exemplo, solug5es contendo um ingrediente ativo, a^Cicar, e uma mistura de etanol, έ- gua, glicerol e propilenoglicol. Caso desejado, tais preparagdes Iiquidas podem incluir um ou mais dentre os seguintes: agentes corantes, agentes fIavorizantes e sacarina. Adicionalmen- te, agentes espessantes, tais como carboximetilcelulose, tambem podem ser usados, assim como outros veiculos aceitaveis, a selegao dos quais sendo conhecida na tecnica. Conforme estabelecido acima, a presente invengao se refere aos metodos para re-
gular processos secretbrios celulares, especialmente aqueles que Iiberam mediadores in- flamatorios a partir de celulas inflamatorias. Conforme aqui utilizado, ο termo "regulando" significa bloqueando, inibindo, diminuindo, reduzindo, aumentando, intensificando ou estimu- lando. Uma variedade de processos secretorios celulares envolve a Iiberagao dos conteCidos a partir de vesiculas ou granulos Iigados a membrana nas celulas. Uma vesicula ou granulo Iigado a membrana e definido como uma particula intracelular, a qual έ primariamente ves卜
cular (ou uma vesicula dentro da celula) e a qual contem ο material armazenado que pode ser secretado. Alguns dos conteiidos dessas vesiculas, tais como aqueles contidos nas c6- Iulas inflamat0rias, foram descobertos como sendo respons^veis para uma variedade de patologias em v^rios tecidos mamiferos. Alguns dos efeitos dessas secregoes aparentam incluir danos de tecidos anteriormente sauddveis durante a inflamagao. Essa invengao pro- porciona um meio de bloquear a secre?ao a partir de qualquer vesicula Iigada έ membrana, incluindo aquelas encontradas nas c6lulas inflamat0rias, pelo alvejamento de uma mol6cula especifica importante na via secretbria intracelular com um peptideo sintetico. Essa aborda- gem pode ser de import§ncia terapeutica para ο tratamento de ma ampla variedade de con- οΐϊςδββ hipersecretorias e inflamatorias em humanos e animais. Mais especificamente, a presente invengao alveja c^lulas inflamat0rias alvo que
contem os mediadores inflamatdrios em um ou mais granulos ou vesiculas no citoplasma das c6lulas. As c^lulas entram em contato com um ou mais peptideos que sao selecionados a partir do peptideo MANS ou de um fragment。ativo sen, todos os quais sendo descritos aqui em detalhes. Preferivelmente1 ο contato do peptideo com a inflamatoria e atrav6s da administragao a um individuo afligido por ou sofrendo de uma doen^a na qual essas c^lulas inflamatorias estao presentes num tecido ou fluido especifico no tecido. Na administragao ou contato do peptideo com a celula, ο peptideo competitivamente compete para e inibe com- petitivamente a Iigagao da proteina MARCKS natural com a membrana dos granulos ou ve- siculas intracelulares, os quais cont§m os mediadores inflamat0rios. Como resultado do blo- queio da Iigagao da proteina MARCKS com s vesiculas nas celulas inflamat0rias, essas ve- siculas nessas celulas nao se movem para a membrana plasmatica das celulas, como elas poderiam normalmente fazer quando estimuladas a Iiberar exocitoticamente seus conteiidos de mediadores inflamatorios para fora das celulas.Deste modo, ο m6todo da presente in- vengao inibe ο movimento das vesiculas para a membrana plasmatica das celulas, ο que, por sua vez, reduz a Iiberagao dos mediadores inflamatbrios a partir das celulas inflamat6- rias. A quaritidade de mediadores inflamatorios Iiberada a partir das celulas no decorrer do tempo e reduzida porque tanto a taxa de Iiberagao quanto a quantidade de IiberaQao dos mediadores a partir das celulas inflamatorias e dependente da concentragao do peptideo administrado e em contato com as celulas inflamatorias. Um beneficio da presente invengao e que ela pode combinar uma terapia que inclui
ο bloqueio dire to da secregao de muco com uma iinica terapia antiinflamatoria. Um beneficio da presente invengao sobre as terapias antiinflamagao atuais que afetam a supressao geral do sistema imune e que ο peptideo e considerado para bloquear a secregao somente dos componentes intracelulares secretados a partir das celulas inflamatorias. Deste modo, mui- tos aspectos do sistema imune devem ainda funcionar, mesmo com a inibigao dos mediado- res inflamatorios.
Os compostos da invengao podem regular, isto e, bloquear a Iiberagao do mediador inflamatdrio das c6lulas. Essa inibi^ao da Iiberagao dos mediadores inflamatdrios έ uma forma atrativa para prevenir e tratar uma variedade de distiirbios, por exemplo, doengas e condigdes patol6gicas envolvendo inflamagao. Deste modo, os compostos da invengao po- dem ser Citeis para ο tratamento de tais condigdes. Essas englobam doengas das vias a6- reas e doengas inflamatorias cronicas incluindo, por6m sem se limitar, a osteoartrite, escle- rose mCiltipla, sindrome de Guillain-Barre, doenga de Crohn, colite ulcerativa, psoriase, do- enga doe enxerto versus hospedeiro e Iupos eritematoso sistSmico. Os compostos da inven- ς§ο podem tambem ser usados para tratar outros distiirbios associados com a atividade dos niveis elevados de mediadores proinflamatorios e enzimas, tais como respostas a v^rios agentes infecciosos e uma variedade de doengas de autoimunidade, tais como artrite reu- matoide, sindrome do choque toxico, diabetes e doengas do intestino inflamatorias.
Usos do peptideo e metodos da invengao incluem terapias para combater inflama- gao juntamente com terapias que irao combinar a atividade antiinflamatdria do peptideo com a sua capacidade de bloquear a secregao de muco. Doengas que podem ser tratadas pela capacidade do peptideo de bloquear tanto a inflamaQao quanto a secregao do muco inclu- em, por6m nao estao limitadas, a doengas do intestino inflamat0rias, distiirbios digestivos (isto έ, vesicula biliar inflamada, doenga de Menetier) e doengas das vias a^reas inflamat6- rias.
Outros mediadores proinflamat0rios foram correlacionados com uma variedade de estados de doenga que se correlacionam com ο influxo de neutrofilos nos sitios de inflama- gao ou injiiria. O bloqueio de anticorpos foi demonstrado como uma terapia Citil contra a injii- ria tecidual associada com neutrofilos na inflamagao aguda (Harada et al·, 1996, Molecular Medicine Today 2’ 482). As celulas diferentes de neutrofilos que podem Iiberar mediadores inflamat0rios incluem outros leucocitos, tais como basofilos, eosinofilos, monocitos e Iinf6ci- tos, e terapias podem ser direcionadas contra a secregao a partir dessas celulas. Neutrofi- los, eosinofilos e basofilos sao tipos de granulocitos, isto 6, um Ieucoito que tern granulos no seu citoplasma. Os leucocitos sintetizam uma variedade de mediadores infIamat0rios que sao empacotados e armazenados nos granulos cltoplasmaticos. Dentre esses mediadores estao, por exemplo, a mieloperoxidase [MPO] em neutr6filos (Borregaard N, Cowland JB. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 1997; 89: 3503- 3521), eosinofilo peroxidase [EPO] e proteina bdisica principal [MBP】 em eosinofilos (Gleich G J. Mechanisms of eosinophn-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651-663), Iisozima em monocitos/macrofagos (Hoff T1 Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt-Struebe M. Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52: 173-182; Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium-independent phospholipase A2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol
2003; 170:5276-5280), e granzimas em celulas natural killer (NK) e Iinfocitos citotoxicos (Bochan MR, Goebel WS, Brahmi Ζ. Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability. Cell Immunol 1995; 164: 234-239; Gong J H., Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8: 652-658; Maki G, Klingemann HG, Martinson JA1 Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10:369-383; e Takayama H1 Trenn G, Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104:183-1907-10).
Esses mediadores podem ser Iiberados nos sitios de injCiria e podem contribuir para inflamagao e reparo, tal como nos pulmoes e em outros lugares, como resultado da infiItra- ?ao dessas celulas no sitio do tecido de injiiria ou doenga. Os Ieucbcitos Iiberam esses gra- nulos atrav§s de um mecanismo exocit6tico (Burgoyne RD1 Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol Rev 2003; 83: 581-632; Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R. Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932).
Mastocitos, os quais geralmente nao circulam na corrente sanguinea, e basofilos contem gr§nulos citoplasmaticos secretorios os quais armazenam e podem liberar, na ativa- gao celular, mediadores inflamat0rios pre-formados (anafilaticos), tal como histamina; prote- oglicanas, tais como heparina e suIfato de condroitina; proteases tais como triptase, quina- se, carboxipeptidase e protease tipo catepsina G; fatores quimiotaticos, citocinas e metabdli- tos do acido araquiddnico que agem na vasculatura, miisculo liso, tecido conjuntivo, glandu- Ias mucosas e celulas inflamatorias.
Neutrofilos1 tambem conhecidos como Ieucocitos polimorfonucleares (PMN), com- preendem de 50 a 60% dos Ieucocitos circulantes totais. Neutrofilos agem contra agentes infecciosos, tais como bacterias, fungos, protozoarios, virus, celulas infectadas por virus, assim como celulas tumorals, que penetram nas barreiras fisicas corporais nos sitios de infecgao ou injdria. Os neutrofilos amadurecem atraves de seis estagios morfolbgicos: pro- mieloblasto, mielocito, metamielocito, neutrofilo nao-segmentado (banda) e neutrofilo seg- mentado (funcionalmente ativo). Nos neutrofilos, os mediadores inflamatorios sao armazenados em granulos prima-
rios (azurofilo), secundarios (especificos) e terciarios (gelatinase), assim como em vesiculas secretorias. Dentre os varios mediadores de inflamagao, os granulos primarios (azurofilos) contem mieloperoxidase (MPO)1 lisozima, defensinas, proteina intensificadora de permeabi- Iidade bactericida (BPI), elastase, catepsina G1 catepsina B, catepsina D, beta-D- glucuronidase, alfa-manosidase, fosfolipase A2, condroitina-4-sulfato e proteinase 3 (ver, por exemplo, Hartwig JH, Thelen M, Rosen A1 Janmey PA. Nairn AC, Aderem A. MARCKS is an
actin filament crosslinking protein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin. Na- ture 1992; 356: 618-622); granulos secunddrios (especificos) contem lisozima, Iactoferrina1 colagenase, ativador do complemento, fosfolipase A2, receptores do complemento, por e- xemplo, CR3, CR4, receptores de N-formilmetionil-leucilfenilalanina (FMLP)1 receptor de Iaminina1 citocromo bsse, fator quimiot^tico de mon6cito, histaminase e proteina de Iigagao έ vitamina B12: e gr§nulos de armazenagem pequenos contem gelatinase, ativador de plas- minogenio, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidase, alfa-manosidase e citocromo
^558-
Os granulos de neutrofilos contem substancias antimicrobianas ou citot6xicas, pro- teinases neutras, hidrolases acidas e uma reuniao de receptores de membrana citoplasm^ti- ca. Dentre os constituintes do granulo azurofilo mieloperoxidase (MPO) έ uma enzima critica na conversao de per6xido de hidrogenio em acido hipocloroso. Juntamente com ο perbxido de hidrogenio e um cofator haleto ele forma um mecanismo microbicida e citot6xico eficaz do sistema leuc0citos-a mieloperoxidase.
Defensinas1 as quais constituem de 30 a 50% da proteina de granulo azurofilico, sao peptideos antimicrobianos potentes pequenos (peso molecular < 4000) que sao citot0xl· cos para uma ampla faixa de bacterias, fungos e alguns virus. Suas toxicidades podem ser devido έ permeabilizagao da membrana da c^lula alvo, a qual e similar a outras proteinas formadoras de canal (perforinas).
A proteina intensificadora da permeabilidade bacteriana (BPI) e um membro das perforinas. Ela e altamente toxica para as bacterias gram-negativas, porem nao para as bac- terias gram-positivas ou fungos e tambem pode neutralizar a endotoxina, ο componente Ii- possacaridico toxico do envelope celular das bacterias gram-negativas.
A Iactoferrina sequestra ο ferro Iivre1 prevenindo dessa forma ο crescimento de mi- crorganismos ingeridos que sobrevivem ao process。de morte e aumenta a permeabilidade bacteriana a lisozima.
Serina proteases, tais como elastase e catepsina G, hidrolisam proteinas nos enve- lopes de celulas bacterianas. Os substratos do granulocito elastase incluem reticulagoes de colageno e proteoglicanas, assim como componentes da elastina dos vasos sanguineos, Iigamentos e cartilagem. CAtepsina D cliva as proteoglicanas da cartilagem, enquanto que os granulocito colagenases sao ativos na clivagem do colageno tipo I e, num menor grau, ao colageno tipo III dos ossos, cartilagens e tenddes. Os produtos da quebra do colageno tem atividade quimiotatica para os neutrofilos, monocitos e fibroblastos.
A regulagao do potencial destrutivo tecidual das proteases Iisossomais e mediada pelos inibidores da protease, tais como alfa-2-macroglobulina e alfa-1 -antiprotease. Essas antiproteases estao presentes no soro e nos fluidos sinoviais. Elas podem funcionar pela Iigagao a e cobertura dos sitios ativos das proteases. O desequilibrio protease-antiprotease pode ser importante na patogenese do enfisema. Granulos azurdfilos funcionam predominantemente no ambiente intracelular (no va- ciiolo fagolisossomal), onde eles estao envolvidos na morte e degradagao de microrganis- mos. Grdnulos especificos de neutr6filos sao suscetiveis έ Iiberagao de seus conteiidos ex- tracelularmente e tem um importante papel na iniciagao da inflamagao. Granulos especificos representam um reservatdrio intracelular de varios componentes da membrana plasm^tica, incluindo citocromo b (componente da NADPH oxidase, uma enzima responsavel pela pro- duQao de super0xido), receptores do fragmento do complemento iC3b (CR3, CR4), para laminina, e quimioatratores de formilmetioni卜peptideo. ΑΙέηι de outros, existe a histaminase, a qual e relevante para a degrada?ao de histamina, proteina de IigaQao έ vitamina e ativador de plasminogenio, ο qual e responsavel pela formagao de plasmina e clivagem de C5a a partir de C5.
A importancia dos granulos de neutr6filos na inflamagao ό perceptivel a partir dos estudos de varios pacientes com anormalidades cong§nitas dos granulos. Pacientes com a sindrome de Ch^diak-Higashi tem uma profunda anormalidade na taxa de estabilizagao de uma resposta inflamatoria e tem granulos Iisossomais anormalmente grandes. A sindrome congenita da deficiencia de gr§nulo especifico e um distiirbio excessivamente raro caracteri- zado por respostas inflamat0rias diminuidas e infecgdes bacterianas severas da pele e teci- dos profundos.
Embora mecanismos que regulam a secregao exocitotica desses granulos sejam somente parcialmente entendidas, varias mol6culas chave no processo foram identificadas, incluindo Ca2+ transitorio intracelular (Richter et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9472- 9476; Blackwood et al., Biochem J 1990; 266: 195-200), proteinas G1 tirosina e proteina qui- nases (PK, especialmente PKC) (Smolen et al., Biochim Biophys Acta 1990; 1052: 133-142; Niessen et al., Biochim. Biophys. Acta 1994; 1223: 267-273; Naucler et al., Pettersen et al., Chest 2002; 121; 142-150), Rac2 (Abdel-Latif et al., Blood 2004; 104: 832-839; Lacy et al., J Immunol 2003; 170: 2670-2679) e varias SNARE'S, SNAP'S e VAMP's (Sollner et al., Nature 1993; 362: 318-324; Lacy, Pharmacol Ther 2005; 107: 358-376).
Proteinas SNARE (receptor de proteina de IigaQao a N-etilmaleimida soliivel) sao uma familia das proteinas associadas έ membrana caracterizadas por um dominio espiral espiralado em alfa-helice chamado de porgao SNARE (Li et al., Cell. Mol. Life Sci. 60: 942- 960 (2003)). Essas proteinas sao classificadas como v-SNAREs e t-SNAREs baseando-se nas suas Iocalizagoes na vesicula ou membrana alvo; outro esquema de classificagao define R-SNARES e Q-SNARES1 baseando-se no residuo e arginina ou glutamina conservado no centra da porgao SNARE. SNAREs sao Iocalizados em compartimentos de membrana dis- tintos das vias de trafego secretorio e endocitico, e contribuem para a especificidade dos processos de fusao de membrana intracelular. O dominio t-SNARE consiste de um feixe com 4 helices com um giro em espiral espiralado. A porgao SNARE contribui para a fusao de duas membranas. PorgSes SNARE caem em quatro classes: hom6logos da sintaxina 1a (t-SNARE), VAMP-2 (v-SNARE) e as porgdes SNARE N- e C-terminais de SNAP-25. Um membro de cada classe pode interagir para formar um complexo SNARE. A porgao SNARE e formada nos dominios N-terminais de certos membros da familia sintaxina, tais como sin- taxina 1a, a qual e requerida para a Iiberagao de neurotransmissor (Lerman et al.’ Bioche- mistry 39: 8470-8479 (2000)), e sintaxina 6, a qual e encontrada nas vesiculas de transporte endossomais (Misura et al·, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 9184-9189 (2002)).
Proteinas SNAP-25 (proteina de 25 Kda associada com sinaptossoma) sao compo- nentes dos complexos SNARE, os quais podem ser responsaveis pela especificidade da fusao da membrana e por executar diretamente a fusao pela formagao de um complexo fir- me (o complexo SNARE ou de niicleo) que une a vesicula sinaptica com as membranas plasmaticas. As SNAREs consistem de uma grande familia de proteinas que sao caracteri- zadas por sequencias de 60 residuos conhecidas como porgdes SNARE, as quais tem uma alta propensao a formar espirais espiraladas e geralmente precedem as regides transmem- branares carboxi-terminais. O complexo do nCicleo sin^ptico e formado por quatro porg5es SNARE (duas de SNAP-25 e uma de cada dentre sinaptobrevina e sintaxina 1) que sao nao estruturadas quando isoladas, porem formam um feixe de quatro helices paralelos na mon- tagem. A estrutura cristalina do complexo do niicleo revelou que ο feixe de helice έ altamen- te torcido e cont6m varias pontes salinas na superficie, assim como camadas de residuos hidrofobicos interiores. Uma camada polar no centra do complexo e formada por tres gIuta- minas (duas de SNAP-25 e uma de sintaxina 1) e uma arginina (da sinaptobrevina) (Rizo et al., Nat Rev Neurosci 3: 641-653 (2002)). Membros da familia SNAP-25 contem um agru- pamento de residuos de cisteina que pode ser palmitoilado para Iigagao a membrana (Ri- singer et al., J. Biol. Chem. 268: 24408-24414 (1993)). O principal papel dos neutrofilos e fagocitar e destruir agentes infecciosos. Eles
tambem Iimitam ο crescimento de alguns microbios, antes do inicio das respostas imunol6- gicas adaptativas (especificas). Embora os neutrofilos sejam essenciais para a defesa do hospedeiro, eles tambem tem sido implicados na patologia de muitas condigoes inflamat6- rias cronicas e na injOria por reperfusao isquemica. As enzimas hidroliticas de origem neu- trofilica e inibidores da protease oxidativamente inativados podem ser detectados num fluido isolado a partir de sitios inflamatorios. Sob condigdes normais, os neutrofilos podem migrar para sitios de infecgao sem danificar os tecidos hospedeiros. Entretanto, danos indesejaveis a um tecido hospedeiro podem, algumas vezes, ocorrer. Esse dano pode ocorrer atraves de varios mecanismos independentes. Esses incluem ativagao prematura durante a migragao, Iiberagao extracelular e produtos toxicos durante a morte de alguns microbios, remogao de fragmentos e celulas hospedeiras infectadas ou danificadas como um primeiro passo na
remodelagem tecidual ou falha para terminar as respostas inflamatorias agudas. A injCiria por reperfusao isquemica est^ associada com um influxo de rieutrofilos no tecido afetado e a subsequente ativa?ao. Isso pode ser desencadeado pelas subst§ncias Iiberadas a partir das celulas hospedeiras danificadas ou como uma consequencia da geragao de super6xido a- trav6s da xantina oxidase.
Sob condigdes normais, ο sangue pode conter uma mistura de neutr6filos normais,
iniciados, ativados e gastos. Em qualquer sitio inflamat6rio, estao presentes principalmente neutr6filos ativados e gastos. Neutrofilos ativados tem uma produgao intensificada de inter- mediaries de oxigenio reativos (ROI). Uma subpopulagao de neutrofilos com explosao respi- ratoria intensificada foi detectada no sangue de pessoas com uma infecgao bacteriana agu- da e pacientes com sindrome do estresse respirat6rio aduIto (ARDS). Este [e um exemplo de um paradoxo neutrofilico. Neutrofilos tem sido implicados na patologia dessa condigao devido ao grande influxo dessas celulas no pulmao e ao dano tecidual associado causado por oxidantes e enzimas hidroliticas Iiberadas de neutr0filos ativados. A redugao da capaci- dade da atividade microbiana neutrofilica que ocorre conforme a ARDS piora pode ser uma resposta protetora na parte do hospedeiro, a qual έ Iocalmente induzida por produtos infla- mat0rios.
A fase aguda da injCiria termica tambem esta associada com ativagao de neutrofilos, e isso e seguido por uma perda da capacidade geral em varias fung5es de neutrofilos. A ativaQao dos neutrofilos por imunocomplexos no fluido sinovial contribui para a patologia da artrite reumatoide. A ativagao cronica dos neutrofilos pode tamb§m iniciar ο desenvolvimen- to tumoral devido ao fato de alguns ROI gerados por neutrofilos danificarem DNA e as pro- teases promoverem a migragao de celulas tumorals. Em pacientes sofrendo de queimaduras severas, uma correlagao foi estabelecida entre ο inicio da infecgao bacteriana e a redugao na proporgao e ntimeros absolutos de neutrofilos positivos para ο anticorpo e receptores do complemento. Oxidantes de origem neutrofilica tamb6m foram demonstrados como oxidan- tes das Iipoproteinas de baixa densidade (LDL), as quais sao ainda mais eficientemente Ii- gadas a membrana plasmatica dos macrofagos atraves de receptores Iimpadores especifi- cos. A absorgao dessas LDL oxidadas por macrofagos pode iniciar a aterosclerose. Alem disso, neutrofilos iniciados foram descobertos em muitas pessoas com hipertensao essenci- al, doenga de Hodgkin1 doenga do intestino inflamatoria, psoriase, sarcoidose e septicemia, onde a iniciagao e correlacionada com altas concentragdes de TNF-alfa circulante (caquec- tina).
O dano hidrolitico ao tecido hospedeiro e, consequentemente, as condig5es infla- matorias cronicas podem ocorrer quando as varreduras de antioxidante e antiprotease sao oprimidas. A deficiencia de antiprotease e considerada como sendo respons^vel pela pato- logia de enfisema. Muitas antiproteases sao membros da familia de inibidores da serina pro- tease (SERPIN). Embora a circula?§o seja rica de antiproteases, essas grandes proteinas podem ser seletivamente excluidas nos sitios de inflamagao devido ao fato dos neutr6filos aderirem aos seus alvos. O estresse oxidativo pode iniciar ο dano tecidual pela redugao da concentragao de antiproteases extracelulares at6 abaixo do nivel necess^rio para inibir as proteases liberadas. Os oxidantes dorados e per0xido de hidrog§nio podem inativar antio- proteases, tal como inibidor da alfa-1-protease e alfa-2-macroglobulina, as quais sao inibido- res end6genos da elastase, por§m ativam simultaneamente as metaloproteases latentes, tais como colagenases e gelatinase, as quais contribuem para a inativagao adicional das antiproteases.
Constituintes citoplasmaticos dos neutr6filos tamb6m podem ser uma causa da formagao de anticorpos citoplasmaticos anti-neutrofilicos especificos (ANCA), os quais estao intimamente relacionados com ο desenvolvimento de vasculite sistemica e glomerulonefrite. ANCA sao anticorpos direcionados contra enzimas que sao encontradas principalmente no azurofilo ou em granulos prim^rios dos neutr6filos. Existem tres tipos de ANCA que podem ser distintos pelos padrSes que eles produzem por imunofluorescencia indireta em neutrofi- Ios fixados com etanol normais. A fluorescencia granular citoplasm^tica difusa (cANCA) έ tipicamente encontrada nas granulomatoses de Wegener, em alguns casos da poliarterite microscopica e na sindrome de Chrug Strauss, e em alguns casos de glomerulonefrite ne- crosante crescente e segmental". O antigeno alvo e geralmente a proteinase 3. Fluorescen- cia perinuclear (pANCA) 6 encontrada em muitos casos de poliarterite microscopica e em glomerulonefrite. Esses anticorpos sao geralmente direcionados contra a mieloperoxidase, por^m outros alvos incluem elastase, catepsina G, lactoferrina, Iisozima e beta-D- glucuronidase. O terceiro grupo designado ANCA "atipico" inclui fluorescencia nuclear de neutrofilos e alguns padrdes citoplasmaticos incomuns e, enquanto alguns dos antigenos alvos sao compartilhados com pANCA, os outros ainda nao foram identificados. pANCA tambem e encontrada num terceiro grupo de pacientes com doenga de Crohn. A incidencia reportada de ANCA em artrite reumatoide e SLE varia consideravelmente, por6m os pa- droes sao predominantemente pANCA e ANCA atipico.
O eosinofilo e um Ieucocito de estdgio final terminalmente diferenciado que reside predominantemente no tecido submucosal e e recrutado para sitios de reag5es imunes es- pecificas, incluindo doengas alergicas. O citoplasma eosinofilico contem grandes granulos elipsoides com um nucleo cristalino de alta densidade de el^trons e matriz parcialmente perme^vel. AI6m desses grandes granulos cristaloides primarios, existe outro tipo de granu- Io que e menor (granulo pequeno) e nao tern ο niicleo cristalino. Os granulos especificos grandes de eosinofilos contem pelo menos quatro proteinas cationicas distintas, as quais exercem uma gama de efeitos biologicos nas celulas hospedeiras e alvos microbianos: pro- teina basica principal (MBP), proteina cationica eosinofilica (ECP), neurotoxiria derivada de
eosinofilo (EDN) e eosinofilo peroxidase (EPO). Basofilos contem cerca de um quarto a mais de proteina b^sica principal do que os eosinofilos juntamente com quantidades detectaveis de EDN1 ECP e EPO. Pequenas quantidades de EDN e ECP sao tamb6m encontradas em neutrofilos (Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651-663). Parece que MBP nao tem atividade enzim^tica, por6m 6 um polipeptideo altamente cationico, ο qual pode exercer suas atividades t0xicas pelas intera- ςδββ com membranas Iipidicas que Ievam ao seu desarranjo. Tanto MBP quanta EPO po- dem agir como inibidores alost^ricos seletivos de Iigagao agonista aos receptores muscari- nicos M2. Essas proteinas podem contribuir para a disfungao do receptor M2 e intensificar broncoconstrigao vagamente mediada na asma. EDN pode danificar especificamente ο re- vestimento de mielina dos neurdnios. Histaminase e uma variedade de enzimas Iisossomais tambem estao presentes nos granulos especificos grandes dos eosinofilos. Dentre as enzi- mas em granulos pequenos de eosinofilos estao a aril sulfatase, a fosfatase ^cida e uma metaloproteinase de 92 KDa, uma gelatinase. Eosinofilos podem elaborar citocinas as quais incluem aquelas com potenciais atividades do fator de crescimento autocrino para eosinbfi- Ios e aquelas com fun?5es potenciais nas respostas inflamatdrias aguda e cronica. Essas citocinas tem atividades do fator de crescimento para eosin0filos: fator estimulatorio de colo- nia granul6cito-macr0fago (GM-CSF), IL-3 e IL-5. Outras citocinas produzidas por eosin6filos humanos que podem ter atividades em respostas inflamat0rias agudas e cronicas incluem IL-1 alfa, IL-6, IL-8, TNF-alfa e ambos os fatores de crescimento transformantes, TGF-alfa e TGF-beta.
Eosinofilos contem granulos cristal0ides que contem MBP1 proteina cationica eosi- nofilica, EPO e neurotoxina derivada de eosinofilo (Gleich, J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651-663). O clone 15 da Iinhagem celular promielocitica humana HL-60 pode ser usado para examinar a secregao de EPO. Essa Iinhagem celular foi estabelecida a partir de um clone de HL-60 que cresceu em pH elevado por dois meses (Fischkoff, Leuk Res 1988; 12: 679-686) e foram, a seguir, tratadas com acido butirico para permitir que as celulas se diferencias- sem, de modo a exibir muitas das caracteristicas dos eosinofilos de sangue periferico, inclu- indo a expressao de proteinas de granulos especificos de eosinofilos (Rosenberg et al.’ J Exp Med 1989; 170: 163-176; Tiffany et al., J Leukoc Biol 1995; 58: 49-54; Badewa et al., Exp Biol Med 2002; 227: 645-651).
Os eosinofilos podem participar nas reagdes de hipersensibilidade, especialmente atrav§s de dois mediadores inflamatorios Iipidicos1 Ieucotrieno C4 (LTC4) e ο fator ativador de plaquetas (PAF). Ambos os mediadores contraem os miisculos Iisos das vias aereas, promovem a secregao de muco, alteram a permeabilidade vascular e eliciam a infiltragao eosinofilica e neutrofilica. Alem das atividades diretas desses mediadores derivados de eo- sinofilos, MBP pode estimular a Iiberagao de histamina a partir de basofilos e mastocitos, e MBP pode estimular a Iiberagao de EPO dos mastocitos. Eosinofilos podem servir como uma fonte local de mediadores Iipidicos especificos, assim como para induzir a Iiberagao de mediadores dos mastocitos e bas0filos. O conteiido de gr3nulos eosinofilicos έ Iiberado a- ρόβ ο estimulo semelhante aos granulos neutrofilicos, por exemplo, durante a fagocitose das particulas opsonizadas e por fatores quimiotdticos. Enzimas Iisossomais neutrofilicas agem primariamente no material afundado nos fagolisossomas, enquanto que os conteiidos dos gr§nulos eosinofilicos agem principalmente na estrutura do alvo extracelular, tal como em parasitas e mediadores inflamatorios.
O desenvolvimento de monbcitos e de macrdfagos ocorre na medula 6ssea e passa pelos seguintes passos: celula tronco; monoblast。； promon6cito; mondcito na medula 6ssea; monocito no sangue periferico; e macr6fago nos tecidos. A diferenciagio de monocitos na medula ossea ocorre rapidamente (1,5 a 3 dias). Durante a diferenciagao, os granulos sao formados no citoplasma do monocito e estes podem ser divididos como em neutrofilos em pelo menos dois tipos. Entretanto, eles sao menos e menores do que suas contrapartes neutrofilos (azur0filo e granulos especificos). Seus conteOdos enzimaticos sao similares. Enzimas Iigadas aos grSnulos dos mondcitos/macrbfagos incluem lisozima, fosfata-
se ^cida e beta-glucuronidase. Como modelo para estudos in vivo, a secregao de lisozima a partir de c6lulas U937 foi usada. Essa Iinhagem celular έ derivada a partir de um Iinfoma histocitico humano e tem sido usada como uma Iinhagem de celula monocitica que pode ser ativada por uma variedade de agonistas, tais como PMA (Hoff et al., J Leukoc Biol 1992; 52: 173-182; Balboa et al·, J Immunol 2003; 170: 5276-5280; Sundstrom et al., Int J Cancer 1976； 17: 565-577).
As celulas natural killer (NK) e os Iinfocitos citotoxicos contem potentes granulos ci- totoxicos incluindo perforina, uma proteina formadora de poros e granzimas, serina protea- ses linf0cito especificas. Por exemplo, a Iinhagem celular NK-92 e uma Iinhagem humana dependente de IL-2 estabelecida de um paciente com Iinfoma nao-Hodgkin rapidamente progressivo (Gong JH., Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell line (NK- 92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8: 652-658). C6lulas NK-92 expressam elevados niveis de moleculas envolvidas na via citolitica perforina-granzima que alveja uma ampla faixa de celulas malignas (Gong et al, ver abaixo, e Maki G, Klingemann HG, Martinson JA, Tarn YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001 ； 10: 369-383).
Granzimas sao serina proteases exdgenas que sao Iiberadas por granulos cito- plasmaticos nas celulas T citotoxicas e nas celulas natural killer. Granzimas podem induzir apoptose nas celulas infectadas por virus, destruindo-as.
A Iiberagao extracelular de um mediador de inflamagao (mediador inflamatorio) de um granulocito (ou leucocito) e a Iiberagao extracelular de mais de um mediador de inflama- gao (mediador de inflamagao) de um granuldcito (ου leuc0cito) έ algumas vezes referida aqui como desgranulagao. Numa modalidade preferida, a IiberagSo de um mediador de in- flamagao compreende a Iiberagao do referido mediador a partir de um gr§nulo Iocalizado no interior de um granuldcito ou leuc0cito. A IiberagSo do mediador inflamatbrio έ preferivel- mente a Iiberagao de um mediador inflamat0rio desses granulos.
Neutrbfilos e macr6fagos, na iniciagio por agentes proinflamatorios (estimulantes inflamat6rios) tais como TNFa1 aumentam dramaticamente suas sinteses da proteina MARCKS: at6 90% das novas proteinas formadas por neutrofilos em resposta ou ao TNFa ou ao Iipopolissacarideo (LPS) sao MARCKS. (Thelen M1 Rosen A1 Nairn AC, Aderem A. Tumor necrosis factor alpha modifies agonist-dependent responses in human neutrophils by inducing the synthesis and myristoylation of a specific protein kinase C substrate. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 5603-5607). MARCKS pode, deste modo, ter um papel importante na Iiberagao subsequente de mediadores inflamat0rios quando c6lulas contendo granulos, tais como neutrofilos e macrbfagos, sao estimuladas por agonistas, especialmente aqueles que funcionam pela ativagao de PKC (Burgoyne et al., Physiol Rev 2003; 83: 581-632; Lo- gan et al. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932; Smolen et al., Biochim Biophys Acta 1990; 1052: 133-142; Niessen et al., Biochim. Biophys. Acta 1994; 1223: 267-273; Naucler et al., J Leukoc Biol 2002; 71: 701-710).
Num aspecto dessa invengao, a administraQao de uma quantidade inibidora de desgranulagao do peptideo MANS ou de um fragment。ativo seu, conforme aqui descrito, a um sitio de inflama^ao num individuo, cujo sitio de inflamagao resultou do inicio do acesso de uma doenga, uma condigao, um trauma, um corpo estranho ou uma combinagao desses no sitio de inflamagSo num individuo, pode reduzir a quantidade de um mediador de infla- magao Iiberado a partir de Ieucocitos infiltrantes no sitio de inflama^ao, onde os Ieucbcitos sao preferivelmente granulocitos. A administragao do peptideo MANS e/ou de pelo menos um fragmento ativo seu pode reduzir a quantidade de um mediador de inflamagao Iiberado dos leucocitos, tais como granulocitos se infiltrando no sitio de inflama?ao. A quantidade inibidora de desgranulagao do peptideo MANS, ou a quantidade inibidora de desgranulagao de um fragmento ativo seu έ suficiente para reduzir ou inibir a Iibera^ao exocit0tica dos me- diadores inflamatorios dos granulos contidos nas c^lulas inflamatorias que se infiltram no sitio. A eficdcia de inibigao da desgranulagao έ medida no momento depois da administra- gao do peptideo MANS ou do seu fragmento ativo por comparagao da porcentagem de inibi- gao (isto 6, porcentagem de redugao) da Iiberagao dos mediadores de inflamagSo das refe- ridas celulas (leuc6citos ou granulocitos ou outras celulas inflamatorias) em relagao ao nivel ou quantidade ou concentragao dos referidos mediadores de inflamagao Iiberados ou produ- zidos aproximadamente ao mesmo tempo na ausencia do peptideo MANS e/ou na ausencia
do seu fragmento ativo. Adicionalmente1 um clinico habilitado pode determinar se a inflama- gao no sitio do tecido foi reduzida pela medi?ao dos sintomas e parametros de inflamagao conhecidos como indicadores da doenga para determinar se uma quantidade terapeutica- mente eficaz ou suficiente de peptideo MANS e/ou de um fragmento ativo seu foi adminis- trada. Uma quantidade inibidora de desgranulagao suficiente έ a quantidade a qual produz uma porcentagem de redugao de um mediador de inflamagao Iiberado a partir de um granu- locito, no sitio de inflamagao, cuja porcentagem έ de cerca de 1% at6 cerca de 99%, preferi- velmente de 5% at6 cerca de 99%, mais preferivelmente de cerca de 10% at6 cerca de 99%, ainda mais preferivelmente de cerca de 25% at6 99%, e ainda mais preferivelmente de cer- ca de 50% ate cerca de 99% da quantidade do referido mediador de inflamaglio Iiberado a partir do referido granulocito na ausencia do peptideo MANS ou de um fragmento ativo seu testado sob as mesmas condigdes.
Num aspecto dessa invengao, a administragao de uma quantidade inibidora de desgranulagao de peptideo MANS a um sitio de estimulagao inflamatorio num animal, cujo sitio de estimulagao inflamatoria foi criado pela administra^ao de uma quantidade estimula- dora de inflamagao de um estimulante inflamatorio ao referido sitio pode reduzir a quantida- de de um mediador de inflamas§o Iiberado a partir de um granulocito, cujo granulocito e es- timulado pelo referido estimulante inflamatorio no referido sitio de estimulagao inflamatoria, de cerca de 1% at6 cerca de 99%, preferivelmente de 5% ate cerca de 99%, mais preferi- velmente de cerca de 10% ate cerca de 99%, ainda mais preferivelmente de cerca de 25% at6 99%, e ainda mais preferivelmente de cerca de 50% at6 cerca de 99% da quantidade do referido mediador de inflamagao Iiberado a partir do referido granulocito na ausencia do pep- tideo MANS na presenga da quantidade de estimulador de inflamagao identica do referido estimulante inflamatorio.
Em outro aspecto dessa invengao, a administragio de uma quantidade inibidora de desgranulagao do peptideo MANS a um sitio de estimula^ao inflamatorio num animal, cujo sitio de estimulagao inflamatorio tenha sido criado pela administragao de uma quantidade estimuladora de inflamagao de um estimulante inflamatorio ao referido sitio, pode reduzir a quantidade de um mediador de inflamagao Iiberado a partir de um granul0cito, cujo granulo- cito έ estimulado pelo referido estimulante inflamatorio no referido sitio de estimulagao de inflamagao, por 100% da quantidade do referido mediador de inflamagao Iiberado a partir do referido granulocito na ausencia do peptideo MANS na presenga da quantidade estimulado- ra de inflamagao identica do referido estimulante inflamatorio.
Um exemplo de um estimulante inflamatorio usado em exemplos in vivo aqui e ο forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). A proteina quimioatratora de monocitos (MCP-1) e quase tao eficaz quanta C5a, e muito mais potente do que a IL-8, na desgranulagao dos basofilos, resultando na Iiberagao de histamina. A Iiberagao de histamina pode ocorrer de-
pois da estimulagao com quimiocinas (isto e, citocinas quimioatratoras), RANTES e MIP-1. Numa modalidade preferida, em relagao a concentragao basal de peptideo MARCKS presente no sitio de estimulagao inflamat0ria, a quantidade inibidora de desgranu- Ia^ao do peptideo MANS administrada a um sitio de estimulagao inflamat6rio num animal compreende de cerca de 1 vez at§ cerca de 1.000.000 de vezes a concentragao do peptideo MARCKS no referido sitio de estimulagao de inflamagao, preferivelmente de cerca de 1 vez at6 cerca de 100.000 vezes a concentragao do peptideo MARCKS no referido sitio de esti- muIagao de inflamagao, mais preferivelmente de cerca de 1 vez at6 cerca de 10.000 vezes a concentragao do peptideo MARCKS no referido sitio de estimulaQao de inflamagao, ainda mais preferivelmente de cerca de 1 vez at6 cerca de 1.000 vezes a concentragao do pepti- deo MARCKS no referido sitio de estimulagao de inflamagao, ainda mais preferivelmente de cerca de 1 vez at6 cerca de 100 vezes a concentragao do peptideo MARCKS no referido sitio de estimulagao de inflamagao, e ainda mais preferivelmente de cerca de 1 vez ate cer- ca de 10 vezes a concentragao do peptideo MARCKS no referido sitio de estimula?ao de inflamagao.
Numa modalidade preferida, os residuos de granul0citos na ou dentro das vias ag-
rees de um animal, preferivelmente um humano, e ο peptideo MANS έ administrado por inalagao, tal como por inalagao de uma composigao farmaceutica compreendendo ο pepti- deo MANS, por exemplo, uma composigao farmaceutica compreendendo ο peptideo MANS e uma soluQao aquosa, cuja composigao e administrada na forma de um aerossol, ou uma composi^ao farmaceutica compreendendo ο peptideo MANS na forma de um ρό seco, cuja composigao e administrada usando um inalador de ρό seco. Outros metodos e dispositivos conhecidos na t^cnica para administragao de uma solugao ou ρό por inalagao tal como, por exemplo, goticulas, borrifos e nebulizadores pode ser iitil.
Em algumas modalidades, έ possivel que ο peptideo da presente invengao possa bloquear os processos secretorios que sejam fisiologicamente importantes, incluindo fun- g5es secretorias basais. Embora os inventores nao desejem se prender a qualquer teoria particular da invengao, e ensinado que os mecanismos que regulam tal secregao basal sao diferentes daqueles que regulam a secregao estimulada. Alternativamente, mecanismos secretorios basais podem requerer menos proteina MARCKS do que a secregao estimulada. A secregao basal pode ser preservada, desde que todas as terapias para bloquear a secre- qao mediada por MARCKS nao possa eliminar toda a fungao MARCKS.
Conforme aqui utilizado, ο termo "sequencia de nucleotideos MARCKS" se refere a qualquer sequencia de nucleotideos derivada de um gene que codifica uma proteina MARCKS incluindo, por exemplo, uma sequencia de DNA ou de RNA1 a sequencia de DNA de um gene, qualquer sequencia de RNA transcrita, uma sequencia de RNA do transcrito pre-RNAm ou RNAm1 e DNA ou RNA Iigado a proteina.
A distribui?§o precisa do peptideo que bloqueia MARCKS tambem pode contornar quaisquer limita?0es potenciais de processos secretorios importantes de bloqueio. A distri- bui?§o de tais agentes ao trato respirat0rio deve ser prontamente efetuada com formuIag5es inaladas. Uma vez que esses agentes podem ser Citeis no tratamento da doenga do intestino inflamat0ria, uma pessoa pode prever a distribuigao dos agentes de bloqueio no trato re- to/c6lon/intestinal atrav^s de enema ou supositorios. Injegoes intra-articulares de distribuigao transd6rmica nas juntas inflamadas podem proporcionar alivio aos pacientes com doengas artriticas ou auto-imunes pela Iimita^ao da secregao a partir de celulas inflamat6rias Iocali- zadas. A injegao em areas ao redor das extremidades nervosas pode inibir a secregao de alguns tipos de neurotransmissores, ο bloqueio da transmissao de dor severa ou espasmos musculares descontrolados. A distribuigao do peptideo para ο tratamento de doengas de pele inflamatorias deve ser prontamente efetuada usando varias formulag5es t6picas conhe- cidas na tecnica.
Acredita-se que MARCKS interaja com actina e miosina no citoplasma e, deste mo- do, possa ser capaz de amarrar os granulos no aparelho contratil celular, deste modo medi- ando ο subsequente movimento de granulos e exocitose. A secregao de MPO mediat6rio inflamatorio a partir dos neutrofilos tambem pode ser maximizada pela ativagao tanto de PKC quanto de PKG. έ possivel que MARCKS sirva como ο ponto de convergencia para coordenar as agdes dessas duas proteinas quinases que controlam a secregao a partir de compartimentos Iigados έ membrana nas celulas inflamatorias (isto 6, a secregao de MPO a partir dos neutrofilos).
A presente ίηνβηςείο demonstra que a secregao do mediador inflamat6rio MPO a partir de neutrofilos caninos ou humanos foi intensificada pela ativagao concorrente tanto de PKC quanto de PKG, enquanto que a ativaQao de quaiquer quinase sozinha foi insuficiente para induzir uma resposta secretoria maxima. Uma resposta secretoria intensificada ao PMA sozinho foi documentada em celulas NHBE e em neutrofilos, conforme aqui demonstrado, embora a magnitude da resposta tenha sido muito menor do que aquela observada por ou- tros numa Iinhagem celular tipo caliciforme de rato. Ver Abdullah et al., acima. Alem disso, embora tenha sido reportado anteriormente que um analogo cGMP poderia induzir significa- tivamente a secregao de mucina a partir de celulas epiteliais da traqueia de porquinhos da India cultivadas (Fischer et al., acima), deve ser notado que essa resposta nao alcangou niveis significativos ate 8 h de exposigao. E improvavel que uma resposta secret6ria com tal Iongo periodo lag seja um efeito direto e provavelmente envolva a sintese de proteina de novo ao contrario da Iibera^ao de granulos citoplasm^ticos pr6-formados e armazenados.
Conforme estabelecido acima, a presente invengao pode ser usada numa formula- gao farmaceutica. Em certas modalidades, ο produto farmaco esta presente numa compos卜 gao farmaceutica solida que pode ser adequada para administragao oral. Uma composigao de materia solida de acordo com a presente invengao pode ser formada e pode ser mistura- da com e/ou diluida por um excipiente. A composiQao de materia s6lida tamb6m pode ser encerrada num veiculo, ο qual pode estar, por exemplo, na forma de uma ciipsula, sache, comprimido, papel ou outro recipiente. Quando ο excipiente serve como um diluente, ele pode ser um material sdlido, semi-s0lido ou Iiquido que age como um veiculo, carreador ou meio para a composigao da materia.
V^rios excipientes adequados serao entendidos pelas pessoas versadas na t6cnica e podem ser encontrados no National Formulary, 19: 2404-2406 (2000), as descobertas das p^ginas 2404 a 2406 sendo aqui incorporadas na sua totalidade. Exemplos de excipientes adequados incluem, porem nao estao limitados, a amidos, goma arabica, silicato de calcio, celulose microcristalina, metacrilatos, laca, polivinilpirrolidona, celulose, agua, xarope e me- tilcelulose. AS formulag5es com produto f^rmaco adicionalmente podem incluir agentes Iu- brificantes tais como, por exemplo, talco, estearato de magnesio e oleo minera; agentes u- midificantes; agentes emusificantes e suspensores. Agentes conservantes tais como metil- e propilidroxibenzoatos; agentes ado^antes; ou agentes flavorizantes. Polidis, tamp5es e en- chimentos inertes tambem podem ser usados. Exemplos de poliois incluem, por^m nao es- tao limitados, a manitol, sorbitol, xilitol, sacarose, maltose, glicose, lactose, dextrose e seme- lhantes. Tampoes adequados incluem, por^m nao estao limitados, a fosfato, citrato, tartara- to, succinato e semelhantes. Outros enchimentos inertes que podem ser usados incluem aqueles que sao conhecidos na tecnica e que sao Citeis na ρΐΌοΙιις^ο de v^rias formas de dosagem. Caso desejado, as formulagdes s0lidas podem incluir outros componentes tais como agentes de massa e/ou agentes de granulagao, e semelhantes. Os produtos de f^r- macos da invengao podem ser formulados de modo a proporcionar uma Iiberagao r^pida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo apos a administragao ao paciente empregan- do-se procedimentos bem conhecidos na tecnica. Para formar comprimidos para administragao oral, a composigao da materia da pre-
sente invengao pode ser feita por um processo de compressao direta. Nesse processo, os ingredientes do farmaco ativo podem ser misturados com um veiculo solido pulverizado tal como, por exemplo, alactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, derivados de celulose ou gelatina, e suas misturas, assim como com um agente anti-fricgao tal como, por exemplo, estearato de magnesio, estearato de calcio e ceras de polietilenoglicol. A mistura pode, a seguir, ser comprimida em comprimidos usando uma maquina com as purges e moldes apropriados para obter ο tamanho do comprimido desejado. Os parametros opera- cionais da maquina podem ser selecionados pelo artesao habilitado. Alternativamente, com- primidos para administragao oral podem ser formados por um processo de granulagao Cimi- da. Ingredientes de farmaco ativo podem ser misturados com excipientes e/ou diluentes. As substancias solidas podem ser moidas ou peneiradas ate um tamanho de particula deseja-
do. Um agente de IigagSo pode ser adicionado ao farmaco. O agente de Iigagao pode ser suspenso e homogeneizado num solvente adequado. O ingrediente ativo e agentes adjuvan- tes tamb6m podem ser misturados com a solu?3o de agente ligante. A mistura seca resiH- tante έ umidificada com a soluQao uniformemente. A umidifica^ao tipicamente faz com que as particulas se agreguem levemente, e a massa resultante έ comprimida atrav^s de uma peneira de ago inoxidavel com um tamanho desejado. A mistura έ, a seguir, seca em unida- des de secagem controladas pela duragao e tempo necess^ria para alcanoar um tamanho e consistencia de particula desejados. Os granulos da mistura seca sao peneirados para re- mover qualquer ρό. A essa mistura, agentes desintegrantes, anti-fricgao e/ou anti-adesivos podem ser adicionados. Finalmente1 a mistura έ comprimida em comprimidos usando uma maquina com as ρυηςδΘβ e moldes apropriados para obter ο tamanho do comprimido dese- jado. Os parametros operacionais da maquina podem ser selecionados pelo artesao versa- do na t6cnica.
Se forem desejados comprimidos revestidos, ο ηCicleo preparado acima pode ser revestido com uma solug§o concentrada de agiicar ou polimeros celul6sicos, os quais po- dem conter goma arabica, gelatina, talco, dioxido de titanio ou com uma Iaca dissolvida num solvente organico volatil ou numa mistura de solventes. A esses revestimento varios coran- tes podem ser adicionados para distinguir dentre comprimidos com diferentes compostos ativos ou com diferentes quantidades do composto ativo presente. Numa modalidade parti- cular, ο ingrediente ativo pode estar presente num ηCicleo envolto por uma ou mais cama- das, incluindo camadas de revestimento ent6ricas.
Capsulas de gelatina mole podem ser preparadas, nas quais c^psulas contem uma mistura do ingrediente ativo e oleo vegetal. Capsulas de gelatina dura podem conter granu- los do ingrediente ativo juntamente com um solido, veiculo pulverulento, tal como, por e- xemplo, lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido de batata, amido de milho, amilopectina, derivados de celulose e/ou gelatina.
Prepara?oes Iiquidas para administragao oral podem ser preparadas na forma de xaropes ou suspensdes, por exemplo, solugdes contendo um ingrediente ativo, agCicar e uma mistura de etanol, agua, glicerol e propilenoglicol. Caso desejado, tais preparagdes Iiquidas podem compreender um ou mais dentre as seguintes: agentes corantes, agentes flavorizantes e sacarina. Agentes espessantes, tal como carboximetilcelulose, tambem po- dem ser usados.
No evento que os medicamentos acima devem ser usados para administragao pa- renteral, tal formulagao pode compreender solutes de injegao aquosa estereis, solug5es de injegao nao-aquosa ou ambas, compreendendo a composigao da materia da presente in- vengao. Quando solug5es de injegao aquosa sao preparadas, a composigao da materia po- de estar presente como um sal farmaceuticamente aceitavel soliivel em agua. Preparag5es
parenterals podem conter antioxidantes, tampoes, bacteriostaticos e solutos, os quais tor- nam a formuIagao isotonica com ο sangue do receptor tencionado. Suspensdes est6reis aquosas e nao-aquosas podem compreender agentes suspensores e agentes espessantes. As formulates podem ser apresentadas em recipientes de dose Cinica ou com miiltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados. SoIuQdes e suspensQes de injegao extem- poraneas podem ser preparadas a partir de p6s, granulos e comprimidos estereis do tipo anteriormente descrito.
A composigao da materia tamb6m pode ser formulada, de modo que ela possa ser adequada para administragao t0pica (por exemplo, creme de pele). Essas formulag5es po- dem conter v^rios excipientes conhecidos pelas pessoas versadas na tecnica. Excipientes adequados podem incluir, porem nao estao limitados, a cera de 6steres cetilicos, alcool ceti- lico, cera branca, monoestearato de glicerila, propilenoglicol, monoestearato, estearato de metila, alcool benzilico, Iaurilsulfato de sodio, glicerina, oleo mineral, ^gua, carbomero, Alco- ol etilico, adesivos de acrilato, adesivos de poliisobutileno e adesivos de silicone.
Numa modalidade preferida, os fragmentos de peptideo estao revelados na Tabela 2 e apresentam um comprimento de pelo menos 4 a 23 residuos de aminoacidos de com- primento e com sequencias de aminoacidos identicas a uma sequencia de aminoacidos do peptideo MANS, em que ο amino^cido N-terminal dos peptideos e selecionado da posigao 2 a 21 da sequencia de peptideo MANS (SEQ ID NO: 1). O comprimento do fragmento de peptideo mais preferido e de pelo menos 6 aminoacidos ate 23 aminoacidos. Preferivelmen- te, esses peptideos sao acilados no amino^cido alfa-N-terminal, e mais preferivelmente es- ses peptideos sao miristoilados na posi^ao de aminoacido alfa-N-terminal.
Tabela 2.
No. do peptideo Sequencia SEQ ID NO: peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 3 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 5 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 8 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 12 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 17 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 23 peptideo AQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 30 peptideo AQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 38 peptideo AQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 47 peptideo AQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 57 peptideo AQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 68 peptideo AQFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 80 peptideo AQFSKTAAKGE SEQ ID NO: 93 peptideo AQFSKTAAKG SEQ ID NO: 107 peptideo AQFSKTAAK SEQ ID NO: 122 peptideo AQFSKTAA SEQ ID NO: 138 peptideo AQFSKTA SEQ ID NO: 155 peptideo AQFSKT SEQ ID NO: 173 peptideo AQFSK SEQ ID NO: 192 peptideo AQFS SEQ ID NO: 212 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 6 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 9 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 13 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 18 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 24 peptideo QFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 31 peptideo QFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 39 peptideo QFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 48 peptideo QFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 58 peptideo QFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 69 peptideo QFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 81 peptideo QFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 94 peptideo QFSKTAAKGE SEQ ID NO: 108 peptideo QFSKTAAKG SEQ ID NO: 123 peptideo QFSKTAAK SEQ ID NO: 139 peptideo QFSKTAA SEQ ID NO: 156 peptideo QFSKTA SEQ ID NO: 174 peptideo QFSKT SEQ ID NO: 193 peptideo QFSK SEQ ID NO: 213 peptideo 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 10 peptideo 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 14 peptideo 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 19 peptideo 25 FSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 25 peptideo 32 FSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 32 peptideo 40 FSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 40 peptideo 49 FSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 49 peptideo 59 FSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 59 peptideo 70 FSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 70 peptideo 82 FSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 82 peptideo 95 FSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 95 peptideo 109 FSKTAAKGEA SEQ ID NO: 109 peptideo 124 FSKTAAKGE SEQ ID NO: 124 peptide。 140 FSKTAAKG SEQ ID NO: 140 peptideo 157 FSKTAAK SEQ ID NO: 157 peptideo 175 FSKTAA SEQ ID NO: 175 peptideo 194 FSKTA SEQ ID NO: 194 peptideo 214 FSKT SEQ ID NO: 214 peptideo 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 15 peptideo 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 20 peptideo 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 26 peptideo 33 SKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 33 peptideo 41 SKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 41 peptideo 50 SKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 50 peptideo 60 SKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 60 peptideo 71 SKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 71 peptideo 83 SKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 83 peptideo 96 SKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 96 peptideo 110 SKTAAKGEAA SEQ ID NO: 110 peptideo 125 SKTAAKGEA SEQ ID NO: 125 peptideo 141 SKTAAKGE SEQ ID NO: 141 peptideo 158 SKTAAKG SEQ ID NO: 158 peptideo 176 SKTAAK SEQ ID NO: 176 peptideo 195 SKTAA SEQ ID NO: 195 peptideo 215 SKTA SEQ ID NO: 215 peptideo 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 21 peptideo 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 27 peptideo 34 KTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 34 peptideo 42 KTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 42 peptideo 51 KTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 51 peptideo 61 KTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 61 peptideo 72 KTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 72 peptideo 84 KTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 84 peptideo 97 KTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 97 peptideo 111 KTAAKGEAAA SEQ ID NO: 111 peptideo 126 KTAAKGEAA SEQ ID NO: 126 peptideo 142 KTAAKGEA SEQ ID NO: 142 peptideo 159 KTAAKGE SEQ ID NO: 159 peptideo 177 KTAAKG SEQ ID NO: 177 peptideo 196 KTAAK SEQ ID NO: 196 peptideo 216 KTAA SEQ ID NO: 216 peptideo 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 28 peptideo 35 TAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 35 peptideo 43 TAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 43 peptideo 52 TAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 52 peptideo 62 TAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 62 peptideo 73 TAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 73 peptideo 85 TAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 85 peptideo 98 TAAKGEAAAER SEQ ID NO: 98 peptideo 112 TAAKGEAAAE SEQ ID NO: 112 peptideo 127 TAAKGEAAA SEQ ID NO: 127 peptideo 143 TAAKGEAA SEQ ID NO: 143 peptideo 160 TAAKGEA SEQ ID NO: 160 peptideo 178 TAAKGE SEQ ID NO： 178 peptideo 197 TAAKG SEQ ID NO: 197 peptideo 217 TAAK SEQ ID NO: 217 peptideo 36 AAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 36 peptideo 44 AAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 44 peptideo 53 AAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 53 peptideo 63 AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 63 peptideo 74 AAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 74 peptideo 86 AAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 86 peptideo 99 AAKGEAAAERP SEQ ID NO: 99 peptideo 113 AAKGEAAAER SEQ ID NO: 113 peptideo 128 AAKGEAAAE SEQ ID NO: 128 peptideo 144 AAKGEAAA SEQ ID NO: 144 peptideo 161 AAKGEAA SEQ ID NO: 161 peptideo 179 AAKGEA SEQ ID NO: 179 peptideo 198 AAKGE SEQ ID NO: 198 peptideo 218 AAKG SEQ ID NO: 218 peptideo 45 AKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 45 peptideo 54 AKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 54 peptideo 64 AKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 64 peptideo 75 AKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 75 peptideo 87 AKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 87 peptideo 100 AKGEAAAERPG SEQ ID NO: 100 peptideo 114 AKGEAAAERP SEQ ID NO: 114 peptideo 129 AKGEAAAER SEQ ID NO: 129 peptideo 145 AKGEAAAE SEQ ID NO: 145 peptideo 162 AKGEAAA SEQ ID NO: 162 peptideo 180 AKGEAA SEQ ID NO: 180 peptideo 199 AKGEA SEQ ID NO: 199 peptideo 219 AKGE SEQ ID NO: 219 peptideo 55 KGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 55 peptideo 65 KGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 65 peptideo 76 KGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 76 peptideo 88 KGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 88 peptideo 101 KGEAAAERPGE SEQ ID NO: 101 peptideo 115 KGEAAAERPG SEQ ID NO: 115 peptideo 130 KGEAAAERP SEQ ID NO: 130 peptideo 146 KGEAAAER SEQ ID NO: 146 peptideo 163 KGEAAAE SEQ ID NO: 163 peptideo 181 KGEAAA SEQ ID NO: 181 peptideo 200 KGEAA SEQ ID NO: 200 peptideo 220 KGEA SEQ ID NO: 220 peptideo 66 GEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 66 peptideo 77 GEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 77 peptideo 89 GEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 89 peptideo 102 GEAAAERPGEA SEQ ID NO: 102 peptideo 116 GEAAAERPGE SEQ ID NO: 116 peptideo 131 GEAAAERPG SEQ ID NO: 131 peptideo 147 GEAAAERP SEQ ID NO: 147 peptideo 164 GEAAAER SEQ ID NO: 164 peptideo 182 GEAAAE SEQ ID NO: 182 peptideo 201 GEAAA SEQ ID NO: 201 peptideo 221 GEAA SEQ ID NO: 221 peptideo 78 EAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 78 peptideo 90 EAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 90 peptideo 103 EAAAERPGEAA SEQ ID NO: 103 peptideo 117 EAAAERPGEA SEQ ID NO: 117 peptideo 132 EAAAERPGE SEQ ID NO: 132 peptideo 148 EAAAERPG SEQ ID NO: 148 peptideo 165 EAAAERP SEQ ID NO: 165 peptideo 183 EAAAER SEQ ID NO: 183 peptideo 202 EAAAE SEQ ID NO: 202 peptideo 222 EAAA SEQ ID NO: 222 peptideo 91 AAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 91 peptideo 104 AAAERPGEAAV SEQ ID NO: 104 peptideo 118 AAAERPGEAA SEQ ID NO: 118 peptideo 133 AAAERPGEA SEQ ID NO: 133 peptideo 149 AAAERPGE SEQ ID NO: 149 peptideo 166 AAAERPG SEQ ID NO: 166 peptideo 184 AAAERP SEQ ID NO: 184 peptideo 203 AAAER SEQ ID NO: 203 peptideo 223 AAAE SEQ ID NO: 223 peptideo 105 AAERPGEAAVA SEQ ID NO: 105 peptideo 119 AAERPGEAAV SEQ ID NO: 119 peptideo 134 AAERPGEAA SEQ ID NO: 134 peptideo 150 AAERPGEA SEQ ID NO: 150 peptideo 167 AAERPGE SEQ ID NO: 167 peptideo 185 AAERPG SEQ ID NO: 185 peptideo 204 AAERP SEQ ID NO: 204 peptideo 224 AAER SEQ ID NO: 224 peptideo 120 AERPGEAAVA SEQ ID NO: 120 peptideo 135 AERPGEAAV SEQ ID NO: 135 peptideo 151 AERPGEAA SEQ ID NO: 151 peptideo 168 AERPGEA SEQ ID NO: 168 peptideo 186 AERPGE SEQ ID NO: 186 peptideo 205 AERPG SEQ ID NO: 205 peptideo 225 AERP SEQ ID NO: 225 peptideo 136 ERPGEAAVA SEQ ID NO: 136 peptideo 152 ERPGEAAV SEQ ID NO: 152 peptideo 169 ERPGEAA SEQ ID NO: 169 peptideo 187 ERPGEA SEQ ID NO: 187 peptideo 206 ERPGE SEQ ID NO: 206 peptideo 226 ERPG SEQ ID NO: 226 peptideo 153 RPGEAAVA SEQ ID NO: 153 peptideo 170 RPGEAAV SEQ ID NO: 170 peptideo 188 RPGEAA SEQ ID NO: 188 peptideo 207 RPGEA SEQ ID NO: 207 peptídeo 227 RPGE SEQ ID NO: 227 peptídeo 171 PGEAAVA SEQ ID NO: 171 peptídeo 189 PGEAAV SEQ ID NO: 189 peptídeo 208 PGEAA SEQ ID NO: 208 peptídeo 228 PGEA SEQ ID NO: 228 peptídeo 190 GEAAVA SEQ ID NO: 190 peptídeo 209 GEAAV SEQ ID NO: 209 peptídeo 229 GEAA SEQ ID NO: 229 peptídeo 210 EAAVA SEQ ID NO: 210 peptídeo 230 EAAV SEQ ID NO: 230 peptídeo 231 AAVA SEQ ID NO: 231
Conforme ilustrado na FIG. 5, MARCKS foi fosforilado por PKC e consequentemen- te translocado da membrana para o citoplasma. Aqui, parece que PKG induziu a desfosfori- lação de MARCKS (FIG. 2A, raia 4, e FIG. 2B). Essa desfosforilação foi revertida pelo inibi- dor de PKG Rp-8-Br-PET-cGMP (FIG. 2A, raia 5), indicando que a desfosforilação foi depen- dente de PKG. Na FIG. 2, as células NHBE foram marcadas com [32P]ortofosfato e, a seguir, expostas aos reagentes indicados. A fosforilação de MARCKS em resposta aos tratamentos foi avaliada pelo ensaio de imunossupressão. Na FIG 2A, 8-Br-cGMP reverteu a fosforilação MARCKS induzida por PMA, e esse efeito de 8-Br-cGMP pôde ser bloqueado por Rp-8-Br- PET-cGMP (inibidor PKG) ou ácido ocadáico(inibidor PP1/2A). Para a FIG. 2B, a fosforila- ção induzida por PMA de MARCKS foi revertida pela subsequente exposição das células ao 8-Br-cGMP. Raia 1, somente meio por 8 min; raia 2, PMA 100 nM por 3 min; raia 3, PMA 100 nM ou 3 min e, a seguir, com 8-Br-cGMP 1 μΜ por 5 min; raia 4, PMA 100 nM por 8 min; raia 5, somente meio por 3 min e, a seguir, PMA 100 nM + 8-Br-cGMP 1 μΜ por 5 min. Na FIG. 2C, a desfosforilação da MARCKS induzida por 8-Br-cGMP foi atenuada por fostriecina de um modo dependente de concentração.
Acredita-se que PKG atue para desfosforilar MARCKS via ativação de uma proteína fosfatase. Conforme ilustrado na FIG. 2A (raia 6), ácido ocadáico a 500 nM, uma concentra- ção que poderia inibir tanto PP1 quanto PP2A, bloqueou a desfosforilação induzida por da MARCKS, sugerindo que PKG causou a desfosforilação pela ativação de PP1 e/ou PP2A. Estudos adicionais com fostriecina e o ensaio direto das atividades da fosfatase indicaram que somente PP2A foi ativada por PKG e foi responsável pela remoção dos grupos fosfato da MARCKS (FIG. 2C). É provável que ou ácido ocadáico ou fostriecina, nas concentrações que inibiram a desfosforilação induzida por PKG da MARCKS atenuou a secreção de muci- na induzida por PMA + 8-Br-cGMP ou UTP conforme exibido na FIG. 3. FIG. 3 ajuda a de- monstram que PP2A é um componente essencial da via secretória de mucina. Células NHBE foram pré-incubadas com a concentração indicada de fostriecina, ácido ocadáico (500 nM) ou meio sozinho por 15 min e, a seguir, estimuladas com PMA (100 nM) + 8-Br- cGMP (1 μΜ) por 15 min ou com UTP (100 μΜ) por 2 h. A mucina secretada foi medida por ELISA. Os dados estão apresentados como média ± S.E. (n = 6 em cada ponto) em que * quer dizer significativamente diferente do controle médio (p < 0,05); t quer dizer significati- vãmente diferente de estimulação com PMA + 8-Br-cGMP (p < 0,05); e t quer dizer signifi- cativamente diferente de estimulação por UTP (p < 005). Deste modo, a desfosforilação de MARCKS por PP2A ativada por PKG aparenta ser um componente essencial da via de sina- lização levando à exocitose dos grânulos de mucina.
Para revelar os eventos moleculares pelos quais MARCKS liga a ativação da qui- nase com a secreção de mucina, a fosforilação de MARCKS em resposta à ativação de PKC/PKG foi investigada a fundo. Conforme ilustrado na FIG. 1A, PMA (100 nM) provavel- mente induziu um aumento significativo (3 a 4 vezes) na fosforilação de MARCKS em célu- las NHBE, e essa fosforilação foi atenuada pelo inibidor de PKC calfostina C (500 nM). Uma vez fosforilada, a MARCKS foi translocada da membrana plasmática para o citoplasma (FIG. 1B). Mais especificamente, a FIG. 1A mostra que a ativação de PKC resulta na fosforilação da MARCKS nas células NHBE. As células foram marcadas com [32P]ortofosfato por 2 h e, a seguir, expostas aos reagentes estimulatórios e/ou inibitórios. Fosforilação de MARCKS em resposta aos tratamentos foi avaliada por imunoprecipitação, conforme descrito. Raia 1, con- trole de meio; raia 2 o veículo, Me 0,1%.sub.2SO; raia 3, 4<x-PMA 100 nM; raia 4, PMA 100 nM; raia 5, PMA 100 nM + calfostina C 500 nM; raia 6, calfostina C 500 nM. FIG. 1B de- monstra que a MARCKS fosforilada é translocada da membrana plasmática para o cito- plasma. As células marcadas com 32P foram expostas ao PMA (100 nM) ou somente meio por 5 min, e a seguir as frações de membrana e do citosol foram isoladas. A ativação de PKG por 8-Br-cGMP (1 μΜ, outro evento de ativação da quinase necessário para provocar secreção de mucina, não levou à fosforilação de MARCKS, porém de fato o efeito oposto foi observado: fosforilação da MARCKS induzida por PMA foi revertida por 8-Br-Cgmp (FIG. 2A). Esse efeito de 8-Br-cGMP não foi devido à supressão da atividade PKC, uma vez que a fosforilação induzida por PMA poderia ser revertida pela subsequente adição de 8-Br-cGMP para as células (FIG. 2B). Consequentemente, a ativação por PKG provavelmente resulta na desfosforilação da MARCKS.
Investigações adicionais demonstraram que a desfosforilação de MARCKS induzida por PKG foi bloqueada por ácido ocadáico 500 nM, um inibidor da proteína fosfatase (tipo 1 e/ou 2A (PP1/2A)) (FIG. 2A, raia 6). Deste modo, parece que a desfosforilação foi mediada por PP1 e/ou PP2A. Para definir o subtipo da proteína fosfatase envolvida, um novo e mais específico inibidor de PP2A, fostriecina (IC50 = 3,2 nM) foi utilizado em estudos de fosforila- ção adicionais.
Conforme ilustrado na FIG. 2C, a fostriecina inibiu a desfosforilação da MARCKS induzida por PKG de um modo dependente de concentração (1 a 500 nM), sugerindo que PKG induziu a desfosforilação através da ativação de PP2A. Para confirmar a ativação adi- cional de PP2A por PKG nas células NHBE1 as atividades de PP1 e de PP2A citosólicas foram determinadas após a exposição das células ao 8-Br-cGMP. A atividade de PP2A foi aumentada em aproximadamente 3 vezes (de 0,1 para 0,3 nmol/min/MG de proteínas, ρ < 0,01) em concentrações de 8-Br-cGMP tão baixas quanto 0,1 .mu.M, enquanto que a ativi- dade de PP1 permaneceu inalterada. Esses dados indicam que PP2A pode ser ativado por PKG e é responsável pela desfosforilação da MARCKS. Concordantemente, essa atividade PP2A aparentou ser crítica para que ocorresse a secreção de mucina; quando a desfosfori- lação da MARCKS induzida por PKG foi bloqueada pelo ácido ocadáico ou fostriecina, a resposta secretória à ativação de PKC/PKG ou estimulação UTP foi melhorada (FIG. 3).
MARCKS se associa com actina e miosina no citoplasma
FIG. 4 demonstra um ensaio de imunoprecipitação radiomarcado, o qual revela que MARCKS pode se associar com duas outras proteínas (cerca de 200 e cerca de 40 KDa) no citoplasma. Na FIG. 4, as células NHBE foram marcadas com [3HJIeucina e [3H]prolina de um dia para o outro, e a membrana e as frações do citosol foram preparadas conforme des- crito em "Experimental Procedures". As frações isoladas foram pré-clareadas com o anticor- po de controle não-imune (6F6). O citosol foi ,a seguir, dividido igualmente em duas frações e usado para executar a imunoprecipitação na presença de 10 μΜ de citocalasina D (Bio- mol, Plymouth Meeting, Pa.) com o anticorpo anti-MARCKS 2F12 (raia 2) e o anticorpo de controle não-imune 6F6 (raia 3), respectivamente. A proteína MARCKS na fração da mem- brana também foi avaliada por imunoprecipitação usando o anticorpo 2F12 (raia 1). O com- plexo protéico precipitado foi separado por eletroforese em gel SDS 8%-poliacrilamida e visualizado por autorradiografia melhorada. Parece que MARCKS se associou com duas proteínas citoplasmáticas com massas moleculares de cerca de 200 e de cerca de 40 KDa, respectivamente. Essas duas proteínas associadas com MARCKS foram cortadas do gel e analisadas por ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz/espectrometria de mas- sa por tempo de vôo/sequenciamento interno (the Protein/DNA Technology Center of Rocke- feller University, Ν. Y.). A massa do peptídeo obtida e os dados de seqüência foram usados para buscar banco de dados de proteínas através dos programas da internet ProFound e MS-Fit. Os resultados indicam que elas são miosina (cadeia pesada, não-músculo tipo A) e actina, respectivamente. Análise por ionização por dessorção a laser auxiliada por ma- triz/espectrometria de massa por tempo de vôo/sequenciamento interno indica que essas duas proteínas associadas à MARCKS eram miosina (cadeia pesada, não-músculo tipo A) e actina, respectivamente.
Esses estudos sugerem um novo paradigma para o mecanismo de sinalização que controla a secreção exocitótia do grânulos de mucina das vias aéreas, assim como propor- ciona o que se acredita ser a primeira evidência direta e uma função biologia específica da MARCKS num processo fisiológico. MARCKS serve como uma molécula mediadora chave que regula a liberação dos grânulos de mucina nas células epiteliais das vias aéreas huma- nas. Acredita-se que eliciação da secreção de mucina das vias aéreas requeira uma dupla ativação e ações sinergísticas de PKC e de PKG. PKC ativado fosforila MARCKS1 resultan- do na transloação de MARCSL da superfície interna da membrana plasmática para dentro do citoplasma. A ativação de PKG, por sua vez, ativa PP2A, o qual desfosforila MARCKS no citoplasma. Devido ao fato da capacidade de associação da membrana da MARCKS ser dependente do seu estado de fosforilação, essa desfosforilação pode permitir que a MARCKS recupere a sua capacidade de ligação à membrana e Poe permitir que MARCKS se ligue às membranas dos grânulos de mucina citoplasmáticos. Também pela interação com actina e miosina no citoplasma (FIG. 4), MARCKS pode, então ser capaz de amarrar os grânulos no aparelho contrátil celular, mediando o movimento dos grânulos para a periferia celular e a subsequente liberação exocitótica. A ampla distribuição da MARCKS sugere a possibilidade de que este ou um mecanismo similar possa regular a secreção dos grânulos ligados à membrana em vários tipos celulares sob condições normais ou patológicas.
Conforme indicado na FIG. 5, MARCKS pode funcionar como um Iigante molecular pela interação com membranas de grânulos no seu domínio N-terminal e ligação com fila- mentos de actina em seu sítio PSD, amarrando dessa forma os grânulos ao citoesqueleto contrátil para movimento e exocitose. FIG. 5 mostra um mecanismo possível demonstrando que o secretagogo de mucina interage com células epiteliais das vias aéreas (caliciformes) e ativa duas proteína quinases separadas, PKC e PKG. PKC ativado fosforila MARCKS, cau- sando a translocação de MARCKS da membrana plasmática para o citoplasma, enquanto que PKG, ativado através da via óxido nítrico (NO) GC-S cGMP PKG, por sua vez, ativa PP2A citoplasmática, a qual desfosforila MARCKS. Essa desfosforilação estabiliza a ligação da MARCKS às membranas dos grânulos. Além disso, MARCKS também interage com actina e miosina, ligando deste modo os grânulos à maquinaria contrátil celular para o subsequente movimento e liberação exocitótica dos mediadores inflamatórios, tais como MPO. A ligação da MARCKS aos grânulos depois de eles serem liberados no citoplasma também pode ser guiada por proteínas de alvejamento específicas ou algumas outras for- mas de interações proteína-proteína, nas quais o domínio N-terminal de MARCKS está en- volvido. Em qualquer caso, o peptídeo MANS, ou um fragmento ativo seu, compreendendo pelo menos 4 aminoácidos, poderia agir para inibir competitivamente o alvejamento da MARCKS nas membranas dos grânulos de mucina, bloqueando deste modo a secreção. A invenção também se refere a um ovo método de bloqueio de qualquer processo
secretório exocitótico celular, especialmente aqueles liberando mediadores inflamatórios a partir de grânulos contidos nas células inflamatórias, cujas vias estimulatórias envolvem a proteína quinase C (PKC) proteína MARCKS substrato e a liberação dos conteúdos das ve- sículas ligadas à membrana. Especificamente, os inventores demonstraram que a liberação estimulada da mieloperoxidase mediadora inflamatória dos neutrófilos humanos (FIG. 6) ou caninos (FIG. 7) pode ser bloqueada de um modo dependente de concentração pelo peptí- deo MANS. Especificamente, FIG. 6 mostra neutrófilos isolados que foram estimulados a secretar mieloperoxidase (MPO) com PMA 100 nM e 10 um.M 8-Br-cGMP. Peptídeo MANS 100 μΜ reduziu a secreção de MPO até os níveis do controle (* = ρ < 0,05) MANS 10 μΜ causa um leve decréscimo na secreção de MPO. 10 ou 100 μΜ de um peptídeo controle (RNS) não em efeito na secreção de MPO. Na FIG. 7, os neutrófilos isolados foram estimu- lados a secretar mieloperoxidase (MPO) com 100 nM de PMA e 10 μΜ de 8-Br-cGMP. 100 μΜ de peptídeo MANS reduziu a secreção de MPO até níveis de controle (* ρ < 0,05). 10 μΜ MANS causa um leve decréscimo na secreção de MPO. 10 ou 100 μΜ de um peptídeo con- trole (RNS) não tem efeito na secreção de MPO. Deste modo, o peptídeo pode ser usado terapeuticamente para bloquear a liberação dos mediadores de inflamação secretados a partir da infiltração das células inflamatórias em quaisquer tecidos. Muitos desses mediado- res liberados são responsáveis pelo extensivo dano tecidual observado numa variedade de doenças inflamatórias crônicas (isto é, doenças respiratórias tais como asma, bronquite crô- nica e DPOC, doenças do intestino inflamatórias incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, doenças autoimunes, doenças de pele tais como rosácea, eczema; e acne severa, síndromes artríticas e de dor tais como artrite reumatóide e fibromialgia). Essa invenção po- de ser útil para tratar doenças tais como artrite, bronquite crônica, DPOC e fibrose cística. Essa invenção é concordantemente útil para o tratamento tanto em doenças humanas quan- to de animais, especialmente aquelas afetando eqüinos, caninos, felinos e outros animais de estimação.
FIGS. 8-12 mostram a secreção de MPO tanto de humanos quanto de caninos.
Em todos esses experimentos, os neutrófilos isolados foram estimulados com LPS numa concentração de 1 χ 10"6 M por 10 minutos a 37 0C. Antes de adicionar o estímulo, conforme indicado nas figuras. O LPS inicia as células, de modo que elas possam responder a um secretagogo.
Numa modalidade, essa invenção revela um método de regulagem de uma inflama-
ção num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo MANS ou um frag- mento ativo seu. Num aspecto dessa modalidade, o referido fragmento ativo da proteína MANS compreende pelo menos quatro e preferivelmente seis aminoácidos. Em outro aspec- to, a referida inflamação é causada por doenças respiratórias, doenças do intestino, doen- ças de pele, doenças autoimunes e síndromes de dor. Em outro aspecto, as referidas doen- ças respiratórias são selecionadas do grupo consistindo de asma, bronquite crônica e DPOC. Em outro aspecto, as referidas doenças do intestino são selecionadas do grupo con- sistindo de colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino irritável. Em outro as- pecto, as referidas doenças de pele são selecionadas do grupo consistindo de rosácea, ec- zema, psoríase e acne severa. Em outro aspecto, a referida inflamação é causada por artrite ou fibrose cística. Em outro aspecto, o referido indivíduo é um mamífero. Adicionalmente, em outro aspecto, o referido mamífero é selecionado do grupo consistindo de humanos, ca- ninos, eqüinos e felinos. Em outro aspecto, o referido passo de administração é selecionado do grupo consistindo de administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmonar, administração nasal, inalação e administração oral. Em outro as- pecto, a referida administração pulmonar é selecionada do grupo de aerossol, inalador de pó seco, inalador de dose medida e nebulizador.
Em outra modalidade, essa invenção revela um método para regular um processo secretório celular num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto compreendendo um peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu, que regula um mediador inflamatório num indivíduo. Num aspecto dessa modalidade, o referido fragmento ativo da proteína MANS compreende pelo menos quatro, e preferivelmente seis aminoáci- dos. Em outro aspecto, a referida regulagem de um processo secretório celular é o bloqueio ou a redução de um processo secretório celular. Em outro aspecto, o referido mediador in- flamatório é causado por doenças respiratórias, doenças do intestino, doenças de pele, do- enças autoimunes e síndromes de dor. Em outro aspecto, as referidas doenças respiratórias são selecionadas do grupo consistindo de asma, bronquite crônica e DPOC. Em outro as- pecto, as referidas doenças do intestino são selecionadas do grupo consistindo de colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino irritável. Em outro aspecto, as referidas doenças de pele são selecionadas do grupo consistindo de rosácea, eczema, psoríase e acne severa. Em outro aspecto, o referido mediador inflamatório é causado por artrite ou fibrose cística. Em outro aspecto, o referido indivíduo é um mamífero. Em outro aspecto, o referido mamífero é selecionado do grupo consistindo de humanos, caninos, eqüinos e feli- nos. Em outro aspecto, o referido passo de administração é selecionado do grupo consistin- do de administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmonar, administração nasal, inalação e administração oral. Em outro aspecto, a referida administração pulmonar é selecionada do grupo de aerossol, inalador de pó seco, inalador de dose medida e nebulizador.
Em outra modalidade, essa invenção revela um método de redução da inflamação num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS de mediadores inflamató- rios, por meio do que a liberação de mediadores inflamatórios no indivíduo é reduzida em comparação com aquela a qual poderia ocorrer na ausência do referido tratamento. Num aspecto dessa modalidade, o referido composto é pelo menos um fragmento ativo de uma proteína MARCKS. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo é pelo menos quatro e pre- ferivelmente seis aminoácidos de comprimento. Em outro aspecto, o referido composto é um peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu. Em outro aspecto, o referido composto é um oligonucleotídeo anti-sentido direcionado contra a seqüência codificadora de uma proteína MARCKS ou um fragmento ativo seu. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo é pelo menos quatro e preferivelmente seis aminoácidos de comprimento.
Em outra modalidade, essa invenção revela um método de redução da inflamação num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmaceuticamente ativa compreendendo um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS dos mediadores inflamatórios, por meio do que a infla- mação no indivíduo é reduzida em comparação com aquela a qual poderia ocorrer na au- sência do referido tratamento. Num aspecto dessa modalidade, o referido composto é um fragmento ativo de uma proteína MARCKS. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem pelo menos quatro e preferivelmente seis aminoácidos de comprimento. Em outro as- pecto, o referido composto é um peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu. Em outro as- pecto, o referido composto é um oligonucleotídeo antissentido direcionado contra a seqüên- cia codificadora de uma proteína MARCKS ou um fragmento ativo seu. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem pelo menos quatro e preferivelmente seis aminoácidos de com- primento. A presente invenção é tencionada a englobar uma composição que contém um ou mais do peptídeo MANS ou de seus fragmentos ativos e o seu uso no tratamento de inibição da liberação de mediadores inflamatórios a partir de grânulos ou vesículas de células infla- matórias.
Em outra modalidade, essa invenção revela um método de redução ou inibição da
inflamação num indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de pelo menos um peptídeo compreendendo peptídeo MANS ou um fragmento ativo seu eficaz para inibir ou suprimir a liberação de um mediador inflamatório no sítio de inflamação. Num aspecto dessa modalidade, o referido fragmento ativo tem pelo menos quatro e preferivelmente pelo menos seis aminoácidos de comprimento. Em outro aspecto, os referidos mediadores inflamatórios são produzidos pelas células selecionadas a partir do grupo consistindo de neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos e leucócitos. Preferivel- mente as células são leucócitos, mais preferivelmente granulócitos, e ainda mais preferivel- mente neutrófilos, basófilos, eosinófilos ou uma combinação desses. Em outro aspecto, o agente é administrado oralmente, parenteralmente, cavitalmente, retalmente ou através de uma passagem de ar. Em outro aspecto, a referida composição ainda compreende uma se- gunda molécula selecionada do grupo consistindo de um antibiótico, de um composto antivi- ral, de um composto antiparasítico, de um composto antiinflamatório e de um imunossupres- sor.
Um fragmento ativo de um peptídeo MANS pode ser selecionado do grupo consis- tindo dos peptídeos revelados na Tabela 1. Conforme aqui revelado, esses peptídeos po- dem conter outras porções químicas no aminoácido N-terminal e/ou C-terminal.
Em outro aspecto dessa invenção, os métodos revelados nessa invenção podem ser efetuados pelo uso de ou administração de combinações dos peptídeos revelados na invenção na Tabela 1, isto é, pelo uso de ou administração de um ou mais desses peptí- deos. Preferivelmente, um único peptídeo é usado ou administrado nos métodos aqui reve- lados.
Em resposta à ativação da proteína quinase C (PKC) por um estimulador da infla- mação, a desgranulação numa célula selecionada do grupo consistindo de neutrófilos, eosi- nófilos, monócitos/macrófagos e linfócitos pode ser atenuada pela pré-incubação e pela co- incubação com um peptídeo idêntico à região N-terminal da proteína MARCKS, em que o peptídeo é selecionado do grupo de fragmentos de peptídeo MANS conforme revelado na Tabela 1.
Embora o progresso de tempo e as concentrações possam variar entre os tipos ce- lulares, em todos os casos o peptídeo MANS atenua a desgranulação induzida por PKC.
Tendo agora descrito a invenção, a mesma será ilustrada com referência a certos exemplos, os quais são aqui incluídos somente com propósitos de ilustração, e os quais não são tencionados a serem Iimitantes da invenção.
EXEMPLOS
Métodos e materiais
Ensaio de imunoprecipitação radiomarcado Ao marcar com [32P]fosfato, as células foram pré-incubadas por 2 h em meio Eagle modificado da Dulbecco sem fosfato contendo albumina de soro bovino 0,2% e, a seguir, marcadas com [32P]ortofosfato 0,1 mCi/mL (9000 Ci/mmol, PerkinEImer Life Sciences) por 2 h. Para marcação com ácido [3H]mirístico ou 3H- aminoácidos, as células foram incubadas de um dia para o outro em meio contendo ácido [3HJmiristico 50 μα/ιτιί (49 Ci/mmol, PerkinEImer Life Sciences) ou [3H]leucina 0,2 mCi/mL (159 Ci/mmol, PerkinEImer Life Sciences) mais [3H]prolina 0,4 mCi/mL (100 Ci/mmol, Perki- nElmer Life Sciences). Após a marcação, as células foram expostas aos reagentes estimula- tórios por 5 min. Quando um inibidor foi usado, as células foram pré-incubadas com o inibi- dor por 15 min antes da estimulação. No final dos tratamentos, as células foram Iisadas num tampão contendo Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, glicerol 10%, Noni- det P-40 1%, fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, benzamidina 1 mM, pepstatina A 10 μg/mL e Ieupeptina 10 μg/mL. A precipitação com ácido tricloroacético e a contagem por cintilação podem determinar a eficiência da radiomarcação em cada cultura. A imunoprecipitação da proteína MARCKS foi efetuada de acordo com o método de Spizz e Blackshear usando Iisa- tos celulares contendo contagens iguais/min. Spizz et al., J. Biol. Chem. 271, 553- 562 (1996). As proteínas precipitadas foram separadas por eletroforese em gel de SDS 8%- poliacrilamida e visualizadas por autorradiografia. Anticorpo MARCKS anti-humano (2F12) e anticorpo de controle não-imune (6F6) foram usados nesse ensaio.
Para avaliar MARCKS ou os complexos de proteína associados com MARCKS em diferentes frações subcelulares, as células radiomarcadas e tratadas foram raspadas num tampão de homogeneização (Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), NaCI 10 mM, EDTA 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, benzamidina 1 mM, pepstatina A 10 μg/mL, Ieupeptina 10 Mg/mL) e, a seguir, rompidas por cavitação (562.456 Kg/m2) (800 libras/polegada quadrada) por 20 min a 4 0C. Os Iisatos celulares foram centrifugados a 600 χ g por 10 min a 4 0C para remover os núcleos e células não-quebradas. Os sobrenadantes pós-nucleares foram sepa- rados em frações de membrana e citosol por ultracentrifugação a 400.000 χ g por 30 min a 4 0C. O pélete da membrana foi solubilizado no tampão de Iise por ultra-som. A imunoprecipi- tação foi, a seguir, executada conforme descrito acima.
Peptídeos relacionados com MARCKS - Tanto a seqüência N-terminal miristoilada (MANS) quanto os peptídeos da seqüência N-terminal aleatórios (RNS) foram sintetizados em Genemed Synthesis, Inc. (San Francisco, Calif.), a seguir purificados por cromatografia líquida de alta pressão (> de 95% de pureza), e confirmados por espectroscopia de massa com cada um apresentando um único pico com uma massa molecular apropriada. O peptí- deo MANS consistiu da seqüência idêntica aos primeiros 24 aminoácidos de MARCKS, isto é, a região N-terminal miristoilada que medeia a inserção de MARCKS nas membranas, MA- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1) (onde MA é uma cadeia miristoil N- terminal). O peptídeo de controle correspondente (RNS) continha a mesma composição de aminoácido que MANS, porém disposta numa ordem aleatória, GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 232). A presença da porção de miristato hidrofóbica nesses peptídeos sintéticos intensifica a permeabilidade às membranas plasmá- ticas, permitindo que os peptídeos sejam absorvidos prontamente pelas células. Para de- terminar os efeitos desses peptídeos na secreção de mucina, as células foram pré- incubadas com os peptídeos por 15 min antes da adição de secretagogos, e a secreção de mucina foi, a seguir, medida por ELISA.
Oligonucleotídeos antissentido - Oligonucleotídeo MARCKS anti-sentido e seu oli- gonucleotídeo de controle correspondente foram sintetizados em Biognostik GmbH (Gottin- gen, Alemanha). Células NHBE foram tratadas com 5 μΜ de oligonucleotídeo antissentido ou controle apicalmente por 3 dias (na presença de 2 μg/mL de Iipofectina pelas primeiras 24 h). As células fora, a seguir, incubadas com secretagogos, e a secreção de mucina foi medida por ELISA. RNA e proteína total foram isolados a partir das células tratadas. RNAm de MARCKS foi avaliado por hibridização Northern de acordo com os procedimentos con- vencionais usando DNAc de MARCKS humana como sonda. O nível de proteína MARCKS foi determinado por Western blot usando IgGI anti-MARCKS purificada (clone 2F12) como o anticorpo de detecção primário.
Transfecção transiente - O domínio do sítio de fosforilação (PSD) de MARCKS con-
tém os sítios de fosforilação dependente de PKC e o sítio de ligação ao filamento de actina. Para construir um DNAc MARCKS anulado de PSD, dois fragmentos flanqueando a se- qüência PSD (codificando para 25 aminoácidos) foram gerados pela reação em cadeia da polimerase e, a seguir, ligados através do sítio Xhol que foi ligado ás extremidades 5' dos iniciadores de oligonucleotídeo projetados para a reação em cadeia da polimerase. O DNAc mutante resultante e o DNAc MARCKS do tipo selvagem foram cada um inseridos num vetor de expressão de mamífero pcDNA4/TO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Os constructos recom- binantes isolados foram confirmados pelos digestos de restrição e sequenciamento de DNA.
HBE1 é uma linhagem celular epitelial bronquial humana transformada pelo vírus papiloma capaz de secretar mucina quando cultivada numa interface ar/líquido. A transfec- ção das células HBE1 foi efetuada usando o reagente de transfecção Effectene (Qiagen, Valencia, Calif.) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HBE1 diferenciadas crescidas na interface ar/líquido foram dissociadas por tripsina/EDTA e ressemeadas em placas de cultura com 12 poços a 1 χ 105 células/cm2. Depois da incuba- ção de um dia para o outro, as células foram transfectadas com DNAc MARCKS tipo selva- gem, os cDNAs MARCKS cortados ou DNA de vetor. As células foram cultivadas por 48 h para permitir que a expressão do gene e, a seguir, expostas aos secretagogos e a secreção de mucina foi medida por ELISA. Todas as transfecções foram executadas na presença de plasmídeo pcDNA4/TO/lacZ (Invitrogen) (proporção de DNA de 6:1, total de DNA 1 μς, pro- porção de DNA para reagente Effeetene = 1:25) para monitorar as variações na eficiência da transfecção. Os resultados não apresentam diferença significativa nas atividades da beta- galactosidase nos Iisatos celulares isolados das células transfectadas, indicando uma efici- ência de transfecção similar entre os diferentes constructos de DNA (dados não apresenta- dos).
Ensaio da atividade da proteína fosfatase - Atividades de PP1 e PP2A foram medi-
das usando um sistema de ensaio da proteína fosfatase (Life Technologies, Inc.) conforme conhecido na técnica com uma leve modificação Huang et al., Adv. Exp. Med Biol. 396, 209- 215 (1996). Resumidamente, as células NHBE foram tratadas com 8-Br-cGMP ou meio so- zinho por 5 min. As células foram, a seguir, raspadas num tampão de Iise (Tris-HCI 50 mM (pH 7,4), 0,1% de beta-mercaptoetanol, EDTA 0,1 mM, benaamidina 1 mM, pepstatina A 10 μg/mL, Ieupeptina 10 μg/mL) e rompidas por ultra-som por 20 s a 4 0C. Os Iisatos celulares foram centrifugados e os sobrenadantes guardados para o ensaio da atividade da fosfatase. O ensaio foi efetuado usando fosforilase A marcada com 32P como substrato. 32Pi liberado foi contado por cintilação. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada pelo ensaio de Bradford. A atividade da PP2A foi expressa como a atividade fosfatase total da amostra menos a atividade remanescente na presença de ácido ocadáico 1 nM. Atividade PP1 foi expressa como a diferença entre as atividades remanescentes na presença de ácido ocadáico 1 nM e 1 μΜ, respectivamente. As atividades da proteína fosfatase foram reporta- das como nmol de Pi liberado por min/mg de proteína total.
Ensaio de citotoxicidade - Todos os reagentes usados no tratamento de células NHBE foram examinados para a citotoxicidade pela medição da liberação total de Iactato desidrogenase das células. O ensaio foi executado usando o kit Promega Cytotox 96, de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos foram efetuados com rea- gentes em concentrações não-citotóxicas.
Análise estatística - Os dados foram analisados quanto à significância usando aná- lise de variância de um fator com correções do teste pós-Bonferroni. As diferenças entre os tratamentos foram consideradas significativas em ρ < 0,05.
Isolamento de MNs do sangue de caninos - Os passos envolvidos no isolamento de PMN incluem a coleta de 10 mL de sangue anticoagulado ACD. A seguir, a formação de camadas de 5 mL em 3,5 mL de meio de isolamento PMN enquanto se assegura que o meio de isolamento PMN (IM) estava em temperatura ambiente (RI). A seguir, o sangue foi centri- fugado em temperatura ambiente por 30', 550 χ g a 1700 RPMs. A banda branca inferior baixa foi transferida para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL (CCFT). A seguir, 2V HESS com 10% de soro bovino fetal (PBS) foi adicionado e centrifugado em temperatura ambiente por 10', 400 χ g a 1400 RPMs. O pélete foi, a seguir, ressuspenso em 5 mL de 1- 1ESS com PBS. A suspensão celular foi adicionada a 50 mL de CCFT contendo 20 mL de NH4CI 0,88% gelado e invertida de duas a três vezes. O produto resultante foi centrifugado por 10', 800 χ g a 200 ORPMs, a seguir aspirado e ressuspenso em 5 mL de HBSS com FBS. O precipitado foi examinado por contagem e citospina e preferivelmente para o sangue total, a quantidade celular deveria estar entre 109 - 1011 células e para PMNs, a quantidade celular devera estar entre 2 - 4 χ 107 células. Ver de um modo geral Wang et al, J. Immunol, "Neutrophil-induced changes in the biomechanical properties of endothelial cells: roles of ICAM-I and reactive oxygen species," 6487-94 (2000).
Ensaio enzimático colorimétrico MPO - As amostras foram analisadas para a ativi- dade MPO em placas de microtitulação com fundo redondo de 96 poços usando um kit ELISA sanduíche (R&D Systems, Minneapolis, Minn.). Resumidamente, 20 microlitros de amostra são misturados com 180 microlitros de mistura de substrato contendo fosfato de potássio 33 mM, pH 6,0, Triton X-100 0,56%, peróxido de hidrogênio 0,11 mM e dicloridrato de O-dianisidina 0,36 mM num poço de microtitulação individual. As concentrações finais na mistura do ensaio são: fosfato de potássio 30 mM, pH 6,0, Triton 0,05% X-100, peróxido de hidrogênio 0,1 mM e dicloridrato de O-dianisidina 0,32 mM. Depois da mistura, a mistura de ensaio foi incubada em temperatura ambiente por 5 minutos, e a atividade da enzima MPO foi determinada espectrofotometricamente a 550 nanômetros. As amostras foram ensaiadas em duplicata.
Exemplo 1.
Estudos de secreção do mediador inflamatório
Quatro diferentes tipos ou modelos de leucócitos que secretam conteúdos de grâ- nulos específicos em resposta ao éster forbol induziram a ativação do PKC foram usados. Os neutrófilos forma isolados do sangue humano e a liberação in vitro de MPO por essas células foi avaliada. A liberação dos mediadores inflamatórios ligados à membrana a partir de linhagens celulares de leucócitos humanos comercialmente disponíveis também foi avali- ada. O clone da linhagem celular promielocítica humana HL-60 15 foi usado para avaliar a secreção de EPO (Fischkoff SA. Graded increase in probability of eosinophilic differentiation of HL-60 promyelocytic Ieukemia cells induced by culture under alkaline conditions. Leuk Res 1988; 12: 679-686; Rosenberg HF, Ackerman S J1 Tenen DG. Human eosinophil cationic protein: molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin with ribonuclease activity. J Exp Med 1989; 170: 163-176; Tiffany HL, Li F, Rosenberg HF. Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic Ieukemia cell Iine and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J Leukoc Biol 1995; 58: 49-54; Badewa AP, Hudson CE, Heiman AS. Regulatory effects of eotaxin, eotaxin-2, and eotaxin-3 on eosinophil degranulation and superoxide anion generation. Exp Biol Med 2002; 227: 645-651). A linha- gem celular de leucemia monocítica U937 foi usada para avaliar a secreção de Iisozima (Hoff T, SpenckerT1 EmmendoerfferA., Goppelt-Struebe M. Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52: 173-182; Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium-independent phospholipase A2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170: 5276-5280; Sundstrom C, Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic Iymphoma cell Iine (U-937). Int J Câncer 1976; 17: 565-577). A linhagem celular natural killer de linfócitos NK-92 usada para avaliar a liberação de granzima (Gong JH., Maki G, Klingeniann HG. Characterization of a human cell Iine (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8: 652-658; Maki G, Klingemann HG, Martinson JA, Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK- 92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369-383; Takayama H1 Trenn G1 Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphocyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104: 183-190). Em todos os casos, as células foram pré-incubadas com uma faixa de concentrações de um peptídeo sintético idêntico ao N-terminal MARCKS de 24 aminoácidos (peptídeo da seqüência N- terminal miristoilada MANS; MA- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1) (onde MA é um miristoil ligado à amina N-terminal do peptídeo por uma ligação amida), ou um peptídeo de controle sem sentido (RNS: peptídeo de seqüência N-terminal aleatório; GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 232), o qual consiste dos mesmos 24 aminoácidos, porém dispostos na seqüência de ordem aleatória a qual possui menos do que 13% de identidade de seqüência com a seqüência de peptídeo MANS. Alternativamente, as células foram pré-tratadas com um dos peptídeos truncados sintéticos listados na Tabela 3 abaixo.
Em cada um dos tipos celulares, MANS, porém não RNS, atenua a liberação de mediadores inflamatórios de um modo dependente de concentração. Um curso de tempo útil de observação é de 0,5 a 3,0 horas. Os resultados são consistentes com a região N-terminal da proteína MARCKS estando envolvida nas vias intracelulares levando à desgranulação de leucócitos.
Isolamento do neutrófilo humano - Esses estudos foram aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional de estudos humanos (IRB). Os neutrófilos humanos foram isolados conforme anteriormente descrito (ver Takashi S, OkuboY, Horie S. Contribution of CD54 to human eosinophil and neutrophil superoxide production. J Appl Physiol 2001 ; 91: 613-622) com leves modificações. Resumidamente, o sangue venoso heparinizado foi obtido a partir de voluntários saudáveis normais, diluído com RPMI-1640 (Cellgro; Mediatech, Inc., Hern- don, VA) numa proporção de 1:1, disposto em camadas em Histopaque (densidade, 1,077 g/mL; Sigma Aldrich Co., St. Louis1 MO) e submetido a centrifugação a 400 g por 20 min a 4 0C. O sobrenadante e as células mononucleares na interface foram cuidadosamente remo- vidos, e os eritrócitos no sedimento foram Iisados em água destilada esfriada. Os granulóci- tos isolados foram lavados duas vezes com solução de sais balanceada de Hanks (HBSS) e ressuspensos em HBSS em gelo. Os neutrófilos usados para os experimentos foram de > de 98% de pureza com < de 2% de contaminação por eosinófilos, e a viabilidade foi de > de 99% conforme determinado por exclusão com corante azul Trypan.
Medição da atividade MPO de neutrófilos liberados - Para medição da liberação de MPO, os neutrófilos humanos purificados suspensos em HBSS foram aliquotados a 4 χ 106 células/mL em tubos de 15 ml_ e pré-incubados ou com 50 ou com 100 μΜ de MANS, RNS ou um dos peptídeos da invenção por 10 min a 37 0C. As células foram, a seguir, estimula- das com forbol 12 miristato 13-acetato 100 nM (PMA) por até 3 h. Uma referência de contro- le (referência de controle PMA) foi estabelecida usando neutrófilos humanos purificados suspensos em HBSS aliquotados a 4 χ 106 células/mL em tubos de 15 ml_ e estimulados com forbol 12 miristato 13-acetato 100 nM (PMA) na ausência de um peptídeo de teste pe- los mesmos períodos de tempo. A reação foi terminada pela colocação dos tubos em gelo e centrifugação a 400 g por 5 min a 4 0C. A atividade MPO no sobrenadante celular foi ensaiado usando tetrametilbenzidina (TMB) baseando-se numa técnica anteriormente estabelecida (Abdel-Latif D1 Steward M, Macdonald DL, Francis GA., Dinauer MC, Lacy P. Rac2 is criticai for neutrophil primary gra- nule exocytosis. Blood 2004; 104: 832-839). Resumidamente, 100 μί de solução de substra- to TMB foram adicionados a 50 μί de sobrenadantes celulares ou MPO humano padrão (EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) numa microplaca de 96 poços seguido pela incuba- ção em temperatura ambiente por 15 min. A reação foi terminada pela adição de 50 μί de H2SO4 1 M e a absorvância foi lida a 450 nm num leitor de microplaca espectrofotométrica (VERSA Max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Estudos de cultura de leucócitos.
Três tipos de linhagens celulares de leucócitos, especificamente o clone 60 da li- nhagem celular promielocítica 15, a linhagem celular monocítica U937, e a linhagem celular natural killer natural de linfócitos NK-92 foram comprados da American Type Culture Collec- tion (ATCC; Rockville, MD). As células do clone HL-60 15 (ATCC CRL-1964) foram mantidas em meio consistindo de RPMI 1640 com L-glutamina suplementado com 10% de soro bovi- no fetal inativado pelo calor (Gibco; Invitrogen Co., Carlsbad1 CA), 50 UI/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina e tampão HEPES 25 mM, pH 7,8, a 37 0C numa atmosfera conten- do 5% de CO2. A diferenciação final num fenótipo tipo eosinofílico foi iniciada pelo cultivo de células a 5 χ 105 células/mL no meio acima contendo 0,5 mM de ácido butírico (Sigma- Aldrich Co.) por 5 dias conforme anteriormente descrito (Tiffany HL1 Li F1 Rosenberg HF. Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic Ieukemia cell Iine and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J Leukoc Biol 1995; 58: 49-54; Tiffany HL, Alkhatib G, Combadiere C, Berger EA, Murphy PM. CC chemokine receptors 1 and 3 are differentially regulated by IL-5 during maturation of eosinophilic HL-60 cells. J Immunol 1998; 160: 1385-1392). Células U937 (ATCC CRL-1593.2) cresceram a 37 0C numa atmosfera de 5% de CO2 em meio completo consistindo de RPMI 1640 com L-glutamina suplementado com 10% de FBS, penicilina 50 UI/mL e estreptomicina 50 μg/mL As células NK-92 (ATCC CRL-2407) foram mantidas em meio alfa-MEM (Sigma Aldrich Co.) suplementado com FBS 20%, 100 U/mL de interleucina-2 (IL-2) (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), 5 χ 10" 5 M de 2-mercaptoetanol, penicilina 50 UI/mL e estreptomicina 50 μg/mL a 37 0C numa at- mosfera contendo 5% de CO2. A morfologia celular foi julgada pela avaliação das células manchadas com Wright-Giemsa. A viabilidade das células coletadas para os experimentos foi avaliada por exclusão com azul tryptan e as populações de células com viabilidade > do que 95% foram usadas. Incubação das células para ensaios de desgranulação.
O clone HL-60 15, U937 e as células NK-92 foram lavados e ressuspensos a 2,5 χ 106 células/mL em RPMI-1640 livre de vermelho de fenol (Cellgro; Mediatech, Inc.) para to- dos os ensaios de desgranulação. Alíquotas das células em tubos de 15 mL foram pré- incubadas com concentrações indicadas de MANS, RNS ou um peptídeo de teste por 10 min a 37 0C. As células foram, a seguir, estimuladas com PMA por até 2 h. Uma referência de controle (referência de controle PMA) foi estabelecida para cada tipo celular usando clo- ne HL-60 15, U937, e células NK-92, respectivamente, as quais foram lavadas e ressuspen- sas em 2,5 χ 106 células/mL em RPMI-1640 livre de vermelho de fenol e estimuladas com PMA, porém na ausência de MANS, RNS ou de um peptídeo de teste para os mesmos perí- odos de tempo. A reação foi terminada pela colocação de tubos em gelo e pela centrifuga- ção das células a 400 g por 5 min a 4 0C. Para medições do MPO liberado a partir dos neutrófilos e da Iisozima liberada a
partir das células U937, nós fomos capazes de quantificar a secreção pelo uso de MPO hu- mano padrões e de ovalbumina de clara de ovo, respectivamente. Para a EPO liberada das células do clone HL-60 15 e para a granzima liberada das células NK-92, nenhum padrão estava disponível para uso para quantificação. Deste modo, tanto os níveis liberado quanto intracelular (das células lisadas) de EPO e de granzima foram medidos, e a EPO e granzima liberados foram expressos como a porcentagem do total (intracelular e liberado) para cada. Para medir a EPO intracelular nas células de clone HL-60 15 e a granzima intracelular em células NK-92, alíquotas apropriadas de células X-100 lisadas em triton 0,1% foram tomadas para quantificação das proteínas do grânulo intracelular conforme descrito abaixo. Todos os tratamentos foram expressos como porcentagem do controle para minimizar a variabilidade entre as culturas.
Medição da liberação de EPO HL-60.
A atividade EPO liberada pelas células do clone HL-60 15 foi avaliada usando TMB de acordo com uma técnica anteriormente estabelecida (Lacy P, Mahmudi-Azer S, Bablitz B, Hagen SC, Velazquez JR, Man SF1 Moqbel R. Rapid mobilization of intracellular stored RANTES in response to interferon-gamma in human eosinophils. Blood 1999; 94: 23-32). Deste modo, 100 μί de solução de substrato TMB foram adicioandos a 50 μί (μί = microli- trosO de amostra numa microplaca de 96 poços e incubados em temperatura ambiente por min (min = minutos). A reação foi terminada pela adição de 50 μί de H2SO4 1,0 M, e a absorvância foi lida a 450 nm (nm = nanômetros) num leitor de microplacas espectrofotomé- trico. A quantidade de EPO secretada foi expressa como a porcentagem do conteúdo total, usando a quantidade obtida na mesma quantidade de células lisadas Triton X-100.
Medição da secreção de Iisozima de monócitos.
Lisozima secretada por células U937 foi medida usando um ensaio espectrofotomé- tricô conforme descrito anteriormente (Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium- independent phospholipase A2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170: 5276-5280) com uma leve modificação. Deste modo, 100 μΙ de amostra foram misturados com 100 μΙ_ de uma suspensão de Micrococcus Iysodeikticus (Sigma- Al- drich Co.) (0,3 mg/mL em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0) numa microplaca de 96 poços. O decréscimo na absorvância a 450 nm foi medido em temperatura ambiente. Uma curva de calibração oi construída usando Iisozima de clara de ovo de galinha (EMD Biosci- ences, Inc.) como padrão.
Medição da secreção de granzima de células NK.
A granzima secretada das células NK-92 foi ensaiada pela medição da hidrólise do éster tiobenzílico de benziloxicarbonil-L-lisina (BLT) essencialmente conforme descrito ante- riormente (Takayama H, Trenn G1 Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphocyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104: 183-190). Resumidamente, 50 μί de sobrenadante foram transformados numa placa de 96 poços, e 150 μί de solução BLT (BLT 0,2 mM; EMD Biosciences, Inc., e DTNB 0,22 mM; Sigma-Aldrich Co.) (mm = milimolar) em salina tampo- nada com fosfato (PBS, pH 7,2) foram adicionados ao sobrenadante. A absorvância a 410 nm foi lida após a incubação por 30 min em temperatura ambiente. Os resultados foram ex- pressos como a porcentagem do conteúdo de enzimas totais, usando a quantidade obtida na mesma quantidade das células Iisadas triton X-100.
Análise estatística.
A significância estatística das diferenças entre vários grupos de tratamento foi ava- liada com ANOVA simples. Valores de P < 0,05 foram tomados como significativos. Inibição da liberação de MPO a partir dos neutrófílos humanos
Foi descoberto que PMA 100 nM (como um estimulador da liberação de mediador inflamatório) aumentou a liberação de MPO neutrófilo humano em aproximadamente três vezes contra o nível de controle em 30 min na referência de controle PMA, a liberação de MPO aumentando até aproximadamente 5-6 vezes depois de 3 h. Em 30 minutos, em re- lação à atividade de MPO de controle como 100% de PMA ausente e PMA ausente mais MANS, RNS ou peptídeo de teste, a atividade MPO da referência de controle PMA foi de cerca de 275%, PMA mais MANS 50 μΜ foi de cerca de 275%, e MANS 100 μΜ foi de cerca de 305%. Deste modo, o peptídeo MANS não teve efeito detectado a 30min. Entretanto, em 1 hora a concentração mais alta de MANS (100 μΜ) tinha um efeito inibitório significativo (medido em cerca de 260% de controle) ou uma redução de cerca de 25% na liberação de MPO versus o nível de referência do controle de PMA (o qual foi medido em cerca de 340% do controle). A amostra MANS 50 μΜ mediu cerca de 290% do controle ou cerca de 15% de redução em relação à referência de controle PMA. Em 2 h e persistindo em 3 h, o peptídeo MANS significativamente atenuou a atividade MPO de um modo dependente de concentra- ção. Em 2 h, a atividade MPO de referência de controle PMA foi de cerca de 540% do con- trole, a MANS 50 μΜ (medindo cerca de 375% do controle) causou uma redução de aproxi- madamente 30% de liberação de MPO versus a referência de controle PMA; e MANS 100 μΜ (medindo cerca de 295% do controle) causou uma redução de aproximadamente 45% da liberação de MPO versus a referência de controle PMA. Em 3 horas, a atividade MO da referência de controle PMA foi de cerca de 560% de controle, MANS 50 μΜ (medindo cerca de 375% do controleO causou uma redução de aproximadamente 33% da liberação de MPO versus a referência de controle PMA; MANS 100 μΜ (medindo cerca de 320% do controle) causou uma redução de aproximadamente 40% de liberação de MPO versus a referência de controle PMA. O peptídeo RNS não afetou a liberação de MPO induzida por PMA em qual- quer um dos pontos de tempo ou concentrações testadas. Os dados apresentados na tabela abaixo representam a concentração de 100 μΜ dos peptídeos de teste e uma incubação de duas horas com PMA 100 nM.
Inibição da liberação de EPO das células HL-60
A atividade EPO no sobrenadante do clone HL-60 15 foi significativamente aumen- tada em 1 e 2 h após a estimulação por PMA. Em 1 hora, em relação à atividade EPO do controle foi de 100%, a referência de controle do PMA medida em cerca de 110%; a amostra contento MANS 10 μΜ medida em cerca de 95% para fornecer redução de cerca de15% na atividade da EPO em relação à referência de controle de PMA; a amostra contento MANS 50 μΜ medida em cerca de 78% para fornecer redução de cerca de 30% na atividade da EPO em relação à referência de controle de PMA; e a amostra contento MANS 100 μΜ me- dida em cerca de 65% para fornecer redução de cerca de 40% na atividade da EPO em re- lação à referência de controle de PMA. Em 2 horas, em relação à atividade EPO do controle como de 100%, a referência de controle do PMA medida em cerca de 145%; a amostra con- tento MANS 10 μΜ medida em cerca de 130% para fornecer redução de cerca de 10% na atividade da EPO em relação à referência de controle de PMA; a amostra contento MANS 50 μΜ medida em cerca de 70% para fornecer redução de cerca de 50% na atividade da EPO em relação à referência de controle de PMA; e a amostra contento MANS 100 μΜ me- dida em cerca de 72% para fornecer redução de cerca de 50% na atividade da EPO em re- lação à referência de controle de PMA. Deste modo, tanto em 1 quanto em 2 h, MANS a 50 ou 100 μΜ atenuou significativamente a liberação de EPO. O peptídeo RNS não afetou a liberação de EPO intensificada por PMA em qualquer ponto de tempo ou concentrações testadas. Os dados apresentados na tabela abaixo representam a concentração de 50 μΜ dos peptídeos de teste numa incubação de duas horas com PMA 100 nM.
Inibição da liberação de Iisozima a partir de células U937
A secreção de Iisozima pelas células U937 foi aumentada pela estimulação de PMA por 1 h depois da incubação, e aumentou ainda mais em 2 h. Em 1 h, em relação à secre- ção de Iisozima por células U937 do controle como 100%, a referência de controle de PMA medida em cerca de 210%; a amostra contento MANS 10 μΜ medida em cerca de 170% para fornecer redução de cerca de 20% na secreção de Iisozima pelas células U937 em re- lação à referência de controle de PMA; a amostra contento MANS 50 μΜ medida em cerca de 170% para fornecer redução de cerca de 20% na secreção de Iisozima pelas células U937 em relação à referência de controle de PMA; e a amostra contento MANS 100 μΜ me- dida em cerca de 115% para fornecer redução de cerca de 45% na secreção de Iisozima pelas células U937 em relação à referência de controle de PMA. Em 2 horas, em relação à secreção de Iisozima por células U937 do controle como 100%, a referência de controle de PMA medida em cerca de 240%; a amostra contento MANS 10 μΜ medida em cerca de 195% para fornecer redução de cerca de 20% na secreção de Iisozima pelas células U937 em relação à referência de controle de PMA; a amostra contento MANS 50 μΜ medida em cerca de 185% para fornecer redução de cerca de 25% na secreção de Iisozima pelas célu- las U937 em relação à referência de controle de PMA; e a amostra contento MANS 100 μΜ medida em cerca de 140% para fornecer redução de cerca de 40% na secreção de Iisozima pelas células U937 em relação à referência de controle de PMA. Deste modo, a secreção de Iisozima foi significativamente atenuada tanto em 1 quanto em 2 h pós-estimulação por 100 μΜ de MANS, porém não tanto por 50 ou 10 μΜ de MANS. O peptídeo RNS não afetou a secreção de Iisozima intensificada por PMA em qualquer um dos pontos de temo ou concen- trações testadas. Os dados apresentados na tabela abaixo representam a concentração de 50 μΜ dos peptídeos de teste e uma incubação de duas horas com PMA 100 nM.
Inibição da liberação de granzima das células NK-92 A linhagem celular natural killer de linfócitos naturais NK-92 foi usada para avaliar a
liberação de granzima (Gong JH1 Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell Iine (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 8: 652-658, 1994; Maki G, Klingemann HG, Martinson JA, Tarn YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J. Hematother. Stem Cell Res., 10: 369-383, 2001 ; Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphocyte activation assay. J. Immunol. Methods 104: 183-190, 1987).
Medição da secreção de granzima de células NK: Granzima secretada das células NK-92 foi avaliada pela medição da hidrólise de éster tiobenzílico de Na-benziloxicarbonil-L- Iisina (BLT, EMD Bioscience, Inc.) essencialmente conforme descrito anteriormente (Taka- yama H, Trenn G, Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T Iymphocyte activation assay. J. Immu- nol. Methods 104: 183-190, 1987). Uma alíquota de 50 μΙ_ de sobrenadante foi transferida para uma placa de 96 poços, e 150 μι. de solução BLT 0,2 mM e DTNB 0,22 mM (Sigma Aldrich Co.) em salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) foram adicionados ao sobre- nadante. Absorvância a 410 nm foi medida depois da incubação por 20 min em temperatura ambiente. Os resultados foram expressos como porcentagem do conteúdo de enzima celu- lar total, usando a quantidade obtida na mesma quantidade de células Iisadas com triton X- 100. Devido ao fato da granzima padrão de células NK-92 não ser disponível para uso para quantificação, nós medimos tanto os níveis liberado e intracelular (das células lisadas) de granzima, e expressamos a granzima liberada como porcentagem do total (intracelular e liberado) para cada. Para medir a granzima intracelular das células NK-92, alíquotas apro- priadas de células lisadas com triton X-100 foram tomadas para quantificação da enzima conforme descrito acima. Todos os dados são expressos como porcentagem de controle para minimizar a variabilidade entre as culturas. Os dados apresentados na tabela abaixo representam a concentração de 50 μΜ dos peptídeos de teste e uma incubação de duas horas sem PMA 100 nM. Citotoxicidade
Devido ao padrão nenhum dos tratamentos ter gerado uma resposta tóxica nas cé- lulas, conforme avaliado pela retenção/liberação de LDH (dados não apresentados) (ver também Park J-A1 He F, Martin LD1 Li Y, Adler KB. Human neutrophil elastase induces hypersecretion of mucin from human bronchial epithelial cells in vitro via a PKCÕ - mediated mechanism. Am J Pathol 2005; 167: 651-661).
Em experimentos preliminares, os seguintes peptídeos os quais são apresentados na tabela abaixo demonstram a inibição porcentual respectiva da liberação de MPO dos neutrófilos humanos, de EPO das células clone HL-60 15, de Iisozima das células U937, e de granzima das células NK-92, em que MA- significa a presença de um grupo substituinte miristoil na posição alfa-N-terminal do peptídeo; Ac- significa a presença de um grupo substi- tuinte acetil na posição alfa-N-terminal do peptídeo; H significa nenhum grupo ligado ao pep- tídeo; e NH2 significa a presença de uma amida na posição C-terminal. Foi tirada uma mé- dia dos dados de inibição a partir de múltiplos experimentos. A solubilidade qualitativa dos peptídeos em salina 0,5 N em pH 6,5 é dada em MG/mL na Tabela 3 abaixo. A alteração da porção química N-terminal a partir de um grupo miristoil pode levar a alterações na solubili- dade dos peptídeos aqui revelados em meio aquoso. Por exemplo, a alteração do grupo miristoil para um grupo acetil resulta na solubilidade aquosa aumentada mostrada na Tabela 3.
Tabela 3. Resultados das solubilidades dos ensaios de inibição enzimática para peptídeos representativos e peptídeos substituídos.
% de inibição mg/mL SEQ ID NO: N—1 Seqüência de aminoácidos C-2 EPO Lisozima MPO Granzima Solubilidade3 219 Ac AKGE 87,6 7,2 >200 45 Ac AKGEAAAERPGEAAVA 72,3 34,3 37 Ae GAQFSKTAAKGEAAAE 56,6 8,4 239 Ae GAQFSKTAAAGE 55,8 37,2 >50 248 Ae GAQFSKTAAA 55,2 28,3 >100 91 Ae AAAERPGEAAVA 51,2 29,5 11 Ac GAQFSKTAAKGEAAAERPGE 48,8 0 79 Ac GAQFSKTAAKGE 46,7 43,3 >100 153 Ac RPGEAAVA 45,8 0 219 Ae AKGE NH2 45,6 26,8 >200 93 Ae AQFSKTAAKGE NH2 42,8 51,8 >90 141 Ae SKTAAKGE NH2 42,2 0 >200 241 Ae GAQFSKTAAKGA 40,9 24,1 >50 143 Ae TAAKGEAA 40,4 0,5 >230 251 Ae AAGE 39,1 36,9 >200 106 Ae GAQFSKTAAK 35,7 41,2 25,3 >100 249 Ae GAQFSATAAA 35,7 3,2 <10 1 Ae GAQFSKTAAKGEAAAERPGE AAVA 33,7 39,8 >250 121 Ae GAQFSKTAA 33,3 28,9 >20 106 Ae GAQFSKTAAK (todos d) 26,9 8,9 40 >100 124 Ae FSKTAAKGE NH2 25,3 56,7 >100 79 Ae GAQFSKTAAKGE NH2 24,7 38,6 26,5 >60 108 Ae QFSKTAAKGE NH2 15,7 60,7 >150 179 Ae AAKGEA 10,6 9,2 >150 159 Ae KTAAKGE NH2 0 24,3 >200 137 Ae GAQFSKTA 0 0 >200 79 H GAQFSKTAAKGE 27,9 >60 1 MA GAQFSKTAAKGEAAAERPGE AAVA 46,1 40,8 31,2 76 <5,0 106 MA GAQFSKTAAK 37,4 56,6 >10 11 MA GAQFSKTAAKGEAAAERPGE 33,6 99 179 MA AAKGEA 31,4 28,6 <1,0 37 MA GAQFSKTAAKGEAAAE 30,3 99 >2,0 79 MA GAQFSKTAAKGE 25,2 85,2 43,2 >2,0 91 MA AAAERPGEAAVA 21,6 98 <20 45 MA AKGEAAAERPGEAAVA 18,1 98 >80 153 MA RPGEAAVA 0 99 MA SKTAAKGEAAAERPGEAAVA 0 99 >80 143 MA TAAKGEAA 0 80,2 <1,0 219 MA AKGE 0 28,6 <1,0 232 MA GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF 0 0 0 29,5 >15 234 MA GAQFSKTKAKGE 65,2 >3,0
2C- = grupo C-terminal 3 Salina 0,5 N1 pH 6,5. Exemplo 2.
Inibição in vivo da inflamação pulmonar induzida por lipopolissacarídeo (LPS) por MANS e peptídeos relacionados
Esse exemplo foi efetuado essencialmente de acordo com os métodos descritos por Cox1 G1 Crossley, J., e Xing1 Z.; Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo; Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12: 232-237, 1995; Hirano S., Quantitative time-course profiies of bronchoalveolar Iavage cells following intratracheal instillation of Iipopolysaccharide in mice, Ind. Health 35: 353-358, 1997; e Ulich TR, Watson LR, Yin SM, Guo KZ1 Wang P, Thang H, e dei Castillo, J. Am. J.
Pathol. 138: 1485-1496, 1991.
Deste modo, camundongos fêmeas CD1 de seis a sete semanas de idade pesando de 15 a 20 gramas foram obtidos de Charles River Iaboratories e alojados em grupos de 5 camundongos por gaiola. Os animais receberam dieta de roedores padrão e água filtrada ad libitum. Os animais foram alojados sob normas prescritas no NIH e temperatura padrão (17,8 0C a 26,1 0C) (64 0 a 79 0F) e umidade relativa de 30 a 70%.
Cinco grupos de tratamento de camundongos, com 5 animais em cada grupo, foram tratados ou com PBS seguido por PBS, com PBS seguido por LPS, com peptídeo MANS (miristoilado) seguido por LPS, com peptídeo acetilado da SEQ ID NO: 1 seguido por LPS ou com peptídeo acetilado da SEQ ID NO: 106, seguido por LPS. Pré-tratamento de instilação de peptídeo intranasal: um peptídeo da invenção a ser
avaliado in vivo quanto À sua capacidade de inibir ou reduzir a inflamação pulmonar induzi- da por LPS foi dissolvido em PBS numa concentração de 1 mM. Animais, anestesiados com isofluorano 0,8% por inalação, foram pré-tratados com 2 χ 10 μί de massa intranasal da solução do peptídeo em uma narina 30 minutos antes da inalação subsequente com LPS. Instilação de LPS intranasal: Endotoxina de lipopolissacarídeo (LPS) (endotoxina
derivada do Sorotipo 011 :B4 de Escherichia coii\ Sigma, St Louis, MO; ver folheto informati- vo de produtos Sigma L4130 intitulado Lipopolysaccharides from Escherichia coli 011 :B4) foi dissolvida em salina tamponada com fosfato (PBS) a 2.500 μg/mL. Para expor os animais à endotoxina, uma massa intranasal de 10 μί de solução de endotoxina de 2.500 μg/mL foi administrada aos animais, os quais foram anestesiados com isoflurano 0,8% por inalação. A massa de 10 μί foi aplicada na narina. Os animais foram monitorados para a respiração forçada, letargia e ingestão de água/alimento reduzida após as instilações de endotoxina.
Lavagem broncoalveolar (BAL): Seis horas após a última instilação, os animais fo- ram anestesiados (90 mg/Kg de Nembutal) e sacrificados por dessangramento. O pulmão foi lavado em série 2 vezes com alíquotas de 1,0 mL de PBS. O fluido BAL coletado foi centri- fugado para remover as células para a contagem subsequente e análise diferencial. O fluido de lavagem recuperado foi usado para análise de proteína total, mieloperoxidase (MPO), LDH e hemoglobina.
Análise: Alíquotas do fluido BAL foram usadas imediatamente para avaliar os níveis de LDH1 proteína total ou hemoglobina usando o analisador Fara COBAS (analisador auto- mático COBAS FARA LL; Riche Diagnostic Systems Inc., Montclair1 NJ). Uma alíquota do fluido BAL foi congelada a -80 0C para quantificação subsequente da mieloperoxidase (MPO) com um ensaio de ELISA específico para camundongo (Cell Sciences, Inc., Canton, Mass). Os dados BAL foram analisados por técnicas padronizadas para examinar as dife- renças entre os grupos de controle e tratamento. Os resultados demonstrando a inibição ou redução de inflamação pelo peptídeo teste estão fornecidos nas tabelas a seguir.
Tabela 4. Valores médios dos marcadores de inflamação na presença de peptídeo
MANS, MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1).
Regime Células Neutrófi- % de MPO Proteína LDH Hb de tra- totais Ios to- neutrófi- (ng/mL) total (unida- (9/dL) tamento conta- das tais con- tados Ios das células totais (ug/mL) des/L) PBS/PB 157.020 29317 18,7 3,28 125,60 68,20 0,00 S η = 5 PBS/LP 264.200 110.061 41,7 28,98 272,40 60,40 0,19 S η = 5 MANS/L 208.457 64.481 30,9 9,49 175,00 68,57 0,05 PS η = 7
Tabela 5. Valores médios dos marcadores de inflamação na presença de um aná- logo N-terminal acetilado do peptídeo MANS1 Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1).
Regime de tra- tamento Conta- gens de células totais Conta- gens de neutrófi- Ios to- tais % de neutrófi- Ios das células totais MPO (ng/mL) Proteína total (ug/mL) LDH (unida- des/L) Hb (g/dL) PBS/PB S η = 5 89.440 19.770 22,1 5,45 230,6 84,0 0,00 PBS/LP S η = 5 251.360 164.578 65,5 37,90 153,4 89,9 0,01 Ac-SEQ ID NO: 1/LPS η = 5 254.400 105.499 41,47 30,79 182,75 74,5 0,01
Tabela 6. Valores médios dos marcadores de in
deo acetilado Ac-GAQFSKTAAK1 SEQ ID NO: 106.
lamação na presença de um peptí-
Regime Conta- Conta- % de MPO Proteína LDH Hb de tra- gens de gens de neutrófi- (ng/mL) total (unida- (9/dL) tamento células totais neutrófi- los to- tais Ios das conta- gens totais (ug/mL) des/L) PBS/PB S η = 5 312.620 66.521 21,3 4,88 113,8 61,80 0,00 PBS/LP S η = 5 327.680 80.077 24,4 7,19 116,4 78,20 0,00 Ac-SEQ ID NO: 106/LPS η = 5 305.688 9.170 3,0 1,50 131,0 106,86 0,00
Tabela 7. Inibição dos marcadores de inflamação pelo peptídeo MANS (Myr-SEQ ID NO: 1), peptídeos de teste (Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA), SEQ ID NO: 1, e Ac- GAQFSKTAAK1 SEQ ID NO: 106, em relação ao tratamento PBS/LPS.
Regime de tratamento Inibição da migração do neutrófilo Inibição da MPO MANS/LPS 41,4% 67,2% SEQ ID NO: 1/LPS 35,9% 18,75% Ac-SEQ ID NO: 106/LPS 88,5% 79,1%
PBS/PBS indica que somente o controle de PBS foi administrado, e nenhuma endo- toxina de LPS foi adicionada para estimular a migração neutrofílica quimiotática; PBS/LPS indica que LPS (endotoxina) foi adicionada para estimular a migração neutrofílica quimiotáti- ca; MANS/LPS indica o pré-tratamento com peptídeo MANS em PBS seguido pela estimula- ção com LPS para induzir a migração dos neutrófilos. A porcentagem de neutrófilos na con- tagem de células totais nos grupos de tratamento com LPS foi reduzida de 41,7% para 30,9%pelo tratamento com peptídeo MANS; de 65,5% para 41,47% pelo tratamento com o peptídeo Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA, SEQ ID NO: 1; de 24,4% para 3,0% pelo tratamento como peptídeo Ac-GAQFSKTAAK, SEQ ID NO: 106. Os níveis de MPO medidos nos grupos de tratamento LPS foram reduzidos de 28,98 ng/mL para 9,49 ng/mL por trata- mento com peptídeo MANS; de 37,9 ng/mL para 30,79 ng/mL por tratamento com o peptí- deo com SEQ ID NO: 1 acetilada, e de 7,19 ng/mL para 1,50 ng/mL pelo tratamento com o peptídeo com SEQ ID NO: 106 acetilada.
Exemplo 3.
Modelo de camundongo de DPOC induzida por ozônio
Estresse oxidativo por irritantes químicos, tal como ozônio, PE uma característica amplamente reconhecida da doença respiratória obstrutiva crônica (DPOC). Ver: Repine JE, Bast Α, Lankhorst I1 and the Oxidative Stress Study Group, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 341-357, 1997; e também Harkema JR e Hotchkiss JA, Toxicology Letters, 68: 251- 263, 1993.
Camundongos fêmeas Balb/C de dez semanas de idade foram obtidos do Charles River Laboratories e alojados sob as diretrizes de NIH em grupos de 5 por gaiola. Os ani- mais receberam dieta para roedores padrão e água filtrada ad libitum. Três grupos de trata- mento de camundongos, 5 animais em cada grupo, foram todos anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/Kg) e xilazina (20 mg/Kg) e a seguir pré-tratadas pela administração intratraqueal com 25 μί ou de PBS sozinho, ou de uma solução de peptídeo MANS 1,0 mM em PBS, ou de uma solução 1,0 mM de um fragmento de peptídeo MANS acetilado Ac-GAQFSKTAAK designado como SEQ ID NO: 106 acetilado em PBS. Depois de minutos, os animais foram a seguir colocados na câmara customizada apropriada para exposições a ozônio ou ar forçado. Os animais foram expostos ao ozônio por 2 horas (nas concentrações de ozônio de 1 a 10 ppm por um método levemente modificado por Haddad et al, 1995. (Haddad E-B1 Salmon M, Sun J, Liu S, Das A, Adcock I, Barnes PJ, e Chung KF, FEBS Letters, 363: 285-288, 1995). O ozônio foi gerado usando um modelo de aparelho gerador de ozônio OL870F/B da OzoneLab, Burton, British Columbia, Canadá. A concentra- ção de ozônio foi continuamente monitorada usando um analisador de 03 fotométrico Te- Iedyne (modelo 400E, Teledyne Instruments, City of Industry, CA). Dois grupos adicionais de camundongos, cada um sem qualquer pré-tratamento, foram ou expostos ao ozônio sob as mesmas condições ou expostos ao ar forçado sob condições semelhantes ao grupo de tra- tamento com ozônio, porém sem ozônio. Depois da exposição, os animais foram sacrifica- dos por dessangramento e os pulmões foram lavado sem série 2 vezes com alíquotas de 1,0 mL de PBS. O fluido de lavagem broncoalveolar coletado (BAL) foi centrifugado para remover as células para a contagem subsequente e análise diferencial. O fluido de lavagem recuperado foi usado para análise de proteína e adicionais de IL-6, IFNy e KC (análogo de IL-8 de murino) por ensaio de ELISA (kits de ensaio obtidos de R&D Systems, Minneapolis, MN).
A inibição porcentual da migração de neutrófilos no fluido BAL como uma função dos grupos de tratamento e em relação ao grupo de controle tratado com PBS sozinho está fornecida na tabela.
Tabela 8. Inibição da migração de neutrófilos induzida por ozônio pelo peptídeo
MANS e pelo peptídeo acetilado SEQ ID NO: 106, Ac-GAQFSKTAAK.
Grupo de tratamento % de inibição da migração de neutrófilos no fluido BAL MANS + ozônio 93,0 Ac-SEQ ID NO: 106 + ozônio 81,2 PBS + ozônio Não aplicável Ar forçado sozinho Não aplicável
tratamento com injeção intratraqueal e subsequente tratamento com ozônio, foram obtidas como se segue. Os níveis de IL-6 foram encontrados como sendo: de aproximadamente 364,5 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo MANS e a seguir expos- to ao ozônio; aproximadamente 130,4 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo de fragmento MANS acetilado, Ac-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106), e a seguir exposto ao ozônio; aproximadamente 1041,3 pg/mL num grupo de camundongos pré- tratado com PBS e exposto ao ozônio; aproximadamente 43,2 pg/mL num grupo de camun- dongos exposto diretamente ao ar forçado sem qualquer pré-tratamento. As concentrações de KC em pg/mL no fluido BAL, como função do pré-tratamento
com injeção intratraqueal e subsequente tratamento com ozônio, foram obtidas como se segue: os níveis de KC foram encontrados como sendo: de aproximadamente 183,6 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo MANS e a seguir exposto ao ozônio; aproximadamente 159,7 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo de fragmento MANS acetilado, Ac-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106), e a seguir exposto ao ozônio; aproximadamente 466,6 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com PBS e exposto ao ozônio; aproximadamente 36,3 pg/mL num grupo de camundongos exposto dire- tamente ao ar forçado sem qualquer pré-tratamento.
As concentrações de IFNy em pg/mL em fluido BAL como função do pré-tratamento com injeção intratraqueal e subsequente tratamento com ozônio foram obtidos como se se- gue: os níveis de IFNy foram descobertos como sendo: de aproximadamente 7,4 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo MANS e a seguir exposto ao ozônio; a- proximadamente 3,6 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com peptídeo de frag- mento MANS acetilado, Ac-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106), e a seguir exposto ao ozônio; aproximadamente 8,6 pg/mL num grupo de camundongos pré-tratado com PBS e exposto ao ozônio; e aproximadamente 5,0 pg/mL num grupo de camundongos exposto ao ar força- do.
A administração de ozônio aos camundongos aumentou significativamente a quan- tidade de células neutrofílicas infiltradas, assim como os níveis de IL-6 e KC em BAL. Em comparação com o gruo de controle no qual os camundongos foram pré-tratados com PBS, o grupo pré-tratado com peptídeo MANS e o grupo pré-tratado com peptídeo acetilado, Ac- GAQFSKTAAK, SEQ ID NO: 106 acetilada, cada um exibiu uma infiltração de células neu- trofílicas reduzida no fluido BAL depois da exposição ao ozônio (por exemplo, 93% ± 10% e 81% ± 10%, respectivamente, VS. controle PBS). Em paralelo, peptídeo MANS e SEQ ID NO: 106 acetilada peptídeo acetilado também reduziu marcantemente as concentrações de KC (por exemplo, 65,8% ± 10% e 71,3% ± 10%, respectivamente, VS. controle PBS) e ní- veis de IL-6 (por exemplo, 67,8% ± 15%, MANS e 91,3% ± 15% de SEQ ID NO: 106 acetila- da VS. controle de PBS) depois da exposição ao ozônio, porém teve pouco efeito nos níveis de interferon-γ. Coletivamente, esses dados evidenciam que o peptídeo MANS e os peptí- deos da SEQ ID NO: 6 acetilados diminuem ou inibem acentuadamente a migração de neu- trófilos induzida por ozônio nas vias aéreas, assim como diminuem seletivamente a quimio- cina e a citocina. Os níveis de IL-6 nos fluidos BAL dos animais pré-tratados com peptídeo MANS ou SEQ ID NO: 106 peptídeo acetilado apresentaram aproximadamente 685 e 91% de inibição, respectivamente, em comparação com aqueles pré-tratados com PBS. Também os níveis de KC nos fluidos BAL dos animais pré-tratados com peptídeo MANS ou peptídeo SEWQ ID NO: 106 acetilado apresentaram aproximadamente 65% e 71% de inibição em comparação com aqueles pré-tratados com PBS.
Exemplo 4.
Modelo de bronquite crônica O procedimento é descrito por Voynow JA1 Fischer BM, Malarkey DE, Burch LH,
Wong T, Longphre M, Ho SB, Foster WM, Neutrophil Elastase induces mucus cell metapla- sia in mouse lung, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L1293-L1302, 2004 e é se- guido para desenvolver um modelo de bronquite crônica no camundongo. Especificamente, hiperplasia de célula caliciforme, uma característica patológica de assinatura da bronquite crônica, é induzida pela exposição crônica de camundongos à elastase de neutrófilo (NE) instilada nas vias aéreas.
NE humana são aspiradas intratraquealmente por camundongos Balb/c machos. Um total de 30 camundongos (cerca de 25 a 30 g em peso) são comercialmente obtidos a partir de um fornecedor tal como Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Os camundongos são mantidos num ciclo diurno de 12 h, com alimento e água fornecidos ad libitum. Os ani- mais recebem NE por aspiração orofaríngea nos dias 1, 4 e 7. Imediatamente após a inala- ção, anestesia com isoflurano (IsoFIo de Abbott Laboratories e Sistema de Anestesia a Gás de Circuito Aberto de Stoelting), os animais foram suspensos por seus incisores superiores numa prancha com inclinação de 60 e um volume líquido de NE humana [50 ug (43,75 unidades)/40 μί. de PBS (Elastin Products, Owensville, MO) é distribuído com a língua do animal estendida para a parte distai da orofaringe. Com a língua estendida, o animal é inca- paz de engolir, e o volume líquido é aspirado no trato respiratório.
Em 7 dias após a última exposição à NE, quando o modelo de hiperplasia de célula caliciforme as vias aéreas na bronquite crônica está em seu máximo (ver Voynow ET al, 2004), camundongos (5 animais por grupo) são instilados intratraquealmente com 50 μί ou de PBS (como controle) ou 100 uM de uma solução de peptídeo MANS, uma solução de peptídeo RNS ou uma solução de um peptídeo tal como peptídeo acetilado SEQ ID NO: 106 dissolvido em PBS. Quinze minutos mais tarde, a secreção de muco é desencadeada pela administração de metacolina, usando um nebulizador de sistema Buxco para proporcionar uma metacolina com distribuição de aerossol fino em aproximadamente 60 mM por 3 min. Quinze minutos depois da administração de metacolina, os camundongos foram sacrificados por exposição por inalação a 100% de gás C02.
Histoquímica. Depois das exposições descritas acima, os pulmões dos animais forma inchados para remover sangue, a seguir foram inflados com OCT (meio de temperatu- ra de corte ótimo (Sakura Finetcj, Torrance1 CA), e diluídos pela metade em salina. Os pul- mões são imersos em 10% de formaldeído em PBS de um dia para o outro a 4 0C, e proces- sados para cera de parafina. Seções de cinco μίτι são tratadas com ácido periódico S- chiff/hematoxilina para manchar as mucinas nas vias aéreas, por exemplo, conforme descri- to por Singer M, Vargaftig BB, Martin LD, Park JJ, Gruber AD, Li Y, Adler KB1 A MARCKS- related peptide blocks mucus hypersecretion in a murine model of asthma., Nature Medicine 10: 193-196, 2004.
índice de muco histológico. Um índice de muco histológico (Whittaker L, Niu N,
Temann U-A, Sloddard A. Flavell RA, Ray A, Homer RJ, and Cohn L, lnterleukin-13 mediates a fundamental pathway for airway epithelial mucus induced by CD4 T cells and interleukin-9, Am. J. Respir. Cell MoL Biol. 27: 593-602, 2002) é efetuado em seções man- chadas com AB/PAS que incluem tanto as vias aéreas centrais quanto periféricas. As lâmi- nas são examinadas com uma objetiova de 10X, e as imagens são capturadas com uma câmera digital. Um mínimo de quatro vias aéreas seccionadas de modo cruzado ou sagital- mente representativas é visualizado por animal. Somente as vias aéreas onde a circunfe- rência completa da via aérea pode ser visualizada e incluída na imagem são analisadas. As vias aéreas que abrem diretamente no espaço alveolar não são incluídas. A extensão do manchamento PAS-positivo em cada via aérea visualizada será semi-quantitativamente de- terminado por um examinador o qual desconhece as condições de tratamento para cada seção, usando a seguinte graduação de cinco séries: grau 0, sem manchamento PAS; grau 1, 25% ou menos do epitélio das vias aéreas manchado com PAS; grau 2, 26 a 50% do epi- télio das vias aéreas manchado com PAS; grau 3, 51 a 75% do epitélio das vias aéreas manchado com PAS; e grau 4, > de 75% do epitélio das vias aéreas manchado com PAS. Esse sistema de classificação é usado para calcular uma pontuação de índice de muco para cada grupo, e os resultados são apresentados como médias ± SE.
todos os resultados estão apresentados como médias ± erro padrão (n = 5 animais, 10-20 seções para cada). Os níveis de significância serão calculados usando ANOVA sim- pies seguido pelo teste de Scheffe, usando o programa de computador SPSS 6.1 (* = signi- ficância entre os dados com um limiar de ρ < 0,05). Exemplo 5. Ensaios in vivo.
O objetivo do seguinte grupo de experimentos é estabelecer os efeitos dos peptí- deos dessa invenção depois da distribuição in vivo, sela por instilação local no sítio de infla- mação ou por injeção i.v., na inflamação em comparação com os peptídeos de controle, tais como RNS. Dois modelos são úteis para esta determinação: (i) o modelo de inflamação da bolsa de ar de murino e (ii) o modelo de pereitonite induzida por tioglicolato de murino. Am- bos são modelos bem caracterizados de inflamação, nos quais os neutrófilos têm um papel essencial. O modelo de bolsa de ar permite a determinação dos efeitos dos peptídeos num curto período de tempo da inflamação (aproximadamente 4 horas) e o modelo de peritonite é útil em relação a um período de temo mais longo de inflamação (aproximadamente 24 h).
Design experimental global:
Quatro estudos, dois para cada modelo, um testando a distribuição i.v. dos peptí- deos e um testando a distribuição local dos peptídeos são úteis para estudar os efeitos dos peptídeos revelados nesse pedido. Cada estudo consiste de 2 grupos experimentais, um controle não-inflamado (tratado com veículo) e um grupo inflamado (isto é, tratado com um estímulo inflamatório). Cada grupo é dividido em 5 e opcionalmente 6 subgrupos de trata- mento, η = 6 para cada subgrupoo. Os subgrupos de tratamento são, por exemplo: veículo, MANS, RNS, peptídeo teste, opcionalmente um peptídeo com uma seqüência misturada são intitulados "peptídeo SCR", e dexametasona. Dexametasona serve como um agente antiin- flamatório de referência. A seleção das doses apropriadas para injeção i.v. ou instilação lo- cal são determinadas a partir dos experimentos de dose resposta preliminares. Tentativas de doses baseadas na atividade inibitória de MANS em neutrófilos humanos são: 1 mg/Kg para a distribuição i.v. administrada uma vez ou uma concentração final de 50 μΜ localmen- te distribuído (na bolsa de ar ou i.p.). As doses para distribuição i.v. são escolhidas assu- mindo um volume de distribuição de 2 L/Kg.
Modelo de inflamação de bolsa de ar:
Ensaios para inflamação e infiltração de neutrófilos na bolsa de ar de camundongo são efetuados conforme descrito em Clish CB, O1Brien JA, Gronert K, Stahl GL, Petasis NA, Serhan CN. Local and systemic delivery of a stable aspirin-triggered Iipoxin prevents neutrophil recruitment in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jul 6; 96 (14): 8247-52. Deste modo, camundongos BALB/c machos brancos (6 a 8 semanas) são anestesiados com iso- flurano, e bolsas de ar dorsais são suscitadas pela injeção de 3 mL de ar estéril subcutane- amente nos dias 0 e 3. No dia 6, e enquanto os camundongos são anestesiados com isoflu- rano, veículo, MANS, RNS, peptídeo de teste ou opcionalmente peptídeo-SCR são distribuí- dos como uma injeção em massa ou i.v. dentro da veia do rabo em 100 μΜ de salina 0,9% estéril ou localmente na bolsa de ar em 900 μί de PBS -/- (Salina tamponada com fosfato da Dulbecco sem íons magnésio ou cálcio, BioWhittaker). Dexametasona (Sigma) distribuída i.v. como 0,1 mg/Kg em 100 μί de salina 0,9% estéril ou localmente como 10 μ9 em 900 μΙ_ de PBS -/- serve como um agente antiinflamatório de referência. A inflamação na bolsa de ar é induzida pela injeção local do fator de necrose tumoral de murino recombinante α (TNF-α, ng) (Boehringer Mannheim) dissolvido em 100 μΙ de PBS estéril, enquanto os camun- dongos são anestesiados com isoflurano, as bolsas de ar são lavadas duas vezes com 3 mL de PBS estéril 4 h depois do início da injeção de TNF-α. Os aspirados são centrifugados a 2.000 rpm por 15 min a 23 0C. Os sobrenadantes são removidos e as células suspensas em 500 μι. de PBS. As alíquotas dos sobrenadantes são ensaiadas para concentrações do me- diador inflamatório (opcionalmente exceto para TNFa), atividade MPO e peroxidação lipídi- ca.
Os leucócitos totais são enumerados na suspensão celular por microscopia ótica usando um hemocitômetro. As células aspiradas ressuspensas (50 μΙ_) são adicionadas a 150 μί de BSA 30% e centrifugadas em lâminas de microscópio a 2.000 rpm por 4 min pelo uso de uma citocentrífuga. As contagens de leucócitos diferenciais são determinadas em citopsinas manchadas com manchamento Wright Giemsa e usadas para calcular a quanti- dade absoluta de cada leucócito por exsudato de bolsa de ar. Para análise microscópica, os tecidos são obtidos com uma bolsa de biópsia de tecido de 6 mm (Acu-Punch, Acuderm) e fixados em 10% de formaldeído tamponado. As amostras são, a seguir, embebidas em para- fina, fatiadas e manchadas com hematoxilina-eosina. Os neutrófilos são enumerados em seções histológicas pela contagem da quantidade de células/hpf. A derme distante serve como um controle para a derme da bolsa de ar inflamada.
Os dados são apresentados como a quantidade total de neutrófilos, monócitos, eo- sinófilos, basófilos e linfócitos por exsudato ou a quantidade de neutrófilos por tecido do campo de alta eficiência. Os valores estão reportados como a média ± SEM (n = 6). A signi- ficância de qualquer tratamento na migração é determinada por ANOVA. P < 0,05 é para ser considerado como significativo.
Exemplo 6.
Modelo de peritôneo inflamado:
Camundongos BALB/c machos (6 a 8 semanas) são usados e os modelos de peri- tonite induzidos por tioglicolato efetuados conforme descrito em Tedder TF, Steeber DA, Pizcueta P. L-selectin-deficient mice have impaired Ieukocyte recruitment into inflammatory sites. J Exp Med. 1995 Jun 1; 181 (6): 2259-64. Veículo, MANS, RNS, peptídeo teste, e op- cionalmente peptídeo-SCR são distribuídos como uma injeção em massa ou na veia do rabo em 100 μΜ de salina 0,9% estéril ou localmente no peritôneo 900 μΙ_ de PBS -/- imediata- mente antes da injeção i.p. de tioglicolato. Dexametasona distribuída i.v. como 0,1 mg/Kg em 100 μΙ_ de salina 0,9% estéril ou localmente como 10 μg em 900 μΙ_ de PBS -/- serve como um agente antiinflamatório de referência. A inflamação é induzida pela injeção de 1 mL de solução de tioglicolato (3% em peso; vol; Sigma Immunochemicals) intraperitoneal- mente no camundongo.
Os camundongos foram humanamente eutanasiados 24 h após a indução da infla- mação e 5 mL de aquecido (37 0C ~ meio (RPMI 1640, FCS 2% e EDTA 2 mM) injetados no peritôneo seguido por uma suave massagem do abdômen. Os aspirados do fluido de lava- gem abdominal são centrifugados a 2.000 rpm por 15 min a 23 0C. Os sobrenadantes são removidos e as células suspensas em 500 μί de PBS. As alíquotas do sobrenadante são ensaiadas para atividade MPO1 concentrações de mediador inflamatório e peroxidação lipí- dica.
Os leucócitos totais são enumerados na suspensão celular por microscopia ótica
usando um hemocitômetro. As células aspiradas ressuspensas (50 μΙ_) são adicionadas a 150 μΙ_ de BSA 30% e centrifugadas em lâminas de microscópio a 2.200 rpm por 4 min pelo uso de uma citocentrífuga. As contagens de leucócitos diferenciais são determinadas em citopsinas manchadas com manchamento Wright Giemsa e usadas para calcular a quanti- dade absoluta de cada leucócito por aspirato de bolsa de ar.
Os dados são apresentados como quantidade de neutrófilos, monócitos, eosinófi- Ios1 basófilos e linfócitos por exsudato. Os valores são reportados como a média ± SEM (n = 6). A significância de qualquer tratamento na migração é determinada por ANOVA. P < 0,05 é para ser considerado significativo. Desgranulação:
Mieloperoxidase é usada como um marcador da desgranulação. A atividade da mie- Ioperoxidase no sobrenadante celular obtido a partir da bolsa de ar ou do fluido de lavagem peritoneal é ensaiado e analisado conforme descrito acima usando o método TMB.
Concentrações do mediador inflamatório: As concentrações dos mediadores proinflamatórios chave TNFa1 IL-Ιβ, IL-10, IL-6,
KC e PGE2 na bolsa de ar e no fluido de lavagem peritoneal são determinadas usando kits de ELISA comerciais (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante.
Peroxidação lipídica:
A concentração de F2-isoprostanos é uma medição sensível e específica da injúria oxidativa resultante da liberação de intermediários de oxigênio reativos a partir dos neutrófi- los e outras células {Milne GL, Musiek ES, Morrow JD. F2-isoprostanes as markers of oxidative stress in vivo: an overview. Biomarkers. 2005 Nov; 10 Suppl l:S10-23}. A concen- tração de F2-isoprostano é determinada numa bolsa de ar e nos sobrenadantes de exsudato peritoneal usando um ELISA comercialmente disponível (8-isoprostano EIA1 Cayman Che- mical) de acordo com as instruções do fabricante.
Ponto final:
O experimento é considerado como sendo bem sucedido se ou a distribuição local ou sistêmica do peptídeo teste reduzir a inflamação por uma ou mais das medidas acima de inibição de liberação do mediador inflamatório.
Os peptídeos de fragmento ativo dessa invenção inibem o influxo de neutrófilos pa- ra dentro e a desgranulação na bolsa de ar inflamada ou peritôneo, resultando numa ativi- dade MPO reduzida, na peroxidaçao lipídica reduzida e na produção de mediador inflamató- rio reduzida.
Os exemplos precedentes são ilustrativos da presente invenção e não são para se- rem construídos como seus limitantes. A invenção é definida pelas reivindicações a seguir, com equivalentes das reivindicações para serem ali incluídos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> BioMarck Pharmaceuticals, Ltd.
<120> MÉTODOS PARA ATENUAR A LIBERAÇÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PEPTÍDEOS ÚTEIS NESSE SENTIDO
<130> BMRK-004/ OlWO
<140> PCTUS0774514 <141> 26-07-2007
<150> US 60/833,239 <151> 26-07-2006
<160> 252
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1 <211> 24 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 1
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 20
<210>2 <211> 23 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400>2
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15 Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 20
<210>3 <211> 23 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não serC-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400>3
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 20
<210>4 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400>4
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro Gly Glu Ala Ala 20
<210>5 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400>5
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly Glu Ala Ala Val 20
<210> 6 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400>6
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly Glu Ala Ala Val Ala 20
<210>7 <211> 21 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400>7
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro Gly Glu Ala 20 <210>8 <211> 21 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400>8
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly Glu Ala Ala 20
<210>9 <211> 21 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400>9
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly Glu Ala Ala Val 20
<210> 10 <211> 21 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 10
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
Glu Ala Ala Val Ala 20
<210> 11 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 11
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro Gly Glu 20
<210> 12 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 12
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly Glu Ala 20
<210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 13
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly Glu Ala Ala 20
<210> 14 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 14
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
Glu Ala Ala Val 20
<210> 15 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 15
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15
Ala Ala Val Ala 20
<210> 16 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 16
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro Gly
<210> 17 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 17
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly Glu
<210> 18 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 18
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys GIy Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly Glu Ala
<210> 19 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 19
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
Glu Ala Ala
<210> 20 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 20
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15
Ala Ala Val <210> 21 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 21
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10 15
Ala Val Ala
<210> 22 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 22
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
Arg Pro
<210> 23 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220> <223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 23
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro Gly
<210> 24 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 24
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly Glu
<210> 25 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 25
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
Glu Ala
<210> 26 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 26
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15
Ala Ala
<210> 27 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 27
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10 15
Ala Val
<210> 28 <211> 18 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 28 Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10 15
Val Ala
<210> 29 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 29
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu AIa Ala Ala Glu 10 15
Arg
<210> 30 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 30
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
Pro
<210> 31 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 31
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
Gly
<210> 32 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 32
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
Glu
<210> 33 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 33
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15 Ala
<210> 34 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 34
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10 15
Ala
<210> 35 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 35
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10 15
Val
<210> 36 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 36
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10 15
Ala
<210> 37 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 37
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
<210> 38 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 38
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15
<210> 39 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 39
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
<210> 40 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 40
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
<210> 41 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 41
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15
<210> 42 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado <400> 42
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly GIu Ala 10 15
<210> 43 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 43
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10 15
<210> 44 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 44
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10 15
<210> 45 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 45 Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10 15
<210> 46 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 46
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10 15
<210> 47 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 47
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys GIy Glu Ala Ala Ala Glu 10 15
<210> 48 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 48
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 49
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10 15
<210> 50 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 50
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 15
<210> 51 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 51
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10 15
<210> 52 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 52
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10 15
<210> 53 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 53
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10 15
<210> 54 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 54
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10 15
<210> 55 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 55
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10 15
<210> 56 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 56
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 10
<210> 57 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 57
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10
<210> 58 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptxdeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 58
GIn Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10
<210> 59 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 59
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys GIy GIu Ala Ala Ala Glu Arg 10
<210> 60 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 60
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10
<210> 61 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado <400> 61
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10
<210> 62 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 62
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10
<210> 63 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 63
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10
<210> 64 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 64 Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala GIu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10
<210> 65 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 65
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10
<210> 66 <211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 66
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10
<210> 67 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 67
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 68
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 10
<210> 69 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 69
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10
<210> 70 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 70
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10
<210> 71 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 71
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10
<210> 72 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 72
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10
<210> 73 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 73
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10
<210> 74 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 74
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10
<210> 75 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 75
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10
<210> 76 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 76
Lys Gly Glu Ala Ala Ala GIu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10
<210> 77 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 77
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10
<210> 78 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 78
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10
<210> 79 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 79
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 80 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 80
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 10
<210> 81 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 81
Gln Phe Ser Lys Thr AIa Ala Lys Gly Glu Ala Ala 10
<210> 82 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 82
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10
<210> 83 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 83 Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10
<210> 84 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 84
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10
<210> 85 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 85
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10
<210> 86 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 86
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10 <210> 87 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 87
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10
<210> 88 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 88
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10
<210> 89 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 89
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10
<210> 90 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 90
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10
<210> 91 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 91
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10
<210> 92 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 92
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala AIa Lys Gly 10
<210> 93 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 93
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 94 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 94
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 10
<210> 95 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 95
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 10
<210> 96 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 96
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10
<210> 97 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 97
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10
<210> 98 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 98
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10
<210> 99 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 99
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10
<210> 100 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 100
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10
<210> 101 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 101
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 10
<210> 102 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 102 Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10
<210> 103 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 103
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10
<210> 104 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 104
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10
<210> 105 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 105
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10 <210> 106 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 106
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 10
<210> 107 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 107
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly 10
<210> 108 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 108
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 109 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 109
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 10
<210> 110 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 110
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 10
<210> 111 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 111
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 10
<210> 112 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 112
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 10
<210> 113 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 113
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 10
<210> 114 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 114
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 10
<210> 115 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 115
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 10
<210>116 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 116
Gly Glu Ala Ala Ala GIu Arg Pro Gly Glu 10
<210> 117 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 117
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 10
<210> 118 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 118
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 10
<210> 119 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 119
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 10
<210> 120 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 120
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 10
<210> 121 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 121 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala 1 5
<210> 122 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 122
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5
<210> 123 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 123
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly 1 5
<210> 124 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 124
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly GIu 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 125
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5
<210> 126 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 126
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 127 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 127
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5
<210> 128 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 128
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5
<210> 129 <m> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 129
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5
<210> 130 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 130
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5
<210> 131 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 131
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5
<210> 132 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 132
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5
<210> 133 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 133
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 1 5
<210> 134 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 134
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 135 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintático
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 135
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 1 5
<210> 136 <211>9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 136
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 1 5
<210> 137 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 137
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala 1 5
<210> 138 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo oode ou não *er C-ter mina! e/ ou N-terir.ir modificado
<400> 138
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala 1 5
<210> 139 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 139
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5
<210> 140 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 140 Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly 1 5
<210> 141 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<4nn> 141
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5
<210> 142 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 142
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5
<210> 143 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 143
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 144 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 144
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5
<210> 145 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 145
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5
<210> 146 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 146
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5
<210> 147 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 147
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5
<210> 148 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 148
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5
<210> 149 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 149
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5
<210> 150 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 150
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 1 5
<210> 151 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 151
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 152 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 152
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 1 5
<210> 153 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 153
Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 1 5
<210> 154 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sin frétírn
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 154
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr 1 5
<210> 155 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 155
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala 1 5
<210> 156 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 156
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala 1 5
<210> 157 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> PeDtideo noríp n» não ser C-terminal ε/ou iN-temimai
AÍ" '
modificado <400> 157
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5
<210> 158 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 158
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly 1 5
<210> 159 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 159 Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5
<210> 160 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 160
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5
<210> 161 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 161
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 162 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 162
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 <210> 163 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 163
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5
<210> 164 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 164
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5
<210> 165 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 165
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5
<210> 166 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 166
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5
<210> 167 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 167
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5
<210> 168 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 168
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 1 5
<210> 169 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 169
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 170 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 170
Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 1 5
<210> 171 <211>7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 171
Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 1 5
<210> 172 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptxdeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 172
Gly Ala Gln Phe Ser Lys 1 5
<210> 173 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 173
Ala Gln Phe Ser Lys Thr 1 5
<210> 174 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 174
Gln Phe Ser Lys Thr Ala 1 5
<210> 175 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 175
Phe Ser Lys Thr Ala Ala 1 5
<210> 176 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 176
Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5
<210> 177 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 177
Lys Thr Ala Ala Lys Gly 1 5
<210>178 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 178 Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5
<210> 179 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 179
Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5
<210> 180 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 180
Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 181 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 181
Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 <210> 182 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 182
Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5
<210> 183 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 183
Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5
<210> 184 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 184
Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5
<210> 185 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 185
Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5
<210> 186 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 186
Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5
<210> 187 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 187
Glu Arg Pro Gly Glu Ala 1 5
<210> 188 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 188
Arg Pro Gly Glu Ala Ala 1 5
<210> 189 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 189
Pro Gly Glu Ala Ala Val 1 5
<210> 190 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 190
Gly Glu Ala Ala Val Ala 1 5
<210> 191 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 191
Gly Ala Gln Phe Ser 1 5
<210> 192 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 192
Ala Gln Phe Ser Lys
1 5
<210> 193 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 193
Gln Phe Ser Lys Thr 1 5
<210> 194 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 194
Phe Ser Lys Thr Ala
1 5
<210> 195 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 195
Ser Lys Thr Ala Ala
1 5
<210> 196 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 196
Lys Thr Ala Ala Lys 1 5
<210> 197 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 197 Thr Ala Ala Lys Gly 1 5
<210> 198 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 198
Ala Ala Lys Gly Glu 1 5
<210> 199 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 199
Ala Lys Gly Glu Ala 1 5
<210> 200 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 200
Lys Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 201 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 201
Gly Glu Ala Ala Ala 1 5
<210> 202 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 202
Glu Ala Ala Ala Glu 1 5
<210> 203 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 203
Ala Ala Ala Glu Arg 1 5
<210> 204 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 204
Ala Ala Glu Arg Pro 1 5
<210> 205 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 205
Ala Glu Arg Pro Gly 1 5
<210> 206 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 206
Glu Arg Pro Gly Glu 1 5
<210> 207 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 207
Arg Pro Gly Glu Ala 1 5
<210> 208 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 208
Pro Gly Glu Ala Ala
1 5
<210> 209 <211>5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 209
Gly Glu Ala Ala Val 1 5
<210> 210 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 210
Glu Ala Ala Val Ala 1 5
<210> 211 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 211
Gly Ala Gln Phe
1
<210> 212 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 212 Ala Gln Phe Ser 1
<210> 213 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 213 Gln Phe Ser Lys 1
<210> 214 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 214 Phe Ser Lys Thr 1
<210> 215 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 215 Ser Lys Thr Ala 1
<210> 216 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 216 Lys Thr Ala Ala 1
<210> 217 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 217 Thr Ala Ala Lys 1
<210> 218 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial·. Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 218 Ala Ala Lys Gly 1
<210> 219 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 219
Ala Lys Gly Glu
1 <210> 220 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 220
Lys Gly Glu Ala
1
<210> 221 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 221
Gly Glu Ala Ala
1
<210> 222 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 222
Glu Ala Ala Ala
1
<210> 223 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 223
Ala Ala Ala Glu
1
<210> 224 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 224
Ala Ala Glu Arg
1
<210> 225 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 225
Ala Glu Arg Pro
1
<210> 226 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 226 Glu Arg Pro Gly 1
<210> 227 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 227 Arg Pro Gly Glu 1
<210> 228 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 228 Pro Gly Glu Ala 1
<210> 229 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 229
Gly Glu Ala Ala
1
<210> 230 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 230 Glu Ala Ala Val 1
<210> 231 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 231 Ala Ala Val Ala 1
<210> 232 <211> 24 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado <400> 232
Gly Thr Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ala Gly Ala Glu Val Lys Arg Ala 10 15
Ser Ala Glu Ala Lys Gln Ala Phe 20
<210> 233 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 233
Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 234 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 234
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu 10
<210> 235 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220> <223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 235
Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu 10
<210> 236 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 236
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys 10
<210> 237 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 237
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 238 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado <400> 238
Gly Ala Glu Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 10
<210> 239 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 239
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala Gly Glu 10
<210> 240 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 240
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Ala Glu 10
<210> 241 <211> 12 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 241
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Ala 10 <210> 242 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 242
Ala Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 10
<210> 243 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 243
Gly Ala Ala Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 10
<210> 244 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 244
Gly Ala Gln Phe Ala Lys Thr Ala Ala Lys 10
<210> 245 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 245
Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Lys 10
<210> 246 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 246
Lys Ala Ala Thr Lys Ser Phe Gln Ala Gly 10
<210> 247 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 247
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Ala Ala Ala Lys 10
<210> 248 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 248
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala 10
<210> 249 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 249
Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ala 10
<210> 250 <211>8 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 250
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala 1 5
<210> 251 <211>4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético <220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ou N-terminal modificado
<400> 251
Ala Ala Gly Glu
1
<210> 252 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<223> Peptídeo pode ou não ser C-terminal e/ ou N-terminal modificado
<400> 252
Gly Lys Ala Ser Gln Phe Ala Lys Thr Ala 10

Claims (57)

1. Método de inibição da liberação de pelo menos um mediador inflamatório a partir de um grânulo em pelo menos uma célula inflamatória num tecido e/ou fluido de um indiví- duo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a administração ao referido tecido e/ou fluido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos com de 4 a 23 aminoácidos contíguos de uma seqüência de referência, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); (b) uma seqüência de aminoácidos com a seqüência GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); e (c) uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência definida em (a), em que o aminoácido C-terminal do peptídeo é opcionalmente independentemente quimicamente modificado, e o aminoácido N-terminal do peptídeo é independentemente quimicamente modificado por acilação com um ácido carboxílico selecionado do grupo con- sistindo de um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C2 a C13, um ácido car- boxílico alifático insaturado ou saturado de C14, um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C15 a C24 e ácido trifluoracético, ou não é quimicamente modificado, com a condição de que o referido peptídeo é modificado por acilação quando sua seqüência de aminoácido começa com a seqüência GAQF da seqüência de referência pela acilação so- mente com um ácido carboxílico selecionado do grupo consistindo de um ácido carboxílico alifático saturado ou insaturado C2 a C13, um ácido carboxílico alifático insaturado de C14, um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C15 a C24 e ácido trifluoracético, ou não é quimicamente modificado, em que o referido peptídeo, opcionalmente combinado com um veículo farmaceutícamente aceitável, e numa quantidade redutora de liberação de medi- ador inflamatório terapeuticamente eficaz para reduzir a liberação do referido mediador in- flamatório a partir de pelo menos uma célula inflamatória em comparação com a liberação do referido mediador inflamatório a partir de pelo menos um dentre o mesmo tipo de célula inflamatória que poderia ocorrer na ausência do referido pelo menos um peptídeo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é acetilado no aminoácido alfa N-terminal.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos dez resíduos de aminoácidos contíguos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de acetil - peptídeo 106 (SEQ ID NO: 106).
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos quatro resíduos de aminoácidos contíguos.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos seis resíduos de aminoácidos contíguos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado no aminoácido alfa-N-terminal.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa-C-terminal.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de (a), em que o aminoácido N- terminal da seqüência de aminoácidos de (a) é selecionado da posição do aminoácido 2 até 21 da seqüência de referência, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1).
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado ou acetilado no aminoácido alfa-N-terminal.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa C-terminal.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida redução da liberação de um mediador inflamatório compreende o bloqueio ou a inibição do mecanismo que libera um mediador inflamatório da referida célula inflamatória no referido indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo ainda compreende um veículo far- maceuticamente aceitável para formar uma composição farmacêutica.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula inflamatória é um leucócito.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula inflamatória é um granulócito.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula inflamatória é selecionada do grupo consistindo de um neutrófilo, de um basófilo, de um eosinófilo e de uma combinação destes.
17. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula inflamatória é um monócito ou macrófago.
18. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido mediador inflamatório é selecionado do grupo consistindo de uma mieloperoxida- se (MPO), de uma eosinófilo peroxidase (EPO), da proteína básica principal [MBP], da Iiso- zima, de granzima, de histamina, de proteoglicano, de protease, de um fator quimiotático, de citocina, de um metabólito do ácido araquidônico, de defensina, de proteína intensificadora da permeabilidade bactericida (BPI)1 de elastase, de catepsina G, de catepsina B, de catep- sina D, de beta-D-glucuronidase, de alfa-manosidase, de fosfolipase A2, de condroitin-4- sulfato, de proteinase 3, de lactoferrina, de colagenase, de ativador de complemento, de receptor de complemento, de receptor de N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (FMLP), de re- ceptor de laminina, de citocromo b558, de fator quimiotático de monócito, de histaminase, de proteína de ligação à vitamina B12, de gelatinase, de ativador de plasminogênio, de beta-D- glucuronidase e de uma combinação destes.
19. Método de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido mediador inflamatório é selecionado do grupo consistindo de uma mieloperoxida- se (MPO), de uma eosinófilo peroxidase (EPO), da proteína básica principal [MBP], da Iiso- zima, de granzima e de uma combinação destes.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida quantidade redutora de liberação de mediador inflamatório eficaz do referido pep- tídeo compreende uma quantidade inibidora de desgranulação do peptídeo que reduz a quantidade de um mediador inflamatório liberado de pelo menos uma célula inflamatória de cerca de 1% até cerca de 99% em comparação com a quantidade liberada de pelo menos uma célula inflamatória na ausência do peptídeo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida quantidade redutora de liberação de mediador inflamatório eficaz do referido pep- tídeo compreende uma quantidade inibidora de desgranulação do peptídeo que reduz a quantidade de um mediador inflamatório liberado de pelo menos uma célula inflamatória de cerca de 5 a 50% até cerca de 99% em comparação com a quantidade liberada de pelo me- nos uma célula inflamatória na ausência do peptídeo.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido indivíduo é afligido por uma doença respiratória.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença respiratória é selecionada do grupo consistindo de asma, bronquite crônica, DPOC e fibrose cística.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido indivíduo é um mamífero.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido mamífero é selecionado do grupo consistindo de humanos, caninos, eqüinos e felinos.
26. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida administração é selecionada do grupo consistindo de administração tópica, admi- nistração parenteral, administração retal, administração pulmonar, administração nasal e administração oral.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida administração pulmonar compreende um aerossol.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido aerossol é gerado a partir de um inalador de pó seco, um inalador de dose medida ou nebulizador.
29. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda a administração ao referido indivíduo de uma segunda molécula sele- cionada do grupo consistindo de um antibiótico, de um composto antiviral, de um composto antiparasítico, de um composto antiinflamatório e de um imunomodulador.
30. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido indivíduo está sofrendo de uma doença selecionada do grupo consistindo de uma doença do intestino, de uma doença de pele, de uma doença auto-imune, de uma síndrome da dor e de suas combinações.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença do intestino é selecionada do grupo consistindo de colite ulcerativa, de doença de Crohn e da síndrome do intestino irritável.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença de pele é selecionada do grupo consistindo de rosácea, eczema, psoríase e acne severa.
33. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido indivíduo está sofrendo de artrite.
34. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de (c) substancialmente idêntica à seqüência de aminoácidos de (a) é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251 e 252.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é acetilado no aminoácido alfa-N-terminal.
36. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado no aminoácido alfa-N-terminal.
37. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa C-terminal.
38. Peptídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de ter uma seqüência de amino- ácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) uma seqüência de aminoácidos com de 4 a 23 aminoácidos contíguos de uma seqüência de referência, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); (b) uma seqüência de aminoácidos com a seqüência GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1); e (c) uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência definida em (a), em que o aminoácido C-terminal do peptídeo é opcionalmente independentemente quimicamente modificado, e o aminoácido N-terminal do peptídeo é independentemente quimicamente modificado por acilação com um ácido carboxílico selecionado do grupo con- sistindo de um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C2 a C13, um ácido car- boxílico alifático insaturado ou saturado de C14, um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C15 a C24 e ácido trifluoracético, ou não é quimicamente modificado, com a condição de que o referido peptídeo é modificado por acilação quando sua seqüência de aminoácido começa com a seqüência GAQF da seqüência de referência por acilação so- mente com um ácido carboxílico selecionado do grupo consistindo de um ácido carboxílico alifático saturado ou insaturado C2 a C13, um ácido carboxílico alifático insaturado de C14, um ácido carboxílico alifático insaturado ou saturado de C15 a C24 e ácido trifluoracético, ou não é quimicamente modificado, em que o referido peptídeo, opcionalmente combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, e numa quantidade redutora de liberação de medi- ador inflamatório terapeuticamente eficaz para reduzir a liberação do referido mediador in- flamatório a partir de pelo menos uma célula inflamatória em comparação com a liberação do referido mediador inflamatório a partir de pelo menos um dentre o mesmo tipo de célula inflamatória que poderia ocorrer na ausência do referido pelo menos um peptídeo.
39. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é acilado no aminoácido alfa N-terminal.
40. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos dez resíduos de aminoácidos contíguos.
41. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de acetil - peptídeo 106 (SEQ ID NO: 106).
42. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos quatro resíduos de aminoácidos contíguos.
43. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo consiste de pelo menos seis resíduos de aminoácidos contíguos.
44. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado no aminoácido alfa N-terminal.
45. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa C-terminal.
46. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de (a), em que o aminoácido N- terminal da seqüência de aminoácidos de (a) é selecionado da posição de aminoácido 2 a 21 da seqüência de referência, GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO. 1).
47. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado no aminoácido alfa N-terminal.
48. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa C-terminal.
49. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de (c) substancialmente idêntica à seqüência de aminoáci- dos de (a) é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251 e 252.
50. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é acilado no aminoácido alfa N-terminal.
51. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é miristoilado no aminoácido alfa N-terminal.
52. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é amidado com amônia no aminoácido alfa C-terminal.
53. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um peptídeo isola- do de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52 e um excipiente.
54. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um peptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52 e um veículo far- maceuticamente aceitável.
55. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição é estéril, esterilizável ou esterili- zada.
56. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de compreender pelo menos um peptídeo iso- lado de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 - 52.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida administração do referido peptídeo reduz a hipersecreção de muco relacionado com MARCKS a partir de pelo menos uma célula ou tecido secretor de muco no referido indivíduo, por meio do que a hipersecreção de muco no indivíduo é reduzida em comparação com aquela a qual poderia ocorrer na ausência da re- ferida administração do referido peptídeo.
BRPI0714953-0A2A 2006-07-26 2007-07-26 mÉtodos para atenuar a liberaÇço de mediadores inflamatàrios e peptÍdeos éteis nesse sentido BRPI0714953A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83323906P 2006-07-26 2006-07-26
US60/833.239 2006-07-26
PCT/US2007/074514 WO2008014414A2 (en) 2006-07-26 2007-07-26 Methods for attenuating release of inflammatory mediators and peptides useful therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0714953A2 true BRPI0714953A2 (pt) 2013-07-16

Family

ID=38982357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0714953-0A2A BRPI0714953A2 (pt) 2006-07-26 2007-07-26 mÉtodos para atenuar a liberaÇço de mediadores inflamatàrios e peptÍdeos éteis nesse sentido

Country Status (21)

Country Link
US (6) US8999915B2 (pt)
EP (2) EP2053915B1 (pt)
JP (2) JP5378998B2 (pt)
KR (1) KR101599894B1 (pt)
CN (2) CN101516190B (pt)
AU (1) AU2007279193B2 (pt)
BR (1) BRPI0714953A2 (pt)
CA (2) CA2658949C (pt)
DK (2) DK2053915T3 (pt)
ES (2) ES2488092T3 (pt)
HR (1) HRP20140587T1 (pt)
IL (1) IL196667A (pt)
MX (1) MX2009000975A (pt)
NO (1) NO20090304L (pt)
PL (2) PL2053915T3 (pt)
PT (1) PT2053915E (pt)
RU (1) RU2423376C2 (pt)
SG (2) SG173411A1 (pt)
SI (1) SI2053915T1 (pt)
WO (1) WO2008014414A2 (pt)
ZA (1) ZA200900550B (pt)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2399599A3 (en) 2005-01-20 2012-04-18 Biomarck Pharmaceuticals, Ltd. Mucin hypersecretion inhibitors and methods of use
CN101516190B (zh) 2006-07-26 2014-06-11 拜欧马克医药有限公司 减少炎症介质释放的方法和可用于该方法的肽
WO2010151699A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-29 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
WO2011060349A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 North Carolina State University Methods of modulating mesenchymal stem cells
HUE043971T2 (hu) 2013-04-05 2019-09-30 Biomarck Pharmaceuticals Ltd Egy fûtõrendszer mûködtetési eljárása, fûtõrendszer és felhasználásai
WO2015013669A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 The Regents Of The University Of California Mps peptides and use thereof
US10314889B2 (en) 2013-12-20 2019-06-11 The Regents Of The University Of California Suppression of allergic lung inflammation and hyperreactivity
KR102181548B1 (ko) * 2019-02-20 2020-11-20 한국외국어대학교 연구산학협력단 염증성 질환 또는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
JP2022527133A (ja) 2019-04-12 2022-05-30 リップタイド バイオサイエンス インコーポレイテッド マクロファージの活性を調節する方法
EP3982928A4 (en) 2019-06-17 2023-07-19 Biomarck Pharmaceuticals, Ltd. PEPTIDES AND METHODS FOR THEIR USE IN THE TREATMENT OF UVEITIS
EP4475866A4 (en) * 2022-02-07 2026-02-25 Park Strategic Ventures Llc Peptides and their methods of use in the treatment of eye disorders
US20250262272A1 (en) * 2022-04-25 2025-08-21 Park Strategic Ventures Llc Peptides and methods of use thereof in treating skin diseases
CN116375796A (zh) * 2022-11-24 2023-07-04 华南农业大学 一种来源于珍珠贝的抗炎肽及其应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61265341A (ja) * 1985-05-17 1986-11-25 Kawasaki Heavy Ind Ltd Ｖ型エンジンのシリンダ−ブロツク構造
US4873346A (en) 1985-09-20 1989-10-10 The Upjohn Company Substituted benzothiazoles, benzimidazoles, and benzoxazoles
US4753945A (en) 1986-02-19 1988-06-28 Eye Research Institute Of Retina Foundation Stimulation of tear secretion with phosphodiesterase inhibitors
US4966848A (en) * 1988-02-08 1990-10-30 The General Hospital Corporation Isolation, purification, characterization, cloning and sequencing of N α-acetyltransferase
CA2003316A1 (en) 1988-11-18 1990-05-18 John F. Oram Hdl-binding proteins
US5223421A (en) * 1989-10-25 1993-06-29 The General Hospital Corporation Identification of methionine Nα-acetyltransferase
WO1992005784A1 (en) 1990-10-02 1992-04-16 Warner-Lambert Company 4,5,6,7-tetrahydro-1h-imidazo[4,5-c]pyridine derivatives and analogues as angiotensin ii receptor antagonists
US5292498A (en) 1991-06-19 1994-03-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of treating lung disease with uridine triphosphates
WO1993000353A1 (en) 1991-06-20 1993-01-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sequences characteristic of human gene transcription product
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
EP0551200A1 (en) 1992-01-07 1993-07-14 National University Of Singapore Protein phosphatase inhibitors for use in therapy
US5298506A (en) 1992-05-08 1994-03-29 Brigham And Women's Hospital Use of guanylate cyclase inhibitors in the treatment of shock
US5861502A (en) 1992-11-09 1999-01-19 Thomas Jefferson University Antisense oligonucleotides to inhibit expression of mutated and wild type genes for collagen
US5512269A (en) 1993-06-09 1996-04-30 Burroughs Wellcome, Co. Method of treating retained pulmonary secretions
US5849719A (en) 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
US5858981A (en) 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
US5436243A (en) 1993-11-17 1995-07-25 Research Triangle Institute Duke University Aminoanthraquinone derivatives to combat multidrug resistance
EP0759768A4 (en) 1994-04-07 2000-08-09 Proteinix Company VASOACTIVE COLON PEPTIDE
US5985822A (en) 1994-12-09 1999-11-16 The Scripps Research Institute Inhibition of glial cell proliferation with N-CAM homophilic peptides
US6713605B1 (en) 1996-04-10 2004-03-30 Kansas State University Research Foundation Synthetic peptides that inhibit leukocyte superoxide anion production and/or attract leukocytes
US5688489A (en) * 1995-09-15 1997-11-18 Resolution Pharmaceuticals, Inc. Non-receptor mediated imaging agents
GB9620390D0 (en) 1996-09-30 1996-11-13 Eisai London Res Lab Ltd Substances and their uses
DE19716713A1 (de) 1997-04-21 1998-10-22 Paz Arzneimittelentwicklung Arzneimittel, enthaltend Ibuprofenthioester als Hemmer der Nf-kappaB abhängigen Bildung von Mediatoren von Entzündung und Schmerz
EP1154786B1 (en) 1999-02-24 2004-10-13 North Carolina State University Compositions for altering mucus secretion
US8501911B2 (en) 1999-02-24 2013-08-06 Biomarck Pharmaceuticals, Ltd Methods of reducing inflammation and mucus hypersecretion
US7544772B2 (en) * 2001-06-26 2009-06-09 Biomarck Pharmaceuticals, Ltd. Methods for regulating inflammatory mediators and peptides useful therein
US6245320B1 (en) 1999-09-01 2001-06-12 University Of Maryland Inhibition of mucin release from airway goblet cells by polycationic peptides
AU7709300A (en) 1999-09-24 2001-04-24 Linden Technologies, Inc. Drug discovery using gene expression profiling
ATE245639T1 (de) 1999-12-03 2003-08-15 Pfizer Prod Inc Acetylenderivate zur verwendung als schmerzstillendes oder entzündungshemmendes mittel
US7919469B2 (en) 2000-02-24 2011-04-05 North Carolina State University Methods and compositions for altering mucus secretion
US7265088B1 (en) 2000-02-24 2007-09-04 North Carolina State University Method and compositions for altering mucus secretion
AU2002322475B2 (en) 2001-06-26 2008-02-21 North Carolina State University Blocking peptide for inflammatory cell secretion
JP2004049133A (ja) 2002-07-22 2004-02-19 Kumamoto Technology & Industry Foundation Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法
WO2006023312A2 (en) 2004-08-20 2006-03-02 Carl Deirmengian Diagnostic assay for source of inflammation
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
EP2399599A3 (en) 2005-01-20 2012-04-18 Biomarck Pharmaceuticals, Ltd. Mucin hypersecretion inhibitors and methods of use
CN101516190B (zh) 2006-07-26 2014-06-11 拜欧马克医药有限公司 减少炎症介质释放的方法和可用于该方法的肽

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009544737A (ja) 2009-12-17
JP2013241428A (ja) 2013-12-05
JP5819889B2 (ja) 2015-11-24
EP2053915A2 (en) 2009-05-06
EP2722052B1 (en) 2019-03-20
US9827287B2 (en) 2017-11-28
ZA200900550B (en) 2010-03-31
US20200138898A1 (en) 2020-05-07
CA2842219C (en) 2017-07-11
US8999915B2 (en) 2015-04-07
AU2007279193A1 (en) 2008-01-31
CN101516190A (zh) 2009-08-26
US20210260154A1 (en) 2021-08-26
DK2053915T3 (da) 2014-06-30
RU2423376C2 (ru) 2011-07-10
ES2488092T3 (es) 2014-08-26
EP2053915A4 (en) 2011-06-08
US20090203620A1 (en) 2009-08-13
CN103990111B (zh) 2016-08-31
JP5378998B2 (ja) 2013-12-25
SG10201500418QA (en) 2015-03-30
SG173411A1 (en) 2011-08-29
KR101599894B1 (ko) 2016-03-04
SI2053915T1 (sl) 2014-10-30
NO20090304L (no) 2009-04-21
MX2009000975A (es) 2009-04-07
ES2725599T3 (es) 2019-09-25
HK1201190A1 (en) 2015-08-28
US20180036367A1 (en) 2018-02-08
HRP20140587T1 (hr) 2014-11-21
RU2009106673A (ru) 2010-09-10
PT2053915E (pt) 2014-08-25
CA2658949A1 (en) 2008-01-31
IL196667A0 (en) 2011-08-01
WO2008014414A2 (en) 2008-01-31
EP2722052A1 (en) 2014-04-23
DK2722052T3 (en) 2019-04-29
US20160030509A1 (en) 2016-02-04
CA2658949C (en) 2014-04-22
CA2842219A1 (en) 2008-01-31
CN101516190B (zh) 2014-06-11
KR20090037487A (ko) 2009-04-15
WO2008014414A3 (en) 2008-09-25
PL2053915T3 (pl) 2014-12-31
US20230293629A1 (en) 2023-09-21
AU2007279193B2 (en) 2011-12-01
PL2722052T3 (pl) 2019-08-30
HK1125793A1 (en) 2009-08-21
CN103990111A (zh) 2014-08-20
IL196667A (en) 2017-04-30
EP2053915B1 (en) 2014-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230293629A1 (en) Methods for attenuating release of inflammatory mediators and peptides useful therein
US8563689B1 (en) Methods for regulating inflammatory mediators and peptides for useful therein
US8501911B2 (en) Methods of reducing inflammation and mucus hypersecretion
HK1191227A (en) Methods for attenuating release of inflammatory mediators and peptides useful therein
HK1125793B (en) Peptides for attenuating release of inflammatory mediators
HK1201190B (en) Methods for attenuating release of inflammatory mediators and peptides useful therein

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL