BRPI0715943A2 - mÉtodo para a produÇço de conjugados de fator de crescimento semelhante À insulina-1 e poli(etileno glicol) - Google Patents

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Abstract

Patente de Invenção:"MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE CONJUGADOS DE FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA-1 E POLI(ETILENO GLICOL)". Método para a produção de um IGF-I PEGuilado com lisina ou variante de IGF-I PEGuilado com lisina, a referida variante compreendendo um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em lisina 27, 65 e/ou 68 independentemente substituídos por um outro aminoácido polar, caracterizado pelo fato de cultivar uma célula hospedeira procariótica que compreende um vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão compreendendo o referido IGF-I ou variante de IGF-I ligada pelo teminal N ao terminal C de um propeptídio, pelo fato de o referido propeptídio ter seu terminal C terminado com aminoácidos -Y-Pro, onde Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro, recuperar e PEGuilar a referida proteína de fusão, clivar a referida proteína de fusão PEGuilada com protease de IgA, e recuperar o referido IGF-I PEGuilado ou variante de IGF-I PEGuilado. O IGF-I PEGuilado ou variante de IGF-I é útil para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos como o mal de Alzheimer

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE CONJUGADOS DE FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA-1 E POLI(ETILENO GLICOL)".
Esta invenção refere-se a métodos para a produção de conjuga- dos de fator de crescimento semelhante à insulina-l (IGF-I) com poli(etileno glicol) (PEG)1 a composições farmacêuticas que contêm tais conjugados, e a métodos de uso de tais conjugados. Antecedentes da Invenção
O mal de Alzheimer (AD) é uma forma cada vez mais predomi- nante de neurodegeneração que é responsável por aproximadamente 50% - 60% de todos os casos de demência entre pessoas com mais de 65 anos de idade. Atualmente, ele afeta um número estimado de 15 milhões de pesso- as em todo o mundo e devido ao aumento relativo de pessoas idosas na po- pulação é provável que sua predominância aumente ainda mais nas próxi- mas 2 a 3 décadas. O AD é um distúrbio progressivo com uma duração mé- dia de cerca de 8,5 anos entre o aparecimento dos sintomas clínicos e a morte. A morte de neurônios piramidais e a perda de sinapses neuronais em regiões do cérebro associadas a funções mentais maiores resulta nos sinto- mas típicos, caracterizados por deterioração flagrante e progressiva da fun- ção cognitiva (Francis, P.T., et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147). AD é a forma mais comum tanto de demência senil quanto de demência pré-senil no mundo e é clinicamente reconhecido como de- mência implacavelmente progressiva que se apresenta com crescente perda de memória, função intelectual e distúrbios da fala (Merritt, A Textbook of Neurology, 6th ed., Lea& Febiger1 Philadelphia (1979), página 484-489). Neuropatologicamente, os principais marcos de AD são a presença de duas lesões características: a placa amiloide senil e o emaranhado neurofibrilar (NFT). Apesar de a placa ser depositada extraneuronalmente, o emaranha- do é observado intraneuronalmente no cérebro pós-morte. Um dos princi- pais componentes do núcleo da placa amiloide é o peptídio amiloide-beta (Αβ) pequeno depositado patologicamente, que é clivado por secretases da proteína precursora de amiloide (APP) (Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy1 J. & Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356; Bush1 A.l. & Tanzi, R.E., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99 (2002) 7317-7319). Αβ, um peptí- dio autoagregador de 39-43 resíduos (MW ~4 kDa), é sintetizado como parte da APP maior (110-120 kDa). APP é uma glicoproteína de membrana inte- gral tipo I com um domínio extracelular N-terminal grande, um único domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática curta. A região de Αβ atravessa porções dos domínios extracelular e transmembrana da APP. A hipótese mais comum para a participação da APP na morte de células neuronais em AD é a hipótese de amiloide. Esta hipótese postula que deposições de ami- Ioides em placas ou Αβ solúveis parcialmente agregados desencadeiam uma cascata neurotóxica, dessa forma provocando neurodegeneração semelhan- te à patologia de AD (Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J. & Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356).
O fator de crescimento semelhante à insulina I humano (IGF-I) é um hormônio circulante estruturalmente relacionado à insulina. O IGF-I foi tradicionalmente considerado o principal mediador das ações do hormônio de crescimento em tecidos periféricos. O IGF-I consiste em 70 aminoácidos e também é chamado de somatomedina C e definido por SwissProt N0 P01343. O uso, a atividade e a produção estão mencionados, por exemplo, em Ie Bouc. Y.. et ai.. FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, Pli et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberq Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenberqh, P.H., et al., Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Ac- ta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K., et al., J. Clin. Endo- crinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5,861,373; US 5,714,460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695.
A regulação da função do IGF-I é bastante complexa. Na circu- lação, só existe 0,2 % de IGF-I na forma livre ao passo que a maioria está ligada a proteínas fixadoras de IGF (IGFBP's), que têm afinidades muito al- tas para os IGFs e modulam a função do IGF-I. O fator pode ser localmente liberado por mecanismos que liberam IGF-I tais como proteólise de IGFBPs por proteases. O IGF-I desempenha um papel parácrino no desenvolvimento e no cérebro maduro (Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778). Estudos in vitro indicam que o IGF-I é um potente agente trófico não-seletivo para diversos tipos de neurônios no SNC (Knusel, B., et al., J. Neurosci.
10(1990) 558-570; Svrzic, D., & Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Com- mun. 172 (1990) 54-60), incluindo neurônios dopaminérgicos (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570) e oligodendrócitos (McMorris, F.A., & Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., & McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)). A patente US 5.093.317 men- ciona que a sobrevivência de células neuronais colinérgicas é aumentada pela administração de IGF-L Sabe-se ainda que o IGF-I estimula a regene- ração dos nervos periféricos (Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396- 398) e intensifica a atividade da ornitina descarboxilase US 5.093.317). A patente US 5.861.373 e WO 93/02695 apresentam um método para tratar lesões ou doenças do sistema nervoso central que afeta predominantemente a glia e/ou as células neuronais não-colinérgicas aumentando as concentra- ções ativas de IGF-I e/ou de análogos do mesmo no sistema nervoso central do paciente. O documento WO 02/32449 refere-se a métodos para reduzir ou prevenir danos isquêmicos no sistema nervoso central de um mamífero pela administração à cavidade nasal do mamífero de uma composição far- macêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de IGF-I ou de uma variante biologicamente ativa do mesmo. O IGF-I ou sua variante é absorvido através da cavidade nasal e transportado para o siste- ma nervoso central do mamífero em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir danos isquêmicos associados a um evento isquêmico. A patente EP 0 874 641 reivindica o uso de um IGF-I ou de um IGF-II para a produção de um medicamento para tratar ou prevenir danos neuronais no sistema ner- voso central, devido à demência associada à AIDS, AD, mal de Parkinson1 doença de Pick1 doença de Huntington1 encefalopatia hepática, síndromes gangliônicas corticais-basais, demência progressiva, demência familiar com paraparesia espástica, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múlti- pia, esclerose cerebral de Schilder ou encefalomielite hemorrágica necroti- zante aguda, onde o medicamento está em uma forma para administração parenteral de uma quantidade eficaz do referido IGF fora da barreira hema- toencefálica ou fora da barreira hematoliquórica.
A redução dos níveis cerebrais e séricos de IGF-I livre foi asso-
ciada à patogênese das formas esporádica e familiar de AD. Além disso, o IGF-I protege os neurônios contra a neurotoxicidade induzida por Αβ (Niiku- ra, T., et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore1 S., et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., et al„ Ann. NY Acad. Sei. 890 (1999) 356-364). Recentemente, foi mostrado que o IGF-I administrado perifericamente é capaz de reduzir os níveis cerebrais de Αβ em ratos e ca- mundongos (Carro, E., et al„ Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397). Além disso, o estudo demonstrou que em um modelo de camundongo transgênico com AD tratamento prolongado com IGF-I reduziu significativamente a carga de pla- cas amiloides no cérebro. Estes dados dão forte suporte à idéia de que o IGF-I é capaz de reduzir os níveis cerebrais de Αβ e a demência cerebral associada às placas depurando o Αβ do cérebro.
A modificação covalente de proteínas com poli(etileno glicol) (PEG) mostrou ser um método útil para esntender as meias-vidas criculantes de proteínas no corpo (Hershfield, M.S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers, F.J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313; Del- gado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (1992) 249-304; Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10 (1993) 91-114; EP-A 0 400 472; Mon- fardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Satake-lshikawa, R., et al., Cell Struct. Funct. 17 (1992) 157-160; Katre, N.V., et al., Proc. Natl. A- cad. Sei. USA 84 (1987) 1487-1491; Tsutsumi, Y., et al., Jpn. J. Câncer Res. 85 (1994) 9-12; Inoue, H., et al., J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536; Chamow, S.M., et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 133-140).
Outras vantagens da PEGuilação são um aumento de solubili- dade e uma diminuição na imunogenicidade de proteínas (Katre, N.V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213). Um método comum para a PEGuilação de proteínas é o uso de poli(etileno glicol) ativado como reagentes amino- reativos como a N-hidroxissuccinimida (NHS). Com tais reagentes o po- li(etileno glicol) é ligado às proteínas nos grupos amino primários livres tais como o grupo α-amino N-terminal e os grupos ε-amino de resíduos lisina. No entanto, uma importante limitação deste método é que as proteínas tipi- camente contêm uma quantidade considerável de resíduos lisina e portanto os grupos poli(etileno glicol) são ligados à proteína de maneira inespecífica em todos os grupos ε-amino livres, resultando em uma mistura de produtos heterólogos de proteínas PEGuiIados aleatórias. Por conseguinte, muitas proteínas NHS-PEGuiIadas são inadequadas para uso comercial por causa da baixa atividade específica. A inativação resulta da modificação covalente de um ou mais resíduos lisina ou do resíduo amino N-terminal necessário para atividade biológica ou da ligação covalente dos resíduos poli(etileno glicol) perto do sítio ativo da proteína ou neste sítio. Por exemplo, foi verifi- cado que a modificação do hormônio de crescimento humano usando rea- gentes de NHS-PEGuilação reduz a atividade biológica da proteína em mais de 10 vezes (Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977). O hormônio de crescimento humano contém 9 Iisinas no aminoácido N- terminal. Algumas destas Iisinas ficam localizadas em regiões da proteína conhecidas por serem críticas para a ligação do receptor (Cunningham, B.C., et al., Science 254 (1991) 821-825). Além disso, a modificação da eritropoie- tina pelo uso de reagentes de poli(etileno glicol) amino-reativos também re- sulta em uma perda praticamente completa de atividade biológica (Woj- chowski, D.M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232). A modifi- cação covalente de lnterferon-a2 com reagentes de PEGuilação amino- reativos resulta em 40 - 75% de perda de bioatividade (Patente US N0 5.382.657). Uma modificação semelhante do G-CSF resulta em mais de 60% de perda de atividade (Tanaka, H., et al., Câncer Res. 51 (1991) 3710- 3714) e da interleucina-2 em mais de 90% de perda de bioatividade (Good- son, R. J., and Katre, Ν. V., BioTechnoIogy 8 (1990) 343-346). Os documentos WO 94/12219 e WO 95/32003 reivindicam con-
jugados de polietileno glicol que compreendem PEG e IGF ou um IGF alte- rado com cisteína, o referido PEG ligado à referida muteína em uma cisteína livre na região N-terminal da muteína. O documento WO 2004/60300 des- creve IGF-I PEGuiIado no terminal N.
O sítio de reconhecimento da protease de IgA é descrito como Yaa-Pro.!.Xaa-Pro. Yaa significa Pro (ou raramente Pro em combinação com Ala, Gly ou Thr: Pro-Ala, Pro-Gly, ou Pro-Thr. Xaa significa Thr, Ser ou Ala (Pohlner, J., et al., Bio/Technology 10 (1992) 799-804; Pohlner, J., et al., Na- ture 325 (1987) 458-462; e US 5.427.927). Sítios de clivagem natural foram identificados por Wood, S.G. e Burton J., Infect. Immun. 59 (1991) 1818- 1822. Substratos peptídicos sintéticos para a protease da imunoglobulina A1 de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) são os sítios autoproteolíticos Lys-Pro-Ala- Pro.!.Ser-Pro, Val-Ala-Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ala-Pro, Pro-Arg- Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Thr-Pro and the IgAI Cleavage Sites Pro-Pro-Thr-Pro.!.Ser-Pro and Ser-Thr-Pro-Pro.!.Thr-Pro.
O documento WO 2006/066891 descreve conjugados que con- sistem em uma variante do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-I) e um ou dois grupos poli(etileno glicol), caracterizados pelo fato de a referida variante de IGF-I ter uma alteração de além disso em até três posi- ções de aminoácido 27, 37, 65, 68 da seqüência de aminoácidos do ifg-l do tipo selvagem de modo que um ou dois dos referidos aminoácidos sejam Iisina e o aminoácido 27 seja um aminoácido polar, porém não lisina, serem conjugados via os grupos amino primários das referidas Iisinas e os referidos grupos poli(etileno glicol) terem um peso molecular total de 20 a 100 kDa. Tais conjugados são úteis para o tratamento de distúrbios neurodegenerati- vos como mal de Alzheimer. O documento WO 2006/074390 refere-se a polipeptídios de fusão com IGF-I. Sumário da Invenção
A invenção compreende um método para a produção de um IGF-I PEGuiIado com lisina ou uma variante de IGF-I PEGuiIado com lisina, a referida variante compreendendo um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em lisina 27, 65 e/ou 68 independentemente substituídos por um outro aminoácido polar, caracterizado pelo fato de a) cultivar uma célula hospedeira procariótica que compreende um vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão compreende o referido IGF-I ou variante de IGF-I ligada pelo terminal N ao terminal C de um propeptídio,
b) por meio do que o referido propeptídio em seu terminal C termina com aminoácidos -Y-Pro1 onde Y é selecionado do grupo que consiste em
Pro1 Pro-Ala, Pro-Gly1 Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro1 Thr-Pro1 Arg-Pro1 or Pro-Arg-Pro1
c) recuperar e PEGuiIar a referida proteína de fusão,
d) clivar a referida proteína de fusão PEGuiIada com protease de IgA1 e e) recuperar o referido IGF-I ou variante de IGF-1 PEGuiIado .
Em uma modalidade, o referido método caracteriza-se pelo fato de a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RRK e a referida variante ser monoPEGuilada no resíduo Iisina 68 ou a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RKR e a referida variante ser monoPEGuilada no resíduo Iisi- na 65.
Em uma outra modalidade, o referido método caracteriza-se pelo fato de a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RKK e a referida varian- te ser mono- ou diPEGuilada nos resíduos Iisina 65 e 68.
Em uma outra modalidade, o referido método caracteriza-se pelo fato de a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser uma mistura de RRK, RKR ou RKK e a referida variante ser mono- ou diPEGuilada nos resíduos Iisina 65 e 68.
Uma outra modalidade da invenção é uma proteína de fusão que compreende o referido IGF-I ou variante de IGF-I ligada pelo terminal N ao terminal C de um propeptídio, caracterizada pelo fato de o referido pro- peptídio ter seu terminal C terminado com aminoácidos -Y-Pro, onde Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala- Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, or Pro-Arg-Pro. Devido à seqüência de -Y- Pro o propeptídio pode ser separado do referido IGF-I ou da referida variante de IGF-I por tratamento com protease de IgA.
De preferência a proteína de fusão de acordo com a invenção caracteriza-se pela fórmula Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-l ou variante de IGF- I], onde
• IGF-I significa IGF-I humano e variante de IGF-I significa IGF-I1 onde um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Iisina 27, 65 e/ou 68 são independentemente substituídos por um outro ami- noácido polar,
• Met significa metionina,
• Xi é uma ligação, serina ou asparagina,
• His é histidina,
• η é um número de 0 a 10, de preferência de 0 a 6,
• X2 é um peptídio ligador, selecionado do grupo de peptídios SEQ ID N°: 6-10,
• Pro é prolina, e
• Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro- Thr, Ala-Pro, Gly-Pro1 Thr-Pro, Arg-Pro, or Pro-Arg-Pro.
De preferência a proteína de fusão de acordo com a invenção é selecionada do grupo que consiste nas proteínas de fusão SEQ ID N0: 2-5 e SEQ ID N°: 22-25.
De preferência o propeptídio é mostrado pela fórmula Met-Xi- Hisn-X2-Y-Pro-, onde
• Met significa metionina
• Xi é uma ligação, serina ou asparagina
• His é histidina,
• η é um número de 0 a 10, de preferência de 0 a 6,
• X2 é um peptídio ligante, selecionado do grupo que consiste nos peptí- dios SEQ ID N0: 6-10,
• Pro é prolina, e
• Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro- Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, or Pro-Arg-Pro.
O propeptídio é ligado pelo terminal C ao terminal N (glicina) do IGF-I ou da variante de IGF-I. De preferência o propeptídio não inclui um resíduo lisina. O propeptídio tem de preferência um comprimento de até 30 aminoácidos. De preferência X1 é uma ligação. De preferência η é 0 ou 6. De preferência X2 é peptídio SEQ ID N°: 7. De preferência Y é Pro-Arg-Pro.
Uma outra modalidade da invenção é um IGF-I PEGuiIado com lisina, caracterizado pelo fato de compreender uma metionina N-terminal.
Uma outra modalidade da invenção é uma variante de IGF-I PEGuiIado com lisina, onde um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em lisina 27, 65 e/ou 68 são independentemente substituídos por um outro aminoácido polar, caracterizada pelo fato de a referida variante não compreender uma metionina N-terminal.
De preferência os referidos aminoácidos polares são indepen- dentemente arginina, glutamina ou asparagina, especialmente arginina.
Variantes de IGF-I e variantes na proteína de fusão preferidas são: RKK, RKR1 RRK. (variantes de IGF-I são designadas da seguinte ma- neira: K65 significa que o aminoácido 65 é lisina, R27 significa que o amino- ácido 27 é arginina etc. Uma variante de IGF-I contendo os aminoácidos R27, K65, K68 é designada RKK, e os aminoácidos restantes da referida variante RRK são os mesmos que no IGF-I do tipo selvagem de SEQ ID N°: 1. Portanto, RKK é uma variante de IGF-I do tipo selvagem, que foi alterado na posição 27 pela troca de K por R. RKR é uma variante de IGF-I do tipo selvagem, que foi alterado nas posições 26 e 68 pela troca de K por R. RRK é uma variante de IGF-I do tipo selvagem, que foi alterado nas posições 27 e 65 pela troca de K por R. O IGF-I do tipo selvagem, onde nenhum aminoá- cido é alterado, é designado KKK.
O IGF-I PEGuiIado com lisina é de preferência aleatoriamente PEGuiIado nos resíduos lisina 27, 65 e 68, de preferência mono- ou diPE- Guilado (um ou dois PEG por molécula de IGF-I). A variante de IGF-I PE- Guilado com lisina é de preferência mono- ou diPEGuilada nos resíduos lisi- na 65 e 68, de preferência monoPEGuilada em K65 ou K68. Os grupos po- li(etileno glicol) são conjugados ao referido IGF-I ou variante de IGF-I via grupos amino primários de lisinas. O método de acordo com a invenção compreende a preparação
de um IGF-I PEGuiIado com lisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com lisi- na, os referidos grupos poli(etileno glicol) tendo de preferência um peso mo- 10
Iecular total de pelo menos 20 kDa por IGF-I ou variante de IGF-I, mais pre- ferivelmente de cerca de 20 a 100 kDa, e especialmente de preferência de a 80 kDa, por reação da proteína de fusão de IGF-I de acordo com a in- venção com (polietileno) glicol ativado em condições tais que o referido (po- lietileno) glicol é quimicamente ligado ao referido intermediário de IGF-I via grupos amino primários da Iisina do IGF-I ou da variante de IGF-I. De prefe- rência o IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina é monoPEGuilado. A variante é de preferência selecionada do grupo que consiste em RKK, RKR1 RRK em relação às posições de aminoácido 27, 65 e 68, respectivamente. O PEG de preferência tem um peso molecular total de 30 a 45 kDa, especialmente 30 kDa ou 40 kDa.
A invenção compreende ainda composições farmacêuticas con- tendo um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina de acordo com a invenção, de preferência junto com um veículo far- maceuticamente aceitável.
A invenção compreende ainda métodos para a produção de composições farmacêuticas contendo um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou va- riante de IGF-I PEGuiIado com Iisina de acordo com a invenção.
A invenção compreende ainda o uso de um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina de acordo com a in- venção para a preparação de um medicamento para o tratamento de AD.
A invenção compreende ainda métodos para o tratamento de AD, caracterizado pelo fato de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de IGF-I PEGuiIado amino-reativo ou variante de IGF-I ser administrada a um paciente com necessidade de tal tratamento, de preferência em uma a duas aplicações por semana. Descrição Detalhada da Invenção
Foi surpreendentemente descoberto que a protease de IgA, de preferência protease de IgA de Neisseria gonorrhoea, é capaz de clivar a seqüência de aminoácidos Y-Pro.!.GIy-Pro. Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg- Pro1 ou Pro-Arg-Pro. De preferência útil como sítio de clivagem é Pro-
30 Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID Ν°: 15) ou Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N°: 11) (.!. : posição de clivagem). O sítio de clivagem da protease de IgA para o processo de acordo com a presente invenção tem a seqüência de consenso de aminoácidos Y-Pro.!.Gly-Pro, onde Gly-Pro são os dois primeiros amino- ácidos do IGF-I. Y de preferência representa uma seqüência de aminoácidos que termina com os aminoácidos Pro, Pro-Ala, Arg-Pro ou Pro-Arg-Pro. Tal seqüência de aminoácidos Y, especialmente Pro-Arg-Pro pode ser prolon- gada por um outro grupo Ala ou Pro-Ala, como por exemplo em Ala-Pro-Arg- Pro (SEQ ID N°: 12) ou Pro-Ala-Pro-Arg-Pro (SEQ ID N°: 13). Particularmen- te preferidas são as seqüências de aminoácidos de clivagem Pro-Ala- Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N°: 14), Pro-Pro-!.GIy-Pro (SEQ ID N°: 15), Pro-Arg- Pro-Pro.!. Gly-Pro (SEQ ID N°: 16), Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N°: 17) ou Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro (SEQ ID N0: 18).
De acordo com a presente invenção o termo "protease de IgA" inclui proteases que clivam especificamente IgA e que estão descritas por exemplo, por Kornfeld, S.J. & Plaut, A.G. em Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521- 534 como por exemplo a protease de IgAI de Neisseria gonorrhoea (tipo 2). Proteases de IgA recombinantes tais como aquelas descritas na DE-A 36 22 221; Koomey, J.M., et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 7881- 7885; Bricker, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 2681- 2685; Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458- 462; e Halter, R., et al., EMBO J. 3 (1984) 1595-1601 também são adequadas. De preferência a referida protease de IgA é protease de IgA de Neisseria gonorrhoea, de preferência tipo 2.
O gene que codifica a proteína de fusão é de preferência colo- cado sob o controle de sinais de expressão (de preferência induzíveis) ade- quados para que proteínas de fusão possam ser produzidas segundo as exi- gências. Células procarióticas ou eucarióticas (vegetais bem como animais) adequadas podem ser usadas como células hospedeiras para a produção fusões de proteínas; sistemas livres de células, entretanto, também são pos- síveis.
Uma modalidade preferida do processo de acordo com a inven- ção é caracterizada pelo fato de uma célula hospedeira ser transformada 10
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com um DNA recombinante ou um vetor recombinante, em que o DNA ou o vetor contém pelo menos uma cópia de um gene que codifica uma proteína de fusão de acordo com a invenção e que a célula transformada é cultivada em um meio adequado, o gene que codifica a proteína de fusão é levado a se expressar na célula transformada, a proteína de fusão é PEGuiIada e subseqüentemente clivada com protease de IgA e o IGF-I PEGuiIado ou va- riante de IGF-I PEGuiIado é isolado.
A expressão da proteína de fusão de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser aumentada no nível do DNA por fusão com fragmen- tos do gene de beta-galactosidase livre de lisina, isto é, Y contém uma parte de uma proteína de beta-galactosidase livre de lisina. Outras alternativas para aumentar a expressão da proteína de fusão são conhecidas pelo espe- cialista. A purificação e separação do produto de expressão podem ser faci- litadas por fusão com outros polipeptídios, em particular, com polipeptídios ou proteínas que sejam altamente carregadas (por exemplo, poli(Lys, Arg)) ou que possam se ligar a substâncias particulares com alta afinidade (por exemplo estreptavidina) (vide por exemplo as patentes EP-A 0 089 626, EP- A 0 306 610). Peptídios Iigadores especialmente preferidos são os peptídios SEQ ID N°: 6-10, de preferência com o terminal N precedido por SHHHHHH (SEQ ID N°: 19), NHHHHHH (SEQ ID N°: 20) ou HHHHHH (SEQ ID N°: 21).
A presente invenção também fornece um ácido nucleico (recom- binante) que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente in- venção e no qual um sítio de clivagem da protease de IgA é incorporado na região de junção entre o propeptídio e o IGF-I ou variante de IGF-I.
Um DNA recombinante de acordo com a presente invenção po- de ser obtido de maneira conhecida especialista na área de biologia molecu- lar. Para tanto um vetor que contém uma seqüência de DNA que codifica a seqüência de aminoácidos do IGF-I ou variante de IGF-I geralmente é cliva- do com endonucleases de restrição na região da extremidade 5' deste gene e religado com oligonucleotídeos que contêm a seqüência desejada.
Além disso, a invenção também fornece um vetor recombinante que contém pelo menos uma cópia de um DNA recombinante de acordo com
25 a presente invenção. Vetores que são adequados como base para a ex- pressão de proteínas em organismos procarióticos são conhecidos pelo es- pecialista. Esse vetor é de preferência um vetor que possibilita uma alta ex- pressão do DNA recombinante de acordo com a presente invenção. O DNA recombinante no vetor está de preferência sob o controle de um sinal de ex- pressão induzível (por exemplo, promotor Iambda., tac, Iac ou trp).
O vetor de acordo com a presente invenção pode estar presente extracromossomicamente (por exemplo plasmídio) assim como pode estar integrado no genoma do organismo hospedeiro (por exemplo bacteriófago lambda). O vetor de acordo com a presente invenção é de preferência um plasmídio. Vetores que são adequados em cada caso para expressão de genes em um organismo hospedeiro particular são conhecidos pelo especia- lista na área de biologia molecular. Ele pode ser um vetor eucariótico, mas de preferência um vetor procariótico. Exemplos de vetores adequados para a expressão do DNA de acordo com a presente invenção em procariotas são, por exemplo, os vetores pUC e pUR comercialmente disponíveis.
A invenção também fornece uma célula, de preferência uma cé- lula procariótica, particularmente de preferência uma célula de E. coli, que é transformada com o DNA recombinante de acordo com a presente invenção e/ou com um vetor recombinante de acordo com a presente invenção.
Quando a proteína de fusão é expressa em procariotas, formam- se agregados moderadamente solúveis (corpos refratários, corpos de inclu- são) que são inativos. Por conseguinte a proteína de fusão deve ser trans- formada em sua forma ativa. Usando procedimentos que são familiares para o versado na técnica (cf. por exemplo os documentos EP-A 0 219 874, EP A 0 114 506, WO 84/03711) primeiro uma solubilização é realizada por adição de agentes desnaturantes que é seguida por renaturação e, se desejado, outras etapas de purificação. O tratamento da proteína de fusão com prote- ase de IgA ocorre depois de PEGuilação da proteína de fusão.
As condições necessárias para o tratamento de IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado a ser clivado com proteases de IgA não são críticas. Neste processo, no entanto, é preferido que a proporção em peso de IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado para protease de IgA seja de 1:1 a 500:1, de preferência 100:1. A reação ocorre de preferência em uma solução aquosa tamponada de pH 6,5 a 8,5. A concentração de tampão está de preferência na faixa entre 50 e 500 mmols/l se desejado, com adição de 0-100 mmols/l de cloreto de sódio. A clivagem é de preferên- cia realizada à temperatura ambiente por pelo menos 60 minutos a até 5 di- as, de preferência entre 24 - 72 horas.
Depois de solubilização, renaturação, PEGuilação e clivagem com protease de IgA o produto de clivagem PEGuiIado obtido desta maneira é de preferência purificado por meio de cromatografia de troca iônica, croma- tografia de interação hidrofóbica e/ou fracionamento por tamanho. O IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado produzido desta maneira é livre de metionina na posição -1 e de preferência livre de outras proteínas, como IGF-I não-PEGuilado ou variante de IGF-I, e de preferência livre de propep- tídio PEGuiIado N-terminal, por 5 %(p/p) ou menos.
"IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuilado" ou " PEGuila- ção amino-reativa" conforme usado neste relatório significa que um IGF-I ou variante de IGF-I é covalentemente ligado a grupos poli(etileno glicol) por acoplamento amino-reativo. Os grupos PEG são ligados aos sítios da molé- cuia de IGF-I ou de variante de IGF-I que são os grupos ε-amino primários das cadeias laterais de lisina. É ainda possível que a PEGuilação ocorra adicionalmente no grupo α-amino N-terminal do propeptídio. Devido ao mé- todo de síntese e à proteína de fusão usados, o IGF-I PEGuilado ou variante de IGF-I PEGuilado pode consistir em uma mistura, com o que os sítios de PEGuilação podem ser diferentes em moléculas diferentes ou podem ser substancialmente homogênes em relação à quantidade de cadeias laterais de poli(etileno glicol) por molécula e/ou ao sítio de PEGuilação na molécula. De preferência o IGF-I ou variantes de IGF-I são mono- e/ou diPEGuilados.
PEGuilação amino-reativa conforme usado neste relatório desig- na um método de ligação aleatória de cadeias de poli(etileno glicol) a grupos amino primários da lisina do IGF-I ou variante de IGF-I pelo uso de po- li(etileno glicol) reativo (ativado), de preferência pelo uso de ésteres N- hidroxissuccinimidílicos, de preferência, de metoxipoli(etileno glicol). A rea- ção de acoplamento prende o poli(etileno glicol) a grupos ε-amino primários reativos de resíduos Iisina e opcionalmente o grupo α-amino ao aminoácido N-terminal da proteína de fusão. Esta conjugação de grupos amino de PEG a proteínas é bastante conhecida na literatura. Por exemplo, uma recapitu- lação desses métodos é dada por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. Segundo Veronese, a conjugação de PEG a grupos amino primá- rios de proteínas pode ser efetuada usando PEGs ativados que efetuam uma alquilação dos referidos grupos amino primários. Para tal reação, PEGs alquilantes ativados, por exemplo, aldeído de PEG, cloreto de PEG- tresila ou epóxido de PEG podem ser usados. Outros reagentes úteis são PEGs acilantes tais como ésteres hidroxissuccinimidílicos de PEGs carboxi- Iados ou PEGs nos quais o grupo hidróxi terminal é ativado por cloroformia- tos ou carbonilimidazol. Outros reagentes de PEG úteis são PEGs com bra- ços de aminoácidos. Tais reagentes podem conter os chamados PEGs ra- mificados, pelos quais pelo menos duas moléculas de PEG idênticas ou dife- rentes são ligadas por um espaçador peptídico (de preferência lisina) e, por exemplo, ligadas ao IGF-I ou variante de IGF-I como carboxilato ativado do espaçador de lisina.
"PEG ou poli(etileno glicol)" conforme usado neste relatório sig- nifica um polímero solúvel em água que se encontra comercialmente dispo- nível ou pode ser preparado por polimerização por abertura de anel de etile- no glicol de acordo com métodos bastante conhecidos na literatura (Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18). O termo "PEG" é usado amplamente para abranger qualquer molécula de polietileno glicol, onde o número de u- nidades etileno glicol é pelo menos 460, de preferência 460 a 2300 e espe- cialmente de preferência 460 a 1840 (230 unidades PEG refere-se a um pe- so molecular de cerca de 10 kDa). O número superior de unidades PEG só é limitado pela solubilidade IGF-I PEGuiIado com lisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com lisina. Geralmente PEGs que são maiores que PEGs con- tendo 2300 unidades não são usados. De preferência, um PEG usado na invenção termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi (metóxi PEG, mPEG) e na outra extremidade é covalentemente ligado a uma porção Iiga- dora via uma ligação oxigênio de éter. O polímero de PEG é linear ou rami- ficado. De preferência o polímero de PEG é ramificado. PEGs ramificados estão descritos, por exemplo, em Veronese, F.M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207. Reagentes do tipo PEG úteis estão disponíveis, por exemplo, na Nektar Therapeutics (www.nektar.com). PEGs ramificados podem ser preparados, por exemplo, pela adição de óxido de polietileno a vários polióis, que incluem glicerol, pentaeritritol, e sorbitol. Por exemplo, um PEG ramificado de quatro braços pode ser preparado a partir de pentaeritritol e óxido de etileno. PEGs ramificados geralmente têm 2 a 8 braços e estão descritos, por exemplo, a patente EP-A 0 473 084 e na Patente US N0 5.932.462. Especialmente preferidos são PEGs com duas cadeias laterais de PEG ligadas via o grupo amino primário de uma Iisina (abreviado por PEG2) (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69).
É possível usar qualquer massa molecular para um PEG con- forme praticamente desejado, por exemplo, de cerca de 20 kDáltons (Da) a 100 kDa (n é 460 a 2300). O número de unidades repetitivas "n" no PEG é aproximado para a massa molecular descrita em Daltons. Por exemplo, se duas moléculas de PEG são presas a um ligante, onde cada molécula de PEG tem a mesma massa molecular de 10 kDa (cada η é cerca de 230), então a massa molecular total de PEG no Iigador é cerca de 20 kDa. As massas moleculares do PEG preso ao Iigador também podem ser diferentes, por exemplo, de duas moléculas em um Iigador uma molécula de PEG pode ter 5 kDa e uma molécula de PEG pode ter 15 kDa. Massa molecular signi- fica sempre massa molécula média.
Nos exemplos abaixo, estão descritos alguns reagentes preferi- dos para a produção de IGF-I amino-reativo ou variantes de IGF-I. Fica en- tendido que modificações, por exemplo, baseadas nos descritos por Verone- se, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417, podem ser feitas nos procedimen- tos contanto que o processo resulte em IGF-I PEGuiIado com Iisina ou vari- 10
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antes de IGF-I de acordo com a invenção.
A invenção fornece métodos para a produção de formas PEGui- Iadas de IGF-I ou de variante de IGF-I com propriedades melhoradas. Tais como IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variantes de IGF-I contêm PEG linear i ou ramificado preso aos mesmos aleatoriamente, com o que o peso molecu- lar total de todos os grupos PEG no IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina é de preferência cerca de 20 a 80 kDa. É óbvio para um especialista na técnica que pequenos desvios desta faixa de peso molecular são possíveis contanto que o IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado apresente atividade para diminuir os níveis de peptídio Abe- ta no cérebro. Também PEG com pesos moleculares superiores a 80 KDa resulta em maior biodisponibilidade. No entanto, espera-se que tal atividade diminua à medida em que o peso molecular aumenta devido à ativação re- duzida do receptor de IGF-I e ao transporte da barreira hematoencefálica Por conseguinte, a faixa de 20 a 100 kDa para o peso molecular do PEG deve ser entendida como a faixa otimizada para um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina útil para um tratamento efi- ciente de um paciente que sofre de AD.
De preferência é produzida uma variante de IGF-I monoPEGui- lada, selecionada do grupo que consiste em RKK1 RKR e RRK onde o grupo PEG ramificado tem um peso molecular de 30 -45, de preferência 40 - 45 kDa (cerca de 920 unidades PEG). Por exemplo, com base em um peso molecular médio de 44 kDa para um PEG e um peso molecular de 7,6 kDa para IGF-I1 o peso molecular médio calculado para tal monoPEG-IGF-l é cerca de 51,5 kDa. Especialmente preferido é o uso de um éster de PEG ramificado ativado com N-hidroxissuccinimidil (mPEG2-NHS) de um peso molecular de 40 kDa (Monfardini, C., et al„ Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62- 69; Veronese, F.M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197. 207; Patente US 5.932.462). Também é de preferência produzido um IGF-I monoPEGuilado onde o PEG tem um peso molecular de 30 ou 40 kDa.
Conforme usado neste relatório, "peso molecular" significa o pe- so molecular médio do PEG. As seguintes formas PEGuiIadas de IGF-1 ou variantes de IGF-I são produtos preferidos e disponíveis pelos métodos de acordo com a in- venção:
variante de IGF-I monoPEGuilada K68, de preferência a variante RRK ou RKK1 mais preferivelmente a variante RRK, onde o grupo PEG tem um peso molecular de 20 a 80 kDa (460 a 1840 unidades PEG); variante de IGF-I monoPEGuilada K 65, de preferência a variante RKR ou RKK1 mais preferivelmente a variante RKR1 onde o grupo PEG tem um peso molecular de 20 a 80 kDa (460 a 1840 unidades PEG);
- variante de IGF-I diPEGuilado, de preferência a variante RKK1 onde os grupos PEG têm um peso molecular de cerca de 10 -50 kDa (230 a 1150 unidades PEG) cada;
e misturas dos mesmos; variante de IGF-I monoPEGuilada K 68, de preferência a variante RRK ou RKK, mais preferivelmente a variante RRK, que compreende um grupo PEG2 de um peso molecular de 40 kDa;
variante de IGF-I monoPEGuilada K 65, de preferência a variante RKR ou RKK, mais preferivelmente a variante RKR, que compreende um grupo PEG2 de um peso molecular de 40 kDa;
- IGF-I monoPEGuilado, onde o grupo PEG tem um peso molecular de a 80 kDa (460 a 1840 unidades PEG);
- IGF-I diPEGuilado, onde os grupos PEG têm um peso molecular de cerca de 10 -50 kDa (230 a 1150 unidades PEG) cada;
- IGF-I monoPEGuilado, que compreende um grupo PEG2 de um peso molecular de 40 kDa.
IGF-I PEGuiIado ou variantes de IGF-I são substancialmente homogêneos. A preparação pode conter pequenas quantidades de proteína não reagida (isto é, faltando o grupo PEG). Como verificado pelo mapea- mento do peptídio a pureza da variante é pelo menos 90% (p/p). A purifica- ção posterior de tais preparações, que inclui separação de IGF-I mono- e/ou diPEGuilado ou variantes de IGF-I, pode ser efetuada pelos métodos de pu- rificação usuais, de preferência por cromatografia de exclusão de tamanhos, cromatografia de interação hidrofóbica e/ou cromatografia de troca iônica, especialmente por cromatografia de troca catiônica.
"MonoPEGuilado" conforme usado neste relatório significa que o IGF-I ou variante de IGF-I é PEGuiIado somente em uma Iisina por molécula de IGF-I ou variante de IGF-I.
"PEGs ativados ou reagentes de PEG ativado" são bastante co- nhecidos no estado da técnica. De preferência são usados PEGs eletrofili- camente ativados tais como ésteres succinimidílicos de ácido alcoxibutírico de poli(etileno glicol) ("alcóxi inferior-PEG-SBA") ou ésteres succinimidílicos de ácido alcoxipropiônico de poli(etileno glicol) ("alcóxi inferior-PEG-SPA") ou PEGs ativados com N-hidroxissuccinimida. Qualquer método convencio- nal para reagir um éster ativado com uma amina para formar uma amida po- de ser utilizado. Na reação do PEG ativado com IGF-I, o éster succinimidíli- co exemplificado é um grupo deslocável que causa a formação de amida. O uso de ésteres succinimidílicos para produzir conjugados com proteínas está apresentado na Patente US N0 5.672.662.
As condições reacionais usadas têm influência sobre a quanti- dade relativa de IGF-I ou variantes de IGF-I PEGuiIados de formas diferen- tes. Com a manipulação das condições reacionais (por exemplo, proporção de reagentes, pH, temperatura, concentração de proteína, tempo de reação etc.), as quantidades relativas das diferentes espécies PEGuiIadas podem variar. De preferência a reação é realizada em uma solução aquosa tampo- nada pH 8-10, opcionalmente contendo até 30% (v/v) de etanol. A propor- ção molar de proteína:PEG é de preferência 1:1 a 1:6, de preferência 1:2 a 1:5. A temperatura de reação e o tempo de reação podem ser variados de acordo com o conhecimento do especialista, pelo que uma temperatura ele- vada e um tempo de reação longo resultam em PEGuilação aumentada. Se forem produzidas proteínas monoPEGuiladas, é portanto preferível trabalhar entre 4°C e 22°C e por até 30 minutos ou até 60 minutos. Quando o reagen- te de PEGuilação é combinado com IGF-I ou variante de IGF-I em um tam- pão de reação que de preferência consiste em 50mM de borato de sódio e 25% de etanol a um pH de cerca de 9,0 - 9,5, uma proporção de proteí- na:PEG de cerca de 1:3 a 1:4, e uma temperatura de reação de 4°C, uma mistura das espécies mono- PEGuiladas, di- PEGuiIadas1 e quantidades de traço das espécies tri-PEGuiladas é produzida dependendo da presença de resíduos Lys na proteína.
IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variantes de IGF-I de acordo com
a invenção podem ser preparados por reação covalente de um grupo amino primário da Iisina de um IGF-I ou variante de IGF-I com um reagente bifun- cional para formar um intermediário com uma ligação amida e reação cova- lente do intermediário contendo a ligação amida com um derivado de po- li(etileno glicol) ativado para formar um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou vari- ante de IGF-I PEGuiIado com lisina. No processo precedente, o reagente bifuncional é de preferência N-succinimidil-S-acetiltiopropionato ou N- succinimidil-S-acetiltioacetato, o derivado de poli(etileno glicol) ativado é de preferência selecionado do grupo que consiste em iodo-acetil-metóxi-PEG, metóxi-PEG-vinilsulfona, e metóxi-PEG-maleimida.
Derivados de PEG ativado são conhecidos na literatura e estão descritos, por exemplo, em Morpurgo, M., et al., J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368 para PEG-vinilsulfona. Espécies de PEG de cadeia linear e de cadeia ramificada são adequadas para a preparação dos compostos de fórmula I. Exemplos de reagentes de PEG reativo são iodo-acetil-metóxi- PEG e metóxi-PEG-vinilsulfona. O uso dessas substâncias iodo-ativadas é conhecido na literatura e está descrito, por exemplo, por Hermanson, G.T., em Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), página 147-148.
Um "aminoácido polar" conforme usado neste relatório refere-se
a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), histidina (H), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R)1 serina (S), e treonina (T). Lisina também é um aminoácido polar, porém excluído, pois a lisina é substituída de acordo com a invenção. Arginina é de preferência usada como aminoácido polar. Formulações Farmacêuticas
O IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado produzido de 10
15
acordo com a invenção oferece maior estabilidade na circulação possibili- tando um acesso sistemático a receptores de IGF-I através do corpo com intervalos de aplicação pequenos.
Os compostos da presente invenção podem ser formulados de acordo com métodos para a preparação de composições farmacêuticas mé- todos estes que são conhecidos pelo especialista na técnica. Para a produ- ção de tais composições, um IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIa- do de acordo com a invenção é combinado em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, de preferência por diálise ou diafiltração contra uma solução aquosa contendo os componentes desejados das composições farmacêuticas. Tais veículos aceitáveis estão descritos, por exemplo em Remmgton-s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, editado por Oslo et al. (por exemplo página 1435-1712) As com- posições típicas contêm uma quantidade eficaz da substância de acordo com a invenção, por exemplo de cerca de 0,1 a 100 mg/ml, junto com uma quantidade adequada de um veículo. As composições podem ser adminis- tradas por via parenteral. O IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIa- do de acordo com a invenção é administrado de preferência por aplicação intraperitoneal, subcutânea, intravenosa ou intranasal.
As formulações farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na literatura. Geralmen- te, soluções de IGF-I PEGuiIado ou variante de IGF-I PEGuiIado são dialisa- das ou diafiltradas contra o tampão destinado a ser usado na composição
farmacêutica e a concentração final de proteínas é ajustada por concentra- ção ou diluição.
Os exemplos e as figuras a seguir são oferecidos para ajudar a entender a presente invenção, cujo verdadeiro escopo está descrito nas rei- vindicações em anexo. Deve ficar entendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da inven- ção. Os nomes dos aminoácidos são abreviados usando o código de uma letra (por exemplo R) ou o código de três letras (por exemplo Arg). Listagem das Seqüências
20 SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
proteína de fusão
proteína de fusão
proteína de fusão
proteína de fusão
seqüência de aminoácidos do IGF-I humano (aminoácidos 49-118 da SwissProt P01343). seqüência de aminoácidos da px3036_IAG_R K27R K65R K68 seqüência de aminoácidos da px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68 seqüência de aminoácidos da px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68 seqüência de aminoácidos da px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68
SEQ ID NO: 6 -10 ligados SEQ ID NO: 11-18sequências de clivagem SEQ ID NO: 19-21 outras
SEQ ID NO: 22 seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAG_R K27R K65 K68R
seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAEE_F 1 K27R K65 K68R seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX_F 1 K27R K65 K68R seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R
seqüência de aminoácido de uma IgAI protease a partir de Neisseria gonorrhala (tipo 2) Descrição das Figuras Figura 1: Análise de peptídios da proteína de fusão monoPEGuilada.
Análise por SDS-PAGE da proteína de fusão dobrada antes e depois da PEGuilação. Faixa 1, mistura de proteína tradicional (aprotinina de pulmão bovino, 6,0 kDa; Iisozima de clara de ovo de galinha, 14,4 kDa; inibidor de tripsina de soja, 21,5 kDa; anidrase carbônica de eritrócito bovino, 31,0 kDa; Iactato desidrogenado de músculo de porco, 36,5 kDa; desidroge- nase glutâmica de fígado bovino, 55,4 kDa; albumina sérica bovina, 66,3 kDa; fosforilase b de músculo de coelho, 97,4 kDa; β-galactosidase de E.
SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26 15
col., 97,4 kDa; miosina de músculo de coelho, 200 kDa); faixa 2, pro-IGF-l antes da peguilação; faixa 3, pro-IGF-l depois da peguilação. Figura 2: Análise de peptídios da variante de IGF-I monoPEGuilada.
Análise por SDS-PAGE da proteína de fusão PEGuiIada antes e depo,s da clivagem com IgA. Faixa 1, mistura tradicional de proteínas (a mesma da Figura 1); faixa 2, mistura reacional antes da clivagem com prote-
ase de IgA; faixa 3, mistura reacional depois da clivagem com protease de IgA.
Figura 3: SDS PAGE.
Análise por SDS-PAGE da proteína de fusão dobrada antes e
depois da PEGuilação.
Faixa 1, mistura tradicional de proteínas (a mesma da Figura 1)· faixa 2, mistura reacional antes de IEC; faixa 3, fluxo através de IEC; faixas 4-19, frações eluídas simples de IEC.
Figura 4: Diminuição de Abeta cerebral in vivo por PEG-RRK em camun- dongos B6.152H.
Camundongos B6.152H duplamente transgênicos com idade de 9-10 meses foram tratados com veículo (NaCI) ou com PEG-RRK (5 pg/kg s.c., duas vezes por semana) por 14 dias. Extratos cerebrais solúveis foram preparados e os níveis de APP, Abeta e actina foram avaliados da maneira descrita. As proporções APP/Actina, Abeta/Actina e Abeta/APP foram calcu- ladas, e estão expressas como % de controle. A, APP/Actina· B Abe- ta/Actina, C, Abeta/APP. Os gráficos superiores mostram dados de um úni- co animal, os gráficos inferiores mostram representação em barras (média ±
SEM) incluindo as diferenças estatísticas (*, p<0,05; **, p<0,01 vs. controle não tratado, n=10).
Exemplos
Exemplo 1
Os seguintes mutantes (compreendendo IGF-I - Variantft rr*} ^ pr. Peptídios de (fórmula l) foram produzidos)·
20
25
Mutante Xi X2 η Y Px3036_ IAG K27R K65R K68 nenhum KAKRFKKH 6 PRPP Mutante Xi X2 η Y Px3036_IAG_R K27R K65R K68 nenhum RARRFRRH 6 PRPP Px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68 S NTEHNREH 6 PRPP Px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68 N IEGRH 6 PRPP Px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68 N TEFENIEH 6 PRPP
Preparação da variante de IGF-I mono-PEGuilada K68 (variante RRK)
O vetor de expressão e a cepa de E. coli usados estão descritos no documento EP 0 972 838. De um clone de E. coli, que expressa a proteí- na de fusão px3036_IAG_R K27R K65R K68, px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68, px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68 ou px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68, cultivado em placa de ágar seletivo, uma alça inoculante foi transferida para (100 ml) meio seletivo e cultivada por 13 horas a 37°C até uma densi- dade ótica (578 nm) de 2 - 4. Esta cultura foi armazenada em gelo durante as 6 horas seguintes antes da inoculação automatizada da cultura principal que foi realizada a 37°C. A expressão do IGF-I mutante foi iniciada a uma densidade ótica (578 nm) de 50 com a adição de 1,0 mM de IPTG. A fermen- tação total leva até 16 horas. A quantidade de proteína foi determinada por densitometria por comparação da intensidade volumétrica da banda de pro- teína do produto com a banda de um padrão de IGF em um gel de SDS- PAGE. O caldo de cultura foi coletado por centrifugação.
Para obter o material de corpo de inclusão (IB) purificado, a bio- massa coletada da fermentação padrão foi tratada com o seguinte procedi- mento: a biomassa foi ressuspenso com o tampão TrisMgSO4 pH 7 e suple- mentada com 0,3 g/100 g de peso seco da biomassa ("bio dry weight"). Li- sozima e 5 U/1 g de peso seco da biomassa de Benzonase foram incubados por 20 minutos e homogeneizados. 30 U/1 g de peso seco da biomassa de Benzonase foram adicionados e incubados por 60 minutos a 37°C. 0,5 I de tampão Brij / Iiter foi adicionado e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de centrifugação o pélete foi ressuspenso em 300 ml de tampão Tris-EDTA /100 g de peso molhado da biomassa (peso molhado do IB purificado), incubada por 30 minutos à temperatura ambiente e centrifu- gada. 1 g de IBs/litro foi solubilizado à temperatura ambiente em guanidina- HCI 6,8 Μ, TrisHCI 0,1 Μ, DTT 0,1 Μ, ρΗ 8,5 por uma noite. A solução turva foi dialisada a 4°C contra guanidina-HCI 6,8 M, TrisHCI 0,1 M, pH 8,0. De- pois da diálise os componentes insolúveis foram removidos por centrifuga- ção. A dobra foi efetuada por diluição 1 para 50 da solução de pro-IGF-l em arginina 0,8 M, TrisHCI 0,1 M, guanidina-HCI 0,1 M, GSH 1 mM, GSSG 1 mM, pH 8,5 à temperatura ambiente. Depois de duas horas a solução foi suplementada com cloreto de sódio 2 M, filtrada e aplicada a uma taxa de fluxo de 10 ml/min a uma coluna de HIC (Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences), que fora equilibrada à temperatura ambiente com tampão contendo NaCI 2 M, arginina 0,8 M, TrisHCI 0,1 M, guanidina-HCI 0,1 M, pH 8,5. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio até ser atingida a linha basal e em seguida eluída com dez volumes de coluna de um gradi- ente linear começando com o tampão de equilíbrio e terminando com um tampão contendo TrisHCI 0,1 M, 5% de etileno glicol, pH 8,5. As frações eluídas foram analisadas por cromatografia de alto desempenho de fase re- versa (rpHPLC). As frações que continham proteína com as pontes SS for- madas corretamente foram reunidas. A cavidade foi dialisada a 4°C contra borato de sódio 50 mM, pH 9,0. PEG ramificado de 40 kDa ativado com NHS (éster de N-hidroxissuccinimida (NHS) de mPEG PM 20.000 (mPEG2NHS, US 5.932.462, Nektar Shearwater Polymers, Huntsville, AL) foi solubilizado em HCI 2 mM gelado e imediatamente adicionado à solução de proteína dialisada (proporção molar de reagente de PEG / proteína 2:1). Depois de 1 hora e 2 horas de incubação em gelo a mesma quantidade de solução ácida de mPEG2-NHS foi adicionada à mistura reacional proteí- na/PEG. Depois de uma terceira adição da mesma quantidade de solução ácida de mPEG2-NHS (excesso molar total de 6 vezes do reagente de PEG) a reação foi incubada em gelo por mais uma hora. A reação foi interrompida pela adição de cloreto de amônio sólido e incubação por mais 45 minutos e em seguida teve o pH ajustado em pH 8,0 (vide Figura 1). A mistura reacio- nal proteína/PEG foi suplementada com protease de IgAI de Neisseria go- norrhoea (tipo 2) (proporção p/p 1:50) e incubada por uma noite à temperatu- ra ambiente (vide Figura 2). A mistura reacional foi diluída 1:2 com ácido acético 50 mM pH 4,5 e em seguida aplicada a uma coluna catiônica IEC (suporte MacroCap SP; GE1 Amersham Biosciences1 Uppsala, Suécia), que fora equilibrada com ácido acético 50 mM. A coluna foi lavada até ser atin- gida a linha basal e em seguida eluída com 20 volumes de coluna de um gradiente linear começando com ácido acético 50 mM e terminando com ácido acético 50 mM suplementado com cloreto de sódio 1 M. As frações eluídas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações contendo uma única banda com um tamanho molecular relativo estimado de cerca de 60 kDa fo- ram reunidas como IGF-I monoPEGuilado K68 (vide Figura 3). A identidade do IGF-I monoPEGuilado K68 foi verificada por cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC) com detecção de espalhamento de luz estática, análise por MS dos produtos digeridos trípticos, análise por MS dos produtos digeridos Asp-N e IEC catiônica analítica. Não foi possível encontrar ne- nhuma outra isovariante de peguilação além do IGF-I monoPEGuilado K68. Exemplo 2
Os seguintes mutantes (compreendendo IGF-I - variante RKR) com os pro- peptídios de (fórmula I) foram produzidos):
Mutante Xi X2 η Y Px3036_ IAG K27R K65 K68R nenhum KAKRFKKH 6 PRPP Px3036_IAG_R K27R K65 K68R nenhum RARRFRRH 6 PRPP Px3036_IAEE_F1 K27R K65 K68R S NTEHNREH 6 PRPP Px3036_IAFX_F1 K27R K65 K68R N IEGRH 6 PRPP Px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R N TEFENIEH 6 PRPP
Preparação da variante de IGF-I mono-PEGuilado K65 (variante RKR)
O vetor de expressão e a cepa de E. coli a serem usados estão descritos na Patente EP 0 972 838. De um clone de E. coli, que expressa a proteína de fusão px3036_IAG_R K27R K65 K68R, px3036_IAEE_F1 K27R K65 K68R, px3036_IAFX_F1 K27R K65 K68R ou px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R, cultivado em placa de ágar seletivo, uma alça inoculante foi transferida para (100 ml) meio seletivo e cultivada por 13 horas a 37°C até uma densidade ótica (578 nm) de 2 - 4. Esta cultura foi armazenada em gelo durante às 6 horas seguintes antes da inoculação automatizada da cul- tura principal que foi realizada a 37°C. A expressão do IGF-I mutante foi iniciada a uma densidade ótica (578 nm) de 50 com a adição de 1,0 mM de IPTG. A fermentação total leva até 16 horas. A quantidade de proteína foi determinada por densitometria por comparação da intensidade volumétrica da banda de proteína do produto com a banda de um padrão de IGF em um gel de SDS-PAGE. O caldo de cultura foi coletado por centrifugação.
Para obter o material de corpo de inclusão (IB) purificado, a bio- massa coletada da fermentação padrão foi tratada com o seguinte procedi- mento: a biomassa foi ressuspensa com o tampão TrisMgSO4 pH 7, e su- plementada com 0,3 g/100 g de peso seco da biomassa de Lisozima e 5 U/1 g de peso seco da biomassa de Benzonase foram incubados por 20 minutos e homogeneizados. 30 U/1 g de peso seco da biomassa de Benzonase fo- ram adicionados e incubados por 60 minutos a 37°C. 0,5 I de tampão Brij / litro foi adicionado e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. De- pois de centrifugação o pélete foi ressuspenso em 300 ml de tampão Tris- EDTA /100 g de peso molhado da biomassa (peso molhado do IB purifica- do), incubado por 30 minutos à temperatura ambiente e centrifugado. 1 g de IBs/litro foi solubilizado à temperatura ambiente em guanidina-HCI 6,8 M, TrisHCI 0,1 M, DTT 0,1 M, pH 8,5 por uma noite. A solução turva foi dialisa- da a 4°C contra guanidina-HCI 6,8 M, TrisHCI 0,1 M, pH 8,0. Depois da diá- Iise os componentes insolúveis foram removidos por centrifugação. A dobra foi efetuada por diluição 1 para 50 da solução de pro-IGF-l em arginina 0,8 M, TrisHCI 0,1 M, guanidina-HCI 0,1 M, GSH 1 mM, GSSG 1 mM, pH 8,5 à temperatura ambiente. Depois de 2 a 48 horas, de preferência depois de 2 a 24 horas a solução foi suplementada com cloreto de sódio 2 M, filtrada e a- plicada a uma taxa de fluxo de 10 ml/min a uma coluna de HIC (Butyl Sepha- rose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences), que fora equilibrada à tem- peratura ambiente com tampão contendo NaCI 2 M, arginina 0,8 M, TrisHCI 0,1 M, guanidina-HCI 0,1 M, pH 8,5. A coluna foi lavada com tampão de e- quilíbrio até ser atingida a linha basal e em seguida eluída com dez volumes de coluna de um gradiente linear começando com o tampão de equilíbrio e terminando com um tampão contendo TrisHCI 0,1 M, 5% de etileno glicol, pH 15
25
30
8,5. As frações eluídas foram analisadas por cromatografia de alto desem- penho de fase reversa (rpHPLC). As frações que continham proteína com as pontes SS formadas corretamente foram reunidas. A cavidade foi diali- sada a 4°C contra borato de sódio 50 mM, pH 9,0. PEG ramificado de 40 KDa ativado com NHS (éster de N-hidroxissuccinimida (NHS) de mPEG PM 20.000 (mPEG2NHS, US 5.932.462, Nektar Shearwater Polymers1 Huntsvil- le, AL) foi solubilizado em HCI 2 mM gelado e imediatamente adicionado à solução de proteína dialisada (proporção molar de reagente de PEG / proteí- na 2:1). Depois de 1 hora e 2 horas de incubação em gelo a mesma quanti- dade de solução ácida de mPEG2-NHS foi adicionada à mistura reacional Proteína/PEG. Depois de uma terceira adição da mesma quantidade de so- lução ácida de mPEG2-NHS (excesso molar total de 6 vezes do reagente de PEG) a reação foi incubada em gelo por mais uma hora. A reação foi inter- rompida pela adição de cloreto de amônio sólido e incubação por mais 45 minutos e em seguida teve o pH ajustado em pH 8,0 (vide Figura 1). A mis- tura reacional proteína/PEG foi suplementada com protease de IgAI de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) (proporção p/p 1:50) e incubada por uma noite à temperatura ambiente (vide Figura 2). A mistura reacional foi diluída 12 com ácido acético 50 mM pH 4,5 e em seguida aplicada a uma coluna catiô- nica IEC (suporte MacroCap SP; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Su- écia), que fora equilibrada com ácido acético 50 mM. A coluna foi lavada até ser atingida a linha basal e em seguida eluída com 20 volumes de coluna de um gradiente linear começando com ácido acético 50 mM e terminando com ácido acético 50 mM suplementado com cloreto de sódio 1 M. As frações eluídas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações contendo uma única banda com um tamanho molecular relativo estimado de cerca de 60 kDa fo- ram reunidas como IGF-I monoPEGuilado K65. A identidade do IGF-I mono- PEGuiIado K65 foi verificada por cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC) com detecção de espalhamento de luz estática, análise por MS dos produtos digeridos trípticos, análise por MS dos produtos digeridos Asp-N e IEC catiônica analítica.
20 Exemplo 3
Redução de Abeta solúvel cerebral pela variante RRK de monoPEGuilado IGF-I K68 in vivo
Para avaliação da potência da variante RRK de IGF-I monoPE- Guilado K68 (40kD, PEG2) (PEG-RRK) sobre a redução dos níveis de Abeta solúvel, camundongos B6.152H com 9-10 meses de idade (camundongos duplamente transgênicos expressando mutantes APP e PS2 humanos) com carga pesada de placa amiloide foram repetidamente tratados por injeção s.c. duas vezes por semana de 5 pg/kg PEG-RRK. Os níveis corticais de APP1 Abeta e Actina foram detectados depois de 14 dias. A proporção de APP/actina não foi significativamente alterada pelo PEG-RRK (Figura 4A) sugerindo que o PEG-RRK não teve efeito sobre a expressão do transgene durante 14 dias. Em contraste, as proporções de Abeta/Actina (Figura 4B) e Abeta/APP (Figura 4C) foram significativamente reduzidas pelo PEG-RRK. Isto indica um efeito positivo do PEG-RRK na depuração de Abeta indepen- dente de sua produção pelo transgene. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Método para a produção de conjugados do fator de crescimento
semelhante à insulina-1 e poli(etileno glicol)
<130> 23907 FT
<150> EP06018170
<151> 2006-08-31
<160> 25
<170> Patente em versão 3.2 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221 > misc feature
<223> seqüência de aminoácidos de IGF-I humano (aminoácidos 4 9-118 da SwissProt P01343)
<4 00> 1
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 2 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAG_R K27R K65R K68 <4 00> 2 Met His His 1
Arg Pro Pro
Leu Gln Phe 35
Gly Tyr Gly 50
Glu Cys Cys
65
Ala Pro Leu
<210> 3 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAEE_Fl K27R K65R
K68 <4 00> 3
Met Ser His His His His His His Asn His Asn Arg Glu His Pro Arg 10 15
Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu
25 30
Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly
40 45
Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu
His His His His Arg Ala Arg
10
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly 25
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe 40
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro 55
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg
70
Arg Pro Ala Lys Ser Ala 85
Arg Phe Arg Arg His Pro 15
Ala Glu Leu Val Asp Ala
30
Tyr Phe Asn Arg Pro Thr 45
Gln Thr Gly Ile Val Asp 60
Arg Leu Glu Met Tyr Cys 75 80 50 55 60
Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 65 70 75 80
Pro Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala
85
<210> 4 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX_Fl K27R K65R
K68 <4 00> 4
Met Asn His His His His His His Ile Glu Gly Arg His Pro Arg Pro 10 15
Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln
25 30
Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly Tyr 35 40 45
Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys
50 55 60
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro 65 70 75 80
Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala
85
<210> 5 <211> 90 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX_F2 K2 7R K65R
Κ68 <400> 5
Met Asn His His His His His His Thr Glu Phe Glu Asn Ile Glu His 10 15
Pro Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp
25 30
Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro
40 45
Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val
50 55 60
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr 65 70 75 80
Cys Ala Pro Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala 85 90
<210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> ligador <4 00> 6
Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ligador <4 00> 7
Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His 1 5 <210> 8 <211> 8
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Iigador
<400> 8
Asn Thr Glu His Asn Arg Glu His
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigador
<4 00> 9
Ile Glu Gly Arg His
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Iigador
<400> 10
Thr Glu Phe Glu Asn Ile Glu His
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial <22 0> <223> seqüência de clivagem <4 00> 11
Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5
<210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de clivagem <4 00> 12 Ala Pro Arg Pro 1
<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <22 0>
<223> seqüência de clivagem <4 00> 13
Pro Ala Pro Arg Pro 1 5
<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de clivagem <400> 14
Pro Ala Pro Gly Pro 1 5 <210> 15 <211> 4
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> seqüência de clivagem
<4 00> 15 Pro Pro Gly Pro 1
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> seqüência de clivagem
<4 00> 16
Pro Arg Pro Pro Gly Pro
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> seqüência de clivagem
<4 00> 17
Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial <220> <223> seqüência de clivagem <4 00> 18
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5
<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> outra <4 00> 19
Ser His His His His His His 1 5
<210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> outra <4 00> 20
Asn His His His His His His 1 5
<210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> outra <4 00> 21
His His His His His His 1 5
<210> 22 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAG_R K27R K65 K68R <4 00> 22 Met His His 1
Arg Pro Pro
Leu Gln Phe 35
Gly Tyr Gly 50
Glu Cys Cys 65
Ala Pro Leu
<210> 23 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAEE_Fl K27R K65
K68R <4 00> 23
Met Ser His His His His His His Asn His Asn Arg Glu His Pro Arg 10 15
Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 25 30
His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro
10 15
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 25 30
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr
40 45
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp
55 60
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys
70 75 80
Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly
40 45
Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu
50 55 60
Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 65 70 75 80
Pro Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85
<210> 24 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX K27R K65
K68R <4 00> 24
Met Asn His His His His His His Ile Glu Gly Arg His Pro Arg Pro 10 15
Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln
25 30
Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly Tyr
40 45
Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys
50 55 60
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro 65 70 75 80
Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85
<210> 25 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> seqüência de aminoácidos da proteína de fusão px3036_IAFX K27R K65
K68R <4 00> 25
Met Asn His His His His His His Thr Glu Phe Glu Asn Ile Glu His 10 15
Pro Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp
25 30
Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro
40 45
Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val
50 55 60
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr 65 70 75 80
Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 90

Claims (19)

1. Método para a produção de um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou uma variante de IGF-I1 a referida variante compreende um ou dois aminoáci- dos selecionados do grupo que consiste em Iisina 27, 65 e/ou 68 são inde- pendentemente substituídos por um outro aminoácido polar, caracterizado pelo fato de a) cultivar uma célula hospedeira procariótica que compreende um vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica uma proteí- na de fusão compreende o referido IGF-I ou variante de IGF-I ligada pelo terminal N ao terminal C de um propeptídio, b) o referido propeptídio em seu C-terminal termina com amino- ácidos -Y-Pro1 onde Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr1 Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro, c) recuperar e PEGuiIar a referida proteína de fusão, d) clivar a referida proteína de fusão PEGuiIada com protease de IgA, e e) recuperar o referido IGF-I ou variante de IGF-1 PEGuiIado .
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o propeptídio ser mostrado pela fórmula Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-, em que • Met significa metionina • Xi é uma ligação, serina ou asparagina • His é histidina, • η é um número de O a 10, • X2 é um peptídio ligante, selecionados do grupo que consiste nos pep- tídios SEQ ID N°: 6-10, • Pro é prolina, e • Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro- Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de o referido propeptídio não compreender um resíduo lisina.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de os referidos aminoácidos polares serem independentemente arginina, glutamina ou asparagina.
5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser mono- ou diPEGui- Iada nos resíduos Iisina 65 e 68.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RRK e a referida varian- te ser monoPEGuilada no resíduo Iisina 68 ou a variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RKR e a referida variante ser monoPEGuilada no resíduo Iisi- na 65.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser RKK e a referida variante ser mono- ou diPEGuilada nos resíduos Iisina 65 e 68.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina ser uma mistura de RRK, RKR ou RKK e a referida variante ser mono- ou diPEGuilada nos resíduos Iisina 65 e 68.
9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de o IGF-I PEGuiIado com Iisina ser aleatoriamente mono- ou di- PEGuilado.
10. Método de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de o referido PEG ter um peso molecular total de 20 a 100 kDa.
11. Método de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracteriza- do pelo fato de os grupos poli(etileno glicol) serem grupos poli(etileno glicol) ramificados.
12. Proteína de fusão que compreende um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina a referida variante compre- endendo um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Iisina 27, 65 e/ou 68 são independentemente substituídos por um outro ami- noácido polar, ligada pelo terminal N ao terminal C de um propeptídio, carac- terizado pelo fato de o referido propeptídio em seu terminal C terminar com aminoácidos -Y-Pro1 onde Y é selecionado do grupo que consiste em Pro1 Pro-Ala1 Pro-Gly1 Pro-Thr1 Ala-Pro1 Gly-Pro1 Thr-Pro1 Arg-Pro1 ou Pro-Arg- Pro.
13. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 12, carac- terizado pelo fato de o referido propeptídio ter um comprimento de até 30 aminoácidos.
14. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pela fórmula Met-X1-HiSn-X2-Y-Pro-IIGF-I ou variante de IGF-I], em que • IGF-I significa IGF-I humano e variante de IGF-I significa IGF-I, onde um ou dois aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Iisina 27, 65 e/ou 68 são independentemente substituídos por um outro ami- noácido polar, · Met significa metionina, Xi é uma ligação, serina ou asparagina , His é histidina, η é um número de O a 10, X2 é um peptídio Iigador1 selecionado do grupo que consiste nos peptí- dios SEQ ID N°: 6-10, • Pro é prolina, e • Y é selecionado do grupo que consiste em Pro, Pro-Ala, Pro-Gly1 Pro- Thr1 Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, ou Pro-Arg-Pro.
15. IGF-I PEGuiIado com Iisina1 caracterizado pelo fato de não compreender uma metionina N-terminal.
16. Variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina onde um ou dois a- minoácídos selecionados do grupo que consiste em Iisina 27, 65 e/ou 68 são independentemente substituídos por um aminoácido polar, caracterizada pelo fato de a referida variante não compreender uma metionina N-terminal.
17. Composição farmacêutica que compreende um IGF-I PEGui- Iado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina como definido na reivindicação 15 ou 16.
18. Uso de um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina como definido na reivindicação 15 ou 16 para a prepa- ração de um medicamento para o tratamento do mal de Alzheimer (AD).
19. Método para o tratamento do mal de Alzheimer (AD)1 carac- terizado pelo fato de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um IGF-I PEGuiIado com Iisina ou variante de IGF-I PEGuiIado com Iisina como defi- nidos na reivindicação 15 ou 16, ser administrada a um paciente com neces- sidade da mesma.
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