BRPI0715066A2 - moduladores de atividades de receptor de quimiocina, formas cristalinas e processo - Google Patents

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BRPI0715066A2
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G. Yang Michael
J. Cherney Robert
G. Eastgate Marting
Muslehiddinoglu Jale
Josyula Prasad Siva
Xiao Zili
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Bristol-Myers Squibb Company
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Abstract

MODULADORES DE ATIVIDADE DE RECEPTOR DE QUIMIOCINA, FORMAS CRISTALINAS E PROCESSO. A presente invenção fornece um novo antagonista ou agonista/ antagonistas parciais de atividade de receptor de MCO-1:N-((1R,2S,5R)-5(isopropil(metil)-2((S)-2oxo-3(6-(trifluorometil)) quizolin-4-ilamini)prirrolidin- 1-il)cicloexil)acetamida, ou um pró-fármaco, solvato ou sal farmaceuticamente aceitável, deste tendo uma combinação inesperada de características farmacológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção são fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de utilização das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares são também um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processo para a preparação e compostos de fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3(6-(trifluorometil) quinzolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida; em que R^ 1^, R^ 8^ , R^ 9^, R^10^, e são composto que são também fornecidos aqui.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA- DORES DE ATIVIDADE DE RECEPTOR DE QUIMIOCINA, FORMAS CRISTALINAS E PROCESSO".
Este Pedido reivindica a prioridade de Pedidos Provisórios dos Estados Unidos Nos. 60/834.235, e 60/896.026 depositado em 28 de Julho de 2006 e 21 Março de 2007, respectivamente, as descrições de ambos os quais são incorporadas aqui por referência. CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil (me- til)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -
il)cicloexil)acetamida, ou um pró-fármaco, solvato ou sal farmaceuticamente aceitável, deste, tendo uma combinação inesperada de características far- macológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção são tam- bém fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e méto- dos de utilização das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças car- diovasculares são também um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processoa para a preparação e compostos de fórmula (I), incluindo N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida:
em que R1, R8, R9, R10, e são como descritos aqui. Compostos que são intermediários úteis dos processos são também fornecidos aqui. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
H
Quimiocinas são citocinas quimiotáticas, de peso molecular 6-15 kDa, que são Iiberdas por uma ampla variedade de células para atrair e ati- var, entre outros tipos de células, macrófagos, linfócitos T e B1 eosinófilos, basófilos e neutrófilos (revisto em: Charo e Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445; e Rollins, Blood 1997, 90, 909-928). Existem duas classes principais de quimiocinas, CXC e CC, dependendo de se as primeiras duas cisteínas na seqüência de aminoácido são separadas por um único aminoácido (CXC) ou são adjacen- tes (CC). As quimiocinas CXC, tais como interleucina-8 (IL-8), proteína 2 ativadora de neutrófilo (NAP-2) e proteína de atidade estimuladora de de- senvolvimento de melanoma (MGSA) são quimiotática principalmente para neutrófilos e Linfócitos T, ao passo que as quimiocinas CC, tais como RAN- TES, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, as proteínas quimiotáticas de monócito (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, e MCP-5) e as eotaxinas (-1 e -2) são quimiotáticas para, entre outros tipos de célula, macrófagos, Linfócitos T, eosinófilos, célu- Ias dendríticas, e basófilos. Existem também as quimiocinas Iinfotactin-1, linfotactin-2 (ambas quimiocinas C), e fractalcina (uma quimiocina CX3C)
que não se incluem em qualquer das subfamílias de quimiocina.
As quimiocinas ligam-se aos receptores de superfície celular es- pecíficos pertencentes à família de Proteínas de domínio de sete membra- nas acopladas à proteína G (revisto em: Horuk, Trends Pharm. Sei. 1994, 15, 159-165) que são denominados "receptores de quimiocina." Em ligação de seus Iigantes cognatos, os receptores de quimiocina transduzem um sinal intracelular através de proteínas G triméricas associadas, resultando e, entre outras respostas, um rápido aumento na concentração de cálcio intracelular, alterações na forma celular, expressão aumentada de moléculas de adesão celular, desgranulação, e promoção de migração celular. Existem pelo me- nos dez receptores de quimiocina humana que ligam-se ou respondem à quimiocinas CC com as seguintes características padrão (revisto em Zlotnik e Oshie Immunity 2000, 12, 121): CCR-1 (ou "CKR-1" ou "CC-CKR-1") [MIP- 1a, MCP-3, MCP-4, RANTES] (Ben-Barruch, e outro, Cell 1993, 72, 415- 425, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-2A e CCR-2B (ou "CKR-2AVCKR-2B" ou "CC-CKR-2AVCC-CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo, e outro, Proc. NatL Acad. Sei. USA 1994, 91, 2752-2756, e Luster1 New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-3 (ou "CKR-3" ou "CC-CKR-3") [eotaxin-1, eotaxin-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere, e outro, J. Biol. Chem. 1995, 270, 16491-16494, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-4 (ou "CKR-4" ou "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power, e outro, J. Biol. Chem. 1995, 270, 19495-19500, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-5 (ou "CKR-5" ou "CC- CKR-5") [MIP-Ia1 RANTES, ΜΙΡ-1β] (Sanson, e outro, Biochemistry 1996, 35, 3362-3367); CCR-6 (ou "CKR-6" ou "CC-CKR-6") [LARC] (Baba, e outro, J. Biol. Chem. 1997, 272, 14893-14898); CCR-7 (or "CKR-7" ou "CC-CKR- 7") [ELC] (Yoshie e outro, J. Leukoc. Biol. 1997, 62, 634-644); CCR-8 (or "CKR-8" ou "CC-CKR-8") [I-309] (Napolitano e outro, J. Immunol., 1996, 157, 2759-2763); CCR-10 (ou "CKR-10" ou "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (Bo- nini, e outro, DNA e Ceil Biol. 1997, 16, 1249-1256); e CCR-11 [MCP-1, MCP-2, e MCP-4] (Schweickert, e outro, J. Biol. Chem. 2000, 275, 90550).
Além dos receptores de quimiocinas mamíferas, citomegalovírus mamíferos, herpesvírus e poxvírus foram mostrados expressarem, em célu- las infectadas, proteínas com as propriedades de ligação de receptores de quimiocinas (revisto em: Cavidades e Schwartz, Curr. Opin. Biotech. 1997, 8, 741-748). Quimiocinas CC humanas, tais como RANTES e MCP-3, podem causar rápida mobilização de cálcio por meio destes receptores viralmente codificados. A expressão de receptor pode ser premissa para infecção pro- vendo a subversão de vigilância do sistema imune normal e responsta à in- fecção. Adicionalmente, receptores quimiocina humana, tais como CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 e CCR8, podem agir como co-receptores para as in- fecções de células mamíferas por micróbios como com, por exemplo, o vírus de imunodeficiência humana (HIV).
As quimiocinas e seus receptores cognatos têm sido implicados como sendo importantes mediadores de doenças e distúrbios inflamatórios, infecciosos, e imunoreguladores, incluindo asma e doenças alérgicas; bem como patologias autoimunes, tais como artrite reumatóide e esclerose múlti- pla; e doenças metabólicas, tais como aterosclerose e diabetes (revisto em: Charo e Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Ζ. Gao e W. A. Metz, Chem. Rev. 2003, 103, 3733; Ρ. H. Carter, Current Opinion in Chemi- cal Biology 2002, 6, 510; Trivedi, e outro, Ann. Reports Med. Chem. 2000, 35, 191; Saunders e Tarby, Drug Disc. Today 1999, 4, 80; Premack e Schall, Nature Medicine 1996, 2, 1174). Por exemplo, o quimioatraente-1 de monó- cito de quimiocina (MCP-1) e seu receptor, o Receptor 2 de Quimiocina CC 2 (CCR-2) desempenha um papel principal na atração de leucócitos aos sítios de inflamação e subseqüentemente na ativação destas células. Quando a quimiocina MCP-1 liga-se ao CCR-2, ela induz um rápido aumento na con- centração de cálcio intracelular, expressão aumentada de moléculas de ade- são celular, e a promoção de migração de leucócito. A demonstração da im- portância da interação de MCP-1/CCR-2 foi fornecida por experimentos com camundongos geneticamente modificados. Os camundongos MCP-ΓΛ foram incapazes de recrutar monócitos em sítios de inflamação após diversos dife- rentes tipos de desafios imunes (Bao Lu, e outro, J. Exp. Med. 1998, 187, 601). Igualmente, os camundongos CCR-2 -/- foram incapazes de recrutar monócitos ou produzir interferon-γ quando desafiados com vários agentes exógenos; além disso, os leucócitos de camundongos nulos CCR-2 não mi- graram em resposta à MCP-1 (Landin Boring, e outro, J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552), pelo qual demonstrando a especificidade da interação de MCP- 1/CCR-2. Dois outros grupos têm independentemente reportado resultados equivalentes com diferentes linhagens de camundongos CCR-2 -/- (William A. Kuziel, e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94, 12053, e Takao Kuri- hara, e outro, J. Exp. Med. 1997, 186, 1757). A viabilidade e saúde geral- mente normal dos animais MCP-1 -/- e CCR-2 -/- são notáveis, em que a ruptura da interação de MCP-1/CCR-2 não induz à crise fisiológica. Conside- rados juntos, estes dados levam a uma conclusão que moléculas que blo- queiam as ações de MCP-1/CCR2 seriam úteis no tratamento de diversos distúrbios inflamatórios e autoimunes: M. Feria e F. Díaz-González, Exp. O- pin. Ther. Patents 2006, 16, 49; e J. Dawson, W. Miltz, e C. Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35). Esta hipótese foi atualmente validade em diversos diferentes modelos de doença de animal, como abaixo descrito. Sabe-se que MCP-1 é super-regulada em pacientes com artrite reumatóide (Alisa Koch, e outro, J. Clin. Invest. 1992, 90, 772 - 779). Além disso, diversos estudos pré-clínicos demonstraram o valor terapêutico po- tencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de artri- te reumatóide. Uma vacina de DNA codificando MCP-1 foi mostrada recen- temente melhorar artrite induzida por poliadjuvante crônico em ratos (Saw- san Youssef, e outro, J. Clin. Invest. 2000, 106, 361). Igualmente, os sinto- mas de doença podem ser controlados por meio de administração direta de anticorpos para MCP-1 aos ratos com artrite induzida por colágeno (Hiroomi Ogata, e outro, J. Pathol. 1997, 182, 106), ou artrite induzida por parede ce- lular estreptocócica (Ralph C. Schimmer, e outro, J. Immunol. 1998, 160, 1466). Talvez mais significantemente, um antagonista de peptide de sinto- mas MCP-1, MCP-1 (9-76), foi mostrado tanto prevenir o início da doença quanto reduzir os sintomas de doença (dependendo do tempo de adminis- tração) no modelo de camundongo MRL-Ipr de artrite (Jiang-Hong Gong, e outro, J. Exp. Med. 1997, 186, 131). Além disso, foi demonstrado que a ad- ministração de antagonistas de CCR2 de molécula pequena reduziu escore clínico em modelos de roedores de artrite (C. M. Brodmerkel, e outro, J. Im- munol. 2005, 175, 5370; e M. Xia, e outro, Pedido de Patente dos Estados Unidos 0069123, 2006). A administração de um anticorpo anti-CCR2 tem efeitos variáveis sobre CIA de murino, dependendo do tempo de administra- ção (H. Bruhl, e outro, J. Immunol. 2004, 172, 890). Estudos recentes com camundongos CCR2-/- sugestionaram que a deleção de CCR2 pode agravar os modelos de artrite de roedor em cisrcunstâncias experimentais específi- cas (Μ. P. Quínones, e outro, J. Clin. Invest. 2004, 113, 856; Μ. P. Quinones, e outro, J. MoL Med. 2006, 84, 503).
Sabe-se que MCP-1 é super-regulada em lesões ateroscleróti- cas, e foi mostrado que níveis circulantes de MCP-1 são reduzidos através do tratamento com agentes terapêuticos (Abdolreza Rezaie-Majd, e outro, Arterioscler. Thromb. \/asc. BioL 2002, 22, 1194 - 1199). Diversos estudos chaves demonstraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da inte- ração de MCP-1/CCR2 no tratamento de aterosclerose. Por exemplo, quan- do camundongos MCP-1 -I- são cruzados com camundongos deficientes de receptor de LDL, uma redução de 83% em deposição de lipídeo aórtico foi observada (Long Gu1 e outro, Mol. Cell 1998, 2, 275). Similarmente, quando MCP-1 foi geneticamente removido dos camundongos que já superexpres- saram apolipoproteína B, os camundongos resultantes foram protegidos da formação de lesão aterosclerótica com relação aos camundongos de contro- le MCP-1 +/+ apoB (Jennifa Gosling, e outro, J. Clin. Invest. 1999, 103, 773). Igualmente, quando camundongos CCR-2 -I- são cruzados com camundon- gos E -I- de apolipoproteína, uma diminuição significannte na incidência de lesões ateroscleróticas foi observada (Landin Boring, e outro, Nature 1998, 394, 894; T. C. Dawson, e outro, Aterosclerose 1999, 143, 205). Finalmente, quando os camundongos E -I- de apolipoproteína são administrados um ge- ne codificando um antagonista de peptídeo de CCR2, em seguida o tamanho da lesão é diminuído e a estabilidade de placa é aumentada (W. Ni, e outro, Circulation 2001, 103, 2096 - 2101). O transplante de medula óssea de ca- mundongos CCR2-/- em camundongos ApoE3-Leiden inibiu aterogênse pre- cose (J. Guo, e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003, 23, 447), po- rém tem um efeito mínimo sobre lesões avançadas (J. Guo, e outro, Arteri- oscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005, 25, 1014). Pacientes com diabetes melito tipo 2 tipicamente exibem resis-
tência à insulina como uma das características marcantes da doença. Resis- tência à insulina é também associada com o agrupamento de arnomalidades conhecidas como a "síndrome metabólica" ou "síndrome X," que inclui obe- sidade, aterosclerose, hipertensão, e dislipidemia (revisto em: Eckel, e outro, Lancet 2005, 365, 1415). É bem reconhecido que inflamação desempenha um papel na exacerbação do processo de doença em diabetes tipo 2 e as patologias de "síndrome X" (revisto em: Chen, Pharmacological Research 2006, 53, 469; Neels e Olefsky, J. Clin. Invest. 2006, 116, 33; Danadona e Aljada, Am J CardioL 2002 90, 27G-33G; Pickup e Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241). MCP-1 é conhecida desempenhar um papel na resistência à insu- lina induzida por obesidade. Em cultura, pré-adipócitos constitutivamente expressaram MCP-1 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81). CCR2 é expressa em adipócitos; A adição de MCP-1 em adipócitos diferen- ciados in vitro diminiu-a captação de glicose estimulada por insulina e a ex- pressão de diversos genes adipogênicos (LpL, adipsin, GLU-4), aP2, recep- tor p3-adrenérgico, e PPARy) (P. Sartipy e D. Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1999, 96, 6902). Pacientes com diabetes tipo 2 tiveram níveis maiores de MCP-1 circulante do que controles não diabéticos (S. Nomura, e outro, Clin. Exp. Immunol. 2000, 121, 437), e a liberação de MCP-1 do tecido adi- poso pode ser reduzida por tratamento com terapias anti-diabéticas tais co- mo metformina ou tiazolidinedionas (J. M. Bruun, e outro, J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005, 90, 2282). Igualmente, MCP-1 foi também superexpressa em modelos experimentais de murino de obesidade, e foi primeiramente produ- zida por tecido adiposo (Sartipy e Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100, 7265). Em camundongos obesos, a expressão de MCP-1 tanto precedeu quanto ocorreu concorrentemente com o início da resistência à insulina (H. Xu, e outro, J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821). Outro estudo mos- trou que a expressão de MCP-1 positivamente correlacionada com a massa corporal no tecido adiposo perigonadal de camundongos (Weisberg, e outro, J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796). Consistente com estes dados, o desenvol- vimento de resistência à insulina em camundongos db/db foi melhorada ou por meio da deleção genética de MCP-1 ou por expressão induzida por gene de um peptídeo negativo dominante (H. Kanda, e outro, J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494). A conversa lógica pode também ser demonstrada: superexpres- são de MCP-1 em tecido adiposo promoveu resistência à insulina (N. Kamei, e outro, J. BioL Chem. 2006, 281, 26602). Um resultado conflitante mostran- do que a deleção genética de MCP-1 não afeta a resistência à insulina no camundongo db/db também apareceu (F. Y. Chow, e outro, Diabetologia 2007, 50, 471). Consistentes com os dados sobre MCP-1, estudos diretos com CCR2 (o receptor de MCP-1) mostraram que ele desempenha um papel na formação de obesidade e resistência à insulina induzida por obsidade. A manutenção de uma dieta de gordura elevada aumentou o número de mo- nócitos inflamatórios de CCR2+ circulantes tanto nos camundongos do tipo selvagem (C. L. Tsou, e outro, J. Clin. Invest. 2007, 117, 902) quanto ApoE7" (F. Tacke1 e outro, J. Clin. Invest. 2007, 117, 185). A deleção genética de CCR2 reduziu os números de macrófagos ativados em tecido adiposo de murino (C. N. Lumeng, e outro, Diabetes 2007, 56, 16), porém não afetaria uma população de macrófagos adiposos de M2 acreditados manterem o es- tado "magro" (C. N. Lumeng, e outro, J. Clin. Invest. 2007, 117, 175). A dele- ção genética de CCR2 reduziu a obesidade induzida por dieta e melhorou a senbibilidade à insulina em modelo de obesidade induzida por dieta (S. P. Weisberg, e outro, J. Clin. Invest. 2006, 116, 115; P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian, Patente WO 2006/013427 A2), 2006), dependendo das con- dições experimentais (A. Chen, e outro, Obes. Res. 2005, 13, 1311). A ad- mininistração de um antagonista de CCR2 de molécula pequena também melhorou a sensibilidade à insulina neste mesmo modelo (S. P. Weisberg, e outro, J. Clin. Invest. 2006, 116, 115).
Dois estudos descreveram o papel importante de CCR2 em hi- pertrofia, remodelagem e inflamação vascular induzida por hipertensão (E Bush e outro Hypertention 2000, 36, 360; M lshibashi, e outro, Circ. Res. 2004, 94, 1203).
Sabe-se que MCP-1 é super-regulada em esclerose múltipla humana, e foi mostrado que terapia eficaz com interferonp-1b reduz a ex- pressão de MCP-1 em células mononucleares de sangue periférico, sugerin- do que MCP-1 desempenha um papel em progresso da doença (Carla Iarlo- ri, e outro, J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170 - 179). Outros estudos demos- traram o valor terapêutico potencial de antagonism da interação de MCP- 1/CCR-2 no tratamento de esclerose múltipla; todos estes estudos foram demonstrados em encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo animal convencional para esclerose múltipla. Administração de anticorpos para MCP-1 aos animais com EAE reduziu significantemente a reincidência de doença (K. J. Kennedy, e outro, J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98). Além disso, dois relatos foram que camundongos CCR-2 -/- são resistentes à EAE (Β. T. Fife, e outro, J. Exp. Med. 2000, 192, 899; L. Izikson, e outro, J. Exp. Med. 2000, 192, 1075). Um relato subsequente estendeu estas obsrevações iniciais exanimando-se os efeitos de deleção de CCR2 em camundongos de diferentes linhagens (S. Gaupp, e outro, Am. J. Pathol. 2003, 162, 139). No- tavelmente, a admininistração de um antagonista de CCR2 de molécula pe- quena também mitigou a progressão da doença em camundongos C57BL/6 (C. M. Brodmerkel, e outro, J. Immunol. 2005, 175, 5370).
Sabe-se que MCP-1 é super-regulada em pacientes que desen-
volveram síndrome obliterante de bronquiolite após transplante de pulmão (Martine Reynaud-Gaubert, e outro, J. of Heart e Lung Transplant., 2002, 21, 721 - 730; John Belperio, e outro, J. CHn. Invest. 2001, 108, 547 - 556). Em um modelo de murino de síndrome obliterante de bronquiolite, A admininis- tração de um anticopro à MCP-1 induz à atenuação da obliteração da via aérea; igualmente, os camundongos CCR2 -/- foram resistentes à oblitera- ção neste mesmo modelo (John Belperio, e outro, J. Clin. Invest. 2001, 108, 547 - 556). Estes dados sugerem que o antagonismo de MCP-1/CCR2 pode ser benéfico no tratamento de rejeição de órgãos seguinte ao transplante. Além disso, estudos mostraram que a ruptura de eixo de MCP-1/CCR2 foi capaz de prolongar a sobrevivência de transplante de ilhota (I Lee e outro, J Immunol 2003, 171, 6929; R Abdi e outro, J Immunol 2004, 172, 767). Em modelos de enxerto de rato, CCR2 e MCP-1 foram mostradas a serem su- per-reguladas em enxerto que desenvolve vascolopatia de enxerto (K Hori- guchi e outro, J Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090). Em outro estudo, a terapia de gene anti-MCP-1 atenuou (A Saiura e outro, Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, 1886). Um estudo descreveu a inibição de formação ne- oíntima de enxerto de veia por bloqueio de MCP-1 (H Tatewaki e outro, J Vasc Surg. 2007, 45,1236). Outros estudos demostraram o valor terapêutico potencial de an-
tagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de asma. Seqüestro de MCP-1 com um anticorpo neutralizante em camundongos desafiados por ovalbumina resultou em decréscimo acentuado em hipersensibilidade brôn- quica e inflamação (Jose-Angel Gonzalo, e outro, J. Exp. Med. 1998, 188, 157). Provou-se ser possível reduzir a inflamação da via aérea alérgica em camundongos desafiados por ovos de Sehistosoma mansoni por meio da administração de anticorpos para MCP-1 (Nicholas W. Lukacs, e outro, J. lmmunol. 1997, 158, 4398). Consistentes com isto, Camundongos MCP-1 -I- exibiram uma resposta reduzida ao desafio com ovos de Schistosoma man- soni (Bao Lu, e outro, J. Exp. Med. 1998, 187, 601).
Outros estudos demostraram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de doença renal. Administração de anticorpos para MCP-1 em um modelo de murino de glomerularnefrite resultou em um decréscimo acentuado em deposição e formação crescente glomerular de colégeno tipo I (Clare M. Lloyd, e outro, J. Exp. Med. 1997, 185, 1371). Além disso, Camundongos MCP-1 -/- com nefrite do soro nefro- tóxico induzida mostraram menos danos tubulares do que seus contrapartes MCP-1 +/+ (Gregory H. Tesch, e outro, J. Clin. Invest. 1999, 103, 73).
Diversos estudos têm demonostrado o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de lúpus erite- matoso sistêmico. Camundongos CCR2-/- exibiram sobrevivência prolonga- da e doença renal reduzida com relação a seus contrapartes WT em um modelo de murino de lúpus eritematoso sistêmico (G. Perez de Lema, e ou- tro, J. Am. Soe. Neph. 2005, 16, 3592). Estes dados são consistentes com a atividade modificadora da doença encontrada em recentes estudos sobre uma deleção genética de MCP-1 (S. Shimizu, e outro, Rheumatology (Ox- ford) 2004, 43, 1121; Gregory H. Tesch, e outro, J. Exp. Med. 1999, 190, 1813) ou a admininistração de um antagonista de peptídeo de CCR2 (H. Ha- segawa, e outro, Arthritis & Rheumatism 2003, 48, 2555) em modelos de roedores de lúpus.
Um notável decrésmino de 30 vezes em linfócitos da própria lâmi- na CCR2+ foi observado nos intestinos delgados de pacientes de Cronh com relação ao íleo não doente (S. J. Connor, e outro, Gut 2004, 53, 1287). Tam- bém de nota, houve uma expansão no subgrupo de monócitos de C- CR27CD14+/CD56+ circulantes com doença de Crohn ativa com relação aos controles. Diversos estudos de roedor têm demonstrado terapêutico potenci- al de antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de doença de Crohn /colite. Os camundongos CCR-2"7" foram protegidos dos efeitos de colite induzida por sulfato de sódio de dextran (Pietro G. Andres, e outro, J. lmmunol. 2000, 164, 6303). A admininistração de um antagonista de molécu- la pequena de CCR2, CCR5, e CXCR3 (afinidades de ligação de murino = 24, 236, e 369 nM, respectivamente) também protegeu contra colite induzida por sulfato de sódio de dextran (H. Tokuyama, e outro, Int. Immunol. 2005, 17, 1023). Finalmente, os camundongos MCP-1-/- mostraram dano colônico substancialmente reduzido (tanto macroscópico e histológico) em um modelo induzido por hapteno de colite (W. I. Khan, e outro, Am. J. Physiol. Gastroin- test. Liver Physiol. 2006, 291, G803).
Dois relatos descreveram a superexpressão de MCP-1 nas células epiteliais instestinais e mucosa do intestino de pacientes com doença do in- testino inflamatória (H. C. Reinecker, e outro, Gastroenterology 1995, 108, 40, e Michael C. Grimm, e outro, J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804).
Um estudo descreveu a associação de polimorfismo promotor no gene MCP-1 gene com escleroderma (esclerose sistêmica) (S Karrer e ou- tro, J Invest Dermatol. 2005, 124, 92). Em modelos relacionados de fibrose de tecido, a inibição do eixo de CCR2/MCP-1 reduziu a fibrose na pele (T Yamamoto e K Nishioka, J Invest Dermatol 2003, 121, 510; AM Ferreira e outro, J Invest Dermatol. 2006, 126, 1900), pulmão (T Okuma e outro, J Pa- thol. 2004, 204, 594; M Gharaee-Kermani e outro, Cytokine 2003, 24, 266), rim (K Kitagawa e outro, Am J Pathoi 2004, 165, 237; T Wada e outro, J Am Soc Nephrol 2004, 15, 940), coração (S Hayashidani e outro, Circulation 2003, 108, 2134), e fígado (S Tsuruta e outro, IntJMoIMed. 2004,74, 837).
Um estudo demonstrou o valor terapêutico potencial de antago- nismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de alveolite. Quando ra- tos com lesão pulmonar complexa imune à IgA foram tratados intravenosa- mente com anticorpos criados contra MCP-1 de rato (JE), os sintomas de alveolite foram parcialmente aliviados (Michael L. Jones, e outro, J. Immunol. 1992, 149, 2147).
Diversos estudos mostraram o valor terapêutico potencial de an- tagonismo da interação de MCP-1 /CCR2 no tratamento de câncer (revisto em: M. J. Craig e R. D. Loberg, câncer Metastasis Rev. 2006, 25, 611; I. Conti e B. Rollins, Seminars in câncer Biology 2004, 14, 149; R. Giles e R. D. Loberg, Curr. câncer Drug Targets 2006, 6, 659). Quando camundongos i- munodeficientes transportando células de carcinoma de mama humanas foram tratados com um anticorpo anti-MCP-1, a inibição de micrometastases pulmonares e aumentos na sobrevivência foram observados (Rosalba Sal- cedo, e outro, Blood2000, 96, 34 - 40). Utilizando espécimes de tumor clíni- co humano, a expressão de CCR2 foi associada com progressão de câncer de próstata (Y. Lu, e outro, J. Cell. Biochem. 2007, 101, 676). A expressão de MCP-1, in vitro, foi mostrada mediar a invasão e desenvolvimento células de câncer de próstata (Y. Lu, e outro, Prostate 2006, 66, 1311); além disso, MCP-1 expressa por células de câncer de próstata induziu progenitores de medula óssea humanos para rebsorção óssea (Y. Lu, e outro, câncer Res. 2007, 67, 3646).
Múltiplos estudos descreveram o valor terapêutico potencial de antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de restenose. Em humanos, os níveis de MCP-1 correlacionam diretamente com o risco para restenose (F. Cipollone, e outro, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327). Os camundongos deficientes em CCR2 ou em MCP-1 mostraram re- duções na área íntima e na relação da íntima/média (com relação aos filhos- tes do tipo selvagem) após a lesão arterial (Merce Roque, e outro, Arterios- der. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554; A. Schober, e outro, Circ. Res. 2004, 95, 1125; W. J. Kim, e outro, Biochem Biophys Res Commun. 2003, 310, 936). Em camundongos, a transfecção de um inibidor negativo dominante de MCP-1 no músculo esqueletal (K. Egashira, e outro, Circ. Res. 2002, 90, 1167) também reduziu a hiperplasia íntima após a lesão arterial. O bloqueio de CCR2 utilizando um anticorpo neutralizante reduziu a hiperplasia neoín- tima após sondagem em primatas (C. Horvath, e outro, Circ. Res. 2002, 90, 488).
Dois relatos descrevem a superexpressão de MCP-1 de ratos com trauma cerebral induzido (J. S. King, e outro, J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127, e Joan W. Berman, e outro, J. Immunol. 1996, 156, 3017). Além disso, estudos têm mostrado que tanto os camundongos CCR2"A (O. B. Dimitrijevic, e outro, stroke 2007, 38, 1345) quanto MCP-Va (Ρ. M. Hughes, e outro, J. Cereb. Biood Flow Metab. 2002, 22, 308) são parcialmente protegidos de isquemia/lesão de reperfusão.
Sabe-se que monócitos/macrófagos desempenham um papel im- portante no desenvolvimento de dor neuropática (Liu T1 van Rooijen N, Tra- cey DJ1 Pain 2000, 86, 25). Consistente com esta noção, um papel potencial para CCR2 no tratamento tanto de dor neuropática quanto inflamatória foi recentemente descrito. Os camundongos CCR2-/-mostraram respostas alte- radas à dor inflamatória com relação a seus contrapartes WT, incluindo com- portamento de dor reduzida após intraplantar injeção de formalina e alodinia mecânica ligeiramente reduzida após intraplantar a injeção de CFA (C. Ab- badie, e outro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 2003, 100, 7947). Além disso, Camundongos CCR2-/- não exibiram alodinia mecânica significante após lesão do nervo ciático. Igualmente, um antagonista de CCR2 de molécula pequena reduziu a alodinia mecânica para -80% de níveis de pré-lesão a- pós administração oral (C. Abbadie, J. A. Lindia, e H. Wang, WO PCT 110376, 2004).
Um estudo descreveu o papel crítico de MCP-1 em cardiomiopatia isquêmica (N. G. Frangogiannis, e outro, Circuiation 2007, 115, 584). Outro estudo descreveu a atenuação de insuficiência cardiac experimental seguin- do a inibição de MCP-1 (S Hayashidani e outro, Circulation 2003, 108, 2134).
Outros estudos têm fornecido evidência que MCP-1 é superex- pressa em vários estados de doença não mencionados acima. Estes relatos fornecem evidência correlativa que antagonistas de MCP-1 poderiam ser terapêuticos úteis apara tais doenças. Outro estudo demonstrou a superex- pressão de MCP-1 em aloenxertos cardíacos de roedor, sugerindo um papel para MCP-1 na patogênese de arteriosclerose de transplante (Mary E. Rus- sell, e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 6086). A superexpressão de MCP-1 foi observada nas células endoteliais de pulmão de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (Harry N. Antoniades, e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, 89, 5371). Similarmente, a superexpressão de MCP-1 foi observada na pele de pacientes com psoríase (M. Deleuran, e outro, J. Der- matol. Sei. 1996, 13, 228, e R. Gillitzer, e outro, J. Invest. Dermatol 1993, 101, 127); descobertas correlativas com predominância de células CCR2+ também foram reportadas (C. Vestergaard, e outro, Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353). Finalmente, um recente relato mostrou que MCP-1 é super- expressa nos cérebros e fluído cerebroespinhal de pacientes com demência associada com HIV-1 (Alfredo Garzino-Demo1 WO 99/46991).
Além disso, o polimorfismo de CCR2 foi mostrado estar associado com sarcoidose em pelo menos um subgrupo de pacientes (P. Spagnolo, e outro, Am J Respir Crit Care Med. 2003, 168, 1162).
Deve-se também observar que CCR-2 foi implicada como um co- receptor para algumas linhagens de HIV (B. J. Doranz, e outro, Cell 1996, 85, 1149). Foi também determinado que o uso de CCR-2 como um co- receptor de HIV pode ser correlacionado com progressão de doença (Ruth I. Connor, e outro, J. Exp. Med. 1997, 185, 621). A descoberta é consistente com a descoberta recente de que a presença de um mutante de CCR-2, CCR2-64I, é positivamente com o inicio retardado de HIV na população hu- mana (Michael W. Smith, e outro, Science 1997, 277, 959). Embora MCP-1 não tenha sido implicada, pode ser que os antagonistas de MCP-1 que agem por meio de ligação à CCR-2 podem ter efeitos terapêuticos benéficos no retardo da progressão da doença para AIDS em pacientes infectados por HIV.
Deve-se observar que CCR2 é também o receptor para as quimio- cinas humanas MCP-2, MCP-3, e MCP-4 (Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445). observado que os novos compostos de fórmula (I) descritos aqui antagonizam MCP-1 ligando-se ao receptor de CCR-2, pode ser que estes compostos de fórmula (I) sejam também antagonistas eficazes das ações de MCP-2, MCP-3, e MCP-4 que são mediadas por CCR-2. Conse- quentemente, quando referência é feita aqui ao "antagonismo de MCP-1," deve ser assumido que este é equivalente ao "antagonismo de estimulação de quimiocina de CCR-2." Consequentemente, os compostos que modulam a atividade de
quimiocina podem demonstrar uma ampla faixa de utilidades no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou cardiovasculares. Publicação de Pedido de Patente dos estados Unidos W02005021500 A1 (incorporada aqui por referência e designada pelo pre- sente Requerente) descreve compostos que modulam a atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4 por meio de CCR2. A referência também descreve vários processos para preparer estes compostos incluindo sínteses de múti- plas estapas que incluem a introdução e subsequente remoção de grupos de proteção.
É desejável encontrar novos compostos com características far- macológicas melhoradas comparadas com moduladores de quimiocina co- nhecidos. Por exemplo, é desejável encontrar novos compostos com ativida- de inibidora melhorada de CCR-2 e seletividade para CCR-2 versus outros receptores acoplados à proteína G (isto é, receptor de 5HT2A). É também desejável encontrar compostos com características vantajosas e melhoradas em uma ou mais das seguintes categorias: (a) propriedades farmacêuticas (isto é, solubilidade, permeabilidade, amenabilidade para formulações de liberação prolongada);
(b) requerimentos de dosagem (por exemplo, dosagens inferiores e/ou dosagem uma vez ao dia);
(c) fatores que diminuem as carecaterísticas peak-to-trough de con- centração sangüínea (isto é, liberação e/ou volume de distribuição);
(d) fatores que aumentam a concentração do fármaco ativo no recep- tor (isto é, ligação de proteína, volume de distribuição);
(e) fatores que diminuem a responsabilidade para interações fármaco- fármaco clínicas (indução ou inibição de enzima citocromo P450, tal como
inibição de CYP 2D6, veja G.K. Dresser, J.D. Spence, D.G. Bailey, Clin. Pharmacokinet. 2000, 38, 41-57, que é pelo presente incorporado por refe- rência);
(f) fatores que diminuem o potencial para efeitos colaterias adversos (por exemplo, seletividade farmacológica além de receptores acoplados à
proteína G, reatividade química ou metabólica potencial, seletividade de ca- nal de íon, penetração de CNS limitada). É especialmente desejável encon- trar compostos tendo uma combinação desejável das características farma- cológicas anteriormente mencionadas.
É também desejável na técnica fornecer processos novos e/ou
melhorados para preparar tais compostos. Estes processos podem ser ca- racterizados, sem limitação, por a) fácil adptação à produção de escala mai- or, tal como usina piloto ou escalas de fabricação; b) etapas de processo e/ou técnicas que possibilitam melhoras na pureza (incluindo pureza quiral), estabilidade e/ou facilidade manipulação de intermediários e/ou compostos finais; e/ou c) menos etapas de processo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um novo antagonista ou agonis-
ta/antagonista parcial de atividade de receptor de MCP-1: N-((1 R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um pró-fármaco, solvato ou sal farmaceuticamente aceitável, deste, tendo uma combinação inesperada de características farmacológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de utilização das mesmas como agentes para o trata- mento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares são também um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processo para a preparação e com- postos de fórmula (I), incluindo N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil) ace- tamida:
em que R11 R8, R9, R10, e são como descritos aqui. Compostos que são intermediários úteis dos processos são também fornecidos aqui.
H A presente descrição também fornece o uso de N-((1 R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, um pró-fármaco, solvato ou sal farmaceuticamente aceitável, para afabricação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 descreve os padrões de força experimental e estimu- lada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal de ácido di-benzenossulfônico, Forma N-1.
A Figura 2 descreve os padrões de força experimental e estimu- lada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trif!uorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, forma de base livre N-2.
A Figura 3 descreve os padrões de força experimental e estimu- lada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidín-1 -il)cicloexil)acetamida, forma de base livre E-1 (mono-etanolato). A Figura 4 descreve os padrões de força experimental e estimu-
lada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, Forma de Sal de HCI H4-1 (tetraidrato).
A Figura 5 descreve os padrões de força experimental e estimu- Iada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, forma de base livre A-1 (solvato de mono-acetona).
A Figura 6 descreve os padrões de força experimental e estimu- lada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(meti!)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, forma de base livre DC-1 (solvato de mono-diclorometano).
A Figura 7 descreve os padrões de força experimental e estimu- Iada de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, forma de base livre AN-3 (solvato de mono-acetonitrilo).
A Figura 8 descreve a análise de calorimetria de varredura dife- rencial da N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6^ (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, forma de sal de di-besilato N-1.
A Figura 9 descreve a análise termogravimétrica de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, forma de sal de di-besilato N-1.
A Figura 10 descreve a análise de calorimetria de varredura dife- rencial deN-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2.
A Figura 11 descreve a análise termogravimétrica de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2.
A Figura 12 descreve o Isoterma de Absorção de Umidade de N-
((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-íl)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2.
A Figura 13 descreve uma Estrutura cristal de raio X de terc- butila (1 fí,3/:?,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-
oxopirrolidin-1-il)cicloexilcarbamato.
A Figura 14. Modelo de peritonite TG de 48 horas em camun- dongos hCCR2 Kl: Exemplo 1 inibição de monócito/infiltração de macrófago na cavidade peritoneal (contagem celular diferencial). FIG. 15. modelo de peritonite TG de 48 horas em camundongos
hCCR2 Kl: Exemplo 1 inibição de monócito/infiltração de macrófago na cavi- dade peritoneal (Análise de FACS). FIG. 16. EAE em camundongos hCCR2 Kl: escore clínico de tratamento Exemplo 1 DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção fornece um novo antagonista ou agonis- ta/antagonista parcial de atividade de receptor de MCP-1: N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um pró-fármaco, solvato ou sal farmaceuticamente aceitável, deste, tendo uma combinação inesperada de características farmacológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção são também fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e métodos de utilização das mesmas como agentes para o trata- mento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares são também um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processoa para a preparação e compostos de fórmula (I), incluindo N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)- 2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida:
fé
em que R1, R81 R91 R10, e 7 são como descritos aqui. Compostos que são intermediários úteis dos processos são também fornecidos aqui. N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, inespe- radamente demonstra uma combinação desejável de características farma- cológicas incluindo um grau supreendentemente elevado de biodisponibili- dade oral em combinação com indicações que é altamente eficaz e tem ex- celentes critérios de segurança. Moduladores conhecidos de receptores de CCR2, tais como a- queles descritos na Publicação de Patente W02005021500 A1 publicada em de março de 2005 (Patente dos Estados Unidos No. 7.163.937, publicada em 16 de Janeiro de 2007, designada pelo presente Requerente) que de- monstram um grau adequado de permeabilidade de membrana (um fator crítico de biodisponibilidade oral), não são suficientemente eficazes, como avaliados por sua capacidade de ligação de CCR2- (uma avaliação de eficá- cia), e/ou eles não têm critérios apropriados para segurança como indicado por seletividade de canal de íon como medido por estudos de hERG e canal de íon de Na+.
Em contraste, como ilustrado pelos dados representados aqui na seção entitulada "Características Farmacológicas Comparativas", infra, a molécula relativamente polar, N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)- 2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida demonstrata um grau supreendentemente elevado de permeabilidade de membrana, e ainda mantém potente capacidade de liga- ção de CCR2 juntamente com excelente seletividade de canal de íon.
Consequentemente, a presente invenção fornece um novo mo- dulador de quimiocina tendo características farmacológicas melhoradas que esperado ser útil no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoi- munes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares. MODALIDADES
Em uma modalidade, a descrição está direcionada a N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, e sais farmaceuticamente aceitáveis deste.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-
(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, a base livre, a forma cristalina compreendendo a forma N-2.
Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) parâmetros de célula unitária substancialmente iguais aos seguintes: Dimensões celulares: a = 11,8427(3)
b= 18,1503(7) C= 12.7923(4) α = 90
β = 105,362(2) γ = 90
Grupo de espaço P21 Moléculas/célula unitária 2
em que o referido cristal está em uma temperatura de cerca de +22°C (RT).
Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de pó de raio X compreendendo três ou mais de valo- res 2Θ (CuKoc λ=1.541Á) selecionados de 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0, 16.6, 18.2, e 18.8, em uma temperatura de cerca de 22°C.
Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de pó de raio X também compreendendo quatro ou mais de valores 2Θ (CuKa λ=1.541Α) selecionados do grupo consistindo em 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0, 16.6, 18.2, e 18.8, em uma temperatura de cerca de 22°C.
Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) a por coordenadas atômicas fracionais substancialmente como listado na Ta- bela 7.
Outra modalidade é a Forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 2.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-
ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal de ácido di-benzenossulfônico, compreendendo a Forma N-1, caracterizada pelos parâmetros de célula uni- tária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais valores de 2Θ (CuKa À=1.541Á) selecionados de Tabela 10; por coordenadas atômicas fracionais substancialmente como listado na Tabela 2, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 1.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-
(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a For- ma E-1 (mono-etanolato), caracterizada pelos parâmetros de célula unitária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou more 2Θ values (CuKa λ=1.541Α) sele- cionados de Tabela 10; por coordenadas atômicas fracionais substancial- mente como listado na Tabela 5, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 3.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal de HCI1 compreendendo a For- ma H4-1 (tetraidrato), caracterizada pelos parâmetros de célula unitária en- contrados na Tabela 1; 3 ou 4 oumais valores de 2Θ (CuKa λ=1.54ΐΑ) sele- cionados de Tabela 10; por coordenadas atômicas fracionais substancial- mente como listado na Tabela 9, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 4.
Outra modalidade é um padrão de forma cristalina de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma A-1 (solvato de mono-acetona), caracterizada pelos parâmetros de célula unitária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais valores de 2Θ (CuKa À=1.541Á) selecionados de Tabela 10; por coordena- das atômicas fracionais substancialmente como listado na Tabela 6, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figu- ra 5.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-
(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a For- ma DC-1 (solvato de mono-diclorometano), caracterizada pelos parâmetros de célula unitária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais valores de 2Θ (CuKoc À=1.541Á) selecionados de Tabela 10; por coordenadas atômicas fracionais substancialmente como listado na Tabela 3, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 6.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre compreendendo a Forma AN-3 (solvato de mono-acetonitrilo), caracterizada pelos parâmetros de célu- Ia unitária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais valores de 2Θ (CuKa X=1.541Á) selecionados de Tabela 10; por coordenadas atômicas fracionais substancialmente como listado na Tabela 8, e/ou um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 7.
Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-
ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre compreendendo a Forma THOO-1 (solvato de mono-tetraidrofurano), caracterizada pelos parâmetros de célula unitária encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais valores de 2Θ (CuKa λ=1.54ΐΑ) selecionados de Tabela 10; e/ou por coordenadas atômi- cas fracionais substancialmente como listado na Tabela 4..
Outra modalidade é uma composição farmacêutica, compreen- dendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um composto dos Exem- plos.
Outra modalidade é método para modulação de quimiocina ou atividade receptora de quimiocina compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um com- posto dos Exemplos.
Outra modalidade é método para modulação de Atividade de receptor de CCR-2 compreendendo administrar a um paciente em necessi- dade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é método para modulação da atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4, e MCP-5 que é mediada pelo receptor de CCR2 compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é método para modulação da atividade de MCP-1 compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é um método para tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, os referidos distúrbios sendo selecionados de outra modalidade é um método para tra- tamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em neces- sidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, os referidos distúrbios sendo selecionados de diabetes, obesida- de, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardi- omiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, a- neurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência car- díaca congestiva, doença autoimune, Infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplan- te, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intes- tino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite do soro nefrotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vascu- lite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de enxerto de diálise, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, neuropatia de aloenxerto crôni- ca, e câncer.
Outra modalidade é um método para tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de diabetes, obesidade, doença de Crohn, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite do soro ne- frotóxico, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, e artrite reumatóide, restenose, transplante de órgão, e câncer.
Outra modalidade é um método para tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, ate- rosclerose, restenose, e transplante de órgão.
Outra modalidade é um método para tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn, e diabetes.
Outra modalidade é um método para tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de restenose, transplante de órgão, e câncer.
Outra modalidade é um método para tratamento de diabetes, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é um método para tratamento de Doença de Crohn, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos. Outra modalidade é um método para tratamento de esclerose
múltipla, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é um método para tratamento de aterosclero- se, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é um método para tratamento de restenose, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.
Outra modalidade é um método para tratamento de transplante de órgão, compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1.
Outra modalidade é um método para tratamento de câncer, com- preendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantida- de terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1.
Outra modalidade é um método para tratamento de câncer, em que o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer de fígado, câncer de próstata e melanoma.
Outra modalidade é um método para tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, câncer e/ou doenças cardiovasculares compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1.
Outra modalidade é um método para tratamento de doenças que são pelo menos parcialmente mediadas por CCR-2, compreendendo admi- nistrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um composto de Exemplo 1.
Outra modalidade é método para modulação da atividade de CCR2 compreendendo administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Exemplo 1.
Outra modalidade é um composto de Exemplo 1 na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia is- quêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, fe- bre, doença cardiovascular, Doença de Crohn, insuficiência cardíaca con- gestiva, doença autoimune, Infecção por HIV, Demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflama- tória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite do soro nefrotóxi- co, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, pla- cas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de enxerto de diálise, hiperplasia íntima de desvio ar- teriovenoso, transplante de órgão, neuropatia de aloenxerto crônica, e cân- cer.
Outra modalidade é um composto dos Exemplos para uso em
terapia.
A invenção pode ser representada de outras formas específicas sem afastar- se do espírito ou atributos essenciais desta. Esta invenção também abrange todas as combinações de modalidades e aspectos alternativos da invenção observados aqui. Entende-se que quaisquer e todas as modalidades podem consideradas em conjunção com qualquer outra modalidade para descrever modalidades adicionais da presente invenção. Além disso, quaisquer ele- mentos de uma modalidade destinam-se a serem combinados com quais- quer e todos os outros elementos de qualquer uma das modalidades para descrever modalidades adicionais. MODALIDADES DE PROCESSO
Emu ma 1â modalidade, a descrição fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula IV, ou um sal deste:
Yv
R1R2N
O
X
NR1R2 ΙΠ
o processo compreende as etapas de:
acoplamento de β-aminoéster de fórmula II, ou um sal deste, com um α-aminoácido quiral adequadamente protegido de fórmula Ill para fornecer amida IV (veja W02005021500); em que:
Ra e Rb são independentemente C-|.galcóxi;
ou Ra e Rbjuntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ambos li- gados combinam-se para formar uma carbonila, uma tiocarbonila, um acetal cíclico ou tioacetal cíclico, em que o acetal cíclico ou tioacetal cíclico é sele- M
cionado de -O-Z-O- e -S-Z-S-, Z é -(CTiT2)2-, -(CT1T2)3-, ou (T;,V4, e
T 1, T2 e T3 em cada ocorrência são independentemente selecionados de
hidrogênio, Ci.4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3,
OCi.4alquila, OCF3, C(=0)C-i-4alquila, e C02Ci-4alquila (preferivelmente T 1,
T2 e T3 são cada qual hidrogênio);
Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de
amina selecionado de um grupo carbobenzilóxi (Cbz), um terc-
butiloxicarbonila (BOC), um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um
grupo benzila (Bn), e um grupo p-metoxibenzila (PMB) (preferivelmente o
grupo de proteção de amina é Cbz, Bn ou BOC, especialmente Cbz ou Bn); R4 é C-|.galquila inferior ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci-
4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4alquila; Y é halogênio, SRi2 ou OSO2Ri3; X é OH, halogênio ou OCORi4;
Ri2 é Ci.6alquila, -(CH2)C(O)ORi3, ou -(CH2)C(O)Ri3; Ri3 em cada ocorrência é Ci.6alquila ou uma benzila opcionalmente substitu- ída por Ci-4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC-i- 4alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4alquila; e Ri4 em cada ocorrência é hidrogênio, Ci-6alquila ou uma benzila opcional- mente substituída por Ci.4alquila, C2-4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi^aIquiIa1 OCF3, e C(=0)Ci_4alquila.
Uma benzila opcionalmente substituída como utilizado aqui indica um grupo benzila que é conectada através de seu grupo metileno (-CH2-) e opcional- mente substituída no anel fenila ligado ao grupo metileno.
Em uma 2- modalidade, a descrição fornece um processo para formação de um produto de fórmula IV, ou um sal deste, em que:
Ra e Rb juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ambos ligados combinam-se para formar um grupo 1,3-dioxolano ou carboni- Ia (preferivelmente Ra e Rb juntamente com os átomos de carbono aos quais eles são ligados combinam-se para formar um grupo 1, 3-dioxolano); Ri é hidrogênio; R2 é Cbz; R3 é hidrogênio; R4 é C-|-6alcóxi;
Y é S(Me); e X é OH.
Em uma 3? modalidade, a descrição fornece um processo em que οβ-aminoéster de fórmula Il é um sal de hidrobrometo ou a toluenossulfona- to. Um sal preferível do β-aminoéster de fórmula Il é o sal de toluenossulfo-
natode ^—' .
Em uma A- modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula IV, ou um sal deste, em que o aco- plamento é conduzido sob uma atmosfera inerte, tal como nitrogênio ou ar- gônio (preferivelmente nitrogênio) em um solvente aprótico tal como proprio- nitrilo, acetato de isopropila, acetato de n-butila, acetato de terc-butila ou acetonitrilo (especialmente acetonitrilo e/ou acetato de etila).
Em uma 5â modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula IV, ou um sal deste, em que o aco- plamento é obtido contactando-se ρβ-aminoéster de fórmula Il com um rea- gente de acoplamento de diimida na presença de um ativador, o β- aminoéster protegido de fórmula II, e uma base de amina terciária. O rea- gente de acoplamento de diimida inclui, por exemplo, reagentes tais como EDAC. Exemplos de ativadores incluem 1-hidroxibenzotriazol (HOBt; o refe- rido termo inclui hidratos destes) e /V,/V-4-dimetilamino-piridina. Uma base de amina terciária inclui, por exemplo, trialquilaminas tais como trietilamina, /V-/V-diisopropil-/V-etil amina e tri-n-propilamina.
Em uma 6ã modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula IV, ou um sal deste, em que o reagen- te de acoplamento de diimida é EDAC, o ativador, é HOBt, e a base de ami- na terciária é trietilamina ou A/-A/-diisopropil-/V-etiI amina.
Em uma 7- modalidade, a descrição fornece um processo para Fórmula um composto de fórmula IV, ou um sal deste, onde as relações mo- Iares do aminoéster de fórmula Il para reagente de acoplamento de diimida para ativador para a amina terciária para é uma em torno de 0,90 - 1,50 a cerca de 0,95-1,50 a cerca de 2,00 a 3,00, respectivamente. As referidas relações molares são preferivelmente uma em torno de 0,95 - 1,05 a cerca de 0,95-1,10 e a cerca de 2.10 a 2.30, respectivamente.
Em uma 8~ modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula V, ou um sal deste:
NR1R2 xXxC02R4
o processo, compreendendo as etapas de:
a) alquilação de um composto de fórmula IV com um agente de alquilação para formar um composto ativado; e
b) ciclização do composto ativado in situ para fornecer um composto de fór- mula IVa.
Em uma 9§ modalidade, a descrição fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula V, ou um sal deste, em que o agen- te de alquilação de etapa a) é um agente de alquilação de enxofre tal como como um haleto de Ci-6alquila e o composto ativado é um sal de sulfônio de composto IV em que Y é S (Ci.6alquil)Ri2· Preferivelmente, o agente de al- quilação é iodeto de metila e Y é S (CH3)2.
Em uma 10ã modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula V, ou um sal deste, em que a etapa de ciclização compreende a combinação do composto ativado, ou um sal deste, com a base na presença de um solvente. A base é selecionada de carbonato de césio, bicarbonato de césio, carbonato de potássio, terc- butilato de sódio, ou hexametildisilazida de sódio, (preferivelmente a base é carbonato de césio).
a formação de um composto de fórmula V, ou um sal deste, em que a etapa de ciclização é conduzida sob uma atmosfera inerte, tal como nitrogênio ou argônio, em um solvente selecionado de DMSO, DMF, DMA, N- metilpirrolidona, e sulfolano. Preferivelmente a atmosfera inerte é nitrogênio e o solvente é selecionado de DMSO e/ou DMF. Em uma 12â modalidade, onde o composto de fórmula IVa tem
uma porção acetal, isto é, onde Ra e Rb são independentemente C-|.galcóxi,
ou juntamente com o átomo ao qual eles são ligados Ra e Rb combinam-se para formar um acetal cíclico ou tioacetal cíclico, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula V, ou um sal deste, também compreendendo a etapa de hidrólise de um composto de fórmula IVa tendo uma porção acetal:
para formar o composto de fórmula V.
a etapa de hidrólise pode ser conduzida de acordo com os procedimentos para hidrólise de grupos acetal conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a etapa de hidrólise pode compreender o tratamento do com- posto de fórmula IVa em um solvente tal como acetona, butanona, acetonitri- Io e isopropanol, ou soluções aquosas destes com um ácido. A etapa de hi- drólise preferivelmente compreende o tratamento do composto de fórmula IVa em uma solução de acetona aquosa com ácido hidroclórico. Em uma 13- modalidade, a presente descrição fornece um pro-
cesso para a preparação de um composto de fórmula Vl tendo uma porção
Em uma 11â modalidade, a descrição fornece um processo para
NR1R2
N
IVa
o
V éster, ou um sal deste:
ν -
NHR8R9
o processo compreende a etapa de:
aminar redutivamente um composto de fórmula V com uma amina tendo a Fórmula, NH(R8)(R9)1 para fornecer uma imina/enamina de fórmula Va em que R8 e R9 são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci- 6alquila. Preferivelmente, R8 e Rg, são independentemente selecionados de Ci-6alquila. Mais preferivelmente, a amina é N-metil-N-isopropilamina.
Em uma 14ã modalidade, a descrição fornece um processo para formação de um produto de fórmula Vl compreendendo a etapa de aminar redutivamente de:
(a) adicionar a amina de fórmula NH(R8)(Rs) e um agente de desidratação a um composto de fórmula V em um solvente aprótico em uma temperatura de cerca de 20° a cerca de +50 0C para formar a imina/enamina de fórmula Va; e
(b) tratar uma solução da imina /enamina de fórmula Va e um catalisador de paládio, 5% de Pt/S/C, com uma pressão de gás de hidrogênio para fornecer um composto de fórmula VI.
Em uma 15â modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula VI, ou um sal deste, em que o agen- te de desidratação de etapa a) é um ácido de Lewis/ácido BrOnsted (preferi- velmente tetraisopropóxido de titânio) e o solvente aprótico é selecionado de dicloroetano, diclorometano, acetonitrilo, DMSO, DMF, e N-metil- pirrolidinona (preferivelmente diclorometano).
Em uma 16ã modalidade, a descrição fornece um processo para a formação de um composto de fórmula VI, ou um sal deste, em que na eta-
NR1R
1B2
/O2R4
r
R8NR9 Va
NR1R2
CX0
N υ
^CO2R4
r Nx
R8 xr9
VI pa b) os 5% de catalisador de Pt/S/C estão presentes em aproximadamente 0,5 a 50% (peso/peso) com relação ao composto Va. Preferivelmente, o gás de hidrogênio é em uma pressão de cerca de 15 a cerca de 2,46 kg/cm2.
Em uma 17ã modalidade, a presente invenção fornece um pro- cesso para a preparação de um composto de fórmula VII, ou um sal deste:
^NR1R2
VII
o processo compreende a etapa de:
hidrolisar o composto de éster de fórmula VI, para fornecer um composto de ácido de fórmula VII. A temperatura varia de cerca de 40°C a cerca de 100 0C (a temperatura varia de cerca de 50° 0C a cerca de 70 0C é mais preferi-
da). Os ácidos são selecionados de ácido enxofre, ácido toluenossulfônico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido hidrobrômico e ácido hidroclóri- co. Ácido hidroclórico é mais preferido. Preferivelmente, a etapa de hidrólise é realizada em uma solução de ácido hidroclórico aquoso para obter o com- posto de fórmula VII.
Em uma 18â modalidade, a descrição fornece um processo para
a preparação de um sal do composto de fórmula Vll também compreenden- do a etapa de misturar a base com uma solução do composto do de fórmula VII, opcionalmente in situ. A base é preferivelmente um hidróxido de alcáli, por exemplo, hidróxido de sódio.
Em uma 19? modalidade, a descrição fornece um processo para
a preparação de um composto de carbamato de fórmula VIII, ou um sal des- te: VIIa VIII
o processo, compreendendo as etapas de:
a) converter um composto de ácido de fórmula Vll em um composto de iso- cianato de fórmula Vila; e
b) reagir o composto de isocianato de fórmula Vlla com um álcool de fórmu- Ia R15OH para fornecer a composto de carbamato de fórmula VIII;
em que R15 é C1^alquila ou uma benzila opcionalmente substituída por C1. 4alquila, C2-4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)C1.4alquila. R15 é preferivelmente íerc-butila ou benzila não substituída.
Em uma 20§ modalidade, a descrição fornece um processo para
a preparação de um composto de fórmula VIII, ou um sal deste, por meio de uma redisposição Curtius compreendendo contatar o sal de sódio do com- posto de fórmula Vll com um reagente de azida (preferivelmente azida de difenilfosforila) em um solvente (preferivelmente álcool terc-butílico) conten- do tolueno em uma temperatura acima do ponto de disparo da redisposição térmica. A temperatura é preferivelmente uma maior do que 50 °C.
Em uma 21ã modalidade, a descrição fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula IX, ou um sal deste: NR1R2
VIII
R10C(O)W
N
0 H
Y
ο
R10
10
15
20
IX
o processo compreende as etapas de:
a) transformar o composto de carbamato de fórmula Vlll em um intermediá- rio de amina livre; e
b) acilar o intermediário de amina livre in situ com um reagente, R10C(O)W, para fornecer um composto de fórmula IX;
em que:
R10 é independentemente Ci-6alquila ou uma benzila opcionalmente substi- tuída por Ci-4alquila, C2^alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi- 4alquila, OCF3, e C(=0)Ci.4alquila; e W é a halogênio ou R10C(O)-. Preferivelmente1 R10C(O)W é anidrido acético.
Em uma 22~ modalidade, a descrição fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula IX, ou um sal deste, em que a e- tapa de transformação comprises as etapas de:
a) tratar uma solução de um composto de fórmula Vlll com um ácido; e
b) adicionar a base à solução para fornecer um intermediário de amina livre. Preferivelmente o ácido é selecionado de ácido enxofre, ácido toluenossul- fônico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido hidrobrômico e ácido hi- droclórico, mais preferivelmente ácido metanossulfônico. Preferivelmente a base é uma trialquilamina, preferivelmente trietilamina.
Em uma 23ã modalidade, a descrição fornece um processo al- ternativo para preparar um composto de fórmula IX, ou um sal deste: NR1R2
R10C(O)W
VIIA
H
ν NL .R10
T
R8 R9
ο processo compreende a etapa de adicionar o composto de isocianato de fórmula Vila, opcionalmente insitu, a um agente de acilação, (R10C(O))2O na presença de seu ácido correspondente, R10C(O)OH, em que R10 é indepen- dentemente C1^alquila ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci- 4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4alquila. Preferível mente, R10 é Ci.6alquila, especialmente metila.
Em uma 24- modalidade, a descrição fornece um processo para a preparação de um composto de fórmula X, ou um sal deste:
NHR1
X
o processo compreende:
a desproteção do composto de amina protegida de fórmula IX para fornecer um composto de fórmula X. Preferivelmente, em que R2 é Cbz, a desprote- ção é realizada por hidrogenação na presença de um catalisador de paládio. O catalisador de paládio é preferivelmente 10% Pd/C.
em uma 25a modalidade, a descrição fornece um processo para
a preparação de um composto de fórmula I: o processo compreende:
acoplar um composto de fórmula X com um composto de formula:
LG
para fornecer um composto de fórmula I; em que:
HET é um anel heteroarila ou heterociclo de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo um a quatro heteroátomos selecionados de Ν, O ou S (pre- ferivelmente um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo menos um dos anéis (HET é preferivelmente quinazolin- 4-il 6-substituída, mais preferivelmente 6-trifluorometil-quinazolin-4-il); e LG é um grupo de partida selecionado de halogênio ou 0S02Ri6 (LG é pre- ferivelmente a halogênio, mais preferivelmente cloro), em que Ri6 é C-i- 6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S1 ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos (preferivelmente, substituintes opcio- nais para Ri6 são um a três grupos selecionados de halogênio, CF3 e C-i- 6alquil).
Em uma 26§ modalidade, a presente invenção fornece um novo processo para preparar um composto de fórmula VIII, ou um sal deste:
HET- nr1r
102
co2r4
0 V
nr1r
1D2 —Ι
_v
0Λ'
co2r4
r
r8nr9 Va
nr1r2
O-
V\C02R4
R8^R9
vi
10
15
nr1r2
N
Λ
« Ν, „ r8 r9
co2h
nr1r
1d2
CX,
\V
r8 r9
vnco
nr1r2
cio
R15OH
0
r8'nvr9
viii
VII VIia
o processo compreende as etapas de:
aminar redutivamente um composto de fórmula V com uma amina de Fórmu- la, NH(R8)(R9)1 para fornecer um composto de fórmula Vl compreendendo as etapas de:
(a) adicionar a amina e um agente de desidratação a um composto de fór- mula V em um solvente aprótico em uma temperatura de cerca de"20° a cer- ca de +50 0C para formar o composto de imina/enamina de fórmula Va; e
(b) tratar uma solução do composto de imina/enamina de fórmula Va e um catalisador de paládio, 5% de Pt/S/C, com uma pressão de gás de hidrogê- nio para fornecer um composto de éster de fórmula VI;
hidrolisar o composto de éster de fórmula Vl para fornecer um composto de ácido de fórmula VII;
converter um composto de ácido de fórmula Vll em um composto de isocia- nato de fórmula Vila; e
reagir o composto de isocianato de fórmula Vlla com um álcool de fórmula R15OH para fornecer a composto de carbamato de fórmula VIII; em que:
Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de um grupo carbobenzilóxi (Cbz), uma terc- butiloxicarbonila (BOC), um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn)1 e um grupo p-metoxibenzil (PMB) (preferivelmente o gru- po de proteção de amina é Cbz, Bn ou BOC, especialmente Cbz ou Bn); R4 é C-i-galquila inferior ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci-
4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC-i-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci_4alquila; R8 e R9 são independentemente hidrogênio ou C-| .galquila;
R15 é Ci.6alquila ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci-4alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4alquila (R15 é preferivelmente terc-butil ou benzila não substituída, mais preferivelmente ferc-butila); HET é um anel heterociclo ou heteroarila de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo um a quatro heteroátomos selecionados de Ν, O ou S (pre- ferivelmente um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo menos um dos anéis (HET é preferivelmente quinazolin- 4-il 6-substituída , mais preferivelmente 6-trifluorometil-quinazolin-4-il); e LG é um grupo de partida selecionados de halogênio ou OSO2Ri6 (LG é pre- ferivelmente a halogênio, mais preferivelmente cloro), em que Ri6 é C-i- 6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos (preferivelmente, substituintes opcio- nais para Ri6 são um a três grupos selecionados de halogênio, CF3 e C-i- 6alquil).
Em uma 27ã modalidade, a presente invenção fornece um novo processo para preparar um composto de fórmula I, ou um sal deste: NR1R
1Q2 ç*.
I^sXnCO2R4
O V
NR1R2
Ck
,CO2R4
Va
NR1R2
Ck
XCO2R4
o-N, „
R8 R9 VI
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1 q2
Ck
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o-Nv „
R8 R9
VXI
. NR1R2
α,
NCO
vila
R15OH
NR1R
1D2
R8'NVR9
VIII
NHR
CX η.
H ... ^ N>0
. \ .CH3 / \ - H
R10C(O)W f I Y (HETj-LG Nx^CH3
(R10 = Me)
Y
o
R8^R9 .N
R8' xR9
IX
o processo compreende as etapas de:
aminar redutivamente um composto de fórmula V com uma amina de Fórmu- la, NH(R8)(R9)1 para fornecer um composto de fórmula VI, redutivamente a- minar compreendendo as etapas de:
(a) adicionar a amina e um agente de desidratação a um composto de fór- mula V em um solvente aprótico em uma temperatura de cerca de~20° a cer- ca de +50 0C para formar o composto de imina/enamina de fórmula Va; e (b) tratar uma solução do composto de imina/enamina de fórmula Va e um catalisador de paládio, 5% de Pt/S/C, com uma pressão de gás de hidrogê- nio para fornecer um composto de éster de fórmula VI; hidrolisar o composto de éster de fórmula Vl para fornecer um composto de ácido de fórmula VII;
converter um composto de ácido de fórmula Vll em um composto de isocia- nato de fórmula Vila;
reagir o composto de isocianato de fórmula Vlla com um álcool de fórmula R15OH para fornecer a composto de carbamato de fórmula VIII; transformar o composto de carbamato de fórmula Vlll em um intermediário de amina livre; e
acilar o intermediário de amina livre in situ com um reagente, R10C(O)W1 pa- ra fornecer um composto de amina protegida de fórmula IX.; desproteger o composto de amina protegida de fórmula IX para fornecer um composto de fórmula X; e
acoplar um composto de fórmula X com um composto de fórmula
LG
para fornecer um composto de fórmula I; em que:
Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de um grupo carbobenzilóxi (Cbz), um terc-butiloxicarbonil (BOC)1 um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn), e um grupo p-metoxibenzila (PMB) (preferivelmente o grupo de proteção de amina é Cbz, Bn ou BOC, especialmente Cbz ou Bn); R4 é C-i-galquila inferior ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci-
4alquila, C2-4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)C1.4alquila; R8 e Rg são independentemente hidrogênio ou C-| .galquila;
R10 é independentemente Ci-6alquila ou uma benzila opcionalmente substitu- ída por Ci-4alquila, C2^alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi- 4alquila, OCF3, e C(=0)Ci.4alquila (preferivelmente Ci^alquila1 mais preferi- velmente metil);
HET- W é halogênio ou R10C(O)-;
R15 é Ci.6alquila ou uma benzila opcionalmente substituída por Ci-4alquila, C2-4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4alquila (R15 é preferivelmente te/r-butila ou benzila não substituída, mais preferivelmente terc-butil);
HET é um anel heterociclo ou heteroarila de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo um a quatro heteroátomos selecionados de Ν, O ou S (pre- ferivelmente um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo menos um dos anéis (HET é preferivelmente quinazolin- 4-il 6-substituída , mais preferivelmente 6-trifluorometíl-quinazolin-4-il); e
LG é um grupo de partida selecionado de halogênio ou OSO2Rie (LG é pre- ferivelmente a halogênio, mais preferivelmente cloro), em que Ri6 é Ci- 6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos (preferivelmente, substituintes opcio- nais para Ri6 são um a três grupos selecionados de halogênio, CF3 e Ci- ealquil).
Em uma 28ã modalidade, a presente invenção fornece um novo processo alternativo para preparar um composto de fórmula I, ou um sal des- te: NR1R
1D2
^CO2R4
O V
NR1R2
XO2R4
IY
I I
R8NR9 Va
_"s
NR1R2 0
o.N^ „
R8 R9
VI
CO2R4
NR1R2
cl„
N
^CO2H
o-Nv „
R8 R9
VIX
.NRR
1D2
CX
NCO
R8 R9
vila
R10aC(O)OH (R10aC(O))2O
NHR1
CXt
R8-nvR9
IX
N, XH3
T
o
HETH-LG
CX0
R8'NVR9
H
Nv ^CH3
T
o processo compreende as etapas de:
aminar redutivamente um composto de fórmula V com uma amina de Fórmu- la, NH(R8)(R9)1 para fornecer um composto de fórmula VI, redutivamente a- minar compreendendo as etapas de:
(a) adicionar a amina e um agente de desidratação a um composto de fór- mula V em um solvente aprótico em uma temperatura de cerca de~20° a cer- ca de +50 0C para formar o composto de imina/enamina de fórmula Va; e (b) tratar uma solução do composto de imina/enamina de fórmula Va e um catalisador de paládio, 5% de Pt/S/C, com uma pressão de gás de hidrogê- nio para fornecer um composto de éster de fórmula VI; hidrolisar o composto de éster de fórmula Vl para fornecer um composto de ácido de fórmula VII;
converter um composto de ácido de fórmula Vll em um composto de isocia- nato de fórmula Vila;
adicionar o composto de isocianato de fórmula Vila, opcionalmente in situ, a um agente de acilação, (R10aC(O))2O na presença de seu ácido correspon- dente, R10aC(O)OH para fornecer o composto de amina protegida de fórmula IX;
desproteger o composto de amina protegida de fórmula IX para fornecer um composto de fórmula X; e
acoplar um composto de fórmula X com um composto de fórmula
LG
para fornecer um composto de fórmula I; em que:
Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de um grupo carbobenzilóxi (Cbz), um terc-butiloxicarbonil (BOC)1 um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn), e um grupo p-metoxibenzila (PMB) (preferivelmente o grupo de proteção de amina é Cbz, Bn ou BOC, especialmente Cbz ou Bn); R4 é C1^alquila inferior ou uma benzila opcionalmente substituída por C-i- 4alquila, C2-4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4alquila, OCF3, e C(=0)Ci.4alquila;
Re e R9 são independentemente hidrogênio ou C-| .galquila; em que R10a é independentemente C-i-6alquila ou benzila opcionalmente substituída (preferivelmente R10a é metil);
HET é um anel heterociclo ou heteroarila de 3 a 14 membros opcionalmente substituído tendo um a quatro heteroátomos selecionados de Ν, O ou S (pre- ferivelmente um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo menos um dos anéis (HET é preferivelmente quinazolin-
HET- 4-il 6-substituída , mais preferivelmente 6-trifluorometil-quinazolin-4-il); e LG é um grupo de partida selecionados de halogênio ou OSO2R16 (LG é pre- ferivelmente a halogênio, mais preferivelmente cloro), em que R16 é Ci- 6alquila, fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos (preferivelmente, substituintes opcio- nais para Ri6 são um a três grupos selecionados de halogênio, CF3 e Ci- 6alquil).
Em uma 29ã modalidade, a descrição fornece um processo de acordo com qualquer uma das seguintes modalidades em que:
NHCbz
ςχ
o composto de fórmula V é 0 , ou um sal deste;
NHCbz
do N υ
o composto de fórmula Vl é ' , ou um sal deste;
NHCbz
do N
o composto de fórmula Vll é I , ou um sal deste (preferivelmen-
te o sal de sódio); NHCbz
CX0
N υ
H
O
1 T
ο composto de carbamato de fórmula Vlll é I , ou um
sal deste;
NHCbz
CX
N' "O
XN CH3
H
-"Τ"
O
o composto de amina protegida de fórmula IX é I , ou um sal
deste;
NH2
CXc
N O
.NvXH3
H
^nY'
O
o composto desprotegido de fórmula X é I , ou um sal deste;
e o composto de fórmula I é N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)- 2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, ou um sal deste. Em uma 30â modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula V, ou um sal deste:
NR1R
1B2
CX0
N υ
,VxCO2R4
O V em que:
R1 e R2 são hidrogênio ou um grupo de proteção de amina selecionado de BOC1 Cbz1 ou benzila; e R4 é C-|-6 alquila inferior.
NHCbz
^>0
^CO2Et
Um composto preferido de fórmula V é 0 , ou um sal deste.
Em uma 31â modalidade, a descrição fornece um composto de
fórmula VI, ou um sal deste:
NR1R
1D2
Ν' ^0
^CO2R*
R8'N vR9 VI
em que:
R1 e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de BOC, Cbz, ou benzila; e R4 é C-i-galquila; e
R8 e R9 são independentemente selecionados de hidrogênio ou C-|-6alquila.
NHC bz
CXt
xxxC02Et
"Ν" ^0
N^
Um composto preferido de fórmula Vl é I , ou um sal deste
Em uma 32- modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula VII, ou um sal deste: NR1R2
ςΐο
VII
em que:
R1 e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de BOC, Cbz, ou benzila; e
R8 e R9 são independentemente selecionados de hidrogênio ou C-|^alquila.
NHCbz
Cl0
N
Um composto preferido de fórmula Vll é I , ou um sal deste.
Sais preferíveis deste incluem os sais de álcali tais como o sal de sódio do
composto de fórmula VII. Em uma 33ã modalidade, a descrição fornece um composto de
fórmula VII, ou um sal deste:
JslR1R2
VIII
em que:
R1 e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de BOC, Cbz, ou benzila; R8 e R9são independentemente selecionados de hidrogênio ou C-|-6alquila; e
R10 é C-i-galquila ou benzila.
NHCbz
α,ο
N υ
VN O(t-butyl)
T
O
N^
Um composto preferido de fórmula Vlll é I , ou um sal
deste.
Em uma 34ã modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula IX, ou um sal deste:
NR1R2
-Ν" 0
\\Nv___- "10
H
R8 n^R9 IX
em que:
R1 e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de BOC1 Cbz1 ou benzila;
R8 e R9 são independentemente selecionados de hidrogênio ou C-|-6alquila; e
R10 é C-| -galquila ou benzila opcionalmente substituído benzila.
N HCbz
H
O
,N CH3
Nv
Um composto preferido de fórmula IX é I , ou um sal deste.
Em uma 35s modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula X, ou um sal deste: NHR1
N υ H
Λ T
O
R8 Ν R9
em que:
R1 é independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina se- lecionado de BOC, Cbz1 ou benzila;
R8 e R9 são independentemente selecionados de hidrogênio ou C-|-6alquila; e
R10 é C-i-galquila ou benzila opcionalmente substituída.
NH2
ç*;
- J CH1 O
Nv
Um composto preferido de fórmula X é I , ou um sal deste.
Em uma 36§ modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula II, ou um sal deste:
NHR3
^CO2R4
em que:
Ra e Rb juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são
ambos ligados combinam-se para formar um grupo 1,3-dioxolano ou carboni- Ia (preferivelmente Ra e Rb juntamente com os átomos de carbono aos quais eles são ligados combinam-se para formar um grupo 1, 3-dioxolano); Ri é hidrogênio; R2 é Cbz;
R3 é hidrogênio; e
R4 é C-|-6alcóxi.
Um composto preferido de fórmula Il is ^—f , ou um sal deste.
Sais preferíveis são os sais de toluenossulfonato ou hidrobrometo, especi- almente o sal de toluenossulfonato. Em uma 46ã modalidade, a descrição fornece um processo em que um composto de fórmula I é N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida ou um sal deste.
A presente invenção pode ser apresentada de outras formas es- pecíficas sem afastar-se do espírito ou atributos essenciais desta. Desse modo, as modalidades acima não devem ser consideradas limitantes. Quaisquer e todas as modalidades da presente invenção podem ser consi- deradas em conjunção com qualquer outra modalidade ou modalidades para descrever modalidades adicionais. Cada elemento individual (por exemplo, aspector preferidos ou especiais) das modalidades é sua própria modalidade independente. Além disso, qualquer elemento de uma modalidade destina- se a ser combinado com qualquer e todos os outros elementos de qualquer modalidade para descrever uma modalidade adicional. Além disso, a presen- te invenção abrange combinações de diferentes modalidades, partes de mo- dalidades, definições, descrições, e exemplos da invenção observados aqui. DEFINIÇÕES
Os seguintes são definições de termos utilizados nesta especifi- cação e reivindicações anexas. A definição inicial fornecida para um grupo ou termo aqui se aplica àquele grupo ou termo por toda a especificação e reivindicações, individualmente, ou como parte de outro grupo, a menos que de outro modo indicado.
O termo "alquila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 1 a 12 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono. Quando os númeross aparecerem em um subscrito a- pós o símbolo "C", o subscrito define com maior especificidade o número de átomos de carbono que um particular grupo pode conter. Por exemplo, "C1.
6alquil" refere-se grupos alquila de cadeia linear ou ramificada com um a seis átomos de carbono, tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t- butila, n-pentila, e assim por diante. O subscrito "0" refere-se a uma ligação. Desse modo, o termo hidróxi(C0_2)alquila ou (C0.2)hidroxialquila inclui hidróxi,
hidroximetila e hidroxietila. Grupos alquila podem ser substituídos com um a três grupos selecionados de (Ci-6)alquila, (C2-6)alquenila, hidróxi, halogênio, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-6alquil), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-6alquil), CO2H, CO2(C1^aIquiI), NHCO^Cvealquil), -S(C1^aIquiI), NH2, NHÍC^alquil), ISKC1- 6alquil)2, N(CH3)3+, S02(Ci-6alquil), C(=0)(C1.4alquileno)NH2, Ci=OXC1- 4alquileno)NH(alquil), C(=0)(Ci.4alquileno)N(C1-4alquil)2, C3-7cicloalquila, feni- Ia, benzila, feniletila, fenilóxi, benzilóxi, naftila, um heterociclo de quatro a sete membros, e/ou uma heteroarila de cinco a seis membros. Quando uma alquila substituída for substituída com um grupo arila, heterociclo, cicloalqui- la, ou heteroarila, os referidos sistemas anelados são como definidos abaixo e desse modo têm zero, um, dois, ou três substituintes, também como defi- nido abaixo.
Quando o termo "alquila" é utilizado juntamente com outro gru- po, tal como em "arilalquila", esta conjução define com maior especificidade pelo menos um dos substituintes que a alquila substituída conterá. Por e- xemplo, "arilalquil" refere-se a um grupo alquila substituída como acima defi- nido em que pelo menos um dos substituintes é uma arila, tal como benzila. Desse modo, o termo aril(C0-4)alquila inclui uma alquila inferior substituída tendo pelo menos um substituinte de arila e também inclui uma arila direta- mente ligada a outro grupo, isto é, aril(C0)alquila.
O termo "alquenila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma liga- ção dupla. Grupos alquenila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma liga- ção dupla são mais preferidos. Grupos alquenila podem ser substituídos co- mo acima descrito para grupos alquila.
O termo "alquinil" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma liga- ção tripla. Grupos alquinila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma ligação tripla são mais preferidos. Grupos alquinila podem ser substituídos como acima descrito para grupos alquila.
O termo "alquileno" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada bivalentes tendo 1 a 12 átomos de carbono, preferivel- mente 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, (-CH2-Jn, em que η é 1 a 12, preferivelmente 1-8. Grupos alquileno inferior, isto é, grupos alquileno de 1 a 2 átomos de carbono, são mais preferidos. Os termos "alquenileno" e "alqui- nileno" referem-se a radicais bivalentes de grupos alquenila e alquinila, res- pectivamente, como acima definido. Grupos alquenileno podem ser substitu- ídos como acima descrito para grupos alquila. O termo "alcóxi" refere-se a um átomo de oxigênio substituído
por alquila, como definido aqui. Por exemplo, o termo "alcóxi" ou inclui o grupo -O-C1^aIquiIa.
Quando o subscrito for utilizado com referência a um alcóxi, tio- alquila ou aminoalquila, o subscrito refere-se ao número de átomos de car- bono que o grupo pode conter além dos heteroátomos.
Deve-se entender que as seleções para todos os grupos, inclu- indo por exemplos, alcóxi, tioalquila, e aminoalquila, serão feitas por alguém versado no campo para fornecer compostos estáveis.
O termo "carbonila" refere-se a um grupo carbonila bivalente
"C(=0").
O termo "acila" refere-se a um grupo carbonila ligado a um radi- cal orgânico, mais particularmente, o grupo C(=0)Re, bem como o grupo bi- valente C(=0)Re, que são ligados aos radicais orgânicos. O grupo Re pode ser selecionado de alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclo, arila, ou heteroarila como definido aqui, ou quando apropriado, o grupo bivalente correspondente, por exemplo, alquileno.
O termo "cicloalquila" refere-se a anéis hidrocarboneto totalmen- te saturado ou parcialmente insaturado (e, portanto, inclui "anéis cicloalque- nila") de 3 a 9, preferivelmente 3 a 7 átomos de carbono. O termo "cicloal- quil" inclui tais anéis tendo zero, um, dois, ou três substituintes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2.4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci- 4alquil), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-4alquil), CO2H, C02(Ci.4alquil), NHC02(Ci- 4alquil), S(C1^aIquiI), NH2, NH(Ci_4alquil), N(C1^aIquiI)2, N(Ci-4alquil)3+, S02(Ci.4alquil), C(=0)(Ci-4alquileno)NH2, C(=0)(Ci-4alquileno)NH(alquil), e/ou C(=0)(Ci-4alquileno)N(C1.4alquil)2. O termo "cicloalquil" também inclui tais anéis tendo um segundo anel fundido a estes (por exemplo, incluindo anéis benzo, heterociclo, ou heteroarila) ou tendo uma ligação em ponte de carbono-carbono de 3 a 4 átomos de carbono.
O termo "halo" ou "halogênio" refere-se a cloro, bromo, fluoro e
iodo.
O termo "haloalquila" significa uma alquila substituída tendo um ou mais substituintes de halo. Por exemplo, "haloalquila" inclui mono, bi, e trifluorometila.
O termo "haloalcóxi" significa um grupo alcóxi tendo um ou mais substituintes de halo. Por exemplo, "haloalcóxi" inclui OCF3.
O termo "heteroátomos" deve incluir oxigênio, enxofre e nitrogê-
nio.
O termo "arila" refere-se a fenila, bifenila, fluorenila, 1-naftila e 2- naftila. O termo "aril" inclui tais anéis tendo zero, um, dois ou três substituin- tes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2.4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-4alquil), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci.4alquil), CO2H, C02(Ci- 4alquil), NHCO2(C1^aIquiI), S(C1^aIquiI), NH2, NH(C1^aIquiI), N(C1^aIquiI)2, N(Ci-4alquil)3+, SO2(C1^aIquiI), C^OXC^alquilenoJNHa,
C(=0)(Ci.4alquileno)NH(alquil), e/ou C^OXC^alquileno^C^alquil)^
Os termos "heterociclo" ou "heterocíclico" referem-se a anéis substituídos e não substituídos não aromáticos (que podem ser parcialmente ou totalmente saturados) de 3 a 15 membros tendo um a quatro heteroáto- mos. Tais anéis podem ser grupos monocíclicos de 3 a 7 membros, grupos bicíclicos de 7 a 11 membros, e grupos tricíclicos de 10 a 15 membros. Cada anel do grupo heterociclo contendo um heteroátomo pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de um a quatro átomos de nitrogênio contanto que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos, e também contanto que o anel contenha pelo menos um átomo de carbono. Os anéis fundidos completando grupos bicíclicos ou tricíclicos po- dem conter apenas átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou insaturados. Os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcio- nalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcionalmente ser quaternizados. O grupo heterociclo pode ser ligado por meio de qualquer átomo de nitrogênio ou carbono disponível. O anel heterociclo pode conter zero, um, dois ou três substituintes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2- 4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-4alquil), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci.4alquil), CO2H, C02(Ci-4alquil), NHC02(Ci-4alquil), S(C1^aIquiI), NH2, NH(Ci.4alquil), N(Ci-4alquil)2, N(C1.4alquil)3+, S02(Ci.4alquil), C(=0)(Ci- 4alquileno)NH2, C(=0)(Ci.4alquileno)NH(alquil), e/ou C(=0)(Ci- 4alquileno)N(Ci-4alquil)2. Grupos heterocíclicos exemplares incluem azetidini- la, pirrolidinila, oxetanila, imidazolinila, oxazolidinila, isoxazolinila, tiazolidini- la, isotiazolidinila, tetraídrofuranila, piperidila, piperazinila, 2-oxopiperazinila, 2-oxopiperidila, 2-oxopirrolodinila, 2-oxoazepinila, azepinila, 4-piperidonila, tetraidropiranila, morfolinila, tiamorfolinila, sulfóxido de tiamorfolinila, sulfona tiamorfolinila, 1,3-dioxolano, quinuclidinila, tetraidro-1,1-dioxotienila e simila- res.
O termo "heteroaril" refere-se a anéis de 3 a 14 membros substi- tuídos e não substituídos aromáticos tendo um a quatro heteroátomos sele- cionados de O, S, ou N em pelo menos um dos anéis. Os referidos anéis podem ser grupos monocíclicos de 5 ou 6 membros, grupos bicíclicos de 9 ou 10 membros, e grupos tricíclicos de 11 a 14 membros. Cada anel do gru- po heteroarila contendo um heteroátomo pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de um a quatro átomos de nitrogênio contanto que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos e cada anel tenha pelo menos um átomo de carbono. Os anéis fundidos completan- do os grupos bicíclicos ou tricíclicos podem conter apenas átomos de carbo- no e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou insaturados. Os áto- mos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcionalmente ser quaternizados. Grupos hteroarila que são bicíclicos ou tricíclicos devem incluir pelo menos um anle totalmente aromático, porém o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não aromáticos. O grupo heteroarila pode ser ligado em qualquer átomo de nitrogênio ou carbono disponível de qualquer anel. O sistema de anel hete- roarila pode conter zero, um, dois ou três substituintes selecionados de (C1- 4)alquila, (C2.4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-4alquil), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci.4alquil), CO2H1 CO2(Ci^aIquiI), NHCO2(C1^aIquiI), S(Ci-4alquil), NH2, NH(C1^aIquiI), N(C1^aIquiI)2, N(C1.4alquil)3+, S02(Ci. 4alquil), C(=0)(C1.4alquileno)NH2, C^OXC^alquilenoJNHÍalquil), e/ou C(=0)(C1-4alquileno)N(C1.4alquil)2.
Grupos heteroarila exemplares incluem pirrolila, pirazolila, pira- zolinila, imidazolila, oxazolila, isoxazolila, tiazolila, tiadiazolila, isotiazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, piridila, pirazinila, pirimidinila, piridazinila, triazi- nila, indolila, benzotiazolila, benzodioxolila, benzoxazolila, benzotienila, qui- nolinila, tetraidroisoquinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzopiranila, indolizinila, benzofuranila, chromonila, cumarinila, benzopiranila, cinnolinila, quinoxalinila, indazolila, pirrolopiridila, furopiridila, diidroisoindolila, tetraidro- quinolinila e similares. Grupos particulares heteroarila incluem, por exemplo, quinazolin-4-il e 6-trifluorometil-quinazolin-4-ila 6-substituída.
Onde um é opcionalmente substituído, deve-se incluir grupos substituídos e não substituídos. Os compostos aqui descritos podem ter centros assimétricos. Os
compostos da presente invenção contendo um átomo assimetricamente po- de ser isolado em formas oticamente ativas ou racêmicas. É bem conhecido na técnica que para preparar formas oticamente ativas, tais como por reso- lução de formas racêmicas ou por síntese de materiais de partida. Muitos isômeros geométricos de oleofinas, ligações duplas de C=N, e similares po- dem também estar presentes nos compostos descritos aqui, e todos os tais isômeros estáveis são contemplados na presente invenção. Isômeros geo- métricos eis e trans dos compostos da presente invenção são descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isomé- ricas separadas. Todas as formas racêmicas, diastereoméricas, quirais e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a menos que a estereoquímica específica ou forma isomérica seja especifica- mente indicada.
Um enantiômero de compostos descritos aqui pode exibir uma atividade superior comparada com o outro. Desse modo, todas as estereo- químicas são consideradas serem uma parte da presente invenção. Quando requirida, a separação do material racêmico pode ser obtida por HPLC utili- zando uma coluna quiral ou por uma resolução utilizando um agente de re- solução tal como sal de cloreto canfônico como em Steven D. Young e outro, Antimicrobial Agents e Chemotherapy, 1995, 2602-2605.
A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para referir-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosa- gem que estão, no escopo de diagnóstico médico seguro, adequadas para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritaçãi, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurado com uma relação benefício/risco razoável. Como utilizado aqui, "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-
se a derivados dos compostos descritos em que o composto origem é modi- ficado por preparação de sais de ácido ou base destes. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados a, sais minerais ou orgânicos de resíduos básicos tais como aminas; sais de álcali ou orgânicos de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos; e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos conven- cionais ou os sais de amônio quartenário do composto origem formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgâ- nicos tais como hidroclóricos, benzenossulfônicos, hidrobrômicos, sulfúricos, sulfâmicos, fosfóricos, nítricos e similares; e os sais preparados de ácidos orgânicos tais como acéticos, propiônicos, sucínicos, glicólicos, esteáricos, lácticos, málicos, tartáricos, cítricos, ascórbicos, pamóicos, maléicos, hidro- ximaléicos, fenilacéticos, glutâmicos, benzóicos, salicíclicos, sulfanílicos, 2- acetoxibenzóicos, fumáricos, toluenossulfônicos, metanossulfônicos, etano- dissulfônicos, oxálicos, isetiônicos, e similares.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção po-
dem ser sintezados do composto origem que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo o ácido livre ou formas de base destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base apropriada ou ácido em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos tipo éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrilo são preferidos. As listas dos sais adequados são encontradas na Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, M- edição, Mack Publishing Company, Eas- ton, PA, 1985, p. 1418, a descrição das quais é pelo presente incorporado aqui por referência.
Visto que os fármacos são conhecidos para alcançar qualidades desejáveis numerosas de farmacêuticos (por exemplo, solubilidade, disponi- bilidade, fabricação, etc...) os compostos da presente invenção podem ser liberados em forma de fármaco. Desse modo, a presente invenção destina- se a abranger fármacos dos compostos atualmente reivindicados, métodos de liberação dos mesmos e composições contendo os mesmos. Os "fárma- cos" destinam-se a incluir qualquer portador covalentemente ligado que libe- ra um fármaco origem ativo da presente invenção in vivo quando tal fármaco é administrado a um paciente mamífero. Os fármacos na presente invenção são preparados modificando grupos funcionais presentes no composto de tal maneira que as modificações sejam clivadas, em manipulação de rotina ou in vivo, para o composto origem. Os fármacos incluem compostos da pre- sente invenção em que um grupo hidróxi, amino, ou sulfonila é ligado a qualquer grupo que, quando o fármaco da presente invenção é administrado a um paciente mamífero, cliva para formar uma hidroxila livre, amino livre, ou grupo sulfidrila livre, respectivamente. Exemplos de fármaco incluem, porém não são limitados a, derivados de acetato, formato e benzoato de álcool e grupos funcionais de amina nos compostos da presente invenção. "Composto estável" e "estrutura estável" destinam-se indicar um composto que é suficientemente forte para sobreviver ao isolamento a um grau útil de pureza de uma mistura reacional, e formulação em um agente terapêutico eficaz. A presente invenção destina-se representar compostos estáveis.
"Quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se incluir uma quantidade de um composto da presente invenção apenas ou uma quanti- dade da combinação dos compostos reivindicados ou uma quantidade de um composto da presente invenção em combinação com outros ingredientes ativos eficazes para inibir MCP-1 ou eficazes para tratar ou previnir distúr- bios como descrito aqui.
Como utilizado aqui, "tratar" ou "tratamento" abranger o trata- mento de um estado da doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) previnir o estado da doença de ocorrência em um ma- mífero, em particular, quando tal mamífero é pré-disposto ao estado da do- ença, porém não sendo ainda diagnosticado como tendo ela; (b) inibir o es- tado da doença, isto é, interrompendo seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado da doença, isto é, causando regressão do estado da doença.
Os nomes utilizados aqui para designar uma forma específica, por exemplo, "N-2", não devem ser considerados Iimitantes com relação a qualquer outra possuindo características químicas e físicas idênticas ou simi- lares, exceto de preferência deve-se entender que estas designações são identificadores que devem ser interpretados de acordo a informação de ca- racterização também presente aqui. A presente invenção fornece formas cristalinas de uma base livre
de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-
(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida como um material novo, em particular, em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades preferidas, formas cristalinas de uma base livre são em forma substancialmente pura. Modalidades preferidas de uma base livre são descritas nos exemplos como o N-2, DC-1, THOO-1, E-1, A-1, e AN-3.
A presente invenção também fornece formas cristalinas e sais de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida como um material novo, em particular, em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades preferidas, formas cristalinas dos sais são em forma substancialmente pura. Modalidades preferidas dos sais são descritas nos exemplos como a forma N-1 do sal de ácido di-benzenosulfônico e a forma H4-1 do sal de HCI.
Como utilizado aqui "polimorfo" refere-se a formas cristalinas ten- do a mesma composição química, porém disposições espaciais diferentes das moléculas, átomos, e/ou íons formando cristal.
Como utilizado aqui "solvato" refere-se a uma forma cristalina de uma molécula, átomo, e/ou íons que também contém moléculas de um sol- vente ou solventes incorporados na estrutura cristalina. As moléculas de sol- vente no solvato podem estar presentes em uma disposição regular e/ou uma disposição não ordenada. O solvato pode compreender uma quantida- de estequiométrica ou não estequiométrica das moléculas de solvente. Por exemplo, um solvato com uma quantidade não estequiométrica das molécu- las de solvente pode resultar da perda parcial de solvente do sulfato.
Como utilizado aqui "amorfo" refere-se a uma forma sólida de uma molécula molécula, átomo, e/ou íons que não é cristalina. Um amorfo sólido não exibe um modelo de difração de raio X definitivo.
Como utilizado aqui, "substancialmente puro", quando utilizado na referência a uma forma cristalina, significa um composto tendo uma pureza maior do que 90% em peso, incluindo maior do que 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 % em peso, e também incluindo igual a cerca de 100% em peso de composto I, com base no peso do composto. O material restante compreende outras forma(s) do composto, e/ou impurezas de reação e/ou processar impurezas originando sua preparação. Por exemplo, uma forma cristalina de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal, pode ser julgada substancialmente pura em que ela tenha uma pureza maior do que 90% em peso, como medido por meios que são neste tempo conhecido e geralmente aceitos na técnica, em que o restante menor do que 10% em peso de material compreende outra forma(s) de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal, e/ou impurezas de reação e/ou processando impurezas.
As amostras das formas cristalinas podem ser fornecidas com homogeneidade de fase substancialmente pura, indicando a presença de uma quantidade dominante de uma forma cristalina pura e opcionalmente quantidades menores de uma ou mais outras formas cristalinas. A presença de mais do que uma forma cristalina em uma amostra pode ser determinada por técnicas tais como difração de pó de raio X (PXRD) ou espectroscopia d ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR). Por exemplo, a presença de picos extras na comparação de um modelo PXRD experimen- talmente medido com um modelo PXRD simulado podem indicar mais do que uma forma cristalina na amostra. O PXRD simulado pode ser calculado de dados de raio X de crystal simples. Veja Smith, D.K., "A FORTRAN Pro- gram for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns," Lawrence Radiation Laboratory, Livermore, Califórnia, UCRL-7196 (April 1963).
Preferivelmente, a forma cristalina tem homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos do que 10%, preferivel- mente menos do que 5%, e mais preferivelmente menos do que 2% da área de pico total no modelo PXRD experimentalmente medido originando os pi- cos extras que estão ausentes do modelo PXRD simulado. Mais preferido é uma forma cristalina tendo homogeneidade de fase substancialmente pura com menos do que 1% da área de pico total no modelo PXRD experimen- talmente medido originando os picos extras que estão ausentes do modelo PXRD simulado.
Procedimentos para a preparação de formas cristalinas são conhecidos na técnica. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, cristalização ou recristalização de um sol- vente adequado, sublimação, desenvolvimento de uma fusão, transformação do estado sólido de outra fase, cristalização de um fluído super-crítico, e va- porização a jato. As técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura de solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solvente, cristal semean- do uma mistura super-saturada de solvente da molécula e/ou sal, desseca- mento a frio da mistura de solvente, e adição de anti-solventes (contra sol- ventes) à mistura de solvente.
As formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando di- fração de raio X de cristal simples, que é com base em medições de célula unitária de um cristal simples de uma forma em uma temperatura analítica fixada. Uma descrição detalhada de células unitárias é fornecida em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co., Nova Iorque (1968), Capítulo 3, que é incorporado aqui por referência. Alter- nativamente, a disposição única de átomos em relação parcial dentro da tre- liça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coordenadas atômi- cas fracionais obsevadas. Outros meios de caracterização da estrutura cris- talina é por análise de difração de pó de raio X em que o perfil de difração experimental ou observado é comparado a um perfil simulado representando material em pó puro, ambos conduzidos na mesma temperatura analítica, e medições para a forma de paciente caracterizada como uma série de valores 2ü.
Outros meios de caracterização da forma podem ser utilizados, tais como ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR), calo- rimetria de varredura diferencial e análise termogravimétrica. Estes parâme- tros podem também ser utilizados em combinação para caracterizar a forma de paciente.
O termo "perda de peso insignificante," como empregado aqui, como caracterizado por TGA indica a presença de uma forma de cristal de gado vacum (não solvatada).
O termo "% de captação de água insignificante," como emprega- do aqui, como caracterizado por isotermia de sorção de umidade indica que a forma testada não é hidroscópica.
Em uma modalidade da invenção, uma forma cristalina de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropN(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamid base livre ou sal, é fornecida em forma substancialmente pura. Esta forma cristali- na pode ser empregada em composições farmacêuticas que podem opcio- nalmente incluir um ou mais outros componentes selecionados, por exemplo, do grupo consistindo de excipientes, portadores, e um dos outros ingredien- tes farmacêuticos ativos ou entidades químicas ativas de estruturas molecu- lares diferentes.
Preferivelmente, a forma cristalina tem homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos do que 10%, preferivel- mente menos do que 5%, e mais preferivelmente menos do que 2% da área de pico total no modelo PXRD experimentalmente medido originando os pi- cos extras que estão ausentes do modelo PXRD simulado. A forma mais preferida é a cristalina tendo homogeneidade de fase substancialmente pura com menos do que 1% da área de pico total no modelo PXRD experimen- talmente medido originando os picos extras que estão ausentes do modelo PXRD simulado.
Em outra modalidade, uma composição é fornecida consistindo essencialmente das formas cristalinas de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-
ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal. A composição desta modalidade pode compreender pelo menos 90% em peso da forma, com base no seu peso na composição.
A presença de impurezas de reação e/ou processamento de im- purezas pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas na técnica, tal como, por exemplo, cromatografia, espectroscopia de ressonância mag- nética nuclear, espectrometria de massa ou espectroscopia de infraverme- lho.
Formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização de um sol- vente adequado, sublimação, desenvolvimento de uma fusão, transformação do estado sólido de outra fase, cristalização de um fluído super-crítico, e va- porização a jato. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura de solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura de solvente, cristal semean- do uma mistura de solvente supersaturada da molécula e/ou sal, desseca- mento a frio da mistura de solvente, e adição dos anti-solventes (contrasol- ventes) à mistura de solvente. Técnicas de cristalização de alta produção podem ser empregadas para preparar formas cristalinas incluindo polifor- mos.
Os cristais de fármacos, incluindo poliformos, métodos de prepa- ração, e caracterização de cristais de fármaco são descritos no Solid-State Chemistry of Drugs, S.R. Bym, R.R. Pfeiffer, e J.G. Stowell, 2nd Edition, SSCI, West Lafayette, Indiana (1999).
Para técnicas de cristalização que empregam solvente, a escolha de solvente ou solventes é tipicamente dependente de um ou mais fatores, tais como solubilidade do composto, técnica de cristalização, e pressão a vapor do solvente. As combinações de solventes podem ser empregadas; por exemplo, o composto pode ser solubilizado em um solvente primário pa- ra fornecer uma solução, seguido pela adição de um anti-solvente para dimi- nuir a solubilidade do composto na solução e para fornecer a formação de cristais. Um "anti-solvente" é um solvente em que o composto tem baixa so- lubilidade. Os solventes adequados para preparar cristais incluem solventes polares e não polares.
Em um método para preparar cristais, N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal, é suspenso e/ou agitado em um solvente adequado para fornecer uma suspensão, que pode ser aquecida para promover dissolução. O termo "suspensão," como utiliza- do aqui, significa uma solução saturada, que pode também conter uma quantidade adicional do sólido para fornecer a mistura heterogênea em uma determinada temperatura. Os solventes adequados a este respeito incluem, por exemplo, solventes apróticos polares e solventes práticos polares, e mis- turas de duas ou mais destes, como descrito aqui. Os cristais semeados podem ser adicionados a qualquer mistura de cristalização para promover critalização. Como será claro para o técnico versado, a semeação é utilizada como um meio de controle do desenvolvi- mento de uma forma cristalina particular ou como um meio de controle da distribuição de tamanho de partícula do produto cristalino. Consequentemen- te, o calculo da quantidade de sementes necessárias dependem do tamanho da semente disponível e o tamanho desejado de uma partícula de produto média como descrito, por exemplo, no "Programmed cooling of batch crystal- lizers," J.W. Mullin e J. Nyvlt, Chemical Engineering Science (1971) 26:369- 377. Em geral, sementes de tamanho pequeno são necessárias para efi- cazmente controlar o desenvolvimento de cristais na batelada. As sementes de tamanho pequeno podem ser geradas por peneiração, moagem, ou mi- cronização de cristais grandes, ou por micro-cristalização de soluções. Cui- dado deve ser tomado para que a moagem ou micronização de cristais não resulte em qualquer mudança na cristalinidade da forma de cristal desejado (isto é, mudança para amorfo ou para outro poliformo).
Uma mistura resfriada pode ser filtrada sob vácuo, e os sólidos isolados podem ser lavados com um solvente adequado, tais como solvente de recristalização frio, e secada sob purga de nitrogênio para fornecer a for- ma cristalina desejada. Os sólidos isolados podem ser analizados por uma técnica analítica ou espectroscópica adequada, tais como SSNMR, DSC, PXRD, ou similares, para assegurar formulação da forma cristalina preferida forma do produto. A forma cristalina resultante é tipicamente produzida em uma quantidade maior do que cerca de 70% em peso de produção isolada, porém preferivelmente maior do que 90% em peso com base no peso de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal, originalmente empregada no procedimento de cristalização. O produto pode ser co-moído ou passado através de uma tela de malha para desagregar o produto, se necessário.
Formas cristalinas podem ser preparadas diretamente do meio de reação da etapa de processo final para preparar N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre ou sal. Isto pode ser ob- tido, por exemplo, empregando na etapa de processo final um solvente ou mistura de solventes das quais o composto pode ser cristalizado. Alternati- vãmente, formas cristalinas podem ser obtidas por destilação ou técnicas de adição de solvente. Solventes adequados para este propósito incluem qual- quer daqueles solventes descritos aqui, incluindo solventes polares práticos, tais como álcools, e solventes polares apróticos, tais como cetonas.
Por meio de orientação geral, a mistura de reação pode ser filtra- da para remover qualquer impureza não desejada, sais inorgânicos, e simila- res, seguido por lavagem com solvente de reação ou cristalização. A solução resultante pode ser concentrada para remover excesso de solvente ou cons- tituintes. Se destilação é empregada, a quantidade final de destilado coleta- da pode variar, dependendo dos fatores de processo incluindo, por exemplo, tamanho de vaso, capacidade de agitação, e similares. Por meio de orienta- ção geral, o solução de reação pode ser destilada a cerca de 1/10 do volume original antes da substituição de solvente ser realizada. A reação pode ser amostrada e ensaiada para determinar a extensão da reação e o produto % em peso de acordo com técnicas de processo padrão. Se desejado, solvente de reação adicional pode ser adicionado ou removido para otimizar concen- tração de reação. Preferivelmente, a concentração final é ajustada a cerca de 50 % em peso em cujo ponto uma suspensão tipicamente resulta.
Pode ser preferível adicionar solventes diretamente ao vaso de reação sem destilar a mistura de reação. Solventes preferidos para este pro- pósito são aqueles que podem ultimamente participar na treliça cristalina, como descritos acima na conecção com permuta de solvente. Ainda que a concentração final possa variar dependendo da pureza desejada, recupera- ção e similares, a concentração final de a base livre na solução é preferivel- mente abaixo de 4% a cerca de 7%. A mistura de reação pode ser agitada seguindo adição de solvente e simultaneamente aquecida. Por meio de ilus- tração, a mistura de reação pode ser agitada durante cerca de 1 hora en- quanto aquecendo a cerca de 70°C. A reação é preferivelmente filtrada quente e lavada com o solvente de reação, o solvente adicionado ou uma combinação destes. Cristais de semente podem ser adicionados a qualquer solução de cristalização para iniciar cristalização.
As várias formas descritas aqui podem ser distinguíveis de uma outra através do uso de várias técnicas analíticas conhecidas por alguém versado na técnica. Tais técnicas incluem, porém não são limitadas a, difra- ção de pó de raio X (PXRD), calorimetria de varredura diferencial (DSC) e/ou análise termogravimétrica (TGA). Alternativamente, as formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando difração de raio X de cristal simples, que é com base em medições de célula unitária de um cristal simples de uma determinada forma em uma temperatura analítica fixada. Uma descri- ção detalhada de células unitárias é fornecida em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co., Nova Iorque (1968), Capítulo 3, que é incorporado aqui por referência. Especificamente, a disposição única de átomos em relação parcial dentro da treliça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coordenadas atômicas fracionais obsevadas. Outros meios de caracterização da estrutura cristalina é por aná- lise de difração de pó de raio X em que o pefil de difração obsevado é com- parado a um perfil simulado gerado de dados de estrutura de cristal simples. Medições de difração de pó de raio X para a forma de paciente são caracte- rizadas como uma série de valores de 2Θ (geralmente quatro ou mais).
Outros meios de caracterização da forma podem ser utilizados, tais como ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSNMR) espec- troscopia, calorimetria de varredura diferencial (DSC), termografia e exame geral da morfologia amorfa ou cristalina. Estes parâmetros podem também ser utilizados em combinação para caracterização da forma de paciente.
Alguém versado na técnica apreciará que um modelo de difração de raio X podem ser obtido com um erro de medida que é dependente das condições de medição empregadas. Em particular, é geralmente conhecido que intensidades em um modelo de difração de raio X podem inteiramente depender das condições de medição empregadas e a forma ou morfologia do cristal. Deve-se também entender que intensidades relativas podem tam- bém variar dependendo das condições experimentais e, consequentemente, a exata ordem de intensidade mostrou não ser levada em conta. Adicional- mente, um erro de medida de ângulo de difração para um modelo de difra- ção de raio X convencional é tipicamente cerca de 0,2° de valores 2Θ ou menos, preferivelmente cerca de 0,1 ° de valores 2Θ (como descrito a seguir), e tal grau de erro de medida mostrou ser levado em conta como como per- tencente aos ângulos de difração acima mencionados. Consequentemente, é entendido que as formas de cristal da invenção instantânea não são limita- das às formas de cristal que fornecem modelos de difração de raio X com- pletamente idênticos aos modelos de difração de raio X representado na Fi- guras acompanhantes descritas aqui. Qualquer forma de cristal que fornece padrões de difração de raio X substancialmente idênticos aqueles descritos nas Figuras acompanhantes caem no escopo da presente invenção. A capa- cidade verificar identidades substanciais de modelos de difração de raio X é dentro do alcance de alguém versado na técnica. SÍNTESE
Esquema 1: Preparação de amida IV.
Iuenossulfonato ou um sal de hidrobrometo, é acoplado com um oc- aminoácido quiral protegido adequadamente de fórmula III, para fornecer amida IV utilizando métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a preparação no W02005021500. A reação de acoplamento pode ser realiza- da com um reagente de diimida na presença de um ativador, e uma base de amina terciária sob uma atmosfera inerte, tal como nitrogênio ou argônio (preferivelmente nitrogênio) em um solvente aprótico tais como proprionitrilo, acetato de isopropila, acetato de n-butila, acetato de terc-butila ou acetonitri-
O β-aminoéster de fórmula II, ou um sal deste, incluindo um to- Io (especialmente acetonitrilo e/ou acetato de etila). O reagente de acopla- mento de diimida inclui, por exemplo, reagentes tais como EDAC. Exemplos de ativadores incluem 1-hidroxibenzotriazol (HOBt; o referido termo inclui hidratos destes) e /V,/V-4-dimetilamino-piridina. Uma base de amina terciá- ria, inclui por exemplo, trietilamina, A/-A/-diisopropil-/V-etilamina e tri-n- propilamina. As relações molares do aminoéster de fórmula Il para o reagen- te de acoplamento de diimida para o ativador para a amina terciária é um a cerca de 0,90 - 1,50 a cerca de 0,95-1,50 a cerca de 2,00 a 3,00, respecti- vamente. Referidas taxas de mol são preferivelmente um a cerca de 0,95 - 1,05 a cerca de 0,95-1,10 e a cerca de 2,10 a 2,30, respectivamente.
O β-aminoéster é selecionado de modo que Ra e Rb são grupos alcóxi ou alquiltiolato, ou juntamente com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados formam uma carbonila, ou formam um acetal cíclico ou acíclico ou tioacetal, preferivelmente um grupo 1,3-dioxolano. R4 é Ci-6alquila, prefe- rivelmente um grupo etila.
O α-aminoácido quiral de fórmula Ill incorpora um resíduo termi- nal funcionalizável Y que apresenta ou pode ser elaborado em um grupo de alquilação adequado para cristalização posterior do carbono distai de cadeia lateral, ao qual Y é ligado, sobre o nitrogênio de amida. Consequentemente, Y pode ser selecionado de grupos tais como halogênio, SMe, ou OSO2Ri2, em que Ri2 é C1^alquila, -(CH2)C(O)ORi3, ou -(CH2)C(O)Ri3; e Ri3 em cada ocorrência é Ci-6alquila. X é OH, halogênio ou OCORu, em que Ri4 é Ci- 6alquila. Grupos de proteção apropriados Ri e R2 para o α-aminoácido quiral, de fórmula Ill são independentemente selecionados de hidrogênio ou grupos proteção de amina que podem ser removidos por hidrólise ou hidrogenólise sob condições padrão. Tais grupos incluem sem limitação, um grupo carbo- benzilóxi (Cbz), um terc-butiloxicarbonila (BOC), um grupo fluorenilmetiloxi- carbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn) ou um grupo p-metoxibenzila (PMB). Grupos preferidos são Cbz, BOC, ou grupos Bn. Cbz é mais preferi- do.
Esquema 2: Preparação de uma amida de fórmula IV JMR1R2
NR1R2
ς^ο
IV
^nCO2R4
^vCO2R4
Ra Rb
0
IVa
V
Um composto de fórmula V é preparado por ciclização de porção
de alquilação Y sobre o nitrogênio de amida para formar um anel de pirrolidi- nona, durante cuja transformação Y age como um grupo de partida. Em uma modalidade preferida, a porção de alquilação representa um sal de sulfônio (Y= S (Me)Ri3, em que Ri3 é Ci.6alquila, benzila ou benzila substituída, me- tila é mais preferida) gerado por ativação de uma amina derivada de metio- nina IV (Y= SMe) utilizando agentes de alquilação de súlfur bem conhecido na técnica, por exemplo um haleto de Ci-6alquila ou benzila, preferivelmente iodeto de metila. Veja, por exemplo, Freidingere outro, J. Org. Chem. 1982, 47, 10.
trogênio ou argônio (preferivelmente nitrogênio) em um solvente contactando composto IV, ou um sal deste, com a base na presença de um solvente a- prótico. Tais bases podem ser, por exemplo sem limitação, carbonato de césio, bicarbonato de césio, carbonato de potássio, terc-butilato de sódio, ou hexametildisilazida de sódio, especialmente carbonato de césio. Solventes apróticos incluem, por exemplo, sem limitação, DMSO, DMF, DMA, N- metilpirrolidinona (NMP), e sulfolano, preferivelmente DMSO e/ou DMF.
mente com o átomo ao qual eles são ligados Ra e Rb combinam-se para formar um acetal cíclico ou acíclico ou tioacetal, os grupos de acetal são re- movidos por desproteção de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica para formar a carbonila. Para acetais, a desproteção pode ser reali- zada por hidrólise, preferivelmente conduzida em um solvente tais como acetona, butanona, acetonitrilo e isopropanol, ou soluções aquosas destes, e
Ciclização é conduzida sob uma atmosfera inerte, tal como ni-
Em que Ra e Rb são independentemente C-i-ealkóxi, ou junta- é preferivelmente conduzida em acetona aquosa. Em que referida desprote- ção de acetal requer ácidos de próton, por exemplo ácido enxofre, ácido to- luenossulfônico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido hidrobrômico ou ácido hidroclórico, ácido hidroclórico é mais preferido. Esquema 3: Aminação redutiva de composto V
NHR8R'
>8n9
NR1R
1d2
Qs
^CO2R4
NR1R
1o2
N v
^CO2R4
β N^
R8 ^RS VI
O composto Vl é preparado por aminação redutiva de um com- posto de fórmula V em duas etapas por (a) adicionando uma amina, NH(R8)(Rg), e um agente de desidratação, a uma solução de fórmula V em um solvente aprótico, e misturando em uma temperatura de 20° a +50 0C para formar a imina/enamina de fórmula Va; e (b) tratar uma solução de uma imina/enamina de fórmula Va com um catalisador de paládio, preferivelmen- te contendo um desativador tais como súlfur, preferivelmente 5% de Pt/C/S, sob uma pressão de gás de hidrogênio. Substituintes de amina, Re e Rg, são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci-6alquila. A amina de fórmula NH(R8)(Rg) é preferivelmente N-metil-N-isopropilamina. O agente de desidratação é um promotor de desidratação de ácido Lewis /ácido BrOnsted que inclui, sem limitação, reagentes de titânio, preferivelmente tetracloreto de titânio ou tetraisopropóxido de titânio ou uma mistura destes (especial- mente tetraisopropóxido de titânio). Veja, por exemplo, R. Mattson e outro, J. Org. Chem. 1990, 55, 2552-2554. O solvente aprótico pode ser selecionado, sem limitação, de solventes tais como dicloroetano, diclorometano, acetoni- trilo, DMSO, DMF, e N-metil-pirrolidinona (preferivelmente diclorometano). Preferivelmente a solução da imina/enamina de intermediário Va em diclo- rometano é tratada com gás de hidrogênio em uma temperatura de 1,05- 2,10 kg/cm2 e 5% de Pt/S/C em aproximadamente 0,5 a 50% (peso/peso) com relação ao composto V. A mais preferida taxa é 5-10% (peso/peso). Esquema 4: Preparação de~Yaminoácido de fórmula VII, ou um sal deste
^NR1R2
cer o ácido correspondente de fórmula VII, ou um sal deste. A hidrólise pode ser realizada por hidrólise de base utilizando métodos comumente conheci- dos na técnica, ou, alternativamente, com ácidos aquosos em temperaturas elevadas, para obter o yaminoácido correspondente de fórmula VII. A hidróli- se de ácido é mais preferida. A temperatura varia de cerca de 40°C a cerca de 100 0C (a temperatura varia de cerca de 50 0C a cerca de 70 0C é mais preferida). Os ácidos são selecionados, sem limitação, de ácido enxofre, á- cido toluenossulfônico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido hidro- brômico ou ácido hidroclórico. Ácido hidroclórico é mais preferido. Opcional- mente, compostos de fórmula Vll podem ser convertidos para seus sais de carboxilato. Preferivelmente, Vll é convertido para seu sal de sódio. Esquema 5: Preparação de carbamato Vlll
VII
O éster de um composto de fórmula Vl é hidrolizado para forne-
NR1R2
NR1R2
VII
VIIa Vin
Carbamatos de fórmula Vlll são preparados convertendo a yaminoácido de fórmula Vll para um isocianato tendo fórmula Vila; e reagin- do o isocianato com um álcool de fórmula R15OH para fornecer um carbama- to de fórmula VIII. A variável R15 é de modo que o carbamato forma um gru- po de proteção de amina que é removível sob hidrólise padrão ou condições de hidrogenólise. Tais grupos de proteção de amina são preferivelmente N- C02-terc-butila (de R15= terc-butila), ou N-CO2- benzila (de R15= benzila), ou benzila substituída por N-CO2 (de R15= benzila substituída). Um álcool prefe- rido é álcool de terc-butila.
por meio de diversos métodos, isto é, redisposição Curtius-, Hofmann-, ou Schmidt-Lossen. Preferivelmente, uma redisposição Curtius é realizada con- tactando Taminoácido Vll (ou um sal deste) com azida de difenilfosforila em um solvente de álcool (preferivelmente álcool de terc-butila), preferivelmente, porém não limitada a, contendo tolueno ou outros co-solventes não-próticos adequados, em uma temperatura do ponto de partida da redisposição térmi- ca para o isocianato (preferivelmente at ou above 50 °C). Esquema 6: Preparação de um composto de fórmula IX
porção de carbamato no composto de fórmula VIII, seguido por acilação da amina livre com um reagente de fórmula R10C(O)W, em que W é halogênio ou R10C(O) para fornecer um composto de fórmula IX. A desproteção de carbamato é realizada por métodos comumente conhecidos na técnica (por exemplo, para R10= terc.-butila, a desproteção de ácido pode ser realizada com ácido enxofre, ácido toluenossulfônico, ácido nítrico, ácido metanossul- fônico, ácido hidrobrômico ou ácido hidroclórico - ácido metanossulfônico é
A conversão de Vll para o isocianato Vlla pode ser conduzida
NR1R2
VIII
IX
Os compostos de fórmula IX são preparados por desproteção da mais preferido). A base (preferivelmente trietilamina) é em seguida adiciona- da e a amina livre é contactada com um composto de fórmula Ri0C(O)W1 em que W é halogênio ou R10C(O)1 para fornecer um composto de estrutura IX. Esquema 7: Preparação alternativa de um composto de fórmula IX
NR1R2
R10aC(O)W
VIIa
Y'
R8^R9
10
IX
Uma preparação alternativa de compostos de fórmula IX consis- te em diretamente acilação do isocianato de intermediário Vlla (veja acima Esquema 5) por adição in situ opcional a um agente de alquilação R10aC(O)W, em que W é R10aC(O), na presença de seu ácido corresponden- te (W = hidrogênio). Preferivelmente, a acilação é conduzida introduzindo o isocianato na mistura de ácido acético e anidrido acético (em que R10a é me- tila e W é hidrogênio) ao isocianato de fórmula Vlla para fornecer um com- posto de fórmula IX.
Esquema 7: Preparação de compostos de fórmula X
NHR1
IX
Y'
,10
O grupo R2 no composto de fórmula IX é removido por desprote- ção para fornecer um composto de fórmula X. Preferivelmente, se R2 for Cbz, a desproteção é realizada por hidrogenação na presença de um catali- sador de paládio, preferivelmente 10% de Pd/C. Esquema 8: Preparação de compostos de fórmula I
LG
^N CH3
X
I
Compostos de fórmula I são preparados acoplando a amina desprotegida de
composto de fórmula I. Tais reações de acoplamento e condições sob as quais elas são conduzidas são conhecidas por alguém versado na técnica. HET é um anel heterociclo ou heteroarila de 3 a 14 membros opcionalmente substituídos tendo um ou mais heteroátomos selecionados de Ν, O ou S (preferivelmente um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio). Os grupos heteroarila preferidos incluem, sem limitação, qui- nazolin-4-ila 6-substituída , mais preferivelmente 6-trifluorometil-quinazolin-4- ila. Um grupo de partida (LG) como utilizado aqui inclui, sem limitação, gru- pos tais como halogênio, Ci.6alkóxi, mesilato, nonaflatos, sulfonatos, tosila- tos e triflatos. Preferivelmente LG é um grupo de partida selecionados de halogênio ou OSO2Ri6, em que Ri6 é fenila, uma heteroarila de 5 a 7 mem- bros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S, ou O, Ci-6alquila, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente subs- tituídos por um a três grupos selecionados de halogênio, CF3 e Ci.6alquila.
Um grupo de partida preferido é um halogênio, especialmente cloreto.
comercialmente disponíveis ou podem ser facilmente preparados por alguém versado na técnica. Solventes, temperaturas, pressões, materiais de partida tendo o grupo desejado, e outras condições de reação, podem ser facilmen-
fórmula X com um composto de formula:
LG
para fornecer um
Para o processo desta invenção, os materiais de partida são te selecionadas como apropriados por alguém versado na técnica. O pro- cesso pode ser escalonado a fim de preparar maiores quantidades do com- posto de fórmula I1 tais como em uma facilidade de produção comercial. EXEMPLOS
Os seguintes exemplos ilustram as modalidades dos compotes e
materiais de partida inventivos, e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações.
Como apropriado, as reações foram conduzidas sob uma atmos- fera de nitrogênio seco (ou argônio). Para reações anidrosas, solventes Dri- Solv de EM foram empregados. Para outras reações, solventes de grau de reagente ou grau HPLC foram utilizados. A menos que de outro modo esta- belecido, todos os reagentes comercialmente obtidos foram utilizados como receptores.
As avaliações de LC/MS foram obtidas utilizando um sistema híbrido de espectrômetro de massa quádrupla simples Shimadzu H- PLC/Waters ZQ. Dados para o pico de interesse são reportados de ioniza- ção de eletrospray de modo positivo. Espectros de NMR (ressonância mag- nética nuclear) foram tipicamente obtidos em instrumentos Bruker ou JEOL 400 MHz e 500 MHz nos solventes indicados. Todas as modificações quími- cas são reportadas em ppm de tetrametilsilano com a ressonância solvente como o padrão interno. Dados de espectros de 1H-NMR são tipicamente re- portados como segue: mudança química, multiplicidade (s = singleto, br s = singleto amplo, d = dupleto, dd = dupla de dupletos, t = tripleto, q = quarteto, sep = septeto, m = multipleto, app = aparent), constantes de acoplamento (Hz), e integração.
Alguém versado na técnica reconhecerá as abreviações padrão utilizadas aqui. Para facilidade de referência, as abreviações incluem, po- rém, não necessariamente limitadas a: sat. = saturado, HPLC = cromatogra- fia líquida de alto desempenho, AP = por cento de área, KF = Karl-Fischer, RT = temperatura ambiente (a menos que de outro modo especificado RT é uma temperatura de cerca de 22 °C), mmol = milimoles, HRMS = espectros- copia de massa de alta resolução, TBTU = tetrafluoroborato de O- benzotriazol-2-il-N,N,N,,N'-tetrametilurônio, MTBE = TBME = éter metílico de terc-butila, EDAC = cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida, EDC = N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida, TEA = trietilamina, DPPA = difenil fosforil azida, IPA = álcool isopropílico, TFA = ácido trifluoroacético, DCM = diclorometano, THF = tetraidrofurano, DMF = N,N-dimetilformamida, BOP = hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-ilóxi)tris(dimetilamino)fosfônio, EtOAc = acetato de etila, DMSO = dimetilsulfóxido, 0C = graus Celsius, eq = equivalente ou equivalentes, g = grama ou gramas, mg = miligrama ou mili- gramas, ml_ (ou ml) = mililitro ou mililitros, h = hora ou horas, M = molar, N = normal, min = minuto ou minutos, MHz = megahertz, tlc = cromatografia de camada fina, v/v = relação volume para volume.
"α", "β", "R" e "S" são designações estereoquímicas são familiares para a- queles versados na técnica.
EXEMPLO 1
N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida
Exemplo 1, Etapa 1: 2-benziloxicarbonilamino-7-oxo-6-aza- biciclo[3,2,1 ]octano-6-carboxilato de (1R, 2S, 5fl)-terc-butila (89.6 g, 0,24 mol, veja: Ρ. H. Carter, e outro, Pedido PCT WO 2005/021500) foi dissolvido em acetato de etila (1,5 L) e a solução resultante foi lavada com NaHCOe saturado (2 χ 0,45 L) e NaCI saturado (1 χ 0,45 L). A solução foi secada (Na2SO4) e em seguida filtrada diretamente em um frasco de fundo redondo de 3 L de 3 gargalos. A solução foi purgada com injeção de nitrogênio direta antes de ser carregada com 10% de Pd/C (13,65 g) sob atmosfera de nitro- gênio. O frasco foi evacuado e carregado novamente om hidrogênio; isto foi repetido mais duas vezes. Hidrogênio foi borbulhado através da solução du- rante 30 minutos e em seguida a reação foi agitada sob 1 atmosfera de H2 durante 18 horas. O frasco foi evacuado, carregado novamente com nitrogê-
Y
N,
N nio, e carregado com catalisador recente (6 g de 10% Pd/C). Hidrogênio foi borbulhado através da solução durante 30 minutos e em seguida a reação foi agitada sob 1 atmosfera de H2 durante 18 horas. O frasco foi evacuado e carregado novamente com nitrogênio. A mistura foi filtrada através de Celite;
a almofada de filtro foi em seguida lavada com acetato de etila. O filtrado (-1,6 L de volume de EtOAc) foi diluído com acetonitrilo (0,3 L) e carregado seqüencialmente com L-/V-Cbz-metionina (68 g, 0,24 mol), TBTU (77 g, 0,24 mol), e N,N-diisopropiletilamina (42 mL, 0,24 mol). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas, tempo durante o qual foi carregada de uma suspensão a uma solução clara. A reação foi saciada com a adição de NH4CI saturado (0,75 L) e água (0,15 L); a mistura foi diluída também com EtOAc (0,75 L). As fases foram misturadas e separadas e a fase orgâ- nica foi lavada com Na2CO3 saturado (2 χ 0,9 L) e NaCI saturado (1 χ 0,75 L). A solução foi secada (Na2SO4), filtrada, e concentrada em vácuo para fornecer 2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metilthio)butanamido)-7-oxo-6- aza-biciclo[3,2,1]octano-6-carboxilato de C\R,2S,5R)-\erc-but\\a como um óleo, que foi tomado na etapa seguinte sem outra purificação. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 406,3; [M+Na]+ = 528,3. 1H-NMR (400 MHz, d4- MeOH): l: 7,36 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,2 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 2,5 - 2,7 (m, 3H), 2,25 (m, 1H), 2,11 (s, 3H), 2,05 (m, 4H), 1,9 (m, 1H), 1,7 (m, 2H), 1,54 (s, 9H). Também estão presentes EtOAc [1,26 (t), 2,03 (s), 4,12 (q)] e Λ/,Λ/,Λ/,/V-tetrametiluréia [2,83 (s)].
Exemplo 1, Etapa 2: Uma amostra de 2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4- (metilthio)butanamido)-7-oxo-6-aza-biciclo[3,2,1]octano-6-carboxilato de (1 fí^S.õfíJ-terc-butila (0,24 mol assumido; veja procedimentos anteriores) foi dissolvida em iodometano (1,250 g) e agitada durante 48 horas em tem- peratura ambiente. A reação foi concentrada em vácuo. O resíduo foi dissol- vido em diclorometano e concentrado em vácuo. Isto foi repetido mais duas vezes. O lodo resultante foi dissolvido em diclorometano (0,4 L) e vertido em uma solução rapidamente agitada de MTBE (4.0 L). Os sólidos amarelos resultantes foram coletados por meio de filtração de sucção e secados sob vácuo elevado para fornecer o sal de sulfônio (179 g). Este material foi to- mado na etapa seguinte sem outra purificação. LC/MS para pico primário: [M-Me2S+H]+ = 458,4; [M]+ = 520,4. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): □ 7,35 (m, 5H), 5,09 (s, 2H), 4,33 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,3 - 3,45 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 2,94 (s, 3H), 2,78 (m, 1H), 2,0 - 2,3 (m, 4H), 1,7 (m, 2H), 1,52 (s, 9H). Também estão presentes MTBE [1,18 (s), 3,2 (s)J e traços de Λ/,Λ/,Λ/, A/-tetrametiluréia [2,81 (s)].
Exemplo 1, Etapa 3: Todo o sal de sulfônio da etapa anterior (0,24 mol as- sumido) foi dissolvido em DMSO (2,0 L). A solução resultante foi agitada sob nitrogênio em temperatura ambiente e carregada com carbonato de césio (216 g) em porções. A suspensão foi agitada em temperatura ambiente du- rante 3 horas e em seguida filtrada para remover os sólidos. A solução foi dividida em porções de -0,22 L e preparada como segue: a mistura reacio- nal (-0,22 L) foi diluída com acetato de etila (1,5 L) e lavada sucessivamente com água (3 χ 0,5 L) e salmoura (1 χ 0,3 L). A fase orgânica foi secada (Na2SO4), filtrada, e concentrada em vácuo. O 2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3,2,1]octano- 6-carboxilato de (1 fí,2S,5H)-terc-butila desejado (90,8 g, 83%) foi obtido co- mo uma espuma microcristalina, livre de impureza de tetrametiluréia. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 358,4; [M+Na]+ = 480,4. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): L 7,35 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,2 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,28 - 2,42 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,7 - 2,0 (m, 5H), 1,55 (s, 9H). Se desejado, este material pode ser isolado como um sólido dissolvendo em MTBE (1 volume), adionando ao heptano (3,3 vo- lumes), e coletando o precipitado resultante. Exemplo 1, Etapa 4: Uma solução resultante de 2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-7-oxo-6-azabiciclo[3,2,1]octano- 6-carboxilato de (1 fl,2S,5fl)-terc-butila (108 g, 0,236 mol) em THF (1 L) foi carregada com monoidrato de hidróxido de lítio (21,74 g, 0,519 mol). Água (0,3 L) foi adicionada lentamente, tal que a temperatura não excedeu 20 °C. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e os voláteis foram removidos em vácuo. O pH foi ajustado para -4 através de uma adi- ção de 1N de HCI (450 mL) e NaH2PO4. Os precipitados brancos resultantes foram coletados por filtração e lavados com água (2 χ 1 L). O sólido foi dis- solvido em diclorometano (1,5 L) e água (~ 1 L). A camada orgânica foi se- cada (NaaSO4)1 filtrada, e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (0,7 L) e a solução resultante foi aquecida em refluxo durante 1 hora. Os sólidos foram separados após resfriarem para temperatura ambien- te, e foram coletados por meo de filtração. Estes sóldos foram purificados por recristalização em isopropanol para fornecer o ácido (1fí,2S,5fí)-2-((S)- 3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(terc- butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxíllico desejado como um sólido branco (104,5 g, 935 de produção). LC/MS para pico primário: [M-tBu+H]+ = 420,2; [M-Boc+H]+ = 376,2; [M+H]+ = 476,2, 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): L 7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,35 (m, 2H), 3,71 (m, 1H), 3,45 - 3,6 (m, 2H), 2,99 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 2,0 (m, 2H), 1,6 - 1,9 (m, 4H), 1,46 (s, 9H). Exemplo 1, Etapa 5: um frasco de fundo redondo de 3 L foi carregado com ácido (1 /=f,2S,5fí)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5- (terc-butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxíllico (75,5 g, 0,158 mol), EDCeHCI (33,5 g, 0,175 mol), 1-hidroxibenzotriazol (23,6g, 0,175 mol), e di- clorometano (1 L). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas, tempo durante o qual foi carregada de uma suspensão branca a uma solução clara. Amônia (gas) foi borbulhada na solução até o pH ser forte- mente básico (papel) e a reação foi agitada durante 10 minutos; esta adição de amônia foi repetida e a reação foi agitada durante mais 10 minutos. Água foi adicionada. A fase orgânica foi lavada com NaHCO3 saturado, NaH2PO4, e salmoura antes de ser concentrada em vácuo. O resíduo foi suspenso com acetonitrilo (0,5 L) e em seguida concentrado para fornecer (1 fí^S.õ/?)^- ((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(ferc- butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxamida como um sólido branco (75,9 g, -100%), que foi utilizado na etapa seguinte sem outra purificação. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 375,3; [M+H]+ = 475,4; [M-tBu+H]+ = 419,3. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): □ 7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 3,70 (m, 1H), 3,6(m, 1H), 3,45 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,9 - 2,05 (m, 2H), 1,65 - 1,9 (m, 4H), 1,46 (s, 9H). Exemplo 1, Etapa 6: a reação foi conduzida em três porções iguais e com- binada para preparação aquosa. Um frasco de fundo redondo de 3 gargalos, de 5 L foi carregado com (1fí,2S,5/?)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2- oxopirrolidin-1-il)-5-(íerc-butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxamida (25,3 g, 53 mmol), acetonitrilo (1,9 L), e 2,6 L de água/gelo. A mistura foi agitada e resfriada para 0 0C. Diacetato de iodobenzeno (25,77 g, 80 mmol) foi adicio- nado e a reação foi agitada durante 2 horas; outros 0,5 eq. de diacetato de iodobenzeno foram adicionados. A reação foi agitada durante 9 horas (tem- peratura de reação < 10 °C). A mistura foi carregada com 8 eq de N,N- diisopropiletilamina e anidrido acético eq.. Durante os trinta minutos seguin- tes, 4 eq. de Ν,Ν-diisopropiletilamina e 2 eq. de anidrido acético foram adi- cionados cada dez minutos, até a reação ter prosseguido para conclusão (HPLC). O acetonitrilo foi removido em vácuo; um sólido separou-se do resí- duo, e este foi coletado por filtração. O resíduo restante foi extraído com di- clorometano (3 L, em seguida 1 L). A fase orgânica foi lavada seqüencial- mente com água, NaHCO3Saturado, e salmoura. Os sólidos coletados foram adicionados à fase orgânica, junto com carbono ativado (15 g). A mistura foi agitada durante 30 minutos a 40 0C antes de ser filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (1 L), e a solução resultante foi agitada a 75 0C durante 1 hora antes de ser deixada resfriar para temperatu- ra ambiente. Um sólido separou-se e foi coletado por filtração. O sólido foi purificado também por recristalização: foi primeiro dissolvido em 0,5 L de CH2CI2, em seguida concentrado em vácuo, em seguida re-cristalizado de EtOAc a um 1 L; isto foi repetido três vezes. Os sólidos obtidos dos líquidos mãe acima foram recristalizados três vezes utilizando o mesmo método. Os sólidos combinados foram recristalizados duas vezes mais de acetonitrilo (0,7 L) para fornecer 66 g (84%) de (1F?,3/?,4S)-3-acetamido-4-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexilcarbamato de de terc- butila (pureza >99,5% por HPLC). LC/MS para pico primário: [M+H]+ = 489,4; [M-tBu+H]+ = 433,3. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): I 7,3 - 7,4 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,6(m, 2H), 2,44 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,87-2,05 (m, 4H), 1,87 (s, 3H), 1,55- 1,7 (m, 2Η), 1,46 (s, 9Η). A fidelidade estereoquímica da recombinação Hofmann foi confirmada através de análise de estrutura de cristal de raio X deste com- posto, como mostra na Figura 1.
Exemplo 1, Etapa 7: Uma solução resultante de ^ R,3R,4S)-3-acetam\do-Λ- ((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)cicloexilcarbamato de terc- butila (66 g, 0,135 mol) em diclorometano (216 mL) foi carregada com ácido trifluoroacético (216 mL). A reação foi agitada durante 2 horas em tempera- tura ambiente e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em metanol e a solução resultante foi concentrada em vácuo; isto foi repetido uma vez. (S)-1 -((1 S,2/?,4/?)-2-acetamido-4-aminocicloexil)-2-oxopirrolidin-3-
ilcarbamato de benzila foi obtido como um óleo e utilizado diretamente na Etapa 8 abaixo. LC/MS encontrado [M + H]+ = 389,4. 1H-NMR (400 MHz, d4- MeOH): [j 7,3 - 7,4 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,41 (br, s, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,00 (t, J = 9,3 Hz1 1H), 3,81 (t, J= 9,1 Hz, 1H), 3,65 (q, J = 8,4 Hz, 1H), 3,3 - 3,4 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 1,95 - 2,24 (m, 5H), 2,00 (s, 3H), 1,6 - 1,8 (m, 2H). Exemplo 1, Etapa 8: Uma solução resultante de (S)-1-((1S,2fl,4fl)-2- acetamido-4-aminocicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (-0,135 mol) em metanol (675 mL) foi carregada seqüencialmente com acetona (37,8 g, 4 eq), acetato de sódio (33,2 g, 3 eq), e cianoborohidreto de sódio (16,9 g, 2 eq). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 6 horas e fil- trada. O filtrado foi dissolvido em diclorometano (1 L); esta solução foi lavada com 1N de NaOH (1 L). Os sólidos coletados na filtração foram dissolvidos em 1N de NaOH (1L) a 0 0C e em seguida extraídos com diclorometano (1 L). Os extratos orgânicos foram combinados e extraídos com HCI aquoso (200 mL de 1N de HCI + 800 mL de água). A fase aquosa foi basificada com NaHCO3 saturado (500 mL) e em seguida 1N de NaOH (100 mL) até pH 11. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (2 L). Os extratos orgânicos foram combinados, secados (NasSO4), filtrados, e concentrados em vácuo para fornecer (S)-1-((1 S,2fl,4fl)-2-acetamido-4-(isopropilamino)cicloexil)-2- oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila como um óleo. LC/MS encontrado [M + H]+ = 431,45. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): □ 7,3 - 7,4 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,31 (m, 1H), 4,24 (t, J= 9,4 Hz, 1H), 4,11 (m, 1H), 3,61 (t, J= 9,1 Hz, I Η), 3,52 (q, J = 8,6 Hz, 1 Η), 3,04 (br, s, 1 Η), 2,96 (sep, J = 6,3 Hz, 1 Η), 2,40 (m, 1 Η), 2,15 (m, 1H), 1,92 (s, 3H), 1,7 - 1,9 (m, 5H), 1,65 (m, 1H), 1,12 (app, dd, J = 6,3, 1,1 Hz, 6H).
Exemplo 1, Etapa 9 (Veja Etapa Alternativa 9, abaixo): Uma solução re- sultante de (S)-1-((1S,2f?,4fí)-2-acetamido-4-(isopropilamino)cicloexil)-2- oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (-115 mmol) em diclorometano (600 mL) foi resfriada para 0 0C e carregada seqüencialmente com formaldeído (18,6 g, 37 wt% de solução), trietilamina (23 mL), e triacetoxiborohydreto de sódio (28,7 g). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos e diluída com diclorometano (até 1,2 L). Esta solução foi lavada três vezes com 500 mL de NaHCO3 saturado + NaOH (NaHCO3 saturado, pH a
II w/ 1N de NaOH). A camada orgânica foi extraída com HCI aquoso (200 mL de 1N de HCI + 600 mL de água). A fase aquosa foi basificada com NaHCO3 saturado (500 mL) e em seguida 1N de NaOH (100 mL) até pH 11.
A fase aquosa foi extraída com diclorometano (1,2 L). Os extratos orgânicos foram combinados, secados (Na2SO4), filtrados, e concentrados em vácuo para fornecer (S)-1-((1 S,2f?,4fí)-2-acetamido-4-
(isopropil(metil)amino)cicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila co- mo um óleo, que foi utilizado diretamente na Etapa 10 abaixo. LC/MS encon- trado [M + H]+ = 445,4. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): L 7,3 - 7,4 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,33 (br s, 1H), 4,25 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 4,11 (br s, 1H), 3,5 - 3,6(m, 2H), 2,77 (v br s, 2 H), 2,41 (m, 1H), 2,26 (s, 3H), 2,0 - 2,1 (m, 2H), 1,92 (s, 3H), 1,7 - 1,9 (m, 5H), 1,10 (app, dd, J = 17, 6,4 Hz, 6H). Exemplo 1, Etapa 10: A uma solução de (S)-1-((1 S^fl^fl^-acetamido^- (isopropil(metil)amino)-cicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (-0,115 mol) em metanol (600 mL) foram adicionados 10% de Pd/C (6 g de 50% de catalisador úmido). O frasco foi evacuado e carregado novamente com hidrogênio. A mistura foi agitada sob 1 atmosfera de H2 durante 2 horas e o catalisador foi removido por filtração através de Celite. O filtrado foi con- centrado em vácuo para fornecer A/-((1f?,2S,5f?)-2-((S)-3-amino-2- oxopirrolidin-1-il)-5-(isopropil(metil)amino)cicloexil)acetamida como um óleo, que foi tomado na etapa seguinte sem outra purificação. LC/MS encontrado [Μ + Η]+ = 311,47. 1H-NMR (400 MHz, Ci4-MeOH): ^ 4,39 (br s, 1 Η), 4,00 (m, 1 Η), 3,3 - 3,5 (m, 4Η), 2,73 (m, 1 Η), 2,38 (m, 1 Η), 2,25 (s, 3Η), 2,0 - 2,2 (m, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,6 - 1,75 (m, 4H), 1,07 (app, dd, J = 21, 6,4 Hz, 6H). Exemplo 1, Etapa 11: A uma solução de R,2S,5R)-2-({S)-3-amino-2- oxopirrolidin-1-il)-5-(isopropil(metil)amino)cicloexil)acetamida (-35 g, 0,115 mol) em isopropanol (600 ml_) foi adicionado 4-cloro-6- (trifluorometil)quinazolina (32 g, 0,138 mol, 1,2 eq, veja: P.H. Carter e outro, Pedido PCT WO 2005/021500). A mistura foi agitada em temperatura ambi- ente durante a noite antes de ser carregada com trietilamina (46 g, 0,46 mol, 4 eq). A mistura foi agitada a 60 0C durante 10 horas. O solvente foi removi- do sob pressão reduzida para fornecer um óleo. Destilação azeotrópica com isopropanol foi realizada duas vezes. O resíduo foi dissolvido em diclorome- tano (600 mL) e extraído com água (250 ml_, contendo 4 eq. de ácido acéti- co). Diclorometano (600 mL) foi adicionado às lavagens aquosas combina- das, e a mistura foi resfriada para 0 °C. NaOH aquoso (50% por peso) foi adicionado com agitação até o pH alcançar 11. A camada de água foi extraí- da com diclorometano duas vezes (2 χ 600 mL). Os extratos orgânicos com- binados foram secados (Na2SO4), filtrados, e concentrados em vácuo para fornecer a base livre de amorfo do composto título (99% de pureza por H- PLC). LC/MS encontrado [M+H]+ = 507,3. 1H-NMR (400 MHz, d4-MeOH): □ 8,82 (s, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,05 (dd, J= 8,8, 1,8 Hz, 1H), 7,9 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 5,28 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,58 (br s, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,52 - 3,68 (m, 2H), 3,43 (m, 1H), 2,76 (br s, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,28 (s, 3H), 2,1 - 2,3 (m, 3H), 2,0 (s, 3H), 2,0 (m, 1H), 1,65 - 1,8 (m, 3H), 1,09 (app, dd, J= 24, 6,4 Hz, 6 H).
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9
(f^r^^ NH2HOTs NH2HOTs
^xxSxCO2Et Pd/C [H2]
EtOH i-PrOAc
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9a': A um hidrogenador foram carregados sal de 4-toluenossulfonato (7/=?,8S)-8-((S)-1-fenil-etilamino)-1 ,4-dioxa- espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 1A (1417 g, 2,8 moles, c.f.: W02004098516, preparado análogo a Patente dos estados Unidos 6,835,841), etanol (200 proof, 11,4 L), e 10% de catalisador de Pd/C (50% de umidade, 284 g). A mistura foi neutralizada com nitrogênio, em seguida pressurizada com gás de hidrogênio (45 psig) e agitada vigorosamente a aproximadamente 40 0C até o material agitante ser consumido (HPLC). A suspensão foi resfriada, purgada com gás de nitrogênio e o catalisador foi removido por filtração enquanto neutralizado. O catalisador gasto foi lavado com etanol (4,3 L). O filtrado e as lavagens foram combinados e concentra- dos sob vácuo a um volume de 2 a 3 L ao mesmo tempo que mantendo a batelada entre 40~°60 °C. Acetato de Isopropila (5 L) foi carregado e a mistu- ra foi concentrada a um volume de ~2 L até mais etanol ser removido (<0,5%) e o conteúdo de umidade residual ser <1,000 ppm. O volume de batelada foi ajustado para -7,5 L pela adição de acetato de isopropila. A mistura foi aquecida para 80 0C até clarear, em seguida resfriada para 65°70 °C. Cristais de semente de 1 (5 g) foram adicionados e a batelada foi resfria- da para 50 0C durante 2 horas, em seguida também resfriada para 20 0C durante 4 horas e mantida durante -10 horas. A suspensão resultante foi filtrada e a massa foi lavada com acetato de isopropila (2 L). O produto foi secado sob vácuo a -35 0C até os voláteis serem reduzidos abaixo de -1% (LOD). sal de 4-toluenossulfonato de (7f?,8S)-8-amino-1,4-dioxa- espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 1 foi obtido como um sólido cristali- no, branco (936 g, 835 de produção; pureza de HPLC: 99,8%). 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) 8,14-7,89 (brs, 3H), 7,75 (d, J 9,0Hz, 2H), 7,15 (d, J 8,0Hz, 2H), 4,22-4,04 (m, 2H), 4,01-3,77 (m, 4H), 3,55-3,43 (m, 1 hora,), 3,20-3,13 (m, 1H), 2,40-2,27 (m, 4H), 2,21-1,94 (m, 2H), 1,81-1,51 (m, 3H), 1,23 (t, J 7,0Hz, 3H); HPLC: Waters Xterra MS C18 4,6 mm χ 150 mm i.d., 3,5μηι de tamanho de partícula, 0,05% de NH4OH (5% de ACN, 95% de H2O, solvente A), a 0,05% de NH4OH (95% ACN, 5% de H20, solvente B), 55 de B a 205 de B em 10 minutos, mudado para 955 de B em 25 minutos, e em seguida mudado para 55 de B em 1 minuto; 11,1 minutos (aminoéster 1). MeS
NH2HOTs
r rn Pt EDAC
2 NHCbz JE^
CbzHN
MeS"^x~/^C0?H HOBt-H2O
MeCN
1 2 Exemplo 1, Etapa Alternativa 9a": Aminoéster 1 (63g, 0,16M, 1eq.; o pro- duto de desproteção redutora de um composto conhecido - (Veja por exem- plo R. J. Cherney, WO 2004/098516 e G. V. Delucca & S. S. Ko, WO 2004/110993) foi colocado em em um frasco de fundo redondo e MeCN (500 mL) foi adicionada. EDAC (33,1g, 0,17M, 1,1eq), HOBt-H2O (21,2g, 0,16M, 1,0eq) e /V-Cbz-L-metionina (46,7g, 0,17M, 1,05eq) foram em seguida adi- cionados seguido por TEA (48.0 mL, 0,35M, 2,2eq). Uma exortermia exoter- mia para 38 0C foi obsevada. A massa de reação foi deixada agitar em tem- peratura ambiente. Após 30 minutos, HPLC indicou conversão completa. A massa de reação foi diluída com EtOAc (2,5L) e lavada com KHCO3 (4u500 mL, 20wt % de solução aquosa) e salmoura (500 mL). A fase orgânica foi separada, secada sobre MgSO4 e concentrada. O resíduo foi dissolvido em TBME e reconcentrado para fornecer (7fl,8S)-8-{(2S)-2- benziloxicarbonilamino-4-metilsulfanyl-butyr-il-amino}-1,4-dioxa- espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 2 como um sólido pegajoso (76,2g, 985 de produção, 93AP de pureza). 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) δ 7,36-7,30 (m, 5H), 7,03 (d, J9,0Hz, 1H), 5,66 (d, J8,0Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,35-4,25 (m, 2H), 4,19-4,04 (m, 2H(), 3,98-3,86 (m, 4H), 2,87-2,80 (m, 1H), 2,55-2,45 (m, 2H), 2,18 (dd, J 14,0Hz, 7,0Hz, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,05-1,67 (m, 6H), 1,26 (t, J 7,0Hz, 3H). HPLC: YMC-Pack Pro 0185μπι 4,6 □ 150 mm, 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de H20), a 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de MeCN), 0-100% de gradiente de 10 minutos. 10,01 minutos (Composto 2, 93,1 AP). HRMS: m/z 495,2166 [Cale: C24H35N2O7S 495,2165]. MeS
CbzHN ^CO2Et CbzHN ^^ ^CO2Et
Λν
7
2 3
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9b: Amida de metionina 2 (75,0 g, 0,15M) foi dissolvido em Mel (225mL, 3mL7g) - um pouco da gaseificação foi observa- da, porem nenhum exoterma. A massa de reação foi deixada agitar no escu- ro durante 16,5 horas. Após este tempo um precipitado amarelo claro grosso se formou. O frasco foi em seguida evacuado para 200 mmHg e um pouco de Mel removido. O material restante foi suspenso em TBME (500 mL), após uns 30 minutos de agitação a suspensão foi filtrada, a massa lavada com TBME (500 mL). Análise de NMR deste material indicou uma pequena quan- tidade de resíduo de Mel. A massa foi re-suspensa em TBME (500 mL), fil- trada, lavada com TBME (500 mL) e secada sob vácuo para fornecer iodeto de [(3S)-3-benziloxicarbonilamino-3-{(7/:?,8S)-7-ethoxicarbonil-1,4-di-oxa- espiro[4,5]dec-8-ilcarbamoil}-propil]-dimetilsulfônio 3 como um sólido não totalmente branco de livre escoamento (93,5g, 97%, 99 % de área de pure- za). 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) δ 7,75 (d, J 9,0Hz, 1H), 7,38-7,27 (m, 5H), 6,40 (d, J 7,0Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,76-4,65 (m, 1H), 4,48-4,39 (m, 1H), 4,14-3,85 (m, 6H), 3,84-7,73 (m, 1H), 3,68-3,55 (m, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 2,90-2,83 (s, 1H), 2,52-1,55 (m, 8H), 1,24 (t, J 7,0Hz, 3H). HPLC: YMC-Pack Pro 0185μπι 4,6 150 mm, 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de H2O), a 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de MeCN), 0-100% de gra- diente de 10 minutos. 2,45 minutos
(I-), 8,14 minutos (Composto 3, 43,6AP, I" 54,6AP). HRMS: m/z 509,2341 [Cale: C25H37N2O7S 509,2321], Cs2CO3
^ .XO2Et DMSO > N^C02Et
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9c: Cs2CO3 (61,5g, 0,19M, 1,5eq) foi coloca- do em em um frasco de fundo redondo e DMSO anidroso (2,4L) foi adiciona- do. Sal de sulfônio 3 (80,Og1 0,13M, 1,0eq) foi em seguida adicionado em porções. Uma vez a adição ser completa a massa de reação foi deixada agi- tar no escuro durante 20 horas. A massa de reação foi em seguida dividida na metade e cada metade preparada separadamente: a massa de reação foi diluída com EtOAc (2,OL) e lavada com salmoura (2L), a fase orgânica foi lavada com salmoura (500 mL). As camadas aquosas combinadas foram em seguida lavadas EtOAc (500 mL). As fases orgânicas combinadas foram em seguida lavadas com salmoura (31750 mL). A segunda metade da massa de reação foi tratada de uma maneira idêntica e os orgânicos combinados secados sobre MgSO4 e concentrados para fornecer (7/?,8S)-8-{(3S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il}-1,4-dioxa-espiro[4,5]decano-7- carboxilato de etila 4 como um óleo de cor clara (56,5g, 0,13M, -100 área-% de pureza) puro por análise de NMR. 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) δ 7,38-7,30 (m, 5H), 5,37 (br d, J4,0Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,27-4,18 (m, 1H), 4,17-3,82 (m, 8H), 3,32 (td, J 10,0Hz, 60,0Hz, 1H), 3,23 (q, J5,0Hz, 1H), 2,63-2,57 (m, 1H), 2,42-2,25 (m, 2H), 1,94-1,68 (m, 5H), 1,25 (t, J7,0Hz, 3H), HPLC: YMC- Pack Pro 0185μηι 4,6 LJ 150 mm, 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de H20), a 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de MeCN), 0-100% de gradien- te de 10 minutos. 8,99 minutos (Composto 5, produzido em coluna, 4,2AP), 9,48 (Composto 4, 74,3AP). HRMS: m/z 447,2127 [Cale: C23H3IN2O7 447,2131]. NHCbz
LEGENDA DA FIGURA
acetona
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9d: Pirrolidinona 4 (50,Og1 0,11M) foi dissol- vido em acetona (500 mL) e 1N de HCI (500 mL) foi adicionado. A massa de reação foi em seguida aquecida para 65°C. Após 20 minutos HPLC indicou reação completa. A massa de reação foi deixada resfriar para temperatura ambiente e a acetona foi removida em um evaporador giratório. Durante esta destilação o produto precipitou-se da solução como um sólido branco. Este foi isolado por filtração e a massa lavada com água. A massa foi em seguida secada azeotropicamente com tolueno (3L300 mL) para fornecer (1 fí,2S)-2- ((3S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5-oxo- cicloexanocarboxilato de etila 5 como um sólido branco (39,8g, 88%, 97 a- rea-% purity). 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) δ 7,37-7,32 (m, 5H), 6,65 (br d, J 4,0Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,54-4,47 (m, 1H), 4,34-4,26 (m, 1H), 4,18 (dq, J 11,0Hz, 7,0Hz, 1H), 4,09 (dq, J 11,0Hz, , 7,0Hz, 1H), 3,36-3,20 (m, 3H), 2,70-2,35 (m, 6H), 2,05-1,96 (m, 1H), 1,81 (quin,, J 11,0Hz, 1H), 1,24 (t, J 7,0Hz, 3H). HPLC: YMC-Pack Pro ΰ185μηι 4,6 _ 150 mm, 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de H20), a 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de MeCN), 0-100% de gradiente de 10 minutos. 8,95 minutos (Composto 5). HRMS: m/z403,1864 [Cale: C2IH27N2O6 403,1869].
.NHCbz
3'\
Ti(OiPr)4 V
,XO2Et NaBH4
Nv Exemplo 1, Etapa Alternativa 9e: Cicloexanona 5 (22,5g, 0,06M, 1eq), DMSO (30 mL) e Ti(O-ZPr)4 (33,7mL, 0,11M, 2,04eq) foram colocados em um frasco de fundo redondo. /V-isopropil-/V-metilamina (11,6mL, 0,11M, 2,0eq) foi em seguida adicionado em uma porção. A mistura foi deixada agitar du- rante 30 minutos em temperatura ambiente antes de ser resfriada para <3°C em gelo/água. MeOH (30 mL) foi em seguida adicionado seguido pela adi- ção em porções de NaBH4 (4,33g, 0,11M, 2,04eq) - temperatura mantida <8°C. 30 minutos após a adição ser completada a massa de reação foi diluí- da com cloreto de metileno (300 mL) e em seguida NaOH (1N, 40 mL). A suspensão resultante foi filtrada através de Celite, e a massa lavada com cloreto de metileno (100 mL). O líquido resultante foi concentrada sob pres- são reduzida e o resíduo dissolvido em EtOAc (500 mL). Esta solução foi extraída com 1N de HCI (2^400 mL), as camadas aquosas combinadas fo- ram em seguida basificadas com Na2CO3. Extração com EtOAc (4_250 mL) forneceu uma fase orgânica incolor e clara que foi secada sobre Na2SO4 e concentrada para fornecer um pó branco (24,6g, 96%, 7:1 d.r.). Este material foi em seguida suspenso durante a noite em hexano (670 mL). O sólido foi isolado por filtração e secado sob pressão reduzida para fornecer (1 /?,2S,5/:?)-2-((3S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5- (isopropil-metil-amino)-cicloexanocarboxilato de etila 6 como um sólido bran- co (20,9g, 81%, 24:1 d.r.). 1H-NMR: (300MHz, CDCI3) δ 7,37-7,28 (m, 5H), 5,55 (d, J 4,5, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,42 (q, J 4,5, 1H), 4,23-4,12 (m, 1H), 4,08 (dq, J 10,5, 7,0, 1H), 4,02 (dq, J 10,5, 7,0, 1H), 3,84 (t, J 9,0, 1H), 3,46-3,36 (m, 1H), 3,04 (septet, J 6,5, 1H), 2,86-2,80 (m, 1H), 2,63-2,48 (m, 2H), 2,17 (s, 3H, Me), 2,10-1,63 (m, 7H), 1,22 (t, J 7,0, 3H), 1,00 (d, J 6,5, 3H), 0,97 (d, J 6,5, 3H). HPLC: YMC-Pack Pro 0185μηι 4,6 ^ 150 mm, 0,01M NH4OAc (MeOH:água 20:80) a 0,01 M de NH4OAc (MeOH:água:MeCN 20:5:75) 10 a 100% de gradiente de 15 minutos. 8,23 (Composto 6), 8,88 (5-epl· Composto 6). HRMS: 460,2798 [Cale: C25H38N3O5 460,2811]. NHCbz sNHCbz
çk ς^ο
XCO2Et 1-2Ν HQ 5.
50 - 60 0C (84%) \ .Ν
N^
6
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9f: O aminoéster 6 (9,76 g, 2,12 mmol) foi dissolvido em 2N de HCI (80 mL), em seguida aquecida para -55 0C sob uma atmosfera inerte. A reação foi agitada durante 20 horas, em seguida resfriada para temperatura ambiente. A solução de reação foi lavada duas vezes com tolueno (25 mL de porções), neutralizada para pH 6 - 7 pela adi- ção de péletes de KOH, em seguida extraída oito vezes com cloreto de meti- Ieno (porções de 100 mL). Os extratos combinados foram secados (Na2S04), filtrados, e concentrados sob pressão reduzida ao volume total de 50 mL. A solução concentrada foi em seguida lentamente adicionada ao éter terc-butílico de metila (300 mL) durante 15 minutos em um funil de adição com agitação vigorosa. A suspensão branca resultante foi agitada em tem- peratura ambiente durante 1 hora, em seguida resfriada para 0 0C e agitada durante 1 hora. O produto foi filtrado, e lavado duas vezes com éter terc- butílico de metila (25 mL porções). A água da massa úmida foi removida por destilação azeotrópica com acetonitrilo (300 mL). O produto foi secado sob pressão reduzida para fornecer ácido (1 fí,2S,5f?)-2-((3S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5-(isopropil-metil-amino)- cicloexanocarboxíllico 7, (7.69 g, 845 de produção) como uma espuma bran- ca. 1H-NMR: (400 MHz, 50°C, CDCI3) δ 7,44-7,32 (m, 5H), 6,10 (amplo s, 1H), 5,19 (app s, 2H), 4,42 (dd, J = 15,6, 7,8 Hz, 1H), 4,29-4,23 (m, 1H), 3,68-3,60 (m, 2H), 3,33-3,27 (m, 2H), 3,20 (amplo s, 1H), 2,99 (amplo s, 1H), 2,51 (s, 3H), 2,49-2,45 (m, 3H), 2,33-2,31 (m, 1H), 2,00 (ddd, J= 9,0, 8,6, 3,9 1H), 1,95-1,78 (m, 2H), 1,36-1,21 (m, 6H), LCMS: m/z 432,20 [Cale: C23H34N3O5 432,25],
NHCbz
NHCbz
DPPA
Φ'
,CO2H
NHAc
Ac2O/AcOH
7
8
Exemplo 1, Etapa Alternativa 9g: Aminoácido 7 (6,3g, 14,7 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em THF (80 mL) sob N2 e NaH (584mg, 14,7 mmol, 1,0 eq, 60 wt% de dispersão em óleo mineral) foi adicionado em porções. Quando a adição foi completa, e a evolução de gás parou, a massa de reação foi con- centrada sob pressão reduzida e o sólido resultante azeotropado com tolue- no (50 mL) para fornecer um sólido branco (KF 0,59 wt%). O sólido foi sus- penso em tolueno (100 mL) sob N2 e aquecido para 90°C. DPPA (3,32 mL, 15,3 mmol, 1,05 eq) foi adicionado gota a gota durante ~2 minutos. Após ~5 minutos todos os sólidos dissolveram, após 10 minutos a precipitação de um sólido branco foi obsevada. Após 30 minutos análise de HPLC indicou rea- ção completa. A massa de reação foi deixada resfriar para temperatura am- biente antes de ser filtrada, a massa foi lavada com tolueno. Os líquidos fo- ram em seguida lentamente adicionados em solução de Ac0H/Ac20 (80/20, 168mL) a 90°C. Após 45 minutos HPLC ainda indicou um isocianato. Em 1,15 horas, a massa de reação foi resfriada para temperatura ambiente e diluída com tolueno (100 mL) e água (100 mL). A camada orgânica foi remo- vida e o tolueno lavado com 1N de HCI (100 mL). As fases aquosas combi- nadas foram em seguida basificadas com K2CO3(S) e conduzidas para pH 12 com NaOH (10N), mantendo a temperatura abaixo de 20°C. A camada a- quosa foi em seguida extraída com cloreto de metileno (4^150 mL), as ca- madas orgânicas combinadas secadas sobre K2CO3 e concentradas para fornecer (S)-1 -((1 S,2R,4R)-2-acetamido-4-(isopropil(metil)amino)cicloexil)-2- oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila 8 como uma espuma branca (4,5g, 70%, 94AP de pureza). O 1H-NMR foi idêntico ao material obtido da rotina descrita acima (Exemplo 1, Etapa 9). HPLÇ:YMC-Pack Pro 0185μπι 4,6 _ 150 mm, 0,05% de TFA (20% de MeOH, 80% de H20), a 0,05% de TFA (20% de MeOH1 80% de MeCN), 0-100% de gradiente de 10 minutos. 7,20 minutos (Composto 8), 7,85 minutos (dímero de uréia). HRMS: 445,2809 [Cale: C24H37N4O4 445,2815].
Preparação Alternativa de Exemplo 1
NH2HOTs
L-Z-Mel-OH
iDAC TEA
CO2Et EDAC
O O
HOBtH2O MeCN
MeS
NH
CbzHN
^CO2Et
O O
Me2S
®í
.Θ
MeI
NH
CbzHN
^CO2Et
O O
2 3
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 1: (7fl,8S)-8-amino-1,4-dioxa- espiro[4,5]decano-7-carboxilato sal de 4-toluenossulfonato de etila 1 (450,1g), foi combinado com hidrocloreto de 1-etil-3-(3-dimetil-amino- propil)carbo-diimida (236,3g), hidreto de benzotriazol de 1-hidróxi (171,9g), /V-carbobenziloxi-L-metionina (333.4g) e acetonitrilo (3,1 L). À mistura agita- da foi adicionado trietilamina (249,5g0 abaixo de 30 °C. Na conclusão da reação (HPLC), a mistura foi diluída com acetato de etila (8,2 L) e lavada com 25% de solução de bicarbonato de potássio aquosa (2J4,5 L) seguido por água (4,5 L). A fase orgânica foi separada e concentrada sob pressão reduzida para obter uma solução de (7fí,8S)-8-((S)-2- benziloxicarbonilamino-4-metilsulfanyl-butyrylamino)-1,4-dioxa- espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 2 (1,4 L). Iodeto de metila (2,39 kg) foi adicionado, o vaso foi protegido da luz e a mistura foi mantida sob baixa agitação durante aproximadamente 24 horas. Ao precipitado amarelo grosso foi adicionado éter terc-butílico de metila (2,7 L) e a mistura foi mantida du- rante aproximadamente 1 hora. O produto foi isolado por filtração e a massa foi lavada com éter terc-butílico de metila (2x1,4 L), em seguida secado sob vácuo, produzindo iodeto de [(S)-3-benziloxi-carbonilamino-3-((7fí,8S)-7- ethoxicarbonil-1,4-dioxa-espiro[4,5]dec-8-ilcarbamoil)-propil]-dimetilsulfônio 3 (671,4 g, -945 de produção) como um sólido não totalmente branco (99,9% de pureza de HPLC). Me2S
<s> T Cs2CO3
CbzHN ^JS) ,vC02Et
7 (R)
DMSO
OZ
NHCbz
(S)
N
Ow
oXo
acetone
1NHCI
NHCbz
^CO2Et
-H (R)
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 2: Sal de sulfônio 3 (619,4 g), e carbonato de césio (416.8 g) e sulfóxido de dimetila anidroso (6,2 L) foram combinados em um reator equipado com um purificador para neutralizar sul- fetos voláteis. A agitação vigorosa foi mantida até a converção completa ser obtida (HPLC). Acetato de etila (12,4 L) foi adicionado, seguido por 20 % de salmoura (3 L). A fase orgânica foi separada, lavada duas vezes com sal- moura (2x3 L) e evaporada para obter uma solução de etila (7/:?,8S)-8-((S)-3- benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-1,4-dioxa-espiro[4,5]decano-7- carboxilato 4 em acetato de etila (-0,8 L). Acetona (2,55 L) foi adicionado, seguido por aquoso 0,5 M de solução de ácido hidroclórico (2,3 L). Com boa mistura, a solução foi aquecida para 50 a 60 0C até conversão de 4 para (1/?,2S)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5-oxo- cicloexanocarboxilato de etila 5 ser completa (HPLC). A mistura foi concen- trada sob pressão reduzida ao mesmo tempo abaixo de 40 °C, resfriada para -30 °C, e água (4,1 L) foi adicionada. A suspensão resultante foi resfriada para 5 a 10 0C e agitada para ~1 hora. O produto foi filtrado e a massa foi lavada com água (2x2,5 L). Na remoção do líquido, a massa foi secada para um peso constante abaixo de 40 0C em um forno a vácuo. Cicloexanona 5 (272g, 705 de produção) foi obtido (98,7% de pureza de HPLC).
1. CH2Cl2
NHCbz
Ti(OiPr)4 HN-h(
CO2Et
2. Pt/S/C [H2]
NHCbz
(S)
CXo
= (S)
^CQ2Et
1| (R)
5, -(R)
aq. HCI
50...60 0C
o:
NHCbz
(S)
(S)
O
ζ im
^CO2H
(R)
CX
NHCbz
(S)
NaOMe
MeOH/THF
^xCO2Na 11 m
r (R)
, N.
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 3: Cicloexanona 5 (206 g) foi dissolvido em diclorometano (1,1 L) e carregado a um hidrogenador. Tetrai- sopropóxido de titânio (218,2 g) e /V-isopropil /V-metilamina (63,64 g) foram adicionados e a mistura foi agitada em temperatura ambiente (23 a 25 °C) durante pelo menos 5 horas. Catalisador de platina (5% Pt/S/C, 15 g, apro- ximadamente 7,5 % relativo a 5) foi adicionado e hidrogenação foi realizada a -2,10 kg/cm2 durante pelo menos 6 horas, produzindo uma mistura de (1 fí^S.õ^^-ÍÍSJ-S-benziloxicarbonilamino^-oxo-pirrolidin-l-iO-õ-íisopropil- metil-amino)-cicloexanocarboxilato de etila 6 e seu 5-ep/-isómero (-7%). O catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para aproximadamente -600 mL. Acetato de etila úmido (-3% de água, 2,0 L) foi adicionado com agitação vigorosa durante um período de pelo menos 1,5 horas. A agitação foi continuada durante pelo menos mais 6 horas. A suspensão foi filtrada. A massa de filtro foi lavada com acetato de etila (1,0 L) e descartada. O filtrado combinado e lavagens foram concentra- dos a -400 mL. Tolueno (2,0 L) foi adicionado e a solução foi lavada com 2M de ácido hidroclórico aquoso (2 χ 400 mL). A camada aquosa foi aquecida para 50° a 60 0C durante aproximadamente 20 horas ou hidrólise de 6 foi considerada completa (HPLC). Solução de hidróxido de sódio aquosa foi adicionada para ajustar-se ao pH -10, e a mistura foi extraída com tolueno (3x600 mL). A fase orgânica foi descartada e o pH foi re-ajustada para ~6 pela adição de ácido hidroclórico aquoso. A fase aquosa foi concentrada pa- ra -600 mL sob pressão reduzida e extraída com cloreto de metileno (pelo menos 3x2,0 L). As camadas de cloreto de metileno combinadas foram eva- poradas sob pressão reduzida e continuamente substituídas com THF para obter uma solução de ácido (1/?,2S,5fí)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2- oxo-pirrolidin-1-il)-5-(isopropil-metil-amino)-cicloexanocarboxíllico 7 (-148 g) em THF (-4 L). Cristais de semente de 8 foram adicionados, seguido por 25 % de solução de metóxido de sódio em metanol (81,24 g) abaixo de 25 °C. A suspensão foi mantida durante pelo menos mais 16 horas com agitação. O produto foi isolado por filtração e a massa foi lavada com THF (4x200 mL) e secada a um peso constante em vácuo abaixo de 30 °C. sal de sódio de (1f?,2S,5fí)-2-((S)-3-benziloxicarbonil-amino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5-(isopropil- metil-amino)-cicloexano-carboxilato seco 8 foi obtido (139 g, -605 de produ- ção de 5).
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 4: Sal de sódio de aminoéster 8 (100g), fosfato de difenila (3.86g), terc-BuOH (1275 mL) e tolueno (225 mL) foram combinados e aquecidos ao refluxo sob pressão reduzida. Aproxima- damente 500 mL de destilado foram coletados e descartados ao mesmo tempo que sendo continuamente substituídas com uma solução de tolueno em terc-BuOH. Vácuo foi removido e o destilado foi mudado para percolato através de uma coluna carregada com peneiras moleculares e deixado para retornar ao vaso. Após a secagem ser completa, DPPA (52,4mL; dissolvido em 60 mL tolueno) foi adicionado lentamente à suspensão a 80 °C. Na con- clusão da reação (HPLC), íerc-BuOH foi removido por destilação a vácuo e continuamente substituído com tolueno. A mistura foi resfriada para tempera- tura ambiente e lavada duas vezes com 10% de K2HPO4 aquoso (1x800 mL, 1x400 mL) e água (400 mL). A fase orgânica foi aquecida e concentrada em vácuo para aproximadamente 270 mL. Vácuo foi removido e heptano (1,1 L) foi adicionado lentamente a aproximadamente 80 °C, seguido por sementes de 9 (~1g). A suspensão foi lentamente resfriada para temperatura ambiente e {(S)-1 -[(1 S,2f?,4f?)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(isopropil-metil-amino)- ciclo-hexil]-2-oxo-pirrolidin-3-il}-carbamato de benzila 9 foi isolado por filtra- ção como um sólido branco (86,76g, 785 de produção). Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 5: O carbamato de ter-butila 9 (50g) foi dissolvido em tolueno (500 mL) e /'-PrOH (150 mL). A solução resul- tante foi em seguida aquecida para 60°C. Ácido metanossulfônico (19.6mL) foi adicionado abaixo de 65°C. Na conclusão da reação (HPLC), a mistura foi resfriada para temperatura ambiente e trietilamina (69,4mL) adicionado len- tamente abaixo de 25°C. Anidrido acético foi em seguida adicionado abaixo de 25°C. Após 1 hora, ácido acético (250 mL) foi adicionado abaixo de 25°C. A fase de tolueno foi descartada e 2-metil-THF (500 mL) foi adicionado á fase aquosa. A mistura foi agitada vigorosamente e basificada com NaOH (25% de solução aquosa) para pH 12. A fase aquosa foi descartada e a ca- mada orgânica foi lavada com salmoura (250 mL). A camada orgânica foi concentrada sob pressão reduzida e continuamente substituída com /-PrOH. A solução foi resfriada e filtrada para fornecer {(S)-1 -[(1 S^/^^H)^- acetilamino-4-(isopropil-metil-amino)-cicloexil]-2-oxo-pirrolidin-3-il}- carbamato de benzila 10 em solução de /-PrOH que foi utilizada diretamente na hidrogenação.
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 6: A uma solução contendo a- cetamida 10 (-61 g) em /-PrOH (-625 mL) foi adicionado 10% de catalisador úmido de Pd/C (2,5 g) e a suspensão foi hidrogenada em 2,10 Kg/cm2 e a- proximadamente 25 0C durante pelo menos 2 horas. Na conclusão (HPLC), o catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado para apro- ximadamente 550 mL. Água (8,8 mL) foi adicionada, seguido por 5,6 N de ácido hidroclórico em solução de /-PrOH (69,5 mL). A suspensão resultante foi mantida em temperatura ambiente durante a noite. O produto foi isolado por filtração e a massa foi enxaguada com APrOH (2x100 mL) e secada em vácuo a peso constante a -50 0C para fornecer Λ/-[(1 R,2S,5R)-2-((S)-3- amino-2-oxo-pirrolidin-1 -il)-5-(isopropil-metil-amino)-cicloexil]-acetamida 11 (55.6 g, 975 de produção) como seu sal de ácido hidroclórico (73,6% ensaio de base livre, HPLC).
vnh2
Cln
Example 1
12
13
LEGENDA DA FIGURA
Exemplo
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 7: Ao 6-trifluorometil-quinazolin- 4-ol 12 (20,1 g) em MeCN (400 mL) foi adicionado 5,5 M de solução de me- tóxido de sódio em metanol (17,0 mL). A suspensão resultante foi destilada sob pressão reduzida e continuamente substituída por MeCN para remover metanol. À suspensão foi adicionado DMF (1,4 g), seguido por cloreto de oxalila (13,0 mL) abaixo de 50 0C. Na conclusão da reação (HPLC), excesso de reagente foi removido sob pressão reduzida para fornecer -400 mL de suspensão. A mistura foi resfriada para temperatura ambiente e lavada com
% de K2HPO4 aquoso (1x1,0 L, 1x0,5 L) para fornecer 4-cloro-6- trifluorometil-quinazolina 13 (-21,2 g) em aproximadamente 450 mL de solu- ção de MeCN úmida, que foram utilizados diretamente na reação de aco- plamento subsequente (99,8 % de pureza de HPLC).
Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 8: A uma mistura de acetamida
11 (28.5 g, sal de HCI, 73,6% de ensaio de base livre), acetonitrilo (100 mL), /V,/V,-di-isopropil-/V-etilamina (61 mL) em temperatura ambiente foi adiciona- do uma solução de 13 (-21,2 g) em MeCN (-450 mL). A mistura homogênea foi mantida durante a noite. Na conclusão da reação (HPLC), a mistura foi concentrada em vácuo para aproximadamente 125 mL. Uma solução aquosa a 9,5% de ácido acético (240 mL) foi adicionada e a fase aquosa foi extraída com cloreto de metileno. A fase aquosa foi separada e éter terc-butílico de metila (450 mL) foi adicionado, seguido por 2 N de solução de hidróxido de lítio aquosa para ajustar-se ao pH >11,5. A camada orgânica foi separada, lavada com água e filtrada. Aproximadamente metade da fase de éter foi diluída com éter terc-butílico de metila (-250 mL) e concentrada em vácuo. Heptano (45 mL) foi adicionado lentamente abaixo de 60 °C, seguido por cristais de semente de Exemplo 1 (0,4 g). Heptano adicional (125 mL) foi adicionado e a mistura foi lentamente resfriada para temperatura ambiente e a suspensão resultante foi mantida durante a noite. O produto foi isolado por filtração, a massa foi lavada com heptano e secada em vácuo a peso cons- tante para fornecer A/-((1fí,2S,5f?)-5-(isopropilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)-quin-azolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida 14 (15,0 g, 855 de produção).
Procedimentos de Cristalização para Exemplo 1
Exemplo 1, Produção de sal de bis-BSA e purificação: A totalidade da base livre de amorfo de Exemplo 1, Etapa 11 foi dissolvida em metanol (600 mL). A solução resultante foi aquecida a 60 0C e carregada com ácido ben- zenossulfônico (2,5 eq). A mistura foi resfriada para temperatura ambiente e o sólido branco resultante foi coletado por filtração para prouzir o sal de áci- do bis-benzeno sulfônico do composto título (95 g, 86%). Este material foi >99% puro por HPLC. Este material foi também purificado por recristalização de 80/20 Et0H/H20, que forneceu o sal livre de qualquer metanol residual. HPLC pureza = 99,8%. 1 hora NMR (500 MHz, D2O) _ ppm 8,75 (1 H, s), 8,66 (1 H, s), 8,25 (1 H, d, J=8,80 Hz), 7,90 (1 H, d, J= 8,80 Hz), 7,75 (4 ho- ras, d, J=8,25 Hz), 7,43 - 7,57 (6 H, m), 5,42 (1 H, t), 4,33 - 4,44 (1 H, m), 4,09 - 4,19 (1 H, m), 3,83 - 3,91 (1 H, m), 3,74 - 3,83 (2 horas, m), 3,61 (1 H, t, J=11,55 Hz), 2,75 (3 H, d, J=6,60 Hz), 2,61 - 2,70 (1 H, m), 2,31 - 2,44 (1 H, m), 2,20 - 2,27 (1 H, m), 2,17 (2 horas, d, J=12,10 Hz), 1,94 - 2,04 (1 H, m, J=12,65 Hz), 1,90 - 1,95 (3 H, m), 1,72 - 1,91 (2 horas, m), 1,37 (3 H, d, J=6,05 Hz), 1,29 (3 H, d, J=6,60 Hz). Calorimetria de varredura diferencial utilizou ma taxa de aquecimento de 10 °C/min e revelou uma endotermia de fusão/decomposição com um início de temperatura de 297.6 0C e uma tem- peratura de pico a 299.1 °C.
Exemplo 1, Cristalização da Base Livre: Uma amostra da base livre de amorfo de /V-((1f?,2S,5/?)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida (1 g) foi dissolvida em diclorometano (5 mL). A solução foi carregada com heptano (30 mL) e em seguida aquecida para destilar o diclorometano. A solução foi resfriada para 40 QC; um sólido branco precipitou-se. A suspensão foi aque- cida para 90 -C e agitada durante 2 horas. A suspensão foi resfriada para temperatura ambiente e filtrada para fornecer a base livre pura do composto título. Nenhum solvente residual foi observado por 1H-NMR. EXEMPLO 2
Formas de Cristal de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 - il)cicloexil)acetamida
Várias Formas de Cristal de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, incluindo a base livre e formas de sal, e solvatos destes, foram preparadas e caracterizadas como descrito a- baixo.
Procedimentos para Caracterização dos Dados de Formas de Cristal Simples
Os dados foram coletados em um difratômetro de série CAD4 Bruker-Nonius (BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison, Wl 53711 USA). Parâmetros de célula unitária foram obtidos através de análise de esquadros mínimos das colocações de difratômetro experimentais de 25 reflexões de ângulo elevado. Intensidades foram medidas utilizando radiação de Cu Κα (λ = 1,5418 Á) em uma temperatura constante com a técnica de varredura variável em j-22 e foram corrigidas apenas para fatores de pola- rização de Lorentz. Conteúdos na base foram coletados nos extremos da varredura durante a metade do tempo da varredura. Alternativamente, dados de cristal simples foram coletados em um sistema Bruker-Nonius Kappa CCD 2000 utilizando radiação de Cu Κα (λ = 1,5418 Á). Indexação e proces- samento dos dados de intensidade medidos foram realizados como o pacote de software HKL2000 (Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) em Macromolecu- lar Crystallography, eds. Carter, W.C. Jr & Sweet, R.M. (Academic, NY), Vo- lume 276, pp. 307-326) no jogo de programa Collect. (Collect Data collection e processing user interface: Collect: Data collection software, R. Hooft, Noni- us B.V., 1998.) Alternativamente, dados de crital simples foram coletados em um sistema Bruker-AXS APEX2 CCD utilizando radiação de Cu Κα (λ = 1,5418 Á). Indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram realizados com o jogo de pacote/programa de software APEX2 (A- PEX2 Data collection and processing user interface: APEX2 User Manual, v1,27; BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison, Wl 53711 USA).
Quando indicado, cristais foram resfriados na corrente fria de um sistema de Oxford cryo (Oxford Cryosystems Cryostream cooler: J. Cosier e A.M. Gla- zer, J. Appl. Cryst., 1986, 19, 105) durante coleção de dados.
As estruturas foram solvidas por métodos diretos e refinadas nas bases de reflexões obsevadas utilizando o pacote de software SDP (SDP, Pacote de Determinação de Estrutura, Enraf-Nonius, Bohemia NY 11716. Fatores de dispersão, incluindo f e f", no software SDP foram tomados do "International Tables for Crystallography", Kynoch Press, Birmingham, En- gland, 1974; Vol. IV, Tables 2,2A e 2,3,1) com modificações locais menores ou MAXUS de pacotes cristalográficos (conjunto de solução maXus e soft- ware de refinamento: S. Mackay, C.J. Gilmore, C. Edwards, M. Tremayne, N. Stewart, K. Shankland. maXus: um programa de computador para a solução e refinamento das estruturas de cristal de dados de difração ou SHELXTL4. Os parâmetros atômicos derivados (coordenadas e fatores de temperatura)
foram refinados através de esquadros menores de matriz máxima. A função
2
minimizada nos refinamentos foi IW(|F0| - |FC|) R é definida como Σ ||F0| -
2 1/2
lFcll/z lFol enquanto Rw = [Iw( |F0| - |FC|)2/IW |F0| ] onde w é uma função de pesagem com base em erros nas intensidades observadas. Os mapas da diferença foram examinados em todas a etapas de refinamento. Hidrogênios foram introduzidos em posições idealizadas com fatores de temperatura iso- trópicos, porém nenhum parâmetro de hidrogênio foi variado.
Dados de Difração de Pó de raio X (PXRD)
Dados de PXRD foram obtidos utilizando um Bruker C2 GADDS . A radiação foi Cu Ka (40 KV, 50mA). A distância do detector de amostra foi cm. As amostras de pó foram colocadas em capilares de vidro selados de 1 mm ou menos em diâmetro; o capilar foi girado durante coleção de dados. Os dados foram coletados para 3^2l<35° com um tempo de exposição de amostra de pelo menos 2000 segundos. Os arcos de difração de bidimensi- onais foram integrados para criar um modelo de PXRD unidimensional tradi- cional com um tamanho de etapa de 0,02 graus 2 L na extensão de 3 a 35 graus 2ü. Cerca de 200 mg foram embalados em um porta amostra de difra- ção de raio X em pó Philips (PXRD). A amostra foi transferida para uma uni- dade MPD Philips (45 KV1 40 mA, Cu Κα). Dados foram coletados em tem- peratura ambiente na extensão de 2-teta de 2 a 32 (modo de varredura con- tínua, taxa de varredura 0,03 graus/segundos, auto-divergência e fendas anti-dispersão, fendas de recebimento: 0,2 mm, centrifugador de amostra: ON)
Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)
Experimentos de DSC foram realizados em um modelo de TA Instruments™ Q1000 ou 2920. A amostra (cerca de 2 a 6 mg) foi pesada em uma panela de alumínio e precisamente registrada um centésimo de mili- grama miligrama, e transferida para o DSC. O instrumento foi purgado com gás de nitrogênio em 50 mL/minuto. Os dados foram coletados entre tempe- ratura ambiente e taxa de aquecimento de 300°C em 10°C/minutos. O lote foi feito com os picos endotérmicos acentuando. Análise Gravimétrica Térmica (TGA) Os experimentos de TGA foram realizados em um modelo de TA
Instruments™ Q500 ou 2950. A amostra (cerca de 10 a 30 mg) foi colocada em uma panela de platina previamente tarada. O peso da amostra foi medi- do precisamente e registrada a um milésimo de um miligrama pelo instru- mento. A fornalha foi purgada com gás de nitrogênio em 100 mL/minuto. Os dados foram coletados entre temperatura ambiente e taxa de aquecimento de 300°C a 10°C/minuto.
Preparação e Análise das Formas
Os dados de célula unitária e outras propriedades para estes exemplos são apresentados na Tabela 1. Os parâmetros de célula unitária foram obtidos de análise cristalográfica de raio X de cristal simples. Uma conta detalhada de células unitárias pode ser encontrada no Chapter 3 of Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: a Practical Guide, (MacMiIIi- an, 1968).
As coordenadas atômicas fracionais para os exemplos 2a, b, c, d, e, f, g, e h, são apresentadas nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, respecti- vamente. .
Adicionalmente, posições de pico de difração de raio χ em pó
características (graus 2ü±0,1 )@ temperatura ambiente para Exemplos 2a, b, d, e, f, g, e h, são apresentadas na Tabela 10, todos dos que são com ba- se em modelos de alta qualidade coletados com um difratômetro (CuKa) com um capilar giratório com 2 ζ calibrados com outro padrão adequado NIST.
Finalmente, as Figuras 1,2,3, 4, 5, 6, e 7 apresentam modelos de XRPD para Exemplos 2a, b, d, e, f, g e h, respectivamente. As figuras 8 e 9 descrevem a análise de DSC e TGA, respectivamente, de Exemplo 2a e as Figuras 10, 11, e 12 descrevem os espectros de DSC, TGA, e Isotermia de Sorção de Umidade de Exemplo 2f, respectivamente.
Preparação de Forma, Caracterização de XRD, DSC e TGA Exemplo 2a, Forma de N-1, dibesilato:
N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, sal de ácido di-benzenossulfônico, foi cristalizado de acetato de etila, etanol, meta- nol e acetona. Forma N-1, sal de dibesilato, é a forma de gado vacum (ne- nhuma molécula de água ou solvente) de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amíno)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal de ácido di-benzenossulfônico. Forma de dibesilato N-1 foi caracterizada por um modelo de XRD que com- para o modelo simulado gerado dos dados da estrutura de cristal simples. A forma de bensilato N-1 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo uma endotermia de fusão/decomposição com um início tipicamente a apro- ximadamente 296 °C. Forma N-1, dibesilato, foi caracterizada por uma curva térmica de TGA tendo perda de peso insignificante (consistente com forma não solvatada) em até aproximadamente 280 °C. Exemplo 2b, Forma DC-1:
Uma amostra da base livre tipo gel, oleoso (amorfo) de N- ((1 f?,2S,5/?)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida (aproxi- madamente 0,5 g), após ser extraída de uma amostra do sal BSA, foi dissol- vida em diclorometano (aproximadamente 3 mL). A uma solução foi adicio- nado aproximadamente 5 ml de heptano e a mistura de óleo resultante foi agitada vigorosamente por uma barra agitadora magnética em um béquer aberto a 20-25°C. Um sólido branco foi obtido após os solventes evapora- rem. O sólido foi re-suspenso em uma mistura de aproximadamente 5 ml de heptano e 0,2 ml de diclorometano e agitada a 25°C durante 7 dias. A sus- pensão resultante foi filtrada e secada a ar para fornecer N-(( 1 fí^S.õ^-õ- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma DC-1. A Forma DC-1 é caracterizada por um mol de diclorometano por mol de N- ((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-
(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. Forma DC-1, foi caracterizado por um modelo de XRD que compara o modelo simulado gerado dos dados da estrutura de cristal simples. Exemplo 2c, Forma THOO-1: N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-
(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, 1 mg, foi dissolvido em 80 uL de THF. O solvente foi removido por Speed-vac (SpeedVac Plus, SC250DDA, Savant/ThermoElectron Corp) sob vácuo elevado a 22 0C durante 16 horas. Um total de 100 uL de MIBK/Heptano (1/2 por volume) foram carregados a esta cavidade. Após contenção durante 2 semanas em temperatura ambiente (20-25°C), os cris- tais foram observados nesta cavidade. Forma THOO é caracterizada por um mol de THF por um mol de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre.
Exemplo 2d, Forma E-1:
N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-
(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre foi cristalizado de uma solução de etanol e heptano. Forma E-1 é carac- terizada por um mol de etanol por um mol de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexH)acetamida, base livre. A Forma E-1 foi caracte- rizada por um modelo XRD que compara o modelo simulado gerado dos da- dos da estrutura de cristal simples. Exemplo 2e, Forma A-1:
N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, base livre, foi suspenso em concentração em excesso de 150 mg/mL em acetona. A suspensão foi deixada equilibrar em temperatura ambiente para fornecer uma suspensão de parte fina. Uma parte da suspensão foi filtrada e tanto o filtrado quanto suspensão foram refrigerados a 5 0C para fornecer cristais do solvato de mono acetona (A-1). A forma A-1 é caracterizada por um mol de acetona por um mol de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo- 3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ba- se livre. A forma de base livre A-1 foi caracterizada por um modelo de XRD que compara o modelo simulado gerado dos dados da estrutura de cristal simples.
Exemplo 2f, Forma N-2:
Uma amostra da base livre tipo gel, oleoso (amorfo) de N- ((1fl,2S,5fl)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetami^ (aproxi- madamente 0,5 g), extraída de uma amostra do sal de BSA, foi suspensa em heptano (aproximadamente 5 mL). O frasco foi iniciado com uma espátula de metal, e a suspensão foi agitada vigorosamente por uma barra de agitação magnética a 25°C. Uma suspensão branca de partículas cristalinas foi obtida após 24 horas de agitação. A suspensão foi filtrada e a massa úmida secada em vácuo (40°C) para fornecer a forma N-2 pura (confirmado por PXRD) da base livre. A forma N-2 foi caracterizada por um modelo de XRD que compa- ra o modelo simulado gerado dos dados da estrutura de cristal simples. A forma N-2 é a forma de gado vacum (nenhuma molécula de solvente ou ne- nhuma molécula de água ou solvente) de N-((1R,2S,5R)-5- (isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. A forma N-2, foi caracte- rizada por um termograma de DSC tendo um início de endotermia de fusão tipicamente a aproximadamente 158 0C a aproximadamente 162 °C. A forma N-2 foi caracterizada por uma curva térmica de TGA tendo uma perda de peso insignificante em até aproximadamente 145 0C em concordância com os dados da estrutura de cristal simples. A perda de peso correspondeu ao solvente adventício. A isotermia de sorção de umidade foi caracterizada por 0,15% de ganho de peso na taxa de aproximadamente 25% a aproximada- mente 75% de RH a 25 0C indicando que a forma N-2 foi ligeiramente hi- groscópica (eu diria muito Iigeramente ou não higroscópico). Exemplo 2g, Forma AN-3: Uma suspensão de N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-
((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre, em -200 mg/mL foi preparada em acetoni- trilo e deixada equilibrar em temperatura ambiente para fornecer uma sus- pensão uma suspensão de parte fina. Parte da suspensão foi filtrada e tanto o filtrado quanto a suspensão foram refrigerados a 5 0C para fornecer cristais do solvato de acetonitrilo (AN-3). A forma AN-3 é caracterizada por um mol de acetonitrilo por um mol de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)- 2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre. A forma AN-3 foi caracterizada por um mo- delo de XRD que compara o modelo simulado gerado dos dados da estrutu- ra de cristal simples.
Exemplo 2h, Forma H4-1, HCI:
Uma amostra da base livre de f?,2S,5fí)-5-
(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida (aproximadamente 0,2 g) foi dissol- vida em etanol (aproximadamente 1 mL). À solução de base livre foram adi- cionados aproximadamente 310 μΙ de solução de HCI em etanol (aproxima- damente concentração de 1,25M). A solução foi semeada com uma pequena quantidade de suspensão de cristal do sal HCI. À solução turva resultante foram adicionados 3 ml de heptano. Uma suspensão branca desenvolvida gradualmente durante 1 a 2 horas enquanto agitada a 20-25°C. A suspensão foi agitada a 20°C durante mais 12 horas, filtrada e lavada com heptano. A massa úmida foi secada em vácuo (40°C) para fornecer o tetraidrado de sal de HCI, forma H4-1, HCI. A forma H4-1, HCI é caracterizada tendo 4 moles de água por um mol de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-
3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, sal de hidrocloreto. A forma de tetraidrato sal de HCI de H4-1 foi caracterizada
por um modelo SRD que compara o modelo simulado gerado dos dados da estrutura de cristal simples. .2 'Z
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Composto Z1 Vm sg dcalc Exp 2a 1 972 P2i 1,406 Exp 2b 1 728 P2i2i2i 1,349 Exp 2c 1 756 P2i2i2i 1,340 Exp 2d 1 737 P2i2121 1,245 Exp 2e 1 735 P2i2121 1,276 Exp 2f 2 663 P2i 1,269 Exp 2g 1 730 P2i 1,246 Exp 2h 1 791 P6i22 1,292
As variáveis utilizadas na Tabela 1 são definidas abaixo: T = temperatura em Centígrado para os dados cristalográficos (RT é tempe- ratura ambiente que é cerca de +22°C) V = volume de célula unitária
Z1 = número de moléculas de fármaco por unidade assimétrica Vm = V(célula unitária)/(moléculas de fármaco Z por célula) sg = grupo de espaço
dcalc = densidade de cristal calculada
TABELA 2 - Coordenadas Atômicas para Exemplo 2a, Forma N-1, dibe- silato
Átomo X Y Z Átomo X Y Z S1 0,4296 0,3405 0,1278 H57 0,5146 0,6132 0,0473 02 0,3848 0,2640 0,1944 H58 0,4218 0,5168 0,2790 03 0,5075 0,2480 0,1097 H59 0,5591 0,9137 0,0886 04 0,3692 0,3687 0,0581 H60 0,5305 1,0179 0,2235 C5 0,4631 0,5514 0,1598 H61 0,4602 0,8229 0,3179 C6 0,5031 0,6610 0,1068 H62 -0,0921 0,0872 0,5134 Cl 0,4500 0,6066 0,2360 H63 -0,0975 0,3507 0,7393 C8 0,5279 0,8279 0,1298 H64 -0,2621 0,3609 0,7274 C9 0,5113 0,8867 0,2054 H65 -0,2589 0,0940 0,5014 C10 0,4744 0,7756 0,2590 H66 -0,3412 0,2321 0,6040 S11 0,0304 0,2103 0,6431 H67 0,2813 0,2966 0,2330 012 0,0580 0,0675 0,5918 Η68 0,3163 0,2103 -0,0149 013 0,0507 0,1758 0,7265 Η69 0,0931 0,1273 0,5084 014 0,0615 0,3788 0,6162 Η70 0,0812 0,1334 -0,0296 C15 -0,0863 0,2166 0,6296 Η71 0,2494 0,4855 -0,0720 C16 -0,1295 0,1458 0,5613 Η72 0,2837 0,3700 -0,1556 C17 -0,1335 0,2944 0,6877 Η73 0,3692 0,2507 0,3208 C18 -0,2249 0,3021 0,6795 Η74 0,1718 0,1588 -0,1410 C19 -0,2234 0,1541 0,5537 Η75 0,1760 0,5937 0,0122 C20 -0,2690 0,2305 0,6124 Η76 0,0713 0,5818 0,0518 Ν21 0,1351 0,3402 0,0394 Η77 0,2388 0,1059 0,5751 Ν22 0,2122 0,3075 0,2421 Η78 0,0144 0,2704 -0,1359 Ν23 0,2612 0,1387 -0,0417 Η79 -0,0107 0,3948 -0,0519 Ν24 0,0979 0,2591 0,3211 Η80 0,0877 0,3884 0,1993 025 0,1429 0,0840 0,1114 Η81 0,1400 0,4103 -0,2251 Ν26 0,1222 0,1701 0,4545 Η82 0,1443 0,8789 -0,2785 027 0,2029 -0,1265 -0,0688 Η83 0,1063 0,6705 -0,3097 Ν28 0,1897 0,6703 -0,2034 Η84 0,0611 0,7736 -0,2276 C29 0,1114 0,2601 -0,0390 Η85 0,3994 0,1229 0,5687 C30 0,2281 0,4006 -0,1212 Η86 0,0212 0,5681 -0,1742 C31 0,3926 0,1870 0,4435 Η87 0,0851 0,6247 -0,0863 C32 0,2482 0,2192 0,3790 Η88 -0,0003 0,2113 0,3972 C33 0,1850 0,2609 0,3119 Η89 0,2528 0,5466 0,1402 C34 0,3395 0,2220 0,3762 Η90 0,1580 0,6514 0,1725 C35 0,1915 0,2339 -0,0878 Η91 0,3253 0,5947 -0,1972 C36 0,2131 0,1749 0,4516 Η92 0,3197 -0,2538 0,0275 C37 0,1374 0,5280 0,0550 Η93 0,3937 -0,0865 0,0040 C38 0,1447 0,2421 0,1065 Η94 0,3249 -0,0591 0,0839 C39 0,2678 0,1409 0,5195 Η95 0,3767 0,8481 -0,2754 C40 0,0410 0,3593 -0,0898 Η96 0,2667 0,9209 -0,2913 C41 0,2593 -0,0327 -0,0318 Η97 0,3183 0,9202 -0,1940 C42 0,1523 0,3701 0,1769 Η98 0,3388 0,5477 -0,3381 C43 0,1572 0,4920 -0,1737 Η99 0,2541 0,4208 -0,3000 C44 0,1203 0,7566 -0,2584 Η100 0,2273 0,6084 -0,3576 C45 0,3559 0,1483 0,5161 Η101 0,2047 0,7544 -0,1523 046 0,0730 0,5239 -0,1311 C47 0,0706 0,2135 0,3909 C48 0,1814 0,5399 0,1402 C49 0,2788 0,6660 -0,2381 C50 0,4909 0,1922 0,4387 C51 0,3294 -0,1139 0,0239 F52 0,5219 0,0514 0,4093 F53 0,5340 0,2113 0,5073 F54 0,5176 0,3178 0,3953 C55 0,3112 0,8512 -0,2507 C56 0,2765 0,5513 -0,3130
TABELA 3
Coordenadas Atômicas para Exemplo 2b, Forma DC-1
Átomo X Y Z Átomo X Y Z 01 0,3874 0,5713 0,1042 H41 -0,1294 0,3465 0,2606 N2 0,6277 0,6481 0,1041 H42 -0,2461 0,1574 0,1324 C3 0,3731 0,6931 0,1987 H43 -0,1481 0,1749 0,0586 04 0,3088 0,7902 0,1889 H44 0,1951 0,4379 0,0994 N5 0,5234 0,6709 0,1945 H45 0,2635 0,5336 0,1473 C6 0,0370 0,3707 0,1487 H46 0,4541 0,5194 0,2668 N7 0,9171 0,7535 0,0862 H47 0,4188 0,4033 0,2278 C8 0,5884 0,7673 0,1246 H48 0,5887 0,4873 0,1799 N9 0,2197 0,5147 0,1799 H49 0,6714 0,5483 0,2272 C10 0,6819 0,8733 0,1041 H50 0,5969 0,8538 0,1868 C11 0,0994 0,4380 0,1852 H51 0,8120 0,7421 0,2149 C12 0,5232 0,5593 0,0958 H52 0,8245 0,6564 0,1665 C13 0,0339 0,3042 0,0748 H53 0,4689 0,7873 0,1195 C14 0,0966 0,3752 0,1068 H54 0,7443 0,6307 0,0952 N15 0,0413 0,4260 0,2242 H55 0,6606 0,8737 0,0699 C16 -0,0879 0,2935 0,1577 H56 0,6450 0,9598 0,1181 N17 -0,1495 0,2843 0,1988 H57 0,9128 0,9427 0,1024 C18 0,6213 0,7635 0,1729 H58 0,9994 0,8349 0,1664 C19 0,2969 0,5749 0,2162 H59 0,8434 0,9363 0,1746 C20 0,8547 0,8596 0,1114 H60 1,1241 0,6556 0,0774 C21 -0,0807 0,3504 0,2284 H61 1,1465 0,8155 0,0889 C22 0,8829 0,8492 0,1601 H62 1,0949 0,7111 0,1303 C23 0,0961 0,3041 0,0303 H63 0,9541 0,8697 -0,0162 C24 0,7904 0,7443 0,1815 H 64 0,9409 0,9581 0,0316 C25 -0,1519 0,2227 0,1243 H65 1,0997 0,8600 0,0230 C26 0,5854 0,4415 0,0762 H66 0,9136 0,6679 -0,0189 C27 0,4325 0,5005 0,2333 H67 1,0529 0,6293 0,0199 F28 0,2100 0,3820 0,0251 H68 0,8640 0,5745 0,0257 C29 0,5694 0,5442 0,2072 H69 0,7752 0,7851 0,0338 C30 0,8956 0,7650 0,0399 H70 0,7087 0,4513 0,0715 F31 -0,0040 0,3354 0,0005 H71 0,5635 0,3648 0,0972 C32 -0,0935 0,2269 0,0831 H72 0,5326 0,4265 0,0453 F33 0,1425 0,1946 0,0181 H73 0,2091 0,6032 0,2400 C34 1,0774 0,7297 0,0973 H75 -0,7132 -0,0216 0,1657 C35 0,9360 0,6480 0,0149 C36 0,9736 0,8757 0,0185 CL37 -0,6723 0,0636 0,0976 CL38 -0,6200 0,1776 0,1776 C39 -0,7292 0,0689 0,1511 CL40 -0,8261 0,1021 0,1984 CL41 -0,5719 0,1649 0,1533
TABELA 4
Átomo X Y Z Átomo X Y Z N1 0,6241 0,6511 0,1036 H 44 0,8469 0,6491 -0,0084 N2 0,5165 0,6586 0,1938 H45 1,0426 0,6769 -0,0009 N3 0,0409 0,4138 0,2209 H46 0,9420 0,5884 0,0369 N4 0,9119 0,7577 0,0893 H47 0,9710 0,8879 -0,0108 N5 0,2188 0,5080 0,1767 H48 0,9644 0,9636 0,0393 N6 -0,1428 0,2821 0,1910 H49 1,1113 0,8600 0,0288 F7 0,2088 0,4068 0,0184 H50 1,1138 0,6612 0,0823 F8 0,1464 0,2269 0,0085 H51 1,1368 0,8124 0,0977 F9 -0,0051 0,3616 -0,0061 H52 1,0715 0,7062 0,1357 010 0,3873 0,5694 0,1019 Η53 0,8967 0,9395 0,1069 011 0,2971 0,7711 0,1928 Η54 0,8364 0,9249 0,1799 C12 -0,0831 0,2960 0,1506 Η55 0,9892 0,8264 0,1696 C13 0,0371 0,3738 0,1430 Η56 0,6557 0,8698 0,0727 C14 0,5812 0,7621 0,1256 Η57 0,6337 0,9476 0,1221 C15 0,0986 0,4345 0,1815 Η58 0,7936 0,7360 0,2193 C16 -0,0886 0,2415 0,0746 Η59 0,8150 0,6527 0,1711 C17 0,6739 0,8655 0,1071 Η60 0,5860 0,8385 0,1901 C18 0,0331 0,3225 0,0673 Η61 0,4619 0,7796 0,1196 C19 0,6111 0,7539 0,1748 Η62 0,7430 0,6376 0,0952 C20 0,7789 0,7380 0,1846 Η63 0,5034 0,3895 0,0665 C21 0,0953 0,3862 0,1014 Η64 0,6466 0,4797 0,0433 C22 -0,1446 0,2303 0,1158 Η65 0,6742 0,4155 0,0950 C23 0,8438 0,8556 0,1148 Η66 0,5931 0,4838 0,1746 C24 0,3673 0,6754 0,2001 Η67 0,6760 0,5373 0,2229 C25 -0,0810 0,3420 0,2233 Η68 0,4199 0,3911 0,2235 C26 0,8681 0,8418 0,1645 Η69 0,4543 0,4982 0,2644 C27 0,5709 0,5348 0,2038 Η70 0,2110 0,5756 0,2404 C28 0,8975 0,7762 0,0422 Η71 0,2578 0,5312 0,1447 C29 0,2923 0,5573 0,2150 Η72 -0,1392 0,3344 0,2555 C30 0,4345 0,4867 0,2295 Η73 0,1922 0,4468 0,0960 C31 0,0958 0,3306 0,0236 Η74 -0,2394 0,1689 0,1216 C32 0,9346 0,6664 0,0161 Η75 -0,1341 0,1904 0,0479 C33 0,9942 0,8828 0,0245 Η76 0,7798 0,8064 0,0354 C34 1,0667 0,7324 0,1019 Η77 -0,5859 0,2979 0,1468 C35 0,5239 0,5633 0,0937 Η78 -0,6934 0,1865 0,0883 C36 0,5916 0,4548 0,0733 Η79 -0,5532 0,0802 0,1023 037 -0,4684 0,1388 0,1701 Η80 -0,7442 -0,0491 0,1228 038 -0,4289 0,2122 0,2075 Η81 -0,8828 0,0626 0,1139 039 -0,7214 0,1782 0,1852 Η82 -0,7168 0,0010 0,1956 C40 -0,6079 0,2004 0,1513 Η83 -0,8983 0,0662 0,1893 C41 -0,7805 0,0664 0,1760 H84 -0,3123 0,2450 0,2037 C42 -0,6561 0,1265 0,1151 C43 -0,7758 0,0381 0,1281 TABELA 5 Coordenadas Atômicas para Exemplo 2d, Forma E-1 Átomo X Y Z Átomo X Y Z N1 0,5556 0,6575 0,1971 H40 0,2903 0,5250 0,1486 N2 0,9580 0,7945 0,0952 H41 0,7902 0,6695 0,0980 N3 0,0504 0,4000 0,2167 H42 0,6121 0,8376 0,1960 N4 0,2466 0,4969 0,1788 H43 0,4802 0,7853 0,1289 N5 0,6640 0,6706 0,1083 H44 -0,1345 0,3091 0,2471 06 0,4235 0,5727 0,1071 H45 0,2219 0,4518 0,0971 07 0,3141 0,7585 0,2020 H46 0,8518 0,7434 0,2205 C8 0,0563 0,3683 0,1425 H47 0,8769 0,6703 0,1722 C9 0,3945 0,6665 0,2051 H48 -0,2356 0,1657 0,1154 N10 -0,1464 0,2693 0,1855 H49 0,2468 0,5491 0,2421 C11 0,1179 0,4244 0,1805 H50 -0,1137 0,1969 0,0471 C12 -0,0757 0,2900 0,1475 H51 0,9339 0,9678 0,1186 C13 0,5699 0,5796 0,0976 H52 0,6715 0,8931 0,0836 C14 0,6460 0,7574 0,1795 H53 0,6450 0,9623 0,1326 C15 0,6096 0,7741 0,1332 H54 0,5054 0,4773 0,2603 C16 -0,0804 0,3256 0,2169 H55 0,4724 0,3825 0,2172 C17 0,1256 0,3867 0,1021 H56 0,8706 0,9373 0,1867 C18 0,8278 0,7497 0,1874 H57 1,0434 0,8510 0,1741 C19 -0,1350 0,2278 0,1118 H58 0,6429 0,4941 0,1737 C20 0,3307 0,5423 0,2161 H59 0,7309 0,5392 0,2214 C21 -0,0669 0,2438 0,0739 H60 0,5606 0,4154 0,0654 C22 0,8827 0,8818 0,1241 H61 0,6932 0,5215 0,0431 C23 0,6945 0,8866 0,1168 H62 0,7497 0,4462 0,0892 C24 0,4824 0,4737 0,2271 H63 1,1678 0,6903 0,0868 C25 0,0642 0,3239 0,0689 H64 1,2002 0,8299 0,1107 C26 0,9139 0,8598 0,1701 H65 1,1111 0,7125 0,1393 C27 0,6193 0,5376 0,2034 H66 0,8527 0,8919 0,0459 C28 0,1332 0,3426 0,0264 H67 0,9828 0,7726 -0,0103 C29 0,6490 0,4838 0,0720 H68 1,0893 0,6894 0,0276 F30 0,1426 0,2490 0,0048 H69 0,8751 0,6798 0,0245 F31 0,2603 0,4035 0,0246 H70 1,1045 0,9693 0,0155 C32 1,1203 0,7545 0,1087 H71 1,0868 1,0079 0,0687 C33 0,9653 0,8421 0,0525 H72 1,2197 0,8923 0,0534 C34 0,9802 0,7362 0,0215 H73 -0,3356 0,1901 0,1827 C35 1,1042 0,9365 0,0471 H74 -0,6100 0,2427 0,1853 F36 0,0282 0,4017 0,0020 H75 -0,5435 0,1919 0,1361 037 -0,4308 0,1231 0,1846 H76 -0,8101 0,1237 0,1519 C38 -0,5696 0,1669 0,1671 H77 -0,6709 0,0043 0,1485 C39 -0,7016 0,0870 0,1643 H78 -0,7374 0,0551 0,1977
TABELA 6]
o 2e, Forma A-1
Áto- mo X Y Z Átomo X Y Z 01 0,3737 0,5677 0,1038 H34 -0,1640 0,1792 0,0657 N2 0,6127 0,6388 0,1027 H16 0,1740 0,4180 0,1027 03 0,3132 0,7830 0,1897 H32 -0,2563 0,1746 0,1343 C4 0,5064 0,5520 0,0949 H24 -0,1168 0,3282 0,2594 N5 0,2190 0,5059 0,1814 H5 0,2557 0,5241 0,1532 C6 0,1016 0,4290 0,1870 H28A 0,4510 0,5073 0,2614 N7 0,9018 0,7409 0,0835 H28B 0,4099 0,3978 0,2297 N8 0,5246 0,6588 0,1932 H30A 0,5706 0,4800 0,1779 C9 0,3746 0,6827 0,1988 H30B 0,6614 0,5265 0,2179 N10 0,0495 0,4145 0,2272 H15 0,2312 0,5873 0,2385 C11 0,5829 0,7591 0,1239 H17 0,5966 0,8294 0,1852 C12 0,0312 0,3644 0,1517 Η2 0,7132 0,6191 0,0935 C13 -0,0936 0,2901 0,1617 Η18Α 0,6668 0,4348 0,0693 Ν14 -0,1492 0,2774 0,2023 Η18Β 0,5096 0,4227 0,0469 C15 0,3004 0,5650 0,2162 H18C 0,5363 0,3599 0,0916 C16 0,0858 0,3691 0,1092 Η22Α 0,8097 0,7261 0,2084 C17 0,6197 0,7499 0,1719 Η22Β 0,8144 0,6500 0,1655 C18 0,5600 0,4313 0,0739 Η11 0,4780 0,7781 0,1200 C19 0,6747 0,8657 0,1038 Η19Α 0,6550 0,8673 0,0737 F20 0,1808 0,3831 0,0261 Η19Β 0,6472 0,9456 0,1161 C21 0,0143 0,3015 0,0775 Η27Α 0,8511 0,9136 0,1702 C22 0,7871 0,7290 0,1785 Η27Β 0,9840 0,8202 0,1605 C23 0,8454 0,8483 0,1091 Η23 0,8972 0,9223 0,0991 C24 -0,0739 0,3401 0,2315 Η33Α 1,0920 0,6435 0,0741 F25 0,1345 0,1856 0,0238 Η33Β 1,0747 0,6924 0,1211 C26 0,0743 0,2971 0,0335 H33C 1,1211 0,7863 0,0846 C27 0,8780 0,8348 0,1570 Η31 0,7694 0,7749 0,0364 C28 0,4326 0,4864 0,2320 Η37Α 0,9230 0,8700 -0,0130 F29 -0,0287 0,3175 0,0040 Η37Β 1,0541 0,8649 0,0205 C30 0,5653 0,5283 0,2038 H37C 0,9089 0,9442 0,0302 C31 0,8750 0,7554 0,0374 Η36Α 0,8874 0,6527 -0,0172 C32 -0,1674 0,2229 0,1280 Η36Β 0,8419 0,5709 0,0225 C33 1,0612 0,7135 0,0915 H36C 1,0100 0,6124 0,0161 C34 -0,1156 0,2277 0,0877 Η40Α -0,7132 0,1528 0,2120 C35 -0,6607 0,1145 0,1509 Η40Β -0,7533 0,0132 0,1994 C36 0,9067 0,6372 0,0125 H40C -0,8560 0,1249 0,1840 C37 0,9468 0,8688 0,0169 Η38Α -0,7948 0,0004 0,1242 C38 -0,7123 0,0511 0,1141 Η38Β -0,6331 -0,0032 0,1041 039 -0,5629 0,1869 0,1523 H38C -0,7461 0,1041 00912 C40 -0,7542 0,0996 0,1900 TABELA 7
Coordenadas Atômicas para Exemplo 2f, Forma N-2
Átomo X Y Z Átomo X Y Z C1 -0,1614 0,2577 0,0383 F7 0,6225 0,2634 0,5011 C2 0,0133 0,3873 0,0895 F8 0,7150 0,2806 0,6609 C3 -0,0055 0,3310 -0,0010 F9 0,5345 0,2749 0,6173 C4 -0,0893 0,3603 -0,1048 F10 0,6186 0,2737 0,7242 C5 -0,0096 0,1977 -0,0307 F11 0,7090 0,2767 0,6039 C6 0,1226 0,1850 -0,0004 F12 0,5230 0,2690 0,5624 C7 -0,0693 0,1244 -0,0205 H10A -0,0413 0,1190 0,1459 C8 0,1708 0,1498 0,1106 H10B -0,0615 0,0409 0,0911 C9 0,1075 0,0771 0,1147 H11 0,0996 0,2283 0,1837 C10 -0,0234 0,0881 0,0905 H12 0,3217 -0,0767 0,3481 C11 0,2617 0,0045 0,2339 H13A 0,1891 -0,0144 0,4538 C12 0,2925 -0,0262 0,3476 H13B 0,1378 -0,0726 0,3618 C13 0,1771 -0,0254 0,3775 H14A 0,0237 0,0225 0,2848 C14 0,1062 0,0350 0,3075 H14B 0,1156 0,0818 0,3457 C15 0,2367 0,2052 0,2942 H16A 0,1608 0,2374 0,4116 C16 0,2078 0,2604 0,3702 H16B 0,1652 0,3007 0,3293 C17 0,5499 -0,0989 0,6085 H16C 0,2789 0,2786 0,4183 C18 0,4630 -0,0041 0,5011 H17 0,5477 -0,1488 0,6244 C19 0,5492 0,0453 0,5666 H1A -0,1774 0,3007 0,0757 C20 0,6362 0,0119 0,6505 H1B -0,1761 0,2143 0,0756 C21 0,5475 0,1213 0,5540 H1C -0,2111 0,2575 -0,0344 C22 0,7226 0,0568 0,7150 H21 0,4899 0,1433 0,4990 C23 0,7201 0,1309 0,7026 H22 0,7832 0,0354 0,7676 C24 0,6306 0,1640 0,6225 H23 0,7779 0,1599 0,7473 C25 0,6233 0,2457 0,6114 H26A 0,3405 0,0047 -0,3327 C26 0,3178 0,0508 -0,3076 H26B 0,3247 0,0893 -0,3570 C27 0,3677 0,1429 -0,1554 H26C 0,2382 0,0477 -0,3035 C28 0,2847 -0,0135 -0,1112 H27A 0,2885 0,1420 -0,1496 C29 0,3985 0,0680 -0,1941 Η27Β 0,3753 0,1801 -0,2063 C30 0,4839 -0,0499 -0,1192 H27C 0,4198 0,1537 -0,0857 C31 0,4689 -0,1207 -0,0596 Η28Α 0,2347 0,0287 -0,1160 C32 0,6120 -0,0241 -0,0769 Η28Β 0,2875 -0,0400 -0,0457 C33 0,6492 -0,0164 0,0464 H28C 0,2545 -0,0451 -0,1725 C34 0,6335 -0,0892 0,1001 Η29 0,4782 0,0723 -0,2025 C35 0,5063 -0,1148 0,0626 Η2Α -0,0589 0,3951 0,1087 C36 0,6313 0,0922 0,1569 Η2Β 0,0389 0,4330 0,0656 C37 0,5494 0,1489 0,1804 H2C 0,0717 0,3696 0,1516 C38 0,7946 -0,0826 0,2650 Η3 0,0704 0,3241 -0,0167 C39 0,6078 -0,0715 0,2941 Η30 0,4704 -0,0619 -0,1962 C40 0,6937 -0,0843 0,4027 Η31Α 0,3871 -0,1351 -0,0819 C41 0,8124 -0,0650 0,3838 Η31Β 0,5139 -0,1595 -0,0817 C42 0,8969 0,0402 0,4994 Η32Α 0,6629 -0,0594 -0,0989 C43 0,9918 0,0223 0,6769 Η32Β 0,6212 0,0230 -0,1096 C44 0,9164 0,1178 0,5156 Η33 0,7326 -0,0036 0,0683 C45 1,0010 0,2152 0,6420 Η34 0,6810 -0,1261 0,0750 C46 0,9795 0,1403 0,6212 Η35Α 0,4983 -0,1624 0,0944 C47 0,9601 0,2664 0,5640 Η35Β 0,4564 -0,0799 0,0866 C48 0,8959 0,2447 0,4599 Η37Α 0,5607 0,1528 0,2573 C49 0,8756 0,1715 0,4360 Η37Β 0,4700 0,1346 0,1467 C50 0,8489 0,3015 0,3761 H37C 0,5650 0,1957 0,1521 Ν1 1,0171 0,0906 0,7037 H 39 A 0,5425 -0,1055 0,2823 Ν2 0,6368 -0,0622 0,6704 Η39Β 0,5781 -0,0214 0,2880 Ν3 0,9331 -0,0075 0,5810 Η40Α 0,6920 -0,1353 0,4251 Ν4 0,4627 -0,0749 0,5246 Η40Β 0,6765 -0,0527 0,4577 Ν5 0,8420 0,0126 0,4015 Η41 0,8743 -0,0960 0,4288 Ν6 0,6777 -0,0849 0,2178 Η43 1,0183 -0,0115 0,7327 Ν7 0,5849 0,0426 0,0803 Η45 1,0440 0,2303 0,7105 Ν8 0,4025 0,0106 -0,1105 Η47 0,9746 0,3161 0,5795 Ν9 0,3818 0,0211 0,4149 Η49 0,8344 0,1575 0,3664 Ν10 0,1561 0,0378 0,2158 H4A -0,1020 0,3231 -0,1600 Ν11 0,1599 0,2000 0,1967 H4B -0,0560 0,4033 -0,1288 Ν12 -0,0389 0,2585 0,0355 H4C -0,1627 0,3731 0,0908 01 0,8718 -0,0902 0,2185 H5 0,8235 0,0422 0,3470 02 0,7359 0,0910 0,2072 H5A -0,0340 0,2128 -0,1069 03 0,3220 0,0019 0,1698 H6A 0,1414 0,1536 -0,0548 04 0,3257 0,1671 0,3217 H6B 0,1615 0,2319 -0,0017 F1 0,7539 0,2815 0,3030 H7 0,5113 0,0460 0,0488 F2 0,9209 0,3190 0,3146 H7A -0,1528 0,1327 -0,0337 F3 0,8233 0,3648 0,4151 H7B -0,0576 0,0910 -0,0759 F4 0,8500 0,2791 0,2840 H8 0,2540 0,1393 0,1202 F5 0,9132 0,3571 0,3931 H9 0,3825 0,0671 0,3986 F6 0,7377 0,3127 0,3710 H9A 0,1212 0,0462 0,0565 TABELA 8 Coordenadas Atômicas para Exemplo 2g, Form AN-3 Átomo X Y Z Átomo X Y Z N1 0,3835 0,0757 0,0375 H21 -0,1570 0,4019 0,0806 N2 0,7286 -0,0185 0,1260 H6 0,2566 0,2184 0,1457 N3 0,2667 0,0953 -0,1106 H15 -0,1768 0,3372 -0,0677 04 0,4406 0,1041 0,2348 H20 0,1322 0,1240 -0,2309 C6 0,1693 0,2426 0,1013 H1 0,3709 0,0824 0,1036 N7 0,6875 0,0647 0,3206 H17 0,4819 -0,0292 -0,0463 C8 0,0362 0,2388 -0,0548 H28A 0,7603 0,0328 -0,0600 09 0,5030 -0,1317 0,1098 H28B 0,6637 0,1325 -0,0383 C10 0,5797 -0,0561 0,0855 H24A 0,7555 0,1274 0,1175 N11 0,9744 0,0244 0,4480 H24B 0,9167 0,0696 0,0774 C12 0,0569 0,3162 0,1260 H19 0,8001 -0,1313 0,2000 0,1605 0,2026 0,0109 H22A 1,0680 -0,0427 0,1790 C13 0,2745 0,1240 -0,0211 H22B 1,0006 0,0401 0,2458 N14 0,0255 0,2060 -0,1450 H29A 1,0737 -0,1556 0,3001 C15 -0,0858 0,3132 -0,0252 Η29Β 1,1889 -0,0637 0,3299 C16 0,5624 0,1278 0,2890 Η27 1,0060 -0,1224 0,4487 C17 0,5237 0,0103 0,0054 Η23Α 0,6964 -0,0882 0,4334 C18 1,1544 0,0668 0,4534 Η23Β 0,7596 -0,1700 0,3643 C19 0,8045 -0,0612 0,2107 Η25 0,5708 -0,0620 0,2829 C20 0,1422 0,1402 -0,1658 Η7 0,7807 0,0874 0,3623 C21 -0,0752 0,3517 0,0617 Η34Α 0,6865 0,2365 0,3642 C22 0,9970 -0,0294 0,2320 Η34Β 0,4795 0,2484 0,3581 C23 0,7649 -0,1008 0,3793 H34C 0,5937 0,2759 0,2722 C24 0,7898 0,0709 0,0816 Η36Α 0,7774 -0,0065 0,5345 C25 0,6909 -0,0417 0,2964 Η36Β 0,8886 0,0871 0,5638 C26 0,6097 0,2153 0,6473 H36C 0,9671 -0,0190 0,5809 C27 0,9604 -0,0758 0,4035 Η18 1,1968 0,0630 0,3910 C28 0,6935 0,0679 -0,0147 Η35Α 1,4009 0,0440 0,5102 C29 1,0708 -0,0864 0,3149 Η35Β 1,3030 -0,0555 0,4859 F30 0,1149 0,3018 0,2839 H35C 1,2530 0,0042 0,5751 C31 1,1447 0,1747 0,4843 Η31Α 1,2617 0,2028 0,4883 C32 0,0681 0,3603 0,2194 Η31Β 1,0911 0,1790 0,5441 F33 -0,0775 0,3987 0,2482 H31C 1,0736 0,2106 0,4391 C34 0,5829 0,2314 0,3240 Η37Α 0,5614 0,1191 0745 C35 1,2896 0,0095 0,5118 Η37Β 0,5364 0,2293 0,7767 C36 0,8948 0,0210 0,5396 H37C 0,7279 0,1858 0,7670 C37 0,6085 0,1849 0,7418 Ν38 0,6123 0,2421 0,5722 F39 0,1781 0,4283 0,2274 TABELA 9
Coordenadas Atômicas para Exemplo 2h, Forma H4-1, HCI
Átomo X Y Z Átomo X Y Z N1 -0,1488 0,2098 -0,0343 H42 0,3077 0,3275 0,1257 02 0,3490 0,4972 0,0272 H43 0,1538 0,2201 0,0743 N3 0,2326 0,3477 0,0060 H44 0,5279 0,4347 0,1149 N4 0,2975 0,2676 0,0466 H45 0,7124 0,4674 0,0613 N5 0,0807 0,4627 0,0181 H46 0,4192 0,2973 0,0255 N6 0,5197 0,3793 0,0531 H47 0,2578 0,0900 0,0153 F7 -0,0010 0,2280 0,0989 H48 0,1288 0,1011 0,0254 08 0,1939 0,6851 0,0181 H49 0,0936 0,1554 -0,0028 C9 0,2189 0,4432 -0,0048 H50 0,2571 0,2098 -0,0092 C10 0,3038 0,3881 0,0205 H51 0,3036 0,5397 -0,0022 N11 0,5990 0,4425 0,0823 H52 0,2392 0,5114 -0,0309 C12 0,0927 0,4487 -0,0003 H53 0,2974 0,4009 -0,0274 C13 -0,0342 0,3317 -0,0074 H54 0,0792 0,2199 -0,0265 C14 0,3955 0,3262 0,0584 H55 0,1025 0,3114 -0,0456 C15 0,4700 0,3861 0,0880 H56 -0,0076 0,4161 -0,0330 C16 0,3630 0,3248 0,0764 H57 -0,0551 0,2416 -0,0013 C17 0,1395 0,5810 0,0261 H58 -0,1201 0,3469 -0,0044 C18 0,3194 0,2774 0,0280 H59 0,0964 0,5331 -0,0071 C19 -0,1511 0,2151 -0,0542 H60 0,1837 0,6722 0,0512 C20 0,1983 0,2123 0,0011 H61 0,0338 0,5217 0,0502 C21 0,0952 0,3112 -0,0319 H62 0,1844 0,5224 0,0503 C22 -0,0230 0,3271 -0,0270 H63 -0,2772 0,1614 -0,0127 C23 0,2130 0,2691 0,1003 H64 -0,2760 0,2805 -0,0267 C24 0,2222 0,4228 -0,0243 H65 -0,3579 0,1133 -0,0329 C25 0,2358 0,2673 0,0829 H66 -0,0504 0,2577 -0,0592 C26 0,4468 0,3881 0,1058 H67 -0,1794 0,3278 -0,0737 C27 0,3218 0,3305 0,1117 H68 -0,3053 0,2578 -0,0581 C28 0,1344 0,5769 0,0455 H69 -0,1526 0,3966 -0,0528 C29 -0,2730 0,1906 -0,0263 H70 -0,2410 0,0701 -0,0746 F30 0,0717 0,2300 0,1235 H71 -0,1946 0,0132 -0,0562 C31 0,2191 0,1567 0,0180 H72 -0,3347 0,0316 -0,0554 C32 0,6135 0,4326 0,0655 H73 -0,1530 0,1183 -0,0305 F33 0,0240 0,0760 0,1070 H74 0,0220 0,3750 0,0260 C34 0,0782 0,2012 0,1072 H75 0,1982 0,2109 0,0512 C35 -0,2346 0,0735 -0,0609 H76 0,2980 0,8016 0,0030 C36 -0,1999 0,3066 -0,0603 H77 0,4177 0,8365 -0,0131 CL37 0,0168 0,2311 0,0469 H78 -0,2680 0,2326 0,0385 038 -0,1364 0,0296 0,0183 H79 -0,2444 0,1328 0,0235 039 0,3598 0,8724 -0,0063 H80 -0,2485 0,2185 0,0683 040 -0,2980 0,1857 0,0261 H81 -0,1126 0,2683 0,0544 041 -0,1879 0,2915 0,0585 H82 -0,0947 0,0714 0,0059 H83 -0,0825 0,1005 0,0284
TABELA 10
Posições de pico de difração de pó de raio X características (graus 2j±0.1 )@ RT por exemplo 2a, b, d, e, f, g, e h, com base em um pa- drão de alta qualidade coletadas com um difratômetro (CuKa) com um capi- lar em rotação com 2ü calibrado com um outro padrão adequado NIST.
Exp 2a Exp 2b Exp 2d Exp 2e Exp 2f Exp 2g Exp 2h 8,1 10,0 5,5 10,1 7,2 6,3 6,9 11,7 11,4 9,6 11,3 8,7 9,0 8,7 13,0 11,9 11,4 11,9 9,7 11,7 9,8 13,9 14,3 14,5 13,3 12,5 15,0 10,3 16,6 15,6 15,8 14,2 12,8 17,6 11,8 17,0 16,5 16,6 15,6 13,3 18,6 13,5 17,6 19,1 18,4 16,8 16,0 19,7 15,0 21,1 19,4 19,2 19,0 16,6 20,7 18,8 23,2 20,2 20,0 19,5 18,2 21,4 21,4 23,9 21,2 23,6 20,4 18,8 23,8 22,9 CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS COMPARATIVAS
Ensaios e dados comparando as características farmacológicas do Exemplo 1 e compostos encontrados no W02005021500 (corresponden- tes à Patente dos Estados Unidos No. 7.163.937 designados pelo presente Requerente) são representados abaixo.
Ligação celular mononuclear de sangue periférico humano ("ligação de CCR2 ")
Veja também: Yoshimura e outro, J. Immunol. 1990, 145, 292. O ensaio de ligação de CCR2 humano foi estabelecido com células mononu- cleares de sangue periférico humano (hPBMCs) utilizando MCP-1 humano 125I como um Iigante traçador. hPBMCs foram isolados de Ieukopak humano (Biological Specialty Inc.) utilizando um protocolo padrão com Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro). Os hPBMCs isolados foram lavados e diluídos para 1x107/ml em um tampão de ligação (RPMI-1640, 0,1% de BSA1 20 mM de Hepes, pH 7.4). 125I-MCP-I (NEN/Perk Elmer) foi diluído para 0.45 nM em um tampão de ligação. O composto foi diluído em um tampão de ligação em 3 vezes as concentrações finais utilizadas no ensaio de ligação. O ensaio de ligação foi realizado utilizando uma placa de filtro de 96 cavidades (Millipo- re). A ligação de 125I-MCP-I total foi estimada como segue: a cada reação de um volume total de 150 μΙ foram adicionados células 5x105, 0,15 nM de 125I- MCP-1, e composto tal que a concentração final variou de 0 a 100 nM. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos seguido por três lavagens com RPMI-1640, 0,1% de BSA, 0,4 M de NaCI, 20 mM de He- pes, pH 7,4 utilizando uma filtragem de tubilação a vácuo (Millipore). Após a lavagem, a placa foi secada por ar durante 60 minutos em temperatura am- biente. Isto foi seguido por adição de 25 μΙ de Microscint 20 em cada cavida- de. A placa foi selada e contada no Trilux durante 1 minuto. A ligação não específica foi determinada na presença de 300 nM MCP-1 frio (PeproTech Inc.). 125I-MCP-I específico foi calculado como a diferença entre a ligação total e não específica. Todas as condições foram testadas em duplicata. O IC50 é definido como a concentração de composto de competição requerido para reduzir a ligação específica para 50%. Fluxo de hERG
Células HEK293 estavelmente espressando canais de hERG foram desenvolvidos (37 0C1 5% de CO2) em Dulbecco's Modified EagIe1S Media suplementados com 10% de soro bovino fetal Sigma, aminoácidos não essenciais, 2mM de L-glutamina e 500 pg/ml de G418, em incubador. Tampão de dissociação celular foi utilizado para extrair células de frascos, que foram em seguida colocadas em placas placas pretas/claras revestidas por Corning poli-D-Lysina de 348 cavidades em uma densidade de 2 χ 104 células por cavidade (20 μΙ) em 10% de meios de soro, e incubadas durante 15-24 horas a 37 0C em um inbubador de 5% de CO2 até uma monocamada confluente de células ser obtida.
Uma matéria-prima de 2 mM de tinta BTC-AM (Molecular Pro- bes, Eugene, OR) foi preparada em 100% de DMSO e em seguida adiciona- da 1:1 para 10% de (peso/volume) ácido plurônico em DMSO no dia do en- saio. A tinta foi em seguida diluída em tampão EP externo hERG (140 mM de NaCI, 4.0 mM de KCI, 1.8 mM de CaCI2, 1.0 mM de MgCI2, 10 mM de HEPES, pH 7.3 e 10 mM de glicose; todos os componentes de tampão obti- dos de Sigma Chemical). Esta mistura de tinta BTC (30 μΙ) foi adicionada às células e produziu uma concentração de carga final de 2.5 μΜ. As células são incubadas a 21 0C durante 45 minutos.
Os compostos teste foram diluídos para 10 mM de DMSO em 60 μΙ. estes compostos foram em seguida serialmente diluídos em uma relação 1:2 em DMSO em colunas 1-10 e 11-20 de uma placa de 384 cavidades. As placas prontas para o ensaio foram geradas estampando 2,5 μΙ da placa de DMSO serialmente diluída, que foi preparada no Velocity 11 BioCeI. As pla- cas aquosas foram criadas adicionando-se 48 μΙ de tampão EP e em segui- da foram diluídas 30 - 45 minutos antes que o ensaio fosse lido no FLIPR. Após o carregamento de tinta, compostos diluídos aquosos foram adiciona- dos às células das três placas replicadas (10 μΙ) produzindo uma faixa de concentração de dez pontos de 80 μΜ a 0,156 nM. A concentração de DM- SO final no ensaio é 1%. As placas aquosas prontas para o ensaio foram preparadas e diluídas em um manipulador de líquido de Cybio. As células carregadas com tinta foram lidas no FLIPR384 (Molecu- lar Devices, Sunnyvale, CA), que excita a tinta utilizando a linha de 488 nm de um laser de argônio. A emissão foi filtrada utilizando um filtro de passo de faixa de 540 ± 30 nm. Os canais de hERG foram estimulados para abrirem pela de adição 20 μΙ/cavidade de tampão de EP contendo 66 mM de K2SO4e 1.3 mM de TI2SO4 (Sigma/AIdrich). Para cada placa, os dados foram coleta- dos a cada segundo durante um período de 12 segundos, em cujo tempo o ΤΓ-contendo tampão de estímulo foi adicionado. A coleta de dados procedeu a cada segundo durante 48 segundos, e em seguida continuou a cada três segundos durante mais 2 minutos.
A faixa dinâmica do ensaio foi determinada de células vazias e totais. As células totais (colunas 21 e 22) definem a ativação de hERG má- xima para a placa (nenhum composto teste presente), e as células vazias (colunas 23 e 24) definem a inibição de 100% de hERG. As células vazias contêm 400 nM de inibidores de hERG padrão dofetilide (Ficker e outro, 1998) ou E-4031. Os pontos de dados brutos em cada cavidade da amostra foram primeiro corrigidos por variação de célula/sinal, base de controle nega- tivo (vazia), e normalizados pelos controles positivos (totais) utilizando o software FLIPR online. As curvas de resposta de concentração de composto teste para os dados de fluxo de hERG Tl+ foram em seguida fixadas utilizan- do Excel Fit (ID Business Solutions Limited, Surrey, UK) com uma esquação logística de sítio simples, Y= A + ((B-A)/1 + ((C/X) Λ D))) em que A= inibição máxima. Os dados foram analizados por amplitudes máximas de fixação de alteração na fluorescência para o fluxo de ΤΓ para uma determinada condi- ção de composto teste. Potências (valores de IC5o) de compostos foram cal- culadas da média de células triplicadas. Ensaio de ligação de sítio, canal de sódio
Veja também: W. A. Catterall, e outro, J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922. O tampão de ligação padrão continha 50 mM de HEPES, 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 130 mM de Cloreto de Colina, 5,4 mM de KCI, 0,8 mM de MgCI2, 5,5 mM de glicose, 40 μς/ηιί LqT. As reações de ligação foram inici- adas adicionando-se sinaptossomas (preparadas de cérebro de rato Wistar) à mistura reacional contendo 5 nM [3HJ-Batrachotoxin em um tampão de li- gação padrão e o composto a ser testado na concentração desejável. As amostras foram em seguida misturadas e incubadas a 37 0C durante 60 mi- nutos. As reações foram interropmpidas adicionando-se tampão de lavagem gelado contendo 50 mM de HEPES, 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 1,8 mM de CaCI2, 0,8mM de MgCI2 e 1 mg/mL de albumina de soro bovino. As sinap- tossomas foram imediatamente coletadas em filtro de fibra de vidro e lava- das 3 vezes com tampões de lavagem. A radioatividade de [3H]- Batrachotoxin restante nos filtros foi contada utilizando espectromêtros de cintilação líquida.
Ensaio de Permeabilidade de membrana Artificial Paralela (PAMPA)
Ensaio de Permeabilidade de membrana Artificial Paralela (PAMPA) consiste em uma combinação de lipídeo com base em Iecitina es- picialmente formulada comreferência como o lipídeo de trato gastrointestinal (GIT). O lipídeo de GIT é utilizado para formar uma membrana em uma mon- tagem de placa sanduíche similar àquela utilizada nos ensaios Caco-2. O lipídeo de GIT intimamente se parece com a composição e desempenho in vivo como avaliado por compostos padrão que são conhecidos serem passi- vamente absorvidos em humanos. PAMPA é amplamente utilizado um como modelo in vitro para análise de permeabilidade de compostos descobertos. A taxa de passagem de compostos através da membrana de PAMPA é utiliza- da para determinar o coeficiente de permeabilidade (Pc), que pode ser rela- cionado à permeabilidade passiva in vivo do composto.
O coeficiente de permeabilidade (Pc) de um composto particular é examinado em um cenário dependente do pH com pH apical e basolateral de 7.4. Todos os experimentos são conduzidos em determinações triplica- das.
Compostos (10 mM de matérias-primas em 100% de DMSO) foram diluído 1:100 em tampão de cavidade doadora de pH 7.4 (plON CAT # 110151), fornecenuma solução de ensaio de 100 μΜ em 1% de DMSO. O composto diluído em tampão de cavidade doadora foi transferido a uma pla- ca Whatman Unifilter e filtrado antes da dispersão de 200 μΙ na placa doado- ra da placa de ensaio (plON CAT #110163). A membrana PAMPA foi forma- da por pepitagem de 4 μΙ da solução de lipídeo (plON CAT #110169) na pla- ca de filtro (VWR CAT #13503). A membrana foi em seguida revestida com 200 μΙ de tampão de cavidade receptora em pH 7,4 (plON CAT #110139). A placa de ensaio PAMPA (parte doadora e parte receptora) foi combinada e deixada incubar em temperatura ambiente durante 4 horas. A placa foi em seguida desmontada e as placas de espectrofotômetro s (VWR CAT #655801) foram carregadas (150 μΙ/cavidade). As placas doadora, recepto- ras, de referência e vazias foram lidas na Ieitira de placa SpectraMax UV. Os dados foram capturados pelo software plON, que analisa os espectros e ge- ra os valores de Pc. Quimiotaxia de CCR2
O ensaio de quiomiotaxia de CCR2 humano foi conduzido com a linhagem celular monocítica humana, as células THP-1. THP-1 foram primei- ro rotuladas com uma tinta fluorescente de CaIcein-AM em RPMI-1640 livre de vermelho fenol, livre de BSA (pH 7.4) a 37 0C durante 30 minutos com mistura suave a cada 15 minutos. As células rotuladas foram em seguida lavadas e re-suspensas em 1x105/ml em tampão de quimiotaxia (RPMI-1640 livre de vermelho fenol, 0,1% de BSA, pH 7.4). O composto teste foi diluído em tampão de quimiotaxia tal que a concentração do ensaio final varie de 0,01 nM a 1 μΜ. o Iigante de MCP-1 (PeproTech Inc.) foi diluído para 20 nM em tampão de quimiotaxia. Para realizar o ensaio, um volume igual de com- posto teste dilutions foi misturado com um volume igual de células THP-1 rotuladas (Mistura 1), e um volume igual diluições de de composto teste foi misturado com um volume igual de Iigante de MCP-1 diluído (Mistura 2). Ambas as misturas foram independentemente incubadas a 37 0C durante 10 minutos seguido por mistura suave. Quimiotaxia induzida por MCP-1 foi em seguida avaliada emu ma placa de quimiotaxia (Becton Dickinson) colocan- do-se 50 μΙ da mistura 1 na câmara superior e 225 μΙ da mistura 2 na câma- ra inferior. A placa foi coberta com uma tampa e incubada a 37°C durante 30 minutos. 30 minutos depois, a placa foi lida em um Cytofluor. Todas as con- dições foram testadas em duplicada. Para sinal para determinação de ruído, 50 μΙ de células THP-1 rotuladas sozinhas (5x104/cavidade) foram colocados na câmara superior e 225 μΙ de Iigante MCP-1 sozinho foram colocados na câmara inferior (concentração final de 10 nM). A inibição obtida por concen- trações graduadas de composto teste foi calculada como uma porcentagem do controle de MCP-1 livre de composto. O IC50 é definido como a concen- tração de composto teste requirido para obter 50% de inibição de quimiota- xia celular.
Grampo de Remendo de hERG
Grampo de remendo de célual inteira foi utilizado para avaliar diretamente correntes de hERG em células HEK-293 estavelmente expres- sando a subunidade α de canal de potássio de hERG clonado. O composto foi testado em um tampão aquoso com pH 7.4 em temperatura ambiente. Pulsos teste repetitivos (0,05 Hz) foram aplicados de um potencial de manu- tenção de -80 mV a +20 mV durante 2 segundos e correntes cauda foram extraídas seguindo os pulsos teste por escalonamento da para -65 mV. Os efeitos do o composto foram calculados avaliando-se a corrente cauda má- xima.
Grampo de Remendo de Canal de Sódio
Grampo de remendo de célual inteira foi utilizado para avaliar diretamente correntes de sódio interiores em células HEK-293 expressando o canal de sódio cardpiaco humano, SCN5A. O composto foi testado em um tampão aquoso livre de proteína. Para determinar a inibição de estado fixo, correntes de sódio foram extraídas a cada 5 segundos utilizando os seguin- tes protocolos de voltagem: as células foram mantidas em um potencial de -90 mV e escalonadas para -20 mV durante 60 minutos. Os efeitos foram calculados avaliando-se a inibição de corrente máxima durante o pulso teste para -20 mV. Taxa de dependência de inibição foi avaliada por estimulação em freqüências de 1 Hz e 4 Hz. Farmacocinéticos de Dose Única em Ratos Ratos Sprague-Dawley machos (250-300 g) foram utilizados pa-
ra os estudos farmacocinéticos. Os ratos jejuaram durante a noite antes da dosage PO e alimentados 4 horas após a dose. Amostras de sangue (-0.3 mL) foram coletadas da veia jugular em tubos contendo K2EDTA e em se- guida centrifugadas a 4°C (1500-2000xg) para obter o plasma. Em um estu- do de biodisponibilidade oral, 2 grupos de animais (N=2-3 por grupo) recebe- ram o composto teste como uma infusão intravenosa (IV) (durante 10 minu- tos) por meio da veia jugular ou por gavagem oral. Amostras de sangue seri- ais foram obtidas em 0.17 (por IV apenas), 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 horas após a dose. Amostras de plasma, obtidas por centrifugação a 4°C (1500-2000xg), foram armazenadas a -20°C até análise por LC/MS/MS. Farmacocinéticos de Dose Única em Macacos Os farmacocinéticos de vários compostos teste foram avaliados
em macacos Cynomolgus machos em um projeto de cruzamento. Os maca- cos jejuaram durante a noite antes da dosagem PO e alimentados 4 horas após a dose. Um grupo de 1-3 animais (3 a 5 kg) recebeu infusão IV de composto po (durante 10 minutos) por meio de uma veia femoral por gava- gem oral, com um intervalo de 1 semana entre os tratamentos. Amostras de sangue seriais (-0.3 mL) foram coletadas de uma artéria femoral a 0.17 (IV apenas), 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 horas após a dose, e centrifuga- das a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. As amostras foram armazena- das a -20°C até análise por LC/MS/MS. Análise de dados para ensaios de farmacocinéticos
Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos por análise não comportamental de concentração de plasma vs. Dados de tempo (software KINETICA_, Versão 4.2, InnaPhase Corporation, Philadelphia, PA). A con- centração máxima (Cmax) e tempo para Cmax foram registrados diretamen- te ee observações experimentais. A área sobre a curva de tempo zero para o tempo da última amostragem (AUC(O-T)) foi calculada utilizando uma combinação de adições lineares e Iog trapezoidais. A liberação de plasma total (CLTp), volume de estado fixo de distribuição (Vss), meia-vida de elimi- nação aparente (T1/2) e tempo de residência médio (MRT) foram estimate- dos após administração IV. Estimativas de T1/2 foram feitas utilizando um mínimo de pontos de 3 vezes com concentrações quantificáveis. A biodispo- nibilidade oral absoluta (F) foi estimada como a taxa de valores de AUC normalizados por dose seguindo doses orais e IV.
Encontrados abaixo dados para cada composto como avaliado
anos ensaios acima descritos.
Tabela 11. Dados Comparativos In Vitro
Composto IC5O de Liga- ção de C- CR2 (nM) IC50 de FLUXO de hERG (nM) Ligação de canal de Na+ (% de inibi- ção) PAMPA permeabi- lidade (nm/sec) Exemplo 12as, W02005021500 0,27(7) 2,800 Não disponí- vel Não dis- ponível Exemplo 12aj W02005021500 0,43 ± 0,06 (2) 770 Não disponí- vel Não dis- ponível Exemplo 2k W02005021500 0,88 ± 0,60 (23) 51,000 97%, 10,000 nM 529 ± 157 (9) Exemplo 12bd W02005021500 1,15 ± 0,07 (2) >80,000 54%, 10,000 nM 392 Exemplo 8a W02005021500 1,83 ± 0,80 (12) >80,000 3%, 10,000 nM 33%, 30,000 nM 94 ± 58 (10) Exemplo 8e, W02005021500 2,20 ± 0,03 (2) >80,000 6%, 10,000 nM 2 ±2 (2) Exemplo 9c, W02005021500 0,96 ± 0,26 (19) >80,000 48%, 10,000 nM 75%, 30,000 nM 145 ± 71 (8) Exemplo 1 Presente inven- ção 1,14 ± 0,69 (18) >80,000 0%, 10,000 nM; 21%, 30,000 nM 443 ± 114 (8) Tabela 12a. Dados Comparativos In Vitro Adicionais Composto IC5O de Quimio- taxia de CCR2 (nM) Grampo de Re- mendo de hERG (% Inhib.) Grampo de Re- mendo de Canal de Na+ (% Inhib.) Exemplo 2k Patente dos Estados Uni- dos 7,163,937 0,24 ±0,16 (12) 83%, 10,000 nM 52%, 10,000 nM 90%, 30,000 nM Exemplo 8a W02005021 500 2,63 ± 1,24 (4) 4%, 10,000 nM 22%, 10,000 nM 49%, 30,000 nM Exemplo 9c, W02005021 500 0,21 4%, 10,000 nM 19%, 10,000 nM 39%, 30,000 nM Exemplo 1, Presente invenção 0,67 ± 0,42 (22) 33%, 10,000 nM 61%, 30,000 nM 17%, 10,000 nM 19%, 30,000 nM
Tabela 12b, Dados Farmacocinéticos Comparat vos in vivo no Rato Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (m L/mi n/kg) F% Oral AUC (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 2,5/25 40 68 9294 Exemplo 8a W02005021500 6/72 42 1,4 690 Exemplo 9c, W02005021500 4/43 54 14 1855 Exemplo 1, Presente inven- ção 2/10 43 51 3794 Tabela 12c, Dados Farmacocinéticos Comparativos in vivo no Macaco
Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (m L/mi n/kg) F% Oral AUC (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 1/1,4 25 46 862 Exemplo 8a W02005021500 1/11 14 9,4 1896 Exemplo 9c, W02005021500 1/10 12 26 6763 Exemplo 1, Presente invenção 1/1,3 23 47 836
UTILIDADE
Compostos representativos dos exemplos são conhecidos serem moduladores de atividade de receptor de quimiocina utilizando ensaios co- nhecidos por aqueles versados na técnica. Nesta seção, descrevemos tais ensaios e fornecemos sua literatura de referência. Mais ensaios são descri- tos aqui na seção entitulada "Características Farmacológicas Comparativas", supra. Exibindo-se a atividade nestes ensaios de antagonismo de MCP-1, os compostos dos exemplos são experados serem úteis no tratamento de do- enças humanas associadas com quimiocinas e seus receptores cognatos. A
definição de atividade nestes ensaios é um composto demonstrando um IC50 de 30 μΜ ou menor em concentração quando avaliado em um particu- lar ensaio.
Antagonismo de Ligação de MCP-1 ao PBMC Humano (Yoshimura e outro, J. Immunol. 1990, 145, 292)
Pelo menos um composto descrito nos exemplos tem atividade no antagonismo de ligação de MCP-1 à PBMC humana (células mononucle- ares de sangue periférico humano) descrita aqui. Placas de filtro Millipore (#MABVN1250) são tratadas com 100 μΙ
de tampão de ligação (0,5% de albumina de soro bovino, 20 mM de tampão de HEPES e 5 mM de cloreto de magnésio em meios RPMI 1640) durante trinta minutos em temperatura ambiente. Para avaliara a ligação, 50 μΙ de tampão de ligação, com ou sem um composto de concentração conhecido, são combinados com 50 μΙ de MCP-1 humana rotulada por I25-I (para for- necer uma concentração final de 150 pM radiolígand) e 50 μΙ de tampão de ligação contendo células 5x105. As células utilizadas para tais ensaios de ligação podem incluir células mononucleares de sangue periférico humano isoladas por centrigugação gradiente Ficoll-Hypaque, monócitos humanos (Weiner e outro, J. Immunol. Methodos . 1980, 36, 89), ou a linhagem celular THP-1 que expressa o receptor endógeno. A mistura de composto, células e radioligantes são incubados em temperatura ambiente durante trinta minu- tos. As placas são colocadas em uma tubulação de vácuo, vácuo aplicado, e as placas lavadas três vezes com tampão de ligação contendo 0,5M de Na- Cl. A aba plastic é removida da placa, a placa deixada secar por ar, as cavi- dades furadas e contadas. O percentual de inibição de ligação é calculado utilizando as contas totais obtidas na ausência de qualquer composto de competição composto e a ligação de base determinnada por adição de 100 nM de MCP-1 no lugar do composto teste. Antagonismo de Influxo de Cálcio Induzido por MCP-1
(Sullivan, e outro, MethodsMol Biol., 114, 125-133 (1999)
Pelo menos um composto descrito nos exemplos tem atividade no antagonismo de ensaio de influxo de cálcio induzido por MCP-Idescrito aqui.
A mobilização de cálcio é avaliada utilizando a tinta indicadora
de Ca2+ fluorescente, Fluo-3. As células são incubadas em 8 χ 105 célu- las/ml em salina tamponada por fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 20 mM de tampão de HEPES, 5 mM de glicose, 1% de soro de bovi- no fetal, 4 μΜ de Fluo-3 AM e 2,5 mM de probenecide durante 60 minutos a 37°C. As células utilizadas para tais ensaios de cálcio podem incluir monóci- tos humanos isolados como descritos por Weiner e outro, J. Immunol. Méto- dos, 36, 89-97 (1980) ou linhagens celulares que expressam o receptor de CCR2 endógenos tais como THP-1 e MonoMac-6. As células são em segui- da lavadas três vezes em salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Albumina de soro bovino, 20 mM de HEPES, 5 mM de glicose e 2,5 mM de probenecide. As células são re-suspensas em salina tamponada por fosfato contendo 0,5% de Albumina de soro bovino, 20 mM de HEPES e 2.5 mM de probenecide em uma concentração final de 2-4 χ 106 células/ml. As células são semeadas em microplacas de parede preta de 96 cavidades (100 μΙ/cavidade) e as placas centrifugadas a 200 χ g durante 5 minutos. Várias concentrações de composto são adicionadas às cavidades (50 μΙ/cavidade) e após 5 minutos, 50 μΙ/cavidade de MCP-1 são adicionados para fornecer uma concentração final de 10 nM. A mobilização de cálcio é detectada por utilizando uma leitora de imagemanto fluorescente. A monocamada celular é excitada com um laser de argônio (488 nM) e fluorescência associada com célula avaliada durante 3 minutos, (a cada segundo para os primeiros 90 segundos e a cada 10 segundos para os 90 segundos seguintes). Os dados são gerados como unidades de fluorescência arbitrária e alteração na fluo- rescência para cada cavidade determinada como o diferencial máximo- mínimo. A inibição dependente de composto é calculada com relação à res- posta de MCP-1 sozinha. Antagonismo de Quimiotaxia de PBMC Humana induzida por MCP-1 - (Bacon e outro, Brit. J. PharmacoL 1988, 95, 966)
Pelo menos um composto descrito nos exemplos tem atividade no antagonismo de ensaio de quimiotaxia de PBMC humana induzida por MCP-1 descrita aqui.
Câmara de quimiotaxia de Neuroprobe MBA96-96-cavidades,
placa de 96 cavidades Polifiltronics MPC, e filtros de 8 mícrons PFD5 de po- Iicarbonato livre de polivinilpirrolidona Neuroprobe são aquecidos em um incubador a 37 Oc. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) (Boyum e outro, Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 1968, 97, 31), recentemente isoladas por meio de método de separação ficoll padrão, são suspensas em DMEM a 1 χ 10 7 c/ml e aquecidas a 370c. Uma solução de 60 nM de MCP-1 é também aquecida a 37°C. Diluições de compostos teste são preparadas em 2x a concentração necessária em DMEM. A suspensão de PBMC e a solução de MCP-1 60 nm são misturadas 1:1 em tubos de po- Iipropileno com DMEM pré-aquecido com ou sem uma diluição dos compos- tos teste. Estas misturas são aquecidas em um aquecedor de tubo a 37^0. Para iniciar o ensaio, adicionar a mistura de composto/MCP-1 nas cavidades da placa de 96 cavidades Polifiltronics MPC 96 que foram colocadas na par- te base da câmara de quimiotaxia Neuroprobe. O volume aproximado é 400μΙ para cada cavidade e deve ser a menisco positivo após dispersão. O filtro de 8 mícrons é colocado suavemente no topo da placa de 96 cavida- des, uma gaxeta de borracha é ligada à base da câmara superior, e a câma- ra é montada. Um volume de 200μΙ da suspensão celular/mistura de com- posto é adicionado às cavidades apropriadas da câmara superior. A câmara superior é coberta com um selador de placa, e a unidade montada é coloca- da em um incubador a 37^0 durante 45 minutos. Após incubação, o selador de placa é removido e toda a suspensão celular restante é aspirada. A câ- mara é desmontada e o filtro gentilemente removido. Enquanto que manten- do o filtro em um ângulo de 90 graus, as células não migradas são removi- das utilizando uma corrente suave de salina tamponada por fosfato e o topo do filtro limpo com a ponta de um rodo de borracha. Repetir esta lavagem mais duas vezes. O filtro é secado por ar e em seguida imerso completa- mente em mancha Wright Geimsa durante 45 segundos. O filtro é em segui- da lavado por embebimento em água destilada durante 7 minutos, e em se- guida uma lavagem adicional de 15 segundos em água destilada fresca. O filtro é novamente secado por ar. As células migradas no filtro são quantifi- cadas por microscopia visual.
Receptores de quimiocina humana fornecem um alvo para inter- ferir com ou promover função celular imune em um mamífero, tal como um humano. Compostos que inibem ou promovem função receptora de quimio- cina são particularmente úteis para modular a função celular imune para os propósitos terapêuticos. Consequentemente, a presente invenção está dire- cionada aos compostos que são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas, e imuno- reguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas, infecção po micróbios pa- togênicos (que, por definição, inclui vírus), bem como patologias autoimunes tais como a artrite reumatóide e aterosclerose.
Por exemplo, um presente composto que inibe uma ou mais fun- ções de um receptor de quimiocina de mamífero (por exemplo, um receptor de quimiocina humana) pode ser administrado para inibir (isto é, reduzir ou prevenir) inflamação ou doença infecciosa. Como um resultado, um ou mais processos inflamatórios, tais como emigração de leucócitos, adesão, quimio- taxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação mediado- ra inflamatória, são inibidos.
Similarmente, um presente composto que promove uma ou mais funções do receptor de quimiocina mamífera (por exemplo, uma quimiocina humana) como administrado para estimular (induzir ou realçar) uma resposta imune ou inflamatória, tal como emigração de leucócitos, adhesion, quimio- taxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação mediado- ra inflamatória, resultando na estimulação benéfica de processos inflamató- rios. Por exemplo, eosinófilos podem ser recrutados para combater infec- ções parasíticas. Além disso, o tratamento da doença inflamatória, alérgica e autoimune anteriormente mencionado pode também ser contemplado por um presente composto que promove uma ou mais funções do receptor de quimiocina mamífera se alguém contempla a liberação de composto suficien- te para causar a perda da expressão de receptor em células através da in- dução de internalização de receptor de quimiocina ou a liberação de com- posto de uma maneira que resulta na direção imperfeita da migração de cé- lulas.
Além dos primatas, tais como humanos, uma variedade de ou- tros mamíferos pode ser tratada de acordo com o método da presente in- venção. Por exemplo, mamíferos, incluindo, porém não limitados à, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cachorros, gatos, cbaisas, porcos, ratos ou outras espécies bovinas, ovinas, eqüinas, caninas, felinas, roedores ou murinos podem ser tratados. Entretanto, o método pode também ser praticado em outras espécies, tais como espécies aviárias. O indivíduo tratado nos méto- dos acima é um mamífero, macho ou fêmea, em que a modulação da ativi- dade receptora de quimiocina é desejada. "Modulação" como utilizado aqui destina-se a abranger antagonismo, agonismo, antagonismo parcial e/ou agonismo parcial.
Ensaios Funcionais e de Ligação de CCR5 Derivação celular e Cultura celular: Um agrupamento de células HT1080 es- tavelmente expressando o receptor 5 de quimiocina CC endógena (CCR5) foi desenvolvido utilizando os métodos delineados por Harrington, Sherf, e Rundlett (veja Patentes dos Estados Unidos US 6,361,972 e US 6,410,266).
Os clones de maior expressão foram isolados utilizando citometria de fluxo repetitivo, seguido por sub-clonagem. Estas células foram em seguida cultu- radas em placas de 6 cavidades em células/cavidades de 3 χ 105 e transfec- tadas com um vetor de DNA contendo a proteína G rotulada por HAquiméri- ca Gqi5 (Molecular Devices; 5 microgramas de vetor de DNA Iinearizado em 15 microL de Ex-Gen de Fermentes foram utilizados para a transfecção). Dois dias após a transfecção, as cavidades foram combinadas e semeadas em placas P100. Sete dias após semeadura, as colônias foram furadas, ex- pandidas e analisadas quanto o teor de Gqi5 por macha Western. Um clone (designado como 3559.1.6) tendo expressão elevada de Gqi5 (de transfec- ção) e de CCR5 (endógena) foi selecionado e utilizado para os experimentos descritos abaixo. As células HT1080 (clone 3559.1.6) foram culturadas com com alfa-MEM suplementadas com com 10% de soro bovino fetal dializado, 2% de penicilina/estreptomicina/glutamina, e 500 microgram/mL de higromi- cina B (concentração final) a 37° C com 5% de CO2 em uma atmosfera umi- dificada.
Preparação de Membrana: Uma pélete celular contendo células 1 χ 108 HT1080 (clone 3559.1.6) foi re-suspensa em 5 mL de Tampão Prep de membrana gelado (50 mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2) e
homogeneizada em alta velocidade em um homogeneizador Politron durante 20 secundos em gelo. O homogeneizado foi diluído com mais 25 mL de Tampão Prep de Membrana e centrifugado durante 12 minutos (48,000 χ g a 4°C). A pélete celular foi re-suspensa em 5 mL de Tampão Prep de Mem- brana antes de ser re-homogeneizada como previamente descrita. O homo- geneizado foi diluído com 5 mL de Tampão Prep de Membrana e ensaiado para concentrações de proteína CCR5.
Ensaio de Ligação: O homogeneizado recentemente preparado de uma pre- paração de membrana acima descrito foi diluído em um tampão de ligação (50 mM de HEPES1 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 0.1% de BSA; um ta- blete de inibidro de protease completo foi adicionado antes do ensaio) para obter uma concentração de proteína final de 10 microgramas/cavidade (pla- cas brancas de 96 cavidades sólidas de Corning, Inc.). Esta preparação de membrana foi misturada com contas WGA-SPA (Amerhsam; pré- empregnadas em tampão de Ligação) para fornecer a concentração de 200 microgramas/cavidade. A mistura de membrana /conta SPA b (100 microli- tros/cavidade) foi em seguida adicionada à placa que foi pré-pontilhada com 2 microlitros de DMSO contendo várias concentrações de artigos teste (DM- SO puro para controle negativo; várias concentrações de exemplos desta invenção por artigos teste; 500 nM de MIP-1 beta como um controle positi- vo). O ensaio de ligação foi iniciado através da adição de 50 microlitros de [125I]-MIP-1 beta (Perkin Elmer; material foi diluído em um tampão de ligação tal que a adição de 50 microlitros/cavidade fornece uma concentração final de 0.1 nM [125I]-MIP-1 beta). A placa foi selada e deixada repousar em tem- peratura ambiente durante 4-6 horas antes de ser contada em uma Pac- kard TopCount. A porcentagem de ligação para o artigo teste foi calculada, utilizando controles negativos e positivos para definir a janela para cada ex- perimento.
Ensaio Funcional com Base na Leitora de Placa de Imaqeamento Fluoromé- trico (FLIPFO: células HT1080 (clone 3559.1.6) foram semeadas em 10,000 céluas/cavidades (30 microlitros) em placas de 384 cavidades (base pre- ta/clara Biocoat PDL, Beckton Dickinson) e carregadas com 30 microli- tros/cavidade de tinta fluorescente Fluro-4 AM (preparada dissolvendo 1 mg de Fluro-4 AM em 440 microlitros de DMSO e diluindo com 100 microlitros ode solução plurônica antes de ser diluída também com 10 mL de tampão Hanks). As células foram incubadas a 37° C com 5% de CO2 durante 30 mi- nutos antes de serem lavadas três vezes e suspensas em Tampão de En- saio (20 mM de HEPES, 1,2 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2, 2,5 mM de Pro-
benecide, 0,5% de BSA, 1x Hanks). O artigo teste foi serialmente diluído em DMSO e em seguida diluído 1:10 com Tampão de Ensaio antes de ser adi- cionado às células (10 microlitros/cavidade). Utilizando FLIPR, as placas foram lidas (10-70 segundos) para indução de fluxo (isto é, atividade ago- nista). As células foram em seguida também carregadas com Solução Ago- nista (30 microlitros/cavidade; preparada diluindo-se 30 microlitros de 100 microMolar MIP-1 beta em 100 mL de Tampão de Ensaio; este protocolo libera uma concentração final de 5 nM de MIP-1 beta no ensaio) e as placas foram lidas utilizando FLIPR durante um minuto. A atividade antagonista do artigo teste foi determinada com relação a 0,4% de controle negativo de tampão/DMSO.
Doenças ou condições de humanos ou outras espécies que po- dem ser tratados com inibidores de função receptora de quimiocina, incluem, porém não estão limitados à: condiçoes e doenças alérgicas ou inflamató- rias, incluindo doenças alérgicas respiratórias tais como asma, rinite alérgi- ca, doenças de pulmão de hipersensibilidade, pneumonite de hipersensibili- dade, celulite eosinófila (por exemplo, Síndrome de Well), pneumonias eosi- nófilas (por exemplo, síndrome de Loeffler, pneumonia eosinófila crônica), fascite eosinófila (por exemplo, síndrome de Shulman), hipersensibilidade tipo retardada, doenças pulmonares intersticiais (ILD) (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática, ou ILD associada com artrite reumatóide, lúpus eritema- toso sistêmico, espondilite anquilosantes, esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, polimiosite ou dermatomiosite); anafilaxia sistêmica ou respostas à hipersensibilidade, alergias a fármacos (por exemplo, à penicilina, cefalospo- rinas), síndrome eosinófila-mialgia devido a ingestão de triptofan contamina- do, alergias à picada de inseto; doença autoimune, tal como artrite reumatói- de, artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, mias- tenia grave, diabetes de início juvenil; glomerulonefrite, tiróide autoimune, doença de Behcet; rejeição de enxerto (por exemplo, em transplante), inclu- indo rejeição de aloenxerto ou doença do enxerto versus hospedeiro; doen- ças inflamatórias do intestino, tais como doença de Crohn e colite ulcerativa; espondiloartropatias; escleroderma; psoríase (incluindo psoríase mediada por célua T) e dermatoses inflamatórias tais como uma dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, urticária; vasculite (por e- xemplo, vasculite por hipersensibilidade, necrosante e cutânea); miosite eo- sinófila, fsaciite eosinófila; cânceres com infiltração de leucócito da pele ou órgão. Outras doenças ou condições em que as respostas inflamatórias in- desejáveis devem ser inibidas podem ser tratadas, incluindo, porém não limi- tados à, vasculite, placas vulneráveis, dano de reperfusão de hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de enxerto de diálise, hiperplasia íntima de desvio arterio-venoso, aterosclerose, certas malignidades hemato- lógicas, toxicidade induzida por citocina (por exemplo, choque séptico), poli- miosite, dermatomiosite. Doenças ou condições infecciosas de humanos ou outras espécies que podem ser tratados com inibidores de função receptora de quimiocina, incluem, porém não estão limitados a, HIV.
Doenças ou condições de humanos ou outras espécies que po- dem ser tratados com promotores da função receptora de quimiocina, inclu- em, porém não estão limitados à: imunossuppressão, tal como aquela em indivíduos com síndromes de imunodeficiência tais como AIDS ou outras infecções virais, indivíduos passando por terapia de radiação, quimioterapia, terapia para doena autoimune ou terapia de fármaco (por exemplo, terapia de corticosteróide), que causa imunossupressão; imunossupressão devido à deficiência congênita na função receptora ou outras caudas; e doenças por infecção, tais como doenças parasíticas, incluindo, porém não limitadas à, infecções por helminto, tais como nematódeos (vermes circulares); (Trichuri- asis, Enterobiasis, Ascariasis, Hookworm, Strongyloidiasis, Trichinosis, filari- asis)·, trematódeos (fiukes) (Schistosomiasis, Clonorchiasis), cestódeos (tê- nias) (Echinococcosis, Taeniasis saginata, Cystieereosis)\ vermes vicerais, hemicrânias de larva visceral (por exemplo, Toxoeara), gastroenterite eosi- nófila (por exemplo, Anisaki sp., Phoeanema sp.), hemicrânias de larva cutâ- nea (Aneylostona braziliense, Aneylostoma eaninum). Os compostos da pre- sente invenção são consequentemente úteis na prevenção e tratamento de uma ampla variedade de doenças e distúrbios inflamatórios, infecciosos e imunoreguladores.
Além disso, tratamento da doença inflamatória, alérgica e autoi-
mine anteriormente mencionada pode também ser contemplado por promo- tores da função receptora de quimiocina se alguém contempla a liberação de composto suficiente para causar a perda da expressão em células através da indução de internalização de receptor de quimiocina ou liberação do composto de uma maneira que que resulta na direção imperfeita da migra- ção de células.
Em outro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada para
avaliar os agonistas ou antagonistas específicos putativos de um receptor acoplado à proteína G. A presente invenção é direcionada ao uso destes compostos na preparação e execução de ensaios e avaliação para compos- tos que modulam a atividade dos receptores de quimiocina. Além disso, os compostos desta invenção são úteis ino estabelecimento ou determinação do sítio de ligação de outros compostos aos receptores de quimiocinas, por exemplo, por inibição competitiva ou como uma referência m um ensaio para comparar sua atividade conhecida a um composto com uma atividade des- conhecida. Quando desenvolvem novos ensaios ou protocolos, os compos- tos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para testar sua eficácia. Especialmente, tais compostos podem ser fornecidos em um kit comercial, por exemplo, para uso em pesquisa farmacêutica envolveno as doenças acima mencionadas. Os compostos da presente invenção são tam- bém úteis para a avaliação de moduladores específicos putativos dos recep- tores de quimiocina. Além disso, alguém poderia utilizar os compostos desta invenção para examinar a especificidade de receptores acoplados à proteína G que não são considerados serem receptores de quimiocina, servindo co- mo exemplos de compostos que não ligam-se ou como variantes estruturais de compostos ativos nestes receptores que podem ajudra a definir sítios es- pecíficos de interação.
Compostos descritos aqui são úteis para tratar ou prevenir dis- túrbios selecionados de artrite reumatóide, osteoartrite, choque séptico, ate- rosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, choque hemodinâmi- co, síndrome de sépse, dano de reperfusão pós isquêmica, malária, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, infecção micobacteriana, menin- gite, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, doença fibrótica, caquexia, rejeição de enxerto, doença autoimune, doenças inflamatórias de pele, es- clerose múltipla, dano por radiação, lesão alveolar hiperóxica, HIV, demência por HIV , diabetes melito não dependente de insulina, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, fibrose pulmonar idiopática, penfigóide bulhoso, infecções parasíticas helmínticas, colite alérgica, eczema, conjuntivite, transplante, eosinofilia familiar, celulite eosinófila, pneumonias eosinófilas, fascite eosinó- fila, gastroenterite eosinófila, eosinofilia induzida por fármaco, Síndrome Churg-Strauss, linfoma, doença de Hodgkin, carcinoma colônico, síndrome de Felty, sarcoidose, uveíte, Alzheimer, Glomerulonefrite, e lúpus eritemato- so sistêmico, carcinoma celular escamaso esofágico, dor neuropática, e o- besidade.
Em outro aspecto, os compostos são úteis para tratar ou preve- nir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculare, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, esclerose múltipla, doença autoimune, skin doenças inflamatórias.
Em outro aspecto, os compostos são utilizados para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatóide, osteoar- trite, aterosclerose, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, e esclerose múltipla.
Em outro aspecto, exemplos descritos aqui podem ser úteis para
o tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo, porém não limitados aos seguintes:
carcinoma incluindo aquele da bexiga (incluindo câncer da bexiga metastáti- co e acelerado), mama, cólon, (incluindo câncer colorretal),rim, fígado, pul- mão (incluindo adenocarcinoma pulmonar e câncer pulmonar de célula pe- quena e não pequena), ovário, prostáta, trato genitário, sistema linfático, re- to, laringe, pâncreas (incluindo carcinoma pancreática exócrina), esôfago, estômago, vesícula biliar, cérvix, tiróide, e pele (incluindo carcinoma celular escamoso);
tumores hematopoiéticos de linhagem de linfóide incluindo leucemia, leuce- mia linfócita aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, non-Hodgkin's linfoma de não Hodgkin, Iin- foma de célua capilar, Iinfoma histiocítica, e Iinfoma Burketts; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide incluindo Ieucemias mielóge- nas agudas e crônicas, síndrome mielodisplásica, leucemia mielóide, e leu- cemia promielocítica;
tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astroitoma, neuro- blastoma, glioma, e schwanomas;
tumoresde origem mesenquimal incluindo fibrosarcoma, rabdomioscarcoma, e osteosarcoma; e
outros tumores incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso, ceratoactan- toma, seminoma, câncer folicular da tiróide, e teratocarcinoma.
Em outra modalidade, descrita aqui são os métodos de trata- mento de câncer, em que o câncer é selecionado de câncer de mama, cân- cer de fígado, câncer de próstata, e melanoma. Adicionalmente, compostos descritos aqui são úteis no tratamento de câncer ovariano, e mieloma múlti- pio.
A presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma variedade de doenças proliferativas não cancerígenas.
Terapia combinada para prevenir e tratar doenças e distúrbios inflamatórios, infecciosos e imunoreguladores, incluindo asma e doenças alérgicas, bem como patologias autoimunes tais como artrite reumatóide e aterosclerose, e aquela patologias acima observadas é ilustrada pela combi- nação dos compostos desta invenção e outros compostos que são conheci- dos por tais utilidades. Por exemplo, no tratamento ou prevenção de infla- mação, os presentes compostos podem ser utilizados em conjunção com um agente antiinflamatório ou analgésico tais como um agonista de opiato, um inibidor de lipoxigenase, um inibidor de ciclooxigenase-2, um inibidor de in- terleucina, tal como um inibidor de interleucina-1, um inibidor de fator de ne- crose de tumor, um antagonista de NMDA, um inibidor ou oxido nítrico ou um inibidor da síntese de óxido nítrico, um agente antiinflamatório não estereoi- dal, um inibidor de fosfodiesterase, ou um agente antiinflamatório supressor de citocina, por exemplo, com um composto tal como acetaminofeno, aspiri- na, codeína, fentainil, ibuprofen, indometacina, cetorolac, morfina, naproxen, fenacetina, piroxican, um analgésico esteroidal, sufentanila, sunlindac, alfa interferem e similares. Similarmente, os presentes compostos podem ser administrados com um aliviador de dor; um potenciador tal como cafeína, um antagonista de H2, simeticona, hidróxido de alumínio ou magnésio; um des- congestionante tal como fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudofedrina, oxi- metazolina, efinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilhexedrina, ou Ievo- desoxi-efedrina; e antitussígeno tal como codeína, hidrocodona, caramifen, carbetapentano, ou dextrametorfan; um diurético; e um anti-histamina sedan- te e não sedante. Igualmente, compostos descritos aqui podem ser utilizados em combinação com outros fármacos que são utilizados no tratamen- to/prevenção/supressão ou melhora das doenças ou condições para as quais os compostos da presente invenção são úteis. Tais outros fármacos podem ser administrados, por rotina e em uma quantidade comumente utili- zada, portanto, contemporaneamente ou seqüencialmente com um compos- to da presente invenção. Quando a composto é utilizado contemporanea- mente com um ou mais outros fármacos, uma composição farmacêutica con- tendo tais outros fármacos além do composto da presente invenção podem ser utilizados. Consequentemente, as composições farmacêuticas incluem aqueles que também contêm um ou mais outros ingredientes ativos, além de um composto da presente descrição.
Exemplos de outros ingredientes ativos que podem ser combi- nados com um composto da presente invenção, administrados separada- mente ou nas mesmas composições farmacêuticas, incluem, porém não es- tão limitados a: (a) antagonistas de integrina tais como aqueles para selecti- nas, ICAMs e VLA-4; (b) esteróides tais como beclometasona, metilpredniso- lona, betametasona, prednisona, dexametasona, e hidrocortisona; (c) imu- nossupressores tais como ciclosporina, tacrolimos, rapamicina e outros imu- nossupressores tipo FK-506; (d) anti-histaminas (antagonistas de H1- histamina) tais como bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, triprolidina, clemastina, difenhidramina, difenilpiralina, tripelennamina, hidro- xizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, ciproheptadina, antazolina, feniramina pirilamina, astemizol, terfenadina, loratadina, cetirizi- na, fexofenadina, descarboetoxiloratadina, e similares; (e) anti-asmáticos não esteroidais tais como b2-agonists (terbutalina, metaproterenol, fenoterol, isoetarina, albuteral, bitolterol, e pirbuterol), teofilina, sódio de cromolin, atro- pina, brometo de ipratrópio, antagonistas de Ieucotrieno (zafirlukast, monte- lukast, pranlukast, iralukast, pobilukast, SKB-102,203), inibidores de biossín- tese de Ieucotrieno (zileuton, BAY-1005); (f) agentes antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDs) tais como derivados de ácido propiônico (alminoprofen, benxaprofen, ácido buclóxico, carprofen, fenbufen, fenoprofen, fluprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indoprofen, cetoprofen, miroprofen, naproxen, oxa- prozin, pirprofen, pranoprofen, suprofen, ácido tiaprofênico, e tioxaprofen), derivados de ácido acético (indometacin, acemetacin, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, fenclozic acid, fentiazac, furofenac, ibufenac, isoxe- pac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmetin, zidometacin, e zomepirac), deriva- dos de ácido fenâmicos (ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido me- fenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcar- boxílico (diflunisal e flufenisal), oxicanos (isoxican, piroxican, sudoxican e tenoxican), salicilatos (ácido salicílico de acetila, sulfasalazina) e as pirazo- Ionas (apazona, bezpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona); (g) inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2); (h) inibidores de fosfodiesterase tipo IV (PDE-IV); (i) outros antagonistas dos receptores de quimiocina; (j) agentes de diminuição de colesterol tais como inibidores de HMG-COA reductase (lovastatin, simvastatin e pravastatin, fluvastatin, atorv- satatin, e outras estatinas), sequestrantes (colestiramina e colestipol), ácido nicotônico, derivados de ácido fenofíbrico (genfibrozil, clofibrat, fenofibrato e benzafibrato), e probucol; (k) agentes anti-diabéticos tais como insulina, sul- foniluréias, biguanidas (metformin), inibidores a-glicosidase (acarbose) e gli- tazonas (troglitazona e pioglitazona); (I) preparações de interferons (interfe- ron alfa-2a, interferon-2B, interferon alfa-N3, interferon beta-1a, interferon beta-1b, interferon gama-1b); (m) compostos antivirais tais como efavirenz, nevirapina, indinavir, ganciclovir, lamivudina, famciclovir, e zalcitabina; (o) outros compostos tais como ácido 5-aminossalicílico umpró-fármacos des- tes, antimetabólitostais como azatioprina e 6-mercaptopurina, e agentes quimioterapêuticos de câncer citotóxicos. A taxa de peso do composto da presente invenção para o segundo ingrediente ativo pode ser variada e de- penderá das doses eficazes de cada ingrediente.
Geralmente, uma dose eficaz de cada sera utilizada. Desse mo- do, por exemplo, quando a composto for combinado com um NSAID a taxa de peso do composto da presente invenção para NSAID geralmente variará de cerca de 1000:1 a cerca de 1:1000, ou alternativamente de cerca de 200:1 a cerca de 1:200. Combinações de um composto da presente inven- ção e outros ingredientes ativos geralmente também estarão na faixa anteri- ormente mencionadas, porém em cada caso, uma dose eficaz de cada in- grediente ativo deve ser utilizada.
No tratamento de câncer, uma combinação de agentes quimiote- rapêuticos e/ou outros tratamentos (por exemplo, terapia por radiação) é fre- qüentemente vantajoso. O segundo (ou terceiro) agente pode ter mecanismo igual ou diferente de ação do que o primeiro agente terapêutico. Pode ser especialmente útil empregar combinações de fármacos citotóxicos em que os dois ou mais fármacos que estão sendo administrados ajam de diferentes maneiras ou em diferentes fases do ciclo celular, e/ou em que os dois ou mais fármacos tenham sobreposição de toxicidades ou efeitos colaterais, e/ou em que os fármacos que estão sendo combinados cada qual tenha um eficácia demonstrada no tratamento do particular estado de doença manifes- tado pelo paciente.
Consequentemente, compostos descritos aqui (ou outras fórmu- las descritas aqui) podem ser administrados em combinação com outros tra- tamentos e agentes citotóxicos e anti-câncer úteis no tratamento de câncer ou outras doenças proliferativas. A invenção aqui também comprende o uso dos compostos aqui (ou outras fórmulas descritas aqui), na preparação de medicamentos para o tratamento de câncer, e/ou compreende a embalagem dos compostos inclusos juntamente com as instruções de que os compostos são utilizados em combinação com outros tratamentos e agentes anti-câncer ou citotóxicos para o tratamento de câncer. A presente invenção também compreende combinações dos compostos de um ou mais agentes adicionais em forma de kit, por exemplo, em que eles são embalados juntamente ou colocados em embalagens separadas a serem vendidas como um kit, ou em que eles são embalados para serem formulados juntos.
O segundo (ou mais) agente anti-câncer pode ser selecionado de qualquer um ou mais dos seguintes:
Agentes de aquilação (incluindo mostardas de nitrogênio, sulfonatos de al- quila, nitrossouréias, derivados de etilenimina, e triazenos); anti- angiogênicos (incluindo inibidores de metaloproteinase matriz); antimetabóli- tos (incluindo inibidores de adenosina deaminase, antagonistas de ácido fóli- co, análogos de purina, e análogos de pirimidina); antibióticos ou anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos CTLA-4, antraciclinas); inibido- res de aromatase;
Modificadores de ciclo celular; enzimas; inibidores de farnesil proteína trans- ferase;
Agentes hormonais e anti-hormonais e esteróides (incluindo análogos sinté- ticos, glicocorticóides, estrogênios/anti-estrogênios [por exemplo, SERMs], androgênios/anti-androgênios, progestinas, agonistas receptores de proges- terona, e agonistas e antagonistas de liberação de hormônio Iuteinizante [L- HRH]); moduladores de sistema de fator de crescimento tipo insulina (IGF)/receptor de fator de crescimento tipo insulina (IGFR) (incluindo inibido- res de IGFR1); inibidores de sinalização de integrina; inibdores de cinase (incluindo inibidores de múltiplas cinases e/ou inibidores de Src cinase ou Src/abl, inibidores de cinase dependente de ciclina [CDK], anticorpos pa- nHer, Her-1 e Her-2, inibidores de VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF, inibidores de EGFR, inibidores de proteína ativada por mitógeno [MAP], ini- bidores de MEK, inibidores de Aurora cinase, inibidores de PDGF, e outros inibidores de tirosina cinase ou inibidores de serina /treonina; agentes disruptores de microtúbulo, tais como ecteinascidinas ou seus aná- logos e derivados; agentes estabilizantes de microtúbulo tais como taxanos, e as epotilonas de ocorrência natual e seus análogos sintéticos e semi- sintéticos;
agentes desestabilizantes, de ligação de microtúbulo (incluindo alcalóides de vinca); e
inibidores de topoisomerase; inibidores de prenil proteína transferase; com- plexos de coordenação de platina; inibidores de trandução de sinal; e outro- as agentes utilizados como anti-câncer e citotóxicos tais como modificadores de resposta biológica, fatoers de cerscimento e moduladores imunes.
Adicionalmente, os compostos da presente invenção podem ser formulados ou co-administrados com outros agentes terapêuticos que são selecionados por sua utilidade particular no tratamento de efeitos colaterias associados com as condições anteriormente mencionadas. Por exemplo, compostos da invenção podem ser formulados com agentes para prevenir náusea, hipersensibilidade e irritação gástrica, tais como antieméticos, e Hi e H2 anti-histamínicos.
Os outros agentes terapêuticos acima, quando empregados em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser utilizados, por exemplo, naquelas quantidades indicadas na Physicians' Desk Reference (PDR) ou como de outro modo determinado alguém versado na técnica.
Os compostos são administrados a um mamífero em uma quan- tidade terapeuticamente eficaz. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entende-se uma quantidade de um composto da presente descrição que, quando administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional a um mamífero, é eficaz para prevenir ou melhorar a condição da doença ou a progressão da doença. DOSAGEM E FORMULAÇÃO
Os compostos desta descrição podem ser administrados em tais formas de dosagem oral como comprimidos, cápsulas (cada dos quais inclui formulações de liberação sustentada ou liberação com o tempo), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões. Eles po- dem também ser administrados em forma intravenosa (bolo ou infusão), in- traperitoneal, subcutânes, ou intramuscular, todas utilizando formas de do- sagem bem conhecidas por aqueles versados na técnica nas técnicas far- macêuticas. Eles podem ser administrados sozinhos, porém, geralmente serão administrados com um veículo farmacêutico selecionado com base na rotina escolhida de administração e prática farmacêutica padrão.
O regime de dosagem para os compostos da presente invenção, evidente, variará dependendo de fatores conhecidos, tais como as caracte- rísticas farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e rotina de admi- nistração; das espécies, idade, sexo, saúde, condição médica, e peso do receptor; da natureza e extensão dos sintomas; a espécie de tratamento concorrente; da freqüência de tratamento; da rotina de adminsitração, da função renal e hepática do paciente, e do efeito desejado. Um médico ou veterinário pode determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerido para prevenir, conter, ou interromper o progresso do distúrbio.
Por meio de orientação geral, a dosagem oral diária de cada in- grediente ativo, quando utilizado para os efeitos indicados, variará entre cer- ca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, ou entre cerca de 0.01 a 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou alternativamente, entre cerca de 1,0 a 20 mg/kg/dia. Intravenosamente, as doses variarão de cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg/minuto durante uma infusão de taxa constante. Os compostos desta invenção podem ser administrados em dose diária única, ou a dosagem diá- ria total pode ser administrada em doses divididas de duas, três, ou quatro vezes ao dia. Em uma modalidade, a dosagem oral diária do ingrediente ati- vo está entre 3 e 600 mg administrada uma vez diariamente ou em doses divididas administradas duas vezes ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado em doses de 10-20 mg administradas duas ve- zes ao dia ou 40 a 100 mg administradas uma vez diariamente. Alternativa- mente, o ingrediente ativo pode ser administrado em doses de 12,5 mg duas vezes ao dia ou 75 mg uma vez ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrados em doses de 3, 10, 30, 100, 300, e 600 mg adminis- tradas uma ou duas vezes ao dia.
Os compostos desta invenção podem ser administrados em for- ma intranasal por meio de uso tópico de veículos intranasais adequados, ou por meio de rotinas transdérmicas, utilizando emplastros de pele transdérmi- cos. Quando administrados na forma de um sistema de liberação transdér- mica, a administração da dosagem, evidente, será contínua em vez de inte- mitente por todo o regime de dosagem.
Os compostos são tipicamente administrados em mistura com veículos, excipientes, ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis (coletiva- mente referidos aqui como veículos farmacêuticos) adequadamente selecio- nados com respeito à forma pretendida de administração, isto é, xaropes, elixires, cápsulas, comprimidos orais e similares, e consistentes com as prá- ticas farmacêuticas convencionais.
Por exemplo, para adminsitração oral na forma de um comprimi- do ou cápsula, o componente de fármaco ativo pode ser combinado com um veículo inerte oral, não tóxico farmaceuticamente aceitável tal como lactose, amido, sacarose, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e similares; para administração oral em forma líquida, os componentes de fármaco podem ser combinados com quaisquer veículos inertes orais, não tóxicos farmaceuticamente aceitá- veis tais como etanol, glicerol, água, e similares. Além disso, quando dese- jado ou necessário, aglutinantes adequados, lubrificantes, agentes desinte- grantes, e agentes de coloração podem também ser incorporados na mistu- ra. Aglutinates adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais tais como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas sintéticas e natu- rais tais como acácia, tragacanto, ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno glicol, ceras, e similares. Lubrificantes utilizados nestas formas de dosage incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, e similares. Desinte- gradores incluem, sem limitação, amido, metil celulose, ágar, bentonita, go- ma xantano, e similares.
Os compostos da presente invenção podem também ser admi- nistrados na forma de sistemas de liberação de lipossoma, tais como vesícu- Ias unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes, e vesículas mul- tilamelares. Os Iipossomas podem ser formados de uma variedade de fosfo- lipídeos, tais como colesterol, estearilamina, ou fosfatidilcolinas.
Os compostos da presente invenção podem também ser acopla- dos com polímeros solúveis como veículos de fármacos alvejáveis. Tais po- límeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poliidroxipro- pilmetacrilamida-fenol, poliidroxietilaspartamidafenol, ou polietilenoóxido- polilisina substituída com resíduos de palmitoíla. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros bio- degradáveis úteis na obtenção de liberação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido polilácti- co e poliglicólico, caprolactona de poliepsilon, ácido butírico de poliidróxi, poliortoésteres, poliacetaiss, polidiidropiranos, policianoacilatos, e copolíme- ros de bloco reticulado ou antipático de hidrogéis. Formas de dosagem (composições farmacêuticas) adequadas
para administração podem conter de cerca de 1 miligrama a cerca de 100 miligramas de ingrediente ativo por unidade de dosagem. Nestas composi- ções farmacêuticas o ingrediente ativo ordinariamente estará presente emu ma quantidade de cerca de 0,5-95% por peso com base no peso total da composição.
Cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente ativo e veícu- los em pó, tais como lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico e similares. Diluentes similares podem ser utiliza- dos para fazer os comprimidos prensados. Tanto comprimidos quanto cáp- sulas podem ser fabricados como produtos de liberação sustentada para prover liberação contínua de medicamento durante um período de horas. Os comprimidos prensados podem ser revestidos por açúcar ou revestidos por película para mascarar qualquer sabor desagradável e proteger o comprimi- do da atmosfera, ou revestidos entericamente para desintegração seletiva no trato gastrointestinal.
Formas de dosagem líquida para adminsitração oral podem con- ter colorantes e aromatizantes para aumentar a aceitação do paciente.
Em geral, água, um óleo adequado, salina, dextrose aquosa (gli- cose), e soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propilene glicol ou polietileno glicóis são veículos adequados para soluções parenterais. So- luções para administração parenterais podem conter um sal solúvel em água do ingrediente ativo, agentes estabilizantes adequados, e se necessário, substâncias de tampão. Agentes antioxidantes tais como bissulfeto de sódio, sulfeto de sódio, ou ácido ascórbico, sozinhos ou combinados, são agentes estabilizantes adequados. Também utilizados aqui são áciso cítrico e seus sais e EDTA de sódio. Além disso, soluções parenterais podem conter pre- servativos, tais como cloreto de benzalcônio, metil- ou propil-parabeno, e clorobutanol.
Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, um texto de refe- rência padrão neste campo. Formas de dosagem farmacêuticas úteis representativas para a
admininistração dos compostos desta invenção podem ser ilustradas como segue: Cápsulas
Um grande número de unidades de cápsulas pode ser prepara- do carregando-se as cápsulas de gelatin dura de duas partes padrão cada qual com 100 miligramas de ingrediente ativo em pó, 150 miligramas de Iac- tose, 50 miligramas de celulose, e 6 miligramas de estearato de magnésio. Cápsulas de gelatina Mole
A mistura de ingrediente ativo em um óleo digerível tal como ó- Ieo de soja, óleo de semente de algodão ou azeite de oliva pode ser prepa- rada e injetada por meios de uma bomba de remoção positiva na gelativa para formar cápsulas de gelatina mole 100 miligramas do ingrediente ativo. As cápsulas devem ser lavadas e secadas. Comprimidoss
Os comprimidos podem ser peraparados por procedimentos con-
vencionais a fim que de que a unidade de dosagem seja é 100 miligramas de ingrediente ativo, 0,2 miligramas de dióxido de silício coloidal, 5 miligra- mas de estearato de magnésio, 275 miligramas de celulose microcristalina, 11 miligramas de amido e 98,8 miligramas de lactose. Revestimentos apro- priados podem ser aplicados para aumentar a palatabilidade ou retardar a absorção. Injetável Uma composição parenteral adequada para administração por injeção pode ser preparada agitando 1,5% por peso do ingrediente ativo em 10% por volume de propileno glicol e água. A solução deve torna-se isotôni- ca com cloreto de sódio esterilizado.
Suspensão
Uma suspensão aquosa pode ser preparada para administração oral a fim de que cada 5 ml_ contenha 100 mg de ingrediente ativo finamente dividido, 200 mg de carboximetil celulose de sódio, 5 mg de benzoato de sódio, 1,0 g de solução de sorbitol, U.S.P., e 0,025 mL de vanilina. Onde compostos desta invenção são combinados com outros
agentes anticoagulantes, por exemplo, uma dosagem diária pode ser de cer- ca de 0,1 a 100 miligramas do composto de fórmula I e cerca de 1 a 7,5 mili- gramas do segundo anticoagulante, por quilograma do peso corporal do pa- ciente. Para um forma de dosagem de comprimido, os compostos desta in- venção geralmente podem estar presentes em uma quantidade de cerca de a 10 miligramas por unidade de dosagemt, e o segundo anticoagulante em uma quantidade de cerca de 1 a 5 miligramas por unidade de dosagem.
Onde dois ou mais dos segundos agentes terapêuticos anterio- res são administrados com o composto dos exemplos, geralmente a quanti- dade de cada componente em uma dosagem diária típica e forma de dosa- gem típica podem ser reduzidas com relação à dosagem usual do agente quando administrado sozinho, em vista do efeito sinérgico ou aditivo dos a- gentes terapêuticos quando administrados em combinação.
Particularmente quando fornecidos como uma unidade de dosa- gem unitária, o potencial existe para uma interação química entre os ingredi- entes ativos combinados. Por esta razão, quando o composto dos exemplos e um segundo agente terapêutico são combinados e uma unidade de dosa- gem única eles são formulados tal que todos os ingredientes ativos sejam combinados em uma unidade de dosagem única, o contato físico entre os ingredientes ativos é minimizado (isto é, reduzido). Por exemplo, um ingredi- ente ativo pode ser revestido por entérico. Por revestimento entérico um dos ingredientes ativos, é possível não apenas minimizar o contato entre os in- gredientes ativos combinados, porém também, é possível controlar a libera- ção de um destes componentes no trato gastrointestinal tal que um destes componentes não seja liberado no estômago, porém de preferência seja li- berado nos intestinos. Um dos ingredientes ativos pode também ser revesti- do com um material que realiza uma liberação sustentada por todo o trato gastrointestinal e também serve para minimizar o contato físico entre os in- gredientes ativos combinados. Além disso, o componente de liberação sus- tentada pode ser adicionalmente revestido por entérico tal que a liberação deste componente ocorra apenas no intestino. Ainda outro método pode en- volver a formulação de um produto de combinação em que um componente é revestido com um polímero de liberação entérica e/ou sustentada, e o ou- tro componente é também revestido com um polímero tal como um baixo grau de viscosidade de hidroxipropil metilcelulose (HPMC) ou outros materi- ais como conhecidos na técnica, a fim de também separar os componentes ativos. O revestimento polímero serve para formar uma barreira adicional para interação com os outros componentes.
Este bem como outros modos de minimizar o contato entre os componentes de produtos de combinação da presente invenção seja admi- nistrados em uma forma de dosagem úncia ou administrados em formas se- paradas, porém no mesmo tempo pelo mesmo modo, será facilmente visível para aqueles versados na técnica, uma vez em concordância com a presen- te descrição.
Adicionalmente, certos compostos descritos aqui podem ser Ci- teis como metabólitos de outros compostos. Portanto, em uma modalidade, os compostos podem ser úteis como um composto substancialmente puro, que podem também em seguida ser incorporados em uma composição far- macêutica, ou podem ser úteis como metabólito que é gerado após a admi- ninistração do pró-fármaco daquele composto. Em uma modalidade, um composto pode ser útil como um metabólito por ser útil para tratamento de distúrbios como descrito aqui.
"Substancialmente puro" como utilizado aqui destina-se a incluir um composto tendo uma pureza maior do que cerca de 90 por cento de pe- so, incluindo cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, e 100 por cento.
Como um exemplo, um composto descrito aqui pode ser subs- tancialmente puro em ter uma pureza maior do que cerca de 90 por cento (por peso), em que o restante menos do que cerca de 10 por cento do mate- rial compreende outro metabólito do composto, um pró-fármaco do compos- to, e/ou reação e/ou processando impurezas originando-se de sua prepara- ção.
Obviamente, numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis levando em consideração os ensinamentos acima. Deve-se, portanto, entender que no escopo das reivindicações anexas, a invenção pode ser de outro modo praticado tal como especialmente descrito aqui.
ENSAIOS E EFICÁCIA EM VIVO
N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida (também referido como "Exemplo 1") foi avaliado nos seguintes ensaios em vivo como descrito abaixo.
Seção 1. Modelo de desafio de MCP-1 intradérmico (ID) em camundon- gos cinomolgus Métodos
Injeção intradérmica de MCP-1 resulta na infiltração de células mononucleares no sítio de injeção. Este modelo foi inicialmente desenvolvi- do para avaliar o efeito inibidor de Antagonistas de CCR2 sobre a infiltração de células mononucleares no tecido de pele injetadas com MCP-1 humana. Como descrito abaixo, cada macaco foi dosado com Exemplo 1
ou seu controle de veículo (0,5% [peso/volume] carboximetilcelulose) uma vez ao dia durante três dias. Imediatamente após a dosagem no Dia 3, todos os animais receberam pelo menos 2 injeções intradérmicas de 10 μg (50 μLyinjeção ) de MCP-1 humana (R & D Systems) e pelo menos 2 injeções intradérmicas de seu controle de DPBS (50 μΙ/injeção) em sítios separados no tórax dorsal. Biópsias dérmicas de todos os sítios foram obtidas em apro- ximadamente 18 horas seguindo desafio com MCP-1 (ou DPBS). As bióp- sias foram processadas para avaliação histológica semi-quantitativa. Seções representativas de amostras de pele foram examinadas por microscopia de luz , lesões microscópicas e infiltrção celular foram observadas, e suas inci- dências foram tabuladas.
No Estudo 1, O Exemplo 1 foi oralmente administrado em doses
de O, 6.5, 13, ou 26 mg/kg a grupos de 3 macacos cinomolgus (1 ou 2 por sexo por grupo). No Estudo 2, animais não submetidos a tratamento foram utilizados para avaliar o Exemplo 1 a O-, 10-, ou 30-mg/kg de doses em gru- pos de 2 ou 4 animais (1/sexo para grupo dosado com o veículo; 2/sexo para grupo dosado pelo Exemplo 1).
Para ambos os estudos, em adição à análise de biópsia, sangue foi coletado e avaliado quanto as contagens de sangue completas e diferen- ciais celulares . Foram também avaliadas amostras de plasma quanto às concentrações de composto, e amostras de soro quanto aos níveis de medi- ador inflamatório sistêmico. Resultados
No primeiro estudo, Recrutamento induzido por MCP-1, de célu- las mononucleares para a pele de animais de controle tratados com o veícu- lo foi 2.7 ± 0.3 (em uma escala de 0 a 4, Tabela 13). Em 26 mg/kg, o Exem- pio 1 inibiu a infiltração (56%). As duas doses menores de 13 e 6,5 mg/kg obtiveram níveis menores de inibição. O composto também inibiu a infiltra- ção de outros tipos celulares tais como eosinófilos e neutrófilos. As concen- trações de plasma do composto em 18 horas e sua ligação a níveis de inibi- ção e Valores IC90 de Cyno quimiotaxia são sumariados na Tabela 13. Dois métodos foram utilizados para determinar a potência inibi-
dora de Exemplo 1 no ensaio de quimiotaxia em vitro. O primeiro emprega PBMC de macaco enquanto o segundo utiliza células L1,2 estavelmente transfectadas com Cyno CCR2. O primeiro foi descoberto ser ligeiramente variável (IC50 = 5,5 ± 10 nM), o segundo forneceu um valor médio maior, porem foi mais consistente (IC50 = 11,4 ± 8 nM). Com base neste segundo valor, a dose de 26 mg/kg resultou em uma concentração de plasma livre em 18 horas após a dosagem de 2X a IC90 de quimiotaxia (Tabela 13). co
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Ln Um segundo estudo foi realizado em macacos não submetidos a tratamento. Comparado com o primeiro estudo, o Exemplo 1 inibiu infiltração de célula mononuclear em um maior grau (91%) a 30 mg/kg (high dose) e forneceu inibição de 87% a 10 mg/kg (Tabela 14). Ui
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ID Em ambos os estudos, avaliação de alterações em mediadores inflamatórios de soro mostrou um aumento (~3-vezes) em nível de MCP-1 nos grupos tratados com o Exemplo 1 com relação ao controle de veículo. Além disso, análise de contagem de sangue completa (CBC) mostrou um aumento (~3-vezes) em neutrófilos nos grupos tratados com o Exemplo 1 com relação ao controle de veículo.
Um estudo de camundongo hCCR2 Kl foi conduzido para avaliar o efeito de Exemplo 1 em infiltração de monócito/macrófago em modelo de peritonite de tioglicolato (TG) com metodologis com base em contagem de diferencial celular e com base em citometria de fluxo.
Seção 2. Caracterização de camundongo de CCR2 Knockin (hCCR2KI)
humano
Métodos
O camundongo hCCR2 Kl foi geneticamente construído substitu- indo o gene CCR2 de camundongo seqüência de codificação CCR2 huma- na. O camundongo foi obtido do Gladstone Institute of Cardiovascular Disea- ses na University of Califórnia San Francisco.
Métodos PCR Padrão (quantitativos e específicos de gene) fo- ram utilizados para distinguir o tipo silvestre (gene CCR2 de camundongo) de alelos alvejados (gene CCR2 humano) e para determinar o número de cópias de gene CCR2 humano e gene CCR2 de número de cópias de ca- mundongo com amostras da orelha ou rabo. Análise de RT-PCR de RNA total isolado de leucócito do sangue foi também conduzida para determinar o nível de expressão de RNA de CCR2 humano e camundongo. Análise de citometria de fluxo foi utilizada para determinar a expressão de superfície de proteínas CCR2 humanas ou de camundongo em monócitos do sangue. A análise FACS de acúmulo de monócito/macrófago na cavidade peritoneal em Modelos de peritonite induzidos por TG (veja Seção 3) foi utilizada para determinar a funcionalidade de CCR2 humanonestes camundongos. Resultados
O camundongo hCCR2 Kl foi geneticamente construído substitu- indo o gene CCR2 de camundongo seqüência de codificação CCR2 huma- na. Antes do uso destes animais para avaliação in vivo de Exemplo 1, carac- terização tanto genotípica quanto fenotípica destes camundongos foi condu- zida. Estudos genotípicos com base em PCR (quantitativo e específica do gene) das amostras da orelha ou rabo detectaram duas cópias de gene C- CR2 humano e quantidades variáveis de produto PCR sugerindo a presença de 0 a 2 cópias do gene CCR2 de camundongo. Com RNA celular total iso- lado de leucócitos de sangue destes camundongos Kl, a análise de RT-PCR quantitativa relativa detectou MRNA humano de CCR2, e níveis marginais de produto PCR com o grupo iniciador designado para detectar mRNA de C- CR2 de camundongo. Quando a análise de citometria de fluxo foi utilizada para detectar a expressão de proteína nos camundongos Kl de CCR2, C- CR2 humano, porém não CCR2 de camundongo, a proteína de superfície foi detectada por manchamento isolados de célula de sangue total com anticor- pos CCR2 humano anti-CCR2 específico e CCR2 anti-camundongo, respec- tivamente.
Os antagonistas seletivos de hCCR2 bloqueiam a infiltração de monócito nestes camundongos Kl de hCCR2 , porém não em camundongos do tipo selvagem, quando os níveis de estado constant de plasma abrangem a IC90 para as quimiotaxia de CCR2 humano, porém são abaixo dos níveis requeridos para inibir a quimiotaxia de CCR2 de camundongo. Além disso, em ensaios in vitro que imitam o cenário de Kl de hCCR2 (MCP-1 de ca- mundongo/ CCR2 humano), o Exemplo 1 inibe a ligação de MCP-1 de ca- mundongo a CCR2 humano expressando hPBMCs (IC50 = 2,2 ± 1,2 nM) e quimiotaxia induzida por MCP-1 de camundongo/mediasda por CCR2 hu- mano de células THP-1 (IC50 = 0,6 ± 0,3 nM).
Seção 3. Modelo de peritonite induzida por tioglicolato (TG) 48 horas
em camundongos Kl de hCCR2
Métodos
Os camundongos Kl de hCCR2 (C57BL76-SVJ129) foram injeta- dos intraperitonealmente com 1 ml de tioglicolato (TG) (Hardy Diagnostics). Para cada estudo, oito camundongos machos por grupo foram utilizados. O O Exemplo 1 foi dosado oralmente 1 hora antes da injeção de TG injeção. O veículo utilizando foi de 0.01 N de HCI em água. Quarenta e oito horas após a injeção de TG, lavagens peritoneais foram realizadas por injeção de 5 ml de PBS/10 mM EDTA/10% BSA na cavidade peritoneal.
Para o estudo de peritonite de TG 48 horas, o O Exemplo 1 foi dosado duas vezes ao dia com a primeira dose uma hora antes da injeção de TG injeção. As contagens celulares totais foram obtidas em células isola- das por uma registradora celular. Cytospins foram realizados para determi- nar contagens de leucócito diferencial. As células foram manchadas durante 3 minutos com Wright-Giemsa Stain (Sigma-AIdrich) e em seguida enxagua- das com água desionizada durante 5 minutos. As contagens diferenciais foram calculadas com base em um total de 200 células contadas por amos- tra. O sangue foi também coletado do seio retro-orbital no final de cada es- tudo em EDTA para determinação de concentração de fármaco.
Para análise citométrica de fluxo, células de exudato peritoneal (1x106) foram lavadas uma vez com Tampão de FACS (PBS/0,5% BSA) e ressuspensas em tampão de FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de bloqueio de Fc (BD Pharmingen) sobre gelo durante 15 minutos seguido pela adição dos seguintes anticorpos (BD Pharmingen): Anti-F4/80 conjugado a PE, Anti-Ly6C conjugado a FITC, e Anti-hCCR2 conjugado a Alexa 647. Após 45 minutos sobre gelo, as células foram fixadas por BD Cy- tofix durante 15 minutos sobre gelo, lavados duas vezes com tampão de FACS, e ressuspensas em 200 μΙ tampão de FACS. Eventos celulares (40.000) foram adquiridos para cada amostra e os dados foram analisados utilizando o software FIoJo (TreeStar). Uma porta FSC/SSC foi estabelecida para incluir todos os monócitos (baixo SSC, FSC maior) ao mesmo tempo que excluindo granulócitos da análise. Esta população fechada foi então analisada quanto à expressão de Ly6C (FITC), F4/80 (PE). Os números de monócitos/macrófagos peritoneais foram determinados multiplicando-se as contagens de célula peritoneal total obtidas pela registradora celular e a per- centagem de monócitos/macrófagos identificados por células F4/80+ de ci- tometria de fluxo. Significância estatística de diferenças entre métodos foi analisada utilizando teste t de duas caudas pareadas com a significância estabelecida em valores ρ abaixo de 0,05. Resultados
O Exemplo 1 foi avaliado em modelo de peritonite de TG de ca- mundongo Kl de hCCR2 para determinar sua EC50 na inibição de infiltração de monócito/macrófago. Aos camundongos foi administrado tioglicolato, e dosados oralmente com o Exemplo 1 a 1, 5, ou 25 mg/kg de BID. Quarenta e oito horas após o tratamento com TG, lavagem peritoneal foi obtida para a- nálise de infiltrado celular. Exemplo 1 mostrou uma redução dependente da dose no número de leucócitos peritoneais totais obtido pela registradora ce- Iular (Figura 15). Com base nas contagens de leucócito diferenciais por ava- liação morfológica de amostras de lavagem, o exemplo 1 demonstrou uma inibição dependente da dose de influxo de monócito/macrófago. As doses de 1, 5, 25 mg/kg forneceram uma inibição de 20%, 62% e 69%, respectiva- mente. A inibição estatisticamente significante foi atingida a 5 e 25 mg/kg (Figura 15). Em dois estudos separados, a EC50 média para inibição de infiltração de monócito/macrófago foi estimada ser 3,0 ± 0,9 nM.
O infiltrado de monócito/macrófato recrutado foi também quanti- ficado por citometria de fluxo. Para distinguir entre os monócitos/macrófagos recrutados versus macrófagos e granulócitos residentes, o manchamento de ambos os marcadores de superfície de monócito/macrófago F4/80 e Ly6C foi utilizado para definir o monócito/macrófago recrutado. Uma inibição depen- dente da dose similar em infiltração de monócito/macrófago foi observada por este método com todas as três doses mostrando inibição estatisticamen- te significante (Figura 16). As doses de 1, 5, e 25 mg/kg forneceram uma inibição de 38%, 71% e 86%, respectivamente. Em dois estudos separados, a EC50 média para inibição de infiltração de monócito/macrófago por esta análise foi estimada ser 2,2 ± 0,5 nM.
Para avaliar o nível in vivo de ocupação do receptor pelo Exem- plo 1 no modelo de peritonite de tioglicolato de 48 horas utilizando o camun- dongo knock-in hCCR2, os níveis de plasma de ambos Exemplo 1 e Ligante MCP-1 de CCR2 de camundongo foram medidos. O caveat para esta esti- mativa é que apenas CCR2 e seu maior Iigante MCP-1, foram considerados. A ocupação do receptor de um Iigante na presença de um inibidor competiti- vo é definida pela equação Gaddum:
IRLI = _1_
[R] l + (Kd/[L])(l + [l]/K0
Visto que o Exemplo 1 é um inibidor competitivo de ligação de MCP-1 a CCR2, as quantidades de ambos complexo de receptor de C- CR2/MCP-1 de camundongo e Complexo de receptor de CCR2/Exemplo 1 podem ser determinadas utilizando os níveis de soro de ambos MCP-1 de camundongo e Exemplo 1 não ligado à proteína em plasma. A Kd para liga- ção de MCP-1 de camundongo a hCCR2 é de 0,91 +/- 0,08 nM (n=8) que foi determinado em experimentos de ligação de Iigante de competição frio utili-
zando 125I- MCP -1 humano. A Ki média para a ligação do Exemplo 1 a hC- CR2 é de 1,2 nM. A fração de complexos de receptor MCP-1/CCR2 de ca- mundongo é determinada utilizando a forma da equação descrita acima. Pa- ra determinar a fração de Complexos Exemplol/CCR2 a equação é redefini- da como:
[RI] = 1
[R] l+(Ki/[I])(l + [L]/Kd)
Finalmente, a quantidade de CCR2 livre é determinada de:
[CCR2]tota) = [CCR2]free + [mouse MCP-1/CCR2] + (Example 1/CCR2]
Legenda da fórmula: Free - livre
Mouse - camundongo Exemplo
Como mostrado na Tabela 15, a inibição percentual de infiltração
de monócito/macrófago no peritôneo em 48 horas reflete a percentagem de complexo de receptor de CCR2/Exemplo 1 (Exemplo 1- CCR2 ocupado). Q
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Para estudar o efeito de Exemplo 1 sobre EAE (encefalomielosi- te autoimune experimental) um modelo de esclerose múltipla, 10 camundon- gos por grupo foram utilizados. No dia O, camundongos Hccr2 Kl foram imu- nizados subcutaneamente com um total de 200 μΙ de 300 μg glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) 35-55 (Genemed Synthesis) misturados 1:1 com 300 μg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) (Becton-Dickinson) em adjuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma-AIdrich). No dia 0 (duas horas após a imunização) e no dia 2, os camundongos foram injetados intra- peritonealmente com 100 μΙ de 400 ng de toxina do coqueluche. A classifi- cação clínica começou no dia 10, continuou três vezes por semana durante todo o estudo, e foi baseada em uma escala de 0-5: 0, nenhum sinal de do- ença; 0,5, fraqueza parcial do rabo; 1, rabo flácido ou andar gingado com tonicidade do rabo; 1.5, andar gingado com fraqueza parcial do rabo; 2, an- dar gingado com rabo flácido (ataxia); 2.5 (ataxia com paralisia de membro parcial; 3, paralisia total de um membro; 3.5, paralisia total de um membro com paralisia parcial de um segundo membro; 4, paralisia total de dois membros; 4.5, moribundo; 5, morto. A dosagem oral de Exemplo 1 a 55 mg/kg (BID) foi iniciada no dia 1. Resultados
Em dois dos três estudos conduzidos, o Exemplo 1 significante- mente reduziu a classificação clínica (p < 0.05) (Figura 17). A IC50 é de 2,2 nM para o Exemplo 1 em 125l-ligação de MCP-1 de camundongo a células expressando hCCR2, hPBMCs (imitando o cenário de hCCR2 Kl). Com base neste valor de IC50, as doses de 55 mg/kg resultaram na concentração de gamela de plasma livre de -2-vezes a IC90 de ligação. Avaliação histológi- ca da coluna espinhal no dia 22 did não demonstra uma diferença significan- te em infiltrado celular inflamatório total entre os camundongos tratados com Exemplo 1 versus o veículo. Um infiltrado de neutrófilo marcado foi observa- do em camundongos tratados com o composto.

Claims (15)

1. Composto, N-((1 R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirro^^ ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é uma for- ma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-(isopropil(metil)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
3. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 2, compreendendo a forma N-2.
4. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 3, ca- racterizada por parâmetros de célula unitária substancialmente iguais aos seguintes: Dimensões celulares: a = 11,8427(3) b= 18,1503(7) C= 12,7923(4) α = 90 β = 105,362(2) γ = 90 Grupo de Espaço P21 Moléculas/célula 2 unitária em que o referido cristal está em uma temperatura de cerca de +22°C.
5. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 4, ca- racterizada por um padrão de difração de pó de raio X compreendendo três ou mais de valores 2z (CuKa λ=1,541Á) selecionados de 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0,16.6, 18.2, e 18.8, em uma temperatura de cerca de 22°C.
6. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 5, tam- bémcaracterizada por um padrão de difração de pó de raio X compreenden- do quatro ou mais de valores 2ii (CuKa λ=1.54ΐΑ) selecionado do grupo consistindo em 7.2, 8.7, 9.7, 12.5, 12.8, 13.3, 16.0, 16.6, 18.2, e 18.8, em uma temperatura de cerca de 22°C.
7. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 6, ca- racterizada por coordenadas atômicas fracionais substancialmente como listado na Tabela 7.
8. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 7, ten- do um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 2.
9. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com as reivindicações 1 a 8, e um diluente ou veículo farmaceutica- mente aceitável.
10. Método de tratamento de uma doença em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com as reivindicações 1 a 9, em que a doença é selecionada de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, aciden- te vascular cerebral, dor neuropática, cardiomiopatia isquêmica, psoríase, hipertensão, escleroderma, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardio- vascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças auto- imunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisica- mente ou quimicamente induzido, doença do intestino inflamatória, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite do soro nefrotóxico, glomerulone- frite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, restenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neo- íntima de enxerto de diálise, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, neuropatia de aloenxerto crônica, e câncer.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a doença é selecionada de diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, restenose, e transplante de órgão.
12. Método de acordo com as reivindicações 10 a 11, em que a doença é selecionada de esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn, e diabetes.
13. Processo para a preparação de um composto tendo a Fór- <formula>formula see original document page 170</formula> ou um sal deste, o processo compreendendo: redutivamente aminar um composto de fórmula V com uma amina de fórmu- la NH(R8)(R9)1 para fornecer um composto de fórmula VI, redutivamente a- minar compreendendo as etapas de: (a) adicionar a amina e um agente de desidratação a um composto de fór- mula V em um solvente aprótico em uma temperatura de cerca de~20° a cer- ca de +50 0C para formar o composto de imina/enamina de fórmula Va; <formula>formula see original document page 170</formula> (b) tratar uma solução do composto de imina/enamina de fórmula Va e um catalisador de platina, 5% de Pt/S/C, com uma pressão de gás de hidrogênio para fornecer um composto de éster de fórmula VI; em que: Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de a- mina selecionado de BOC, Cbz1 ou benzila; R4 é C-|-6alquila; e R8 e R9são independentemente hidrogênio ou Ci^alquila.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que: <formula>formula see original document page 170</formula> <formula>formula see original document page 171</formula>
15. Composto selecionado de <formula>formula see original document page 171</formula>
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