BRPI0715754A2 - mÉtodo para a produÇço de fator do crescimento similar Á insulina i - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE FATOR DO CRESCIMENTO SIMILAR À INSULINA I. A presente invenção refere-se a métodos para a produção de IGF-I, caracterizados por cultivo de uma célula hospedeira procariótica compreendendo um vetor de expressão contendo um ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão compreendendo o dito IGF-I ligado de modo N- terminal à extremidade de C de um propeptídeo, pelo que o dito propeptídeo finaliza C terminalmente com os aminoácidos -Y-Pro, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thur, Ala-pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro, recuperação e clivagem da dita proteina de fusão a IgA protease, e recuperação do dito IGF-I. O IGF-I é útil para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer.
Description
Relatorio Descritivo da Patente de Invengao para "ΜETODO PARA A PRODUQAO DE FATOR DO CRESCIMENTO SIMILAR A INSU- LINA I".
A presente invengao refere-se a um metodo para a produgao do fator do crescimento similar a insulina I (IGF-I), as composigdes farmaceuti- cas, e aos metodos de uso. Antecedentes da Invencao
O fator do crescimento similar a insulina I (IGF-I) humano e um hormonio circulante estruturalmente relacionado a insulina. O IGF-I e tradi- cionalmente considerado ο mediador principal das ag5es do hormonio do crescimento sobre os tecidos perifericos. O IGF-I consiste em 70 aminoaci- dos e e tambem chamado somatomedina C e definido pelo SwissProt N2 P01343. O uso, a atividade e a produgao sao mencionados, por exemplo, em Ie Bouc1 Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., et al., Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Ac- ta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K., et al., J. Clin. Endo- crinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP O 123 228; EP O 128 733; US 5.861.373； US 5.714.460； EP O 597 033； WO 02/32449; WO 93/02695.
A regulagao da fungao do IGF-I e bem complexa. Na circulagao, somente 0,2 % do IGF-I existe na forma livre, enquanto que a maior parte esta Iigada as proteinas de Iigagao ao IGF (IGFBP's), as quais tern afinida- des muito altas pelos IGF's e modulam a fungao do IGF-I. O fator pode ser Iiberado Iocalmente por mecanismos que Iiberam ο IGF-I, tais como a pro- teolise das IGFBPs pelas proteases.
O IGF-I desempenha uma fungao paracrina no cerebro em de- senvolvimento e maduro (Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778). Os estudos in vitro indicam que ο IGF-I e um agente trofico nao- seletivo potente para diversos tipos de neuronios no SNC (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570; Svrzic, D.，e Schubert, D·，Biochem. Biophys.
Res. Commun. 172 (1990) 54-60), incluindo os neuronios dopaminergicos (Knusel, B., et al·，J. Neurosci. 10(1990) 558-570) e os oligodendrocitos (McMorris, F.A., e Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., et al·, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R丄.，e McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)). A US 5.093.317 menciona que a sobrevivencia das celulas neuronals colinergicas e aumentada por administragao do IGF-I. Sabe-se adicionalmente que ο IGF-I estimula a regeneragao do nervo periferico (Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398) e aumenta a atividade da ornitina descarboxilase (US 5.093.317). A US 5.861.373 e a WO 93/02695 mencionam um metodo de tratar as Iesdes ao, ou as doengas do sistema nervoso central que pre- dominantemente afetam a glia e/ou as celulas neuronals nao-colinergicas por aumento da(s) concentragao(oes) ativa(s) de IGF-I e/ou seus analogos no sistema nervoso central do paciente. A WO 02/32449 e dirigida aos me- todos para reduzir ou prevenir ο dano isquemico no sistema nervoso central de um mamifero, por administragao a cavidade nasal do mamifero de uma composigao farmaceutica compreendendo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de IGF-I ou biologicamente ativa do mesmo. O IGF-I e absorvido atraves da cavidade nasal e transportado para ο sistema nervoso central do mamifero em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir ο dano isque- mico associado a um evento isquemico. A EP 0874641 reivindica ο uso de um IGF-I ou um IGF-II para a fabricagao de um medicamento para tratar ou prevenir dano neuronal no sistema nervoso central, devido a demencia rela- cionada a AIDS, doenga de Alzheimer (AD), doenga de Parkinson, doenga de Pick, Doenga de Huntington, encefalopatia hepatica, sindromes ganglio- nicas corticais-basais, demencia progressiva, demencia familiar com parapa- resia espastica, paralisia supranuclear progressiva, esclerose mCiltipla, escle- rose cerebral de Schilder ou encefalomielite hemorragica necrotizante agu- da, onde ο medicamento esta em uma forma para a administragao parente- ral de uma quantidade eficaz do dito IGF fora da barreira hematoencefalica ou da barreira hematoespinhal.
A redugao dos niveis no cerebro e no soro de IGF-I Iivre tern es-
tado relacionada a patogenese de formas esporadicas e familiares da AD. Alem disso, ο IGF-I protege os neuronios contra a neurotoxicidade induzida por Αβ (Niikura, T., et al.，J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364). Recentemente, mostrou-se que ο IGF-I ad- ministrado perifericamente e capaz de reduzir os niveis de Αβ no cerebro, em ratos e camundongos (Carro, E·, et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397). Ademais, ο estudo demonstrou que em um modelo de camundongo com AD transgenico, ο tratamento com IGF-I prolongado reduziu significativamente a carga de placa amiloide no cerebro. Estes dados suportam fortemente a i- deia que ο IGF-I e capaz de reduzir os niveis de Αβ no cerebro e a demencia do cerebro associada as placas por depuragao de Αβ do cerebro.
O sitio de reconhecimento da IgA Protease e descrito como Yaa- Pro.!.Xaa-Pro. Yaa significa Pro (ou raramente Pro em combinagao com Ala, Gly ou Thr: Pro-Ala, Pro-Gly, ou Pro-Thr). Xaa significa Thr, Ser ou Ala (Po- hlner, J. et al., BioyTechnoIogy 10 (1992) 799-804; Pohlner1 J. et al., Nature 325 (1987) 458-462 e US 5.427.927). Os sitios de clivagem naturalme门te foram identificados por Wood, S.G. e Burton, J., Infect lmmun. 59 (1991) 1818-1822. Os substratos peptidicos sinteticos para a imunoglobulina A1 protease de Neisseria gonorrhoeae (tipo 2) sao os sitios autoproteoliticos Lys-Pro-Ala-Pro.!.Ser-Pro, Val-Ala-Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ala- Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Thr-Pro e os Sitios de Cli- vagem de IgAI Pro-Pro-Thr-Pro.!.Ser-Pro e Ser-Thr-Pro-Pro.!.Thr-Pro.
A WO 2006/066891 divulga conjugados consistindo em um fator do crescimento similar a insulina I (IGF-I) e um ou dois grupos poli(etileno glicol), caracterizados pelo fato de que ο dito IGF-I tem uma alteragao de aminoacido em ate tres posig5es de aminoacidos 27, 37，65, 68 da sequen- cia de aminoacidos de IGF-I do tipo selvagem, de modo que um ou dois dos ditos aminoacidos sao Iisina e ο aminoacido 27 e um aminoacido polar, po- re m nao a lisina, esta conjugado via o(s) grupo(s) amino primario(s) da(s) dita(s) lisina(s) e o(s) dito(s) grupo(s) poli(etileno glicol) tem(tem) um peso molecular global de 20 a 100 kDa. Tais conjugados sao Lite is para ο trata-
mento de distiirbios neurodegeneratives como a doenga de Alzheimer. A WO 2006/074390 refere-se as variantes de IGF-I e as protei- nas de fusao compreendendo as variantes de IGF-I e certos componentes da fusao. A WO 2006/074390 refere-se a certas variantes de IGF-I.
Os metodos para a produgao recombinante de IGF-I via uma ρ rote ι na de fusao sao conhecidos, por exemplo, de EP0155655 e US 5.158.875. Entretanto, verifica-se frequentemente a micro-heterogeneidade do IGGF-I produzido de modo recombinante (Forsberg, G. et. al·，Biochem. J. 271 (1990) 357-363). Sumario da Invencao A invengao proporciona um metodo para a produgao recombi-
nante de IGF-I sem metionina unida ao N-terminal, em procariotos, com pu- reza e rendimento altos. A invengao compreende um metodo para a produ- gao de IGF-I1 caracterizado por
a) cultivo de uma celula hospedeira procariotica compreendendo um vetor de expressao contendo um acido nucleico que codifica uma protei-
na de fusao compreendendo ο dito IGF-I Iigado de modo N-terminal a extre- midade de C de um propeptideo,
b) pelo que ο dito propeptideo finaliza C terminalmente com os aminoacidos -Y-Pro1 em que Y e selecionado a partir do grupo que consiste
em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro,
c) recuperagao e clivagem da dita proteina de fusao com a IgA
protease, e
d) recuperagao do dito IGF-I.
O IGF-I recuperado nao compreende nenhum residuo de metio-
nina unido na extremidade de N.
Uma modalidade preferida da invengao e um propeptideo sele- cionado a partir do grupo consistindo nos peptideos mostrados na SEQ ID NO:2-5.
Uma modalidade adicional da invengao e uma proteina de fusao
compreendendo ο dito IGF-I Iigado de modo N-terminal a extremidade de C
de um propeptideo, caracterizada pelo fato de que ο dito propeptideo finaliza C terminalmente com os aminoacidos -Y-Pro, em que Y e selecionado a par- ti r do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly- Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro. Devido a sequencia de -Y-Pro, ο pro- peptideo pode ser separado do dito IGF-I por tratamento com IgA protease.
De preferencia, a proteina de fusao de acordo com a invengao e
caracterizada pela formula Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-l], em que
• Met significa metionina,
• X1 e uma ligagao, serina ou asparagina,
• His e histidina,
· η e um niimero de O a 6,
• X2 e um peptideo ligante, selecionado a partir do grupo peptideos SEQ ID NO: 6-10，
• Pro e prolina, e
• Ye selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro- Ala, Pro-Gly1 Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
De preferencia, ο propeptide。e mostrado pela formula Met-Xi- Hisn-X2-Y-Pro-, em que
• Met significa metionina
• X1 e uma Iigagao1 serina ou asparagina, · His e histidina,
• η e um niimero de O a 6，
• X2 e um peptideo ligante, selecionado a partir do grupo que consiste nos peptideos SEQ ID NO: 6-10，
• Pro e prolina, e
· Ye selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro-
Ala, Pro-Gly1 Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
O propeptideo e Iigado de modo C terminal a extremidade de N (glicina) do IGF-I. O propeptideo preferivelmente tem um comprimento de ate 30 aminoacidos. De preferencia, X1 e uma ligagao. De preferencia, η e O ou 6. De preferencia, X2 e ο peptideo SEQ ID NO:7. De preferencia, Y e Pro-Arg-Pro.
A invengao adicionalmente compreende composigoes farmaceu- ticas contendo um IGF-I de acordo com a invengao, preferivelmente com um veiculo farmaceuticamente aceitavel.
A invengao adicionalmente compreende metodos para a produ- gao de composigoes farmaceuticas contendo um IGF-I de acordo com a in- vengao.
A invengao adicionalmente compreende ο uso de um IGF-I de acordo com a invengao para a preparagao de um medicamento para ο tra- tamento de AD.
A invengao adicionalmente compreende metodos para ο trata- mento de AD, caracterizado pelo fato de que uma quantidade farmaceutica- mente eficaz de IGF-I amino-reativo e administrada a um paciente que ne- cessita de tal tratamento, preferivelmente em uma a duas aplicagoes por sema 门 a.
Descricao Detalhada da Invencao Foi surpreendentemente verificado que a IgA protease, preferi-
velmente a IgA protease de Neisseria gonorrhoae, e capaz de clivar a se- quencia de aminoacidos Y-Pro.!.Gly-Pro. Y e selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro1 ou Pro-Arg-Pro. De preferencia, Pro-Pro.!.Gly-Pro ou Pro-Arg-Pro- Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0:11) (·!■: posigao de clivagem) e Citil como sitio de clivagem. O sitio de clivagem da IgA protease para ο processo de acordo com a presente invengao tern a sequencia de consenso de aminoacidos Y- Pro.!.Gly-Pro, pelo que Gly-Pro sao os primeiros dois aminoacidos de IGF-I. Y preferivelmente representa uma sequencia de aminoacidos que termina com o(s) aminoacido(s) Pro, Pro-Ala, Arg-Pro ou Pro-Arg-Pro. Tais sequen- cias de aminoacidos Y, especialmente Pro-Arg-Pro, podem ser prolongadas por um grupo adicional Ala ou Pro-Ala, como por exemplo em Ala-Pro-Arg- Pro (SEQ ID NO: 12) or Pro-Ala-Pro- Arg-Pro (SEQ ID NO: 13). As sequencia de aminoacidos de clivagem Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0:11), Pro-Ala-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0:14), Pro-Pro-.!.GIy-Pro (SEQ ID NO:15), Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0:16) ou Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-
Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0:17) sao particularmente preferidas. De acordo com a presente invengao, ο termo "IgA protease" in- clui as proteases que especificamente clivam a IgA e que sao descritas, por exemplo, em Kornfeld, SJ. e Plaut, A.G., Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534, como, por exemplo, a IgAI protease de Neisseria gonorrhoea (tipo 2). As IgA proteases recombinantes, tais como aquelas descritas em DE-A 36 22 221 ； Koomey’ J.M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881-7885; Bric- ker,丄，et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681-2685; Pohlner, J., Nature 325 (1987) 458-462; e Halter, R.，et al., EMBO J. 3 (1984) 1595- 1601，sao tambem, da mesma forma, adequadas. De preferencia, a dita IgA protease e a IgA protease de Neisseria gonorrhoae. De preferencia, a dita IgAI protease de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) tern a sequencia SEQ ID N0:21.
O IGF-I de acordo com a invengao refere-se a uma proteina hu- mana consistindo em 70 aminoacidos, que e tambem chamada somatome- dina C e definida pelo SwissProt N9 P01343. O uso, a atividade e a produgao sao mencionados, por exemplo, em Ie Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al·, FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist1 A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275- 277; Steenbergh, P.H., et al·, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K·, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP O 123 228； EP O 128 733； US 5.861.373; US 5.714.460； EP O 597 033； WO 02/32449; WO 93/02695.
O IGF-I de acordo com a invengao compreende um IGF-I sele- cionado a partir do grupo que consiste em IGF-I1 IGF-I truncado no C termi- nal (remogao de 3-6 aminoacidos), R36A (substituigao de arginina na posi- gao 36 por alanina), R37A. De preferencia, ο dito IGF-I esta Iigado de modo C terminal ao Fc humano da IgG, preferivelmente da IgGI ou lgG4.
O IGF-I truncado no C terminal (remogao de 3-6 aminoacidos) e ο IGF-I de SEQ ID N0.1, em que sao removidos 3-6 aminoacidos na extre- midade de C.
O R36A significa um IGF-I de SEQ ID NO. 1，em que a arginina na posigao de aminoacido 36 θ substituida pela alanina.
O R37A significa um IGF-I de SEQ ID NO. 1，em que a arginina na posigao de aminoacido 37 e substituida pela alanina.
O gene que codifica para a proteina de fusao e preferivelmente colocado sob ο controle de sinais de expressao adequados (preferivelmente induziveis), de modo que as proteinas de fusao possam ser produzidas de acordo com as exigencias. As celulas procarioticas ou eucarioticas (vegetais, bem como animais) adequadas podem ser usadas como celulas hospedei- ras para a produgao de fusoes de proteinas; os sistemas sem celulas sao, entretanto, tambem possiveis.
Uma modalidade preferida do processo de acordo com a presen- te invengao e caracterizada pelo fato de que uma celula hospedeira e trans- formada com um DNA recombinante ou um vetor recombinante, em que ο DNA ou ο vetor contem pelo menos uma copia de um gene que codifica para uma proteina de fusao de acordo com a invengao, e a celula transformada e cultivada em um meio adequado, ο gene que codifica para a proteina de fu- sao e deixado expressar na celula transformada, a proteina de fusao e cliva- da com a IgA protease e ο IGF-I e isolado.
A expressao da proteina de fusao de acordo com a invengao po- de, por exemplo, ser aperfeigoada, no nivel de DNA, por fusao com fragmen- tos de gene de beta-galactosidase sem lisina, i.e., Y contem uma parte de uma proteina beta-galactosidase sem lisina. As outras alternatives para au- mentar a expressao da proteina de fusao sao conhecidas para ο tecnico. A purificagao e a separagao do produto de expressao podem ser facilitadas por fusao com outros polipeptideos, em particular, com polipeptideos ou protei- nas que estejam altamente carregados (por exemplo, poli(Lys, Arg)) ou que possam ligar-se a substancias particulares com alta afinidade (por exemplo, estreptavidina) (ver, por exemplo, EP-A O 089 626, EP-A O 306 610). Os peptideos Iigantes especialmente preferidos sao os peptideos SEQ ID NO: 6-10，preferivelmente precedidos de modo N-terminal por SHHHHHH (SEQ ID NO:18), NHHHHHH (SEQ ID NO:19) ou HHHHHH (SEQ ID N0:20).
A presente invengao tambem proporciona um acido nucleico (re- combinante) que codifica para uma proteina de fusao de acordo com a pre- sente invengao e no qual um sitio de clivagem da IgA protease e incorporado na regiao de jungao entre ο propeptideo e ο IGF-I.
O DNA recombinante de acordo com a presente invengao pode ser obtido em um modo conhecido para alguem versado na area de biologia molecular. Para isto, um vetor que contem uma sequencia de DNA codifi- cando para a sequencia de aminoacidos de IGF-I e normalmente clivado com endonuclease(s) de restrigao na regiao da extremidade de 5' deste ge- ne e religado com oligonucleotideos que contem a sequencia desejada. Alem disso, a invengao tambem proporciona um vetor recombi-
nante que contem pelo menos uma copia de um DNA recombinante de a- cordo com a presente invengao. Os vetores que sao adequados como uma base para a expressao da proteina em organismos procarioticos sao conhe- cidos para ο tecnico. Este vetor e preferivelmente um que permita uma alta expressao do DNA recombinante de acordo com a presente invengao. O DNA recombinante sobre ο vetor esta preferivelmente sob ο controle de um sinal de expressao induzivel (por exemplo, promotor lambda, tac, Iac ou trp).
O vetor de acordo com a presente invengao pode estar presente de modo extracromossomico (por exemplo, plasmidio), bem como integrado no genoma do organismo hospedeiro (por exemplo, bacteriofago lambda). O vetor de acordo com a presente invengao e preferivelmente um plasmidio. Os vetores que sao adequados em cada caso para a expressao genica em um organismo hospedeiro particular sao conhecidos para alguem versado na area de biologia molecular. Ele pode ser um vetor eucariotico, porem preferi- velmente um vetor procariotico. Os exemplos de vetores adequados para a expressao do DNA de acordo com a presente invengao em procariotos sao, por exemplo, os vetores pUC e pUR comercialmente disponiveis.
A invengao tambem proporciona uma celula, preferivelmente uma celula procariotica, particular e preferivelmente uma celula de E. coli, a qual e transformada com ο DNA recombinante de acordo com a presente invengao ou/e com um vetor recombinante de acordo com a presente inven-
gao. Quando a proteina de fusao for expressa em procariotos, for- mam-se agregados moderadamente soldveis (corpos refrativos, corpos de inclusao) que sao inativos. Portanto, a proteina de fusao deve ser transfor- mada em sua forma ativa. Usando procedimentos que sao conhecidos para aqueles versados na tecnica (conforme., por exemplo, EP-A O 219 874，EP A O 114 506, WO 84/03711), realiza-se primeiramente uma solubilizagao por adigao de agentes de desnaturagao, que e seguida por renaturagao e, se desejado, etapas adicionais de purificagao.
As condi?5es requeridas para ο tratamento de uma proteina de fusao de IGF-I a ser clivada com as IgA proteases nao sao criticas. Neste processo prefere-se, entretanto, que a razao em peso de proteina de fusao de IGF-I para IgA protease seja 1:1 a 100:1. A reagao preferivelmente ocorre em uma soIugao aquosa tamponada de pH 6,5 a 8,5. A concentragao de tampao esta preferivelmente na faixa entre 50 e 500 mmols/l se desejado, com adigao de 0-100 mmols/l de cloreto de sodio. A clivagem e preferivel- mente realizada na temperatura ambiente por pelo menos 60 min ate 5 dias, preferivelmente entre 24 - 72 h.
Apos a solubilizagao, a renaturagao e a clivagem com a IgA pro- tease, ο ρ rod uto de clivagem obtido neste modo e preferivelmente purificado por meio de cromatografia por interagao hidrofobica, cromatografia por troca ionica e/ou fracionamento por tamanho. O IGF-I produzido neste modo esta Iivre de metionina na posigao -1. Formulacoes Farmaceuticas
Os IGF-I's podem ser administrados como uma mistura, ou dife- rentes especies separadas atraves de, por exemplo, cromatografia por inte- ragao hidrofobica, cromatografia por troca ionica ou cromatografia por exclu- sao de tamanho. Os compostos da presente invengao podem ser formulados de acordo com metodos para a preparagao de composigoes farmaceuticas, metodos estes que sao conhecidos para a pessoa versada na tecnica. Para a produgao de tais composig5es, um IGF-I de acordo com a invengao e com- binado, em uma mistura, com um veiculo farmaceuticamente aceitavel, pre-
ferivelmente por dialise ou diafiltragao contra uma solugao aquosa contendo os ingredientes desejados das composigoes farmaceuticas. Tais veiculos aceitaveis sao descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 18a edigao, 1990, Mack Publishing Company, editado por Oslo et al. (por exemplo, pp. 1435-1712). As composigdes tipicas contem uma quanti- dade eficaz da substancia de acordo com a ίηνβηςδο, por exemplo, de cerca de 0,1 a 100 mg/ml, juntamente com uma quantidade adequada de um vei- culo. As composi?5es podem ser administradas parenteralmente. O IGF-I de acordo com a invengao e administrado preferivelmente via aplicagao intrape- ritoneal, subcutanea, intravenosa, ou intranasal. As formulag5es farmaceuticas de acordo com a invengao podem
ser preparadas de acordo com metodos conhecidos na tecnica. Normalmen- te, as solugoes de IGF-I sao dialisadas ou diafiltradas contra ο tampao pre- tendido ser usado na composigao farmaceutica, e a concentragao de protei- na final desejada e ajustada por concentragao ou diluigao. Os exemplos e as sequencias a seguir sao proporcionados para
auxiliar ο entendimento da presente invengao, cujo verdadeiro escopo e a- presentado nas reivindicagdes em anexo. Entende-se que podem ser feitas modificagoes nos procedimentos apresentados, sem sair do espirito da in- vengao. Os nomes dos aminoacidos sao abreviados usando ο codigo de uma Ietra (por exemplo, R) ou ο codigo de tres Ietras (por exemplo, Arg). R36A significa um mutante de IGF-I no qual ο aminoacido arginina36 e subs- tituido por alanina.
Listagem de Sequencia
SEQ ID NO: 1 sequencia de aminoacidos do IGF-I humano (aminoa- cidos 49-118 da SwissProt P01343). SEQ ID NO: 2 sequencia de aminoacidos de um propeptideo preferido SEQ ID NO: 3 sequencia de aminoacidos de um propeptideo preferido SEQ ID NO: 4 sequencia de aminoacidos de um propeptideo preferido SEQ ID NO: 5 sequencia de aminoacidos de um propeptideo preferido SEQ ID NO: 6-10 Iigante SEQ ID NO: 11-17 sequencias de clivagem
SEQ ID NO: 18-20 outras SEQ ID NO: 21 sequencia de aminoacidos de uma IgAI protease de
Neisseria gonorrhoea (tipo 2)
Exemplos Exemplo 1
O vetor de expressao e a cepa de E. coli ύΐϊΙ sao descritos em EP O 972 838. A partir de um clone de E. coli, a proteina de fusao de ex- pressao e desenvolvida sobre placa de agar seletivo, um loop de inoculagao e transferido para meio seletivo (100 ml) e cultivado por 13 h a 37。C ate uma densidade optica (578 nm) de 2-4. Esta cultura e armazenada sobre gelo pelas 6 horas seguintes, antes da inoculagao automatizada da cultura princi- pal, a qual e efetuada a 37°C. A expressao do mutante de IGF-I e iniciada em uma densidade optica (578 nm) de 50 com a adigao de IPTG a 1，O mM. A fermentagao global dura ate 16 horas. A quantidade de proteina e deter- minada de modo densitometrico por comparagao da intensidade volumetrica da banda de proteina do produto com a banda de um padrao de IGF sobre um gel de SDS-PAGE. O caldo de cultura e coletado por centrifugagao. Para obter ο material de corpo de inclusao (IB) purificado, a bio-
massa coletada da fermentagao-padrao e tratada com ο seguinte procedi- mento: 0,3 g/100 g de biopeso seco de Lisozima e 5 U/1 g de biopeso seco de Benzonase sao incubados por 20 min e homogeneizados. 30 U/1 g de biopeso seco de Benzonase sao adicionadas e incubadas por 60 min. a 37°C. 0,5 L de tampao de Brij / Iitro e adicionado e incubado por 30 min., na TA. Apos a centrifugagao, ο pelete e ressuspenso novamente em 300 ml de Tampao de Tris-EDTA/100 g de biopeso Cimido (peso Limido de IB purifica- do), incubado por 30 min. na TA e centrifugado. 1 g de IBs/litro e solubilizado a temperatura ambiente em guanidina-HCI a 6,8 M, TrisHCI a 0,1 M, DTT a 0,1 M, pH 8,5，durante a noite. A solugao turva e dialisada a 4°C contra gua- nidina-HCI a 6,8 M1 TrisHCI a 0,1 M, pH 8,0. Apos a dialise, os componentes insolijveis foram removidos por centrifugagao. O dobramento e efetuado por diluigao de 50 vezes da solugao de pro-IGF-l em arginina a 0,8 M, TrisHCI a 0,1 M, guanidina-HCI a 0,1 M1 GSH a 1 mM, GSSH a 1 mM, pH 8,5, a tem-
peratura ambiente. Apos duas horas, a solugao e suplementada com cloreto de sodio a 2 Μ, filtrada e aplicada em uma vazao de 10 ml/min a uma coluna de HIC (Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE1 Amersham Biosciences), que e equilibrada a temperatura ambiente com tampao contendo NaCI a 2 M, argi- nina a 0,8 M, TrisHCI a 0,1 M, guanidina-HCI a 0,1 M, pH 8,5. A coluna e Iavada com tampao de equilibrio ate a Iinha de base ser atingida e entao eluida com dez volumes de coluna de um gradiente linear, comegando com tampao de equilibrio e terminando com tampao contendo TrisHCI a 0,1 M, 5% de etileno glicol, pH 8,5. As fragdes eluidas sao analisadas por cromato- grafia de alto desempenho em fase invertida (rpHPLC). As fragdes que con- tem proteina com pontes de SS corretamente formadas foram unidas. A mis- tura de reagao e suplementada com IgAI protease de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) (razao em p/p de 1:50) e incubada durante a noite a temperatura ambiente (ver a figura 2). A mistura de reagao e diluida a 1:2 com acido ace- tico a 50 mM pH 4,5 e entao aplicada a uma coluna de IEC cationica (supor- te MacroCap SP; GE1 Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), equilibrada com acido acetico a 50 mM ou aplicada a uma SEC Superdex® 200 (General Electric). A coluna e Iavada ate a Iinha de base ser atingida e entao eluida com 20 volumes de coluna de um gradiente linear, comegando com acido acetico a 50 mM e terminando com acido acetico a 50 mM suplementado com cloreto de sodio a 1 M. As frag5es eluidas foram analisadas por SDS- PAGE. As frag5es contendo uma Cinica banda com tamanho molecular de IGF-I sao re unidas como IGF-I. A identidade do IGF-I e verificada atraves de cromatografia por exclusao de tamanho (SEC) analitica com detecgao da dispersao de Iuz estatica, analise por MS dos digestos tripticos, analise por
MS dos digestos de Asp-N e IEC cationica ou SEC analiticas.
Claims (7)
1. Metodo para a produgao de IGF-I, caracterizado por a) cultivo de uma celula hospedeira procariotica compreendendo um vetor de expressao contendo um acido nucleico que codifica uma protei- na de fusao compreendendo ο dito IGF-I Iigado de modo N-terminal a extre- midade de C de um propeptideo, b) pelo que ο dito propeptideo firializa C terminalmente com os aminoacidos -Y-Pro1 em que Y e selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro, c) recuperagao e clivagem da dita proteina de fusao com a IgA protease, e d) recuperagao do dito IGF-I.
2. Metodo de acordo com a reivindicagao 1，caracterizado pelo fato de que ο dito IGF-I e selecionado a partir do grupo de IGF-I (SEQ ID N0:1), IGF-I truncado no C terminal (3-6 aminoacidos), R36A, R37A.
3. Metodo de acordo com a reivindicagao 1 ou 2，caracterizado pelo fato de que ο dito IGF-I esta Iigado de modo C terminal ao Fc humano da IgG.
4. Metodo de acordo com as reivindicag5es 1 a 3，caracterizado pelo fato de que ο propeptideo e mostrado pela formula Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-, em que • Met significa metionina · Xi e uma ligagao, serina ou asparagina, • His e histidina, • η e um nilmero de O a 6， • X2 e um peptideo ligante, selecionado a partir do grupo que consiste nos peptideos SEQ ID NO: 6-10， · Pro e prolina, e • Ye selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro- Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
5. Proteina de fusao compreendendo ο IGF-I Iigado a extremida- de de C de um propeptideo, caracterizada pelo fato de que ο dito propepti- deo finaliza C terminalmente com os aminoacidos -Y-Pro, em que Y e sele- cionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly1 Pro-Thr1 Ala-Pro, Gly-Pro1 Thr-Pro, Arg-Pro1 ou Pro-Arg-Pro.
6. Proteina de fusao de acordo com a reivindicagao 5， zada pelo fato de que ο dito propeptideo tem um comprimento de minoacidos.
7. Proteina de fusao de acordo com a reivindicagao 5 racterizada pela formula Met-XrHisn-X2-Y-Pro-[IGF-l]’ em que • Met significa metionina, • X1 e uma ligagao, serina ou asparagina, His e histidina, • η e um nijmero de O a 6, • X2 e um peptideo ligante, selecionado a partir do grupo que consiste nos peptideos SEQ ID NO: 6-10, • Pro e prolina, e · Ye selecionado a partir do grupo que consiste em Pro, Pro- caracteri- ate 30 a- ou 6，ca- Ala1 Pro-Gly1 Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
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