BRPI0715521A2

BRPI0715521A2 - mÉtodos, composiÇÕes e artigos de fabricaÇço para contribuir para o tratamento de cÂnceres

Info

Publication number: BRPI0715521A2
Application number: BRPI0715521-2A
Authority: BR
Inventors: Anil Gulati; Guru Reddy; Luigi Lenaz
Original assignee: Spectrum Pharmaceuticals Inc; Univ Illinois
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2013-06-25
Also published as: RU2009107085A; TW200820965A; CN101522186A; NO20090915L; US20130102543A1; KR101507178B1; JP2009545609A; RU2407527C2; EP2046323A2; US8030278B2; HK1129601A1; WO2008016793A3; US20070032422A1; DK2046323T3; WO2008016793A2; ES2402232T3; EP2046323B1; EP2450037A1; IL196825A0; TWI469776B

Abstract

MÉTODOS, COMPOSIÇÕES E ARTIGOS DE FABRICAÇçO PARA CONTRIBUIR PARA O TRATAMENTO DE CÂNCERES. Métodos, composições e artigos de fabricação para contribuir para o tratamento de cânceres, incluindo tumores sólidos, são descritos. Os métodos, composições e artigos de fabricação podem utilizar um agonista endotelina B (ETB) para aumentar o envio e resultando na eficácia de um agente quimioterapêutico.

Description

"MÉTODOS, COMPOSIÇÕES E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO PARA CONTRIBUIR PARA O TRATAMENTO DE CÂNCERES"

Referência cruzada aos pedidos relacionados

O presente pedido reivindica prioridade ao pedido de patente US No. 11/461,961 depositado em 2 de Agosto de 2006, o qual é uma continuação em parte do Pedido de pa- tente US No. 11/360,236 depositado em 22 de Fevereiro de 2006 (que reivindica os benefí- cios dos Pedidos de patentes US provisórios Nos. 60/655,656; 60/655,654; e 60/655,643 todos os quais foram depositados em 22 de Fevereiro de 2005) o qual é uma continuação em parte do pedido de patente US No. 10/691,915 depositado em 23 de Outubro de 2003 que reivindica os benefícios do Pedido de patente US provisório No. 60/420,960, depositado 24 de Outubro de 2002. Os conteúdos de todos os referidos pedidos se encontram aqui in- corporados por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a métodos, composições e artigos de fabricação para contribuir para o tratamento de cânceres incluindo tumores sólidos através da administração de um agonista de endotélio e um agente quimioterapêutico.

Antecedentes da Invenção

O tratamento bem sucedido de cânceres, incluindo tumores sólidos, permanece um objetivo médico ainda não alcançado, apesar do maior entendimento da biologia molecular de células tumorais e da disponibilidade de um maior número de agentes terapêuticos po- tenciais. Por exemplo, a incidência de câncer de mama aumentou substancialmente nos últimos 10 anos, e é a única causa Iiderante de morte para as mulheres de idades de 40 - 49 anos nos Estados Unidos.

Um problema no tratamento de cânceres é que uma dose eficaz de uma grande va- riedade de agentes quimioterapêuticos potenciais é restrita pelos referidos efeitos altamente tóxicos não seletivos dos referidos agentes em tecidos normais. Como um resultado, diver- sos pacientes sofrem dos efeitos colaterais de quimioterapia sem obter os benefícios do tratamento. Por exemplo, o agente quimioterapêutico paclitaxel inibe a proliferação celular e induz a apoptose de células tumorais. A utilidade clínica do paclitaxel foi incrementada, en- tretanto, em virtude de sua toxicidade de limitação de dose incluindo hipersensibilidade, neu- tropenia e neuropatia periférica. Assim, há uma necessidade de desenvolver terapias de câncer mais específicas e menos tóxicas.

O envio direcionado de agentes quimioterapêuticos a tumores pode ser dotado da vantagem de aumentar os benefícios dos agentes quimioterapêuticos ao mesmo tempo em que minimiza seus efeitos tóxicos sistêmicos. O referido envio direcionado pode ainda servir para reduzir a dose necessária dos agentes quimioterapêuticos assim potencialmente redu- zindo os efeitos adversos inaceitáveis dos referidos agentes. Uma forma possível de se al- cançar o envio direcionado dos agentes quimioterapêuticos é de se utilizar as características distintas da vasculatura tumoral.

Tumores maiores do que poucos milímetros de tamanho necessitam de um forne- cimento nutricional constante e, portanto, desenvolvem seu próprio leito vascular e fluxo sangüíneo. Folkman, Câncer Res1 46:467 (1986). Sem nutrição constante a partir dos referi- dos vasos sangüíneos em desenvolvimento, os tumores se tornam hipóxicos e subseqüen- temente morrem. O recrutamento de uma nova vasculatura a partir de vasos sangüíneos pré-existentes é denominado de "angiogênese."

Durante a angiogênese, vasos sangüíneos tumorais se desenvolvem de modo substancialmente diferente a partir da vasculatura normal, e apresentam diferentes proprie- dades. Células epiteliais de uma única camada são os primeiros vasos sangüíneos tumorais rapidamente formados. Os referidos vasos sangüíneos tumorais recém formados não são dotados de uma camada muscular lisa ou de inervação. Tumores também incorporam vasos sangüíneos maduros que são dotados de todas as suas funções autoregulatórias. Mattsson et al., Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Raton, pg. 129 (1979); Reinhold, Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Raton, pg. 115 (1979); Warren, Tumor Blood Circula- tion, CRC Press, Boca Raton, pg. 26 (1979).

O tônus vascular (o grau pelo qual os vasos sangüíneos são dilatados ou constri- tos) é governado por uma série de fatores endógenos incluindo H+, K+, Ca2+, p02, PCO2 e óxido nítrico (NO), assim como outras substâncias regulatórias tais como endotelina (ET-1). Secombe et al., Landes, Austin, pg. 40 (1994); Luscher et al., The endothelium: modulator of cardiovascular function, CRC Press, Boca Raton, pg. 61 (1990). ET-1 contribui significativa- mente para regular o tônus vascular (Yanagisawa et al., Nature, 332:411 (1988)) e investi- gadores mostraram um aumento na expressão de receptores ET1 e ETb em tumores sólidos incluindo carcinomas de mama. Alanen et al., Histopathology, 36:161 (2000); Nelson et al., Câncer Res, 56:663 (1996); Kar et al., Biochem Biophys Res Commun 216:514 (1995); Pa- gotto et al., J Clin Invest, 96:2017 (1995); Yamashita et al., Câncer Res, 52:4046 (1992); Yamashita et al., Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74:363 (1991). Ademais, a estimu- lação dos receptores ETb promove um aumento no suprimento de sangue a tumores através da vasodilatação de vasos sangüíneos tumorais. A presente invenção obtém vantagem des- te fato ao se usar agonistas receptores de ET6 para seletivamente aumentar o fluxo de san- gue a tumores para aumentar o envio direcionado dos agentes quimioterapêuticos.

Sumário da Invenção

A presente invenção está direcionada para a administração de agonistas de endoté- lio e um agente quimioterapêutico para contribuir para o tratamento de cânceres incluindo tumores sólidos. Em particular, tumores são dotados de vasculatura distinta incluindo um maior número de receptores ETb os quais, quando ligados, ocasionam vasodilatação. Pelo fato dos receptores ETb serem vasodilatadores, um agonista receptor de ET6, em combina- ção com um agente quimioterapêutico, é útil no tratamento de um tumor sólido, tal como aqueles encontrados em cânceres de mama. O agonista receptor de ETb pode mais eficien- temente enviar o agente quimioterapêutico a tumores resultando em melhor tratamento.

Especificamente, uma modalidade de acordo com a presente invenção inclui um

método de contribuir para o tratamento de um câncer compreendendo administrar um ago- nista ET6 e um agente quimioterapêutico. Em diversas modalidades dos métodos de acordo com a presente invenção, o agonista ETb e o agente quimioterapêutico podem ser adminis- trados substancialmente simultaneamente ou podem ser administrados em seqüência (com o agente quimioterapêutico administrado antes do agonista ETb ou o agonista ETb adminis- trado antes do agente quimioterapêutico). Em determinadas modalidades de acordo com a presente invenção quando o agonista ETb e o agente quimioterapêutico são administrados substancialmente simultaneamente, os mesmos podem ser administrados como uma com- posição única.

Outra modalidade de acordo com a presente invenção inclui uma composição com-

preendendo um agente quimioterapêutico, um agonista ETb, e um excipiente opcional. Outra modalidade de acordo com a presente invenção inclui um artigo de fabricação que compre- ende uma composição compreendendo um agonista ETb, e informações de instrução dire- cionando a administração da composição com um agente quimioterapêutico para tratar um tumor sólido. Artigos de fabricação de acordo com a presente invenção podem adicional- mente compreender um ou mais agentes quimioterapêuticos. Quando artigos de fabricação de acordo com a presente invenção incluem um ou mais agentes quimioterapêuticos, o ago- nista ETb e o agente quimioterapêutico podem ser parte da mesma composição, podem ser proporcionados como composições separadas, ou ambos. Cânceres que são tratados com os métodos, composições ou artigos de fabricação

de acordo com a presente invenção podem incluir tumores sólidos incluindo, sem limitação, tumores de ovário, tumores de cólon, sarcoma de Karposi, tumores de mama, melanoma, tumores de próstata, meningiomas, tumores de fígado, tumores de filódio de mama e combi- nações dos mesmos.

Agonistas de endotelina B usados de acordo com os métodos, composições ou ar-

tigos de fabricação da presente invenção podem seletivamente aumentar o suprimento de sangue a tumores sólidos assim aumentando o envio dos agentes quimioterapêuticos ao tumor sólido. Agonistas de endotelina B que podem ser usados de acordo com a presente invenção podem incluir, sem limitação, um ou mais do ET-1, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc-[Glu9, Alai 1,15]ET-1 (8-21)), sarafotoxin 56c, [Alai, 3, 11, 15]ET-1, e combinações dos mesmos. Agente quimioterapêutico pode incluir, sem limitação, um ou mais de adriami- cina, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, alfa interferon, beta interferon, gama interferon, interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, 5-fluorouracila, e combinações dos mesmos. Métodos, composições ou artigos de fabrica- ção particulares de acordo com a presente invenção irão incluir IRL1620 como o agonista ETb com um agente quimioterapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em pacli- taxei, doxorubicina, 5-fluorouracila, e combinações dos mesmos.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIGURA 1 mostra o efeito de IRL1620 em mudanças induzidas a paclitaxel em perfusão de tumor;

AS FIGURAS 2A - 2E mostram o efeito de ET-1 em hemodinâmicas sistêmicas de ratos com tumor de mama e livres de câncer;

As FIGURAS 3A - 3B mostram o efeito de ET-1 no fluxo de sangue e resistência vascular regional no tecido de mama de ratos com tumor de mama e livres de câncer;

As FIGURAS 4A - 4C mostram o efeito de ET-1 na perfusão, concentração células sangüíneas móveis (CMBC), e velocidade das células sangüíneas em tecido de mama de ratos com tumor de mama e livres de câncer;

As FIGURAS 5A - 5C mostram o efeito de BQ788 em Mudanças induzidas a ET-1 na perfusão sangüínea, CMBC, e velocidade de células sangüíneas em tecido de mama de ratos com tumor de mama e livres de câncer;

A FIGURA 6 mostra o efeito do veículo ou IRL1620 na farmacocinética plasmática da análise de paclitaxel em ratos normais e que têm tumor conforme determinado por HPLC;

As FIGURAS 7 e 8 mostram o efeito do veículo ou IRL1620 na farmacocinética plasmática de [3H]-paclitaxel conforme determinado por contagem de cintilação líquida;

AS FIGURAS 9A e 9B mostram o efeito de IRL1620 em perfusão de tumor de ma- ma conforme medido por Fluxometria Doppler a Laser; A FIGURA 10 mostra o efeito dependente de tempo da administração de IRL 1620

em concentração de [3H] paclitaxel em tumor e órgãos principais dos ratos que têm tumor de mama;

A FIGURA 11 mostra o percentual de diferença no peso corporal de ratos que têm tumor de mama em comparação com o início do tratamento; A FIGURA 12 mostra o efeito da administração de IRL 1620 no volume de tumor de

ratos que têm tumor de mama;

A FIGURA 13 mostra o efeito da administração de IRL 1620 na progressão, estase e regressão do tumor em ratos que têm tumor de mama;

AS FIGURAS 14A e 14B mostram os efeitos de diferentes doses ou IRL1620 em perfusão de tumor de próstata conforme medido por Fluxometria Doppler a Laser (14A) e o percentual de mudança em perfusão de tumor de próstata a partir da linha basal em seguida da administração de IRL1620(14B); A FIGURA 15 mostra o efeito de IRL1620 na concentração de [14C]-doxorubicina (DOX) em tumor e outros órgãos principais dos ratos que portam tumor de próstata;

A FIGURA 16 mostra o peso corporal (16A); volume de tumor (16B); e peso de tu- mor (16C) dos ratos que portam tumor de próstata em seguida da administração de IRL1620 e DOX;

A FIGURA 17 mostra o peso corporal (17A); volume de tumor (17B); e peso de tu- mor (17C) dos ratos que portam tumor de próstata em seguida da administração de IRL1620 e 5-Fluorouracil (5-FU);

As FIGURAS 18A e 18B mostram o efeito de IRL1620 em perfusão de tumor de melanoma conforme medido por Fluxometria Doppler a Laser (18A) e o percentual de mu- dança in perfusão do tumor de melanoma a partir da linha basal em seguida da administra- ção de IRL1620 (18B);

A FIGURA 19 mostra o efeito de IRL1620 na concentração de [3H]-paclitaxel em tumor e outros órgãos principais de ratos que portam tumor de melanoma. A FIGURA 20 mostra os efeitos de diversas concentrações de IRL 1620 com e sem

radiação no volume de tumor com o tempo. Para objetivos de comparação, o efeito de salina e radiação e no tratamento no volume de tumor é também mostrado.

Descrição Detalhada

I. Definições

Informações de instrução: Como usado aqui, o termo "informações de instrução"

deve significar um material que acompanha um produto farmacêutico que proporciona uma descrição de como administrar o produto, junto com os dados de segurança e eficácia ne- cessários para permitir que o médico, farmacêutico e paciente tomem uma decisão informa- da relativa ao uso do produto. As referidas informações de instrução em geral são observa- das como a "bula" para um produto farmacêutico. As informações de instrução podem vir em diversas formas incluindo, sem limitação, um papel inserido, c.d. rom ou direções a um web site que contém informação relativa ao o produto farmacêutico.

Pródroga: Como usado aqui, o termo "pródroga" deve significar compostos que se transformam rapidamente in vivo em um composto útil na presente invenção, por exemplo, por hidrólise. Uma discussão minuciosa sobre pródrogas é proporcionada em Higuchi et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, da A.C.S.D. Symposium Series, e em Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association e Perga- mon Press, 1987.

Tratar, Tratamento ou Contribuir para o tratamento de: Como usado aqui, os termos "tratar", "tratamento" e "contribuir para o tratamento de deve significar prevenir, retardar o progresso ou desenvolvimento de, retrair, ou eliminar um câncer incluindo um tumor sólido. Como tal, os referidos termos incluem tanto a administração médico terapêutica e/ou profilá- tica, como apropriado.

Substancialmente Simultaneamente: Como usado aqui, o termo "substancialmente simultaneamente" deve significar que duas preparações farmacêuticas (isto é, um agonista ETb e um agente quimioterapêutico) são administradas ao mesmo tempo. De acordo com a referida definição, "mesmo tempo" deve ser entendido como incluindo exatamente simulta- neamente assim como dentro de cerca de dez minutos.

A maioria dos agentes quimioterapêuticos apresentam propriedades citotóxicas que são direcionadas para destruir células de câncer, mas no processo infligem dano considerá- vel aos sistemas fisiológicos normais do corpo. Seria, portanto de grande vantagem se sele- tivamente enviar agente quimioterapêutico a tumores sólidos assim ajudando a evitar os referidos efeitos negativos do tratamento do câncer.

A angioarquitetura dos vasos sangüíneos tumorais é diferente a partir daquela de vasos sangüíneos normais. Carmeliet & Jain, Nature, 407:249 (2000). Portanto, a reativida- de vascular de tumores difere daquela do tecido normal. Por exemplo, a administração de doadores de óxido nítrico, nicotinamida e agonistas de bradiquinina modulam o fluxo de sangue a tumores. Jordan et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48:565 (2000); Fukumura et al., Am J Pathol, 150:713 (1997); Hirst et ai, Br J Radiol, 67: 795 (1994).

Endotelina é uma substância vasoativa que modula o fluxo de sangue e está pre- sente em grandes concentrações em tecidos de carcinoma de mama em comparação com tecido de mama normal (especificamente, endotelina pode estar presente em uma quantida- de de cerca de 12 pg/mg em tecidos de carcinoma de mama em comparação com cerca de 0.12 pg/mg em tecido de mama normal). Kojima et al., Surg Oncol, 4(6):309 (1995); Kurbel et ai, Med Hypotheses, 52(4):329 (1999); Patel et ai, Mol Cell Endocrinol, 126(2):143 (1997); Yamashita et ai, Câncer Res, 52(14):4046 (1992); Yamashita et ai, Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74(3):363 (1991). As endotelinas são uma família de peptídeos cíclicos com 21 amino ácidos, compreendendo três isoformas em mamíferos, ET-1, ET-2 e ET-3. Inoue et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:2863 (1989); Yanagisawa et ai, Nature, 332:411 (1988). As endotelinas exercem seus efeitos ao se ligar a dois receptores de super- fície celular distintos, ETa e ET6. O Receptor ETB se liga a três isótipos de peptídeo com igual afinidade. De modo diferente, o Receptor ETA se liga a ET-1 com maior afinidade do que as outras isoformas. Ambos os receptores pertencem ao sistema receptor acoplado a proteína G e mediam respostas biológicas a partir de uma variedade de estímulos, incluindo fatores de crescimento, polipeptídeos vasoativos, neurotransmissores e hormônios. Ma- saki, J Cardiovasc Pharmacol, 35:S3 (2000); Gulati, Preface. Adv Drug Deliv Rev, 40:129 (2000); Gulati et al., Am J Physiol, 273:H827 (1997); Levin, N Engl J Med, 333:356 (1995). Receptores ETB, um foco da presente invenção, estão presentes em ambas as células en- doteliais (ECs) e células da musculatura lisa vascular (VSMCs) e estão aumentadas em te- cido de câncer de mama (incluindo nos invasivos assim como no tecido de carcinoma de mama ductal e Iobular em seres humanos) quando em comparação com tecido de mama normal. Wulfing et al., Oncol Rep, 11:791 (2004); Wulfing et al., Clin Câncer Res1 9:4125 (2003); Alanen et ai, Histopathology, 36(2): 161 (2000). A endotelina atua nos receptores ETB para produzir dilatação vascular e aumentar o fluxo de sangue ao tecido de tumor de mama. Os receptores ETB que predominam em ECs1 produzem vasodilatação por meio da liberação de fatores tais como prostaciclina e óxido nítrico, de Nucci et ai, Proc Natl Acad Sci USA, 85:9797 (1988). Pelo fato de ET-1 produzir um aumento no fluxo de sangue a tu- mores ao estimular os receptores ETB1 um agonista receptor de ETB pode ser usado para seletivamente aumentar o suprimento de sangue a tumores, assim aumentando o envio di- recionado e resultando na eficácia dos agentes quimioterapêuticos.

Os receptores ETB têm estado presentes, por exemplo e sem limitação, em cânce- res de ovário, miofibroblastos, vasos intratumorais e de tumor de Sarcoma de Karposi, cân- ceres de mama e melanomas. Bagnato et al., Am J Pathol, 158:841 (2001); Alanen et al., Histopathology, 36(2):161 (2000); Bagnato et ai, Câncer Res, 59:720 (1999); Kikuchi et ai, Biochem Biophys Res Comm, 219:734 (1996). Portanto, a administração de um agonista receptor de ETB em combinação com um agente quimioterapêutico pode ser usada para contribuir para o tratamento de tumores sólidos, incluindo, sem limitação, câncer de ovário, carcinoma de cólon, sarcoma de Karposi, câncer de mama, e melanomas. Agonistas ET6 úteis de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação,

ET-1, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc-[Glu9, AIa1115JET-I (8-21)), sarafotoxina 56c, [Ala1,3,11, 15]ET-1, e combinações dos mesmos. [Ala1,3,11,15]ET-1 é um análogo linear de ET-1 no qual as pontes de dissulfeto foram removidas por substituição de Ala por resíduos Cys. Saeki et al., Biochem Biophys Res Commun, 179:286 (1991). BQ3020 e IRL1620 são aná- Iogos sintéticos lineares truncados de ET-1 e são os agonistas sintéticos seletivos mais am- plamente usados. IRL1620 é um análogo de ET- linear cuja estrutura se baseia na extremi- dade terminal carbóxi da ET-1 e apresenta seletividade de 120.000 para os Receptores ETb. Okada & Nishikibe, Cardiovasc Drug Rev, 20:53 (2002); Douglas et al., Br J Pharmacol, 114:1529 (1995). IRL1620 é um agonista ETB potente e altamente seletivo, com evidência sendo reportada desta seletividade para o subtipo de receptor ETB1 em preferência sobre o subtipo ETb2. Brooks et al., J Cardiovasc Pharmacol, 26 Suppl 3:S322 (1995).

Agentes quimioterapêuticos úteis de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, e sem limitação, agentes alquilantes, antimetabólitos, hormônios e antagonistas dos mesmos, radioisótopos, anticorpos, assim como produtos naturais, e combinações dos mesmos. Por exemplo, um agonista ET6 pode ser administrado com antibióticos, tais como doxorubicina e outros análogos de antraciclina, mostardas de nitrogênio, tais como, sem limitação, ciclofosfamida, análogos de pirimidina tais como, sem limitação, 5-fluorouracila, cisplatina, hidróxiuréia, e seus derivados naturais e sintéticos, e semelhante. Como outra exemplo, no caso de tumores mistos, tais como adenocarcinoma da mama, onde os tumores incluem células gonadotropina dependentes e gonadotropina independentes, o agonista ETb pode ser administrado em conjunto com, sem limitação, Ieuprolide ou goserelina (análogos de peptídeo sintético de LH-RH). Exemplos não Iimitantes adicionais dos agentes quimiote- rapêuticos que podem ser usados com a presente invenção incluem adriamicina, camptote- cina, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, interferon (alfa, beta, e/ou gama), interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, e análogos e derivados terapeuti- camente eficazes dos mesmos. Em uma modalidade da presente invenção, um agonista de endotélio é usado em

conjunto com um agente quimioterapêutico para contribuir para o tratamento de um tumor sólido. No referido método, o agonista de endotélio, notavelmente um agonista ET6, aumen- ta o fluxo de sangue para o tumor, que é rico em receptores ETb. O agonista ETb, portanto, proporciona um alvo mais seletivo para o agente quimioterapêutico e aprimora o efeito qui- mioterapêutico do agente.

Teoricamente, mas não contando com isto, os agonistas de endotélio estimulam os receptores ETb para dilatar os vasos sangüíneos tumorais, deste modo aumentando o fluxo de sangue e o envio resultante dos agentes quimioterapêuticos para o tumor. A maior per- fusão de sangue de tumores ocasionada por agonistas de endotélio também aumenta a oxi- genação do tecido. O aprimoramento da oxigenação pode aumentar a ação terapêutica dos agentes quimioterapêuticos. Endotelina também pode ser dotada de propriedades mitogêni- cas. As ações mitogênicas da endotelina podem ajudar a aumentar a ação dos agentes quimioterapêuticos, quando administrados juntos. A ação mitogênica de um agonista de en- dotélio pode aumentar a ação dos agentes quimioterapêuticos ao aprimorar a incorporação dos mesmos em células que se dividem, assim aumentando a sua eficácia.

Quimioterapia é freqüentemente indicada como um adjuvante à cirurgia no trata- mento de um câncer. O objetivo da quimioterapia na questão adjuvante é reduzir o risco de recorrência e aumentar a sobrevivência livre de doença quando o tumor principal tiver sido controlado. A quimioterapia é utilizada como um tratamento adjuvante para um câncer, fre- qüentemente quando a doença é metastática. Um agonista ETB, portanto, é particularmente útil antes ou em seguida de cirurgia no tratamento de um tumor sólido em combinação com quimioterapia.

MODELO DE TUMOR DE MAMA

Exemplo 1. Efeito de IRL1620 e Paclitaxel em perfusão de tumor de mama Os estudos a seguir foram conduzidos para examinar a hemodinâmica sistêmica e

os efeitos dos circuitos regionais de ET-1 em ratos normais e portadores de tumor de mama.

Um modelo de tumor de mama extensamente estudado é o modelo de carcinogê- nese mamária de rato quimicamente induzida, van Zwieten, The rat as animal model in bre- ast câncer research. Martinus Nijhoff Publishers, Boston, pg. 206 (1984); Dao et al., J Natl Câncer Inst, 71:201 (1983); Russo et al., J Natl Câncer Inst, 61:1439 (1978); Huggins et ai., Science, 137 (1962); Huggins et al., Proc Natl Acad Sci USA, 45:1294 (1959). Tumorigênese mamária quimicamente induzida em ratos é o modelo que mais proximamente se assemelha ao câncer humano. Russo et al., Lab Invest, 62:244 (1990). Em termos de arquitetura tissu- lar, a glândula mamária de um rato é comparável àquela de uma mulher humana. A mesma é formada por um epitélio que cobre os dutos e os alvéolos e um estroma, o tecido conectivo que estrutura do referido órgão. Os referidos dois compartimentos estão em contínua intera- ção durante o desenvolvimento embriônico e através da vida adulta. Portanto, o referido modelo experimental autóctone foi selecionado como o modelo nos estudos atualmente descritos como aquele que mais se assemelha ao câncer humano. Id.

A carcinogênese mamária de rato quimicamente induzida tipicamente é alcançada pela administração de 7,12-dimetilbenzeno(a)antraceno (DMBA) ou N-metilnitrosoureia (MNU). Rogers et al., Chemically induced mammary gland tumors in rats: modulation by dietary fat. Alan R. Liss, Inc., New York 255 (1996). Tumors induced by DMBA or MNU have different morphological characteristics. Em particular, os tumores induzidos por MNU são mais localizados na mama e são menos prováveis de apresentar metástases. Macejova et al., Endocr Regul, 35:53 (2001). Portanto, MNU com freqüência é escolhido como o agente químico para a indução específica de tumores de mama em ratos. Os referidos tumores de mama podem ser benignos com fibroadenomas e papilomas, ou os mesmos podem ser ma- lignos, van Zwieten, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, pg. 206 (1984). Os ratos apresen- tam seis pares de glândulas mamárias, uma na região cervical, duas na região torácica, uma na região abdominal, e duas na região ingual. Id.; Astwood et al., Am J Anat, 61 (1937). Ra- tos virgem tratados com MNU desensolveram mais tumores na região torácica do que na região abdominal. Russo etal., Lab Invest, 57:112(1987).

Ratos fêmea Sprague Dawley (Harlan Co., Madison, Wis.) pesando 180 gramas - 200 gramas (g) foram usados. Todos os animais foram alojados, três por gaiola, em um am- biente de temperatura controlada (23 ±1°C), umidade (50 ±10%), e luz artificial (0600-1800 hr). Os animais foram alimentados e receberam água à vontade. Os experimentos foram conduzidos após os animais terem sido aclimatados ao ambiente Por pelo menos quatro dias.

N-metilnitrosoureia (MNU) foi adquirido da Ash Stevens Inc. (Detroit, Mich). IRL1620 e Endotelina-1 (ET-1) foram adquiridos da American Peptide Company Inc. (Sunny- vale, Calif). ET-1 foi dissolvido em 0,1% de albumina.

MNU (50 mg/kg) ou salina (1 ml_/kg) foi administrado por via intraperitoneal (i.p.) aos ratos fêmea Sprague Dawley. Após os tumores terem alcançado cerca de 2 cm - 4 cm de diâmetro, os experimentos de fluxo de sangue foram realizados.

Durante os experimentos de fluxo de sangue, os ratos foram anestesiados com ure- tano (1.5 g/kg, i.p.) (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.), e a veia femoral esquerda recebeu uma cânula (Tubo PE 50, Clay Adams, Parsipanny, N.J.) para administração da droga.

Os animais foram divididos nos grupos a seguir:

Grupo I: Salina + paclitaxel (taxol; 3 mg/kg; 15 minutos após a administração de sa- lina) em ratos normais (N = 4);

Grupo II: IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos após a administra- ção de IRL 1620) em ratos normais (N=4); Grupo III: Salina + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos após a administração de salina)

em ratos que portam tumor (N = 4); e

Grupo IV: IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos após a administra- ção de IRL 1620) em ratos que portam tumor (N = 4).

A perfusão de sangue a uma glândula mamária dos ratos foi medida usando Flu- xometria Doppler a Laser. Ver Song et ai, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 18:903 (1990); Song et ai, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 17:1041 (1989). No referido procedimento, os animais foram raspados em torno dos mamilos e a pele que circunda as glândulas mamárias foi dis- secada. Um modelo de sonda de fibra ótica padrão foi fixado à artéria mamária e conectado a um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser (Perimed KB, Stockholm, Sweden). A constante de tempo foi ajustada em 1,5 segundos, e a largura de banda foi ajustada em 4 KHz. Os dados foram analisados usando análise de variância (ANOVA) seguido pelo Teste de Duncan. Um nível de ρ < 0.05 foi considerado significativo.

Nenhuma mudança no fluxo de sangue ao tecido de mama de ratos normais foi ob- servada em seguida da administração de salina ou IRL1620 e paclitaxel. Diferenças signifi- cativas foram observadas entre o fluxo de sangue em tecido de tumor após Injeção de IRL1620 (36.3%, ρ < 0.05) e após paclitaxel em seguida da administração de IRL 1620 (51.9%, ρ < 0.0.5) a partir da linha basal (ver a FIGURA 1). O referido estudo assim demons- tra que IRL1620 pode proporcionar um importante adjuvante para o tratamento dos cânce- res incluindo a administração dos agentes quimioterapêuticos. Exemplo 2. Efeito de Infusão de ET-1 em hemodinâmicas sistêmicas E O fluxo de

sangue Para o tecido mamário De ratos normais e portadores de tumor.

Tratamentos de MNU e salina foram realizados como injeções intraperitoneais três meses antes dos estudos. Os ratos foram palpados regularmente iniciando quatro semanas após os tratamentos. Uma vez que os tumores alcançaram cerca de 4mm - 8 mm de diâme- tro, os experimentos foram iniciados.

Os ratos foram anestesiados com uretano (1.5 g/kg, i.p.) (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.). Todas as áreas cirúrgicas foram raspadas e limpas com esfregões de álcool. A veia femoral esquerda recebeu uma cânula (Tubo PE 50, Clay Adams, Parsipanny1 N.J.) para a administração da droga. A artéria femoral esquerda recebeu uma cânula (Tubo PE 50) e foi was usado para a retirada de uma amostra de sangue de referência em estudos de microesferas usando uma bomba de retirada (Model 22, Harvard Apparatus, South Natick, Mass.). A artéria femoral direita recebeu uma cânula (Tubo PE 50) e foi conectada a um Transdutor de pressão Gould P23 ID para registrar a pressão sangüínea em um polígrafo Grass P7D (Grass Instrument Co., Quincy, Mass., USA) através de um pré-amplificador 7PI. O ritmo cardíaco (HR) foi registrado através do tacógrafo 7P4B Grass (Grass Instrument Co., Quincy, Mass.) engatilhados a partir dos sinais de pressão sangüínea. A artéria carótida direita foi exposta e um Tubo PE 50 foi guiado através da artéria carótida comum para den- tro do ventrículo esquerdo. A presença da cânula no ventrículo esquerdo foi confirmada ao registrar a pressão no Polígrafo de Grass usando o transdutor de pressão Statham P23 DC (Grass Instrument Co., Quincy, Mass.). Quando a cânula alcança o ventrículo esquerdo; a pressão diastólica cai para zero. De modo a manter constante no sangue p02, pC02, e pH constante, e para evitar o efeito da respiração na pressão sangüínea e HR1 os animais fo- ram mantidos em uma respiração artificial de coeficiente constante ao inserir uma cânula endotraqueal conectada a um ventilador de roedor (Model 683, Harvard Apparatus Inc., Sou- th Natick, Mass.).

Os ratos foram inicialmente divididos em dois grupos, cada um dos quais receben- do um dos tratamentos a seguir:

Grupo I: ET-1 (50 ng/kg/min) de infusão por 30 minutos em ratos tratados com sali- na (ratos normais) (N = 6); e

Grupo II: ET-1 (50 ng/kg/min) de infusão por 30 minutos nos tratados com MNU (50 mg/kg, i.p.; ratos com tumor) (N = 6). Os parâmetros de circulação regional e de hemodinâmica sistêmica foram determi-

nados na linha basal, 30, 60, e 120 minutos após iniciar a infusão de ET-1 (50 ng/kg/min). Pelo fato da infusão de ET-1 ter sido realizada por 30 minutos, os dados do minuto 30 mos- tram o efeito de ET-1, e os dados dos minutos 60- e 120- indicam a duração do efeito de ET- 1.

A circulação regional e a hemodinâmica sistêmica foram determinadas usando um

procedimento descrito na literatura. Ver Gulati et ai, J Lab Clin Med, 126:559 (1995); Gulati et ai, Life Sci., 55:827 (1994); Sharma et ai, Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 22:593 (1994). Em cada medição, uma suspensão vigorosamente misturada de aproxima- damente 100.000 microesferas (15±1 μιτι de diâmetro) marcadas com 46Sc (escândio), 113Sn (estanho), 141Ce (cério), ou 95Nb (nióbio) (New England Nuclear Corporation, Boston, Mass., USA) em 0,2 mL de salina foi injetada no ventrículo esquerdo e enxaguada com 0,3 mL de salina por um período de 15 segundos. De modo a se calcular o fluxo de sangue, o sangue arterial foi retirado em um coeficiente de 0,5 mL/minuto através da artéria femoral direita. O sangue foi retirado por 90 segundos iniciando cerca de 5-10 segundos antes da injeção de microesferas.

A perfusão de sangue a uma glândula mamária dos ratos foi medida usando Flu- xometria Doppler a Laser. Ver Song et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 18:903 (1990); Song etal., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 17:1041 (1989). Os animais foram raspados em torno dos mamilos. A pele circundando as glândulas mamárias foi dissecada como um objeto de cerca de 6 cm de largura e cerca de 4 cm de comprimento. Um modelo de sonda de fibra ótica padrão foi aplicado à superfície do objeto, e fixado ao tecido por uma fita adesiva dupla face. O objeto foi disposto em um suporte de metal e fixado para evitar movimento, então conec- tado a um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser (Perimed KB, Stockholm, Swe- den). A constante de tempo foi ajustada a 1,5 segundos e a largura de banda foi ajustada a 4 KHz. Os dados foram analisados usando análise de variância seguido pelo Teste de Dun- can. Um nível de ρ < 0.05 foi considerado significativo. No final do experimento, os animais foram sacrificados com uma overdose de pen-

tobarbital de sódio. Todos os tecidos e órgãos foram dissecados, pesados, e dispostos em frascos. A radioatividade nos padrões, as amostras de sangue, e as amostras de tecido fo- ram contadas em um contador gama da série Packard Minaxi Auto-Gama 5000 (Packard Instruments Co., Downers Grove, III.) com janelas pré-ajustadas discriminando as energias de isótopos. Os parâmetros a seguir foram calculados: (1) débito cardíaco (CO) ((radioativi- dade injetada χ coeficiente de retirada do sangue arterial)/radioatividade em amostras de sangue arterial), (2) volume do passo (SV) (CO/HR), (3) resistência periférica total (TPR) (pressão arterial média (MAP)/CO), (4) fluxo de sangue regional ((radioatividade em tecido χ coeficiente de retirada do sangue arterial)/radioatividade em amostras de sangue arterial), e (5) resistência vascular regional (MAP/fluxo de sangue regional). Os dados foram calculados usando programas de computador descritos na literatura. Saxena et ai, Comput Programas Biomed, 12:63(1980).

Os parâmetros hemodinâmicos sistêmicos de linha basal em ratos normais (trata- dos com salina) foram MAP: 111.1 ±4.8 mm Hg; CO:268.6 ±17.6 mL/min; SV:0.87 ±0.06 mL; TPR.419.6 ±.24.37 mm Hg.min/mL; e HR:312.5 ±20.2 batidas/min. Em ratos normais, um significante aumento na MAP foi observado a 30 minutos (14.5%; ρ < 0.05), e uma redução a 120 minutos (17.8%; ρ < 0.05) em seguida de Infusão de ET-1. TPR aumentada a 120 minutos (49.2%; ρ < 0.05). CO reduzido em 60 e 120 minutos (22.9% e 42.5% respectiva- mente; ρ < 0.05) após Infusão de ET-1. SV reduzido em 60 e 120 minutos (20.9% e 36% respectivamente; ρ < 0.05). Nenhuma mudança significante em HR foi observada (FIGURAS 2A - 2E).

Os parâmetros hemodinâmicos sistêmicos de linha basal em ratos portadores de tumor (tratados com MNU) foram similares aos dos ratos normais. Um significante aumento em MAP foi observado a 30 minutos (19.1%; ρ < 0.05) e a 60 minutos (15.3%; ρ < 0.05) em seguida de Infusão de ET-1 em ratos portadores de tumor. TPR aumentada a 30 minutos (73.9%; ρ < 0.05), 60 minutos (39.7%; ρ < 0.05), e 120 minutos (71.4%; ρ < 0.05) em segui- da da administração de ET-1. CO reduzido em 30, 60 e 120 minutos (29.4%, 16.7% e 36.1% respectivamente; ρ < 0.05). SV significativamente reduzido a 30, 60 e 120 minutos (31.1%, 17.9% e 32.1% respectivamente; ρ < 0.05). Nenhuma mudança em HR foi observada (FIGURAS 2A-2E).

Nenhuma mudança significante no fluxo de sangue ao tecido de mama ou mudança na resistência vascular de ratos normais tratados com salina foi observada em seguida da administração de ET-1. Diferenças significativas foram observadas entre o fluxo de sangue e a resistência vascular regional no tecido de mama de ratos portadores de tumor (Tratados com MNU) quando em comparação com ratos normais (tratados com salina). Um significan- te aumento (153%; ρ < 0.05) no fluxo de sangue ao tecido de mama de ratos portadores de tumor em comparação com ratos normais foi observado a 60 minutos em seguida da admi- nistração de ET-1. A resistência vascular nos ratos portadores de tumor foi significativamen- te diferente na linha basal (102%; ρ < 0.05) e a 60 minutos (147%; ρ < 0.05) em seguida da administração de ET-1 em comparação com ratos normais (FIGURAS 3A - 3B).

As FIGURAS 4A - 4C mostram as mudanças na perfusão, concentração de células sangüíneas móveis (CMBC), e velocidade de células sangüíneas vermelhas (RBC) no tecido de mama de ratos portadores de tumor e de ratos normais. A perfusão de sangue no tecido de mama de ratos normais não mudou significativamente após a administração de ET-1. A perfusão no tecido de mama de ratos portadores de tumor a 30 minutos em seguida da ad- ministração de ET-1 aumentou significativamente (176%; ρ < 0.05) em comparação com ratos normais. O referido aumento na perfusão retornou para a linha basal a 60 e 120 minu- tos em seguida da administração de ET-1 em ratos portadores de tumor.

O CMBC em ratos portadores de tumor aumentou significativamente (54%; ρ <

0.05) a 60 minutos pós administração de ET-1 em comparação com ratos normais. CMBC retornou para a linha basal a 120 minutos após a administração de ET-1. A velocidade de

RBC aumentou significativamente (252%; ρ < 0.05) a 30 minutos pós administração de ET-1 em comparação com ratos normais. Duas horas (120 minutos) após a administração de ET-

1, a velocidade de RBC em ratos portadores de tumor retornou para a linha basal (FIGURAS 4A - 4C).

Outro estudo avaliou o papel dos receptores ETB nas mudanças induzidos por Infu- são de ET-1 nas hemodinâmicas sistêmicas e o fluxo de sangue para o tecido mamário de ratos normais e ratos com tumores de mama. BQ788 (isto é, N-cis-2,6- dimetilpiperidinocarbonil-L-gama-metill-eucil-D-1-metoxicarboniltrptofanil-D-Nle) é um anta- gonista específico para receptor ETB que inibe ligação a receptores ETB com um valor de IC50 de 1.2 nM. BQ788 foi, portanto, usado para determinar o papel dos receptores ETB em vasodilatação induzida a ET-1 no tumor de mama. O referido estudo empregou os métodos descritos no estudo anterior exceto em que os animais foram divididos nos grupos a seguir: Grupo I: infusão de BQ788 (American Peptide Company Inc. (Sunnyvale, Calif) dis-

solvido em salina a 0.5 pmol/kg) por 20 minutos seguido por infusão de ET-1 (50 ng/kg/min) por 30 minutos em ratos normais tratados com salina (N = 5); e

Grupo II: infusão de BQ788 (0.5 pmol/kg) por 20 minutos seguido por infusão de ET-1 (50 ng/kg/min) por 30 minutos em ratos portadores de tumor tratados com MNU (50 mg/kg, i.p.) (N = 5).

As FIGURAS 5A - 5C mostram o efeito de BQ788 nas mudanças induzidas por ET- 1 na perfusão sangüínea, CMBC1 e velocidade de RBC em ratos portadores de tumor e ra- tos normais, respectivamente. Perfusão de sangue no tecido de mama de ratos normais não mudou significativamente após Administração de BQ788 ou Infusão de ET-1. Entretanto, a perfusão no tecido de tumor de mama de ratos portadores de tumor significativamente redu- ziu a 30 (25.25.+-.5.7%; P < 0.05) e 60 minutos (25.17.+-.2.8%; P < 0.05) em seguida de Infusão de ET-1 ratos pré-tratados com BQ788. O pré-tratamento com BQ788 atenuou o aumento na perfusão induzida por ET-1 em ratos portadores de tumor. Nenhuma diferença entre a perfusão em tecido de mama de ratos portadores de tumor e ratos normais foi ob- servada em seguida da administração de ET-1 em ratos pré-tratados com BQ788. Este re- sultado sugere que as respostas de vasodilatação induzidas a ET-1 são mediadas através de receptores ETB.

A linha basal CMBC em ratos portadores de tumor foi significativamente mais alta do que a linha basal CMBC de tecido de mama de ratos normais (42.4%; P < 0.05). Entre- tanto, após a infusão de BQ788, nenhuma diferença entre CMBC de ratos portadores de tumor e ratos normais foi observada. Ademais, nenhuma diferença na velocidade de RBC entre os dois grupos foi observada (FIGURAS 5A - 5C).

Os testes acima mostram o efeito de ET-1 em hemodinâmicas sistêmicas e o fluxo de sangue ao tecido de mama ratos tratados com salina e tratados com MNU portadores de tumor. É sabido que ET-1 estimula a angiogênese ao promover a produção de VEGF. Estu- dos mostraram mostraram que ET-1 é aumentada em diversos tecidos de câncer tais como carcinoma de mama (Yamashita et ai, Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74:363 (1991)), tumor filódio de mama (Yamashita et ai, Câncer Res, 52:4046 (1992)), carcinoma de próstata (Nelson et ai, Câncer Res, 56:663 (1996)), carcinoma de fígado (Kar et al., Bio- chem Biophys Res Commun 216:514 (1995)), e alguns meningiomas (Pagotto et al., J Clin Invest, 96:2017 (1995)). Os testes acima demonstram mudanças em Respostas vasculares induzidas a ET-1 no tumor de mama. O método usado nos referidos testes foi uma técnica bem estabelecida de microesferas radioativas para estudar a circulação regional e a hemo- dinâmica sistêmica. Gulati et ai., Am J Physiol, 273:H827 (1997); Gulati et ai, Crit Care Med1 24:137 (1996); Gulati et ai, J Lab Clin Med1 126:559 (1995); Gulati et ai, Life Sci1 55:827 (1994).

Exemplo 3. Efeito de IRL1620 na Farmacocinética do Paclitaxel

Ao se alterar a dinâmica de fluxo de sangue no corpo se pode significativamente afetar a farmacocinética da fração terapêutica, e paclitaxel é conhecido por ser dotado de propriedades farmacocinéticas complexas. Ver, por exemplo, Sparreboom et al., Câncer Res 56:2112 (1996a); Gianni et ai, J Natl Câncer Inst 87:1169 (1995b); Sonnichsen & Relling, Clin Pharmacokinet 27:256 (1994); Huizing et ai, J Clin Oncol 11:2127 (1993); Brown et ai, J Clin Oncol 9: 1261 (1991); de Longnecker et ai, Câncer Tratar Rep 71:53 (1987); Wiemik et ai, Câncer Res 47:2486 (1987b). É portanto importante se entender o impacto de IRL1620 na farmacocinética plasmática do paclitaxel. O estudo atualmente descrito foi por- tanto conduzido para determinar se o IRL1620, um agonista seletivo receptor de ETB, altera a farmacocinética do paclitaxel em ratos que têm tumor de mama.

Ratos fêmeas virgens Sprague Dawley (Harlan Co., Madison, Wl), de 48 dias de i- dade (120 g - 140 g) foram usados para o referido estudo. Ao chegar, todos os ratos foram alojados três por gaiola, em uma sala com temperatura controlada (23 ± 1°C), umidade (50 ± 10%) e luz artificial (0600-1800 hr). Os ratos foram alimentados e receberam água à vonta- de. Os experimentos foram iniciados apenas após os ratos terem sido aclimatados ao am- biente por pelo menos 4 dias.

IRL1620 foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Paclitaxel (solução de 6 mg/mL) foi adquirido da Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford OH). Cetamina e xilazina fo- ram adquiridos da Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). [3H]-paclitaxel (ImCi, 6.4 Ci/mmol, atividade específica) foi adquirido da Moravek Biochemicals (Moravek Biochemi- cals, CA). Uretano foi adquirido da Sigma Aldrich (Sigma Chemicals, St. Louis, MO).

N-metil-n-nitrosoureia (MNU) foi administrado a uma dose de 50mg/kg, i.p. e os ra- tos foram palpados duas vezes por semana. Uma vez que os tumores alcançaram cerca de 75 mm3 - 100 mm3, estudos farmacocinéticos foram realizados. Estudos de HPLC-UV. Os ratos foram anestesiados com uma única injeção i.p. de

uretano (1,5 mg/kg) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). A região femoral direita foi raspada e limpa com desinfetante cirúrgico e álcool. A artéria femoral direita e a veia foram expostas e canuladas com tubo de PE-50 estéril. O pescoço foi raspado e limpo com desinfetante cirúr- gico e álcool. Uma incisão média foi produzida em torno da região do pescoço e a traquéia foi entubada e conectada a um ventilador de roedor (Modelo 683, Harvard Apparatus Inc., South Natick, MA). Todas as cirurgias foram realizadas sob condições assépticas. Creme antibiótico de Neosporina (Pfizer, Morris Plains, NJ) foi aplicado às lesões para evitar infec- ção. Um período de recuperação de 45 minutos foi dado antes da administração da droga.

Ratos normais (tratados com salina) e ratos portadores de tumor (tratados com MNU) foram usados. Paclitaxel foi dado i.v. (3 mg/kg) 15 minutos após a administração de IRL1620 (3 nmol/kg) ou veículo (salina, 3 mL/kg). O sangue foi coletado antes da adminis- tração de IRL 1620 para proporcionar os valores de linha basal. 0,5 ml_ do sangue foi retira- do dos ratos em seringas heparinizadas na linha basal, 5, 30 minutos, e 2, 6, e 10 horas após a administração de paclitaxel. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi coletado e armazenado a - 80°C até a análise.

As amostras de plasma foram analisadas para paclitaxel usando um sistema HPLC. Em suma, plasma foi derretido e misturado com 50 μΙ_ do padrão interno N-cicloexil benza- mida (3 mM, curva padrão mais baixa e 30 mM, curva padrão mais alta) e 3 mL de éter etíli- co (Fisher Scientific, Chicago, IL) em um tubo de cultura de vidro de 13 χ 100. A mistura foi agitada usando um agitador recíproco por 5 minutos e então centrifugada por 5 minutos a 3,000 rpm a 4°C. O sobrenadante resultante foi transferido a um tubo de cultura de vidro borosilicato de 13 χ 100 e evaporado sob uma corrente de nitrogênio em um banho de água aquecida (37°C). O resíduo foi reconstituído com 200 pL da fase móvel A (50% água desio- nizada, 50% acetonitrila). Alíquotas de 100 μί (curva padrão mais baixa e amostras coleta- das após IV administrações) do material reconstituído foram injetadas em uma coluna C18 de 4 mm NovaPak 150 χ 3.9 mm (Waters Associates, Milford, MA) precedido por uma pré- coluna C18 de 4 mm NovaPak 20 χ 3.9 mm usando os módulos de separação Waters 2695 conectados a um conjunto detector de absorção Waters 2487 a 227 nm. Um gradiente linear foi iniciado com 100% fase móvel A bombeada a um coeficiente de fluxo de 1 mL/min. A fase móvel A foi então reduzida para 70% a partir de 10 para 11 minutos com a fase móvel A mantida a 70% a partir de 11 a 16 minutos para remover os materiais que lentamente eluem a partir da coluna antes da próxima injeção. Subseqüentemente, a fase móvel A foi aumen- tada para 100% a partir de 16 para 17 minutos e mantida a 100% de fase móvel A por três minutos proporcionando um tempo de funcionamento total de 20 minutos. As concentrações plasmáticas para o paclitaxel foram calculadas a partir da proporção da área do pico de pa- clitaxel para a área do pico de N-cicloexil benzamida usando regressão linear de quadrados mínimos e pesagem por 1/x. Dentro do dia e entre dias a variabilidade medida por um coefi- ciente de variação foi < 10%. Os perfis de concentração plasmática dos ratos normais e ra- tos que portam tumor foram comparados.

Estudos de Contagem de cintilação líquida. Os ratos foram anestesiados com uma única injeção i.p. de uma combinação de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg). O pes- coço foi raspado e limpo com desinfetante cirúrgico e álcool. A artéria carótida direita foi ex- posta e canulada com tubo de PE-50 estéril. A incisão da linha mediana foi produzida em torno da região do pescoço e a artéria carótida esquerda recebeu uma cânula com Tubo ΡΕ50 para a amostragem de sangue. Cateteres foram passados por via subcutânea e exte- riorizados na base do pescoço seguido pelo fechamento das incisões usando grampos ci- rúrgicos. Buehler et ai., Free Radie Biol Med 37:124 (2004). O tubo aberto foi bloqueado com uma linha terminal. Todas as cirurgias foram realizadas sob condições assépticas.

Creme antibiótico de Neosporina (Pfizer, Morris Plains, NJ) foi aplicado às lesões para evitar infecção. Um período de recuperação de 45 minutos foi dado antes da administração da droga.

IRL1620 foi administrado i.v. aos animais portadores de tumor a uma dose de 3 nmol/kg. [3H]-paclitaxel (160 pCi/kg) foi misturado com paclitaxel não marcado. Paclitaxel foi administrado i.v. 15 minutos em seguida do veículo ou da administração de IRL 1620.

Plasma foi coletado antes do veículo ou da administração de IRL 1620 para propor- cionar os valores de linha basal. Aproximadamente, 0,2 mL do sangue foi coletado dos ratos em seringas heparinizadas na linha basal, 1, 5, 15 e 30 minutos e 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ho- ras. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi separado e armazenado a -80°C até a análise.

As concentrações de [3H]-paclitaxel nas amostras de plasma foram medidas usando um contador de cintilação líquida Beckman Coulter (modelo LS 6500). Em suma, o plasma foi derretido e misturado com 20 mL de coquetel de cintilação líquida. As amostras foram contadas e as contagens foram convertidas das unidades "dpm" para as "fmol/mL" usando a fórmula a seguir:

fmol/mL = valor dpm χ fator de dissolução χ 2.2 χ 10~12/10"12 χ volume de amostra

em mL

Após a conversão em fmol/mL, a farmacocinética do paclitaxel total foi calculadas usando a proporção de [3H]-paclitaxel para paclitaxel não marcado. As estimativas de far- macocinética de paclitaxel plasmático foram determinadas usando tanto a análise de com- partimento como as análises de não compartimento como implementadas em WinNonIin Pro 4.1 (Pharsight Corp, Mt. View, CA).

Na análise de não compartimento, a área sob a curva (AUC0-00) foi estimada usan- do a regra trapezoidal para a última concentração medida (CIast) e extrapolada ao infinito ao se dividir Clast pelo valor negativo da inclinação terminal (A) da concentração plasmática Iog-Iinear com relação à curva do tempo. Os parâmetros a seguir foram também calculadas: tempo médio de estadia (MRTiv) foi calculado como a recíproca de A, depuração sistêmica (CL) foi calculada como a proporção da dose para AUCO-00 e a distribuição de volume apa- rente foi calculada como a proporção de CL e A. A meia vida do plasma foi calculadas como o produto de 0,693 (natural Iog 2) e MRTiv.

Na análise de compartimento, uma série de modelos de compartimento não linea- res foi adaptada aos dados de concentração plasmática com relação à curva de tempo. Es- pecificamerite, modelos de um compartimento, dois compartimentos e três compartimentos foram comparados. Dados uniformes e previstos com base na pesagem foram testados. A seleção final do modelo se baseou em gráficos de diagnóstico (observados vs. previstos e gráfico de resíduos), Akaike Informação Criteria (AIC) e Schwartz Criteria (SC). O modelo com um critério mais baixo de AIC e SC foi considerado o modelo final.

Os dados foram analisados por um Way ANOVA seguido pelo Teste de Duncan pa- ra estudos de HPLC-UV e por t-teste para estudos de cintilação líquida. Uma ρ < 0.05 foi considerada significativa. As principais medidas de resultado nos referidos estudos de res- posta farmacológica foi a diferença na concentração do paclitaxel no plasma. O perfil farmacocinético do paclitaxel não foi afetado pela administração de IRL

1620 (FIGURAS 6 e 7) em ratos normais ou portadores de tumor. Análise HPLC do perfil farmacocinético plasmático é similar ao perfil mais extenso de disposição de paclitaxel ra- dioativo. A figura 7 ilustra o perfil farmacocinético da radioatividade do paclitaxel em ratos tratados com veículo e ratos portadores de tumor tratados com IRL1620. O perfil farmacoci- nético foi analisado por métodos de não compartimento e de compartimento.

Na análise de não compartimento, a AUC calculada para o veículo + o grupo pacli- taxel foi 9433.53 ± 1465.00 ng*h/mL e foi similar (p > 0.05) àquele dos ratos com tumor tra- tados com IRL1620. A eliminação da meia vida foi calculada como 0.14 ± 0.08 hora. A depu- ração calculada como Dose/AUC foi estimada ser 0.56 ± 0.07 L/h/kg. O volume de distribui- ção, calculado como depuração/Kel foi encontrado ser 10.11 ±4.17 L/kg. No geral, e como pode ser visto na tabela a seguir, IRL1620 não afetou o perfil farmacocinético do paclitaxel.

Grupo Veículo + Paclitaxel IRL1620 Lambda (h) 0.14 ±0.08 0.10 ±0.05 Cmax (pg/mL) 6.73 ±0.54 5.85 ± 0.77 AUCo-» (pg-h/mL) 9.43 ±1.47 8.63 ± 0.79 Cl (L/h/Kg) 0.56 ± 0.07 0.60 ± 0.06 Vd (L/Kg) 10.11 ±4.18 9.56 ± 2.90 Vss (L/Kg) 8.14 ±2.95 8.15 ±2.20 MRTinf(h) 17.43 ±8.13 14.48 ±4.70

As concentrações plasmáticas do paclitaxel foram calculadas a partir da contagem de dpm nas amostras de plasma. Um modelo de três compartimentos melhor descreveu a farmacocinética do paclitaxel. A figura 8 ilustra os gráficos farmacocinéticos observado ver-

sus previsto para ambos os ratos tratados com veículo e tratados com IRL 1620. A AUC do paclitaxel em ratos tratados com veículo foi 9.42 ±3.18 pg-h/mL. O volume de estado está- vel da distribuição (Vss) foi 10.31 ± 4.54 L/Kg. A depuração foi estimada ser 0.69 ±0.17 L/h/Kg. Os a t1/2, β V2 y t1/2 foram 0.03 ± 0.01 hora, 1.0 ± 0.32 hora, e 25.87+ 17.81 hora, respectivamente. O tempo de estadia médio foi 27.92 ± 19.84 horas. Como pode ser visto na tabela a seguir, os referidos parâmetros estimados no grupo tratado com IRL1620 não foram significativamente diferentes daquele do grupo tratado com veículo.

Grupo Veículo + Paclitaxel IRL1620 AUCo-oo (pg-h/mL) 9.42 ±3.18 7.25 ± 0.75 Cl (L/h/Kg) 0.69 ±0.17 0.72 ±0.09 MRT(h) 27.92 ±19.84 10.58 ±3.20 Vss (L/Kg) 10.31 ±4.54 7.28 ±1.79 aty2 0.03 ±0.01 0.04 ±0.01 Ptj4 1.0 ±0.32 0.84 ± 0.32 Yty2 25.87 ±17.81 9.42 ± 2.59 K10 3.14 ±1.34 1.72 ±0.57 K12 56.47 ± 27.69 34.93 ± 23.26 K13 5.71 ±3.37 3.92 ±1.88 No referido estudo, um modelo de três compartimenl os descreve melhor a farmaco

cinética plasmática do paclitaxel. O referido modelo sugere que o paclitaxel é distribuído a vários órgãos seja a perfusão de sangue nos órgãos elevada, média ou baixa. A administra- ção de IRL 1620 não mudou a distribuição do paclitaxel. Os parâmetros de farmacocinética plasmática, gerados pelo modelo de 3 compartimentos, exibiu depurações comparável, vo- lumes de distribuição e absorção, distribuição e meias vida de eliminação para os grupos tratados com veículo e IRL1620. Entretanto, IRL1620 aumenta perfusão de sangue no tumor e a concentração de paclitaxel no tumor. Rai et ai, American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharmaceutics e Drug Delivery Conference. Philadelphia, PA (2004); Rai & Gula- ti, Câncer Chemother Pharmacol, 51:21 (2003). Portanto, o IRL1620 seletivamente aumenta a perfusão do tumor sem significativamente alterar o perfil farmacocinético do paclitaxel.

Os referidos estudos demonstraram que o uso de IRL1620 não afetou a farmacoci- nética do paclitaxel. Com freqüência, a farmacocinética pode ser considerada como um substituto para a segurança do composto. Conseqüentemente, os referidos resultados tam- bém sugerem que a segurança do paclitaxel não muda em virtude da administração do IRL1620. Como um resultado, o IRL1620 pode ser usado para aprimorar a eficácia do pacli- taxel e permitir a titulação apropriada da dose para minimizar suas graves toxicidades. Exemplo 4. Efeito de Resposta de Dose de IRL1620, Efeito de IRL1620 na Bio-

Distribuição de [3H] paclitaxel em Órgãos principais e Tecido de tumor e Efeito de IRL1620 na Eficácia do paclitaxel no Status do Tumor

Os experimentos descritos no presente exemplo foram projetados para adicional- mente avaliar (a) o efeito de resposta de dose do agonista receptor de ETB, IRL1620, na perfusão de mama de ratos normais e que portam tumor, (b) o efeito de IRL1620 na bio- distribuição de [3H] paclitaxel em órgãos principais e tecido de tumor e (3) o efeito de IRL1620 na eficácia do paclitaxel no status do tumor em ratos portadores de tumor de mama induzido a MNU.

Ratos fêmeas virgens Sprague Dawley (Harlan Company, Madison, Wl) foram ad- quiridos com 40 dias de idade e alojados dois por gaiola em um ambiente de temperatura controlada a 23±1°C e mantidos sob um programa de 12 horas luz/12 horas de escuro. Eles receberam água e dieta padrão para roedores ad libitum.

IRL1620 foi obtido da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). [3H] paclitaxel foi adqui- rido da Moravek Biochemicals (Brea, CA). Paclitaxel (solução de 6 mg/mL) foi adquirido da Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford, OH). Cetamina e xilazina foram adquiridos da Phoe- nix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). Solubilizante de tecido (TS-2) foi adquirido da RPI Corp. (Chicago, IL).

Aos 48 dias de idade, cada animal recebeu uma única injeção i.p. de N-metil nitro- soureia (MNU, Ash Stevens, Detroit1 ML) a uma dose de 50 mg/kg. MNU foi dissolvido em 3% ácido acético e diluído em 0,9% NaCI (concentração final de 12.5 mg/mL) e foi adminis- trado dentro de 30 minutos de preparação. O referido tratamento induz quase 100% de inci- dência de adenocarcinoma mamário em ratos a aproximadamente 100 dias do tratamento de carcinogênio. Mehta, Eur J Câncer, 36:1275 (2000). A aparência e a localização do tumor foi monitorada por palpação da glândula mamária e a superfície do tumor foi medida com um calibre digital. Ratos com volume de tumor de 500 mm3 - 800 mm3 foram selecionados para o estudo.

Estudo de Perfusão. A perfusão para o tecido mamário do rato e tumor foi medida usando um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser (Perimed, Stockholm, Sweden) como anteriormente descrito. Em suma, os ratos foram anestesiados usando cetamina (100 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) como uma única injeção i.p. combinada. O pelo foi raspado em torno dos mamilos e os animais foram dispostos em uma almofada de aquecimento (37°C) para minimizar as variações de temperatura. A pele circundando as glândulas mamárias foi dissecada a cerca de 6 mm de largura e cerca de 4 mm de comprimento. Um modelo de sonda de fibra ótica padrão (MP3 sonda de fluxo, Moors Instruments, Devon, England) foi aplicado à superfície do tecido exposto. A mesma foi então conectada a um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser. A constante de tempo foi ajustada em 1,5 segundos e a largura de banda foi ajustada em 4 kHz. O referido método mede um desvio Doppler na luz a laser (fluxo), que é determinado pelo número de eritrócitos e velocidade, e é proporcional ao fluxo de sangue total em um determinado volume de tecido. Valores de fluxo foram adquiri- dos usando o programa Polyview. Uma linha basal de 15 minutos de registro estável foi ob- tida antes da administração de salina ou IRL1620. Os animais foram administrados 1, 3 ou 9 nmol/kg de IRL1620 e a perfusão foi registrada por 3 horas. Cada dose foi administrada a pelo menos 4 os animais.

O efeito da administração de IRL 1620 na perfusão de tumor foi observado ser tran- sitório e relacionado a dose (FIGURA 9A). Um aumento máximo de 244.0% (p< 0.001) a partir da linha basal em perfusão de tumor foi observada a 30 minutos após a administração de 3 nmol/kg IRL1620. O aumento na perfusão foi observado ser significante a 15, 30 e 60 minutos em comparação com a linha basal assim como com os ratos tratados com salina. (FIGURAS 9A e 9B). A administração de 1 e 9 nmol/kg de IRL1620 produziu apenas um aumento marginal na perfusão de tumor de mama em comparação com a perfusão de linha basal e aquela dos ratos tratados com salina. O aumento máximo na perfusão (60.9 e 63.3%) foi registrado a 120 e 30 minutos após 1 e 9 nmol/kg de IRL1620, respectivamente. Entretanto, o aumento na perfusão nos animais tratados com 9 nmol/kg de IRL1620 foi ob- servado ser significante a 15, 30 e 60 minutos em comparação com ratos tratados com sali- na (FIGURA 9A). A administração de salina a ratos que portam tumor não produziu qualquer mudança significante na perfusão sangüínea em comparação com linha basal (FIGURA 9A). A administração de salina ou 1, 3 ou 9 nmol/kg IRL1620 não produziu qualquer mudança significante na perfusão de mama em ratos fêmeas normais (dados não mostrados).

Os referidos resultados mostram que a administração de 3 nmol/kg ou 9 nmol/kg de IRL1620 produz um aumento na perfusão de tumor em comparação com a linha basal e ratos tratados com veículo. Embora 1, 3 e 9 nmol/kg de IRL1620 todos aumentem relativa- mente a perfusão de tumor, a dose de 3 nmol/kg produz o efeito máximo.

Estudo de Bio-distribuição. Em seguida da formação de tumor como anteriormente descrito, os ratos foram anestesiados com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) como uma injeção i.p. combinada. O peso corporal, local do tumor e volume de tumor dos ratos foram documentados. Os animais foram então aleatoriamente agrupados para receber ou salina ou IRL1620 (3 nmol/kg) por meio da veia do rabo em um volume final de 0,2 mL. Os ratos de cada grupo então receberam [3H] paclitaxel (40 μθί/rato em 50:50 de Cremofor EL e etanol) em um volume final de 1,0 mL a 15, 120 e 240 minutos após IRL1620. Seis ratos foram estudados em cada ponto do tempo e um total de 36 ratos foi usados. Os animais foram sacrificados 3 horas após a administração de [3H] paclitaxel. A concentração do [3H] paclitaxel foi determinada no tecido de tumor, rins, fígado, pulmões e baço. Especificamente, o tumor e órgãos foram fatiados em pequenas peças. Cerca de 500 mg do tecido ou tumor foi disposto em frascos separados que contém solubilizante de tecido (6 mL) e incubados em um banho de água a 50°C. Os frascos foram removidos a partir do banho de água após o tecido ou tumor ser dissolvido e 1,2 mL de 10% ácido acético glacial ser adicionado. Os conteúdos do frasco foram igualmente divididos em 3 frascos e 15 mL de coquetel de líquido de cintilação (Safety Solve, RPI Corp, Chicago, IL) ser adicionado a cada frasco e mantido durante a noite para equilíbrio. A radioatividade nos tubos foi contada usando um contador de cintilação líquida (Beckman Coulter, LS 6500).

A concentração do [3H] paclitaxel no tumor foi significativamente aumentada em ra- tos tratados com IRL1620 (3 nmol/kg) em comparação com ratos tratados com salina. O efeito máximo foi observado no grupo dos animais administrados com paclitaxel 15 minutos após a administração de IRL 1620. Um aumento de 277.1, 151:9 e 34.7% na concentração de paclitaxel no tumor foi observado quando paclitaxel foi administrado 15, 120 e 240 minu- tos, respectivamente após a administração de IRL 1620 (FIGURA 10). A administração de IRL 1620 não alterou significativamente o acúmulo do paclitaxel no fígado, pulmões, rins e baço quando em comparação com os animais de controle (FIGURA 10). Estudo de Eficácia. Os animais portadores de tumor (tratados com MNU) foram a-

Ieatoriamente divididos em sete grupos (12 ratos/grupo):

Grupo I — Salina;

Grupo Il — IRL1620 (3 nmol/kg);

Grupo Ill — Cremofor EL:etanol; Grupo IV — Veículo (salina) + paclitaxel (1 mg/kg);

Grupo V — Veículo (salina) + paclitaxel (5 mg/kg);

Grupo Vl — IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (1 mg/kg); e

Grupo Vll — IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (5 mg/kg).

O esquema de dosagem foi de uma vez a cada três dias para um total de 5 doses. Peso corporal, tamanho do tumor e localização foram monitorados a cada três dias para um total de 30 dias após a dose final. As categorias a seguir foram usadas para a pontuação: Progressão: o tumor cresce mais do que 40% em área em comparação com o início do tra- tamento; Estase: o tumor não faculta mais do que 40% a partir de sua área inicial através do curso do tratamento; Regressão parcial: o tumor regrediu mais do que 40% a partir de sua área inicial; Completa remissão: o tumor não é mais palpável ou mensurável; multiplicidade de tumor: aparecimento de novos tumores durante o tratamento; e período de observação de 30 dias. Os animais foram sacrificados 30 dias após a dose final (5o). Os dados foram analisados usando análise de variância seguida pelo Teste de Duncan. Um nível de P < 0.05 foi considerado significativo. Peso corporal. O percentual de diferenças no peso corporal dos animais a partir da

linha basal (antes iniciando tratamento) em 30 dias após a dose final é mostrado na FIGURA 11.0 percentual de aumento no peso corporal no final do experimento em ratos de controle tratados com salina foi 7.2 ± 1.7% em comparação com a linha basal de peso corporal. Hou- ve um aumento de 5.1 ± 3.6, 9.4 ±2.4, 14.3 ± 3.1 e 13.1 ± 1.8% no peso corporal no grupo dos animais tratados com veículo + paclitaxel (1 mg/kg), veículo + paclitaxel (5 mg/kg), IRL1620 + paclitaxel 1 mg/kg e IRL1620 + paclitaxel 5 mg/kg, respectivamente (FIGURA 11). O percentual de aumento no peso corporal dos animais administrados com Cremofor EL:etanol e IRL1620 em comparagao com Iinha basal foi observado ser < 10% (dados nao mostrados).

Volume de tumor. O tamanho dos tumores em varios grupos foi compar^vel e nao significativamente diferente um do outro no inicio do tratamento (FIGURA 12). O volume de tumor dos ratos de controle aumentou em um coeficiente rapido e variavel. A grande variabi- Iidade no crescimento do tumor pode ser atribuida ao padrao de crescimento aleatorio dos tumores de desenvolvimento autoctones. No final do periodo de observagao de 30 dias, os tumores de controle apresentaram um volume de tumor de 2693.4 士 790.9 mm3. Os ratos tratados com IRL 1620 apresentaram um padrao similar de desenvolvimento com um volu- me de tumor final de 2560.5 土 844.4 mm3. O tratamento com cremofor EL:etanol tambem resultou em um padrao de desenvolvimento similar com um volume de tumor final de 2338 土 1329 mm3. Assim, IRL1620 e cremofor EI:etanol nao apresentaram efeitos significantes no desenvolvimento de tumores de mama induzidos a MNU por si so (dados nao mostrados). Os ratos tratados com veiculo + paclitaxel (1 mg/kg) apresentaram um desenvolvimento re- Iativamente reduzido em tamanho do tumor (1960.8 土 611.9 mm3). O grupo de veiculo + paclitaxel (5 mg/kg) mostrou uma maior redugao no volume de tumor (1682.7 土 497.3 mm3) quando em comparagao com ratos de controle. Os ratos tratados com IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) tambem mostraram uma redugao em tamanho do tumor (1707.2 土 621.1 mm3). Entretanto, a menor media de tamanho do tumor (730.1 土 219.4 mm3) foi observada no gru- po dos animais tratados com IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg). IRL1620 seguido por 5mg/kg paclitaxel a cada tres dias para um total de 5 doses significativamente (p < 0.05) reduziu ο volume de tumor em comparagao com os ratos administrados com salina + paclitaxel (5 mg/kg) (FIGURA12). O volume de tumor foi tambem observado ser mais baixo no grupo de IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) quando em comparagao com ratos tratados seja com IRL1620 ou cremofor EL:etanol (dados nao mostrados).

Multiplicidade de Tumor. Os animais em todos os grupos de tratamento desenvolve- ram tumores adicionais no final do periodo de observagao de 30 dias. Houve um aumento adicional 58.4, 57.1 e 60.8% da aparencia do tumor nos animais tratados com salina, cremo- for ELetanoI e IRL1620, respectivamente. Novas ocorrencias de tumor foram observadas ser de 78.3% e 41% nos animais administrados com veiculo + paclitaxel (1 e 5 mg/kg, respecti- vamente). Entretanto, ο percentual de tumores adicionais foi observado ser de 69.2% e 44.8% em IRL1620 + paclitaxel (1 e 5 mg/kg, respectivamente) (dados nao mostrados).

Progressao do Tumor. O percentual de tumores que progrediram, permaneceram em estase, regrediram ou desapareceram foi calculado como descrito anteriormente. 73.5% de tumores no grupo tratado com salina progrediram acima de 40% do tamanho inicial do tumor. Os grupos tratados com 丨RL1620 (82.7%) e cremofor ELietanoI (80.4%) apresenta-

ram percentual similar de tumores progredindo alem de 40% do tamanho inicial do tumor. Um percentual mais baixo de tumores progrediram no grupo de veiculo + paclitaxel (5 mg/kg) (71.4%), no grupo de veiculo + paclitaxel (1 mg/kg) (61.1%) e no grupo de IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) (69%). Mas, ο percentual mais baixo (40%) foi observado no grupo de IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) (FIGURA 13).

Estase de Tumor. 16.9% de tumores nos ratos tratados com salina permaneceram

em estase, nao se desenvolverido alem da faixa de 40% ate ο ponto final de 30 dias. Outros grupos de controle mostraram um percentual relativamente mais baixo de tumores que per- maneceram em estase: IRL1620 (13.7%), cremofor EL: etanol (15.2%). Os ratos tratados com veiculo + paclitaxel (1 mg/kg) (22.2%) e veiculo + paclitaxel (5 mg/kg) (19.5%) mostra- ram umpercentual mais elevado de tumores que permaneceram em estase. Os ratos trata- dos com IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) (23.8%) e os ratos tratados com IRL1620 + paclita- xel (5 mg/kg) mostraram um maior percentual de tumores que permaneceram em estase (26.6%) (A FIGURA 13).

Regressao do Tumor. A administra?ao de IRL1620 antes de 5 mg/kg de paclitaxel de tratamento significativamente reduziu a progressao de tumores em compara?ao com os animais de controle. Os ratos tratados com salina apresentaram 9,2% de tumores que re- gressaram ao volume inicial do tumor. Os ratos tratados com Cremofor ELietanoI (4.3%), IRL1620 (3.4%) e veiculo + paclitaxel (1 mg/kg) (9.5%) nao foram significativamente diferen- tes do grupo de controle no percentual de tumores que regressaram em tamanho. No final da quinta dose, os tumores regrediram em 76.1 土 10.5 e 45.9 土 11·50/ο nos ratos tratados com IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) e ratos tratados com veiculo + paclitaxel (5 mg/kg), res- pectivamente em comparagao com os ratos de controle. Houve regressao de 80.2 土 6·90/ο (ρ < 0.05) e de 33.8 土 19.4% nos animais tratados com IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) e grupo de veiculo + paclitaxel (5 mg/kg), respectivamente (FIGURA 13). O coeficiente de regressao de tumor no grupo tratado com IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) e grupo tratado com veiculo + paclitaxel (1 mg/kg) foi observado ser 47.1 ± 15.4 e 37.7 土 16·20/ο，respectivamente. A admi- nistragao do paclitaxel (5 mg/kg) 15 minutos apos IRL1620 produziu significativamente maior regressao de tumor em comparagao com administragao do paclitaxel (5 mg/kg) 15 minutos apos salina. Os grupos tratados com cremofor Eketanol e IRL1620 nao foram significativa- mente diferentes em sua regressao de tumor em comparagao com os ratos de controle em qualquer ponto de tempo (dados nao mostrados).

Remissao de Tumor. A completa regressao, onde os tumores completamente de- sapareceram, foi apenas observada em dois grupos. Ratos tratados com IRL1620 + paclita- xel (1 mg/kg) (2,3%) e IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) (15%) (FIGURA 13). Os resultados dos referido estudo de eficacia indicam que a administragao de

IRL1620 significativamente aumenta a redugao induzida a paclitaxel em volume de tumor em

comparagao com ratos tratados com salina administrada com paclitaxel. O maior beneficio terapeutico observado com a dose de 5 mg/kg de paclitaxel foi mantido ate 30 dias apos a dose final. Isto indica que nao houve relapso do volume do tumor e ο efeito de IRL1620 em aumentar a eficacia do paclitaxel permaneceu consistente ate ο final do estudo. Entretanto, ο tratamento de salina seguido por paclitaxel (1 e 5 mg/kg) nao produziu a referida signifi- cante mudanga no crescimento do tumor. Adicionalmente, a multiplicidade de tumor foi re- duzida no grupo de ratos tratados com IRL1620 seguido pelo paclitaxel (5 mg/kg). Assim, a administragao de IRL 1620 antes do paclitaxel (5 mg/kg) apresenta um efeito significante na eficacia do paclitaxel. Isto e ilustrado pela redugao da carga tumoral, percentual de regres- sao do tumor, peso corporal nao afetado e multiplicidade. Ademais, houve uma completa remissao de 2,3% e 15% dos tumores iniciais no grupo dos animais tratados com IRL1620 seguido pelo paclitaxel 1 e 5 mg/kg, respectivamente em compara^ao com qualquer outro grupo.

Os experimentos descritos nos referidos exemplos de um modelo de tumor de ma- ma claramente mostram que ο agonista receptor de ETB1 IRL1620 significativamente au- menta ο fluxo de sangue ao tumor. A administragao de IRL1620 produziu um aumento no fluxo de sangue ao tumor, enquanto que a perfusao no controle de tecido saudavel nao foi alterada. O aumento na perfusao de tumor durou por 3 horas. A administragao de [3H] pacli- taxel durante a janela de elevada perfusao significativamente aumentou a concentra^ao do [3H] paclitaxel no tecido de tumor apenas, mas nao nos outros orgaos. Ademais, os resulta- dos dos experimentos descritos no presente exemplo proporcionam evidencias de que a administragao de IRL1620 poderia galvanizar a eficacia anti-tumor do paclitaxel. Houve uma redu9§o de 60.0% no volume de tumor de ratos tratados com paclitaxel (5 mg/kg), a cada tres dias para um total de 5 doses, como em compara?§o com ratos de controle. Entretanto, a administragao de paclitaxel 15 minutos apos a administra9ao de IRL 1620 reduziu ο volu- me de tumor para 268.9% em comparagao com ratos de controle quando registrado um mes apos a Liltima dose do paclitaxel. Houve uma redugao de 130,4% no volume de tumor em ratos administrados com IRL1620 as em comparagao com ratos tratados apenas com pacli- taxel. Ha uma possibilidade de que a elevada perfusao de tumor possa aumentar a disponi- bilidade de nutrientes que possam facilitar ο desenvolvimento do tumor Os referidos resuI- tados mostram que nao houve aumento significante no volume de tumor e na multiplicidade de tumor dos ratos tratados com IRL 1620 em comparagao com ratos tratados com salina, indicando que ο IRL1620 isoladamente nao produziu qualquer efeito no volume de tumor e multiplicidade.

MODELO DE TUMOR DE PROSTATA Exemplo 5. Efeito de IRL1620 em perfusao de tumor de prostata, Biodistribuigao e

Eficacia da Doxorubicina e 5-Fluorouracila

Apos demonstrar que ο IRL1620 pode aumentar a eficacia do paclitaxel em um mo- delo de tumor de mama, ο seu efeito em um modelo de tumor de prostata foi tambem exa- minado. Especificamente, se ο IRL1620 pode aumentar os efeitos anticancer da doxorubici- na (DOX) e 5-Fluorouracila (5-FU) em um modelo de tumor de cancer de prostata foram examinados.

Ratos portadores de tumor de prostata Copenhagen de cinco semanas de idade

(Harlan, Indianapolis, IN) pesando 100 gramas -120 gramas foram escolhidos para uso nos estudos de modelo de tumor de prostata descritos. As instalagdes dos animais foram manti- das a uma temperatura controlada (23 土 1°C), umidade (50 ± 10 0/o) e em um programa de 12 horas de Iuz/ Iuz escura artificial (L0600-1800 h). Os ratos foram alojados tres por gaiola e foram alimentados e receberam agua a vontade. Os ratos foram permitidos aclimatar ao ambiente por pelo menos uma semana antes do exame veterinario e ο inicio da experimen- tagao. Todos os procedimentos e ο cuidado com os animais foram de acordo com as diretri- zes estabelecidas pelo Animal Care Committee of the University of Illinois em Chicago. As instala95es dos animais foram mantidas de acordo com a Regulamentagao Federa丨 e sao abonadas pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care.

IRL1620 foi adquirido da American Peptide (Sunnyvale, CA ). Hidrocloreto de [14C] doxorubicina ([14C]adriamicina) foi adquirido da GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Ce- tamina e xilazina foram adquiridos da Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). Solubilizante de tecido (TS-2) foi obtido da RPI Corp. (Chicago, IL). Tumores de prostata foram induzidos em ratos Copenhagen machos usando celu-

Ias JHU-4 (MAT-LyLu) obtidas da ATCC (Manassas, VA). Ver Gaddipati et al., J Exp Ther Oncol, 4(3): 203-12 (2004) a qual se encontra aqui incorporada por referencia. As celulas foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal (10%) em uma incubadora umidificada que contem 5% CO2 a 37°C. Os pelos foram raspados do Iado dor- sal do pescogo, e os animais foram inoculados com 10.000 celulas JHU-4 (MAT-LyLu) em 100 μΙ_ de salina tamponada a fosfato por meio de injegao subcutanea (s.c·). a aparencia do tumor e a Iocaliza?ao foram monitorados por palpagao manual e os diametros do tumor fo- ram medidos com um calibre digital. Os procedimentos experimentais se iniciaram uma vez que ο tamanho do tumor alcangou cerca de 200 mm3. Estudo de Perfusao. Os ratos foram anestesiados usando cetamina (100 mg/kg) e

xilazina (2 mg/kg) como uma injegao intraperitoneal combinada (i.p.). ο pelo foi raspado em torno da area do tumor e os animais foram dispostos em uma almofada de aquecimento (37°C) para minimizar as varia?5es de temperatura. A pele circundando ο tecido de tumor foi separada a cerca de 3 mm de Iargura e cerca de 3 mm de comprimento para expor ο tumor. Um modelo de sonda de fibra otica padrao conectado a um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser (MP3 sonda de fluxo, Moors Instruments, Devon, England) foi aplicado a

superficie exposta do tumor. A constante de tempo foi ajustada em 1.5 segundos e a Iargura de banda foi ajustada em 4 kHz. O referido metodo mede um desvio Doppler na Iuz a laser (fluxo), que e determinado pelo niimero de eritrocitos e velocidade, e e proporcional ao fluxo de sangue total dentro de um determinado volume de tecido. Valores de fluxo foram adquiri- dos usando ο programs Polyview. Uma Iinha basal de 15 minutos de registro est^vel foi ob- tida antes da administra?ao de salina ou de IRL1620. Os animais foram administrados com IRL1620 (1, 3, ou 6 nmol/kg) em um volume final de 0,2 mL via da veia do rabo e a perfusao foi registrada por 3 horas.

Como pode ser visto nas FIGURAS 14A e 14B, a administragao de salina ou 1 nmol/kg de IRI_1620 nao produziu qualquer mudanga significante na perfusao de sangue de tumor em ratos que portam tumor. A administragao de 3 nmol/kg ou de 6 nmol/kg ocasionou um aumento maximo na perfusao de sangue de tumor de 102.8% e 79.12% a partir da Iinha basal respectivamente. O referido aumento na perfusao foi significante a 15, 30，e 60 minu- tos quando em comparaijao com Iinha basal e os ratos tratados com salina (p< 0.005). As- sim, doses apropriadas de IRL1620 transitoriamente aumentam a perfusao de sangue de tumor em um modelo animal de cancer de prostata.

Estudo de Biodistribui^ao. Ratos que portam tumor foram aleatoriamente agrupados (N = 6/grupo) para receber salina ou IRL1620 (1，3 ou 6 nmol/kg) por meio da veia do rabo em um volume final de 0,2 mL. Os ratos de cada grupo entao receberam [14C]doxorubicina (1 pCi/rato) i.v. em um volume final de 1,0 mL 15 minutos apos a salina ou a administragao de IRL 1620. Os animais foram entao sacrificados 3 horas apos a administragao de [14C]doxorubicina . A concentragao de [14C]doxorubicina no tumor, coragao, cerebro, rins, figado, pulmdes, medula ossea, prostata, miisculos esqueleticos e ba?o foi examinada. Es- pecificamente, tumor e orgaos foram fatiados em pequenas pegas. Os femur de ambas as pernas foram separados e pesados com a medula ossea erixaguada usando uma seringa que contem solubilizante de tecido. Cerca de 500 mg de tecido ou tumor foi disposto em frascos separados que continham solubilizante de tecido (6 mL) e incubados em um banho de agua a cerca de 50°C. Os frascos foram removidos a partir do banho de agua apos ο tecido ou tumor ser dissolvido e 1,2 mL de 10 % acido acetico glacial foi adicionado. Os con- teiidos do frasco foram entao igualmente divididos em 3 frascos e 15 mL do coquetel de Iiquido de cintilagao (Safety Solve, RPI Corp, Chicago, IL) foi adicionado a cada frasco e mantido durante a noite para equilibrar. A radioatividade nos tubos foi contada usando um contador de cintilagao Itquida (Beckman Coulter, LS 6500).

Como pode ser visto na FIGURA 15, a administragao de 1 nmol/kg de IRL1620 nao produziu qualquer mudanga significante na captagao de [14C]doxorubicina em tumor ou ou- tros tecidos. As concentragoes de [14C]doxorubicina em tumor, entretanto, foram significati- vamente aumentadas naqueles ratos que receberam 3 nmol/kg de IRL1620 (115.85% de aumento; p< 0.01) ou 6 nmol/kg de IRL1620 (80.02% de aumento; p< 0.05) quando em com para gao com ratos tratados com salina. No dose de IRL1620 produziu significante au- mento no acijmulo de [14C]doxorubicina no coragao, cerebro, rins, figado, pulmoes, medula ossea, prostata, miisculos esqueleticos ou bago quando em com para Qao com os animais de controle. Assim, ο IRL1620 pode seletivamente aumentar ο envio dos agentes quimiotera- peuticos ao tecido de tumor.

Estudos de Eficacia: Efeito de IRL1620 na eficacia de doxorubicina (DOX) No referido estudo,丨RL1620 (N-Succinyl-[Glu9,Ala11,15] Endotelina fragmento 8- 21) foi obtido da American Peptides (Sunnyvale, CA). Hidrocloreto de doxorubicina (adria- micina, solugao de 2 mg/mL) foi adquirido da Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford, OH). 5- Flurouracila (50 mg/mL) foi adquirido da Cadlia Pharmaceuticals (Ahmedabad, India). Ceta- mina e xilazina foram adquiridos da Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO).

Tumores de prostata foram induzidos ratos machos Copenhagen de cinco semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN) como anteriormente descrito. Os procedimentos experi- mentais se iniciaram uma vez que ο tamanho do tumor alcangou cerca de 200 mm3. Os a- nimais portadores de tumor foram aleatoriamente divididos em seis grupos (8 ratos/grupo): Grupo I -Salina; Grupo Il - IRL1620 (3 nmol/kg); Grupo III - Veiculo (salina) + DOX (2.5 mg/kg); Grupo IV- Veiculo (salina) + DOX (5 mg/kg); Grupo V - IRL1620 (3 nmol/kg) + DOX (2.5 mg/kg); e

Grupo Vl - IRL1620 (3 nmol/kg) + DOX (5 mg/kg).

DOX foi diluido em salina a um volume final de 1,0 mL e injetada por meio da veia do rabo 15 minutos apos salina ou a administragao de IRL 1620. O esquema de dosagem foi uma vez a cada tres dias por um total de 4 doses. O peso corporal e ο tamanho do tumor foram monitorados a cada tres dias ate 12 dias apos a dose final. Os animais foram sacrifi- cados 12 dias apos a dose final (4°). Os tumores foram separados e pesados, e os tecidos foram observadas quanto a metastases. Os tecidos e tumor foram preservados em 10% de formalina tamponada para analise histopatologica.

Peso corporal. Houve um aumento no peso corporal no grupo de ratos tratados com salina ou IRL1620 isoladamente. O peso corporal dos animais tratados com salina ou IRL1620 isoladamente no inicio do experimento foi observado ser 152 土 6.97 e 148.8 土 2·52 g respectivamente que aumentou para 178.8 土 4·7 e 175.72 土 2.35 g, respectivamente, no dia 19 do estudo. Os ratos que receberam salina e DOX, ou IRL1620 e DOX apresentaram uma redugao no peso corporal. A redugao maxima no peso corporal foi observada ser -8.46 土 3.88 e -10.03 土 2·12 no grupo de ratos tratados com salina + DOX (5 mg/kg) e IRL1620 + DOX(5 mg/kg), respectivamente, no dia 13. Entretanto1 a redugao no peso corporal nao foi observada ser significante em qualquer ponto do tempo entre qualquer um dos grupos ad- ministrados com DOX a partir do inicio do tratamento (FIGURA 16 A).

Volume de tumor. Volume de tumor de salina ou os ratos tratados com IRL 1620 aumentou em um rapido coeficiente e todos os ratos nos referidos grupos foram sacrificados no dia 19 em virtude da grande carga de tumor. Todos os outros grupos foram sacrificados no dia 22. Os ratos tratados com salina ou os ratos tratados com IRL 1620 apresentaram um volume de tumor de 10166 土 957 e 11033 土 873 mm3, respectivamente, com ο sacrificio. O volume de tumor dos ratos tratados com salina + DOX (2.5 mg/kg) e com salina + DOX (5 mg/kg) foi observado ser 9102 土 1442 e 4204 土 299 mm3, respectivamente. Os ratos trata- dos com IRL1620 + DOX (2.5 mg/kg) registraram um volume de tumor de 5544 土 845 mm3. O menor volume de tumor (1965 土 332 mm3) foi observado no grupo de ratos tratados com IRL1620 + DOX (5 mg/kg). A redugao em volume de tumor em ratos tratados com IRL1620 + DOX (5 mg/kg) foi observado ser significante nos dias 10, 13, 16, 19 e 22 as em compara- 9§o com os ratos tratados com salina + DOX (5 mg/kg) (FIGURA 16B).

Peso de tumor. Os ratos tratados com salina, IRL1620, e com salina + DOX (2.5 mg/kg) apresentaram um peso de tumor comparavel com ο sacrificio (19.14 土 1.8, 20.77 土 1.64 e 17.14 土 2.42 g, respectivamente). O peso de tumor ou os ratos tratados com salina + DOX (5 mg/kg); IRL1620 + DOX (2.5 mg/kg) e IRL1620 + DOX (5 mg/kg) foi reduziu a 7.19 土 0.56, 10.44 土 1.42 e 3.31 ± 1.64 g respectivamente com ο sacrificio no dia 22. Houve a signi- ficante diferenga no peso de tumor entre os ratos tratados com salina + DOX (5 mg/kg) e com IRL1620 + DOX (5 mg/kg) (p < 0.005). Os referidos estudos demonstram que IRL1620 significativamente aumenta a eficacia anticancer deDOX (A FIGURA 16C).

Estudos de Eficacia: Efeito de IRL1620 na eficacia da 5-Flurouracila (5-FU)

Em um estudo de acompanhamento, os mesmos procedimentos foram seguidos exceto em que os ratos que portam tumor foram dispostos aleatoriamente nos seis grupos a seguir (6 ratos/grupo) para examinar ο efeito de IRL1620 na eficacia da 5-FU:

Grupo I -Salina;

Grupo Il - IRL1620 (3 nmol/kg);

Grupo III - Veiculo (salina) + 5-FU (25 mg/kg);

Grupo IV- Veiculo (salina) + 5-FU (50 mg/kg); Grupo V - IRL1620 (3 nmol/kg) + 5-FU (25 mg/kg); e

Grupo Vl - IRL1620 (3 nmol/kg) + 5-FU (50 mg/kg).

A 5-FU foi diluida em salina em um volume final de 1,0 mL e injetada por meio da veia do rabo 15 minutos apos a salina ou a administragao de IRL 1620. O esquema de do- sagem e os procedimentos foram os mesmos que os acima mencionados no estudo de DOX.

Peso corporal. O peso corporal dos animais de salina ou de IRL1620 no inicio do experimento foi observado ser 172 土 4.87 e 176.9 ± 6.19 g respectivamente, ο que foi au- mentado para 200.3 土 2.57 e 202.2 土 7.28 g, respectivamente no dia 16. O percentual de diferenga no ganho de peso corporal dos animais de salina ou de IRL1620 no dia 16 a partir do inicio do experiment。foi observado ser 16.17 ± 1.64 e 14.19 ± 1.66 respectivamente. O peso corporal de ratos em outros grupos foi comparavel ao do tratamento inicial e foi obser- vado ser 170.38 土 2.61, 174.6 土 3.45, 174.7 土 5.78 e 179.45 土 2.53 g para salina + 5-FU (25 mg/kg), para salina + 5-FU (50 mg/kg), para IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg) e para IRL1620 + 5- FU (50 mg/kg) respectivamente. Entretanto, ο peso corporal declinou durante as quantida- des a seguir: salina + 5-FU (25 mg/kg): -5.46 土 3.39; salina + 5-FU (50 mg/kg): -10.97 ±2.18; IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg): -8.27 ± 2.31; e IRL1620 + 50 mg/kg: -11.20 ± 2.41 (FIGURA 17A).

Volume de tumor. Os ratos tratados com salina ou com IRL 1620 apresentaram um rapido aumento progressive? em tamanho do tumor e todos os ratos nos referidos grupos foram sacrificados no dia 16 em virtude da grande carga de tumor. Nao houve significante diferenga no tamanho do tumor de ratos administrados com salina + 5-FU (25 mg/kg) e com IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg). Entretanto, houve uma redugao consistente em volume de tu- mor de ratos tratados com IRL1620 + 5-FU (50 mg/kg) nos dias 13, 16, 19 e 22 em compa- ragao com os ratos tratados com salina + FU (50 mg/kg) (FIGURA 17B).

Peso de tumor. Nao houveram diferengas significativas no peso de turn ο res de ra- tos administrados com salina ou com IRL1620 com ο sacrificio no dia 16 (os pesos foram 17.92 土 2.01 e 19.50 土 2.37 g respectivamente). Houve uma redugao de 38.18 % no peso de tumor de ratos tratados com IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg) em comparagao com os animais tratados com salina + 5-FU (25 mg/kg). Ademais, houve uma diferenga de 167.19 % no peso de tumor entre os ratos tratados com IRL1620 + 5-FU (50 mg/kg) e os tratados com salina + 5-FU (50 mg/kg) (p< 0.01) (FIGURA 17C). Os referidos resultados demonstram que ο IRL1620 significativamente aumenta a eficacia de 5-FU na redugao de volume de tumor e peso de tumor.

Os referidos estudos demonstram coletivamente que ο IRL1620 e eficaz em um modelo animal de cancer de prostata para aumentar perfusao de sangue de tumor, aumen- ta r ο envio dos agentes quimioterapeuticos para ο tumor e aumentar a eficacia dos agentes quimioterapeuticos.

MODELO DE MELANOMA

Exemplo 6. Efeito de IRL1620 na perfusao de tumor e na Biodistribuigao do paclita-

xel

Ratos machos pelados foram usados nos estudos de modelo de melanoma descri- tos. Todos os procedimentos e ο cuidado com os animal foram de acordo com as Iinhas ge- rais estabelecidas pelo Animal Care Committee of the University of Illinois at Chicago. As

instalagdes dos animais foram mantidas a temperature controlada (23 士 1°C), umidade (50 土 o/o) e em Iuz artificial (L0600-1800 h). As instalagoes dos animais foram mantidas de a- cordo com Federal Regulations e sao abonadas pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care.

IRL1620 (N-Succinil-[Glu9, Ala11,15] fragmento de Endotelina 8-21) foi obtido da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). [3H]paclitaxel foi adquirido da Moravek Biochemicals (Brea, CA). Paclitaxel (solugao de 6 mg/mL) foi adquirido da Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford, OH). Cetamina e xilazina foram adquiridos da Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). Solubilizante de tecido (TS-2) foi obtido da RPI Corp. (Chicago, IL).

Um modelo de melanoma transplantado inoculado com uma Iinhagem celular foi usado para ο estudo. Os ratos foram inoculados por via subcutanea com um milhao de celu- Ias de melanoma humano (UISO-MEL-2). Ratos com um volume de tumor de cerca de 200 mm3 - 400 mm3 foram selecionados para ο estudo.

Estudo de Perfusao. Ratos (N = 4/grupo) foram anestesiados usando cetamina (150 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) como uma injegao i.p. combinada. Os animais foram dispostos em uma almofada de aquecimento (37°C) para minimizar as variagoes de temperatura. Uma incisao de 10 mm de comprimento foi produzida na pele circundando ο tumor. Um modelo de sonda de fibra otica padrao conectado a um Periflux PF2b 4000 Fluxometria Doppler a Laser (MP3 sonda de fluxo, Moors Instruments, Devon, England) foi aplicado a superficie exposta do tumor. A constante de tempo foi ajustada em 1,5 segundos e a Iargura de banda foi ajustada em 4 kHz. Os valores de fluxo foram adquiridos usando ο programs Polyview. Uma Iinha basal de 15 minutos de registro estavel foi obtida antes da administragao de sali- na ou de IRL1620 (3 nmol/kg) por meio da veia do rabo e a perfusao foi registrado por 3 ho- ras.

A administragao de salina nao produziu qualquer mudanga significante na perfusao de sangue de tumor de melanoma de rato. Um aumento de 154.4%, 189.0%, 198.1%, 172.8% e 94.07.12% a partir da Iinha basal em perfusao de tumor foi observada a 30, 60, 90, 120 e 150 minutos respectivamente em seguida da administragao de IRL 1620. Assim, ο IRL1620 significativamente aumentou a perfusao de sangue de tumor em melanoma de rato quando em comparagao com os controles tratados com salina. O referido efeito foi transito- rio, durando por cerca de 2 horas (FIGURAS 18A e 18B).

Estudo de Biodistribuigao. Ratos portadores de tumor foram anestesiados com ce- tamina (150 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) como uma injegao i.p. combinada. Os animais foram aleatoriamente agrupados (N = 4/grupo) para receber salina ou IRL1620 (3 nmol/kg) por meio da veia do rabo em um volume final de 0,1 mL. Um rato de cada grupo tambem rece- beu [3H]paclitaxel (10 p,Ci/rato em 50:50 de Cremofor EL: etanol) diluido a uma concentra- gao de 20:80 [3H]paclitaxel:salina em um volume final de 1,0 mL (i.v) 15 minutos apos a ad-

ministragao de salina ou IRL 1620. Os animais foram sacrificados 3 horas apos a adminis- tragao de [3H]paclitaxel_ A concentragao do [3H]paclitaxel foi determinada no tumor, coragao, rins, figado, pulmoes e ba?o. O tumor e orgaos foram fatiados em pequenas pegas. 500 mg de tecido ou tumor foi disposta em frascos separados que continham solubilizante de tecido (6 mL) e incubados em um banho de agua a 50° C. Os frascos foram removidos a partir do banho de agua apos ο tecido ou tumor ser dissolvido e 1,2 mL de 10 % de acido acetico glacial foi adicionado. O conteCido do frasco foi igualmente dividido em 3 frascos e 15 mL do coquetel de Iiquido de cintilagao (Safety Solve, RPI Corp, Chicago, IL) foi adicionado a cada frasco e mantido durante a noite para equilibrio. A radioatividade nos tubos foi contada u- sando um contador de cintilagao Iiquida (Beckman Coulter, LS 6500). Como mostrado na FIGURA 19，a concentragao de [3H]paclitaxel no tumor foi signi-

ficativamente aumentada em ratos tratados com IRL1620 em comparagao com os ratos tra- tados com salina. A concentragao de [3H]paclitaxel no tumor foi observada ser 40.77 e 274.28 nmol/g no tecido dos animais injetados com salina ou IRL1620，respectivamente, 15 minutos antes [3HJa administragao de paclitaxel. Houve um aumento de 572.99 % no tumor [3H]paclitaxel dos animais tratados com IRL1620 em comparagao com ratos tratados com veiculo. Entretanto, a administragao de IRL 1620 nao produziu significante aumento no a- ciimulo de [3H]paclitaxel no coragao, rins, figado, pulmdes ou bago quando em comparagao com os animais tratados com salina. Assim, ο IRL1620 pode significativamente aumentar a capta^ao e ο envio do paclitaxel ao tecido de tumores sem afetar ο seu envio a outros or- gaos.

Concluindo, IRL1620 pode ser usado como um vasodilatador seletivo de tumor e pode ser usado para seletivamente aumentar ο envio e a eficacia dos agentes quimiotera- peuticos. O presente estudo claramente demonstra que concentrates de droga mijltiplas vezes maior pode ser alcangada no tecido de tumor ao se adotar a referida estrategia tera- peutica. Finalmente, os antagonistas receptores de ETA foram tambem propostos para a- primorar ο fluxo de sangue ao tumor (Sonveaux et al.} Cancer Res, 64:3209 (2004)) e po- dem ser usados para aumentar ο envio de drogas anticancer para ο tumor de acordo com a presente invengao.

As composites farmaceuticas que contem os ingredientes ativos descritos sao a- dequadas para a administragao a seres humanos ou outros mamiferos. Tipicamente, as composigoes farmaceuticas sao estereis, e nao contem compostos toxicos, carcinogenicos， ou mutagenicos que possam ocasionar uma reagao adversa quando administradas. A adrrH- riistragao da composigao farmaceutioa pode ser realizada antes, durante, ou apos a instala- gao do desenvolvimento do tumor solido. Um metodo da presente invengao pode ser realizado usando os ingredientes ativos

como descritos acima, ou como um sal fisiologicamente aceitavel, derivado, prodroga, ou solvato do mesmo. Os ingredientes ativos podem ser administrados como ο composto Iiqui- do, ou como uma composigao farmaceutica que contem uma ou ambas as entidades. As composig5es farmaceuticas incluem aquelas onde os ingredientes ativos sao administrados em uma quantidade eficaz para alcangar seu objetivo pretendido. Mais espe- cificamente, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade eficaz para evitar ο desenvolvimento de, para eliminar, para retardar a progressao de, ou para reduzir ο tamanho de um tumor solido. A determinagao de uma quantidade terapeuticamente eficaz esta bem dentro da capacidade daqueles versados na tecnica, em especial na Iuz da descri- 9§o detalhada aqui proporcionada.

Uma "dose terapeuticamente eficaz" se refere a quantidade dos ingredientes ativos que resulta em alcan?ar ο efeito desejado. A toxicidade e a eficacia terapeutica dos referidos ingredientes ativos podem ser determinados por procedimentos farmaceuticos em cultures celulares ou em animais experimentais, por exemplo, determinando a LD50 (a dose Ietal a 50% da populagao) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da populagao). A pro- porgao de dose entre os efeitos toxicos e terapeuticos e ο indice terapeutico, que e expresso como a proporgao entre LD50 e ED50. Um alto indice terapeutico e preferido. Os dados obti- dos podem ser usados na formula^ao de uma faixa de dosagem para uso em seres huma- nos. A dosagem dos ingredientes ativos preferivelmente se encontra na faixa das concen- tragSes circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro da referida faixa dependendo da forma de dosagem empregada, e da via de administragao utilizada.

A formula^ao e a dosagem exatas sao determinadas por um medico individual em vista das οοηάϊςδβε do paciente. A quantidade de dosagem e ο intervalo podem ser ajusta- dos individualmente para proporcionar os niveis de ingredientes ativos que sao suficientes para manter os efeitos terapeuticos ou profilaticos.

A quantidade da composiQao farmaceutica administrada pode ser dependente do individuo em tratamento, no peso do individuo, na gravidade da doenga, da maneira de ad- ministragao, e do julgamento do medico que prescreve.

Os ingredientes ativos podem ser administrados isoladamente, ou em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitavel selecionado com relagao a via de administragao pretendida e a pratica farmaceutica padrao. As composig5es farmaceuticas para uso de acordo com a presente invengao assim podem ser formuladas de modo convencional usan- do um ou mais veiculos fisiologicamente aceitaveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam ο processamento dos ingredientes ativos em preparagdes que podem ser usa- das farmaceuticamente.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz dos ingredientes ativos e adminis- trada, a composi^ao pode ser na forma de uma solugao aquosa parenteralmente aceitavel Iivre de pirogeno. A preparagao das referidas solug5es parenteralmente aceitaveis, coriside- rando pH, isotonicidade, estabilidade, e semelhante, esta dentro da tecnica. Uma composi- ςΒΟ preferida para injegao intravenosa tipicamente contera um veiculo isot6nico embora as caracteristicas nao sejam necessarias.

Para uso veterinario, os ingredientes ativos sao administrados como uma formula- gao adequadamente aceitavel de acordo com a pratica veterinaria normal. O veterinario po- de prontamente determinar ο regime de dosagem que e mais apropriado para um animal particular.

Diversas adaptagdes e modificag5es das modalidades podem ser implementadas e usadas sem se desviar do ambito e espirito da presente invengao a qual pode ser praticada de modo diferente que ο especificamente aqui descrito. A descrigao acima pretende ser ilus- trativa, e nao restritiva. O ambito da presente invengao deve ser determinado apenas pelas reivindicag5es.

Os termos e expresses que foram aqui empregados sao usados como termos de descrigao e nao como Iimitagao1 e nao ha intengao no uso dos referidos termos e expres- s5es de excluir as equivalentes das caracteristicas mostradas e descritas, ou porgdes das mesmas, sendo reconhecido que diversas modifica?5es sao possiveis dentro do ambito da presente invengao reivindicada. Ademais, qualquer uma ou mais caracteristicas de qualquer modalidade da presente invengao pode ser combinada com qualquer uma ou mais outras caracteristicas de qualquer outra modalidade da presente invengao, sem se desviar do espi- rito da presente invengao.

A nao ser que de outro modo indicado, todos os niimeros que expressam as quan- tidades dos ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condi^des de rea?ao, e assim por diante na especifica^ao e nas reivindicagdes devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de." Assim, a nao ser que indicado ο con- trario, os parametros numericos determiriados na especifica^ao a seguir e nas reivindica- goes anexas sao aproximagoes que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se pretende obter pela presente invengao. Ainda por ultimo, e nao como uma tentative de Iimitar ο pedido da doutrina de equivalentes para ο ambito das reivindicag5es, cada pa- rametro numerico deve pelo menos ser construido na Iuz dos nCimeros de digitos significan- tes reportados e pela aplicagao de tecnicas simples de arredondamento. Nao obstante que as faixas numericas e os parametros que determinam ο amplo ambito da presente invengao sejam aproximagdes, os valores numericos determinados nos exemplos especificos sao reportados ο mais precisamente possivel. Qualquer valor numerico, entretanto, inerentemen- te contem determinados erros necessariamente resultantes do desvio padrao encontrado em suas respectivas medigoes de teste.

Os termos "um" e "uma" e "o" "a" e similares referentes usados no contexto que descreve a presente invengao (em especial no contexto das reivindicag5es a seguir) devem ser coηstruidos para cobrir tanto ο singular como ο plural, a nao ser que de outro modo aqui indicado ou claramerite contra-indicado pelo contexto. A recita^ao da faixa de valores aqui e meramente indicada para servir como um metodo abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que se encontre na referida faixa. A nao ser que de outro modo indica- do aqui, cada valor individual e incorporado na especificagao como se tivessem sido indivi- dualmente indicado aqui. Todos os metodos descritos aqui podem ser realizados em qual- quer ordem adequada a nao ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo clara- mente contra-indicado pelo contexto. O uso de qualquer e de todos os exemplos, ou lingua- gem exemplificativa (por exemplo, "tal como") proporcionada aqui pretende meramente me- Ihor esclarecer a presente invengao e nao acarreta em uma Iimitagao do ambito da presente invengao reivindicada. Nenhuma Iinguagem na especificagao deve ser construida como in- dicando qualquer elemento nao reivindicado essencial para a pratica da presente invengao.

Grupos de elementos alternatives ou de ou modalidades da presente inven?ao aqui descritos nao devem ser construidos como Iimitag5es. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinagao com outros membros do grupo ou outros elementos encontrados aqui. E antecipado que um ou mais membros de um grupo podem ser incluidos ou eliminados a partir de um grupo de raz5es de conveniencia e/ou patentabilidade. Quando qualquer um de inclusao ou delegao ocorrer, a especifica^ao pretende aqui conter ο grupo como modificado, preenchendo assim a descrigao escrita de todos os grupos Markush usados nas reivindica?oes anexas.

Determinadas modalidades da presente invengao sao aqui descritas, incluindo ο melhor modo conhecido pelos inventores de implementar a presente invengao. Evidente- mente，variagdes nas referidas determinadas modalidades se tornarao aparentes daqueles versados na tecnica com a Ieitura da descrigao anterior. O inventor espera que aqueles ver- sados na tecnica empreguem as referidas varia^des como apropriado, e os inventores pre- tendem que a presente invengao seja praticada de outro modo alem do que ο descrito espe- cificamente aqui. Assim, a presente invengao inclui todas as modificagdes e equivalerites do objeto recitado nas reivindicagdes aqui anexas como permitido pela Iei aplicavel. Ademais1 qualquer combina^ao dos elementos acima descritos em todas as possiveis variag5es dos mesmos esta englobada pela presente invengao a nao ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente indicado pelo contexto.

Ademais, numerosas referencias foram feitas as patentee e publicag5es impresses atraves a presente especificagao. Cada uma das referencias acima citadas e publica?5es impressas se encontram aqui incorporadas por referencia em sua totalidade. Encerrandoj deve ser entendido que as modalidades da presente invengao aqui

descritas sao ilustrativas dos principios da presente invengao. Outras modificagoes que po-

dem ser empregadas se encontram inseridas no ambito da presente invengao. Assim, ape- nas como exemplo, mas nao como Iimitagao1 configuragoes altemativas da presente inven- gao podem ser utilizadas de acordo com os ensinamentos aqui. Assim, a presente invengao nao esta Iimitada ao que esta precisamente mostrado e descrito.

Claims

1. Metodo de contribuir para ο tratamento de um cancer CARACTERIZADO pelo fa- to de que compreende admiriistrar um agonista endotelina B (ETb) e um agente quimiotera- peutico.

2. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ’ CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido cancer e um tumor solido.

3. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido tumor solido e selecioriado a partir do grupo que consiste em um tumor ovariano, tumor de colon, Sarcoma de Karposi, um tumor de mama, um melanoma, um tumor de pros- tata, um meningioma, um tumor de figado tumor,um tumor filodio de mama e combinagdes dos mesmos.

4. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agonista ETb e selecionado a partir do grupo que consiste em ET-1, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc-[Glu9, Ala1115]ET-1 (8-21)), sarafotoxina 56c, [Ala1' 3' 1' 15]ET-1, e combina^des dos mesmos.

5. Metodo, de acordo com a reivindicaQao 1，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agente quimioterapeutico e selecionado a partir do grupo que consiste em adriami- cina, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, aIfa interferon, beta interferon, gama interferon, interleucina 2，irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, 5-fluorouracila, e combinagdes dos mesmos.

6. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agonista ETb seletivamente aumenta ο suprimento de sangue ao referido tumor so- lido.

7. Metodo, de acordo com a reivindicagao 6，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido aumento no referido fornecimento de sangue ao referido tumor aumenta ο envio do referido agente quimioterapeutico ao referido tumor solido.

8. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agonista ETb e ο referido agente quimioterapeutico sao administrados substancia卜 mente simultaneamente.

9. Metodo, de acordo com a reivindicagao 8，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agonista ETb e ο referido agente quimioterapeutico sao administrados como um composigao Cinica.

10. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agonista ETb e ο referido agente quimioterapeutico sao administrados em seqtien- cia.

11. Metodo, de acordo com a reivindicagao 10，CARACTERIZADO pelo fato de que ο referido agente quimioterapeutico e administrados antes do referido agonista ETb ou ο referido agonista ETb e administrado antes do referido agente quimioterapeutico.

12. Composigao, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um agente qui- mioterapeutico, um agonista ETB1 e um excipiente opcional.

13. Artigo de fabricagao, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma composigao compreendendo um agonista ETb, e iriformagoes de instrugao direcionando a administragao da referida composigao com um agente quimioterapeutico para tratar um tu- mor solido.

14. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicagao 13，adicionalmente com- preendendo ο referido agente quimioterapeutico.

15. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicagao 14, CARACTERIZADO pe- lo fato de que ο referido agonista ETb e ο referido agente quimioterapeutico sao parte da mesma composigao, sao proporcionados como composigdes separadas, ou ambos.

16. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicaQao 14，CARACTERIZADO pe- lo fato de que referido agonista ETb e selecionado a partir do grupo que consiste em ET-1, ET-2, ET-3，BQ3020, IRL1620 (N-suc-[Glu9, Ala11,15]ET-1 (8-21)), sarafotoxina 56c’ [A- la13-11'15]ET-1,e combina95es dos mesmos.

17. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicagao 14，CARACTERIZADO pe- lo fato de que referido agonista ETb e IRL1620.

18. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicagao 14，CARACTERIZADO pe- Io fato de que ο referido agente quimioterapeutico e selecionado a partir do grupo que con- siste em adriamicina, camptotecina， carboplatina， cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, alfa interferon, beta interferon, gama interferon, interleucina 2，irinotecan, docetaxel, paclita- xel, topotecan, 5-fluorouracila, e combinagdes dos mesmos.

19. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicaQao 14, CARACTERIZADO pe- Io fato de que ο referido agente quimioterapeutico e paclitaxel.

20. Artigo de fabricagao, de acordo com a reivindicagao 14，CARACTERIZADO pe- lo fato de que referido agonista ETb e IRL1620 e ο referido agente quimioterapeutico e sele- cionado a partir do grupo que consiste em paclitaxel, doxorubicina, 5-fluorouracila, e combi- nag5es dos mesmos.