BRPI0715950A2

BRPI0715950A2 - tratamento de doenÇas inflamatàrias

Info

Publication number: BRPI0715950A2
Application number: BRPI0715950-1A2A
Authority: BR
Inventors: Betty C Soliven
Original assignee: Univ Chicago
Priority date: 2006-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2013-07-30
Also published as: HRP20121034T1; CA2660880A1; JP2010500995A; JP2013144694A; DK2056807T3; US8258150B2; CN102526736A; US20150335666A1; CN101553216B; RU2009109418A; PT2056807E; SI2056807T1; MX2009001788A; ES2393631T3; WO2008021532A2; PL2056807T3; US9370497B2; US20130017190A1; CN101553216A; RU2440110C2

Abstract

"TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATàRIAS". A presente invenção está relacionada de modo geral ao campo das doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico. Mais particularmente, ela está voltada para os métodos para tratar doenças inflamatórias do sistema nervosos periférico mediante modular a atividade do receptor 1-fosfato de esfingosina. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo com polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP) ou outras neuropatais autoimune compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de FTY720.

Description

"TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS" Fundamentos da invenção

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória U.S. No Serial 60/838,222, emitida em 17 de agosto de 2006, a revelação total da qual é aqui especi- ficamente incorporada por referência. Essa invenção foi produzida com suporte governa- mental sob número de concessão NS049014-02 outorgado pelos National Institutes of Heal- th. O governo tem certos direitos na invenção.

A. Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada de modo geral ao campo das doenças infla- matórias do sistema nervoso periférico. Mais particularmente, ela está voltada aos métodos para tratar doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico mediante modular a ativida- de do receptor 1-fosfato de esfingosina.

B. Descrição da Técnica Relacionada

O sistema nervoso periférico (PNS) é um alvo usual do ataque imuno. A polineuro- patia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP) é algumas vezes referida como a contra- parte PNS da esclerose múltipla (MS), que afeta o sistema nervoso central, devido as simila- ridades entre as duas doenças em termos do transcurso da enfermidade (recidiva vs. pro- gressiva), presença de desmielinação focai e variados graus de perda axonal, e patofiologia imuno-mediada. Infiltrados inflamatórios nos nervos da CIDP consistem primariamente de células-T e macrófagos, sugerindo que a reação mediada por célula-T no sentido de antíge- nos mielina é uma provável causa dos danos teciduais na CIDP. Terapias disponíveis para a CIDP, tal como gamaglobulina intravenosa, plasmaferese e esteróides, são eficazes em dois terços dos pacientes, mas estão associadas com complicações ou falhas para induzir uma remissão de longa duração (Ropper, 2003). Portanto, existe uma necessidade premente para desenvolver novos métodos e agentes terapêuticos que possam ser usados sozinhos ou em combinação com as modalidades de tratamento existentes.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona terapias para distúrbios inflamatórios e distúrbios autoimunes. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo com um distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfin- gosina. Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de aliviar um sintoma de um distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de prolongar o tempo para a recidiva de um distúrbio autoimune do sistema ner- voso periférico em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina.

Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo com um distúrbio autoimune da musculatura que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina, em que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é tratado. Em uma outra modalida- de, a presente invenção proporciona um método de aliviar um sintoma de um distúrbio auto- imune da musculatura em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de prolongar o tempo para a recidiva de um distúrbio autoimune da musculatura em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina.

Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo com um distúrbio autoimune de uma junção neuromuscular que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina, em que o distúrbio autoimune de uma junção neuromuscular é tratado. Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de aliviar um sintoma de um distúrbio autoimune de uma junção neuromuscular em um indivíduo que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfin- gosina. Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de pro- Iongar o tempo para a recidiva de um distúrbio autoimune de uma junção neuromuscular em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modu- lador de receptor 1-fosfato de esfingosina.

Em uma modalidade, um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é usado no tratamento de um distúrbio do sistema nervoso periférico. Em certos aspectos, o distúrbio do sistema nervoso periférico é Síndrome de Guillain-Barré (GBS), polineuropatia desmieli- nizante inflamatória crônica (CIDP), uma neuropatia mediada pelo anticorpo, ou uma neuro- patia vasculítica. Em algumas modalidades, um modulador de receptor 1-fosfato de esfingo- sina é usado no tratamento de condições autoimune que afeta a musculatura (por exemplo miosite) ou junção neuromuscular (por exemplo miastenia). Sintomas dos distúrbios inflamatórios ou autoimune do sistema nervoso periférico

incluem, por exemplo, formigamento ou embotamento (começando tipicamente nos dedos dos pés e dedos), fraqueza dos braços, fraqueza das pernas, perda de reflexo de tendão profundo (areflexia), fadiga, e sensações anormais. Sintomas dos distúrbios inflamatórios ou autoimune da musculatura incluem, por exemplo, fraqueza muscular, atrofia muscular, dor muscular, fadiga geral, e disfagia (dificuldade de deglutição). Sintomas dos distúrbios infla- matórios ou autoimune da junção neuromuscular incluem, por exemplo, fraqueza muscular, ptose assimétrica (uma queda de uma ou ambas as pálpebras), diplopia (visão dupla) devi- do a fraqueza das musculaturas que controlam os movimentos dos olhos, caminhada instá- vel ou claudicante, fraqueza nos braços, mãos, dedos, pernas e pescoço, uma alteração na expressão facial, disfagia (dificuldade de deglutição), respiração ofegante, e disartria (defeito na expressão da fala). Um ou mais desses sintomas podem ser aliviados através dos méto- dos da presente invenção. Pela frase "aliviar um sintoma de um de um distúrbio inflamatório do sistema nervoso periférico" é significado que o sintoma é tornado menos grave ou mais suportável.

Em certos aspectos da invenção, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é FTY720, FTY720-P, AAL(R)1 AFD(R), ou SEW2871. Em alguns aspectos da invenção, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é um sub regulador de um receptor 1-fosfato de esfingosina. Em outros aspectos da invenção, o modulador de receptor 1-fosfato de es- fingosina é um agonista de um receptor 1-fosfato de esfingosina. O receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser, por exemplo, um receptor S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, e/ou S1P5.

O modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser administrado ao indiví- duo antes do início dos sintomas do distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico, ou ele pode ser administrado ao indivíduo após o início dos sintomas do distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico. Em certos aspectos da invenção, o modulador de receptor 1- fosfato de esfingosina é administrado ao indivíduo durante a remissão dos sintomas do dis- túrbio autoimune do sistema nervoso periférico. Em certas modalidades da invenção, o mo- dulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado ao indivíduo tanto antes e após o início dos sintomas do distúrbio autoimune. O modulador de receptor 1-fosfato de esfingo- sina pode ser administrado por meio de qualquer rota conhecida por aqueles usualmente versados na técnica. Em certas modalidades, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingo- sina é administrado de modo oral ou por injeção. Para administração oral, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser provido em qualquer composição farmacêutica adequada para administração oral, tal como um líquido, cápsula, ou comprimido. Para inje- ção, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser provido em qualquer com- posição farmacêutica adequada para injeção, tal como em um líquido que possa ser aplica- do por meio de uma seringa. A injeção pode ser, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, ou subcutânea.

Em certos aspectos da invenção, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado numa base diária, duas vezes ao dia, ou três vezes ao dia. Em algumas mo- dalidades, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado em torno de cada 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, ou 72 horas. Em certos aspec- tos da invenção, a dosagem diária do modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina admi- nistrada a um indivíduo humano está entre cerca de 0,1 mg a 20 mg, 0,5 mg a 10 mg, 0,5 mg a 5 mg, 1 mg a 5 mg, 1,25 mg a 5 mg, 1,5 mg a 3 mg, 0,1 mg a 1 mg, ou qualquer faia derivável contida nessas mencionadas. Em alguns aspectos da invenção, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado dia sim dia não, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, semanalmente, ou mensalmente. O profissional responsável pela administração de uma composição da presente invenção estará capacitado para de- terminar a apropriada quantidade de dosagem, rota de administração, e a freqüência de administração mediante avaliar os fatores físicos e fisiológicos do indivíduo, tal como peso corpóreo, gênero, gravidade da condição, e intervenções terapêuticas anteriores ou conco- mitantes.

É também o contemplado que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico. Por exemplo, o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina pode ser administrado em combinação com um imunossupressor (por exemplo, ciclosporin A, ciclosporin G, FK-506, ABT-281, ASM981, rapamicin, 40-0-(2-hidróxi)etil-rapamicin, corticosteróides, ciclofosfamida, azatioprina, metotrexato, leflunomida, mizoribina, micofenolato de mofetila, ou 15-deoxispergualina), a steroid (por exemplo, prednisone ou hidrocortisone), uma immunoglobulina, ou interferon tipo 1. O modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina e o segundo agente podem ser administrados simultaneamente ou consecutivamente. Onde o modulador de receptor 1- fosfato de esfingosina e o segundo agente são administrados simultaneamente, eles podem ser formulados como uma composição única ou em composições separadas. É contemplado que qualquer método ou composição descritos aqui podem ser im-

plementados com respeito a qualquer outro método ou composição descritos aqui.

O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado aqui para significar" e/ou" a menos que explicitamente indicado referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente excludentes, embora a revelação suporte uma definição que se refira a alternativas únicas e "e/ou."

No transcurso desse pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro do dispositivo ou do método que está sendo empregado para determinar o valor.

Segundo a lei patentária antiga, as palavras "um" e "uma", quando usadas em conjunto com a palavra "compreendendo" as reivindicações ou especificações denotam um ou mais, a menos que especificamente indicado.

Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evi- dentes a partir da descrição detalhada apresentada adiante. Deve ser entendido, todavia, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades espe- cíficas da invenção, são dados a título de ilustração apenas, uma vez que diversas altera- ções e modificações inseridas no espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes por aqueles usualmente versados na técnica a partir dessa descrição detalhada. Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos apresentados a seguir fazem parte da presente especificação e estão inclusos para adicionalmente demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida mediante referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.

FIG. 1. Estruturas químicas de FTY720 e compostos correlatos. A FIG. 1 proporciona as estruturas químicas da esfingosina, 1-fosfato de esfingosina, FTY720, FTY720-P, AAL(R)1 AFD(R)1 e SEW2871.

FIG. 2. Potenciais de ação do composto na musculatura (CMAPs). A FIG. 2 proporciona exemplos de CMAPs a partir da estimulação do nervo ciático em ratos NOD B7- 2~'~ tipo selvagem.

FIG. 3. Preparações de fibra orientada a partir de nervos ciáticos. Preparações de fibra orientadas apresentaram desmielinação segmentai e internodos encurtados com espessura irregulares de capas de mielina nos ratos NOD B7-2"'" como comparado com ratos NOD tipo selvagem. Os nós de Ranvier estão indicados com as setas.

FIG. 4. Acumulação de ceramida citocina-induzida em células de Schwann (SCs). TNF-α e IFN-γ atuaram sinergicamente para reduzir a viabilidade celular através da indução NOS e acumulação ceramida em SCs imortalizadas. A FIG. 4 mostra os níveis de ceramida como uma porcentagem dos controles nas SCs induzidas com TNF-σ (100 g/ml) + IFN-γ (200 U/ml), L-NAME (inibidor NOS), ou TNF-σ (100 g/ml) + IFN-γ (200 U/ml) + L-NAME. A indução citocina foi por 24 horas. O asterisco (*) indica p<0.0001.

FIGs. 5A e 5B. Efeito de FTY720 em pontuações clínicas e força de agarramento de rato NOD deficiente em ratos NOD deficientes em B7-2. Os animais foram divididos em 3 grupos: (1) água (n = 11); (2) FTY720 a 0,3 mg/kg (n = 5); e (3) FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 10). O tratamento diário foi iniciado aos 7 meses de idade e continuou por 4 semanas. A Figura 5A mostra as pontuações clínicas para ratos NOD deficiente em B7-2 aos 7 meses (pré-tratamento) e 8 meses (pós-tratamento) para ratos administrados com veículo (água), FTY720 a 0,3 mg/kg, ou FTY720 a 1,0 mg/kg. O asterisco (*) indica ρ <0,0007. Em contraste, as pontuações clínicas dos ratos tratados com FTY720 (1 mg /kg) não ficaram piores. Ao final do tratamento de 4 semanas, a força de agarramento das patas traseiras e patas dianteiras foi medida com um medidor de força de agarramento (Columbus Instruments). A Figura 5B mostra os resultados das medidas da força de agarramento das patas dianteiras e das patas traseiras para ratos administrados com veículo (água), FTY720 a 0,3 mg/kg, ou FTY720 a 1,0 mg/kg. O asterisco (*) indica ρ <0,01. As barras de erro representam SEM.

FIGs. 6A e 6B. Efeito de FTY720 sobre a latência distai, velocidade de condução, e amplitude dos al latency, conduction velocity, e amplitude dos potenciais da ação muscular do composto em ciático em ratos NOD deficientes em B7-2. Estudos eletrofisiológicos foram realizados para avaliar a função do nervo ciático em ratos tratados com FTY720 a 1,0 mg/kg ou com veículo (água). Latência distai (DL), velocidade de condução (CV), e potenciais da ação muscular do composto em ciático (CMAPs) foram avaliados. Essa Figura ilustra que ratos tratados com FTY720 a 1,0 mg/kg demonstrou aprimorada DL e CV como comparado a rato tratado por veículo, mas não demonstraram aprimorada amplitude de CMAPs ciáticos. A Figura 6A mostra exemplos de CMAPs ciáticos. A FIG. 6B mostra um sumário dos dados coletados a partir de 12 nervos de ratos tratados com veículo e 14 nervos de ratos tratados com FTY720 a 1,0 mg/kg. O asterisco (*) indica ρ <0,02; duplo asterisco (**) indica ρ <0,01. FIG. 7. Efeito de FTY720 sobre infiltração de células inflamatórias em seções de

nervo ciático de ratos NOD deficientes em B7-2. A avaliação histológica foi realizada em ratos NOD deficientes em B7-2 tratados com veículo (água, η = 6) ou com FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 7). A infiltração de células inflamatórias foi medida através de um método quantitativo e através de um método semi-quantitativo. Essa Figura demonstra que a infiltração de células inflamatórias foi reduzida em seções de nervos ciáticos provenientes de ratos tratados com FTY720 como comparado com aqueles ratos tratados com veículo. O asterisco (*) indica ρ < 0,02. O duplo asterisco (**) indica ρ < 0,003.

FIG. 8. Efeito de FTY720 sobre a desmielinação e perda de fibras mielinizadas em ratos NOD deficientes em B7-2. Seções epon provenientes de ratos NOD deficientes em B7- 2 tratados com veículo (água, η = 6) ou com FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 7) foram analisados. A perda das fibras mielinizadas foi medida através de um was measured by a método quantitativo, e a desmielinação foi medida através de um método semi-quantitativo. Essa Figura demonstra que a desmielinação e as perdas de fibras mielinizadas foram atenuadas em ratos tratados com FTY720 como comparado a rato tratado com veículo. O asterisco (*) indica ρ < 0,015.

Descrição das Modalidades Ilustrativas

A. Patogênese Da Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica

A Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP) é uma doença inflama- tória do sistema nervoso periférico (PNS). O transcurso da enfermidade pode ser recidivante ou progressivo, e é caracterizado pela presença de desmielinação focai, variados graus de perda axonal, e patofiologia imuno-mediada. Infiltrados inflamatórios nos nervos da CIDP consistem primariamente de células-T e macrófagos, sugerindo que a reação mediada por célula-T no sentido de antígenos mielina é uma provável causa dos danos teciduais na CIDP. Todavia, os alvos antigênicos das respostas anormais de célula-T permanecem não identificados. Terapias disponíveis para a CIDP, incluem corticosteróides tal como predniso- na, que pode ser usado sozinho ou em composição bom drogas imunossupressoras; plas- maferese e imunoglobulina intravenosa. A fisioterapia pode melhorar a força, função, e mo- bilidade muscular, e minimizar a contração dos músculos e tendões e distorções das juntas.

A completa ativação das células-T requer sinalização por meio de moléculas co- estimulatórias, B7-1 e B7-2, em adição à sinalização antígeno-específica por meio de recep- tores de célula-T. A apresentação do antígeno em presença de B7-1 induz a diferenciação de células-T a um fenótipo Th1 com expressão de interleucina-2, IFN-γ, e TNF-σ, enquanto que a apresentação em associação com B7-2 induz um fenótipo Th2 com expressão pre- dominante de IL-4 (Karandikar et al., 1998; Kuchroo et al., 1995). Consistente com o concei- to acima, existe uma supra-regulação preferencial de B7-1 em nervos da CIDP (Kiefer et al., 2000). Estudos em ratos CD28 nocauteados revelam que CD28 é requerido para o desen- volvimento da neurite alérgica experimental (ΕΑΝ), um modelo animal para a Síndrome de Guillain-Barré (GBS) (Zhu et al., 2001b). Em ratos NOD, o diabetes pode ser prevenido me- diante tratamento com anticorpo anti-B7-2 ou pela eliminação da expressão B7-2, porém essas manipulações disparam uma polineuropatia autoimune espontânea (SAP), que imita clinicamente, histologicamente, e eletrofisiologicamente a CIDP (Salomon et al., 2001). O curso progressivo nesse modelo é distinto daquele na ΕΑΝ, que é usualmente monofásica com recuperação espontânea com somente umas poucas exceções. Na ΕΑΝ, os animais são imunizados com mielina periférica ou proteínas mielina purificadas tal como P0, P2, PMP22, ou MAG (Constantinescu et al., 1996; Kim et al., 1994; Stoll et al., 1993; Zhu et al., 2001b).

Linfócitos ativados migram através da barreira nervosa do sangue (BNB), que de-

pende da interação entre moléculas nos linfócitos e moléculas de adesão nas células endo- teliais. Uma vez exista ampla infiltração mononuclear, o dano ao nervo periférico e a des- mielinação podem ocorrer através de mecanismos múltiplos. À parte de elaborar compostos citotóxicos e citocinas tal como TNF-α, os macrófagos podem penetrar aparentemente intac- tos nas capas de mielina e mielina nua proveniente da superfície axonal (Prineas e McLeod1 1976). Citocinas Th1 tal como TNF-σ e IFN-γ atuam sinergicamente para reduzir a viabilida- de das células de Schwann (SC) por meio da indução iNOS e acumulação ceramida (Naga- no et al., 2001). Outros descobriram que essas citocinas inibem a proliferação SC e sub- regulam a expressão da glicoproteína mielino-associada (Chandross et al., 1996; Schneider- Schaulies etal., 1991).

As células de Schwann desempenham um papel multifuncional nas neuropatias in- flamatórias, atuando como células que apresentam antígenos, alvos de imuno-ataque, bem como uma fonte de fatores neutrotróficos. Essas células expressam receptores S1P2 e S1P3; o último é supra-regulado por meio de um ativador adenilato ciclase forskolin (Ber- mingham et al., 2001; Weiner et al., 2001). Agentes que elevam a cAMP são protetores con- tra a EAN e reduzem a suscetibilidade das SCs à morte celular induzida por citocina (Kim et al., 1994; Nagano et al., 2001). O efeito protetor de cAMP pode ser mediado em parte pela regulação da expressão de receptores S1P sobre as SCs1 e a sinalização esfingolipídio po- de desempenhar um papel importante na sobrevivência d diferenciação das SCs. Fatores que levam à terminação versus persistência da imuno-resposta não estão totalmente com- preendidos. células de Schwann que expressam-FasL podem contribuir para a eliminação das células-T autorreativas (Wohlleben et al., 2000). A remissão está geralmente associada com a aumentada produção de IL-4, IL-10 e TGF-/?.

B. Sinalização Esfingolipídios em Células Linfócitos e Gliais

Em muitos tipos de células, fatores de crescimento e citocinas têm mostrado modu- lar a atividade de enzimas envolvidas no controle do assim chamado ceramida/S1P, um de- terminante crítico da resposta celular (Cuvillier et al., 1996; Spiegel e Milstien, 2003). Citoci- nas pró-inflamatórias tal como TNF-σ e interleucina-1 ativam a esfingomielinase, mas não a ceramidase, resultando na acumulação de ceramida, enquanto que PDGF e FGF supra- regula a ceramidase adicionalmente a esfingomielinase, levando a uma redução na cerami- da e aumento na esfingosina, que pode então ser convertida a 1-fosfato de esfingosina (S1P) (Coroneos et ai, 1995).

Plaquetas, monócitos, e células mastóides ativacas são conhecidas secretarem S1P, resultando em concentrações de até μΜ no plasma (Murata et al., 2000; Spiegel e Milstien, 1995). Portanto, S1P pode potencialmente funcionar ou como um mensageiro in- tracelular ou como um ligando extracelular para receptores acoplados a proteína-G S1P1- S1P5 (anteriormente chamados Edg1, Edg5, Edg3, Edg6, e Edg8, respectivamente). Recep- tores S1P são acoplados a uma variedade de proteínas G. Por exemplo, S1P1 se acopla a Gi/o e a outros membros da família Gi mas não Gs, Gq, G12 ou G13. A ativação de S1P1 estimula a fosforilação de proteína quinase mitogênio-ativada (MAPK), inibe adenilato cicla- se, e ativa a fosfolipase C levando a uma resposta proliferativa ou migratória (Windh et al., 1999; Zondag et al., 1998). Nas células endoteliais, onde os genes de S1P1 e S1P3 foram primeiramente identificados, S1P estimula a síntese de DNA e a migração celular e promove a integridade da barreira endotelial (Liu et al., 2001; Schaphorst et al., 2003). Os receptores S1P são expressos por muitos tipos de células, mas os subtipos predominantes do receptor diferem de um tipo de célula para outro embora com alguma sobreposição. Dos receptores S1P expressos por linfócitos T, os receptores S1P1 e S1P4 predo-

minam, mas a expressão deles é suprimida pela atividade TCR-dependente. S1P em baixas concentrações μΜ) elicia a quimiotaxia de células-T, embora altas concentrações se- jam inibitórias (Graeler et al., 2002). Estudos iniciais em transfectantes revelaram que o re- ceptor S1P1 é o transdutor da quimiotaxia S1P-induzida, mas estudos subsequentes revela- ram que a superexpressão de S1P4 em células-T Jurkat é suficiente para induzir a motilida- de celular em ausência de S1P exógeno (Graler et al., 2003). Estudos in vitro revelam que S1P inibe a proliferação de células-T policlonais, mas não existe consenso com respeito a seu efeito sobre a segregação de IL-2 e IFN-γ por células-T humanas embora ele reduza a segregação de IFN-γ e IL-4 por meio das células-T CD4+ de ratos sem influenciar a IL-2 (Dorsam et al., 2003; Jin et al., 2003). Além dos linfócitos, as células macrófagas e dendríti- cas de ratos também expressam receptores S1P (S1P1, S1P2, S1P3 e S1P5). O tratamento de células dendríticas maduras com S1P está associado com a emergência de uma imuno- resposta de Th2 (Idzko et al., 2002; Lee et al., 2002). Portanto a resposta líquida da ação de S1P sobre a polarização de uma imuno-resposta (Th1 vs Th2) in vivo permanece a ser es- clarecida.

Receptores S1P são expressos em células gliais. Foi também mostrado que S1P exógeno ativa a cascata ERK e modula sinais Ca2+ em oligodendrócitos (OLGs) (Hida et al., 1998). S1P induz a expressão de fatores de crescimento tal como fator neurotrófico derivado de Iinh de célula glial em astrócitos (Sato et al., 1999; Yamagata et al., 2003). As células da linhagem OLG expressam predominantemente S1P1, S1P5, e possivelmente SP2, enquanto que as células de Schwann expressam receptores S1P2 e S1P3 (Bermingham et al., 2001; Im et al., 2000; McGiffert e Chun1 2002; Terai et al., 2003; Weiner et al., 2001). Ácido lisofosfatídico, que atuam sobre outros receptores Edg receptors, mostraram promover a sobrevivência e a diferenciação de SCs bem como regulam sua morfologia e adesao (Li et al., 2003; Weiner et al., 2001).

C. Moduladores de Receptores 1-fosfato de esfingosina Receptores de 1-fosfato de esfingosina (S1P) estão implicados na regulação da

traficação do linfócito. Receptores S1P estão expressos em diversas tipos de células envolvidos na patogenese de doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico tal como células gliais, macrófagos, células endoteliais, e células de Schwann. A presente invenção proporciona métodos para tratar doenças inflamatórias, tal como doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico, mediante modular a atividade do receptor de S1P em pacientes.

FTY720 (2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3-propanediol) é um agente imunomodulatório que tem se mostrado ser eficaz em modelos transplante. Ele atua mediante seqüestrar linfócitos em órgãos linfóides com a concomitante Iinfopenia sangüínea periférica e uma redução na migracao de células-T aos tecidos alvos (Chiba et al., 1998; Pinschewer et al., 2000; Xie et al., 2003). FTY720 compartilha similaridade estrutural com esfingosina, o que sugere que ele atua por meio de receptores S1P (Brinkmann et al., 2002; Suzuki et al., 1996). Embora FTY720 propriamente seja desprovido propriamente de atividade quimiotática de células-T, sua forma fosforilada (FTY720-P) é um potente agonista de receptores S1P com a exceção de S1P2, como detectado pelo ensaio de ligação [γ35- S]GTPyS em células transfectadas expressando receptores S1P individuais (Brinkmann et al., 2002; Mandala et al., 2002). FTY720 é convertido extensivamente a FTY720-P in vivo (Brinkmann et al., 2002). A sub-regulação ou inativação da expressão de S1P1 por FTY720 ou sua forma fosforilada proporciona uma explicação para o seqüestro do linfócito, similar àquela observada em ratos nulos de S1P1 (Matloubian et al., 2004). Um outro modelo proposto é que FTY720 bloqueia a saída do linfócito por meio da atividade agonista S1P1 (Brinkmann et al., 2002; Mandala et ai., 2002). Em concentrações >3 //M1 FTY720 elicia a apoptose do linfócito (Matsuda et al., 1998; Oyama et al., 1998). FTY720 tem se mostrado ser eficaz em encefalomielite alérgica experimental (EAE) quando o tratamento é iniciado no dia da imunização com cordão espinhal bovino ou MBP (Brinkmann et al., 2002; Fujino et al., 2003). FTY720 está atualmente sendo avaliado para o tratamento da esclerose múltipla (MS)1 um distúrbio inflamatório e neurodegenerativo do sistema nervoso central (CNS) ("FTY720, uma nova medicação oral de aplicação uma vez ao dia, apresenta resultados promissores no tratamento da esclerose múltipla", Novartis Media Release, [online] recuperado a partir da rede mundial em

novartispharma.at/download/presse/international/FTY720%20-%20ENGLISH%20- %20FINAL.pdf. Accessado em 28 d junho de 2006). Todavia, uma resposta bem sucedida em um distúrbio do CNS nem sempre se traduz na forma de um resultado bem sucedido em um distúrbio do PNS. Por exemplo, o interferon-β (IFN-β) é eficaz em reduzir a freqüência de ataque de MS, mas seu posicionamento no tratamento da CIDP e outras neuropatias inflamatórias permanece controverso. Melhoras de pacientes com CIDP que receberam IFN- β foi reportado em 2 de 4 estudos (Choudhary et al., 1995; Vallat et al., 2003; Kuntzer et al., 1999; Hadden et al., 1999).

AAL(R) é um análogo metílico quiral de FTY720 e AFD(R) é um éster fosfato de FTY720 (Kiuchi et al., 2000). AFD(R) atua como um atua como um agonista em quatro receptores S1P (S1P1, S1P3, S1P4, e S1P5) (Brinkmann et al., 2002). Recently, AAL(R) demonstrou induzir uma rápida alteracao fenotípica em timocitos medulares resultando na sub-regulação de CD69 no intervalo de 2 horas (Rosen et al., 2003). SEW2871 atua como um agonista S1P1. Esses resultados indicam que FTY720 e compostos correlatos exercem ações pleiotrópicas no sistema imuno. As estruturas da esfingosina, 1-fosfato de esfingosina, FTY720, FTY720-P, AAL(R), AFD(R), e SEW2871 são providas na Figura 1. D. Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade e ficaz de um ou mais moduladores da atividade do receptor S1P dissolvidos ou disperso em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases "farmacêutico ou farmaceuticamente aceitável" se refere a entidades e composições moleculares que não produzam uma reação adversa, alérgica ou indesejada quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um humano, como apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um modulador da atividade do receptor S1P será conhecido para aqueles usualmente versados na técnica à luz da presente revelação, e como exemplificado em "Remington: The Science e Practice of Pharmacy," 21 st Edition, 2005, incorporated aqui by reference. Além disso, para a administração em humanos, será entendido que as preparações devem satisfazer os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza como requerido pelas Normas do FDA de Padrões Biológicos.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meio de dispersão, antioxidantes, sais, revestimentos, tensoativos, conservantes (por exemplo, p-hidroxibenzoado de metila ou de propila, ácido sórbico, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes retardadores de solução (por exemplo parafina), absorventes (por exemplo argila caulim, argila bentonita), estabilizantes de fármacos (por exemplo Iauril sulfato de sódio), géis, aglutinantes (por exemplo xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidinona, carboxi-metil- celulose, alginatos), excipientes (por exemplo lactose, açúcar do leite, polietileno glicol), agentes desintegrantes (por exemplo agar-agar, amido, lactose, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, ácido algínico, sorbitol, glicina), agentes umectantes (por exemplo álcool cetílico, monoestearato de glicerol), lubrificantes, aceleradores de absorção (por exemplo sais de amônio quaternário), óleos comestíveis (por exemplo óleo de amêndoas, óleo de coco, ésteres oleosos ou propileno glicol), agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, cargas, (por exemplo amido, lactose, sacarose, glicose, manitol, ácido salicílico), lubrificantes de tabletagem (por exemplo estearato de magnésio, amido, glicose, lactose, farinha de arroz, giz), veículos para inalação (por exemplo propelentes de base hidrocarboneto), ats de tamponamento, ou materiais do tipo e combinações desses mencionados, como será conhecido por aqueles usualmente versados na técnica (ver, por exemplo, "Remington: The Science e Practice of Pharmacy," 21 st Edition, 2005). Exceto, na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso na terapêutica ou composições farmacêuticas é contemplado.

Em qualquer caso, a composição pode compreender diversos antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Exemplos de antioxidantes incluem ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, sulfito de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, palmitato de ascorbila, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, lecitina, gaiato de propila, e tocoferol. Adicionalmente, a prevenção da ação de microorganismos pode ser produzida pelos conservantes tal como diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, que incluem, mas não estão limitados a, parabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou combinações desses mencionados.

Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteinácea ou que sejam formados com ácidos inorgânicos tal como, por exemplo, ácido clorídrico, bromídrico, ou fosfórico; ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico, benzóico, lático, fosfônico, cítrico, maleico, fumárico, succínico, napsílico, clavulânico, esteárico, ou mandélico. Sais formados com os grupos carboxílicos livres podem ser também derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidroxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, magnésio ou férrico; ou bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína.

Em modalidades onde a composição está numa forma líquida, um veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão compreendendo, mas não limitado a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, etc.), Iipidios {por exemplo, triglicerídeos, óleos vegetais, lipossomas) e combinações desses mencionados. A apropria- da fluidez pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento, tal como lecitina; mediante a manutenção do requerido tamanho de partícula pela dispersão nos veí- culos tal como, por exemplo, poliol ou lipídios líquidos; mediante o uso de tensoativos tal como, por exemplo, hidroxipropilcelulose; ou combinações desses mencionados em tais métodos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tal como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio ou combinações desses mencionados.

A presente invenção pode ser administrada mediante qualquer método adequado conhecido por aqueles usualmente versados na técnica (ver, por exemplo, "Remington: The Science e Practice of Pharmacy," 21 st Edition, 2005). Rotas de administração da composição farmacêutica incluem, por exemplo, oral, intradérmica, subcutânea, topical, por injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada, banho das células alvo diretamente, por meio de um cateter, ou por uma combinação dos mencionados.

Os moduladores da atividade do receptor S1P quando administrados de modo oral podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, saches, pequenos frascos, pós, grânulos, pastilhas, pós para reconstituição, ou preparações líquidas. Soluções estéreis injetáveis são preparadas mediante incorporar os compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com diversos dos outros ingredientes acima, como requerido, seguido por esteri- lização por filtragem. No geral, as dispersões são preparadas mediante incorporar os diver- sos ingredientes ativos esterilizados dentro de um veículo estéril que contenha o meio bási- co de dispersão e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções, suspensões ou emulsões estéreis injetáveis, os métodos preferidos da preparação são por secagem em vácuo ou técnicas de secagem por congelamento que produzam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um seu meio líquido previamente esterilizado por filtragem. O meio líquido se necessário deverá estar adequadamente tamponado e o diluente líquido primeiramente tornado isotônico antes da injeção com suficiente salino ou glicose. A preparação de composições altamente con- centradas para a injeção direta é também contemplada, onde o uso de DMSO como um sol- vente é vislumbrado para resultar numa penetração extremamente rápida, entregando altas concentrações dos agentes ativos a uma pequena área.

A quantidade real de dosagem de uma composição da presente invenção adminis- trada a um paciente pode ser determinada através de fatores físicos e fisiológicos tal como peso corporal, gênero, gravidade da condição, do tipo de doença que está sendo tratado, das intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, idiopatia do paciente, tempo de administração, taxa de excreção do composto particular, e da rota de administração. O pro- fissional responsável pela administração irá, em qualquer eventualidade, determinar a con- centração do(s) ingrediente ativo(s) numa composição e a(s) dose() apropriada para o indi- víduo.

Em modalidades particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser obtida através do uso de agentes retardadores de absorção nas composições, tal como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina, ou combinações desses mencio- nados.

E. EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são inclusos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deverá ser notado por aqueles usualmente versados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que são apresentados a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores para bem funcionar na prática da invenção, e desse modo podem ser con- sideradas constituir modos preferidos para a sua prática. Todavia, aqueles usualmente ver- sados na técnica, à luz da presente revelação, podem perceber que muitas alterações po- dem ser feitas nas modalidades específicas as quais são reveladas e ainda obter resultados iguais ou similares sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1

Polineuropatia autoimune espontânea (SAP em ratos NOD deficientes em B7.2

No transcurso de um esforço para avaliar o papel de sinais co-estimulatórios em ra- tos NOD, foi descoberto que a eliminação da expressão de B7-2 impediu o desenvolvimento da hiperglicemia nesses ratos. Todavia, esses ratos desenvolveram paresia nas patas tra- seiras começando em 24 semanas de idade (Salomon et ai, 2001). Estudos da condução nervosa realizados em nervos ciáticos in vivo revelaram um prolongamento das latências distais, freando notadamente as velocidades de condução, e a dispersão dos potenciais de ação muscular do composto (CMAPs), como mostrado na Figura 2. A latência motora distai foi de 1,1 ±0,1 ms (n=8) em peso do NOD e 2,7 ±0,4 ms em ratos NOD B7.2"'" (p <0.005). A velocidade de condução foi de 50,5 ± 3,8 m/s em peso de NOD, e 17,9 ± 3,2 m/s em ratos NOD B7.2"/_ (p <0.00001). A amplitude de CMAP foi de 10,8 + 1,5 mV em peso de NOD e 3,0 ± 0,6 mV em ratos NOD B7.2"'" (p <0.005). Bloqueio parcial da condução, definido como declínio 30% na amplitude com estimulação proximal versus distai, foi observado em alguns, mas não em todos os animais, provavelmente relacionado ao número limitado de nervos estudados. Essas descobertas eletrofisiológicas são clássicas para um processo desmielini- zante com perdas axonais sobrepostas.

A avaliação histológica revelou a presença de infiltrados inflamatórios na espinha

dorsal (DRG) e nervos ciáticos, mas não no CNS de ratos NOD B7-2~'\ Houve uma perda significativa de axônios de grande diâmetro e evidência de fibras mielinizadas adelgaçadas nas seções do nervo ciático. A preparação de fibras orientadas apresentaram desmielinação segmentai e encurtados internodos com espessuras irregulares da capa mielina consisten- tes com o reparo mielina em andamento (FIG. 3). Essa alguma remielinação ocorre apon- tando para o potencial de reversibilidade do processo. A polineuropatia autoimune espontâ- nea (SAP) foi induzida em ratos NOD-SCID através de células-T CD4+ T isoladas de ani- mais infectados, mas não em estudos de transferência passiva usando soro proveniente de animais infectados. Esses estudos demonstram que ratos NOD deficientes em B7-2 consti- tuem o primeiro modelo de uma neuropatia autoimune espontânea que se parece à doença humana CIDP; e que indivíduos com tendências autoimune possuem uma disfunção que pode se manifestar como entidades distintas de doença dependendo do meio co- estimulatório.

Exemplo 2

Efeito Sinérgico das citocinas pro-inflamatórias nas co-culturas de SCs e gânglios

da espinha dorsal (DRG)

TNF-α e IFN-γ (marcadas como citocinas) atuaram sinergicamente para reduzir a viabilidade celular por meio da indução NOS e acumulação de ceramida em SCs imortaliza- das (FIG. 4) (Nagano et ai, 2001). Nenhuma das citocinas sozinhas induziu a morte da célu- Ia. Essas citocinas também exerceram uma ação inibitória sinérgica na mielinação em co- culturas neonatais de DRG-SC1 que é evidente após 3 dias de tratamento. Não foi observa- do efeito de mielinação com IFN-γ a 50-300 U/mL ou baixas concentrações de TNF-a (10 ng/mL), embora uma modesta ação inibitória fosse observada a 100 ng/mL de TNF-α. A morte da célula cotocina-induzida afetando as SCs e neurônios foi observada em co-culturas tratadas por 7 dias.

Exemplo 3

Efeito de FTY720 sobre a gravidade da SAP em ratos NOD deficientes em B7-2 FTY720 se mostrou inibir a emigração de linfócitos provenientes de órgãos linfói- des, sua forma fosforilada tem se mostrado ser um potente agonista em quatro receptores S1P (Brinkmann et ai., 2002; Graler e Goetzl1 2004; Matloubian et ai, 2004). Estudos recen- tes sugerem que o efeito dessas drogas in vivo pode ser devido à sub-regulação dos recep- tores S1P by FTY720 ou de sua forma fosforilada (Brinkmann et ai., 2002; Graler e Goetzl1 2004; Matloubian et al., 2004). A conseqüência principal desses agentes é o seqüestro do linfócito nos orgaos linfóides secundários, embora a apoptose fosse observada em concen- trações maiores (Brinkmann et al., 2002; Mandala et ai, 2002; Nagahara et ai, 2000). A administração oral de FTY720 impede a EAE quando dada no momento da imunização (Brinkmann et ai, 2002; Fujino et al., 2003). Todavia, não ficou previamente claro se FTY720 ou seu análogo quiral AAL(R) pudesse ser eficaz quando administrado após o início da doença.

Dada à sua semelhança a CIDP, os ratos NOD deficientes de B7-2 oferecem uma oportunidade única para estudar agentes que possam interromper o progresso da doença ou melhorar a recuperação em neuropatias autoimunes. Nesse modelo de neuropatia auto- imune espontânea, o início dos sintomas ocorreu entre 24 e 28 semanas. Deixados sem tratamento, os ratos irão deteriorar até o ponto da tetraparesia por volta de 32 semanas.

Ratos NOD fêmeas deficientes em B7-2 foram usados uma vez que eles são mais tendentes a desenvolver SAP que as suas contrapartes macho (Salomon et al., supra). Os ratos tinham 7 meses de idade no início do estudo. Aos animais foram dados FTY720 (solu- ção aquosa) em doses de 0,3 mg/kg ou 1 mg/kg ou veículo sozinho através de ingestão oral forçada uma vez ao dia durante 1 mês. As concentrações foram escolhidas com base nos estudos dose-resposta com respeito ao esvaziamento de linfócitos periféricos, e dados pro- venientes dos estudos de EAE em ratos (Brinkmann et al., 2002; Fujino et al., 2003). Para determinar o efeito de FTY720 nas pontuações clínicas e força de agarramen-

to de ratos NOD deficientes em B7-2, ambas as avaliações qualitativa e quantitativa foram realizadas através de pessoal de laboratório em modo cego. Para a avaliação qualitativa, uma escala nominal (com 0 como normal, e 5 como morte) descrita por outros investigado- res (Zhu et al., 2001a) foi usada. Para a avaliação quantitativa, a força de agarramento nas patas traseiras e patas dianteiras foi medida com um medidor de força de agarramento (Co- Iumbus Instruments). Os animais tratados por 1 mês com 1 mg/kg FTY720 (n=10) apresenta- ram menor fraqueza qualitativamente e quantitativamente maior força de agarramento quando comparado aos animais tratados por veículo (n=11) ou animais tratados com so- mente 0,3 mg/kg FTY720 (n=5) (FIGs. 5A e 5B). A diferença na pontuação clínica entre ra- tos tratados com água a 7 meses e a 8 meses foi estatisticamente significativa, com um va- lor ρ de menos de 0,0007 (FIG. 5a). Do mesmo modo, a diferença na pontuação clínica en- tre ratos tratados com 0,3 mg/kg FTY720 a 7 meses e a 8 meses foi estatisticamente signifi- cativa, com um valor ρ de menos de 0,03. Em contraste aos ratos tratados com veículo e ratos tratados com 0,3 mg/kg FTY720, as pontuações clínicas de ratos tratados com 1,0 mg/kg FTY720 não aumentaram entre o mês 7 e mês 8. Resultados similares foram obtidos quando a força de agarramento das patas dianteiras e das patas traseiras foi avaliada quan- titativamente. Os ratos tratados com 1,0 mg/kg FTY720 apresentaram aumentada força de 10

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agarramento como comparado a ratos tratados com veículo ou com 0,3 mg/kg FTY720 (FIG. 5B). Esses resultados indicam que FTY720 pode ser benéfico mesmo quando dado após o início dos sintomas.

A eficácia de FTY720 foi também monitorada através da indução de Iinfopenia do sangue periférico. A contagem de linfócitos do sangue periférico foi reduzida para 50-60% daqueles tratados por veículo por FTY720 (0,3 mg/kg) (n=4) e para 25-30% por FTY720 (1 mg/kg) (n=3).

Estudos eletrofisiológicos foram realizados para avaliar o efeito de FTY720 sobre a função do nervo ciático in vivo em um subconjunto dos animais de estudo. Os ratos tratados com 1,0 mg/kg FTY720 demonstraram melhorada latência distai (DL) e velocidade de con- dução (CV) como comparado aos ratos tratados por água, mas não demonstraram melhora- da amplitude dos potenciais da ação muscular do composto em ciático (CMAPs) (Tabela 1). A Figura 6 do mesmo modo ilustra que o tratamento por FTY720 melhora a DL e CV (FIG. 6B, apresenta um resumo dos resultados provenientes dos experimentos realizados sobre 12 nervos de 6 ratos tratados com água e 14 nervos de 7 ratos tratados com FTY720) mas não a amplitude dos CMAPs em ciático (FIG. 6A).

Tabela 1

Veículo FTY720 (1 mg/kg) (* p<0,02; **p<0,01) Latência distai (ms) 2,59 ±0,3 1,58 ±0,3* Velocidade de condução (m/s) 14,7 ±3,0 22,8 ± 3,2** Amplitude (mV) 3,75 ± 1,8 3,8 ±0,7

Para avaliar ainda mais o efeito de FTY720 em ratos NOD deficientes em B7-2, a avaliação histológica foi realizada para avaliar a infiltração de células inflamatórias. Usando um ou outro do método quantitativo ou semi-quantitativo, os ratos tratados com 1,0 mg/kg FTY720 (n=7) apresentaram reduzida infiltração de células inflamatórias como comparado a ratos tratados com água (n=6) (FIG. 7). Essas diferenças observadas foram estatisticamente significativa com um valor ρ de menos de 0.02 quando comparando ratos tratados com água to ratos tratados com FTY720 usando o método quantitativo e um valor ρ de menos de 0.003 quando fazendo a comparação usando o método semi-quantitativo. Para o método quantitativo, áreas de tecido foram medidas através da análise por imagem do número de células inflamatórias contadas numa ampliação de x20. Foram tiradas as médias dos resul- tados e expressos como células por mm2 da seção de tecido. Para o método semi- quantitativo, a inflamação foi classificada como: 1, pouco espalhamento de células inflama- tórias mononucleares freqüentemente subperineural; 2, oclusão perivascular com células inflamatórias mononucleares (um ou dois focos); 3, oclusão multifocal perivascular extensiva e amplo espalhamento endoneurial da inflamação.

O tratamento com FTY720 também preveniu a desmielinação eperda das fibras mi- elinizadas. Seções epon foram preparadas com ratos tratados com veículo (n=6) e ratos tratados com 1,0 mg/kg FTY720 (n=7). Os ratos tratados com FTY720 apresentaram um decréscimo na porcentagem de fibras mielinizadas perdidas e um aumento na desmielina- ção (FIG. 8). Essas diferenças foram estatisticamente diferentes com um valor ρ de menos de 0,015. A porcentagem de perda de fibras mielinizadas em seções epon foi avaliada atra- vés de observação em cego usando uma grade de classificação. A desmielinação foi classi- ficada como a seguir: 1, axônios desmielinizados isolados perivasculares ou espalhados; 2, muitos focos de desmielinação perivascular; 3, desmielinação extensiva, perivascular e con- fluente.

Exemplo 4

Investigação do Efeito de FTY720 sobre a Permeabilidade da Barreira nervosa do

sangue

Experimentos adicionais irão determinar se o FTY720 e compostos correlatos, tal como o agonista S1P1 SEW2871, podem atenuar a ruptura da barreira nervosa do sangue (BNB) quando dado após o início da doença. Para investigar o efeito de FTY720 sobre a permeabilidade da BNB, Evans blue (EBA) é injetado de modo intravenoso aos ratos NOD deficientes em B7-2, 1 hora antes do sacrifício. Os ratos tratados com veículo são compara- dos aos ratos no dia 1 do tratamento com FTY720 e no dia 3 do tratamento com FTY720. Imagens de mesmo foco de EBA com imageamento por DIC das seções longitudinais do nervo ciático são tomadas usando condições similares (por exemplo, mesmas lentes, ener- gia do laser, tamanho do orifício, etc.). Se o vazamento de EBA nos tecidos é atenuado por FTY720, este resultado irá indicar que o efeito terapêutico de FTY720 é mediado pelo me- nos em parte mediante pelo alívio da ruptura da BNB. Resultados negativos (isto é, sem efeito sobre a capacidade de EBA em atravessar a BNB), pode implicar que a capacidade de FTY720 para reduzir a infiltração inflamatória nas seções de nervo ciático em ratos SAP resulta de um decréscimo na migração de linfócitos para os órgãos alvo preferentemente que a ação predominante nos receptores S1P1 e /ou S1P3 que se expressa pelas células endoteliais.

Além disso, experimentos adicionais irão também determinar se, nesse modelo ra- to, a imunorreatividade dos esplenócitos no sentido de antígenos putativos é alterada por FTY720 e compostos correlatos. Os esplenócitos serão isolados a partir de ratos SAP ratos tratados com veículo, FTY720, ou compostos FTY720-relacionados. A proliferação de es- plenócitos é monitorada através da incorporação de timidina (por exemplo ensaio 3H- timidina). A produção de citocina em resposta ao peptídeo proteína PO (180-199) (10-20 μς/ιτιΙ), peptídeo proteína P2 (57-81) (10-20 μο/ιτιΙ), mielina de PNS purificada (100 μ9/ιτιΙ), e Iisato de SC (100 μς/ιηΙ) serão também avaliados. Um decréscimo na proliferação de esple- nócito e na produção de citocina pode indicar que a ativação de célula-T é diminuída em resposta a FTY720 e compostos correlatos. Esse resultado pode indicar que esses compos- tos podem atuar tanto nas fases iniciais (sensibilização) e posterior (executor) da doença.

Exemplo 5

Investigação do papel de Receptores S1P nas células de Schwann (SCs)

SCs purificadas a partir de nervos ciáticos neonatais de ratos são tratados com TNF-a (100 ng/mL) + IFN-γ (200 U/mL) por 48 a 72 h em condições livres de soro com ou sem FTY720-P (0,01-1 μΜ). As dosagens estabelecidas de TNF-α e IFN-γ estão baseadas nos estudos prévios (Nagano et ai., 2001). Para determinar se FTY720-P pode reduzir a morte das SC, o nível de apoptose celular é ensaiado em seguida ao manchamento nuclear por meio de iodeto de propídio e pelo ensaio de trypan blue. Se FTY720-P reduz a morte de SC1 métodos de siRNA são usados para determinar qual subtipo de receptor S1P media esse efeito. Essa abordagem também pode ser empregada para determinar se agonistas S1P outros que FTY720-P, tal como S1P ou SEW2871, podem inibir a morte de SC.

Na eventualidade de que FTY720-P ou outro agonista de receptor S1P inibe a mor- te das SC, experimentos adicionais são realizados para examinar o efeito de FTY720-P e de outros agonistas de receptor S1P sobre a fosforilação de ERK1/2 e Akt, os quais são molé- cuias sinalizadoras ligadas à sobrevivência e proliferação celular. Se não é observado efeito na sobrevivência, proliferação e fosforilação através dos ensaios, esse resultado pode impli- car que os receptores S1P não são cruciais para a sobrevivência, diferenciação, ou mielina- ção das SCs. Os resultados positivos provenientes dos estudos acima podem indicar que os receptores S1P podem servir como alvos potenciais para os agentes glicoprotetores. Todas as composições e métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitas

e executadas sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Embora as com- posições e métodos dessa invenção tenham sido descritos em termos das modalidades pre- feridas, será evidente por aqueles usualmente versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na seqüência das etapas dos méto- dos descritos aqui sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especifi- camente, será evidente que alguns agentes que sejam tanto quimicamente e fisiologicamen- te correlatos podem ser substitutos para os agentes descritos aqui ao mesmo tempo em que resultados similares podem ser conseguidos. Todos os tais substituintes e modificações si- milares, evidentes para aqueles usualmente versados na técnica são consideradas estarem inseridas no espírito, escopo, e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas. Referências

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Claims

1. Método de tratar um indivíduo com um distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina, de modo que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é tratado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é FTY720.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é FTY720-P.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é AAL(R).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é AFD(R).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é SEW2871.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é síndrome de Guillain-Barré (GBS), poli- neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), uma neuropatia mediada pelo anti- corpo, ou uma neuropatia vasculítica.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é polineuropatia desmielinizante inflama- tória crônica (CIDP).

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado ao indivíduo antes do início dos sintomas do distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado ao indivíduo após o início dos sintomas do distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é administrado de modo oral.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um imunos- supressor.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um corticos- teróide.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma imuno- globulina.

15. Método de aliviar um sintoma de um distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina, de modo que o sintoma do distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é aliviado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é FTY720, FTY720-P, AAL(R)1 ou AFD(R).

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é polineuropatia desmielínizante infla- matória crônica (CIDP).

18. Método de prolongar o tempo de recidiva de um distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um modulador de receptor 1-fosfato de esfin- gosina, em que o tempo para a recidiva do distúrbio autoimune do sistema nervoso periféri- co é prolongado.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o modulador de receptor 1-fosfato de esfingosina é FTY720, FTY720-P, AAL(R), ou AFD(R).

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio autoimune do sistema nervoso periférico é polineuropatia desmielínizante infla- matória crônica (CIDP).