BRPI0715794A2 - conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico - Google Patents

conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico Download PDF

Info

Publication number
BRPI0715794A2
BRPI0715794A2 BRPI0715794-0A BRPI0715794A BRPI0715794A2 BR PI0715794 A2 BRPI0715794 A2 BR PI0715794A2 BR PI0715794 A BRPI0715794 A BR PI0715794A BR PI0715794 A2 BRPI0715794 A2 BR PI0715794A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
gly
val
thr
gln
Prior art date
Application number
BRPI0715794-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Brandt
Stephan Fischer
Erhard Kopetzki
Suryanayana Sankuratri
Ralf Schumacher
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of BRPI0715794A2 publication Critical patent/BRPI0715794A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

CONJUGADO DE ANTICORPO CONTRA CCR5 E PEPTÍDEO ANTIFUSOGÊNICO. A presente invenção refere-se a um conjugado que compreende um ou mais peptídeos antiusogênicos e um anticorpo contra um receptor de superficle celular que se liga a gp12O de HIV, caracterizado pelo fato de que um a oito peptideos antifusogênicos são conjugados, cada, a uma terminação das cadelas pesadas e/ou leves do dito anticorpo contra um receptor de superficle celular que se liga a gp12O de HIV ao uso farmacêutico do dIto conjugado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA- DO DE ANTICORPO CONTRA CCR5 E PEPTÍDEO ANTIFUSOGÊNICO".
A presente invenção refere-se a um conjugado de um anticorpo contra CCR5 e um peptídeo antifusogênico em que um a oito peptídeos anti- fusogênicos são, cada, conjugados a uma terminação das cadeias pesada e/ou leve de um anticorpo anti-CCR5. Os peptídeos antifusogênicos podem ser diferentes, similares ou idênticos ao nível dos aminoácidos. Antecedentes da Invenção
A infecção de células pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) é efetuada por um processo no qual a membrana das células a ser infectada e a membrana viral são fundidas. Um esquema geral para este processo é proposto: O complexo de glicoproteína do envelope viral (gp120/gp41) interage com um receptor de superfície celular localizado na membrana da célula a ser infectada. A ligação de gp120, por exemplo, ao receptor CD4 em combinação com um correceptor tal como CCR-5 ou CX- CR-4 causa uma alteração na conformação do complexo gp120/gp41. Em conseqüência desta alteração conformacional a proteína gp41 é capaz de se inserir na membrana da célula alvo. Esta inserção é o início do processo de fusão da membrana. É sabido que a seqüência de aminoácido da proteína gp41 varia em diferentes cepas de HIV por causa de polimorfismos de ocor- rência natural. Mas a mesma arquitetura de domínio pode se reconhecida, mais precisamente, um sinal de fusão, dois domínios hepta repetidos (HR1, HR2) e um domínio transmembrana (na direção N- para C-terminal). É suge- rido que o domínio de fusão (ou fusogênico) participe na inserção e na de- sintegração da membrana celular. As regiões HR são construídas de múlti- plas fitas compreendendo sete aminoácidos "heptad" (vide, por exemplo, Shu, W., et ai, Biochemistry 38 (1999) 5378-5385). Além dos "heptads" um ou mais motivos similares a zíperes de Ieucina estão presentes. Esta com- posição é responsável pela formação de uma estrutura super-hélice ("coiled- coil") das proteínas gp41 e também de peptídeos derivados destes domí- nios. Super-hélices são em geral oligômeros que consistem em duas ou mais hélices em interação. Os peptídeos com seqüências de aminoácido deduzidas do domínio HR1 ou HR2 de gp41 são eficientes inibidores in vitro e in vivo da entrada de HIV nas células (para exemplos de peptídeos vide, por exemplo, US 5.464.933, US 5.656.480, US 6.258.782, US 6.348.568, ou US 6.656.906). Por exemplo, T20 (também conhecido como DP178, Fu- zeon®, um peptídeo de HR2), T651 (US 6.479.055), e T2635 (WO 2004/029074) são inibidores muito potentes da infecção por HIV. Tentativas foram feitas para aumentar a eficácia de peptídeos derivados de HR2 com, por exemplo, substituições de aminoácido ou reticulação química (Sia, S.K., et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99 (2002) 14664-14669; Otaka, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940).
A conjugação de peptídeos a certas moléculas pode alterar suas propriedades farmacocinéticas, por exemplo, a meia-vida sérica de tais con- jugados de peptídeo pode ser aumentada. Conjugações são relatadas, por exemplo, para polietileno glicol (PEG) e lnterleucina-6 (EP 0 442 724), para PEG e eritropoietina (WO 01/02017), para moléculas quiméricas que com- preendem Endostatina e imunoglobulinas (US 2005/008649), para proteínas de fusão a base de anticorpos secretados (US 2002/147311), para polipeptí- deos de fusão que compreendem albumina (US 2005/0100991; albumina sérica humana US 5.876.969), para polipeptídeos PEGuiIados (US 2005/0114037), e para fusões de interferon. Também são descritos no esta- do da técnica imunotoxinas que compreendem Gelonina e um anticorpo (WO 94/26910), proteínas de fusão de transferrina-anticorpo modificadas (US 2003/0226155), proteínas de fusão de anticorpo-citocina (US 2003/0049227), e proteínas de fusão que consistem em um peptídeo com atividade imunoestimulatória, de transporte de membrana ou homofílica e um anticorpo (US 2003/0103984). Em WO 2004/085505 conjugados biologi- camente ativos de atuação longa consistindo em compostos biologicamente ativos quimicamente ligados a macromoléculas são relatados.
O correceptor CCR5 é usado pela maioria dos isolados de HIV-1 e é critico para o estabelecimento e manutenção da infecção. Além disso, a função de CCR5 é dispensável para a saúde humana. Um alelo de CCR5 mutante, "CCR5 Δ32", codifica uma proteína truncada não-funcional (Sam- son, M., et ai., Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M., et ai, Science 273 (1996) 1856-1862). Indivíduos homozigotos para a mutação não têm expres- são de CCR5 e são fortemente protegidos da infecção por HIV-1. Eles não demonstram conseqüência fenotípica observável e são altamente resistentes à infecção por HIV M-trópico, enquanto que indivíduos heterozigotos apre- sentam progressão atrasada da doença (Schwarz, M.K. e Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347- 358). A falta de CCR5 não tem conseqüên- cias adversas aparentes, provavelmente porque CCR5 é parte de uma rede de quimiocinas altamente redundante como receptor para as a-quimiocinas ΜΙΡ-Ια, MIP-1 β, e RANTES, as quais partilham muitas funções em comum, e a maioria das quais têm receptores alternativos (Rossi, D. e Zlotnik, A., An- nu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242). A identificação de CCR5 como um correceptor de HIV-1 foi baseada na habilidade dos seus ligantes, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, e RANTES, bloquearem a infecção por isolados de R5, mas não por isolados de R5X4 ou X4 (Cocchi, F., et ai, Science 270 (1995) 1811-1815). CCR5 também é um receptor de quimiocinas "agregadas", as quais são pro- duzidas primariamente durante respostas inflamatórias e controlam o recru- tamento de neutrófilos (quimiocinas CXC), macrófagos e um subgrupo de células T (células T auxiliares Th1 e Th2). As respostas de Th1 são tipica- mente aquelas envolvendo imunidade mediada por célula eficaz contra vírus e tumores, respostas pró-inflamatórias responsáveis pela morte de parasitas intracelulares, e a perpetuação de respostas autoimunes, por exemplo, en- quanto que as respostas de Th2 são acreditadas como sendo as principais em alergias. Portanto, inibidores destes receptores de quimiocina podem ser úteis como imunomoduladores. Para respostas de Th1, respostas as supera- tivas são reduzidas, por exemplo, na autoimunidade incluindo na artrite reu- matóide, ou para respostas de Th2, ataques de asma ou respostas alérgicas incluindo respostas alérgicas incluindo dermatite atópica são reduzidos (vide por exemplo Schols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A., e Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, W.M., etal., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T., Trends Immunol. 23 (2002) 347-351). Anticorpos contra CCR5 humano são, por exemplo, PRO 140 (Olson, W.C., et aí., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155), e/ou 2D7 (Samson, M., et aí., J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941). Anticorpos adicionais são men- cionados em US 2004/0043033, US 6.610.834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6.528.625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308, e EP 05007138.0.
Conjugados de polietileno glicol de anticorpos contra CCR5 são conhecidos de US 2003/0228306. US 2003/0215421 se refere aos conjuga- dos de quimicina-toxina. WO 01/43779 se refere aos conjugados de anticor- pos anti-CD4 e anticorpos anti-CCR5 e a conjugados de anticorpos anti-CD4 e peptídeo inibidor de fusão de HIV-1. Conjugados de anticorpos de CCR5 e toxinas são mencionados em EP 1 346 731. Sumário da Invenção A presente invenção relata um conjugado que compreende um a
oito peptídeos antifusogênicos e um anticorpo contra um receptor de super- fície celular de ligação de g120 de HIV, caracterizado em que um a oito, pre- ferivelmente dois a quatro peptídeos antifusogênicos conjugam, cada, a uma terminação das cadeias pesada e/ou leve do dito anticorpo contra um recep- tor de superfície celular de ligação de gp120 de HIV (um número de oito pep- tídeos antifusogênicos por anticorpo só é possível se o anticorpo compreen- der oito terminações, isto é, for composto, por exemplo de duas cadeias pe- sadas e duas cadeias leves; se o anticorpo compreender um número menor de terminações-C e -N, por exemplo, como um scFv, o número correspon- dente de peptídeos antifusogênicos possíveis no máximo, no conjugado também será reduzido, isto é, ele é reduzido para menos de oito).
A invenção ainda compreende um conjugado que compreende um ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo anti-CCR5 (mAb C- CR5) caracterizado em que no máximo um a oito peptídeos antifusogênicos são conjugados, cada, a uma terminação das cadeias pesada e/ou leve do dito anticorpo anti-CCR5 (um número de oito peptídeos antifusogênicos por mAb CCR5 só é possível se o mAb CCR5 compreender oito terminações, isto é, for composto, por exemplo, de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; se o mAb CCR5 compreender um número menos de terminações-C e -N, por exemplo, como scFv, o número correspondente de peptídeos antifu- sogênicos possíveis no máximo no conjugado também será reduzido, isto é, será reduzido para menos do que oito).
Preferivelmente, o aminoácido carbóxi-terminal de uma cadeia de anticorpo anti-CCR5 é conjugado ao aminoácido amino-terminal do pep- tídeo antifusogênico ou o aminoácido carbóxi-terminal do peptídeo antifuso- gênico é conjugado ao aminoácido amino-terminal da cadeia de anticorpo, preferivelmente por uma ligação peptídica com ou sem um Iigante intermedi- ário.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado pela fórmula geral
mAb CCR5 - [Iigantejm - [peptídeo antifusogênico]n na qual m é independentemente para cada peptídeo antifusogênico 0 (isto é, um ligação peptídica entre mAb CCR5 e o peptídeo antifusogênico) ou 1 (is- to é, um Iigante entre mAb CCR5 e o peptídeo antifusogênico) e η é um nú- mero inteiro de 1 a 8.
Um conjugado preferido de uma cadeia pesada e/ou leve de mAb CCR5 e um peptídeo antifusogênico ("conjugado da cadeia") é selecio- nado do grupo que consiste em:
(1) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]
(2) [cadeia pesada]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico]
(3) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[peptí- deo antifusogênico]
(4) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]
(5) [cadeia leve]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico]
(6) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[peptídeo antifusogênico]
(7) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[ligan- te]m-[peptídeo antifusogênico]
(8) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[ligante]m- [peptídeo antifusogênico]
em que o Iigante pode ser igual ou diferente nos (dentro ou en- tre) ditos conjugados de cadeia, em que m é um número inteiro de 1 ou 0, e m pode ser independentemente igual ou diferente nos (dentro ou entre) ditos conjugados de cadeia. (O lado esquerdo da cadeia de peptídeo ou de mAb CCR5 signi-
fica terminação-N, o lado direito significa terminação-C. Em (1) portanto, a terminação-C do peptídeo antifusogênico está ligada por uma ligação peptí- dica ou um Iigante à terminação-N da cadeia pesada de mAb CCR5).
Preferivelmente1 os conjugados de cadeia são agrupados aos conjugados de acordo com a invenção compreendendo o mAb CCR5 (por exemplo, consistindo em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas inclu- indo os domínios constantes de Fc1 um fragmento scFv, ou um fragmento Fab).
Conjugados de cadeia especialmente preferidos são (2), (3), (4) e (7). Conjugados especialmente preferidos de acordo com a invenção com- preendem 2x [cadeia leve de mAb CCR5] e 2x (2), 2 χ [cadeia leve de mAb CCR5] e 2 χ (3), ou 2 χ [cadeia pesada de mAb CCR5] e 2 χ (4), ou 2 χ [ca- deia leve de mAb CCR5] e 2 χ (7). A cadeia pesada e/ou cadeia leve com- preende preferivelmente uma região constante (Fc). Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender
um domínio variável de cadeia pesada que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NO: 16, 17.
Preferivelmente, o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável da cadeia pesada que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 SEQ ID NO: 16, 17, uma região CDR2 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR2 SEQ ID NO: 13, 14, 15, e uma região CDR1 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR1 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo dos domínios variáveis da cadeia que compreendem SEQ ID NO: 1, 3, 5, e 7.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve que consiste em uma estrutura de imu- noglobulina e uma região CDR1 selecionada a partir de SEQ ID NO: 18, 19, 20, uma região CDR2 selecionada a partir de SEQ ID NO: 21, 22, 23, e uma região CDR3 selecionada a partir de SEQ ID NO: 24, 25.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 1 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 2, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 3 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 4, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 5 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 6, ou como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 7 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 8.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada e leve independentemente seleciona- do a partir do grupo que consiste em
a) o domínio variável de cadeia pesada (Vh) definido pela se- qüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 e o domínio variável de cadeia leve (Vl) definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2;
b) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 4;
c) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ
ID NO: 6; d) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 8.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender o domínio variável de cadeia pesada (Vh) definido pela seqüência de aminoá- cido SEQ ID NO: 1 e o domínio variável de cadeia leve (Vl) definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2; ou o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 4; ou o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de ami- noácido SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de cadeia leve definido pela se- qüência de aminoácido SEQ ID NO: 6; ou o domínio variável de cadeia pe- sada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 7 e o domínio vari- ável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 8; um Iigante selecionado a partir do grupo que consiste nos aminoácidos glici- na (G) e asparagina, um tripeptídeo GST e SEQ ID NO: 36 a 62 e SEQ ID NO: 67 a 70; e um peptídeo antifusogênico selecionado a partir do grupo de peptídeos definidos por SEQ ID NO: 29 a 35 e SEQ ID NO: 73.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um peptídeo antifusogênico selecionado a partir do grupo de peptídeos que compreende C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107, e afp-1.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um peptídeo antifusogênico em cada terminação-C das cadeias pesadas ou em cada terminação-N das cadeias leves (dois peptídeos antifusogênicos). Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que ele compreende um peptídeo antifusogênico em cada terminação-C das cadeias pesadas e em cada terminação-N das cadeias leves (quatro peptídeos antifusogênicos).
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 2, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33, por compreender dois domínios variáveis da cadeia leve de SEQ ID NO: 4, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33, por compreender dois domínios variáveis da cadeia leve de SEQ ID NO: 6, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um a domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33, ou por compreender dois domínios variáveis da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que o dito anti- corpo anti-CCR5 é da subclasse IgGI. Também é preferido que o dito anti- corpo anti-CCR5 é da subclasse lgG4, ou da subclasse IgGI ou lgG2, com uma mutação na posição de aminoácido S228, L234, L235, e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que o anticorpo o dito anticorpo anti-CCR5 da subclasse lgG4 tem uma mu- tação S228P e o dito anticorpo anti-CCR5 da subclasse IgGI tem as muta- ções L234A e L235A.
A invenção ainda compreende um conjugado que compreende dois ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo anti-CD4 (mAb CD4) caracterizado em que dois a oito peptídeos antifusogênicos, preferivelmente dois ou quatro, são, cada, conjugados a uma terminação das cadeias pesa- da e/ou leve do dito anticorpo anti-CD4 (um número de oito peptídeos antifu- sogênicos por mAb CD4 só é possível se o anticorpo mAb CD4 compreen- der oito terminações, isto é, for composto, por exemplo, de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; se o mAb CD4 compreender um número me- nor de terminações-C e -N, por exemplo, como um scFv, o número corres- pondente de peptídeos antifusogênicos possíveis no conjugado também é reduzido, isto é, ele é reduzido para menos do que oito). Preferivelmente, o aminoácido carbóxi-terminal de uma cadeia
de anticorpo é conjugada ao aminoácido amino-terminal do peptídeo antifu- sogênico ou o aminoácido carbóxi-terminal do peptídeo antifusogênico é conjugado ao aminoácido amino-terminal da cadeia de anticorpo, preferivel- mente por uma ligação peptídeo com ou sem um Iigante intermediário.
Preferivelmente, o conjugado é caracterizado pela fórmula geral
anticorpo - [ligante]m-[peptídeo antifusogênico]n em que m é independentemente para cada peptídeo antifusogê-
nico 0 (isto é, um Iigante entre o anticorpo e o peptídeo antifusogênico) ou 1 (isto é, um Iigante entre o anticorpo e o peptídeo antifusogênico) e η é um número inteiro de 2 a 8, preferivelmente um número inteiro par de 2 a 8, mais preferivelmente 2 ou 4. Preferivelmente o dito anticorpo é mAb CD4.
Um conjugado preferido de uma cadeia pesada e/ou leve de um
anticorpo e um peptídeo antifusogênico ("conjugado da cadeia") é selecio- nado do grupo que consiste em (na direção N-terminal para C-terminal):
(1) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]
(2) [cadeia pesada]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico]
(3) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[peptí-
deo antifusogênico]
(4) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]
(5) [cadeia leve]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico]
(6) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[peptídeo
antifusogênico]
(7) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[ligan- te]m-[peptídeo antifusogênico]
(8) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[ligante]m- [peptídeo antifusogênico]
em que o Iigante pode ser igual ou diferente nos (dentro e entre)
ditos conjugados de cadeia, em que m é um número inteiro de 1 ou 0, e m pode ser independentemente igual ou diferente nos (dentro e entre) ditos conjugados.
(O lado esquerdo da cadeia de peptídeo ou anticorpo significa
terminação-N, o lado direito significa terminação-C. Em (1) portanto, a termi- nação-C do peptídeo antifusogênico está ligada por uma ligação peptídica ou um Iigante à terminação-N da cadeia pesada do anticorpo). Preferivelmente os conjugados são agrupados a conjugados de acordo com a invenção compreendendo um mAb CD4 (por exemplo, consis- tindo em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas incluindo os domínios Fc constantes, um fragmento scFv, ou um fragmento Fab).
Conjugados de cadeia especialmente preferidos são (2), (3), (4),
e (7). Conjugados especialmente preferidos de acordo com a invenção com- preendem 2x [cadeia leve de mAb CD4] e 2x (2), 2 χ [cadeia leve de mAb CD4] e 2 χ (3), ou 2 χ [cadeia pesada de mAb CD4] e 2 χ (4), ou 2 χ [cadeia leve de mAb CD4] e 2 χ (7). A cadeia pesada e/ou leve compreende preferi- velmente uma região constante.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada das seqüências de CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 103, 104, ou 105. Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender
um domínio variável de cadeia pesada de uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada a partir das seqüências de CDR3 de SEQ ID NO: 103, 104, ou 105, uma região CDR2 selecionada a partir das seqüên- cias de CDR2 de SEQ ID NO: 100, 101, ou 102, e uma região CDR1 sele- cionada a partir das seqüências de CDR1 de SEQ ID NO: 97, 98, ou 99.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada em que o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 82, ou 83.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve que consiste em uma estrutura de imu- noglobulina e uma região CDR1 selecionada a partir de SEQ ID NO: 87, 88, 89, ou 90, uma região CDR2 selecionada a partir de SEQ ID NO: 91, 92, ou 93, e uma região CDR3 selecionada a partir de SEQ ID NO: 94, 95, ou 96.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 81, e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 75, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 82, e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 76, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 84, e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 78, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 85, e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 79, ou como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 86, e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 80.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada e leve independentemente seleciona- do a partir de:
a) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência
de aminoácido SEQ ID NO: 81, e o domínio variável de cadeia leve definido
pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 75;
b) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 82, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 76;
c) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência
de aminoácido SEQ ID NO: 84, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 78;
d) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 85, e o domínio variável de cadeia leve definido
pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 79,
e) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 86, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido
SEQ ID NO: 80.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender o
domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 81, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 75; ou o domínio variável de cadeia pesada de- finido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 82, e o domínio variável de
cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 76; ou o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 84, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 78; o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 85, e o domínio variável de ca- deia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 79, ou o domí- nio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 86, e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 80; um Iigante selecionado a partir dos aminoácidos glicina (G) e asparagina (Ν), o tripeptídeo GST, a as SEQ ID NO: 36 a 62 e SEQ ID NO: 67 a 70; e um peptídeo antifusogênico selecionado a partir dos peptídeos antifusogênicos de SEQ ID NO: 29 a 35 ou SEQ ID NO: 73. Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender
um peptídeo antifusogênico selecionado a partir dos peptídeos antifusogêni- cos C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107, ou afp-1.
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender um peptídeo antifusogênico em cada terminação-C das cadeias pesadas ou em cada terminação-N das cadeias leves (dois peptídeos antifusogênicos). Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que ele compreende um peptídeo antifusogênico em cada terminação-C das cadeias pesadas e em cada terminação-N das cadeias leves (quatro peptídeos antifusogênicos). Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que ele compreende um peptídeo antifusogênico nas duas terminações-C das cadeias pesadas e em cada uma das duas terminações-N das cadeias leves (quatro peptídeos anti- fusogênicos).
Preferivelmente o conjugado é caracterizado por compreender dois domínios variáveis da cadeia leve de SEQ ID NO: 75, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 81, um Iigante de SEQ ID NO: 69, e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 73, por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 76, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 82, um Iigante de SEQ ID NO: 69, e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 73, por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 78, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84, um Iigante de SEQ ID NO: 69, e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 73, por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 79, dois conjugados do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 85, um Iigante de SEQ ID NO: 69, e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 73, ou por compreen- der dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 80, dois conjuga- dos do tipo (2) compreendendo, cada, um domínio variável de cadeia pesa- da de SEQ ID NO: 86, um Iigante de SEQ ID NO: 69, e um peptídeo antifu- sogênico de SEQ ID NO: 73. Preferivelmente o conjugado é caracterizado em que o dito anti-
corpo é da subclasse IgGI ou da subclasse lgG4. Também é preferido que o dito anticorpo seja da subclasse lgG4 ou IgGI ou da subclasse lgG2, com uma mutação na posição de aminoácido S228, L234, L235, e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Preferivelmente o dito conjugado é caracteriza- is do em que o dito anticorpo da subclasse lgG4 tem uma mutação S228P e o dito anticorpo da subclasse IgGI tem as mutações L234A e L235A.
Especialmente preferido é o dito anticorpo seja um anticorpo an- ti-CD4 ou um anticorpo anti-CCR5.
A invenção compreende um método para a produção de um conjugado de acordo com a invenção, caracterizado em que o método com- preende
a) cultivar uma célula contendo um ou mais plasmídeos conten- do uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um conjugado de acordo com a invenção sob condições adequadas para a expressão do
conjugado,
b) recuperar o conjugado da célula ou do sobrenadante.
Em uma modalidade estão os genes que codificam as cadeias leve e pesada de mAb CCR5 ou mAb CD4 com ou sem peptídeo antifuso- gênico ligado localizado no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão diferentes.
A invenção compreende uma composição farmacêutica conten- do um conjugado de acordo com a invenção, junto com um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
A invenção compreende o uso de um conjugado de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de in- fecções virais. Preferivelmente o uso é caracterizado em que a infecção viral é uma infecção por HIV.
A invenção compreende o uso de um conjugado de acordo com a invenção para o tratamento de um paciente que necessita de um tratamen- to antiviral, preferivelmente um tratamento anti-HIV. Descrição da Invenção Um aspecto da presente invenção é um conjugado que compre-
ende um ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo anti-CCR5 (mAb CCR5) caracterizado em que um a oito peptídeos antifusogênicos são con- jugados, cada, a uma terminação das cadeias pesada e/ou leve do dito anti- corpo anti-CCR5. Um número de oito peptídeos antifusogênicos por mAb CCR5 só é possível se o mAb CCR5 compreender oito terminações, isto é, for composto por exemplo, de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Se o mAb CCR5 compreender um número menos de terminações-C e -N, por exemplo, como um scFv, o número máximo correspondente de peptí- deos antifusogênicos possíveis no conjugado também é reduzido, isto é, ele é reduzido para menos do que oito.
Outro aspecto da presente invenção é um conjugado compre- endendo dois ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo anti-CD4 (mAb CD4) caracterizado em que dois a oito peptídeos antifusogênicos são conjugados, cada, a uma terminação das cadeias pesada e/ou leve do dito anticorpo anti-CD4.
Quando a seguir for feita referência a anticorpo em geral ou a mAb CCR5 ou a mAb CD4 também é incluída, onde apropriado, referência ao outro mAb e às seqüências correspondentes.
Um "peptídeo antifusogênico" é um peptídeo que inibe eventos associados com a fusão da membrana ou o evento de fusão da membrana em si, incluindo, entre outras coisas, a inibição de infecção de células não infectadas por um vírus devido à fusão de membrana. Estes peptídeos anti- fusogênicos são preferivelmente peptídeos lineares. Por exemplo, eles po- dem ser derivados do ectodomínio de gp41, por exemplo,tal como DP107, DP178. Exemplos de tais peptídeos podem ser encontrados em US 5.464.933, US 5.656.480, US 6.013.263, US 6.017.536, US 6.020.459, US 6.093.794, US 6.060.065, US 6.258.782, US 6.348.568, US 6.479.055, US 6.656.906, WO 1996/19495, WO 1996/40191, WO 1999/59615, WO 2000/69902, e WO 2005/067960. Por exemplo, as seqüências de aminoáci- do de tais peptídeos compreendem ou podem ser selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 1 a 10 de US 5.464.933; SEQ ID NO: 1 a 15 de US 5.656.480; SEQ ID NO: 1 a 10 e 16 a 83 de US 6.013.263; SEQ ID NO: 1 a 10, 20 a 83 e 139 a 149 de US 6.017.536; SEQ ID NO: 1 a 10, 17 a 83 e 210 a 214 de US 6.093.794; SEQ ID NO: 1 a 10, 16 a 83 e 210 a 211 de US 6.060.065; SEQ ID NO: 1286 e 1310 de US 6.258.782; SEQ ID NO: 1129, 1278 a 1309, 1311 e 1433 de US 6.348.568; SEQ ID NO: 1 a 10 e 210 a 238 de US 6.479.055; SEQ ID NO: 1 a 171, 173 a 216, 218 a 219, 222 a 228, 231, 233 a 366, 372 a 398, 400 a 456, 458 a 498, 500 a 570, 572 a 620, 622 a 651, 653 a 736, 739 a 785, 787 a 811, 813 a 823, 825, 827 a 863, 865 a 875, 877 a 883, 885, 887 a 890, 892 a 981, 986 a 999, 1001 a 1003, 1006 a 1018, 1022 a 1024, 1026 a 1028, 1030 a 1032, 1037 a 1076, 1078 a 1079, 1082 a 1117, 1120 a 1176, 1179 a 1213, 1218 a 1223, 1227 a 1237, 1244 a 1245, 1256 a 1268, 1271 a 1275, 1277, 1345 a 1348, 1350 a 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374 a 1376, 1378 a 1379, 1381 a 1385, 1412 a 1417, 1421 a 1426, 1428 a 1430, 1432, 1439 a 1542, 1670 a 1682, 1684 a 1709, 1712 a 1719, 1721 a 1753, 1755 a 1757 de US 6.656.906; ou SEQ ID NO: 5 a 95 de WO 2005/067960. O peptídeo antifusogênico tem uma se- qüência de aminoácido que compreende de 5 a 100 aminoácidos, preferi- velmente de 10 a 75 aminoácidos e mais preferivelmente de 15 a 50 amino- ácidos. Peptídeos antifusogênicos especialmente preferidos são C-34, T-20, T- 1249, T-651, T- 2635, N-36, (Root, M.J., et al, Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825) e DP-107 (Wild, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 12676-12680) e afp-1 (SEQ ID NO: 29 a 35 e SEQ ID NO: 73). Em uma modalidade o conjugado de acordo com a invenção compreende um ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo em que i) os peptídeos anti- fusogênicos são peptídeos lineares com uma seqüência de aminoácido de 5 a 100 aminoácidos, e ii) um a oito peptídeos antifusogênicos são conjuga- dos, cada, a uma terminação das cadeias pesadas e/ou leves do dito anti- corpo. Em outra modalidade o conjugado de acordo com a invenção com- preende um ou mais peptídeos antifusogênicos e um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-CCR5 (mAb CCR5), em que i) os peptídeos antifusogêni- cos são derivados do ectodomínio de gp41, e ii) um a oito peptídeos antifu- sogênicos são conjugados, cada, a uma terminação das cadeias pesadas e/ou leves do dito anticorpo. O termo "ectodomínio de gp41" denota a se- qüência de aminoácido que começa com a posição de aminoácido 561 e termina com a posição de aminoácido 620 de gp160 de HIV-1 ou começa com a posição de aminoácido 50 e termina com a posição de aminoácido 109 de gp41 de HIV-I (SEQ ID NO: 66) (vide também, por exemplo, Bar, S. e Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811 -820).
O termo "anticorpo" abrange as várias formas de estruturas de anticorpo incluindo anticorpos inteiros e fragmentos de anticorpo. O anticor- po de acordo com a invenção é preferivelmente um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo depletado de antígeno de célula T (WO 98/33523, WO 98/52976, e WO 00/34317). A ma- nipulação genética de anticorpos é descrita, por exemplo, em Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Patente US Nos. 5.202.238 e 5.204.244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biote- chnol. 23(2005) 1117-1125.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de extensão completa, preferivelmente seus domínios variáveis ou pelo menos sua porção de ligação de antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo são, por exemplo, fragmentos de moléculas de anticorpo de cadeia única (scFv), Fab, F(ab)2, e similares contanto que eles retenham as carac- terísticas de um anticorpo anti-CCR5. Anticorpos de scFv são descritos, por exemplo, em Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Huston também descreve Iigantes e métodos para ligação de polipeptídeos úteis para a presente invenção.
"CCR5" significa CCR5 humano, conforme descrito, por exem- plo em Oppermann, M., Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210 e SwissProt P51681. Os termos "ligação de anticorpo a CCR5", "anticorpo anti-CCR5", ou "mAb CCR5", os quais são usados intercambiavelmente dentro deste pe- dido, significam um anticorpo que se liga especificamente a CCR5 e preferi- velmente inibe a fusão de HIV com uma célula alvo. A ligação pode ser tes- tada em um ensaio ELISA in vitro a base de célula (células CHO expressan- do CCR5). A ligação é encontrada se o anticorpo causar uma razão S/R (si- nal/ruído) de 5 ou mais, preferivelmente 10 ou mais em uma concentração de anticorpo de 100 ng/ml_. O termo "inibição da fusão de HIV com uma cé- lula alvo" se refere à inibição da fusão de HIV com uma célula alvo medida em um ensaio que compreende contatar a dita célula alvo (por exemplo, PBMC) com o vírus na presença do anticorpo em uma concentração eficaz para inibir a fusão da membrana entre o vírus e a dita célula e medir, por exemplo, atividade de gene repórter de Iuciferase ou a concentração de an- tígeno p24 de HIV. O termo "fusão de membrana" se refere à fusão entre uma primeira célula que co-expressa polipeptídeos de CCR5 e CD4 e uma segunda célula ou vírus que expressa um proteína env do HIV. A fusão de membrana é determinada por células manipuladas geneticamente e/ou vírus por um ensaio de gene repórter (por exemplo, por ensaio de gene repórter de luciferase).
Anticorpos anti-CCR5 preferidos são mencionados em US 2004/0043033, US 6.610.834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6.528.625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308, e WO 2006/103100. Anticorpos anti-CCR5 especialmente preferidos são descritos em WO 2006/103100. Um anticorpo anti-CCR5 especialmente preferido é caracterizado em que o anticorpo compreende um domínio de cadeia pesa- da variável que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 de cadeia pesada SEQ ID NO: 16, 17. Um anticorpo adicionalmente preferi- do compreende uma região variável de cadeia pesada de uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada a partir do grupo que con- siste nas seqüências de CDR3 SEQ ID NO: 16, 17, uma região CDR2 sele- cionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de SEQ ID NO: 13, 14, 15, e uma região CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de CDR1 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12. Domínios variáveis de ca- deia pesada preferidos são mostrados em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7. Um anti- corpo anti-CCR5 preferido compreende além de um domínio variável de ca- deia leve que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de CDR1 SEQ ID NO: 18, 19, 20, uma região de CDR2 selecionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de CDR2 SEQ ID NO: 21, 22, 23, e uma região CDR3 selecionada a partir do grupo de seqüências de CDR3 SEQ ID NO: 24, 25. O anticorpo anti-CCR5 é caracterizado preferível mente em conter como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 1 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 2, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 3 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 4, como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 5 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 6, ou como CDRs da cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 7 e como CDRs da cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 8.
Seqüências de CDR podem ser determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, E.A., et a!., Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Be- thesda, MD (1991). As CDRs de SEQ ID NO: 1 a 8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 9 a 25. O anticorpo anti-CCR5 compreende preferivelmente um domínio variável de cadeia pesada e leve independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em
a) o domínio variável de cadeia pesada (Vh) definido pela se- quência de aminoácido SEQ ID NO: 1 e o domínio variável de cadeia leve
(Vl) definido por SEQ ID NO: 2;
b) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido por SEQ ID NO: 4;
c) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência
de aminoácido SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de cadeia leve definido por SEQ ID NO: 6;
d) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido por SEQ ID NO: 8.
"CD4" significa CD4 humano, conforme descrito, por exemplo, em Brady, R.L. e Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1- 18 e SwissProt P01730. Os termos "anticorpo que se liga a CD4", "anticorpo anti-CD4", ou "mAb CD4", os quais são usados intercambiavelmente dentro deste pedido, denotam um anticorpo que se liga especificamente a CD4 e preferivelmente inibe a fusão do HIV com uma célula alvo. A ligação pode ser testada em um ensaio ELISA in vitro a base de célula (células CHO ex- pressando CD4). A ligação é encontrada se o anticorpo em questão causar uma razão S/N (sinal/ruído) de 5 ou mais, preferivelmente 10 ou mais em uma concentração de anticorpo de 100 ng/ml. O termo "inibir da fusão de HIV com uma célula alvo" se refere à inibição da fusão de HIV com uma cé- lula alvo medida em um ensaio que compreende contatar a dita célula alvo (por exemplo, PBMC) com o vírus na presença do anticorpo em questão em uma concentração eficaz para inibir a fusão de membrana entre o vírus e a dita célula e medir, por exemplo, a atividade do gene repórter de Iuciferase ou a concentração de antígeno p24 de HIV. O termo "fusão de membrana" se refere à fusão entre uma primeira célula que expressão polipeptídeos de CD4 e uma segunda célula ou vírus que expressa uma proteína env do HIV. A fusão de membrana é determinada por células e/ou vírus manipulados geneticamente por um ensaio de gene repórter (por exemplo, por um ensaio de gene repórter de luciferase). Anticorpos anti-CD4 exemplares são men- cionados, por exemplo, em Reimann, K.A., et al, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943, EP 0 512 112, US 5.871.732, EP 0 840 618, EP 0 854 885, EP 1 266 965, US 2006/0051346, WO 97/46697, WO 01/43779, US 6.136.310, WO 91/009966.
"CXCR4" significa CXCR4 humano, conforme descrito, por e- xemplo, em Feng, Y., et al., Science 272 (1996) 809-810, ou Tamamura, H. e Fujii, N., Expert Opinion on Therapeutic Targets 9 (2005) 1267-1282. Os termos "anticorpo que se liga a CXCR4", "anticorpo anti-CXCR4" ou "mAb CXCR4", os quais são usados intercambiavelmente dentro deste pedido, denota um anticorpo que se liga especificamente a CXCR4 e preferivelmente inibe a fusão de HIV com uma célula alvo. A ligação pode ser testada em um ensaio ELISA in vitro a base de célula (células CHO expressando CD4). A ligação é encontrada se o anticorpo em questão causar uma razão S/N (si- nal/ruído) de 5 ou mais, preferivelmente 10 ou mais em uma concentração de anticorpo de 100 ng/ml. O termo "inibir a fusão de HIV com uma célula alvo" se refere à inibição da fusão de HIV com uma célula alvo medida em um ensaio que compreende contatar a dita célula alvo (por exemplo, PBMC) com o vírus na presença do anticorpo em questão em uma concentração eficaz para inibir a fusão de membrana entre o vírus e a dita célula e medir, por exemplo, a atividade do gene repórter de luciferase ou a concentração de antígeno p24 de HIV. O termo "fusão de membrana" se refere à fusão entre uma primeira célula que expressa polipeptídeos de CXCR4 e uma se- gunda célula ou vírus que expressa uma proteína env do HIV. A fusão da membrana é determinada por células e/ou vírus manipulados geneticamente por um ensaio de gene repórter (por exemplo, por um ensaio de gene repór- ter de luciferase). Anticorpos anti-CXCR4 exemplares são mencionados, por exemplo, Strizki, J.M., et al., J. Virol. 71 (1997) 5678-5683 (Ab 12G5), US 7.138.496. Um "anticorpo contra um receptor de superfície celular de liga- ção a gp120 de HIV" denota dentro da presente invenção um anticorpo que está se ligando a um receptor de superfície celular, o qual é usado pela su- bunidade de gp120 de HIV para mediar a ligação do vírus à superfície celu- lar de uma célula, e assim evitar a ligação de gp120 ao dito receptor e tam- bém a ligação de HIV a uma superfície celular. A gp120 de HIV é derivada da clivagem proteolítica do precursor gp160 de HIV (vide, por exemplo, Brenneman, D.E., etal., Int. Rev. Neurobiol. 32 (1990) 305-353). O segundo fragmento desta clivagem é a gp41 de HIV. Estes dois fragmentos se asso- ciam não-covalentemente e mediam a ligação e fusão celular do HIV e uma célula. Receptores de superfície celular exemplares são o receptor de CD4, ou os receptores de quimiocina, tais como o receptor de CCR5, o receptor de CXCR4 ou o receptor de CXCR5. Portanto, em uma modalidade o anti- corpo contra um receptor de superfície celular de ligação a gp120 de HIV é um anticorpo anti-CD4, ou um anticorpo anti-CCR5, ou um anticorpo anti- CXCR4, ou um anticorpo anti-CXCR5.
O anticorpo usado no conjugado de acordo com a invenção é preferivelmente caracterizado em que os domínios constantes são de origem humana. Tais domínios constantes são bem conhecidos no estado da técni- ca, e, por exemplo, descritos por Kabat (vide, por exemplo, Johnson, G., e Wu1 T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de IgGI humana útil (CHl-dobradiça-CH2-CH3) compreende uma seqüência de aminoácido independentemente selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26, 27. Por exemplo, um domínio constante de cadeia pesada kappa (κ) útil compreende uma seqüência de aminoácido de um domínio constante de cadeia leve kappa (domínio cons- tante de cadeia leve κ, CL) de SEQ ID NO: 28. Ainda, é preferido que os do- mínios variáveis do anticorpo sejam originados de camundongo e que com- preendam a estrutura da seqüência do domínio variável do anticorpo de um anticorpo de camundongo de acordo com Kabat (vide, por exemplo, John- son, G., e Wu1 T.T., NucIeicAcids Res. 28 (2000) 214-218).
Um anticorpo anti-CCR5 preferido mostra ligação ao(s) mes- mo(s) epítopo(s) de CCR5 do que um anticorpo selecionado do grupo que consiste nos anticorpos A a E ou é inibido na ligação a CCR5 pelos anticor- pos AaE devido ao impedimento estérico da ligação ou à ligação competiti- va. A ligação ao epítopo é investigada pelo uso de seleção de alanina de acordo com o método descrito por Olson, W.C., et al. (J. Virol. 73 (1999) 4145-4155) para mapeamento de epítopo. Uma redução do sinal de 75% ou mais mostra que o(s) aminoácido(s) mutado(s) contribui(em) para o epítopo reconhecido pelo dito anticorpo. A ligação do anticorpo ao mesmo epítopo é encontrada se os aminoácidos que contribuem para o epítopo forem reco- nhecidos pelo anticorpo investigado e pelo anticorpo A, B, C, D, ou Ε. O an- ticorpo C, o qual mostra menores valores de IC50 do que o anticorpo 2D7 em ensaios de HIV1 se liga a um epítopo que inclui os aminoácidos no domínio ECL2 de CCR5 (Lee, B., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626) que é diferente do epítopo reconhecido pelo anticorpo 2D7 (2D7 se liga aos ami- noácidos K171 e E172 de ECL2A mas não aos aminoácidos 184 a 189 de ECL2B). A ligação ao epítopo para o anticorpo C é vista ser 20% para K171A ou E172A de CCR5 mutante (glu 172 é mutada para ala). Ligação ao epítopo de 100% é definida para CCR5 de tipo selvagem. Um anticorpo anti- CCR5 adicionalmente preferido se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo C. O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capaz
de se ligar especificamente a um anticorpo. Epítopos geralmente consistem em grupamentos de moléculas superfície quimicamente ativa tais como ami- noácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características es- truturais tridimensionais específicas, bem como características de carga es- pecíficas. Epítopos conformacionais e não-conformacionais são distintos em que a ligação ao primeiro, mas não ao último é perdida na presença de sol- vente desnaturantes. Preferivelmente um anticorpo de acordo com a inven- ção se liga especificamente a CCR5 nativa, mas não a CCR5 desnaturada. Tal anticorpo compreende preferivelmente CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17, e preferivelmente adicionalmente de CDRs de cadeia pesada selecionadas do grupo de CDRs de SEQ ID NO: 10, 11, 12, 14 e/ou 15. Pre- ferivelmente tal anticorpo é o anticorpo B, C, D, ou E, ou compreende os domínios variáveis do anticorpo B, C, D, ou E. preferivelmente um anticorpo que se liga a CCR5 é o anticorpo A ou compreende os domínios variáveis do anticorpo A.
O termo "domínio variável" (domínio variável de uma cadeia leve (VL), domínio variável de uma cadeia pesada (Vh)) conforme usado aqui de- nota cada domínio do par de domínios de cadeia leve e pesada que está envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios va- riáveis da cadeia leve e pesada têm a mesma estrutura geral, isto é, eles possuem uma "estrutura de imunoglobulina" e cada domínio compreende quatro "regiões de estrutura" (FR)1 cujas seqüências são amplamente con- servadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou "regiões de de- terminação de complementaridade", CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de folha-β e as CDRs podem formar alças que conectam a estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas na sua estru- tura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam junto com as CDRs da outra cadeia o sítio de ligação ao antígeno. As regiões CDR3 da cadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel particularmente impor- tante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e portanto fornecem um objeto adicional da invenção. Os termos "porção de ligação ao antígeno de um anticorpo" ou
"sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo" quando usados aqui se refe- rem aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compre- ende os resíduos de aminoácido das "regiões de determinação de comple- mentaridade" ou "CDRs". Regiões de "estrutura" ou "FR" são aquelas cujas regiões do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável de um anticorpo compreendem da terminação-N para a -C as regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4 (estrutura de imunoglobulina). Espe- cialmente, a região CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antígeno e define o anticorpo. Preferivelmente o anticorpo anti-CCR5 de acordo com a invenção é caracterizado por compreender no seu domínio variável de cadeia pesada a seqüência de CDR3 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17. As regiões de determinação de complementari- dade (CDR) e de estrutura (FR) são determinadas de acordo com a defini- ção padrão de Kabat, E.A., et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed„ Public Health Service, National Institutes of Health, Bethes- da, MD (1991).
A "porção Fc" de um anticorpo anti-CCR5 não está envolvida di- retamente na ligação a CCR5, mas exibe várias funções efetoras. Depen- dendo da seqüência de aminoácido da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em subclas- ses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4, IgAI e lgA2. De acor- do com as regiões constantes de cadeia pesada as diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas α, δ, ε, γ, e μχ respectivamente. Os anticor- pos de acordo com a invenção são preferivelmente do tipo IgG. Uma "porção Fc de um anticorpo" é um termo bem conhecido do versado na técnica e de- finido com base na clivagem de papaína de anticorpos. Os anticorpos de acordo com a invenção contêm como porção Fc uma porção Fc humana, ou uma porção Fc derivada de origem humana. Em uma modalidade adicional da invenção a porção Fc é uma porção Fc de um anticorpo humano da sub- classe lgG4 ou uma porção Fc de um anticorpo humano da subclasse IgGI, lgG2, ou lgG3, que é modificada modificado de tal forma que nenhuma liga- ção ao receptor Fcy (por exemplo, FcyRIIIa) e/ou a C1q, conforme definido abaixo, pode ser detectada. Preferivelmente a porção Fc é uma porção Fc humana e especialmente preferido da subclasse lgG4 ou uma porção Fc mutada da subclasse IgGI. Adicionalmente preferidas são as porções Fc da subclasse IgGI com as mutações L234A e L235A. Adicionalmente preferi- das são as porções Fc mostradas em SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 26 com as mutações L234A e L235A, SEQ ID NO: 27 com a mutação S228P. Embora lgG4 mostre ligação reduzida ao receptor Fcy (FcyRIIIa), anticorpos de outras subclasses de IgG mostram forte ligação. Entretanto, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, e His435 sao residuos que se alterados fornecem tambem reduzida Iigagao ao receptor Fcy (Shields, R.L., et al„ J. Biol. Chem. 276 (2001)6591- 6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al.’ Immu- nology 86 (1995) 319-324; EP O 307 434). Preferivelmente um anticorpo de acordo com a inven^ao e, em relagao a Iigagao ao receptor Fcy, da subclas- se lgG4 ou da subclasse IgGI com uma mutagao em L234, L235, e/ou D265, e/ou contem a mutagao PVA236. Preferidas sao as mutag5es S228P, L234A, L235A, L235E, e/ou PVA236 (PVA236 significa que a sequencia de aminoacido ELLG (dada em codigo de aminoacido de uma letra) da posigao de aminoacido 233 a 236 de IgGI ou EFLG de lgG4 e substituida por PVA). Especialmente preferidas sao as mutaQoes S228P de lgG4, e L234A e L235A de IgGI. A porgao Fc de um anticorpo esta diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por celula dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento). A ativagao do complemento (CDC) e iniciada pela Iigagao do fator C1q do complemento a porgao Fc da maioria das subclasses de anticorpo IgG. A Iigagao de C1q a um anticorpo e causada por interag5es proteina-proteina definidas no assim-chamado sitio de ligagao. Tais sitios de Iigagao de porgao Fc sao conhecidos no estado da tecnica e descritos, por exemplo, por Lukas1 T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; ldusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.’ et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; e EP 0 307 434. Tais si- tios de Iigagao de porgao Fc sao caracterizados, por exemplo, pelos aminoa- cidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e P329 (numera- gao de acordo com ο indice Ε.U. de Kabat). Anticorpos das subclasses lgG1, lgG2, e lgG3 geralmente mostram ativagao do complemento incluindo Iiga- gao a C1q e C3, enquanto que lgG4 nao ativa ο sistema complemento e nao se Iiga a C1q e C3. Um anticorpo anti-CCR5 que nao se Iiga ao receptor Fcy e/ou ao fator do complemento C1q nao elicia citotoxicidade celular depen-
dente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Preferivelmente, este anticorpo e caracterizado em que ele se Iiga a CCR5, contem uma porgao Fc derivada de origem humana, e nao se Iiga aos receptores Fcy e/ou ao fator do complemento C1q. Mais preferivelmente, este anticorpo e um anticorpo humano, ou humanizado ou um anticorpo de- pletado de antigeno de celula T. A Iigagao a C1q pode ser medida de acordo com ldusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. Nenhuma "li- gagao a C1q" e encontrada se em tal ensaio a densidade optica (OD) a 492 a 405 nm para ο anticorpo de teste for menor do que 15% do valor para a Iigagao de C1q humano da porgao Fc do anticorpo selvagem nao modificado em uma concentragao de anticorpo de 8 pg/ml. A ADCC pode ser medida como a Iigagao do anticorpo a FcyRIIIa humano em celulas NK humanas. A Iigagao e determinada em uma concentragao de anticorpo de 20 pg/ml. "Ne- nhuma Iigagao ao receptor Fey" ou "nenhuma ADCC" significa uma Iigagao de ate 30% a FcyRIIIa humano em celulas NK humanas em uma concentra- gao de anticorpo de 20 pg/ml em comparagao com a Iigagao do mesmo anti- corpo como IgGI humana (SEQ ID NO: 26).
Um anticorpo usado em um conjugado de acordo com a inven- gao inclui, adicionalmente, tais anticorpos que tem "modificag5es de se- quencia conservativas" (anticorpos variantes), que sao modificag5es da se- quencia de aminoacido que nao afetam ou alteram as caracteristicas acima mencionadas do anticorpo de acordo com a invengao.
Modificag5es podem ser introduzidas por tecnicas padrao co- nhecidas na tecnica, tais como mutagenese sitio-dirigida e mutagenese me- diada por PCR. Substituigoes de aminoacido conservativas incluem aquelas nas quais ο residuo de aminoacido e substituido por um residuo de aminoa- cido que tem uma cadeia lateral similar. Familias de residuos de aminoacido que tem cadeias laterals similares foram definidas na tecnica. Estas familias incluem aminoacidos com cadeias laterals basicas (por exemplo, lisina, argi- nina, histidina), cadeias laterals acidas (por exemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadeias Iaterais polares nao carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadeias
laterals nao polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, proli- na, fenilalanina, metionina), cadeias laterals beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterals aromaticas (por exemplo, tiro- sina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desta forma, um residuo de aminoa- cido nao-essencial previsto em um anticorpo anti-CCR5 human。pode ser preferivelmente substituido por outro residuo de aminoacido da mesma fami- Iia de cadeia. Um anticorpo anti-CCR5 "variante", se refere aqui, portanto, a uma molecula que difere na sequencia de aminoacido de uma sequencia de aminoacido do anticorpo anti-CCR5 "parental" por ate dez, preferivelmente de cerca de dois a cerca de cinco adig5es, delegoes, e/ou substituigdes em uma ou mais das regi5es do dominio variavel do anticorpo parental fora da regiao CDR3 de cadeia pesada. Cada outra regiao de CDR da cadeia pesa- da compreende no maximo uma Linica adigao, delegao e/ou substituigao de aminoacido. A invengao compreende um metodo de modificar a sequencia de aminoacido da CDR de um anticorpo parental que se Iiga a CCR5, carac- terizado em selecionar um dominio variavel de cadeia pesada do grupo de dominios variaveis de cadeia pesada que consiste em SEQ ID NO: 1，3, 5, 7’ 82，83 e/ou um dominio variavel de cadeia Ieve do grupo de dominios varia- veis de cadeia Ieve que consiste em SEQ ID NO: 2，4, 6, 8，76，77 fornecer um acido nucleico que codifica a dita sequencia do dominio variavel inicial, modificar ο dito acido nucleico em que um aminoacido e modificado na C- DR1 da cadeia pesada, um aminoacido e modificado na CDR2 da cadeia pesada, 1 a 3 aminoacidos sao modificados na CDR1 da cadeia leve, 1 a 3 aminoacidos sao modificados na CDR2 da cadeia Ieve e/ou 1 a 3 aminoaci- dos sao modificados na CDR3 da cadeia leve, expressar e incorporar a dita sequencia de aminoacido do(s) dominio(s) variavel(is) modificado(s) em uma estrutura de anticorpo, medir se ο dito anticorpo se Iiga a CCR5 e selecionar o(s) dito(s) dominio(s) variavel(is) modificado(s)/CDR(s) se ο anticorpo se Iigar a CCR5. Preferivelmente, tais modificag5es sao modificagdes de se- quencia conservativas. Modifica?5es de sequencia de aminoacido podem ser efetuadas por mutagenese baseada em modelagem molecular conforme descrito por Riechmann1 L.’ et a 1., Nature 332 (1988) 323-327, e Queen, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. O termo "ligante" ou "ligante peptidico" conforme usado dentro deste pedido denota Iigantes peptidicos de origem natural e/ou sintetica. E- Ies sao formados de uma cadeia de aminoacido linear em que os 20 amino- acidos de ocorrencia natural sao os blocos de construgao monomericos. A cadeia tern um cumprimento de 1 a 50 aminoacidos, preferido entre 1 e 28 aminoacidos, especialmente preferido entre 3 e 25 aminoacidos. O ligante pode conter sequencias de aminoacido repetitivas ou sequencias de polipep- tideos de ocorrencia natural, tais como polipeptideos com uma fungao de dobradiga. O ligante tem a fungao de garantir que um peptideo conjugado a um anticorpo anti-CCR5 possa efetuar sua atividade biologica por permitir que ο peptideo dobre corretamente e seja apresentado apropriadamente. Preferivelmente, ο ligante e um "ligante peptidico sintetico" que e designado para ser rico em residuos de glicina, glutamina, e/ou serina. Estes residuos sao dispostos, por exemplo, em pequenas unidades repetitivas de ate cinco aminoacidos, tais como GGGGS, QQQQG, ou SSSSG. Esta pequena uni- dade repetitive pode ser repetida por duas a cinco vezes para formar uma unidade multimerica. Nas extremidades amino- e/ou carboxi-terminais da unidade multimerica ate seis aminoacidos adicionais arbitrarios de ocorren- cia natural podem ser adicionados. Outros Iigantes peptidicos sinteticos sao compostos de um Cinico aminoacido, que e repetido entre 10 a 20 vezes, tal como, por exemplo, serina no ligante SSSSSSSSSSSSSSS. Em cad a uma das extremidades amino- e/ou carb0xi terminais ate seis aminoacidos arbi- trarios, de ocorrencia natural podem estar presentes. Ligantes preferidos sao mostrados na Tabela 2. Especialmente preferidos sao os Iigantes [GQ4] 3GNN (SEQ ID NO: 40), LSLSPGK (SEQ ID NO: 36)，LSPNRGEC (SEQ ID NO: 37), LSLSGG (SEQ ID NO: 61), LSLSPGG (SEQ ID NO: 62), G3[SG4]2SG (SEQ ID NO: 69). Todos os Iigantes peptidicos podem ser cocM- ficados por uma molecula de acido nucleico e, portanto, podem ser expres- sos recombinantemente. Ja que os Iigantes sao peptideos em si, ο peptideo antifusogenico e conectado ao ligante por uma ponte de peptideo que e for- mada entre dois aminoacidos. O ligante dos peptideos e introduzido entre ο
peptideo antifusogenico e a cadeia de anticorpo Anti-CCRS a qual ο pepti- deo antifusogenico deveria ser conjugado. Portanto, duas ou tres, respecti- vamente, possiveis sequencias (na diregao amino para carboxi-terminal) e- xistem: a) peptideo antifusogenico - Iigante peptidico - cadeia de polipepti- deo de anticorpo anti-CCR5, ou b) cadeia de polipeptideo de anticorpo anti- corpo anti-CCR5 - Iigante peptidico - peptideo antifusogenico, ou c) peptideo antifusogenico - Iigante peptidico - cadeia de polipeptideo de anticorpo anti- CCR5 - Iigante peptidico - peptideo antifusogenico.
Em uma modalidade da invengao ο conjugado mAb CCR5 e ca- racterizado por compreender i) ο dominio variavel de cadeia pesada (Vh) definido pela sequencia de aminoacido SEQ ID NO: 1 e ο dominio variavel de cadeia Ieve (VLl) definido pela SEQ ID NO: 2; ou ο dominio variavel de cadeia pesada definido pela sequencia de aminoacido SEQ ID NO: 3 e ο dominio variavel de cadeia Ieve definido por SEQ ID NO: 4; ou ο dominio variavel de cadeia pesada definido pela sequencia de aminoacido SEQ ID NO: 5 e ο dominio variavel de cadeia Ieve definido por SEQ ID NO: 6; ou ο dominio variavel de cadeia pesada definido pela sequencia de aminoacido SEQ ID NO: 7 e ο dominio variavel de cadeia Ieve definido por SEQ ID NO: 8; ii) um Iigante selecionado a partir do grupo que consiste nos aminoacidos glicina (G) e asparagina (N)1 ο tripeptideo GST, e SEQ ID NO: 36 a 62, e SEQ ID NO: 67 a 70; e iii) um peptideo antifusogenico selecionado a partir do grupo de peptideos definidos por SEQ ID NO: 29 a 35, ou 73.
Um conjugado preferido de uma cadeia pesada e/ou Ieve de mAb CCR5 e um peptideo(s) antifusogenico(s)("conjugado de cadeia") e selecionado do grupo que consiste nos conjugados (1) [peptideo antifusoge- nico]-[ligante]m-[cadeia pesada], (2) [cadeia pesada]-[ligante]m-[peptideo anti- fusogenico], (3) [peptideo antifusogenico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[pepti- deo antifusogenico], (4) [peptideo antifusogenico]-[ligante]m-[cadeia leve], (5) [cadeia leve]-[ligante]m-[peptideo antifusogenico], (6)[peptideo antifusogeni- co]-[ligante]m-[cadeia leve]-[peptideo antifusogenico], (7) [peptideo antifuso- genico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[ligante]m-[peptideo antifusogenico], (8) [peptideo antifusogenico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[ligante]m-[peptideo antifu- sogenico], em que ο Iigante pode ser igual ou diferente, tanto dentro quanto entre os ditos conjugados de cadeia, em que m e um niimero inter。de 1 ou O, e m pode ser independentemente igual ou diferente, tanto dentro quanto entre os ditos conjugados. Por exemplo, em um conjugado que compreende um conjugado de cadeia (7) e uma cadeia Ieve de mAb CCR5 os dois Iigan- tes no conjugado de cadeia (7) podem ser os mesmos, isto e, ter a mesma sequencia de aminoacido, ou podem ser diferentes, isto e, ter sequencias de aminoacido e/ou comprimentos diferentes, ou um ou ambos podem estar ausentes. Por exemplo, em um conjugado que compreende conjugados de cadeia (2) e (4) ο Iigante contido no conjugado de cadeia (2) e ο Iigante con- tido no conjugado de cadeia (4) podem ser os mesmos, isto e, ter a mesma sequencia e comprimento de aminoacido, ou podem ser diferentes, isto e, ter sequencias de aminoacido e/ou comprimentos diferentes, ou um ou ambos podem estar ausentes. Nos conjugados de cadeia o(s) ligante(s) pode(m) estar presente(s) (m=1) ou ausente(s) (m=0). Conjugados de cadeia preferi- dos sao os conjugados de cadeia (2)，(3), (4), e (7). Uma modalidade da pre- sente invengao e um conjugado que compreende 2 χ [cadeia Ieve de mAb CCR5] e 2 χ conjugado de cadeia (2). Este conjugado compreende duas ca- deias Ieves de anticorpo anti-CCR5 nao conjugadas e duas cadeias pesadas de anticorpo anti-CCR5 conjugadas atraves da terminagao-C a terminagao-N de um peptideo antifusogenico, opcionalmente com um Iigante intermediario. Outra modalidade da presente invengao e um conjugado que compreende duas cadeias Ieves de mAb CCR5 e dois conjugados de cadeia (3). Outra modalidade ainda e um conjugado que compreende duas cadeias pesadas de mAb CCR5 e dois conjugados de cadeia (4). Uma modalidade adicional da presente invengao e um conjugado que compreende duas cadeias Ieves de mAb CCR5 e dois conjugados de cadeia Ieve (7). A cadeia pesada e/ou Ieve compreende preferivelmente uma regiao constante (Fe).
A invengao ainda fornece um metodo para a fabricagao de uma composigao farmaceutica que compreende uma quantidade eficaz de um conjugado de acordo com a invengao junto com um veiculo farmaceutica- mente aceitavel e ο uso do conjugado de acordo com a invengao para tal
metodo. A inven^ao ainda fornece ο uso de um conjugado de acordo com a invengao em uma quantidade eficaz para a fabricagao de um agente farmaceutico, preferivelmente junto com um veiculo farmaceuticamente acei- tavel, para ο tratamento de um paciente que sofre de AIDS.
O termo "aminoacido" conforme usado dentro deste pedido de-
nota ο grupo de carboxi α-aminoacidos de ocorrencia natural que compre- ende alanina (codigo de tres letras: ala, codigo de uma Ietra, A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), acido aspartico (asp, D), cisteina (cis, C), glu- tamina (gin, Q), acido gIutamico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), Ieucina (leu, L), Iisina (lys, K), metionina (met, M), fenilala- nina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y), e valina (val, V).
Metodos e tecnicas conhecidos de um versado na tecnica, que sao Liteis para executar a presente invengao, sao descritos, por exemplo, Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I a III (1997), Wiley e Sons; Sambrook et a/·’ Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, Segunda Edigao, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Nos conjugados de acordo com a invengao ο aminoacido carbo- xi-terminal de uma cadeia de anticorpo e conjugada atraves de um Iigante peptidico ao peptideo do peptideo antifusogenico ou ο aminoacido carboxi- terminal do peptideo antifusogenico e conjugado atraves de uma Iigagao peptidica ao aminoacido amino-terminal de uma cadeia de anticorpo. Em uma modalidade um Iigante intermediario esta presente entre ο peptideo antifusogenico e a cadeia de anticorpo. Desta forma, ο conjugado de acordo com a invengao e caracterizado pela formula geral
anticorpo - [ligante]m-[peptideo antifusogenico]n em que m e independentemente para cada peptideo antifusogenico ou O (isto e, uma Iigagao peptidica direta entre ο anticorpo e ο peptideo antifuso- genico) ou 1 (isto e, ο Iigante esta presente entre ο anticorpo e ο peptideo antifusogenico) e η e um niimero inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, η e um niimero inteiro de 2 a 8. Em outra modalidade, η e um niimero inteiro de 2 a 4. Em outra modalidade, η e um niimero inteiro de 2 ou 4. Uma modali- dade da invengao compreende um conjugado caracterizado em compreen- der um peptideo antifusogenico na terminagao-C das cadeias pesadas ou em cada terminaQao-N das cadeias Ieves do anticorpo. Nesta modalidade dois peptideos antifusogenicos sao conjugados a um anticorpo. Em outra modalidade ο conjugado e caracterizado por compreender um peptideo anti- fusogenico em cada terminagao-C das cadeias pesadas e em cada termina- gao-N das cadeias leves. Nesta modalidade quatro peptideos antifusogeni- cos sao conjugados a um anticorpo. Em uma modalidade ο dito anticorpo e mAb CCR5 ou mAb CD4.
O peptideo antifusogenico que e introduzido em uma terminagao da(s) cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s) de um mAb CCR5 tern tamanho pe- queno em comparagao ao mAb CCR5. Por exemplo, as menores imunoglo- bulinas, imunoglobulinas da classe G, tern um peso molecular de aproxima- damente 150 kDa; um peptideo antifusogenico preferivelmente tem um ta- manho (peso molecular) de menos do que 12,5 kDa, que e equivalente a cerca de 100 aminoacidos, em geral menos do que 7,5 kDa, ο que e equiva- lente a cerca de 60 aminoacidos. O peptideo antifusogenico tem uma se- quencia de aminoacido de 5 a 100 residuos de aminoacido, preferivelmente de 10 a 75 aminoacidos, mais preferivelmente de 15 a 50 residuos de ami- noacido. Os conjugados da presente invengao sao Citeis para aplicagSes farmaceuticas, terapeuticas ou de diagnostico. O nijmero de peptideos anti- fusogenicos, que podem ser conjugados a(s) cadeia(s) pesada(s) e/ou Ie- ve(s) de mAb CCR5, e de um ao niimero combinado de terminates amino e carboxi das cadeias de polipeptideo do anticorpo anti-CCR5. Ja que a pre- sente invengao abrange diferentes anticorpos anti-CCR5, ο numero de pep- tideos antifusogenicos pode variar. No caso de um anticorpo anti-CCR5 compreendendo duas cadeias leves e duas pesadas, ο nCimero combinado de terminagdes amino (terminagao-N) e terminates carboxi (terminagao-C) e oito, ο que e ao mesmo tempo ο nCimero maximo total de peptideos antifu- sogenicos conjugados; no caso, por exemplo, de um fragment。de anticorpo anti-CCR5 tal como um anticorpo de cadeia Cinica (scFv) ο numero combina- do de terminag5es e portanto ο niimero maximo de peptideos antifusogeni- cos conjugaveis e dois. Se um Cinico peptideo antifusogenico estiver conju- gado ao mAb CCR5, ο peptideo pode ocupar qualquer uma das terminagdes das cadeias do anticorpo anti-CCR5. Da mesma forma, se ο niimero maximo possivel de peptideos estiver conjugado ao mAb CCR5, todas as termina- qoes estarao ocupadas por um Cinico peptideo. Se ο niimero de peptideos, os quais estao conjugados ao mAb CCR5, for menor do que ο niimero ma- ximo possivel, distribuig5es diferentes dos peptideos nas terminag0es das cadeias do anticorpo anti-CCR5 serao possiveis. Por exemplo, se quatro peptideos forem conjugados a uma imunoglobulina da classe G ou E, cinco combinag5es diferentes serao possiveis (vide Tabela 1). Em duas combina- goes, todas as terminagdes do tipo, isto e, todas as quatro termina95es ami- no ou todas as quatro terminates carboxi das cadeias do anticorpo anti- CCR5, sao conjugadas, cad a, a um Cinico peptideo antifusogenico. As outras terminag5es nao sao conjugadas. Isto resulta em uma modalidade em uma alocagao das modificag5es/conjugag5es em uma area do anticorpo anti- CCR5. Nos outros casos, os polipeptideos sao conjugados a um niimero de ambas as terminag5es. Dentro destas combinagoes, os peptideos conjuga- dos sao alocados a diferentes areas do anticorpo anti-CCR5. Em qualquer um dos casos, a soma das terminagoes conjugadas e quatro.
Tabela 1: Combinagao possivel para a conjugagao de quatro peptideos as
terminag5es de um anticorpo anti-CCR5 composto por quatro cadeias de polipeptideo.
NCimero de terminagdes amino ocupadas Niimero de termina?5es carboxi ocupadas Niimero total de terminag5es ocupadas 4 O 4 3 1 4 2 2 4 1 3 4 O 4 4
A presente invengao compreende preferivelmente conjugados
nos quais pelo menos duas das terminagoes sao conjugadas a um peptideo antifusogenico. As sequencias de aminoacidos dos peptideos antifusogeni- cos podem ser diferentes, similares ou identicas. Em uma modalidade, a i- dentidade de sequencia de aminoacido esta na faixa de 90% a menos do que 100%; essas sequencias de aminoacidos e os peptideos corresponden- tes sao definidos como similares. Em uma modalidade preferida, os pepti- deos antifusogenicos sao identicos, isto e, tem uma identidade de aminoad- do de 100%.
A presente invengao compreende um conjugado que compre- ende um ou mais peptideos antifusogenicos e um anticorpo anti-CCR5 (mAb CCR5) em que um a oito peptideos antifusogenicos sao conjugados a uma terminagao da cadeia pesada e/ou Ieve do dito anticorpo anti-CCR5 atraves de uma Iigagao peptidica. Em uma modalidade, ο conjugado de acordo com a invengao compreende pelo menos dois peptideos antifusogenicos e um anticorpo anti-CCR5 em que dois a oito peptideos antifusogenicos sao con- jugados, cad a, a uma terminagao das cadeias pesadas e/ou Ieves do dito anticorpo anti-CCR5.
Em uma modalidade, ο conjugado de acordo com a invengao e caracterizado i) por compreender dois dominios variaveis da cadeia Ieve de SEQ ID NO: 2, dois conjugados de cadeia do tipo (2) cada um compreenden- do um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptideo antifusogenico de SEQ ID NO: 33’ ii) por com- preender dois dominios variaveis da cadeia Ieve de SEQ ID NO: 4，dois con- jugados de cadeia do tipo (2) cada um compreendendo um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3’ um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um pep- tideo antifusogenico de SEQ ID NO: 33, iii) por compreender dois dominios variaveis da cadeia Ieve de SEQ ID NO: 6, dois conjugados de cadeia do tipo (2) cada um compreendendo um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5，um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptideo antifusogenico de SEQ ID NO: 33’ ou iv) por compreender dois dominios variaveis da cadeia Ieve de SEQ ID NO: 8’ dois conjugados de cadeia do tipo (2) cada um compreenden- do um dominio variavel de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7，um Iigante de
SEQ ID NO: 40 e um peptideo antifusogenico de SEQ ID NO: 33. A conjugagao entre ο peptideo antifusogenico e ο anticorpo anti- CCR5 e realizada ao nivel do acido nucleico. Portanto, uma Iigagao peptidi- ca e formada entre ο peptideo antifusogenico e a cadeia de anticorpo anti- CCR5 com ou sem um Iigante intermediario. Assim, ou ο aminoacido carbo- xi-terminal do peptideo antifusogenico e conjugado ao aminoacido amino- terminal de uma cadeia de anticorpo anti-CCR5 com ou sem um Ijgante in- termediario, ou um aminoacido carb0xi-terminal da cadeia de anticorpo anti- CCR5 e conjugado ao aminoacido amino-terminal do peptideo antifusogeni- co com ou sem um Iigante intermediario ou ambas as terminag5es da cadeia de anticorpo anti-CCR5 sao conjugadas a um peptideo antifusogenico cada uma com ou sem um Iigante intermediario. Para a produgao recombinante do conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 de acordo com a inveng§o, uma ou mais moleculas de acido nucleico que codificam polipeptideos diferentes sao necessarias, preferivelmente duas a oito mole- culas de acido nucleico sao empregadas. Essas moleculas de acido nucleico codificam as diferentes cadeias de polipeptideo de anticorpo anti-CCR5 do conjugado e sao referidas a seguir como genes estruturais. Eles podem es- tar Iocalizados no mesmo plasmideo de expressao (vetor) ou podem estar, alternativamente, Iocalizados em plasmideos de expressao diferentes (veto- res). A uniao do conjugado ocorre preferivelmente antes da secregao do conjugado e assim dentro das celulas que expressam ο mesmo. Portanto, as moleculas de acido nucleico que codificam as cadeias de polipeptideo do conjugado sao preferivelmente expresses na mesma celula hospedeira. Se, apos expressao recombinante, for obtida uma mistura de conjugados, os conjugados podem ser separados e purificados por metodos conhecidos pe- Io versado na tecnica. Esses metodos sao bem estabelecidos e amplamente usados para purificagao de imunoglobulina e sao empregados tanto sozi- nhos quanto em combinagao. Tais metodos sao, por exemplo, cromatografia de afinidade usando proteinas derivadas de microbios (por exemplo, croma- tografia por afinidade com a proteina A ou proteina G), cromatografia por troca de ion (por exemplo, troca de cation (resinas de carboximetila), troca
de anion (resinas de aminoetila) e cromatografia de troca de modo misto), adsorgao tiofilica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol e outros Iigantes de SH), cromatografia por interagao hidrofobica ou adsorgao aromatica (por exemplo, com fenil-sefarose, resinas aza-arenofilicas ou acido aminofenilbo- ronico), cromatografia por afinidade com quelato de metal (por exemplo, ma- terial de afinidade com Ni(II)- e Cu(II)), cromatografia por exclusao de tama- nho e metodos eletroforeticos preparativos (tal como eletroforese em gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Com metodos de manipulagao recombinante conhecidos por um versado na tecnica, os conjugados podem ser produzidos ao nivel do acido nucleico/gene. As sequencias de acido nucleico que codificam imunoglobuli- nas sao conhecidas e podem ser obtidas, por exemplo, de bases de dados genomicas. Da mesma forma, as sequencias de acido nucleico que codifi- cam peptideos antifusogenicos sao conhecidas ou podem ser facilmente deduzidas a partir de suas sequencias de aminoacidos. Os elementos ne- cessarios para a construQao de um plasmideo de expressao para expressao de um conjugado da presente invengao sao, por exemplo, um cassete de expressao para a cadeia Ieve do anticorpo anti-CCR5 em sua versao natural e/ou modificada e/ou conjugada, um cassete de expressao para a cadeia pesada do anticorpo anti-CCR5 em sua versao natural e/ou modificada e/ou conjugada (alternativamente, a cadeia Ieve do anticorpo anti-CCR5 e a ca- deia pesada do anticorpo anti-CCR5 podem estar contidas no mesmo casse- te de expressao, por exemplo, como um elemento de expressao bicistroni- co), um marcador de selegao e uma unidade de replicagao em E. coli assim como uma unidade de selegao. Esses cassetes de expressao compreendem um promotor, um segmento de DNA que codifica uma sequencia de sinal de secregao, ο gene estrutural e um sinal de terminagao/poliadenilagao. Os e- Iementos sao reunidos em uma forma operativamente Iigada tanto em um plasmideo codificante de todas as cadeias do conjugado, quanto em dois ou mais plasmideos cada um codificando uma ou mais cadeias do conjugado. Para a expressao dos polipeptideos codificados, o(s) plasmideo(s) e(sao) introduzido(s) em uma celula hospedeira adequada. As proteinas sao prefe-
rivelmente produzidas em celulas de mamiferos tais como celulas CHO1 ce- Iulas NSO1 celulas Sp2/0, celulas COS, celulas HEK, ceiulas K562, celulas BHK1 celulas PER.C6® e similares. Os elementos regulatorios devem ser selecionados de tal modo que eles sejam funcionais na celula hospedeira selecionada. Para a expressao, a celula hospedeira que contem ο plasmideo que codifica uma ou mais cadeias do conjugado e cultivada sob condigdes adequadas para a expressao das cadeias. As cadeias de conjugado expres- sas sao unidas funcionalmente. O conjugado de peptideo antifusogenico- anticorpo anti-CCR5 completamente processado e secretado no meio.
Um "plasmideo de expressao" e um acido nucleico que codifica um polipeptideo a ser expresso em uma celula hospedeira. Tipicamente, um plasmideo de expressao compreende uma unidade de propagagao de plas- mideo procariotico, por exemplo, para E. coli, que compreende uma origem de replicagao e um gene de resistencia, um marcador de selegao eucariotico e um ou mais cassetes de expressao para a expressao do(s) gene(s) estru- tural(ais) de interesse compreendendo um promotor, um gene estrutural e um terminador da transcrigao que inclui um sinal de poliadenilagao. A ex- pressao do gene e geralmente colocada sob ο contraIe de um promotor e tal gene estrutural e dito estar "operativamente ligado" ao promotor. Similar- mente, um elemento regulatorio e um promotor central sao operativamente Iigados se ο elemento regulatorio modular a atividade do promotor central.
Um aspecto da presente invengao e, assim, um metodo para a produgao de um conjugado de acordo com a invengao, compreendendo as seguintes eta pas
a) cultivar uma celula contendo um ou mais plasmideos de ex- pressao, cada um compreendendo uma ou mais moleculas de acido nucleico
que codificam um conjugado de acordo com a invengao sob condig5es ade- quadas para a expressao do conjugado,
b) recuperar ο conjugado da celula ou do sobrenadante.
A expressao "sob condigdes adequadas para a expressao do conjugado" denota condigdes que sao usadas para ο cuItivo de uma celula que expressa um polipeptideo e que sao conhecidas ou podem ser facilmen- te determinadas por um versado na tecnica. E sabido por um versado na tecnica, que essas condig5es podem variar dependendo do tipo de celula cultivada e do tipo do polipeptideo expresso. Em geral, a celula e cultivada em uma temperatura, por exemplo, entre 20°C e 40°C, e por um periodo de tempo suficiente para permitir a produgao efetiva do conjugado de polipepti- deo, por exemplo, por 4 a 28 dias.
Conforme usado aqui, "veiculo farmaceuticamente aceitavel" in- clui todos e quaisquer solventes, meios de dispersao, revestimentos, agen- tes antibacterianos e antifiingicos, agentes isotonicos e que retardam a ab- sorgao/reabsorgao e similares, que sao fisiologicamerite compativeis. Prefe- rivelmente, ο veiculo e adequado para injegao ou infusao. Veiculos farma- ceuticamente aceitaveis incluem solug5es ou dispers5es aquosas estereis e pos estereis para a preparagao de solugoes ou dispers5es injetaveis este- reis. O uso de tais meios e agentes para uma substancia farmaceuticamente ativa e conhecido na tecnica. Alem da agua, ο veiculo pode ser, por exem- plo, uma soIugao de salina tamponada isotonica.
Sem Ievar em consideragao a via de administragao selecionada, os compostos da presente invengao, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada, e/ou as composig5es farmaceuticas da presente inven- gao sao formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitaveis por metodos convencionais conhecidos por aqueles versados na tecnica.
Os niveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas compo- sigoes farmaceuticas da presente invengao podem ser alterados a fim de se obter uma quantidade do ingrediente ativo que e eficaz para se obter a res- posta terapeutica desejada para um paciente em particular, composigao e modo de administragao, sem ser toxica para ο paciente. O nivel de dosagem selecionado dependera de uma variedade de fatores farmacocineticos inclu- indo a atividade das composig5es da presente invengao particulares empre- gadas, a via de administragao, ο tempo de administragao, a taxa de excre- gao do composto particular a ser empregado, outros farmacos, compostos e/ou materials usados em combinagao com a composigao particular empre- gada, a idade, sexo, peso, condigao geral de saCide e historia medica anteri-
or do paciente a ser tratado e fatores similares bem conhecidos nas tecnicas medicas.
A invengao preferivelmente compreende ο uso de um conjugado de acordo com a invengao para ο tratamento de um paciente que sofre de sindromes de imunodeficiencia tal como AIDS.
Os exemplos a seguir, Iistagem de sequencia, figuras e deposi-
tos sao fornecidos para auxiliar na compreensao da presente invengao, cujo verdadeiro escopo esta descrito nas reivindicagoes anexas. Entende-se que modifica^oes podem ser feitas nos procedimentos descritos sem se afastar do espirito da inveng§o. Descrigao das Figuras:
Figura 1: Mapa do plasmideo do cadeia Ieve κ de mAb CCR5
Figura 2: Mapa do plasmideo do cadeia pesada γ1 de mAb CCR5. Figura 3: Mapa do plasmideo do
conjugado de cadeia pesada γ1 de mAb CCR5 Figura 4: Mapa do plasmideo do cadeia Ieve κ de mAb CD4.
Figura 5: Mapa do plasmideo do cadeia pesada γ1 de mAb CD4.
Figura 6: Mapa do plasmideo do conjugado de cadeia pesada γ1 de mAb CD4. Deposito de Anticorpo anti-CCR5
As Iinhagens celulares de hibridoma que expressam mAb CCR5 preferidas Oteis nos conjugados de acordo com a invengao foram deposita- das com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha.
Linhagem celular N0 de deposito Data de deposito m<CCR5>Pz01.F3 DSM ACC 2681 18.08.2004 m<CCR5>Pz02.1C11 DSM ACC 2682 18.08.2004 m<CCR5>Pz03.1C5 DSM ACC 2683 18.08.2004 m<CCR5>Pz04.1F6 DSM ACC 2684 18.08.2004
vetor de expressao 4900 da vetor de expressao 4901 da vetor de expressao 4995 do vetor de expressao 6310 da vetor de expressao 6309 da vetor de expressao 6303 do Nomenclatura de anticorpo
<CCR5»Pz011.F3: Anticorpo A SEQ ID NO: 1’ 2 <CCR5>Pz02.1CII: Anticorpo B SEQ ID NO: 3’ 4 <CCR5>Pz03.1C5 : Anticorpo C SEQ ID NO: 5, 6 <CCR5>F3.1H12.2E5: Anricorpo D SEQ ID NO: 7, 8
<CCR5>Pz04.1F6: Anticorpo E
O dominio variavel 1 de mAb CD4 e relatados em SEQ ID NO: 10, 15, 45’ e 56 de US 5.871.732.
Os dominios variaveis 2 e 4 de mAb CD4 sao relatados em Re- imann, K.A., et al·, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943.
O dominio variavel 3 de mAb CD4 e relatado nas Figuras 3, 4’ 12, e 13de WO 91/009966.
Sequencias de anticorpo. sequencias de peptideos antifusogenicos e se- quencias de Iiqantes peptidicos
SEQ ID NO 1 cadeia pesada, dominio variavel de <CCR5>Pz01.F3 SEQ ID NO 2 cadeia Ieve1 dominio variavel de <CCR5>Pz01 .F3 SEQ ID NO 3 cadeia pesada, dominio variavel de <CCR5>Pz02.1C11 SEQ ID NO 4 cadeia leve, dominio variavel de <CCR5>Pz02.1C11 SEQ ID NO 5 cadeia pesada, dominio variavel de <CCR5>Pz03.1C5 SEQ ID NO 6 cadeia leve, dominio variavel de <CCR5>Pz03.1C5 SEQ ID NO 7 cadeia pesada, dominio variavel de <CCR5>F3.1H12.2E5 SEQ ID NO 8 cadeia leve, dominio variavel de <CCR5>F3.1H12.2E5 SEQ IDNO 9 CDR1 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ IDNO 10 CDR1 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ IDNO 11 CDR1 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ IDNO 12 CDR1 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ IDNO 13 CDR2 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ ID NO 14 CDR2 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ IDNO 15 CDR2 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ ID NO 16 CDR3 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ ID NO 17 CDR3 de cadeia pesada de mAb CCR5 SEQ ID NO 18 CDR1 de cadeia leve de mAb CCR5 10
15
20
25
30
SEQ ID NO: 19 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 20 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 21 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 22 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 23 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 24 CDR3 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 25 CDR3 de cadeia Ieve de mAb CCR5 SEQ ID NO: 26 regiao constante de cadeia pesada γ1 SEQ ID NO: 27 regiao constante de cadeia pesada γ4 SEQ ID NO: 28 dominio constante de cadeia Ieve K SEQ ID NO: 29 C34 SEQ ID NO: 30 T20 SEQ ID NO: 31 T1249 SEQ ID NO: 32 T651 SEQ ID NO: 33 T2635 SEQ ID NO: 34 N36 SEQ ID NO: 35 DP107 SEQ ID NO: 36 a 62, 67 a 70 peptideos Iigantes SEQ ID NO: 63 Sequencia de aminoacido da cadeia I
SEQ ID NO: 64
SEQ ID NO: 65
SEQ SEQ
ID ID
NO: NO:
66 71
SEQ ID NO: 72
SEQ SEQ
ID NO: ID NO:
73
74
i κ de mAb CCR5 maduro
Sequencia de aminoacido da cadeia pesada γ1 de mAb CCR5 maduro
Sequencia de aminoacido da cadeia pesada do conjugado de mAb CCR5 maduro gp41 de HIV-1
Sequencia de aminoacido da cadeia Ieve κ de mAb CD4 maduro
Sequencia de aminoacido da cadeia pesada γΙ de mAb
CD4 maduro
afp-1
Sequencia de aminoacido da cadeia pesada do conjugado
de mAb CD4 maduro SEQ ID NO 75 dominio vari^vel de cadeia Ieve 1 de mAb CD4 de murino SEQ ID NO 76 dominio vardvel de cadeia Ieve 1 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO 77 cadeia Ieve 1 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO 78 dominio variavel de cadeia Ieve 2 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO 79 dominio variavel de cadeia Ieve 3 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO 80 dominio variavel de cadeia Ieve 4 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO 81 dominio variavel de cadeia pesada 1 de mAb CD4 de mu- Ι-ΪΠΛ SEQ ID NO: 82 ΓΙΠΟ dominio variavel de cadeia pesada 1 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO: 83 cadeia pesada 1 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO: 84 dominio variavel de cadeia pesada 2 de mAb CD4 quimericx) SEQ ID NO: 85 dominio variavel de cadeia pesada 3 de mAb CD4 quimerico SEQ ID NO: 86 dominio variavel de cadeia pesada 4 de mAb CD4 quimericx) SEQ ID NO: 87 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 88 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 89 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 90 CDR1 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 91 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 92 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 93 CDR2 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 94 CDR3 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 95 CDR3 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 96 CDR3 de cadeia Ieve de mAb CD4 SEQ ID NO: 97 CDR1 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 98 CDR1 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 99 CDR1 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 100 CDR2 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 101 CDR2 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 102 CDR2 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 103 CDR3 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 104 CDR3 de cadeia pesada de mAb CD4 SEQ ID NO: 105 CDR3 de cadeia pesada de mAb CD4 Tabela 2: Ligante
N0 Peptideos Iigantes SEQ ID NO: 1 lslspgk 36 2 lspnrgec 37 3 (GQ4)3 38 4 [gq4]3g 39 [gq4i3gnn 40 6 GGGfSG4J2SGG 41 7 ggg[sg4]2sgn 42 8 [sg4j3 43 9 [sg4i3g 44 g[sg4]3t 45 11 [sg4i3gg 46 12 [sg4j3ggt 47 13 [sg4j3ggn 48 14 [sg4j3gas 49 [SG4J5 50 16 [SG4J5G 51 17 (sg4j5gg 52 18 [SG4I5GAS 53 19 g(s)15g 54 g(s)15gas 55 21 g - 22 n - 23 gst - 24 f (G)4Sl3GAS 56 [(g)4sl3g 57 26 i(g)4s]5g 58 27 I(G)4Sl3GG 59 28 i(g)4sl5gg 60 29 lslsgg 61 lslspgg 62 31 [G3Sl5 67 32 [G3Sl5GGG 68 33 gjsgd 2sg 69 34 gjsgj7sg1 70 Exemplos
Materials e Metodos
lnformag5es gerais com relagao as sequencias de nucleotideo das cadeias Ieves e pesadas de imunoglobulinas humanas e dada em: Ka- bat, E.A., et a/·, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Pu- blic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Os aminoacidos das cadeias de anticorpo sao numerados de acordo com a nu- meragao EU (Edelman, G.M., etal.’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78- 85; Kabat, E.A., et a/., Sequences of Proteins de Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Tecnicas de DNA Recombinante:
Metodos usuais foram usados para manipular DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989. Os reagentes de biologia molecular foram usados de acordo com as instrug5es do fabricante. Sintese de gene:
Os segmentos genicos desejados foram preparados a partir de oligonucleotideos feitos por sintese quimica. Os segmentos com 100 a 600 bp de extensao, os quais sao flanqueados por sitios de clivagem de endonuclease de restrigao Linicos1 foram unidos pelo anelamento e Iiga- gao de oligonucleotideos, incluindo amplificagao por PCR, e subsequen- temente clonados no vetor de clonagem pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., EUA) atraves de projeg5es-A ("Α-overhangs"). A sequencia de DNA dos fragmentos de gene subclonados foi confirmada por sequencia- mento de DNA. Determinagao de proteina:
A concentragao de proteina do conjugado foi determinada pela determinagao da densidade optica (OD) a 280 nm, usando ο coeficiente de
extingao molar calculado com base na sequencia de aminoacidos. Exemplo 1 ： Producao dos plasmideos de expressao do anticorpo anti-CCR5
Os segmentos genicos que codificam ο dominio variavel da ca- deia Ieve do anticorpo anti-CCR5 (Vl) e ο dominio constante da cadeia Ieve kappa humana (Cl) foram unidos como se fossem segmentos de gene para ο dominio variavel de cadeia pesada do anticorpo anti-CCR5 e os dominios constantes de cadeia pesada γ1 humanos (CHl-dobradi9a-CH2-CH3).
No caso de mAB CCR5 de SEQ ID NO: 63/64, os dominios va- riaveis de cadeia pesada e Ieve sao derivados de um anticorpo de camun- dongo e os dominios constantes de cadeia pesada e Ieve sao derivados de uma anticorpo humano (C-kappa e IgGI).
Subsequentemente1 ο segmento genico que codifica uma cadeia Ieve completa de anticorpo anti-CCR5 foi Iigado na terminagao-N e/ou -C com um acido nucleico codificando um peptideo antifusogenico incluindo uma sequencia Iigante de conexao e/ou ο segmento genico que codifica uma cadeia pesada completa de anticorpo anti-CCR5 foi Iigado na terminagao-N e/ou -C com um acido nucleico que codifica um peptideo antifusogenico in- cluindo uma sequencia Iigante de conexao. a) Vetor 4900
O vetor 4900 e um plasmideo de expressao para a expressao transitoria de uma cadeia Ieve de mAB CCR5 (cassete de expressao geno- micamente organizado; organizagao exon-introri) em celulas HEK293.
Alem do cassete de expressao da cadeia Ieve κ de mAB CCR5, esse vetor cont6m:
-um gene de resistencia a higromicina como um marcador sele-
cionavel,
-uma origem de replicagao, oriP, do virus Epstein-Barr (EBV), -uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repli- cagao desse plasmideo em celulas de E. coli, e
-um gene de β-lactamase que confere resistencia a ampicilina
em E. coli.
A unidade de transcrigao do gene da cadeia Ieve κ de mAB CCR5 e composta dos seguintes elementos:
-ο intensificador e promotor imediatamente precoces de cito- megalovirus humano,
-uma regiao 5' nao-traduzida sintetica, - uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina
de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1, intron, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]),
-a cadeia Ieve κ variavel madura de anticorpo anti-CCR5 de murino que codifica ο segmento disposto com um tinico sitio de restrigao de Bsml na extremidade 5' (sequencia de sinal L2), e um sitio doador de "spli- ce" e um sitio de restrigao de Notl Cinico na extremidade 3',
-um intron 2 hibrido da cadeia Ieve κ de humano/camundongo, -ο dominio constante do gene de κ-leve de humano, -a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de κ de imu- noglobulina humana e,
-os sitios de restrigao Linicos de Ascl e Fsel nas extremidades 5' e 3' respectivamente.
O mapa do plasmideo do vetor de expressao 4900 da cadeia Ie- ve κ do mAB CCR5 e mostrado na Figura 1. A sequencia de aminoacidos da cadeia κ-leve madura de mAB CCR5 (sem a sequencia de sinal) e mostrada na SEQ ID NO: 63. b) Vetor 4991
O vetor 4991 e um plasmideo de expressao para expressao transitoria de uma γ1-cadeia pesada de mAB CCR5 (cassete de expressao genomicamente organizado; organizagao exon-intron) em celulas HEK293.
Alem do cassete de expressao da γ1-cadeia pesada de mAB CCR5 esse vetor contem:
-um gene de resistencia a higromicina como um marcador sele-
cionavel,
- uma origem de replicagao, oriP, do virus Epstein-Barr (EBV)1
-uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repli-
cagao desse plasmideo em E. coli, e -um gene de β-lactamase que confere resistencia a ampicilina
em E. coli.
A unidade de transcrigao do gene da γΐ-cadeia pesada de mAB CCR5 e composta dos seguintes elementos: - ο intensificador e promotor imediatamente precoces de cito-
megalovirus humano,
-uma regiao 5' nao-traduzida sintetica,
-uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1, intron, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]),
-a cadeia pesada variavel madura de anticorpo anti-CCR5 de murino que codifica ο segmento disposto com um Cinico sitio de restrigao de Bsml na extremidade 5' (sequencia de sinal L2), e um sitio doador de "spli- ce" e um sitio de restrigao de Notl Linico na extremidade 3', - um intron 2 hibrido da cadeia pesada de humano/ camundon-
go, incluindo ο elemento intensificador de cadeia pesada de camundongo (porgao JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1993) 1373-1378)
-os dominios constantes genomicos do gene de γ1 pesada hu-
mana,
- a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de γ1-
imunoglobulina humana e,
-os sitios de restrigao iinicos de Ascl e de SgrAI nas extremida- des 5' e 3' respectivamente.
O mapa do plasmideo do vetor de expressao 4901 da γ1-cadeia pesada do mAB CCR5 e mostrado na Figura 2. A sequencia de aminoacidos da y1-cadeia pesada madura de mAB CCR5 (sem a sequencia de sinal) e mostrada na SEQ ID NO: 64. c) Vetor 4995
O vetor 4995 e um plasmideo de expressao para expressao transitoria de um conjugado de peptideo quimerico γΙ-cadeia pesada de anti- corpo anti-CCR5 (cassete de expressao genomicamente organizado; organi-
zagao exon-intron) em celulas HEK293. O vetor 4995 e derivado do plasmideo 4991 pelo fato de que a γΐ-cadeia pesada de mAB CCR5 e Iigada na terminagao-C com um acido nucleico que codifica ο peptideo antifusogenico T-2635 (SEQ ID NO: 33) e a sequencia peptidica Iigante [GQ4]3GNN (SEQ ID NO: 40).
Alem do cassete de expressao do conjugado de peptideo qui-
merico γΙ-cadeia pesada de anticorpo anti-CCR5 esse vetor contem:
-um gene de resistencia a higromicina como um marcador sele-
cionavel,
-uma origem de replicagao, oriP, do virus Epstein-Barr (EBV)1 - uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repli-
cagao desse plasmideo em E. coli, e
-um gene de β-lactamase que confere resistencia a ampicilina
em E. coli.
A unidade de transcrigao do conjugado de peptideo quimerico γΙ-cadeia pesada de anticorpo anti-CCR5 e composta dos seguintes elemen- tos:
-intensificador e promotor imediatamente precoces de citome- galovirus humano,
-uma regiao 5' nao traduzida sintetica, - uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina
de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1, intron, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]),
-a cadeia pesada variavel madura do anticorpo anti-CCR5 de murino que codifica ο segmento disposto com um Cinico sitio de restrigao de Bsml na extremidade 5' (sequencia de sinal L2), e um sitio doador de "spli- ce" e um sitio de restrigao de Notl Cinico na extremidade 3',
-um intron 2 hibrido da cadeia pesada de humano/ camundon- go, incluindo ο element。intensificador de cadeia pesada de camundongo (porgao JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1993) 1373-1378) - os dominios constantes genomicos do gene /1 -pesado huma-
no,
-ο peptideo antifusogenico T-2635, -a sequencia peptidica Iigante [GQ4]3GNN, -a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de γ1- imunoglobulina humana e,
-os sitios de restrigao Cinicos de Ascl e de SgrAI nas extremida- des 5' e 3' respectivamente.
O mapa do plasmideo do vetor de expressao 4995 do conjuga- do de peptideo de γΙ-cadeia pesada de mAB CCR5 e mostrado na Figura 3. A sequencia de aminoacidos da cadeia pesada madura do conjugado (sem a sequencia de sinal) e mostrada na SEQ ID NO: 65. Exemplo 2:
Produpao dos plasmideos de expressao de anticorpo anti-CCR5 finais
Os genes de fusao (genes de fusao de cadeia pesada e/ou Ie- ve de anticorpo) que compreendem um segmento genico de mAB CCR5, um segmento genico Iigante opcional e um segmento genico de peptideo antifu- sogenico foram unidos por metodos e tecnicas de recombinagao conhecidos pela conexao dos segmentos de acido nucleico concordantes. As sequen- cias de acido nucleico que codificam os Iigantes peptidicos e polipeptideos antifusogenicos foram sintetizadas por sintese quimica e entao Iigadas em um plasmideo de E. coli para amplificagao. As sequencias de acido nucleico subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Exemplo 3:
Expressao transitoria de imunoglobulinas e variantes de imunoglobulina em celulas HEK293 com EBNA
Anticorpos recombinantes anti-CCR5 e variantes de anticorpo anti-CCR5 foram gerados por transfecgao transitoria de celulas HEK293- EBNA em cultura aderente (linhagem celular 293 de rim embrionario humano expressando antigeno nuclear de virus Epstein-Barr; American type culture collection niimero de deposito ATCC # CRL-10852) cultivadas em DMEM (Meio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado com 10% de FCS IgG ultra-baixa (soro fetal bovino, Gibco), Glutamina a 2 mM (Gibco), aminoacidos nao essenciais 1% volume por volume Gibco) e 250 Mg/ml de
G418 (Roche Molecular Biochemicals). Para transfecgao foi usado FuGE- NΕ® 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals) em uma pro- porgao de reagente (μΙ) para DNA (pg) variando entre 3:1 a 6:1. As cadeias Ieve e pesada, incluindo as cadeias Ieve e pesada do conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foram expressas a partir de dois plasmi- deos diferentes usando uma proporgao molar de cadeia Ieve para cadeia pesada que codifica ο plasmideo de 1:2 a 2:1, respectivamente. Conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 contendo sobrenadantes de cuItura celular foram coletados no dia 4 a 11 apos a transfecgao. Informagao geral com relagao a expressao recombinante de imunoglobulinas humanas, por exemplo, em celulas HEK293, e dada em: Meissner, P. et a 1., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203. Exemplo 4
Analise de expressao usando SDS PAGE, transferencia por Western blotting e detecpao com coniuqados de anticorpo especificos para imunoglobulina Os conjugados expressos e secretados de peptideo antifusoge-
nico-anticorpo anti-CCR5 foram processados por eletroforese em gel de po- Iiacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE) e as cadeias sepa- radas de anticorpo anti-CCR5 e de conjugado de peptideo antifusogenico- anticorpo anti-CCR5 foram transferidas do gel para uma membrana e sub- sequentemente detectadas por um metodo imunologico. SDS-PAGE:
Tampao de amostra LDS, concentrado 4 vezes (4x): 4g de glice- rol, 0’682g de TRIS-base, 0，666g de TRIS-hidrocloreto, 0，8g de LDS (dodecil sulfato de litio), 0,006g de EDTA (acido etilenodiaminotetracetico), 0,75 ml de uma solugao a 1% em peso (p/p) de Serva Blue G250 em agua, 0,75 ml de uma solugao a 1 % em peso (p/p) de vermelho de fenol e agua para fazer um volume total de 10 ml.
O caldo de cultura contendo ο conjugado secretado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foi centrifugado para remover celulas e restos celulares. Uma aIiquota do sobrenadante clarificado foi misturada com 1/4 volume (v/v) de tampao de amostra LDS 4x e 1/10 volume (v/v) de 1,4-
ditiotreitol a 0,5 M (DTT). As amostras foram entao incubadas por 10 min a 70°C e a proteina foi separada por SDS-PAGE. O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com as instrugdes do fabricante. Em particular, geis a 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) e um tampao de corrida NuPAGE® MOPS foram usados.
Western blot:
Tampao de transferencia: glicina 39 mM, TRIS-hidrocloreto 48 mM, SDS 0,04% em peso (p/p) e etanol 20% em peso (v/v).
Apos ο SDS-PAGE, as cadeias separadas do conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foram transferidas eletroforeti- camente para uma membrana de filtro de nitrocelulose (tamanho do poro: 0,45 μιτι) de acordo com ο "Metodo de Blotting semi-seco" de Burnette (Bur- nette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203). Detecpao imunologica:
Tampao TBS: TRIS-hidrocloreto a 50 mM, NaCI a 150 mM, pH ajustado para 7,5.
Solugao de bloqueio: Western Blocking Reagent a 1 % (p/v) (Ro- che Molecular Biochemicals) em tampao TBS.
Tampao TBST: tampao TBS 1x com Tween-20 a 0,05% em vo- lume (v/v).
Para detecgao imunologica as membranas de western blotting
foram incubadas com agitagao em temperatura ambiente duas vezes por 5 minutos em tampao TBS e uma vez por 90 minutos em solugao de bloqueio. Detecpao das cadeias de conjugado de peptideo e imunoglobulina:
Cadeia pesada: Para detec^ao da cadeia pesada do conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foi usado um anticorpo puri- ficado de coelho anti-IgG humana conjugado a uma peroxidase (DAKO, Co- digo N° P.0214).
Cadeia leve: A cadeia Ieve do conjugado de peptideo antifuso- genico-anticorpo anti-CCR5 foi detectada com um com um anticorpo de coe- Iho anti-cadeia Ieve kappa humana conjugado com peroxidase purificado (DAKO, Codigo N。P.0129).
Para visualizagao das cadeias Ieve e pesada de anticorpo, as membranas de Western blot Iavadas e bloqueadas foram primeiro incuba- das, no caso de uma cadeia pesada, com um anticorpo purificado de coelho anti-IgG humana conjugado com uma peroxidase ou, no caso de uma cadeia Ieve, com um anticorpo de coelho anti-cadeia Ieve kappa humana conjugado com peroxidase purificado em uma diluigao de 1:10.000 em 10 ml de solu- gao de bloqueio a 4°C com agitagao durante a noite. Apos Iavar as membra- nas tres vezes com tampao TBST e uma vez com tampao TBS por 10 min em temperatura ambiente, as membranas de Western blot foram tratadas com uma solugao de Luminol/peroxido gerando quimioluminescencia (Lumi- Lightpujs Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals). Entao, as membranas foram incubadas em 10 ml de solugao de Luminol/peroxido por 10 segundos a 5 minutos e a Iuz emitida foi detectada subsequentemen- te com um LUMI-Imager FL Analysator (Roche Molecular Biochemicals) e/ou foi registrada com um filme de raio X. A intensidade das marcag5es foi quan- tificada com ο Programa LumiAnaIyst (Versao 3.1). Marcagao miiltipla de imunoblots:
O conjugado de anticorpo marcado com peroxidase secundario usado para detecgao pode ser removido do blot marcado pela incubagao da membrana por uma hora a 70°C em tampao TRIS-hidrocloreto a 1M (pH 6,7) contendo beta-mercaptoetanol a 100 mM e SDS a 20% (p/v). Apos esse tra- tamento ο blot pode ser marcado com um anticorpo secundario diferente uma segunda vez. Antes da segunda detecgao, ο blot e Iavado tres vezes em temperatura ambiente com agitagao em tampao TBS por 10 minutos ca- da.
Exemplo 5
Purificacao por afinidade. dialise e concentracao de coniuqados de peptideo e imunoqlobulina
Os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 expressos e secretados foram purificados por cromatografia de afinidade usando Proteina A-Sepharose® CL-4B (GE Healthcare antiga Amersham Bioscience, Suecia) de acordo com metodos conhecidos. Resumidamente,
apos a centrifugagao (10.000 g por 10 minutos) e filtragao atraves de um filtro de 0,45 μιτι, os sobrenadantes de cultura clarificada contendo ο conju- gado de peptideo-imunoglobulina foram aplicados sobre uma coluna de Pro- teina A-Sepharose® CL-4B equilibrada com tampao PBS (Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1 mM, NaCI a 137 mM e KCI a 2,7 mM, pH 7,4). Proteinas nao Iigadas foram removidas com tampao de equilibrio PBS e tampao citrato a 0,1 M, pH 5,5. Os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti- CCR5 foram eluidos com tampao citrato a 0,1 M, pH 3,0 e as fragdes conten- do ο conjugado foram neutralizadas com TRIS-Base a 1M. Entao, os conju- gados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foram intensivamente dialisados contra tampao PBS a 4°C, concentrados com um Ultrafree®-CL Centrifugal Filter Unit equipado com uma membrana Biomax-SK (Millipore Corp., USA) e armazenados em um banho de gelo-agua a O0C. A integrida- de dos conjugados foi analisada por SDS-PAGE na presenga e na ausencia de um agente redutor e corados com azul de Coomassie brilhante conforme descrito no Exemplo 4. A agregagao de conjugados de peptideo antifusoge- nico-anticorpo anti-CCR5 foi analisada por cromatografia analitica por exclu- sao de tamanho. Exemplo 6
Deglicosilapao de conjugados de peptideo e imunoqlobulina Carboidratos N-Iigados de anticorpos anti-CCR5 e conjugados
de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 foram clivados por trata- mento enzimatico com Peptideo-N-Glicosidase F (PNGaseF, Roche Molecu- lar Biochemicals, Mannheim, Alemanha ou Prozyme, San Leandro1 CA). A seguir, os anticorpos anti-CCR5 e conjugados de peptideo antifusogenico- anticorpo anti-CCR5 foram incubados a 37°C por 12 a 24 h usando PNGa- seF 50 mU por mg de proteina N-glicosilada em tampao PBS com uma con- centragao de proteina de cerca de 2 mg/ml. Entao, ο Peptideo-N-Glicosidase F foi separado por fiItragao em gel preparativa de acordo com metodos co- nhecidos. Resumidamente, anticorpos anti-CCR5 e conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 tratados com PNGaseF foram aplicados a uma coluna de Superose® 12 10/300 GL (GE Healthcare antiga Amer-
sham Bioscience, Suecia) equilibrada com tampao PBS (Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1 mM, NaCI a 137 mM e KCI a 2,7 mM, pH 7,4) e entao eluidos com tampao de equilibrio em uma taxa de fluxo de 0,5 a 1,0 ml/min usando ο sistema de cromatografia exploratoria Akta da Amersham Bioscience (GE Healthcare antiga Amersham Bioscience, Suecia).
Exemplo 7
Ensaio de atividade antiviral de ciclo Cinico
Para a produgao de virus pseudotipados NL-Bal, ο plasmideo pNL4-3Aenv (construto genomico pNL4-3 de HIV com uma delegao dentro do gene env) e pCDNA3.1/NL-BAL env [plasmideo pcDNA3.1 contendo ο gene env NL-BaI (obtido de NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagents)] foram co-transfectados na Iinhagem celular HEK 293FT (Invitrogen) cultivada em meio minimo modificado de Dulbecco (DMEM) contendo soro fetal bovl· no a 10% (FCS), 100 U/ml de Penicilina, 100 Mg/ml de Estreptomicina, L-glutamina a 2 mM e 0,5 mg/ml de geniticina (todos os meios da Invitro- gen/Gibco). Os sobrenadantes contendo os virus pseudotipados foram cole- tados dois dias apos a transfecgao e os restos celulares foram removidos por filtragao atraves de um filtro PES (polietersulfona) com poro de 0,45 μηι (NaIgene) e armazenados a -80°C em aliquotas. Para normalizagao para ο desempenho do ensaio, aliquotas de estoque de virus foram usadas para infectar celulas JC53-BL (US NIH Aids Reagent Program) gerando aproxi- madamente 1,5 χ 105 RLU (unidades relatives de luz) por cavidade. Conju- gados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5 de teste, anticorpos de referencia e peptideos antifusogenicos de referenda (T-20, T-1249, T-651 e T-2635) foram diluidos seriadamente em placas de 96 cavidades. O ensaio foi realizado em quadruplicatas. Cada placa continha cavidades de celula de controle e virus de controle. O equivalente a 1,5 χ 105 RLU de estoques de virus foi adicionado a cada cavidade, entao 2,5 χ 104 celulas JC53-BL foram adicionadas a cada cavidade, com um volume de ensaio final de 200 μΙ por cavidade. Apos 3 dias de incuba^ao a 37°C, 90% de Umidade Relativa e 5% de CO2, os meios foram aspirados e 50 μΙ de Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega) foram adicionados a cada cavidade. As placas de ensaio
foram Iidas em um Luminometro (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) apos 10 min de incubagao em temperatura ambiente. O percentual de inibi- gao da atividade de Iuciferase foi calculado para cada dose apos a subtragao do fundo e os valores de IC50 e IC90 foram determinados pelo uso do pro- grama de ajuste de curva para Excel XLfit (versao 3.0.5 Buildl2; Microsoft).
Os resultados sao mostrados na Tabela 3.
Tabela 3: Atividade antiviral de polipeptideos antifusogenicos, anticorpos e
conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CCR5
Composto Atividade antiviral IC50 (ng/ml) IC90 (ng/ml) Anticorpo de referenda 1 (inerte) inativo inativo Anticorpo de referencia 2 (inerte) inativo inativo T-20 206 3955 T-1249 11 90 T-651 11 139 T-2635 14 161 mAb CCR5 (4901/4900) 114 2387 Conjugado quimerico de peptideo-mAb CCR5 (4995/4900) 7 45
Exemplo 8
Ensaio de Fusao de Celula-Celula No dia 1, celulas HeLa expressando gp160 (2 χ 104 celulas/50
μΙ/cavidade) sao semeadas em uma placa de microtitulagao 96 branca em meio DMEM suplementado com FCS 10% e 2 Mg/ml de doxicilina. No dia 2’ 1 μ| de amostra de sobrenadante ou anticorpo de controle por cavidade sao adicionados em uma placa de microtitulagao 96 limpa. Entao, 100 μΙ conten- do 8x104 celulas CEM-NKr-Luc em suspensao em meio sao adicionados e incubados por 30 min a 37°C. O meio de cuItura de celula HeLa e aspirado da placa de 96 cavidades, 100 μΙ da mistura de 200 μΙ de anticorpo/CEM- NKr-Luc sao adicionados e incubados durante a noite a 37°C. No dia 3, 100 μΙ/cavidade de substrato de ensaio Bright-Glo® Luciferase (1,4-ditiotreitol e ditionito de sodio; Promega Corp., EUA) sao adicionados e a Iuminescencia
e medida apos um minimo de 15 min de incubagao em TA. Materials:
Celulas HeLa-R5-16 (linhagem celular para expressar gp160 de HIV apos indugao com doxicilina) sao cultivadas em meio DMEM contendo nutrientes e 10% de FCS com 400 Mg/ml de G418 e 200 pg/ml de Higromici- na B. CEM.NKR-CCR5-LUC (Niimero de Catalogo: 5198, uma linhagem de celula T disponibilizada por NIH AIDS Research & Reference Reagent Pro- gram McKesson BioServices Corporation Germantown1 MD 20874, EUA). Tipo Celular: CEM.NKR-CCR5 (Cat. #4376) e transfectada (eletroporagao) para expressar ο gene da Iuciferase sob ο controle transcricional de LTR de HIV-2 e propagada em RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino, glu- tamina a 4 mM, penicilina/estreptomicina (100 U/ml de Penicilina, 100 pg/ml de Estreptomicina), e 0,8 mg/ml de suIfato de geniticina (G418). Caracteristi- cas de Crescimento: Celulas Iinfoides redondas, morfologia nao muito varia- vel. As celulas crescem em suspensao como celulas isoladas, que podem formar pequenos aglomerados. Repique 1:10 duas vezes por semana. Ca- racteristicas Especiais: Expressa atividade de Iuciferase apos transativagao de LTR de HIV. Adequada para infecgao com isolados primarios de HIV-2, para neutralizagao e ensaios de sensibilidade a farmacos (Spenlehauer, C, et al.’ Virology 280 (2001) 292-300; Trkola1 A., et a/·, J. Virol. 73 (1999) 8966- 8974). A linhagem celular foi obtida atraves da NIH AIDS Research and Re- ference Reagent Program, NIAID, NIH pelo Drs. John Moore e Catherine Spenlehauer. Tampao de ensaio Bright-Glo® Luciferase (Promega Corp. EUA, Part. N0 E2264B), Bright-Glo®, Substrata de ensaio de Luciferase (Promega Corp. EUA, part. N0 EE26B). Exemplo 9
Ensaio de atividade antiviral em celulas mononucleares de sanque periferico (PBMC)
PBMC humanas sao isoladas da camada de celulas brancas (buffy-coats) (obtidos do Stanford Blood Center) por centrifugagao com gra- diente de densidade com Ficoll-Paque (Amersham, Piscataway, Nova Jer- sey, EUA) de acordo com ο protocolo do fabricante. Resumidamente, ο san- gue e transferido da camada de celulas brancas para tubos conicos de 50 ml e diluido com salina esteril tamponada com fosfato de Dulbecco (Invitro- gen/Gibco) para um volume final de 50 ml. Vinte e cinco ml do sangue dilui- do sao transferidos para dois tubos conicos de 50 ml, cuidadosamente co- bertos com 12,5 ml de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) e centri- fugados em temperatura ambiente por 20 min a 450 χ g com parada lenta. A camada de celula branca e cuidadosamente transferida para um novo tubo conico de 50 ml e Iavada duas vezes com PBS. Para remover as celulas vermelhas do sangue remanescentes, as celulas sao incubadas por 5 min em temperatura ambiente com tampao de Iise ACK (Biosource) e Iavadas mais uma vez com PBS. PBMC sao contadas e incubadas em uma concen- tragao de 2 a 4 χ 106 celulas/ml em RPMI1649 contendo 10% de FCS (Invi- trogen/Gibco), 1% de penicilina/estreptomicina, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sodio a 1 mM e Fito-hemaglutinina 2 Mg/ml (Invitrogen) por 24 h a 37°C. As celulas sao incubadas com 5 Unidades/ml de IL-2 humana (Roche Mole- cular Biochemicals) por um minimo de 48 h antes do ensaio. Em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo 1 χ 105 PBMC sao infectadas com ο virus HIV-I JR-CSF (Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822) na presen- ga de conjugados de teste de peptideo-imunoglobulinas, imunoglobulinas de referencia e peptideos de referencia (T-20, T-1249, T-651 e T-2635) diluidos seriadamente. A quantidade de virus usada e equivalente a 1,2 ng de anti- geno p24 de HIV-1/cavidade. As infecg5es sao feitas em quadruplicata. As placas sao incubadas por 6 dias a 37°C. A produgao de virus e medida no final da infecgao usando ELISA para p24 (HIV-I p24 ELISA #NEK050B, Per- kin Elmer/NEN) usando ο modelo de format。sigmoide de dose-resposta com um sitio de Iigagao em Microsoft Excel Fit (versao 3.0.5 Build 12; equa- gao 205; Microsoft). Exemplo 10
Producao de plasmideos de expressao de anticorpo anti-CD4
Os segmentos de gene que codificam ο dominio variavel da ca- deia Ieve (Vl) de anticorpo anti-CD4 humana e ο dominio constante da ca- deia Ieve kappa (Cl) foram Iigados como se fossem segmentos de gene para
ο dominio variavel (Vh) da cadeia pesada do anticorpo anti-CD4 e os domi- nios constantes da γΐ-cadeia pesada humana (CH1 -dobradiga-CH2-CH3).
No caso de mAb CD4 de SEQ ID NO: 71/72’ os dominios varia- veis de cadeia pesada e Ieve sao derivados de um anticorpo de camundon- go que foi humanizado como descrito, por exemplo, por Reimann1 K.A., et a/., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 ou em US 5.871.732, e os dominios constantes de cadeia pesada e Ieve sao derivados de um anticorpo humano (C-kappa e IgGI).
Subsequentemente, ο segmento genico que codifica uma cadeia Ieve complete de anticorpo anti-CD4 foi Iigado na terminagao-N e/ou -C com um acido nucleico que codifica um peptideo antifusogenico incluindo uma sequencia Iigante de conexao e/ou ο segmento genico que codifica uma ca- deia pesada completa de anticorpo anti-CD4 foi Iigado na terminagao-N e/ou -C com um acido nucleico que codifica um peptideo antifusogenico incluindo uma sequencia Iigante de conexao. a) Vetor 6310
O vetor 6310 e um plasmideo de expressao, por exemplo, para expressao transitoria da cadeia Ieve de mAb CD4 (cassete de expressao genomicamente orgariizado; organizagao exon-intron) em celulas HEK293.
Alem do cassete de expressao da cadeia κ-leve de mAb CD4, esse vetor contem:
-um gene de resistencia a neomicina como um marcador sele-
cionavel,
-uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repli- cagao desse plasmideo em celulas de E. coli, e - um gene de β-lactamase que confere resistencia a ampicilina
em E. coli.
A unidade de transcrigao do gene da cadeia κ-leve de mAb CD4 e composta dos seguintes elementos:
-ο intensificador e promotor imediatamente precoces de cito- megalovirus humano,
-uma regiao 5' nao traduzida de uma Iinhagem germinativa de
anticorpo humano, -uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1, intra η, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]),
-a cadeia Ieve variavel madura κ de anticorpo anti-CD4 humana que codifica ο segmento disposto com um sitio doador de "splice" e um CirH- co sitio de restrigao BamHI na extremidade 3',
-um intron 2 truncado da cadeia κ-leve humana, -ο dominio constante do gene de κ-leve de humano, -a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de hormonio do crescimento bovino (bGH) e,
-os sitios de restrigao Linicos de Ascl e de SgrAI na extremidade 3'.
O mapa do plasmideo do vetor de expressao 6310 da cadeia κ- Ieve de mAb CD4 e mostrado na Figura 4. A sequencia de aminoacidos da cadeia κ-leve madura de mAb CD4 (sem sequencia de sinal) e mostrada na SEQ ID NO: 71. b) Vetor 6309
O vetor 6309 e um plasmideo de expressao, por exemplo, para expressao transitoria da γ1 -cadeia pesada de mAb CD4 (cassete de expres- sao genomicamente organizado; organizagao exon-intron) em celulas HEK293.
Alem do cassete de expressao da cadeia pesada γΙ de mAb CD4, esse vetor contem:
-uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repn- cagao desse plasmideo em celulas de E. coli, e
-um gene de β-lactamase que confere resistencia a ampicilina
em E. coli.
A unidade de transcrigao do gene da y1-cadeia pesada de mAb CD4 e composta dos seguintes elementos: - ο intensificador e promotor imediatamente precoces de cito-
megalovirus humano,
-uma regiao 5' nao traduzida de uma Iinhagem germinativa de anticorpo humano,
-uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1， intra η, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]), - a cadeia pesada variavel madura do anticorpo anti-CD4 huma-
na que codifica ο segmento disposto com um sitio doador de "splice" e um Cinico sitio de restrigao de Xhol na extremidade 3',
-um intron 2 hibrido da cadeia pesada de camundongo/ huma- no,
- os dominios constantes genomicos humanos do gene de γΙ pe-
sada contendo a mutagao L234A e L235A,
-a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de hormonio do crescimento bovino (bGH) e,
-ο sitio de restrigao Cinico de SgrAI na extremidade 3'.
O mapa do plasmideo do vetor de expressao 6309 da γ1-cadeia
pesada de mAb CD4 e mostrado na Figura 3. A sequencia de aminoacidos da /1-cadeia pesada madura de mAb CD4 (sem sequencia de sinal) e mos- trada na SEQ ID NO: 72. c) Vetor 6303
O vetor 6303 e um plasmideo de expressao, por exempio, para
expressao transitoria de um corijugado quimerico de peptideo yl-cadeia pe- sada de anticorpo anti-CD4 (cassete de expressao genomicamente organi- zado; organizagao exon-intron) em celulas HEK293.
O vetor 6303 e derivado do vetor 6309 de tal forma que a γΙ-
cadeia pesada de mAb CD4 e Iigada ao iiltimo, porem um Cinico aminoacido C-terminal, isto e, ο residuo de Iisina C-terminal da cadeia pesada e removi- do, com um acido nucleico que codifica ο peptideo antifusogenico afp-1 (SEQ ID NO: 73) e ο Iigante peptidico glicina-serina de SEQ ID NO: 69.
Alem do cassete de expressao do conjugado quimerico de pep-
tideo γ1-cadeia pesada de anticorpo anti-CD4 esse vetor contem:
-uma origem de replicagao do vetor pUC18 que permite a repli-
cagao desse plasmideo em celulas de E. coli, e -um gene de beta (P)-Iactamase que confere resistencia a am- picilina em E. coli.
A unidade de transcri^ao do conjugado quimerico de peptideo γ1- cadeia pesada de anticorpo anti-CD4 e composta dos seguintes elementos: - ο intensificador e promotor imediatamente precoces de cito-
megalovirus humano,
-uma regiao 5' nao-traduzida de uma Iinhagem germinativa de anticorpo humano,
-uma sequencia de sinal da cadeia pesada de imunoglobulina de murino incluindo um intron da sequencia de sinal (sequencia de sinal 1， intron, sequencia de sinal 2 [L1-intron-L2]),
-a cadeia pesada variavel madura do anticorpo anti-CD4 huma- na que codifica ο segmento disposto com um sitio doador de "splice" e um Linico sitio de restrigao de Xhol na extremidade 3', - um intron hibrido da cadeia pesada de camundongo/ humano
contendo as mutagdes L234A e L235A,
-a sequencia Iigante peptidica de serina-glicina de SEQ ID NO:
69,
-ο peptideo antifusogenico afp-1 de SEQ ID NO: 73, - a sequencia de sinal de poliadenilagao ("poli A") de hormonio
do crescimento bo vino (bGH) e,
-ο sitio de restrigao Cinico de SgrAI na extremidade 3'. O mapa do plasmideo do vetor de expressao 6303 do conjuga- do de y1 -cadeia pesada de mAb CD4 e mostrado na Figura 6. A sequencia de aminoacidos do conjugado de cadeia pesada madura (sem sequencia de sinal) e mostrada na SEQ ID NO: 74. Exemplo 11
Producao dos plasmideos de expressao finais de anticorpo anti-CD4
Os genes de fusao (genes de fusao de cadeia pesada e/ou Ieve de anticorpo) que compreendem um segmento genico de mAb CD4, um segmento genico Iigante opcional e um segmento genico de peptideo antifu- sogenico foram reunidos por metodos e tecnicas recombinantes conhecidas pela conexao dos segmentos de acido nucleico concordantes. As sequen- cias de acido nucleico que codificam os Iigantes peptidicos e polipeptideos antifusogenicos foram sintetizadas por sintese quimica e entao Iigadas em um plasmideo de E. coli para amplifica^ao. As sequencias de acido nucleico subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Exemplo 12
Expressao transitoria de imunoqlobulinas e variantes de imunoqlobulina em celulas HEK293 com EBNA
Anticorpos recombinantes anti-CD4 e variantes de anticorpo an- t卜CD4 foram gerados por transfecgao transitoria de celulas HEK293-EBNA em cultivo aderente (linhagem celular 293 de rim embrionario humano que expressa ο antigeno nuclear do virus Epstein-Barr American type culture collection niimero de deposito ATCC # CRL- 10852) cultivadas em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado com 10% de FCS IgG ultra-baixa (soro fetal bovino, Gibco), Glutamina a 2 mM (Gibco), aminoacidos nao essenciais a 1% volume por volume (v/v) (Gibco) e G418 250 pg/ml (Roche Molecular Biochemicals). Para transfecgao, foi usado Fu- GENE® 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals) em uma proporgao de reagente (μΙ) para DNA (pg) variando entre 3:1 a 6:1. As ca- deias Ieve e pesada incluindo as cadeias Ieve e pesada do conjugado de peptideo-anticorpo anti-CD4 foram expressas em dois plasmideos diferentes usando uma proporgao molar de plasmideo que codifica a cadeia Ieve para cadeia pesada variando de 1:2 a 2:1, respectivamente. Sobrenadantes de cuItura celular contendo os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram coletados no dia 4 a 11 apos a transfecgao. Informagao geral com relagao a expressao recombinante de imunoglobulinas humanas, por exemplo, em celulas HEK293, e dada em: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203. Exemplo 13
Analise de expressao usando SDS-PAGE. transferencia por Western blotting e deteccao com coniuqados de anticorpo especificos para imunoqlobulina.
Os conjugados expressos e secretados de peptideo antifusoge- nico-anticorpo anti-CD4 foram processados por eletroforese em gel de polia- crilamida dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE) e as cadeias separa- das de anticorpo anti-CD4 e de peptideo antifusogenico do conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram transferidas do gel para uma membrana e subsequentemente detectadas por um metodo imunologi- co.
SDS-PAGE:
Tampao de amostra LDS, concentrado 4 vezes (4x): 4g de glice- rol, 0’682g de TRIS-base, TRIS-hidrocloreto 0’666g, 0,8g de LDS (dodecil sulfato de litio), 0’006g de EDTA (acido etilenodiaminotetracetico), 0,75 ml de uma solugao de 1% em peso (p/p) de Serva Blue G250 em agua, 0,75 ml de uma solugao de 1% em peso (p/p) de vermelho de fenol e agua para fa- zer um volume total de 10 ml.
O caldo de cuItura contendo ο conjugado secretado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foi centrifugado para remover celulas e restos celulares. Uma aliquota do sobrenadante clarificado foi misturada com 1/4 de volume (v/v) de tampao de amostra 4xLDS e 1/10 de volume (v/v) de 1，4-ditiotreitol a 0,5 M (DTT). As amostras foram entao incubadas por 10 min a 70°C e a proteina foi separada por SDS-PAGE. O sistema de gel NuPA- GE® Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com as instrugdes do fabri- cante. Em particular, geis a 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) e um tampao de corrida NuPAGE® MOPS foram usados. Western blot:
Tampao de transferencia: glicina a 39 mM, TRIS-hidrocloreto a 48 mM, SDS 0,04% em peso (p/p) e etanol 20% por volume (v/v).
Apos SDS-PAGE, as cadeias separadas do conjugado de pepti- deo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram transferidas eletroforeticamente para uma membrana de filtro de nitrocelulose (tamanho do poro: 0,45 μηη) de acordo com ο "Metodo de Blotting semi-seco" de Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203). Detecpao imunoloqica:
Tampao TBS: TRIS-hidrocloreto a 50 mM, NaCI a 150 mM, pH ajustado para 7,5.
Solugao de bloqueio: Western Blocking Reagent 1% (p/v) (Ro- che Molecular Biochemicals) em tampao TBS.
Tampao TBST: 1x tampao TBS com Tween-20 0,05% por volu-
me (v/v).
Para detecgao imunologica as membranas de western blotting foram incubadas com agitagao em temperatura ambiente duas vezes por 5 minutos em tampao TBS e uma vez por 90 minutos em solugao de bloqueio. Detecpao das cadeias de coniugado de peptideo e imunoqlobulina: Cadeia pesada: Para detecgao da cadeia pesada do conjugado
de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foi usado um anticorpo purifi- cado de coelho anti-IgG humana conjugado a uma peroxidase (DAKO1 Codi- go N0 P.0214).
Cadeia Ieve: A cadeia Ieve do conjugado de peptideo antifuso- genico-anticorpo anti-CD4 foi detectada com um anticorpo de coelho anti- cadeia Ieve kappa humana conjugada com peroxidase purificado (DAKO1 Codigo N° P.0129).
Para visualizagao das cadeias Ieve e pesada de anticorpo, as membranas de Western blot Iavadas e bloqueadas foram primeiro incuba- das, no caso de uma cadeia pesada, com um anticorpo purificado de coelho anti-IgG humana conjugado com uma peroxidase ou, no caso de uma cadeia Ieve1 com um anticorpo anti-cadeia Ieve kappa humana conjugado com pe- roxidase purificado em uma dilui^ao de 1:10.000 em 10 ml de solugao de bloqueio a 4°C com agitagao durante a noite. Apos Iavar as membranas tres vezes com tampao TBST e uma vez com tampao TBS por 10 min em tempe- ratura ambiente, as membranas de Western-blot foram tratadas com uma solugao de Luminol/peroxido gerando quimioluminescencia (LurrH-Lightpujs Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals). Entao, as membranas foram incubadas em 10 ml de soIugao de Luminol/peroxido por 10 segundos a 5 minutos e a Iuz emitida foi detectada subsequentemente com um LUMI-Imager Fl Analysator (Roche Molecular Biochemicals) e/ou foi registrada com um filme de raio X. A intensidade dos pontos foi quantificada com ο LumiAnaIyst Software (Versao 3.1). Marcapao miiltipla de imunoblots:
O conjugado de anticorpo secundario marcado com peroxidase usado para detecgao pode ser removido do blot corado pela incubagao da membrana por uma hora a 70°C em tampao TRIS-hidrocloreto a 1M (pH 6,7) contendo beta-mercaptoetanol a 100 mM e SDS 20% (p/v). Apos esse tra- tamento ο blot pode ser corado com um anticorpo secundario diferente uma segunda vez. Antes da segunda detecgao, ο blot e Iavado tres vezes em temperatura ambiente com agitagao em tampao TBS por 10 minutos cada. Exemplo 14
Purificapao por afinidade, dialise e concentragao de coniugados de peptideo- imunoqlobulina
Os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 expressos e secretados foram purificados por cromatografia de afinidade usando Proteina A-Sepharose® CL-4B (GE Healthcare antiga Amersham Bioscience, Suecia) de acordo com metodos conhecidos. Resumidamente, apos a centrifugagao (10.000 g por 10 minutos) e filtragao atraves de um filtro de 0,45 μηι, os sobrenadantes de cultura clarificada contendo ο conju- gado de peptideo-imunoglobulina foram aplicados sobre uma coluna de Pro- tein A-Sepharose® CL-4B equilibrada com tampao PBS (Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1 mM, NaCI a 137 mM e KCI a 2,7 mM, pH 7,4). Proteinas nao Iigadas foram removidas com tampao de equilibrio PBS e tampao citrato 0，1M, pH 5,5. Os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram eluidos com tampao citrato a 0,1M, pH 3,0 e as fragdes contendo ο conjugado foram neutralizadas com TRIS-Base a 1M. Entao1 os conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram intensivamente dialisa- dos contra tampao PBS a 4°C, concentrados com um Ultrafree®-CL Centri- fugal Filter Unit equipado com uma membrana Biomax-SK (Millipore Corp., USA) e armazenados em um banho de gelo-agua a O0C. A integridade dos conjugados foi analisada por SDS-PAGE na presenga e na ausencia de um agente redutor e corados com azul de Coomassie brilhante como descrito no Exemplo 13. A agregagao de conjugados de peptideo aritifusogenico- anticorpo anti-CD4 foi analisada por cromatografia analitica por exclusao de
tamanho.
Exemplo 15
Deglicosilacao de coniuqados de peptideo e imunoqlobulina Carboidratos N-Iigados de anticorpos anti-CD4 e conjugados de
peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram clivados por tratamento enzimatico com Peptideo-N-Glicosidase F (PNGaseF, Roche Molecular Bio- chemicals, Mannheim, Alemanha ou Prozyme, San Leandro, CA). A seguir, os anticorpos anti-CD4 e conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 foram incubados a 37°C por 12 a 24 h usando PNGaseF 50 mU por mg de proteina N-glicosilada em tampao PBS com uma concentragao de prateina de cerca de 2 mg/ml. Entao1 ο Peptideo-N-Glicosidase F foi separa- do por filtragao em gel preparativa de acordo com metodos conhecidos. Re- sumidamente, anticorpos anti-CD4 e conjugados de peptideo antifusogenico- anticorpo anti-CD4 foram aplicados em uma coluna Superose® 12 10/300 GL (GE Healthcare antiga Amersham Bioscience, Suecia) equilibrada com tampao PBS (Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1 mM, NaCI a 137 mM e KCI a 2,7 mM, pH 7,4)e entao eluidos com tampao de equilibrio em uma taxa de fluxo de 0,5 a 1,0 ml/min usando ο sistema de cromatografia exploratoria Akta da Amersham Bioscience(GE Healthcare antiga Amersham Bioscience, Suecia). Exemplo 16
Ensajo de atividade antiviral de ciclo unico
Para a produgao de virus pseudotipados NL-Bal, ο plasmideo pNL4-3Aenv (construto genomico de pNL4-3 de HIV com uma delegao den- tro do gene env) e pCDNA3.1/NL-BAL env [plasmideo pcDNA3.1 contendo ο gene NL-BaI env (obtido de NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagents)] foram co-transfectados na Iinhagem celular HEK 293FT (Invitrogen)1 cuItiva- das em meio minimo modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FCS), 100 U/ml de Penicilina, 100 pg/ml de Estreptomici- na, L-glutamina a 2 mM e 0,5 mg/ml de geniticina (todos os meios da Invitro-
gen/Gibco). Os sobrenadantes contendo os virus pseudotipados foram cole- tados dois dias apos a transfecgao e os restos celulares foram removidos por fiItragao atraves de um filtro PES (polietersulfona) com poro de 0,45 μιη (NaIgene) e armazenados a -80°C em aliquotas. Para normalizagao do de- sempenho do ensaio, aliquotas de estoque de virus foram usadas para in- fectar celulas JC53-BL (US NIH Aids Reagent Program) gerando aproxima- damente 1,5 χ 105 RLU (unidades relatives de luz) por cavidade. Conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 de teste, anticorpo anti-CD4 parental, anticorpos de referenda e peptideo antifusogenico de referencia (T-651) foram diluidos seriadamente em placas de 96 cavidades. O ensaio foi realizado em quadruplicatas. Cada placa continha cavidades de celula de controle e virus de controle. O equivalente a 1,5 χ 105 RLU de estoques de virus foi adicionado a cad a cavidade, entao 2,5 χ 104 celulas JC53-BL foram adicionadas a cada cavidade, com um volume de ensaio final de 200 μΙ por cavidade. Apos 3 dias de incubagao a 37°C, 90% de Umidade Relativa e 5% de CO2, os meios foram aspirados e 50 μΙ de Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega) foram adicionados a cada cavidade. As placas de ensaio foram Iidas em um Luminometro (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) apos 10 min de incubagao em temperatura ambiente. O percentual de inibi- gao da atividade de Iuciferase foi calculado para cada dose apos a subtragao do fundo e os valores de IC5o e ICg0 foram determinados pelo uso do pro- grama de ajuste de curva para Excel XLfit (versao 3.0.5 Build 12; Microsoft). Os resultados sao mostrados na Tabela 4 e 5 respectivemente. Tabela 4: Atividade antiviral de polipeptideos antifusogenicos, anticorpos e conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 (em peso)
Composto Atividade antiviral NL-BAL (R5) NL-4-3 (x4) IC50 [ng/ml]/IC90 [ng/ml] IC50 [ng/ml]/IC90 [ng/ml] Anticorpo de referencia 1 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo Anticorpo de referencia 2 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo T-651 21,5/181,9 169,2/1099,7 Composto Atividade antiviral NL-BAL (R5) NL-4-3 (x4) IC50 [ng/ml]/IC90 [ng/ml] IC50 [ng/ml]/IC90 [ng/ml] mAb CD4 (6310/6309) inibigao maxima = 50% inibiQao maxima = 20% Conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 (6310/6303) 6,1/32,2 43,9/123,9
Tabela 5: Atividade antiviral de polipeptideos antifusogenicos, anticorpos e conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 (por molaridade)
Compost。 Atividade antiviral NL-BAL (R5) NL-4-3 (x4) IC50 _/ IC90 _ IC50 _/ IC90 _] Anticorpo de referencia 1 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo Anticorpo de referencia 2 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo T-651 5,4/45 42/275 mAb CD4 (6310/6309) inibigao maxima = 50% inibiQao maxima = 20% Conjugado de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 (6310/6303) 0,038/0,201 0,275/0,774
Exemplo 17
Ensaio de Fusao de Celula-Celula
No dia 1, celulas HeLa expressando gp160 (2 χ 104 celulas/50 μΙ/cavidade) sao semeadas em uma placa de microtitulagao 96 branca em meio DMEM suplementado com FCS 10% e 2 pg/ml de doxicilina. No dia 2, 100 μΙ por cavidade de amostra de sobrenadante ou anticorpo de controle sao adicionados em uma placa de microtitulagao 96 limpa. Entao, 100 μΙ contendo 8x104 celulas CEM-NKr-Luc em suspensao em meio sao adiciona- dos e incubados por 30 min a 37°C. O meio de cultura de celula HeLa e as- pirado da placa de 96 cavidades, 100 μΙ da mistura de 200 μΙ de anticor- po/CEM-NKr-Luc sao adicionados e incubados durante a noite a 37°C. No dia 3，100 μΙ/cavidade de substrata de ensaio Bright-Glo® Luciferase (1,4- ditiotreitol e ditionito de sodio; Promega Corp., USA) sao adicionados e a Iuminescencia e medida apos um minimo de 15 min de incubagao em TA. Materials:
Celulas HeLa-R5-16 (linhagem celular para expressar gp160 de HIV apos indugao com doxicilina) sao cultivadas em meio DMEM contendo nutrientes e 10% de FCS com 400 pg/ml de G418 e 200 pg/ml de Higromici- na B. CEM.NKR-CD4-LUC (NCimero de Catalogo: 5198, uma linhagem de celula T disponibilizada por NIH AIDS Research & Reference Reagent Pro- gram McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, EUA). Tipo Celular: CEM.NKR-CD4 (Cat. #4376) e transfectada (eletroporagao) para expressar ο gene da Iuciferase sob ο controle transcricional de LTR de HIV-2 e propagada em RPMI 1640 contendo soro fetal bovino 10%, glutami- na a 4 mM, penicilina/estreptomicina (100 U/ml de Penicilina1 Estreptomicina de 100 pg/ml), e 0,8 mg/ml de sulfato de geniticina (G418). Caracteristicas de Crescimento: Celulas Iinfoides redondas, morfologia nao muito variavel. As celulas crescem em suspensao como celulas isoladas, que podem formar pequenos aglomerados. Repique 1:10 duas vezes por semaria. Caracteristi- cas Especiais: Expressar atividade de Iuciferase apos transativagao de LTR de HIV. Adequada para infecgao com isolados primarios de HIV, para neu- traIizagao e ensaios de sensibilidade a farmacos Spenlehauer, C, et al., Viro- logy 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974). A linhagem celular foi obtida atraves da NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH dos Drs. John Moore e Catherine Spenlehau- er. Tampao de ensaio Bright-Glo® Luciferase (Promega Corp. EUA, Part. N0 E2264B), Bright-Glo®, Substrato de ensaio de Luciferase (Promega Corp. USA, part. N0 EE26B). Exemplo 18
Ensaio de atividade antiviral em celulas mononucleares de sangue periferico (PBMC).
PBMC humanas sao isoladas da camada de celulas brancas
(obtida do Stanford Blood Center) por centrifugagao com gradiente de densi- dade com Ficoll-Paque (Amersham, Piscataway1 Nova Jersey, USA) de a- cordo com ο protocolo do fabricante. Resumidamente, ο sangue e transferi- do da camada de celulas brancas para tubos conicos de 50 ml e diluido com salina est6ril tamponada com fosfato de Dulbecco (Invitrogen/Gibco) para um volume final de 50 ml. Vinte e cinco ml do sangue diluido sao transferi- dos para dois tubos conicos de 50 ml, cuidadosamente cobertos com 12,5 ml de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) e centrifugados em tempera- tura ambiente por 20 min a 450 χ g com parada Ienta. A camada de celulas brancas e cuidadosamente transferida para um novo tubo conico de 50 ml e Iavada duas vezes com PBS. Para remover as celulas sanguineas verme- Ihas remanescentes, as celulas sao incubadas por 5 min em temperature ambiente com tampao de Iise ACK (Biosource) e Iavadas mais uma vez com PBS. PBMC sao contadas e incubadas em uma concentragao de 2 a 4 χ IO6 celulas/ml em RPMI1649 contendo 10% de FCS (Invitrogen/Gibco), 1% de penicilina/estreptomicina, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sodio a 1 mM e 2 Mg/ml de Fito-hemaglutinina (Invitrogen) por 24 h a 37°C. As celulas sao in- cubadas com 5 Unidades/ml de IL-2 humana (Roche Molecular BiocherrH- cals) por um minimo de 48 h antes do ensaio. Em uma placa de 96 cavida- des de fundo redondo 1 χ 105 PBMC sao infectadas com ο virus HIV-I JR- CSF (Koyanagi, Y., et al„ Science 236 (1987) 819-822) na presenga de con- jugados de teste de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4, imunoglo- bulinas de referencia, anticorpo anti-CD4 parental e peptideo de referencia (T-651) diluidos seriadamente. A quantidade de virus usada e equivalente a 1,2 ng de antigeno p24 de HIV/cavidade. As infecg5es sao feitas em qua- druplicatas. As placas sao incubadas por 6 dias a 37°C. A produgao de virus e medida no final da infecgao usando ELISA para p24 (HIV-I p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN) usando ο modelo de formato sigmoide de dose-resposta com um sitio de Iigagao em Microsoft Excel Fit (versa。3.0.5
Build 12; equagao 205; Microsoft). Tabela 6: Atividade antiviral de polipeptideos antifusogenicos, anticorpos e conjugados de peptideo antifusogenico-anticorpo anti-CD4 (em peso)
Composto Atividade antiviral NL-BAL (R5) NL-4-3 (x4) IC50 [ng/ml]/ IC90 [ng/ml] IC50 [ng/ml]/ IC90 [ng/ml] Anticorpo de referenda 1 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo Anticorpo de referencia 2 (inerte) inativo/inativo inativo/inativo T-651 14,1/57,8 41,4/79,6 Anticorpo anti-CD4 (6310/6309) 917,6/inibigao max 54% 35,6/1117,0 Conjugado quimerico de peptideo antifusogenico- anticorpo anti-CD4 (6310/6303) 5,3/18,2 3,2/25,1 Listagem de Sequencia
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> CONJUGADO DE ANTICORPO CONTRA CCR5 E PEPTIDEO ANTIFUSOGENICO
<130> 23883 MO
<150> BP 06017156.8
<151> 200S-08-17
<X50> EP 0701433 5.9
<X51> 2007-07-20
<150> EP 06020647.1
<151> 2006-09-29
<160> 105
<1?0> PatentIn version 3.2
<210> ι
<211> 119
<.212> PRT
< 21 '3 > camundongo
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly
1 5
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 2S
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 40
Ala Ser lie Ser Thr Gly Asp Asn Thr 50 55
GXy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn
65 70
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 85
Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15
Gly Phe Tbr Phe Ser Thr Tyr 30
Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 45
Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Arg 60
Ala Arg Asn lie Leu Tyr Leu 75 80
Thr Ala Met Tyr Phe Cys Thr 90 95
Arg Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 2 <211> 114 <212> PRT
camundongo
<400> 2
Asp lie Val Met Ser GXn Ser Pro Ser Ser Leu Ala. Val Ser Val Giy IS 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg 25 30
Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gin 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val SO 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Thr Val Tyr Tyr Cys Gln Gin 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys Arg
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 3
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Pro Leu Gly Val Phe 25 3 0 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 45
Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60
Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 30 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110
Val Ile Val Ser Ser 115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> camundongo
<4 Q0> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro AIa Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lyo Ser Pro Gln Leu Leu Val 40 45
Tyr Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 5
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe
25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 45
Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60
Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Ile Val Ser Ser 115
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213 > camundongo
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 7S 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
«213> camundongo
<400> 7
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 10 15
Ser Leu ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Thr Phe 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60
Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110
Val Ile Val Ser Ser 115
<21C> 8
< 211 > 108
<212> PRT
<213 > camundongo <400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lvs Leu Glu Ile Lys Arg 100 " 105
<2ÍQ> 9
<211> 5
<212 > PRT
«213> camundongo
<400» 9
Thr Tyr Ala Net Ser 1 5
«210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213* camundongo
<400> 10
Val Phe Gly Val His 1 5
«210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 11 Ile Phe Gly Val His
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 12
Thr Phe Gly Val His 1 5
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 13
Ser Ile Ser Thr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Arg Gly 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 14
Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asri Ala Ala Phe Met Ser 1 5 10 15
<210> 15 <211> 16 <212> PRT
<213> camundongo
< 4 Q 0 > 15
Val Ile Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
«213> camundongo
<400> 16
Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe GIy Tyr 10 <21C> 17
<211> 9
<212> PRT
«213> camundongo
<4D0> 17
Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr ι 5
<210> 18
< 211 > 17
< 212 > PRT
<213> camundongo
«4Q0> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu 10 15
Ala
<210> 19
<211> 11
c212* PRT
<213> camundongo
<4Ü0> 19
Arg Ser Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr Leu Ala i 5 10
c 210 > 20
<211> 11
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 20
Arg Ala Ser Gly Asn lie His Gly Tyr Leu Ala 1 5 10
< 210 > 21
<211» 7
<212> PRT
<213» camundongo
<400> 21
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210» 22
<211 > 7
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 22
Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu 1 5
<21Q> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 23
Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu 1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213 > camundongo
<400> 24
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr 1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 25
Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg Thr 1 S
<210» 26
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lye Val Aep Lys
85 " 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
13C 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Ly3 Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lya Ser Arg Trp Gln Gln Gly Acn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val «et His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 27 <211> 327 <212> PRT <213> Homo <400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Αερ His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lvs Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Ket Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val ser Gln Glu Asp Pro Olu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 ISD 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lye Gly Leu 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255
lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Sei 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
c21Q> 28
<2 11> 107
«212» PRT
<213> Homo sapiens
<40Q> 28
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 10 IS Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 29
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C34
<400> 29
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Hxs
1 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 25 30
Leu Leu
<210> 30
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> T20
<400> 30 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 25 30
Trp Asn Trp Phe 35
<210» 31
<211> 39
<212» PRT
< 213 > Artificial
<22 0>
<223 » T1249
<400» 31
Trp Gln Glu Trp Olu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 10 15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35
<210» 32
<211> 36
<212» PRT
<213» Artificial
<220>
<223» T651 <400» 32
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 25 30
Gln Glu Leu Leu 35
<210> 33 <211» 38 <212» PRT <213> Artificial
< 22 Q >
<223 > Τ2635 <40Q> 33
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Xle Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35
<210> 34
<211> 36
<212> PRT
< 213 > Artificial
<220>
<22 3 > N36 <400> 34
Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala 10 15
Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln
25 30
Ala Arg Ile Leu 35
<210> 35 <211> 38 <212 > PRT <213 > Artificial <220> <223 > DP107 <400> 35
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu 10 15
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu 25 30 Arg Tyr Leu Lys Asp Gln
35
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ligante 1
<400> 36
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<2I3> Artificial
<220>
<223 > ligante 2
<400> 37
Leu Ser Pro Asn Arg Gly Glu Cys 1 5
<210> 38 «211> 15 <212> PRT <213 > Artificial <220> <223 > ligante 3
<400> 38
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln IS 10 15
<210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ligante 4 <400> 39
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly 10 15 <210> 40
<211> 18
<212> PRT
«í213> Artificial
<220>
<223> Iigante 5 <400> 40
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly 10 15
Asn Asn
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
«213> Artificial
<220>
<223> Iigante 6 <400> 41
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glv Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 10 15
<210> 42
<211> 16
«212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 7 <400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Glv Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 8
<400> 43
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 * 10 15 <210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 9 <400> 44
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glv GIy 10 15
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223 > Iigante 10 <400> 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 10 15
Thr
<2!0> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 11 <400> 46
Ser Gly Gly Gly Gly Ser GIy Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 10 15
Gly
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 12 <40ύ> 47
Ser Gly Gly Gly GIy Ser Gly Gly GIy Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 10 15
Gly Ttir
<210> 48 < 211 > 18 <212> PRT <213 > Artificial <220> <223 > ligante 13 <400> 48
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Giy Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
10 15
Gly Asn
<2L0> 49
<211> IS
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> ligante 14 <400> 49
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
10 15
Ala Ser
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> !ligante 15
<400> 50
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
25
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
< 2 2 3 > Hgante 16 <400> 51
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glv Gly Ser 10 15
Glv Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 25
<210> 52 < 211 > 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> íigante 17 <400> 52
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10* 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 25
<210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Íigante 18 <400> 53
Ser Oly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser 25 <210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Iigante 19
<400> 54
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 10 15
Gly
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213 > Artificial
< 220>
<223> Iigante 20
<400> 55
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 10 IS
Gly Ala Ser
<210> 56 <211> 18 <212 > PRT <213> Artificial <220> <223> Iigante 24 <400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15
Ala Ser
< 210 > 57
<211> 16
«212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Iigante 25
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15
<210> 58 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223 > Iigante 26 <400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glv Gly Gly Ser Gly 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 25
<2Ι0> 59 <211> 17 < 212 > PRT <213> Artificial <220> <223> Iigante 27 <400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15
Gly
<210> 60
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 28
<40Ο> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 25
< 210 > 61
<211> 6
<212» PRT
< 213 > Artificial
<22Q>
<223> ligante 29
<400> 61
Leu Ser Leu Ser Gly Gly 1 5
< 210 > 62
<211> 7
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> ligante 30
<400> 62
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
1 5
< 210 > 63
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cye Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu vai 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 18C 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 64
<211> 44 7
<212> PRT
<213 > Homo sapiens
<400> 64
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe 25 30
Glv Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glv Leu Glu Trp Leu 40 45
Gly Val Tle Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110
Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glv Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys VaI Glu Pro Lvs Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Aen Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320
Cya Lys Val Ser Aan Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro 340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gla Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 37C 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Agp Lys Ser Arg 405 410 415
?rp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430
His Asn Kis Tvr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 * 440 445
<210> 65 <211> 503 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 65 Gln Val Gln Leu Lys
15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe 25 30
Gly Val Kis Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 4S
Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
IOC 105 lio
Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hls Lys Pro Ser Asn 195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys VaI Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255
Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp Val ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350
Pro Ser Axg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 360
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430
His Asri His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445
Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Asn 450 455 460
Asn Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala 465 470 475 480
Arg Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn 485 490 495
Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 500
<210> 66 <21i> 345 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 66
Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 10 15
Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln
25 30
Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 40 45
Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 50 55 60
Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 85 90 95
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 100 105 110
Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 115 120 125
Ser Leu Ile His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 130 135 140
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
145 150 155 160
Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met 165 170 175
Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser 180 185 190
Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr 195 200 205
His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu 210 215 220 Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Oly 225 230 235 240
Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser 245 250 255
Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu 260 265 270
Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu 275 280 285
Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn ser Ala vai Ser Leu Leu
290 295 300
Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu 305 310 315 320
Val Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile 325 330 335
Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu 340 345
<210> 67 <211> 20 «212> PRT <213> Artificial <220> <223> ligange 31 <400> 67
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser X 5 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
<21ü> 68
<2ll> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ligange 32 <4QÜ> 68
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20
<210> 69 < 211 > 15 PRT <213 > Artificial c220> <223> ligange 33 <40G> 69
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<22G>
<223> ligange 34
<400> 70
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Giy Gly 1 5 * 10 15
<21Q> 71
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Cadeia leve de anticorpo anti-CD4 <400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 IS
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys IOC 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Olu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
160 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Aen Arg Gly Glu Cys 210 215
<21Q> 72
<211> 452
<212> PRT
«213> Artificial
<220>
<223> Cadeia pesada de anticorpo anti-CD4
<4 QQ> 72
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Fro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lvs Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lya Gly Lya Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Hir Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240
Gly Gly ?ro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Aep Pro Glu Val Lyo Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
34Q 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Aap Ile Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tvr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly Lys 450
<210> 73
«211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220> <223> afp-l <400> 73
Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Gln Tyr Thr Ser 10 15
Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn 25 30
Glu Gln Glu Leu Leu 35 <21Q> 74 <211 > 503 «212 > PRT <213 > Artificial <22Q> < 223 > Cadeia pesada
antifusogênico afp-l <400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Het Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Aap Trp Ile 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 no
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 13S 140
Ala Ala Leu Oly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 165 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460
Ser Gly Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Gln Tyr 465 470 475 480
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu 485 490 495
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu 500
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala vai Ser Val Gly
10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val SO 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lvs Leu Glu Ile Lys 100 105 lio
<21Q> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia leve quimérica <4Q0> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 lio
<210> 77
<211> 241
<212> PRT
<213 > Artificial
<220> <223>
Cadeia leve quimérica <400> 77
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser 40 45
Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser 65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly 115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240
Cys
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia leve quimérica <400> 78
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Thr Asn Gln Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly VaI 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 79
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia leve quimérica <40O> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glri Asp Ile Asn Asn Tyr 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Cys Leu Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 100 105
<210> 80 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223 > Domínio variável <400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 30 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 HO
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 81
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Ly3 Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Aep Trp Ile 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 82
< 211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia pesada humanizada <400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala IS 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 83
<211> 467
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Cadeia pesada quimérica
«400> 83
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 10 15
Ala HiS Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 40 45
Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 SO
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tvr Asp 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe 115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thi 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205
Val Val Thr Val Prq Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly vai Glu 290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Mefc Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Gly Lys 465
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia pesada quimérica <400> 84
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 5S 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 9D 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 85
«211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
< 2 2 0 >
<223> Domínio variável de cadeia pesada quimérica <4Q0> 85
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Ala Ile ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 GXy Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Domínio variável de cadeia pesada quimérica
«40Q> 86
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lyo Met Ser Cyo Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 JO
Val Ue His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lya Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Oln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 87
<211> 1?
<212» PRT
<213> Mus musculus
<400·» 87
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tvr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 10 15
Ala <21Q> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 88
Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 10 15
Ala
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
< 2 2 0 >
<223> CDR
<400> 89
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 10 15
Ala
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 30
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 91 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
<210> 92
<211> 7
<212 > PRT
<213 > Mus musculus
<4Q0> 92
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210 > 93
<211> 11
<212> PRT
<213> Hus musculus
<40Q> 93
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser 10
<21Q> 94
<211> 8
< 212 > PRT
<213> Mus musculus
< 4 O Q > 94
Gln Gln Tyr 'IYr Ser Tyr Arg Thr 1 5
< 210 > 95
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr 1 5
< 210 > 96
<211> 6
<212> PRT
<213> Mu3 musculus
<400> 96
Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 1 5 <210> 97
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 97
Ser Tyr Val Ile His
1 S
<210> 98
<211» S
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 98
Ser Tyr Val Ile His
1 5
<210> 99
< 211> 10
<212 > PRT
<213> Mus musculus
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 10
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 100
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lye Phe Lys 10 15
Gly
<210> 101
«211> 17
«212> PRT
<213> Mus musculus
<400» 101
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 10 15 Gly
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 102
Ala Xle Ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro 10
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400» 103
Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 10
<210> 104 <211» 13 <212> PRT <213» Mus musculus <400> 104
Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 10
<210> 105
< 211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4Ü0> 105
Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe 10

Claims (25)

1. Conjugado que compreende um ou mais peptídeos antifuso- gênicos e um anticorpo contra um receptor de superfície celular que se liga a gp120 de HIV, caracterizado pelo fato de que dois a quatro peptídeos antifu- sogênicos são conjugados, cada, a uma terminação das cadeias pesadas e/ou leves do dito anticorpo contra um receptor de superfície celular que se liga a gp120 de HIV.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo contra um receptor de superfície celular que se liga a gp120 de HIV é um anticorpo anti-CCR5 (mAB CCR5).
3. Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas das terminações do dito anticorpo anti- CCR5 são conjugadas, cada, com um peptídeo antifusogênico.
4. Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os ditos peptídeos antifusogênicos são peptídeos lineares e compreendem uma seqüência de aminoácidos de 5 a 100 aminoácidos.
5. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pela fórmula geral mAb CCR5 - [ligante]m-[peptídeo antifu- sogênicojn, em que m é, independentemente para cada peptídeo antifusogê- nico, ou 0 ou 1, e η é um número inteiro no máximo entre 1 a 8.
6. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender um conjugado de cadeia pesada e/ou leve de mAB CCR5 e o(s) peptídeo(s) antifusogênico(s) ("conjugado de cadeia"), selecionado(s) do grupo que consiste em: (1) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada] (2) [cadeia pesada]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico] (3) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[peptí- deo antifusogênico] (4) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve] (5) [cadeia leve]-[ligante]m-[peptídeo antifusogênico] (6) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[peptídeo antifusogênico] (7) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia pesada]-[ligan- te]m-[peptídeo antifusogênico] (8) [peptídeo antifusogênico]-[ligante]m-[cadeia leve]-[ligante]m - [peptídeo antifusogênico] em que o Iigante pode ser igual ou diferente, em que m é um nú- mero inteiro de 1 a 0 e m pode ser, independentemente, igual ou diferente.
7. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender um conjugado de cadeia (2), (3), (4), ou (7).
8. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender 2x [cadeia leve de mAB CCR5] e 2 χ (2), 2x [cadeia leve de mAB CCR5] e 2x (3), 2x [cadeia pesada de mAB CCR5] e 2x (4) ou 2x [ca- deia leve de mAB CCR5] e 2x (7).
9. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo antifusogênico é seiecio- nado do grupo de peptídeos definidos por SEQ ID NO: 29 a 35 e SEQ ID NO: 73.
10. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreende um domínio variável de cadeia pesada que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 de cadeia pesada SEQ ID NO: 16, 17.
11. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreende um domínio variável de cadeia pesada que consiste em uma estrutura de imuno- globulina e uma região CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüên- cias de CDR3 de cadeia pesada SEQ ID NO: 16 e 17, uma região CDR2 sele- cionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 13, 14 e 15 e uma região CDR1 selecionada do grupo que consis- te nas seqüências de CDR1 de cadeia pesada SEQ ID NO: 9,10,11 e 12.
12. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreen- de um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo de SEQ ID NO: 1, 3, 5e7.
13. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreen- de um domínio variável de cadeia leve que consiste em uma estrutura de imunoglobulina e uma região CDR1 selecionada de SEQ ID NO: 18, 19 e 20, uma região CDR2 selecionada de SEQ ID NO: 21, 22 e 23 e uma região CDR3 selecionada de SEQ ID NO: 24 e 25.
14. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreen- de como CDRs de cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 1 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 2, como CDRs de cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 3 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 4, como CDRs de cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 5 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 6 ou como CDRs de cadeia pesada as CDRs de SEQ ID NO: 7 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQ ID NO: 8.
15. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreen- de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve independentemente selecionados do grupo que consiste em a) o domínio variável de cadeia pesada (Vh) definido pela se- qüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e o domínio variável de cadeia leve (Vl) definido pela SEQ ID NO: 2; b) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 4; c) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 6; d) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 8.
16. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 15, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 compreen- de o domínio variável de cadeia pesada (Vh) definido pela seqüência de a- minoácidos SEQ ID NO: 1 e o domínio variável de cadeia leve (Vl) definido pela SEQ ID NO: 2, o domínio variável de cadeia pesada definido pela se- qüência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 4, o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de ca- deia leve definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou o domí- nio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de a- minoácido SEQ ID NO: 8; um Iigante selecionado do grupo que consiste nos aminoácidos glicina (G) e asparagina (Ν), o tripeptídeo GST e SEQ ID NO: 36 a 62 e SEQ ID NO: 67 a 70; e um peptídeo antifusogênico selecionado do grupo de peptídeos definidos por SEQ ID NO: 29 a 35 e SEQ ID NO: 73.
17. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 15, caracterizado por compreender um peptídeo antifusogênico selecio- nado do grupo de SEQ ID NO: 29 a 35 e SEQ ID NO: 73.
18. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações -2 a 17, caracterizado por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 2, dois conjugados de tipo (2) cada um compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33, por compreen- der dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 4, dois conjuga- dos de tipo (2) cada um compreendendo um domínio variável de cadeia pe- sada de SEQ ID NO: 3, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifu- sogênico de SEQ ID NO: 33, por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 6, dois conjugados de tipo (2) cada um compre- endendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, um Iigan- te de SEQ ID NO: 40 e um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 33 ou por compreender dois domínios variáveis de cadeia leve de SEQ ID NO: 8, dois conjugados de tipo (2) cada um compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, um Iigante de SEQ ID NO: 40 e um peptí- deo antifusogênico de SEQ ID NO: 33.
19. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 é da sub- classe lgG4, ou da subclasse IgGI ou lgG2, com uma mutação no aminoá- cido S228, L234, L235, e/ou D265 e/ou contem a mutação PVA236.
20. Conjugado de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que o dito anticorpo anti-CCR5 da subclasse lgG4 tem a mu- tação S228P e o dito anticorpo anti-CCR5 da subclasse IgGI tem as muta- ções L234A e L235A.
21. Método para produção de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o método compreende a) cultivar uma célula contendo um ou mais plasmídeos conten- do uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um conjugado de acordo com as reivindicações 1 a 20 sob condições adequadas para a expressão do conjugado, b) recuperar o conjugado da célula ou do sobrenadante de cultu- ra celular.
22. Composição farmacêutica, contendo um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, junto com um excipien- te ou veículo farmaceuticamente aceitável.
23. Uso de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a produção de um medicamento para tratamento de infecções virais.
24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é uma infecção por HIV.
25. Uso de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para tratamento de um paciente com necessidade de um tratamento antiviral.
BRPI0715794-0A 2006-08-17 2007-08-14 conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico BRPI0715794A2 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06017156 2006-08-17
EP06017156.8 2006-08-17
EP06020647.1 2006-09-29
EP06020647 2006-09-29
EP07014335 2007-07-20
EP07014335.9 2007-07-20
PCT/EP2007/007164 WO2008019817A1 (en) 2006-08-17 2007-08-14 A conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0715794A2 true BRPI0715794A2 (pt) 2013-07-23

Family

ID=38877282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0715794-0A BRPI0715794A2 (pt) 2006-08-17 2007-08-14 conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2054086A1 (pt)
JP (1) JP2010500984A (pt)
KR (1) KR101105610B1 (pt)
AU (1) AU2007286451A1 (pt)
BR (1) BRPI0715794A2 (pt)
CA (1) CA2658474A1 (pt)
IL (1) IL195667A0 (pt)
MX (1) MX2009001204A (pt)
WO (1) WO2008019817A1 (pt)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2599791A1 (en) * 2007-04-27 2013-06-05 Genentech, Inc. Potent, stable and non-immunosuppressive anti-CD4 antibodies
CL2008002092A1 (es) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
EP2291392B1 (en) * 2008-05-28 2014-03-05 New York Blood Center Bifunctional molecules for inhibiting hiv entry
WO2010028796A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
WO2010045613A1 (en) 2008-10-16 2010-04-22 New York Blood Center Immunoenhancer-linked oligomeric hiv vaccines
CN102307588A (zh) 2009-02-09 2012-01-04 纽约血库公司 用于治疗或预防hiv感染的三聚体hiv融合抑制剂
US8828932B2 (en) 2010-05-03 2014-09-09 New York Blood Center, Inc. Bifunctional molecules for inactivating HIV and blocking HIV entry
US10071170B2 (en) 2013-06-24 2018-09-11 Ablbio Antibody-drug conjugate having improved stability and use thereof
ES2924402T3 (es) * 2015-10-02 2022-10-06 Symphogen As Anticuerpos anti-PD-1 y composiciones
US12030942B2 (en) 2015-10-02 2024-07-09 Les Laboratoires Servier Anti-PD-1 antibodies and compositions
DK3541841T3 (da) 2016-11-18 2024-10-21 Servier Lab Anti-PD-1-antistoffer og sammensætninger
UA129904C2 (uk) 2017-04-05 2025-09-10 Ле Лаборатуар Сервьє Комбінація антитіла до tim-3 й антитіла до pd-1 для лікування раку
EP3621649A2 (en) * 2017-05-10 2020-03-18 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity
EP3894543A1 (en) * 2018-12-14 2021-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Isolated mhc-derived human peptides and uses thereof for stimulating and activating the suppressive function of cd8cd45rc low tregs

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
FR2654429B1 (fr) 1989-11-13 1992-03-06 Panmedica Sa Nouveaux derives du methyl-2-propionate de 3,3,5-trimethylcyclohexanol, leur procede de preparation ainsi que compositions therapeutiques les contenant.
AU662891B2 (en) * 1990-11-27 1995-09-21 Biogen Idec Ma Inc. Anti CD-4 antibodies blocking HIV-induced syncytia
KR100358209B1 (ko) 1992-07-20 2003-01-24 듀크 유니버시티 Hiv복제를저해하는조성물
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US6743594B1 (en) 1995-06-06 2004-06-01 Human Genome Sciences, Inc. Methods of screening using human G-protein chemokine receptor HDGNR10 (CCR5)
AU723537B2 (en) 1995-06-07 2000-08-31 Trimeris Inc. The treatment of HIV and other viral infections using combinatorial therapy
WO1997045543A2 (en) 1996-05-28 1997-12-04 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Cc chemokine receptor 5, antibodies thereto, transgenic animals
US6528625B1 (en) 1996-10-28 2003-03-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibodies and kits comprising same
AU5874798A (en) 1997-01-31 1998-08-25 Biovation Limited Vaccination methods and molecules
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6656906B1 (en) 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6258782B1 (en) 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
DE69910216T2 (de) 1998-07-22 2004-02-19 Osprey Pharmaceuticals Ltd., Calgary Konjugate zur behandlung von entzündungskrankheiten und von assozierter gewebeschädigung
US20030215421A1 (en) 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US6610834B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 Peter I. Lobo Human IgM antibodies to chemokine receptors
US20030099645A1 (en) 2000-10-10 2003-05-29 Lobo Peter Isaac Naturally occuring IgM antibodies that bind to membrane receptors on lymphocytes
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
CA2355607A1 (en) 1998-12-16 2000-06-22 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Anti-ccr5 antibody
ES2233359T3 (es) 1999-03-11 2005-06-16 Micromet Ag Construcciones de anticuerpos dirigidos contra el ccr5 y su empleo en el tratamiento de enfermedades autoinmunologicas.
EP1179012B2 (en) 1999-05-17 2009-07-15 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting fusion peptide inhibitors of viral infection
AU2841101A (en) 1999-12-08 2001-06-18 Novartis Ag Methods and compositions useful for inhibiting ccr5-dependent infection of cellsby hiv-1
AU2265701A (en) * 1999-12-16 2001-06-25 Tanox, Inc. Anti-hiv-1 conjugates for treatment of hiv disease
EP1263791A4 (en) 2000-02-09 2004-07-07 Human Genome Sciences Inc HUMAN G-PROTEIN CHEMOKIN RECEPTOR HDGNR10 (CCR5 RECEPTOR)
US20040043033A1 (en) 2000-05-01 2004-03-04 Green Lorrence H. Method and vaccine for the prevention of AIDS
US7138119B2 (en) 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US7005503B2 (en) 2002-02-08 2006-02-28 Genetastix Corporation Human monoclonal antibody against coreceptors for human immunodeficiency virus
US20030165988A1 (en) 2002-02-08 2003-09-04 Shaobing Hua High throughput generation of human monoclonal antibody against peptide fragments derived from membrane proteins
EP1207202A1 (en) 2000-11-16 2002-05-22 Mölling, Karin, Inst. für med. Virologie der Uni. Zürich Nucleic acid molecules encoding a protein interacting with the chemokine receptor CCR5 or other chemokine receptor family members
US20020147147A1 (en) 2000-11-16 2002-10-10 Karin Molling Nucleic acid molecules encoding a protein interacting with the chemokine receptor CCR5 or other chemokine receptor family members
US7175988B2 (en) 2001-02-09 2007-02-13 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10
US20030003440A1 (en) 2001-03-14 2003-01-02 Lucia Lopalco Novel CCR5 epitope and antibodies against it
US7060273B2 (en) 2001-04-06 2006-06-13 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibiting HIV-1 infection
US20020146415A1 (en) 2001-04-06 2002-10-10 Olson William C. Methods for inhibiting HIV-1 infection
DE60237704D1 (de) 2001-10-16 2010-10-28 Government Of The Us Secretary Neutralisierende antikörper gegen hiv mit breiter kreuzreaktion, die mit hilfe von env-cd4-co-rezeptorkomplexen selektiert werden
WO2003066830A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against membrane proteins
NZ534947A (en) 2002-02-22 2008-03-28 Progenics Pharm Inc Anti-CCR5 antibody that binds to CCR5 on the surface of a human cell.
US7122185B2 (en) 2002-02-22 2006-10-17 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibody
AU2003299085B2 (en) * 2002-09-27 2008-04-10 Tanox, Inc. Synergistic compositions for the prevention and treatment of acquired immunodeficiency syndrome
WO2004108885A2 (en) * 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004103312A2 (en) * 2003-05-19 2004-12-02 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Peptides useful as hiv fusion inhibitors
AU2004313242A1 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Trimeris, Inc. HIV gp41 HR2-derived synthetic peptides, and their use in therapy to inhibit transmission of human immunodeficiency virus
US7551647B2 (en) * 2004-07-19 2009-06-23 Qvidium Technologies, Inc. System and method for clock synchronization over packet-switched networks

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090037944A (ko) 2009-04-16
WO2008019817A1 (en) 2008-02-21
JP2010500984A (ja) 2010-01-14
EP2054086A1 (en) 2009-05-06
CA2658474A1 (en) 2008-02-21
AU2007286451A1 (en) 2008-02-21
KR101105610B1 (ko) 2012-01-18
MX2009001204A (es) 2009-02-11
IL195667A0 (en) 2009-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0715794A2 (pt) conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico
AU2008280443B2 (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
JP4733736B2 (ja) Ｃｃｒ５に対する抗体およびそれらの使用
JP2010500984A5 (pt)
JP4960459B2 (ja) Ｃｃｒ５に対する抗体およびその使用
US20110165182A1 (en) Conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide
AU2013251184A1 (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
CN101500615A (zh) 针对ccr5的抗体和抗融合肽的缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
B08L Patent application lapsed because of non payment of annual fee [chapter 8.12 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AO NAO RECOLHIMENTO DAS 6A E 7A ANUIDADES.

B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: C07K 16/28 (2006.01), A61K 47/68 (2017.01)

B08I Publication cancelled [chapter 8.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 8.12 NA RPI NO 2277 DE 26/08/2014 POR TER SIDO INDEVIDA.

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AS 6A, 7A, 8A, 9A, 10A, 11A, 12A E 13A ANUIDADES.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2602 DE 17-11-2020 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.