BRPI0716207B1 - método para a identificação de plantas de milho transgênicas - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS DE MILHO TRANSGÊNICAS (51) Int.CI.: C12N 15/82 (30) Prioridade Unionista: 31/08/2006 US 60/841,519 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): JYOTI R. ROUT (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/03/2009

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS DE MILHO TRANSGÊNICAS.

Antecedentes da Invenção

Este Pedido de Patente reivindica a prioridade do Pedido de Pa5 tente Provisória U.S. N° 60/841.519, depositado em 31 de agosto de 2006, a descrição total do qual fica incorporada aqui, neste pedido de patente, por referência.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia de 10 vegetais. Especificamente, a invenção refere-se a métodos para a produção de plantas transgênicas que não requerem o uso de um gene marcador selecionável antes de ser obtida uma planta ou parte de planta regenerada.

2. Descrição da Técnica Relacionada

A transformação estável de células de plantas e a produção de 15 plantas transgênicas têm exigido tipicamente uma etapa de seleção, na qual o tecido da planta é selecionado na presença de um agente de seleção depois de ter sido posto em contato com uma ou mais seqüências exógenas de ácido nucléico, incluindo aqueles que compreendem uma seqüência ou seqüências que codifique um gene de interesse e um gene marcador. Em se20 guida a essa seleção, as plantas estáveis transformadas que compreendem um gene de interesse (GOI) podem ser regeneradas e identificadas. No entanto, na ocasião da criação de uma planta transformada que compreende um GOI, um gene mercador que pode ser selecionado ou submetido à triagem que não é ele próprio um GOI não é mais tipicamente necessário, e a presença do mesmo pode complicar as analises subseqüentes e os esforços para o desenvolvimento do produto. Além disso, a necessidade de um promotor forte para acionar um marcador selecionável tem mostrado influenciar de modo desfavorável à expressão do gene desejado (Yoo et al., 2005).

Uma ampla faixa de métodos tem sido relatada com relação à criação de plantas transgênicas isentas de gene marcador, por exemplo, cotransformação, elementos transponiveis, recombinação especificada ao sítio e recombinação entre cromossomos (como por exemplo, Darbani et al.,

Petição 870170018118, de 20/03/2017, pág. 12/25

2007). No entanto, a maioria desses sistemas são consumidores de tempo e ineficientes. Goldsburg (2001) revisou métodos pata evitar o uso de, ou para eliminar genes marcadores selecionáveis na criação de plantas transgênicas.

De Vetten et al., (2003) e a Publicação do Pedido de Patente

U.S. 2005/0097641 descrevem métodos para a transformação livre de marcador de uma plantação propagada de forma vegetativa, tal como batatas, resultando, no entanto em plantas quiméricas. Palys et al., (Publicação PCT wO 2004/081184) descreve a transformação de tomates, alface e repolho sem seleção. Francis e Spiker (2005) descrevem a identificação de linhas Arabidopsis transgênicas com a utilização de triagem com base em PCR, para impedir o desvio da seleção na integração transgênica. Em contraste, a presente invenção proporciona métodos para uma produção rápida e eficaz de plantas de milho com a linha de germe transformada obtidas através de métodos que não exigem a presença de um agente seletivo ou um gene marcador que possa ser submetido à triagem, tal como um gene marcador visual, antes de serem obtidas plantas de milho regeneradas.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para a i20 dentificação de plantas de milho transgênicas que compreende: (a) obtenção células de plantas transformadas com um segmento de DNA que compreende uma sequência do ácido nucléico de interesse; (b) regeneração uma pluralidade de plantas de milho ou partes de plantas de milho diferenciadas a partir de células sem primeiro selecionando com relação à presença do refe25 rido segmento de DNA; e (c) identificação de pelo menos uma primeira planta de milho transgênica ou uma parte diferenciada de uma planta de milho a partir de uma pluralidade de partes de plantas de milho ou de partes de plantas de milho diferenciadas. Em algumas modalidades, o segmento de DNA não compreende um gene marcador que possa ser selecionado ou um gene marcador visual. Em outras modalidades, as plantas são regeneradas através do cultivo em meio sólido, meio líquido ou uma combinação de meios sólidos e líquidos. Em modalidades específicas, as plantas são regeneradas através do cultivo somente em meio líquido em seguida ao contato das células com GOI e antes da identificação da planta de milho transgênica ou da parte de planta transgênica diferenciada. Em determinadas modalidades, a frequência de transformação das células cultivadas somente em meios líqui5 dos em seguida ao contato das células com um GOI e antes da identificação de plantas transgênicas ou das partes de plantas transgênicas diferenciadas é aumentada com relação à frequência de transformação observada quando as células são cultivadas em meios sólidos ou em solo em seguida ao contato das células com um GOI e antes da identificação das plantas transgênicas ou das partes de plantas transgênicas.

Em algumas modalidades, as células de plantas são células de embriões de milho imaturos. Em modalidades específicas os embriões imaturos de milho são a partir de cerca de 1,5 mm até cerca de 3,5 mm de comprimento, ou a partir de cerca de 1,9 mm até cerca de 2,3 mm de compri15 mento.

Em determinadas modalidades, o método também compreende, entre as etapas (b) e (c), (1) colocar uma pluralidade de plantas de milho ou de partes diferenciadas de plantas em tubos de cultura ou tampão de cultivo que compreendam um meio de cultura ou água, enquanto mantendo a iden20 tidade individual das plantas de milho; e (2) submeter as plantas ou as partes de plantas pelo menos a uma primeira análise com relação à presença do segmento de DNA para a identificação de uma ou mais plantas ou partes de planta como transgênicas com base nos resultados a partir da análise. A análise pode ainda ser selecionada a partir do grupo que consiste em hibri25 dização Southern, PCR, sequenciamento de DNA, marcação northern, marcação western, ou imunoanálise, e uma análise com relação à atividade enzimática codificada pelo segmento de DNA. Em modalidades específicas a análise é executada antes da colocação das plantas regeneradas no solo. Em outras modalidades, as plantas de milho transformadas de modo putati30 vo ou partes de plantas diferenciadas que não tenham a sequência de ácido nucleico de interesse são identificadas, em que a análise é realizada em tecido de planta que compreendem subconjuntos de ácidos nucleicos a partir da referida pluralidade de plantas de milho ou de partes de plantas diferenciadas.

Em algumas modalidades, as plantas de milho ou as partes das plantas de milho são regeneradas não mais tarde do que em 6 semanas de5 pois que o segmento de DNA é transformado em células de planta de milho. Em outras modalidades, as plantas de milho ou as partes das plantas de milho são regeneradas não mais tarde do que em 4 semanas depois que o segmento de DNA é transformado nas células de planta de milho. Em ainda outras modalidades, as plantas de milho ou as partes de plantas de milho são regeneradas não mais tarde do que em 3 semanas depois que o segmento de DNA é transformado nas células de planta de milho. Em ainda outras modalidade as plantas de milho ou as partes de plantas de milho são regeneradas não mais tarde do que em 2 semanas depois que o segmento de DNA é transformado nas células de planta de milho. Em modalidades adicionais, as plantas de milho ou as partes de plantas de milho são regeneradas não mais tarde do que em 1 semana depois que o segmento de DNA é transformado nas células de planta de milho.

Em determinadas modalidades, o segmento de DNA é introduzido dentro da célula da planta de milho através de transformação mediada por bactérias, eletroporação, transformação mediada por PEG ou bombardeio de partículas. Em modalidades específicas, a transformação mediada através de bactérias é mediada através de uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula de Agrobacterium, uma célula de Rhizobium, uma célula de Sinorhizobium, e uma célula de Mesorhi25 zobium.

O método pode também compreender a etapa de submeter uma planta de milho ou uma parte de uma planta de milho derivada a partir da primeira planta de milho às condições de cultura que selecionem com relação à, ou permitam a triagem com relação à presença ou a ausência da se30 quência de ácido nucleico de interesse depois da regeneração de uma planta ou parte de uma planta. Em determinadas modalidades, o meio de crescimento é um meio sólido. Em ainda outras modalidades o meio de crescimento é um meio líquido, em ainda outras modalidades o meio de crescimento é o solo. E, outras modalidades a planta regenerada ou a parte da planta diferenciada é uniforme com relação à presença o segmento de DNA. Breve Descrição das Figuras

Os desenhos que se seguem fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar ainda mais determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida através de referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui, neste pedido de patente.

Figura 1 - Comparação esquemática de protocolos de não seleção (no sei) e de 2T (Para maiores detalhes na estratégia 2T, ver, por favor, Huang etal., 2004).

Figura 2 - Análise histoquímica com a utilização de GUS de li15 nhas de regeneração representativas.

Figura 3 - Recuperação de eventos tolerantes ao glifosato através da abordagem de não seleção depois da pulverização das plantas com a solução de glifosato.

Figura 4 - Dados representativos da análise Southern a partir de 20 plantas Ro selecionadas como descrito no Exemplo 4.

Figura 5 - Transmissão da linha de germe e segregação do gene GUS para a segunda geração foi validada com a utilização de pólen R_o e retro cruzamento com a linha de origem.

Figura 6 - Dados da análise Southern a partir da progênie de 25 eventos de transformação independentes selecionados, que demonstram a transmissão estável de sequências transformadas (Gene CP4).

Figura 7 - Disposição dos tampões de crescimento para permitir a identificação com facilidade de plantas individuais em seguida à análise com relação à presença de sequência transgênica.

Figura 8 - Diagrama esquemático de protocolos de regeneração com a utilização de abordagens de comparação de meio semissólido e sem seleção.

Figura 9 - Protocolos de regeneração com a utilização de cultura líquida sem seleção antes de ser obtida uma comparação de meio de proliferação de planta regenerada.

Descrição Detalhada da Invenção

O desenvolvimento de muitos produtos modernos de plantas geneticamente transformadas envolve o empilhamento em conjunto de múltiplas características transgênicas para prover características de valor adicionado aos fazendeiros. Um gargalo principal nesse processo é a presença de genes marcadores selecionáveis, que são levados junto com um gene de interesse (GOI) durante a transformação, na medida em que o processo tipicamente se apoia sobre o uso de um gene marcador selecionável para assegurar a transformação das células das plantas. Embora diversos métodos estejam disponíveis para a remoção dos genes marcadores selecionáveis em seguida a transformação, esses métodos são quase sempre consumido15 res de tempo e não altamente eficazes.

A presente invenção elimina o gargalo acima mencionado através do desenvolvimento de um processo de transformação efetivo que não requer o uso de um gene marcador selecionável, bem como métodos para uma manipulação e uma triagem eficiente das plantas com relação ao avan20 ço de eventos transgênicos produzidos sem seleção. Especificamente, a invenção refere-se a métodos para melhorar a eficiência da transformação de plantas e a regeneração subsequente sem a utilização de seleção, levando a produção de eventos transgênicos isentos de marcadores. Este é um rompimento significativo na produção de plantas de lavoura transgênicas, na medida em que a transformação sem o marcador (bem como a regeneração subsequente das plantas na ausência de um agente de seleção) evita a complexidade associada com a remoção do marcador, evita o desvio da estrutura genética dos eventos de transformação resultantes devido à necessidade com relação a uma expressão inicial de um gene marcador selecioná30 vel, e também evita as dificuldades potenciais durante o processo do avanço da progênie (como por exemplo, devido à segregação dos transgenes correspondentes a um GOI com relação aqueles que codificam um marcador selecionável). O processo também elimina a necessidade da utilização de um cassete de expressão adicional para o gene marcador que pode ser selecionado ou triado, reduzindo por esse motivo o tamanho do vetor de transformação e proporcionando as vantagens associadas tais como a redução das probabilidades de silenciar devido às sequências repetitivas do cassete, interferência do promotor e construção simplificada dos vetores de transformação.

A produção de alto rendimento de plantas transgênicas isentas de marcador selecionável requer a produção eficiente de transformantes. É de preferência que a transformação sem a seleção antes de serem obtidos rebentos ou plantas completas regeneradas (que compreendam rebentos e raízes), sejam executados na ausência de um agente de seleção. Em determinadas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos transformadas em células de plantas objetivadas podem compreender nenhum gene de marcação selecionável. Em outras modalidades, um gene de marcação selecionável ou um gene de marcação visual pode estar presente, porém as células transformadas e os tecidos em regeneração não obstante, não estão submetidos a um agente de seleção ao qual o gene de marcação selecionável especifica tolerância, resistência ou outro fenótipo que possa ser anali20 sado.

Além disso, esses transformantes são de preferência não quiméricos (isto é, uniformes) com relação à presença de um GOI, uma vez que a presença de tecidos quiméricos de planta, que não são uniformes com relação à presença de um GOI, complica a análise, produção e identificação posterior da progênie de plantas que compreendem o GOI. Por isso, foi descoberto que a transformação, incluindo as etapas que se seguem de regeneração, sem a seleção para a produção rotineira de plantas transgênicas não quiméricas requer a produção eficiente de grandes setores transgênicos e a produção rápida de rebentos primordiais.

Além disso, na ausência da pressão de seleção, grandes quantidades de plantas podem ser regeneradas, muitas ou a maioria das quais não tem o GOI. Dessa forma, são providos métodos eficientes para a regeneração, crescimento e identificação de plantas que compreendem um GOI.

Em determinadas modalidades, a regeneração de plantas é executada em um meio semissólido antes do transplante de transformantes putativos para dentro do solo. Em outras modalidades, o meio pode ser líquido. Em ainda outras modalidades, uma combinação de meios semissólidos e líquidos pode ser empregada durante o processo de regeneração, para facilitar a manuseio das plantas, e para economizar tempo, dinheiro e custos, durante a triagem e as transferências para as condições de crescimento diferentes utilizadas durante o processo de cultura dos tecidos. Em ainda outras modali10 dades, são usados somente meios líquidos durante o processo de regeneração. Em modalidades específicas, a regeneração em meios líquidos pode aumentar a frequência da transformação das células postas em contato com um gene de interesse.

A presença de um gene de seleção durante todas as etapas de cultura de tecido com relação a uma planta regenerada transformada pode prejudicar as características do tecido selecionado, essencialmente por requerer um determinado nível de expressão do marcador selecionável com a finalidade da sobrevivência do tecido a pressão de seleção. Isso pode resultar, por exemplo, em um desvio com relação à obtenção de eventos trans20 gênicos com inserções múltiplas ou complexas de uma sequência heterogênica de um ácido nucleico. Dessa forma, a invenção proporciona um método para ser obtida uma população ou uma série de plantas transformadas de forma putativa sem as plantas terem sido submetidas a essa pressão de seleção durante as fases da cultura dos tecidos tais como a proliferação de calos, pré-regeneração e regeneração e cujas plantas podem exibir um perfil de expressão vantajoso de um GOI e/ou características vantajosas com relação à estrutura molecular e a segregação genética dos sítios de inserção do transgene, encontrados em um determinado evento. Especificamente uma tal característica vantajosa pode incluir, por exemplo, que uma propor30 ção significativa de eventos de transformação exibam um nível vantajoso de expressão de um GOI, ou que uma proporção significativa de eventos de transformação exibam um número baixo de inserção de cópias (isto é, 1 ou 2 cópias). Em modalidades específicas, os eventos de transformação com um número baixo de cópias não têm oviV ou outras sequências de estrutura de vetor, se essas sequências estiverem presentes no construto de transformação que entrou em contato inicialmente com as células das plantas no início do processo de transformação.

A transformação e a regeneração sem essa seleção, de acordo com os métodos da presente invenção, podem ser reproduzidas e são eficientes. Em determinadas modalidades a frequência da transformação (TF) na forma expressa, por exemplo, com base em uma quantidade uniforme obtida de plantas uniformes estavelmente transformadas (isto é, não quiméricas), por embrião imaturo ou outra ex-planta que compreenda células postas em contato através de um construto heterólogo de ácido nucleico, seja, pelo menos 3% e possa variar a partir de cerca de 3% até cerca de 60%, dependendo do tamanho do embrião e das condições da cultura incluindo o tipo dos métodos de regeneração. Em modalidades de preferência, o TF pode variar a partir de cerca de 10% até cerca de 15%. De forma alternativa, o TF pode ser calculado de outras maneiras, por exemplo, com base no número de plantas transformadas obtidas, pelo número de plantas regeneradas e cultivadas a partir de tais embriões imaturos ou outras ex-plantas.

Em determinadas modalidades, a planta de lavoura que está sendo transformada sem seleção é selecionada entre plantas de lavoura monocotiledôneas, incluindo as Poaceae, tais como as plantas de o milho, arroz, sorgo, trigo, centeio, milho miúdo, cana-de-açúcar, aveia, triticale, capim de turfa e switchgrass. Em uma modalidade especifica, a planta de lavoura é uma planta de milho (maize). Em determinadas modalidades, o tecido-alvo da transformação, como por exemplo, a ex-planta, posta em contato com uma sequência heteróloga de ácido nucleico compreende o tecido meristemático, tal como um embrião, ou um meristema de rebento. Em determinadas modalidades a ex-planta é um embrião. Em modalidades especí30 ficas o embrião é um embrião imaturo. Em ainda outras modalidades, o embrião imaturo é um embrião imaturo de milho, e tem entre cerca de 1,9 e 3,5 mm de tamanho, ou entre cerca de 1,6 a 1,8 mm de tamanho. Em modalida10 des específicas, o embrião de milho imaturo tem entre cerca de 1,9 e 2,5 mm, e de preferência cerca de 2,3 mm de tamanho. Em outras modalidades, o embrião de milho imaturo tem cerca de 2,5 a 3,2 mm de tamanho ou cerca de 2,8 a 4,0 mm de tamanho. O embrião imaturo também pode ser selecio5 nado como um alvo de transformação com base no seu estágio de desenvolvimento, ou na ocasião do seu isolamento, dias depois da polinização (DFAP), por exemplo, cerca de 9 a 14 dias DAP, ou cerca de 10 a 12 DAP.

Para o início do processo de transformação de acordo com a presente invenção, é primeiro necessário a seleção dos componentes gené10 ticos a serem inseridos no interior da célula ou dos tecidos da planta. Os componentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucléico que é introduzido dentro de uma célula ou tecido de uma planta com a utilização do método de acordo com a invenção. Os componentes genéticos podem incluir DNA que não de planta, DNA de planta ou DNA sintético.

Em uma modalidade de preferência, os componentes genéticos são incorporados dentro de uma composição de DNA tal como vetor de um plasmídio ou molécula recombinante, de filamento duplo que compreenda um ou mais dos seguintes tipos de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona em células de plantas para ocasionar a produção de uma se20 quência de RNA; (b) uma sequência estrutural de DNA que cause a produção de uma sequência de RNA que codifique um produto de utilidade agronômica; e (c) uma sequência de 3' de DNAQ não traduzida que funcione em células de plantas para ocasionar a adição de nucleotídios poli adenilados ao terminal 3'da sequência de RNA.

O vetor pode conter uma quantidade de componentes genéticos para facilitar a transformação da célula ou do tecido da planta e regular a expressão do gene ou genes desejados. Em uma modalidade de preferência, os componentes genéticos estão orientados de tal forma a expressar um mRNA, que em uma modalidade pode ser traduzido em uma proteína. A ex30 pressão de uma sequência que codifica a estrutura de uma planta (um gene, cDNA, DNA sintético, ou outro DNA) que exista em forma de filamento duplo envolve a transcrição de RNA mensageiro (mRNA) a partir de um filamento do DNA através da enzima polimerase do RNA e o subsequente processamento do transcrito primário do mRNA no interior do núcleo. Esse processamento envolve uma região 3' não traduzida que adiciona nucleotídios poli adenilados aos finais 3' do mRNA.

Os métodos para a preparação de plasmídios ou vetores que contenham os componentes genéticos desejados são bem conhecidos na técnica. Os vetores consistem tipicamente em uma quantidade de componentes genéticos, que incluem porem não estão limitados a elementos regulatórios tais como sequências promotoras, líderes, íntrons e sequências fina10 lizadoras. Os elementos regulatórios também são referidos como elementos regulatórios cis- ou trans-, dependendo da proximidade do elemento ás sequências ou ao gene ou aos genes que eles controlam.

A transcrição de DNA e, mRNA é regulada através de uma região do DNA usualmente referida como a promotora. A região promotora contém uma sequência de bases que sinalizam a polimerase do RNA para se associar com o DNA e para iniciar a transcrição em mRNA com a utilização de um dos filamentos do DNA como um gabarito para fazer um filamento complementar correspondente de RNA.

Uma quantidade de promotoras que são ativas em células de plantas tem sido descrita na literatura. Essas promotoras poderão incluir, porém não estão limitadas as promotoras nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) que estão contidas em plasmídios indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, as promotoras de caulimovírus tais como as promotoras 19S e 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), e a promoto25 ra 35S do vírus do mosaico do figo (FMV), a promotora aperfeiçoada CaMV35S (e35S), a promotora induzível pela luz a partir da pequena subunidade da ribulose bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptídio muito abundante em plantas). Todas essas promotoras foram usadas para a criação de diversos tipos de construtos de DNA que foram expressos em plantas.

Também podem ser construídas promotoras híbridas para aumentar a atividade de transcrição (Patente U.S. N° 5.106,739), ou para a combinação de atividade de transcrição desejada, capacidade de indução em especificidade de tecido ou em especificidade de desenvolvimento. As promotoras que funcionam em plantas incluem, porém não estão limitadas as promotoras que possam ser induzidas, viróticas, sintéticas, constitutivas como as descritas, e reguladas temporariamente, reguladas espacialmente e reguladas espaço-temporalmente. Outras promotoras que são aperfeiçoadas em tecido, específicas para tecido ou reguladas de forma desenvolvida também são conhecidas na técnica e consideradas como tendo utilidade ma pratica desta invenção.

As promotoras podem ser obtidas a partir de uma variedade de origens tais como plantas e vírus de DNA de plantas e incluem, porém não estão limitadas a promotoras isoladas a partir de genes de plantas tais como os genes ssRUBISCO. Como descrito abaixo, é de preferência que a promotora específica selecionada deva ser capaz de ocasionar a expressão sufici15 ente para resultar na produção de uma quantidade efetiva do produto de gene de interesse.

As promotoras usadas nos construtos de DNA (por exemplo, genes de plantas quimérico-recombinantes) da presente invenção podem ser modificadas, se desejado, para afetar as características de controle dos mesmos.

As promotoras podem ser derivadas por mio de ligações com regiões operadoras, metagênese controlada ou aleatória, etc. Além disso, as promotoras podem ser alteradas para conter sequências aumentadoras múltiplas para auxiliar na elevação da expressão do gene.

Um mRNA produzido por um construto de DNA da presente invenção também pode conter uma sequência líder 5'não traduzida. Essa sequência pode ser derivada a partir da sequência promotora selecionada para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de tal forma a aumentar a translação do mRNA. As regiões 5' não traduzidas também podem ser obtidas a partir de RNA viróticos, a partir de genes eucarióticos adequados, ou a partir de uma sequência sintética de gene. Essas sequências aumentadoras podem ser desejáveis para o aumento ou para a alteração da eficiência translacional do mRNA resultante. A presente invenção não está limitada a construtos nos quais a região não traduzida é derivada a partir de ambas as sequências 5' não traduzidas que acompanham a sequência promotora. Ao contrário, a sequência líder não traduzida pode ser derivada a partir de promotoras ou genes não relacionados (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.362.865). Outros componentes genéticos que servem para o aumento da expressão ou afetam a transcrição ou a translação de um gene também são consideradas como componentes genéticos.

A região 3' não traduzida dos construtos quiméricos devem con10 ter um finalizador de transcrição ou um elemento que tenha uma função equivalente, e um sinal de poli-adenilação que funcione em plantas para ocasionar a adição dos nucleotídios poli adenilados ao terminal 3' do RNA. Os exemplos de regiões 3' adequadas são (1) as regiões 31 transcritas, não traduzidas que contenham o sinal de poliadenilação dos genes do plasmídio de indução de tumor (Ti) da Agrobacterium, tais como o gene da nopalina sintase (NOS), e (2) genes de plantas tais como os genes do armazenamento de proteína da soja e o gene da pequena subunidade da ribulose-1,5bifosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' de preferência é aquela do gene E9 da ssRUBISCO da ervilha (Pedido de Patente

Européia 0 385 962).

Tipicamente, as sequências de DNA localizadas a poucas centenas de pares de base á jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. As sequências de DNA são referidas aqui, neste pedido de patente como regiões de transcrição/terminais. As regiões são ne25 cessárias para a poliadenilação eficiente dão RNA mensageiro transcrito (mRNA) e são conhecidas como as regiões 3' não traduzidas. A RNA polimerase transcreve uma sequência de DNA que codifica através de um sitio no qual ocorre a poliadenilação.

Em uma modalidade, o T-DNA não compreende um gene mar30 cador que pode ser selecionado, triado ou classificado. De forma alternativa, o DNA a ser transferido pode conter um gene marcador que pode ser selecionado, triado ou classificado, embora em determinadas modalidades da invenção o tecido de plantas são somente selecionados ou submetidos à triagem com relação à presença do marcador depois que a regeneração tenha ocorrido. Esses componentes genéticos também são referidos aqui, neste pedido de patente como componentes genéticos funcionais, na medi5 da em que eles produzem um produto que oferece uma função na identificação de uma planta transformada, ou um produto de utilidade agronômica; O DNA que serve como um dispositivo de seleção funciona em um tecido de planta que pode ser regenerado, especificamente um tecido regenerado, para a produção de um composto que poderá conferir ao tecido da planta resistência a um composto de outra forma tóxico. Os genes de interesse para serem usados como um marcador que pode ser selecionado, triado ou classificado pode, incluir porém não estão limitados a GUS codificando uidA, gfp, codificando proteína fluorescente verde3 (GFP), genes relacionados com a biossíntese da antocianina (C1,B-peru), luciferase (LUX), e genes es15 pecificando resistência a antibióticos tais como a kanamicina (Dekeyser et al., 1989), e herbicidas tais como o glifosato (Della-Cioppa et al., 1987). Outros métodos de seleção também podem ser implementados incluindo, porém não limitados à tolerância a fosfinotricina e mecanismos de seleção positiva, poderão ainda cair dentro do âmbito da presente invenção.

A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmídio ou vetor de transformação de planta adequado que contenha um marcador que possa ser selecionado ou triado e elementos regulatórios associados como descritos, juntos com um ou mais ácidos nucleicos expressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica especifica. Os exemplos de genes estruturais adequados de interesse agronômico considerados pela presente invenção poderão incluir porém não estão limitados a genes para tolerância a insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhoramentos de qualidade tais rendimento, melhoramentos nutricionais, tolerâncias com relação ao meio ambiente ou estresse, ou quaisquer mudanças desejáveis na fisiologia, crescimento, desenvolvimento, morfologia de plantas ou de produto ou produtos de plantas.

De forma alternativa, as sequências que codificam o DNA po15 dem afetar esses fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA não traduzível que ocasione a inibição objetivada da expressão de gene endógeno, por exemplo através de mecanismos mediados por antissenso ou co-supressão (ver, por exemplo, Bird et al., 1991). O RNA também pode ser uma molécula de RNA catalítico (por exemplo, uma ribozima), manipulada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado (ver, por exemplo, Gibson e Shillitoe, 1997). Mais especificamente, para uma descrição de regulação antissenso da expressão de gene em células de planta ver a Patente U.S. 5.107.065 e para uma descrição da supressão de gene em plantas através de transcrição de um dsRNA ver a Patente U.S. 6.506.559, Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2002/0168707 A1, e o Pedido de Patente U.S. Serial No. 09/423,143 (ver a WO 98/53083), 09/127,735 (ver a WO 99/53050) e 09/084.942 (ver a WO 99/61631), todas as quais são incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência. Desse modo, qualquer ge15 ne que produza uma proteína ou um mRNA que expresse um fenótipo ou uma mudança de morfologia de interesse é útil para a prática da presente invenção.

Os exemplos de ácidos nucleicos que podem ser introduzidos através do método englobado pela presente invenção incluem, por exemplo, sequências de DNA ou genes a partir de outra espécie, ou mesmo genes ou sequências que se originam com ou estão presentes na mesma espécie, porem que são incorporadas em células recebedoras através de métodos de engenharia genética ao invés das técnicas clássicas de reprodução ou de procriação. No entanto, o termo exógeno também está destinado a se referir a genes que não estão normalmente presentes na célula que está sendo transformada, ou talvez simplesmente não esteja presente na forma, estrutura,etc., como a encontrada no segmento ou gene de transformação do DNA ou em genes que estejam normalmente presentes que desejem, por exemplo ter sido expresso em excesso. Desse modo, o termo @gene ou DNA exógeno está destinado a de referir a qualquer gene ou segmento de DNA que seja introduzido dentro de uma célula recebedora, sem levar em consideração se um gene similar já possa estar presente em tal célula. O tipo de

DNA incluído no DNA exógeno pode incluir um DNA que já esteja presente na célula da planta, o DNA de outra planta, o DNA a partir de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, tal como uma sequência de

DNA que contenha uma mensagem antissenso de um gene, ou uma se5 quência de DNA que codifique para uma versão sintética ou modificada de um gene.

As tecnologias com relação à introdução de DNA no interior de células são bem conhecidas daquelas pessoas versadas na técnica e podem ser divididas em categorias que incluem, porém não estão limitadas a: (1) métodos químicos; (2) métodos físicos tais como microinjeções, eletroporação e bombardeamento com microkprojeteis; (3) vetores viróticos; (4) mecanismos mediados através de receptores e (5) mediados por Rhizobia (como por exemplo, mediados por Agrobacterium) métodos de transformação de plantas (como por exemplo, Broothaerts et al., 2005).

Para a transformação mediada pela Agrobacterium, depois da construção do vetor ou do construto de transformação da planta, a referida molécula de ácido nucléico, preparada como uma composição de DNA in vitro, é introduzida no interior de um hospedeiro adequado tal como o E.coli e igualada em outro hospedeiro adequado tal como a Agrobacterium, ou transformada diretamente dentro da Agrobacterium competente. Essas técnicas são bem conhecidas daquelas pessoas versadas na técnica e foram descritas com relação a uma quantidade de sistemas de plantas incluindo a soja, algodão e trigo (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.569.834 e 5.159.135, e a WO 97/48814, incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência em suas totalidades).

A presente invenção engloba o uso de cepas bacterianas para a introdução de um ou mais componentes genéticos dentro de plantas. Aquelas pessoas versadas na técnica poderíam reconhecer a utilidade dos métodos de transformação mediados pela Agrobacterium, em um de tais proces30 sos. Uma quantidade de cepas do tipo natural e desarmadas da Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes contendo plasmídios Ti ou Ri pode ser usada para a transferência de genes para dentro de plantas. De preferência, os hospedeiros de Agrobacterium contêm plasmídios Ti e Ri desarmados que não contêm os oncogenes que causam a tumorgênese ou rizogênese, respectívamente, que são usados como vetores e contem os genes de interesse que são em seguida introduzidos dentro pás plantas. As cepas de preferência poderíam incluir, porém não estão limitadas a Agrobacterium tumefaciens derivadas da cepa C58, uma cepa do tipo da nopalina que é usada para mediar a transferência do DNA para dentro de uma célula de planta, cepas do tipo da octopina tais como a LBA4404 ou cepas do tipo da succinamopina, por exemplo, EHA101 ou EHA105. Outras bactérias tais como as Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com as plantas de modo natural podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para uma quantidade de plantas diversas. Essas bactérias simbióticas associadas com as plantas podem ser tornadas competentes para a transferência de genes através da aquisição de ambos um plasmídio Ti de15 sarmado e um vetor binário adequado (Broothaerts et al., 2005). O uso dessas cepas para a transformação de plantas foi reportado e os métodos são familiares aquelas pessoas habilitadas na técnica.

As ex-plantas podem ser a partir de um único genótipo ou a partir de uma combinação de genótipos. Qualquer semente de milho que possa germinar é um material de partida viável. Em uma modalidade de preferência, ex -plantas superiores a partir de híbridos de plantas podem ser usadas como ex-plantas. Por exemplo, uma linha de células de crescimento rápido com uma resposta de cultura elevada (frequência mais alta de formação de calos embriogênicos, taxa de crescimento, frequência de regeneração de planta, etc.) pode ser gerada com a utilização de embriões híbridos que contenham diversos genótipos. Em uma modalidade, um híbrido Fi ou um rebento de primeira geração de geração cruzada pode ser usado como uma planta doadora e cruzado com outro genótipo. Aquelas pessoas versadas na técnica estão cientes que a heterose, também referida aqui, neste pedido de patente como vigor híbrido, ocorre quando duas gerações internas são cruzadas. Desse modo, a presente invenção engloba o uso de uma ex-planta que resulta a partir de um cruzamento de três modos, no qual, pelo menos um ou mais das gerações internas é altamente regenerável e transformável, e a frequência da regeneração e da transformação da ex-planta cruzada de três modos excede as frequências das gerações internas individuais. Outros tecidos também são considerados como tendo utilidade na pratica da pre5 sente invenção. As ex-plantas podem incluir embriões maduros, meristemas, tecido de calo ou qualquer outro tecido que possa ser transformado e regenerado.

Qualquer meio de cultura de plantas adequado pode potencialmente ser usado durante o processo de transformação. Os exemplos de tais meios poderíam incluir, porém não estão limitados a Murashige e Skoog (1962), N6 (Chu et al., 1975); Linsmaier e Skoog (1965); Uchimiya e Murashige (1962); Gamborg's media (1968), D médium (Duncan et al., 1985), McCown's Woody plant media (McCown e Lloyd, 1981), Nitsch e Nitsch (1969), e Schenk e Hildebrandt (1972) ou derivações desses meios suple15 mentadas de acordo, bem como os numerosos meios descritos abaixo. Aquelas pessoas versadas na técnica estão cientes de que meios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores de crescimento para serem usados na transformação e na regeneração e outras condições de cultura tais como a intensidade da luz durante a incubação, pH e temperatu20 ras de incubação podem ser otimizados com relação a variedade especifica de interesse.

Em seguida a regeneração dos rebentos compreendendo brotos ou brotos e raízes, um agente de seleção pode ser aplicado aos rebentos ou a partes dos rebentos, por exemplo, se um gene marcador selecionável es25 tava sendo transformado em célula alvo inicial da planta junto com um GOI, ou de forma alternativa, se o próprio GOI codificar um marcador selecionável. Desse modo, depois que uma planta tenha sido produzida através do método da presente invenção, um agente de seleção pode ser aplicado à mesma, de acordo com a presente invenção, com o propósito de auxiliar com análise ou de outra forma identificar uma planta transformada que exibe características úteis.

A presente invenção também compreende métodos para o manuseio eficiente de plantas regeneradas, que permitem a identificação de plantas transformadas que contenham um GOI. Esses métodos simplificam e modernizam o processo de regeneração de crescimento da população de plantas transformadas de forma putativa, economizando tempo, espaço e os custos exigidos pelo processo, e tornando o processo comercialmente possível.

Em uma modalidade o tecido objetivado da planta, TAM como embriões imaturos de milho (lEs) são cultivados com uma cepa de Agrobac10 terium que contem um GOI, por exemplo, durante de 1 a 3 dias a 23°C seguido pela cultura a 30°C durante de 7 a 10 dias adicionais, tanto no mesmo meio de cultura como em meio de proliferação de calos. Os embriões podem ser observados com a finalidade de identificar quais embriões estão respondendo, isto é, produzindo calos embriogênicos que possam ser regene15 rados para a formação de uma plantícula (rebento). Os embriões que respondem com calos, tipicamente calos escutelares, são em seguida transferidos a partir da cocultura para um primeiro meio de pré-regeneração, com condições de cultura apropriadas de temperatura, luz, e nutrientes para permitir o crescimento posterior dos calos, e a diferenciação e regeneração. De forma alternativa, eles podem ser colocados sobre um suporte, tal como feltro e/ou papel de filtro em um prato de cultura, que esteja em contato com um meio de regeneração líquido, de tal forma que os calos possam crescer e se diferenciarem.

Na medida em que necessário, os embriões inoculados podem ser cultivados, por exemplo, no escuro durante de 1 a 2 semanas a 30°C, incluindo a transferência para meio de nutrição fresco. Depois da incubação no escuro, as culturas podem ser cultivadas em meio de regeneração sob períodos alternados de luz e de escuridão, por exemplo de 1 a 3 semanas de crescimento sob um ciclo de 16/8 de luz e escuro a cerca de 27°C com uma intensidade de luz de cerca de 100 μΕ, ou como apropriado com base na espécie ou na variedade da de planta em questão, e no conhecimento de uma pessoa versada na técnica de cultura de tecido de planta. Tipicamente, o início da regeneração de uma planta se inicia dentro de 1 a 3 semanas do inicio do cocultivo, especialmente se estiver presente uma fase de crescimento de calos. O método também pode compreender uma etapa de préregeneração, que compreende o uso de meio basal de cultura de um tecido de planta suplementado com níveis reduzidos de auxina ou auxinas do que são usados no meio de proliferação de calos.

Depois de cerca de 2 a 3 semanas de cultura e regeneração sobre meios semissólidos ou líquidos, as plantas em regeneração a partir de uma única ex-planta, por exemplo a partir de embriões imaturos (lEs), po10 dem ser transferidas para um único contêiner de meio de crescimento. Um exemplo de um deles é um PHYTATRAY (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) compreendendo tanto meio de cultura de regeneração e de crescimento de tecido semissólido como líquido durante cerca de 4 semanas antes da transferência das plantas resultantes para o meio de cresciemento para o endurecimento das olantas, tais como tampões de cultura no solo. Devido a que o transplante para o solo é um processo de tempo e trabalho intenso, pode ser de preferência a triagem de plantas individuais antes do transplante das mesmas, ou mesmo antes das mesmas serem colocadas em uma PHYTATRAY, com relação à presença de GOI e de outras características de in20 teresse. O número de rebentos regeneradas na ausência de uma pressão de seleção pode ser de 20 a 50 X mais alto do que seria encontrado em um experimento similar, com a utilização de um agente de seleção durante o crescimento do calo e da regeneração da planta. Desse modo, o processo para a manipulação de uma grande quantidade de plantas, por exemplo, transferindo as mesmas a partir da fase de cultura de tecido para o crescimento sob condições não estéreis, é provido. O uso de tampões de horticultura ou tubos ou bandejas de cultura individuais sob condições não estéreis para permitir o crescimento e a análise dos rebentos é uma outra modalidade da invenção. Esses rebentos também podem ser cultivados sem marcar necessariamente todas as plantas, através de agrupamento apropriado de plantas em crescimento para permitir uma circulação fácil entre as plantas determinadas e o tecido das mesmas que está sendo submetido a uma ou mais análises ou triagem para a identificação das plantas transformadas que compreendem o GOI.

Em uma modalidade, uma triagem com base em PCR pode ser empregada para a eliminação das plantas não transformadas antes da trans5 ferência das mesmas para os meios de crescimento, incluindo os meios de crescimento líquidos, por exemplo, nas PHYTATRAY. Desse modo, por exemplo, se cerca de 5.000 embriões de milho imaturos forem usados na transformação com uma cepa bacteriana, cerca de 25.000 plantas podem ser produzidas, necessitando de cerca de 5.000 PHYTATRAYs. Se for al10 cançada cerca de 10% de frequência de transformação, uma triagem inicial das plantas em regeneração no estagio de crescimento V irão resultar em cerca de 25.000 plantas transformadas putativamente, que correspondem à resposta de 500 embriões ou necessitando de cerca de 500 PHYTATRAYs, que poderiam ser transplantadas em tampões de crescimento para o solo. O método de triagem pode incluir o ajuntamento dos tecidos das plantas em regeneração a partir de PHYTATRAYs individuais ou de qualquer outro contêiner de crescimento tais como os tampões. Os ajuntamentos são projetados de tal forma que, através da análise de múltiplos conjuntos, membros individuais de uma população podem ser identificados sem a necessidade com relação a análises individuais de cada membro da população. Um método de ajuntamento é o de agrupar todas as plantas derivadas a partir de uma ex-planta, de preferência uma IE em uma PHYTATRAY ou em um vaso de crescimento similar e descartar os contêineres negativos, reduzindo grandemente por meio disso os esforços associados com a manipulação e a análise das plantas. O número de plantas ajuntadas em conjunto pode ser ainda aumentado, até o limite de detecção de uma análise PCR.

Os tampões de crescimento podem ser manipulados ou agrupados para maximizar a eficiência das etapas de triagem posteriores, e para remover a necessidade de marcação individual das plantas regeneradas.

Por exemplo, os tampões podem ser agrupados e orientados para corresponder a uma análise formatada para a utilização de um prato de microtitulação, por exemplo, um prato de 96 cavidades pelo crescimento das plantas em 96 grupos de tampões. Isso poderia permitir que fossem feitas correlações rápidas e acuradas entre os resultados de uma análise e as plantas a partir das quais o tecido da análise foi isolado. Em determinadas modalidades, as análises para a determinação da presença ou da ausência de um

GOI em uma planta putativamente transformada e regenerada isenta de marcador, pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma análise com base em PCR, hibridização Southern, sequenciamento de DNA, manchamento northern, manchamento western, uma imuno-análise, e uma análise com relação a uma atividade enzimática codificada através do seg10 mento do DNA transgênico que contatou o tecido objetivado durante o cocultivo com a Agrobacterium. Em uma modalidade específica, a análise é uma análise com base em PVR. Em determinadas modalidades, a análise com base em PCR ou outra análise é realizada em tecido de planta isolado a partir de plantas regeneradas que estão sendo cultivadas em PHYTATRAYs ou equivalente, antes do transplante para um meio de crescimento com base em solo.

Os presentes métodos são mais eficazes do que os outros métodos típicos para a obtenção de plantas transgênicas isentas de marcador, por exemplo abordagens mediadas por Agrobacterium com a utilização de um ou mais T-DNA(s) compreendendo um GOI e um marcador selecionável ou que possa ser triado (figura 1). As vantagens providas pelas diversas modalidades da invenção incluem:

1. O construto de transformação é menor, o que simplifica o procedimento de clonagem.

2. Eliminação do cassete de expressão do gene marcador libera os elementos de expressão que poderíam ser necessários para o cassete do marcador, reduzindo as preocupações a cerca da estabilidade de recombinação devido à presença de elementos repetidos. A eliminação dos elementos regulatórios repetitivos a partir do cassete do marcador também minimiza a possibilidade de silenciar o gene.

3. O processo de triagem com relação às plantas Ro é mais simples. Nos processos anteriores, pelo menos dois elementos têm que ser submetidos à triagem, o GOI e o gene marcador selecionável. No presente método, não há a necessidade da triagem com relação a um marcador. Além disso, as plantas positivas com relação ao GOI necessitam ser submetidas à triagem para a determinação de se o inserto do gene marcador está ligado ao inserto do GOI, e quase sempre a ligação é encontrada, o que interfere com a capacidade de identificar as plantas que não possuem o marcador selecionável em uma geração subsequente. Em contraste, a ligação não é um problema no método presente.

4. Eficácias melhoradas nas gerações da progênie também são encontradas. Com relação aos métodos anteriores tais como os métodos de transformação 2-T, uma grande população de plantas Fi ou Ri tem que ser submetida à triagem para a identificação positiva do GOI em plantas isentas de marcador. Com relação às plantas produzidas através do presente método, não é necessária nenhuma segregação de um gene marcador.

5. Permite uma seleção mais rápida para os melhores eventos contendo o GOI sem a presença do gene marcador selecionável facilitando dessa forma um empilhamento eficiente de múltiplos GOI, por exemplo, quando o gene marcador selecionável codifica uma característica agronômica de interesse.

A invenção proporciona métodos para a produção eficiente de plantas transgênicas isentas de marcador, em geral capazes de serem cultivadas em um meio com base em solo, dentro de 7 a 10 semanas depois de que uma ex-planta objetivada inicial é posta em contato com um ácido nucleico exógeno. Os métodos de alto rendimento da presente invenção permitem o desenvolvimento de um eficiente sistema de transformação sem seleção. Especificamente, a simplificação da manipulação dos tecidos em regeneração e das plantas regeneradas permite a mecanização de muitas etapas, e economiza tempo, dinheiro e carga ergonômica. O sistema pode produzir cerca de 4 a 6 eventos de transformação isentos de marcador (isto é, even30 tos de cópia única e eventos isentos de estrutura de vetor) por experimento de transformação com a utilização de cerca de 100 embriões, acelerando desse modo um conduto de produto de planta transformado.

Exemplos

Os exemplos que se seguem foram incluídos para ilustrar as modalidades da invenção. Devem ser observadas por aquelas pessoas versadas na técnica, que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção. No entanto, aquelas pessoas versadas na técnica devem, na luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que estão descritas e ainda serem obtidos resultados iguais ou similares sem que se afastem do conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, se tornarão aparentes que determinados agentes que são tanto quimicamente como fisiologicamente relacionados podem ser substituídos por agentes descritos aqui, neste pedido de patente, embora possam ser conseguidos os mesmos resultados ou resultados similares. Todos esses substitutos similares e modificações aparen15 tes àquelas pessoas versadas na técnica são destinados a estar dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção, como definidos pelas reivindicações em anexo.

Exemplo 1

Transformação Isenta de Marcador

A transformação de embriões de milho imaturos regenerados pode ser realizada através do protocolo mediado por Rhizobia, como por exemplo, descrito de forma geral por Cai et al., (Publicação de Pedido de Patente U.S. 2004/0244075). Especificamente um método mediado por Agrobacterium modificado foi usado. Embriões imaturos com uma faixa de tamanho de 1,9 a 2,5 mm por exemplo de cerca de 2,3 mm, foram selecionados a partir de espigas de milho, e cocultivados com uma cepa ABI de Agrobacterium C58 para mediar a transferência do DNA para dentro das células da planta que continham o construto recombinante de interesse, por exemplo, pMON93040 contendo ambos GUS e CP4 EPSPS sob o controle de expressão de um promotor de actina, para permitir tanto a análise visual das células e setores transformados, e para permitir o uso de um glifosato pulverizado Weathermax® como um substituto para uma triagem pós25 regeneração posterior seguida por um teste de confirmação através de uma triagem com base em PCR com relação às plantas transformadas. Os embriões maiores, como por exemplo de cerca de 2,5 mm ou de até 3,2 mm de tamanho, também podem ser usados, e podem ser de preferência quando poucas plantas por embrião são produzidas através da redução da proliferação de calos antes da pré-regeneração, e as fases de regeneração da cultura de tecido. As composições dos meios usados abaixo são dadas na Tabela 1. Em seguida a inoculação com a Agrobacterium, os embriões foram transferidos para Lynx 1947 ou Lynx 1898 para cocultura durante um período de

1 a 3 dias à 23°C, seguidos por um adicional de 7 a 14 dias à 30°C no mesmo prato ou em um meio de proliferação da calos (como por exemplo, Lynx 1316), seguido pelo crescimento em um meio de pré-regeneração (Lynx 1844; 2232; 2197) ou um meio de regeneração (Lynx 1344; 2282; 22379, etc.) O crescimento final das plantas pode ser conseguido através de dois métodos: (1) transferindo as plantas a partir de cada calo derivado de embrião para uma Phytatray® contendo Lynx 1607, ou (2) transferindo as plantas a partir de cada embrião derivado de calos para uma Phytatray® contendo Lynx 2168 líquido. As plantas foram permitiras crescer em Phytatray® durante um período de cerca de 4 semanas antes de serem transferidas para os tampões (tampões Q pela International Horticultural Technologies, Hollister, CA). Uma semana antes da transferência das plantas para os tampões, foram tomadas amostras das plantas enquanto as plantas ainda estavam dentro da Phytatray™ e analisadas para a remoção das plantas sem o GOI. Aproximadamente, amostras de 10 dias depois da colocação nos tampões a partir de cada planta foram tomadas para a análise do DNA e as plantas positivas para GOI foram identificadas e retidas para crescimento e desenvolvimento posterior.

Tabela 1 - Composições de meios usadas em diversos aspectos da presente invenção. A função do meio representativo é identificada.

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Vitaminas MSFromm (1000 X)*

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| Sacarose (Phytotech) |

| Prolina (Sigma) |

| Ácidos casamino (Difco) |

X CL

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ío E cn ω ω cn <0 >> x: 0.

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Carbecilina (Phytotech)

Acetosyringone (Aldrich)

BAP (Sigma)

Glifosaro (Gateway Chemical)

Nitrato de prata (sigma)

I Ácido abcísico

2Ί

Exemplo 2

Desenvolvimento Eficiente de Setores Transqênicos sem Pressão de Seleção durante a proliferação de calos

Foi desenvolvido um sistema para a regeneração eficaz de plan5 tas transgênicas na ausência de um agente de seleção. Em seguida a cocultura de uma ex-planta com Agrobacterium (4 dias em meio Lynx 1898 (Tabela 1)) a proliferação de calos começou em Lynx 1316 (Tabela 1) durante 10 a 14 dias sem seleção. Em seguida, a pré-regeneração do tecido de calos foi executada durante 10 dias em meio Lynx 1844 (Tabela 1), seguida pela re10 generação em Lynx 1344 (tabela 1) durante 10 dias, e Lynx 1471 durante 3 semanas (tabela 1). Todas as etapas, exceto com relação a cultura em Lynx 1471 foram executadas sem o uso de um agente de seleção; dessa forma o crescimento dos calos e a regeneração das plantas ocorreu em um agente seletivo durante cerca de 4 semanas depois do cocultivo. O crescimento das plantas em regeneração na ultima etapa, em Lynx 1471, foi executado na presença de um nível baixo de glifosato (0,02 nM v/v) para calcular a frequência de transformação máxima possível. Antes da transferência dos tecidos para o meio Lynx 1471, 24 calos independentes derivados de embriões e tecidos associados foram marcados com relação à atividade de GUS em 4 semanas depois da transformação. Quatro rebentos positivos para GUS foram identificados demonstrando desse modo uma eficiência de transformação de ~ 16%.

O crescimento posterior das plantas foi conseguido através da transferência dos tecidos para Lynx 1471 em Phytatrays, e um total de 43 eventos transgênicos foram regenerados, todos os quais sobreviveram quando foram transferidos para o solo. A análise da transformação e o número de cópias foram mostradas na Tabela 2. Cerca de 14% do total das plantas que sobreviveram foram escapadas, porém cerca de 45% das plantas foram transformadas com de 1 a 2 insertos. A análise hístoquímica de linhas de calos em regeneração representativas, 5 semanas depois da transformação está mostrada na figura 2.

Tabela 2 - Transformação eficiente com a utilização de seleção somente durante a última etapa da regeneração das plantas indica a formação eficiente de setor transformado sem seleção.

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Exemplo 3

Transformação adicional do milho e experimentos de Regeneração e Triagem de Plantas Putativas Transformadas

Mais três estudos foram realizados para confirmar que a regene5 ração eficiente dos setores transgênicos era possível de forma rotineira sem a aplicação da seleção em nenhuma das etapas. O plasmídio usado foi o pMON93040, descrito acima. Em seguida a cocultura em Lynx 1898 durante 1 dia, foi realizada a proliferação de calos em Lynx 1316 durante 10 dias, pré-regeneração em Lynx 1844 durante 10 dias, e regeneração em Lynx

1344 durante 3 dias, seguida por crescimento em Lynx 1607. Uma única espiga de milho foi usada para isolar os embriões para cada experimento, e os embriões variaram em tamanho a partir de 2,8 - 3,2 mm. Em dois dos estudos, a inoculação dos embriões foi executada diretamente, isolando os embriões dentro de uma suspensão de Agrobacterium em O.D.₆₆o = 1,0, en15 quanto que no outro estudo os embriões foram primeiro isolados dentro de 1 ml de meio líquido Lynx 1013 (1 litro: MS Basal Salts (Phytotech): 2,165g; MS Vitamins (100X; Phytotech): 10 ml; Sacarose (Phytotech): 68,5g; Prolina (Fisher): 0,115 g; Glicose (Phytotech) 36g. O meio foi ajustado para o pH 5,4 com KOH, e esterilizado por filtragem, seguido pela inoculação com a utiliza20 ção der uma suspensão de Agrobacterium a O.D.₆₆o = 1,0. Os resultados dos estudos estão relacionados na Tabela 3.

Tabela 3 - Transformação adicional de milho sem seleção

Expt N° IES N° plantas em tampões I N° gus ZCP4 plantas positivas N°Eventos /100 plantas (calculado) co

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TO	C
O	II

c ^w ro — o o TO H c <n

CD cn

Φ c

«D ro

CL

-*—* c CD cn o το ro TO cn O

No final do ciclo de regeneração as plantas de cada experimento foram transplantadas dentro dos tampões e acima de 95% das plantas sobreviveram a transferência, demonstrando que os tampões de propagação oferecem uma maneira aperfeiçoada de manipular uma grande quantidade de plantas. Cerca de dez dias depois do transplante, amostras das folhas a partir das plantas individuais foram analisadas com relação à atividade de GUS com a utilização de marcação histoquímica, e as plantas positivas para GUS foram transplantadas para crescimento adicional e análise histoquímica. Para demonstrar ainda mais a frequência da transformação e para au10 mentar a eficiência total do protocolo, um substituto para uma triagem com base em PCR foi desenvolvido, por meio do qual 1% de WeatherMax™ (Glifosato) foi aplicado depois do final da fase de regeneração que foi executada sem a seleção em PHYTATRAYs. Os resultados estão mostrados nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4 - Transformação Eficiente e Reproduzível de Milho sem Seleção

N°Eventos /100 plantas (calculado)	2,4	2,7	oo	00	7,2 I	5,5 I	l·-	2,5 I		4,8 |
N°cp4 + eventos	CD		I 35	h- CM	L 43 I	-	CO		CM	V Tf
N° plantas calculada	380 |	Γ 260	| 440	i 560	Γ 600	200 ]	| 180	r 160	[ 140 |	2920 j
N° fitos triados	CD	CO	( 22	00 CM	30 Π	O	σ>	00		[ 146
tamanho IE	2,8-3,2 |	2,8-3,2 i	1,8-2,0	2,8-3,0	2,8-3,0	2,8-3,2	I 2,8-3,2	i 2,8-3,2	2,8-3,2
N° embriões inoculados	O CO V-	140 |	O	O o	O o	j 08	O 00	O 00	O 00	| 900
Expt	| 6705-1 |	I 6705-2 |	| 6706-3 I	I 6829-1 I	| 6829-2 I	| 6829-3 I	| 6829-4 I	to 1 σ> CM 00 CO	| 6829-6

o

ICO

O

Φ

Φ

OT

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Φ

O

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LU

O

ICO o

CO

L—

Φ α

Σ3 υ

φ

Dí to _ço

Φ jQ

CO

Total (1 a 2 cópias)	c? θ'1 r< r- u-	2 (28,6%) I	29 (82,9%) |	18(66,7%) I	30 (69,8%) |	8 (72,2%) |	2 (66,7%) |	3 (75,0%) |	1 (50,0%) |	σ' Oi d> o o
N° Eventos que sobreviveram nos tampões	σ>		tO CO	r- CM	43	-	co		CM	5* sr
N° embriões inoculados	o CO 5“	140 I	o	o o	O o	O 00	o 00	80 |	O 00	o o O)
Experimentos |	| 6705-1 I	| 6705-2 I	| 6706-3 I	I 6829-1 |	| 6829-2 I	| 6829-3	| 6829-4	I 6829-5 Ί	| 6829-6	| Total

Os resultados indicaram que a partir de um total de 900 embriões, 141 plantas tolerantes ao glifosato foram produzidas, incluindo 100 com um número de cópias baixo (1 a 2 cópias) do gene de interesse, isto é, uma média de cerca de 15% de TF com base no número de embriões imaturos inoculados

Uma triagem posterior (Tabela 6) mostrou que, dos 90 eventos submetidos à triagem através de análise Southern dos 100 eventos de baixo número de cópias mostrados na Tabela 5, 79 eventos de integração independentes estavam presentes. Eventos irmãs são eventos com o mesmo padrão de banda e que são originários da mesma ex-planta. Uma frequência de transformação mais alta leva a uma porcentagem mais alta de eventos transgênicos com eventos irmãs. Não obstante, a frequência foi muito baixa e a análise Southern revelou ~ 5% exibindo capacidade de clonagem, especialmente quando O TF é > 30% (Tabelas 5 e 6).

Tabela 6 - Eficiência da Transformação sem Seleção- Quantidade de Eventos de Integração Independentes Produzida

Experimento	N° Eventos analisados por Southern blot (1 e 2 cópias)	N° Eventos com irmã
6705-1	1	0
6705-2	7	0
6706-3	25	3
6829-1	16	1
6829-2	27	1
6829-3	8	0
6829-4	2	0
6829-5	3	0
6829-6	1	0
Total	90	5

Exemplo 4

Confirmação da Integração no Cromossomo de um DNA Transferido em Seguida a Transformação e Regeneração Sem a Pressão de Seleção.

O DNA genômico foi isolado a partir de folhas de plantas Ro com a utilização de procedimentos descritos por Dellaporta (1983). O DNA genômico (20 a 30 pg) foi digerido com HindlW, separado em um gel de agarose à 0,7% (w/v), e transferido para membranas de náilon de carga positiva (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). A pré-hibridização, hibridi25 zação, lavagem e detecção das membranas foram executadas com a utiliza34 ção de um sistema de digestão não radioativo com base em DIG (Roche

Molecular Biochemicals) seguindo os protocolos do fabricante. A sequência de DNA a partir do gene CP4 foi marcada por PCR para a produção de sondas. A enzima H/ndlll corta uma vez com no vetor (próximo ao final 5' do cassete de expressão de CP4, e por esse motivo, o número de faixas por Southern blot corresponde ao número de cópias do gene CP4. A análise Southern foi realizada em plantas selecionadas descritas na Tabela 3 (isto é, 22 eventos de cópias baixas foram selecionados). Os dados representativos da análise Southern das plantas R_o está mostrado na figura 4. A análise re10 velou que oito eventos (cópia única, negativas oríV) foram produzidos a partir da população de 37 eventos produzidos a partir de 320 embriões (Tabela 3). Para confirmar ainda mais a transmissão da linha de germe para a próxima geração, as plantas R_o foram cruzadas com a linha congênita de milho de origem não transformada. Neste estudo, as plantas Ri a partir de três li15 nhas independentes foram usadas; ZM_187694 (4 cópias -cp4); ZM_189983 (0 cópia, cp-4 - um evento cp4 possível truncado); ZM_187738 (3 cópias cp4). A análise histoquímica da expressão de gus das espigas em desenvolvimento indicou que uma proporção de 1:1 de sementes positivas para sementes que não expressaram, indicando a transmissão e a ligação da linha de germe do trangsnene (figura 5). Este resultado confirma a transmissão da linha de germe de um transgene com a utilização de eventos transgênicos produzidos sem seleção. A progênie a partir de três eventos adicionais independentes ZM_187692, ZM 18997, e ZM 18998 também foram analisadas através de análise Southern com a utilização do gene CP4 gene como uma sonda (figura 6), mostrando que todas as progênies derivadas a partir das três plantas Ro diferentes mostraram o padrão esperado, isto é, uma transmissão estável do evento transgênico para a próxima geração.

Exemplo 5

Manipulação Eficiente de Plantas

Um método para a manipulação eficiente de múltiplas plantas é um componente importante de um sistema eficiente de transformação de plantas que não use um agente de seleção antes de ser obtida uma planta regenerada. Isso é devido a que um grande número de plantas podem necessitar de ser submetida à triagem com a finalidade de identificar as plantas transformadas com um número de cópias apropriado e a complexidade das inserções, bem como a expressão do GOI. Esta manipulação (como por exemplo, a transferência ou o transplante para meio ou para o solo para o crescimento posterior, e a manutenção da identidade durante as etapas de triagem) permite que múltiplos rebentos sejam processados no interior de um recipiente que mantém os tampões individuais ou os tubos de cultura, e mantendo ao mesmo tempo a identidade individual das plantas, e também facilita a captura de dados sem a marcação das plantas individuais. A combinação de plantas em crescimento em tampões de horticultura sem a marcação das plantas individuais, e desenvolvendo um protocolo para a captura de dados de análise para a identificação e a movimentação para a frente dos eventos desejados, acelera o canal de transformação com base em não seleção durante a transferência do gene e a regeneração. Em resumo, a presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um sistema eficiente de transformação de plantas sem seleção, manipulação de plantas e captura de dados.

As plantas transformadas de forma putativa, regeneradas a par20 tir de calos que tenham sido cultivados com a cepa de Agrobacterium que compreenda um gene de interesse, podem ser transplantadas, por exemplo, a partir de uma Phytatray® para o solo em tampões de cultivo. O uso de tais tampões pode modernizar a amostragem e a análise das plantas e economizar o espaço de crescimento. Por exemplo, os tampões são dispostos em um padrão que corresponda as cavidades de, por exemplo, um prato de microtitulação de 96 cavidades (por exemplo, a figura 7), se as análises das amostras a partir das plantas são para serem executadas em tais pratos de microtitulação. Isso permite uma identificação fácil das plantas que exibem um fenótipo de análise de interesse sem a necessidade de marcar as plan30 tas individuais.

A eliminação precoce de plantas que não compreendem o GOI é conseguida através de uma triagem com base em PCR ou outra triagem molecular, enquanto as plantas estão sendo regeneradas em Phytatrays ou em meios semissólidos ou líquidos, e antes do transplante das plantas para os tampões de crescimento ou para o solo.

Exemplo 6

Meios Semissólidos para a Cultura Durante a Regeneração de Plantas

Transformadas.

Os meios semissólidos para a cultura durante as fases de crescimento do calo, pré-regeneração e regeneração do processo de transformação e de cultura de tecido permite uma manipulação eficiente do tecido. A figura 8 resume um estudo de transformação executado sem um agente de seleção (painel mais baixo), quando comparado a um estudo paralelo no qual o tecido da planta foi cultivado na presença de um agente de seleção (painel superior). Ver as Tabelas 1 e 7 com relação aos componentes dos meios. As fases de proliferação dos calos, pré-regeneração e de regenera15 ção foram executadas em um meio semissólido como mostrado. Depois de uma segunda fase de regeneração, as plantas são transplantadas para dentro de tampões de crescimento e analisadas com relação a presença de um GOI.

Tabela 7 - Composições de meios usadas em um método anterior compreendendo meios de seleção semissólidos contendo glifosato (Cai et ap Pedido de Patente U.S. Publicado 2004/00244075),

1084 (formação de raiz)

I 2,165 g

O

O

o

O

O

0,5 mg

0,75 mg

O) o CM

O

O

O

O

O

O

O

σι co

o

O

0,1 mM |

O

| 8‘S

1071 (segunda regeneração)

4,33 g

o

-J E

o

o

o

O

O

O

CD O

CD o CM

o

0,5 I

0,15 |

0,1 g I

o

CD co

O

250 mg I

0,1 mM |

o

CO in

1073 (primeira regeneração

4,33 g |

o

E

. 3,5 mg I

o

o

o

o

CD o co

O

O

1,38 g I

I 0,05 g I

O

O

o

CD CO

o

250 mg

0,1 mM

o

I 5,8 j

o CO Ά t> <M Φ V- φ (0

4,33 g |

10 mL ]

o

0,01 mg l

CD E LO o'

0,5 mg

o

o

30 g |

O

O

CD 00 co

I°-5 g J

o

o

o

CD co

o

I 500 mg

0,1 mM

3,4 mg

I 5,8

1233 (cocultura)

2,165 g l

E o

o

O

CD E LO o~

3 mg J

o

o

20 g l

CD O

O

115 mg

o

o

o

I 5,5 g

o

D O o CM

500 mg 1

O

| 3,4 mg I

I 5,2

Componentes dos meios/1 (fornecedores)

| MS Sais Basais (Phytotech) |

I MS Vitaminas (100X) (Phytotech) |

| MS Fromm Vitaminas (1000Χ)* |

| BAP (Sigma) |

| Tiamina HCL (Sigma)

I 2,4-D (Phytotech) Π

NAA (Sigma)

IBA (Sigma) Π

| Sacarose (Phytotech) l

l Glicose (Phytotech) I

| Maltose (Phytotech)

Prolina (Sigma)

| Ácidos Casamino (Difco)

| Asparagina mono hidrato (Sigma)

Mio-inositol (Sigma)

| Agarose de baixo EEO (Sigma)

Phytagel (Sigma)

Acetosiringona (Aldrich)

I Carbenicilina (Phytotech)

I Glifosato (Gateway Chemical)

| Nitrato de Prata (Sigma)

X Q_

ro

E σ>

w ω

c

Ε <p *4—»

Φ σ

Õ

X

Ο)

Ε ο

LO <Μ ω

Ε

Ο) ω

(Ο

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φ σ

Õ

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ΙΟ

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ο 'c ο

ρ

Ό «5 φ

Τ3

Ε ο ΙΟ CM τ—

Ο

-σ c

φ

Τ3

C

Φ

Φ

Ω.

Ε ο

Ο e 250 mg/l pantotenato de cálcio (Sigma).

Exemplo 7

Cultura Líquida Durante a Regeneração de Plantas Transformadas

A cultura líquida durante as fases de crescimento dos calos, préregeneração e regeneração do processo de transformação e de cultura de 5 tecido permite uma manipulação eficiente dos tecidos. A figura 9 ilustra os estudos de transformação e de regeneração executados sem um agente de seleção antes da regeneração. As fases de proliferação de calos, préregeneração e regeneração foram executadas em meio líquido isento de glifosato, como mostrado. Depois de uma fase de segunda geração, que pode ocorrer de forma alternativa em um meio semissólido, as plantas foram transplantadas para dentro de tampões de crescimento. As análises histoquímicas de GUS podem ser combinadas com aquelas de base em PCR ou outras triagens, tais como uma triagem substituta com, por exemplo, glifosato para detectar a expressão de, por exemplo, tolerância ao glifosato no teci15 do de planta regenerado. Esses experimentos foram realizados tanto com a utilização de um vetor sem um gene de marcação (isto é, pMON97372) ou com um gene de marcação (pMON93040).

O plasmidio para o estudo ilustrado na figura 9 foi o pMON93040 contendo os genes cp4 e gus. Foram isolados embriões de ca20 da espiga dentro de pratos Petri com 1 ml de meio Lynx 1013 e cocultivados em Lynx 1947. Os embriões foram divididos entre os diversos tratamentos como mostrado na Tabela 8 abaixo, incluindo 8 semanas com seleção (Tratamento 1); 8 semanas sem seleção, cultura líquida, com crescimento em meio solido em PHYTATRAY (Tratamento 2); e 8 semanas sem seleção, cultura líquida, com crescimento em meio líquido em PHYTATRAY (Tratamento 3). A transformação sem a utilização de seleção foi bastante eficiente (~ 1/3 X) quando comparada ao que foi conseguido com a utilização de seleção. Um resumo dos resultados do método de tampão líquido está mostrados na Tabela 8. Quando uma pequena amostra de ex-plantas foi levada adiante comente com a utilização de cultura líquida (isto é, o tratamento N° 3, usando Lynx 2168 como o meio de crescimento final), a eficiência foi mais alta e quase tão alta quanto a que foi obtida com a seleção. A cultura líquida parece promover a regeneração mais eficiente de eventos transgênicos co mo é evidente a partir da Tabela 9. É provável que a eliminação da sub cul tura reduza o estresse e acelere a regeneração da planta.

Tabela 8 - Transformação eficiente com a utilização do esquema de tampão líquido e sem a utilização de seleção

% TF

<d

CO o LO

co co

CO co CN

CN nF co

CO co

CN co v~

σί

u- oo

r* co r*

42,9

55,6

18,2 I

37,7 |

N° IE com eventos

co

N-

b-

r*

LO

co

co

-

io 'φ

O)

O

Ν’

co CN

N° Ex-plantas (IEs)

30

i_30. J

30

30

120 J

i 09

00 00

co co

127

343 I

CN

00 T“

CN CN

V» co

Tamanho IE

2,5-2,8 |

1,9-2,1 |

1,9-2,2 |

2,5-2,8 j

| Total

CN

2,5-2,8

1,9-2,1

1,9-2,2

Total

2,5-2,8 j

1,9-2,1 S

1,9-2,2 i

| Total

Tratamento

Seleção líquida - 8 semanas

Transformação sem seleção usando cultura líquida com uma etapa de triagem com pulverização com PHYTATRAY + glifosato

Transformação sem seleção usando cultura líquida com triagem por pulverização com glifosato depois do transplante para os tampões

o Z Q. X LU

| 7530-1 |

| 7531-1 I

| 7532-1 I

| 7533-1 I

I 7529-1 |

| 7530-2 |

| 7531-2

I 7532-2

| 7530-3

| 7531-3

| 7532-3

o

ICO o

co

L_ φ

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Φ σ}

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o

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co

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« E	CN	CN	CN	co
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o	00	CO	CO
z	t o	1 v~	1 CN
	co	CO	CO
	LO	LO	LO
LLI	b-

Exemplo 8

Eficiência de Transformação quando Relacionada à Duração da Fase de

Proliferação de Calos.

O papel da duração da fase de proliferação de calos na fre5 quência da transformação é ilustrado na Tabela 10. A redução da duração da fase de calos aumentou a TF, produzindo plantas com mais rapidez.

Tabela 10 - Fase mais longa de proliferação de calos tem impacto negativo na transformação sem a seleção.

ExpN° Tratamento I Tamanho IE N° para seleção N° IE com eventos %TF

7533-1 Sei - 8 semanas de cultura líquida 2,5 - 2,8 30 7 23,3 o

O

Φ

Φ ω

E φ

ω σ>

Exemplo 9

Transformação e Regeneração Com a Utilização de Cultura Líquida Rápida

Sem Seleção.

Para ainda aperfeiçoar mais o processo, um protocolo de ciclo 5 de líquido rápido (RLC) foi desenvolvido, com 6 semanas de duração, no qual a etapa de proliferação dos calos (Lynx 2133) foi omitida. As etapas no esquema de transformação incluíram: fases de pré-regeneração (Lynx 2197), e de regeneração (Lynx 2168 e Lynx 1607 como por exemplo, a figura 9 e a Tabela 11). pMON93040, contendo os genes Cp4 e gus, foi usado para este estudo. Embriões a partir de cada espiga foram isolados sobre um prato Petri com meio líquido (Lynx 1013), cocultivados em meio Lynx 1947, e divididos entre os tratamentos mostrados na Tabela 11. Os tratamentos incluíram a comparação do TF dos embriões com ou sem seleção e comparando os efeitos tanto de 1 ou 2 semanas em meio de proliferação Lynx

2197. Como mostrado na Tabela 11, uma redução da duração no meio de proliferação Lynx 2197 afetou a TF. No entanto, a transformação sem a seleção resultou em um TF comparável ao TF conseguido com a utilização de seleção quando foi usada uma duração ótima do crescimento em meio de pré-regeneração.

Tabela 11 - Transformação Eficiente Usando o Protocolo de Cultura Líquida rápida sem Seleção

Eventos /100 plantas	V/N	I 4,9	r-	I 5,1 I	xr CM	1 4,7 1	CM <*>
V)
a>
Ό
Q.
E
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	Φ	an	CD C	CM X	ão	CD C	CM X	Φ
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	ω		CD	Φ	em	CD	Φ	<0
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O Z	CO 1 CM	1 CO	l··—	5-1	3-2	5	5-1	3-2	2
&	CO	CO		CO	CO	Lo	CO	CO
X	cd	CD		CD	ct>		<y>	o
UJ	r-	h-		r-	r-			r^·

Nesses experimentos, a duração das fases de proliferação de calos, pré-regeneração e regeneração foram ainda reduzidas, e o uso de seleção foi comparado ao crescimento em meios não seletivos. A redução nos nas etapas exigidas de manipulação de tecidos torna esse método mais acessível à automação (ver também a Tabela 15).

Uma comparação do nível de expressão de plantas selecionadas obtidas da forma descrita acima revelou níveis de expressão (Tabela 12) que podem ser comparados seguindo a análise com base em PCR com relação ao sinal de transcrição de terminação pinll'3.

Tabela 12 - Análise da expressão de plantas categorizada pelo numero de cópias do transgene

Tratamento	N° cópias com relação a UTR Pinll 3'	N° Plantas analisadas	Valor médio de expressão com relação a UTR Pinll 3'.	SD
RLC com	1	70	1,432	1,5
seleção	2	28	1,902	2,6
RLC sem	1	44	0,957	3,37
seleção*	2	35	0,809	1,3

*As plantas de sem seleção eram 2 semanas mais velhas na ocasião da amostragem.

Um resumo da linha de tempo do protocolo de cultura líquida rápida sem seleção é fornecido na Tabela 13.

Tabela 13 - Protocolo de cultura líquida rápida sem seleção

Condições de cultura |	1 dia @ 23°C, escuro; 6 dias à 30°C, escuro |	30°C, escuro |	30°C, escuro |	27 - 28°C, luz |	27 - 28°C, luz |	Transferência das ex-plantas para as PHYTATRAY |	Endurecimento das plantas	Com relação a tolerância ao glifosato ou para a análise ou para a análise de PCT para o GOI |	Γ Atribuir números aos eventos e avanço dos eventos positivos.
Meio N°	Lynx 1947 Π	Lynx 2197/2379/ 2282]	Lynx 2168 |	Lynx 2168	Lynx 2168 I	Lynx 1607 I	Transplante	Amostra	Avanço
I Dias I	Ό O	I 1a semana I	I 2a semana I	3a semana	ro c ro e φ (Λ <0	ro c ro £ φ ω nj LO	~8a semana	10 dias depois do transplante	| 20 dias depois do transplante

Para validar os resultados acima com base no protocolo descrito na Tabela 13, foram realizados três experimentos usando a transformação com pMON93049. Os embriões foram divididos entre os diversos tratamentos, como mostrados na Tabela 14. Nesses experimentos as análises de

GOI foram realizadas em rebentos. O glifosato não foi pulverizado. Os embriões de cada espiga foram isolados em um prato Petri com 1 ml de meio líquido Lynx 1013 e co cultivados em Lynx 1947. Com é evidente a partir dos resultados, a transformação sem a utilização de seleção é bastante eficiente (> 60%) quando comparado ao que foi alcançado com a utilização de sele10 ção.

Tabela 14. Protocolo de transformação rápida funciona com eficiência tanto com seleção como sem seleção

Eventos em plantas 1IE	N/A	LO LO	θ,5 I	' Ã2	Ό- <o
SD	3,3 I	3,5 ]	3,3	co
Eventos /100 plantas	6,6 J	I__4,7 .......... I	3,8 |	IO
N° Plantas	347 |	I 387 ]	! 373	[ 369 )
u. 1-	43,6 1	42,5 j	45 ]	Γ 43,6	30,7	| 30	I 23,3	í 28,2
N° Eventos 1	24 j	Μ- CO	C\l	Vi 00	Γ 23 |	00		LO LO
N° ex-plantas (IE's)	55	O 00	09	LO o> T*	75	| 60	09 |	| 195
Tratamento	RLC, seleção	Media	RLC, sem seleção	| Média
Expt N°	Γ8105-4 |	I 8106-4 J	| 8107-4 I	L-80L8 I	I 8108-2	CO 1 00 O 00

Com a finalidade de compreender melhor a natureza da proliferação de células e o efeito da mesma sobre a transformação sem a seleção, foram realizados experimentos adicionais com a utilização de dois meios de cocultura diferentes (Lynx 1947 com 0,5 mg/l 2, 4-D e Lynx 2232 (com 0,2 mg/l 2, 4-D). Os embriões a partir de cada meio de cocultura foram igualmente divididos em dois grupos e cada um transferido para ou meio de préregeneração (com 0,2 mg/l 2, 4-D - Lynx 2197) ou meio de regeneração (sem quaisquer reguladores de crescimento - Lynx 2282). Foram realizados cinco experimentos (8415 - 8419) utilizando um vetor de transformação sem marcador (pMON97372) contendo somente o gene uidA. Um esboço da abordagem experimental é dado na figura 9. Depois de estabelecer as plantas em tampões, as plantas de cada uma das linhas derivadas de embriões foram juntadas e marcadas com relação a GUS para a identificação das linhas positivas. Mais tarde, foi realizada outra marcação para GUS das linhas indi15 viduais a partir dos clones positivos para identificar os eventos positivos com relação ao GUS. Cerca de 1/5 dos embriões de cada espiga foram inoculados em separado com um vetor de controle uidA+cp4 (pMON97367) e o protocolo RLC (por exemplo, da Tabela 13) foi seguido para a comparação dos resultados da transformação com ou sem a seleção (experimento 8420). Os resultados de tais experiementos estão resumidos nas Tabelas 15 e 16.

Tabela 15 - Transformação eficiente sem seleção usando um vetor gus (pMON 97372)

%TF (com base em N° Phytatrays)

30 |

CM

r<

20 |

í 18,9 |

[ 19,4 |

( 26,5 |

I 20,6 |

I 15,6 |

í 26,5 |

I 12,2 I

I 19,7 |

\ 19,4 |

Γ- o“ V

I 22,7 I

1 10,8 |

I 15,4 I

I 13,3 |

cm

l·-’

N. CM V

%TF (com base em N° para seleção)

m

LO

LO

13,3 |

r-

12

LO v~

LO

8,3

12,3

CD LO

I 6,7

T~-

O

I 10,9

<4,

CD cd

1 8,9

CO co v-

Oi 00

N° IE com eventos

cd

cd

co

00

h-

36 |

CD

05

LO

I 78 \

h-

CO

LO

Γ 37

CM

CD

9t I

Total N° plantas para tampões

273 I

co r- CM

co CM

CM «sr CO

405 |

£ in

LO O CM

274 |

290 I

CM CO CM

445 ]

1574 |

398

CD CO CM

276

| 256

| 1169

I 297

I 208

| 226

| 342

| 1073

N° Para Phytatrays

O co

I ζε

CM Tf

40 I

co

186 I

34 I

34 |

45 I

CO

188 |

CD CO

I 28

I 22 I

ζε I

I 123

I 28

I 30

I 33

LO CO

co CM v-

N° Ex- plantas (lEs)

| 09

I 09

O CD

O CD

| 09

300 I

| 09

j 09

í 09

60

l 09 1

300

LO

LO

LO

o

I 175

I 45

LO sf

LO Xt

LO

O 00 V-

Tamanho IE

CO cm

CM

M CM

CD

CM

I Total I

2,3 I

CM

cm

CD T“

CM

Total

CM

cm

CD

CM

CM

CM

CD

cm

I Total

T ratamento

Co cultura em Lynx 1947 - 1a, regeneração em Lynx 2197

Co cultura em Lynx 1947 - 1a, regeneração em Lynx 2282

-1 Co cultura em Lynx 2232 - 1a, regeneração em Lynx 2197

Co cultura em Lynx 2232

5 0 Ό z» 2 c D C ü 1

M 0 M M < J

Expt N°

I 8415-1 I

I 8416-1 I

8417-1

1 00 00

8419-1

8415-2 I

8416-2

8417-2

8418-2

8419-2

8416-3

8417-3

CO 1 OO OO

8419-3

8416-4

1 00

1 00 M· OO

8419-4

Tabela 16 - Experimentos de transformação com a utilização de um (pMON97367) com seleção indica que a transformação sem seleção é eficiente

%TF (com base em N° para seleção)	CM	12,5 |	O	CO		<o o?
N° IE com eventos	<D			Ό·	co	<N CN
N° para seleção	50 |	40 I	40 |	50	50	[ 230
Tamanho ΙΕ I (mm) I	L	CM	L ... 2,4 J	cr>	cm'	| Total
Controle para	8415	8416	8417 ι	00 M· 00	1 8419
Tratamento j	Transformação usando RLC com pMon97367
Experimento N°	I 8420-1 |	8420-2	8420-3	M· 1 O CM 00	8420-5

Como fica evidente a partir da Tabela 15, o meio de co cultura

Lynx 1947, com uma concentração de 2,4 D mais alta do que o Lynx 2232,

COI considerado como sendo superior. Esses resultados indicam que a proliferação de células antes da regeneração contribui para ser obtida uma transformação eficiente sem seleção. Além disso, a regeneração das explantas em um meio livre de regulador de crescimento (por exemplo, o Lynx 2282) em seguida a cocultura não reduz de forma apreciável o número de plantas/embriões. A comparação da frequência de transformação com os embriões que foram transformados com pMON97367 com a utilização do protocolo RLC demonstra a transformação sem a seleção como sendo efetiva. Além do mais, a análise do número de cópias indicou uma percentagem mais alta de plantas com inserto de cópia mais baixo (Tabela 17).

Tabela 17 - A transformação sem a seleção resultou em uma porcentagem mais alta de eventos de cópia única negativos para or/V.

Total N° de Plantas Analisadas	% de eventos de cópia única, sem oriV
122	66 (55%)

É imaginado que a ausência de seleção, e/ou o T-DNA mais curto podem ser as razões para uma percentagem mais alta da produção de eventos que possam ser usados. Para os tratamentos sem seleção, a faixa de tamanho de preferência para os embriões é ligeiramente maior (2,0 a 2,3 mm) do que a faixa de tamanho de embriões (1.9 a 2,1) usada para RLC. A validação através de hibridização Southern de ~ 120 eventos (Tabela 17) indicou que todos os eventos são independentes. Isso enfatiza ainda mais as descobertas iniciais que sob um TF mais baixo (~ 15%) a maioria dos eventos produzidos são eventos independentes indicando que a adoção de uma estratégia de ajuntamento antes do transplante para os tampões de crescimento pode aumentar ainda mais a eficiência do protocolo.

Exemplo 10

Triagem das Plantas antes do Transplante para os Tampões para Eliminar as Plantas não Transgênicas Aumenta a Eficiência.

As plantas a partir de um único recipiente que contém o meio fi30 nal de crescimento (Lynx 1607) foram unidas e analisadas com relação a ambos, gus com a utilização da análise histoquímica para GUS e a presença do transgene com a utilização de PCR. Foi obtida uma correlação de 100% entre as análises GUS e PCR. Este estudo permitiu a eliminação dos recipientes de crescimento sem evento positivo reduzindo bastante por meio disso o esforço para a manipulação das plantas e aumentando o rendimento.

Todas as composições e/ou métodos descritos e reivindicados aqui, neste pedido de patente podem ser feitos e executados sem experimentação indevida na luz da presente descrição. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalida10 des de preferência, se tornará aparente àquelas pessoas versadas na técnica que podem ser aplicadas variações as composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui, neste pedido de patente sem que se afastem do conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, se tornará aparente que determinados agentes que sejam ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados possam ser substituídos pelos agentes descritos aqui, neste pedido de patente, embora possam ser alcançados os mesmos resultados ou resultados similares. Todos esses substitutos similares e modificações aparentes as pessoas versadas na técnica estão destinados a ficarem dentro do espírito, âmbito e con20 ceito da invenção, na forma definida pelas reivindicações em anexo. Referências

The references listed below are incorporated herein by reference to the extent that they supplement, explain, provide a background for, or teach methodology, techniques, and/or compositions employed herein.

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Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a identificação de plantas de milho transgênicas, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) obtenção células de planta de milho embriogênicas transfor5 madas com um segmento de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucléico de interesse;

   (b) regeneração de uma pluralidade de plantas de milho ou de partes de plantas de milho diferenciadas a partir das células sem primeiro selecionar ou triar com relação à presença do referido segmento de DNA;

   10 (c) identificação de pelo menos uma primeira planta de milho transgênica ou uma parte de planta transgênica diferenciada a partir de uma pluralidade de plantas de milho ou de partes de plantas de milho diferenciadas.

   em que a planta regenerada ou a parte de planta diferenciada é

   15 uniforme com relação a presença do segmento de DNA.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segmento de DNA não compreende um gene marcador selecionável ou um gene marcador visual.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 20 fato de que as plantas são regeneradas pelo crescimento em meios sólidos, meios líquido, ou uma combinação de meios sólidos e líquidos.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as plantas são regeneradas através de crescimento somente em meios líquido antes da identificação da planta de milho transgênico ou da

   25 parte da planta transgênica diferenciada.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a frequência de transformação das células crescidas somente em meios líquido em seguida ao contato das células com um gene de interesse e antes da identificação das plantas transgênicas ou de partes de

   30 plantas transgênicas é aumentada com relação à frequência de transformação observada quando as células são cultivadas em meios sólidos, meios semissólidos, meios líquidos e/ou solo, ou uma combinação de meios sóliPetição 870170018118, de 20/03/2017, pág. 13/25 dos, meios semissólidos, meios líquidos e/ou solo, em seguida ao contato das células com um gene de interesse e antes da identificação das plantas transgênicas ou partes de plantas transgênicas.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 5 fato de que as células da planta são células de embriões imaturos de milho.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os embriões imaturos de milho são a partir de cerca de 1,5 mm até cerca de 3,5 mm de comprimento.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo 10 fato de que os embriões imaturos de milho são a partir de cerca de 1,9 mm até cerca de 2,3 mm de comprimento.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, entre as etapas (b) e (c):

   (1) colocar a pluralidade de plantas de milho ou as partes de 15 plantas diferenciadas em tubos de cultura ou batoques de crescimento compreendendo um meio de crescimento ou água enquanto é mantida a identidade individual das plantas de milho; e (2) submetendo as plantas ou as partes de plantas a pelo menos uma primeira analise com relação a presença do segmento de DNA para

   20 identificar uma ou mais plantas ou partes de plantas como transgênicas com base nos resultados da analise.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, no qual a analise é selecionada a partir do grupo que consiste de hibridização Southern, PCR, seqüenciamento de DNA, northern blotting, western blotting, uma imuno

    25 análise e uma análise com relação a atividade enzimática codificada pelo segmento de DNA.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a analise é realizada antes da colocação das plantas regeneradas no solo.

    30
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as plantas de milho putativamente transformadas ou as partes de plantas diferenciadas que não contem a sequência de ácido nucléico de

    Petição 870170018118, de 20/03/2017, pág. 14/25 interesse são identificadas, em que a análise é executada em tecido de planta compreendendo os conjuntos ajuntados de ácidos nucleicos a partir da referida pluralidade de plantas de milho ou de partes de plantas de milho diferenciadas.

    5
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas de milho ou as partes de planta de milho são regeneradas não mais tarde do que 6 semanas depois do segmento de DNA seja transformado dentro das células da planta de milho.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 10 fato de que as plantas de milho ou as partes de planta de milho são regeneradas não mais tarde do que 4 semanas depois do segmento de DNA seja transformado dentro das células da planta de milho.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas de milho ou as partes de planta de milho são regene15 radas não mais tarde do que 3 semanas depois do segmento de DNA seja transformado dentro das células da planta de milho.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas de milho ou as partes de planta de milho são regeneradas não mais tarde do que 2 semanas depois do segmento de DNA seja

    20 transformado dentro das células da planta de milho.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas de milho ou as partes de planta de milho são regeneradas não mais tarde do que 1 semana depois do segmento de DNA seja transformado dentro das células da planta de milho.

    25
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segmento de DNA é introduzido no interior da célula da planta de milho através de transformação mediada por bactéria, eletroporação, transformação mediada por PEG ou bombardeamento de partícula.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe30 lo fato de que a transformação mediada por bactéria é mediada por uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo que consiste de uma célula de Agrobacterium, uma célula de Rhizobium, uma célula de Sinorhizobium, e

    Petição 870170018118, de 20/03/2017, pág. 15/25 uma célula de Mesorhizobium.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende também a etapa de submeter uma planta de milho ou uma parte de planta derivada a partir da primeira célula de planta de milho a condições de cultura que selecionem com relação a ou permitam a triagem com relação a presença ou a ausência da sequência de acido nucléico de interesse depois da regeneração da planta ou da parte da planta.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento é um meio sólido.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento é o solo.

    Petição 870170018118, de 20/03/2017, pág. 16/25

    1/9