BRPI0717510B1 - análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada e composição farmacêutica que os compreende - Google Patents

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Abstract

ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO CPG CONTENDO ANÁLOGOS T HIDROFÓBICOS COM ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA INTENSIFICADA. A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos incluindo pelo menos um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico e dinucleotídeo de pirimidina-purina. A invenção também refere-se a composições farmacêuticas e a métodos de uso das mesmas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se, de modo geral, ao campo de imunologia. Mais especificamente, a invenção refere-se a oligonucle- otídeos terapêuticos com capacidade imunoestimulatória intensificada.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] DNA bacteriano tem efeitos estimulatórios imunes para ativar células B e células assassinas naturais, mas DNA de vertebrado não (Tokunaga, T. et. al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T. et. al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P. et. al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; e revisto em Krieg, 1998, Em: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein e A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, páginas 431-448). Agora, entende-se que esses efeitos estimulatórios imunes do DNA bacteriano são um resultado da presença de dinucleotídeos CpG não-metilados, em particular contextos de base (motivos CpG), os quais são comuns em DNA bactériano, mas metilados e sub-representados em DNA de vertebrado (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321: 1-10). Os efeitos estimulatórios imunes do DNA bacteriano podem ser imitados com oligodesoxinucleotídeos sintéticos (ODN) contendo esses motivos CpG. Tal ODN de CpG tem efeitos altamente estimulatórios sobre leucócitos humanos e de murino, induzindo à proliferação de células B; secreção de citocina e imunoglobulina; atividade lítica de células assassinas naturais (NK) e secreção de IFN-Y; e ativação de células dendríticas (DCs) e outras células que apresentam antígeno para expressar moléculas coestimulatórias e secretar citocinas, especialmente as citocinas Do tipo Th1 que são importantes na promoção do desenvolvimento de respostas de células T Do tipo Th1. Esses efeitos estimulatórios imunes do ODN de CpG com parte principal de fosfodiéster nativa são altamente específicos ao CpG pelo fato de que os efeitos são dramaticamente reduzidos se o motivo CpG é metilado, alterado para GpC ou de outro modo eliminado ou alterado (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann et. al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10).
[0003] Em estudos anteriores, acreditava-se que o motivo de CpH estimulatório imune seguia a fórmula purina-purina-CpG-pirimidina- pirimidina (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et. al., 1998 EMBO J. 17: 6230-6240; Lipford et. al., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Contudo, agora está claro que linfócitos de camundongo respondem muito bem aos motivos CpG de fosfodiéster que não seguem essa "fórmula" (Yi et. al., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906) e o mesmo é verdadeiro para células B humanas e células dendríticas (Hartmann et. al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).
[0004] Várias classes diferentes de ácidos nucleicos de CpG foram recentemente descritas. Uma classe é potente para ativação de células B, mas é relativamente fraca na indução de IFN-Y e ativação de células NK; essa classe foi denominada classe B. Ácidos nucleicos de CpG da classe B são, tipicamente, totalmente estabilizados e incluem um dinucleotídeo de CpG não-metilado dentro de determinados contextos de base preferidos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Outra classe de ácidos nucleicos de CpG ativa células B e células NK e induz ao IFN-Y; essa classe foi denominada a classe C. Os ácidos nucleicos de CpG da classe C, conforme primeiro caracterizado, são, tipicamente, totalmente estabilizados, incluem uma sequência do tipo classe B e um palindroma rico em GC ou palindroma semelhante. Essa classe foi descrita no pedido de patente provisório US copendente 60/313.273, depositado em 17 de Agosto de 2001 e US10/224.523 depositado em 19 de Agosto de 2002 e Pedido de Patente PCT relacionado PCT/US02/26468 publicado sob o Número de Publicação Internacional WO 03/015711.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A invenção refere-se a um oligonucleotídeo o qual compre ende uma ou mais modificações que estimulam capacidade imunoes- timulatória intensificada. Em particular, a invenção é baseada na descoberta de que subclasses específicas de oligonucleotídeos tendo pelo menos um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico são altamente eficazes em mediação de resposta imune. Esses oligonucleotídeos são úteis terapêutica e profilaticamente para indução de uma resposta imune e para tratamento de doenças e distúrbios, tais como câncer e infecções virais.
[0006] Em um aspecto, a invenção é uma composição compre endendo a sequência: R1YZR2, em que R1 e R2 representam um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L), um nucleotídeo e uma ligação, em que pelo menos um de R1 e R2 é um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L), em que Y é um nucleotídeo de pirimidina e em que Z é um resíduo de purina, uma pirimidina ou um resíduo abásico.
[0007] Em algumas modalidades, L compreende um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos.
[0008] Em outras modalidades do aspecto da invenção, L é um grupo de fórmula I.
Figure img0001
[0009] tendo os seguintes elementos: A, B, X, D, E e F são C (carbono) ou N (nitrogênio) opcionalmente trazendo hidrogênio ou um substituinte; n é 0 ou 1; as linhas pontilhadas indicam ligações duplas opcionais; em que pelo menos um substituinte não é escolhido do grupo consistindo em oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino, metila e hidrogênio e que o total de átomos A, B, X, D, E e F não é mais do que 3 nitrogênios (N). Em alguns casos, n é 1 e, em outros casos, n é 0. Em algumas modalidades, todos os átomos A, B, X, D, E, F são carbono (C). Em algumas modalidades, um, dois ou três dos átomos A, B, X, D, E, F são nitrogênio (N). De acordo com algumas modalidades, pelo menos um dos átomos A, B, X, D, E, F é substituído por um dos seguintes: F, Cl, Br, I, alquila, alquenila, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O-alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, - SO-alquila, -SO2-alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila, oxo, tio, hidróxi, mercapto e imino, em que pelo menos um substituinte não é oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino ou metila.
[00010] De acordo com ainda outras modalidades, um dos dois átomos A ou E é substituído por um dos seguintes: F, Cl, Br, I, C2-C6- alquila, alquenila, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O-alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, -SO-alquila, -SO2-alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila ou metila contanto que, se metila, então, A, B, X, D, E e F são todos C.
[00011] Em algumas modalidades, a fórmula I compreende uma pirimidina substituída, uracila, tolueno, imidazol ou pirazol ou azola. De acordo com outras modalidades, a fórmula I é selecionada do seguinte: 5-cloro-uracila, 5-bromo-uracila, 5-iodo-uracila, 5-etil-uracila, 5-propil- uracila, 5-proinil-uracila, (E)-5-(2-bromovinil)-uracila e 2,4-difluoro- tolueno. De acordo com uma modalidade da invenção, a fórmula I é fundida com um sistema de anel alifático ou aromático de 3 a 6 elementos. De acordo com outras modalidades, a fórmula I é ligada a uma porção de anticorpo com 5 a 6 elementos, incluindo uma pentose ou hexose. Em alguns casos, a pentose é furanose e hexose é uma piranose, a qual pode ser opcionalmente substituída por F, amino, alcóxi, alcóxi-etóxi, aminopropila, alquenila, alquinila ou uma ligação em ponte de O2,C4-alquileno. Em outros casos, a furanose é ribose ou desoxirribose.
[00012] De acordo com algumas modalidades da invenção, R1 e R2 são ambos L. Em algumas modalidades, R1 é L e R2 é um nucleotídeo. Alternativamente, em alguns casos R1 é um L e R2 é uma ligação, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R1CG 3’. Outras modalidades incluem oligonucleotídeos em que R1 é L e R2 é uma ligação e em que R3 é 5’ a R1YZ, de modo o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R3R1YZ 3’. Em algumas modalidades, R1 é L e R2 é uma ligação e em que um segundo R1 é 5’ a R1YZ espaçado por um nucleotídeo N, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R1NR1YZ 3’. Em alguns casos, o oligonucleotídeo pode incluir dois motivos 5’ R1NR1YZ 3’.
[00013] De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui Y, que é uma das seguintes pirimidinas: citocina, 5-metil-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-halogeno-citosina, 2- tiocitosina, 4-tiocitosina, N3-metil-citosina, N4-alquil-citosina ou uma citosina 6-substituída.
[00014] De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui Z, que é um nucleotídeo de purina incluindo: guanina, 7-deaza- guanina, hipoxantina, 7-deaza-hipoxantina, 2-amino-purina, 4-tio- purina, 2.6-diamino-purina, 8-oxo-7.8-di-hidroguanina, 7-tia-8-oxo-7.8- di-hidroguanina, 7-alil-8-oxo-7.8-di-hidroguanina, 7-deaza-8-aza-guani- na, 8-aza-guanina, N1-metil-guanina ou purina. Em outras modalidades, Z é um nucleotídeo de pirimidina, incluindo T.
[00015] De acordo com algumas modalidades da invenção, R2 é L e R1 é um nucleotídeo.
[00016] De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo tem entre 3-100 nucleotídeos de comprimento; por exemplo, o oligonucleotídeo tem 3-6 nucleotídeos de comprimento, 3-100 nucleotí- deos de comprimento ou 7-100 nucleotídeos de comprimento. Em algumas circunstâncias, o oligonucleotídeo é rico em T, de modo que pelo menos 80% dos nucleotídeos são T.
[00017] A invenção inclui modalidades compreendendo pelo menos uma sequência palindrômica. Por exemplo, em alguns casos, o oligonucleotídeo inclui duas sequências palindrômicas.
[00018] De acordo com a invenção, algumas modalidades incluem um a quatro dinucleotídeos de CG não-metilados. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode incluir pelo menos uma sequência (G)m, em que m é 4 a 10. Em alguns casos, pelo menos um, mas até todos os dinucleotídeos de CG são não-metilados. De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode, adicionalmente, compreender uma modificação de não nucleotídeo. As modificações de não nucleotídeo incluem, mas não estão limitadas a: C6-C48-polietile- noglicol, C3-C20-alcano-diol, ligante de C3-C18-alquilamino, ligante de C3- C18-alquiltiol, colesterol, ácido biliar, ácido graxo saturado ou insaturado, folato, um hexadecil-glicerol ou um grupo di-hexadecil-glicerol, um octadecil-glicerol ou um grupo dioctadecil-glicerol, um grupo vitamina E. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo da invenção ainda compreende uma porção ramificada não-nucleotídica ou uma porção ramificada nucleotídica. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui uma porção ramificada em que o oligonucleotídeo tem pelo menos duas extremidades 5'.
[00019] De acordo com a invenção, algumas modalidades incluem pelo menos dois nucleotídeos do oligonucleotídeo têm uma ligação estabilizada, incluindo: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosfonotioato boranofosfonato, fosforamidato ou uma ligação defosfo, quer como uma mistura enantiomérica ou configuração S ou R enantiomérica.
[00020] Em algumas modalidades, o YZ de R1YZR2 tem uma ligação de fosfodiéster ou uma ligação de fosforotioato. Em alguns casos, o R1Y e ou o ZR2 de R1YZR2 tem uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, todos os outros nucleotídeos têm uma ligação de fosforotioato.
[00021] De acordo com algumas modalidades da invenção, o oligonucleotídeo é isento de um microveículo, incluindo um veículo lipídico.
[00022] De acordo com a invenção, os oligonucleotídeos podem ser um oligonucleotídeo da classe A, um oligonucleotídeo da classe B, um oligonucleotídeo da classe C, um oligonucleotídeo da classe P ou um oligonucleotídeo da classe T. Para o oligonucleotídeo de classe B da invenção, algumas modalidades incluem a sequência 5' TCN1TX1X2CGX3X4 3', em que X1 é G ou A; X2 é T, G , ou A; X3 é T ou C e X4 é T ou C; e N é qualquer nucleotídeo e N1 e N2 são sequências de ácido nucleico de cerca de 0-25 N’s cada.
[00023] De acordo com algumas modalidades da invenção, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação 3’-3’ e/ou pelo menos uma ligação 5’-5’.
[00024] Em outro aspecto, a invenção é uma composição dos oligonucleotídeos descritos aqui em combinação com um antígeno ou outro composto terapêutico, tal como um agente antimicrobiano. O agente antimicrobiano pode ser, por exemplo, um agente antiviral, um agente antiparasítico, um agente antibacteriano ou um agente antifúngico.
[00025] Uma composição de um dispositivo com liberação sustentada incluindo os oligonucleotídeos descritos aqui é proporcionada de acordo com outro aspecto da invenção.
[00026] A composição pode, opcionalmente, incluir um veículo farmacêutico e/ou ser formulada em um dispositivo de distribuição. Em algumas modalidades, o dispositivo de distribuição é selecionado do grupo consistindo em lipídios catiônicos, proteínas de permeação celular e dispositivos com liberação sustentada. Em uma modalidade, o dispositivo com liberação sustentada é um polímero biodegradável ou uma micropartícula.
[00027] De acordo com outro aspecto da invenção, um método de estimulação de uma resposta imune é proporcionado. O método envolve administração de um oligonucleotídeo a um indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir a uma resposta imune no indivíduo. De preferência, o oligonucleotídeo é administrado oralmente, localmente, em um dispositivo com liberação sustentada, mucosalmente, sistêmicamente, parenteralmente ou intramuscularmente. Quando o oligonucleotídeo é administrado à superfície mucosal, ele pode ser distribuído em uma quantidade eficaz para induzir a uma resposta imune mucosal ou uma resposta imune sistêmica. Em modalidades preferidas, a superfície mucosal é selecionada do grupo consistindo em uma superfície oral, nasal, retal, vaginal e ocular.
[00028] Em algumas modalidades, o método inclui exposição do indivíduo a um antígeno, em que a resposta imune é uma resposta imune antígeno-específica. Em algumas modalidades, o antígeno é selecionado do grupo consistindo em um antígeno tumorígeno, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um antígeno parasítico e um antígeno peptídico.
[00029] Os oligonucleotídeos são úteis para tratamento de câncer em um indivíduo tendo câncer ou em um indivíduo em risco de desenvolver câncer (por exemplo, redução do risco de desenvolver câncer). O câncer pode ser selecionado do grupo consistindo em câncer do trato biliar, câncer de mama, câncer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer endometrial, câncer gástrico, neoplasmas intraepiteliais, linfomas, câncer de fígado, câncer de pulmão (por exemplo, células pequenas e células não-pequenas), melanoma, neuroblastomas, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, sarcomas, câncer da tiróide e câncer renal, bem como outros carcinomas e sarcomas. Em algumas modalidades importantes, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer ósseo, câncer de cérebro e CNS, câncer de tecido conectivo, câncer esofageal, câncer de olho, linfoma de Hodgkin, câncer de laringe, câncer de cavidade oral, câncer de pele e câncer testicular.
[00030] Os oligonucleotídeos podem também ser usados para aumento da responsividade de uma célula cancerígena a uma terapia para o câncer (por exemplo, uma terapia anticâncer), opcionalmente quando o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG é administrado em conjunto com uma terapia anticâncer. A terapia anticâncer pode ser uma quimioterapia, uma vacina (por exemplo, uma vacina de célula dendrítica produzida in vitro ou uma vacina de antígeno cancerígeno) ou uma terapia baseada em anticorpo. Essa última terapia pode também envolver administração de um anticorpo específico para um antígeno na superfície celular, por exemplo, de uma célula cancerígena, em que a resposta imune resulta em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Em uma modalidade, o anticorpo pode ser selecionado do grupo consistindo em Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC- Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, antiVEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA.
[00031] Assim, de acordo com alguns aspectos da invenção, a um indivíduo tendo câncer ou em risco de ter um câncer é administrado um oligonucleotídeo e uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a terapia anticâncer é selecionada do grupo consistindo em um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico e uma vacina contra o câncer.
[00032] A invenção, em outros aspectos, refere-se a métodos para prevenção de doenças em um indivíduo. O método envolve administração, ao indivíduo, de um oligonucleotídeo em uma base regular para promover a responsividade do sistema imune para prevenir doença no indivíduo. Exemplos de doenças ou condições podem ser prevenidas usando os métodos profiláticos da invenção incluem infecções microbianas (por exemplo, doenças sexualmente transmissíveis) e choque anafilático por alergias alimentares.
[00033] Em outros aspectos da invenção, um método para tratamento de uma infecção viral ou retroviral é proporcionado. O método envolve administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção viral ou retroviral, de uma quantidade eficaz para tratamento da infecção viral ou retroviral de qualquer uma das composições da invenção. Em algumas modalidades, o vírus é causado por um vírus da hepatite, por exemplo, hepatite B, hepatite C, HIV, vírus do herpes ou papilomavírus.
[00034] Um método para tratamento de uma infecção bacteriana é proporcionada de acordo com outro aspecto da invenção. O método envolve administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção bacteriana, de uma quantidade eficaz para tratamento da infecção bacteriana de qualquer uma das composições da invenção. Em uma modalidade, a infecção bacteriana é em virtude de uma bactéria intracelular.
[00035] Em outro aspecto, a invenção é um método para tratamento de uma infecção parasítica através de administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção parasítica, de uma quantidade eficaz para tratamento da infecção parasítica de qualquer uma das composições da invenção. Em uma modalidade, a infecção parasítica é em virtude de infecção de qualquer uma das composições da invenção. Em uma modalidade, a infecção parasítica é em virtude de um parasita intracelular. Em outra modalidade, a infecção parasítica é em virtude de um parasita não-helmíntico.
[00036] Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano e, em outras modalidades, o indivíduo é um vertebrado não-humano selecionado do grupo consistindo em um cão, um gato, cavalo, vaca, porco, peru, cabra, peixe, macaco, galinha, rato, camundongo e ovelha.
[00037] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratamento de doença auto-imune através de administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma doença autoimune, de uma quantidade eficaz para tratamento ou prevenção da doença autoimune de qualquer uma das composições da invenção.
[00038] A invenção, em alguns aspectos, é um método para tratamento de remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia compreendendo: administração, a um indivíduo, de qualquer uma das composições da invenção, em uma quantidade eficaz para tratamento ou prevenção da doença autoimune de qualquer uma das composições da invenção.
[00039] A invenção, em alguns aspectos, é um método para tratamento de remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia compreendendo: administração, a um indivíduo, de qualquer uma das composições da invenção, em uma quantidade eficaz para tratar remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia no indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo tem asma, doença pulmonar obstrutiva crônica ou é um fumante. Em outras modalidades, o indivíduo não tem sintomas de asma.
[00040] Uso de um oligonucleotídeo da invenção para estimulação de uma resposta imune é também proporcionado como um aspecto da invenção.
[00041] Um método para fabricação de um medicamento de um oligonucleotídeo da invenção para estimulação de uma resposta imune é também proporcionado.
[00042] Cada uma das limitações da invenção pode abranger várias modalidades da invenção. Portanto, é previsto que cada uma das limitações da invenção envolvendo qualquer elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção. A presente invenção não está limitada quanto à sua aplicação aos detalhes de construção e à disposição dos componentes apresentados na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou ser realizada de várias formas. Também, a fraseologia e terminologia usadas aqui são para fins de descrição e não deverão ser consideradas como limitativas. O uso de "incluindo", "compreendendo" ou "tendo", "contendo", "envolvendo" e variações dos mesmos aqui se destina a abranger os itens listados aqui depois e equivalentes dos mesmos, bem como itens adicionais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00043] A figura 1 são dois desenhos ilustrando a estrutura das bases modificadas da invenção. A figura 1a mostra uma seção de um motivo de hexâmero de CpG (GTCGTT). A figura 1b mostra os análogos de formato hidrofóbico incorporados de 2’-deoxitimidina: 2,4-Difluoro- tolueno (FF), 5-bromouridina (BU) e 5-iodouridina (JU).
[00044] A figura 2 é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio de luciferase com oligonucleotídeo da classe B (ODN) modificados com análogo em formato de timina 2,4-difluorotolueno (FF). A atividade do ODN FF-modificado (SEQ ID NO: 3-9) foi comparada àquela da sequência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), sequência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9- LUC-293 foram estimuladas com quantidades indicadas de ODN e a estimulação de NF-KB foi determinada através de medição da atividade de luciferase 16h depois. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativo.
[00045] A figura 3 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN da classe B modificado. Timidina (T) foi substituída por 5-bromo-2’-desoxiuridina (BU) (SEQ ID NO: 10-12) e 5- iodo-2’-desoxiuridina (JU) (SEQ ID NO: 13-15). Sua atividade foi comparada àquela da sequência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), sequência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9-LUC-293 foram estimuladas com quantidades indicadas de ODN e a estimulação de NF-kB foi determinada através de medição da atividade de luciferase 16h depois. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativo.
[00046] A figura 4 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN da classe B modificado. 2’-deoxitimidina (T) foi substituída por 2’-desoxiuridina (U) (SEQ ID NO: 16-18). A atividade do ODN U-modificado foi comparada àquela da sequência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), sequência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não- modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9-LUC-293 foram estimuladas com as quantidades indicadas de ODN e a estimulação de NF-kB foi determinada através de medição da atividade de luciferase 16h depois. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00047] A figura 5 são dois gráficos demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase e um ensaio com PBMC com ODN da classe B modificado. A atividade relativa de um ODN com 5-Etil-2’-desoxiuridina (EU) (SEQ ID NO: 42), 2’-desoxiuridina (U) (SEQ ID NO: 16), 5-iodo-2’- desoxiuridina (JU) (SEQ ID NO: 13), 5-bromo-2’-desoxiuridina (BU) (SEQ ID NO: 10) e 5-Cloro-2’-desoxiuridina (CU) (SEQ ID NO: 41) foi comparada àquela da sequência precursora (SEQ ID NO: 1). A figura 5a mostra a atividade de TLR9 e a figura 5b mostra a produção de IFN- alfa. É mostrada a média +/- SEM de três doadores. Os eixos x são a concentração de ODN em μM e os eixos y são o índice de estimulação relativa (figura 5a) ou a concentração de IFN-alfa em pg/ml (figura 5b).
[00048] A figura 6 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN EU-modificado. A atividade do ODN EU- modificado SEQ ID NO: 29, 30 e 42 foi comparada àquela da sequência precursora (SEQ ID NO: 1) e outro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). O eixo x é a concentração de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00049] A figura 7 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN da classe B modificado. A atividade de SEQ ID NO: 19-24 JU-modificado foi comparada àquela da sequência precursora SEQ ID NO: 37. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00050] A figura 8 são dois gráficos demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase e um ensaio com PBMC com um ODN da classe A modificado. A atividade de SEQ ID NO: 35-37 JU-modificado foi comparada àquela da sequência precursora não-modificada (SEQ ID NO: 43) e com o ODN da classe B não-modificado SEQ ID NO: 1. A figura 8a mostra a atividade de TLR9 e a figura 8b mostra a produção de IFN-alfa. É mostrada a média +/- SEM de três doadores. Os eixos x são a concentração log de ODN (figura 8a) ou a concentração de ODN (figura 8b) em μM e os eixos y são o índice de estimulação relativa (figura 8a) ou a concentração de IFN-alfa em pg/ml (figura 8b).
[00051] A figura 9 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN da classe C modificado. A atividade do ODN da classe C JU-modificado SEQ ID NO: 27-28 e 44-45 foi comparada àquela da sequência precursora não-modificada SEQ ID NO: 45 e um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00052] A figura 10 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com um ODN da classe P modificado. A atividade de SEQ ID NO: 31-33 JU-modificado foi comparado àquela da sequência precursora não-modificada (SEQ ID NO: 52). O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00053] A figura 11 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN da classe T modificado. A atividade de SEQ ID NO: 47-50 JU-modificado e SEQ ID NO: 51 U-modificado foi comparada àquela da sequência precursora não-modificada SEQ ID NO: 25. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00054] A figura 12 é um gráfico demonstrando os resultados de um ensaio de luciferase com ODN curto. A atividade do ODN curto JU- modificado SEQ ID NO: 39-40 foi comparada àquela da sequência precursora não-modificada SEQ ID NO: 38 e com o ODN da classe B SEQ ID NO: 37. Os ODNs foram formulados com e sem DOTAP. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00055] A figura 13 são quatro gráficos mostrando os resultados de um ensaio ELISA que mede a concentração de citocina em sobrenadantes de cultura de esplenócitos onde esplenócitos de camundongo BALB/c foram cultivados com diferentes ODNs. Os sobrenadantes de cultura foram coletados a 6 horas (para TNF-alfa) ou 24 horas (para IL-6, IL-10 e IL-12). As atividades de um ODN da classe B JU-modificado (SEQ ID NO: 13), um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de controle negativo de não-CpG (SEQ ID NO: 26) foram comparadas. As figuras 13a-d mostram a concentração de TNF-alfa, IL-6, IL-10 e IL-12, respectivamente. Os eixos x são a concentração de ODN em μg/ml e os eixos y são a concentração de citocina em pg/ml.
[00056] A figura 14 é um gráfico mostrando os resultados de análise por FACS de proliferação de células B. esplenócitos de camundongo BALB/c corados com CFSE (4 x 105/cavidade) foram incubados com 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 μg/ml de ODN. A 72 horas pós- incubação, as células foram coradas para CD19 e a proliferação de células B foi determinada através de FACS, seguido por análise através do software ModFit. As atividades de um ODN da classe B JU- modificado (SEQ ID NO: 13), um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de controle negativo de não-CpG (SEQ ID NO: 26) foram comparadas. O eixo x é a concentração de ODN em μg/ml e o eixo y é a proliferação relativa de células B.
[00057] A figura 15 são dois gráficos mostrando a produção de citocina in vivo, conforme medido através de ELISA. Camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados SC com 10, 50 ou 100 μg de ODN. O grupo de controle recebeu 100 μl de PBS apenas. O sangue dos animais foi coletado através de punção cardíaca em 1 hora (para TNF- alfa) ou 3 horas (para IP-10) pós-injeção e o plasma avaliado com relação ao TNF-alfa e IP-10 através de ELISA. As atividades de um ODN da classe B JU-modificado (SEQ ID NO: 13) e um ODN da classe B não-modificado ODN (SEQ ID NO: 37) foram comparadas. A figura 15a mostra a concentração de TNF-alfa e a figura 15b mostra a concentração de IP-10. Os eixos x são a dose de ODN em μg e os eixos y são a concentração de citocina em pg/ml.
[00058] A figura 16 é um gráfico mostrando a ativação de NF-KB TLR9-mediada por ODN da classe B com uma base universal (6- nitrobenzimidazol) (SEQ ID NO: 178) em lugar de timidina na sequência precursora (SEQ ID NO: 1). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF- kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00059] A figura 17 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB TLR9-mediada por ODN da classe B com 5-(2-bromovinil)-uridina (SEQ ID NO: 153 e 154) em lugar de timina na sequência precursora (SEQ ID NO: 1). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00060] A figura 18 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB TLR9-mediada por ODN da classe B com uma modificação de açúcar (2’-O-metilguanosina) além de um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 111-113). A atividade desse ODN foi comparada àquela da sequência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma sequência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00061] A figura 19 é um gráfico mostrando a ativação de NF-KB TLR9-mediada através de ODN da classe B ramificado com múltiplas extremidades 5’ acessíveis. A atividade do ODN ramificado (SEQ ID NO: 96, 97, 101 e 102) foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1. Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00062] A figura 20 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB TLR9-mediada através de um ODN da classe B não-modificado curto (SEQ ID NO: 38) e um ODN da mesma sequência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico e uma tag 3’ lipofílica (SEQ ID NO: 126). Ambos foram formulados com e sem DOTAP. Células hTLR9- LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00063] A figura 21 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB TLR9-mediada por dois ODN's da classe B com 5-proinil-dU (SEQ ID NO: 116 e 117) em lugar de timina da sequência precursora (SEQ ID NO: 1). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00064] A figura 22 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB hTLR9-mediada por ODN da classe B com um segundo análogo de nucleotídeo além de um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 138, 7-deaza-dG; SEQ ID NO: 139, inosina; SEQ ID NO: 140, 5-metil-dC). A atividade desse ODN foi comparada àquela da sequência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma sequência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-KB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00065] A figura 23 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB hTLR9-mediada por ODN da classe T com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 132-134). A atividade do mesmo foi comparada àquela de um ODN da classe C imunoestimulatório (SEQ ID NO: 198). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00066] A figura 24 são dois gráficos mostrando a ativação de NF-kB hTLR9-mediada por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-63). A figura 24a mostra a atividade de SEQ ID NO: 58-61 comparado àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). A figura 24b mostra a atividade de SEQ ID NO: 62-63 comparado àquela dos mesmos controles positivos e negativos. Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração log de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00067] A figura 25 é um gráfico mostrando a ativação de NF-kB hTLR9-mediada por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 64, 66-67). A atividade do mesmo é comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não- modificado (SEQ ID NO: 57). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-KB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é log da concentração de ODN em μM e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
[00068] A figura 26 são dois gráficos mostrando a indução de IFN-α por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-63). A figura 26a mostra a atividade de SEQ ID NO: 58-61 comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). A figura 26b mostra a atividade de SEQ ID NO: 62-63 comparada àquela dos mesmos controles positivos e negativos. PBMC's humanas foram incubadas com o ODN indicado durante 48 horas. IFN-α foi, então, determinado nos sobrenadantes de cultura de célula através de ELISA. Os eixos x são a concentração de ODN em μM e os eixos y são a concentração de IFN-α em pg/ml.
[00069] A figura 27 é um gráfico mostrando a indução de IFN-α por um ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 64, 66-67). A atividade do mesmo é comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57). PBMC's humanas foram incubadas com o ODN indicado durante 48 horas. IFN-α foi, então, determinado nos sobrenadantes de cultura de célula através de ELISA. Os eixos x são a concentração de ODN em μM e os eixos y são a concentração de IFN- α em pg/ml.
[00070] A figura 28 são dois gráficos mostrando a indução de IL-6 por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 28a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 28b). A atividade foi comparada àquela de um ODN da classe B não- modificado (SEQ ID NO: 55) e ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). PBMCs desses três doadores foram incubadas com o ODN durante 24 horas e os sobrenadantes foram analisados com luminex. É mostrada a média +/- SEM. Os eixos x são a concentração de ODN em μM e os eixos y são a concentração de IL-6 em pg/ml.
[00071] A figura 29 são dois gráficos mostrando a proliferação de células B após tratamento com ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 29a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 29b). A atividade foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53), ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56), LPS, R-848, SEB e um poli[I]: [C] ODN. PBMC CFSE-rotulada de três doadores foram incubados com o ODN durante 5 dias e, então, coradas com um anticorpo CD19. O percentual de células B com coloração de CFSE reduzida foi determinado. Os eixos x são a concentração de ODN em μM e os eixos y são o % de células B com coloração reduzida após divisão.
[00072] A figura 30 é um gráfico mostrando a indução de IFN-α de murino por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58, 60-62, 64 e 67). A atividade do mesmo é comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um controle negativo (SEQ ID NO: 26). Camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados SC com diferentes doses de ODN. O sangue dos animais foi coletado em 3 horas pós-injeção e o plasma testado com relação ao IFN-alfa através de ELISA. O eixo x é a dose de ODN em μg e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml. A figura 31 são dois gráficos mostrando o efeito do ODN sobre o volume de tumor no modelo de tumor SA1N de camundongo. Camundongos A/J fêmeas (10 por grupo) foram injetados SC com 5 x 105 células tumorígenas SaI/N no dia 0. Os camundongos foram tratados com 35 μg (figura 31a) ou 100 μg (figura 31b) de ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 60, 64 e 67), um ODN da classe C não-modificado, um ODN da classe B não- modificado (SEQ ID NO: 55) ou PBS apenas fornecido SC uma vez por semana começando a partir do dia 8 pós-indução de tumor. Os animais foram monitorados com relação à sobrevivência e volume do tumor. O tamanho do tumor (o comprimento e a largura) foi medido usando um calibrador Vernier digital. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula: volume do tumor = (0,4) (ab2), onde a = diâmetro maior e b = diâmetro menor. O eixo x mostra dias pós-indução de tumor e o eixo y mostra o volume do tumor em mm3.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00073] A invenção é baseada, em parte, sobre oligonucleotídeos de CpG que mostram capacidade imunoestimulatória intensificada. Oligonucleotídeos de CpG que mostram capacidade imunoestimulatória intensificada são conhecidos por estimular o sistema imune, por exemplo, através de interação com o receptor 9 tipo sino (TLR9). Estimulação de TLR9 tem muitos efeitos, incluindo estimulação de uma resposta imune que tende a Th1, ativação de células NK e ativação de células B. A invenção está relacionada, em alguns aspectos, à identificação de oligonucleotídeos imunoestimulatórios com estrutura alterada que afeta sua interação com TLR9. Foi descoberto, pelos inventores, que oligonucleotídeos com análogos de nucleotídeo substituído lipofílico fora do motivo CpG têm capacidade intensificada de estimular a produção de interferon-α (IFN-α) e induzir à ativação de TLR9. Esse efeito foi observado em todas as classes de oligonucle- otídeos imunoestimulatórios testados. Esses oligonucleotídeos modificados com capacidade estimulatória intensificada foram denominados oligonucleotídeos da classe E.
[00074] Os oligonucleotídeos modificados da classe E da presente invenção têm, em alguns casos, capacidade intensificada de induzir a uma resposta imune. Uma indução de uma resposta imune refere-se a qualquer aumento no número ou atividade de uma célula imune ou um aumento na expressão ou níveis absolutos de um fator imune, tal como uma citocina. Células imunes incluem, mas não estão limitadas a, células NK, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, células B, células dendríticas, macrófagos e outras células que apresentam antígeno. Citocinas incluem, mas não estão limitadas a, interleucinas, TNF-α, IFN- a,β e Y, Flt-ligante e moléculas coestimulatórias.
[00075] Sabe-se que oligonucleotídeos contendo motivos CpG não- metilados são capazes de estimular respostas imunes através da através de do receptor 9 Tipo sino (TLR9). A indução de muitas citocinas se correlaciona com a ativação de TLR9. Assim, a indução aumenta à medida que a estimulação de TLR9 aumenta. Contudo, em geral, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a indução de IFN-α para ODN de CpG. Descobriu-se que algumas das modificações da invenção podem produzir um padrão de sinalização modificado, de modo que uma correlação mais direta, ao invés de uma correlação inversa entre ativação de TLR9 e IFN-α, seja observada.
[00076] Os inventores começaram a investigar o impacto dos resíduos lipofílicos na região que circunda o motivo CpG. Conforme descrito nos exemplos abaixo, vários tipos diferentes de análogos de nucleotídeo substituído lipofílico, tais como 2,4-difluorotolueno, 5- bromouracila e 5-iodouracila, foram incorporados em um oligonucleotídeo de CpG sobre o lado 5’ ou 3’ do motivo CpG. Inesperadamente, a incorporação desses análogos de nucleotídeo substituído lipofílico levou a um aumento incomumente forte na atividade do hTLR9, bem como indução de IFN-α em PBMCs humanas. A substituição por um nucleotídeo não lipofílico, tal como um resíduo de uracila (o qual é estruturalmente similar à timina, mas carece de um grupo metila) produziu uma forte diminuição na estimulação de hTLR9. Nos oligonucleotídeos testados, o aumento na estimulação de TLR9 parecia ser melhor se o análogo de nucleotídeo lipofílico substituído está posicionado 5' ao motivo CpG do que quando ele estava posicionado 3' ao motivo. Substituição dupla (isto é, uma substituição por análogo de nucleotídeo lipofílico substituído 5’ e 3’) resultou em estimulação mais potente daquelas testadas. Em contraste, substituição de guanina ou citosina por 2,4-difluorotolueno no motivo CpG levou a uma forte diminuição do índice de estimulação de TLR9.
[00077] A modificação dos análogos de nucleotídeo substituído lipofílico resultou em uma forte intensificação de indução de IFN-α. Especialmente, para o ODN modificado com 5-bromouracila e 5- iodouracila, parecia haver uma boa correlação entre a estimulação de TLR9 e a indução de IFN-α. Conforme mencionado acima, essa observação era inesperada, uma vez que (i) a molécula precursora 21317 é virtualmente inativa quanto à indução de IFN-α e (ii) usualmente, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a indução de IFN-α para ODN de CpG o qual não contém essas modificações.
[00078] Em alguns aspectos da invenção, o oligonucleotídeo tem a sequência R1YZR2. O oligonucleotídeo pode incluir um ou mais de tais motivos. R1 e R2 são, independentemente um do outro, um análogo de nucleotídeo lipofílico substituído (L), um nucleotídeo ou uma ligação. É preferido, contudo, que pelo menos um de R1 e R2 seja um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L). Em alguns casos, R1 e R2 são ambos L. Conforme mostrado na seção exemplos abaixo, oligonucleotídeos tendo um L 5’ e 3’ ao motivo CpG eram particularmente estimulatórios. Contudo, algumas vezes, apenas um R é um L. Por exemplo, R1 pode ser L e R2 é um nucleotídeo ou vice versa. Alternativamente, R1 pode ser um L e R2 pode ser uma ligação, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R1CG 3’.
[00079] Em alguns casos, o oligonucleotídeo tem a sequência R1N1YZN2R2 em que N1 e N2 são nucleotídeos de 0-3 nucleotídeos de comprimento. Outras possíveis variações incluem estruturas tais como 5’ R1 N1R1YZ N2 3’, 5’ R3R1YZ 3 e R1ZN2R2.
[00080] Y é um nucleotídeo de pirimidina. Z é um resíduo de purina, pirimidina ou um resíduo abásico. Em algumas modalidades, Z é, de preferência, uma purina.
[00081] L é um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico o qual pode ser, por exemplo, um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos. Um exemplo de um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos é mostrado no grupo a seguir de fórmula I.
Figure img0002
[00082] A, B, X, D, E e F são, independentemente, qualquer um de C (carbono) ou N (nitrogênio) opcionalmente trazendo hidrogênio ou um substituinte tal como, por exemplo, mas não limitado a, F, Cl, Br, I, alquila, alquenila, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O-alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, -SO-alquila, -SO2-alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila, oxo, tio, hidróxi, mercapto e imino. Em alguns casos, pelo menos um substituinte não é oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino ou metila. n é 0 ou 1. As linhas pontilhadas indicam ligações duplas opcionais. Contudo, pelo menos um substituinte não é escolhido do grupo consistindo em oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino, metila e hidrogênio. Adicionalmente, o total de átomos A, B, X, D, E e F não é mais do que 3 nitrogênios (N). Em algumas modalidades, todos os átomos A, B, X, D, E, F são carbono (C). Alternativamente, pelo menos um, dois ou três dos átomos A, B, X, D, E, F é nitrogênio (N).
[00083] O composto de fórmula I pode ser, por exemplo, qualquer um dos seguintes análogos de nucleotídeo lipofílico substituído: uma pirimidina substituída, uma uracila substituída, um tolueno substituído, uma imidazol ou pirazol substituída, um triazol substituído, 5-cloro- uracila, 5-bromo-uracila, 5-iodo-uracila, 5-etil-uracila, 5-propil-uracila, 5- proinil-uracila, (E)-5-(2-bromovinil)-uracila ou 2.4-difluoro-tolueno.
[00084] O análogo de nucleotídeo lipofílico substituído pode ser separado ou ele pode ser fundido com outro composto. Por exemplo, ele pode ser fundido a um sistema de anel aromático ou alifático de 3 a 6 elementos. Ele pode ser também ligado a uma porção de açúcar com 5 a 6 elementos tal como, por exemplo, uma pentose ou hexose. Um exemplo de uma pentose é uma furanose, tal como uma ribose ou desoxirribose e um exemplo de uma hexose é uma piranose. A pentose ou hexose pode, opcionalmente, ser substituída por F, amino, alcóxi, alcóxi-etóxi, aminopropila, alquenila, alquinila ou uma ligação em ponte de O2,C4-alquileno.
[00085] O oligonucleotídeo pode também incluir uma modificação não-nucleotídica, tal como um ligante de C6-C48-polietileno glicol, C3- C20-alcano-diol, C3-C18-alquilamino, um ligante de C3-C18-alquiltiol, colesterol, ácido biliar, ácido graxo saturado ou insaturado, folato, um grupo hexadecil-glicerol, di-hexadecil-glicerol, um grupo octadecil- glicerol ou dioctadecil-glicerol ou um grupo vitamina E.
[00086] Os análogos de nucleotídeo lipofílico substituídos podem ser incorporados em qualquer oligonucleotídeo imunoestimulatório. Em algumas modalidades da invenção, os oligonucleotídeos imunoestimu- latórios incluem motivos imunoestimulatórios os quais são "dinucleotídeos de CpG". Um dinucleotídeo de CpG pode ser metilado ou não-metilado. Um ácido nucleico imunoestimulatório contendo pelo menos um dinucleotídeo de CpG não-metilado é uma molécula de ácido nucleico a qual contém uma sequência dinucleotídica de citosina- guanina não-metilada (isto é, uma citidina 5' não-metilada, seguido por uma guanosina 3' e ligadas por uma ligação de fosfato) e o qual ativa o sistema imune; tal ácido nucleico imunoestimulatório é um ácido nucleico de CpG. Ácidos nucleicos de CpG foram descritos em uma série de patentes emitidas, pedidos de patente publicados e outras publicações, incluindo Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Um ácido nucleico imunoestimulatório contendo pelo menos um dinucleotídeo de CpG metilado é um ácido nucleico o qual contém uma sequência dinucleotídica de citosina-guanina metilada (isto é, uma citidina 5' metilada, seguido por uma guanosina 3' e ligadas por uma ligação de fosfato) e o qual ativa o sistema imune. Em outras modalidades, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios são isentos de dinucleotídeos de CpG. Esses oligonucleotídeos os quais são isentos de dinucleotídeos de CpG são referidos como oligonucleotídeos de não-CpG e eles não têm motivos imunoestimulatórios de CpG. De preferência, esses são ODNs ricos em T, tal como um ODN tendo pelo menos 80% de T.
[00087] Os ODNs da classe E da invenção podem incluir motivos e propriedades de outras classes de ODN de CpG, tal como classe A, classe B, classe C, classe T e classe P, na medida em que eles incluam análogos de nucleotídeo lipofílico substituídos 5’ e/ou 3’ de um motivo YGZ.
[00088] Ácidos nucleicos imunoestimulatórios de CpG da "classe A" foram descritos no Pedido de Patente Não-provisório U.S. N°. de Série: 09/672.126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (WO 01/22990), ambos depositados em 27 de Setembro de 2000. Esses ácidos nucleicos são caracterizados pela capacidade de induzir a altos níveis de interferon-alfa, ao mesmo tempo em que têm efeitos mínimos sobre a ativação de células B. O ácido nucleico imunoestimulatório de CpG da classe A não contém necessariamente um palindroma hexamérico de GACGTC, AGCGCT ou AACGTT, descrito por Yamamoto et. al.. Yamamoto S. et. al., J Immunol 148: 4072-6 (1992).
[00089] Sequências exemplificativas de ácidos nucleicos imunoestimulatórios da classe A são descritas no Pedido de Patente Não-Provisório U.S. N°. de Série: 09/672.126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (WO 01/22990), ambos depositados em 27 de Setembro de 2000.
[00090] ODNs da "classe B" são potentes na ativação de células B, mas são relativamente fracos na indução de ativação de IFN-Y e células NK. Os ácidos nucleicos de CpG da classe B são, tipicamente, totalmente estabilizados e incluem um dinucleotídeo de CpG não- metilado dentro de determinados contextos de base preferidos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Outra classe é potente para indução de ativação de IFN-Y e células NK, mas relativamente fraca na estimulação de células B; essa classe foi denominada a "classe A". Os ácidos nucleicos de CpG da classe A têm, tipicamente, sequências de poli-G estabilizadas nas extremidades 5' e 3' e uma sequência contendo dinucleotídeo de CpG de fosfodiéster palindrômica de pelo menos 6 nucleotídeos. Veja, por exemplo, pedido de patente publicado PCT/US00/26527.
[00091] Ainda outra classe de ácidos nucleicos de CpG ativa células B e células NK e induz ao IFN-Y; essa classe foi denominada a classe C. Os ácidos nucleicos imunoestimulatórios da "classe C" contêm pelo menos dois motivos distintos únicos e têm efeitos estimulatórios desejáveis sobre células do sistema imune. Alguns desses ODNs têm uma sequência de CpG "estimulatória" tradicional e um motivo "rico em GC" ou "de neutralização de células B". Esses ácidos nucleicos com motivo combinado têm efeitos de estimulação imune que se assemelham um pouco àqueles efeitos associados a um ODN de CpG da "classe B" tradicional, os quais são fortes indutores de ativação de células B e ativação de células dendríticas (DC) e àqueles efeitos associados a uma classe mais recentemente descrita de ácidos nucleicos imunoestimulatórios (ODN de CpG da "classe A"), os quais são fortes indutores de ativação de IFN-y e células assassinas naturais (NK), mas indutores relativamente pobres de ativação de células B e DC. Krieg AM et. al. (1995) Nature 374: 546-9; Ballas ZK et. al. (1996) J Immunol 157: 1840-5; Yamamoto S. et. al. (1992) J Immunol 148: 40726. Embora o ODN de CpG da classe B preferido frequentemente tenha partes principais de fosforotioato e ODN de CpG da classe A preferidos têm partes principais misturadas ou quiméricas, os ácidos nucleicos imunoestimulatórios com motivo combinado podem ter partes principais estabilizadas, por exemplo, de fosforotioato, quiméricas ou fosfodiéster e, em algumas modalidades preferidas, eles têm partes principais semimacias. Essa classe foi descrita no pedido de patente U.S. US10/224.523, depositado em 19 de Agosto de 2002, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
[00092] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios da "classe P" têm vários domínios, incluindo um domínio de ativação 5’TLR, 2 regiões de formação de dupla e um espaçador opcional e cauda 3’. Essa classe de oligonucleotídeos tem a capacidade, em alguns casos, de induzir a níveis muito maiores de secreção de IFN-α do que a classe C. Os oligonucleotídeos da classe P têm a capacidade de se autoestruturar espontaneamente em concatâmeros in vitro e/ou in vivo. Sem estar preso a qualquer teoria em particular quanto ao método de ação dessas moléculas, uma hipótese potencial é que essa propriedade dota os oligonucleotídeos da classe P com a capacidade de se ligar cruzadamente ao TLR9 de maneira mais intensa dentro de determinadas células imunes, induzindo a um padrão distinto de ativação imune, comparado com as classes previamente descritas de oligonucleotídeos de CpG. Ligação cruzada de receptores TLR9 pode induzir à ativação de secreção mais forte de IFN-α através do loop de feedback de IFNR do tipo I em células dendríticas plasmacitóides. Oligonucleotídeos da classe P são descritos pelo menos no Pedido de Patente US No. de Série 11/706.561.
[00093] Os oligonucleotídeos da "classe T" induzem à secreção de menores níveis de IFN-alfa quando não-modificados, conforme nos ODNs da invenção e citocinas e quimiocinas relacionadas a IFN do que oligonucleotídeos da classe B ou da classe C, ao mesmo tempo em que retêm a capacidade de induzir a níveis de IL-10 similares aos oligonucleotídeos da classe B. Oligonucleotídeos da classe T são descritos pelo menos no Pedido de Patente US No. de Série 11/099.683, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
[00094] Em uma modalidade, o ODN imunoestimulatório da invenção é, vantajosamente, combinado com um lipídio catiônico. Em uma modalidade, o lipídio catiônico é DOTAP (metil-sulfato de N-[1-(2,3- dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio). Outros agentes com propriedades similares, incluindo tráfego ao compartimento endossomico, podem ser usados em lugar de ou além de DOTAP. Outras formulações lipídicas incluem, por exemplo, EFFECTENE® (um lipídio não- lipossômico com um intensificador de condensação de DNA especial) e SUPERFECT® (uma nova tecnologia de atuação dendrimérica). Lipossomas estão comercialmente disponíveis da Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN® e LIPOFECTACE®, os quais são formados de lipídios catiônicos, tais como cloreto de N-[1-(2, 3 dioleilóxi)-propil]-N, N, N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Métodos para fabricação de lipossomas são bem conhecidos na técnica e foram descritos em muitas publicações. Lipossomas também foram revistos por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3: 235-241.
[00095] Em outras modalidades, os ODNs imunoestimulatórios não são formulados em lipossomas catiônicos. Em virtude da natureza lipofílica dos análogos modificados dentro do ODN, mesmo o ODNs curtos, tal como com 3 nucleotídeos de comprimento, podem não requerer formulação para funcionar eficientemente in vivo.
[00096] Em uma modalidade, o ODN imunoestimulatório da invenção está na forma de moléculas em formato de haltere, covalentemente fechadas, com estrutura primária e secundária. Em uma modalidade, tais oligoribonucleotídeos cíclicos incluem dois loops fita simples conectados através de um segmento fita dupla interveniente. Em uma modalidade, pelo menos um loop fita simples inclui um motivo de DNA imunoestimulatório da invenção. Outras moléculas em formato de haltere, covalentemente fechadas da invenção incluem moléculas de DNA:RNA quiméricas nas quais, por exemplo, o segmento fita dupla é pelo menos parcialmente DNA (por exemplo, dsDNA homodimérico ou DNA:RNA heterodimérico) e pelo menos um loop fita simples inclui um motivo de DNA imunoestimulatório da invenção. Alternativamente, o segmento fita dupla da molécula quimérica é DNA.
[00097] Em determinadas modalidades, o ODN imunoestimulatório é isolado. Uma molécula isolada é uma molécula que é substancialmente pura e é isenta de outras substâncias com as quais ela é comumente encontrada na natureza ou em sistemas in vivo até um ponto prático e apropriado para seu uso pretendido. Em particular, os ODNs imunoestimulatórios são suficientemente puros e são suficientemente isentos de outros constituintes biológicos das células de modo a serem úteis, por exemplo, na produção de preparados farmacêuticos. Em virtude do fato de um ODN imunoestimulatório isolado da invenção poder ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável em um preparado farmacêutico, o ODN imunoestimulatório pode compreender apenas um pequeno percentual em peso do preparado. O ODN imunoestimulatório, todavia, é substancialmente puro pelo fato de que ele foi substancialmente separado das substâncias com as quais ele pode estar associado em sistemas vivos.
[00098] As moléculas de ácido nucleico imunoestimulatórias podem ter uma parte principal quimérica. Para fins da presente invenção, uma parte principal quimérica refere-se a uma parte principal parcialmente estabilizada, em que pelo menos uma ligação internucleotídeo é fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante e em que pelo menos uma outra ligação internucleotídeo é uma ligação internucleotídeo estabilizada, em que a pelo menos uma ligação de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhante e a pelo menos uma ligação estabilizada são diferentes. Uma vez que foi reportado que ligações de boranofosfonato são estabilizadas com relação à ligações de fosfodiéster, para fins da natureza quimérica da parte principal, ligações de boranofosfonato podem ser classificadas como fosfodiéster-semelhantes ou como estabilizadas, dependendo do contexto. Por exemplo, uma parte principal quimérica de acordo com a invenção poderia, em uma modalidade, incluir pelo menos uma ligação de fosfodiéster (fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante) e pelo menos uma ligação de boranofosfonato (estabilizada). Em outra modalidade, uma parte principal quimérica de acordo com a presente invenção poderia incluir ligações de boranofosfonato (fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante) e fosforotioato (estabilizada). Uma "ligação internucleotídeo estabilizada" significará uma ligação internucleotídeo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, através de uma exo- ou endonuclease), comparado com a ligação internucleotídeo de fosfodiéster. Ligações internucleotídeo estabilizadas preferidas incluem, sem limitação, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato e metilfosfo- rotioato. Outras ligações internucleotídeo estabilizadas incluem, sem limitação: peptídeo, alquila, defosfo e outras, conforme descrito acima.
[00099] Partes principais modificadas, tais como fosforotioatos, podem ser sintetizadas usando técnicas automáticas empregando químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Aril- e alquil-fosfonatos podem ser feitos, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N°. 4.469.863; e alquilfosfotriésteres (nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada, conforme descrito na Patente U.S. N°. 5.023.243 e Patente Européia No. 092.574) podem ser preparados através de síntese em fase sólida automática usando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e substituições da parte principal do DNA foram descritos. Uhlmann E et. al. (1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. Métodos para preparo de oligonucleotídeos quiméricos também são conhecidos. Por exemplo, as patentes emitidas para Uhlmann et. al. descreveram tais técnicas.
[000100] ODNs com parte principal misturada modificados podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA comercialmente disponível e química padrão de fosforamidita (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogs - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1991 e M. D. Matteucci e M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)) Após acoplamento, as ligações PS são introduzidas através de sulfurização usando reagente de Beaucage (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan e S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0,075 M em acetonitrilo) ou dissulfeto de fenil acetila (PADS), seguido por revestimento com anidrido acético, 2,6-lutidina em tetrahidrofurano (1: 1: 8; v: v: v) e N-metilimidazola (16 % em tetrahidrofurano). Essa etapa de revestimento é realizada após a reação de sulfurização para minimizar a formação de ligações de fosfodiéster (PO) indesejadas em posições onde uma ligação de fosforotioato deveria estar localizada. No caso da introdução de uma ligação de fosforodiéster, por exemplo, em um dinucleotídeo de CpG, o fósforo-III intermediário é oxidado através de tratamento com uma solução de iodo em água/piridina. Após clivagem do suporte sólido e desproteção final através de tratamento com amônia concentrada (15 horas a 50°C), os ODNs são analisados através de HPLC sobre uma coluna Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) usando um gradiente de NaCl (por exemplo, tampão A: NaH2PO4 a 10 mM em acetonitrilo/água = 1: 4/v: v, pH de 6,8; tampão B: NaH2PO4 a 10 mM, NaCl a 1,5 M em acetonitrilo/água = 1: 4/v: v; 5 a 60 % de B em 30 minutos a 1 ml/min) ou através de eletroforese em gel capilar. O ODN pode ser purificado através de HPLC ou através de FPLC sobre uma coluna Source High Performance (Amersham Pharmacia). Frações homogêneas por HPLC são combinadas e desalinizadas através de uma coluna C18 ou através de ultrafiltração. O ODN foi analisado através de espectrometria de massa MALDI-TOF para confirmar a massa calculada.
[000101] Os ácidos nucleicos da invenção podem também incluir outras modificações. Essas incluem análogos de DNA não-iônico, tais como alquil- e aril-fosfatos (nos quais o oxigênio do fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada. Também foi mostrado que ácidos nucleicos os quais contêm diol, tal como tetraetileno glicol ou hexaetileno glicol, em um ou ambos os términos são substancialmente resistentes à degradação por nuclease.
[000102] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos macios ou semimacios. Um oligonucleotídeo macio é um oligonucleotídeo imunoestimulatório tendo uma parte principal parcialmente estabilizada, na qual ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes ocorrem apenas dentro e imediatamente adjacentes a pelo menos um dinucleotídeo interno de pirimidina -purina (YZ). De preferência, YZ é YG, um dinucleotídeo de pirimidina-guanosina (YG). O pelo menos um dinucleotídeo YZ interno tem, em si, uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhante. Uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante que ocorre imediatamente adjacente a pelo menos um dinucleotídeo YZ interno pode estar 5', 3' ou 5' e 3' ao pelo menos um dinucleotídeo YZ interno.
[000103] Em particular, ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes envolver "dinucleotídeos internos". Um dinucleotídeo interno, em geral, significará qualquer par de nucleotídeos adjacentes conectados através de uma ligação internucleotídeo, no qual nenhum nucleotídeo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo terminal, isto é, nenhum nucleotídeo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo que define a extremidade 5' ou 3' do oligonucleotídeo. Assim, um oligonucleotídeo linear que tem n nucleotídeos de comprimento tem um total de n-1 dinucleotídeos e apenas n-3 dinucleotídeos internos. Cada ligação internucleotídeo em um dinucleotídeo interno é uma ligação internucleotídeo interna. Assim, um oligonucleotídeo linear que tem n nucleotídeos de comprimento tem um total de n-1 ligações internucleotídeo e apenas n-3 ligações internucleotídeo internas. As ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes estrategicamente colocadas, portanto, referem-se à ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes posicionadas entre qualquer par de nucleotídeos na sequência de ácido nucleico. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes não estão posicionadas entre o par de nucleotídeos mais próximo da extremidade 5' ou 3'.
[000104] De preferência, uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante que ocorre imediatamente adjacente ao pelo menos um dinucleotídeo YZ interno é, em si, uma ligação internucleotídeo interna. Assim, para uma sequência N1 YZ N2, em que N1 e N2 são, cada um independentemente um do outro, qualquer único nucleotídeo, o dinucleotídeo YZ tem uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante e, além disso (a) N1 e Y são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando N1 é um nucleotídeo interno, (b) Z e N2 são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando N2 é um nucleotídeo interno ou (c) N1 e Y são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando N1 é um nucleotídeo interno e Z e N2 são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando N2 é um nucleotídeo interno.
[000105] No oligonucleotídeo da invenção, pelo menos um YZ de R1YZR2 pode ter uma ligação de fosforodiéster. Alternativamente, o YZ de R1YZR2 pode ter uma ligação de fosforotioato. Em algumas modalidades, o R1Y e ou ZR2 de R1YZR2 tem uma ligação de fosforotioato.
[000106] Acredita-se que oligonucleotídeos macios de acordo com a presente invenção sejam relativamente suscetíveis à clivagem por nuclease comparado com oligonucleotídeos completamente estabilizados. Sem pretender estar preso a uma teoria ou mecanismo em particular, acredita-se que oligonucleotídeos macios da invenção são cliváveis em fragmentos com atividade imunoestimulatória reduzida ou nenhuma com relação a oligonucleotídeos macios de comprimento total. Acredita-se que a incorporação de pelo menos uma ligação internucleotídeo sensível à nuclease, particularmente próximo da parte mediana do oligonucleotídeo, proporciona um "desligamento", o qual altera a farmacocinética do oligonucleotídeo de modo a reduzir a duração da atividade imunoestimulatória máxima do oligonucleotídeo. Isso pode ser de valor particular em tecidos e aplicações clínicas nas quais é desejável evitar lesão relacionada à inflamação ou imuno- estimulação local crônica, por exemplo, no rim.
[000107] Um oligonucleotídeo semimacio é um oligonucleotídeo imunoestimulatório tendo uma parte principal parcialmente estabilizada, na qual ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes ocorrem apenas dentro de pelo menos um dinucleotídeo interno de pirimidina-purina (YZ). Oligonucleotídeos semimacios geralmente possuem potência imunoestimulatória aumentada com relação aos oligonucleotídeos imunoestimulatórios totalmente estabilizados correspondentes. Em virtude da maior potência dos oligonucleotídeos semimacios, oligonucleotídeos semimacios podem ser usados, em alguns casos, em menores concentrações eficazes e têm menores doses eficazes do que oligonucleotídeos imunoestimu- latórios totalmente estabilizados convencionais de forma a obter um efeito biológico desejado.
[000108] Acredita-se que as propriedades precedentes dos oligonucleotídeos semimacios geralmente aumentam com aumento da "dose" de ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes envolvendo dinucleotídeos YZ internos. Assim, acredita-se que, por exemplo, em geral, para uma determinada sequência de oligonucleotídeo com cinco dinucleotídeos YZ internos, um oligonucleotídeo com ligações internucleotídeo YZ internas de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com quatro ligações internucleotídeo YG internas de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes o qual, por sua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com três ligações internucleotídeo YZ internas de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes o qual, por s ua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com duas ligações internucleotídeo YG internas de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes o qual, por sua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com uma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante. De modo importante, acreidta-se que mesmo a inclusão de uma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante é vantajosa com relação a nenhuma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante. Além do número de ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes, a posição ao longo do ácido nucleico também pode afetar a potência.
[000109] Os oligonucleotídeos macios e semimacios geralmente incluem, além das ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes em posições internas preferidas, extremidades 5' e 3' que são resistentes à degradação. Tais extremidades resistentes à degradação podem envolver qualquer modificação que resulta em uma resistência aumentada contra digestão por exonuclease com relação às extremidades não-modificadas correspondentes. Por exemplo, as extremidades 5' e 3' podem ser estabilizadas através da inclusão de pelo menos uma modificação de fosfato na parte principal. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma modificação de fosfato da proporciona em cada extremidade é, independentemente, uma ligação internucleotídeo de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato ou metilfosforotioato. Em outra modalidade, a extremidade resistente à degradação inclui uma ou mais unidades nucleotídicas conectadas por ligações peptídicas ou de amida na extremidade 3'.
[000110] A ligação internucleotídeo de fosfodiéster é o tipo de ligação característica dos ácidos nucleicos encontrados na natureza. A ligação internucleotídeo de fosfodiéster incluiu um átomo de fósforo flanqueado por dois átomos de oxigênio ligados em ponte e ligados também por dois átomos adicionais de oxigênio, um carregado e o outro descarregado. Ligação internucleotídeo de fosfodiéster é particularmente preferida quando é importante reduzir a meia-vida tecidual do oligonucleotídeo.
[000111] Uma ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante é um grupo de ligação em ponte contendo fósforo que é química e/ou diastereomericamente similar ao fosfodiéster. Medidas de similaridade ao fosfodiéster incluem suscetibilidade à digestão por nuclease e a capacidade de ativar RNAse H. Assim, por exemplo, oligonucleotídeos de fosfodiéster, mas não fosforotioato, são suscetíveis à digestão por nuclease, enquanto que oligonucleotídeos de fosfodiéster e fosforo- tioato ativam RNAse H. Em uma modalidade preferida, a ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante é uma ligação de boranofos- fato (ou, equivalentemente, boranofosfonato). Patente U.S. N°. 5.177.198; Patente U.S. N°. 5.859.231; Patente U.S. N°. 6.160.109; Patente U.S. N°. 6.207.819; Sergueev et. al., (1998) J Am Chem Soc 120: 9417-27. Em outra modalidade preferida, a ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante é Rp fosforotioato diastereomericamente puro. Acredita-se que Rp fosforotioato diastereomericamente puro é mais suscetível à disgestão por nuclease e é melhor na ativação de RNAse H do que Sp fosforotioato misturado ou diastereomericamente puro. Estereoisômeros de oligonucleotídeos de CpG são o assunto do pedido de patente U.S. copendente 09/361.575, depositado em 27 de Julho de 1999 e pedido PCT publicado PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Deve ser notado que, para fins da presente invenção, o termo "ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante" exclui especificamente ligações internucleotídeo de fosforoditioato e metilfosfonato.
[000112] Conforme descrito acima, os oligonucleotídeos macios e semimacios da invenção podem ter ligações fosfodiéster-semelhantes entre C e G. Um exemplo de uma ligação fosfodiéster-semelhante é uma ligação de fosforotioato em uma conformação Rp. A p-quiralidade do oligonucleotídeo pode ter efeitos evidentemente opostos sobre a atividade imune de um oligonucleotídeo de CpG, dependendo do ponto de tempo no qual a atividade é medida. Em um ponto de tempo inicial de 40 minutos, o estereoisômero Rp, mas não o SP, do oligonucleotídeo de CpG de fosforotioato induzi à fosforilação de JNK em células de baço de camundongo. Em contraste, quando ensaiado em um ponto de tempo posterior de 44 horas, o estereoisômero SP, mas não o Rp, é ativo na estimulação de proliferação de células do baço. Essa diferença na cinética e bioatividade dos estereoisômeros Rp e SP não resulta de qualquer diferença na captação celular, mas antes, mas provavelmente, é em virtude de dois papéis biológicos opostos da p-quiralidade. Primeiro, a atividade intensificada do estereoisômero Rp, comparado com o Sp, com relação à estimulação de células imunes em pontos de tempo iniciais indica que o Rp pode ser mais eficaz na interação com o receptor de CpG, TLR9 ou indução de vias de sinalização a jusante. Por outro lado, a degradação mais rápida dos PS-oligonucleotídeos Rp, comparado com o Sp, resulta em uma duração de sinalização muito mais curta, de modo que os PS-oligonucleotídeos Sp parecem ser mais biologicamente ativos quanto testados em pontos de tempo posteriores.
[000113] Um efeito surpreendentemente forte é obtido através da p- quiralidade no dinucleotídeo de CpG em si. Em comparação com um oligonucleotídeo de CpG estéreo-aleatório, o congênero no qual o único dinucleotídeo de CpG foi ligado em Rp era ligeiramente mais ativo, enquanto que o congênere contendo uma ligação Sp era quase que inativo para induzir a proliferação de células do baço.
[000114] Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" também abrangem ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos com substituições ou modificações, tal como nas bases e/ou açúcares. Por exemplo, eles incluem ácidos nucleicos tendo açúcares na parte principal que são covalentemente presos a outros grupos orgânicos de baixo peso molecular que não um grupo hidroxila na posição 2' e outros que não um grupo fosfato ou grupo hidróxi na posição 5'. Assim, ácidos nucleicos modificados podem incluir um grupo ribose 2'-O-alquilado. Além disso, ácidos nucleicos modificados podem incluir açúcares, tal como arabinose ou 2'-fluoroarabinose, ao invés de ribose. Assim, os ácidos nucleicos podem ser heterogêneos quanto à composição da parte principal, desse modo, contendo qualquer combinação possível de unidades poliméricas juntas, tais como ácidos nucleicos-peptídeo (os quais têm uma parte principal de aminoácido com bases de ácido nucleico).
[000115] Ácidos nucleicos incluem também purinas e pirimidinas substituídas, tais como bases modificadas de C-5 propino pirimidina e purina 7-deaza-7-substituída. Wagner RW et. al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a, adenina, citosina, guanina, timina, 5-metilcitosina, 5-hidroxicitosina, 5-fluorocitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diamino- purina, hipoxantina e outras nucleobases que ocorrem naturalmente e não-naturalmente, porções aromáticas substituídas e não-substituídas. Outras de tais modificações são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[000116] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios da presente invenção podem abranger várias modificações químicas e substituições, em comparação com RNA e DNA neutro, envolvendo uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster, uma unidade a- D-ribose e/ou uma base nucleotídica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracila. Exemplos de modificações químicas são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritas, por exemplo, em Uhlmann E et. al. (1990) Chem Rev 90: 543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, EUA 1993; Crooke ST et. al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36: 107-129; e Hunziker J et. al. (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417. Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode ter uma ou mais modificações, em que cada modificação está localizada na posição de uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster particular e/ou em uma unidade de a- D-ribose particular e/ou em uma base nucleotídica natural particular em comparação com um oligonucleotídeo da mesma sequência o qual é composto de DNA ou RNA natural.
[000117] Por exemplo, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo o qual pode compreender uma ou mais modificações e em que cada modificação é independentemente selecionada de: a) a substituição de uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma ligação em ponte internucleotídeo modificada, b) a substituição da ligação em ponte de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma ligação em ponte defosfo, c) a substituição de uma unidade fosfato de açúcar da parte principal fosfato de açúcar por outra unidade, d) a substituição de uma unidade a-D-ribose por uma unidade açúcar modificado, e e) a substituição de uma base nucleotídica natural por uma base nucleotídica modificada.
[000118] Exemplos mais detalhados para a modificação química de um oligonucleotídeo são como segue.
[000119] Uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo pode ser substituída por uma ligação em ponte internucleotídeo modificada, em que a ligação em ponte internucleotídeo modificada é, por exemplo, selecionada de ligações em ponte de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, α-hidroxibenzil fosfonato, fosfato- (C1-C21)-O-alquil éster, fosfato-[(C6-C12)aril-(C1-C21)-O-alquil]éster, (C1- C8)alquilfosfonato e/ou (C6-Ci2)arilfosfonato, (C7-Ci2)-α-hidroximetil- arila (por exemplo, divulgada no WO 95/01363), em que (C6-C12)arila, (C6-C20)arila e (C6-C14)arila são opcionalmente substituídas por halogênio, alquila, alcóxi, nitro, ciano e onde R1 e R2 são, independentemente um do outro, hidrogênio, (C1-C18)-alquila, (C6-C20)- arila, (C6-C14)-aril-(C1-C8)-alquila, de preferência hidrogênio, (C1-C8)- alquila, de preferência (C1-C4)-alquila e/ou metoxietila ou R1 e R2 formam, junto com o átomo de nitrogênio que traz os mesmos, um anel heterocíclico de 5-6 elementos o qual pode, adicionalmente, conter um outro heteroátomo do grupo O, S e N.
[000120] A substituição de uma ligação em ponte de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma ligação em ponte defosfo (ligações em ponte defosfo são descritas, por exemplo, em Uhlmann E e Peyman A em "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, páginas 355 ff), em que uma ligação em ponte defosfo é, por exemplo, selecionada das ligações em ponte defosfo de grupos formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidróxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetileno-sulfona e/ou silila.
[000121] Uma unidade fosfato de açúcar (isto é, uma ligação em ponte internucleotídeo de β-D-ribose e fosfodiéster que forma, junto, uma unidade fosfato de açúcar) da parte principal fosfato de açúcar (isto é, uma parte principal fosfato de açúcar é composta de unidades fosfato de açúcar) pode ser substituída por outra unidade, em que a outra unidade é, por exemplo, adequada para construir um oligômero "morfolino-derivado" (conforme descrito, por exemplo, em Stirchak EP et. al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 6129-41), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade morfolino-derivada; ou construir um ácido nucleico de poliamida ("PNA"; conforme descrito, por exemplo, em Nielsen PE et. al. (1994) Bioconjug Chem 5: 3-7), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade com parte principal de PNA, por exemplo, por 2-aminoetilglicina.
[000122] Uma unidade de β-ribose ou uma unidade de β -D-2'- desoxirribose pode ser substituída por uma unidade de açúcar modificada, em que a unidade de açúcar modificada é, por exemplo, selecionada de β-D-ribose, a-D-2'-desoximbose, L-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxirribose, 2'-F-arabinose, 2'-O-(C1-C6)alquil-ribose, de preferência 2'-O-(C1-C6)alquil- ribose é 2'-O-metilribose, 2'-O-(C2-C6)alquenil-ribose, 2'-[O-(C1-C6)alquil- O-(C1-C6)alquil]-ribose, 2'-NH2-2'-desoxirribose, β-D-xilo-furanose, a-arabinofuranose, 2,4-dideoxi-β-D-eritro-hexo-piranose e carbocíclica (descrita, por exemplo, em Froehler J (1992) Am Chem Soc 114: 8320) e/ou análogos de açúcar com cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Vandendriessche et. al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) e/ou análogos de açúcar biciclo (descritos, por exemplo, em Tarkov M et. al. (1993) Helv Chim Acta 76: 481).
[000123] Em algumas modalidades preferidas o açúcar é 2'-O- metilribose, preferivelmente para um ou ambos nucleotídeos ligados por um fosfodiéster ou por uma ligação internucleotídeo fosfodiéster- semelhantes.
[000124] Ácidos nucleicos também incluem purinas e pirimidinas substituídas, tais como C-5 propino pirimidina e bases de purina 7- deaza-7-substituída modificadas. Wagner RW et. al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a, adenina, citosina, guanina e timina e outras nucleobases que ocorrem naturalmente e não-naturalmente, porções aromáticas substituídas e não-substituídas.
[000125] Uma base modificada é qualquer base a qual é quimicamente distinta das bases que ocorrem naturalmente encontradas tipicamente em DNA e RNA, tais como T, C, G, A e U, mas as quais compartilham estruturas químicas básicas com essas bases que ocorrem naturalmente. A base de nucleotídeo modificado pode ser, por exemplo, selecionada de hipoxantina, uracila, dihidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5-(C1-C6)-alquiluracila, 5-(C2-C6)-alqueniluracila, 5-(C2- C6)-alquiniluracila, 5-(hidroximetil)uracila, 5-clorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-hidroxicitosina, 5-(C1-C6)-alquilcitosina, 5-(C2-C6)- alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, uma 7-deazapurina substituída, de preferência purina 7-deaza-7-substituída e/ou 7-deaza-8-substituída, 5-hidróximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por exemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxideoxicitidina, 5-hidroximetildeoxicitidina, N4-alquildeoxicitidina, por exemplo, N4-etildeoxicitidina, 6-tiodeoxigua- nosina e desoxirribonucleotídeos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina e diaminopurina, por exemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina ou outras modificações de bases de nucleotídeo naturais. Essa lista se destina a ser exemplificativa e não deve ser interpretada como sendo limitativa.
[000126] Em fórmulas particulares descritas aqui, um conjunto de bases modificadas é definido. Por exemplo, a letra Y é usada para se referir à pirimidina e, em algumas modalidades, um nucleotídeo contendo uma citosina ou uma citosina modificada. Uma citosina modificada, conforme usado aqui, é um análogo de base de pirimidina que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente o qual pode substituir essa base sem prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligonucleotídeo. Citosinas modificadas incluem, mas não estão limitadas a, citosinas 5-substituídas (por exemplo, 5-metil-citosina, 5- fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5- hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina e 5- alquinil-citosina substituída ou não-substituída), citosinas 6- substituídas, citosinas N4-substituídas (por exemplo, N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anel condensado (por exemplo, N,N’-propileno citosina ou fenoxazina) e uracila e seus derivados (por exemplo, 5-fluoro-uracila, 5-bromo-uracila, 5-bromovinil-uracila, 4-tio- uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-proinil-uracila). Algumas das citosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina e N4-etil-citosina. Em outra modalidade da invenção, a base citosina é substituída por uma base universal (por exemplo, 3-nitropirrol, P-base), um sistema de anel aromático (por exemplo, fluorobenzeno ou difluorobenzeno) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer).
[000127] A letra Z é usada para se referir a uma purina, pirimidina ou abásica e, em algumas modalidades, uma base de guanina ou guanina modificada. Uma guanina modificada, conforme usado aqui, é um análogo de base de purina que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente o qual pode substituir essa base sem prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligonucleotídeo. Guaninas modificadas incluem, mas não estão limitadas a, 7-deazaguanina, guanina 7-deaza-7-substituída (tal como 7-deaza-7-(C2-C6)alquinil- guanina), guanina 7-deaza-8-substituída, hipoxantina, guaninas N2- substituídas (por exemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H- tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil- adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8-substituída (por exemplo, 8-hidróxiguanina e 8-bromoguanina) e 6-tioguanina. Em outra modalidade da invenção, a base guanina é substituída por uma base universal (por exemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol e K-base), um sistema de anel aromático (por exemplo, benzimidazol ou dicloro- benzimidazol, amida de ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer).
[000128] Os oligonucleotídeos podem ter uma ou mais extremidades 5' acessíveis. É possível criar oligonucleotídeos modificados tendo duas de tais extremidades 5’. Isso pode ser obtido, por exemplo, por meio de fixação de dois oligonucleotídeos através de uma ligação 3'-3' para gerar um oligonucleotídeo tendo uma ou duas extremidades 5' acessíveis. A ligação 3'3' pode ser uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster, fosforotioato ou qualquer outra modificada. Métodos para realizar tais ligações são conhecidos na técnica. Por exemplo, tais ligações foram descritas em Seliger, H. et. al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 e Jiang et. al., Pseudo-ciclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
[000129] Adicionalmente, ácidos nucleicos 3'3'-ligados onde a ligação entre os nucleotídeos 3'-terminais não é um fosfodiéster, fosforotioato ou outra ligação em ponte modificada, podem ser preparados usando um espaçador adicional, tal como uma porção de fosfato de tri- ou tetra- etileno glicol (Durand, M. et. al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaetilene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, Patente US No. 5658738 e Patente US No. 5668265). Alternativamente, o ligante não-nucleotídico pode ser derivado de uma unidade de etanodiol, propanodiol ou de uma desoxirribose abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et. al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) usando química padrão com fosforamidita. Os ligantes não- nucleotídicos podem ser incorporados uma ou múltiplas vezes ou combinados uns com os outros, permitindo que qualquer distância desejável entre as extremidades 3' dos dois ODNs sejam ligadas.
[000130] Os oligonucleotídeos são parcialmente resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizados). Uma "molécula de oligonucleotídeo estabilizada" significará um oligonucleotídeo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, através de uma exo- ou endo-nuclease). A estabilização de ácido nucleico pode ser realizada através de modificações da parte principal. Oligonucleotídeos tendo ligações de fosforotioato proporcionam atividade máxima e protegem o oligonucleotídeo de degradação por exo- e endo-nucleases intracelulares. Outros oligonucleotídeos modificados incluem ácidos nucleicos fosfodiéster-modificados, combinações de ácido nucleico de fosfodiéster e fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etóxi e combinações dos mesmos.
[000131] Partes principais modificadas, tais como fosforotioatos, podem ser sintetizadas usando técnicas automáticas que empregam químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Aril- e alquil-fosfonatos podem ser feitos, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N°. 4.469.863; e alquilfosfotriésteres (nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada, conforme descrito na Patente U.S. N°. 5.023.243 e Patente Européia No. 092.574) podem ser preparados através de síntese em fase sólida automática usando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e substituições na parte principal do DNA foram descritos (por exemplo, Uhlmann, E. e Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).
[000132] Outros oligonucleotídeos estabilizados incluem: análogos de DNA não-iônicos, tais como alquil- e aril-fosfatos (nos quais o oxigênio do fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada. Também foi mostrado que ácidos nucleicos os quais contêm diol, tais como tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em qualquer um ou ambos os términos, são substancialmente resistentes à degradação por nuclease.
[000133] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreenda uma ou mais sequências palindrômicas. Conforme usado aqui, "palindroma" e, equivalentemente, "sequência palindrômica", se referirão a uma repetição invertida, isto é, uma sequência tal como ABCDEE'D'C'B'A' na qual A e A', B e B', etc., são bases capazes de formar pares de base de Watson-Crick usuais. Em alguns casos, o palindroma é rico em GC. Um palindroma rico em GC é um palindroma tendo uma composição de base de pelo menos dois terços de G’s e C’s. Em algumas modalidades, o domínio rico em GC está, de preferência, 3’ ao "domínio estimulatório de células B". No caso de um palindroma rico em GC de 10 bases de comprimento, o palindroma, assim, contém pelo menos 8 G’s e C’s. No caso de um palindroma rico em GC de 12 bases de comprimento, o palindroma também contém pelo menos 8 G’s e C’s. No caso de um palindroma rico em GC de 14-mer, pelo menos dez bases do palindroma são G’s e C’s. Em algumas modalidades, o palindroma rico em Gc é composto exclusivamente de G’s e C’s. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo contém mais do que uma sequência palindrômica.
[000134] DNA é um polímero de desoxirribonucleotídeos unidos através de ligações de fosfodiéster 3‘-5‘. Unidades do polímero da invenção também podem ser unidas através de ligações de fosfodiéster 3'-5'. Contudo, a invenção também abrange polímeros tendo ligações internucleotídeo incomuns, incluindo especificamente ligações internucleotídeo 5‘-5‘, 3‘-3‘, 2‘-2‘, 2‘-3‘ e 2‘-5‘. Em uma modalidade, tais ligações incomuns são excluídas do motivo de DNA imunoestimulatório, mesmo embora uma ou mais de tais ligações possam ocorrer em qualquer parte dentro do polímero. Para polímeros tendo extremidades livres, a inclusão de uma ligação internucleotídeo 3‘-3‘ pode resultar em um polímero tendo duas extremidades 5' livres. Inversamente, para polímeros tendo extremidades livres, a inclusão de uma ligação internucleotídeo 5'-5' pode resultar em um polímero tendo duas extremidades 3' livres.
[000135] Uma composição imunoestimulatória da presente invenção pode conter dois ou mais motivos de DNA imunoestimulatório os quais podem ser ligados através de uma unidade de ramificação. As ligações internucleotídeo podem ser ligações 3-5', 5-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' ou 2'-5'. Desse modo, a nomenclatura 2'-5' é escolhida de acordo com o átomo de carbono da desoxirribose. Contudo, se porções de açúcar não natural são empregadas, tais como análogos de açúcar com anel expandido (por exemplo, hexanose, cilohexeno ou piranose) ou análogos de açúcar bi- ou tricíclicos, então, essa nomenclatura muda de acordo com a nomenclatura do monômero. A ligação internucleotídeo incomum pode ser uma ligação de fosforodiéster, mas também pode ser, alternativamente, modificada como fosforotioato ou qualquer outra ligação modificada, conforme descrito aqui. A Fórmula IV mostra uma estrutura geral para oligômeros de DNA ramificado e análogos de oligorribonucleotídeo modificados da invenção através de uma unidade de ramificação nucleotídica. Desse modo, Nu1, Nu2 e Nu3 pode ser ligado através de ligações 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' ou 2'-5'. Ramificação de oligômeros de DNA pode também envolver o uso de ligantes não-nucleotídicos e espaçadores abásicos. Em uma modalidade, Nu1, Nu2 e Nu3 representam motivos de DNA imunoestimulatórios idênticos ou diferentes.
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[000136] O análogo de oligorribonucleotídeo modificado pode conter uma unidade duplicadora ou triplicadora (Glen Research, Sterling, VA), em particular aquelas análogos de oligodesoxiribonucleotídeo modificados com uma ligação 3‘-3‘. Uma unidade duplicadora, em uma modalidade, pode ser baseada em 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoxitritilóxi)pentilamido]propil-2- [(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita. Uma unidade triplicadora, em uma modalidade, pode ser baseada na incorporação de Tris-2,2,2-[3-(4,4'- dimetóxitritilóxi)propilóximetil]etil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]- fosforamidita. Ramificação dos análogos de oligorribonucleotídeo modificados através de múltiplas unidades duplicadoras, triplicadoras ou outras multiplicadoras leva a dendrímeros, os quais são uma outra modalidade da presente invenção. Análogos de oligorribonucleotídeo ramificados modificados podem levar à ligação cruzada de receptores, particularmente para combinações de RNA e DNA imunoestimulatórios, tais como TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9, com efeitos imunes distintos comparado com formas não ramificadas de análogos. Além disso, a síntese de análogos multiméricos ramificados ou outros pode estabilizar o DNA contra degradação e pode permitir que sequências de DNA fracas ou parcialmente eficazes exerçam um nível terapeuticamente útil de atividade imune. Os análogos de oligodeóxiribonucleotídeo modificados podem também conter unidades ligantes resultantes de reagentes de modificação de peptídeo ou reagentes de modificação de oligonucleotídeo (Glen Research). Além disso, os análogos de oligodeóxiribonucleotídeo modificados podem conter um ou mais resíduos de aminoácido naturais ou não naturais os quais são conectados ao polímero através de ligações peptídicas (amida).
[000137] As ligações internucleotídeo 3‘-5‘, 5'-5', 3‘-3‘, 2‘-2‘, Z-3 e 2‘5' podem ser diretas ou indiretas. Ligações diretas, nesse contexto, refere-se a uma ligação de fosfato ou fosfato modificado conforme divulgado aqui, sem uma porção ligante interveniente. Uma porção ligante interveniente é uma porção orgânica distinta de uma ligação de fosfato ou fosfato modificado conforme divulgado aqui a qual pode incluir, por exemplo, polietileno glicol, trietileno glicol, hexaetileno glicol, dSpacer (isto é, um deoxinucleotídeo abásico), unidade duplicadora ou unidade triplicadora.
[000138] As ligações são, de preferência, compostas de C, H, N,O , S, B, P e halogênio contendo 3 a 300 átomos. Por exemplo, com 3 átomos é uma ligação de acetal (ODN1-3’-O-CH2-O-3’-ODN2) conectando, por exemplo, o grupo 3'-hidróxi de um nucleotídeo ao grupo 3'-hidróxi de um segundo oligonucleotídeo. Um exemplo com cerca de 300 átomos é PEG-40 (tetra polietileno glicol). Ligações preferidas são ligações de fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, fosforamidato, boranofos- fonato, amida, éter, tioéter, acetal, tioacetal, ureia, tiouréia, sulfonamida, Base de Schiff e dissulfeto. Também é possível usar o Solulink BioConjugation System (www.trilinkbiotech.com).
[000139] Se o oligonucleotídeo é composto de duas ou mais partes de sequência, essas partes podem ser idênticas ou diferentes. Assim, em um oligonucleotídeo com uma ligação 3'3', as sequências podem ser 5’- ODN1-3’3’-ODN1-5’ idênticas ou 5’-ODN1-3’3’-ODN2-5’ diferentes. Além disso, a modificação química das várias partes do oligonucleotídeo, bem como o ligante que conecta as mesmas, podem ser diferentes. Uma vez que a captação de oligonucleotídeos curtos parece ser menos eficiente do que aquela de oligonucleotídeos longos, a ligação de duas ou mais sequências curtas resulta em estimulação imune aperfeiçoada. O comprimento dos oligonucleotídeos curtos é, de preferência, 2-20 nucleotídeos, mais preferivelmente 3-16 nucleotídeos mas, mais preferivelmente, 5-10 nucleotídeos. Preferidos são oligonucleotídeos ligados os quais têm duas ou mais extremidades 5' não ligadas.
[000140] As sequências parciais de oligonucleotídeo também podem ser ligadas através de ligantes não-nucleotídicos. Um "ligante não- nucleotídico", conforme usado aqui, refere-se a qualquer elemento ligante que não é um nucleotídeo ou polímero do mesmo (isto é, um polinucleotídeo), em que um nucleotídeo inclui uma nucleobase purina ou pirimidina e um fosfato de açúcar, em particular ligantes abásicos (dSpacers), unidades de trietileno glicol ou unidades de hexaetileno glicol. Outros ligantes preferidos são ligantes de alquilamino, tais como C3, C6, C12 aminoligantes e também ligantes de alquiltiol, tais como ligantes de C3 ou C6 tiol. Os oligonucleotídeos podem também ser ligados através de resíduos aromáticos os quais podem ser ainda substituídos por grupos alquila ou alquila substituída.
[000141] Para facilitar a captação em células, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios têm, em algumas modalidades, na faixa de 3 a 100 bases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos têm 7-100 bases de comprimento. Tipicamente, ácidos nucleicos de qualquer tamanho maior do que 6 nucleotídeos (mesmo muitos kb de comprimento) são capazes de induzir a uma resposta imune de acordo com antígeno se motivos imunoestimulatórios suficientes estão presentes. Contudo, a capacidade imunoestimulatória aprimorada dos oligonucleotídeos modificados da invenção proporciona moléculas imunoestimulatórias de comprimento muito mais curto. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios têm 3-6 bases de comprimento.
[000142] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são úteis, em alguns aspectos da invenção, como uma vacina para o tratamento de um indivíduo em risco de desenvolver alergia ou asma, uma infecção com um organismo infeccioso ou um câncer no qual um antígeno cancerígeno específico foi identificado. Os oligonucleotídeos imunoesti- mulatórios de CpG podem também ser fornecidos sem o antígeno ou alérgeno para proteção contra infecção, alergia e câncer e, nesse caso, doses repetidas podem permitir proteção a longo prazo. Um indivíduo em risco, conforme usado aqui, é um indivíduo que tem qualquer risco de exposição a uma infecção causada por um patógeno ou um câncer ou um alérgeno ou um risco de desenvolver câncer. Por exemplo, um indivíduo em risco pode ser um indivíduo que está planejando viajar para uma área onde um tipo particular de agente infeccioso é encontrado ou pode ser um indivíduo que, pelo estilo de vida ou procedimentos médicos, está exposto a fluidos corporais os quais podem conter organismos infecciosos ou diretamente ao organismo ou mesmo qualquer indivíduo que vive em uma área onde um organismo infeccioso ou um alérgeno tenha sido identificado. Indivíduos em risco de desenvolver infecção também incluem populações em geral às quais uma agência médica recomenda vacinação com um antígeno de organismo infeccioso em particular. Se o antígeno é um alérgeno e o indivíduo desenvolve respostas alérgicas a esse antígeno em particular e o indivíduo é exposto ao antígeno, isto é, durante estação de pólen, então, esse indivíduo está em risco de exposição ao antígeno. Um indivíduo em risco de desenvolver alergia ou asma inclui aqueles indivíduos que foram identificados como tendo uma alergia ou asma, mas que não têm a doença ativa durante o tratamento com oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG, bem como indivíduos que são considerados em risco de desenvolver essas doenças em virtude de fatores genéticos ou ambientais.
[000143] Um indivíduo em risco de desenvolver um câncer é um que tem uma alta probabilidade de desenvolver câncer. Esses indivíduos incluem, por exemplo, indivíduos tendo uma anormalidade genética, a presença da qual foi demonstrada como tendo uma correlação com uma maior probabilidade de desenvolver um câncer e indivíduos expostos a agentes que causam câncer, tais como tabaco, amianto ou outras toxinas químicas ou um indivíduo que foi previamente tratado para câncer e está em evidente remissão. Quando um indivíduo em risco de desenvolver um câncer é tratado com um antígeno específico para o tipo de câncer ao qual o indivíduo está em risco de desenvolver e um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG, o indivíduo pode ser capaz de matar as células cancerígenas à medida que elas se desenvolvem. Se um tumor começa a se formar no indivíduo, o indivíduo desenvolverá uma resposta imune específica contra o antígeno tumoral.
[000144] Além do uso dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG para tratamento profilático, a invenção também abrange o uso dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG para o tratamento de um indivíduo tendo uma infecção, uma alergia, asma ou um câncer.
[000145] Um indivíduo tendo uma infecção é um indivíduo que foi exposto a um patógeno infeccioso e tem níveis detectáveis agudos ou crônicos do patógeno no corpo. Os oligonucleotídeos imunoesti- mulatórios de CpG podem ser usados com ou sem um antígeno para montar uma resposta imune sistêmica ou mucosal específica a antígeno que é capaz de reduzir o nível de ou erradicar o patógeno infeccioso. Uma doença infecciosa, conforme usado aqui, é uma doença que surge da presença de um micro-organismo estranho no corpo. É particularmente importante desenvolver estratégias de vacina e tratamentos eficazes para proteger as superfícies mucosais do corpo, as quais são o local primário de entrada patogênica.
[000146] Um indivíduo tendo uma alergia é um indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver uma reação alérgica em resposta a um alérgeno. Um alérgeno refere-se a uma hiper-sensibilidade adquirida a uma substância (alérgeno). Condições alérgicas incluem, mas não estão limitadas a, eczema, rinite alérgica ou coriza, febre do feno, conjuntivite, asma brônquica, urticária e alergias alimentares e outras condições atópicas.
[000147] Alergias são, em geral, causadas pela geração de anticorpo IgE contra alérgenos prejudiciais. As citocinas que são induzidas através de administração sistêmica ou mucosal de oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são predominantemente de uma classe denominada Th1 (exemplos são IL-12, IP-10, IFN-a e IFN-y) e essas induzem à respostas imunes humorais e celulares. O outro principal tipo de resposta imune a qual está associada à produção de citocinas IL-4 e IL-5 é denominado uma resposta imune Th2. Em geral, parece que doenças alérgicas são mediadas por respostas imunes do tipo Th2. Baseado na capacidade dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG de desviar a resposta imune em um indivíduo de uma resposta Th2 predominante (a qual está associada à produção de anticorpos IgE e alergia) para uma resposta Th2/Th1 equilibrada (a qual é protetora contra reações alérgicas), uma dose eficaz para indução de uma resposta imune de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrada a um indivíduo para tratar ou prevenir asma e alergia.
[000148] Assim, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG têm utilidade terapêutica significativa no tratamento de condições alérgicas e não alérgicas, tais como asma. Citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, estão elevadas nas vias aéreas de indivíduos asmáticos. Essas citocinas promovem aspectos importantes da resposta inflamatória asmática, incluindo troca de isotipo IgE, quimiotaxia de eosinófilos e ativação e crescimento de mastócitos. Citocinas Th1, especialmente IFN-Y e IL-12, podem suprimir a formação de clones de Th2 e a produção de citocinas Th2. Asma refere-se a um distúrbio do sistema respiratório caracterizado por inflamação, estreitamento das vias aéreas e reatividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. A asma está frequente, embora não exclusivamente, associada a sintomas atópicos ou alérgicos.
[000149] Um indivíduo tendo um câncer é um indivíduo que tem células cancerígenas detectáveis. O câncer pode ser um câncer maligno ou não-maligno. Cânceres ou tumores incluem, mas não estão limitados a, câncer do trato biliar; câncer de cérebro; câncer de mama; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon; câncer endometrial; câncer esofageal; câncer gástrico; neoplasmas intraepiteliais; linfomas; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, células pequenas e células não-pequenas); melanoma; neuroblastomas; câncer oral; câncer ovariano; câncer de pâncreas; câncer de próstata; câncer retal; sarcomas; câncer de pele; câncer testicular; câncer da tiróide; e câncer renal, bem como outros carcinomas e sarcomas. Em uma modalidade, o câncer é leucemia de células pilosas, leucemia mielogênea crônica, leucemia de células T cutâneas, mieloma múltiplo, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, carcinoma de células da bexiga ou carcinoma de cólon.
[000150] Um indivíduo significará um ser humano ou animal vertebrado incluindo, mas não limitado a, um cão, gato, cavalo, vaca, porco, ovelha, cabra, peru, galinha, primata, por exemplo, macaco e peixe (espécies de aquicultura), por exemplo, salmão. Assim, a invenção também pode ser usada para tratar câncer e tumores, infecções e alergia/asma em indivíduos não humanos. Câncer e uma das causas de morte em animais de companhia (isto é, cães e gatos).
[000151] Conforme usado aqui, o termo tratar, tratado ou tratamento, quando usado com relação a um distúrbio, tal como uma doença infecciosa, câncer, alergia ou asma, refere-se a um tratamento profilático o qual aumenta a resistência de um indivíduo ao desenvolvimento da doença (por exemplo, à infecção com um patógeno) ou, em outras palavras, diminui a probabilidade de que o indivíduo desenvolva a doença (por exemplo, se torne infectado com o patógeno), bem como um tratamento após o indivíduo ter desenvolvido a doença de modo a combater a doença (por exemplo, reduzir ou eliminar a infecção) ou impedir que a doença se torne pior.
[000152] Nos casos quando o oligonucleotídeo de CpG é administrado com um antígeno, o indivíduo pode ser exposto ao antígeno. Conforme usado aqui, o termo exposto refere-se à etapa ativa de contato do indivíduo com um antígeno ou à exposição passiva do indivíduo ao antígeno in vivo. Métodos para a exposição ativa de um indivíduo a um antígeno são bem conhecidos na técnica. Em geral, um antígeno é administrado diretamente ao indivíduo através de qualquer meio, tal como administração intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, mucosal, intranasal, intratraqueal ou subcutânea. O antígeno pode ser administrado sistêmica ou localmente. Métodos para administração do antígeno e do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG são descritos em maiores detalhes abaixo. Um indivíduo é passivamente exposto a um antígeno se um antígeno se torna disponível para exposição às células imunes no corpo. Um indivíduo pode ser passivamente exposto a um antígeno, por exemplo, através de entrada de um patógeno estranho no corpo ou através do desenvolvimento de uma célula tumoral expressando um antígeno estranho sobre sua superfície.
[000153] Os métodos nos quais um indivíduo é passivamente exposto a um antígeno podem ser particularmente dependentes da sincronização de administração do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG. Por exemplo, em um indivíduo em risco de desenvolver um câncer ou uma doença infecciosa ou uma resposta alérgica ou asmática, o indivíduo pode ser administrado com o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG em uma base regular quando esse risco é maior, isto é, durante uma estação de alergia ou após exposição a um agente que causa câncer. Adicionalmente, o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrado a viajantes antes que eles viagem para países estrangeiros onde eles estão em risco de exposição a agentes infecciosos. Da mesma forma, o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrado a soldados ou civis em risco de exposição à guerra biológica para induzir a uma resposta imune sistêmica ou mucosal ao antígeno quando e se o indivíduo for exposto ao mesmo.
[000154] Um antígeno, conforme usado aqui, é uma molécula capaz de provocar uma resposta imune. Antígenos incluem, mas não estão limitados a, células, extratos de células, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeos, mímicos de polissacarídeo de peptídeo e não-peptídeo e outras moléculas, pequenas moléculas, lipídios, glicolipídios, carboidratos, vírus e extratos virais e organismos multicelulares, tais como parasitas e alérgenos. O termo antígeno inclui, amplamente, qualquer tipo de molécula a qual é reconhecida pelo sistema imune do hospedeiro como sendo estranho. Antígenos incluem, mas não estão limitados a, antígenos cancerígenos, antígenos microbianos e alérgenos.
[000155] Um antígeno cancerígeno, conforme usado aqui, é um composto, tal como um peptídeo ou proteína, associado à superfície celular de um tumor ou câncer e o qual é capaz de provocar uma resposta imune quando expresso sobre a superfície de uma célula apresentando antígeno no contexto de uma molécula do MHC. Antígenos cancerígenos podem ser preparados a partir de células cancerígenas através de preparo de extratos brutos de células cancerígenas, por exemplo, conforme descrito em Cohen et. al., 1994, Cancer Research, 54: 1055, através de purificação parcial dos antígenos, através da tecnologia recombinante ou através da síntese de novo de antígenos conhecidos. Antígenos cancerígenos incluem, mas não estão limitados a, antígenos que são recombinantemente expressos, uma porção imunogênica de ou todo um tumor ou câncer. Tais antígenos podem ser isolados ou preparados recombinantemente ou através de qualquer outro meio conhecido na técnica.
[000156] Um antígeno microbiano, conforme usado aqui, é um antígeno de um micro-organismo e inclui, mas não está limitado a, vírus, bactérias, parasitas e fungos. Tais antígenos incluem o microorganismo intacto, bem como isolados naturais e fragmentos ou derivados dos mesmos e também compostos sintéticos os quais são idênticos a ou similares a antígenos de micro-organismo naturais e induzem a uma resposta imune específica para esse micro-organismo. Um composto é simular a um antígeno de micro-organismo natural se ele induz a uma resposta imune (humoral e/ou celular) a um antígeno de micro-organismo natural. Tais antígenos são usados rotineiramente na técnica e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[000157] Vírus são pequenos agentes infecciosos os quais geralmente contêm um núcleo de ácido nucleico e um revestimento de proteína, mas não são organismos vivos independentes. Vírus podem tomar também a forma de ácidos nucleicos infecciosos carecendo de uma proteína. Um vírus não pode sobreviver na ausência de uma célula viva, dentro da qual ele se replica. Vírus entram em células vivas específicas através de endocitose ou injeção direta de DNA (fago) e se multiplicam, causando doença. O vírus multiplicado pode, então, ser liberado e infectar células adicionais. Alguns vírus são vírus contendo DNA e outros são vírus contendo RNA. Vírus de DNA incluem Pox, Herpes, Adeno, Papova, Parvo e Hepadna. Vírus de RNA incluem Picorna, Calici, Astro,Toga, Flavi, Corona, Paramyxo, Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, Filo, Borna, Reo e Retro. Em alguns aspectos, a invenção também se destina a tratar doenças nas quais prions estão implicados na progressão da doença tais como, por exemplo, encefalopatia espongiforme bovina (isto é, doença da vaca louca, BSE) ou infecção paraplexia enzoótica em animais ou doença de Creutzfeldt- Jakob em seres humanos.
[000158] Vírus incluem, mas não estão limitados a, enterovírus (incluindo, mas não limitado a, vírus da família picornaviridae, tais como o pólio vírus, vírus Coxsackie, eco vírus), rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite, tal como hepatite A, B, C D e E. Exemplos específicos de vírus que foram encontrados em seres humanos incluem, mas não estão limitados a: Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, tal como HIV-1 (também referido como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV ou HIV-III; e outros isolados, tal como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, pólio vírus, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, ebola vírus); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da parainfluenza, vírus da catapora, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza); Bunyaviridae (por exemplo, vírus de Hantaan, bunya vírus, flebovírus e Nairo vírus); Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus, polioma vírus); Adenoviridae (a maioria dos adenovírus); Herpesviridae (vírus do herpes simplex (HSV) 1 e 2, vírus da varicela zoster, citomegalovírus (CMV)); Poxviridae (vírus da varíola, vírus da vaccinia, pox vírus); Iridoviridae (por exemplo, vírus da febre suína Africana); e outros vírus, tais como vírus da laringotraqueobronquite aguda, Alfavírus, herpes vírus sarcoma de Kaposi-associado, vírus da doença de Newcastle, Nipah vírus, Norwalk vírus, Papilomavírus, vírus da parainfluenza, influenza aviária, vírus da SARs, vírus West Nile.
[000159] Os métodos da invenção são particularmente úteis, em algumas modalidades, para o tratamento de vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da hepatite. O HIV, uma espécie de retrovírus, também conhecido como vírus III linfotrópico de células T humanas (HTLV III), é responsável por causar a deterioração que resulta no distúrbio conhecido como AIDS. O HIV infecta e destrói células T, alterando o equilíbrio global do sistema imune, resultando em uma perda da capacidade dos pacientes de combater outras infecções e predispondo o paciente à infecções oportunistas, as quais frequentemente provam ser fatais.
[000160] A hepatite viral é uma inflamação do fígado a qual pode produzir inchaço, dor e algumas vezes dano permanente ao fígado. Se a inflamação do fígado continua pelo menos seis meses ou mais, ela é referida como hepatite crônica. Existem pelo menos cinco vírus diferentes conhecidos por causar hepatite viral, incluindo hepatite A, B, C, D e E. A hepatite A é geralmente transmitida através de alimento ou água contaminada com fezes humanas. A hepatite B é geralmente transmitida através de fluidos corporais, tal como sangue. Por exemplo, ela pode ser transmitida da mãe para a criança ao nascer, através de contato sexual, transfusões de sangue e agulhas contaminadas. A hepatite C é muito comum e, assim como a hepatite B, é frequentemente transmitida através de transfusões de sangue e agulhas contaminadas. A hepatite D é encontrada mais frequentemente em usuários de drogas IV que são portadores do vírus da hepatite B com ele se co-associa. A hepatite E é similar à hepatite A viral e está geralmente associado à pobre sanitarização.
[000161] Bactérias gram negativas e gram positivas servem como antígenos em animais vertebrados. Tais bactérias gram positivas incluem, mas não estão limitadas a, espécies Pasteurella, espécies Staphilococci e espécies Streptococcus. Bactérias gram negativas incluem, mas não estão limitadas a, espécies Escherichia coli, Pseudomonas e espécies Salmonella. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem, mas não estão limitados a, Helicobacter piloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por exemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphilococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococo do Grupo A), Streptococcus agalactiae (Estreptococo do Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (sps. anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campilobacter sp. patogênico, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopatiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia e Actinomyces israelli.
[000162] Exemplos de fungos incluem Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
[000163] Outros organismos infecciosos (isto é, protistas) incluem Plasmodium spp. tais como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax e Toxoplasma gondii. Parasitas teciduais e/ou trazidos no sangue incluem Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense e Trypanosoma rhodesiense (doença do sono Africana), Trypanosoma cruzi (doença de Chagas) e Toxoplasma gondii.
[000164] Outros micro-organismos medicamente relevantes foram descritos extensivamente na literatura, por exemplo, veja C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
[000165] Um alérgeno refere-se a uma substância (antígeno) que pode induzir a uma resposta alérgica ou asmática em um indivíduo suscetível. A lista de alérgenos é enorme e pode incluir polens, venenos de inseto, pó de caspa animal, esporos fúngicos e fármacos (por exemplo, penicilina). Exemplos de alérgenos naturais, de animal e planta incluem, mas não estão limitados a, proteínas específicas aos seguintes gêneros: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por exemplo, Lolium perenne ou Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por exemplo, Parietaria officinalis ou Parietaria judaica); Blattella (por exemplo, Blattella germanica); Apis (por exemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por exemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressus macrocarpa); Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis e Juniperus ashei); Thuya (por exemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por exemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por exemplo, Agropyron repens); Secale (por exemplo, Secale cereale); Triticum (por exemplo, Triticum aestivum); Dactilis (por exemplo, Dactilis glomerata); Festuca (por exemplo, Festuca elatior); Poa (por exemplo, Poa pratensis ou Poa compressa); Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (por exemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por exemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (por exemplo, Agrostis alba); Phleum (por exemplo, Phleum pratense); Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por exemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis); e Bromus (por exemplo, Bromus inermis).
[000166] O termo substancialmente purificado, conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo o qual é substancialmente isento de outras proteínas, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais ele está naturalmente associado. Aqueles versados na técnica podem purificar polipeptídeos virais ou bacterianos usando técnicas padrões para purificação de proteína. O polipeptídeo substancialmente puro frequentemente proporcionará uma única banda principal sobre um gel de poliacrilamida de não redução. No caso de polipeptídeos parcialmente glicosilados ou aqueles que têm vários códons iniciais, podem haver várias bandas sobre um gel de poliacrilamida de não redução, mas essas formarão um padrão distintivo para esse polipeptídeo. A pureza do polipeptídeo viral ou bacteriano também pode ser determinada através de análise de sequência de aminoácido amino terminal. Outros tipos de antígeno não codificados por um vetor de ácido nucleico, tais como polissacarídeos, pequenas moléculas, mímicos, etc. estão incluídos dentro da invenção.
[000167] Os oligonucleotídeos da invenção podem ser administrados a um indivíduo com um agente antimicrobiano. Um agente antimicrobiano, conforme usado aqui, refere-se a um composto sintético ou que ocorre naturalmente, o qual é capaz de matar ou inibir microorganismos infecciosos. O tipo de agente antimicrobiano útil de acordo com a invenção dependerá do tipo de micro-organismo com o qual o indivíduo é infectado ou está em risco de se tornar infectado. Agentes antimicrobianos incluem, mas não estão limitados a, agentes antibacterianos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e agentes antiparasíticos. Frases tais como "agente anti-infeccioso", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifúngico", "agente antiparasítico" e "parasiticida" têm significados bem estabelecidos por aqueles versados na técnica e são definidos em textos médicos padrões. Resumidamente, agentes antibacterianos matam ou inibem bactérias e incluem antibióticos, bem como outros compostos sintéticos ou naturais tendo funções similares. Antibióticos são moléculas de baixo peso molecular as quais são produzidas como metabolitos secundários por células, tais como micro-organismos. Em geral, antibióticos interferem com uma ou mais funções ou estruturas bacterianas as quais são específicas para o micro-organismo e as quais não estão presentes em células hospedeiras. Agentes antivirais podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados e são úteis para matar ou inibir vírus. Agentes antifúngicos são usados para tratar infecções fúngicas superficiais, bem como infecções fúngicas oportunísticas e sistêmicas primárias. Agentes antiparasíticos matam ou inibem parasitas.
[000168] Exemplos de agentes antiparasíticos, também referidos como parasiticidas, úteis para administração a seres humanos incluem, mas não estão limitados a, albendazola, anfotericina B, benzimidazol, bitionol, cloroquina HCl, fosfato de cloroquina, clindamicina, dehidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflornitina, furazolidona, glicocorticóides, halofantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazola, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazola, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanil, pamoato de pyrantel, pirimetanamina- sulfonamidas, pirimetanamina-sulfadoxina, quinacrina HCl, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato sódico (gluconato de antimônio de sódio), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazola, tinidazola, trimetroprim-sulfametoxazola e triparsamida, alguns dos quais são usados apenas ou em combinação com outras.
[000169] Agentes antibacterianos matam ou inibem o crescimento ou função de bactérias. Uma grande classe de agentes antibacterianos são antibióticos. Antibióticos os quais são eficazes para matar ou inibir uma ampla faixa de bactérias são referidos como antibióticos de amplo espectro. Outros tipos de antibióticos são predominantemente eficazes contra as bactérias da classe gram positiva ou gram negativa. Esses tipos de antibióticos são referidos como antibióticos de espectro limitado. Outros antibióticos os quais são eficazes contra um único organismo ou doença e não contra outros tipos de bactérias são referidos como antibióticos de espectro limitado. Agentes antibacterianos são, algumas vezes, classificados baseado no modo primário de ação. Em geral, agentes antibacterianos são inibidores da síntese da parede celular, inibidores da membrana celular, inibidores da síntese de proteína, inibidores da síntese de ácido nucleico ou funcionais e inibidores competitivos.
[000170] Agentes antivirais são compostos os quais impedem a infecção de células por vírus ou a replicação do vírus dentro da célula. Existem muito menos fármacos antivirais do que fármacos antibacterianos porque o processo de replicação viral é tão próximo da replicação de DNA dentro da célula hospedeira que agentes antivirais não específicos frequentemente são tóxicos para o hospedeiro. Existem vários estágios dentro do processo de infecção viral os quais podem ser bloqueados ou inibidos por agentes antivirais. Esses estágios incluem fixação do vírus à célula hospedeira (imunoglobulina ou peptídeos de ligação), não revestimento do vírus (por exemplo, amantadina), síntese ou tradução de mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação de RNA ou DNA viral (por exemplo, análogos de nucleotídeo), maturação de novas proteínas virais (por exemplo, inibidores de protease) e surgimento e liberação do vírus.
[000171] Análogos de nucleotídeo são compostos sintéticos os quais são similares aos nucleotídeos, mas os quais têm um grupo desoxirribose ou ribose anormal ou incompleto. Uma vez que os análogos de nucleotídeo estão na célula, eles são fosforilados, produzindo o trifosfato formado o qual compete com nucleotídeos normais pela incorporação no DNA ou RNA viral. Uma vez que a forma de trifosfato do análogo de nucleotídeo é incorporada na cadeia de ácido nucleico em crescimento, ela causa associação irreversível com a polimerase viral e, assim, término de cadeia. Análogos de nucleotídeo incluem, mas não estão limitados a, aciclovir (usado para o tratamento do vírus do herpes simplex e vírus de varicela-zoster), ganciclovir (útil para o tratamento de citomegalovírus), idoxuridina, ribavirina (útil para o tratamento de vírus sincicial respiratório), dideóxiinosina, dideóxicitidina, zidovudina (azidotimidina), imiquimod e resimiquimod.
[000172] Os interferons são citocinas as quais são secretadas por células infectadas com vírus, bem como células imunes. Os interferons funcionam através de ligação a receptores específicos sobre células adjacentes às células infectadas, causando a alteração na célula a qual a protege contra infecção pelo vírus. α e β-interferon também induzem à expressão de moléculas do MHC da Classe I e da Classe II sobre a superfície de células infectadas, resultando em apresentação aumentada de antígeno para reconhecimento por células imunes do hospedeiro. α e β-interferons estão disponíveis como formas recombinantes e têm sido usados para o tratamento de infecção crônica por hepatite B e C. Nas dosagens as quais são eficazes para terapia antiviral, interferons têm vários efeitos colaterais, tais como febre, mal estar e perda de peso.
[000173] Agentes antivirais úteis na invenção incluem, mas não estão limitados a, imunoglobulinas, amantadina, interferons, análogos de nucleotídeo e inibidores de protease. Exemplos específicos de antivirais incluem, mas não estão limitados a, Acemannan; Aciclovir; Aciclovir Sódico; Adefovir; Alovudina; Alvircept Sudotox; Hidrocloreto de Amantadina; Aranotina; Arildona; Mesilato de Atevirdina; Avridina; Cidofovir; Cipanfillina; Hidrocloreto de Citarabina; Mesilato de Delavirdina; Desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Edoxudina; Enviradeno; Enviroxima; Famciclovir; Hidrocloreto de Famotina; Fiacitabina; Fialuridina; Fosarilato; Foscarnet Sódico; Fosfonet Sódico; Ganciclovir; Ganciclovir Sódico; Idoxuridina; Kethoxal; Lamivudina; Lobucavir; Hidrocloreto de Memotina; Metisazona; Nevirapina; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirina; Hidrocloreto de Rimantadina; Mesilato de Saquinavir; Hidrocloreto de Somantadina; Sorivudina; Statolon; Estavudina; Hidrocloreto de Tilorona; Trifluridina; Hidrocloreto de Valaciclovir; Vidarabina; Fosfato de Vidarabina; Fosfato de sódio de Vidarabina; Viroxima; Zalcitabina; Zidovudina; e Zinviroxima.
[000174] Agentes antifúngicos são úteis para o tratamento e prevenção de fungos infecciosos. Agentes antifúngicos são, algumas vezes, classificados por seu mecanismo de ação. Alguns agentes antifúngicos funcionam como inibidores da parede celular através de inibição da sintase de glicose. Esses incluem, mas não estão limitados a, basiungina/ECB. Outros agentes antifúngicos funcionam através de desestabilização de integridade da membrana. Esses incluem, mas não estão limitados a, imidazolas, tais como clotrimazola, sertaconzola, fluconazola, itraconazola, cetoconazola, miconazola e voriconacola, bem como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina e terbinafina. Outros agentes antifúngicos funcionam através de ruptura de quitina (por exemplo, quitinase) ou imuno-supressão (creme 501).
[000175] Oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser combinados com outros agentes terapêuticos, tais como adjuvantes, para intensificar respostas imunes. O oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e outros agentes terapêuticos podem ser administrados simultânea ou sequencialmente. Quando os outros agentes terapêuticos são administrados simultaneamente, eles podem ser administrados na mesma ou em formulações distintas, mas são administrados ao mesmo tempo. Os outros agentes terapêuticos são administrados sequencialmente uns com os outros e com um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG, quando a administração dos outros agentes terapêuticos e do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG é temporariamente separada. A separação no tempo entre a administração desses compostos pode ser uma questão de minutos ou pode ser mais longa. Outros agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes, citocinas, anticorpos, antígenos, etc.
[000176] As composições da invenção podem também ser administradas com adjuvantes que não são de ácido nucleico. Um adjuvante que não é de ácido nucleico é qualquer molécula ou composto, exceto quanto aos oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG descritos aqui, a qual pode estimular a resposta imune humoral e/ou celular. Adjuvantes que não são de ácido nucleico incluem, por exemplo, adjuvantes que criam um efeito de depósito, adjuvantes de estimulação imune e adjuvantes que criam um efeito de depósito e estimulam o sistema imune.
[000177] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são também úteis como adjuvantes mucosais. Descobriu-se anteriormente que a imunidade sistêmica e mucosal é induzida pela distribuição mucosal de ácidos nucleicos de CpG. Assim, os oligonucleotídeos podem ser administrados em combinação com outros adjuvantes mucosais.
[000178] Respostas imunes podem também ser induzidas ou aumentadas através da coadministração ou expressão colinear de citocinas (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et. al., 1997; Geissler et. al.,1997; Iwasaki et. al.,1997; Kim et. al.,1997) ou moléculas coestimulatórias B7 (Iwasaki et. al.,1997; Tsuji et. al.,1997) com os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG. O termo citocina é usado como um nome genérico para um grupo diverso de proteínas solúveis e peptídeos os quais atuam como reguladores hormonais em concentrações nano- a picomolar e os quais, sob condições normais ou patológicas, modulam as atividade funcionais de células e tecidos individuais. Essas proteínas também mediam interações entre células diretamente e regulam processos que ocorrem no ambiente extracelular. Exemplos de citocinas incluem, mas não estão limitados a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), interferon-α (α-IFN), IFN-β, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-β, ligante FLT-3 e ligante CD40.
[000179] Os oligonucleotídeos são também úteis para redirecionamento de uma resposta imune de uma resposta imune Th2 para uma resposta imune Th1. Isso resulta na produção de um ambiente Th1/Th2 relativamente equilibrado. Redirecionamento de uma resposta imune de uma resposta imune Th2 para Th1 pode ser avaliado através de medição dos níveis de citocinas produzidas em resposta ao ácido nucleico (por exemplo, através de indução de células monocíticas e outras células a produzir citocinas Th1, incluindo IL-12, IFN-α e GM- CSF). O redirecionamento ou reequilíbrio da resposta imune de uma resposta Th2 para Th1 é particularmente útil para o tratamento ou prevenção de asma. Por exemplo, uma quantidade eficaz para tratamento de asma pode ser aquela quantidade útil para redireciona- mento de uma resposta imune do tipo Th2 que está associada à asma para uma resposta do tipo Th1 ou um ambiente Th1/Th2 equilibrado. Citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, estão elevadas nas vias aéreas de indivíduos asmáticos. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG da invenção causam um aumento em citocinas Th1, o que ajuda a reequilibrar o sistema imune, prevenindo ou reduzindo os efeitos adversos associados a uma resposta imune predominantemente Th2.
[000180] Os oligonucleotídeos da invenção podem também ser úteis para o tratamento de remodelamento das vias aéreas. Remodelamento das vias aéreas resulta de proliferação de células do músculo liso e/ou espessamento submucosal nas vias aéreas e, por fim, causa estreitamento das vias aéreas, levando a um fluxo de ar restrito. Os oligonucleotídeos da invenção podem prevenir remodelamento adicional e possivelmente mesmo reduzir o desenvolvimento tecidual resultante do processo de remodelamento.
[000181] Os oligonucleotídeos são também úteis para melhorar a sobrevivência, diferenciação, ativação e maturação de células dendríticas. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG têm a capacidade única de promover a sobrevivência, diferenciação, ativação e maturação de células dendríticas.
[000182] Oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG também aumentam a atividade lítica de células assassinas naturais e a citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). A ADCC pode ser obtida usando um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG em combinação com um anticorpo específico para um alvo celular, tal como uma célula cancerígena. Quando o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG é administrado a um indivíduo em conjunto com o anticorpo, o sistema imune do indivíduo é induzido a matar a célula tumoral. Os anticorpos úteis no procedimento de ADCC incluem anticorpos os quais interagem com uma célula no corpo. Muitos de tais anticorpos específicos para alvos celulares foram descritos na técnica e muitos estão comercialmente disponíveis.
[000183] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem também ser administrados em conjunto com uma terapia anticâncer. Terapias anticâncer incluem medicamentos para o câncer, radiação e procedimentos cirúrgicos. Conforme usado aqui, um "medicamento para o câncer" refere-se a um agente o qual é administrado a um indivíduo para fins de tratamento de um câncer. Conforme usado aqui, "tratamento de câncer" inclui prevenção do desenvolvimento de um câncer, redução dos sintomas de câncer e/ou inibição do crescimento de um câncer estabelecido. Em outros aspectos, o medicamento para câncer é administrado a um indivíduo em risco de desenvolver um câncer para fins de redução do risco de desenvolvimento de câncer. Vários tipos de medicamentos para o tratamento de câncer são descritos aqui. Para fins da presente especificação, medicamentos para o câncer são classificados como agentes quimioterapêuticos, agentes imunoterapêuticos, vacinas contra o câncer, terapia hormonal e modificadores de resposta biológica.
[000184] Adicionalmente, os métodos da invenção se destinam a abranger o uso de mais de um medicamento para o câncer junto com os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG. Como um exemplo, onde apropriado, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser administrados com um agente quimioterapêutico e um agente imunoterapêutico. Alternativamente, o medicamento para o câncer pode abranger um agente imunoterapêutico e uma vacina contra o câncer ou um agente quimioterapêutico e uma vacina contra o câncer ou um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico e uma vacina contra o câncer, todos administrados a um indivíduo para fins de tratamento de um indivíduo tendo um câncer ou em risco de desenvolver um câncer.
[000185] O agente quimioterapêutico pode ser selecionado do grupo consistindo em metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitrosouréias não contendo açúcar, 5-fluorouracila, mitomicina C, bleomicina, doxorubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina, carmustina e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inibidor de farnesil transferase RAS, inibidor de famesil transferase, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP- 470, Hycamtina/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantro- na/Mitroxantrona, Metaret/Suramina, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK- 432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estrôncio, Temodal/Te- mozolomida, Evacet/doxorubicina lipossômica, Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon/Doxifluridina, Ciclo- pax/paclitaxel oral, Taxóide Oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/Flavo- piridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inibidor de oncogene RAS, BMS-182751/platina oral, UFT(Tegafur/Uracila), Ergamisol/Levamisola, Eniluracil/776C85/intensificador de 5FU, Campto/Levamisola, Campto- sar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatina/Cladribina, Paxex/Pacli- taxel, Doxil/doxorubicina lipossômica, Caelyx/doxorubicina lipossômica, Fludara/Fludarabina, Farmarubicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastaína, Caetyx/doxorubicina lipossômica, Gemzar/Gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, sementes de lodina, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Teniposídeo, Paraplatina/Carboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepesida/Etoposídeo, ZD 9331, Taxotero/Docetaxel, pró-fármaco de arabinosídeo de guanina, análogo de Taxano, nitrosouréias, agentes de alquilação, tais como melphelan e ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginase, Busulfan, Carboplatina, Clorombucila, Citarabina HCl, Dactinomicina, Daunoru- bicina HCl, fosfato sódico de Estramustina, Etoposídeo (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracila (5-FU), Flutamida, Hidróxiuréia (hidróxicar- bamida), Ifosfamida, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, acetato de Leuprolida (análogo de fator de liberação de LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloretamina HCl (mostarda de nitrogênio), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano (o.p'-DDD), Mitoxantrona HCl, Octreotídeo, Plicamicina, Procarbazina HCl, Estreptozocina, citrato de Tamoxifeno, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoietina, Hexametilmelamina (HMM), Interleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metila glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2’deóxicoformicina), Semustina (metil-CCNU), Teniposídeo (VM-26) e sulfato de Vindesina, mas não estão assim limitados.
[000186] O agente imunoterapêutico pode ser selecionado do grupo consistindo em Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, antiVEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA, mas não está assim limitado.
[000187] A vacina contra câncer pode ser selecionada do grupo consistindo em EGF, vacinas contra câncer anti-idiotípicas, antígeno Gp75, vacina contra melanoma GMK, vacina conjugada com gangliosídeo MGV, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, teratopo STn-KHL, BLP25 (MUC-1), vacina idiotípica lipossômica, Melacine, vacinas de antígeno peptídico, vacinas de toxina/antígeno, vacina MVA- baseada, PACIS, vacina BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-vírus e ImmuCyst/TheraCys, mas não está assim limitada.
[000188] O uso de oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG em conjunto com agentes imunoterapêuticos, tais como anticorpos monoclonais, é capaz de aumentar a sobrevivência a longo prazo através de uma série de mecanismos, incluindo intensificação significativa de ADCC (conforme discutido acima), ativação de células assassinas naturais (NK) e aumento nos níveis de IFNa. Os ácidos nucleicos, quando usados em combinação com anticorpos monoclonais, servem para reduzir a dose do anticorpo requerida para obter um resultado biológico.
[000189] Conforme usado aqui, os termos "antígeno cancerígeno" e "antígeno tumoral" são usados permutavelmente para se referir a antígenos os quais são diferencialmente expressos por células cancerígenas e podem, desse modo, ser explorados de forma a objetivar células imunes. Antígenos cancerígenos são antígenos os quais podem estimular potencialmente respostas imunes evidentemente tumor-específicas. Alguns desses antígenos são codificados, embora não necessariamente expressos, por células normais. Esses antígenos podem ser caracterizados como aqueles os quais normalmente estão silenciosos (isto é, não-expressos) em células normais, aqueles que são expressos apenas em determinados estágios de diferenciação e aqueles que são temporariamente expressos, tais como antígenos embriônicos e fetais. Outros antígenos cancerígenos são codificados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene rãs ativado), genes supressores (por exemplo, mutante p53), proteínas de fusão resultantes de deleções internas ou translocações cromossômicas. Ainda outros antígenos cancerígenos podem ser codificados por genes virais, tais como aqueles trazidos sobre vírus de tumor de RNA e DNA.
[000190] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG também são úteis para o tratamento e prevenção de doença autoimune. Doença autoimune é uma classe de doenças nas quais os próprios anticorpos do indivíduo reagem com tecido hospedeiro ou na qual células T efetuadoras imunes são autoreativas a autopeptídeos endógenos e causam destruição tecidual. Assim, uma resposta imune é montada contra os próprios antígenos do indivíduo, referidos como autoantígenos. Doenças autoimunes incluem, mas não estão limitadas a, artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múltipla, lupus eritematoso sistêmico (SLE), encefalomielite autoimune, miastenia gravis (MG), tiroidite de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgaris), doença de Grave, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia púrpura autoimune, escleroderma com anticorpos anticolágeno, doença mista do tecido conectivo, polimiosite, anemia perniciosa, doença idiopática de Addison, infertilidade autoimune-associada, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulonefrite crescêntica, glomerulonefrite proliferativa), penfigóide bolhoso, síndrome de Sjogren, resistência à insulina e diabetes mellitus autoimune. Syndrome, insulin resistance e autoimmune diabetes mellitus.
[000191] Um "autoantígeno", conforme usado aqui, refere-se a um antígeno de um tecido hospedeiro normal. Tecido hospedeiro normal não inclui células cancerígenas. Assim, uma resposta imune montada contra um autoantígeno, no contexto de uma doença autoimune, é uma resposta imune indesejável e contribui para a destruição e dano do tecido normal, enquanto que uma resposta imune montada contra um antígeno cancerígeno é uma resposta imune desejável e contribui para a destruição do tumor ou câncer. Assim, em alguns aspectos da invenção objetivados ao tratamento de distúrbios autoimunes, não é recomendado que os ácidos nucleicos imunoestimulatórios de ODN sejam administrados com autoantígenos, particularmente aqueles que são os alvos do distúrbio autoimune.
[000192] Em outros casos, os ácidos nucleicos imunoestimulatórios de CpG podem ser distribuídos com baixas doses de autoantígenos. Uma série de estudos com animais demonstrou que a administração mucosal de baixas doses de antígeno pode resultar em um estado de hipo-responsividade imune ou "tolerância". O mecanismo ativo parece ser um desvio imune citocina-mediado de uma resposta Th1 para predominantemente Th2 e Th3 (isto é, TGF-a dominado). A supressão ativa com baixa dose de antígeno pode também suprimir uma resposta imune desregulada (supressão "bystander") a qual é de interesse considerável na terapia de doenças autoimunes, por exemplo, artrite reumatóide e SLE. A supressão "bystander" envolve a secreção de citocinas supressoras contrarregulatórias de Th1 no ambiente local onde citocinas pró-inflamatórias e Th1 são liberadas de uma maneira antígeno-específica ou não antígeno-específica. "Tolerância", conforme usado aqui, é usada para se referir a esse fenômeno. Na verdade, a tolerância oral tem sido eficaz no tratamento de uma série de doenças autoimunes em animais, incluindo: encefalomielite autoimune experimental (EAE), miastenia gravis autoimune experimental; artrite colágeno-induzida (CIA) e diabetes mellitus insulina-dependente. Nesses modelos, a prevenção e supressão de doença autoimune estão associadas a um desvio em respostas celulares e humorais antígeno- específicas de uma resposta Th1 para Th2/Th3.
[000193] A invenção também inclui um método para indução de ativação imune inata não antígeno-específica e resistência de amplo espectro a estímulos infecciosos usando os oligonucleotídeos imunoestimulatório de CpG. O termo ativação imune inata não antígeno- específica, conforme usado aqui, refere-se à ativação de outras células imunes que não células B e, por exemplo, pode incluir a ativação de células NK, células T ou outras células imunes que podem responder de um modo independente de antígeno ou alguma combinação dessas células. Uma resistência de amplo espectro a estímulo infeccioso é induzida porque as células imunes estão em uma forma ativa e são produzidas para responder a qualquer composto ou micro-organismo invasor. As células não têm de ser especificamente produzidas contra um antígeno em particular. Isso é particularmente útil em bio-segurança e as outras circunstâncias descritas acima, tais como viajantes.
[000194] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser diretamente administrados ao indivíduo ou podem ser administrados em conjunto com um complexo de distribuição de ácido nucleico. Um complexo de distribuição de ácido nucleico significará uma molécula de ácido nucleico associada com (por exemplo, iônica ou covalentemente ligada a; ou encapsulada dentro de) um meio de objetivação (por exemplo, uma molécula que resulta em maior afinidade de ligação por uma célula-alvo). Exemplos de complexos de distribuição de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos associados a um esterol (por exemplo, colesterol), um lipídio (por exemplo, um lipídio catiônico, virossoma ou lipossoma) ou um agente de ligação específico a uma célula-alvo (por exemplo, um ligante reconhecido por um receptor específico a uma célula-alvo). Complexos preferidos podem ser suficientemente estáveis in vivo para impedir acoplamento significativo antes de internalização pela célula-alvo. Contudo, o complexo pode ser clivável sob condições apropriadas dentro da célula, de modo que o oligonucleotídeo é liberado em uma forma funcional.
[000195] Veículos de distribuição ou dispositivos de distribuição para distribuição de antígeno e os oligonucleotídeos às superfícies foram descritos. O oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e/ou o antígeno e/ou outros produtos terapêuticos podem ser administrados sozinhos (por exemplo, em solução salina ou tampão) ou usando quaisquer veículos de distribuição conhecidos na técnica. Por exemplo, os seguintes veículos de distribuição foram descritos: Cocleatos; Emulssomas, ISCOMs; Lipossomas; vetores bacterianos vivos (por exemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus); vetores virais vivos (por exemplo, Varíola, adenovírus, Herpes Simplex); Microesferas; vacinas de ácido nucleico; polímeros; anéis poliméricos; proteossomas; fluoreto de sódio; plantas transgênicas; virossomas; partículas vírus-semelhantes. Outros veículos de distribuição são conhecidos na técnica e alguns exemplos adicionais são fornecidos abaixo na discussão de vetores.
[000196] O termo quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG refere-se à quantidade necessária ou suficiente para obter um efeito biológico desejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG administrada com um antígeno para indução de imunidade mucosal é aquela quantidade necessária para causar o desenvolvimento de IgA em resposta a um antígeno quando de exposição ao antígeno, enquanto que a quantidade requerida para indução de imunidade sistêmica é aquela quantidade necessária para causar o desenvolvimento de IgG em resposta a um antígeno quando de exposição ao antígeno. Combinado com os ensinamentos fornecidos aqui, escolhendo dentre os vários compostos ativos e fatores de peso, tais como potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, gravidade de efeitos colaterais adversos e modo preferido de administração, um regime de tratamento profilático ou terapêutico eficaz pode ser planejado, o qual não causa toxicidade substancial e ainda é totalmente eficaz para tratar o indivíduo em particular. A quantidade eficaz para qualquer aplicação em particular pode variar, dependendo de fatores tais como a doença ou condição que está sendo tratada, o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG que está sendo administrado em particular, o tamanho do indivíduo ou a gravidade da doença ou condição. aqueles versados na técnica podem determinar empiricamente a quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG em particular e/ou antígeno e/ou outro agente terapêutico sem necessitar de experimentação indevida.
[000197] Doses em questão dos compostos descritos aqui para distribuição mucosal ou local oscilam, tipicamente, de cerca de 0,1 μg a 10 mg por administração a qual, dependendo da aplicação, poderia ser fornecido diariamente, semanalmente ou mensalmente e qualquer outra quantidade de tempo entre os mesmos. Mais tipicamente, doses mucosais ou locais oscilam de cerca de 10 μg a 5 mg por administração e, mais tipicamente, de cerca de 100 μg a 1 mg, com 2-4 administrações sendo espaçadas dias ou semanas de distância. Mais tipicamente, as doses de estimulante imune oscilam de 1 μg a 10 mg por administração e, mais tipicamente, 10 μg a 1 mg, com administrações diárias ou semanais. Doses em questão dos compostos descritos aqui para distribuição parenteral para fins de indução de uma resposta imune antígeno-específica, em que os compostos são distribuídos com um antígeno, mas não outro agente terapêutico são, tipicamente, 5 a 10.000 vezes maior do que a dose mucosal eficaz para adjuvante de vacina ou aplicações de estimulante imune e, mais tipicamente, 10 a 1.000 vezes maior e, mais tipicamente, 20 a 100 vezes maior. Doses dos compostos descritos aqui para distribuição parenteral para fins de indução de uma resposta imune inata ou para aumento de ADCC ou para indução de uma resposta imune antígeno-específica quando oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são administrados em combinação com outros agentes terapêuticos ou em veículos de distribuição especializados oscilam, tipicamente, de cerca de 0,1 μg a 10 mg por administração a qual, dependendo da aplicação, poderia ser fornecida diariamente, semanalmente ou mensalmente e qualquer outra quantidade de tempo entre os mesmos. Mais tipicamente, doses parenterais para essas finalidades oscilam de cerca de 10 μg a 5 mg por administração e, mais tipicamente, de cerca de 100 μg a 1 mg, com 2-4 administrações sendo espaçadas dias ou semanas. Em algumas modalidades, contudo, doses parenterais para essas finalidades podem ser usadas em uma faixa de 5 a 10.000 vezes maior do que as doses típicas descritas acima.
[000198] Para muitos compostos descritos aqui, as quantidades terapeuticamente eficazes podem ser inicialmente determinadas a partir de modelos animais. Uma dose terapeuticamente eficaz também pode ser determinada a partir de dados com seres humanos para oligonucleotídeos de CpG os quais foram testados em seres humanos (experimentos clínicos com seres humanos foram iniciados) e para compostos os quais são conhecidos por exibir atividades farmacológicas similares, tais como outros adjuvantes, por exemplo, LT e outros antígenos para fins de vacinação. Doses maiores podem ser requeridas para administração parenteral. A dose aplicada pode ser ajustada baseado na biodisponibi- lidade relativa e potência do composto administrado. Ajuste da dose para obter eficácia máxima baseado nos métodos descritos acima e outros métodos são bem conhecidos na técnica e está bem dentro das capacidades daqueles versados na técnica.
[000199] As formulações da invenção são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis as quais podem, rotineiramente, conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes de tamponamento, conservantes, veículos compatíveis, adjuvantes e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.
[000200] Para uso em terapia, uma quantidade eficaz do oligonucle- otídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrada a um indivíduo através de qualquer modo que distribui o oligonucleotídeo à superfície desejada, por exemplo, mucosal, sistêmica. administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser realizada através de qualquer meio conhecido por aqueles versados na técnica. Vias preferidas de administração incluem, mas não estão limitadas a, oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inalação, ocular, vaginal e retal.
[000201] Para administração oral, os compostos (isto é, oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG, antígenos e outros agentes terapêuticos) podem ser formulados prontamente através de combinação do(s) composto(s) ativo(s) com veículos farmaceuti- camente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Preparados farmacêuticos para uso oral podem ser obtidos como um excipiente sólido, opcionalmente trituração da mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparados de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidróxipropil metil celulose, carboximetil celulose de sódio e/ou polivinil pirrolidona (PVP). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinil pirrolidona reticulada, Agar ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões, isto é, EDTA para neutralização de condições ácidas internas ou podem ser administradas sem quaisquer veículos.
[000202] Também especificamente consideradas são formas de dosagem orais do componente ou componentes acima. O componente ou componentes podem ser quimicamente modificados, de modo que a distribuição oral do derivado seja eficaz. Geralmente, a modificação química considerada é a fixação de pelo menos uma porção à molécula do componente em si, onde a referida porção permite (a) a inibição de proteólise; e (b) a captação na corrente sanguíneo do estômago ou intestino. Também desejado é o aumento na estabilidade global do componente ou componentes e aumento do tempo em circulação no corpo. Exemplos de tais porções incluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e poliprolina. Abuchowski e Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" Em: Enzymes as Drugs, Hocenberg e Roberts, editores, Wiley-Interscience, New York, NY, páginas 367383; Newmark et. al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Outros polímeros que poderiam ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6- tioxocano. Preferidas para uso farmacêutico, conforme indicado acima, são porções de polietileno glicol.
[000203] Para o componente (ou derivado), o local de liberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno ou o íleo) ou o intestino grosso. Aqueles versados na técnica têm formulações disponíveis as quais não dissolvem no estômago, ao mesmo tempo em que liberam o material no duodeno ou mesmo no intestino. De preferência, a liberação evitará os efeitos prejudiciais do ambiente estomacal, quer através de proteção do oligonucleotídeo (ou derivado) ou através de liberação do material biologicamente ativo além do ambiente estomacal, tal como no intestino.
[000204] Para assegurar resistência gástrica total, um revestimento impermeável a um pH de pelo menos 5,0 é essencial. Exemplos dos ingredientes inertes mais comuns que são usados como revestimentos entéricos são trimelitato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidróxipropil metil celulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit L, Eudragit S e goma-laca. Esses revestimentos podem ser usados como filmes misturados.
[000205] Um revestimento ou mistura de revestimentos também pode ser usada sobre comprimidos, os quais não destinam à proteção contra o estômago. Esses podem incluir revestimentos de açúcar ou revestimentos os quais tornam o comprimido mais fácil de engolir. Cápsulas podem consistir de um envoltório rígido (tal como gelatina) para distribuição do produto terapêutico seco, isto é, pó; para formas líquidas, um envoltório de gelatina mole pode ser usado. O material do envoltório de sachês poderia ser amido espesso ou outro papel comestível. Para pílulas, comprimidos, comprimidos moldados ou triturados de comprimido, técnicas de formação de massa úmida podem ser usadas.
[000206] O produto terapêutico pode ser incluído na formulação como multi-partículas finas na forma de grânulos ou péletes com um tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para administração de cápsulas também poderia ser como um pó, tampões ligeiramente comprimidos ou mesmo como comprimidos. O produto terapêutico poderia ser preparado através de compressão.
[000207] Colorantes e agentes de flavorização podem todos ser incluídos. Por exemplo, o oligonucleotídeo (ou derivado) pode ser formulado (tal como através de encapsulação em lipossoma ou microesfera) e, então, ainda contido dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada contendo colorantes e agentes de flavorização.
[000208] Pode-se diluir ou aumentar o volume do produto terapêutico com um material inerte. Esses diluentes poderiam incluir carboidratos, especialmente manitol, α-lactose, lactose anídrica, celulose, sacarose, dextranas modificadas e amido. Determinados sais inorgânicos também podem ser usados como enchedores, incluindo trifosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.
[000209] Desintegrantes podem ser incluídos na formulação do produto terapêutico em uma forma de dosagem sólida. Materiais usados como desintegrantes incluem, mas não estão limitados a, amido, incluindo o desintegrante comercial baseado em amido Explotab. Amido glicolato de sódio, Amberlite, carboximetil celulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, carboximetil celulose ácida, esponja natural e bentonita podem todos ser usados. Outra forma dos desintegrantes são as resinas de troca catiônica insolúveis. Gomas em pó podem ser usadas como desintegrantes e como aglutinantes e essas podem incluir gomas em pó, tais como Agar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínico e seu sal de sódio também são úteis como desintegrantes.
[000210] Aglutinantes podem ser usados para manter o agente terapêutico junto para formar um comprimido duro e incluem materiais de produtos naturais, tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC), etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC). Polivinil pirrolidona (PVP) e hidróxipropil metil celulose (HPMC) poderiam ser usados em soluções alcoólicas para granular o produto terapêutico.
[000211] Um agente anti-atrito pode ser incluído na formulação do produto terapêutico para prevenir aderência durante o processo de formulação. Lubrificantes podem ser usados como uma camada entre o produto terapêutico e a parede da matriz e esses podem incluir, mas não estão limitados a: ácido esteárico, incluindo seus sais de magnésio e cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos vegetais e ceras. Lubrificantes solúveis podem também ser usados, tais como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio, polietileno glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.
[000212] Glidantes que poderiam melhorar as propriedades de fluxo do fármaco durante formulação e auxiliar na reestruturação durante compressão poderiam ser adicionados. Os glidantes podem incluir amido, talco, sílica pirogênica e silico-aluminato hidratado.
[000213] Para auxiliar na dissolução do produto terapêutico no ambiente aquoso, um tensoativo poderia ser adicionado como um agente de composição de volume. Tensoativos podem incluir detergentes aniônicos, tais como lauril sulfato de sódio, dioctil sulfo- succinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos poderiam ser usados e poderiam incluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio. A lista de detergentes não-iônicos potenciais que poderiam ser incluídos na formulação como tensoativos são lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, polioxietileno de óleo de mamona hidrogenado 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Esses tensoativos poderiam estar presentes na formulação do oligonucleotídeo ou derivado sozinhos ou como uma mistura em diferentes proporções.
[000214] Preparados farmacêuticos os quais podem ser usados oralmente incluem cápsulas de encaixe por pressão feitas de gelatina, bem como cápsulas vedadas moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe por pressão podem conter os ingredientes ativos em mistura com um enchedor, tal como lactose, aglutinantes, tais como amidos e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem estar dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabilizantes podem ser adicionados. Microesferas formuladas para administração oral também podem ser usadas. Tais microesferas foram bem definidas na técnica. Todas as formulações para administração oral deverão estar em dosagens adequadas para tal administração.
[000215] Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou comprimidos formulados de maneira convencional.
[000216] Para administração através de inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção podem, convenientemente, ser distribuídos na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluoroetano, triclorofluoro- metano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada para proporcionar uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.
[000217] Também considerada aqui é a distribuição pulmonar dos oligonucleotídeos (ou derivados dos mesmos). O oligonucleotídeo (ou derivado) é distribuição aos pulmões de um mamífero enquanto de inalação e atravessa o revestimento epitelial do pulmão para a corrente sanguínea. Outros relatos de moléculas inaladas incluem Adjei et. al., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei et. al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (acetato de leuprolida); Braquet et. al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (endotelina-1); Hubbard et. al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, páginas 206-212 (a1- antitripsina); Smith et. al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et. al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (hormônio do crescimento humano recombinante); Debs et. al., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferon-g e fator alfa de necrose de tumor) e Platz et. al., Patente U.S. N°. 5.284.656 (fator de estimulação de colônia de granulócito). Um método e composição para a distribuição pulmonar de fármacos para efeito sistêmico são descritos na Patente U.S. N°. 5.451.569, emitida em 19 de Setembro de 1995 para Wong et. al..
[000218] Considerados para uso na prática da presente invenção são uma ampla faixa de dispositivos mecânicos projetados para a distribuição pulmonar de produtos terapêuticos incluindo, mas não limitado a, nebulizadores, inaladores de dose medida e inaladores de pó, todos os quais são familiares para aqueles versados na técnica.
[000219] Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis adequados para a prática da presente invenção são o nebulizador Ultravent, fabricado pela Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; o nebulizador Acorn II, fabricado pela Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; o inalador de dose medida Ventolin, fabricado pela Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, fabricado pela Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
[000220] Todos de tais dispositivos requerem o uso de formulações adequadas para a distribuição de oligonucleotídeo (ou derivado). Tipicamente, cada formulação é específica para o tipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso de um material propelente adequado, além dos diluentes, adjuvantes e/ou veículos usuais úteis em terapia. Também, o uso de lipossomas, microcápsulas ou microesferas, complexos de inclusão ou outros tipos de veículo é considerado.Oligonu- cleotídeo quimicamente modificado também pode ser preparado em diferentes formulações, dependendo do tipo de modificação química ou do tipo de dispositivo empregado.
[000221] Formulações adequadas para uso com um nebulizador, quer a jato ou ultrassônico, compreenderão, tipicamente, oligonucleotídeo (ou derivado) dissolvido em água em uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de oligonucleotídeo biologicamente ativo por mL de solução. A formulação também pode incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo, para estabilização do oligonucleotídeo e regulação da pressão osmótica). A formulação para nebulizador também pode conter um tensoativo para reduzir ou prevenir a agregação induzida na superfície do oligonucleotídeo causada pela atomização da solução na formação do aerossol.
[000222] Formulações para uso com um dispositivo inalador de dose medida geralmente compreenderão um pó finamente dividido contendo o oligonucleotídeo (ou derivado) suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para essa finalidade, tal como um clorofluoro carboneto, um hidroclorofluoro carboneto, um hidrofluoro carboneto um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano ou combinações dos mesmos. Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitan e lecitina de soja. Ácido oleico pode ser útil também como um tensoativo.
[000223] Formulações para distribuição a partir de um dispositivo inalador de pó compreenderão um pó seco finamente dividido contendo oligonucleotídeo (ou derivado) e também podem incluir um agente de composição de volume, tal como lactose, sorbitol, sacarose ou manitol em quantidades as quais facilitam a dispersão do pó do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da formulação. O oligonucleotídeo (ou derivado) deverá, mais vantajosamente, ser preparado na forma de partículas com um tamanho médio de partícula de menos de 10 mm (ou mícrons), mais preferivelmente 0,5 a 5 mm, para distribuição mais eficaz à parte distal do pulmão.
[000224] Distribuição nasal de uma composição farmacêutica da presente invenção também é considerada. A distribuição nasal permite a passagem de uma composição farmacêutica da presente invenção à corrente sanguínea diretamente após administração do produto terapêutico ao nariz, sem a necessidade de depósito do produto no pulmão. Formulações para distribuição nasal incluem aquelas com dextrano ou ciclodextrano.
[000225] Para administração intranasal, um dispositivo útil é uma pequena garrafa rígida à qual um pulverizador de dose medida é preso. Em uma modalidade, a dose medida é distribuída extraindo a composição farmacêutica da solução da presente invenção em uma câmara de volume definido, câmara a qual tem uma abertura dimensionada para aerossolizar a formulação em aerossol através de formação de um spray quando um líquido na câmara é comprimido. A câmara é comprimida para administrar a composição farmacêutica da presente invenção. Em uma modalidade específica, a câmara é uma disposição de pistão. Tais dispositivos estão comercialmente disponíveis.
[000226] Alternativamente, uma garrafa plástica comprimível com uma abertura ou furo dimensionado para aerossolizar uma formulação em aerossol através de formação de um spray quando apertada é usada. A abertura é, usualmente, encontrada na parte de cima da garrafa e a parte de cima é, em geral, afunilada para se adaptar parcialmente às passagens nasais para administração eficiente da formulação em aerossol. De preferência, o inalador nasal fornecerá uma quantidade medida da formulação em aerossol para administração de uma dose medida do fármaco.
[000227] Os compostos, quando é desejável distribuir os mesmos sistemicamente, podem ser formulados para administração parenteral através de injeção, por exemplo, através de injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes com multidose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.
[000228] Formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões para injeção oleosa apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos ou lipossomas. Suspensões para injeção aquosas podem conter substâncias as quais aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabili- zantes ou agentes adequados os quais aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[000229] Alternativamente, os compostos ativos podem estar na forma em pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênio, antes de uso.
[000230] Os compostos também podem ser formulados em composições retais ou vaginais, tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases para supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.
[000231] Além das formulações descritas previamente, os compostos também podem ser formulados como um preparado em depósito. Tais formulações de longa ação podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de íons ou como derivados solúveis pulverizáveis, por exemplo, como um sal solúvel pulverizável.
[000232] As composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes em fase sólida ou de gel. Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, tais como polietileno glicóis.
[000233] Formas de preparação farmacêutica líquida ou sólida adequadas são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microencapsuladas, revestidas sobre partículas de ouro microscópicas, contidas em lipossomas, nebulizadas, aerossóis, péletes para implante na pele ou secas sobre um objeto pontiagudo a ser raspado na pele. As composições farmacêuticas também incluem grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro) cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, gotas ou preparações com liberação retardada dos compostos ativos, em cuja preparação excipientes e aditivos e/ou auxiliares, tais como desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes de intumescimento, lubrificantes, flavorizantes, adoçantes ou solubilizantes são comumente usados conforme descrito acima. Para uma rápida revisão de métodos para distribuição de fármaco veja Langer, Science 249: 1527-1533, 1990, o qual é incorporado aqui por referência.
[000234] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG e opcionalmente outros produtos terapêuticos e/ou antígenos podem ser administrados per se (puros) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando usados em medicina, os sais deverão ser farmaceuti- camente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitaveis podem, convenientemente, ser usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, mas não estão limitados a, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico e benzenossulfônico. Também, tais sais podem ser preparados como sais de metal alcalino ou alcalino-terroso, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico.
[000235] Agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% em peso/v); ácido cítrico e um sal (1-3% em peso/v); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% em peso/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% em peso/v). Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% em peso/v); clorobutanol (0,3-0,9% em peso/v); parabenos (0,01-0,25% em peso/v) e timerosal (0,004-0,02% em peso/v).
[000236] As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e opcionalmente antígenos e/ou outros agentes terapêuticos opcionalmente incluídos em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo veículo farmaceuticamente aceitável significa um ou mais agentes de enchimento, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidas ou líquidas compatíveis as quais são adequadas para administração a um ser humano ou a outro animal vertebrado. O termo veículo denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de serem misturados com os compostos da presente invenção e uns com os outros, de uma maneira que não haja interação, o que prejudica substancialmente a eficiência farmacêutica desejada.
[000237] A presente invenção é ainda ilustrada pelos Exemplos a seguir, os quais não deverão, de maneira nenhuma, ser construídos como outra limitação. Os conteúdos inteiros de todas as referências (incluindo as referências na literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citados por todo o presente pedido são aqui expressamente incorporados por referência.
EXEMPLOS Materiais e Métodos
[000238] Oligodesoxinucleotídeos (ODN) e reagentes
[000239] Todos os ODN foram sintetizados seguindo protocolos- padrão de química com fosforamidita e controlados com relação à identidade e pureza pela Coley Pharmaceutical GmbH e tinham níveis indetectáveis de endotoxina (< 0,1 EU/ml) medidos através do ensaio Limulus (BioWhittaker, Verviers, Bélgica). Os ODNs foram suspensos em Tris-EDTA estéril, isento de endotoxina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e armazenados e manipulados sob condições assépticas para prevenir contaminação microbiana e por endotoxina. Todas as diluições foram realizadas usando Tris-EDTA isento de endotoxina. Ensaios de TLR
[000240] Células HEK293 foram transfectadas através de eletroporação com vetores expressando o respectivo TLR humano e um plasmídeo-repórter de 6xNF-KB-luciferase. Transfectantes estáveis (3 x 104 células/cavidade) foram incubados com as quantidades indicadas de ODN durante 16h a 37°C em uma incubadora umidificada. Cada ponto de dados foi feito em triplicata. As células foram submetidas à lise e ensaiadas com relação à atividade do gene de luciferase (usando o kit BriteLite da Perkin-Elmer, Zaventem, Bélgica). Os índices de estimulação foram calculados em referência à atividade do gene- repórter do meio sem a adição de ODN. 1. Purificação de células
[000241] Preparações da camada leucoplaquetária de sangue periférico de doadores humanos saudáveis foram obtidas do Banco de Sangue da University of Dusseldorf (Alemanha) e PBMCs foram purificadas através de centrifugação sobre Ficoll-Hypaque (Sigma). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C em meio RPMI 1640 suplementado com soro AB humano inativado termicamente a 5% (v/v) (BioWhittaker) ou FCS termicamente inativado a 10% (v/v), L-glutamina a 2 mM, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina (todos da Sigma). 2. Detecção de citocina e análise citométrica de fluxo
[000242] PBMC foi ressuspensa em uma concentração de 5 x 106 células/ml e adicionada às lâminas de fundo redondo com 96 cavidades (250 μl/cavidade). PBMCs foram incubadas com ODN e os sobrenadantes de cultura (SN) foram coletados após os pontos de tempo indicados. Se não imediatamente usados, os SNs foram armazenados a -20°C até requeridos.
[000243] As quantidades de citocinas no SN foram avaliadas usando um ELISA próprio para IFN-α desenvolvido usando anticorpo comercialmente disponível (PBL, New Brunswick, NJ, EUA) ou sobre o sistema multiplex Luminex (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115). Animais
[000244] Camundongos BALB/c fêmeas (6-8 semanas de idade) foram adquiridas de Charles River Canada (Quebec, Canadá) e alojados em microisoladores no Animal Care Facility at Coley Pharmaceutical Group Canada. Todos os estudos foram conduzidos de acordo com o Animal Care Committee of Coley Canada sob a orientação do Canadian Council on Animal Care. Todos os animais eram naive para ODNs de CpG.
[000245] Modelo de tumor SA1N: Camundongos A/J fêmeas (10 por grupo) foram injetados SC com 5 x 105 células tumorais SaI/N no dia 0. Os camundongos foram tratados com 100 μg de ODN ou PBS apenas fornecido SC uma vez por semana, começando no dia 8 pós-indução de tumor. Os animais foram monitorados com relação à sobrevivência e volume do tumor. O tamanho do tumor (o comprimento e a largura) foi medido usando um calibrador Vernier digital. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula: Volume do tumor = (0,4) (ab2), onde a = diâmetro maior e b = diâmetro menor. Ensaios in vitro
[000246] Esplenócitos de camundongo BALB/c naive (dos reservatórios de 3-5 animais) foram usados para ensaios in vitro. Os animais foram anestesiados com isoflurano e sofreram eutanásia através de deslocamento cervical. Os baços foram removidos sob condições assépticas e colocados em PBS + albumina de soro bovino a 0,2% (Sigma Chemical Company). Os baços foram, então, homogeneizados e os esplenócitos foram ressuspensos em meio de cultura tecidual RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com soro de camundongo normal a 2% (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá), solução de penicilina-estreptomicina (concentração final de 1000 U/ml e 1 mg/ml, respectivamente; Sigma Chemical Company) e β-mercaptoetanol a 5 x 10— 5 M (Sigma Chemical Company). Ensaios de proliferação de células B
[000247] Esplenócitos de camundongo BALB/c corados com diacetato de carbóxi-fluoresceína, succimidil éster (CFSE) (Invitrogen, Eugene, Oregon, EUA) (4 x 105/cavidade) foram incubados com diferentes concentrações de ODN em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37°C durante 5 dias. As células foram, então, coradas com anticorpo anti-CD19 PE-conjugado (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) para CD19 e a proliferação de células B foi determinada através de FACS, seguida por análise através do software ModFit V3.0 (Verity Software House Inc., Topsham, ME, EUA). Exemplo 1: Investigação da relação de atividade estrutural no motivo CpG
[000248] Sabe-se que oligonucleotídeos contendo motivos CpG não- metilados são capazes de estimular respostas imunes através da através de do receptor 9 Tipo sino (TLR9). De forma a identificar oligonucleotídeos com a maior capacidade de estimular a através de de TLR9, um estudo da relação estrutural compreensivo (SAR) no motivo CpG foi realizado. Os resultados mostraram que substituição de guanina por hipoxantina e 6- tioguanina leva a uma atividade similar no ensaio de hTLR9, enquanto que substituição de purina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-oxo-7,8-di- hidroguanina e 7-deazaguanina resultou em uma redução de 40-80% na estimulação de hTLR9. Ainda, modificação em C5 e N4 não resultou em estimulação da através de de hTLR9. Essas observações resultaram em um modelo de SAR no qual guanina é reconhecida através de o sítio de Hoogsteen, enquanto que citosina se liga à borda C,H ao receptor TLR9 (veja figura 1a). Assim, nenhuma modificação, no sítio de reconhecimento de Hoogsteen, de guanina, bem como da borda C,H da citosina era possível sem perda significativa na atividade de hTLR9. Nenhuma das modificações de base investigadas no motivo de dinucleotídeo era mais ativa do que o motivo CpG não-modificado. Exemplo 2: O efeito de análogos em formato de base de timina hidrofóbica próxima do motivo CpG
[000249] Para investigar o impacto dos resíduos de dT em proximidade ao motivo CpG, vários análogos em formato de base de timina hidrofóbica, tais como 2,4-difluorotolueno (FF) (SEQ ID NO: 3-9), 5-bromo-2’- desoxiuridina (BU) e 5-iodo-2’-desoxiuridina (JU), foram incorporados fora do motivo CpG (veja tabela 1 e figuras 2-3). Surpreendentemente, a incorporação de todos os análogos de timina hidrofóbica testados levou a um forte aumento incomum na atividade de hTLR9, enquanto substituição por resíduos de uracila (timina carecendo de um grupo metila, figura 4) levou a uma forte diminuição na estimulação de hTLR9. O aumento na estimulação de TLR9 foi pronunciado quando a modificação era 5’ ao motivo CpG. Substituição dupla por 5-iodouracila (JU) 5’ e 3’ do motivo CpG resultou na estimulação mais potente daquelas testadas. Em contraste, substituição de guanina e citosina por 2,4-difluorotolueno no motivo CpG levou, em ambos os casos, a uma forte diminuição do índice de estimulação de TLR9.
[000250] A incorporação de análogos T hidrofóbicos também resultou em uma forte intensificação na indução de IFN-alfa em PBMCs humanas. Inesperadamente, a modificação de um ODN (SEQ ID NO: 1) que é virtualmente inativo na indução de IFN-alfa por 5-bromouridina e 5-iodouridina em particular resultou em estimulação de TLR9 e indução de IFN-alfa aumentadas. Usualmente, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a indução de IFN-alfa para o ODN de CpG o qual não contém essas modificações. Tabela 1: Exemplos de oligonucleotídeos modificado com análogos em formato de base de timina hidrofóbica próximo do motivo CpG
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster Exemplo 3: Ativação de TLR9 com substituições em formato de base lipofílica
[000251] Uma vez que diferentes tipos de substituição lipofílica da base 5’ no motivo CpG causaram aumentos significativos na estimulação de hTLR9, outros análogos de base, tais como resíduos de 5-cloro-uracila, 5-trifluorometil-uracila, fenila, arila e arila substituída foram investigados com relação à sua capacidade de estimular hTLR9 (Tabela 3). Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotídeos modificados da classe B com vários análogos de base lipofílicos, ODN da classe B SEQ ID NO: 1 foi modificado com 5-Cloro- 2’-desoxiuridina (CU), 5-Bromo-2’-desoxiuridina (BU), 5-Iodo-2’- desoxiuridina (JU) e 5-Etil-2’-desoxiuridina (EU). Células hTLR9-NFkB- 293 foram incubadas com o ODN indicado (figura 5a) durante 16 horas. As células foram, então, submetidas à lise e a atividade de luciferase foi determinada. Oligonucleotídeos CU-modificado (SEQ ID NO: 41), BU- modificado (SEQ ID NO: 10) JU-modificado (SEQ ID NO: 13) e EU- modificado (SEQ ID NO: 42), todos mostraram maior estimulação de atividade de TLR9 com relação ao controle (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 16 com modificação de uridina mostrou atividade dramaticamente diminuída. Em um segundo experimento, a produção de IFN-alfa foi medida (figura 5b). PBMCs humanas foram incubadas com o ODN modificado, conforme indicado durante 24h, após o que os sobrenadantes foram testados através de ELISA. ODN JU-modificado , BU-modificado e EU- modificado resultou no maior aumento no IFN-alfa com relação ao controle. Esses dados demonstram que a 5’-substituição de dU sobre o ODN da classe B aumenta a atividade de TLR9 e a produção de IFN-alfa.
[000252] Para investigar o efeito da modificação EU sobre a ativação de TLR9, o experimento foi repetido com oligonucleotídeos modificados tendo modificações EU 5’ do CpG (SEQ ID NO: 42), 3’ do CpG (SEQ ID NO: 29) e 5’ e 3’ do CpG (SEQ ID NO: 30). SEQ ID NOs 42 e 30 mostraram um aumento significativo na ativação de TLR9 com relação a SEQ ID NO: 1 não-modificada e ODN da classe B não-modificado SEQ ID NO: 37 (figura 6). Tabela 2: Exemplos de oligonucleotídeos modificados com substituições de análogo de base lipofílicos
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster Exemplo 4: Substituição lipofílica sobre oligonucleotídeos das classes A, B, C, P e T
[000253] Para investigar os efeitos de substituição de análogo de base lipofílica sobre as diferentes classes de ODN, modificações foram feitas em oligonucleotídeos da classe A, classe B, classe C, classe P e classe T. Alguns exemplos desses oligonucleotídeos são fornecidos na Tabela 3. Tabela 3: Oligonucleotídeos JU-modificados das classes A, B, C, P e T
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster
[000254] Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucle- otídeos da classe B modificados, derivados de classe B 5-iodo-2’- desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 37 foram avaliados em um ensaio de luciferase com relação à sua capacidade de ativar TLR9 (veja materiais e métodos). Todos os oligonucleotídeos da classe B modificados mostraram um aumento significativo na ativação de TLR9 com relação ao SEQ ID NO: 37 não-modificado (figura 7).
[000255] Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotídeos da classe A modificados, derivados da classe A 5- iodo-2’-desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 43 foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9 em um ensaio de luciferase (figura 8a) e um ensaio com PBMC (figura 8b), conforme na figura 5. O aumento na estimulação de TLR9 foi pronunciado quando a modificação era 5’ ao motivo CpG, embora a dupla substituição com 5- iodouracila (JU) 5’ e 3’ do motivo CpG tenha resultado em estimulação mais potente.
[000256] Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucle- otídeos da classe C modificados, derivados de classe C 5-iodo-2’- desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 e 45, foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Sequências da classe A SEQ ID NO: 43 (não-modificada) e SEQ ID NO: 35 e 36 foram testadas simultaneamente. Conforme mostrado na figura 9, os ODNs modificados SEQ ID NO: 35, 36, 44 e 45 mostraram todos estimulação aumentada de TLR9, acima das classes A e C não- modificadas em um ensaio de luciferase. Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotídeos da classe P, derivados da classe P 5-iodo-2’-desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 46 foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9 em um ensaio de luciferase. Conforme mostrado na figura 10, o ODN modificado SEQ ID NO: 31-33 mostrou uma estimulação aumentada de TLR9 com relação ao ODN não-modificado.
[000257] Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucle- otídeos da classe T modificados, derivados da classe T 5-iodo-2’- desoxiuridina-modificados do ODN da classe T não-modificado SEQ ID NO: 52 foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Conforme mostrado na figura 11, o ODN modificado SEQ ID NOs 47-50 mostrou uma estimulação aumentada de TLR9 com relação ao ODN da classe T não-modificado em um ensaio de luciferase. O derivado de uridina SEQ ID NO: 51 mostrou estimulação reduzida de TLR9.
[000258] Conforme os exemplos acima demonstram, substituição dos T-análogos lipofílicos 5’ no motivo CpG resulta em um forte aumento na ativação de TLR9 em todas as classes testadas e resultou em uma capacidade aumentada de induzir a produção de IFN-alfa. Exemplo 5: Estimulação de TLR9 por oligonucleotídeos modificados curtos
[000259] Uma vez que o ODN de CpG modificado de 20 nucleotídeos de comprimento mostrou uma afinidade incomum pela ativação de TLR9, ODNs de CpG muito curtos foram investigados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Oligonucleotídeos muito curtos teriam uma maior vantagem com relação a oligonucleotídeos mais longos para uso em tratamento em virtude da facilidade aumentada de captação pelas células, bem como o potencial de uma formulação mais simples, sem o uso de DOTAP. Três ODNs de CpG curtos ("curtâmeros") foram investigados (Tabela 3): um hexâmero com motivo de CpG de 6-meros (SEQ ID NO: 38), uma modificação 5’JU do hexâmero (SEQ ID NO: 39) e uma modificação 5’3’ JU do hexâmero (SEQ ID NO: 40) (Tabela 4). A atividade dos "curtâmeros" foi comparada com o oligonucleotídeo da classe B não-modificado SEQ ID NO: 37 em um ensaio de luciferase. Conforme mostrado na figura 12, em sua maioria, particularmente com SEQ ID NO: 40, o uso dos "curtâmeros" modificados mostra grande potencial como um medicamento aperfeiçoado para imunoterapia. Tabela 4: Oligonucleotídeos curtos modificados
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster Exemplo 6: Ativação da através de de TLR9 in vivo por oligonucleotí- deos modificados
[000260] De forma a determinar a eficácia do ODN modificado da invenção in vivo, o ODN com análogos T lipofílicos foram testados em esplenócitos isolados de camundongo. Esplenócitos de camundongo BALB/c foram isolados e incubados com ODN da classe B modificado (SEQ ID NO: 13), ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de não-CpG (SEQ ID NO: 26) (Tabela 5). Os sobrenadantes de cultura foram coletados a 6 horas (TNF-alfa) ou 24 horas (IL-6, IL-10, IL-12) e a concentração de citocina foi medida através de ELISA. Conforme mostrado na figura 13, incubação com SEQ ID NO: 13 modificada resultou em níveis dramaticamente aumentados de todas as citocinas testadas.
[000261] Os ODN foram, então, testados com relação à sua capacidade de induzir a proliferação de células B em esplenócitos. Esplenócitos de camundongo BALB/c CFSE-corados (4 x 105/cavidade) foram incubados com 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 μg/ml do ODN indicado (figura 14). A 72 horas pós-incubação, as células foram coradas com relação ao marcador na superfície celular CD19 e a proliferação de células B foi determinada através de FACS, seguida por análise através do software ModFit. Conforme mostrado na figura 14, incubação com SEQ ID NO: 13 modificado resultou em um aumento acentuado na proliferação de células B. O aumento foi mais pronunciado mesmo na menor concentração de ODN.
[000262] Para medir o efeito de um ODN modificado in vivo, camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados subcutaneamente (SC) com 10, 50 ou 100 μg de SEQ ID NO: 13 ou 100 μg de SEQ ID NO: 37 em um volume total de 100 μl de SC. O grupo de controle negativo recebeu 100 μl de PBS apenas. O sangue dos animais foi coletado através de punção cardíaca em 1 hora pós-injeção (TNF-alfa) ou 3 horas pós-injeção (IP-10). Amostras de plasma foram ensaiadas através de ELISA com relação ao TNF-alfa (figura 15a) e IP-10 (figura 15b). Injeção de camundongos BALB/c com SEQ ID NO: 13 modificada resultou em maior produção de TNF-alfa e IP-10 do que SEQ ID NO: 37 não-modificada, demonstrando que o ODN substituído com formato de base lipofílica da invenção resultou em maior estimulação imune in vivo do que o ODN estimulatório imune não-modificado. Tabela 5: Oligonucleotídeos testados in vivo
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster Exemplo 7: Oligonucleotídeos com modificações adicionais
[000263] ODN com análogos de base lipofílicos foram testados com relação à sua capacidade de induzir à atividade de NF-KB TLR9- mediada em um ensaio de luciferase (veja materiais e métodos). As figuras 16-23 mostram a atividade do ODN com modificações adicionais (veja tabela 6).
[000264] De forma a testar a atividade de outros análogos de base, a atividade do ODN 6-nitro-benzimidazol (6NB)-modificado SEQ ID NO: 178 e da sequência precursora não-modificada SEQ ID NO: 1 foram comparadas. Conforme mostrado na figura 12, SEQ ID NO: 178 foi capaz de ativar NF-kB TLR9-mediada em um grau comparável à sequência precursora não-modificada. Em seguida, a atividade do ODN 5-(2-bromovinil)-uridina modificado (SEQ ID NO: 153-154) foi comparada àquela da sequência precursora não-modificada SEQ ID NO: 1. Conforme mostrado na figura 17, ambos os ODNs modificados foram mais ativos no ensaio do que a sequência precursora. Em seguida, a atividade de dois ODNs da classe B com 5-proinil-dU (SEQ ID NO: 116 e 117) em lugar de timidina da sequência precursora (SEQ ID NO: 1). Conforme mostrado na figura 21, ambos os ODNs modificados tinham atividade comparável àquela da sequência precursora. A atividade de SEQ ID NO: 116, na qual a modificação é 5’ ao dinucleotídeo CG, era ligeiramente aperfeiçoada com relação à sequência precursora.
[000265] De forma a testar o efeito de um segundo tipo de modificação sobre o ODN JU-modificado, 2’O-metilguanosinas foram incorporadas no ODN JU-modificado. A atividade do ODN 2’-O-metilguanosina/JU, SEQ ID NO: 111-113, foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1 precursora e JU modificado apenas, SEQ ID NO: 13. Conforme mostrado na figura 18, all ODN JU-modificado foi mais ativo do que o ODN precursor. O ODN com a modificação 3' 2’O-metilguanosina do dinucleotídeo CG (SEQ ID NO: 112-113) era ligeiramente mais ativo do que o ODN com a modificação 5' 2’O-metilguanosina do dinucleotídeo CG (SEQ ID NO: 111) ou o ODN modificado com JU apenas (SEQ ID NO: 13).
[000266] Em seguida, a atividade do ODN ramificado JU-modificado (SEQ ID NO: 96, 97, 101 e 102) foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1. Conforme mostrado na figura 19, os ODNs ramificados com duas extremidades 5’ acessíveis eram todos ativos ou mais ativos do que SEQ ID NO: 1 não-modificada no ensaio. SEQ ID NO: 101 e 102, com o espaçador de fosfato de trietileno glicol, foram mais ativos do que SEQ ID NO: 96 e 97 com o espaçador 3'-O-Metil-G.
[000267] Em seguida, a atividade de um ODN da classe B curto não- modificado (SEQ ID NO: 38) e um ODN da mesma sequência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílica e um tag 3' lipofílico (SEQ ID NO: 126) foram comparados. Ambos foram formulados com e sem DOTAP. Conforme mostrado na figura 20, a adição da JU-modificação e do tag lipofílico intensificou grandemente a atividade do ODN, assim como a adição de DOTAP.
[000268] Em seguida, a atividade do ODN da classe B com um segundo análogo de nucleotídeo além de um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 138, 7-deaza-dG; SEQ ID NO: 139, inosina; SEQ ID NO: 140, 5-metil-dC) foi comparada àquela da sequência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma sequência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Conforme mostrado na figura 22, todos os ODNs modificados foram mais ativos no ensaio do que o ODN precursor.
[000269] Em seguida, a atividade do ODN da classe T com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 132-134) foi comparada àquela de um ODN da classe C (SEQ ID NO: 198) conhecido por ser imunoestimulatório. Conforme mostrado na figura 23, todos os ODNs modificados mostraram atividade muito maior no ensaio do que o ODN da classe C não-modificado. Tabela 6: Oligonucleotídeos substituídos lipofílicos com modificações adicionais
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* ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster Exemplo 8: Atividade de oligonucleotídeos da classe P modificados
[000270] ODN da classe P com análogos de base lipofílicos foram testados com relação à capacidade de ativar a através de de NF-kB através de TLR9, conforme medido pelo ensaio de luciferase. A atividade do ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-61) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). Conforme mostrado na figura 24, todos os ODNs da classe P modificados mostraram estimulação aumentada de TLR9 comparado com os controles. A figura 24a mostra o ODN da classe P JU-modificado e 24b mostra o ODN da classe P EU- modificado.
[000271] Em seguida, a atividade do ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 64 (EU-modificado), 66-67 (JU-modificado) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57). Conforme mostrado na figura 25, todos os ODNs modificados mostraram um grau de estimulação de TLR9 do que o ODN da classe P não-modificado. SEQ ID NO: 66, com a ligação de fosfodiéster no dinucleotídeo CG, mostrou atividade reduzida comparada com o fosforotioato total, SEQ ID NO: 67.
[000272] Em seguida, o ODN da classe P modificado foi testado com relação à sua capacidade de induzir à expressão de IFN-alfa. A atividade do ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-61) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56) conforme medido através de um ensaio ELISA. Conforme mostrado na figura 26, todos os ODNs da classe P modificados mostraram um aumento na indução de IFN-alfa. A figura 26a mostra ODN da classe P JU-modificado e 26b mostra ODN da classe P EU-modificado .
[000273] Em seguida, o ODN da classe P modificado (EU-modificado), 66-67 (JU-modificado) foi comparado com aquele de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57) com relação à capacidade de induzir ao IFN-alfa, conforme medido através de um ensaio ELISA. Conforme mostrado na figura 27, o ODN da classe P modificado mostrou capacidade intensificada de induzir ao IFN-alfa. Conforme na figura 24, SEQ ID NO: 66 mostrou atividade reduzida comparado com SEQ ID NO: 67.
[000274] Em seguida, o ODN da classe P modificado foi testado com relação à capacidade de induzir a IL-6 em PBMCs humanas. PBMCs de três doadores foram incubadas com ODN em concentrações conforme indicado durante 24h, seguido por análise com Luminex 25-plex dos sobrenadantes com relação à IL-6. A atividade do ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 28a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 28b) foi comparada àquela de um ODN da classe B não- modificado (SEQ ID NO: 55) e ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). O ODN JU-modificado (SEQ ID NO: 58, 60-61 e 67) mostrou uma ativação ligeiramente maior de IL-6 do que o ODN EU-modificado (SEQ ID NO: 62 e 64). Todos os ODNs modificados mostraram atividade aumentada comparados com o ODN não-modificado.
[000275] Em seguida, a atividade de um ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 29a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 29b) foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53), um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56), LPS, R-848, SEB e um ODN poli[I]: [C]. PBMCs CFSE- rotuladas de três doadores foram incubadas com o ODN durante 5 dias e, então, coradas com um anticorpo a CD19. O percentual de células B com coloração reduzida de CFSE foi determinado. Tratamento com o ODN da classe B resultou no maior percentual de células B após divisão. Tratamento com o ODN JU-modificado resultou em um percentual de células B maior do que o ODN EU-modificado.
[000276] De forma a determinar o efeito do ODN da classe P modificado in vivo, camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados SC com diferentes doses de ODN. O sangue dos animais foi coletado a 3 horas pós-injeção e o plasma testado com relação ao IFN-alfa através de ELISA. A atividade do ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 58, 60-62, 64 e 67) foi comparada àquela de um controle negativo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um controle negativo (SEQ ID NO: 26). Conforme mostrado na figura 30, tratamento com o ODN JU-modificado SEQ NO: 58, 60 e 61 resultou em indução de IFN-alfa ligeiramente maior do que o ODN EU-modificado SEQ ID NO: 64. O ODN da classe B SEQ ID NO: 55 não induz a muito IFN-alfa de murino, conforme esperado.
[000277] Em seguida, o ODN da classe P modificado foi avaliado com relação à sua capacidade de reduzir o volume de tumor no modelo de tumor SA1N de camundongo. Camundongos A/J fêmeas (10 por grupo) foram injetados SC com 5 x 105 células tumorais SaI/N no dia 0. Os camundongos foram tratados com 35 μg (figura 31a) ou 100 μg (figura 31b) de ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 60, 64 e 67), um ODN da classe C não- modificado, um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55) ou PBS apenas. ODN foi fornecido SC uma vez por semana, começando no dia 8 pós-indução de tumor. Os animais foram monitorados com relação à sobrevivência e volume do tumor. Conforme mostrado na figura 31a, na menor dosagem, tratamento com o ODN da classe P modificado mostrou a maior redução no volume de tumor, sugerindo que esse ODN seria eficaz no tratamento de câncer. Na maior dosagem em 31b, todos os ODNs da classe P modificados e o ODN da classe C foram eficazes na redução do volume do tumor. Tabela 7: Oligonucleotídeos da classe P modificados
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*ligação internucleotídeo de fosforotiato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster
[000278] Um sumário de ODNs modificados exemplificativos é apresentado na Tabela 8: Tabela 8
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Chave
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EQUIVALENTES
[000279] A especificação precedente escrita é considerada como sendo suficiente para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção. A presente invenção não está limitada, quanto ao escopo, pelos exemplos fornecidos, uma vez que os exemplos se destinam a ser uma simples ilustração de um aspecto da invenção e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e caem dentro do escopo das reivindicações em anexo. As vantagens e os objetivos da invenção não são necessariamente abrangi-dos por cada modalidade da invenção

Claims (7)

1. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T (SEQ ID No. 60), em que JU é 5'-Iodo-2'-desoxiuridina, o * é ligação internucleotídeo fosforotioato, e o - é ligação internucleotídeo fosfodiéster.
2. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*- C*G*T (SEQ ID No. 61), em que JU é 5'-Iodo-2'-desoxiuridina, o * é ligação internucleotídeo fosforotioato.
3. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T (SEQ ID No. 66), em que JU é 5'-Iodo-2'-desoxiuridina, o * é ligação internucleotídeo fosforotioato e o - é ligação internucleotídeo fosfodiéster.
4. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T (SEQ ID No. 67), em que JU é 5'-Iodo-2'-desoxiuridina, o * é ligação internucleotídeo fosforotioato.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a dita composição ainda compreende um antígeno.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita composição ainda compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita composição ainda compreende um antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.
BRPI0717510A 2006-09-27 2007-09-27 análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada e composição farmacêutica que os compreende BRPI0717510B8 (pt)

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