BRPI0717145A2 - Processo para produzir uma vacina combinada, e, vacina - Google Patents

Description

I “PROCESSO PARA PRODUZIR UMA VACINA COMBINADA, E, VACINA”

CAMPO TÉCNICO A presente invenção se relaciona a uma vacina combinada, 5 particularmente uma vacina combinada contendo uma cepa Sabin inativada de poliovírus (sIPV) e a um método de preparação desta.

TÉCNICA ANTERIOR Pólio é uma doença infecciosa causada por um poliovírus. Poliovírus infectam humanos por via oral, proliferam-se no trato intestinal e entram no sistema nervoso central através do sangue. A proliferação de poliovírus dentro de grandes neurônios motores que entraram no sistema nervoso central causa degeneração neuronal e necrose, desencadeando paralisia flácida aguda nos membros. Além disso, quando o poliovírus afeta o centro respiratório medular, pode resultar morte por paralisia respiratória. Vacinas de pólio são amplamente usadas para suprimir o início de pólio que desencadeia tais graves sintomas.

Dois tipos de vacinas de pólio são usados: vacinas de pólio vivas orais e vacinas de pólio inativadas. Vacinas de pólio vivas orais são vacinas que usam cepas atenuadas de poliovírus (cepas Sabin). Cepas 20 atenuadas de poliovírus administradas oralmente causam infecções normais. Poliovírus de vacinas de pólio vivas orais crescem bem nos intestinos, resultando na formação de imunidade localizada nos intestinos. Além disso, quando poliovírus de uma vacina de pólio viva oral entram no sangue e causam viremia, isto também estimula a produção de anticorpos no sangue. 25 Entretanto, visto que a habilidade de cepas atenuadas de poliovírus de proliferar no sistema nervoso central é muito fraca, elas geralmente não causam paralisia. No corpo do inoculado, poliovírus da vacina de pólio viva oral se multiplicam e são excretados nas fezes cerca de 4 até 6 semanas após a inoculação. Os vírus excretados infectam pessoas ao redor do inoculado que têm uma imunidade fraca ou nenhuma imunidade à pólio, conferindo imunidade ou exibindo um efeito potencializador do mesmo modo como no inoculado.

Entretanto, no curso de repetido crescimento no corpo do 5 inoculado ou no curso de repetido crescimento no corpo de uma pessoa infectada por vírus excretados, uma cepa atenuada de poliovírus de uma vacina de pólio viva oral às vezes dá origem a mutações em uma direção altamente virulenta. Em casos muito raros, tais mutantes causam paralisia associada à vacina.

Uma vacina de pólio inativada é uma vacina que perdeu sua

infectividade pela inativação do poliovírus com formalina. Visto que uma vacina de pólio inativada nem se multiplica no corpo do inoculado nem infecta pessoas ao redor do inoculado, ela não causará paralisia associada à vacina. Cepas altamente virulentas foram usadas até agora para preparar 15 vacinas de pólio inativadas, mas avanços também foram feitos recentemente no desenvolvimento de cepas atenuadas (cepas Sabin) (Biologicals 34: 151- 154 (2006); Dev Bil Basel Karger 105: 163-169 (2001), Clinicai Virology 30(5): 336-343 (2002)). O crescimento um pouco mais pobre de cepas atenuadas (cepas Sabin) em relação a cepas altamente virulentas foi 20 considerado como uma desvantagem.

Vacinas que contêm um antígeno protetor de Bordetella pertussis, um toxóide diftérico e um toxóide de tétano são amplamente usadas como vacina combinadas de difteria-tétano-pertússis.

Vacinas polivalentes compostas por uma vacina de pertússis acelular, um toxóide diftérico, um toxóide de tétano e poliovírus inativados são conhecidas (Tradução Japonesa Publicada de um Pedido PCT No. 2000- 504032).

Células Vero são células de passagem dos rins de macacos verdes. Devido a essas células terem uma ampla sensibilidade a vários tipos de vírus, elas são amplamente usadas em cultivo de vírus. Um método para preparar uma vacina de enterovírus tipo 71 que foi relatada na literatura inclui cultivar células Vero em um microcarreador e usar as células Vero cultivadas para crescer enterovírus 71 (“Optimization of microcarrier cell culture process 5 for the inactivated enterovírus type 71 vaccine development”, por Suh-Chin Wu et al., Vaccine 22: 3858-3864 (2004)). Condições de cultivo de células gerais usando um microcarreador também foram descritas (Microcarrier cell culture principies & methods: Pharmacia LKB, Biotechnology, 1998).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Sob tais circunstâncias, houve um desejo por um processo para

produzir uma vacina combinada contendo uma cepa Sabin de poliovírus (sIPV) e contendo também um antígeno protetor de B. pertussis, um toxóide diftérico e um toxóide de tétano (DPT), processo o qual inclui a etapa de preparar um poliovírus de cepa Sabin de título alto.

Foram conduzidas investigações prolongadas a fim de resolver

o problema acima. Como resultado, os inventores descobriram que um poliovírus de cepa Sabin de título alto pode ser preparado por cultivo, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, de células Vero inoculadas com uma cepa Sabin de poliovírus. Após conduzir 20 repetidas investigações baseadas nessas descobertas, os inventores chegaram por fim à presente invenção.

A presente invenção assim provê:

(I) Um processo para preparar uma vacina combinada

contento

(A) uma cepa Sabin inativada de poliovírus,

(B) um antígeno protetor de Bordetella pertussis,

(C) um toxóide diftérico e

(D) um toxóide de tétano,

o processo compreendendo (a) a etapa de cultivar, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, células Vero a serem inoculadas com uma cepa Sabin de poliovírus.

(2) O processo de acordo com (1) acima, compreendendo adicionalmente:

(b) uma etapa de infectar as células Vero com uma cepa Sabin

de poliovírus;

(c) uma etapa de permitir que o poliovírus prolifere;

(d) uma etapa de recuperar um fluido viral contendo o

poliovírus e

(e) uma etapa de inativar o poliovírus.

(3) O processo de acordo com (1) acima, em que o microcarreador tem uma concentração de cerca de 5 g/L.

(4) O processo de acordo com (1) acima, em que o microcarreador é um microcarreador de dextrano.

(5) O processo de acordo com (1) acima, em que a etapa de

cultivar a célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos cerca de 3 litros.

(6) O processo de acordo com (1) acima, em que a etapa de cultivar a célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos

cerca de 30 litros.

(7) O processo de acordo com (2) acima, compreendendo adicionalmente:

(d-2) uma etapa de purificar o fluido viral.

(8) O processo de acordo com (7) acima, em que a etapa de

purificação (etapa (d-2)) compreende:

(i) formar o fluido viral recuperado na etapa (d) em um grânulo por ultracentrifugação;

(ii) sonicar uma ressuspensão do grânulo e

(iii) purificar por cromatografia em coluna. (9) O processo de acordo com (8) acima, em que a purificação por coluna de cromatografia (iii) é executada apenas uma vez.

(10) Uma vacina preparada pelo processo de acordo com (1)

acima.

(11) O processo de (1) acima, em que a etapa de cultivar a célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos cerca de 3 litros.

(12) O processo de (1) acima, em que a etapa de cultivar célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos cerca de 30 litros.

Pelo cultivo, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, das células Vero a serem inoculadas com uma cepa Sabin de poliovírus, é possível obter poliovírus de cepa Sabin de título alto. Pelo uso de poliovírus de cepa Sabin de título alto, um poliovírus de cepa Sabin inativado pode ser produzido eficientemente. Portanto, um processo para produzir uma vacina combinada que inclui a etapa de cultivar, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, células Vero a serem inoculadas com uma cepa Sabin de poliovírus (o processo de produção da presente invenção) é útil como um processo para a produção eficiente de vacinas combinadas contendo uma cepa Sabin inativada de poliovírus.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIG. 1 é um gráfico mostrando curvas de crescimento de célula Vero no cultivo de células Vero por um método de microcarreador. Aqui, “3L” indica um número celular de partida de cerca de 2x105 células/mL (baixa concentração) e 3 g/L de microcarreador. “3H” indica um número celular de partida de cerca de IOxlO5 células/mL (alta concentração) e 3 g/L de microcarreador. “5L” indica um número celular de partida de cerca de 2x105 células/mL (baixa concentração) e 5 g/L de microcarreador. “5H” indica um número celular de partida de cerca de IOxlO5 células/mL (alta concentração) e 5 g/L de microcarreador.

A FIG. 2 é um gráfico mostrando os títulos de infectividade (títulos virais) de poliovírus tipo I obtidos em células Vero cultivadas sob várias condições. Aqui, “3L” representa poliovírus tipo I obtidos em células 5 Vero cultivadas a partir de um número celular de partida de cerca de 2x105 células/mL (baixa concentração) em 3 g/L de microcarreador. “5L” indica poliovírus tipo I obtidos em células Vero cultivadas a partir de um número celular de partida de cerca de 2x105 células/mL (baixa concentração) em 5 g/L de microcarreador. “5H” indica poliovírus tipo I obtidos em células Vero 10 cultivadas a partir de um número celular de partida de cerca de IOxlO5 células/mL (alta concentração) em 5 g/L de microcarreador. “Ref.” indica poliovírus tipo I cultivados usando células de rim de macaco verde.

A presente invenção provê um processo para produzir uma vacina combinada contendo uma cepa Sabin inativada de poliovírus (sIPV) junto um antígeno protetor de B. pertussis, um toxóide diftérico e um toxóide de tétano (DPT), processo o qual inclui a etapa de produzir uma cepa Sabin de título alto de poliovírus.

A invenção é descrita mais completamente abaixo.

1. Poliovírus de Cepa Sabin Inativada (1) Poliovírus de Cepa Sabin

Na presente especificação, “cepa Sabin de poliovírus” se refere a uma cepa de poliovírus derivada de uma cepa atenuada de poliovírus isolado por Dr. Albert B. Sabin (veja, por exemplo, Sabin, AB, Boulger, LR: “History of Sabin attenuated poliovírus oral Iive vaccine strains”, J Biol Standard 1: 115-118 (1973)).

Poliovírus de cepa Sabin incluem cepas de Sabin tipo I de poliovírus, cepas de Sabin tipo II de poliovírus e cepas de Sabin tipo III de poliovírus. Exemplos de cepas de Sabin tipo I de poliovírus incluem as cepas LSc e 2ab. Exemplos de cepas de Sabin tipo II de poliovírus incluem as cepas Ρ712, Ch e 2ab. Exemplos de cepas de Sabin tipo III de poliovírus incluem as cepas Leon e 12aib.

(2) Inativação

Na presente especificação, “inativação” de vírus se refere à 5 eliminação da habilidade infecciosa de um vírus. Métodos de inativação incluem, mas não estão limitados a, métodos físicos (p. ex., métodos envolvendo o uso de irradiação de raios-X, calor ou ultra-som) e métodos químicos (p. ex., métodos envolvendo o uso de formalina, mercúrio, álcool ou cloro).

A inativação de poliovírus pode ser efetuada por um método

conhecido (veja, por exemplo, Biologicals 34: 151-154 (2006)). Por exemplo, a inativação pode ser efetuada pelo tratamento do poliovírus com formalina.

(3) Imunogenicidade de Cepas de Sabin Inativadas de

Poliovírus

Dois antígenos conhecidos como antígenos D e antígenos C

estão geralmente presentes em mistura em cepas de Sabin inativadas de poliovírus. Antígenos D são partículas virais completas. Anticorpos para antígenos D têm a habilidade de neutralizar a infectividade de vírus vivos e funcionam como anticorpos protetores. Antígenos C, chamados partículas 20 defectivas, são partículas que não possuem o RNA de ácido nucleico cerne e parte das proteínas virais de uma partícula viral completa; essas partículas são ocas no centro. Anticorpos para antígenos C têm pouca ou nenhuma habilidade de neutralizar a infectividade de vírus vivos. Portanto, quando uma cepa Sabin inativada de poliovírus é para ser usada como uma vacina, os 25 antígenos D são requeridos.

Há três tipos de poliovírus: tipo I, tipo II e tipo III. A imunidade para infecção de poliovírus é específica para os três tipos de vírus - tipo I, tipo II e tipo III; imunidade cruzada que pode existir entre tipos é mínima. Os antígenos D de cepas Sabin tipo I, tipo II e tipo III têm imunogenicidades capazes de produzir anticorpos neutralizantes para, respectivamente, cepas selvagens tipo I, tipo II e tipo III (altamente virulentas) de poliovírus. As imunogenicidades dos antígenos D de cepas Sabin inativadas de poliovírus diferem para cada um dos tipos I, II e III; daí, a 5 quantidade de antígeno D requerida para produzir anticorpo suficiente para neutralizar cepas selvagens tipo I, tipo II e tipo III (altamente virulentas) de poliovírus difere de acordo com o tipo de vírus.

Conforme mencionado acima, há três tipos de poliovírus - tipo I, tipo II e tipo III I, cada um dos quais causa o mesmo pólio. Portanto,

quando uma cepa Sabin inativada de poliovírus é usada como uma vacina (vacina de pólio inativada), ela deve ter uma imunogenicidade capaz de produzir anticorpos suficientes para neutralizar cepas selvagens (cepas altamente virulentas) de poliovírus de cada um dos tipos I, II e III. Além disso, é desejável para a imunogenicidade estar próxima da imunogenicidade 15 das vacinas de pólio inativadas de cepas altamente virulentas que foram usadas até agora. Para exibir tal imunogenicidade, a vacina contém de preferência cepas Sabin inativadas tipo I, tipo II e tipo III de poliovírus em uma proporção, por peso dos antígenos D respectivos, de preferência (2 até 4):(80 até 120):(80 até 120) e da maior preferência (cerca de 3):(cerca de 20 100):(cerca de 100). As cepas Sabin inativadas de poliovírus usadas na presente invenção, pela inclusão dos tipos I, II e III em uma proporção específica semelhante à anterior, exibem uma imunogenicidade similar àquela de vacinas de pólio inativadas de cepas altamente virulentas (p. ex., a vacina Sauk).

2. Produção de Cepas Sabin Inativadas de Poliovírus

Cepas Sabin inativadas de poliovírus adequadas para uso na presente invenção podem ser produzidas pelo método descrito abaixo.

Primeiro, células Vero são cultivadas na presença de cerca de

4 g/L até cerca de 6 g/L de microcarreador, dando desse modo células para cultivo de poliovírus. As células que cultivam poliovírus resultantes são inoculadas com vírus semente (poliovírus de cepa Sabin) e os vírus são cultivados, dando poliovírus de cepa Sabin que proliferaram. Os poliovírus de cepa Sabin resultantes são inativados para dar poliovírus de cepa Sabin 5 inativados. Podem ser obtidos poliovírus de cepa Sabin inativados que correspondem aos vírus semente usados (cepas Sabin tipo I, cepas Sabin tipo

II e cepas Sabin tipo III). Os vírus podem ser concentrados e/ou purificados antes e após a inativação viral.

Conforme mencionado acima, a vacina de pólio inativada deve 10 ter uma imunogenicidade capaz de produzir anticorpos suficientes para neutralizar cepas selvagens (cepas altamente virulentas) de cada um dos tipos I, II e III. Entretanto, os antígenos D de cepas Sabin de poliovírus inativados têm imunogenicidades que diferem entre tipos I, II e III. Consequentemente, vacina de pólio inativada possuindo uma imunogenicidade capaz de produzir 15 anticorpos suficientes para neutralizar cepas selvagens (cepas altamente virulentas) de cada um dos tipos I, II e III pode ser obtida pelo ajuste das quantidades de poliovírus inativados de tipo I, tipo II e tipo III contidos.

(Células Vero)

Células Vero são células de passagem de rins de macacos 20 verdes {Cercopithecus aethiops) e estão depositadas na Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC). Células Vero são amplamente usadas para cultivar vírus porque elas exibem uma morfologia fibroblástica, têm uma ampla sensibilidade a vários tipos de vírus e são fáceis de manter como células de passagem. Células Vero que são conhecidas por estarem disponíveis na 25 ATCC incluem ATCC Nos. CCL-81 e CRL-1587.

(Microcarreador)

Nesta especificação, “microcarreador” se refere a um veículo que têm superfícies às quais células aderem e permite cultivo celular a ser efetuado em um estado de suspensão em um meio líquido. O microcarreador não está sujeito a qualquer limitação particular com respeito a material, forma e tamanho, desde que ele seja um veículo à superfície do qual células aderem e que permite que o cultivo celular seja efetuado em um estado de suspensão em um meio líquido.

Exemplos do material microcarreador incluem dextrano,

gelatina, colágeno, poliestireno, polietileno, poliacrilamida, vidro e celulose. Dextrano é preferido como o material microcarreador.

Exemplos da forma do microcarreador incluem formas esféricas (microesferas) e discóides. O microcarreador de preferência tem uma forma esférica.

O microcarreador esférico tem um tamanho de, por exemplo, de cerca de 0,01 até cerca de 1 mm, de preferência de cerca de 0,05 até cerca de 0,5 mm e de maior preferência de cerca de 0,1 até cerca de 0,3 mm.

O microcarreador pode ser poroso.

Exemplos de microcarreadores esféricos que podem ser usados

na presente invenção incluem Cytodex 1 (nome comercial), Cytodex 3 (nome comercial) e Cytopore (nome comercial) (todos produtos de GE Healthcare Biosciences). Exemplos de microcarreadores discóides incluem Cytoline 1 (nome comercial) e Cytoline 2 (nome comercial) (ambos os produtos de GE 20 Healthcare Biosciences). Exemplos de microcarreadores porosos incluem Cytopore (nome comercial), Cytoline 1 (nome comercial) e Cytoline 2 (nome comercial) (todos produtos de GE Healthcare Biosciences). O microcarreador usado na presente invenção é da maior preferência um microcarreador de dextrano esférico. O microcarreador de dextrano esférico é de preferência 25 Cytodex 1 (nome comercial), Cytodex 3 (nome comercial) ou Cytopore (nome comercial), de maior preferência Cytodex 1 (nome comercial) ou Cytodex 3 (nome comercial) e da maior preferência Cytodex 1 (nome comercial).

(Cultivo de Célula Vero)

Na presente invenção, as células Vero são cultivadas na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de microcarreador. A concentração de microcarreador é de preferência de cerca de 4,5 g/L até cerca de 5,5 g/L e de maior preferência cerca de 5 g/L.

A etapa de cultivo de célula Vero acima descrita é efetuada em uma escala, em termos do volume líquido, de preferência pelo menos 3 litros, de maior preferência pelo menos 30 litros e da maior preferência pelo menos 150 litros. A etapa de cultivo de células Vero é efetuada em uma escala de geralmente não mais que 1.000 litros.

Quando as células Vero são cultivadas na presença de um microcarreador, o meio de cultura usado pode ser, por exemplo, meio ME (Science 122: 501 (1952)), meio DME (Virology 8: 396 (1959)), meio RPMI 1640 (The Journal of the American Medicai Association 199: 519 (1967)) ou meio 199 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950)), contendo de cerca de 5 até cerca de 20 vol% de soro de bezerro ou soro bovino fetal. O meio de cultura é de preferência um meio DME, de maior preferência um meio DME contendo soro de bezerro e da maior preferência um meio DME contendo cerca de 5 vol % de soro de bezerro. O meio pode, se necessário ser alterado durante o período de cultivo celular. O pH é de preferência de cerca de 6 até cerca de 8, de maior preferência de cerca de 6,5 até cerca de 7,5 e da maior preferência cerca de 7. O cultivo é tipicamente executado a partir de cerca de 35°C até cerca de 40°C por um período de cerca de 5 até 9 dias. Se necessário, aeração e agitação podem ser executadas durante o cultivo. A concentração de oxigênio dissolvido (DO) no momento do cultivo celular é de preferência de cerca de 60 até cerca de 90%, de maior preferência de cerca de 70 até cerca de 80% e da maior preferência cerca de 75%.

O número de células Vero no meio no início do cultivo da presença do microcarreador (número de partida de células) pode ser ajustado conforme apropriado para tais fatores como o tipo de meio, o tipo de microcarreador, a escala de cultivo. O número de partida de células é de preferência de 2x104 células/mL até IOxlO5 células/mL e da maior preferência de 2x105 células/mL até IOxlO5 células/mL.

(Cultivo de Poliovírus)

O cultivo de poliovírus pode ser efetuado pela inoculação e assim infecção das células Vero cultivadas com uma cepa Sabin de poliovírus (vírus semente) e cultivo do poliovírus dentro das células. O cultivo das células infectadas pode ser efetuado do mesmo modo conforme o cultivo de célula Vero acima descrito. O meio usado para cultivo de poliovírus é de preferência um meio 199, de maior preferência um meio 199 contendo bicarbonato de sódio e da maior preferência um meio 199 contendo 0,3% p/v de carbonato de sódio.

A temperatura de incubação durante cultivo de vírus é de preferência de cerca de 3O0C até cerca de 38°C, de maior preferência de cerca de 32°C até cerca de 36°C e da maior preferência de cerca de 3 3 0C até cerca de 35°C. O período de cultivo de vírus é de preferência de cerca de 1 até cerca de 5 dias, de maior preferência de cerca de 2 até cerca de 4 dias e da maior preferência cerca de 3 dias. O cultivo de vírus pode ser levado a um fim usando efeitos citopáticos do poliovírus (arredondamento das células infectadas com poliovírus e soltura das células do microcarreador) como o indicador.

Uma cepa Sabin de poliovírus que foi cultivada usando células de rim de cultura primária de macaco verde pode ser empregada como o vírus semente.

(Recuperação de Fluido Viral Contendo Poliovírus)

Após a completude do cultivo de vírus, o microcarreador é removido e o fluido viral contendo o poliovírus (às vezes referido aqui como o “fluido de poliovírus”) é recuperado.

A remoção do microcarreador pode ser efetuada por meio de, por exemplo, uma malha de Teflon (tal como uma que tem um tamanho de poro de 120 μηι). Visto que poliovírus permanecem presentes (aderidos) no microcarreador deixado na malha, esses poliovírus remanescentes podem ser recuperados pela rinsagem com, por exemplo, o meio de cultura viral.

O fluido de poliovírus resultante pode ser filtrado usando uma

membrana de filtro (p. ex., uma membrana de filtro de 0,2 μηι) ou semelhantes para remover restos celulares.

O fluido de poliovírus pode ser concentrado e/ou purificado antes ou após a inativação.

Exemplos ilustrativos do método de concentração incluem

ultrafiltração, ultracentrifugação e diálise. O método de concentração é de preferência ultrafiltração ou ultracentrifugação. É mais preferível efetuar tanto ultrafiltração como ultracentrifugação e ainda mais preferível efetuar ultrafiltração seguida por ultracentrifugação.

A membrana usada na ultrafiltração pode ser uma membrana

de ultrafiltração comumente empregada para concentrar vírus. A membrana de ultracentrifugação tem um limite de corte de peso molecular que é de preferência cerca de 100 kDa. A membrana de ultrafiltração é de preferência feita de um material tal como poliéter sulfona.

A concentração do poliovírus por ultracentrifugação pode ser

efetuada pela submissão do fluido de poliovírus a 4 horas de centrifugação a 4°C e 100.OOOg para formar um grânulo. O grânulo pode ser colocado em ressuspensão em, por exemplo, um tampão fosfato. Também é possível quebrar a massa de vírus agregados por sonicação da ressuspensão do 25 grânulo. A sonicação pode sr efetuada usando um aparato disponível comercialmente, tal como Insonator modelo 200M (Kubota). As condições de sonicação devem ser suficientes para quebrar a massa de vírus agregados e podem ser selecionadas conforme apropriado para tais fatores como a vasilha usada na sonicação, o rendimento de ultra-som e a concentração da ressuspensão. Condições de sonicação são exemplificadas pelo tratamento de 200W por um período de 3 até 10 minutos. Mesmo quando tal sonicação é efetuada, a cepa Sabin de poliovírus não perde sua imunogenicidade, permitindo a ela ser vantajosamente usada como uma vacina de poliovírus.

Métodos de purificação incluem, mas não estão limitados a,

métodos que utilizam características físicas da substância a ser purificada, tal como tamanho, densidade e coeficiente de sedimentação e métodos que utilizam reações químicas ou físico-químicas (p. ex., adsorção-dessorção). Exemplos ilustrativos de métodos de purificação incluem centrifúgação em gradiente de densidade, filtração (incluindo ultrafiltração), cromatografia em coluna de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de gel filtração e cristalização. O método de purificação é de preferência cromatografia em coluna, de maior preferência cromatografia em coluna de troca iônica e da maior preferência cromatografia em coluna de troca iônica DEAE. O número de vezes que a purificação é efetuada por cromatografia em coluna não está submetido a qualquer limitação particular. Isto é, a purificação por cromatografia em coluna pode ser efetuada repetidamente até que a pureza necessária seja atingida. Entretanto, a partir do ponto de vista de eficiência de produção e outras considerações, é preferível efetuar a purificação em poucas etapas quando possível.

Concentração e purificação são de preferência efetuadas pela formação do fluido de poliovírus em um grânulo por ultracentrifugação, sonicação de uma ressuspensão do grânulo resultante, então purificação por cromatografia em coluna. Além disso, a partir do ponto de vista de eficiência 25 de produção, é preferível efetuar a purificação em cromatografia em coluna apenas uma vez. Pela efetuação da formação do fluido de poliovírus em um grânulo por ultracentrifugação, sonicação de uma ressuspensão do grânulo e purificação por cromatografia em coluna apenas uma vez, o fluido de poliovírus pode ser concentrado e purificado tanto eficientemente como adequadamente.

(Inativação de Poliovírus)

A inativação do poliovírus pode ser efetuada por um método comumente empregado. Especificamente, o poliovírus pode ser inativado pela 5 adição de um inativador do fluido de poliovírus e desse modo efetuando uma reação entre o poliovírus e o inativador. O inativador é de preferência formalina. As condições de inativação não são submetidas a qualquer limitação particular, contanto que o poliovírus seja inativado. Para evitar a presença residual de poliovírus insuficientemente inativados, o período de 10 tratamento de inativação é geralmente de cerca de 2 até cerca de 4 vezes, de preferência de cerca de 2,5 até cerca de 3,5 vezes e de maior preferência cerca de 3 vezes, o comprimento do período para o qual a inativação do poliovírus foi confirmada.

Por exemplo, quando formalina é usada como o inativador, a quantidade de adição é de preferência de cerca de 0,001 até cerca de 0,1 p/v%, de maior preferência de cerca de 0,005 até cerca de 0,05 p/v% e da maior preferência de cerca de 0,01 p/v%. A temperatura de inativação é da maior preferência cerca de 37°C. O período de inativação pode variar também dependendo do tipo de inativador, da concentração do inativador e da temperatura de inativação. Por exemplo, quando cerca de 0,01 p/v% de formalina é usado como o inativador e a temperatura de inativação é cerca de 37°C, o período de inativação é de preferência de cerca de 8 até cerca de 16 dias, de maior preferência de cerca de 10 até cerca de 14 dias e da maior preferência cerca de 12 dias. Quando cerca de 0,01% p/v% de formalina é usado e o tempo de inativação é de cerca de 37°C, poliovírus de cepa Sabin são geralmente inativados em 4 dias.

3. Toxóide diftérico, antígeno protetor de B. pertussis e toxóide de tétano (DPT)

O antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide de tétano usados na presente invenção não estão submetidos a qualquer limitação particular.

O antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide de tétano estão disponíveis comercialmente como vacinas combinadas de difteria-pertússis-tétano (tal como aquelas fabricadas por Takeda Chemical Industries, Ltd., a Fundação de Pesquisa para Doenças Microbianas da Universidade de Osaka (Biken) e o Instituto de Pesquisa Quimio-Soro- Terapêutico (Kaketsuken)). Senão, o antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide de tétano podem ser obtidos por métodos conhecidos. Especificamente, o antígeno protetor de B. pertussis pode ser obtido, por exemplo, pela extração, isolamento e purificação da fração de antígeno filático de um caldo de cultura de cepas de B. pertussis de fase I (cepa Tohama) usando um método físico-químico tal como fracionamento por sulfato de amônio/fracionamento em centrífuga por gradiente de densidade de sacarose, então atenuando a virulência resultante com formalina. O toxóide diftérico pode ser obtido, por exemplo, pela purificação e concentração da toxina produzida por Corynebacterium diphtheriae (cepa Park-Williams No. 8) usando um método físico-químico tal como cromatografia em coluna, seguida por desentoxificação com formalina. O toxóide de tétano pode ser obtido, por exemplo, pela purificação e concentração da toxina produzida por Clostridium tetani (cepa Harvard) usando um método físico-químico tal como cromatografia em coluna, seguido pela desentoxificação com formalina.

O antígeno protetor de B. pertussis contém toxina pertússis (antígeno PT), hemaglutinina filamentosa (antígeno FHA), proteína de 25 membrana externa (antígeno de 69 KD) e fímbria (também chamada antígeno FB, aglutinogênio (FGG)). O antígeno protetor de B. pertussis não precisa necessariamente conter cada um dos antígenos acima, contanto que ele contenha pelo menos um, de preferência pelo menos dois e de maior preferência pelo menos três desses antígenos. Anticorpos para esses antígenos protetores protegem o hospedeiro de pertússis.

4. Vacina Combinada

A vacina combinada da presente invenção contém cepas Sabin de poliovírus, antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide de 5 tétano. Conforme acima mencionado, o antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide de tétano estão disponíveis comercialmente como vacinas combinadas de difteria-tétano-pertússis. Portanto, a vacina combinada da presente invenção também pode ser preparada pela mistura de cepas Sabin inativadas de poliovírus com uma vacina combinada de difteria-tétano- 10 pertússis.

As cepas Sabin inativadas de poliovírus podem ser preparadas pela mistura de cepas de poliovírus tipo I de Sabin inativadas, cepas de poliovírus tipo II de Sabin inativadas e cepas de poliovírus tipo III de Sabin inativadas. Conforme acima mencionado, as cepas Sabin inativadas de 15 poliovírus contêm as cepas Sabin inativadas tipo I, tipo II e tipo III de poliovírus em uma proporção, baseada nas quantidades dos respectivos antígenos D desses, de preferência (2 até 4):(80 até 120):(80 até 120) e da maior preferência (cerca de 3):(cerca de 100):(cerca de 100).

O antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e toxóide 20 de tétano podem estar incluídos na vacina combinada da invenção em quaisquer quantidades que são eficazes para prevenir pertússis. Difteria e tétano. Especificamente, essas respectivas quantidades podem ser as mesmas que as quantidades correspondentes nas acima mencionadas vacinas combinadas de difteria-tétano-pertússis disponíveis comercialmente. Em 25 casos onde as imunogenicidades do antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e/ou toxóide de tétano são influenciadas pela cepa Sabin inativada de poliovírus e outros ingredientes, uma vacina combinada eficaz para prevenir cada uma das doenças alvo pode ser produzida pelo ajuste adequado dos conteúdos respectivos. A vacina combinada da invenção pode ser produzida e usada por meios convencionais. Especificamente, a produção e uso podem ser efetuados como descrito abaixo.

A vacina combinada da invenção pode ser preparada como uma injeção por um método convencional. Tal injeção é preparada de acordo com um método que é por si só conhecido na técnica, tal como dissolver, fazer suspensão e emulsificar as substâncias acima em um líquido estéril aquoso ou oleaginoso comumente usado em injeções. Exemplos de líquidos aquosos para injeção que podem ser usados incluem composto salino fisiológico e soluções isotônicas contendo glicose ou algum outro adminículo. A solução injetável que foi preparada tipicamente preenche uma ampola ou seringa.

A vacina combinada da invenção também pode incluir opcionalmente aditivos farmacêuticos tal como conservantes, antioxidantes e agentes quelantes. Exemplos ilustrativos de conservantes incluem timerosal e 2-fenoxietanol. Exemplos ilustrativos de agentes quelantes incluem ácido etilenodiaminotetracético e ácido de glicol éter diaminotetracético.

A vacina combinada da invenção pode adicionalmente conter adjuvantes. Exemplos ilustrativos de adjuvantes incluem hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e cloreto de alumínio.

Além do poliovírus de cepa Sabin inativado, antígeno protetor de B. pertussis, toxóide diftérico e/ou toxóide de tétano, a vacina combinada da invenção também pode incluir outros ingredientes imunogênicos. Exemplos ilustrativos de tais ingredientes imunogênicos incluem ingredientes imunogênicos para vírus ou bactérias fora poliovírus, B. pertussis, C. diphtheriae e C. tetani. Exemplos de tais ingredientes imunogênicos incluem toxóides, vírus atenuados, vírus inativados, proteínas, peptídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, lipopeptídeos e combinações destes. Exemplos de vírus e bactérias fora poliovírus, B. pertussis, C. diphtheriae e C. tetani incluem vírus influenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola, vírus da herpes, vírus da varíola, vírus da raiva, vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite, Diplococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, bacilo tifóide e Haemophilus influenzae tipo b.

A vacina combinada da presente invenção pode ser

administrada parenteralmente, tal como por injeção subcutânea ou injeção intramuscular e de preferência por injeção subcutânea.

A quantidade de uma única dose da vacina combinada da invenção pode ser selecionada adequadamente de acordo com várias 10 condições, tal como a idade e peso corporal do vacinado alvo. Especificamente, uma única dose pode conter, por exemplo, pelo menos 4 unidades internacionais de antígeno protetor de B. pertussis, cerca de 15 Lf de toxóide diftérico, cerca de 2,5 Lf de toxóide de tétano, cerca de 2 até cerca de

4 unidades (de preferência cerca de 3 unidades) de poliovírus tipo I de Sabin 15 inativado (base de antígeno D), cerca de 80 até cerca de 120 unidades (de preferência cerca de 100 unidades) de poliovírus tipo II de Sabin inativado (base de antígeno D) e cerca de 80 até cerca de 120 unidades (de preferência cerca de 100 unidades) de poliovírus tipo III de Sabin inativado (base de antígeno D).

O número de vezes que a vacina combinada da invenção é

administrada como uma imunização inicial pode ser, por exemplo, duas ou três doses em intervalos de 3 até 8 semanas. Quando a vacina combinada inventiva é administrada duas vezes como uma imunização inicial, é desejável administrar também uma vacina combinada de difteria-pertússis-tétano 25 (vacina DPT) em um intervalo de 3 até 8 semanas. Como um reforço de imunização, a vacina combinada inventiva pode ser dada mais uma vez em um intervalo de pelo menos 6 meses após imunização inicial (p. ex., de 12 até 18 meses após o fim da imunização inicial). EXEMPLOS A presente invenção é ilustrada mais completamente por meio de exemplos, embora os exemplos não limitem o âmbito da invenção.

Exemplo de Referência 1: Estabelecendo um Banco de Células de Trabalho do Fabricante para Vírus de Vacina de Pólio

Um banco de células conservadas para a produção de vacina de pólio foi preparado pelo procedimento descrito abaixo a partir de células Vero adquiridas do ATCC.

(i) Preparação de Banco de Célula Mestre (MCB)

Células congeladas em uma ampola recebidas do ATCC (CCL 81 Vero, F-6573; número de passagem, 124) foram descongeladas e transferidas para um frasco de 4 onças vazio (um frasco que tem uma capacidade para 154 mL e uma área de superfície para crescimento de célula de 54 cm2). Quinze mililitros de um meio de crescimento de células (DME, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; Sigma, No. de catálogo D5523) contendo 5 vol% de soro de bezerro, 0,075% de bicarbonato de sódio, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/mL de canamicina (concentrações finais) foram adicionados gota a gota ao frasco de 4 onças contendo células por um período de cerca de 5 minutos. O frasco contendo as células e o meio de crescimento celular foi cultivado estático a 36°C (um frasco de 4 onças, passagem 125). Na manhã seguinte, a cultura de crescimento celular foi substituída com 15 mL de cultura fresca e o cultivo estático foi novamente efetuado a 36°C. No dia 6 após o início da cultura estática, uma subcultura foi efetuada (de um frasco de 4 onças até quatro frascos de 4 onças, passagem 126). O método de subcultura foi efetuado como se segue.

Método de subcultura

(1) Descarte o caldo de cultura

(2) Coloque 5 mL de solução de tripsina a 0,25% para subcultivo em frasco de 4 onças. (3) Imersa superfícies celulares por cerca de 1 minuto, então descarte a solução de tripsina a 0,25% para subcultivo.

(4) Coloque o frasco de 4 onças em descanso a 36°C e espere as células soltarem-se da superfície de vidro.

(5) Quando as células começarem a soltar, adicione 5 mL de meio de crescimento celular e induza todas as células a soltarem-se por uso de pipeta.

(6) Faça suspensão das células uniformemente por uso adicional da pipeta, então transfira o meio de crescimento celular para um tubo de centrífuga.

(7) Centrifugue por 5 minutos a 600 rpm, descarte o sobrenadante e faça suspensão uniforme das células sedimentadas em cerca de 8 mL de meio de crescimento celular fresco por uso da pipeta.

(8) Adicione 2 mL de suspensão celular a cada um dos quatro novos frascos de 4 onças (em cada um dos quais 13 mL de meio de crescimento celular fresco foram distribuídos).

(9) Coloque quatro frascos de em descanso a 36°C e efetue

cultivo celular.

A composição da solução de tripsina a 0,25% para subcultivo foi como se segue.

Tripsina a 5% *\ 50 mL

Polivinil pirrolidona a 5% (90K), 20 mL/L

0,247 de edetato de sódio*2, 56 mL/L

EK*3, 2 mL/L

Fluido diluente de tripsina*4, 872 mL/L

*1: Tripsina de pâncreas suíno e que tem uma atividade de 1:300 foi usada.

*2: A composição de 0,247 mol de edetato de sódio foi como

se segue: edetato de sódio - 2Na-2H20, 91,95 g/L NaOH, 9,88 g/L

*3: A composição de EK foi como se segue: lactobionato de eritromicina, 10.000 μg/mL sulfato de canamicina, 50.000 μg/mL

*4: A composição do fluido diluente de tripsina foi como se

segue:

NaCl, 8.000 mg/L KCl, 400 mg/L Na2HPO4-12H20, 150 mg/L KH2PO4, 60 mg/L

Subcultivo foi subseqüentemente efetuado pelo mesmo método (embora, devido à área de superfície de cultura ser aumentada cerca de 3 até 4 vezes em uma única passagem, as garrafas de cultura e o volume líquido manipulado diferiram) em intervalos de 3 até 6 dias, produzindo desse modo células de 129 passagens (o número de passagens aumenta em um cada vez que é efetuada subcultura). As células de 129 passagens cultivadas foram tratadas com tripsina em frascos 33 SR (frascos de Roux pequenos: frascos de cultura que têm um volume de 727 mL e uma área de superfície de crescimento celular de 156 cm ) do mesmo modo como durante subcultivo e foi feita centrifügação, após o que o grânulo foi colocado em ressuspensão em

•j

uma concentração de cerca de 1,5 x 10 células/mL em um meio crioconservado (DME (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; Sigma, No. de catálogo D5523) contendo 10 % de dimetil sulfóxido (DMSO), 10 vol% de soro de bezerro, 0,075% de bicarbonato de sódio, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/mL de canamicina (concentrações finais)). Um mililitro da suspensão celular acima foi dispensada em uma ampola, a temperatura foi diminuída para -32°C em um congelador lento (em uma taxa de resfriamento de cerca de l°C/min), então transferida para nitrogênio líquido e conservada. As células de 129 passagens obtidas como descrito acima foram usadas como o banco de célula mestre (MCB).

(ii) Preparação do Banco de Células de Trabalho do Fabricante

(MWCB)

Usando o Banco de Células Mestre (MCB) preparado e

conservado na seção (i) acima, as etapas a partir do descongelamento das células na ampola até o crescimento por subcultivo celular até a passagem 134 foram efetuadas basicamente da exata maneira que foi usada para preparar o Banco de Células Mestre (MCB) em (i) acima (embora, devido ao número de 10 células de partida ser maior, a quantidade de líquido manuseado e o tipo e número de frascos diferiu). As células de 134 passagens foram conservadas em nitrogênio líquido do mesmo modo que no Banco de Células Mestre (MCB). As células de 134 passagens assim obtidas foram usadas como um Banco de Células de Trabalho do Fabricante (MWCB).

Exemplo 1: Preparação de Células para Produção de Vírus de

Vacina de Pólio

(i) Etapa de Cultivo Estático

Uma ampola do Banco de Células de Trabalho do Fabricante (MWCB) preparado e conservado no Exemplo de Referência 1 acima (células 20 de 134 passagens) foi descongelada do mesmo modo que na preparação do Banco de Células Mestre (MCB) e do Banco de Células de Trabalho do Fabricante (MWCB) no Exemplo de Referência 1 e as células foram cultivadas estáticas por 7 dias (135 passagens) em três frascos LR (frascos de Roux grandes, que são frascos de cultura que têm uma capacidade de cerca de 25 1.540 mL e uma área de superfície de crescimento celular de cerca de 274 cm2). O subcultivo foi efetuado até o dia 7 a partir do início do cultivo estático, após o que a escala de cultivo foi expandida para 18 frascos LR (passagem 136) e cultivo estático foi efetuado. Subcultivo e cultivo estático dessas foi efetuado pelo mesmo método como na preparação do Banco de Células Mestre (MCB) e na preparação do Banco de Células de Trabalho do Fabricante (MWCB) no Exemplo de Referência 1 acima.

Em seguida, 7 dias de cultivo estático foram efetuados em um Cell Factory de 40 bandejas (Nunc, No. de catálogo 139446) (passagem 137). O subcultivo foi então efetuado no dia 7 após o início da cultura estática, em adição da qual foi efetuado cultivo estático de 7 dias em quatro Cell Factory de 40 bandejas (passagem 138).

(ii) Etapa de Cultivo de Microcarreador

Em seguida, as células da passagem 138 obtidas na etapa de cultivo estático em (i) acima foram tratados com tripsina e centrifugadas no mesmo modo que durante o subcultivo em (i) acima e as células sedimentadas foram postas em suspensão uniformemente por uso de pipeta em 1.000 mL de um meio de crescimento celular para microcarreador (DME (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; Sigma, No. de catálogo D5523) contendo 5 vol% de soro de bezerro (Thermo Trace), 0,11% de bicarbonato de sódio, 0,1% de frutose, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/mL de canamicina (concentrações finais)). A suspensão celular foi expandida anteriormente com composto salino tamponado com fosfato (PBS), então misturada com um microcarreador (Cytodex 1 (nome comercial); GE Healthcare Biosciences) equilibrado com o meio de crescimento celular para cultivo de microcarreador (5 g/L de Cytodex 1 (nome comercial) foram usados, com base no peso antes da expansão) e cultivo foi efetuado em três recipientes de cultura de 50 litros a 37°C, pH 7,15 e sob agitação. Começando no dia 2 de cultivo, metade do meio de crescimento celular foi trocado sucessivamente uma vez por dia por meio de crescimento celular fresco. As células crescidas por 7 dias foram usadas como células (passagem 139) para a produção de vírus de vacina de pólio.

Exemplo 2: Produção de Vacina de Pólio Inativada Tipo I

(i) Etapa de Cultivo de Vírus Logo antes da inoculação de vírus sementes em células para produção de vírus de vacina de pólio obtidas no Exemplo I (passagem 139), a agitação foi interrompida e deixou-se as células assentarem-se, então lavadas uma vez usando Solução Salina Balanceada de Earl (EBSS) contendo 0,075% de bicarbonato de sódio, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/nlL de canamicina (concentrações finais). Após remoção do sobrenadante dos 5 mL do meio de crescimento celular coletado junto com o microcarreador, o volume foi novamente levado até 5 mL pela adição de solução de tripsina 0,25%, soltando desse modo as células das microesferas e levando elas a ficarem em suspensão. A contagem de células foi então determinada, baseado na qual o número de células para o recipiente de cultura de 50 litros inteiro foi estimado. Vírus semente tipo I (cepas LSc, 2ab) Sabin atenuados foram inoculados em uma concentração de cerca de IO"3 CCID50 por célula. Após inoculação dos vírus semente, 50L de um meio de cultura viral (Ml99 (meio 199) contendo 0,3% de bicarbonato de sódio, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/mL de canamicina (concentrações finais)) foi imediatamente distribuído no recipiente de cultura. Os vírus semente usados eram vírus que tinham sido cultivados anteriormente em cerca de 33,3°C usando células de cultura primária de rim de macaco verde africano, então embaladas em pequenas porções e crioconservadas a -70°C.

O cultivo viral foi efetuado em 34°C±1°C por 3 dias. Usando os efeitos citopáticos do poliovírus (arredondamento das células infectadas com poliovírus, seguido pela soltura das células do microcarreador) como indicador, o cultivo viral foi levado ao fim quando de 95 até 100% das células tinham se soltado do microcarreador. Após a completude do cultivo viral, o microcarreador foi removido com uma malha de Teflon (tamanho do poro, 120 μιη) e a suspensão de vírus foi recuperada. O microcarreador que remanescia na malha foi lavado uma vez com cerca de 3 L de meio de cultura viral por recipiente de cultura de 50 L. O fluido de lavagem resultante foi adicionado à suspensão viral recuperada, dando desse modo um “fluido viral de pólio tipo I”.

(ii) Etapa de Concentração/Purificação de Vírus

Cerca de 15 OL do fluido de poliovírus tipo I obtido em (i) acima foram passados através de uma membrana de filtro de 0,2 μπι (Pall Corporation, SLK7002NRP) para remover restos celulares. O filtrado foi concentrado em 1,2 L com uma membrana de ultrafiltração (Sartorius, PESU (polieterssulfona) 100 kDa, 0,1 m2, 3051466801E—SG). O fluido viral concentrado foi formado em um grânulo por 4 horas de ultracentrifugação a 6°C e lOO.OOOg e após o que o grânulo foi colocado em ressuspensão em 0,1 M de tampão fosfato (PB) (o grânulo de um tubo de centrífuga (cerca de 100 mL) foi colocado em ressuspensão em 5 mL de PB). A ressuspensão do grânulo foi agitada durante a noite a 4°C, então sonicada (Kubota, Insonator Modelo 200M) por 8 minutos a 200 W, quebrando desse modo a massa de vírus agregados. Em seguida, após 30 minutos de centrifugação a 15.000 rpm, o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante assim obtido foi purificado com DEAE Sepharose CL-6B (nome comercial, GE Healthcare Biosciences; GE 17-0710-05). Tampão fosfato (PB), 0,1 M, foi usado como o eluente. A absorbância a 280 nm foi monitorada e o primeiro pico foi recuperado como “fluido de poliovírus tipo I purificado”. A absorbância a 260/280 nm para o pico amostrado foi calculada e confirmada como sendo maior que 1,5 (a absorbância a 260/280 nm para partículas de poliovírus completas é de 1,6 até

1,7).

(iii) Etapa de Inativação

O fluido de poliovírus tipo I purificado obtido em (ii) acima

foi diluído cerca de 10 vezes com uma solução diluente de pré-inativação (Ml99 contendo 5% de ácido aminoacético (concentração final), mas não contendo nenhum cálcio, magnésio, vermelho fenol ou bicarbonato de sódio), passado através de uma membrana de filtro de 0,2 μηι (Pall Corporation, SLK7002NRP) e a massa de vírus agregados foi removida. Após preparação do filtrado, a inativação foi iniciada rapidamente de modo a evitar agregação de vírus novamente. Uma hora antes do início da inativação, o filtrado e formalina diluída a 1:200 foram separadamente aquecidos a 37°C. Enquanto o filtrado era agitado vigorosamente, a formalina foi adicionada a uma concentração final de 1:4.000, a mistura foi aquecida a 37°C e a inativação foi iniciada. Durante tratamento de formalina, a inativação de vírus foi feita para proceder uniformemente por agitação da mistura duas vezes por dia - uma vez na primeira metade do dia e uma vez na segunda metade do dia. Antecipando que vírus inativados insuficientemente adeririam ao recipiente de paralisação e a certos lugares específicos dentro do recipiente, o paralisador foi trocado nos dias 2 e 4 após o início da inativação e o recipiente por si só foi trocado no dia 6. Além disso, dada a possibilidade de que os vírus se agregariam durante a etapa de inativação, no dia 6 da inativação, foi efetuada filtração usando uma membrana de filtro de 0,2 μηι (Pall Corporation, SLK7002NRP). A etapa de tratamento com formalina foi levada ao fim após 12 dias. No dia 12, formalina livre no fluido viral tratado com formalina foi neutralizada com sulfito de sódio (adicionado em uma concentração de 0,0264 M), após o que edetato de sódio foi adicionado (0,0009 M) como um estabilizador, dando desse modo um material volumoso de “vacina de pólio tipo I inativada”.

(iv) A quantidade de antígeno D é medida por um método de ELISA indireto usando anticorpos que têm uma alta especificidade ao tipo e ao antígeno D. O método de ELISA indireto começa pelo revestimento de uma microplaca com, como o anticorpo primário, um anticorpo monoclonal (derivado de camundongo) específico para antígenos D do mesmo tipo que o antígeno a ser avaliado. O antígeno a ser avaliado é então diluído e colocado naquele. Em seguida, um anticorpo policlonal de coelho do mesmo tipo que o antígeno a ser avaliado é colocado naquele como o anticorpo secundário, além do qual é colocado naquele anticorpo anti-IgG de coelho marcado com HRPO, efetuando uma reação. Após a reação, o desenvolvimento de cor é efetuado usando uma solução de o-fenilenodiamina e a absorbância a 492 nm é medida. A quantidade de antígeno D (antígeno avaliado) é determinada pela 5 comparação da absorbância medida para o anticorpo avaliado com a absorbância medida para o antígeno de referência por análise quantitativa em paralelo.

Exemplo 3: Produção de Vacina de Pólio Inativado Tipo II

A parte do uso de cepas tipo II Sabin atenuadas (cepas P712, Ch, 2ab) em vez de cepas tipo I Sabin atenuadas (cepas LSc, 2ab), um material volumoso de “vacina de pólio tipo II inativada” foi produzida do mesmo modo que no Exemplo 2.

Exemplo 4: Produção de Vacina de Pólio Inativado Tipo III

A parte do uso de cepas tipo III Sabin atenuadas (cepas Leon, 12a!b) em vez de cepas tipo I Sabin atenuadas (cepas LSc, 2ab), um material volumoso de “vacina de pólio tipo III inativada” foi produzida do mesmo modo que no Exemplo 2.

Exemplo 5: Produção de Antígeno Protetor de B. pertussis

(1) Cultivo de Bordetella pertussis

Cepas de B. pertussis de fase I (cepa Tohama) foram

cultivadas em centrifugação a 30 até 34°C por 20 até 24 horas em meio Cohen-Wheeler. A B. pertussis crescida no meio Cohen-Wheeler foi então crescida em um meio Stainer-Scholte a 30 até 34°C por 48 até 68 horas.

A cultura foi concentrada para 1/10° do volume original por ultracentrifugação e o sobrenadante e células bacterianas foram separados por separação de centrifugação.

(2) Preparação de Toxina de Pertússis

Em seguida, I M de tampão fosfato (pH 8,0) foi adicionado ao sobrenadante obtido em (1) acima para levar o volume até 1/10° do volume original, então uma solução de acetato de cálcio a 25 p/v% foi adicionada para levar a concentração a 0,1 até 2,0 p/v% e um filtrado contendo toxina de pertússis (antígeno filático) foi obtido por filtração. O filtrado foi passado através de uma coluna por cromatografia em coluna SP (solução equilibrada:

5 0,1 M de tampão fosfato (pH 6,0) e a toxina pertússis adsorvida foi eluída com 0,415 M de tampão fosfato (pH 7,0), fracionando desse modo uma solução contendo toxina de pertússis. Em seguida, a solução contendo toxina pertússis foi passada através de uma coluna por cromatografia em coluna de gel (solução equilibrada: 0,025 M de solução de fosfato de sódio (pH 8,7) 10 contendo 0,25 M de cloreto de sódio), então filtrada (tamanho do poro, 0,2 μηι), dando uma solução de toxina pertússis (antígeno PT) pura.

(3) Preparação de Hemaglutinina Filamentosa

As células bacterianas isoladas em (1) acima foram dispersas em um tampão fosfato a 0,05 M (pH 8,0) contendo I M de cloreto de sódio, 15 após o que foi efetuada separação de centrifugação para separar novamente o sobrenadante e as células bacterianas. Uma solução de acetato de cálcio a 25 p/v% foi adicionada ao sobrenadante resseparado em uma concentração de 0,1 até 2,0 p/v%, após o que foi efetuada filtração, dando uma solução contendo hemaglutinina filamentosa (antígeno filático). O filtrado foi 20 concentrado com sulfato de amônio, então purificado por centrifugação em gradiente de densidade, fracionando desse modo hemaglutinina filamentosa pura (antígeno FHA).

(4) Preparação de Proteína de Membrana Externa

As células bacterianas resseparadas em (3) acima foram 25 dispersas em um tampão fosfato 0,01 M (pH 7,0) contendo 0,145 M de cloreto de sódio e aquecidas a 60°C por 90 minutos, após o que o sobrenadante e células bacterianas foram novamente resseparados por separação de centrifugação. Em seguida, tampão fosfato I M (pH 8,0) foi adicionado ao sobrenadante novamente resseparado para levar o volume até 1/10°, após o que uma solução de acetato de cálcio 25 p/v% foi adicionado em concentrações de 0,1 até 2,0 p/v% e foi efetuada filtração, dando desse modo um filtrado contendo proteína de membrana externa (antígeno filático). A solução contendo proteína de membrana externa (antígeno filático) foi 5 submetida a cromatografia em coluna SP (solução equilibrada: tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0)) e o líquido que passou através da coluna foi coletado. Em seguida, o líquido foi passado através de uma coluna por cromatografia em coluna de gel (solução equilibrada: solução de fosfato de sódio 0,025 M (pH 8,7) contendo 0,25 M de fosfato de sódio), então filtrado (tamanho de poro, 10 0,2 μηι), dando desse modo proteína de membrana externa pura (antígeno 69 K).

(5) Preparação de Fímbria (Aglutinogênio (AGG))

Um tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0) contendo I M de cloreto de sódio foi adicionado ao resíduo deixado após a coleta da solução contendo 15 proteína de membrana externa em (4) acima em uma quantidade 1/10° da quantidade do sobrenadante, após o que a filtração foi efetuada, dando um filtrado contendo fímbria (antígeno filático). A solução resultante contendo fímbria foi concentrada com sulfato de amônio, então purificada por centrifugação em gradiente de densidade, fracionando desse modo fímbria 20 pura (antígeno FB).

(6) Preparação de Antígeno Protetor (Atenuação)

Uma solução contendo o antígeno PT, antígeno FHA, antígeno 69 KD e antígeno FB obtidos nas seções (2) até (5) acima misturados de tal modo que a vacina combinada DPT preparada no Exemplo 8 abaixo incluirá 25 níveis de antígeno de 1,89 μg de antígeno PT, 3,00 μg de antígeno FHA, 0,76 μg de antígeno 69K e 0,36 μg de antígeno FB por 0,5 mL de vacina foi preparada como uma solução de antígeno filático puro. Formalina (de 0,2 até 0,5 % de vol) e, se necessário, cloreto de lisina em uma concentração de não mais que 1% p/v foram adicionados à solução de antígeno filático puro, após o que a solução foi aquecida a 37 até 410C por pelo menos 7 dias para efetuar atenuação, dando desse modo uma solução de antígeno protetor de pertússis. Cloreto de lisina e formalina em excesso foram removidos por ultrafiltração, dando um material volumoso de antígeno protetor de pertússis.

Exemplo 6: Produção de Toxóide Diftérico

(1) Cultivo de Corynebacterium diphtheriae

C. diphtheriae (cepa Park-Williams No. 8) foi cultivada em meio de Loeffler a 32,0 até 34,00C por 5 dias.

(2) Preparação de Toxina Diftérica

Sulfato de amônio foi adicionado ao fluido de cultura obtido

em (1) acima, após o que o sobrenadante foi filtrado (tamanho de poro, 0,45 μηι). O filtrado resultante foi passado através de uma coluna por cromatografia em coluna hidrofóbica de fenil (solução equilibrada: solução de fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,5) contendo 1,25 M de sulfato de amônio). A 15 solução de toxina obtida desse modo foi passada através de uma coluna por cromatografia em coluna de troca iônica DEAE (solução equilibrada: tampão fosfato 0,01 M (pH 7,0)), então passada através de uma coluna por cromatografia em coluna de gel (solução equilibrada: tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) contendo 0,145 M de cloreto de sódio), fracionando desse modo a 20 toxina diftérica. ESta foi usada como uma solução de toxina pura.

(3) Conversão de Toxina Diftérica para Toxóide

Em seguida, cloreto de lisina foi adicionado à solução de toxina pura obtida em (2) acima em uma concentração de não mais que 1 % p/v, formalina foi adicionado em uma concentração de 0,3 % de vol e a solução foi aquecida a 38,0 até 40,00C por 21 dias, convertendo desse modo a toxina a toxóide.

(4) Preparação de Toxóide Diftérico

Após a conversão para toxóide em (3) acima, cloreto de lisina e formalina em excesso foram removidos por ultrafiltração, dando desse modo um toxóide diftérico. Exemplo 7: Produção de Toxóide de tétano

(1) Cultivo de Clostridium tetani

C. tetani (Harvard 47-A) foi cultivado em caldo de carne de fígado a 34,5°C até 36,5°C por 5 dias.

(2) Preparação de Toxina de tétano

Sulfato de amônio foi adicionado à cultura obtida em (1) acima em uma concentração de 1,25 M por litro da cultura. Em seguida, a cultura foi passada através de uma coluna por cromatografia em coluna hidrofóbica de fenil (solução equilibrada: fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,5) contendo 1,25 M de sulfato de amônio). A solução de toxina resultante foi passada através de uma coluna por cromatografia em coluna de troca iônica DEAE (solução equilibrada: tampão fosfato 0,01 M (pH 7,5)), após o que a solução foi passada através de uma coluna por cromatografia em coluna de gel (solução equilibrada: tampão fosfato 0,004 M (pH 7,0) contendo 0,145 M de cloreto de sódio), fracionando desse modo a toxina de tétano. Esta foi usada como uma solução de toxina pura.

(3) Conversão de Toxina de tétano para Toxóide

Em seguida, formalina foi adicionada à solução de toxina pura obtida em (2) acima em uma concentração de 0,3 % de vol, o pH foi corrigido para 7,0 e a solução foi aquecida a 39°C por 15 até 23 dias, convertendo desse modo a toxina a toxóide.

(4) Preparação de Toxóide de tétano

Após a conversão para toxóide em (3) acima, cloreto de lisina e formalina em excesso foram removidos por ultrafiltração, dando desse modo um toxóide de tétano.

Exemplo 8: Produção de Vacina Combinada

(i) Preparação de Vacina de Pólio Inativada Combinada

Os materiais volumosos de vacina de pólio inativado tipo I, vacina de pólio inativado tipo II vacina de pólio inativado tipo III obtidos nos Exemplo 2, 3 e 4 acima foram misturados com meio 199 (Ml99), 2- fenoxietanol (concentração final, 0,5% de vol) e cloreto de alumínio (concentração final, 0,09% de p/v) de tal modo a ajustar os níveis relativos

dos respectivos antígenos D a 3:100:100. A mistura resultante foi ajustada a um pH de 7 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, dando desse modo uma vacina de pólio inativada combinada.

(ii) Produção de Vacina Combinada de DPT Os materiais volumosos de antígeno protetor de B. pertussis, 10 toxóide diftérico e toxóide de tétano obtidos nos Exemplos 5, 6 e 7 acima foram misturados com meio 199 (Ml99), 2-fenoxietanol (concentração final, 0,5% de vol) e cloreto de alumínio (concentração final, 0,24% de p/v). A mistura resultante foi ajustada a um pH de 7 com hidróxido de sódio e ácido clorídrico, dando desse modo uma vacina DPT.

(iii) Produção de Vacina Combinada

A vacina de pólio inativada combinada obtida em (i) acima e a vacina combinada DPT obtida em (ii) acima foram misturadas em quantidades iguais, produzindo desse modo uma vacina combinada.

Exemplo 9: Estabilidade de Vacina Combinada A vacina combinada obtida no Exemplo 8 foi medida

efetuando-se um teste acelerado a 25°C. A estabilidade foi avaliada por testes de potência em cada um dos vírus.

(I) Teste de Potência de Vacina de pertússis Pura Precipitada Um espécime teste, uma vacina de pertússis padrão e B.

pertussis cepa 18323 foram usados. O espécime teste e a vacina padrão são diluídos cada um, diluições de cada a partir das quais em um total de pelo menos 3 diluições seriadas em intervalos adequados logaritmicamente iguais de 4 vezes ou mais são então preparadas. Um grupo de pelo menos dezesseis camundongos de 4 semanas de idade é usado para cada diluição. A cada animal são dados 0,5 mL de diluição como uma única injeção intraperitoneal. Vinte e um dias após as injeções imunes, 0,025 mL de uma suspensão celular bacteriana para desafio são injetados no cérebro de cada animal, após o que os animais são observados por 14 dias e o número de mortes é registrado. A 5 partir de tratamento estatístico e comparação dos resultados de teste, o espécime testado deve ter uma potência de pelo menos 8 unidades/mL.

(2) Teste de Potência de Toxóide Diftérico Precipitado

Um espécime teste, um toxóide diftérico precipitado controle e uma solução de toxina adequada são usados. A diluição do espécime teste e do controle é efetuada com composto salino fisiológico; a diluição da solução de toxina é efetuada com uma solução de tampão fosfato 0,017 M/cloreto de sódio (pH 7,0) contendo 0,2% p/v de gelatina. O espécime teste e o controle são diluídos cada um, criando diluições seriadas em intervalos logaritmicamente iguais. Usando um grupo de pelo menos dez camundongos de 5 semanas de idade para cada diluição do espécime teste e do controle, cada animal é injetado subcutaneamente com 0,5 mL. Quatro a seis semanas após as injeções imunes, sangue é extraído de cada animal e o título da antitoxina sanguínea é medido. A partir de tratamento estatístico e comparação dos resultados de teste, o espécime teste deve ter uma potência de pelo menos 47 unidades/mL.

(3) Teste de Potência de Toxóide de tétano Precipitado

Um espécime teste, um toxóide de tétano precipitado controle e uma solução de toxina adequada são usados. A diluição do espécime teste e do controle é efetuada com composto salino fisiológico; a diluição da solução 25 de toxina é efetuada com uma solução de tampão fosfato 0,017 M/cloreto de sódio (pH 7,0) contendo 0,2% p/v de gelatina. O espécime teste e o controle são diluídos cada um, criando diluições seriadas em intervalos logaritmicamente iguais. Usando um grupo de pelo menos dez camundongos de 5 semanas de idade para cada diluição do espécime teste e do controle, a cada animal é dada uma injeção subcutânea de 0,5 mL. Quatro a seis semanas após as injeções imunes, cada camundongo é desafiado com cerca de 100 LD50 de toxina e observado por 4 dias. A partir de tratamento estatístico e comparação dos resultados de teste, o espécime teste deve ter uma potência de 5 pelo menos 27 unidades/mL.

(4) Teste de Imunogenicidade de Rato

Um espécime teste, um controle para um teste de potência de IPV, soros padrões para cada tipo e cepas Sabin de poliovírus (tipos I, II e III) para desafios teste de neutralização são usados. O espécime teste e o controle 10 são diluídos cada um, criando diluições em intervalos logaritmicamente iguais. Um grupo de pelo menos dez ratas de 8 semanas de idade Wister é usado para cada diluição. Cada animal é inoculado intramuscularmente com

0,5 mL na região femoral da perna traseira. Vinte e um dias após a inoculação, sangue é extraído individualmente de cada animal e o soro é 15 coletado então aquecido a 56°C por 30 minutos. O soro de cada anima e o soro padrão são colocados em pelo menos dois poços para cada soro e diluídos serialmente 2 vezes com meio MEM. Além disso, os respectivos poços são inoculados em cerca de 100 CCID50 de suspensões de vírus neutralizantes dos respectivos tipos. Em seguida, todas as placas são 20 colocadas em um incubador de CO2 a 36±1°C por 3 horas, então deixadas reagir durante a noite em cerca de 4°C. Suspensão celular contendo IxlO4 células é adicionada no dia seguinte em cada poço e é cultivada em um incubador de CO2 a 36±1°C por 7 dias. Após a completude do cultivo, o CPE para cada poço é examinado, a taxa de diluição de soro no momento de 50% 25 de neutralização é calculada e a recíproca desta é tratada como o título de anticorpo neutralizante. A partir de tratamento estatístico e comparação dos resultados de teste, o espécime teste deve ter uma potência igual a ou maior que o controle.

Resultados para o teste acelerado são mostrados na Tabela 1. Lot 04C (Instituto de Pesquisa de Pólio do Japão) foi usado como o IPV controle.

Tabela 1

Especificação No início 1 2 3 do teste mês meses meses Vacina de pólio Maior ou igual a 1,7 1,7 1,5 2,1 inativada tipo I IPV controle Vacina de pólio Maior ou igual a 2,1 2,0 1,6 1,5 inativada tipo II IPV controle Vacina de pólio Maior ou igual a 20,3 12,3 5,9 6,0 inativada tipo III IPV controle Vacina de pertússis 8 unidades/mL 15,8 13,8 14,6 27,3 pura precipitada Toxóide diftérico 47 unidades/mL 97,9 109,3 85,9 102,9 precipitado Toxóide de tétano 27 unidades/mL 72,3 88,6 105,5 79,4 precipitado Exemplo 10: Cultivo de Célula Vero por Método de

Microcarreador e Cultivo de Poliovírus

(i) Cultivo de Célula Vero

Células que foram subcultivadas em uma cultura estática partindo de um banco de trabalho de células Vero (MWCB93) foram soltas com uma solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,25%, EDTA 0,14 M), então 10 centrifugadas a 600 rpm por 10 minutos e subseqüentemente postas em suspensão em um meio de crescimento celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) contendo 5 % de vol de soro de bezerro, 0,11% de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 0,1% de frutose, 20 μg/mL de eritromicina e 100 μg/mL de canamicina).

Um microcarreador (Cytodex 1 (nome comercial) foi

expandido em PBS (-), esterilizado em autoclave 1210C por 15 minutos, então substituído com meio de crescimento celular e usado.

Biorreatores Celligen Plus e Celligen fabricados por New Brunswick Scientific foram usados como aparatos de cultura. O microcarreador e a suspensão celular foram adicionados em um biorreator, após o que o meio de crescimento celular foi adicionado em um volume final de 4,8 L (no caso do biorreator Cellingen, 3,5 L) e o cultivo foi efetuado em uma temperatura de 37,00C, uma concentração de oxigênio dissolvido (DO) de 15%, um pH de 7,15 e uma velocidade de rotação de 35 até 50 rpm. Troca de meio usando meio de crescimento celular que têm um NaHCO3 na 5 concentração de 0,15% como o meio de troca foi efetuada continuamente a partir do dia 2 de cultivo em uma taxa de cerca de 4L/dia (no caso do biorreator Cellingen, a quantidade inteira de meio foi traçada uma vez dia, sim dia não). A contagem de células foi medida usando um contador Coulter (nome comercial).

Os resultados de cultivo de células são mostrados na FIG. 1

(biorreatores Cellingen foram usados apenas nos testes 3H). Em uma concentração de carreador de 3 g/L, a contagem de células atingiu um máximo no dia 7 em um número de células de partida de baixa concentração (3L, cerca de 2x105 células, mL) e atingiu um máximo no dia 8 em um 15 número de células de partida de alta concentração (3H, cerca de IOxlO5 células, mL), após o que ela diminuiu. Em uma concentração de carreador de 5 g/L, a contagem de células aumentou por um período de 11 dias em um número de células de partida de baixa concentração (5L, cerca de 2x105 células, mL), mas a contagem de células diminuiu no dia 12. No caso de um 20 número de células de partida de baixa concentração, a contagem de células total em uma concentração de carreador de 5 g/L foi maior no dia 10 que a contagem de células total em um nível de carreador de 3 g/L, mas a diferença não foi grande. Em uma concentração de carreador de 5 g/L e um número de células de partida de alta concentração (5H, cerca de IOxlO5 células, mL), a 25 contagem de células ainda estava crescendo no dia 9, com a contagem de células neste ponto sendo de cerca de 2,8x106 células/mL, representando um aumento de cerca de 2,7 vezes o número de células de partida.

(ii) Cultivo de Poliovírus

Um poliovírus tipo I (IS-90C) foi usado como o vírus semente. No dia final de medidas de contagem de células, as células foram lavadas com um volume de 4 vezes (baseado na capacidade de cultivo do biorreator) de EBSS contendo 0,075% de NaHCO3. O vírus semente foi então diluído em 1 litro de meio M-199 (E) contendo 0,3% de NaHCO3, 20 μg/mL de 5 eritromicina e 100 μg/mL de canamicina (meio de crescimento viral). A diluição de vírus resultante foi então inoculada nas células lavadas e o meio de cultura de vírus foi adicionado às capacidades de cultivo dos respectivos biorreatores. O cultivo de vírus foi efetuado em uma temperatura de cultura de 33,3°C, 15% de oxigênio dissolvido (DO), um pH de 7,40 e uma 10 velocidade de rotação de 35 até 50 rpm. O cultivo de vírus foi interrompido quando as células tinham se soltado completamente do microcarreador devido aos efeitos citopáticos (CPE) dos vírus, ponto em que o fluido viral foi recuperado. O fluido viral recuperado foi crioconservado a -80°C.

Neste teste, cultivo de vírus foi iniciado no dia final de medição das respectivas curvas de crescimento celular mostradas na FIG. 1.

A medição do título viral foi efetuada como se segue. Células GMK-2 cultivadas por 3 dias em um tubo rolante foram lavadas duas vezes com I mL de HBSS contendo 0,075% de NaHCO3, 200 u/mL de penicilina e 200 μg/mL de estreptomicina, após o que 1 mL de um fluido de manutenção 20 celular (meio M-199 contendo 0,1% de albumina sérica bovina, 0,225% de NaHCO3, 200 u/mL de penicilina e 200 μg/mL de estreptomicina) foi adicionado. O fluido viral teste foi diluído serialmente 0,5 Iogi0 com o fluido

"7 OC

de manutenção celular e 0,2 mL de 10' até 10" ’ de fluido viral por tubo foram inoculados em 5 tubos em cada nível de diluição. Após a inoculação, o 25 cultivo foi efetuado por 7 dias em um incubador a 36°C. O título de infectividade (CCID50/0,2mL) foi computado pelo método de Reed & Muench baseado em um julgamento da observação dos efeitos citopáticos (CPE) no dia 7.

A FIG. 2 mostra os títulos de infectividade (títulos de vírus) do poliovírus tipo I obtido nas células Vero cultivadas sob várias condições. Como resultado de cultivo viral, o título de infectividade mais alto foi obtido no sistema que tem uma concentração de carreador de 5 g/L e um número de células de partida de alta concentração (5H); este sistema atingiu uma 5 densidade celular no dia 9 de 2,8x106 células/mL. Os sistemas, arranjados de acordo com o tamanho dos títulos de infectividade destes na ordem descendente, foram 5H, 5L e 3L. Esses resultados estavam em concordância com as contagens de células totais. Além disso, comparado com o fluido viral obtido por cultivo em células de rim de macaco verde como controle, um 10 título de infectividade mais de 10 vezes maior foi obtido no sistema 5H. Os títulos virais mostrados na FIG. 2 (Iogi0 CCID5o/0,2mL) foram 8,18 no sistema 3L, 8,51 no sistema 5L, 8,59 no sistema 5H e 7,50 em Ref. (controle).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL Cepas Sabin de alta potência de poliovírus podem ser obtidas por cultivo, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, células Vero inoculadas com poliovírus de cepa Sabin. Poliovírus de cepa Sabin inativados podem ser eficientemente produzidos pelo uso de poliovírus de cepa Sabin de alta potência. Portanto, um processo para produzir uma vacina combinada que inclui a etapa de cultivar, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de microcarreador, células Vero inoculadas com poliovírus de cepa Sabin (o processo de produção da presente invenção) é útil como um processo para produzir eficientemente vacinas combinadas contendo poliovírus de cepa Sabin inativadas. Além disso, devido à vacina combinada da presente invenção ser capaz de suprimir eficazmente o início de pólio, pertússis, difteria e tétano, ela é útil como uma vacina para pólio, pertússis, difteria e tétano.

Claims (11)

1. Processo para produzir uma vacina combinada, contendo: (A) uma cepa Sabin inativada de poliovírus, (B) um antígeno protetor de Bordetella pertússis, (C) um toxóide diftérico e (D) um toxóide de tétano, caracterizado pelo fato de compreender (a) uma etapa de cultivar, na presença de cerca de 4 g/L até cerca de 6 g/L de um microcarreador, células Vero a serem inoculadas com uma cepa Sabin de poliovírus.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente: (b) uma etapa de infectar as células Vero com uma cepa Sabin de poliovírus; (c) uma etapa de permitir que o poliovírus prolifere; (d) uma etapa de recuperar um fluido viral contendo o poliovírus; e (e) uma etapa de inativar o poliovírus.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microcarreador tem uma concentração de cerca de 4,5 g/L até cerca de 5,5 g/L.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microcarreador tem uma concentração de cerca de 5 g/L.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microcarreador é um microcarreador de dextrano.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar a célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos cerca de 3 litros.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar a célula Vero (etapa (a)) é executada em uma escala de pelo menos cerca de 30 litros.

8. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente: (d-2) uma etapa de purificar o fluido viral.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação (etapa (d-2)) compreende: (i) formar o fluido viral recuperado na etapa (d) em um grânulo por ultracentrifugação; (ii) sonicar uma ressuspensão do grânulo; e (iii) purificar por cromatografia em coluna.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a purificação por cromatografia em coluna (iii) é executada apenas uma vez.

11. Vacina, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo processo como definido na reivindicação 1.