BRPI0716963A2 - Expressão geneticamente programada de proteínas seletivamente sulfatadas em eubactéria - Google Patents

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Chang C Liu
Peter G Schultz
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Scripps Research Inst
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Description

"EXPRESSÃO GENETICAMENTE PROGRAMADA DE PROTEÍNAS SELETIVAMENTE SULFATADAS EM EUBACTÉRIA"
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
Pedido Provisório Seriado dos Estados Unidos No. 60/846.519, depositado em 21 de Setembro de 2006; e Pedido Provisório Seriado dos Estados Unidos No. 60/855.210, depositado em 28 de Outubro de 2006, as revelações dos quais são ambas aqui incorpora- das por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
RELATO COMO DIREITOS PARA INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO Esta invenção foi feita com suporte governamental a partir de Institutos Nacionais
de Saúde sob a Concessão No. GM62159. O governo pode ter certos direitos a esta inven- ção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção está no campo de tradução bioquímica. A invenção relaciona-se a com- posições e métodos para fazer e usar tRNAs ortogonais, aminoacil-tRNA sintetases ortogo- nais, e pares dos mesmos, que incorporam aminoácidos não naturais em proteínas. A in- venção também se relaciona aos métodos de produção de proteínas em células utilizando tais pares e proteínas feitas pelos métodos.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO Sulfação de tirosina é uma modificação pós-traducional em proteínas ligadas a
membrana e secretadas (Kehoe e Bertozzi, "Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein-protein interactions.," Chem Biol 7:R57-61 (2000)). Embora nós estejamos somente começando a entender a extensão de sua função biológica, sulfotirosina tem já sido identifi- cada em vários paradigmas de interação proteína-proteína. Por exemplo, sulfação de tiros- ina desempenha um papel determinante na ligação de quimiocina para os receptores de quimiocina CCR2 (Preobrazhensky et al, "Monocyte chemotactic protein-1 receptor CCR2B is a glycoprotein that hás tyrosine sulfation in a conserved extracellular N-terminal region" J Immunol 165:5295-5303 (2000)), CCR5 (Farzan et al, "Tyrosine sulfation of the amino termi- nus of CCR5 facilitates HIV-1 entry" Cell 96:667-676 (1999)), CXCR4 (Farzan et al, "The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino terminus in stromal-derived factor 1 alpha association and HIV-1 entry," J Biol Chem 277:29484-29489 (2002); Veldkamp et bI, "Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha/CXCL12)," J Mol Biol 359:1400-1409 (2006)) e CX3CR1 (Fong et al, "CX3CR1 tyrosine sulfation enhances fractalkine-induced cell adhesion," J Biol Chem 277:19418- 19423 (2002)). Similarmente, o rolamento de leucócitos sob estresse de corte hidrodinâmica requer sulfação da PSGL-1 para a ligação e adesão adequadas (Somers et al, "Insight sinto the molecular basis of Ieukocyte tethering and rolling revealed by structures of P- and E- selectin bound to SLe(X) e PSGL-1" Cell 103:467-479 (2000)). Sulfação de tirosina é tam- bém envolvido na cascata de coagulação, tendo sido identificado nos vários fatores de coa- gulação bem como nos inibidores naturais de trombina tal como hirudina anticoagulante se- cretado de sangue-suga ( Dong et al, "Tyrosine sulfation of the glycoprotein Ib-IX complex: Identification of sulfated residues and effect on Iigand binding", Biochemistry 33:13946-13953 (1994); Badgy et al, "Hirudina," Methods Enzymol 45: 669-678 (1976)). Em adição, foi recen- temente descoberto que sulfação de tirosina em uma região da alça variável do anticorpo é responsável para a atividade neutralizante de um subgrupo de anticorpos de HIV-1 induzido por CD4, então demonstrando a habilidade da sulfotirosina aumentar a afinidade anticorpo- antígeno (Choe et al, "Tyrosine sulfation of human antibodies contributes to recognition of the CCR5 binding region of HIV -1 gp120," Cell 114:161-170 (2003); Xiang et al, "Functional mimicry of a human immunodeficiency vírus type 1 coreceptor by a neutralizing monoclonal antibody," J Virol 79:6068-6077 (2005)).
Um obstáculo principal para determinar as funções de sulfação de 60 conhecidos e 2100 proteínas preditas contendo sulfotirosina (baseada em um estudo de seqüências de proteína de camundongo) é a habilidade para sintetizar seletivamente de proteínas sulfata- das (Moore, "The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation," J Biol Chem 278:24243-24246 (2003)). Métodos correntes dependem em síntese de peptídeo padrão ou em sulfação enzimática in vitro (Veldkamp et al, "Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha/CXCL12)," J Mol Biol 359:1400-1409 (2006); Kirano et al, "Total synthesis of porcine cholecystokinin-33 (CCK- 33)," J Chem Soc Chem Commum, 323-325 (1987); Muramatsu et al, "Enzymic O-sulfaton of tyrosine residues in hirudinas by sulfotransferase from Eubacterium A-44," Eur J Biochem 223:243-248 (1994); Young e Kiessling, "A strategy for the synthesis of sulfated peptides," Angew Chem Int Ed Engl 41:3449-3451 (2002)); entretanto, ambos faltam generalidades: o anterior é limitado por restrições de comprimento e a tendência voltada para a desulfação de sulfotirosina sob condições acídicas; o último é limitado pela disponibilidade de sulfotransfe- rases acessórias e sua seqüência de reconhecimento associada limitada.
A incorporação direta de um aminoácido não natural geneticamente codificando sul- fotirosina nos sítios definidos nas proteínas diretamente nos organismos vivos pode superar as limitações descritas acima. A incorporação direta de sulfotirosina grandemente facilitará o estudo dos eventos de sulfação na regulação dos processos biológicos e também será per- mitido para a criação de anticorpo sulfatado e bibliotecas de peptídeos de diversidade signi- ficante. Além disso, a habilidade de produzir uma forma sulfatada da proteína hirudinaa tem aplicação clínica imediata para uso como um anticoagulante melhorado (melhora relativa a forma não sulfatada). O que são necessários na técnica é novas estratégias para incorpora- ção de aminoácidos não naturais de sulfotirosina nas proteínas. Uma metodologia geral tem sido desenvolvida para a incorporação sítio-específica in vivo de aminoácidos não naturais diversos em proteínas em ambos, organismos procarió- ticos e eucarióticos. Esses métodos se baseiam nos componentes de tradução protéica or- togonal que reconhecem um códon seletor adequado para inserir um aminoácido não natu- ral desejado em uma posição definida durante a tradução do polipeptídeo in vivo. Esses mé- todos utilizam um tRNA ortogonal (O-tRNA) que reconhece um códon seletor, e onde uma correspondente aminoacil-tRNA sintetase ortogonal específica (uma O-RS) carrega o O- tRNA com um aminoácido não natural. Esses componentes não reagem cruzadamente com quaisquer dos tRNAs, RSs, aminoácidos ou códons endógenos no organismo hospedeiro (isto é, ele pode ser ortogonal). O uso de tais pares tRNA-RS ortogonais têm feito possível geneticamente codificar um grande número de aminoácidos não naturais estruturalmente diversos.
A prática do uso de sistemas de tradução ortogonais que são adequados para fazer proteínas que compreendem um ou mais aminoácidos não naturais é geralmente conhecido na técnica, como são métodos gerais para produção de sistemas de tradução ortogonais. Por exemplo, ver Números de Publicação Internacional WO 2002/086075, intitulado "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA- AMINOACYL-tRNA SYNTHASE PAIRS;" WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/19415, depositado em 7 de Julho de 2004; WO 2005/007870, depositado em 7 de Julho de 2004; WO 2005/007624, depositado em 7 de Julho de 2004 e WO 2006/110182, depositado em 27 de Outubro de 2005, intitulado ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS." Cada um desses pedidos é aqui in- corporado por referência em sua totalidade. Para discussão adicional dos sistemas de tra- dução ortogonais que incorporam aminoácidos não naturais, e métodos para sua produção e uso, ver também, Wang e Schultz, "Expanding the Genetic Code", Chem Commun (Camb) 1:1-11 (2002); Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code", Angewandte Chemie Int Ed. 44(1):34-66 (2005); Xie e Schultz, "Na Expanding Genetic Code", Methods 36(3):227-238 (2005); Xie e Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr Opinion in Che- mical Biology 9(6):548-554 (2005); Wang et al, "Expanding the Genetic Code," Annu Ver Biophys. Biomol. Struct, 35:225-249 (2006; epub 13 de Janeiro de 2006); E Xie e Schultz, "A chemical toolkit for proteins - na expanded genetic code," Nat Ver Mol Cell Biol, 7(10):775- 782 (2006; epub 23 de Agosto de 2006).
Existe uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de componentes de tradução ortogonal que incorporam aminoácidos não naturais de sulfotirosina em proteínas, onde o aminoácido não natural pode ser incorporado em qualquer posição definida. A inven- ção descrita aqui preenche essas e outras necessidades, como será aparente sob revisão da seguinte revelação.
RESUMO DA INVENÇÃO
Embora a sulfação da tirosina seja uma modificação pós-traducional freqüente atra- vés de eucariotos multicelulares (Moore, "The biology and enzymology of protein tyrosine O- sulfation", J Biol Chem 278:24243-24246 (2003)), suas funções biológicas permanecem am- plamente desconhecido. Isto é em parte pelas dificuldades associadas com a síntese de proteínas seletivamente sulfatadas. A invenção provê para a incorporação seletiva de sulfoti- rosina em proteínas em bactérias por geneticamente codificar o aminoácido modificado em resposta ao códon não senso âmbar, TAG. Além disso, é demosntrado que sulfo-hirudina, previamente inacessível através de métodos recombinantes, podem ser diretamente ex- pressos em E. coli utilizando esta estratégia. Como descrito aqui, análises cinéticas mostra- ram um aumento maior que 10 vezes em afinidade para a trombina humana por sulfo- hirudina em desulfo-hirudina, uma observação que oferece vantagens clínicas para sulfo- hirudina em seu uso como um anticoagulante (Di Nisio et al, "Direct thrombin inhibitors," N Engl J Méd 353:1028-1040 (2005)). Esta abordagem geral da síntese de proteínas sulfata- das facilita ainda estudo e aplicação da modificação pós-traducional emergente, sulfação de tirosina.
A invenção provê composições e métodos para incorporar o aminoácido não natural sulfotirosina em uma cadeia polipeptídica crescente em resposta a um códon seletor, por exemplo, um códon de parada âmbar in vivo (por exemplo, em uma célula hospedeira). Es- sas composições incluem pares de ortogonal-tRNAs (O-tRNAs) e aminoacil-tRNA sintetases ortogonais (O-RSs) que não interagem com a maquinaria de tradução da célula hospedeira. Isto é para dizer que o O-tRNA não é carregado (ou não carregado a um nível significante) com um aminoácido (natural ou não natural) por um aminoacil-tRNA sintetase endógeno da célula hospedeira. Similarmente, o O-RSs provido pela invenção não carrega qualquer tRNA com um aminoácido (natural ou não natural) a um nível significante ou detectável. Essas novas composições permitem a produção de grandes quantidades de proteínas tendo sulfo- tirosina traducionalmente incorporadas.
Em alguns aspectos, a invenção provê sistemas de tradução. Esses sistemas com- preendem uma primeira aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS)1 um primeiro tRNA orto- gonal (O-tRNA), e um primeiro aminoácido não natural que é sulfotirosona, onde o primeiro O-RS preferencialmente aminoacila o primeiro O-tRNA com o primeiro aminoácido não natu- ral sulfotirosina. Em alguns aspectos, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com a referida sulfotirosona com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de tradução compreendendo que o mesmo O-tRNA, a sulfotirosina, e um aminoacil-tRNA sintetase compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 4, 6, 8 OU 10. Os sistemas de tradição podem ser utilizar componentes derivados de uma varie- dade de fontes. Em uma modalidade, o primeiro O-RS é derivado de uma aminoacil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii, por exemplo, uma tirosil-tRNA sintetase de Metha- nococcus jannaschii. A O-RS utilizada no sistema pode compreender a seqüência aminoáci- da da SEQ ID N0:4, 6, 8 ou 10, e variantes conservativas desta seqüência adequada. Em algumas modalidades, o O-tRNA é um supressor de tRNA âmbar. Em algumas modalida- des, a O-tRNA compreende ou é codificada pela SEQ ID NO:1.
Em alguns aspectos, os sistemas de tradução ainda compreendem um ácido nu- cléico codificando uma proteína de interesse, onde o ácido nucléico tem pelo menos um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA.
Em alguns aspectos, o sistema de tradução incorpora um segundo par ortogonal (isto é, uma segunda O-RS e uma segunda O-tRNA) que utilizada um segundo aminoácido não natural, de forma que sistema é agora capaz de incorporar pelo menos dois diferentes aminoácidos não naturais em diferentes sítios selecionados em um polipeptídeo. Neste sis- tema duplo, o segundo O-RS preferencialmente aminoacila o segundo O-tRNA com um se- gundo aminoácido não natural que é diferente a partir do primeiro aminoácido não natural, e a segunda O-tRNA reconhece um segundo códon que é diferente a partir do códon seletor reconhecido pela primeira O-tRNA.
Em algumas modalidades, o sistema de tradução reside em uma célula hospedeira (e inclui a célula hospedeira). A célula hospedeira utilizada não é particularmente limitada, de forma que a O-RS e O-tRNA retêm sua ortogonalidade no ambiente de sua célula hos- pedeira. A célula hospedeira pode ser uma célula eurobacteriana, tal como E. coli. A célula hospedeira pode compreender um ou mais polinucleotídeos que codificam componentes do sistema de tradução, incluindo a O-RS ou O-tRNA. Em algumas modalidades, o polinucleo- tídeo codificando a O-RS compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
A invenção também provê métodos para produção de proteínas tendo um ou mais aminoácidos não naturais nas posições selecionadas. Esses métodos utilizam os sistemas de tradução descritos acima. Geralmente, esses métodos começam com o passo de prover um sistema de tradução compreendendo: (i) um primeiro aminoácido não natural que é ami- noácido sulfotirosina não natural; (ii) uma primeira aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O- RS); (iii) um primeiro tRNA ortogonal (O-tRNA), em que o O-RS preferencialmente aminoaci- la o o-tRNA com o aminoácido não natural; e, (iv) um ácido nucléico codificando a proteína, onde o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor que é reconhecido pelo primeiro O-tRNA. O método então incorpora o aminoácido não natural na posição selecio- nada na proteína durante a tradução da proteína em resposta ao códon seletor, assim pro- duzindo a proteína compreendendo o aminoácido não natural na posição selecionada. Em alguns aspectos desses métodos, o O-RS preferencialmente aminoacila a O-tRNA com a sulfotirosina com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de tradução compreendendo que alguma O-tRNA, a sulfotirosina, e uma aminoacil- tRNA sintetase compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:4, 6, 8 ou 10. Em alguns aspectos, os métodos são utilizados para produzir a forma sulfatada da hirudina.
Esses métodos podem ser amplamente aplicados utilizando uma variedade de rea- gentes e passos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo codificando a O-RS é provi- do. Em algumas modalidades, uma O-RS derivada de uma aminoacil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii, por exemplo, uma tirosil-tRNA sintetase de Methanococcus jan- naschii selvagem pode ser provida. Em algumas modalidades, o passo provido inclui prover uma O-RS compreendendo uma seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, e vari- antes conservadas das mesmas.
Em algumas modalidades desses métodos, é provido um passo do sistema de tra- dução que compreende mutar um aminoácido se ligando ao sítio de ligação de uma amino- acil-tRNA sintetase selvagem por mutagênese sítio-direcionada, e selecionando uma O-RS resultante que preferencialmente aminoacila a O-tRNA com o aminoácido não natural. O passo de seleção pode compreender seleção positiva ou seleção negativa para a O-RS a partir de um grupo de moléculas aminoacil-tRNA resultante seguindo mutagênese sítio dire- cionada. Em algumas modalidades, o passo provê o fornecimento um polinucleotídeo codifi- cando a O-tRNA, por exemplo, uma O-tRNA que é um tRNA supressor âmbar, ou um O- tRNA que compreende ou é codificado pelo polinucleotídeo da SEQ ID N0:1. Nesses méto- dos, o passo provido pode também fornece um ácido nucléico compreendendo um códon seletor âmbar que é utilizado pelo sistema de tradução.
Esses métodos podem também ser modificados para incorporar mais que um ami- noácido não natural em uma proteína. Nesses métodos, um segundo sistema de tradução ortogonal é empregado em conjunção com o primeiro sistema de tradução, onde o segundo sistema tem aminoácido diferente com o primeiro sistema de tradução, onde o segundo sis- tema tem aminoácido diferente e especificidades de códon seletor. Por exemplo, o passo provedor pode incluir prover uma segunda O-RS e uma segunda O-tRNA, onde a segunda O-RS preferencialmente aminoacila a segunda O-tRNA com um segundo aminoácido não natural que é diferente a partir do primeiro aminoácido não natural, e onde o segundo O- tRNA reconhece um códon seletor no ácido nucléico que é diferente a partir do códon sele- tor reconhecido pela primeira O-tRNA.
Os métodos para produzir uma proteína com um aminoácido não natural podem também ser conduzidos no contexto de uma célula hospedeira. Nesses casos, uma célula hospedeira é provida, onde a célula hospedeira compreende o aminoácido não natural, a O- RS, a O-tRNA e o ácido nucléico com pelo menos um códon seletor que codifica a proteína, e onde a cultura da célula hospedeira resulta em incorporação do ácido não natural. Em algumas modalidades, o passo de prover compreende prover uma célula hospedeira eubac- teriana (por exemplo, E. coli). Em algumas modalidades, o passo de prover passos inclui prover uma célula hospedeira que contenha um polinucleotídeo codificando a O-RS. Por exemplo, o polinucleotídeo codificando a O-RS pode compreende uma seqüência de nucleo- tídeo de SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11. Em algumas modalidades, o passo de prover um sistema de tradução é alcançado por prover um extrato celular.
A invenção também provê uma variedade de composições, incluindo ácidos nucléi- cos e proteínas. A natureza da composição não é particularmente limitada, a não ser que a composição compreenda o ácido nucléico especificado ou proteína. As composições da in- venção podem compreender qualquer número de componentes adicionais de qualquer natu- reza.
Por exemplo, a invenção provê composições compreendendo polipeptídeos O-RS, onde os polipeptídeos compreendem a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, ou uma variante conservada da mesma. Em alguns aspectos, o polipeptídeo da variante conservada aminoacila um cognato tRNA ortogonal (O-tRNA) com um aminoácido não natu- ral com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para o sistema de tradução compreendendo o O-tRNA, o aminoácido não natural, e uma aminoacil-tRNA sinte- tase compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10. A invenção também provê polinucleotídeos que codificam quaisquer desses polipeptídeos acima. Em algumas modalidades, esses polinucleotídeos podem compreender uma seqüência de nu- cleotídeos da SEQ ID NO:5, 7, 9 ou 11. Em algumas modalidades, os polipeptídeos estão em uma célula.
A invenção também provê composições de polinucleotídeos compreendendo uma seqüência nucleotídica da SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11. Em algumas modalidades, a invenção provê vetores compreendendo os polinucleotídeos, por exemplo, vetores de expressão. Em algumas modalidades, a invenção provê células compreendendo um vetor descrito acima.
DEFINIÇÕES
Antes de descrever a invenção em detalhes, é para ser entendido que esta inven- ção não é limitada a sistemas biológicos particulares, que podem, claro, variar. É também para ser entendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito de descrever somen- te modalidades particulares, e não é tencionado ser limitante. Como utilizado nesta especifi- cação e as reivindicações em apêndice, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem refe- rentes no plural a menos que o conteúdo claramente dita de outra forma. Então, por exem- plo, referência a " uma célula" inclui combinações de duas ou mais células; referência a "um polinucleotídeo" inclui, como uma forma de prática, muitas cópias daquele polinucleotídeo. A menos que definido aqui e abaixo no lembrete da especificação, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um dos versados na técnica para os quais esta invenção pertence.
Ortogonal: Como aqui utilizado, o termo "ortogonal" refere-se a uma molécula (por exemplo, um tRNA ortogonal (O-tRNA) e/ou uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O- RS)) que funciona com componentes endógenos de uma célula com eficiência reduzida co- mo comparado a uma molécula correspondente que é endógeno para a célula ou sistema de tradução, ou que falha para a função com componentes endógenos da célula. No contex- to de tRNAs e aminoacil-tRNA sintetases, ortogonal refere-se a uma inabilidade ou eficiência reduzida, por exemplo, menos que 20% de eficiência, menos que 10% de eficiência, menos que 5% de eficiência, ou menos que 1% de eficiência, de um tRNA ortogonal para função com um tRNA sintetase endógeno comparado a um tRNA endógeno para funcionar com o tRNA sintetase endógeno, ou de uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal para funcionar com um tRAN endógeno comparado a uma tRNA sintetase endógena para funcionar com tRNA endógeno. A molécula ortogonal tem ausência de uma molécula complementar endó- gena normal na célula. Por exemplo, um tRNA ortogonal em uma célula é aminoacilado por qualquer RS endógeno da célula com eficiência reduzida ou mesmo zero, quando compara- do a uma aminoacilação de um tRNA endógeno pelo RS endógeno. Em outro exemplo, um RS ortogonal aminoacila qualquer tRNA endógeno em uma célula de interesse com eficiên- cia reduzida ou mesmo zero, como comparado a aminoacilação de tRNA endógeno por um RS endógeno. Uma segunda molécula ortogonal pode ser introduzida nas células que fun- cionam com a primeira molécula ortogonal. Por exemplo, um par tRNA/RS ortogonal inclui componentes complementares introduzidos que funcionam junto na célula com uma eficiên- cia (por exemplo, 45% de eficiência, 50% de eficiência, 60% de eficiência, 70% eficiência, 75% de eficiência, 80% de eficiência, 90% de eficiência, 95% de eficiência, ou 99% de efici- ência) como comparado ao de um controle, por exemplo, um par endógeno de tRNA/RS correspondente, ou um par ortogonal ativo (por exemplo, um par tRNA/RS tirosil ortogonal).
Tirosil-tRNA ortogonal: como aqui utilizado, um tirosil-tRNA ortogonal (tirosil-O- tRNA) é um tRNA que é ortogonal a um sistema de tradução de interesse, onde o tRNA é: (1) idêntico ou substancialmente similar a um tirosil-tRNA de ocorrência de natural, (2) deri- vado a partir de um tirosil-tRNA de ocorrência natural por mutagênese natural ou artificial, (3) derivado por qualquer processo que toma uma seqüência de uma seqüência tirosil-tRNA selvagem ou mutante de (1) ou (2) em conta, (4) homólogo a uma tirosil-tRNA selvagem ou mutante; (5) homóloga a qualquer exemplo de tRNA que é designado como um substrato para uma tirosil-tRNA sintetase na FIG. 7, ou (6) uma variante conservativa de qualquer e- xemplo tRNA que é designada como um substrato para uma tirosil-tRNA sintetase na FIG. 7. A tirosil-tRNA pode existir carregada com um aminoácido, ou em um estado não carregado. É também para ser entendido que uma "tirosil-O-tRNA" opcionalmente é carregada (amino- acilada) por um cognato sintetase com um aminoácido outro que tirosina, respectivamente, por exemplo, com um aminoácido não natural. De fato, será apreciado que uma tirosil-O- tRNA da invenção é vantajosamente utilizada para inserir essencialmente qualquer aminoá- cido, se natural ou não natural, em um polipeptídeo crescente, durante a tradução, em res- posta a um códon seletor.
Ortogonal tirosil aminoácido sintetase: como aqui utilizado, um ortogonal tirosil ami- noácido sintetase (tirosil-O-RS) é uma enzima que preferencialmente aminoacila a tirosil-O- tRNA com um aminoácido em um sistema de tradução de interesse. O aminoácido que a tirosil-O-RS carrega na tirosil-O-tRNA pode ser qualquer aminoácido, se natural, não natural ou artificial, e não é aqui limitado. A sintetase é opcionalmente a mesma com ou homólogo a uma tirosil aminoácido sintetase de ocorrência natural, ou o mesmo como ou homólogo a uma sintetase designada como um O-RS em FIG. 7. Por exemplo, o O-RS pode ser uma variante conservada de uma tirosil-O-RS de FIG. 7, e/ou pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idênticas em seqüência a um O-RS da FIG. 7.
Cognato: O termo "cognato" refere-se a componentes que funcionam junto, ou têm algum aspecto de especificidade para cada outro, por exemplo, um tRNA ortogonal e uma amínoacil-tRNA sintetase ortogonal. Os componentes podem também ser referidos para serem complementares.
Preferencialmente aminoacilados: Como aqui utilizado em referência a sistemas de tradução ortogonais, um O-RS "preferencialmente aminoacila" um O-tRNA cognato quando o O-RS carrega o O-tRNA com um aminoácido mais eficientemente que ele carrega qual- quer tRNA endógeno em um sistema de expressão. Isto é, quando o O-tRNA e qualquer dado tRNA endógeno estão presentes em um sistema de tradução em aproximadamente proporções molares iguais, o O-RS carregará o O-tRNA mais freqüentemente que será car- regado o tRNA endógeno. Preferivelmente, a proporção relativa de O-tRNA carregada por O-RS para tRNA endógeno carregada por O-RS é alto, preferivelmente resultando em O-RS carregando o O-tRNA exclusivamente, ou perto de exclusivamente, quando o O-tRNA e tR- NA endógeno estão presentes em concentrações molares iguais no sistema de tradução. A proporção relativa entre O-tRNA e tRNA endógeno que é carregado por O-RS, quando o O- tRNA e O-RS estão presentes em concentrações molares iguais, é maior que 1:1, preferi- velmente pelo menos de cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, ainda mais preferi- velmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1 500:1, 1000:1, 5000:1 ou maior.
O O-RS "preferencialmente aminoacila um O-tRNA com um aminoácido não natu- ral" quando (a) o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA comparado a um tRNA en- dógeno, e (b) onde a aminoacilação é específica para o aminoácido não natural, como com- parado a aminoacilação do O-tRNA pela O-RS com qualquer aminoácido natural. Isto é, quando os aminoácidos não naturais e naturais estão presentes em quantidades molares iguais em um sistema de tradução compreendendo o O-RS e O-tRNA, o O-RS carregará o O-tRNA com o aminoácido não natural mais freqüentemente que com o aminoácido natural. Preferivelmente, a proporção relativa do O-tRNA carregado com um aminoácido não natural para O-tRNA carregado com o aminoácido natural á alto. Mais preferivelmente, O-RS carre- ga o O-tRNA exclusivamente, ou perto de exclusivamente, com um aminoácido não natural. A proporção relativa entre carregamento do O-tRNA com o aminoácido não natural e carre- gando do O-tRNA com o aminoácido natural, quando ambos, aminoácidos naturais e não naturais são presentes no sistema de tradução em concentrações molares iguais, é maior que 1:1, preferivelmente pelo menos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais pre- ferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, ainda mais preferivelmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1000:1, 5000:1 ou maior.
Códon seletor: O termo "códon seletor" refere-se à códons reconhecidos pelo O- tRNA no processo de tradução e não reconhecido por um tRNA endógeno. A alça anticódon O-tRNA reconhece o códon seletor no mRNA e incorpora seu aminoácido, por exemplo, um aminoácido não natural, neste sítio no polipeptídeo. Códons seletores pode incluir, por e- xemplo, códons não senso, tal como, códons de parada, por exemplo, códons âmbar, ocre e opala; quatro ou mais bases de códons; códons raros; códons derivados a partir de pares de base naturais ou não naturais e/ou semelhantes.
tRNA supressor: Um tRNA supressor é um tRNA que altera a leitura de um RNA mensageiro (mRNA) em um dado sistema de tradução, tipicamente por permitir a incorpora- ção de um aminoácido em resposta a um códon de parada (isto é, "ligo através") durante a tradução de um polipeptídeo. Em alguns aspectos, um códon seletor da invenção é um có- don supressor, por exemplo, um códon de parada (por exemplo, um códon âmbar, ocher ou opala), um códon de quatro bases, um códon raro etc.
Atividade de supressão: Como aqui utilizado, o termo "supressão de atividade" refe- re-se, em geral, a habilidade de um tRNA (por exemplo, um tRNA supressor) para permitir a lida através da tradução de um códon (por exemplo, um códon seletor que é um códon âm- bar ou um códon de 4-ou-mais bases) que podem de outra forma resultam na terminação da tradução ou tradução incorreta (por exemplo, mutação com troca). Atividade de supressão de um tRNA supressor pode ser expresso como uma porcentagem de atividade lida através da tradução observada comparada com um segundo tRNA supressor, ou como comparado a um sistema controle, por exemplo, um sistema controle com ausência de um O-RS.
A presente invenção provê vários métodos pelos quais a atividade de supressão pode ser quantificada. Porcentagem de supressão de um O-tRNA particular e O-RS contra um códon seletor (por exemplo, um códon âmbar) de interesse refere-se a porcentagem de atividade de um dado marcador teste expresso (por exemplo, LacZ), que inclui um códon seletor, em um ácido nucléico codificando o marcador teste expresso, em um sistema de tradução de interesse, onde o sistema de tradução de interesse inclui O-RS e um O-tRNA, como comparado a uma construção de controle positivo, onde o controle positivo está au- sente no O-tRNA, o O-RS e o códon seletor. Então, por exemplo, se uma construção de marcador de controle positivo ativo que está ausente em um códon seletor tem uma ativida- de observada de X em um dado sistema de tradução, em unidades relevantes ao ensaio marcador no caso, então a supressão do porcentual de uma construção teste compreen- dendo o códon seletor é a porcentagem X que a construção do marcador teste revela sob essencialmente as mesmas condições de ambiente como o marcador de controle positivo foi expresso sob, exceto que a construção do marcador teste é expressa em um sistema de tradução que também inclui o O-tRNA e o O-RS. Tipicamente, o sistema de tradução ex- pressando o marcador teste também inclui um aminoácido que é reconhecido pelo O-RS e O-tRNA. Opcionalmente, a medida da supressão da porcentagem pode ser refinada por comparação do marcador teste para uma construção marcador controle de "antecedente" ou "negativo", que inclui o mesmo códon seletor como o marcador teste, mas em um sistema que não inclui o O-tRNA, O-RS e/ou aminoácido relevante reconhecido pelo O-tRNA e/ou O- RS. Este controle negativo é útil nas medidas de supressão da porcentagem normalizada para contar para os efeitos de sinal do antecedente a partir do marcador no sistema de tra- dução do interesse.
Eficiência da supressão pode ser determinada por qualquer de um número de en- saios conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio repórter /?-galactosidase pode ser utilizado, por exemplo, um plasmídeo IacZ detivado (onde a construção tem um códon sele- tor η a seqüência de ácido nucléico IacZ) é introduzido em células a partir de um organismo apropriado (por exemplo, um organismo onde os componentes ortogonais podem ser utili- zados) ao longo com plasmídio compreendendo um O-tRNA da invenção. Uma sintetase congnata pode também ser introduzida (ou como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a sintetase congnata quando expressa). As células são crescidas em meio para uma densidade desejada, por exemplo, para uma D06oo de cerca de 0,5, e ensaios de β- galactosidase são feitos, por exemplo, utilizando o Kit de Ensaio BetaFluor® de β- Galactosidase (Novagen). A supressão da porcentagem pode ser calculada como a porcen- tagem da atividade para uma amostra relativa para um controle comparável, por exemplo, o valor observado a partir da construção IacZ derivatizada, onde a construção tem um códon senso correspondente na posição desejada ao invés de um códon seletor.
Sistema de Tradução: O termo "sistema de tradução" refere-se aos componentes que incorporam um aminoácido em uma cadeia de polipeptídeo crescente (proteína). Com- ponentes de um sistema de tradução podem incluir, por exemplo, ribossomos, tRNAs, sinte- tases, mRNA e semelhantes. O O-tRNA e/ou O-RS da invenção pode ser adicionado ou ser parte de um sistema de tradução in vitro ou in vivo, por exemplo, em uma célula não eucari- ótica, por exemplo, uma bactéria (tal como E. coli), ou em uma célula eucariótica, por exem- plo, uma célula de levedura, uma célula mamífera, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula fúngica, uma célula de inseto, e/ou semelhantes.
Aminoácido não natural: Como aqui utilizado, o termo "aminoácido não natural" re- fere-se a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, e/ou aminoácido análogo, que não é dos 20 aminoácidos comuns de ocorrência natural para seleno cisteína ou pirrolisina. Por exemplo, o aminoácido não natural sulfotirosina; ver FID. 1) encontra o uso com a invenção.
Derivado de: Como aqui utilizado, o termo "derivado de" refere-se a um componen- te que é isolado a partir ou feito utilizando uma molécula ou organismo específico, ou infor- mação a partir da molécula ou organismo especificado. Por exemplo, um polipeptídeo que é derivado a partir de um segundo polipeptídeo pode incluir uma seqüência aminoácida que é idêntica ou substancialmente similar a seqüência aminoácida do segundo polipeptídeo. No caso dos polipeptídeos, as espécies derivadas podem ser obtidas por, por exemplo, muta- gênese de ocorrência natural, mutagênese direcionada artificial ou mutagênese aleatória artificial. A mutagênese utilizada para derivar polipeptídeos pode ser intencionalmente dire- cionada ou intencionamente aleatória, ou uma mistura de cada. A mutagênese de um poli- peptídeo para criar um polipeptídeo diferente derivado a partir do primeiro pode ser um e- vento aleatório (por exemplo, causado por infidelidade da polimerase) e a identificação do polipeptídeo derivado pode ser feito por método de seleção apropriado, por exemplo, como aqui discutido. Mutagênese de um polipeptídeo tipicamente confere manipulação do polinu- cleotídeo que codifica o polipeptídeo.
Seleção positiva ou marcador de seleção: Como aqui utilizado, o termo "seleção positiva ou marcado de seleção" refere-se a um marcador que, quando presente, por exem- plo, expresso, ativado ou semelhante, resulta em identificação de uma célula, que compre- ende a característica, por exemplo, uma célula que o marcador de seleção positiva, a partir daquelas sem as características.
Seleção negativa ou marcador de seleção: Como aqui utilizado, o termo "seleção negativa ou marcador de seleção" refere-se a um marcador que, quando presente, por e- xemplo, expresso, ativado ou semelhante, permite identificação de uma célula que não compreende uma propriedade selecionada ou característica (por exemplo, como comparado a uma célula que possui a propriedade ou característica).
Repórter: Como aqui utilizado, o termo "repórter" refere-se a um componente que pode ser utilizada para identificar e/ou componentes alvos selecionados de um sistema de interesse. Por exemplo, um repórter pode incluir uma proteína, por exemplo, uma enzima, que confere resistência a antibiótico ou sensibilidade (por exemplo, /J-lactamase, cloranfeni- col acetiltransferase (CAT), e semelhantes), um marcador de seleção fluorescente (por e- xemplo, proteína de fluorescência verde (por exemplo, GFP), YFP, EGFP, RFP etc), um marcador Iuminescente (por exemplo, uma proteína Iuciferase de vagalume), um marcador de seleção baseado em afinidade, ou genes de marcadores selecionáveis positivo ou nega- tivo como IacZ, /?-gal/lacZ (0-galactosidase), ADH (álcool deidrogenase), his3, ura3, Ieu2, Iys2, ou semelhantes.
Eucarioto: Como aqui utilizado, o termo "eucarioto" refere-se a organismos perten- cendo ao Reino Eucarya. Eucariotos são geralmente distinguíveis a partir de procariotos por sua típica organização multicelular (mas não exclusivamente multicelular, por exemplo, le- vedura), a presença de um núcleo ligado a membrana e outras organelas ligadas a mem- brana, material genética linear (isto é, cromossomos lineares), a ausência de óperons, a presença de íntrons, capa química de mensagem e poli-A mRNA, e outras características bioquímicas, tal como uma estrutura ribossomal distinguível. Organismos eucarióticos inclu- em, por exemplo, animais (por exemplo, mamíferos, insetos, répteis, pássaros etc), ciliados, plantas (por exemplo, monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas etc), fungos, leveduras, fla- gelados, microesporidia, protistas etc.
Procarioto: Como aqui utilizado, o termo "procarioto" refere-se aos organismos per- tencendo ao Reino Monera (também chamado Procarya). Organismos procarióticos são geralmente distinguíveis a partir de eucariotos por sua organização unicelular, reprodução assexual por brotamento ou fissão, a ausência de um núcleo de ligação da membrana ou outras organelas ligadas à membrana, um cromossomo circular, a presença de óperons, a ausência de íntrons, capa química de mensagem e poli-A mRNAm outras características bioquímicas, tal como uma estrutura ribossomal distinguível. O Prokarya inclui sub-reinos Eubactéria e Archaea (algumas vezes chamado "Archaebacteria). Cianobacteria (as algas azuis verdes) e micoplasma são algumas vezes dão classificações separadas sob o Reino Monera.
Bactéria: Como aqui utilizado, os termos "bactéria" e "eubactéria" referem-se a or- ganismos procarióticos que são distinguíveis a partir de Archaea. Similarmente, Archae refe- re-se a procariotos que são distinguíveis a partir da eubactérias. Eubactéria e Archaea po- dem ser distinguíveis por um número de critérios moroflógicos e bioquímicos. Por exemplo, diferenças nas seqüências de RNA ribossomal, estrutura da ENA polimerase, a presença ou ausência de íntrons, sensibilidade de antibiótico, a presença ou ausência de peptidoglicanos da parede celular e outros componentes da parede celular, as estruturas ramificadas versus não ramificadas de lipídeos da membrana, e a presença/ausência de histonas e proteínas do tipo histona são utilizadas para determinar um organismo para Eubactéria ou Archaea. Exemplos de Eubactéria incluem Escherichia eoli, Thermus thermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus stearothermophilus. Exemplo de Arehaea incluem Methanococcus jannas- ehii (Mj), Methanosareina mazei (Mm), Methanobaeterium thermoautotrophieum (Mt), Me- thanoeoeeus meripaludis, Methanopyrus kandleri, Halobacterium tais como Haloferax volea- nii e Halobaeterium espécies NRC-1, Archaeoglobus fulgidus (Af), Pyroeoeeus furiosus (Pf), Pyroeoeeus horikoshii (Ph), Pyrobaeulum aerophilum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfata- rieus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Aeuropyrum pernix (Ap), Thermoplasma aeidophilum e Ther- moplasma voleanium.
Variante conservativa: Como aqui utilizado, o termo "variante conservativa", em um contexto de um componente de tradução, refere-se a um componente de tradução, por e- xemplo, uma variante conservada O-tRNA ou um variante consevado O-RS1 que funcional- mente tem desempenho similar a um componente base que o variante conservado é similar a, por exemplo, um O-tRNA ou O-RS1 tendo variações na seqüência como comparado a uma referência a O-tRNA ou O-RS. Por exemplo, um O-RS1 ou um variante conservado da O-RS, irá aminoacilar um O-tRNA cognato com um aminoácido não natural, por exemplo, sulfotirosina. Neste exemplo, o O-RS e a variante conservada O-RS não tem as mesmas seqüências aminoácidas. A variante conservada pode ter, por exemplo, uma variação, duas variações, três variações, quatro variações, ou cinco ou mais variações em seqüência, des- de que a variante conservada é ainda complementar a (por exemplo, funções com) o cogna- to correspondente O-tRNA ou O-RS.
Em algumas modalidades, uma variante conservada O-RS compreende um ou mais substituições aminoácidas conservadas comparadas a O-RS a partir de que ela foi derivada. Em algumas modalidades, uma variante conservada O-RS compreende uma ou mais substi- tuições aminoácidas conservadas comparadas a O-RS a partir da qual ela foi derivada, e além disso, retém atividade biológica O-RS; por exemplo, uma variante conservada O-RS que retém pelo menos 10% da atividade biológica da molécula O-RS parente a partir da qual ela foi derivada, ou alternativamente, pelo menos 20%, pelo menos 30%, ou pelo menos 40%. Em algumas modalidades preferidas, o variante conservado O-RS retém pelo menos 50% da atividade biológica da molécula O-RS parente a partir da qual ela foi derivada. As substituições aminoácidas conservadas de uma variante conservada O-RS pode ocorrer em qualquer domínio de O-RS, incluindo o aminoácido ligando ao sítio de ligação.
Seleção ou agente de seleção: Como aqui utilizado, o termo "seleção ou agente de seleção" refere-se a um agente que, quando presente, permite para seleção/classificação de certos componentes a partir de uma população. Por exemplo, um agente de seleção ou classificação pode ser, mas não é limitado em, por exemplo, um nutriente, um antibiótico, um comprimento de onda luminoso, um antibiótico, um polinucleotídeo expresso ou seme- lhante. O agente de seleção pode ser variado, por exemplo, pela concentração, intensidade etc.
Em resposta a: como aqui utilizado, o termo "em resposta a" refere-se ao processo em que o O-tRNA da invenção reconhece um códon seletor e medeia a incorporação do aminoácido não natural, que é acoplada ao tRNA, na cadeia do polipeptídeo crescente.
Codificar: Como aqui utilizado, o termo "codificar" refere-se a qualquer processo em
que a informação em uma macromolécula polimérica ou seqüência string é utilizada para direcionar a produção de uma segunda molécula ou cadeia de seqüência que é diferente a partir da primeira molécula ou cadeia de seqüência. Como aqui utilizado, o termo é utilizado amplamente, e pode ter uma variedade de aplicações. Em alguns aspectos, o termo "codifi- car" descreve o processo de replicação de DNA semiconservatívo, onde uma fita de uma molécula de DNA de dupla fita é utilizada como um padrão para codificar uma fita irmã no- vamente complementar sintetizada por uma DNA polimerase dependente de DNA.
Em outro aspecto, o termo "codificar" refere-se a qualquer processo em que a in- formação em uma molécula é utilizada para direcionar a produção de uma segunda molécu- Ia que tem uma natureza química diferente a partir da primeira molécula. Por exemplo, uma molécula de DNA pode codificar uma molécula RNA (por exemplo, pelo processo de trans- crição incorporando uma enzima RNA polimerase dependente de DNA). Também, uma mo- lécula de RNA pode ser codificar um polipeptídeo, como no processo de tradução. Quando utilizado para descrever o processo de tradução, o termo "codificar" também estende ao códon triplete qe codifica um aminoácido. Em alguns aspectos, uma molécula de RNA pode codificar uma molécula de DNA, por exemplo, pelo processo de transcrição reversa incorpo- rando uma DNA polimerase dependente de RNA. Em outro aspecto, uma molécula de DNA pode codificar um polipeptídeo, onde ela é entendida que "codificar" como utilizado no neste caso incorpora ambos, os processos de transcrição e de tradução. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
FIG. 1 provê a estrutura química do aminoácido não natural sulfotirosina.
FIG. 2 mostra um gel PAGE desnaturado corado com azul de Coomassie ilustrando sulfo-hirudina e migração sulfo-hirudina. Tamanho da hirudina não pode ser julgada por pa- drões de peso moleculares devido a carga atípica da hirudina. FIGS. 3A e 3B provêem gráficos representativos de inibição de trombina com suas
respectivas curvas de progressão ajustadas sobrepostas nos pontos dos dados brutos. En- saios de enzimas foram conduzidos com 50 μΜ de substrato fluorogênico, 40 pM de a- trombina humana, e 100 pM de hirudina expressa em um tampão salino de Tris-HCI suple- mentado com polietileno glícol 6000 e HSA. FIG. 3A mostra um gráfico de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para nenhuma inibição (controle), inibição por dessulfo- hirudina, e inibição por sulfo-hirudina. FIG. 3B mostra expansão de gráficos de dessulfo- hirudina e sulfo-hirudina para comparação. FIGS. 4Α e 4Β ilustram sulfotirosina dependente da expressão do Z-domínio. FIG. 4A provê um gel PAGE desnaturado corado com azul de Coomassie de Iisado de célula Ni- NTA purificada de células expressando domínio Z com um códon âmbar na posição 7. So- mente expressão com meio suplementado com sulfotirosina produz domínio Z com compri- mento completo. FIG. 4B provê um modo linear de íon positivo de espectro MALDI-TOF (ge- rado utilizando matriz THAP) de Iisado celular purificado Ni-NTA (concentrado e dialisado contra água) mostrando um pico correspondente ao domínio Z de comprimento inteiro con- tendo uma sulfotirosina única e com ausência de metionina. Também observado é um pico correspondente a perda de sulfato resultando a partir das condições de análises do espectro de massa.
FIGS. 5A, 5B e 5C mostram vários espectros MALDI-TOF. FIG. 5A mostra um mo- do linear de íon positivo do espectro MALDI-TOF (gerado utilizando uma matriz THAP) de sulfo-hirudina mostrando ambos, pico sulfo-hirudina [M+H] intacto (7059 Da) e o pico cor- respondente para perda do sulfato durante a análise do espectro de massa (6979 Da). Note que os pequenos picos para a direita do principal um são adutos de sódio. Eles ocorrem nos intervalos adicionais de 22 Da. FIG. 5B mostra um espectro de MALDI-TOF (gerada utilizan- do uma matriz sináptica) documentando pureza da amostra. Para aumentar a detecção de possíveis impurezas, uma matriz dura sinapínica, que resultam na predominância do pico [M+H-80], foi utilizado. O pico a 13964 Da pode ser atribuído para dimerização de sulfo- hirudina. Nenhuma outra impureza são observadas. FIG. 5C mostra uma expansão de região relevante para mostrar a presença de ambos [M+H-80] e pico de sulfo-hirudina intac- to. Sulfo-hirudina intacto é o menos pico devido ao uso da matriz dura sinapínica. Os picos pequenos para a direita do principal são adutos de sódio.
FIGS. 6A e 6B mostram vários espectros MALDI-TOF. FIG. 6A mostram um espec- tro MALDI-TOF (gerados utilizando a matriz sinapínica) do meio de expressão sulfo-hirudina não purificado correspondendo a expressão na ausência de sulfotirosina. Somente o pico de hirudina truncado é encontrado; nenhuma proteína de comprimento inteiro é observada. FIG. 6B mostra um espectro de MALDI-TOF (gerado utilizando uma matriz sinapínica) de meio de expressão sulfo-hirudina não purificada correspondendo a expressão em presença de sulfotirosina demonstrando a proporção do pico da sulfo-hirudina truncada e de compri- mento inteiro. Por causa das condições duras necessárias para a boa detecção das mistu- ras de amostras brutas, somente a forma ionizada da sulfo-hirudina é claramente observa- da.
FIG. 7 provê seqüências de nucleotídeos e aminoácidos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora a sulfação da tirosina é uma modificação pós-traducional amplamente dis- tribuída através dos eucariotos multicelulares (Moore, "The biology and enzymology of prote- in tyrosine O-sulfation," J Biol Chem 278:24243-24246 (2003)), suas funções biológicas permanecem amplamente desconhecidas. Isto é em parte devido às dificuldades associadas com a síntese de proteínas sulfatadas. A invenção provê para a incorporação seletiva da sulfotirosina em proteínas em bactérias por geneticamente codificar o aminoácido modifica- do em resposta ao códon não senso âmbar, TAG. Além disso, é demonstrado que sulfo- hirudina, previamente inacessível através de métodos recombinantes, podem ser diretamen- te expressos em E coli utilizando esta estratégia. Como aqui descrito, análises cinéticas mostram um aumento maior que 10 vezes em afinidade para a trombina humana por sulfo- hirudina em seu uso como um anticoagulante (Di Nisio et al, "Direct thrombin inhibitors," N Engl J Méd 353:1028-1040 (2005)). Esta abordagem geral para a biossíntese de proteínas sulfatadas facilita ainda o estudo e aplicação da modificação pós-traducional emergente, sulfação de tirosina.
Como um método geral para a sulfação sítio-específica de proteínas, a presente descreve a evolução de um par tRNA/aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (aaRS) que permi- te a eficiência, incorporação seletiva de sulfotirosina em proteínas em eucariotos tal como E. coli em resposta ao códon não senso âmbar. Utilizando este par tRNA/aaRS supressor úni- co, a forma sulfatada nativa de hirudina é diretamente expressa e é mostrado que ela tem uma maior afinidade de 10 vezes mais para trombina humana que para desulfo-hirudina, em acordo com relatos prévios na literatura (Stone e Hofsteenge1 "Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudina," Biochemistry 25:4622-4628 (1986)).
A presente especificação provê pares tRNA ortogonal/aminoacil-tRNA sintetase que permitem a introdução seletiva in vivo de sulfotirosina (ver FIG. 1) em proteínas em E. coli em resposta ao códon seletor, por exemplo, o códon de patada âmbar TAG. A invenção provê novos polipeptídeos aminoacil-tRNA sintease ortogonal (O-RS) que especificamente carrega um cognato tRNA ortogonal (O-tRNA) com um aminoácido sulfotirosina não natural.
Em alguns aspectos, para demonstrar (mas não para limitar) a presente invenção, a revelação aqui demonstra que a fração aminoácida não natural pode ser incorporada em vários modelos de proteínas. Não é tencionado que a incorporação do aminoácido não natu- ral ser limitado a qualquer proteína particular. A partir da presente revelação, será claro que a incorporação do aminoácido sulfotirosina não natural em proteínas particulares de interes- se é vantajoso para uma grande variedade de propósitos.
A presente revelação descreve a evolução de novos pares tRNA ortogonal/tRNA sintetase que funcionam em eubactéria para incorporar especificamente no sítio um amino- ácido não natural sulfotirosina (provido na FIG. 1) em resposta aos códons seletores. Bre- vemente, a invenção provê novos mutantes de Methanococcus janaschii tirosil-tRNA sinte- tase que seletivamente carrega um tRNA supressor com o aminoácido não natural sulfotiro- sina em células hospedeiras E. coli. Esses pares de tRNA-sintetase envolvidos podem ser utilizados para sítio específi- co incorporar o aminoácido não natural sulfotirosina em uma proteína. A incorporação do aminoácido não natural na proteína pode ser programada para ocorrer em qualquer posição desejada por construção do polinucleotídeo codificando a proteína de interesse para conter um códon seletor que sinaliza a incorporação do aminoácido não natural.
A invenção descrita aqui provê pares ortogonais para a codificação e incorporação genética do aminoácido não natural sulfotirosina em proteínas em uma eubactéria, por e- xemplo, uma célula E. coli, onde os componentes ortogonais não reagem cruzadamente com componentes endógenos da E. coli da maquinaria traducional da célula hospedeira, mas reconhecem o aminoácido não natural desejado e incorpora suas proteínas em respos- ta a um códon seletor (por exemplo, um códon não senso âmbar, TAG). Os componentes ortogonais providos pela invenção incluem aminoacil-tRNA sintetases ortogonais derivadas a partir de Methanococcus jannaschii tirosil tRNA-sintetase, e o mutante tirosil íRNAcua âm- bar supressor, que funciona como um par ortogonal em uma célula hospedeira eubacteria- na.
Esta invenção provê composições de e métodos para identificar e produzir pares tRNA-aminoacil ortogonal - tRNA sintetase, por exemplo, pares O-tRNA/O-RS que podem ser utilizados para incorporar sulfotirosina em proteínas. Como par O-tRNA/O-RS da inven- ção é capaz de mediar a incorporação da sulfotirosina em uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo, onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconheci- do pelo O-tRNA. A alça anticódon da O-tRNA reconhece o códon seletor em um mRNA e incorpora o aminoácido não natural neste sítio no polipeptídeo. Geralmente, uma aminoacil- tRNA sintetase ortogonal da invenção preferencialmente aminoacila (ou carrega) seu O- tRNA com somente um aminoácido não natural específico.
TECNOLOGIA tRNA ORTOGONAL/AMINOACIL-tRNA SINTETASE
Um entendimento das novas composições e métodos da presente invenção requer um entendimento das atividades associadas com tRNA ortogonal e pares aminoacil-tRNA sintetase ortogonal. A fim de adicionar aminoácido não naturais para o código genético, no- vos pares ortogonais compreendendo um aminoacil-tRNA sintetase e um tRNA adequado são necessários que podem funcionar eficientemente na maquinaria de tradução hospedei- ra, mas que são "ortogonais" para o sistema de tradução neste caso, significando que suas funções independentemente das sintetases e tRNAs endógenas par ao sistema de tradução. Características desejadas do par ortogonal incluem tRNA que traduzem ou reconhecem so- mente um códon específico, por exemplo, um códon seletor, que não é traduzido por qual- quer tRNA endógeno, e aminoacil-tRNA sintetases que preferencialmente aminoacilam (ou "carregam") seu tRNA cognato com somente um aminoácido não natural específico. O O- tRNA é também não tipicamente aminoacilado (ou é pobremente aminoacilado, isto é, car- regado) por sintetases endógenas. Por exemplo, em um sistema de hospedeiro E. coli, um par ortogonal incluirá uma aminoacil-tRNA sintetase que não reage cruzadamente com qualquer dos tRNA endógenos, por exemplo, que são 40 na E. coli, e um tRNA ortogonal que não é aminoacilado por qualquer sintetase endógena, por exemplo, das quais estão 21 na E. coli.
Os princípios gerais de sistemas de tradução ortogonal que são adequados para fazer proteínas que compreendem um ou mais aminoácidos não naturais são conhecidos na técnica, como são métodos gerais para produzir sistemas de tradução ortogonais. Por e- xemplo, ver Publicação Internacional Números WO 2002/086075, denominado "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL- tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2002/085923, denominado ΊN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, denominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, depositado em 7 de Julho de 2004; WO 2005/007870, depositado em 7 de Julho de 2004; WO 2005/007624, depositado em 7 de Julho de 2004; WO 2006/110182, depositado em 27 de Outubro de 2005, denominado "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" e WO 2007/103490, depositado 7 de Março de 2007, deno- minado "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS." Cada uma desses pedidos é incorpora- do aqui por referência em sua totalidade. Para discussão de sistemas de tradução ortogonal que incorporam aminácidos não naturais, e métodos para sua produção e uso, ver também, Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed. 44(1):34-66 (2005), Xie e Schultz, "An Expanding Genetic Code", Methods 36(3):227-238 (2005); Xie e Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554 (2005); e Wang et al, "Expanding the Genetic Code," Annu. Rev. Biophys. Bi- omol. Struct., 35:225-249 (2006); os conteúdos dos quais são cada incorporados em sua totalidade.
Sistemas de Tradução Ortogonais
Sistemas de tradução ortogonais geralmente compreendem células (que podem ser células procarióticas tais como E. coli) que incluem um tRNA ortogonal (O-tRNA), uma ami- noacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS), e um aminoácido não natural, onde o O-RS amino- acila o O-tRNA com o aminoácido não natural. Um par ortogonal da invenção pode incluir um O-tRNA, por exemplo, um tRNA supressor, uma inserção ou deleção de um nucleotídeo no tRNA, ou semelhantes,e um O-RS cognato. Os sistemas ortogonais da invenção podem tipicamente compreender pares O-tRNA/O-RS, ou no contexto de uma célula hospedeira ou sem a célula hospedeira. Em adição aos sistemas multi-componentes, a invenção também provê novos componentes individuais, por exemplo, novos polipeptideos aminoacil-tRNA sintetase ortogonais (por exemplo, SEQ IDNO:4, 6, 8 ou 10), e os polinucleotídeos que codi- ficam aqueles polipeptídeos (por exemplo, SEQ ID NO:5, 7, 9 ou 11).
Em geral, quando um par ortogonal reconhece um códon seletor e carrega um ami- noácido em resposta a um códon seletor, o par ortogonal é referido "suprimir" o códon sele- tor. Isto é, um códon seletor que não reconhecido pela maquinaria endógena do sistema de tradução (por exemplo, da célula) não é ordinariamente carregada, cujos resultados no blo- queio da produção de um polipeptídeo que pode de outra forma ser traduzido a partir do ácido nucléico. EM um sistema de par ortogonal, o O-RS aminoacila o O-tRNA com um ami- noácido não natural específico. O O-tRNA carregado reconhece o códon seletor e suprimi o bloqueio traducional causado pelo códon seletor.
Em alguns aspectos, um O-tRNA da invenção reconhece um códon seletor e inclui pelo menos cerca de, por exemplo, 45%, uma 50%, uma 60%, uma 75%, uma 80%, ou uma 90% ou mais eficiência de supressão em presença de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor como comparado a eficiência de supressão de um O-tRNA compreenden- do ou codificado por uma seqüência polinucleotídica como revelado na seqüência de lista- gem aqui.
Em algumas modalidades, a eficiência de supressão do O-RS e o O-tRNA junto é cerca, por exemplo, de 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, ou 25 vezes ou mais maior que a eficiência de supressão do O-tRNA com O-RS ausente. Em algum aspecto, a eficiên- cia de supressão do O-RS e o O-tRNA junto é pelo menos cerca, por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% ou 90% ou mais de eficiência de supressão de um par de sinte- tase ortogonal como revelado na seqüência de listagem aqui.
A célula hospedeira usa o par O-tRNA/O-RS para incorporar o aminoácido não na- tural em uma cadeia crescente de polipeptídeo, por exemplo, através de um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o poli- nucleotídeo compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA. Em certos as- pectos preferidos, a célula pode incluir um ou mais pares O-tRNA/O-RS adicionais, onde o O-tRNA adicional é carregado pelo O-RS adicional com um aminoácido não natural diferen- te. Por exemplo, um dos O-tRNAs podem reconhecer um códon de quatro bases e outro O- tRNA pode reconhecer um códon de parada. Alternativamente, múltiplos códons de parada diferentes ou múltiplos códons de quatro bases diferentes podem ser utilizados no mesmo ácido nucléico codificador.
Como notado, em algumas modalidades, existem múltiplos pares de O-tRNA/O-RS em uma célula ou outro sistema de tradução, que permite incorporação de mais que um a- minoácido não natural em um polipeptídeo. Por exemplo, a célula pode ainda incluir um par adicional diferente O-tRNA/O-RS e um segundo aminoácido não natural, onde este O-tRNA adicional reconhece um segundo códon seletor e este O-RS adicional preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o segundo aminoácido não natural. Por exemplo, uma célula que inclui um par O-tRNA/O-RS (onde o O-tRNA reconhece, por exemplo, um códon seletor âm- bar), pode ainda compreender um segundo par ortogonal, onde o segundo O-tRNA reco- nhece um códon seletor diferente, por exemplo, um códon opala, um códon de quatro ba- ses, ou semelhantes. Desejavelmente, os pares ortogonais diferentes são derivados a partir de fontes diferentes, que podem facilitar o reconhecimento de diferentes códons seletores.
Em certas modalidades, sistemas compreendem uma célula tal como uma célula E. coli que inclui um tRNA ortogonal (O-tRNA), uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O- RS), um aminoácido não natural e um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende o códon sele- tor que é reconhecido por O-tRNA. O sistema de tradução pode também ser um sistema livre de célula, por exemplo, qualquer de uma variedade comercialmente disponível "in vitro" de sistemas transcrição/tradução em combinação com um par O-tRNA/O-RS e um amináci- do não natural como aqui descrito. O O-tRNA e/ou O-RS pode estar naturalmente ocorrendo ou pode ser, por exemplo,
derivado por mutação de um tRNA de ocorrência natural e/ou RS, por exemplo, por gera- ções de bibliotecas de tRNAs e/ou bibliotecas de RSs, a partir de qualquer de uma varieda- de de organismos e/ou utilizando qualquer de uma variedade de estratégias de mutação disponíveis. Por exemplo, uma estratégia para produzir um par tRNA ortogonal/aminoacil- tRNA envolve importação de um par tRNA/sintetase heterólogo (para a célula hospedeira) a partir de, por exemplo, uma fonte outra que a célula hospedeira, ou múltiplas fontes, em uma célula hospedeira. As propriedades da sintetase heteróloga candidata incluem, por e- xemplo, aquelas que não carregam qualquer tRNA da célula hospedeira, e as propriedades do candidato tRNA heterólogo incluem, por exemplo, que não é aminoacilado por qualquer sintetase da célula hospedeira. Em adição, o tRNA heterólogo é ortogonal para todas as sintetases da célula hospedeira. Uma segunda estratégia para gerar um par ortogonal en- volve geração de bibliotecas mutantes a partir das quais a classifica e/ou seleciona um O- tRNA ou O-RS. Essas estratégias podem também ser combinadas. tRNA ortogonal (O-tRNA) Um tRNA ortogonal (O-tRNA) da invenção desejavelmente medeia a incorporação
de um aminoácido não natural em uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA, por exemplo, in vivo ou in vitro. Em certas modalidades, um O-tRNA da invenção inclui pelo menos cerca de, por e- xemplo, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% ou 90% ou mais de eficiência de supressão em presen- ça de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor como comparado a um O- tRNA compreendendo ou codificado por uma seqüência polinucleotídica como revelado nas seqüências O-tRNA na seqüência de listagem aqui. Eficiência de supressão pode ser determinada por qualquer de um número de en- saior conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio repórter de β-galactosidase pode ser utilizar, por exemplo, um plasmídeo IacZ derivatizado (onde a construção tem um códon seletor η na seqüência de ácido nucléico IacZ) é introduzido nas células a partir de um orga- nismo apropriado (por exemplo, organismo onde os componentes ortogonais podem ser utilizados) junto com plasmídeo compreendendo um O-tRNA da invenção. Uma sintetase cognata pode também ser introduzida (ou como um polipeptideo ou um polipeptídeo que codifica a sintetase cognata quando expresso). As células são crescidas em meio a uma densidade desejada, por exemplo, a uma D06oo de cerca de 0,5, e ensaios de β- galactosidase são feitos, por exemplo, utilizando o Kit de Ensaio de /?-galactosidase Beta- Fluor® (Novagen). Supressão percentual pode ser calculada como a porcentagem de ativi- dade para uma amostra relativa para um controle comparável, por exemplo, o valor obser- vado a partir da construção IacZ derivatizada, onde a construção tem um códon senso cor- respondente na posição desejada ao invés de um códon seletor. Exemplos de O-tRNAs da invenção são revelados na seqüência de listagem aqui,
por exemplo, ver FIG. 7 e SEQ ID NO:1. O revelado aqui também provê guias para o dese- nho de espécies de O-tRNA equivalentes adicionais. Em uma molécula de RNA, tal como uma O-RS mRNA, ou molécula de O-tRNA, Timina (T) é substuída com Uracila (U) relativa a uma dada seqüência (ou vice versa para um DNA codificante), ou complemento da mesma. Modificações adicionais para as bases podem também estarem presentes para gerar molé- culas equivalentes de grande funcionalidade.
A invenção também compreende variações conservadas de O-tRNAs correspon- dentes ao particular O-tRNAs aqui. Por exemplo, variações conservadas de O-tRNA incluem aquelas moléculas que funciona, tidpo o O-tRNA particular, por exemplo, como na seqüên- cia de listagem aqui e aquela mantida na estrutura de tRNA de formato L, por virtude da a- propriada auto-complementariedade, mas que não tem uma seqüência idêntica àquelas, por exemplo, na seqüência de listagem ou FIG. 7, e desejavelmente, são outras que moléculas de tRNA selvagens.
A composição compreendendo um O-tRNA pode ainda incluir uma aminoacil-tRNA ortogonal (O-RS), onde o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA pode ainda incluir um sistema de tradução (por exemplo, in vitro ou in vivo). Um ácido nucléico que compreen- de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA, ou uma combinação de um ou mais desses podem também estar presentes na célula. Métodos de produção de um tRNA ortogonal (O-tRNA) são também uma caracterís-
tica da invenção. Um O-tRNA produzido pelo método é também uma característica da in- venção. Em cercas modalidades da invenção, os O-tRNAs podem ser produzidos por gera- ção de uma biblioteca de mutantes. A biblioteca de tRNAs mutantes pode ser gerada utili- zando várias técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Por exemplo, os tRNAs mu- tantes podem ser gerados por mutações sítio específicas, mutações de pontos aleatórios, recombinação homóloga, mistura de DNA ou outros métodos de mutagênese recursivos, construção quimérica ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, da O-tRNA da SEQ ID NO:1.
Mutações adicionais podem ser introduzidas em uma(s) posição (s) específica(s), por exemplo, em uma(s) posição(s) não conservada(s), ou em uma posição conservada, em uma(s) posição(s) aletatória(s), ou uma combinação de ambos em uma alça desejada ou região de um tRNA, por exemplo, uma alça anticódon, o aceptor original, braço ou alça D, alça variável, braço ou alça TPC1 ou regiões da molécula de tRNA, ou uma combinação dos mesmos. Tipicamente, mutações em um tRNA incluem mutações na alça anticódon de cada membro da biblioteca dos tRNAs mutantes para permitir o reconhecimento de um códon seletor. O método pode ainda incluir adição de seqüências adicionais para o O-tRNA. Tipi- camente, um O-tRNA possui um melhoramento de ortogonalidade para um organismo dese- jado comparado ao material de partida, por exemplo, a pluralidade das seqüências de tRNS, enquanto preservam sua afinidade ao RS desejado.
Os métodos opcionalmente incluem analisar a similaridade (e/ou homologia inferi- da) de seqüências de tRNAs e/ou aminoacil-tRNA sintetases para determinar candidatos potenciais para um O-tRNA, O-RS e/ou pares dos mesmos, que parecem ser ortogonais para um organismo específico. Programas de computador conhecidos na técnica e descrito aqui podem ser utilizados para a análise, por exemplo, programas BLAST e Pile up podem ser utilizados. Em um exemplo, para escolher o potencial ortogonal de componentes de tra- dução para uso em E. coli, uma sintetase e/ou um tRNA é escolhido que não mostre simila- ridade de seqüência próxima para organismos de eubactéria.
Tipicamente, um O-tRNA é obtido por sujeitar a, por exemplo, seleção negativa, uma população de célula de uma primeira espécie, onde as células compreendem um membro da pluralidade do potencial O-tRNAs. A seleção negativa elimina células que com- preendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais que são aminoacilados por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) que é endógena para a célula. Isto provê um conjunto de tRNAs que são ortogonais para a célula das primeiras espécies.
Em certas modalidades, na seleção negativa, um(s) códon(s) seletor(s) é introduzi- do em um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção negativa, por exemplo, uma enzima que confere resistência a antibiótico, por exemplo, /?-lactamase, uma enzima que confere um produto detectável, por exemplo, /ff-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), por exemplo, um produto tóxico, tal como barnase, em uma posição não essencial (por exemplo, produção paralisada de uma barnase funcional) etc. Classificação/seleção é opcionalmente feita por crescimento da população de células em presença de um agente seletivo (por exemplo, um antibiótico, tal como ampicilina). Em uma modalidade, a concen- tração do agente de seleção é variada.
Por exemplo, para medir a atividade dos tRNAs supressores, um sistema de sele- ção é utilizado que é baseado na supressão in vivo do códon seletor, por exemplo, não sen- so (por exemplo, parada) ou mutações de inserção ou deleção de um nucleotídeo introduzi- das em um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção negativa, por exemplo, um gene para β-lactamase (bla). Por exemplo, variantes polinucleotídicos, por exemplo, varian- tes bla, com um códon seletor em certa posição (por exemplo, A184), são construídos. Célu- Ias, por exemplo, bactéria, são transformadas com esses polinucleotídeos. No caso de um tRNA ortogonal, que não pode ser eficientemente carregado por sintetases de E. coli endó- genas, resistência a antibióticos, por exemplo, resistência a ampicilina, deve ser cerca de ou menos que aquela para uma bactéria transformada com nenhum plasmídio. Se o tRNA não é ortogonal, ou se uma sintetase heteróloga capaz de carregar o tRNA é co-expresso no sistema, um nível mais alto de antibiótico, por exemplo, ampicilina, resistência é observada. Células, por exemplo, bactéria, são escolhidas por serem capazes de crescer em placas de agar LB com concentrações de antibióticos em cerca das iguais para células transformadas com nenhum plasmídeo.
No caso de um produto tóxico (por exemplo, ribonuclease ou barnase), quando um membro da pluralidade dos tRNAs potenciais são aminoacilados por hospedeiro endógeno, por exemplo, sintetases de Escherichia coli (isto é, ela não é ortogonal ao hospedeiro, por exemplo, sintetases de Escherichia coli), o códon seletor é suprimido e o produto polinucleo- tídico tóxico leva a morte celular. Células contendo tRNAs ortogonais ou tRNAs não funcio- nais sobrevivem.
Em uma modalidade, o conjunto de tRNAs que são ortogonais ao organismo dese-
jado são então sujeitos a uma seleção positiva em que um códon seletor é colocado em um marcado de seleção positivo, por exemplo, codificado por um gene de resistência a droga, tal como um gene a /Mactamase. A seleção positiva é feita em uma célula compreendendo um polinucleotídeo codificando ou compreendendo um membro do conjunto de tRNAs que são ortogonais para a célula, um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção posi- tivo, e um polinucleotídeo codificando um RS cognato. Em certas modalidades, a segunda população de células compreende células que não foram eliminadas pela seleção negativa. Os polinucleotídeos são expressos na célula e a célula é crescida em presença de um agen- te de seleção, por exemplo, ampicilina. tRNAs são então selecionados por sua habilidade para serem aminoacilados por sintetases cognatas co-expressas e para inserir um aminoá- cido em resposta a este códon seletor. Tipicamente, essas células mostram um aumento na eficiência de supressão comparada com células contendo tRNAs não funcionais, ou tRNAs que não podem eficientemente serem reconhecidos pela sintetase de interesse. A célula contendo os tRNAs não funcionais ou tRNAs que não são eficientemente reconhecidos pela sintetase de interesse, são sensíveis ao antibiótico. Dessa forma, tRNAs que: (i) não são substratos para sintetases endógenas do hospedeiro, por exemplo, Escherichia coli,; (ii) po- dem ser aminoaciladas pela sintetase de interesse; e (iii) são funcionais em tradução, so- brevivem em ambas as seleções.
Consequentemente, o mesmo marcado pode ser ou um marcador positivo ou nega- tivo, dependendo do contexto em que é classificado. Isto é, o marcador é um marcador posi- tivo se selecionado para, mas um marcador negativo se é selecionado contra.
A severidade da seleção, por exemplo, a seleção positiva, a seleção negativa ou ambas, a seleção positiva e negativa, nos métodos descritos acima, opcionalmente incluem variação de severidade de seleção. Por exemplo, porque a barnase é uma proteína extre- mamente tóxica, a severidade da seleção negativa pode ser controlada por introdução de números diferentes de códons seletores no gene da barnase e/ou uso de um promotor indu- zível. Em outro exemplo, a concentração do agente de seleção ou claddificação é variada (por exemplo, concentração de ampicilina). Em alguns aspectos da invenção, a severidade é variada porque a atividade desejada pode ser baixa durante os ciclos iniciais. Então, crité- rios de seleção menos exigentes são aplicados em ciclos iniciais e critérios mais exigentes são aplicados em ciclos tardios de seleção. Em certas modalidades, a seleção negativa, a seleção positiva, ou ambas, a seleção negativa e positiva podem ser repetidas em tempos múltiplos. Múltiplos marcadores de seleção negativa diferentes, marcadores de seleção po- sitiva ou ambos, marcadores de seleção negativa e positiva podem ser utilizados. Em certas modalidades, o marcador de seleção positiva e negativa podem ser os mesmos.
Outros tipos de seleções/classificações podem ser utilizados na invenção para pro- duzir componentes de tradução ortogonal, por exemplo, um O-tRNA, um O-RS1 e um par O- tRNA/O-RS que carrega um aminoácido não natural em resposta a um códon seletor. Por exemplo, o marcador de seleção negativa, o marcador de seleção positiva ou ambos, os marcadores de seleção positiva e negativa podem incluir um marcador que fluoresce ou ca- talisa uma reação Iuminescente em presença de um reagente adequado. Em outra modali- dade, um produto do marcador é detectado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS) ou por luminescência. Opcionalmente, o marcadodor inclui um marcador de seleção baseado em afinidade. Ver também Francisco, J. A. et al (1993) Production and fluores- cence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the externai surface. Proc Natl Acad Sci USA 90:10444-8.
Métodos adicionais para produzir um tRNA orthogonal recombinante podem ser en- contrados, por exemplo, nos Pedidos Internacionais WO 2002/086075, denominado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2004/094593, denominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; e WO 2005/019415, depositado em 7 de Julho de 2004. Ver também Forster et al (2003) Programming peptidomimetic synthetases by tran- skating genetic codes designed de novo PNAS 100(11 ):6353-6357; e, Feng et al, (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10):5676-5681.
Aminoacil-tRNA sintetase orthogonal (O-RS)
Um O-RS da invenção preferencialmente aminoacil um O-tRNA com um aminoáci- do não natural, in vitro e in vivo. Um O-RS da invenção pode ser provido para o sistema de tradução, por exemplo, uma célula, por um peptídeo que inclui um O-RS e/ou por um polinu- cleotídeo que codifica um O-RS ou uma porção da mesma. Por exemplo, um exemplo de O- RS compreende uma seqüência de aminoácido como revelado em SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, ou uma variação conservativa do mesmo. Em outro exemplo, um O-RS1 ou uma porção da mesma, é codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma seqüência compreendendo um aminoácido na seqüência de listagem ou exemplos aqui, ou uma se- qüência de polipeptídeo complementar do mesmo. Ver, por exemplo, o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
Métodos para identificar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS), por e- xemplo, um O-RS, para uso com um O-tRNA, são também uma característica da invenção. Por exemplo, um método inclui sujeitar a seleção, por exemplo, seleção positiva, uma popu- lação de células de uma primeira espécie, onde células individualmente compreendem: 1) um membro de uma pluralidade de aminoacil-tRNA sintetases (RSs), (por exemplo, a plura- lidade de RSs e RSs derivados a partir de espécies outras que as primeiras espécies); 2) o tRNA ortogonal (O-tRNA) (por exemplo, a partir de uma ou mais espécies); 3) um polinu- cleotídeo que codifica um marcador de seleção(por exemplo, positivo) e compreende pelo menos um códon seletor. Células são selecionadas ou classificadas por aqueles que mos- tram um aumento na eficiência de supressão comparada com células com ausência ou com uma quantidade reduzida do membro da pluralidade dos RSs. Eficiência de supressão pode ser medida por técnicas conhecidas como aqui descrito. Células tendo um aumento na efici- ência de supressão compreende um RS ativo que aminoacila o O-tRNA. Um nível de ami- noacilação (in vitro ou in vivo) pelo RS ativo de um primeiro grupo de tRNAs a partir das primeiras espécies é comparado ao nível de aminoacilação (in vitro ou in vivo) pelo RS ativo de um segundo grupo de tRNAs a partir das segundas espécies. O nível de aminoacilação pode ser determinado por uma substância detectável (por exemplo, um aminoácido não na- tural marcado). O RS ativo que mais eficientemente aminoacila o segundo grupo de tRNAs comparado ao primeiro grupo de tRNAs é tipicamente selecionado, assim provendo uma eficiente (otimizada) aminoacil-tRNA sintetase ortogonal para uso com o O-tRNA. Um O-RS, identificado pelo método, é também uma característica da invenção.
Qualquer de um número de ensaios pode ser utilizado para determinar aminoacila- ção. Esses ensaior podem ser feitos in vitro e in vivo. Por exemplo, ensaiors de aminoacila- ção in vitro são descritos em, por exemplo, Hoben e Soll (1985) Methods Enzvmol. 113:55- 59. Aminoacilação pode também ser determinada pelo uso de um repórter junto com com- ponentes de tradução ortogonal e detectando o repórter em uma célula expressando um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um códon seletor que codifica uma proteína. Ver também, WO 2002/085923, denominado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" e WO 2004/094593, denominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE."
O-RS identificados podem ser ainda manipulados para alterar a especificidade do substrato da sintetase, a fim de que comente um aminoácido não natural desejado, mas não qualquer dos 20 aminoácidos comuns, sejam carregados para o O-tRNA. Métodos para ge- rar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal com uma especificidade ao substrato para um aminoácido não natural inclui mutação da sintetase, por exemplo, no sítio ativo na sintetase, no sítio de mecanismo de edição na sintetase, em diferentes sítios por combinar diferentes domínios de sintetases, ou semelhantes, e aplicando um processo de seleção. Uma estraté- gia é utilizada, que é baseada na combinação de uma seleção positiva seguida por uma seleção negativa. Na seleção positiva, supressão do códon seletor introduzido em uma(s) posição(s) não essencial de um marcador positivo permite células sobreviverem sob pres- são de seleção positiva. Em presença de ambos, aminoácidos naturais e não naturais, so- breviventes então codificam sintetases ativas carregando o tRNA supressor ortogonal com ou um aminoácido natural ou não natural. Na seleção negativa, supressão de um códon se- letor introduzido em uma (s) posição(s) não essencial(s) de um marcador negativo remove sintetases com especificidades de aminoácidos naturais. Sobreviventes da seleção positiva e negativa compreendem sintetases que aminoacilam (carregam) o tRNA supressor ortogo- nal com somente aminoácidos não naturais. Essas sintetases podem então serem sujeitas a mutagênese adicional, por exemplo, DNA misturado ou outros métodos de mutagênese re- cursivo.
Uma biblioteca de O-RSs mutantes pode ser gerada utilizando várias técnicas de
mutagênese conhecidas na técnica. Por exemplo, o mutante RSs pode ser gerado por mu- tações sítio-específicas, mutações pontuais aleatórias, recombinação homóloga, DNA mistu- rado ou outros métodos de mutagênese recursiva, construção quimérica ou qualquer combi- nação dos mesmos. Por exemplo, uma biblioteca de RSs mutantes pode ser produzida a partir de dois ou mais outros, por exemplo, menores e menos diversas "sub-bibliotecas". Bibliotecas quiméricas de RSs são também incluídas na invenção. Deve ser notado que bi- bliotecas de tRNA sintetase a partir de vários organismos (por exemplo, microorganismos tais como eubactéria ou archaebacteria) tal como bibliotecas que compreendem diversidade natural (ver, por exemplo, Patente EUA No. 6.238.884 para Short et a/; Patente dos EUA No. 5.756.316 a Schallenberger et a/; Patente dos EUA No. 5.783.431 para Petersen et a/; Pa- tente dos EUA No. 5.824.485 para Thompson et al; Patente dos EUA No. 5.958.672 para Short et al), são opcionalmente construídos e selecionados para pares ortogonais.
Uma vez que as sintetases são sujeitas a estratégia de seleção/classificação positi- va e negativa, essas sintetases podem então ser sujeitas a mutagênese adicional. Por e- xemplo, um ácido nucléico que compreende o O-RS pode ser isolado; um grupo de polinu- cleotídeos que codificam O-RSs mutado (por exemplo, por mutagênese aleatória, mutagên- se sítio-específica, recombinação ou qualquer combinação do mesmo) pode ser gerado a partir do ácido nucléico; e, esses passos individuais ou uma combinação desses passos podem ser repetidos até um O-RS mutado ser obtido que preferencialmente aminoacila o O- tRNA com o aminoácido não natural. Em alguns aspectos da invenção, os passos são feitos múltiplas vezes, por exemplo, pelo menos duas vezes. Níveis adicionais de exigência na seleção/classificação pode também ser utilizados
nos métodos da invenção, para produção de O-tRNA, O-RS ou pares dos mesmos. A exi- gência de seleção ou classificação pode ser variada em um ou ambos os passos do método para produzir um O-RS. Este pode incluir, por exemplo, variando a quantidade de agente de seleção/classificação que é utilizado etc. Ciclos adicionais de seleção positiva e/ou negativa podem também ser feitos. Selecionar ou classificar também pode compreender um ou mais de uma mudança na permeabilidade do aminoácido, uma mudança na eficiência de tradu- ção, uma mudança na fidelidade de tradução etc. Tipicamente, o uma ou mais mudanças são baseadas na mutação em um ou mais genes em um organismo em que um par de tR- NA-tRNA sintetase ortogonal é utilizado para produzir proteína. Detalhes gerais adicionais para produzir O-RS, e alterar a especifidade do substrato
da sintetase podem ser encontrados no Pedido Internacional Número WO 2002/086075, denominado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;"e WO 2004/094593, de- nominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE." Ver também, Wang e Schultz, "Expanding the Genetic Code", Angewandte Chemie Int. Ed1 44(1):34-66 (2005), o conteúdo do qual é incorporado por referência em sua totalidade.
FONTE E ORGANISMO HOSPEDEIROS
Componentes de tradução ortogonais (O-tRNA e O-RS) da invenção podem ser de- rivados a partir de qualquer organismo (ou uma combinação de organismos) para uso em um sistema de tradução de hospedeiro a partir de qualquer outra espécie, com o aviso que os componentes O-tRNA/O-RS e o sistema de hospedeiro trabalham em uma forma ortogo- nal. Não é um requerimento que o O-tRNA e o O-RS a partir de um par ortogonal ser deri- vado a partir do mesmo organismo. Em alguns aspectos, os componentes ortogonais são derivados a partir dos genes Archaea (isto é, archaebacteria) para uso em um sistema hos- pedeiro de eubactéria.
Por exemplo, o O-tRNA ortogonal pode ser derivado a partir de um organismo Ar- chae, por exemplo, um archaebacterium, tais como Methanococcus jannaschii, Methanobae- terium thermoautotrophieum, Halobaeterium tais como Haloferaxa voleanii e espécies Halo- bacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyroeoeeus furiosus, Pyroeoeeus horikoshii, Aeu- ropyrum pernix, Methanoeoeeus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosareina mazei (Mm), Pyrobaeulum aerophilum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfatarieus (Ss), Sulfolobus tokoodaii, Thermoplasma aeidophilum, Thermoplasma voleaniem, ou semelhantes, ou uma eubactéria, tais como Eseheriehia eoli, Thermus thermophilus, Bacillus subtilis, BaciHus stea- rothermphilus, ou semelhantes, enquanto o O-RS ortogonal pode ser derivado a partir de um organismo ou combinação de organismos, por exemplo, um archaebacterium, tais como, Methanoeoeeus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophieum, Halobacterium tais como Haloferax voleanii espécies de Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyro- eoeeus furiosus, Pyroeoeeus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanoeoeeus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosareina mazei, Pyrobaeulum aerophilum, Pyroeoeeus abys- si, Sulfolobus solfatarieus, Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma aeidophilum, Thermoplasma voleanium, ou semelhantes, ou uma eubactéria, tais como Eseheriehia eoli, Thermus ther- mophilus, Baeillus subtilis, Bacillus stearothermphilus, ou semelhantes. Em uma modalidade, fontes eucarióticas, por exemplo, plantas, algas, protistas, fungos, leveduras, animais (por exemplo, mamíferos, insetos, artrópodes etc), ou semelhantes, podem também ser utiliza- dos como fontes de O-tRNA e O-RSs.
Os componentes individuais de um par O-tRNA/O-RS podem ser derivados a partir do mesmo organismo ou diferentes organismos. Em uma modalidade, o par O-tRNA/O-RS é a partir do mesmo organismo. Alternativamente, o O-tRNA e o O-RS do par O-tRNA/O-RS são a partir de diferentes organismos.
O O-tRNA, O-RS ou par O-tRNA/O-RS podem ser selecionados ou classificados in vivo e in vitro e/ou utilizados em uma célula, por exemplo, uma célula de eubactéria, para produzir um polipeptídeo com um aminoácido não natural. A célula eurobacteriana não está limitada a, por exemplo, Escherichia eoli, Thermus thermophilus, Baeillus subtilis, Baeillus stearothermphilus, ou semelhantes. Composições de células eubacterianas compreendendo componentes de tradução da invenção são também uma característica da invenção.
Ver também, Pedido Intenacional Número WO 2004/094593, denominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE", depositado em 16 de Abril de 2004, para selecionar O-tRNA e/ou O-RS em uma espécie para uso em outras espécies.
Embora sistemas de tradução ortogonais (por exemplo, compreendendo um O-RS, um tRNA e um aminácido não natural) podem utilizar células hospedeiras cultivadas para produzir proteínas tendo aminoácidos não naturais, não é tencionado que um sistema de tradução ortogonal da invenção requeira uma célula hospedeira viável e intacta. Por exem- plo, um sistema de tradução ortogonal pode utilizar um sistema livre de célula em presença de um extrato de célula. De fato, o uso de sistemas de transcrição/tradução in vitro livre de célula para produção de proteína é uma técnica bem estabelecida. Adaptação desses sis- temas in vitro para produzir proteínas tendo aminoácidos não naturais utilizando componen- tes do sistema de tradução ortogonal descritos aqui é bem dentro do objetivo da invenção.
CÓDONS SELETORES
Códons seletores da invenção expandem a rede de códon genética da maquinaria biossintética da proteína. Por exemplo, um códon seletor inclui, por exemplo, um códon de três bases único, um códon não senso, tal como um códon de parada, por exemplo, um có- don âmbar (UAG), ou um códon opala (UGA), um códon não natural, pelo menos um códon de quatro bases, um códon raro, ou semelhante. Um número de códons seletores pode ser introduzido em um gene desejado, por exemplo, um ou mais, dois ou mais, mais que três etc. Por uso de códons seletores, pares de tRNA/sintetase ortogonais múltiplos podem ser utilizados para permitir a incorporação sítio-específica simultânea de múltiplos aminoácido não naturais, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural, utilizando es- ses códons seletores diferentes.
Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de parada para a incorporação de um aminoácido não natural in vivo em uma célula. Por exemplo, um O-tRNA é produzido que reconhece o códon de parada e é aminoacilado por um O-RS com um aminoácido não natural. Este O-tRNA não é reconhecido pelas ami- noacil-tRNA sintetases de hospedeiro de ocorrência natural. Mutagênese sítio-direcionada convencional podem ser utilizada para introduzir o códon de parada no sítio de interesse em um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse. Ver, por exemplo, Sayers et aí (1988), 5'3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802. Quando o O-RS, O-tRNA e o ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de interesse são combinados, por exemplo, in vivo, o aminoácido não natural é incorporada em resposta ao códon de parada para dar um polipeptídeo contendo o aminoá- cido não natural na posição especificada. Em uma modalidade da invenção, o códon de pa- rada utilizado como um códon de seletor em um códon âmbar, UAG, e/ou um códon opala, UGA. Em um exemplo, um código genético em que UAG e UGA são ambos utilizados como um códon seletor pode codificar 22 aminoácidos enquanto preservar o códon não senso ocre, UAA, que é o sinal de terminação mais abundante.
A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feito sem perturbação significante da célula hospedeira. Por exemplo, em células não eucarióticas, tal como Es- cherichia coli, porque a eficiência de supressão para o códon UAG depende da competição entre o O-tRNA, por exemplo, OtRNA supressor âmbar, e o fator de liberação 1 (RF1) (que liga ao códon UAG e inicia a liberação do peptídeo crescente a partir do ribossomo), a efici- ência de supressão pode ser modulada, por exemplo, ou aumentado o nível de expressão o de O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor, ou utilizando uma fita deficiente de RF1. Em células eucarióticas, porque a eficiência de supressão para o códon UAG depende sob a competição entre o O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor âmbar, e um fator de liberação eucariótico (por exemplo, eRF) (que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo de crescimento a partir do ribossomo), a eficiência de supressão pode ser modula- da por, por exemplo, aumentando o nível de expressão de O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor. Em adição, compostos adicionais podem também estar presente, por exemplo, agentes redutores tal como ditiotretiol (DTT).
Aminoácidos não naturais podem também compreender códons raros. Por exem- plo, quando a concentração arginina em uma reação de síntese de proteína in vitro é redu- zida, o códon raro de arginina, AGG, tem provado ser eficiente para inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Ver, por exemplo, Ma et al, Biochemistry, 32:7939 (1993). Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg de ocorrência natural, que exis- te como uma espécie menor em Escherichia coli. Em adição, alguns organismos não usam todos os códons tripletes. Um códon não assigned AGA em Micrococcus Iuteus tem sido utilizado para inserção de aminoácidos em um extrato de transcrição/tradução in vitro. Ver, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res. 25:4685 (1997). Componentes da invenção podem ser gerados para usar esses códons raros in vivo.
Códons seletores também compreendem códons extendidos, por exemplo, códons de quatro ou mais bases, tais como, quatro, cinco, seis ou mais bases de códons. Exemplos de códons de quatro bases incluem, por exemplo, AGGA, CUAG, UAGA1 CCCU e seme- lhantes. Exemplos de códons de cinco bases incluem, por exemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e semelhantes. Métodos da invenção incluem utilizando códons extendidos baseados em supressão da inserção ou deleção de um nucleotídeo. Quatro ou mais bases de códons podem inserir, por exemplo, um ou múltiplos aminoácidos não naturais, na mesma proteína. Em outras modalidades, as alças de anticódon codificam, por exemplo, pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases, ou pelo menos um códon de seis bases ou mais. Desde que existam 256 possíveis códons de quatro bases, aminoácidos não naturais múltiplos podem ser codificador na mesma célu- la utilizando um códon de quatro ou mais bases. Ver também, Anderson et al (2002) "Explor- ing the Limits of Codon and Anticodon Size"' Chemistry and Biology 9:237-244; e, Magliery, (2001) "Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Supressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli," J. Mol. Biol. 307:755-769. Por exemplo, códons de quarto bases têm sido utilizados para incorporar aminoáci- dos não naturais em proteínas utilizando métodos biossintéticos in vitro. Ver, por exemplo, Ma et al (1993) Biochemistry 32:7939; e Hohsaka et al, (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. CGGG e AGGU foram utilizados para simultaneamente para incorporar 2-naftilalanina e um derivado NBD de Iisina em estreptavidina in vitro com dois tRNAs supressores da inserção ou deleção de um nucleotídeo quimicamente adiados. Ver, por exemplo, Hohsaka et al (1999) J Am Chem Soc1 121:12194. Em um estudo in vivo, Moore et al, examinou a habili- dade dos derivados tRNALeu com anticódons NCUA para suprimir códons UAGN (N pode ser U, A, G ou C), e encontrou que o quadruplete UAGA pode ser codificado por um tRNALeu com um antícódon UCUA com uma eficiência de 13 a 26% com um pouco de decodificante de O a -1 da região que pode ser traduzida. Ver Moore et al (2000) J Mol Biol 298,195. Em uma modalidade, códons extensos baseados em códons raros ou códons não senso podem ser utilizados na invenção, que podem reduzir a mutação pontual na tradução e supressão de deleção ou inserção de nucleotídeo nos outros sítios não queridos. Códons de quatro bases têm sido utilizados como códons seletores em uma variedade de sistemas ortogonais. Ver, por exemplo, WO 2005/019415; WO 2005/007870 e WO 2005/07624. Ver também, Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code", Angewandte Chemie Int Ed., 44(1):34-66 (2005), o conteúdo do qual é incorporado por referência em sua totalidade. Enquanto os exemplos abaixo utilizam um códon seletor âmbar, códons de quatro ou mais bases podem ser utilizados também, por modificar os exemplos aqui para incluir O-tRNAs de quatro bases e sintetases modificadas para incluir mutações similares àquelas previamente descritas para vários aminoácidos não naturais O-RSs.
Para um dado sistema, um códon seletor podem também incluir um dos códons de três bases naturais, onde o sistema endógeno não utiliza (ou uso raro) o códon de base na- tural. Por exemplo, este inclui um sistema que é a ausência de um tRNA que reconhece o códon de três bases naturais, e/ou um sistema onde o códon de três bases é um códon raro.
Códons seletores opcionalmente incluem pares de base não naturais. Esses pares de base não naturais ainda expandem o existente alfabeto genético. Um par de bases extra aumenta o número de códons tripletes a partir do 64 a 125. Propriedades dos pares de ter- ceira base incluem pareamento de base estável e seletivo, incorporação enzimática eficiente no DNA com alta fidelidade por uma polimerase, e a extensão primária continuada após sín- tese do par de bases não natural nascente. Descrições de pares de base não naturais que podem ser adaptados para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao et al, (2002) "An unnatural pair for incorporating amino acid analogues into protein," Nature Biote- chnology 20:177-182. Ver também Wu et al (2002) J. Am. Chem. Soe. 124:14626-14630. Outras publicações relevantes são listadas abaixo. Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é permeável a membrana e é fosforila- do para foramr o trifosfato correspondente. Em adição, a informação genética aumentada é estável e não destruída por enzimas celulares. Esforços prévios de Benner e outros toma- ram vantagem de modelos de ligação de hidrogênio que são diferentes daqueles nos pares canônicos de Watson-Crick, o exemplos mais notável do qual é o par iso-C:iso-G. Ver, por exemplo, Switzer et al (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; e Piccirilli et al, (1990) Nature 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Biol. 4:602. Essas bases em geral combinam erroneamente a alguns graus com bases naturais e não podem ser enzimaticamente replicadas. Kool e colaboradores demonstraram que intereções de empacotamento hidrofóbicas entre as ba- ses podem substituir ligações de hidrogênio para dirigir a formação do par de base. Ver Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:602; e Guckian e Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36, 2825. Em um esforço para desenvolver um par de bases não natural satisfazendo todos os requerimentos acima, Schultz, Romesberg e colaboradores têm sistematicamente sintetizado e estudado uma série de bases hidrofóbicas não naturais. Um auto-par PICS:PICS é encontrado ser mais estável que os pares de base não naturais, e podem ser eficientemente incorporado no DNA pelo fragmento Klenow de DNA polimerase I de Esche- richia coli (KF). Ver, por exemplo, McMinn et al (1999) J Am Chem Soe, 121:11586; e Oga- wa et al (2000) J Am Chem Soe, 122:3274. Um auto-par 3MN:3MN pode ser sintetizado por KF com eficiência e seletividade suficiente para função biológica. Ver, por exemplo, Ogawa et al (2000) J Am Chem Soe, 122:8803. Entretanto, ambas as bases atuam como uma ca- deia terminadora para replicação adicional. Uma DNA polimerase mutante tem sido recen- temente desenvolvido que pode ser utilizada para replicar o auto par PICS. Em adição, um auto par 7AI pode ser replicado. Ver, por exemplo, Tae et al (2001) J Am Chem Soe, 123:7439. Um novo par metalobase, Dipic:Py, tem também sido desenvolvido, que forma um par estável sob ligação com Cu(II). Ver Megger et al (2000) J Am Chem Soe, 122:10714. Porque códons estendidos e códons não naturais são intrinsicamente ortogonais para có- dons naturais, os métodos da invenção podem tomar vantagem desta propriedade para ge- rar tRNAs ortogonais para eles.
Um sistema de ultrapassagem traducional pode também ser utilizado para incorpo- rar um aminoácido não natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema de ultrapas- sagem traducional, uma grande seqüência é inserida em um gene, mas não é traduziada em proteína. A seqüência contém uma estrutura que serve como uma marcação para introduzir o ribossomo para pular através da seqüência e resumir a cascata intracelular de tradução da inserção.
AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS
Como aqui utilizado, um aminoácido não natural refere-se a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, ou análogo de aminoácido outro que selenocisteína e/ou pirrolisina e seguindo vinte alfas aminoácidos geneticamente modificados: alanina, arginina, asparagi- na, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, Ieuci- na, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina. A estru- tura genérica de um alfa aminoácido é ilustrada pela Fórmula I:
I
R
UM aminoácido não natural é tipicamente qualquer estrutura tendo Fórmula I em que o grupo R é qualquer substituinte outro que um utilizado oem vinte aminiácido naturais. Ver, por exemplo, Biochemistry por L. Stryer, 3a ed., 1988, Freeman and Company, Nova Iorque, para estruturas dos vinte aminoácidos naturais. Note que, os aminoácidos não natu- rais da invenção podem ser compostos de ocorrência natural outro que os vinte alfa- aminoácidos acima.
Porque os aminoácidos naturais da invenção tipicamente diferem a partir de amino- ácido naturais na cadeia lateral, os aminoácidos não naturais formam ligações amidas com outros aminoácidos, por exemplo, natural ou não natural, da mesma maneira em que eles são formados nas proteínas de ocorrência natural. Entretanto, os aminoácidos não naturais têm grupos de cadeia lateral que distinguem os mesmos a partir dos aminoácidos naturais.
De particular interesse aqui é o aminoácido não natural sulfotirosina (ver FIG. 1). Em adição ao aminoácido sulfotirosina não natural, outros aminoácidos não naturais podem ser simultaneamente incorporados em um polipeptídeo de interesse, por exemplo, utilizando um segundo par O-RS/O-tRNA em conjunção com um par ortogonal provido pela presente invenção. Muitos aminoácidos não naturais adicionais e pares ortogonais adequados são conhecidos. Ver a presente revelação e referências citadas aqui. Por exemplo, ver Wang e Shultz "Expanding the Genetic Code", Angewandte Chemie Int Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie e Shultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554 (2005); e Wang et ai, "Expanding the Genetic Code", Annu Rev Biophys Biomol Struct., 35:225-249 (2006); o conteúdo dos quais são cada um incorporados aqui por refe- rência em sua totalidade.
Embora o aminoácido não natural sulfotirosina mostrado na FIG. 1 é o de interesse primário nos Exemplos descritos aqui, não é tencioanado que a invenção serja estritamente limitada a esta estrutura. De fato, uma variedade de análogos relacionados estruturalmente e facilmente derivados pode ser facilmente produzida que retêm as características principais 10
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da sulfotirosina mostrada na FIG. 1, e também são especificamente reconhecidas pela ami- noacil-tRNA sintetase da invenção (por exemplo, o O-RS da SEQ ID NOS: 4, 6, 8, e 10). É tencionado que esses aminoácidos análogos relacionados estejam dentro do objetivo da invenção.
Em outros aminoácidos não naturais, por exemplo, R na Fórmula I opcionalmente compreende uma alquila-, arila-, acila- hidrazina, ciano- halo-, hidrazina, alquenila, éter, bo- rato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, enona, imina, éster, hidroxilamina, amina, e semelhan- tes, ou qualquer combinação dos mesmos. Outros aminoácidos não naturais de interesse incluem, mas não são limitados a, aminoácidos compreendendo um Iigador cruzado fotoati- vável, aminoácidos spin-marcados, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos ligados a metal, aminoácidos contendo metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que covalentemente ou não covalentemente interagem com outras moléculas, aminoácidos ativados por luz e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos contendo bio- tina ou análogos de biotina, aminoácidos contendo ceto, aminácidos glicosilados, uma fra- ção sacarídea ligada a cadeia lateral de aminoácido, aminoácidos compreendendo polietile- no glicol ou poliéter, aminoácidos substituídos por átomo pesado, aminoácidos quimicamen- te cliváveis ou fotocliváveis, aminoácidos com uma cadeia lateral elongada como comparado com aminoácidos naturais (por exemplo, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, por exemplo, maiores que cerca de 5, maiores que cerca de 10 carbonos etc), aminoácidos con- tendo açúcar ligado a carbono, aminoácidos contendo aminotioácido, e aminoácidos con- tendo uma ou mais frações tóxicas.
Em outro aspecto, a invenção provê aminoácidos não naturais tendo a estrutura ge- ral ilustrada pela Fórmula IV abaixo:
Um aminoácido não natural tendo esta estrutura é tipicamente qualquer estrutura onde R1 é um substituinte utilizado em um dos vinte aminoácidos naturais (por exempo, tirosina ou fenilalanina) e R2 é um substituinte. Então, este tipo de aminoácido não natural pode ser visto como um aminoácido natural derivado.
Em adição aos aminoácidos não naturais que contêm a estrutura sulfotirosina mos- trada na FIG. 1, aminoácidos não naturais podem também opcionalmente compreender es- truturas de esqueleto modificadas, por exemplo, como ilustrado pelas estruturas de Fórmula Il e III:
II
R
X
ΙΠ
H H HjN """^^C QiH
em que Z tipicamente compreende OH1 NH2, SH1 NH-R', ou S-R'; X e Y, que podem ser os mesmos ou diferentes, tipicamente compreendem S ou O, e R e R', que são opcio- nalmente os mesmos ou diferentes, são tipicamente selecionados a partir da mesma lista de constituintes para o grupo R descrito acima para aminoácidos não naturais tendo Fórmula I bem como hidrogênio. Por exemplo, aminoácidos não naturais da invenção opcionalmente compreendem substituições no grupo amino ou carboxila como ilustrado pelas Fórmulas Il e III. Aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não são limitados a, ácidos σ-hidróxi, σ-tioácidos σ-aminotiocarboxilatos, por exemplo, com cadeias correspondentes aos vinte aminoácidos comuns ou cadeias laterais não naturais. Em adição, substituições no carbono a opcionalmente incluem aminoácidos L, D, ou a- σ-disubstituídos tais como D-glutamina, D- alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, e semelhantes. Outras alternativas estrutu- rais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina bem como 3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros do anel de análogos de prolina, β e γ aminoácidos tais como ácido /?-alanina e γ- amino butírico.
Em alguns aspectos, a invenção utilizada aminoácidos não naturais na configura- ção L. Entretanto, não é tencionado que a invenção seja limitada para o uso da configuração L de aminoácido não natural. É contemplado que D-enastiômeros desses aminoácidos não naturais também encontram uso com a invenção.
Os aminoácidos não naturais que encontram uso com a invenção não são estrita- mente limitados ao aminoácido não natural sulfotirosina mostrado na FIG. 1. Um versado na técnica reconhecerá que uma grande variedade de análogos não naturais de aminoácidos de ocorrência natural são facilmente produzidos. Por exemplo, mas não limitado a, deriva- dos não naturais a partir de tirosina são facilmente produzidos. Análogos de tirosina incluem, por exemplo, tirosinas para-substituídas, tirosinas orto-substituídas, e tirosinas meta- substituídas, em que a tirosina substituída compreende um grupo alquinila, grupo acetila, um grupo benzoila, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carbóxi, um grupo isopropila, um grupo metila, uma cadeia reta C6-C20 ou hidrocarboneto ramificado, um hidrocarboneto saturado ou não saturado, um grupo O-metila, um grupo poli- éter, um grupo nitro, ou semelhantes. Em adição, anéis arila múltiplas substituições são também contemplados. Análogos de glutamina da invenção incluem, mas não são limitados a, derivados σ-hidróxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos, e derivados de glutamina substituídos com amida. Exemplos de análogos de fenilalanina incluem, mas não são limita- dos e, fenilalaninas para-substituídas, fenilalaninas orto-substituídas, e fenilalaninas meta- substituídas, em que o substituinte compreende um grupo alquinila, um grupo hidróxi, um grupo metóxi, um grupo metila, um grupo alila, um aldeído, um nitro, um grupo tiol, um grupo ceto, ou semelhantes. Exemplos específicos de aminoácidos não naturais incluem, mas não são limitados a sulfotirosina, p-etilcarbonil-L-fenilalanina, p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina, 1,5-dansil-alanina, ácido amino 7-amino-coumarino, ácido amino 7-hidróxi-coumarino nitro- benzil-serina, 0-(2-nitrobenzil)-L-tirosina, p-carboximetil-L-fenilalanina, p-ciano-L- fenilalanina, m-ciano-L-fenilalanina, bifenilalanina, 3-amino-L-tirosina, bipiridil alanina, p-(2- amino-1-hidroxietil)-L-fenilalanina, p-isopropiltiocarbonil-L-fenilalanina, 3-nitro-L-tirosina e p- nitro-L-fenilalanina. Também, um p-propargiloxifenilalanina, um 3,4-diidróxi-L-fenilalanina (DHP), um 3,4,6-triidróxi-L-fenilalanina, um 3,4,5-tríidróxi-L-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, um p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, um L-3-(2-naftil)alanina, um 3-metil-fenilalanina, um Ο-4-alil-L-tirosina, um 4-propil-L-tirosina, um 3-nitro-tirosina, um 3-tiol-tirosina, um tri-O- acetil-GlcNAc/?-serina, um L-Dopa1 uma fenilalanina fluorinada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, um p-acil-L-fenilalanina, um p-benzoil-L-fenilalanina, uma L- fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, um p-iodo-fenilalanina, um p- bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, e uma isopropil-L-fenilalanina e semelhan- tes. As estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais são reveladas nas refe- rências aqui citadas. Ver também, WO 2006/110182, depositada em 27 de Outubro de 2005, denominada "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS."
Síntese Química de Aminoácidos Não Naturais Muitos dos aminoácidos não anturais providos acima são comercialmente disponí-
veis, por exemplo, a partir da Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, Wl, EUA). Esses que não são comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como providos em várias publicações ou utilizando métodos padrões conhecidos por aqueles versados na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Mass); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Filhos, Nova Iorque); e Advanced Or- ganic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira Edição, Partes AeB, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). Publicações adicionais descrevendo a síntese de aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, WO 2002/085923 denomiado "In vivo incorporation of Unnatural Ami- no Acids;" Matsoukas et al (1995) J Med Chem1 38, 4660-4669; King e Kidd (1949) "A New Synthesis of Glutamine and γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated lntermediates", J Chem Soe, 3315-3319; Friedman e Chatterji (1959) Synthesis of Derivates of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J Am Chem Soe 81, 3750-3752; Craig et al (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(dithylamino)-1- methylbutyl]amino]quinoline (ChIoroquine) J Org Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M. Vilmont1 M & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potencial Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optieally Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Aeid De- carbonylation and Imunium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton et al (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthe- sis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimetic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43: 4297-4308; e, Subasinghe et al, (1992) Quisqualic aeid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivates and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J Med Chem 35:4602-7. Ver também, Pedido Interna- cional WO 2004/058946, denominado "PROTEIN ARRAYS," depositado em 22 de Dezem- bro de 2003.
Captação celular de aminoácidos não naturais
Captação de aminoácido não natural por uma célula é um questão que é tipicamen- te considerada quando desenhando e selecionando aminoácidos não naturais, por exemplo, para incorporação em uma proteína. Por exemplo, a densidade de alta carga de o- aminácídos sugere que esses compostos são improváveis para ser permeável a célula. A- minoácidos naturais são tomados na célula através de uma coleção de sistemas de trans- porte baseado em proteína sempre mostrando graus variados de especificidade de aminoá- cido. Uma seleção rápida pode ser feita que acesse os aminoácidos não naturais, se quais- quer, são tomados por células. Ver, por exemplo, os ensaior de toxicidade em, por exemplo, Pedido Internacional WO 2004/058946, denominado "PROTEIN ARRAYS", depositado em 22 de Dezembro de 2003; e Liu e Schultz (1999) Progress toward the evolution of an orga- nism with an expanded genetic code. PNAS 96:4780-4785. Embora a captação seja facil- mente analisada com vários ensaios, uma alternativa para desenhar aminoácidos não natu- rais que são amenistas para vias de captação celular é para prover vias biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.
Biossíntese de Aminoácidos Não Naturais Muitas vias biossintéticas já existem em células para a produção de aminoácidos e outros componentes. Enquanto um método biossintético para um aminoácido não natural particular pode não existir em natureza, por exemplo, em uma célula, a invenção provê tais métodos. Por exemplo, vias biossintéticas para aminoácidos não naturais são opcionalmen- te gerados na célula hospedeira por adição de novas enzimas ou modificando a existência de vias de célula hospedeira. Novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas de o- corrência natural ou enzimas desenvolvidas artificialmente. Por exemplo, a biossíntese de p- aminofenilalanina (como apresentado em um exemplo em WO 2002/085923) acredita-se na adição de uma combinação de enzimas conhecidas a partir de outros organismos. OS ge- nes para essas enzimas podem ser introduzidos em uma célula por transformar a célula com um plasmídio compreendendo os genes. Os genes, quando expressos na célula, prover uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionados são providos em exemplos abaixo. Seqüências de en- zimas adicionais são encontrados, por exemplo, em Genbank. Enzimas desenvolvidas artifi- cialmente são também opcionalmente adicionadas em uma célula na mesma maneira. Nes- ta maneira, a maquinaria celular e fontes de uma célula são manipuladas para produzir ami- noácidos não naturais.
De fato, quaisquer de uma variedade de métodos podem ser utilizados para produ- zir novas enzimas para uso nas vias biossintéticas, ou para evolução de vias existentes, para a produção de aminoácidos não naturais, in vitro ou in vivo. Muitos métodos disponí- veis de enzimas desenvolvendo e outros componentes da via biossintética podem ser apli- cados para presente invenção para produzir aminoácidos não naturais (ou, de fato, desen- volver sintetases para ter novas especifidades de substrato ou outras atividades de interes- se). Por exemplo, DNA misturado é opcionalmente utilizado para desenvolver novas enzi- mas e/ou vias de tais enzimas para a produção de aminoácidos não naturais (ou produção de novas sintetases), in vitro ou in vivo. Ver, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994) DNA shuf- fling by random fragmentarion and reassembly: In vitro recombination for molecular evolu- tion, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 91:10747-10751. Uma abordagem relationada de famílias misturadas de genes relacionados (por exemplo, homólogos) para enzimas desenvolverem rapidamente com características desejadas. Um exemplo de tais métodos "mistura de gene família" é encontrado em Cramari et al (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diver- se species accelerates directed evolution" Nature, 391(6664):288-291. Novas enzimas (se componentes da via biossintética ou sintetases) podem também ser gerados utilizando um procedimento de recombinação de DNA conhecido como "truncagem incrementada" para a criação de enzimas híbridas"("ITCHY"), por exemplo, como descrito em Ostermeier et al (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205. Esta abordagem pode também ser utilizada para gerar uma biblioteca de enzima ou vias variantes que podem servir como substratos para um ou mais métodos de recombinação in vitro ou in vivo. Ver, também, Ostermerier et al (1999) "Combinatorial Pro- tein Engineering by Incrementai Truncation", Proc Natl, Acad. Sci EUA 96: 3562-67, e Os- termeier et al, (1999), "Incrementai Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Bio- catalysts," Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44. Outra abordagem utilize expo- nencial mutagênese unida para produzir bibliotecas de enzima ou outras vias variants que são, por exemplo, selecionados para uma habildiade para catalisar uma reação biossintetíca relevante para produzir um aminoácido não natural (ou uma nova sintetase). Nesta aborda- gem, grupos pequenos de resíduos em uma seqüência de interesse são aleatórios em para- lelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que levam às proteínas funcio- nais. Exemplos de tais procedimentos, que podem ser adaptados para a presente invenção para produzir novas enzimas para a produção de aminoácidos não naturais (ou novas sinte- tases) são encontrados em Delegrave & Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548- 1552. Em ainda outra abordagem, mutagêneses aleatórias ou semi-aleatórias utilizando oli- gonucleotídeos deduzidos ou degenerados para enzima e/ou vias componentes da enge- nharia podem ser utilizados, por exemplo, por uso de métodos de mutagênese gerais de, por exemplo, Arkin e Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific sub- sets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300; ou Reidhaar- Olson et al (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide casse- tes" Methods Enzymol. 208:564-86. Ainda outra abordagem, sempre denominada uma mu- tagênese "não-estocástico", que usam união polinucleotídeo e mutagênese de sítio- saturação pode ser utilizado para produzir enzimas e/ou componentes da via, que podem então ser selecionados para uma habildiade para fazer uma ou mais funções da via da sin- tetase ou biossintética (por exemplo, para a produção de aminoácidos não naturais in vivo). Ver, por exemplo, Short "NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES" WO 00/46344.
Uma alternativa para tais métodos mutacionais envolve recombinação de genomas inteiros de organismos e selecionando a progênie resultante para funções da via particular (sempre referido como "misturando o genoma inteiro"). Esta abordagem pode ser aplicada a presente invenção, por exemplo, pela recombinação genômica e seleção de um organismo (por exemplo, uma E. coli ou outra célula) para uma habilidade para produzir um aminoácido não natural (ou intermediário do mesmo). Por exemplo, métodos ensinados em nas seguin- tes publicações podem ser aplicados para o desenho da via para a evolução de vias existen- tes e/ou novas em células para produzir aminoácidos não naturais in vivo: Patnaik et al (2002) "Genome shuffling of Iactobacillus for improved acid tolerance"Nature Biotechnology, 20(7):707-712; e Zhang et al (2002) "Genome shuffling Ieads to rapid phenotypic improve- ment in bacteria"Nature, 7 de Fevereiro, 415(6872):644-646.
Outras técnicas para construção de organismos e via metabólica, por exemplo, para a produção de compostos desejados são também disponíveis e podem também ser aplica- dos para a produção de aminoácidos não naturais. Exemplos de publicações úteis para en- sinar as abordagens davia de construção incluem: Nakamura e White (2003) "Metabolic en- ginerring forthe microbial production of 1,3 propanediol" Curr. Opin. Biotechnol. 14(5):4554- 9; Berry et al (2002) "Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech índigo" J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133; Banta et al (2002) "Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic reductase for use in vitamin C biosynthesis" Bio- chemistry, 41 (20), 6226-36; Selivonova et al (2001) "Rapid Evolution of Novel Traits in Mi- croorganisms" Applied and Environmental Microbiology, 67:3645, e muitos outros.
A despeito do método utilizado, tipicamente, o aminoácido não natural produzido com uma via de construção biossintética da invenção é produzida em uma concentração suficiente para biossíntese eficiente de proteína, por exemplo, uma quantidade celular natu- ral, mas não em tal grau para significantemente afetar a concentração de outros aminoáci- dos celulares ou para exaurir fontes celulares. Concentraçõe típicas produzidas in vivo nesta maneira são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Uma vez que uma célula é construída para produzir enzimas desejadas para uma via específica e um aminoácido não natural é gerado, seleções in vivo são opcionalmente utilizadas para ainda otimizar a produção de aminoácido não natural para ambas, a síntese de proteína ribossomal e crescimento celular. Componentes Ortogonais para Incorporar Aminoácidos Não Naturais A invenção provê composições e métodos para produzir componentes ortogonais para incorporar o aminoácido não natural sulfotirosina (ver FIG. 1) em uma cadeia de poli- peptídeo crescente em resposta a um códon seletor, por exemplo, um códon de parada âm- bar, um cóndon não senso, um códon de quatro ou mais bases etc, por exemplo, in vivo. Por exemplo, a invenção provê tRNAs ortogonais (O-tRNAs), aminoacil-tRNA sintetase ortogo- nal (O-RSs) e pares dos mesmos. Esses pares podem ser utilizados para incorporar um aminoácido não natural em cadeias polipeptídicas crescentes. Uma composição da invenção inclui uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-
RS), onde o O-RS preferencialmente aminoacila um O-tRNA com sulfotirosina. Em certas modalidades, o O-RS compreende uma seqüência aminoácida compreendendo a SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, e variações conservadas das mesmas. Em certas modalidades da inven- ção, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA em qualquer tRNA endógeno com um aminoácido não natural particular, onde o O-RS tem um indutor para o O-tRNA, e onde a proporção de O-tRNA carregada com um aminoácido não natural para o tRNA endógeno carregado com o mesmo aminoácido não natural é maior que 1:1, e mais preferivelmente onde o O-RS carrega o O-tRNA exclusivamente ou quase exclusivamente.
Uma composição que inclui um O-RS pode opcionalmente ainda incluir, um tRNA ortogonal (O-tRNA), onde o O-tRNA reconhece um códon seletor. Tipicamente, um O-tRNA da invenção inclui pelo menos cerca de, por exemplo, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% ou 90% ou mais de eficiência de supressão em presença de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor como comparado a eficiência de supressão de um O-tRNA compreenden- do ou codificado por uma seqüência polinucleotídica como revelado na listagem de seqüên- cia (por exemplo, SEQ ID NO:1) e exemplos aqui. Em uma modalidade, a eficiência de su- pressão da O-RS e o O-tRNA juntos é melhor, por exemplo, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes ou mais que a eficiência de supressão do O-tRNA em ausência de um O- RS. Em alguns aspectos, a eficiência de supressão do O-RS e o O-tRNA juntos é pelo me- nos 45% da eficiência de supressão de um par de tirosil-tRNA sintetase ortogonal derivado a partir de Methanococcus jannaschii.
Uma composição que inclui um O-tRNA pode opcionalmente incluir uma célula (por exemplo, uma célula de eubactéria, tal como célula de E. coli e semelhantes, ou uma célula eucaritótica tal como uma célula de levedura), e/ou um sistema de tradução.
Uma célula (por exemplo, uma célula eubacteriana ou uma célula de levedura) compreendendo um sistema de tradução é também provida pela invenção, onde o sistema de tradução inclui um tRNA ortogonal (O-tRNA); uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS); e, um aminoácido não natural sulfotirosina. Tipicamente, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA em qualquer tRNA endógeno com o aminoácido não natural, onde o O-RS tem uma indutora para o O-tRNA, e onde a proporção de O-tRNA carregado com o aminoácido não natural para o tRNA endógeno carregado com o aminoácido não natural é melhor que 1:1, e mais preferivelmente onde o O-RS carrega o O-tRNA exclusivamente ou quase exclusivamente. O O-tRNA reconhece o primeiro códon seletor, e o O-RS preferenci- almente aminoacil o O-tRNA com um aminoácido não natural. Em uma modalidade, o O- tRNA compreende ou é codificado por uma seqüência de polinucleotídeo como revelado na SEQ ID NO:1, ou uma seqüência de polinucleotídeo complementar do mesmo. Em uma mo- dalidade, o O-RS compreende uma seqüência aminoácida como revelado na SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, e variações conservadas dos mesmos.
Uma célula da invenção pode opcionalmente ainda compreender um par O- tRNA/O-RS diferente adicional e um segundo aminoácido não saturado, por exemplo, onde este O-tRNA reconhece um segundo códon seletor e este O-RS preferencialmente aminoa- cila o O-tRNA correspondente com o segundo aminoácido não natural, onde o segundo a- minoácido é diferente do primeiro aminoácido não natural. Opcionalmente, uma célula da invenção inclui um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um poli- peptídeo de interesse, onde o polinucletídeo compreende um códon seletor que é reconhe- cido pela O-tRNA.
Em certas modalidades, uma célula da invenção é uma célula eubacteriana (tal co- mo E. coli), que inclui um tRNA-ortogonal (O-tRNA), uma aminoacil-tRNA sintetase ortogo- nal (O-RS), um aminoácido não natural, e um ácido nucléico que compreende um polinucle- otídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende o có- don seletor que é reconhecido pela O-tRNA. Em certas modalidades da invenção, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminoácido não natural com uma eficiência que é maior que a eficiência com a qual o O-RS aminoacil qualquer tRNA endógeno.
Em certas modalidades da invenção, um O-tRNA da invenção compreende ou é codificado pela seqüência polinucleotídica como revelado na seqüência de listagens (por exemplo, SEQ ID NO: 1) ou exemplos aqui, o uma seqüência polinucleotídica completamen- tar do mesmo. Em certas modalidades da invenção, um O-RS compreende uma seqüência de aminoácido como revelado na seqüência de listagem, ou uma variação conservada do mesmo. Em uma modalidade, a O-RS ou uma porção do mesmo por uma seqüência polinu- cleotídica codificando um aminoácido como revelado na seqüência de listagens ou exem- plos aqui, ou uma seqüência polinucleotídeo complementar da mesma.
O O-tRNA e/ou o O-RS da invenção pode ser derivado de qualquer de uma varie- dade de organismos (por exemplo, organismos eucarióticos e/ou não eucarióticos).
Polinucleotídeos são também uma característica da invenção. Um polinucleotídeo da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11) inclui um polinucleotídeo artificial (por exemplo, feita pelo homem, e não de ocorrência natural) compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo como revelado na seqüência de listagens aqui, e/ou é complementar a ou aquela seqüência polinucleotídica. Um polinucletídeo da invenção pode também incluir um ácido nucléico que hibridiza para um polinucleotídeo descrito acima, sob condições altamente rigorosas, em substancialmente o comprimento inteiro do ácido nucléico. Um polinucleotídeo da invenção também inclui um polinucleotídeo que é, por e- xemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico ao tNRA de ocorrência natural ou correspondendo ao código do ácido nucléico (mas um polinucleotídeo da invenção é outro que um tRNA de ocorrência natural ou codificando o ácido nucléico correspondente), onde o tRNA reconhece um códon seletor, por exemplo, um códon de quatro base. Polinucleotídeos artificiais que são, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico pa- ra qualquer dos acima e/ou um polinucleotídeo compreendendo uma variação conservada de qualquer dos acima, são também inclusos em polinucleotídeos da invenção. Vetores compreendendo um polinucleotídeo da invenção são também uma caracte-
rística da invenção. Por exemplo, um vetor da invenção pode incluir um plasmídeo, um cos- mídeo, um fago, um vírus, um vetor de expressão, e/ou semelhantes. Uma célula compre- endendo um vetor da invenção é também uma característiica da invenção.
Métodos de produção de componentes de um par O-tRNA/O-RS são tamb[em ca- racterísticas da invenção. Componentes produzidos por esses métodos são também uma característica da invenção. Por exemplo, métodos de produzir pelo menos um tRNA que é ortogonal a uma célula (O-tRNA) incluem a geração de uma biblioteca de tRNAs mutantes; mutando uma alça anti-códon de cada membro da biblioteca de tRNAs mutantes para permi- tir o reconhecimento de um códon seletor, assim provendo uma biblioteca de O-tRNAs po- tenciais, e sujeitando a seleção negativa uma primeira população de células de uma primei- ra espécie, onde as células compreendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais. A seleção negativa elimina células que compreendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais que é aminoacilado por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) que é endógena para a célula. Este provê um conjunto de tRNAs que são ortogonais para a célula da primeira espécie, assim provendo pelo menos um O-tRNA. Um O-tRNA produzido pelos métodos da invenção é também provido. Em certas modalidades, os métodos ainda compreendem sujeitar a seleção positiva
uma segunda população de células da primeira espécie, onde as células compreendem um membro do conjunto de tRNAs que são ortogonais para a célula da primeira espécie, uma aminoacil-tRNA sintetase cognata, e um marcador se seleção positivo. Utilizando a seleção positiva, células são selecionadas ou classificadas para aquelas células que compreendem um membro do conjunto de tRNAs que é aminoacilado pela aminoacil-tRNA sintetase vog- nata e que mostra ums resposta desejada em presença do amrcador de seleção positiva, assim provendo um O-tRNA. Em certas modalidades, a segunda população de células com- preende células que não foram eliminadas pela seleção negativa.
Métodos para identificar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal que carrega um O-tRNA com um aminoácido não natural são também providos. Por exemplo, métodos in- cluem sujeitar uma população de células a uma primeira espécie para uma seleção, onde as células compreendem: 1) um membro de uma pluralidade de aminoacil-tRNA sintetase (RSs), (por exemplo, a pluralidade de RSs pode incluir RSs mutantes, Rss derivadas de es- pécies outras que uma primeira espécie ou amboas, RSs mutante e RSs derivada de espé- cie outr que uma primeira espécie); 2) o tRNA ortogonal (O-tRNA) (por exemplo, a partir de uma ou mais espécies); e 3) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção posi- tiva e compreende pelo menos um códon de seleção.
Células (por exemplo, célula hospedeira) são selecionadas ou classificadas por a- queles que mostraram um amentaram a eficiência de supressão para as células com ausên- cia ou tendo uma quantidade reduzida do membro da pluralidade dos RSs. Essas células selecionadas/classificadas compreendem um RS ativo que aminoacila o O-tRNA. Uma ami- noacil-tRNA sintetase ortogonal identificada pelo método e também uma característica da invenção.
Métodos de produção de uma proteína em uma célula (por exemplo, em uma célula eubacteriana tal como uma E. coli ou semelhante, ou em uma célula de levedura) tendo o aminoácido não natural na posição selecionada são também uma característica da inven- ção. Por exemplo, um método inclui crescer, em um meio apropriado, uma célula, onde a célula compreende um ácido nucléico que compreendem pelo menos um códon seletor e codifica uma proteína, provendo o aminoácido não natural, e incorporando o aminoácido não natural na posição especificada na proteína durante a tradução do ácido nucléico com pelo menos um códon seletor, assim produzidno a proteína. A célula ainda compreende: um tR- NA ortogonal (O-tRNA) que funciona na célula e reconhece o códon seletor; e, uma aminoa- cil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o ami- noácido não natural. Uma proteína produzida por este método é também uma característica da invenção. De particular interesse são métodos para produzir a forma sulfatada de hirudi- na, que encontra uso como anticoagulante.
A invenção também provê composições que incluem protéinas, onde as proteínas compreendem sulfotirosina. Em certas modalidades, a proteína compreende uma seqüência aminoácida que é pelo menos 75% idêntica aquela de uma protéina conhecida, por exem- plo, hirudina, uma proteína terapêutica, uma protéina diagnostica, uma enzima industrial, ou porções das mesmas. Opcionalmente, a composição compreende um veículo farmaceuti- camente aceitável.
ÁCIDO NUCLÉICO E SEQÜÊNCIAS POLIPEPTÍDICAS E VARIANTES
Como aqui descrito, a invenção provê para seqüências polinucleotídicas codifican- do, por exemplo, O-tRNA e O-RSs1 e seqüências aminoácidas polipeptídicas, por exemplo, O-RSs, e, por exemplo, composições, sistemas e métodos compreendendo o referido poli- nucleotídeo ou seqüências de polipeptídeos. Exemplos de tais seqüências, por exemplo, O- tRNA e aminoácido O-RS e sequencuas nucleotídicas são revelado aqui (ver FIG. 7, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 4-11). Entretanto, um versado na técnica apreciará que a inven- ção não é limitada às seqüências reveladas aqui, por exemplo, nos Exemplos e seqüência de listagem. Um dos versados na técnica aprecia que a invenção também provê muitas se- qüências relacionadas com as funções aqui descritas, por exemplo, polinucleotídeos e poli- peptídeos codificando variantes conservadas do O-RS revelado aqui.
A construção de análise de sintetases ortogonais de espécies (O-RS) que são ca- pazes de aminoacilar um O-tRNA com uma sulfotirosina e descrita no Exemplo 1. Este e- xemplo demonstra que a contração e análise das espécies O-RS que são capazes de incor- porar o aminoácido não natural sulfotirosina.
A invenção provê polipeptídeos (O-RSs) e polinucleotídeos, por exemplo, O-tRNA, polinucleotídeos que codificam O-RSs ou porções dos mesmos, oligonucleotídeos utilizados para isolar clones de aminoacil-tRNA sintetease etc. Polinucleotídeos da invenção incluem aqueles codificam protéinas ou polipeptídeos de interesse da invenção com um ou mais có- don seletor. Em adição, polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo, um polinucleo- tídeo compreendendo uma seqüência nucleotídica como revelado na SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11, e um polinucleotídeo que é complementar a ou que codifica uma seqüência polinucleotí- dica do mesmo. Um polinucleotídeo da invenção também inclui qualquer polinucleotídeo que codifica uma seqüência aminoácida O-RS compreendendo a SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10. Si- milarmente, um ácido nucléico artificial que hibridiza a um polinucleotídeo indicado acima sob condições altamente rigorossas sob substancialmente o comprimento inteiro do ácido nucléico (e é outro que um polinucleotídeo de ocorrência natural) é um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, uma composição inclui um polipeptídeo da invenção e um excipiente (por exemplo, tampão, água, excipiente farmaceuticamente aceitável etc). A in- venção também provê um anticorpo ou anti-soro especificamente imunoreativo com um po- lipeptídeo da invenção. Um polinucleotídeo artificial é um polinucleotídeo que é feito pelo homem e não é de ocorrência natural.
Um polinucleotídeo da invenção também inclui um polinucleotídeo artificial que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico ao tRNA de ocorrência natural, (mas é outro que um tRNA de ocorrência natural). Um polinucleotídeo também inclui um polinucleotídeo artificial que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 98% ou mais idêntico (mas não 100% idêntico) àquele de um tRNA de ocorrência natu- ral.
Em certas modalidades, um vetor (por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus etc) compreende um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Em outra modalidade, o vetor de expressão inclui um promo- tor operavelmente ligado a um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Em outra modali- dade, uma célula compreende um vetor que inclui um polinucleotídeo da invenção.
Um versado na técnica apreciará que muitas variantes das seqüências reveladas são inclusas na invenção. Por exemplo, variações conservadas das seqüências reveladas que produzem uma seqüência funcionalmente idênticas são inclusas na invenção. Variantes das seqüências polinucletídicas de ácido nucléico, em que as variantes hibridizam a pelo menos uma seqüência revelada, são considerados serem inclusas na invenção. Subse- quências únicas das seqüências reveladas aqui, como determinado por, por exemplo, técni- cas de comparação da seqüência padrão, são também inclusas na invenção. Variações Conservadas
Pertencendo a degeneração do código genético, "substituições silenciosas" (isto é, substituições em uma seqüência de ácido nucléico que não resulta em uma alteração em um polipeptídeo codificado) são uma característica implicada de cada seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência aminoácida. Similarmente, "substituições aminioácidas conservadas", onde um ou um número limitado de aminiácidos na seqüência aminoácida são substituídos com diferentes aminoáciso com propriedades altamente similares, são também facilemente identificados como sendo altamente similares a uma construção reve- lada. Tais variações conservadas de cada seqüência revelada são uma característica da presente invenção.
"Variações conservadas" de uma seqüência de ácido nucléico particular referem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam seqüências aminoácidas idênticas ou essencialmen- te idênticas, ou, onde o ácido nucléico não codifica uma seqüência aminoácida, para se- qüências essencialmente idênticas. Um versado na técnica reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminiácidos (tipicamente menos que 5%, mais tipicamene menos que 4%, 2% ou 1%) em uma seqüência codificada são "variações conservativamente modificadas" onde as alterações resultam na deleção de um aminoácido, adição de um ami- noácido, ou substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. En- tão, "variações conservadas" de uma seqüência polipeptídica listada da presente invenção incluem substituições de uma pequena porcentagem, tipicamente menos que 5%, mais ti- picmente menos que 2% ou 1%, de aminoácidos da seqüência de polipeptídeo, com um aminoácido do mesmo grupo de substituição conservado. Finalmente, a adição de seqüên- cias que não alteram a atividade codificada de uma molécula de ácido nucléico, tal como a adição de uma seqüência não-funcional, é uma variação conservada do ácido nucléico bási- co.
Tabelas de substituições conservadas provendo aminoácidos funcionalmente simi- lares são bem conhecidas na técnica, onde um resíduo aminoácido é substituído por outro resíduo aminoácido tendo propriedades químicas similares (por exemplo, cadeias aromáti- cas laterais ou cadeias laterais positivamente carregadas), e dessa forma não mudam subs- tancialmete as propriedades funcionais da molécula polipeptídica. Os seguintes grupos de exemplos revelados que contêm aminoácidos naturais das propriedades químicas, onde substituições dentro do grupo é uma "substituição conservada".
Cadeias Late- rais Não Polares e/ou Alifáticas Cadeiras Late- rais Polares Não Carregadas Cadeias Late- rais Aromáticas Cadeias Late- rais Positiva- mente Carrega- das Cadeias Late- rais Negativa- mente Carrega- das Glicina Alanina Serina Treonina Fenilalanina Tirosina Lisina Arginida Aspartato Glutamato Valina Cisteína Triptofano Histidina Leucina Metionina Isoleucina Asparagina Prolina Glutamina
Hibriduzação de Ácido Nucléico
Hibridização comparativa pode ser utilizada para identificar ácidos nucléicos da in- venção, incluindo variações conservativas de ácidos nucléicos da invenção, e este método de hibridização comparativa é um método preferido de ácidos nucléicos distinguíveis da in- venção. Em adição, ácidos nucléicos alvos que hibridizam ao ácido nucléico representado pelo SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11, sob condições de alta, ultra alta e ultra ultra alta rigidez são uma característica da invenção. Exemplos de tais ácidos nucléicos incluem aquelas com um ou poucas substituições de ácidos nucléicos silenciosos ou conservados como comparados a uma dada seqüência de ácido nucléico. Um teste de ácido nucléico é referido para especificamente hibridizar a um ácido
nucléico quando ela hibridiza pelo menos 50% bem como o padrão como o alvo comple- mentar perfeitamente combinado, isto é, com um sinal de proporção de ruído de pelo menos metade como alta hibridização do padrão para o alvo sob condições em que o padrão perfei- tamente combinados se liga ao alvo complementar perfeitamente combinado com um sinal de proporção de ruído que é pelo menos 5x-10x alto como aquele observado para hibridiza- ção de quaisquer ácidos nucléicos alvos não combinados.
Ácidos nucléicos "hibridizam" quando eles associam-se tipicamente em solução. Á- cidos nucléicos hibridizam devido a uma variedade de forças físico-químicas bem caracteri- zadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão de solvente, empilhamento de base e se- melhantes. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridizatoin with Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, Nova Iorque), bem como em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., Current Protocols, uma junção empreendedora entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Filhos, Inc. (suplementado através de 2006); Hames e Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press nna Oxford University Press, Ox- ford, lnglatessa; e Hames e Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press na Oxford University Press, Oxford, England, provêem detalhes na síntese, marcação, detecção e quantificação de DNA e RNA, incluindo oligonucleotídeos. Um exemplo de condições de hibridização rigorosa para hibridização de ácidos nu-
cléicos complementares que têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou Northern blot é 50% formalina com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridiza- ção sendo realizada por uma noite. Um exemplo de condições de lavagem rigorosa é uma lavagem 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (para a descrição de tampão SSC1 ver, Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001). Sempre a lavagem de alta rigidez é precedida por uma lavagem de baixa rigidez para remover o sinal basal do padrão. Um exemplo de lavagem de baixa rigidez é 2x SSC a 40oC por 15 minutos. Em geral, um sinal de proporção de ruído de 5x (ou mais) que aquele observado para um padrão não relacionado no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridização específica.
"Condições de lavagem de hibridização rigorosas" no contexto dos experimentos de hibridização de ácido nucléico tais como hibridizações southern e northern são dependentes de seqüência, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. UM guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em, por exemplo, Tijssen (1993) Labo- ratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology - Hibridization with Nucleic Acids Probes, Parte I, Capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nuclei acid probe assays", (Elsevier, Nova Iorque); Hames e Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press em Oxford University Press, Oxford, Inglaterra; e Hames e Higgins (1995) Gene Pro- bes 2 IRL Press em Oxford University Press, Oxford, Inglaterra. Hibridização rigorosa e con- dições de lavagem podem facilmente ser determinadas empiricamente por um teste de áci- do nucléico. Por exemplo, na determinação da hibridização rigorosa e condições de Iava- gem, a hibridização e condições de lavagem são gradualmente aumentadas (por exemplo, temperatura aumentada, diminuição da concentração de sal, aumento da concentração de detergente e/ou aumento da concentração de solventes orgânicos tal como formalina na hibridização ou lavagem), até um grupo selecionado de critérios serem encontrados. Por exemplo, na hibridização almente rigorosa e condições de lavagem, a hibridização e condi- ções de lavagem são gradualmente aumentadas até um padrão se ligar a um alvo comple- mentar perfeitamente combinado com um sinal de proporção de ruído que é pelo menos 5x alto como aquele observado para hibridização do padrão para um alvo não combinado.
Condições "muito rigorosas" são selecionadas para serem iguais ao ponto de fusão térmica (Tm) para um padrão particular. O Tm é a temperatura (sob força iônica definida e pH) em que 50% da seqüência teste hibridiza a um padrão perfeitamente combinado. Para os propósitos da presente invenção, geralmente, hibridação "altamente rigorosa" e condi- ções de lavagem são selecionadas serem cerca de 5°C menores que o Tm para a seqüên- cia específica na força iônica definida e pH.
Hibridização "de rigidez ultra alta" e condições de lavagem são aquelas em que a rigidez de hibridização e condições de lavagem são aumentadas até o sinal da proporção de ruído para ligação do padrão para o ácido nucléico alvo complementar perfeitamente combi- nado ser pelo menos 10x tão alto como aquele observado para hibridização para qualquer dos ácidos nucléicos alvos não combinado. Um ácido nucléico que hibridiza a um padrão sob tais condições, com um sinal de proporção de ruído de pelo menos Vá que do ácido nu- cléico alvo complementar perfeitamente combinado é referido para ligar ao padrão sob con- dições de rigidez ultra altas.
Similarmente, mesmo níveis mais altos de rigidez podem ser determinados por au-
mento gradual da hibridização e/ou condições de lavagem do ensaio de hibridização rele- vante. Por exemplo, aqueles em que a rigidez de hobridização e condições de lavagem são aumentadas até o sinal para a proporção de ruído para se ligar ao padrão do ácido nucléico alvo complementar perfeitamente combinado é pelo menos 10x, 20x, 50x, 100x, ou 500x ou mais alto como aquele observado para hibridização para qualquer dos ácidos nucléicos al- vos não combinado. Um ácido nucléico alvo que hibridiza a um padrão sob tais condições, com um sinal para proporção de ruído de pelo menos /4 que do ácido nucléico complemen- tar perfeitamente combinado é referido para ligar ao padrão sob condições de rigidez ultra ultra altas.
Ácidos nucléicos que não hibridizam para cada outro sob condições rigorosa são
ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancial- mente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada utilizando a degeneração máxima do códon permitida pelo código genético.
Subsequências únicas
Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucléico que compreende uma
sebsequência única em um ácido nucléico selecionado a partir as seqüências de O-tRNAs e O-RSs revelados aqui. A subsequência única é única como comparado a um ácido nucléico correspondente a qualquer seqüência de ácido nucléico O-tRNA ou O-RS conhecida. Ali- nhamento pode ser feito utilizando, por exemplo, BLAST ajustado para parâmetros pré- determinados. Qualquer subsequência única é útil, por exemplo, como um padrão para iden- tificar os ácidos nucléicos da invenção ou ácidos nucléicos relacionados.
Similarmente, a invenção inclui um polipeptídeo que compreende uma subsequên- cia única em um polipeptídeo selecionado a partir de seqüências de O-RS reveladas aqui. Aqui, a subsequência única é única como comparada a um polipeptídeo correspodendo a qualquer de seqüência polipeptídica conhecida.
A invenção também provê para ácidos nucléicos alvo que hibridizam sob condições rigorosa para um único código de oligonucleotídeo que codifica uma subsequência única em um polipeptídeo selecionado a partir de seqüências de O-RSs em que a subsequência única é única como comparado a um polipeptídeo correspondente a qualquer dos polipeptídeos controles (por exemplo, seqüências parentais a partir das quais sintetases da invenção fo- ram derivadas, por exemplo, por mutação). Seqüências únicas são determinadas como no- tado acima. Comparação de seqüência, identidade e homologia
Os termos "idêntica" ou "identidade de porcentagem" no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais seqüências ou subsequências que são os mesmos ou têm uma porcentagem especificada de resíduos a- minoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para cor- respondência máxima, como medido utilizando uma das seqüências algoritmas de compa- ração descritas abaixo (ou outros algoritmos disponíveis para pessoas versadas na técnica) ou por inspeção visual.
A frase "substancialmente idêntica", no contexto de dois ácidos nucléicos ou poli- peptídeos (por exemplo, DNAs codificando um O-tRNA ou O-RS, ou seqüências aminoáci- das de um O-RS) refere-se a duas ou mais seqüências que têm pelo menos cerca de 60%, cerca de 80%, cerca de 90-95%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais identidade de nucleo- tídeo ou resíduo aminoácido, quando comparado e alinhado para correspondência máxima, como medido utilizando uma seqüência de comparação algorítma ou por inspeção visual. Tais seqüências "substancialmente idênticas" são tipicamente consideradas serem "homólo- gas", sem referências ao ancestral atual. Preferivelmente, a "identidade substancial" existe sob uma região de seqüências que é pelo menos 50 redíduos de comprimento, mais preferi- velmente sob uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais preferivelmente, as seqüências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos 150 resíduos, ou so longo do comprimento completo de duas seqüências a serem comparadas.
Proteínas e/ou seqüências proteícas são "homólogas" quando eles são derivados, naturalmente ou artificialmente, a partir de uma proteína ancestral ou seqüências proteíca. Similarmente, ácidos nucléicos e/ou seqüências de ácido nucléicos são homólogas quando elas são derivadas, naturalmente ou artificialmente, a partir de um ácido nucléico commum ou seqüências de ácido nucléico. Por exemplo, qualquer ácido nucléico de ocorrência natu- ral pode ser modificado por qualquer método de mutagênese disponível para incluir um ou mais códon seletores. Quando expressos, estes ácidos nucléicos mutageneizados codificam um polipeptídeo compreendo um ou mais aminoácidos não naturais. O processo de muta- ção pode claro, adicionalmente alterar um ou mais códons padrões, assim mudando um ou mais aminiácidos padróes na proteína mutante resultante também. Homologia é geralmente inferida a partir de uma similaridade de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ou proteínas (ou seqüências dos mesmos). A porcentagem precisa de similaridade entre se- qüências que é útil no estabelecimento de homologua varia com o ácido nucléico e proteína na questão, mas como pouco como 25% de similaridade de seqüência é rotineiramente utili- zada para estabelecer homologia. Níveis mais altos de similaridade de seqüência, por e- xemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% ou mais, podem também ser utilizados para estabelecer homologia. Métodos para determinar as porcentagens de simila- ridade de seqüência (por exemplo, BLASTP e BLASTN utilizando parâmetros prévios) são descritos aqui e são geralmente disponíveis.
Para comparação de seqüência e determinação de homologia, tipicamente uma se- qüência atua como uma seqüência de referência ao qual seqüências testes são compara- das. Quando utilizando um algoritmo de comparação de seqüência, teste e seqüências refe- rências são inseridos em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcula a porcentagem de identidade de se- qüência para a(s) sequência(s) teste(s) relativa(s) a seqüência de referência, baseado nos parâmetros do programa designado.
Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exem- plo, pelo algoritmo homólogo local de Smith e Waterman, Adv Apll Math 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento homólogo de Needleman e Wunch, J Mol Biol, 48:443 (1970), pela pesquisa por método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc Natl Acad Sci EUA 85:2444 (1988), por implementaçõe computadorizados desses algoritmos (GAP, VESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programa Wisconsin Genetics, Grupo Genetics Computer, 575 Science Dr. Madison, Wl), ou por inspeção visual (ver geralmente Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., Current Protocols, uma junção empreendendora entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Filhos, Inc., suplementado até 2006). Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de
identidade de seqüência e similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altshcul et al, J Mol Biol, 215:403-410 (1990). Programa para fazer análises BLAST são publicamente disponíveis através do Centro Nacional para Informação Biotecnológica. Este algoritmo envolve primeira identificação de pares de seqüência de alto ganho (HSPs) por identificar palavras curtas de comprimento W na seqüência culsultada, que ou combina ou satisfazem algum valor positivo basal; de ganho T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como uma palavra vizinha de pontuação basal (Altschul et al, J Mol Biol. 215:403-410 (1990)). Essa palavra vizinha inicial chega atuar como semente para pesquisas iniciais para encontrar HSPs mais longas contendo as mesmas. A palavra chega são então estendidas em ambas aa direções ao longo de cada seqüência para até que o número de alinhamento cumulativo pode ser aumentado. Números cumulativos são calculados utilizando seqüências nucleotídicas, os parâmetros M (valor recompesa para um par de resíduos combinando; sempre > 0) e N (contagem de falhas para resíduos combinados de má forma; sempre < 0). Para seqüências aminoácidas, uma matriz obtida é utilizada para calcular o número cumulativo. Extensão da palavra chega a cada direção são paradas quando: o alinhamento do ganho cumulativo cai por quantidade X a partir de seu valor alcançado máximo; o ganho cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de ganho negativo; ou no final de sua seqüência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X deter- minam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeo) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um limiar de 100, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüên- cias aminoácidas, o programa BLASTP usa como padrão uma palavra de comprimento (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de ganho BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci EUA 89:10915).
Em adição para calcular a porcentagem da identidade de seqüência, o algoritmo BLAST também faz uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc Nal'1 Acad Sei, EUA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a soma da probabilidade menor (P(N))1 que provê uma indicação de probabilidade pela qual uma combinação entre duas seqüências nucleotídeas ou aminoácidas pode ocorrer pela chance. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a soma da probabilidade menor em uma comparação do ácido nucléico teste para o ácido nucléico de referência é menor que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor que cerca de 0,001.
Mutagênese e Outras Técnicas de Biologia Molecular Polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção e utilizados na invenção podem ser
manipulados utilizando técnicas de biologia molecular. Textos gerais que descrevem técni- cas de biologia molecular incluem Berger e Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techni- ques", Methods in Enzymology, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambro- ok et al, Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor La- boratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., Current Protocols, um junção empreendendora entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Filhos, Inc., (suplementado até 2006).
Esses textos descrevem mutagênese, o uso dos vetores, promotores e muitos ou- tros tópicos relevantes relacionados a, por exemplo, a geração de genes que incluem có- dons seletores para produção de proteínas que incluem aminoácidos não naturais, tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais, e pares dos mesmos.
Vários tipos de mutagênese são utilizados da invenção, por exemplo, para molécu- las de tRNA mutado, para produzir bibliotecas de tRNAs, para produzir bibliotecas de sinte- tases, para inserir códons seletores que codificam um aminoácido não natural em uma pro- teína ou polipeptídeo de interesse. Eles incluem, mas não são limitados para mutagênese pontual aleatória sítio-direcionada, recombinação homóloga, DNA misturado ou outros mé- todos de mutagênese recursivos, construção quimérica, mutagênese utilizando uracila con- tendo padrãp, mutagêneses direcionada a oligonucleotídeo, mutagênese de DNA modifica- da por fosforotioato, mutagênese utlizando DNA duplo aberto ou semelhante, ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos adequados adicionais incluem reparo mal combinado pontual, mutagênese utilizando fitas hospedeiras deficientes em reparo, seleção de restrição e purificação de restrição, deleção de mutagênese, mutagênese por síntese gênica total, reparo de quebra de fita dupla, e semelhantes. Mutagênese, por exemplo, envolvendo cons- truções quiméricas, é também inclusos na presente invenção. Em uma modalidade, muta- gênese pode ser guiada por informação conhecida da molécula de ocorrência natural ou alterada ou molécula de ocorrência natural mutada, por exemplo, comparação de seqüência, propriedades físicas, estrutura cristal ou semelhantes.
Células hospedeiras são geneticamente construídas (por exemplo, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou construções que incluem um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um vetor da invenção, que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões codificantes para o tRNA ortogonal, a tRNA sintetase ortogonal, e a proteína para ser deri- vada são operacionalmente ligadas aos elementos de controle de expressão gênica que são funcionais na célula hospedeira desejada. Vetores típicos contêm terminadores de transcri- ção e tradução, seqüências de iniciação de transcrição e tradução, e promotores úteis para regulação da expressão de ácido nucléicos alvo particular. Os vetores opcionalmente com- preedem cassetes de expressão genéricos contendo pelo menos uma seqüência terminado- ra independente, seqüência permitindo replicação de cassete em eucariotos, ou procariotos, ou ambos (por exemplo, vetores pequenos) e seleção de marcadores para ambos os siste- mas procarióticos e eucarióticos. Vetores são adequados para replicação e/ou integraçãoem procariotos, eucariotos, ou preferencialmente ambos. Ver Giliman e Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Shneider et al, Protein Expr, Purif. 6435:10 (1995); Berger e Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Current Proto- cols, uma junção empreendedora entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Filhos, Inc., (suplementado até 2006). O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo descoberto, ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores são introduzidos em células e/ou microorganismos por métodos pa- drões incluindo eletroporação (From et al, Proc Natl Acad Sci EUA 82, 5824 (1985), infecção por vetores virais, alta velocidade balística penetração por partículas pequenas com o ácido nucléico ou dentro da matriz de esferas ou partículas pequenas, ou na superfície (Klein et al, Nature 327, 70-73 (1987)), e/ou semelhantes. Um sistema de plasmídeo único altamente eficiente e versátil foi desenvolvido para incorporção sítio específica de aminoácidos não naturais em proteínas em resposta a um códon de parada âmbar (UAG) em E. coli. Em um novo sistema, o par de tRNAtyr (CUA) supressor de M. Jannaschii e tRNA-tirosil sintentase são codificados em um plasmídeo úni- co, que é compatível com vetores de expressão de E. coli. Óperons de tRNA monocistrôni- cos sob controle de promotor proK e terminador foi construído para uma estrutura secundá- ria ótima e tRNA processador. Introdução de uma forma mutada de promotor glnS para a sintetase resultou em um aumento significante em ambas, eficiência de supressão e fideli- dade. Aumentos na eficiência de supressão foram também obtidos por cópias múltiplas do gene de tRNA bem como por uma mutação específica (D286R) na sintetase (Kobayashi et al, "Strutural basis for orthogonal tRNA specifities of tyrosil-tRNA synthetases for genetic code expansion," Nat Struct Biol 10(6): 425-432 [2003]). A generalidade do sistema otimiza- da foi também demonstrado por incorporação altamente eficiente e acurada de vários ami- noácidos não naturais diferentes, cujas utilizadas únicas no estudo da função protéica e es- trutura foram previamente providos.
Um catálogo de Bactéria e Bacteriófagos úteis para clonagem é provido, por exem- plo, pelo ATCC, por exemplo, The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1996) Gherna et al (eds) publicado por ATCC. Procedimentos básicos adicionais para sequência- mente, clonagem ou outros aspectos de biologia molecular e destacando considerações teóricas são também encontradas em, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a ed), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., Current Pro- tocols, uma junção empreendedora entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Filhos, Inc., (suplementado through 2006), e em Watson et al (1992) Recombinant DNA, Segunda Ed., Scientific American Books, NI. Em adição, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico maracado, se padrão ou não padrão) pode ser costume ou padrão ordenado a partir de qualquer de uma variedade de fontes comerci- ais, tais como Midland Certified Reagent Company, The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL). Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.
As células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meio de nutriente convencional modificado como aproprieado para tais atividades como, por exemplo, passos de seleção, ativando pomotores ou transformantes de seleção. Essas células podem opcio- nalmente serem cultivadas em organismos transgênicos. Outras referências úteis, por e- xemplo, para isolamento de célula e cultura (por exemplo, para subsequente isolamento de ácido nucléico) incluiu Freshney (1994) Culture of Animais Cells, a Manual of Basic Techni- que, terceira edição, Wiley-Liss, Nova Iorque e as referências citadas aqui; Payne et al (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Filhos, Inc. Nova Iorque, NI; Gamborg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Funda- mental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova Iorque) e Atlas e Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
PROTEÍNAS E POLIPEPTÍDEOS OF INTERESSE
Métodos de produzir uma protein emu uma célula com um aminoácido não natural na posição especificada são também uma característica da invenção. Por exemplo, um mé- todo inclui crescimento, em um meio apropriado, a célula, onde a célula compreende um ácido nucléico que compreende pelom enos um códon seletor e codifica uma proteína; e, provendo o aminoácido não natural; onde a célula ainda compreende: um tRNa-ortogonal (O-tRNA) que funciona na célula e reconhece o códon seletor; e, uma aminoacil-tRNA orto- gonal sintentase (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminiácido não natural. Uma proteína produzida por este método é também uma característica da invenção. Em certas modalidades, o O-RS compreende uma inclinação para a aminoacilação
do O-tRNA congnato sob qualquer tRNA endógeno em um sistema de expressão. A propor- ção relativa entre O-tRNA e tRNA endógeno que é carregado por O-RS, quando o O-tRNA e O-RS são presentes em concentrações molares iguais, é maior que 1:1, preferivelmente pelo menos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, aind amais preferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, ainda mais preferivelmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1000:1, 5000:1 ou maior.
A invenção também provê composições que incluem protéinas, onde as proteínas compreendem um aminoácido não natural. Em certas modalidades, a proteína compreende uma seqüência aminoácida que é pelo menos 75% idêntica àquela de uma proteína tera- pêutica, uma proteína diagnostica, uma enzima industrial, ou porção da mesma.
As composições da invenção e composições feitas pelos métodos da invenção op- cionalmente estão em uma célula. Os pares O-trRNA/O-RS ou componentes individuais da invenção podem então serem utilizados em uma maquinaira de tradução do sistema hospe- deiro, que resulta em um aminoácido não natural sendo incorporando em uma proteína. Números de Pedidos Internacionais WO 2004/094593, depositado em 16 de Abril de 2004, denominado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE," e Wo 2002/085923, de- nominado ΊΝ VIVO INCORPORATION OF UNNNATURAL AMINO ACIDS", descreve este processo, e são aqui incorporados por referência. Por exemplo, quando um par O-tRNA/O- RS é introduzido em um hospedeiro, por exemplo, uma célula Escherichia coli, o par leva a incorporação in vivo de um aminoácido não natural tal como sulfotirosina em uma proteína em resposta a um códon seletor. O aminoácido não natural que é adicionado ao sistema pode ser um aminoácido sintético, tal como um derivado de uma fenilalanina ou tirosina, que pode ser exogenamente adicionada ao meio de crescimento. Opcionalmente, as composi- ções da presente invenção podem estar em um sistema de tradução in vitro, ou em um (s) sistema(s) in vivo.
Uma célula da invenção provê a habilidade de sintentizar proteínas que compreen- dem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Em alguns aspectos, a com- posição opcionalmente inclui, por exemplo, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas ou mais de proteína que compreende um aminoácida não natural, ou uma quantidade que pode ser alcançada com métodos de produção de pro- teína in vivo (detalhes na produção de proteína recombinante e purificação são providas aqui). Em outro aspecto, a proteína é opcionalmente presente na composição em uma con- centração de, por exemplo, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramsa de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelom enos 100 microgramsa de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo mennos 250 microgramas de protéina por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro, ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, por exemplo, um Iisado de celular, um tampão, um tampão farmacêutico, ou outra suspensão líquida (por exemplo, em um volume de, por exemplo, qualquer de cerca de 1 nL a cerca de 100 L). A produção de grandes quantidades (por e- xemplo, maior que aquela tipicamente possível com outros métodos, por exemplo, tradução in vitro) de uma proteína em uma célula incluindo pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção.
A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feita para, por exemplo, mudanças adaptadas na estrutura protéica e/ou função, por exemplo, para mudar o tama- nho, acidez, nucleofilicidade, ligação de hidrogênio, hidrofobocidade, acessabilidade de sí- tios alvos de protease, alvos para uma fração (por exemplo, para um arranjo de proteína), incorporação de grupos de marcação ou reativos etc. Protéinas que incluem um aminoácido não natural podem ter propriedades catalíticas ou físicas aumentadas ou mesmo inteiramen- te novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas por inclu- são de um aminoácido não natural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, proprieda- des estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, habilidade catalítica, meia vida (por exemplo, meia vida sérica), habilidade de reagir com outras moléculas, por exemplo, covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes. As composições incluindo protéinas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, por exemplo, novas terapias, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industri- ais, proteínas Iigantes (por exemplo, anticorpos), e por exemplo, o estudo de estrutura e função proteíca. Ver, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.
Em alguns aspectos da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um, por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinvo, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelomenos nove, ou pelo menos dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, por exemplo, podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais aminoá- cidos não naturais diferentes. Em outro aspecto, uma composição inclui uma proteína com pelo menos um, mas menos que todos, de um aminoácido particular presente na proteína é um aminoácidos não natural. Para uma dada proteína com mais que um aminiácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser idênticas ou diferentes (por exemplo, a pro- teína pode incluir dois ou mais tipos diferentes de aminoácidos não naturais, ou podem in- cluir dois dos mesmos aminoácidos não naturais). Para uma dada proteína com mais que dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos, diferen- tes ou uma combinação de um aminoácido não natural múltiplo do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido não natural diferente.
Essencialmente qualquer proteína (ou porção do mesmo) que inclui um aminoácido não natural (e qualquer ácido nucléico correspondente codificando, por exemplo, que inclui um ou mais códons seletores) pode ser produzida utilizando as composições e métodos aqui. Nenhum esforço é feito para identificar as centenas de milhares de protéinas conheci- das, qualquer das quais pode ser modificada para incluir um ou mais aminoácidos não natu- rais, por exemplo, por adaptar quaisquer métodos de mutação disponível para incluir um ou mais códons seletores em um sistema de tradução relevante. Seqüências repositórías co- muns para proteínas conhecidas incluem GenBank EMBL, DDBJ e o NCBI. Outras reposi- ções podem facilmente ser identificadas por pesquisa na internet.
Tipicamente, as proteínas são, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% ou mais idênticas a qualquer protéina disponível (por exemplo, uma proteína terapêutica, uma protéina diagnostica, uma enzima industrial, ou porção da mesma), e eles compreen- dem um ou mais aminoácidos. Exemplos de terapêustica, diagnóstico, e outras proteínas que podem ser modificadas para compreender um ou mais aminoácidos não naturais podem ser encontrados, mas não limitados, aqueles no Pedido Internacional WO 2004/094593, de- positado em 16 de Abril de 2004, denominado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS". Exemplos de terapêutica, diagnostica e outras proteínas que podem ser modificadas para compreender um ou mais aminoácidos não naturais incluem, mas não são limitados a, por exemplo, hirudina, alfa-1 antitripsina, angioestatina, apoproteí- na, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeos atriais, quimiocinas C-X- C (por exemplo, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-b, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), Calcitonina, quimiocinas CC (por exemplo, proteína quimioatraente de monócito-1, proteína quimioatraente de monócito-2, proteína quimioatraente de proteína-3, proteína inflamatória de monócito-1 alfa, protéina inflamatória de monócito-1 beta, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, T64262), Iigante CD40, Iigante C-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator do complemento 5a, inibidor do complemento, receptor do complemento 1, citocinas, (por exemplo, peptídeo ativador de neutrófilo epitelial-78, GROa-MGSA, GROjff, GROy, ΜΙΡ-1σ, MIP-1<í, MCP-1), Fator de Crescimento Epidermal (EGF), Eritropoietina ("EPO"), Toxinas esfoliantes AeB, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, Fator de Cresci- mento de Fibroblasto (FGF), Fibrinogênio, Fibronectina, G-CSF, GM-CSF, Glicocerebrosida- se, Gonadotropina, fatores de crescimento, proteínas Hedgehog (por exemplo, sônica, indi- ana, Desert), hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (HGF), hirudina, albumina sérica humana, insulina, fator de crescimento do tipo insulina (IGF), interferons (por exem- pio, IFN-σ, IFN-0, IFN-γ), interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 etc), fator de crescimento de queratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibitório de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibitório de neutrófilo (NIF), oncosta- tina M, proteína osteogênica, hormônio paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônios peptídeos (por exemplo, hormônio de crescimento humano), pleiotropina, proteína A, proteína G, exo- toxinas pirogênicas A, B, e C, relaxina, renina, SCF, receptor de complemento solúvel I, I- CAM solúvel 1, receptores de interleucina solúvel (11-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15), receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquina- se, superantígeno, isto é, enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), superóxido dismutase (SOD), toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1), timosina alfa 1, ativador de plasminogênio tissular, fator de necrose tumoral beta (TNF beta), receptor de fator de necrose tumoral (TNFR), fator de necrose tumoral alfa (TNF alfa), fator de crescimento endotelial vascular (VEGEF), uroquinase e muitos outros.
Uma classe de proteínas que podem ser feitas utilizando as composições e méto- dos para incorporação in vivo de aminoácidos não naturais descritas aqui inclui moduladores transcricionais ou uma porção dos mesmos. Moduladores transcricionais exemplares inclu- em genes e proteínas moduladores transcricionais que modulam crescimento celular, dife- renciação, regulação ou os semelhantes. Moduladores transcricionais são encontrados em procariotos, vírus, e eucariotos, incluindo fungos, plantas, leveduras, insetos, e animais, in- cluindo mamíferos, provendo uma grande variedade de alvos terapêuticos. Será apreciado que a expressão e transcrição regulada por ativadores transcricionais por muitos mecanis- mos, por exemplo, por ligação para receptores, estimulando uma cascata de tradução de sinal, regulando expressão de fatores de tradução, ligação de promotores e aumentadores, ligando a proteínas que ligam a promotores e aumentadores, abrindo DNA1 "splicing" pré- mRNA, e RNA poliadenilante, e RNA degradante.
Uma classe de protéinas da invenção (por exemplo, proteínas com um ou mais a - minoácidos não naturais) incluem proteínas biologicamente ativas tais como hirudina, citoci- nas, moléculas inflamatórias, fatores de crescimento, seus receptores, e produtos oncoge- nes, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-8 etc), interferons, FGF, IGF-I, IGF-II1 FGF, PDGF, TNF, TGF-σ, TGF-£, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, e hialurina/CD44; moléculas de tradução de sinal e produtos oncegenes cor- respondentes, por exemplo, Mos, Ras, Raf, e Met; e ativadores transcricionais e supresso- res, por exemplo, p53, Tat1 Fos, Myc1 Jun, Myb, Rei, e receptores de hormônio esteróide tais como estrogênio, progesterona, testoterona, aldosterona, o Iigante do receptor de LDL e corticosterona.
Enzimas (por exemplo, enzimas industriais) ou porções das mesmas com pelo me- nos um aminoácido não natural são providas pela invenção. Exemplos de enzimas incluem, mas não são limitados a, por exemplo, amidases, racemases aminoácidas, acilases, dealo- genases, dioxigenases, peroxidases diarilpropano, epimerases, epóxido hidrolases, estera- ses, isomerases, quinases, glicose isomerases, glicosidases, glicosil transferases, halopero- xidases, monooxigenases (por exemplo, p450s), lipases, Iignina peroxidases, nitrila hidrata- ses, nitrilases, proteases, fosfatases, subtilisinas, transaminase, e nucleoases.
Muitas dessa protéinas são comercialmente dosponíveis (ver, por exemplo, o catá- logo Sigma BioSciences 2002 e lista de preço), e as seqüências de proteína corresponden- tes e genes e, tipicamente, muitas variantes das mesmas, são bem conhecidas (ver, por exemplo, Genbank). Quaisquer das mesmas podem ser modificadas pela inserção de um ou mais aminoácidos não naturais de acordo com a invenção, por exemplo, para alterar a pro- teína com respeito a uma ou mais terapêuticas, diagnosticas ou propriedades enzimáticas de interesse. Exemplos de propriedades relevantes terapeuticamente incluem meia vida sérica, meia vida de estoque, estabilidade, imunogeneicidade, atividade terapêutica, detec- tabilidade (por exemplo, pela inclusão de grupos receptores (por exemplo, marcadores ou sítios de ligação de marcadores) nos aminoácidos não naturais), redução de DL50 ou outros efeitos colaterais, habilidade para entrar no corpo através do trato gástrico (por exemplo, disponibilidade oral), ou semelhantes. Exemplos de propriedades diagnosticas incluem meia vida de prateleira, estabilidade, atividade diagnósticos, detectabilidade, ou semelhantes. Exemplos de propriedades enzimáticas relevantes incluem meia vida de prateleira, estabili- dade, atividade enzimática, capacidade de produção, ou semelhantes.
Uma variedade de outras proteínas pode também ser modificada para incluir um ou mais aminoácido não natural utilizando composições e métodos da invenção. Por exemplo, a invenção pode incluir substituição de um ou mais aminoácidos naturais em uma ou mais vacinas de proteínas com um aminoácido não natural, por exemplo, em proteínas a partir de fungos infecciosos, por exemplo, Aspergillus, espécies de Candida; bactéria, particularmente E. coli, que serve de modelo para bactéria patogênica, bem como bactéria medicalmente importante tais como Staphylococci (por exemplo, aureus), ou Streptococci (por exemplo, pneumoniae); protozoários tais como esporozoários (por exemplo, Plasmodia), rizópodes (por exemplo, Entamoeba) e flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia etc); vírus tais como (+) RNA vírus (exemplos incluem Poxvírus, por exemplo, vaccina; Pi- cornavírus, por exemplo, pólio; Togvírus, por exemplo, rubella; Flavivírus, por exemplo, HCV; e Coronavírus), (-) RNA vírus (por exemplo, Rhabdovírus, por exemplo, VS; Parami- xovimses, por exemplo, RSV; Ortomixovimses, por exemplo, influenza; Buniavírus; e Arena- vírus)m dsDNA vírus (Reovírus, por exemplo), RNA a DNA vírus, isto é, Retrovírus, por e- xemplo, HIV e HTLV, e certos DNA e RNA vírus tal como Hepatite B.
Proteínas agriculturamente relacionadas tais como proteínas de resistência de inse- to (por exemplo, as proteínas Cry), enzimas de produção de amido e lipídeos, toxinas de planta e insetos, proteínas resistentes a toxina, proteínas de detoxificação de micotoxina, enzimas de crescimento de planta (por exemplo, Ribulose 1,5-Bisfosfato Carboxila- se/Oxigenase, "RUBISCO"), Iipoxigenase (LOX) e Fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase são também alvos adequados para modificação de aminoácido não natural.
Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou porção dos mesmos) em métodos e/ou composições da invenção e codificado por um ácido nucléico. Tipicamente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos dois códons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.
Genes codificando para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser muta- geneizados utilizando métodos bem conhecidos por um versado na técnica e descritos aqui sob "Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques", para inclui, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucléico para uma proteína de interesse é mutageneizada para incluir um ou mais códons seletores, provendo para a inserção de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui qualquer tal variante, por exemplo, mutante, versões de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural. Similarmente, a invenção também inclui ácidos nucléicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucléico com um ou mais códon seletores que codificam um ou mais aminoácidos não naturais.
Para fazer uma proteína que inclua um aminoácido não natural, um pode usar célu- las hospedeiras e organismos que são adaptados para a incorporação in vivo de aminoácido não natural através de pares de tRNA/RS ortogonais. Células hospedeiras são genetica- mente construídas (por exemplo, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com um ou mais vetores que expressam o tRNA ortogonal, a tRNA sintetase ortogonal, e um vetor que codifica a proteína para ser derivatizada. Cada um desses componentes pode ser no mes- mo vetor, ou cada um pode em vetor separado, ou dois componentes podem estar no mes- mo vetor e o terceiro componente em um segundo vetor. O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo descoberto, ou um poli- nucleotídeo conjugado.
Definindo Polipeptídeos por Imunoreatividade Porque os polipeptídeos da invenção provêem uma variedade de novas seqüências
polipeptídicas (por exemplo, polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais no caso de proteínas sintetizadas nos sistemas de tradução aqui, ou, por exemplo, no caso de novas sintetases, novas seqüências de aminoácidos padrões), os polipeptídeos também provêem novas características estruturais que podem ser reconhecidas, por exemplo, em ensaios imunológicos. A geração de anti-soro, que especificamente se ligam a polipeptídeos da invenção, bem como os polipeptídeos que são ligados por tal anti-soro, são uma caracte- rística da invenção. O termo "anti-soro", como aqui utilizado, inclui, mas não é limitado a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imu- noglobulinas, ou fragmentos dos mesmos que especificamente se ligam e reconhecem um analito (antígeno). Exemplos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos e de cadeia única, e semelhante. Fragmentos de imunoglobulinas, incluindo fragmentos Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão, incluindo revelação de fago, são também incluídos no termo "anticorpo" como aqui utilizado. Ver, por exemplo, Paul, Funda- mental Immunology, 4a Ed, 1999, Raben Press, Nova Iorque, para estrutura e terminologia do anticorpo.
A fim de produzir anti-soro para uso em um imunoensaio, um ou mais polipeptídeos imunogênicos são produzidos e purificados como aqui descrito. Por exemplo, protéina re- combinante pode ser produzida em uma célula recombinante. Uma cepa inata de camun- dongo (utilizada neste ensaio porque resultados são mais reprodutíveis devido a identeidade genética do camundongo) é imunizado com proteína(s) imunogênica(s) em conbinação com um adjuvante padrão, tal como adjuvante de Freund, e um protocolo de imunização de ca- mundongo padrão (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manu- al, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque, para uma descrição padrão da geração de anticorpo, formatos e condições de imunoensaio que pode ser utilizadas para determinar a imunoreatividade específica. Detalhes adicionais em proteínas, anticorpos, anti-soro etc, podem ser encontrados nos Pedidos Internacionais Números WO 2004/094593, denomina- do "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE", WO 2002/085923, denominado, ΊΝ VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS", WO 2004/035605, denomi- nado "GLYCOPROTEIN SYNTHESIS;" e WO 2004/058946, denominado "PROTEIN ARRA YS".
USO DE O-tRNA AND O-RS AND PARES O-tRNA/O-RS
As composições da invenção e composições feitas pelos métodos da invençõa op- cionalmente estão em uma célula. Os pares O-tRNA/O-RS ou componentes individuais da invenção podem então serem utilizadas em uma maquinaria de traduçõa do sistema hospe- deiro, que resulta em um aminoácido não natural sendo incorporado em uma proteína. Pe- dido Internacional Número WO 2002/085923 por Schultz et al, denominado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS", descreve este processo e é incorpo- rado aqui por referência. Por exemplo, quando um par O-tRNA/O-RS é introduzido em um hospedeiro, por exemplo, Escheriche coli ou levedura, o par leva a incorporação in vivo de um aminoácido não natural, que pode ser exogenamente adicionado ao meio de crescimen- to, em uma proteína, por exemplo, uma proteína teste mioglobina ou uma proteína terapêu- tica, em resposta a um códon seletor, por exemplo, um códon não senso âmbar. Opcional- mente, as composições da invenção podem ser um sistema de tradução in vitro, ou em um(s) sistema (s) celular(s) in vivo. Proteínas com aminoácidos não naturais podem ser utili- zadas em qualquer das amplas variações dos pedidos. Por exemplo, a fração não natural incorporada em uma proteína pode servir como um alvo para qualquer de uma grande vari- edade de modificações, por exemplo, ligações cruzadas com outras proteínas, com peque- nas moléculas tais como marcadores e corantes e/ou biomoléculas. Com essas modifica- ções, incorporação do aminoácido não natural pode resultar em proteínas terapêuticas e podem ser utilizadas para alterar ou aumentar a função catílita de enzimas. Em alguns as- pectos, a incorporação e modificação subsequente de um aminoácido não natural em uma proteína pode facilitar estudos em estrutura de proteína, interações com outras proteínas, e semelhantes.
KITS
Kits são também uma caracterísitca da invenção. Por exemplo, um kit para produzir uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido não natural em uma célula é provido, onde o kit inclui pelo menos um recipiente contendo uma seqüência polinucleotídica codificando um O-tRNA, e/ou um O-tRNA, e/ou uma seqüência polinucleotídica codificando um O-RS, e/ou um O-RS. Em uma modalidade, o kit ainda inclui o aminoácido sulfotirosina. Em outras modalidades, o kit ainda compreende materiais instrucionais para produzir a pro- teína e/ou célula hospedeira.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não são Iimitantes para a invençõa reivindicada. UM versado na técnica reconhecerá uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados sem sair do objetivo da invenção reivindicada. É en- tendido que os exemplos e modalidades descritos aqui para propósitos ilustrativos some- mente e que várias modificações ou mudanças na luz dos mesmos será sugerido para pes- soas versadas na técnica e são para serem incluídos no espírito e objetivo deste pedido e objeito das reivindicações em apêndices.
EXEMPLO 1
Seleção Genética de Sintetases Mutantes Específicas para Sulfotirosina
Metodologias que permitem a adição sistemática de aminoácidos não naturais para códigos genéticos de E. coli (Wang et al, "Expanding the genetic code of Escherichia coli", Science 292:498-500 (2001)), levedura (Chin et al, "An expanded eucaryotic genetic code", Science 301:964-967 (2003)) e células mamíferas (Zhang et al, "Selective incorporation of 5- hydrozytryptophan into proteins in mammalian cells (Zhang et al, "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells", Proc Natl Acad Sci EUA 101:8882- 8887 (2004)) têm sido previamente relatado. Tais métodos são baseados na evolução de um par tRNA/aaRS supressos não senso que tem a propriedade de ortogonalmente, defini- do como a habilidade de seletivamente incorporar um dado aminoácido em resposta a um códon único sem reação cruzada com tRNAs hospedeiros endógenos, aminoacil-tRNA sin- tetases, ou aminiácidos.
Para gerar um par tRNA ortogonal/aaRS que unicamente insere sulfotirosina (FIG. 1), uma biblioteca de mutantes sítio ativos da tirosil-tRNA sintetase de Methanococcus jan- naschíi (MjTyrRS), que especificamente carrega um (MjRNATyrCUA) supressor nã senso de M. Jannaschii não reconhecido por E. coli sintetase (Wang et al, "Expanding the genetic co- de of Escherichia coli" Science 292:498-500 (2001)) foi utilizado. Esta biblioteca, aquela de- senhada e geração são descritas em outro lugar (Bose et al, "The incorporation of a photoi- somerizable amino acid into proteins in E. coli", J Am Chem Soc 128:388-389 (2006)) foi sujeito a uma série de seleções positiva e negativa (3 positivas e 2 negativas). Sobrevivên- cias na seleção positiva é contida na supressão de uma mutação âmbar no gene cloranfeni- col acetiltransferase (CAT) em presença de 2 mM de sulfotirosina; sobrevivência na seleção negativa é contida sob supressão inadequada nas três mutações âmbar em um gene codifi- cando a proteína barnase tóxica em ausência de sulfotirosina (Wang et al, "Expanding the genetic code of Escherichia coli,"Science 292:498-500 (2001)). Clones sobrevivem através de ambos os ciclos positivo e negativo de seleção somente se eles unicamente incorporam sulfotirosina em resposta ao códon âmbar.
Seguindo essas seleções, clones numerosos foram identificados que permitiram cé- lulas contendo o gene CAT com uma mutação âmbar no sítio permissivo 112 para sobrevi- ver em 130 Mg/mL de cloranfenicol em presença de 2 mM de sulfotirosina. Em ausência de sulfotirosina, as mesmas células não crescem em 20 pg/mL de cloranfenicol, consistente com incorporação sulfotirosina eficiente com pouco para nenhum basal a partir da incorpo- ração de aminoácidos endógenos. Sequênciamento dos candidatos mutantes de clone sin- tetase (denominados sTyrRS) revelaram quatro diferentes clones sintetase, cada um dos quais preencheram o critério para um sistema de tradução ortogonal. Clone 1 foi predom- nante (Tyr32Leu, Leu65Pro, Asp158Gly, lle159Cys, Leu162Lys). O nucleotídeo e seqüên- cias aminoácidas de cada um desses clones e as espécies selvagens são providos na FIG. 7.
Aminoácido tirosil-tRNA sintetase Mj (e códon correspondente) 32 65 155 158 159 162 SEQ ID NO: Selvagem Tyr Leu Gln Asp Ile Leu 2 (TAC) (TTG) (CAG) (GAT) (GAT) (TTA) (3) Clone 1 Leu Pro Gln Gly Cys Lys 4 (CTG) (CCT) (CAG) (GGT) (TGT) (AAG) (5) Clone 2 Leu Pro Gln Gly Thr Lys 4 (CTG) (CCG) (CAG) (GGT) (ACT) (AAG) (5) Clone 3 Leu Pro Glu Gly Cys Lys 6 (CTG) (CCT) (GAG) (GGT) (TGT) (AAG) (7) Clone 4 Leu Pro Gln Gly Ile Lys 10 (CTG) (CCG) (CAG) (GGT) (ATT) (AAG) (11)
É possível determinar possíveis papéis para essas mutações, particularmente Lys162, que provavelmente formam uma interação de ponte salina com a sulfotirosina SO3". Leu32 e Gly158 podem acomodar o grupo SO3" maior e remover a afinidade para tirosina endógena (Tyr32 e Asp 158 são envolvidas em ligação de hidrogênio para o grupo fenólico tirosina na enzima selvagem). Substituição de Asp158 aniônico por Gly possivelmente obvi- ar interações eletroestáticas não favoráveis com sulfotirosina. Entretanto, um entendimento dos mecanismos ou papéis de várias posições substituídas não é requerido para fazer ou uso da invenção.
METODOLOGIA DETALHADA PARA SELEÇÃO DE SULFOTIROSINA AMINOACIL tRNA SINTETASE
Para selecionar para STyrRS1 uma biblioteca sítio ativo MjTyrRS colocada no vetor pBK (pBK-lib) foi utilizado (Bose et al, "The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli," J Am Chem Soc 128:388-389 (2006)). Células DH10B contendo pRep, um plasmídeo de seleção positiva contendo uma construção MjtRNATyrCuA. um gene cloranfenicol acetiltransferase com um códon âmbar introduzido na posição 112 (um sítio permissivo), e um marcado de resistência a tetraciclina, foram transformados com pBK-lib e plaqueados em placas de ágar GMML sumplementado com 2 mM de sulfotirosina (Senn Chemicals) e 68 pg/mL de cloranfenicol. Após 72 horas a 37oC, as placas foram raspadas e os vetores pBK-lib foram extraídos.
Esta coleção de plasmídeos de biblioteca foi então utilizada para transformar célu- las DH10B contendo pNeg, um plasmídeo de seleção negativa contendo uma construção MjtRNATyrCuA> um gene barnase tóxico com três códons âmbar introduzidos, e um marcador de resistência a cloranfenicol. As células foram plaqueadas em placas de ágar LB contendo nenhuma sulfotirosina e vrescendo a 37oC por 12 horas após as quais os vetores pBK-lib foram extraídos a partir de células sobreviventes. O ciclo de seleção positiva e negativa foi repetido uma vez, e os vetores pBK-lib foram subseqüentemente transformados em células DH10B contendo pRep e a réplica da placa nas placas de ágar GMML com e sem sulfotiro- sina. Essas células que cresceram em placas contendo 130 pg/mL de cloranfenicol em pre- sença de sulfotirosina mas não cresceram em placas contendo 20 μg/mL de cloranfenicol em ausência de sulfotirosina foram consideradas com êxito forte.
Estes acertos foram retirados e ortogonalidade dessas sintetases correspondentes foi confirmada por expressão do domínio Z da proteína contendo um códon âmbar na posi- ção 7 em presença e ausência da sulfotirosina. MALDI-TOF foi utilizado para confirmar que sulfotirosina foi mesmo incorporada no domínio Z de comprimento inteiro.
EXEMPLO 2
Expressão e Caracterização de um Modelo Mutante de Proteína Contendo Sulfoti- rosina
Para verificar a incorporação única de sulfotirosina pela sintetase StyrES seleciona- da, um mutante âmbar (resíduo 7) de um C-terminal His6 tag da proteína de domínio Z foi expressa em E. coli contendo plasmídeos para o domínio Z âmbar mutante, MjtRNATyr, e STyrRS (clone 1). Análises de eletroforese de gel de poliacrilamina (PAGE) após purificação com Ni-NTA mostrou uma forte banda para o domínio Z somente quando a protéina foi ex- pressa em meio contendo 2 mM de sulfotirosina - nenhuma banda foi observada em ausên- cia de sulfotirosina, confirmando a dependência de supressão âmbar ou sulfotirosina (FIG. 4A).
Para caracterização adicional, análises de MALDi-TOF foram feitas no domínio Z mutante purificado. Deve ser notado que análises MALDI-TOF e ESI de proteínas tirosina- sulfatadas resultam em perda parcial de sulfato, a extensão da qual depende da severidade das condições (22, 23). Dessa forma, condições de modo íon positivo moderado com uma matriz de pH moderado (2,4,6-triídróxi-acetofenona) foram utilizados, sob as quais um pico predominante [M+H] de 7876 Da (Mteórico=7877.5 Da) correspondendo ao domínio Z conten- do uma sulfotirosina única e faltando metionina apareceu. Nós também observados um pe- queno pico (<10%) [M+H] de 7798 Da (Mteórico=7797.5 Da) que é o resultado de perda de sulfato durante o MALDI-TOF, deixando a tirosina (FIG. 4B). Embora esses dados de espec- troscopia de massa sozinhos não exluir o basal de incorporação de tirosina por STyrRS1 nós podemos fazer na base da análise do gel PAGE. STyrRS então unicamente incorpora sulfo- tirosina, premitindo a expressão recombinante de proteínas sulfatadas em bactéria.
EXEMPLO 3
Expressão de uma Proteína Modelo Sulfatada (Hirudina) Derivada de um Organis- mo Maior
Se este sistema ortogonal para a produção de protéinas sulfatadas pode ser utiliza- do para gerar uma proteína nativa seletivamente sulfatada normalmente biosintetizada so- mente em organismos maiores foi examinada. Para isto, nós escolhemos a proteína hirudi- na, que é sulfatada na posição tirosina 63. Hirudina, secretada por sanguessuga medicinal Hirudo medicinalis, é o inibidor natural mais potente de trombina, e sua forma recombinante é clinicamente administrada como um anticoagulante. Entretanto, expressão recombinante de hirudina em E. coli e levedura utilizada para produção comercial de campos de fármacos produz a forma não sulfatada (desulfo-hirudina) devido a ausência de sulfotransferases re- quisitadas nesses organismos (Markwardt, "Hirudina as alternative anticoagulant - a histori- cal review," Semin Thromb Hemost 28, 405-414 (2002)). Embora desulfo-hirudina seja ainda um inibidor de trombina efetivo, sua afinidade para trombina humana é pelo menos uma or- dem de magnitude menor que aquela de sulfo-hirudina, que tem um Ki de cerca de 20 fM (Braun et al, "Use of site-directed mutagenesis to investigate the basis for the specificity of hirudina," Biochemistry 27, 6517-6522 (1988)).
Para expressar sulfo-hirudina, o gene STyrRS (clone 1) foi clonado no esqueleto do vetor pSup contendo seis cópias de MhRNATyrCUA com promotores otimizados (Rya e S- chultz, "Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli," Nat Methods 3:263-265 (2006)). O gene hirudina com um códon âmbar na posição 63 e uma seqüência de sinal periplasmático glll foi sintetizado e inserido no vetor pBAD. Após co- transformação de células DH10B de E. coli com ambos plasmídeos, a expressão do frasco agitado em meio líquido com mínimo glicerol (GMML) suplementado com 10 mM de sulfoti- rosina foi realizado. Desde que a hirudina é pequena, direção ao periplasma efetivamente resulta em secreção; assim, a sulfo-hirudina foi purificada diretamente a partir do meio con- centrado por FPLC utilizando uma coluna de troca iônica de Q Sefarose seguida por Croma- tografia de Exclusão por Tamanho para dar uma produção de 5 mg/L. Para comparação, desulfo-hirudina com tirosina codificada na posição 63 foi similarmente expressa e purificada com uma produção de 12 mg/L. METODOLOGIA DETALHADA PARA CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE SULFO-HIRUDINA E DESULFO-HIRUDINA
O gene correspondente a [Leu1, Thr2]-63-desulfo-hirudina (comercialmente conhe- cido com Lepirudin (Refludan®) fusionado a uma seqüência de sinal periplasmática glll para secreção foi sintetizada por BIueHeronOcom Otimização de Expressão. Este gene foi inseri- do no vetor de pBAD (Invitrogen) para produzir pBAD-Hirudina sob controle do promotor araBAD. Mutagênese direcionada ao sítio Quickchange (Stratagene) foi utilizado para intro- duzir TAG na posição 63 do gene Lepirudin para produzir pBAD-Hirudina TAG para expres- são de sulfo-hirudina.
O gene correspondente para STyrRS selecionado (clone 1) foi inserido em vetor
pSup entre sítios Pstl e Ndel sob o controle do promotor glnS para produzir pSup-STyRS. O pSup-STysRS também contém seis cópias da contrução MjRNATyrCuA sob controle do pro- motro proK.
Células SH10B eletro-competente co-transdormadas com pSup-STyrRS e pBAD- Hirusin TAG foram crescidos em meio GMML com 50 pg/mL ampicilina, 20 pg/mL de cloran- fenicol e 10 mM sulfotirosina a 37oC. Quando células alcançaram uma D0600 de 0,6 L- arabinose foi adicionado a uma concentração final de 0,2% para induzir expressão de prote- ína. Células foram crescidas para um adicional de 24 horas a 37oC. As células foram pla- queadas e o meio foi concentrado utilizando um aparato de agitação de célula. O meio concentrado foi dializado contra água e aplicado a uma coluna de troca iô-
nica (HiLoad 26/10 Q Sefarose, GE Healthcare) previamente equilibrada com 50 mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, e 10 mM de /?-mercaptoetanol, pH 7.4. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear a partir de 0,025 a 1 M de NaCI. Picos de frações foram analisados por PAGE. Frações a partir de um pico maior que eluiu a 0,3 M de NaCI foram colocados juntos, concentrados, dialisados contra água, e aplicados a um gel de filtração (Superdex 200 10/300 GL, GE Healthcare). Proteínas foram eluídas com solução salina tamponada com Tris (25 mM de Tris-HCI, 125 mM de NaCI, e 2 mM de KCI, pH 7.6). A concentração final de sulfo-hirudina foi determinada por titulação contra 1 nM de σ-trombina humana (Dia- pharma) utilizando 50 μΜ de substrato fluorogênico de trombina Boc-Asp (OBzI)-Pro-Arg- MCA (Peptides International, Inc.) para medir a atividade de trombina. Isto assume uma ini- bição estequiométrica de 1:1 de trombina por hirudina, que é válida sob as concentrações utilizadas como ditado por cinéticas de ligação estreita (Szedlacsek e Duggleby, "Kinetics of slow and tight-binding inhibitors", Methods Enzymol 249:144-180 (1995)). Procedimentos similares foram utilizados para expressar, purificar e quantificar [Leu1, Thr2]-63-desulfo- hirudina.
EXEMPLO 4
Caracterização de uma Hirudina Sulfatada Geneticamente Codificada As hirudinas resultantes descritas nos exemplos prévios foram caracterizadas por análise de PAGE e cada uma foi apresentada como uma banda única. Sulfo-hirudina pode ser distinguida a partir de desulfo-hirudina desde que o formador migra mais longe que o último para permitir a mudança do gel (FIG. 2). Análise de MALDI-TOF mostrou as massas [M+H] corretas para ambos, sulfo-hirudina (7059 Da; Mterórico=7059,5 Da) e desulfo-hirudina (6979 Da; Μ,βόποο=6979,5 Da) com dois picos no caso sulfo-hirudina como perda de sulfato resulta em um menor sinal [M+H-80] (ver FIG. 5).
Para ainda verificar que este segundo pico resultou somente a partir da análise do espectro de massa, dois experimentos foram conduzidos. Primeiro, o fato que a eluição do sulfo-hirudina a partir da coluna de troca iônica ocorre a 10% de força iônica maior que a eluição do desulfo-hirudina sob as mesmas condições de gradiente foi explorado, que pode permitir separação completa de duas hirudinas tiveram que estar simultaneamente presen- tes. Desde que nenhum pico de desulfo-hirudina foi observado na purificação de troca iônica de sulfo-hirudina como determinado pela ausência de um pico de desulfo-hirudina no espec- tro de massa das correspondentes frações eluídas, nós concluímos que nenhuma desulfo- hirudina foi produzida quando a sulfo-hirudina foi expressa.
Segundo, uma expressão controle foi corrida em que nenhuma sulfotirosina foi adi- cionada. Análise subsequente de MALDI-TOF do meio concentrado bruto contendo uma mistura de todas as proteínas secretadas mostrou somente um pico [M+H] de 6578 Da cor- respondendo à proteína truncada resultando a partir do comportamento alternativo do TAG como um códon parador (Mteórico=6575 Da); nenhum pico correspondente para a proteína de comprimento inteiro foi observado (ver FIG. 6A). Este está em contraste com a expressão em presença de sulfotirosina em que ambos, picos de proteína truncada e de comprimento inteiro são encontrados no espectro de massa em aproximadamente intensidades iguais (ver FIG. 6B), sugeringo dependência estrita de supressão âmbar em presença de sulfotiro- sina. A partir desses dois experimentos, é concluído que o sinal [M+H-80] no MALDI-TOF da sulfo-hirudina é somente atribuível a clivagem de SO3" durante a espectrometria de massa, confirmando que STyrRS carrega seu cognato tRNA exclusivamente com sulfotirosina com nenhuma aminoacilação observável de tirosina. Um deve notar que as intensidades similares dos picos truncados e de comprimen-
to inteiro no espectro de massa do meio de expressão da sulfo-hirudina combinada com o fato que a expressão de desulfo-hirudina produz aproximadamente duas vezes proteína quanto a expressão de sulfo-hirudina sob as mesmas condições sugere supressão por a- proximadamente metade dos eventos de tradução durante a expressão da sulfo-hirudina. Um pode assim inferir que a dupla supressão em nosso sistema produzirá aproximadamente 75% de proteína truncada e 25% de proteína de comprimento inteiro, assumindo a ausência de efeitos no contexto de supressão âmbar. É para ser contemplado que a presença de pro- teína truncada é devida a baixa permeabilidade da sulfotirosina aniônica nas células de E. coli, resultando em uma população diminuída de MjtRNATyrCuA carregada com aminoácido. De fato, expressão de hirudina utilizando o mesmo sistema, mas com a p-acetil fenilalanina altamente permeável e sua sintetase mutante correspondente, produz incorporação de p- acetil fenilalanina com nenhuma proteína truncada detectável (dados não mostrados). Uma estratégia de pró-fármaco para distribuir sulfotirosina pode assim eliminar a presença de proteína truncada e produção aumentada.
EXEMPLO 5
Caracterização da Atividade Biológica da Sulfo-Hirudina Geneticamente Codificada Para caracterizar a eficácia da sulfo-hirusin expressa como um anticoagulante, as
cinéticas de inibição de trombina foram determinadas utilizando um ensaio de enzima fluo- reogênica baseado na curva de progresso única previamente relatada na literatura (Cha, "Tight-binding inhibitors-lll. A new approach for the determination of competition between tight-binding inhibitors and substrates-innhibition of adenosine deaminase by coformycin", Biochem Pharmacol 25:2695-2702 (1976); Komatsu et al, "CX-397, a novel recombinant hirudina analog having a hybrid sequence of hirudina variants-1 and 3", Biochem Biophys Res Commun 196:773-779 (1993)). Neste ensaio, 100 pM de ou sulfo-hirudina ou desulfo- hirudina foi misturada com 50 μΜ de substrato fluorogênico para o qual σ-trombina humana foi adicionada para iniciar a reação. Clivagem do substrato fluorogênico para trombina, cuja atividade é inibida para graus diferentes por sulfo-hirudina e desulfo-hirudina, resultou em um gráfico de intensidade de fluorescência ao longo do tempo (FIG. 3).
As concentrações exatas de hirudina e sulfo-hirudina foram determinadas por titula- ção contra trombina em uma concentração variando onde ligação 1:1 pode ser assumida. Como segue a partir da cinética de ligação apertada apropriada para hirudina (Stone e Hofs- teenge, "Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudina", Biochemistry 25:4622-4628 (1986)), esse dados experimentais foram encaixados na equação 1, produzidno Ki, Kon, e Koff após manipulação de constantes extraídas. Esta análise permitiu do Ki para sulfo- hirudina e desulfo-hirudina de 26fM e 307 fM respectivamente, em acordo com relator da literatura (17). Como esperado, Kon para sulfo-hirudina (0,95x10® M"1s"1) foi maior que para desulto-hirudina (0,38x10® M"1s"1), enquanto koff para sulfo-hirudina foi menor (0,22x10"5s~1) que para desulfo-hirudina (1,18x10"5s1). Essas cinéticas de inibição de trombina derivadas a partir de curvas de progressão não lineares com média de pelo menos 3 leituras com desvi- os padrões relatadas são mostradas na tabela abaixo.
Ki Konx IO-8 (M1S1) Koffx 105 (s1) Sulfo-hidurin 26+9,8 0,95±0,56 0,22+0,06 Desulfo-hirudina 307±72 0,38±0,07 1,18+0,45 A vantagem c a afinidade mais alta de sulfo-hirudina sob desulfo-hirudina deve ser especialmente pronunciada na concentração de trombina variando Ioosely ligada por seu respectivo Ki (Szedlacsek e Duggleby, "Kinetics of slow ad tight-binding inhibitors." Methods Enzymol. 249:144-180 (1995)). É assim interessante que a concentração do estado estável do basal fisiológico da trombina humana caia dentro desta variação (Velan e Chandler, "Ef- fects of surgical trauma and cardiopulmonary bypass on active thrombin concentrations and the rate of thrombin enhibition in vivo", Pathophysiol Haemost Thromb 33:144-156 (2003)), sugerindo um possível ímpeto evolucionário para sulfação na hirudina de sanguessuga nati- va. Esta observação deve servir como um guia para possíveis aplicações terapêuticas para a sulfo-hirudina geneticamente modificada (aqui descrita) sob a forma recombinate não sul- fatada prevalente.
A incorporação co-traducional de sulfotirosina em proteínas deve tornar possível a expressão eficiente de muitas mais proteínas seletivamente sulfatadas em E. coli incluindo anticorpos, motivos de receptores de quimiocina, e fatores de coagulação, assim facilitando os estudos de estrutura-função bem como a aplicação terapêutica prática de proteínas sulfa- tadas. Além disso, esta estratégia in vivo pode ser aplicada em direção a construção das bibliotecas de anticorpos sulfatadas e o fago mostrando proteínas sulfatadas, prometendo avenues inacessíveis por métodos disponíveis da síntese de peptídeo, ligação química nati- va, e ligação de proteína expressa. Alternativamente, deve ser possível extender esta estra- tégia para a expressão direta de proteínas tirosina-sulfatadas em organismos eucaritóticos. METODOLOGIA DETALHADA DA CINÉTICA DE CARACTERIZAÇÃO DE
ESPÉCIES DE HIRUDINA EXPRESSAS
A liberação de 7-amino-4-metilcumarina a partir de 50 μΜ de Boc-Asp(OBzI)-Pro- Arg-MCA como um resultado da atividade de trombina foi monitorada por medida de intensi- dade de fluorescência (comprimento de excitação = 365 nm; comprimento de emissão = 450 nm) com um leitor de fluorescência de placa (Molecular Devices SpectraMax Gemini). A re- ação enzimática foi feita em triplicata e repetida três vezes em placas de 96 poços a 37oC em 50 mM de tampão Tris-HCI1 pH 7.8, contendo 0,1% de Polietileno Glicol 6000 (Fluka), 100 mM de NaCI, e 250 pg/mL de HSA (Calbiochem). A constante de Michaelis do substrato sob essas condições é 11,6 μΜ (Komatsu et al, "CX-397, a novel recombinante hirudina analog having a hybrid sequence of hirudina variants-1 and 3", Bioehem Biophys Res Com- mun 196:773-779(1993)).
Os parâmetros cinéticos da inibição de trombina pela sulfo-hirudina expressa e de- sulfo-hirudina foram extraídas a partir de curvas de progressão não lineares obtidas de 40 pM de σ-trombina e 100 pM de sulfo-hirudina ou desulfo-hirudina utilizando o método da curva de progressão única, como previamente descrita (Komatsu et al, "CX-397, a novel recombinant hirudina analog having a hybrid sequence of hirudina variants-1 and 3", Bio- chem Biophys Res Commun 196:773-779 (1993)). De acordo com o mecanismo de inibição competitiva de ligação forte e lenta de hirudinas, a formação do produto pode ser descrita pela equação 1 (Stone e Hofsteenge, "Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudina", Bio- chemistry 25:4622-4628 (1986); Cha1 "Tight-binding inhibitors-lll. A new approach for the determination of competition between tight-binding inhibitors and substrates-inhibition of adenosine deaminase by coformycin", Biochem Pharmacol 25:2695-2702 (1976)):
(I-^)(Vft-Vf)1 v.r + -—i^-fi-—In —-—
\
λγ \ l-y J
Onde O é a quantidade do produto formado no tempo t, e o V0 e vs são as velocida- des iniciais e estado-estável da reação. Na equação 1, vs, γ, e λ podem ser descritos pelas seguintes expressões:
V=Vi
Ε,-Ι,-Κ'+Q
y
10
_ K'+E,+ I1-Q
r K;+E, + I,+Q
Onde
k:=K
í 1
'
1 +
ν
K
m
)
Q = ^j(K;+El + /,f-4E,Il
Utilizando essas equações, Ki e Kon foram determinados. O valor de Koff é o pro- duto de Kon e Ki. Regressão não linear ajustada foi calculada utilizando o programa Graph- Pad Prism.
s$s ^c
Enquanto a invençãof antecedente tem sido descrita em alguns deta- lhes para propósitocs de clarificar e entendimento, será claro a um versado na técnica que a leitura desta revelação que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas sem sair do verdadeiro objetivo da invenção. Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, e/ou outros documentos citados neste pedido são incorporados por referência em sua totali- dade para todos os propósitos para a mesma extensão como se cada publicação individual, patente, pedido de patente, e/ou outro documento seja individualmente indicado para ser incorporado por referência para todos os propósitos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Instituto de Pesquisa The Scripps Liu, Chang C Schultz1 Peter G.
<120> EXPRESSÃO GENETICAMENTE PROGRAMANDA DE PROTEÍNAS SELTIVAMENTE SULFATADAS EM EUBACTÉRIA <130> 54-002120PC
<140> PCT/US2007/020459 <141 > 20-09-2007
<160> 11
<170> Patentln versão 3.4
<210> 1 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial
<220>
<223> Mutante suppressor tirosil-tRNA(CUA) derivado de Methanococcus jannasehii tRNA
<400> 1
ccggcgguag uucagcaggg cagaacggcg gacucuaaau ccgcauggcg cugguucaaa 60 uccggcccgc cggacca 77
<210> 2 <211> 306 <212> PRT
<213> Methanococcus jannasehii <400> 2
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Asp Ile His 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300
Arg Leu 305
<210> 3 <211> 918 <212> DNA
<213> Methanococcusjannaschii <400> 3
atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gcttacatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgetggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa aeeagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aageaatggg gttaaaggea 300 aaatatgttt atggaagtga attceagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgatattcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918
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<223> Sulfotirosina aminoacil-tRNA sintetase derivada a partir de tirosil tRNA-syntetase Methanococcus jannaschii selvagem
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<223> Sulfotirosina aminoacil-tRNA sintetase derivada tirosil tRNA-sintetase de Methano- coccus jannaschii selvage
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<223> Sulfotirosine aminoacyl-tRNA sintetase derivada de tirosil tRNA-sintetase Methanococcus jannaschii selvagem
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Claims (42)

REIVINDICAÇÕES
1. Sistema de tradução CARATERIZADO pelo fato de compreender: (a) um primeiro aminoácido não natural que é sulfotirosina; (b) uma primeira aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS); e (c) um primeiro tRNA ortogonal (O-tRNA); em que o primeiro O-RS preferencialmente aminoacila o referido primeiro O-tRNA com a referida sulfotirosina com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência obser-vada para um sistema de tradução compreendendo o referido O-tRNA, a referida sulfotirosi-na, e um aminoacil-tRNA sintetase compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:10 4, 6, 8 ou 10.
2. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido O-RS é derivado a partir da aminoacil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii.
3. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido primeiro O-RS ser derivado a partir da tirosil-tRNA sintetase de Methanococ-cus jannaschii selvagem.
4. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofato de que o referido primeiro O-RS compreende uma seqüência aminoácida apresentada na SEQ ID NO:4, 6, 8 ou 10, e os variantes conservados dos mesmos.
5. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido primeiro O-tRNA é um tRNA supressor âmbar.
6. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido primeiro O-tRNA compreende ou é codificado por uma seqüência poli-nucleotídica apresentada na SEQ ID NO:1.
7. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um ácido nucléico codificando uma proteína de interesse, o refe-rido ácido nucléico compreendendo pelo menos um códon seletor, em que o referido códon seletor é reconhecido pelo referido primeiro O-tRNA.
8. O sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pe-lo fato de compreender um segundo O-RS e um segundo O-tRNA, em que o segundo O-RS preferencialmente aminoacila o segundo O-tRNA com um segundo aminoácido não natural que é diferente a partir do primeiro aminoácido não natural, e em que o segundo O-tRNA reconhece um códon seletor que é diferente a partir do códon seletor reconhecido pelo pri-meiro O-tRNA.
9. Sistema de tradução, de acordo a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema compreende uma célula hospedeira compreendendo o referido primeiro aminoácido não natural, o referido primeiro O-RS e o referido primeiro O-tRNA.
10. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira é uma célula eubacteriana.
11. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pe- lo fato de que a referida célula eubacteriana é uma célula E. coli.
12. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira compreende um polinucleotídeo codificando o refe- rido primeiro O-RS.
13. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido polinucleotídeo compreende uma seqüência nucleotídica apresen- tada em SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
14. Sistema de tradução, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de a referida célula hospedeira compreende um polinucleotídeo codificando o referido primeiro O-tRNA.
15. Método para produção em um sistema de tradução de uma proteína compreen- dendo um aminoácido não natural em uma posição selecionada, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) prover um sistema de tradução compreendendo: (i) um primeiro aminoácido não natural que é suIfotirosina; (ii) um primeiro aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS); (iii) um primeiro tRNA ortogonal (O-tRNA), em que o referido primeiro O-RS prefe- rencialmente aminoacila o referido primeiro O-tRNA com a referida sulfotirosina com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de tradução compreendendo o referido O-tRNA, a referida sulfotirosina, e uma aminoacil-tRNA sintenta- se compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:4, 6, 8 ou 10; e, (iv) uma ácido nucléico codificando a referida proteína, em que o referido ácido nu- cléico compreende pelo menos um códon seletor que é reconhecido pelo referido primeiro O-tRNA; e, (b) incorporando o referido aminoácido não natural na referida posição selecionada na referida proteína durante a tradução da referida proteína em resposta ao referido códon seletor, assim produzindo a referida protéina compreendendo o referido aminoácido não natural na posição selecionada.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína compreendendo um aminoácido não natural é sulfo-hirudina.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARATERIZADO pelo fato rido prover um sistema de tradução que compreende prover um polipeptídeo codificando o referido O-RS.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que referido provê um sistema de tradução compreendendo a provisão de um O-RS derivado a partir de uma aminoacil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver um sistema de tradução que compreende prover um derivado O-RS a partir de uma tiro- sil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii selvagem.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver um sistema de tradução que compreende prover um O-RS compreendendo uma se- qüência aminoácida apresentada na SEQ ID NO: 4, 6, 8 ou 10, e variantes conservadas da mesma.
21. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver um sistema de tradução compreendendo mutação em um sítio de ligação do aminoácido de uma aminoacil-tRNA sintetase selvagem por mutagênese sítio-direcionada, e selecio- nando um O-RS resultante que preferencialmente aminoacila o referido O-tRNA com o refe- rido aminoácido não natural.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o passo de seleção compreende a seleção positiva e seleção negativa para o referido O-RS a partir de um conjunto compreendendo uma pluralidade das moléculas aminoacil-tRNA sin- tetease resultante seguindo a mutagênese sítio-direcionada.
23. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido provê um sistema de tradução que compreende prover um polinucleotídeo codifi- cando o referido O-tRNA.
24. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver um sistema de tradução que compreende prover um O-tRNA que é um tRNA supressor âmbar.
25. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de o referido prover um sistema de tradução que compreende prover um O-tRNA que compreen- de ou é codificado por uma seqüência polinucleotídica apresentada na SEQ ID NO:1.
26. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido prover um sistema de tradução que compreende prover um ácido nucléico compreen- dendo um códon seletor âmbar.
27. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína compreende um segundo aminoácido não natural que é diferente a partir do referido primeiro aminoácido não natural, e em que o referido sistema de tradução ainda compreende um segundo O-RS e um segundo O-tRNA, em que o segundo O-RS preferen- cialmente aminoacila o segundo O-tRNA com um segundo aminoácido não natural que é diferente a partir do primeiro aminoácido não natural, e em que o segundo O-tRNA reconhe- ce um códon seletor no ácido nucléico que é diferente a partir do códon seletor reconhecido pelo primeiro O-tRNA.
28. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido prover um sistema de tradução que compreende prover uma célula hospedeira, em que a referida célula hospedeira compreende o referido aminoácido não natural, o referido primeiro O-RS, o referido primeiro O-tRNA e o referido ácido nucléico, e em que o referido passo de incorporação compreende a cultura da referida célula hospedeira.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido prover uma célula hospedeira que compreende prover uma célula hospedeira eubac- teriana.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver uma célula hospedeira eubacteriana que compreende prover uma célula hospedeira E. coli.
31. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido provê uma célula hospedeira que compreende prover uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando o referido O-RS.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo coficando o referido passo O-RS que compreende prover uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
33. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de pro- ver um sistema de tradução que compreende prover um extrato celular.
34. Composição CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptídeo compreendendo uma seqüência aminoácída apresentada na SEQ ID NO:4, 6, 8 ou 10, ou uma variante conservada da mesma.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido polipeptídeo variante conservado aminoacila um tRNA ortogonal cognato (O-tRNA) com um aminoácido não natural com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de tradução compreendendo o referido O-tRNA, o referido aminoácido não natural, e uma aminoacíl-tRNA sintetase compreendendo sequên- cia amininoácida da SEQ ID NO:4, 6, 8 ou 10.
36. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de codificar o polipeptídeo cofor- me descrito na reivindicação 34.
37. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fa- to do referido polipeptídeo compreender a seqüência nucleotídica da SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
38. Composição, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição compreende uma célula compreendendo o polipeptídeo.
39. Vetor CARACTERIZADO pelo fato compreender um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 36.
40. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de compreender um polinu- cleotídeo conforme descrito na reivindicação 36.
41. Célula CARACTERIZADA pelo fato de compreender um vetor, o vetor compre- endendo um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 36.
42. Composição CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 5, 7, 9 ou 11.
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