BRPI0717768B1

BRPI0717768B1 - anticorpo, epítopo, sequência de dna isolada, vetor de clonagem ou expressão, processo para a produção do anticorpo, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo

Info

Publication number: BRPI0717768B1
Application number: BRPI0717768-2A
Authority: BR
Inventors: Ralph Adams; Andrew George Popplewell; Stephen Edward Rapecki
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-18
Publication date: 2021-01-05
Also published as: TR201907599T4; CA2666458C; US8617847B2; US9890219B2; CA2666458A1; JP6329516B2; PL2076539T3; US8303953B2; IL198061A0; AU2007311689A1; WO2008047134A2; ES2729064T3; PT2076539T; CN101589061B; MX2009003973A; EP3524623A1; SI2076539T1; SG175652A1; EP2076539A2; JP5856121B2

Abstract

ANTICORPO, EPÍTOPO, SEQUENCIA DE DNA ISOLADA, VETOR DE CLONAGEM OU EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DO ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM ANTICORPO. A invenção diz respeito a moléculas de anticorpo tendo especificidade quanto a determinantes antigênicos tanto de IL-17A quanto IL-17, usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e métodos para produzir as ditas moléculas de anticorpo.

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a moléculas de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigênicos tanto de IL-17A quanto de IL-17F. A presente invenção também diz respeito aos usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e métodos para produzir os mesmos.

[0002] A interleucina 17 (IL-17), também conhecida como CTLA-8 ou IL-17A, é uma citocina pró-inflamatória que estimula a secreção de uma ampla faixa de outras citocinas de várias células não imunes. IL-17A é capaz de induzir a secreção de IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 e G-CSF pelas células aderentes como fibroblastos, queratinócitos, células epiteliais e endoteliais e é também capaz de induzir a expressão de superfície de ICAM-1, proliferação de células T, e crescimento e diferenciação de progenitores humanos de CD34+ em neutrófilos quando co- cultivados na presença de fibroblastos irradiados (Fossiez et al., 1998, Int. Rev. Immunol. 16, 541-551). A IL-17A é predominantemente produzida pelas células T de memória ativada e atua pela ligação a um receptor de superfície celular ubiquituosamente distribuído (IL-17R) (Yao et al., 1997, Cytokine, 9, 794-800). Este também pode atuar através da ligação a um complexo de IL-17RA e IL-17RC (Toy et al., 2006, J. Immunol. 177(11); 36-39). As células T que produzem IL-17 chamadas de ‘células TH17’ foram implicadas na patogênese de certos cânceres (Weaver et al., 2006, Immunity, 24, 677-688; Langowski et al., 2006, 442, 461-465; Iwakura e Ishigame, 2006, J. Clin. Invest. 116, 5, 1218-1222).

[0003] Vários homólogos de IL-17 foram identificados que têm papéis tanto similares quanto distintos nas respostas inflamatórias reguladoras. Para uma revisão de famílias de citocina/receptor de IL-17 ver Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents, 13, 287-303. Um tal homólogo é IL-17F, também conhecido como IL-24 e ML-1, que é em torno de 55 % idêntico à IL-17A e é considerado compartilhar os mesmos receptores como IL-17A (Kolls e Linden 2004, Immunity, 21, 467-476; Hymowitz, et al., 2001, EMBO J. 20(19), 5332-5341; Kuestner et al., 2007, Journal of Immunology, 179, 5462-5473).

[0004] Tanto IL-17A quanto IL-17F podem formar proteínas tanto homodiméricas quanto heterodiméricas, todas as quais são produzidas pelas células T CD4+ humanas ativadas (Wright et al., 2007, J Biol Chem. 282 (18), 13447-13455).

[0005] A IL-17 pode contribuir para várias doenças mediadas pelas respostas imune anormais, tais como artrite reumatóide e inflamação das vias aéreas, assim como rejeição ao transplante de órgão rejeição e imunidade antitumor. Inibidores da atividade de IL-17 são bem conhecidos na técnica por exemplo, uma proteína de fusão de IL-17R de murino:Fc humano, uma IL-17R solúvel e um anticorpo monoclonal anti-IL-17 de murino foram usados para demonstrar o papel de IL-17 em vários modelos de artrite reumatóide (Lubberts et al,, J. Immunol. 2001, 167, 1004-1013; Chabaud et al., Arthritis Res. 2001, 3, 168- 177). Além disso, os anticorpos policlonais neutralizadores foram usados para reduzir a formação de adesão peritoneal (Chung et al., 2002, J. Exp. Med., 195, 1471-1478). Os anticorpos de IL-17 anti-humano derivado de rato foram descritos na WO04/106377. Um anticorpo anti-IL-17 humanizado com uma afinidade em torno de 220 pM foi descrita na WO2006/054059. Um anticorpo monoclonal anti-IL-17 totalmente humano com uma afinidade em torno de 188 pM foi descrito na WO2006/013107. Os anticorpos que se ligam a IL-17F e heterodímeros de IL- 17A/IL-17F foram descritos na WO2006/088833. Anticorpos que especificamente se ligam ao heterodímero de IL-17A/IL-17F foram descritos na WO2005/010044.

[0006] O antagonismo de IL-17F foi associado com proteção contra a asma (Kawaguchi et al., 2006, J. Allergy Clin. Immunol. 117(4); 795-801) e IL-17F também é considerado desempenhar um papel na patologia da artrite (Lubberts 2003, Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (5), 572-577).

[0007] Consequentemente antagonistas duais de IL-17A e IL-17F podem ser mais eficaz do que um único antagonista no tratamento das Doenças mediadas por IL-17. Anticorpos que se ligam a IL-17A e IL-17F foram descritos na WO2007/106769 publicada em 20.9.07.

[0008] Demonstrou-se que é possível isolar um anticorpo que é capaz de ligar tanto a IL-17A quanto a IL-17F e é capaz de neutralizar a atividade de ambas as isoformas de IL-17. Por este motivo a presente invenção fornece um anticorpo anti- IL-17 que é capaz de ligar tanto a IL-17A quanto a IL-17F. Em particular, o anticorpo da presente invenção é capaz de ligar especificamente tanto a IL-17A quanto a IL- 17F isto é, o anticorpo não se liga a outras isoformas de IL-17. Preferivelmente o anticorpo da presente invenção também se liga ao heterodímero IL-17A/IL-17F. Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção neutraliza a atividade tanto de IL- 17A quanto de IL-17F. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção também neutraliza a atividade do heterodímero IL-17A/IL-17F. Os anticorpos da presente invenção portanto têm a propriedade vantajosa de que eles podem inibir a atividade biológica tanto de IL-17A quanto de IL-17F. Consequentemente, a presente invenção também fornece o uso de tais anticorpos no tratamento de e/ou profilaxia de uma doença mediada por cada um ou ambos de IL-17A ou IL-17F tal como doença autoimune ou inflamatória ou câncer.

[0009] Como aqui usado, o termo ‘neutralizar anticorpo’ descreve um anticorpo que é capaz de neutralizar a atividade de sinalização biológica tanto de IL-17A quanto de IL-17F por exemplo pelo bloqueio da ligação de IL-17A e IL17F a um ou mais dos seus receptores e pelo bloqueio da ligação do heterodímero IL-17A/IL-17F a um ou mais de seus receptores. Será avaliado que o termo ‘neutralizar’ como aqui usado refere-se a uma redução na atividade de sinalização biológica que pode ser parcial ou completa. Além disso, será avaliado que o grau de neutralização da atividade de IL-17A e IL-17F pelo anticorpo pode ser o mesmo ou diferente. Em uma forma de realização o grau de neutralização da atividade do heterodímero de IL- 17A/IL-17F pode ser o mesmo ou diferente como o grau de neutralização da atividade de IL-17A ou IL-17F.

[0010] Em uma forma de realização os anticorpos da presente invenção especificamente se ligam a IL-17A e IL-17F. Especificamente ligação significa que os anticorpos têm uma enorme afinidade quanto aos polipeptídeos de IL-17A e IL-17F (incluindo o heterodímeros de IL-17A/IL-17F) do que para outros polipeptídeos. Preferivelmente os polipeptídeos de IL-17A e IL-17F são humanos. Em uma forma de realização o anticorpo também liga IL-17F de cinomolgo.

[0011] Os polipeptídeos de IL-17A ou IL-17F ou uma mistura dos dois ou células que expressam um ou ambos dos ditos polipeptídeos podem ser usados para produzir anticorpos que especificamente reconhecem ambos os polipeptídeos. Os polipeptídeos de IL-17 (IL-17A e IL-17F) podem ser polipeptídeos ‘maduros’ ou fragmentos biologicamente ativos ou derivados destes que preferivelmente incluem o sítio de ligação de receptor. Preferivelmente os polipeptídeos de IL-17 são os polipeptídeos maduros. Os polipeptídeos de IL-17 podem ser preparados pelos processos bem conhecidos na técnica de engendrar geneticamente células hospedeiras que compreendem sistemas de expressão ou eles podem ser recuperados de fontes biológicas naturais. no presente pedido, o termo “polipeptídeos” inclui peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Estes são usados intercambiavelmente a menos que outro modo especificado. O polipeptídeo de IL-17 em alguns casos podem ser parte de uma proteína maior tal como uma proteína de fusão por exemplo fundida a um rótulo de afinidade. Os anticorpos gerados contra estes polipeptídeos podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração dos polipeptídeos a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos de rotina e bem conhecidos, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelha, vacas ou porcos podem ser imunizados. Entretanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são no geral preferidos.

[0012] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem anticorpos inteiros e fragmentos ou derivados destes funcionalmente ativos e podem ser, mas não são limitados a, anticorpos monoclonais, multi-valentes, multi-específicos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de domínio por exemplo, VH, VL, VHH, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’)2 e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Outros fragmentos de anticorpo incluem aqueles descritos nos Pedidos de patente internacionais WO2005003169, WO2005003170 e WO2005003171. Fragmentos de anticorpo e métodos de produzi- los são bem conhecidos na técnica, ver por exemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair e Lawson, 2005. Therapeutic Antibodies. Drug Design Reviews - Online 2(3): 209-217.

[0013] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que especificamente se liga a um antígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasses da molécula de imunoglobulina.

[0014] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) e a técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0015] Os anticorpos para o uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único pela clonagem e que expressam os cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por exemplo pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843- 78481; WO92/02551; WO2004/051268 e Pedido de Patente Internacional número WO2004/106377.

[0016] Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de não humanas tendo uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) da região não humana e uma de matriz de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, a US 5.585.089; WO91/09967).

[0017] Os anticorpos quiméricos são aqueles anticorpos codificados pelos genes da imunoglobulina que foram engendrados geneticamente de modo que os genes da cadeia leve e pesada são compostos de segmentos de gene da imunoglobulina que pertencem a espécies diferentes. Estes anticorpos quiméricos são prováveis de serem menos antigênicos. Os anticorpos bivalentes podem ser fabricados pelos métodos conhecidos na técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659). Os anticorpos multivalentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficos (ver por exemplo WO 92/22853 e WO05/113605).

[0018] Os anticorpos para o uso na presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de demonstração de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles divulgados por Brinkman et al. (em J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) e WO 90/02809; WO91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108. Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única, tais como aquelas descritas na US 4.946.778 também podem ser adaptados para produzir anticorpos de cadeia única que se ligam à IL-17A e IL-17F. Também, camundongos transgênicos ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados.

[0019] Os resíduos em domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema planejado por Kabat et al. Este sistema é apresentado em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (daqui em diante “Kabat et al. (supra)”). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo exceto onde de outro modo indicado.

[0020] As designações de resíduo de Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais do que na numeração de Kabat estrita que corresponde a um encurtamento de ou inserção em, um componente estrutural, seja região de matriz ou região determinadora de complementaridade (CDR), da estrutura de domínio variável básico. A numeração Kabat correta de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat “padrão”.

[0021] As CDRs do domínio variável de cadeia pesada são localizadas nos resíduos 31 a 35 (CDR-H1), resíduos 50 a 65 (CDR-H2) e resíduos 95 a 102 (CDR- H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Entretanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), a alça equivalente a CDR-H1 estende-se do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim ‘CDR-H1’, como aqui usado, compreende os resíduos de 26 a 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e definição de alça topológica de Chothia.

[0022] As CDRs do domínio variável de cadeia leve são localizadas nos resíduos de 24 a 34 (CDR-L1), resíduos de 50 a 56 (CDR-L2) e resíduos de 89 a 97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0023] Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos uma de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.

[0024] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia pesada, em que pelo menos duas de CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 do domínio variável da cadeia pesada são selecionadas das seguintes: a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR- H3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que a CDR-H1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 1 e a CDR-H2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 2. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 1 e CDR-H3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 3 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e CDR-H3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 3. Para se evitar dúvidas, é entendido que todas as permutas são incluídas.

[0025] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3.

[0026] Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos uma de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-L1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR- L2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-L3.

[0027] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia leve, em que pelo menos duas de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do domínio variável da cadeia leve são selecionadas das seguintes: a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-L3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que a CDR-L1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 4 e a CDR-L2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 5. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que a CDR-L1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 4 e a CDR-L3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 6 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que a CDR- L2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 5 e a CDR-L3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 6. Para se evitar dúvidas, é entendido que todas as permutas são incluídas.

[0028] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que compreendem uma cadeia leve, em que o domínio variável compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR- L3.

[0029] As moléculas de anticorpo da presente invenção preferivelmente compreendem uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada complementar, respectivamente.

[0030] Por este motivo em uma forma de realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: l para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-L3.

[0031] Será avaliado que uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas às CDRs fornecidas pela presente invenção sem alterar significantemente a capacidade do anticorpo para ligar ao IL-17A e IL-17F e para neutralizar a atividade de IL-17A e IL-17F. O efeito de qualquer substituição de aminoácido na ligação e neutralização pode ser facilmente testado por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo pelo uso dos métodos aqui descritos. Consequentemente, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs selecionadas de CDRH-1 (SEQ ID NO: 1), CDRH-2 (SEQ ID NO: 2), CDRH-3 (SEQ ID NO: 3), CDRL-1 (SEQ ID NO: 4), CDRL-2 (SEQ ID NO: 5) e CDRL-3 (SEQ ID NO: 6) em que um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foram substituídas com um outro aminoácido. Também será avaliado que o comprimento de uma ou mais das CDRs podem ser alteradas sem significantemente alterar a capacidade do anticorpo para ligar ao IL-17A e IL-17F e para neutralizar a atividade de IL-17A e IL-17F.

[0032] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência da CDRH-1 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 1, CDRH-2 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e/ou CDRH-3 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 3. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência de CDRH-1 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 1, a CDRH-2 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e/ou a CDRH-3 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 3.

[0033] “Identidade”, como aqui usado, indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. “Similaridade”, como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituída no lugar de isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos no lugar um do outro incluem mas não são limitados a: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas); - lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias laterais de amida); e - cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre). Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing, Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991).

[0034] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende três CDRs em que a sequência da CDRL-1 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 4, a CDRL-2 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 5 e/ou CDRL-3 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 6. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência da CDRL-1 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 4, a CDRL-2 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 5 e/ou a CDRL-3 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 6.

[0035] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0036] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo quimérico.

[0037] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é uma molécula de anticorpo enxertada na CDR que compreende uma ou mais das CDRs fornecidas nas SEQ ID NOS: l a 6. Como aqui usado, o termo ‘molécula de anticorpo enxertada na CDR’ refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino) enxertado em uma matriz da região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). para uma revisão, ver Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Em uma forma de realização ao invés da CDR inteira que é transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinadores de especificidade de qualquer uma das CDRs descritas aqui acima são transferidos para a matriz de anticorpo humano (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Em uma forma de realização apenas os resíduos determinadores de especificidade de uma ou mais das CDRs aqui descritas acima são transferidos para a matriz do anticorpo humano. Em uma outra forma de realização apenas os resíduos determinadores de especificidade de cada uma das CDRs aqui descritas acima são transferidas para a matriz de anticorpo humano.

[0038] Quando as CDRs ou resíduos determinadores de especificidade são enxertados, qualquer sequência de matriz da região variável aceitadora apropriada pode ser usada levando-se em consideração a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, incluindo as regiões de matriz de camundongo, primata e ser humano. Preferivelmente, o anticorpo enxertado com a CDR de acordo com a presente invenção tem um domínio variável que compreende regiões de matriz aceitadora humana assim como uma ou mais das CDRs ou resíduos determinadores de especificidade descritos acima. Assim, é fornecido em uma forma de realização um anticorpo enxertado na CDR neutralizador em que o domínio variável compreende regiões de matriz aceitadoras humanas e CDRs doadoras não humanas.

[0039] Os exemplos de matrizes humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas tanto para a cadeia pesada quanto a cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humana podem ser usadas; estas são disponíveis em: http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/

[0040] Em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as cadeias pesadas e leves aceitadoras não necessariamente precisam ser derivadas do mesmo anticorpo e, se desejado, podem compreender cadeias de compósito tendo regiões de matriz derivadas de cadeias diferentes.

[0041] A região de matriz preferida para a cadeia pesada do anticorpo enxertado com a CDR da presente invenção é derivada da sequência de subgrupo VH3 humana 1-3 3-07 junto com JH4. Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado na CDR neutralizador que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a região de matriz da cadeia pesada é derivada da sequência de subgrupo humano 1-3 3-07 junto com JH4. A sequência de JH4 humano é como segue: (YFDY)WGQGTLVTVSS. O motivo YFDY é parte da CDR-H3 e não é parte da matriz 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).

[0042] A região de matriz preferida para a cadeia leve do anticorpo enxertado com CDR da presente invenção é derivada da sequência de subgrupo da linha germinativa humana VK1 2-1-(1) L4 junto com JK1. Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado na CDR neutralizador que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a região de matriz de cadeia leve é derivada da sequência de subgrupo humana VK1 2-1-(1) L4 junto com JK1. A sequência de JK1 é como segue: (WT)FGQGTKVEIK. O motivo WT é parte da CDR-L3 e não é parte da matriz 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).

[0043] Também, em um anticorpo enxertado com a CDR da presente invenção, as regiões de matriz não precisam ter exatamente a mesma sequência como aquelas do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos não usuais podem ser mudados para resíduos que ocorrem mais freqüentemente para aquela classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, resíduos selecionados nas regiões de matriz aceitadoras podem ser mudadas de modo que elas correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tais mudanças devem ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões de matriz aceitadoras que podem precisar ser trocada é apresentada na WO 91/09967.

[0044] Preferivelmente, em uma molécula de anticorpo enxertada na CDR da presente invenção, se a cadeia pesada aceitadora tem a sequência VH3 humana 1- 3 3-07 junto com JH4, depois as regiões de matriz da cadeia pesada aceitadoras compreendem, além de uma ou mais CDRs doadoras, um resíduo doador pelo menos na posição 94 (de acordo com Kabat et al., (supra)). Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR, em que pelo menos o resíduo na posição 94 do domínio variável da cadeia pesada é um resíduo doador.

[0045] Preferivelmente, em uma molécula de anticorpo enxertada na CDR de acordo com a presente invenção, se a cadeia leve aceitadora tem a sequência do subgrupo VK1 humana 2-1-(1) L4 junto com JK1, então nenhum resíduo doador é transferido isto é, apenas as CDRs são transferidas. Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR em que apenas as CDRs são transferidas com a matriz doadora.

[0046] Os resíduos doadores são resíduos do anticorpo doador, isto é, o anticorpo a partir dos quais as CDRs foram originalmente derivadas.

[0047] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 (gH9).

[0048] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9. Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9.

[0049] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 (gL7).

[0050] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0051] Em uma forma de realização um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0052] Em uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e o domínio variável da cadeia leve compreende um sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0053] Como descrito aqui acima, a molécula de anticorpo da presente invenção pode compreender uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesadas e leves de tamanho natural ou um fragmento destes, tais como um anticorpo de domínio por exemplo, fragmentos VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

[0054] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados com respeito à função proposta da molécula de anticorpo, e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser os domínios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanas. Em particular, domínios da região constante de IgG humana podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para os usos terapêuticos e as funções efetoras de anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isótipos de IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é intencionada para propósitos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo não são requeridas, por exemplo, para bloquear simplesmente a atividade de IL-17. Por exemplo as moléculas de IgG4 em que a serina na posição 241 foi mudada para prolina como descrito em Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108 podem ser usadas. Particularmente preferido é o domínio constante de IgG4 que compreendem esta mudança.

[0055] Em uma forma de realização a cadeia pesada de anticorpo compreende um domínio CH1 e a cadeia leve de anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lambda.

[0056] Em uma forma de realização preferida o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana em que a região constante de cadeia pesada compreende a região constante de IgG4 humana em que a serina na posição 241 foi substituída por prolina como descrito em Angal et al., supra. Consequentemente, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 15.

[0057] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15.

[0058] Em uma forma de realização uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0059] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0060] Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 15 e a cadeia leve compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0061] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0062] Também é fornecido pela presente invenção uma região ou epítopo específicos de IL-17A humana e/ou uma região ou epítopo específicos da IL-17F humana e/ou uma região ou epítopo específicos do heterodímero IL-17A/F humano que é ligado por um anticorpo fornecido pela presente invenção, em particular um anticorpo que compreende a sequência da cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e/ou a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7).

[0063] A região ou epítopo específicos do polipeptídeo da IL-17A humana e a região ou epítopo específicos do polipeptídeo da IL-17F humana e a região ou epítopo específicos do heterodímero IL17A/F humano podem ser identificados por qualquer método de mapeamento de epítopo adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Os exemplos de tais métodos incluem triar peptídeos de comprimentos variáveis derivados de IL-17A e IL-17F para ligar ao anticorpo da presente invenção com o menor fragmento que pode especificamente ligar ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo. Os peptídeos IL-17 podem ser produzidos sinteticamente ou pela digestão proteolítica do polipeptídeo de IL-17 apropriada. Os peptídeos que ligam o anticorpo podem ser identificados, por exemplo, pela análise espectrométrica de massa. Em um outro exemplo, a espectroscopia de RMN pode ser usada para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Uma vez identificado, o fragmento epitópico que se liga a um anticorpo da presente invenção pode ser usado, se requerido, como um imunógeno para se obter anticorpos de neutralização adicionais que se ligam ao mesmo epítopo.

[0064] Os anticorpos que bloqueiam cruzado a ligação de um anticorpo de acordo com a presente invenção, em particular, um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7), podem ser similarmente úteis na neutralização da atividade de IL- 17A e IL-17F. Consequentemente, a presente invenção também fornece um anticorpo de neutralização que se liga às IL-17A humana e IL-17F humana, que bloqueiam cruzado a ligação de qualquer um dos anticorpos descritos acima para IL- 17A humana e/ou IL-17F humana e/ou heterodímero IL-17A/F humano e/ou é bloqueado cruzado a partir da ligação de IL-17A e/ou IL-17F e/ou heterodímero IL- 17A/F humano por qualquer um destes anticorpos. Em uma forma de realização, um tal anticorpo liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo aqui descrito acima. Em uma outra forma de realização o anticorpo de neutralização bloqueador cruzado liga- se a um epítopo que faz fronteira e/ou se sobrepõem com o epítopo ligado por um anticorpo aqui descrito acima. Em uma outra forma de realização o anticorpo de neutralização bloqueador cruzado deste aspecto da invenção não se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo da presente invenção ou um epítopo que faz fronteira e/ou se sobrepõem com o dito epítopo.

[0065] Os anticorpos bloqueadores cruzados podem ser identificados usando qualquer método adequado na técnica, por exemplo usando-se ELISA de competição ou BIAcore onde a ligação do anticorpo bloqueador cruzado à IL-17A humana e/ou IL-17F humana impede a ligação de um anticorpo da presente invenção ou vice-versa.

[0066] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e IL-17F humana, que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência gH9 (SEQ ID NO: 9) e cuja cadeia leve compreende a sequência gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A humana e à IL-17F humana. Em uma forma de realização os anticorpos que bloqueiam cruzado fornecidos pela presente invenção inibem a ligação de um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 % e à IL-17F em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0067] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e IL-17F humana, que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência gH9 (SEQ ID NO: 9) e cuja cadeia leve compreende a sequência gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A humana e à IL-17F humana e ao heterodímero IL-17A/F humano. Em uma forma de realização os anticorpos que bloqueiam cruzado fornecidos pela presente invenção inibem a ligação de um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 % e à IL-17F em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 % e ao heterodímero IL- 17A/F à IL-17F em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0068] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e IL-17F humana, que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência gH9 (SEQ ID NO: 9) e cuja cadeia leve compreende a sequência gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A humana ou à IL-17F humana ou ao heterodímero IL-17A/F humano. Em uma forma de realização os anticorpos que bloqueiam cruzado fornecidos pela presente invenção inibem a ligação de um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) à IL-17A ou IL-17F ou IL-17A/F em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0069] Alternativamente ou além disso, anticorpos de neutralização de acordo com este aspecto da invenção podem ser bloqueados cruzado da ligação à IL-17A humana e IL-17F humana por um anticorpo que compreende a sequência da cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7). Portanto também é fornecida uma molécula de anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e à IL-17F humana que é bloqueado cruzado de ligar IL-17A humana e IL-17F humana por um anticorpo que compreende a sequência da cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7). Em uma forma de realização os anticorpos de neutralização fornecidos por este aspecto da invenção são inibidos de ligar à IL-17A humana e IL-17F humana por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0070] Em uma outra forma de realização é fornecido uma molécula de anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e à IL-17F humana que é bloqueada cruzado de ligar IL-17A humana e IL-17F humana e heterodímero de IL-17A/F por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7). Em uma forma de realização os anticorpos de neutralização fornecidos por este aspecto da invenção são inibidos de ligar à IL-17A humana e IL-17F humana e heterodímero de IL-17A/F humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0071] Portanto também é fornecido uma molécula de anticorpo de neutralização que se liga à IL-17A humana e à IL-17F humana que é bloqueada cruzado de ligar IL-17A humana ou IL-17F humana ou IL-17A/F humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7). Em uma forma de realização os anticorpos de neutralização fornecidos por este aspecto da invenção são inibidos de ligar à IL-17A humana ou IL-17F humana ou IL-17A/F humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH9 (SEQ ID NO: 9) e a sequência de cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 7) em mais do que 80 %, preferivelmente em mais do que 85 %, mais preferivelmente em mais do que 90 %, ainda mais preferivelmente em mais do que 95 %.

[0072] A molécula de anticorpo de qualquer aspecto da presente invenção preferivelmente tem uma alta afinidade de ligação, preferivelmente nanomolar, ainda mais preferivelmente picomolar. Será avaliado que a afinidade de ligação de um anticorpo de acordo com a presente invenção para IL-17A humana pode ser diferente da afinidade de ligação do mesmo anticorpo para IL-17F humana e/ou o heterodímero de IL-17A/F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é maior do que a sua afinidade para IL- 17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é pelo menos 10 vezes maior do que a sua afinidade de ligação para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é pelo menos 50 vezes maior do que a sua afinidade de ligação para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é pelo menos 100 vezes maior do que a sua afinidade de ligação para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17F que é maior do que a sua afinidade para IL-17A. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é a mesma como a sua afinidade para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade picomolar para IL-17A e uma afinidade nanomolar para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade nanomolar para IL-17F e uma afinidade picomolar para IL-17A. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade nanomolar tanto para IL-17A quanto para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade picomolar tanto para IL-17A quanto para IL- 17F.

[0073] Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A melhor do que 10 nM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL- 17A melhor do que 500 pM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A melhor do que 100 pM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A melhor do que 20 pM. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A de 16 pM.

[0074] Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17F melhor do que 10 nM. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17F melhor do que 2 nM. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17F de 1,75 nM.

[0075] Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para o heterodímero de IL17A/F melhor do que 10 nM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para heterodímero de IL-17A/F melhor do que 500 pM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para heterodímero de IL17A/F melhor do que 150 pM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para heterodímero de IL-17A/F de 116 pM.

[0076] Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17F de cinomolgo melhor do que 2 nM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17F de cinomolgo de 1,03 nM.

[0077] Será avaliado que a afinidade dos anticorpos fornecidos pela presente invenção pode ser alterados usando qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção também diz respeito às variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que têm uma afinidade melhorada para IL-17A e/ou IL-17F. Tais variantes podem ser obtidas por vários protocolos de maturação por afinidade incluindo mutar as CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), embaralhamento de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), demonstração de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) debatem estes métodos de maturação por afinidade.

[0078] Em uma forma de realização as moléculas de anticorpo da presente invenção neutralizam a atividade de IL-17A e IL-17F, por exemplo nos ensaios in vitro descritos nos Exemplos. Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F que é capaz de inibir a atividade de 0,8 nM de IL-17A humana em 50 % a uma concentração de menos do que 5 nM e a atividade de 4,2 nM de IL-17F em 50 % a uma concentração de menos do que 12 nM da dita atividade inibidora que é medida na liberação induzida por IL-17A ou IL-17F de IL-6 a partir de células Hela. Em uma forma de realização a concentração de anticorpo que inibe IL-17A em 50 % é menor do que 3 nM. Em uma forma de realização a concentração de anticorpo que inibe IL-17F em 50 % é menor do que 11 nM. Em uma forma de realização a IL-17A humana e IL-17F humana usadas nos ensaios são IL-17A e IL-17F humanas recombinantes. Em uma forma de realização o anticorpo de neutralização é um anticorpo humanizado ou totalmente humano.

[0079] Se desejado um anticorpo para o uso na presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais molécula(s) efetora(s). Será avaliado que a molécula efetora pode compreender uma única molécula efetora ou duas ou mais de tais moléculas assim ligadas como para formar uma única porção que pode ser ligada aos anticorpos da presente invenção. Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isto pode ser preparado pelos procedimentos de DNA químicos ou recombinantes padrão em que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou por intermédio de um agente de ligação à molécula efetora. Técnicas para conjugar tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119- 58 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo a ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na WO 86/01533 e EP0392745.

[0080] O termo molécula efetora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes neoplásticos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucléicos e fragmentos destes por exemplo, DNA, RNA e fragmentos destes, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados pela espectroscopia de RMN ou ESR.

[0081] Os exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos incluindo qualquer agente que seja nocivo (por exemplo, mate) às células. Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes.

[0082] As molécula efetoras também incluem, mas não são limitadas a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquiladores (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[0083] Outras molécula efetoras podem incluir radionuclídeos quelados tais como 111In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Califórnio252, Irídio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou medicamentos tais como mas não limitados a, alquilfosfocolinas, inibidores da topoisomerase I, taxóides e suramina.

[0084] Outras molécula efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não são limitadas às, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas, toxinas tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria, uma proteína tal como insulina, fator de necrose de tumor, interferon α, interferon β, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou, um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulador de colônia de granulócito (GCSF), fator de crescimento de nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.

[0085] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis por exemplo em diagnóstico. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais que emitem pósitron (para o uso na tomografia de emissão de pósitron) e íons de metal paramagnético não radioativo. Ver no geral a Patente U.S. No 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para o uso como diagnósticos. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; os grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; os materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In e 99Tc.

[0086] Em um outro exemplo a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo, e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou realçar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial para o sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas que ligam albumina ou compostos que ligam albumina tais como aqueles descritos na WO 05/117984.

[0087] Onde a molécula efetora é um polímero esta, no geral, pode ser um polímero sintético ou um que ocorre naturalmente, por exemplo um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou hetero- polissacarídeo.

[0088] Os substituintes opcionais particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0089] Os exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol) poli(álcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos ou derivados destes, especialmente poli(etileno glicol) opcionalmente substituído tal como metoxipoli(etileno glicol) ou derivados destes.

[0090] Os polímeros que ocorrem naturalmente particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados destes.

[0091] “Derivados” como aqui usado é intencionado a incluir derivados reativos, por exemplo grupos reativos seletivos em tiol tais como maleimidas e outros. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador ao polímero. Será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[0092] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas no geral estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, preferivelmente de 5000 a 40000 Da e mais preferivelmente de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero em particular pode ser selecionado com base no uso pretendido do produto por exemplo capacidade para localizar a certos tecidos tais como tumores ou meia-vida em circulação prolongada (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, onde o produto é intencionado deixar a circulação e penetrar no tecido, por exemplo para o uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo com um peso molecular em torno de 5000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.

[0093] Os polímeros particularmente preferidos incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado destes e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

[0094] Em um exemplo anticorpos para o uso na presente invenção são ligados às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser engendrados no fragmento usando métodos de DNA recombinantes (ver por exemplo US 5.219.996; US 5.667.425; W098/25971). Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento de Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade de terminal C da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para possibilitar a ligação de uma molécula efetora. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser ligada. Sítios múltiplos podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas de PEG.

[0095] Preferivelmente as moléculas de PEG são covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente no geral será uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação de enxofre-carbono. Onde um grupo tiol é usado como o ponto de ligação de moléculas efetoras apropriadamente ativadas, por exemplo derivados seletivos em tiol tais como maleimidas e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímero como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo em tiol tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo da Nektar, antigamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. As moléculas de PEG particulares incluem metóxi-PEG-amina 20K (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M-PEG-SPA (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater).

[0096] Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento de Fab modificado que é PEGuilado, isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente ligado a isto, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na EP 0948544 [ver também “Poly(ethileneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova Iorque, “Poly(ethileneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. Em um exemplo PEG é ligado a uma cisteína na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento de Fab modificado com PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um único grupo tiol em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e para cada um dos grupos amina no resíduo de lisina podem ser ligadas a um polímero de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab portanto pode ser de aproximadamente 40.000 Da.

[0097] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que é um fragmento Fab modificado tendo uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 e tendo na extremidade de terminal C da sua cadeia pesada uma região de dobradiça modificada contendo pelo menos um resíduo de cisteína ao qual uma molécula efetora é ligada. Preferivelmente a molécula efetora é PEG e é ligada usando os métodos descritos na (WO98/25971 e WO2004072116) por meio do qual um grupo lisila-maleimida é ligado ao resíduo de cisteína na extremidade do terminal C da cadeia pesada e cada grupo amino do resíduo de lisila tem covalentemente ligado a ele um resíduo de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de cerca de 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao anticorpo é portanto de aproximadamente 40.000 Da.

[0098] Em um outro exemplo as moléculas efetoras podem ser ligadas aos fragmentos de anticorpo usando os métodos descritos nos pedidos de patente internacionais WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171.

[0099] A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica as cadeias pesadas e/ou leves de uma molécula de anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzida pelo processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação destes.

[00100] As sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas pelos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam parte ou todas as cadeia pesadas e leves do anticorpo podem ser sintetizados como desejado das sequências de DNA determinadas ou com base nas sequências de aminoácido correspondentes.

[00101] O DNA que codifica as sequências de matriz aceitadora é amplamente disponível àqueles habilitados na técnica e pode ser facilmente sintetizado com base nas suas sequências de aminoácido conhecidas.

[00102] As técnicas padrão da biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo. As técnicas de mutagênese direcionada ao sítio e reação da cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriadas.

[00103] Os exemplos de sequências adequadas são fornecidos na SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18. Nucleotídeos de 1 a 57 na SEQ ID NO 18 e 1 a 60 na SEQ ID NO 14 codificam a sequência de peptídeo de sinal do anticorpo B72.3 de camundongo (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505) que é clivada para dar uma molécula de anticorpo de neutralização da presente invenção.

[00104] A presente invenção também diz respeito a um vetor de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Consequentemente, é fornecido um vetor de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o vetor de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA, que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, respectivamente. Preferivelmente, um vetor de acordo com a presente invenção compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 18. Nucleotídeos de 1 a 57 na SEQ ID NO 18 e 1 a 60 na SEQ ID NO 14 codificam a sequência de peptídeo de sinal do anticorpo B72.3 de camundongo (resíduos 1 a 19 na SEQ ID NO: 16 e 1 a 20 na SEQ ID NO: 12 respectivamente) que é mais preferivelmente clivado para dar uma molécula de anticorpo de neutralização da presente invenção.

[00105] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A este respeito, referência é feita ao “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova Iorque e ao Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.

[00106] Também é fornecido uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA que codifica um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema de célula hospedeira/vetor adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Sistemas bacterianos, por exemplo E. coli e outros microbianos podem ser usados ou sistemas de expressão de célula hospedeira eucariótica, por exemplo de mamífero, também podem ser usados. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, de mieloma ou hibridoma.

[00107] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão de proteína do DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção e isolar a molécula de anticorpo.

[00108] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso este em que apenas uma sequência codificadora de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos que compreendem tanto cadeia pesada quanto leve, a linhagem de célula pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo sequências que codificam os polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[00109] Visto que os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitáveis. Consequentemente, é fornecido o uso de um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento. A composição usualmente será fornecida como parte de uma composição farmacêutica, estéril que normalmente incluirá um carreador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção adicionalmente pode compreender um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00110] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende adicionar e misturar a molécula de anticorpo da presente invenção junto com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitáveis.

[00111] A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo na composição farmacêutica ou de diagnóstico ou pode estar acompanhada por outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo ingredientes de anticorpos anti-TNF, anti-IL-1β, anti-célula T, anti-IFNY ou anti-LPS ou não anticorpo tais como xantinas.

[00112] As composições farmacêuticas preferivelmente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição alvejadas ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de célula ou em modelos de animal, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração e a via de administração apropriadas. Tal informação pode ser depois usada para determinar doses e vias úteis para a administração em seres humanos.

[00113] A quantidade terapeuticamente eficaz exata para um paciente humano dependerá da gravidade do estado de doença, da saúde geral do paciente, da idade, peso e gênero do paciente, dieta, tempo e frequência de administração, combinação(ões) medicamentosa(s), sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada pela experimentação de rotina e está dentro do julgamento do médico. No geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferivelmente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade pré-determinada de um agente ativo da invenção per dose.

[00114] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo, simultânea, sequencial ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormônios.

[00115] A dose na qual a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada depende da natureza da condição a ser tratada, do grau da inflamação presente e se a molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.

[00116] A frequência da dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida curta (por exemplo, de 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo tem uma meia vida longa (por exemplo, de 2 a 15 dias) pode ser necessário dar apenas uma dosagem uma vez ao dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez a cada 1 ou 2 meses.

[00117] O carreador farmaceuticamente aceitável por si só não deve induzir a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Os carreadores adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas.

[00118] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo os sais de ácidos minerais, tais como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00119] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes de umectação ou emulsificação ou substâncias tamponizantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carreadores possibilitam que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões, para a ingestão pelo paciente.

[00120] As formas preferidas para a administração incluem formas adequadas para a administração parenteral, por exemplo, pela injeção ou infusão, por exemplo pela injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, o mesmo pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou veículo aquoso e o mesmo pode conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, conservante, estabilizante e/ou dispersante. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.

[00121] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao paciente. Os pacientes a serem tratados podem ser animais. Entretanto, é preferido que as composições sejam adaptadas para a administração aos pacientes humanos.

[00122] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitadas às vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver a WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser usadas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. As formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.

[00123] A liberação direta das composições no geral será realizadas por injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscularmente ou liberadas no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas em uma lesão. O tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de dose múltipla.

[00124] Será avaliado que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, o mesmo será suscetível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição deva ser administrada por uma via usando o trato gastrointestinal, a composição necessitará conter agentes que protejam o anticorpo da degradação mas que liberem o anticorpo uma vez que o mesmo tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[00125] Um debate completo de carreadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

[00126] Também é considerado que o anticorpo da presente invenção será administrado pelo uso da terapia de gene. De modo a obter isso, as sequências de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA apropriados são introduzidos em um paciente tal que as cadeias de anticorpo sejam expressadas a partir das sequências de DNA e montadas in situ.

[00127] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo para o uso no controle de doenças inflamatórias. Preferivelmente, a molécula de anticorpo pode ser usada para reduzir o processo inflamatório ou para prevenir o processo inflamatório.

[00128] A presente invenção também fornece a molécula de anticorpo da presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado pela IL-17A e/ou IL-17F ou está associado com um nível aumentado de IL-17A e/ou IL-17F. Preferivelmente, a condição patológica é selecionada do grupo que consiste de infecções (virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas), choque endotóxico associado com a infecção, artrite, artrite reumatóide, asma, doença inflamatória pélvica, Mal de Alzheimer, doença de Crohn, doença do intestino inflamatório, Colite ulcerativa, Doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, Diabete Tipo I, artrite de Lyme, meningoencefalite, distúrbios inflamatórios imuno mediados do sistema nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla e síndrome de Guillain-Barr, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição a transplante, câncer (tanto tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, canceres de célula transicional, canceres ovarianos e malignidades hematológicas e em particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, câncer gástrico e câncer colônico), doença cardíaca incluindo doenças isquêmicas tais como infartação do miocárdio assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, periodontite e hipocloridia.

[00129] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia da dor.

[00130] A presente invenção fornece ainda o uso de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado pela IL-17A e/ou IL-17F ou associado com um nível aumentado de IL-17A e/ou IL-17F. Preferivelmente o distúrbio patológico é a artrite reumatóide ou esclerose múltipla.

[00131] A presente invenção fornece ainda o uso de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da dor.

[00132] Uma molécula de anticorpo da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia onde é desejado reduzir os efeitos de IL-17A e/ou IL-17F no corpo humano ou animal. IL-17A e/ou IL-17F podem estar circulando no corpo ou podem estar presentes em um nível indesejavelmente alto localizado em um sítio particular no corpo, por exemplo um sítio de inflamação.

[00133] Uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção é preferivelmente usada para o controle de doença inflamatória, doença autoimune ou câncer.

[00134] A presente invenção também fornece um método de tratar pacientes humanos ou animal que sofrem de um distúrbio ou em risco do mesmo mediado pela IL-17A e/ou IL-17F, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo da presente invenção.

[00135] Uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção também pode ser usada em diagnóstico, por exemplo no diagnóstico e formação de imagem in vivo de estados de doença que envolvem IL-17A e/ou IL-17F.

[00136] A presente invenção é ainda descrita apenas por via de ilustração nos seguintes exemplos, que referem-se às Figuras anexas, em que:

[00137] Figura: 1a) Região de cadeia leve V do anticorpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 7) b) Região de cadeia pesada V do anticorpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 9) c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), CDRL3 (SEQ ID NO: 6) do anticorpo CA028_496. d) Cadeia leve do anticorpo CA028_496 (SEQ ID NO: 11). e) Cadeia pesada do anticorpo CA028_496 (SEQ ID NO: 15). f) DNA que codifica a cadeia leve do anticorpo CA028_496 incluindo sequência de sinal (SEQ ID NO: 14). g) DNA que codifica a cadeia pesada do anticorpo CA028_496 incluindo a sequência de sinal (SEQ ID NO: 18).

[00138] Figure 2 a) O efeito do anticorpo CA0280496 (designado Ab#496 na legenda) na produção de IL-6 induzida por IL-17 humana a partir das células Hela. b) O efeito do anticorpo CA0280496 (designado Ab#496 na legenda) sobre a produção de IL-6 induzida pela IL-17F humana a partir de células Hela

[00139] Manipulações de DNA e métodos gerais

[00140] A cepa de E. coli INVαF’ (Invitrogen) foi usada para a transformação e crescimento de cultura de rotina. As enzimas de restrição e modificação de DNA foram obtidas da Roche Diagnostics Ltd. e New England Biolabs. As preparações plasmídicas foram realizadas usando kits de purificação Maxi Plasmid (QIAGEN, catálogo No 12165). As reações de sequenciamento de DNA foram realizadas usando o kit de sequenciamento ABI Prism Big Dye terminator (catálogo No 4304149) e conduzido em um sequenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados usando o programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Os oligonucleotídeos foram obtidos da Invitrogen. A concentração de IgG foi determinada usando ELISA de montagem de IgG.

[00141] Isoformas de IL-17

[00142] As IL-17A e IL-17F recombinantes foram adquiridas da R&D Systems.

[00143] O heterodímero recombinante de IL-17A/F foi produzido pela ligação de IL-17A e IL-17F usando um ligador de GS. O heterodímero teve a seguinte sequência (SEQ ID NO: 19) MGmPRNPGCPNS ED KNFP R.TVMVNLNnÍN RNTNTN PKRS S DY YNRSTSP WNLHRN EDPERYPS VIWEAKCRHLGCIN ADGN VDYHMNS VPIQQE1LV LRREP P HCPN SFRLEK ILVSVGCTC VTP1VHH V AGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSRKIPICVGHTT FQKP ES CP P VPGGS MKLD1G11N EKQR VS MSMNIESMSTSPWNYTVTWDPNRYPS E WQAQCRNL GCIN AQGKEDIS MN S VP1QQETL V VRR KHQGCS VSFQLE KVLVTVGCTC VTP V1HHV Q

[00144] IL-17F de cinomolgo recombinante (SEQ ID NO: 20) M RKIPKVGH'rFFQKPE3 CPPVPEGSMKLDTGIINENQRVSMS RN 1E SRST 3 PWN YTVTWDPN RY P SEVVQAQCKHL GCINAQGKE DlSMMSVPIQQETLVL RRKHQGC SVS FQ L EKVLVTVGCT CVTPVIHHVQ

[00145] A sequência de DNA que codifica heterodímero de IL-17A/F foi quimicamente sintetizada pelo Entelechon GmbH e foi subclonado no pET43.1a nos sítios NdeI/XhoI. A sequência de DNA que codifica L-17F cino foi amplificada pela PCR usando iniciadores que introduziram sítios de restrição NdeI e XhoI. Os produtos de PCR foram ligados em pCR4BluntTOPO e a sequência verificada antes da digestão e ligação em pET43.1a nos sítios NdeI/XhoI.

[00146] pET43.1a DNA que codifica as isoformas de IL-17 foi usado para transfectar células BL21(DE3) e clones selecionados resistentes a carbenicilina foram cultivados a 37° C durante a noite em caldo 2TY contendo 2 % de glicose e 50 μg/ml de carbenicilina. As culturas foram depois diluídas e cultivadas no mesmo meio para uma OD600 de 0,5 a 0,7, induzidas com 1 mM de IPTG e cultivadas a 37° C por um adicional de 4 a 5 horas.

[00147] As células foram colhidas pela centrifugação e os corpos de inclusão preparados a partir das células. Os corpos de inclusão foram solubilizados em 50 mM de Tris-HCl, 5 M de cloridreto de guanidínio, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 2 mM de glutationa reduzida, 0,2 mM de glutationa oxidada, pH 8,5. A proteína de IL- 17 foi redobrada pela adição às gotas da proteína solubilizada no tampão acima sem cloridreto de guanidínio, com agitação vigorosa. O volume final foi escolhido tal que a concentração de proteína final não fosse maior do que 0,1 mg/ml.

[00148] A solução de proteína redobrada foi concentrada se requerido, antes da troca de tampão com 10 mM de MES pH 6. A proteína foi depois aplicada a uma coluna de Sepharose SP HP equilibrada com 20 mM de MES pH 6. A proteína foi eluída com um gradiente linear de 0 a 500 mM de NaCl em MES pH 6 em 10 volumes de coluna. Para IL-17F o gradiente foi estendido para 600 mM de NaCl. De modo a purificar ainda mais a IL-17, a fração relevante da coluna de Sepharose SP HP foi reunida, concentrada e diluída com 20 mM de CAPSO (pH 10) e aplicada a uma coluna Mono Q equilibrada com 20 mM de CAPSO. A proteína foi eluída com um gradiente linear de 0 a 250 mM de NaCl em 20 mM de CAPSO em 20 volumes de coluna. As frações contendo IL-17 foram reunidas e neutralizadas usando 1 M de MES pH 6.

[00149] Exemplo 1: Produção de um anticorpo de neutralização anti-IL-17

[00150] Ratos Sprague Dawly fêmeas foram imunizados com IL-17 humano recombinante (adquirido da R & D systems). Os ratos receberam quatro imunizações de 20 μ g de IL-17 em 100 μl de adjuvante de Freund. O anticorpo 225 que se liga à IL-17 humana foi isolado usando os métodos descritos na WO04/051268. Os genes para o domínio variável de cadeia pesada (VH) e domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo 225 foram isolados e sequenciados a seguir da clonagem por intermédio da PCR de transcrição reversa.

[00151] Uma série das regiões VL e VH humanizadas foi planejada usando matrizes aceitadoras da região V humana e pela variação do número de resíduos doadores nas regiões de matriz. Oito regiões VL enxertadas (gL1-8) e 9 regiões VH enxertadas (gH1-9) foram planejadas e genes foram construídos pela montagem de oligonucleotídeo e mutagênese de PCR.

[00152] As sequências enxertadas de cadeia leve foram sub-clonadas no vetor de expressão de cadeia leve humana pKH10.1 que contém o DNA que codifica a região constante Capa C humana (alotipo Km3). As sequências enxertadas de cadeia pesada foram sub-clonadas no vetor de expressão gama 4 humano pVhg4P FL, que contém o DNA que codifica a região constante gama 4 humana contendo a mutação de estabilização de dobradiça S241P (Angal et al., supra). Os plasmídeos foram co- transfectados em células CHO e os anticorpos produzidos triados quanto a atividade nos ensaios de ligação e neutralização de IL-17. As transfecções de células CHO foram realizadas usando o procedimento de Lipofectamina® 2000 de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen, catálogo No 11668).

[00153] O enxerto mais ótimo com base na potência de expressão, afinidade e neutralização (gL7gH9) foi selecionado e chamado de CA0280496. As sequências da região V deste anticorpo são mostradas na Figura 1 (a) e (b) e nas SEQ ID NOs: 7 e 9 para a cadeia leve (gL7) e cadeia pesadas (gH9) respectivamente.

[00154] A matriz aceitadora de cadeia pesada é a sequência da linha germinativa humana VH3 1-3 3-07 com matriz 4 origina-se desta porção da linha germinativa da região JH humana JH4. A matriz aceitadora de cadeia leve é a sequência da linha germinativa humana VK1 2-1-(1) L4, com a matriz 4 originando-se desta porção da linha germinativa da região JK humana JK1.

[00155] Exemplo 2: Anticorpo CA028 0496 neutraliza IL-17 e IL-17F e heterodímero de IL-17A/F

[00156] Células Hela

[00157] A potência do anticorpo CA028_0496 contra IL-17 recombinante humana e IL-17F recombinante humana em células Hela foi testada e comparada com o anticorpo CDP435 (WO06/054059). As células Hela foram obtidas do banco de célula na ATCC (ATCC CCL-2). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal, penicilina, gentamicina e glutamina. 1 x 104 células foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de fundo chato de 96 reservatórios. As células foram incubadas durante a noite e lavadas uma vez em tampão de ensaio. A IL-17A humana (25 ng ml-1) ou IL-17F humana (125 ng ml-1) foram incubadas na presença de uma concentração fixa de TNF-α humano esta mistura foi pré incubada com anticorpo CA028_0496 ou anticorpo CDP435. Citocina mais anticorpo foram depois adicionados às células Hela que foram incubadas durante a noite. A produção de IL- 6 no sobrenadante de cultura de célula foi proporcional à quantidade de IL-17A/IL- 17F adicionados às células. Os níveis de IL-6 humana foram medidos pelo ELISA e quantificados pela comparação com concentrações padrão conhecidas de IL-6 humana.

[00158] Os dados (Figuras 2a e 2b) indicam que o anticorpo CA0280496 neutralizou potencialmente IL-17A recombinante humana e também teve alguma atividade contra IL-17F humana. Os dados destes experimentos indicaram que o anticorpo CA0280496 deu uma IC50 de 43/ng/ml contra a IL-17 recombinante humana (25 ng ml-1) e 1477 ng/ml contra IL-17F recombinante (125 ng ml-1).

[00159] Consequentemente, o anticorpo CA028_0496 deu uma IC50 de 0,29 M contra IL-17 recombinante humana (0,78 nM) e 10,18 nM contra IL-17F recombinante humana (4,16 nM) neste ensaio (cálculo com base na IgG assumindo um peso molecular de 145.000 como um IgG4 médio e assumindo que IL-17A e IL- 17F são dímeros).

[00160] Células de micróglia humana

[00161] As células de micróglia humana (TCS Cellworks) foram plaqueadas em uma placa de 96 reservatórios de fundo chato a 5.000 células por reservatório em um volume total de 100 μl e deixado por 24 horas para ligar ao plástico. Neste momento as titulações (5, 1, 0,2 e 0,04 μ g/ml) de IL-17A recombinante humana, IL- 17F recombinante humana, IL-17F recombinante de cinomolgo e heterodímero de IL-17A/F recombinante humano na presença e ausência de 10 ng/ml de TNFα recombinante humano foram adicionados aos reservatórios em triplicata. Os reservatórios de controle não contiveram nenhuma estimulação, IL-17A sozinha (100 ng/ml), TNFα sozinho e IL-17A e TNFα juntos. Todas as citocinas foram adicionadas em um volume total de 110 μl/reservat0rio, compondo o volume de reservatório total de 210 μl. Nos experimentos que envolvem anticorpos, as células foram plaqueadas do mesmo modo. Depois de 24 horas os anticorpos e citocinas foram adicionados ao mesmo tempo para dar as concentrações finais estabelecidas em um volume final total de 200 μl.

[00162] Depois de um adicional de 24 horas de incubação a 37° C, os sobrenadantes foram colhidos e congelados a -20° C até a análise. Para a análise, os sobrenadantes foram diluídos 1/10 e medidos para IL-6 usando um kit MSD de IL- 6 humana, de acordo com as instruções do fabricante.

[00163] Todas as isoformas de IL-17 testadas foram descobertas ser ativas no ensaio, particularmente na presença de TNFα.

[00164] A potência de anticorpo CA028_0496 contra IL-17A recombinante humana e IL-17F recombinante humana, IL-17F recombinante de cinomolgo e heterodímero de IL-17A/F recombinante humana em células microgliais humanas foi testada na presença de TNFα e comparada a um anticorpo de controle e um anticorpo específico de IL-17A usando o método descrito acima.

[00165] O anticorpo de controle não teve nenhum efeito sobre a atividade de qualquer uma das citocinas testadas.

[00166] O anticorpo CA0280496 teve atividade inibidora contra todas as três citocinas IL-17, IL-17F e IL-17A/F, incluindo IL-17F de cinomolgo enquanto que o anticorpo específico de IL-17A teve apenas atividade inibidora contra IL-17A e heterodímero de IL-17A/F.

[00167] Exemplo 3: Afinidade de anticorpo CA028 0496 (regiões constantes de IgG4 humana) para IL-17A e IL-17F

[00168] BIA (Análise de Interação Biamolecular) foi realizada usando um Biacore 3000 (Biacore AB). Todos os experimentos foram realizados a 25° C. Fragmento Fc Affinipure de IgG anti-humano de cabra, fragmento Fc específico (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um Chip Sensor CM5 por intermédio da química de ligação de amina a um nível de captura de ~6000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20, Biacore AB) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μl/min. Uma injeção de 10 μl de anticorpo CA028_0496 (1,81 mg/ml) foi usada para capturar pelo IgG-Fc anti-humano imobilizado. As isoformas IL-17A e IL-17 humanas foram tituladas sobre o CA0280496 capturado em diluições duplicadas de 50 nM a sub nM em uma taxa de fluxo de 30 μl/min. A superfície foi regenerada por uma injeção de 30 μl de HCl 40 mM, seguido por uma injeção de 5 μl de NaOH 5 mM.

[00169] A subtração do fundo das curvas de ligação foi duplamente citada e analisada usando o software BIAevaluation (versão 3.2) seguindo procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste.

[00170] O valor de afinidade determinado para o anticorpo CA028_0496 que liga IL-17A foi de 16 pM e 1750 pM para IL-17F. O anticorpo CA028_0496 não ligou às outras isoformas de IL-17 (IL-17 B, C, D e E). O anticorpo CA0280496 portanto especificamente liga IL-17A e IL-17F.

[00171] Exemplo 4: Afinidade de anticorpo CA028 0496 (regiões constantes de IgG1 de murino) para IL-17A, cinomolgo IL-17F e heterodímero de IL-17A/F

[00172] BIA (Análise de Interação Biamolecular) foi realizada usando um Biacore 3000 (Biacore AB).

[00173] Todos os experimentos foram realizados a 25° C. o fragmento de F(ab’)2 Affinipure de IgG anti-camundongo de cabra, fragmento Fc específico (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um Chip Sensor CM5 (Biacore AB) por intermédio da química de ligação de amina a um nível de captura de «6000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, NaCl 0,15 M, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20, Biacore AB) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μl/min. Uma injeção de 10 μl de anticorpo CA028_0496 a 4 μ g/ml foi usada para a captura pelo IgG anti-camundongo imobilizado, Fc. IL-17A humana, IL-17F cino e heterodímero A/F foram titulados sobre o CA028_0496 capturado em diluições em duplicata a partir de 25 nM até sub nM a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. A superfície foi regenerada a uma taxa de fluxo de 10 μl/min por uma injeção de 10 μl de HCl 40 mM, seguida por uma injeção de 5 μl de NaOH a 5 mM.

[00174] A subtração do fundo das curvas de ligação foi duplamente citada e analisada usando o software BIAevaluation (versão 3.2) seguindo procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste.

[00175] O anticorpo CA028_0496 teve uma afinidade de 21 pM para IL-17A, 116 pM para heterodímero de IL-17A/F e 1030 pM para a IL-17F de cinomolgo.

[00176] Naturalmente será entendido que a presente invenção foi descrita apenas por via de exemplo, não é de nenhum modo intencionada a ser limitante e que as modificações de detalhes podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações a seguir. As características preferidas de cada forma de realização da invenção são como para cada uma das outras formas de realização mutatis mutandis. Todas as publicações, incluindo mas não limitadas às patentes e pedidos de patente, citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada ser incorporada aqui por referência como se completamente apresentada.

Claims

1. Anticorpo de neutralização que liga a IL-17A humana e IL-17F humana, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 e em que o anticorpo tem uma afinidade para IL-17A melhor que 20pM e uma afinidade para IL-17F melhor que 2nM.

2. Anticorpo de neutralização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

3. Anticorpo de neutralização de acordo com a reivindicação 2 que liga a IL-17A humana e IL-17F humana, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

4. Anticorpo de neutralização que liga a IL-17A humana e IL-17F humana, caracterizado pelo fato de que liga-se ao mesmo epítopo na IL-17A humana e IL-17F humana como o anticorpo como definido na reivindicação 2.

5. Anticorpo de neutralização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo inteiro ou um fragmento ou derivados deste funcionalmente ativos.

6. Anticorpo de neutralização de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv ou um fragmento de ligação de epítopo destes.

7. Anticorpo de neutralização de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo enxertado com CDR.

8. Anticorpo de neutralização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é conjugado a uma ou mais moléculas efetoras.

9. Sequência de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que codifica as cadeias pesada e/ou leve de um anticorpo de SEQ ID Nos 8 e 10 ou 14 e18.

10. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de DNA como definida na reivindicação 9.

11. Processo para a produção do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão como definidos na reivindicação 10 e isolar o anticorpo.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitáveis.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende outros ingredientes ativos.

14. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico selecionado do grupo consistindo em artrite, artrite reumatóide, asma, psoríase e esclerose múltipla.