BRPI0718389A2

BRPI0718389A2 - incorporação genética de aminoácidos antinaturais em proteìnas em células de mamìferos

Info

Publication number: BRPI0718389A2
Application number: BRPI0718389-5A
Authority: BR
Inventors: Wenshe Liu; Peter G Schultz
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2012-04-10
Also published as: JP2010506591A; US20100021963A1; EP2069481A2; CN101535338A; RU2009112104A; MX2009004043A; AU2007333010A1; KR20090094812A; IL197917A0; WO2008073184A3; EP2069481A4; CA2665678A1; US20080166766A1; US9624485B2; WO2008073184A2

Abstract

INCORPORAçãO GENéTICA DE AMINOáCIDOS ANTINATURAIS EM PROTEìAS EM CéLULAS DE MAMìFERO. A invenção se refere aos pares ortogonais de tRNAs e aminoacil-tRNA sintetases que podem incorporar aminoácidos antinaturais em proteínas em células hospedeiras de mamífero, por exemplo, células hospedeiras de primata e células hospedeiras de roedor. A invenção fornece, por exemplo, porém não limitada aos, sistemas de transíação que incluem células hospedeiras (por exemplo, células de primata ou roedor), aminoacil-tRNA sintetases ortogonais derivadas de sintetases eubacterianas, tRNAs ortogonais, e o aminoácido antinatural. A invenção também se refere aos métodos para produzir proteínas de interesse que compreendem pelo menos um aminoácido antinatural em sistemas de célula hospedeira de mamífero.

Description

"INCORPORAÇÃO GENÉTICA DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS EM PROTEÍNAS EM CÉLULAS MAMÍFERAS"

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade aos Pedidos de Patente Provisórios U.S. No. Seri- al 60/853,008, depositado em 18 de outubro de 2006, e No. Serial 60/923,458, depositado em 12 de abril de 2007, as descrições das quais estão aqui incorporadas através de refe- rência dentro de sua totalidade para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO SOBRE DIREITOS ÀS INVENÇÕES FEITAS SOB DESENVOLVIMENTO E PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADAS

Esta invenção foi feita com suporte governamental a partir dos National Institutes of Health under Grand No. GM62159. O governo pode ter certos direitos a esta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está no campo da bioquímica de translação. A invenção se refere a composições e métodos para preparar e utilizar tRNAs ortogonais, aminoacil-tRNA sinteta- ses ortogonais, e pares destes, que incorporam aminoácidos não naturais em proteínas. A invenção da mesma forma se refere a métodos de produzir proteínas em células que utili- zam tais pares e as proteínas produzidas pelos métodos.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Métodos foram previamente descritos para incorporar aminoácidos não naturais de sítio específico em proteínas em células mamíferas. tRNAs supressores quimicamente ami- noacilados foram microinjetados ou eletroporados em células e neurônios de CHO1 respecti- vamente, e utilizados para suprimir mutações ambarinas de não sentido com uma séries de aminoácidos não naturais (Monahan e outro (2003), "Site-specific incorporation of aminoáci- do não naturais into receptors expressed in Mammalian cells," Chem Biol 10:573-580). En- tretanto, o uso do tRNA aminoacilado como um reagente estequiométrico severamente limita a quantidade de proteína que pode ser produzida.

Alternativamente, pares de tRNA/aaRS supressores heterólogos pares que não re- agem cruzado com tRNAs hospedeiros, aaRSs ou aminoácidos (tRNA/aaRSs ortogonaisl) foram criados para incorporar aminoácidos antinaturais seletivamente em proteínas. For example, Yokoyama e colaboradores modificaram um tRNA t^a supressor ambarino de Ba- cillus stearothermophilus (SstRNA^) e tirosil-tRNA sintetase de E coli (EcTyrRS) para incorporar 3-iodo-L-tirosina em proteínas em células de CHO (Sakamoto e outro (2002), "Si- te-specific incorporation of an aminoácido não natural into proteins in mammalian cells," Nu- cleic Acids Res 30:4692-4699). Semelhantemente, Zhang e colaboradores criaram um par de tRNA/triptofanil-tRNA sintetase supressor de Bacillus subtilis ortogonais para incorporar 5-hidroxitriptofano em proteínas em células mamíferas com alta-fidelidade (Zhang e outro (2004), "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proe NatIAcad Sci USA 101:8882-8887).

Entretanto, o uso de mutagênese baseada em estrutura para gerar variantes de aaRS que aminoacilam um aminoácido cuja cadeia lateral difere significativamente daquela do substrato tipo selvagem requer mutações de resíduos de sítio ativo múltiplos que são difíceis prognoticar a priori (Zhang e outro (2002), "Structure-based design of mutant Metha- nocoeeus jannasehii tyrosyl-tRNA sintetase for incorporation of O-methyl-L-tyrosine," Proe NatIAead Sei USA 99:6579-6584; Turner e outro (2005), "Structural characterization of a p- acetylphenylalanyl aminoacyl-tRNA sintetase," J Am Chem Soe 127:14976-14977; Turner e outro (2006), "Structural plasticity of an aminoacyl-tRNA sintetase active site," Proe Natl A- ead Sei USA 103:6483-6488). Além disso, o mutante criado pode ain da reconhecer amino- ácidos hospedeiros, como é o caso com um aaRS mutante que muda seus tRNA^ cogna- to com 3-iodo-L-tirosina (Sakamoto e outro (2002), "Site-specific incorporation of an aminoá- cido não natural into proteins in mammalian cells," Nueleie Aeids Res 30:4692-4699; and Kiga e outro (2002), "An engineered Eseheriehia eoli tyrosyl-tRNA sintetase for site-specific incorporation of an aminoácido não natural into proteins in eukaryotic translation and its ap- plication in a wheat germ cell-free system," Proc Natl Aead Sei USA 99:9715-9720).

Alternativamente, alguém pode tentar evoluir aaRSs com especificidades alteradas diretamente em células mamíferas. Por exemplo, Wang e colaboradores recentemente utili- zaram hipermutação somática em uma linhagem de célula B humana para evoluir direta- mente uma proteína fluorescente vermelha monomérica com fotoestabilidade realçada e emissões muito vermelhas (Wang e outro (2004), "Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hipermutação," Proc Natl Aead Sei USA 101:16745-16749). Porém, a hi- permutação somática introduz mutações aleatórias na proteína inteira, que pode ser menos eficaz que a diversidade genética criada por mutagênese alvejada do sítio ativo ao evoluir variantes com especificidade de substrato alterada. O último, porém, está limitado por difi- culdades na geração de bibliotecas estáveis grandes em células mamíferas.

TECNOLOGIA DE TRANSLACÃO ORTOGONAL

Uma metodologia geral foi desenvolvida para a incorporação sítio-específica in vivo de aminoácidos não naturais estruturalmente diversos com propriedades físicas, químicas e biológicas não nativas em proteínas em organismos procarióticos e levedura. Estes métodos dependem de componentes de translação de proteína ortogonais que reconhecem um có- don seletor adequado para inserir um aminoácido não natural desejado a uma posição defi- nida em um gene de interesse durante a translação de polipeptídeo in vivo. Estes métodos utilizam um tRNA ortogonal (O-tRNA) que reconhece um códon seletor (por exemplo, um códon ambarino sem sentido), e onde uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (uma O-RS) específica correspondente especificamente carrega a O-tRNA com o aminoácido não natu- ral. Estes componentes não reagem cruzado com quaisquer das tRNAs ou RSs endógenas no organismo hospedeiro (isto é, a tRNA criada e RS são ortogonais).

Utilizando esta técnica em sistemas hospedeirtos de E coli, pares de tRNA/aaRS supressores de fase de leitura e ambarinos funcionais foram foram derivados de par de tR- NATyr/TyrRS de Methanococcus jannaschii, um par de tRNAGlLJ/Pyrococcus horikoshii gluta- mil-tRNA sintetase arehaeal, e um par de tRNALys/Pyrococcus horikoshii lisil-tRNA sintetase arehaeal. Em Saccharomyees eerevisiae (S. eerevisiae), pares de tRNACUA/aaRS funcio- nais foram derivados de pares de tRNATyr/TyrRS e tRNALeu/leucil-tRNA sintetase de E coli correspondentes. Evolução direcionada de pares de tRNA/aaRS supressores utilizando uma combinação de seleções positivas e negativas permitiu a incoporação in vivo altamente sele- tiva, eficiente de um número grande de aminoácidos não naturais diversos em E coli e S. eerevisiae. Estes incluem aminoácidos fluorescentes, glicosilados, sulfatados, de ligação de íon de metal e ativos de redox, bem como aminoácidos com nova reatividade química e fo- toquímica. Esta metodologia fornece uma ferramenta poderosa para explorar a estrutura de proteína e função in vitro e in vivo, e para gerar proteínas, por exemplo, proteínas terapêuti- cas, com propriedades novas ou realçadas. A extensão desta metodologia para células mamíferas, por exemplo, linhagens celulares de primata e roedores, realçaria significativa- mente a a utilidade desta tecnologia.

A prática de utilizar sistemas de translação ortogonais que são adequado para pro- dução in vivo de proteínas que compreendem um ou mais aminoácidos não naturais é ge- ralmente conhecida na técnica. Por exemplo, veja Números de Publicação Internacional WO 2002/086075, intitulados "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SINTETASE PAIRS;" WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, depositado em 7 de Julho, 2004; WO 2005/007870, depositado em 7 de Julho, 2004; WO 2005/007624, deposi- tado em 7 de Julho, 2004 e WO 2006/110182, depositado em 27 de Outubro de 2005, intu- tulado ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS." Cada um destes pedidos está incorporado aqui através de referência em sua totalidade.

Discussão adicional de sistemas de translação ortogonais é da mesma forma en- contrada em, por exemplo, Wang e outro, (2001), "Expanding the genetic code of Escheri- chia coli," Science 292:498-500; Wang e Schultz (2002), "Expanding the Genetic Code," Chem. Commun. (Camb.) 1:1-11; Alfonta e outro, (2003), "Site-Specific Incorporation of a Redox-Active Amino Acid into Proteins," J Am Chem Soc 125:14662-14663; Santoro e outro, (2003), "An archaebacteria-derived glutamyl-tRNA sintetase and tRNA pair for unnatural amino acid mutagenesis of proteins in Escherichia coli," Nucleic Acids Res 31:6700-6709; Chin e outro, (2003), "An expanded eukaryotic genetic code," Science 301, 964-967; Chin e outro, (2003), "Progress toward an expanded eukaryotic genetic code," Chem Biol 10, 511- 519; and Wu e outro, (2004), "A genetically encoded photocaged amino acid," J Am Chem Soc 126, 14306-14307; Summerer e outro, (2006), "A Genetically Encoded Fluorescent Amino Acid," PNAS 103(26):9785-9789; Anderson e outro, (2004), "An expanded genetic code with a functional quadruplet códon," Proc Natl Acad Sci U S A 101:7566-7571; Zhang e outro, (2004), "A new strategy for the synthesis of glycoproteins," Science 303, 371-373; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie and Schultz1 "An Expanding Genetic Code," Methods 36(3):227-238 (2005); Xie and Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Bi- ology 9(6):548-554 (2005); Wang e outro, "Expanding the Genetic Code," Annu. Rev. Bio- phys. Biomoi Struct., 35:225-249 (2006); Xie and Schultz (2006), "A Chemical Toolkit for Proteins - an Expanded Genetic Code," Nat. Rev. Mol. Cell Bioi, 7(10):775-782; Summerer e outro, (2006), "A Genetically Encoded Fluorescent Amino Acid," Proc Natl Acad Sci USA 103, 9785-9789; Wang e outro, (2006), "A Genetically Encoded Fluorescent Amino Acid," J Am Chem Soc 128, 8738-8739; and Liu and Schultz (2006), "Recombinant Expression of Selectively Sulfated Proteins in E. coli," Nat Biotechnol., 24(11): 1436-1440. O conteúdo de cada uma destas publicações acima está por este meio incorporado através de referência.

Há uma necessidade na arte quanto ao desenvolvimento de componentes de trans- lação ortogonais melhorados que incorporam aminoácidos não naturais em proteínas em sistemas hospedeiros de célula mamífera, por exemplo, em sistemas de célula hospedeira de primata e roedor, onde um aminoácido não natural desejado está incorporado em posi- ções definidas. Há uma necessidade na técnica quanto aos métodos melhorados para avali- ar e identificar componentes de translação ortogonais (por exemplo, enzimas aminoacil- tRNA sintetase mutantes) que podem funcionar em células mamíferas, tais como células de roedores e células humanas. A invenção descrita aqui cumpre estas e outras necessidades, visto que ficará evidente na revisão da seguinte descrição.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma abordagem geral que permite os aminoácidos não naturais com propriedades biológicas e fisicoquímicas diversas a ser codificadas geneti- camente em células mamíferas, por exemplo, células de roedores e células de primata. A- minoacil-tRNA sintetases (RS) de Escherichia coli (E. coli) mutantes são primeiro desenvol- vidas em levedura para seletivamente utilizar o aminoácido não natural de interesse. A RS mutante juntamente com uma tRNA supressora ambarina de uma eubacteria, por exemplo, Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus), é em seguida utilizada para sítio espe- cificamente incorporar o aminoácido não natural em proteínas nas células mamíferas com respeito a um códon sem sentido ambarino. Dez aminoácidos não naturais (os aminoácidos não naturais fornecidos na FIG. 1) foram independentemente incorporados em proteínas modelo expressas em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células 293T huma- nas com eficiências até 1 μς de proteína por 2 χ 107 de células. Espectrometria de massa confirmou uma fidelidade translacional alta pelo aminoácido não natural. Esta metodologia pode facilitar a introdução de sondas biológicas em proteínas para estudos celulares e pode finalmente facilitar a síntese de proteínas terapêuticas que contêm aminoácidos não naturais em células mamíferas tais como células de roedores e células de primata.

A invenção fornece composições e métodos para incorporar aminoácidos não natu- rais em uma cadeia de polipeptídeo em desenvolvimento com respeito a um códon seletor, por exemplo, um códon de interrupção ambarino, in vivo em uma célula hospedeira tal como uma célula hospedeira de roedor ou uma célula hospedeira de primata. Estas composições incluem as células hospedeiras, bem como pares de tRNAs ortogonais (O-tRNAs) e aminoa- cil-tRNA sintetases ortogonais (O-RSs) que não interagem com a maquinaria de translação de célula hospedeira. Isto é, a O-tRNA é não carregada (ou não carregado a um nível signi- ficante) com um aminoácido (natural ou não natural) por uma aminoacil-tRNA sintetase de célula hospedeira endógena. Semelhantemente, as O-RSs fornecido pela invenção não car- rega nenhuma tRNA endógena com um aminoácido (natural ou não natural) a um nível sig- nificante ou detectável. Estas novas composições permitem a produção de grandes quanti- dades de proteínas que têm aminoácidos não naturais transacionalmente incorporados em sistemas de célula hospedeira de mamífero.

Em alguns aspectos, a invenção fornece sistemas de translação. Estes sistemas compreendem (a) uma célula hospedeira de mamífero tal como uma célula hospedeira de de roedor ou de primata, compreendendo (b) uma primeira aminoacil-tRNA ortogonal sinte- tase (O-RS), (c) uma primeira tRNA ortogonal (O-tRNA), e (d) um primeiro aminoácido não natural onde a primeira O-RS preferencialmente aminoacila a primeira O-tRNA com o primei- ro aminoácido não natural. O aminoácido não natural pode ser, porém não limitado por:

p-metoxifenilalanina (pMpa);

p-acetilfenilalanina (pApa);

p-benzoilfenilalanina (pBpa);

p-iodofenilalanina (pipa);

p-azidofenilalanina (pAzpa);

p-propargiloxifenilalanina (pPpa);

ácido σ-aminocaprílico;

o-nitrobenzilcisteína (o-NBC);

1,5-dansilalanina; e

o-nitrobenzilserina (o-NBS).

Em alguns aspectos, o O-RS preferencialmente aminoacila a O-tRNA com o referi- do aminoácido não natural com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência obser- vada para um sistema de trarislação que compreende aquela mesma O-tRNA, o aminoácido não natural, e uma aminoacil-tRNA sintetase que compreendem uma seqüência de aminoá- cido selecionada de SEQ ID NO: 57-101.

Os sistemas de translação podem utilizar componentes derivados a partir de uma variedade de fontes. Em uma modalidade, a primeira O-RS é derivada de uma aminoacil- tRNA sintetase de E. coli, por exemplo, uma tirosil ou leucil-tRNA sintetase de E. colí tipo selvagem. Em algumas modalidades, a O-tRNA compreende ou é codificada por SEQ ID NO: 3. A O-RS utilizada no sistema pode compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 57-101, e variantes conservadoras dessa seqüência. Em alguns aspectos, a célula hospedeira pode compreender um ou mais polinucleotídeos que codificam componentes do sistema de translação, incluindo o O-RS ou O-tRNA. Em algumas modalidades, o polinu- cleotídeo que codifica o O-RS compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO: 8-56.

Em alguns aspectos, o sistema de translação compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína de interesse, onde o ácido nucléico tem pelo menos um códon seletor que é reconhecido pela O-tRNA.

Em alguns aspectos, o sistema de translação (isto é, a célula hospedeira) incorpora um segundo par ortogonal (isto é, uma segunda O-RS e uma segunda O-tRNA) que utiliza um segundo aminoácido não natural, de forma que o sistema possa agora incorporar pelo menos dois aminoácidos não naturais diferentes em sítios selecionados diferentes em um polipeptídeo. Neste sistema dual, a segunda O-RS preferencialmente aminoacila a segunda O-tRNA com um segundo aminoácido não natural que é diferente do primeiro aminoácido não natural, e a segunda O-tRNA reconhece um códon seletor que é diferente do códon seletor reconhecido pela primeira O-tRNA.

A célula hospedeira mamífera utilizada no sistema de translação não é particular- mente limitada, contanto que o O-RS e O-tRNA mantenham sua ortogonalidade em seu am- biente de célula hospedeira. A célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de roedor tal como uma célula de camundongo ou uma célula de rato. Quando a célula hospedeira for uma célula de primata, a célula pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira humana, cé- lula hospedeira de chimpanzé, célula hospedeira de bonobo, célula hospdeira de gorila, cé- lula hospedeira de orangotango, célula hospdeira de gibão, célula hospdeira de macaco, célula hospdeira de tamarin ou uma célula hospdeira de sagüi. Por exemplo, a célula hos- pedeira pode ser uma célula de CHO ou uma 293T humana.

Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para produzir proteínas de inte- resse que tem um ou mais aminoácidos não naturais em posições selecionadas. Estes mé- todos utilizam os sistemas de translação descritos acima. Geralmente, estes métodos come- çam com a etapa de fornecer um sistema de translação que compreende: (i) um primeiro aminoácido não natural (por exemplo, um aminoácido não natural de FIG. 1); (ii) uma primei- ra aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS); (iii) uma primeira tRNA ortogonal (O-tRNA), em que o O-RS preferencialmente aminoacila a O-tRNA com o aminoácido não natural; e, (iv) um ácido nucléico que codifica a proteína de interesse onde o ácido nucléico compreen- de pelo menos um códon seletor que é reconhecido pela primeira O-tRNA, e onde a posição do códon seletor no ácido nucléico corresponde à posição selecionada na proteína de inte- resse. Todos estes componentes de sistemas estão contidos em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula de roedor ou uma célula de primata. Os métodos para produzir uma proteína com um aminoácido não natural requer geralmente o cultivo da célula hospedeira na presença de todos os componentes do sistema de translação descritos aci- ma. Nestes métodos, o aminoácido não natural pode ser selecionado a partir de (porém não limitado):

p-metoxifenilalanina (pMpa);

p-acetilfenilalanina (pApa);

p-benzoilfenilalanina (pBpa);

p-iodofenilalanina (pipa);

p-azidofenilalanina (pAzpa);

p-propargiloxifenilalanina (pPpa);

ácido σ-aminocaprílico;

o-nitrobenzilcisteína (o-NBC);

1,5-dansilalanina; e

o-nitrobenzilserina (o-NBS).

Em alguns aspectos destes métodos, o O-RS preferencialmente aminoacila a O- tRNA com o aminoácido não natural com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de translação que compreende essa mesma O-tRNA, o amino- ácido não natural, e uma aminoacil-tRNA sintetase (O-RS) compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 57-101.

Estes métodos podem ser amplamente aplicados utilizando uma variedade de rea- gentes. Em algumas modalidades dos métodos, a O-tRNA compreende ou é codificada por SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica o O-RS e/ou a O- tRNA é fornecido. Em algumas modalidades, o O-RS é derivado de uma aminoacil-tRNA sintetase de E. coli, tal como uma tirosil ou leucil-tRNA sintetase de E. coli tipo selvagem. Em algumas modalidades, a etapa de fornecimento inclui fornecer uma O-RS que compre- ende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOS: 57-101, e varian- tes conservadoras destas. Em alguns aspectos destes métodos, um polinucleotídeo que codifica o O-RS é fornecido. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o O-RS pode com- preender uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO: 8-56. Em algumas modalidades destes métodos, o fornecimento de O-RS requer a muta- ção de uma bolsa de ligação de aminoácido de uma aminoacil-tRNA sintetase de tipo selva- gem através de mutagênese direcionada ao sítio, e selecionar uma O-RS resultante que preferencialmente aminoacila a O-tRNA com o aminoácido não natural. A etapa de seleção compreende positivamente selecionar e negativamente selecionar quanto o O-RS a partir de um lago de moléculas de aminoacil-tRNA sintetase resultantes que seguem a mutagênese direcionada ao sítio.

Estes métodos podem da mesma forma ser modificados para incorporar mais de um aminoácido não natural em uma proteína. Nestes métodos, um segundo sistema de translação ortogonal é empregado junto com o primeiro sistema de translação onde o se- gundo sistema tem aminoácido diferente e especificidades de códon seletor. Por exemplo, a etapa de fornecimento pode incluir o fornecimento de uma segunda O-RS e uma segunda O-tRNA onde a segunda O-RS preferencialmente aminoacila a segunda O-tRNA com um segundo aminoácido não natural que é diferente do primeiro aminoácido não natural, e onde o segundo O-tRNA reconhece um códon seletor no ácido nucléico que é diferente do códon seletor reconhecido pelo primeiro O-tRNA.

DEFINIÇÕES

Antes de descrever a invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a sistemas biológicos particulares, que podem, claro, variar. Da mesma forma deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui é apenas para o propósito de descrever modalidades particulares, e não é pretendida ser limitante. Quando utilizado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a menos que o conteúdo dite claramente de outra maneira. Desse modo, por exemplo, referência a "uma célula" inclui combinações de duas ou mais células; referên- cia a "um polinucleotídeo" inclui, como uma matéria prática, muitas cópias desse polinucleo- tídeo.

A menos que definido aqui e abaixo no restante da especificação, todos os termos técnicos e científicas utilizados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendido por alguém de experiência ordinária na arte a qual a invenção pertence.

Ortogonal: Quando aqui utilizado, o termo "ortogonal" refere-se a uma molécula (por exemplo, uma tRNA ortogonal (O-tRNA) e/ou uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS)) que funciona com componentes endógenos de uma célula com eficiência reduzida quando comparada a uma molécula correspondente que é endógeno à célula ou sistema de translação, ou que falha ao funcionar com componentes endógenos da célula. No contexto de tRNAs e aminoacil-tRNA sintetases, ortogonal refere-se a uma incapacidade ou eficiência reduzida, por exemplo, menor que 20% de eficiência, menor que 10% de eficiência, menor que 5% de eficiência, ou menor que 1% de eficiência, de uma tRNA ortogonal de funcionar com uma tRNA sintetase endógena comparada a uma tRNA endógena de funcionar com a tRNA sintetase endógena, ou de uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal de funcionar com uma tRNA endógena comparada a uma tRNA sintetase endógena de funcionar com a tRNA endógena. A molécula ortogonal necessita de uma molécula complementar endógena fun- cionalmente normal na célula. Por exemplo, uma tRNA ortogonal em uma célula é aminoaci- lada por qualquer RS endógena da célula com eficiência reduzida ou até mesmo zero, quando comparada à aminoacilação de uma tRNA endógena pela RS endógena. Em outro exemplo, uma RS ortogonal aminoacila qualquer tRNA endógena uma célula de interesse com eficiência reduzida ou até mesmo zero, quando comparada à aminoacilação de tRNA endógena por uma RS endógena. Uma segunda molécula ortogonal pode ser introduzida na célula que funciona com a primeira molécula ortogonal. Por exemplo, um par de tRNA/RS ortogonal inclui componentes complementares introduzidos que funcionam junto na célula com uma eficiência (por exemplo, 45 % de eficiência, 50% de eficiência, 60% de eficiência, 70% de eficiência, 75% de eficiência, 80% de eficiência, 90% de eficiência, 95% de eficiên- cia, ou 99% ou mais eficiência) quando comparada àquela de um controle, por exemplo, um par endógeno de tRNA/RS correspondente, ou um par ortogonal ativo (por exemplo, um par de tRNA/RS ortogonal derivado de tirosila ou leucila).

tirosil-tRNA ortogonal: Quando aqui utilizado, uma tirosil-tRNA ortogonal (tirosil-O- tRNA) é uma tRNA que é ortogonal a um sistema de translação de interesse onde a tRNA é: (1) idêntica ou substancialmente similar a uma tirosil-tRNA de ocorrência natural, (2) deriva- da de uma tirosil-tRNA de ocorrência natural através de mutagênese natural ou artificial, (3) derivada por qualquer processo do que leva uma seqüência de uma seqüência de tirosil- tRNA mutante ou tipo selvagem (1) ou (2) em conta, (4) homóloga a uma tirosil-tRNA mutan- te ou tipo selvagem; (5) homóloga a qualquer tRNA que é designada como um substrato para uma tirosil-tRNA sintetase, ou (6) uma variante conservadora de qualquer tRNA de e- xemplo que é designada como um substrato para uma tirosil-tRNA sintetase. A tirosil-tRNA pode existir carregado com um aminoácido, ou em um estado não carregado. É da mesma forma entendido que uma "tirosil-O-tRNA" é opcionalmente carregada (aminoacilada) por uma sintetase cognata com um aminoácido diferente de tirosina, respectivamente, por e- xemplo, com um aminoácido não natural. Realmente, será apreciado que uma tirosil-O-tRNA da invenção é utilizada para inserir essencialmente qualquer aminoácido vantajosamente, seja natural ou não natural, em um polipeptídeo em desenvolvimento, durante a translação, com respeito a um códon seletor.

Tirosil aminoácido sintetase ortogonal: Quando aqui utilizado, uma tirosil aminoáci- do sintetase ortogonal (tirosil-O-RS) é uma enzima que preferencialmente aminoacila a tiro- sil-O-tRNA com um aminoácido em um sistema de translação de interesse. O aminoácido que a tirosil-O-RS carrega sobre a tirosil-O-tRNA pode ser qualquer aminoácido, seja natu- ral, não natural ou artificial, e não está limitado aqui. A sintetase é opcionalmente a mesma como ou homóloga a uma tirosil aminoácido sintetase de ocorrência natural, ou a mesma como ou homóloga a uma sintetase designado como uma O-RS fornecido aqui. Por exem- plo, o O-RS pode ser uma variante conservadora de uma tirosil-O-RS da FIG. 16, e/ou pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica na seqüência a uma O-RS da FIG. 16 (SEQ ID NOS: 57-101).

Leucil-tRNA ortoaonal: Quando aqui utilizado, uma leucil-tRNA ortogonal (leucil-O- tRNA) é uma tRNA que é ortogonal a um sistema de translação de interesse onde a tRNA é: (1) idêntica ou substancialmente similar a uma leucil-tRNA de ocorrência natural, (2) deriva- da de uma leucil-tRNA de ocorrência natural através da mutagênese natural ou artificial, (3) derivada por qualquer processo que leva uma seqüência de uma seqüência de leucil-tRNA mutante ou tipo selvagem (1) ou (2) em conta, (4) homóloga a uma tirosil-tRNA mutante ou tipo selvagem; (5) homóloga a qualquer tRNA que é designada como um substrato para uma leucil-tRNA sintetase, ou (6) uma variante conservadora de qualquer tRNA de exemplo que é designada como um substrato para uma leucil-tRNA sintetase. A leucil-tRNA pode existir carregada com um aminoácido, ou em um estado não carregado. Deve da mesma forma ser entendido que uma "leucil-O-tRNA" é opcionalmente carregada (aminoacilada) por uma sintetase cognata com um aminoácido diferente de leucina, respectivamente, por e- xemplo, com um aminoácido não natural. Realmente, será apreciado que uma leucil-O-tRNA da invenção é vantajosamente utilizada para inserir qualquer essencialmente aminoácido, seja natural ou não natural, em um polipeptídeo em desenvolvimento, durante a translação, com respeito a um códon seletor.

Leucil-aminoácido sintetase ortogonal: Quando aqui utilizado, uma Ieucil aminoáci- do sintetase ortogonal (IeuciI-O-RS) é uma enzima que preferencialmente aminoacila a Ieu- cil-O-tRNA com um aminoácido em um sistema de translação de interesse. O aminoácido que a leucil-O-RS carrega sobre a leucil-O-tRNA pode ser qualquer aminoácido, seja natu- ral, não natural ou artificial, e não está limitado aqui. A sintetase é opcionalmente a mesma a ou homóloga a uma Ieucil aminoácido sintetase de ocorrência natural, ou a mesma como ou homóloga a uma sintetase designada como uma O-RS fornecida aqui. Por exemplo, o O-RS pode ser uma variante conservadora de uma leucil-O-RS da FIG. 16, e/ou pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica na seqüência a uma O-RS de FIG. 16.

Coqnato: O termo "cognato" refere-se aos componentes que funcionam juntos, ou têm algum aspecto de especificidade um para o outro, por exemplo, um tRNA ortogonal e uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal. Os componentes podem da mesma forma ser refe- ridos como sendo complementar.

Preferencialmente aminoacila: Quando aqui utilizado em referência aos sistemas de translação ortogonais, uma O-RS "preferencialmente aminoacila" uma O-tRNA cognata quando o O-RS carrega a O-tRNA com um aminoácido mais eficazmente do que carrega qualquer tRNA endógeno em um sistema de expressão. Isto é, quando a O-tRNA e qualquer tRNA endógena determinada estão presentes em um sistema de translação em relações molares aproximadamente iguais, o O-RS carregará a O-tRNA mais freqüentemente do que carregará a tRNA endógena. Preferivelmente1 a relação relativa da O-tRNA carregada pela O-RS para tRNA endógeno carregada pela O-RS é alta, preferivelmente resultando na O-RS que carrega a O-tRNA exclusivamente, ou quase exclusivamente, quando a O-tRNA e tRNA endógeno estão presentes em concentrações molares iguais no sistema de translação. A relação relativa entre O-tRNA e tRNA endógena que é carregada pela O-RS, quando a O- tRNA e O-RS estão presentes em concentrações molares iguais, é maior que 1:1, preferi- velmente pelo menos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, ainda mais preferi- velmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1.000:1, 5.000:1 ou mais alta.

A O-RS "preferencialmente aminoacila uma O-tRNA com um aminoácido não natu- ral" quando (a) o O-RS preferencialmente aminoacila a O-tRNA comparada a uma tRNA endógena, e (b) onde essa aminoacilação é específica para o aminoácido não natural, quando comparada à aminoacilação de O-tRNA pela O-RS com qualquer aminoácido natu- ral. Isto é, quando os aminoácidos não naturais e naturais estão presentes em quantidades molares iguais em um sistema de translação que compreende o O-RS e O-tRNA, o O-RS carregará a O-tRNA com o aminoácido não natural mais freqüentemente do que com o ami- noácido natural. Preferivelmente, a relação relativa de O-tRNA carregada com o aminoácido não natural para O-tRNA carregada com o aminoácido natural é alta. Mais preferivelmente, o O-RS carrega a O-tRNA exclusivamente, ou quase exclusivamente, com o aminoácido não natural. A relação relativa entre o carregamento de O-tRNA com o aminoácido não natural e carregamento do O-tRNA com o aminoácido natural, quando ambos aminoácidos naturais e não naturais estão presentes no sistema de translação em concentrações molar iguais, é maior que 1:1, preferivelmente pelo menos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, contudo mais preferivelmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1.000:1,5.000:1 ou mais altas.

Códon seletor: O termo "códon seletor" refere-se a códons reconhecidos pela O- tRNA no processo de translação e não reconhecidos por uma tRNA endógena. A alça anti- códon de O-tRNA reconhece o códon seletor no mRNA e incorpora seu aminoácido, por exemplo, um aminoácido não natural, neste sítio no polipeptídeo. Códons seletores podem incluir, por exemplo, códons sem sentido, tais como, códons de interrupção, por exemplo, códons ambarino, ocre, e opala; quatro ou mais códons base; códons raros; códons deriva- dos de pares de base naturais ou não naturais e/ou similares.

tRNA supressor: Um tRNA supressor é um tRNA que altera a leitura de um RNA mensageiro (mRNA) em um determinado sistema de translação, tipicamente permitindo a incorporação de um aminoácido com respeito a um códon de interrupção (isto é, "read- through") durante a translação de um polipeptídeo. Em alguns aspectos, um códon seletor da invenção é um códon supressor, por exemplo, um códon de interrupção (por exemplo, um códon ambarino, ocre ou opala), um códon de quatro bases, um códon raro, etc.

Atividade de supressão: Quando aqui utilizado, o termo "atividade de supressão" se refere, em geral, à capacidade de um tRNA (por exemplo, uma tRNA supressora) permitir read-through translacional de um códon (por exemplo, um códon seletor que é um códon ambarino ou um códon de 4 ou mais bases) que de outra maneira resultaria na terminação da translação ou translação incorreta (por exemplo, fase de leitura). A atividade de supres- são de um tRNA supressor pode ser expressa como uma porcentagem de atividade de read- through translacional observada comparada a um segundo tRNA supressor, ou quando comparada a um sistema de controle, por exemplo, um sistema de controle que necessita de uma O-RS.

A presente invenção fornece vários métodos pelos quais a atividade de supressão pode ser quantificada. O percentual de supressão de uma O-tRNA e O-RS particular contra um códon seletor (por exemplo, um códon ambarino) de interesse refere-se à percentagem da atividade de um determinado marcador teste expresso (por exemplo, LacZ), que inclui um códon seletor, em um ácido nucléico que codifica o marcador teste expresso, em um siste- ma de translação de interesse onde o sistema de translação de interesse inclui uma O-RS e uma O-tRNA, quando comparada a uma construção de controle positivo, onde o controle positivo necessita de O-tRNA, de O-RS e do códon seletor. Desse modo, por exemplo, se uma construção de marcador de controle positivo ativo que necessita de um códon seletor tem uma atividade observada de X em um determinado sistema de translação, em unidades relevantes ao ensaio marcador no tecido, em seguida o percentual de supressão de uma construção teste compreendendo o códon seletor é a porcentagem de X que a construção de marcador teste exibe sob essencialmente as mesmas condições ambientais quando o marcador de controle positivo foi expresso abaixo, exceto que a construção de marcardor teste é expressa em um sistema de translação que também inclui a O-tRNA e a O-RS. Tipi- camente, o sistema de translação que também expressa o marcador teste inclui um aminoá- cido que é reconhecido pela O-RS e O-tRNA. Opcionalmente, o percentual da medida de supressão pode ser refinada por comparação do marcador teste a uma construção de mar- cador de controle "negativo" ou "base", que inclui o mesmo códon seletor como o marcador teste, porém em um sistema que não inclui a O-tRNA, O-RS e/ou aminoácido relevante re- conhecido pela O-tRNA e/ou O-RS. Este controle negativo é útil na normalização das medi- das de supressão percentuais para explicar os efeitos de sinal de base do marcador no sis- tema de translação de interesse.

Eficiência de supressão pode ser determinada por quaisquer dos vários ensaios conhecidos na arte. Por exemplo, um ensaio repórter de β-galactosidase pode ser utilizado, por exemplo, um plasmídeo IacZ derivado (onde a construção tem um códon seletor na se- qüência de ácido nucléico IacZ) é introduzido em células de um organismo apropriado (por exemplo, um organismo onde os componentes ortogonais podem ser utilizados) junto com o plasmídeo que compreende uma O-tRNA da invenção. Uma sintetase cognata podem da mesma forma ser introduzida (como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a sintetase cognata quando expressa). As células são crescidas em meios a uma densidade desejada, por exemplo, a uma OD600 de cerca de 0,5, e ensaios de β-galactosidase sçao realizados, por exemplo, utilizando o Kit de Ensaio de ^-Galactosidase BetaFluor™ (Nova- gen). O percentual de supressão pode ser calculado como a porcentagem de atividade para uma amostra relativa a um controle comparável, por exemplo, o valor observado da constru- ção IacZ derivada, onde a construção tem um códon de sentido correspondente em posição desejada em vez de um códon seletor.

Sistema de translação: O termo "sistema de translação" refere-se aos componentes que incorporam um aminoácido em uma cadeia de polipeptídeo em desenvolvimento (prote- ína). Componentes de um sistema de translação podem incluir, por exemplo, ribossomas, tRNAs, sintetases, mRNA e similares. A O-tRNA e/ou as O-RSs da invenção pode(m) ser adicionada(s) a ou fazer parte de um sistema de translação in vitro ou in vivo, por exemplo, em uma célula mamífera, por exemplo, uma célula de roedor ou uma célula de primata.

Aminoácido não natural: Quando aqui utilizado, o termo "aminoácido não natural" refere-se a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, e/ou análogo de aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural comuns ou seleno cisteína ou pirrolisi- na. Por exemplo, veja os aminoácidos não naturais fornecidos na FIG. 1.

Derivado de: Quando aqui utilizado, o termo "derivado de" refere-se a um compo- nente que é isolado de ou feito utilizando um organismo ou molécula especificada, ou infor- mação do organismo ou molécula especificada. Por exemplo, um polipeptídeo que é deriva- do de um segundo polipeptídeo pode incluir uma seqüência de aminoácido que é idêntica ou substancialmente similar à seqüência de aminoácido do segundo polipeptídeo. No caso de polipeptídeos, as espécies derivadas podem ser obtidas por, por exemplo, mutagênese de ocorrência natural, mutagênese direcionada artificial ou mutagênese aleatória artificial. A mutagênese utilizada para derivar polipeptídeos pode ser intencionalmente direcionada ou intencionalmente aleatória, ou uma mistura de cada. A mutagênese de um polipeptídeo para criar um polipeptídeo diferente derivado do primeiro pode ser um evento aleatório (por e- xemplo, causado por infidelidade de polimerase) e a identificação do polipeptídeo derivado pode ser feita por métodos de avaliação apropriados, por exemplo, como discutido aqui. Mutagênese de um polipeptídeo tipicamente requer a manipulação do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

Seleção positiva ou marcador de avaliação: Quando aqui utilizado, o termo "seleção positiva ou marcador de avaliação" refere-se a um marcador que, quando presente, por e- xemplo, expresso, ativado ou asimilar, resulta na identificação de uma célula, que compre- ende a característica, por exemplo, uma célula com o marcador de seleção positivo, daque- les sem a característica.

Seleção negativa ou marcador de avaliação: Quando aqui utilizado, o termo "sele- ção negativa ou marcador de avaliação" refere-se a um marcador que, quando presente, por exemplo, expresso, ativado, ou similar, permite a identificação de uma célula que não com- preende uma propriedade selecionada ou característica (por exemplo, quando comparada a uma célula que possui a propriedade ou característica).

Repórter: Quando aqui utilizado, o termo "repórter" refere-se a um componente que pode ser utilizado para identificar e/ou selecionar componentes alvos de um sistema de inte- resse. Por exemplo, um repórter pode incluir uma proteína, por exemplo, uma enzima, que confere sensibilidade ou resistência antibiótica (por exemplo, /Mactamase, cloranfenicol ace- tiltransferase (CAT), e similares), um marcador de avaliação fluorescente (por exemplo, pro- teína fluorescente verde (por exemplo, (GFP), YFP, EGFP, RFP, etc.), um marcador Iumi- nescente (por exemplo, uma proteína de vaga-lume luciferase), um marcador de avaliação com base em afinidade, ou genes marcadores selecionáveis positivos ou negativos tal como IacZ, β-gal/lacZ (β-galactosidase), ADH (álcool desidrogenase), his3, ura3, Ieu2, Iys2, ou similares.

Eucariota: Quando aqui utilizado, o termo "eucariota" refere-se a organismos que pertencem à Kingdom Eucarya. Eucariotas são geralmente distinguíveis a partir de procario- tas por sua organização tipicamente multicelular (porém não exclusivamente multicelular, por exemplo, levedura), a presença de um núcleo ligado por membrana e outras organelas ligadas por membrana, material genético linear (isto é, cromossomos lineares), a ausência de opérons, a presença de íntrons, capeamento de mensagem e poli-A mRNA, e outras ca- racterísticas bioquímicas, tal como uma estrutura ribossômica distintiva. Organismos eucari- óticos incluem, por exemplo, animais (por exemplo, mamíferos, insetos, répteis, pássaros, etc.), ciliados, plantas (por exemplo, monocotilédones, dicotilédones, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporídios,protistas, etc.

Procariota: Quando aqui utilizado, o termo "procariota" refere-se a organismos que pertencem ao Kingdom Monera (da mesma forma chamado Procarya). Organismos proca- rióticos são geralmente distinguíveis a partir de eucariotos por sua organização unicelular, reprodução assexual por brotamento ou fendimento, a falta de um núcleo ligado por mem- brana ou outras organelas ligadas por membrana, um cromossomo circular, a presença de opérons, a ausência de íntrons, capeamento de mensagem e poli-A mRNA, e outras carac- terísticas bioquímicas, tal como uma estrutura ribossômica distintiva. O Prokarya inclui su- breinos Eubacteria e Archaea (às vezes chamado "Archaebacteria"). Cyanobacteria (as al- gas verdes azuis) e micoplasma, embora historicamente considerado "bactérias", são às vezes determinados classificações separadas sob o Kingdom Monera.

Eubacteria: Quando aqui utilizado, os termos "eubacteria" e "bactérias" referem-se aos organismos procarióticos que são distinguíveis de Archaea. Semelhantemente, Archaea refere-se a procariotas que são distinguíveis de eubacteria. Eubacteria e Archaea podem ser distinguidos por critérios morfológicos e bioquímicos de número. Por exemplo, diferenças em seqüências de RNA ribossômicas, estrutura de RNA polimerase, a presença ou ausência de íntrons, sensibilidade antibiótica, a presença ou ausência de na peptidoglicanos de parede celular e outros componentes da parede celular, as estruturas ramificada versus não ramifi- cada de lipídeos de membrana, e a presença/ausência de histonas e proteínas semelhantes à histona são utilizadas para nomear um organismo em Eubacteria ou Archaea.

Exemplos de Eubacteria incluem Escherichia eoli, Thermus thermophiius, Bacillus subtilis e Bacillus stearothermophilus. Exemplo de Archaea incluem Methanococcus jannas- chii (Mj), Methanosarcina mazei (Mm), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mt), Metha- nococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Halobacterium such as Haloferax volcanii and Halobacterium species NRC-1, Archaeoglobus fulgidus (Aí), Pyrococcus furiosus (Pf), Pyro- coccus horikoshii (Ph), Pyrobaeulum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Aeuropyrum pernix (Ap), Thermoplasma acidophilum and Thermo- plasma volcanium.

Variante conservadora: Quando aqui utilizado, o termo "variante conservadora", no contexto de um componente de translação, refere-se a um componente de translação, por exemplo, uma variante conservadora O-tRNA ou uma variante conservadora O-RS, que fun- cionalmente desempenham similarmente a um componente base em que a variante conser- vadora é similar a, por exemplo, uma O-tRNA ou O-RS1 tendo variações na seqüência quando comparada a uma O-tRNA ou O-RS de referência. Por exemplo, uma O-RS, ou uma variante conservadora dessa O-RS, aminoacilará uma O-tRNA cognata com um aminoácido não natural, por exemplo, um aminoácido não natural da FIG. 1. Neste exemplo, o O-RS e a variante conservadora O-RS não têm as mesmas seqüências de aminoácido. A variante conservadora pode ter, por exemplo, uma variação, duas variações, três variações, quatro variações, ou cinco ou mais variações na seqüência, contanto que a variante conservadora seja ainda complementar às (por exemplo, funções com) O-tRNA ou O-RS correspondente cognata. Em algumas modalidades, uma variante conservadora O-RS compreende uma ou mais substituições de aminoácido conservadoras comparadas à O-RS da qual foi derivada. Em algumas modalidades, uma variante conservadora O-RS compreende uma ou mais substituições de aminoácido conservadoras comparada à O-RS a partir da qual foi derivada, e além disso, mantém atividade biológica de O-RS; por exemplo, uma variante conservadora O-RS que mantém pelo menos 10% da atividade biológica da molécula de O-RS de origem a partir da qual foi derivada, ou alternativamente, pelo menos 20%, pelo menos 30%, ou pelo menos 40%. Em algumas modalidades preferidas, a variante conservadora O-RS man- tém pelo menos 50% da atividade biológica da molécula de O-RS de origem a partir da qual foi derivada. As substituições de aminoácido conservadoras de uma variante conservadora O-RS podem ocorrer em qualquer domínio de O-RS1 incluindo a bolsa Iigadora de aminoáci- do.

Agente de seleção ou avaliação: Quando aqui utilizado, o termo "agente de seleção ou avaliação" se refere a um agente que, quando presente, permite a seleção/avaliação de certos componentes a partir de uma população. Por exemplo, um agente de seleção ou ava- liação pode ser, porém não está limitado a, por exemplo, um nutriente, um antibiótico, um comprimento de onda de luz, um anticorpo, um polinucleotídeo expresso, ou similares. O agente de seleção pode ser variado, por exemplo, por concentração, intensidade, etc.

Com respeito a: Quando aqui utilizado, o termo "com respeito a" refere-se ao pro- cesso no qual uma O-tRNA da invenção reconhece um códon seletor e media a incorpora- ção do aminoácido não natural que é acoplado ao tRNA na cadeia de polipeptídeo em de- senvolvimento.

Codificar: Quando aqui utilizado, o termo "codificar" refere-se a qualquer processo por meio do qual a informação em uma macromolécula polimérica ou série de seqüência é utilizada para direcionar a produção de uma segunda molécula ou série de seqüência que é diferente da primeira molécula ou série de seqüência. Quando aqui utilizado, o termo é am- plamente utilizado, e pode ter uma variedade de aplicações. Em alguns aspectos, o termo "codificar" descreve o processo de replicação de DNA semi-conservadora onde um filamento de uma molécula de DNa de filamento duplo é utilizado como um padrão para codificar um filamento irmã complementar recentemente sintetizada por um DNA polimerase dependente de D NA.

Em outro aspecto, o termo "codifica" refere-se a qualquer processo por meio do qual a informação em uma molécula é utilizada para direcionar a produção de uma segunda molécula que tem uma natureza química diferente da primeira molécula. Por exemplo, uma molécula de DNA pode codificar uma molécula de RNA (por exemplo, pelo processo de transcrição incorporando uma enzima RNA polimerase dependente de DNA). Da mesma forma, uma molécula de RNA pode codificar um polipeptídeo, como no processo de transia- ção. Quando utilizado para descrever o processo de translação, o termo "codificar" da mes- ma forma estende-se ao códon de tripleto que codifica um aminoácido. Em alguns aspectos, uma molécula de RNA pode codificar uma molécula de DNA1 por exemplo, pelo processo de transcrição reversa incorporando uma DNA polimerase dependente de RNA. Em outro as- pecto, uma molécula de DNA pode codificar um polipeptpídeo, onde é compreendido que "codificar" como utilizado neste caso incorpora tanto o processo de transcrição e translação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1 fornece as estruturas químicas e nomenclatura dos aminoácidos p- metoxifenilalanina não natural (pMpa), p-acetilfenilalanina (pApa), p-benzoilfenilalanina (pB- pa), p-iodofenilalanina (pipa), p-azidofenilalanina (pAzpa), p-propargiloxifenilalanina (pPpa), ácido α-aminocaprílico, o-nitrobenzilcisteína (o-NBC), 1,5-dansilalanina e o-nitrobenzilserina (o-NBS). A maioria destes aminoácidos não naturais foi variavelmente referido ao utilizar várias nomenclaturas alternativas, que são da mesma forma indicadas na figura.

FIG. 2 mostra uma análise de Western blot de expressão de GFP de tamanho natu- ral em células de CHO Invitrogen ™ T-REx™ utilizando pares de SstRNA^ e EcTyrRS ortogonais. As células foram co-transfectadas com plasmídeos pcDNA4-GFP37TAG, varian- te pcDNA4-EcTyrRS e pUC18-3SstRNA^ e crescidas na presença ou ausência de amino- ácidos não naturais. A primeira faixa é expressão de GFP tipo selvagem em células de CHO T-rex que foram transitoriamente transfectadas com pcDNA4-GFP. A segunda faixa é a ex- pressão de tamanho natural de GFP37TAG suprimida por EcTyrRS tipo selvagem juntamen- te com SstRNA^. As seguintes faixas são a expressão de tamanho natural de GFP37TAG suprimida por variantes de EcTyrRS juntamente com SstRNA^ na presença ou ausência de aminoácidos não naturais. pMpaRS representa pMpa-tRNA sintetase, etc. Uma alíquota de 40 μg de Iisado celular para cada reação (10 μg de Iisado celular foram carregados na primeira faixa) foi analisada com anticorpo anti-c-myc. As concentrações de aminoácidos não naturais para expressão de proteína foram 10 mM para pMpa, 10 mM para pApa, 1 mM para pBpa, 8 mM para pipa, 5 mM para pAzpa e 1 mM para pPpa.

FIG. 3 mostra uma análise de Western blot de expressão de GFP de tamanho natu- ral em células 293 de Invitrogen™ T-REx™ utilizando pares BstRNA^ e EeTyrRS ortogo- nais como descrito na FIG. 2. Uma alíquota de 20 μg de Iisado celular para cada reação (5 μg para a reação de controle) foi analisada com anticorpo anti-His-HRP. Os reagentes, con- centrações de aminoácidos não naturais e designações da faixa foram os mesmos como descrito na FIG. 2.

FIG. 4A fornece um mapa de plasmídeo de pSWAN-pMpaRS.

FIG. 4B fornece um mapa de plasmídeo de pSWAN-GFP37TAG.

FIG. 5 fornece a seqüência de aminoácido dos peptídeos GFP e GFP-pMpa tipo selvagem. Y* denota tirosina em GFP ou pMpa tipo selvagem em GFP-pMpa. Os íons tipo y e b gerados durante a fragmentação do peptídeo FSVSGEGEGDATY*GK (SEQ ID NO: 103) são mostrados.

FIG. 6 fornece espectros de MS tandem anotados do peptídeo de GFP FSVSGEGEGDATY*GK tipo selvagem (SEQ ID NO: 103) fornecido na FIG. 5. Para compa- ração e clareza, apenas as séries de íon Y* abundantes são anotadas bem como o íon de b13 que localiza pMpa não ambiquamente na posição 37. Proteínas foram purificadas por coluna de afinidade anti-myc e analisadas por SDS-PAGE. As faixas de GFP foram cortadas para a análise de MS.

FIG. 7 fornece espectros de MS tandem anotados do peptídeo FSVSGE- GEGDATY*GK (SEQ ID NO: 103) de GFP-pMpa. Espectros de MS tandem das séries de íon Y* exibem a troca de massa esperada de 14 Da.

FIG. 8 fornece um espectro de ESI TOF-MS de proteína intacta de GFP-pMpa puri- ficada por afinidade. O envelope de estado de carga desconvoluto (mostrado na inserção da figura) mostra um componente principal de 29696 Da1 que compara a massa esperada da proteína modificada menos a metionina N-terminal e mais acetilação (massa teórica 29696.52) dentro do erro experimental. O aspecto menor em 29654 Da é nomeado para GFP-pMpa menos a metionina N-terminal. As duas faixas laterais são prováveis devido à modificação não específica.

FIG. 9 fornece espectros de MS tandem de GFP mutante que contém pApa. Os í- ons Y* exibem uma mudança de massa de 26 Da com respeito aos mesmos íons no espec- tro de GFP tipo selvagem.

FIG. 10 fornece um espectro de MS tandem de GFP mutante que contém pBpa. A mudança de massa característica de 86 Da entre GFP mutante e GFP tipo selvagem é ob- servada claramente.

FIG. 11 fornece um espectro de MS tandem de GFP mutante que contém pAzpa. A maioria de pAzpa declina em pampa (p-aminofenilalanina; veja FIG. 15 para espectros de MS tandem de fragmento contendo pAmpa tríptico). Porém, a mudança de massa caracte- rística de 25 Da de íons Y* em comparação aos sinais de GFP tipo selvagem ainda é obser- vada claramente.

FIG. 12 fornece um espectro de MS tandem de GFP mutante que contém pPpa. Os sinais do fragmento de pPpa são largamente submersos através da base. Apesar disto, é ainda identificado com boa discriminação através da base de dados do espectro contra MSDB. Os íons Y* mais fortes são observados com uma mudança de massa característica de 38 Da.

FIGS. 13A e 13B illustratam que a supressão ambarina é dependente tantos dos genes EcTyrRS e BstRNA^ em ambas células de CHO Invitrogen™ T-REx™ e 293 Invi- trogen™ T-REx™. FIG. 13A fornece painéis com imagens de fluorescência verde de células de CHO Invitrogen™ T-Rex™ transitoriamente transfectadas com construções diferentes. No primeiro painel, as células foram transfectadas com pcDNA4-GFP. No segundo painel, as células foram transfectadas com pcDNA4-EcTyrRS e pcDNA4-GFP37TAG. No terceiro pai- nel, as células foram transfectadas com pUC18-3SstRNA^ e pcDNA4-GFP37TAG. No

quarto painel, as células foram transfectadas com pUC18-3SstRNA^ , pcDNA4-EcTyrRS e

pcDNA4-GFP37TAG. FIG. 13B fornece painéis com imagens de fluorescência verdes de células 293 Invitrogen™ T-Rex™ transitoriamente transfectadas com construções diferentes. As construções utilizadas nos vários painéis foram idênticas àqueles mostrados na FIG. 13A.

FIG. 14 fornece uma análise de Western blot de expressão de seis variantes de EcTyrRS em células de CHO e 293 Invitrogen™ T-Rex™. Uma alíquota de 40 μg do Iisado celular para cada reação foi analisada com anticorpo anti-c-myc. A expressão de variantes de EcTyrRS não é afetada pelas mutações de sítio ativo. As variantes expressam igualmen- te em ambas linhagens de célula de CHO e 293 T-Rex™ e T-Rex™.

FIG. 15 fornece espectros de MS tandem anotados do peptídeo FSVSGE- GEGDATY*GK (SEQ ID NO: 103) de GFP mutante que contém pAzpa. Y* denota pAmpa (p- aminofenilalanina). Apenas para clareza, a série de íon Y* é anotada. A maioria do pAzpa declinouOse em pAmpa quando a resistência de sinal para o peptídeo pAzpa é bastante fra- ca (veja FIG. 11) e a diferença da massa de 1 Da de massa detectável entre os fragmentos de GFP tipo selvagem e aqueles de GFP mutante que contém pAzpa.

FIG. 16 fornece seqüências de nucleotídeo e aminoácido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma metodologia geral que permite a avaliação rápida e isolamento de enzimas aminoacil-tRNA sintetase mutantes (RS) que têm a capacidade de carregar um tRNA supressor ortogonal adequado com aminoácidos não naturais com pro- priedades biológicas e fisicoquímicas diversas em sistemas hospedeiros de célula mamífera, e também, onde o método de avaliação anula a necessidade de avaliação tecnicamente desafiadora e lenta em células mamíferas. Nestes métodos, aminoacil-tRNA sintetases (RS) de Escherichia coli (E. coli) mutantes são desenvolvidas em levedura para seletivamente utilizar o aminoácido não natural de interesse. A mesma RS mutante junto com um tRNA supressor ambarino a partir de Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus) é em seguida utilizada para sítio-especificamente incorporar o aminoácido não natural na proteína de interesse em células mamíferas com respeito a um códon seletor (por exemplo, um có- don sem sentido ambarino). A incorporação do aminoácido não natural na proteína é pro- gramada para ocorrer em qualquer posição desejada criando-se o polinucleotídeo que codi- fica a proteína de interesse para conter o códon seletor que sinaliza a incorporação do ami- noácido não natural.

A presente invenção da mesma forma fornece novos sistemas de translação, onde os sistemas compreendem células hospedeiras que não foram consideradas até aqui. Por exemplo, um sistema de translação da invenção inclui (i) um aminoácido não natural, (ii) um tRNA ortogonal (O-tRNA), (iii) uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) derivada de uma aminoacil-tRNA sintetase eubacteriana, tipicamente uma RS de E. coli, e (iv) uma célu- la hospedeira de mamífero que contém estes componentes onde a célula hospedeira de mamífero pode ser uma célula de roedor (por exemplo, uma célula de camundongo ou uma célula de rato), ou uma célula de primata, isto é, qualquer célula que pertence a quaisquer dos grupos geralmente chamados símios (incluindo macacos, humanos e macacos de Old World), macacos de New World e pró-símios (por exemplo, lêmures). Células humanas en- contram uso particular com a invenção. Porém, não é pretendido que a invenção seja limita- da às células hospedeiras listadas acima, visto que outras células hospedeiros da mesma forma encontram uso com a invenção.

A invenção da mesma forma fornece métodos para produzir uma proteína que tem pelo menos um aminoácido não natural em uma posição selecionada, onde os métodos uti- lizam os sistemas de translação descritos acima. Os métodos resultam na incorporação do aminoácido não natural programando-se a incorporação do aminoácido não natural no sítio de um códon seletor durante a translação de proteína.

A invenção fornece uma abordagem geral em que RSs mutante (originalmente de- senvolvidas em S. cerevisiae) junto com um supressor ambarino a partir de uma eubactéria adequada, por exemplo, B. stearothermophilus, são uutilizadas para incorporar uma ampla variedade de aminoácidos não naturais em proteínas em células hospedeiras de mamífero, tais como células de roedor e células de primata. Como uma prova do princípio, esta meto- dologia foi bem-sucedidamente empregada para sítio especificamente incorporar um total de dez aminoácidos não naturais diferentes em proteínas modelo em resposta aos códons sem sentido ambarinos com fidelidade excelente e eficiências boas em células hospdeiras de ovário de chinês (CHO) e 293T humanas. Por exemplo, aminoácidos não naturais foram independentemente incorporados em proteína fluorescente verde (GFP) expressa em célu- las de CHO com eficiências até 1 μg de proteína por 2 x 10^7 de células. Espectrometria de massa confirmaram uma fidelidade translacional alta para o aminoácido não natural. Esta metodologia deveria facilitar a introdução de sondas biológicas em proteínas para estudos celulares e pode finalmente facilitar a síntese de proteínas terapêuticas que contêm aminoá- cidos não naturais em células mamíferas.

Em alguns aspectos, para demonstrar (porém não limitar) a presente invenção, a descrição aqui demonstra que a porção de aminoácido não natural pode ser incorporada em várias proteínas modelo em células hospedeiras de mamífero. Não é pretendido que a in- corporação do aminoácido não natural seja limitada a qualquer proteína particular de inte- resse. A partir da presente descrição, ficará claro que a incorporação dos vários aminoáci- dos não naturais em proteínas particulares de interesse é vantajosa para uma ampla varie- dade de proteínas e para uma ampla variedade de propósitos.

É notado que os genes que controlam a expressão das aminoacil-tRNA sintetases de E. coli mutantes (O-RSs) que são desenvolvidas em levedura e a O-tRNA não pode ser utilizada imediatamente em células hospedeiras de mamífero (por exemplo, células de roe- dor ou humanas). Estes genes devem ser recriados com elementos reguladores adequados para direcionar sua expressão na base da célula mamífera. Os elementos reguladores de transcrição de levedura originalmente associados com os genes de O-tRNA e O-RS seriam ineficazes (ou melhor não ideais) para uso nas células mamíferas. Alguém de experiência na técnica reconhece este ponto. Elementos de expressão de gene de célula mamífera são bem caracterizados e facilmente disponíveis para uso em construções recombinantes com a finalidade de otimizar (por exemplo, maximizar) as seqüência de gene com as quais elas estão associadas.

AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS QUE ENCONTRAM USO COM A INVENÇÃO A invenção fornece sistemas de translação ortogonais que têm a capacidade de produzir polipeptídeos que compreendem aminoácidos não naturais em sistemas de célula hospedeira de mamífero, por exemplo, sistemas de célula hospdeira de primata e roedor. Os aminoácidos não naturais que são empregados nestes sistemas de translação não são par- ticularmente limitados. Geralmente, os aminoácidos não naturais que encontram uso com a invenção são aqueles que podem ser utilizados por uma aminoacil-tRNA sintetase mutante derivada de E. coli para carregar um tRNA ortogonal correspondente em um sistema de cé- lula hospedeira de levedura de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Por exemplo, co- mo utilizado aqui, os seguintes aminoácidos não naturais encontram uso com a invenção:

p-metoxifenilalanina (pMpa);

p-acetilfenilalanina (pApa);

p-benzoilfenilalanina (pBpa);

p-iodofenilalanina (pipa);

p-azidofenilalanina (pAzpa);

p-propargiloxifenilalanina (pPpa);

As estruturas de cada destes seis aminoácidos não naturais são mostradas na FIG. 1. Estes aminoácidos podem da mesma forma ser conhecidos por nomenclaturas alternati- vas e várias abreviações, que são da mesma forma mostradas na FIG. 1. Como mostrado nos Exemplos, estes seis aminoácidos não naturais foram independentemente incorporados em proteína fluorescente verde (GFP) em células hospdeiras humanas e de roedores que utilizam espécies de O-RS derivadas de E. coli que foram originalmente avaliadas e isoladas utilizando sistemas de célula hospdeira de levedura.

Além daqueles listados acima, ainda outros aminoácidos não naturais encontram uso com a invenção. Os aminoácidos não naturais listados abaixo foram previamente utili- zados bem-sucedidamente através de RS's ortogonais derivadas de E. coli para carregar uma O-tRNA em sistemas de célula hospedeira de levedura. Estes aminoácidos não natu- rais incluem:

ácido σ-aminocaprílico

o-nitrobenzilcisteína (o-NBC)

1,5-dansilalanina

o-nitrobenzilserina (o-NBS)

As estruturas destes aminoácidos não naturais e suas várias nomenclaturas alter- nativas e abreviações na FIG. 1 são mostradas.

O uso bem-sucedido de todos estes aminoácidos não naturais são descritos em cé- lulas hospedeiros de levedura, por exemplo, em Chin e outro, (2003), "An expanded eukar- yotic genetic code," Science 301:964-967; Deiters e outro, (2003), "Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae," J Am Chem Soc 125:11782-11783; Summerer e outro, (2006), "A Genetically Encoded Fluorescent Amino Acid," PNAS 103(26):9785-9789; WO 2005/003294 por Deiters e outro, "UNNATURAL RE- ACTIVE AMINO ACID GENETIC CODE ADDITIONS," filed April 16, 2004; WO 2006/034410 por Deiters e outro, "ADDING PHOTOREGULATED AMINO ACIDS TO THE GENETIC CO- DE," depositado em 21 de Setembro de 2005; e WO 2006/110182, depositado em 27 de outubro de 2005, intitulado "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS."

CÉLULAS HOSPEDEIRAS QUE ENCONTRAM USO COM A INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos sistemas de translação, onde os sistemas utili- zam células hospedeiras que não foram consideradas até aqui. Por exemplo, um sistema de translação da invenção inclui (i) um aminoácido não natural, (ii) um tRNA ortogonal (O- tRNA), (iii) uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) derivada a partir de uma amino- acil-tRNA sintetase de E. coli, e (iv) uma célula hospedeira de mamífero que contém estes componentes, onde a célula hospedeira de mamífero pode ser uma célula de roedor (por exemplo, uma célula de camundongo ou uma célula de rato), ou uma célula de primata, isto é, qualquer célula que pertence a quaisquer dos grupos geralmente chamados símios (inclu- indo macacos, humanos e macacos de Old World), macacos de New World e pró—símios (por exemplo, lêmures). Células humanas encontram uso particular com a invenção. As linhagens de célula animal que encontram uso com a invenção podem ser derivadas de qualquer tecido do animal. Não é pretendido que a invenção seja limitada às células hospe- deiras listadas acima, visto que outras células hospedeiras da mesma forma encontram uso com a invenção.

Quando aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" da mesma forma inclui uma plu- ralidade de células individuais, geralmente referidas como uma "linhagem celular", e neste caso, uma "linhagem de célula hospedeira".

As células hospedeiras utilizadas para a produção de polipeptídeos que contém pe- lo menos um aminoácido não natural podem ser qualquer tipo de célula hospedeira, porém algumas células hospedeiros encontram uso particular. Por exemplo, alguns tipos de célula hospedeira podem ser utilizados para produzir polipeptídeos que encontram uso na produ- ção de polipeptídeos terapêuticos recombinantes.

Quando a célula hospedeira é uma célula de roedor, o tipo de célula de roedor não está particularmente limitada. Como descrito nos Exemplos, células de ovário de hamster chinês (CHO) podem ser utilizadas como células hospedeiras. Células de CHO são ampla- mente adaptadas e são um sistema bem estabelecido para a expressão de proteínas re- combinantes. Porém, não é pretendido que a invenção seja limitada a este tipo de célula de roedor. Realmente, alguém de experiência na arte conhece uma vasta ordem de linhagens de células de roedor que podem ser utilizadas como células hospedeiras para a produção de proteína recombinante.

Linhagens de célula de roedor incluem qualquer linhagem celular derivada da or- dem de mamífero Rodentia, e incluem, porém não limitadas a, camundongos verdadeiros, ratos, hamsters, chipmunks, castores e esquilos. Linhagens de célula de roedor incluem linhagens celulares derivadas do camundongo de casa comum, Mus musculus, e qualquer e todas as cepas destes. Semelhantemente, linhagens celulares de roedor incluem linhagens celulares derivadas de rato, por exemplo, quaisquer espécies do gênero Rattus, tal como Rattus norvegicus (rato Norwegian) e Rattus rattus (o rato preto), e qualquer e todas as cepas destes.

A célula hospedeira da invenção pode ser uma célula de primata. O tipo de célula de primata não está particularmente limitada. Como descrito nos Exemplos, células de rim embriônicas humanas (da mesma forma conhecidas como células HEK, HEK 293 ou apenas 293) podem ser utilizadas como células hospedeiras. Células 293 são amplamente adapta- das e são um sistema bem estabelecido para a expressão de proteínas recombinantes. En- tretanto, não é pretendido que a invenção seja limitada a este tipo de célula humana. Real- mente, alguém de experiência na arte sabe conhece uma vasta ordem de linhagens celula- res de humano e outras de primata que podem ser utilizadas como células hospedeiras para a produção de proteína recombinante.

Linhagens de célula de primata incluem qualquer linhagem celular derivada da or- dem de mamífero Primate, e incluem, porém não limitadas a (i) símios, que incluem maca- cos de Old World apes, incluindo humanos), (ii) macacos de New World e (iii) prosimians (por exemplo, lêmures). A linhagem de célula de primata pode ser derivada de qualquer es- pécie de primata. Por exemplo, porém não limitadas, as linhagens de célula de primata po- dem ser derivadas de chimpanzés, babuínos, sagüis, macacos, e macacos verdes africanos (por exemplo, a linhagem celular COS-1).

A tabela abaixo fornece uma lista não exaustiva de espécies de primata a partir das quais as linhagens celulares derivadas encontram uso com a invenção.

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Linhagens celulares derivadas destas espécies de primata podem ser encontradas, por exemplo, nos Websites para a Research Infrastructure to Promote Primate Molecular Biology (INPRIMAT; Barcelona, Spain) e o Biomedical Primate Research Centre (BPRC; Rijswijk, The Netherlands).

O uso de linhagens celulares humanas para a produção de polipeptídeos recombi- nantes está bem estabelecido e dentro do escopo da presente invenção. As linhagens de célula hospedeira de humano podem ser de qualquer fonte, e podem ser derivadas de qual- quer tecido. Linhagens celulares humanas adequadas para a produção de proteínas recom- binantes são amplamente conhecidos, e estão disponíveis de um grande número de fontes comerciais e privadas bem conhecidas por alguém de experiência na arte.

Além disso, linhagens de célula hospedeira derivadas de outras espécies de mamí- fero diversas estão da mesma forma dentro do escopo da invenção. Estas incluem linhagens celulares de bovino (gado), porcino (suínos), ovino (ovelha), canino (cachorro), eqüino (ca- valo) e caprino (cabra). Linhagens celulares derivadas destas espécies são conhecidas na técnica, e são facilmente disponíveis por alguém de experiência comum na arte.

Linhagens de célula de roedor, linhagens de célula de primata, e numerosas outras linhagens celulares de outros grupos de mamífero, e materiais e métodos para a cultura des- ta linhagem de célula animal, são bem estabelecidas na técnica, e estão amplamente dispo- níveis de várias fontes. Por exemplo, veja a American Type Culture Collection (ATCC; Ma- nassas, VA) para listagens extensas de linhagens celulares disponíveis. Meios de cultura de célula estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, meios de cultura celular de marca registrada GIBCO® (Invitrogen.) e meios de cultura de Mediatech, Inc. por Cellgro®. Além disso, o estabelecimento de novo de novas linhagens celulares (linhagens celulares primárias ou linhagens celulares estabelecidas) da mesma forma encontram uso com a invenção como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes que têm pelo menos um aminoácido não natural.

ESPÉCIES DE O-RS QUE ENCONTRAM USO COM A INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos sistemas de translação ortogonais onde os sis- temas têm a capacidade de produzir polipeptídeos que compreendem aminoácidos não na- turais em células hospedeiras de mamífero que não foram previamente consideradas, por exemplo, sistemas de célula hospdeira de primata e roedor. Um sistema de translação da invenção inclui (i) um aminoácido não natural, (ii) um tRNA ortogonal (O-tRNA), (iii) uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) derivada de uma aminoacil-tRNA sintetase de E. coli, e (iv) uma célula hospedeira de mamífero que contém estes componentes, onde a célu- la hospedeira de mamífero pode ser, por exemplo, uma célula de roedor (por exemplo, uma célula camundongo ou uma célula de rato), ou uma célula de primata, (por exemplo, uma célula de humano ou uma célula de camundongo). A invenção da mesma forma fornece métodos para produzir uma proteína que tem pelo menos um aminoácido não natural em uma posição selecionada onde os métodos utilizam os sistemas de translação descritos a- cima. Os métodos resultam na incorporação do aminoácido não natural na célula hospedeira de mamífero programando-se a incorporação do aminoácido não natural em um códon sele- tor durante a translação da proteína.

As espécies de O-RS que encontram uso com a invenção não são particularmente limitadas, porém geralmente têm as seguintes propriedades. Uma O-RS que encontra uso com a invenção é geralmente derivada de uma aminoacil-tRNA sintetase de E. coli, tal como uma leucil-tRNA sintetase de E. coli tipo selvagem (Ec LeuRS; seqüência de aminoácido fornecida em SEQ ID NO: 4, e seqüência de polinucleotídeo fornecida em SEQ ID NO: 5) ou uma tirosil-tRNA sintetase de E. coli tipo selvagem (Ec TyrRS; seqüência de aminoácido fornecida em SEQ ID NO: 6, e seqüência de polinucleotídeo fornecida em SEQ ID NO: 7).

As espécies de O-RS mutante que encontram uso com a invenção (por exemplo, sintetases derivadas de SEQ ID NOS: 4 ou 6) são originalmente desenvolvidas e selecionadas em um sistema de célula hospedeira de levedura de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).

Um grande número de tais espécies de O-RS que encontram uso com a invenção é conhecido na arte. Em S. cerevisiae, pares de tRNACUA/RS funcionais foram derivados bem- sucedidamente dos pares de tRNATyr/TyrRS e tRNALeu/leucil-tRNA sintetase de E. coli cor- respondentes. Veja, por exemplo, Chin e outro, "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301, 964-967 (2003); Chin e outro, "Progress Toward an Expanded Eukaryotic Ge- netic Code," Chem Biol 10, 511-519 (2003); Deiters e outro, (2003), "Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae," J Am Chem Soc 125:11782-11783; Summerer e outro, (2006), "A Genetically Encoded Fluorescent Amino Acid," PNAS 103(26):9785-9789; e Wu e outro, "A Genetically Encoded Photocaged Amino Acid," JAm Chem Soc 126, 14306-14307 (2004)). Veja da mesma forma WO 2005/003294 por Deiters e outro, "UNNATURAL REACTIVE AMINO ACID GENETIC CODE ADDITIONS," depositado em 16 de Abril de 2004; WO 2006/034410 por Deiters e outro, "ADDING PHOTOREGULATED AMINO ACIDS TO THE GENETIC CODE," depositado em 21 de Se- tembro de 2005; e WO 2006/110182, depositado em 27 de Outubro de 2005, intitulado "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS." Cada uma destas referências está incorporado através de referência em sua totalidade. Este ensinamento na arte da mesma forma fornece orientação suficiente para a construção de espécies de O-RS adicionais que encontram uso com a in- venção.

Exemplos de espécies de O-RS que encontram uso com a invenção são fornecidos na FIG. 16. Seqüências de polinucleotídeo que codificam as O-RSs são fornecidas em SEQ ID NOS: 8-56. As seqüências de polipeptídeo de O-RS correspondentes são fornecidas em SEQ ID NOS: 57-101. É notável que uma O-RS de comprimento total não necessariamente é requerido para RS ser operativo na invenção. Expressão de apenas um fragmento sítio ativo de RS pode ser suficiente para uso com a invenção, como mostrado em algumas das seqüências na FIG. 16. Cada uma das seqüências de O-RS na FIG. 16 é conhecida na téc- nica, como descrito nas referências citadas aqui.

Não é pretendido que a invenção seja limitada ao uso do O-RS fornecido na FIG. 16. Qualquer espécie de O-RS identificada aqui que encontra uso com a invenção pode ser- vir como um modelo para a derivação ainda é outras espécies de O-RS que podem ser utili- zadas com a invenção, por exemplo, fazendo-se substituições de aminoácido conservadoras dentro das espécies de O-RS existentes. O número de substituições que são permitidas não está limitado, com a condição que o O-RS recentemente derivado mantenha atividade bioló- gica para preferencialmente aminoacilar o O-tRNA correspondente com o aminoácido não natural.

A atividade biológica de uma O-RS pode ser expressa como uma porcentagem da atividade biológica de outra O-RS de "referência" que é mostra ser de uso com a invenção. Por exemplo, uma O-RS que encontra uso com a invenção pode incluir uma O-RS que pre- ferivelmente aminoacila um O-tRNA com um aminoácido não natural com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de translação "referência" com- preendendo o O-tRNA, o aminoácido não natural e uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) da seqüência conhecida. A seleção da atividade limiar é arbitrária e o valor de "50%" serve a- penas apenas como um exemplo. Realmente, uma O-RS encontra uso com a invenção pode incluir uma O-RS que preferivelmente aminoacila um O-tRNA com um aminoácido não natu- ral com uma eficiência que é pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% da eficiência observada para um sistema de translação "referência".

ESPÉCIES DE O-TRNA QUE ENCONTRAM USO COM A INVENÇÃO

As espécies de O-RS mutantes que encontram uso com a invenção estão original- mente envolvidas e selecionadas em um sistema de célula hospedeira de levedura. As es- pécies de O-RS que são evoluídas na função de sistema de célula hospedeira de levedura juntamente com um O-tRNA adequado que é preferencialmente aminoacilado pelo O-RS com o aminoácido não natural. Por exemplo, espécies de O-tRNA supressoras que funcio- nam no sistema de hospedeiro de levedura podem ser, por exemplo, o tRNA de SEQ ID NOS: 1 ou 2.

Em comparação, os sistemas de translação da presente invenção usam um O- tRNA diferente que é ortogonal em uma célula hospedeira mamífera (tal como uma célula de roedor ou uma célula de primata). Por exemplo, um O-tRNA encontrando uso com a inven- ção pode ser o tirosil-tRNACuA supressor ambarino de Bacillus stearothermophilus (Bs- tRNATyrCUA), como fornecido em SEQ ID NO: 3. Não é pretendido que a invenção seja limitada a esta espécies de tRNA, como variantes desta seqüência de tRNA, outro derivado de tRNAs de Bacillus stearothermophilus, bem como espécies de tRNA derivadas de outros organismos (por exemplo, espécies eubacterial exteriores) são da mesma forma considera- dos.

TECNOLOGIA DE TRNA/AMINOACIL-TRNA ORTOGONAL SINTETASE

Um entendimento das novas composições e métodos da presente invenção requer um entendimento das atividades associadas com pares de tRNA ortogonal e aminoacil-tRNA sintetase ortogonal. Para adicionar aminoácidos não naturais adicionais ao código genético, novos pares ortogonais compreendendo uma aminoacil-tRNA sintetase e um tRNA adequa- do são necessários que podem funcionar eficazmente na maquinaria translacional hospedei- ra, porém que são "ortogonais" ao sistema de translação em questão, significando que fun- ciona independentemente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema de translação. Características desejadas do par ortogonal incluem tRNA que decodifica ou reconhece ape- nas um códon específico, por exemplo, um códon seletor, que não é descodificado por qual- quer tRNA endógeno, e aminoacil-tRNA sintetases que preferencialmente aminoacila (ou "muda") seu tRNA cognato com apenas um aminoácido não natural específico. O O-tRNA não é da mesma forma tipicamente aminoacilado (ou é pobremente aminoacilado, isto é, carregado) através de sintetases endógenas. Por exemplo, em um sistema hospedeiro E coli, um par ortogonal incluirá uma aminoacil-tRNA sintetase que não reagem cruzado com qualquer do tRNA endógeno, por exemplo, que há 40 em E. coli, e um tRNA ortogonal que não é aminoacilado por quaisquer das sintetases endógenas, por exemplo, das quais há 21 em E coli.

Os princípios gerais de sistemas de translação ortogonais que são adequados para preparar proteínas que compreendem um ou aminoácido mais não natural são conhecidos na técnica, como são os métodos gerais para produzir sistemas de translação ortogonais. Por exemplo, veja Números de Publicação Internacional WO 2002/086075, MÉTODOS no- meado "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2002/085923, nomeado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, nomeado "EX- PANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, depositado em 7 de julho de 2004; WO 2005/007870, depositado em 7 de julho de 2004; WO 2005/007624, de- positado em 7 de julho de 2004; Pedido Internacional No. PCT/US2005/039210, depositado em 27 de outubro de 2005, nomeado ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" e Pedido Provisio- nal U.S. de No. Serial 60/783,497, nomeado "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF OR- THOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS," depositado em 17 de março de 2006. Cada um destes pedidos está incorporado aqui através de refe- rência em sua totalidade. Para discussão de sistemas de translação ortogonais que incorpo- ram aminoácidos não naturais, e métodos para sua produção e uso, veja da mesma forma, Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005), Xie e Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36(3):227-238 (2005); Xie e Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554 (2005); e Wang e outro, "Expanding the Genetic Code," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 35:225-249 (2006); os teores dos quais estão cada qual incorporado através de referência em sua totalidade.

Sistemas de Translacão Ortoaonais

Sistemas translação ortogonais geralmente compreendem células (que podem ser células mamíferas tais como células de roedor ou células de primata) que incluem um tRNA ortogonal (O-tRNA), uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS), e um aminoácido não natural onde o O-RS aminoacila o O-tRNA com o aminoácido não natural. Um par ortogonal da invenção pode incluir um O-tRNA, por exemplo, um tRNA supressor, um tRNA de de fase de leitura, ou similar, e uma O-RS cognato. Os sistemas ortogonais da invenção podem tipi- camente compreender pares de O-tRNA/O-RS, ou no contexto de uma célula hospedeira ou sem a célula hospedeira. Além de sistemas multi-componente, a invenção da mesma forma fornece componentes individuais, por exemplo, polipeptídeos de aminoacil-tRNA sintetase ortogonais (por exemplo, SEQ ID NOs: 57-101), e os polinucleotídeos que codificam aqueles polipeptídeos (por exemplo, SEQ ID NOs: 8-56).

Em geral, quando um par ortogonal reconhecer um códon seletor e cargas um ami- noácido em resposta ao códon seletor, o par ortogonal é referido para "suprimir" o códon seletor. Isto é, um códon seletor que não é reconhecido pelos sistemas de translação (por exemplo, as células) maquinaria endógena não é ordinariamente carregada, que resulta em bloqueio de produção de um polipeptídeo que deveria de outra maneira ser transladado a partir do ácido nucléico. Em um sistema de par ortogonal, o O-RS aminoacila o O-tRNA com um aminoácido não natural específico. O O-tRNA carregado reconhece o códon seletor e suprime o bloqueio translacional causado pelo códon seletor.

Em alguns aspectos, um O-tRNA da invenção reconhece um códon seletor e inclui pelo menos cerca de, por exemplo, a 45%, a 50%, a 60%, a 75%, a 80%, ou 90% ou mais eficiência de supressão na presença de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor quando comparada à eficiência de supressão de um O-tRNA compreendendo ou codificado por uma seqüência de polinucleotídeo como mencionado na listagem de seqüên- cia aqui.

Em algumas modalidades, a eficiência de supressão do O-RS e o O-tRNA junto é cerca de, por exemplo, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, ou 25 vezes ou maior do que a eficiência de supressão do O-tRNA faltando o O-RS. Em algum aspecto, a eficiência de supressão do O-RS e do O-tRNA juntos é pelo menos cerca de, por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 80%, ou 90% ou mais da eficiência de supressão de um par de sinte- tase ortogonal como mencionado nas listagens de seqüência aqui.

A célula hospedeira usa o par de O-tRNA / O-RS para incorporar o aminoácido não natural em uma cadeia de polipeptídeo crescente, por exemplo, por meio de um ácido nu- cléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA. Em certos aspectos preferidos, a célula pode incluir um ou mais pares de O-tRNA / O-RS adicionais, onde o O-tRNA é carregado pelo O-RS adicional com um aminoácido não natural diferente.

Por exemplo, um dos O-tRNAs pode reconhecer um códon de quatro bases e o outro O- tRNA pode reconhecer um códon interrompido. Alternadamente, códons interrompidos dife- rentes múltiplos ou códons de quatro bases diferentes múltiplos podem ser utilizados no mesmo ácido nucléico de codificação.

Como notado, em algumas modalidades, existe pares de O-tRNA/O-RS múltiplos em uma célula ou outro sistema de translação, que permite incorporação de mais do que um aminoácido não natural em um polipeptídeo. Por exemplo, a célula pode também incluir um par de O-tRNA/O-RS diferente adicional e um segundo aminoácido não natural, onde este O-tRNA adicional reconhece um segundo códon seletor e este O-RS adicional preferencial- mente aminoacila o O-tRNA com o segundo aminoácido não natural. Por exemplo, uma cé- lula que inclui um par de O-tRNA/O-RS (onde o O-tRNA reconhece, por exemplo, um códon seletor ambarino), pode também compreender um segundo par ortogonal, onde o segundo O-tRNA reconhece um códon seletor diferente, por exemplo, um códon opala, um códon de quatro bases , ou similar. Desejavelmente, os pares ortogonais diferentes são derivados de fontes diferentes, que podem facilitar reconhecimento de códons seletores diferentes.

Em certas modalidades, sistemas compreendem uma célula tal como uma célula de mamífero, incluindo porém não limitada a células de roedor e primata, que incluem um tRNA ortogonal (O-tRNA), uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS), um aminoácido não natural e um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende o códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA. O sistema de translação pode da mesma forma ser um sistema livre de célula, por exemplo, qualquer de uma variedade de sistemas de transcrição/translação "in vitro" comercialmente disponível em combinação com um par de O-tRNA/O-RS e um aminoácido não natural como descrito aqui.

O O-tRNA e/ou o O-RS pode ser de ocorrência natural ou pode ser, por exemplo, derivado por mutação de um tRNA e/ou RS de ocorrência natural, por exemplo, gerando-se bibliotecas de tRNAs e/ou bibliotecas de RSs, a partir de qualquer de uma variedade de or- ganismos e/ou utilizando-se qualquer de uma variedade de estratégias de mutação disponí- veis. Por exemplo, uma estratégia para produzir um tRNA ortogonal / par de de aminoacil- tRNA sintetase envolve importar um par de tRNA/sintetase heterólogo (para a célula hospe- deira) a partir de, por exemplo, uma fonte diferente da célula hospedeira, ou fontes múlti- plas, na célula hospedeira. As propriedades do candidato de sintetase heteróloga incluem, por exemplo, isto é não carrega qualquer tRNA de célula hospedeira, e as propriedades dos candidatos de tRNA heterólogo incluem, por exemplo, que não é aminoacilado por qualquer sintetase de célula hospedeira. Além disso, o tRNA heterólogo é ortogonal a todas as sinte- tases de célula hospedeira. Uma segunda estratégia para gerar um par ortogonal envolve gerar bibliotecas mutantes a partir de qual avaliar e/ou selecionar um O-tRNA ou O-RS. Es- tas estratégias podem da mesma forma ser combinadas.

tRNA Ortogonal (O-tRNA)

Um tRNA ortogonal (O-tRNA) da invenção desejavelmente media incorporação de um aminoácido não natural em uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA, por exemplo, in vivo ou in vitro. Em certas modalidades, um O-tRNA da invenção inclui pelo menos cerca de, por e- xemplo, uma eficiência de supressão de 45%, uma de 50%, uma de 60%, uma de 75%, uma de 80%, ou uma de 90% ou mais na presença de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor quando comparado a um O-tRNA compreendendo ou codificado por uma se- qüência de polinucleotídeo como mencionado nas seqüências de O-tRNA nas listagens de seqüência aqui.

Eficiência de supressão pode ser determinada por quaisquer de vários ensaios co- nhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de /?-galactosidase repórter pode ser utilizado, por exemplo, um plasmídeo de IacZ derivatizado (onde a construção tem um códon seletor na seqüência de ácido nucléico) é introduzido em células a partir de um organismo apropri- ado (por exemplo, um organismo onde os componentes ortogonais podem ser utilizados) juntamente com plasmídeo compreendendo um O-tRNA da invenção. Uma sintetase cogna- ta pode da mesma forma ser introduzido (como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a sintetase cognata quando expressa). As células são cultivadas em meio em uma densidade desejada, por exemplo, em uma OD6oo de cerca de 0,5, e ensaios de β- galactosidase são realizados, por exemplo, utilizando o Kit de Ensaio BetaFluor™ Galactosi- dase (Novagen). Supressão percentual pode ser calculada como a porcentagem de ativida- de para uma amostra relativa a um controle comparável, por exemplo, o valor observado a partir da construção de IacZ derivatizada, onde a construção tem um códon de em posição desejada diferente de um códon seletor.

Exemplos de O-tRNAs encontram uso com a invenção são mencionados na se- quência listada aqui, por exemplo, veja FIG. 16 e SEQ ID NO: 3. A descrição aqui da mesma forma fornece orientação para o desígnio de espécies de O-tRNA equivalentes adicionais. Em uma molécula de RNA, tal como uma O-RS mRNA, ou molécula de O-tRNA, Timina (T) é substituída com Uracila (U) relativo a uma determinada seqüência (ou vice-versa para um DNA de codificação), ou complemento deste. Modificações adicionais para as bases podem da mesma forma estar presentes para gerar moléculas largamente funcionalmente equiva- lentes.

A invenção da mesma forma abrange variações conservadoras de O-tRNAs corres- pondendo a O-tRNAs particulares destes. Por exemplo, variações conservadoras de O-tRNA incluem aqueles moléculas que funcionam como os O-tRNAs particulares, por exemplo, co- mo na listagem de seqüência aqui e que mantém a estrutura L-moldadas de tRNA em virtu- de da auto-complementaridade apropriada, porém que não tem uma seqüência idêntica a- quela, por exemplo, na listagem de seqüência aqui ou FlG. 16, e desejavelmente, são dife- rentes de moléculas de tRNA de tipo silvestre.

A composição compreendendo um O-tRNA pode também incluir uma aminoacil- tRNA sintetase ortogonal (O-RS), onde o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com um aminoácido não natural. Em certas modalidades, uma composição incluindo um O-tRNA pode também incluir um sistema de translação (por exemplo, in vitro ou irt vivo). Um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA, ou uma combinação de um ou mais destes pode da mesma forma estar presente na célula.

Métodos de produzir um tRNA ortogonal (O-tRNA) são da mesma forma uma carac- terística da invenção. Um O-tRNA produzido pelo método é da mesma forma uma caracte- rística da invenção. Em certas modalidades da invenção, os O-tRNAs podem ser produzidos gerando-se uma biblioteca de mutantes. A biblioteca de tRNAs mutantes pode ser gerada utilizando várias técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Por exemplo, os tRNAs mutantes podem ser gerados por mutações sítio-específicas, mutações de ponto aleatórias, recombinação homóloga, embaralhamento de DNA ou outros métodos de mutagênese re- cursivos, construção quimérica ou qualquer combinação destes, por exemplo, do O-tRNA de SEQ ID NO: 3.

Mutações adicionais podem ser introduzidas em posição(ões) específica(s), por e- xemplo, em posição(ões) não conservadora(s), ou em posição(ões) conservadora(s), em posição(ões) aleatórias, ou uma combinação ambos em uma alça desejada ou região de um tRNA, por exemplo, uma alça anticódon, o tronco aceptor, braço D ou alça, alça variável, braço TPC ou alça, outras regiões da molécula de tRNA, ou uma combinação destes. Tipi- camente, mutações em um tRNA incluem mutação da alça anticódon de cada membro da biblioteca de tRNAs mutantes para permitir reconhecimento de um códon seletor. O método pode da mesma forma incluir seqüências adicionais de adição ao O-tRNA. Tipicamente, um O-tRNA possui uma melhoria de ortogonalidade para um organismo desejado comparado ao material de partida, por exemplo, a pluralidade de seqüências de tRNA, enquanto preser- vando sua afinidade para um RS desejado.

Os métodos opcionalmente incluem analisar a similaridade (e/ou deduziu homologi- a) de seqüências de tRNAs e/ou aminoacil-tRNA sintetases para determinar candidatos po- tenciais para um O-tRNA, O-RS e/ou pares destes, que parece ser ortogonal para um orga- nismo específico. Programas de computador conhecidos na técnica e descritos aqui podem ser utilizados para a análise, por exemplo, programas BLAST e pileup podem ser utillizados. Em um exemplo, para escolher componentes translacionais ortogonais potenciais para uso em células de mamífero tal como células de roedor e células de primata, uma sintetase e/ou um tRNA é escolhido, o qual não exibe similaridade de seqüência íntima aos organismos hospedeiros.

Tipicamente, um O-tRNA é obtido submetendo-se, por exemplo, à seleção negati- va, a uma população de células de uma primeira espécie, onde as células compreendem um membro da pluralidade de O-tRNAs potenciais. A seleção negativa elimina células que com- preendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais que é aminoacilada por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) que é endógeno à célula. Isto fornece uma mistura de tRNAs que são ortogonais à célula das primeiras espécies.

Em certas modalidades, na seleção negativa, códon(s) seletor(es) é introduzido em um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção negativa, por exemplo, uma enzi- ma que confere resistência antibiótica, por exemplo, β-lactamase, uma enzima que confere um produto detectável, por exemplo, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), por exemplo, um produto tóxico, tal como barnase, em uma posição dispensável (por exem- plo, ainda produzindo uma barnase funcional), etc. Avaliação/seleção é opcionalmente feita cultivando-se a população de células na presença de um agente seletivo (por exemplo, um antibiótico, tal como ampicilina). Em uma modalidade, a concentração do agente de seleção é variada.

Por exemplo, para medir a atividade de tRNAs supressores, um sistema de seleção é utilizado isto é com base na supressão in vivo de códon seletor, por exemplo, mutação sem sentido (por exemplo, interrompida) ou de fase de leitura introduzidas em um polinucle- otídeo que codifica um marcador de seleção negativo, por exemplo, um gene para β- lactamase (bla). Por exemplo, variantes de polinucleotídeo, por exemplo, variantes de bla, com um códon seletor em uma certa posição (por exemplo, A184), são construídas. Células, por exemplo, bactérias, são transformadas com estes polinucleotídeos. No caso de um tRNA ortogonal, que não pode ser eficazmente carregado por E. coli sintetases endógena, resis- tência antibiótica, por exemplo, resistência a ampicilina, deveria ser cerca de ou menor do que para uma bactéria transformada sem plasmídeo. Se o tRNA não é ortogonal, ou se uma sintetase heteróloga capaz de carregar o tRNA é co-expressado no sistema, um nível mais alto de antibiótico, por exemplo, ampicilina, resistência será observada. Células, por exem- plo, bactérias, são escolhidas as quais não são capazes de crescer em placas de LB ágar com concentrações de antibiótico aproximadamente iguais em células transformadas sem plasmídeo.

No caso de um produto tóxico (por exemplo, ribonuclease ou barnase), quando vá- rias pluralidades de tRNAs potenciais são aminoaciladas por hospedeiro endógeno, por e- xemplo, sintetases de Escherichia coli (Isto é, não é ortogonal ao hospedeiro, por exemplo, sintetases de Escherichia coli), o códon seletor é suprimido e o produto de polinucleotídeo tóxico leva a morte celular. Células que abrigam tRNAs ortogonais ou sobrevivência de tR- NAs não funcionais.

Em uma modalidade, a mistura de tRNAs que é ortogonal a um organismo deseja- do é em seguida submetida a uma seleção positiva em que um códon seletor é colocado em um marcador de seleção positiva, por exemplo, codificado por um gene de resistência a fár- maco, tal como gene β-lactamase. A seleção positiva é realizada em uma célula compreen- dendo um polinucleotídeo codificando ou compreendendo um membro da mistura de tRNAs que é ortogonal à célula, um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção positiva, e um polinucleotídeo codificando um RS cognato. Em certas modalidades, a segunda popula- ção de células compreende células que não foram eliminadas pela seleção negativa. Os polinucleotídeos são expressos na célula e a célula é cultivada na presença de um agente de seleção, por exemplo, ampicilina. tRNAs são em seguida selecionados quanto a sua ca- pacidade de ser aminoacilados pela sintetase cognata co-expressa e inserir um aminoácido com respeito a este códon seletor. Tipicamente, estas células mostram um realce na eficiên- cia de supressão comparada às células que abrigam tRNA(s) não funcionais, ou tRNAs que não eficazmente podem ser reconhecidos pela sintetase de interesse. A célula que abriga os tRNAs não funcionais ou tRNAs que não são eficazmente reconhecidos pela sintetase de interesse, são sensíveis ao antibiótico. Portanto, tRNAs que: (i) não são substratos para hospedeiro endógeno, por exemplo, Escherichia coli, sintetases; (ii) pode ser aminoacilada pela sintetase de interesse; e (iii) são funcionais em translação, sobrevivem ambas sele- ções.

Desta maneira, o mesmo marcador pode ser um marcador positivo ou negativo, de- pendendo do contexto em que é avaliado. Isto é, o marcador é um marcador positivo se é avaliado para, porém um marcador negativo se avaliado contra.

A severidade da seleção, por exemplo, a seleção positiva, a seleção negativa ou tanto a seleção positiva quanto a negativa, nos métodos descritos acima, opcionalmente inclui variar a severidade da seleção. Por exemplo, porque barnase é uma proteína extre- mamente tóxica, a severidade da seleção negativa pode ser controlada introduzindo-se nú- meros diferentes de códons seletores no gene barnase e/ou utilizando-se um promotor indu- zível. Em outro exemplo, a concentração do agente de seleção ou avaliação é variada (por exemplo, concentração de ampicilina). Em alguns aspectos da invenção, a severidade é variada porque a atividade desejada pode ser baixa durante círculos precoces. Desse modo, critérios de seleção menos estritos são aplicados em círculos precoces e critérios mais estri- tos são aplicados em círculos posteriores de seleção. Em certas modalidades, a seleção negativa, a seleção positiva ou tanto as seleções negativas quanto positivas podem ser re- petidas múltiplas vezes. Marcadores de seleção negativos diferentes múltiplos, marcadores de seleção positivos ou ambos os marcadores de seleção negativa e positiva podem ser utilizados. Em certas modalidades, o marcador de seleção positiva e negativa podem ser o mesmo.

Outros tipos de seleções/avaliação podem ser utilizados na invenção para produzir componentes translacionais ortogonais, por exemplo, um par de O-tRNA, um O-RS1 e um O- tRNA/O-RS que leva a um aminoácido não natural em resposta a um códon seletor. Por exemplo, o marcador de seleção negativo, o marcador de seleção positivo ou ambos os marcadores de seleção positivos e negativos podem incluir um marcador que fluoresce ou catalisa uma reação Iuminescente na presença de um reagente adequado. Em outra moda- lidade, um produto do marcador é detectado por separador celular ativado por fluorescência (FACS) ou por luminescência. Opcionalmente, o marcador inclui um marcador de avaliação com base em afinidade. Veja da mesma forma, Francisco, J. A., e outro, (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the externai surface. Proc Natl Acad Sci USA. 90:10444-8.

Métodos adicionais para produzir um tRNA ortogonal recombinante podem ser en- contrados, por exemplo, em International Application Publications WO 2002/086075, nome- ado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2004/094593, nomeado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" e WO 2005/019415, depositado em 7 de julho de 2004. Veja da mesma forma Forster e outro, (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357; and, Feng e outro, (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681.

Aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS)

Uma O-RS da invenção preferencialmente aminoacila um O-tRNA com um aminoá- cido não natural, in vitro ou in vivo. Uma O-RS da invenção pode ser fornecido ao sistema de translação, por exemplo, uma célula, por um polipeptídeo que inclui uma O-RS e/ou por um polinucleotídeo que codifica uma O-RS ou uma porção destes. Por exemplo, uma O-RS compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 57-101, ou uma variação conservadora deste. Em outro exemplo, um O-RS, ou uma porção deste, é codificado por uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido na seqüência listada ou exemplos aqui, ou uma seqüência de polinucleotídeo complementar deste. Veja, por exemplo, os polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 8-56.

Métodos para identificar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS), por e- xemplo, um O-RS, para uso com um O-tRNA, são da mesma forma uma característica da invenção. Por exemplo, um método inclui submeter a seleção, por exemplo, seleção positi- va, uma população de células de uma primeira espécie, onde as células individualmente compreendem: 1) um membro de uma pluralidade de aminoacil-tRNA sintetases (RSs)1 (por exemplo, a pluralidade de RSs pode incluir mutante RSs1 RSs derivado a partir de uma es- pécie diferente da primeira espécie ou ambos RSs e RSs mutantes derivados de espécies diferentes das primeiras espécies); 2) o tRNA de ortogonal (O-tRNA) (por exemplo, de uma ou mais espécies); e 3) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção (por exem- plo, positivo) e compreende pelo menos um códon seletor. Células são selecionadas ou ava- liadas quanto àquelas que mostram um realce em eficiência de supressão comparada a cé- lulas faltando ou com uma quantidade reduzida do membro da pluralidade de RSs. Eficiên- cia de supressão pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica e como descrito aqui. Células tendo um realce em eficiência de supressão compreendem um RS ativo que amino- acila o O-tRNA. Um nível de aminoaciiação (in vitro ou in vivo) pelo RS ativo de um primeiro grupo de tRNAs a partir das primeiras espécies é comparado ao nível de aminoaciiação (in vitro ou in vivo) pelo RS ativo de um segundo grupo de tRNAs a partir das segundas espé- cies. O nível de aminoaciiação pode ser determinado por uma substância detectável (por exemplo, um aminoácido não natural rotulado). O RS ativo que mais eficazmente aminoacila o segundo grupo de tRNAs comparado ao primeiro grupo de tRNAs é tipicamente selecio- nado, desse modo fornecendo uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal eficiente (por exem- plo, otimizado) para uso com o O-tRNA. Um O-RS, identificado pelo método, também é da mesma forma uma característica da invenção.

Quaisquer de vários ensaios podem ser utilizados para determinar aminoaciiação. Estes ensaios podem ser realizados in vitro ou in vivo. Por exemplo, ensaios de aminoaciia- ção in vitro são descritos em, por exemplo, Hoben and Soll (1985) Methods Enzvmol. 113:55-59. Aminoaciiação pode da mesma forma ser determinada utilizando um repórter juntamente com componentes de translação ortogonais e detectando o repórter em uma célula expressando um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um códon seletor que codifica uma proteína. Veja da mesma forma, WO 2002/085923, nomeado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" e WO 2004/094593, nomeado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GEIMETIC CODE."

O-RS identificada pode ser também manipulada para alterar a especificidade de substrato da sintetase, de forma que apenas um aminoácido não natural desejado, porém nem todos os 20 aminoácidos comuns, seja carregado ao O-tRNA. Métodos para gerar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal com uma especificidade de substrato para um aminoáci- do não natural inclui mutar a sintetase, por exemplo, no sítio ativo na sintetase, no sítio de mecanismo da edição na sintetase, em sítios diferentes combinando-se domínios diferentes de sintetases, ou similar, e aplicando-se um processo de seleção. Uma estratégia é utiliza- da, a qual é com base na combinação de uma seleção positiva seguida por uma seleção negativa. Na seleção positiva, supressão do códon seletor introduzido em posição(ões) não essenciais de um marcador positivo permite células sobreviver sob pressão de seleção posi- tiva. Na presença de ambos aminoácidos naturais e não naturais, sobreviventes desse mo- do codificam sintetases ativas carregando o tRNA supressor ortogonal com ou um aminoá- cido natural ou não natural. Na seleção negativa, supressão de um códon seletor introduzido em posição(ões) não essenciais de um marcador negativo remove sintetases com especifi- cidades de aminoácido naturais. Sobreviventes da seleção negativa e positiva codificam sintetases que aminoacila (carga) o tRNA supressor ortogonal com aminoácidos não natu- rais apenas. Estas sintetases podem em seguida ser submetidas a outra mutagênese, por exemplo, embaralhamento de DNA ou outros métodos de mutagênese recursiva.

Uma biblioteca de O-RSs mutante pode ser gerada utilizando várias técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Por exemplo, o RSs mutante pode ser gerado por mu- tações sítio-específicas, mutações de ponto aleatórias, recombinação homóloga, embara- lhamento de DNA ou outros métodos de mutagênese recursiva, construção quimérica ou qualquer combinação destes. Por exemplo, uma biblioteca de RSs mutante pode ser produ- zida a partir de dois ou mais outras, por exemplo, "sub-bibliotecas", menores, menos diver- sas. Bibliotecas quiméricas de RSs estão da mesma forma incluídas na invenção. Deve ser notado que bibliotecas de tRNA sintetases a partir de vários organismos (por exemplo, mi- croorganismos tais como eubactérias ou archaebacteria) tais como bibliotecas que compre- endem diversidade natural (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.238.884 a Short e outro; Patente U.S. No. 5.756.316 a Schallenberger e outro; Patente U.S. No. 5.783.431 a Peter- sen e outro; Patente U.S. No. 5.824.485 a Thompson e outro; Patente U.S. No. 5.958.672 a Short e outros), são opcionalmente construídas e avaliadas quanto pares ortogonais.

Uma vez que as sintetases são submetidas à estratégia de seleção positiva e negativa / avaliação, estas sintetases podem em seguida ser submetidas a outra mutagênese. Por exemplo, um ácido nucléico que codifica o O-RS pode ser isolado; um grupo de polinu- cleotídeos que codifica O-RSs mutadas (por exemplo, por mutagênese aleatória, mutagêne- se sítio-específica, recombinação ou qualquer combinação destes) pode ser gerado a partir do ácido nucléico; e, estas etapas individuais ou uma combinação destas etapas pode ser repetida até que uma O-RS mutado seja obtido que preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminoácido não natural. Em alguns aspectos da invenção, as etapas são realizadas múltiplas vezes, por exemplo, pelo menos duas vezes.

Níveis adicionais de severidade de seleção / avaliação podem ser utilizados nos métodos da invenção, para produzir O-tRNA, O-RS, ou pares destes. A severidade de sele- ção ou avaliação pode ser variada em uma ou ambas as etapas do método para produzir um O-RS. Isto poderia incluir, por exemplo, variar a quantidade de agente de seleção / ava- liação que é utilizado, etc. Círculos adicionais de seleções positivas e/ou negativas podem da mesma forma ser realizadas. Seleção ou avaliação pode da mesma forma compreender uma ou mais de uma mudança na permeabilidade de aminoácido, uma mudança na eficiên- cia de translação, uma mudança na fidelidade translacional, etc. Tipicamente, a uma ou mais mudanças é com base em uma mutação em um ou mais genes em um organismo em que um par de tRNA-tRNA sintetase ortogonal é utilizado para produzir proteína.

Detalhes gerais adicionais para produzir O-RS1 e alterar a especificidade do subs- trato da sintetase podem ser encontrados em Número de Publicação Interno WO 2002/086075, nomeado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" e WO 2004/094593, no- meado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE." Veja da mesma forma, Wang e Schultz Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1 ):34-66 (2005), o teor do qual está incorporado por referência em sua totalidade.

FONTE E ORGANISMOS HOSPEDEIROS

Os componentes translacionais ortogonais (O-tRNA e O-RS) da invenção podem ser derivados a partir de qualquer organismo (ou uma combinação de organismos) para uso em um sistema de translação de hospedeiro a partir de qualquer outra espécie, com a ad- vertência que os componentes O-tRNA/O-RS e o sistema de hospedeiro trabalhem de uma maneira ortogonal. Não é uma exigência que o O-tRNA e o O-RS a partir de um par ortogo- nal sejam derivados a partir do mesmo organismo. Em alguns aspectos, os componentes ortogonais são derivados a partir de genes E. coli (isto é, eubacteria) para uso em sistemas de hospedeiro mamíferos (por exemplo, sistema de hospedeiro de roedor ou primata).

Por exemplo, o O-tRNA ortogonal pode ser derivado a partir de um organismo de Archae, por exemplo, uma arquebacterium, tais como espécies Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophieum, Halobaeterium tal como Haloferax voleanii e Halo- baeterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyroeoceus furiosus, Pyroeoeeus horikoshii, Aeu- ropyrum pernix, Methanoeoeeus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosareina mazei (Mm), Pyrobaeulum aerophilum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfatarieus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma aeidophilum, Thermoplasma voleanium, ou similar, ou uma eubacte- rium, tal como Eseheriehia coli, Thermus thermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus stearo- thermphilus, ou similar, enquanto o O-RS ortogonal pode ser derivado a partir de um orga- nismo ou combinação de organismos, por exemplo, uma archaebaeterium, tal como espé- cies de Methanoeoeeus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophieum, Halobacterium tal como Haloferax voleanii e Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyroeoeeus furiosus, Pyroeoeeus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanoeoeeus maripaludis, Methanop- yrus kandleri, Methanosarcina mazei, Pyrobaculum aerophilum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolo- bus solfatarieus, Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma aeidophilum, Thermoplasma voleanium, ou similar, ou um eubaeterium, tal como Eseheriehia coli, Thermus thermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermphilus, ou similar. Em uma modalidade, fontes eucarióticas, por exemplo, plantas, algas, protistas, fungos, leveduras, animais (por exemplo, mamíferos, in- setos, artrópodes, etc.), ou similar, podem da mesma forma ser utilizados como fontes de O- tRNAs e O-RSs.

Os componentes individuais de um par de O-tRNA/O-RS podem ser derivados a partir do mesmo organismo ou organismos diferentes. Em uma modalidade, o par de O- tRNA/O-RS é a partir do mesmo organismo. Alternativamente, o O-tRNA e o O-RS do par de O-tRNA/O-RS são a partir de organismos diferentes.

O par de O-tRNA, O-RS ou O-tRNA/O-RS pode ser selecionado ou pode ser avali- ado in vivo ou in vitro e/ou utilizado em uma célula, por exemplo, uma célula de mamífero tal como uma célula de roedor ou célula de primata, para produzir um polipeptídeo com um aminoácido não natural. A célula hospedeira mamífera utilizada não está particularmente limitada. Composições de células de mamífero compreendendo componentes translacionais da invenção são da mesma forma um aspecto da invenção.

Veja da mesma forma, Número de Publicação de Pedido Internacional WO 2004/094593, nomeado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE," depositado em 16 de abril de 2004, para avaliar O-tRNA e/ou O-RS em uma espécie para uso em ou- tras espécies.

Embora sistemas de translação ortogonais (por exemplo, compreendendo um O- RS, um O-tRNA e um aminoácido não natural) possam utilizar células hospedeiras cultiva- das para produzir proteínas tendo aminoácidos não naturais, não é pretendido que um sis- tema de translação ortogonal da invenção requeira uma célula hospedeira intacta, viável. Por exemplo, um sistema de translação ortogonal pode utilizar um sistema livre de célula na presença de um extrato celular. Realmente, o uso de célula livre, sistemas de transcri- ção/translação in vitro para produção de proteína é uma técnica bem estabelecida. Adapta- ção destes sistemas in vitro para produzir proteínas tendo aminoácidos não naturais utili- zando componentes de sistemas de translação ortogonais descritos aqui está bem dentro do escopo da invenção.

CÓDONS SELETORES

Códons seletores da invenção ampliam a estrutura de codon genético de maquina- ria biossintética de proteína. Por exemplo, um codon seletor inclui, por exemplo, um códon de três base único, um códon de não sentido, tais como um códon de parada, por exemplo, um códon ambarino (UAG), ou um códon opala (UGA), um códon não natural, pelo menos um códon de quatro bases , um códon raro, ou similar. Vários códons seletores podem ser introduzidos em um gene desejado, por exemplo, um ou mais, dois ou mais, mais do que três, etc. Utilizando-se códons seletores diferentes, pares de tRNA/sintetase ortogonais múl- tiplos podem ser utilizados que permite a incorporação sítio-específica simultânea de amino- ácidos não naturais múltiplos por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natu- ral, utilizando estes códons seletores diferentes.

Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de interrupção para a incorporação de um aminoácido não natural in vivo em uma célula. Por exemplo, um O-tRNA é produzido que reconhece o códon de interrupção e é aminoacilado por uma O-RS com um aminoácido não natural. Este O-tRNA não é reconhe- cido pelas aminoacil-tRNA sintetases hospedeiras de ocorrência natural. Mutagênese dire- cionada ao sítio convencional pode ser utilizada para introduzir o códon de interrupção no sítio de interesse em um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse. Veja, por exemplo, Sayers, J.R., e outros (1988), 5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligo- nucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 791-802. Quando os O-RS, O-tRNA e o ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de interesse são combinados, por exemplo, in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao códon de interrupção para produzir um polipeptídeo contendo o aminoácido não natural na posição especificada. Em uma modalidade da invenção, o códon de interrupção utilizado como um códon seletor é um códon ambarino, UAG, e/ou um códon opala, UGA. Em um exemplo, um código genético em que UAG e UGA são ambos utilizados como um códon seletor pode codificar 22 aminoáci- dos enquanto preservando o códon sem sentido de ocre, UAA que é o sinal de terminação mais abundante.

A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significante da célula hospedeira. Por exemplo em células não-eucarióticas, tal como Esche- richia coli, porque a eficiência de supressão para o códon de UAG depende da competição entre o O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor ambarino, e o fator de liberação 1 (RF1) (que liga-se ao códon UAG e inicia liberação do peptídeo em desenvolvimento do ribosso- ma), a eficiência de supressão pode ser modulada por, por exemplo, aumentando o nível de expressão de O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor, ou utilizando uma cepa deficiente de RF1. Em células eucarióticas, por causa da eficiência de supressão ao códon de UAG de- pende da competição entre o O-tRNA, por exemplo, tRNA supressor ambarino, e um fator de liberação eucariótica (por exemplo, eRF) (que liga-se a um códon de interrupção e inicia liberação do peptídeo em desenvolvimento do ribossoma), a eficiência de supressão pode ser modulada por, por exemplo, aumentando-se o nível de expressão de O-tRNA, por e- xemplo, o tRNA supressor. Além disso, compostos adicionais podem da mesma forma estar presentes, por exemplo, agentes de redução tais como ditiotretiol (DTT).

Aminoácidos não naturais podem da mesma forma ser codificados com códons ra- ros. Por exemplo, quando a concentração de arginina em uma reação de síntese de proteí- na in vitro é reduzida, o códon de arginina raro, AGG, mostra ser eficiente para inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Veja, por exemplo, Ma e outro, Biochemistry, 32:7939 (1993). Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAAr9 de ocorrência natural, que existe como uma espécie secundária em Escherichia coli. Além disso, alguns organis- mos não usam todos os códons tripletos. Um códon não designado AGA em Micrococcus luteus foi utilizado para inserção de aminoácidos em um extrato de transcrição/translação in vitro. Veja, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Componentes da invenção podem ser gerados para utilizar estes códons raros in vivo.

Códons seletores podem da mesma forma compreender códons prolongados, por exemplo, códons de quatro bases ou mais, tais como, quatro, cinco, seis ou mais códons de base. Exemplos de códons de quatro bases incluem, por exemplo, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU, e similares. Exemplos de códons de cinco bases incluem, por exemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e similares. Métodos da invenção incluem utilizar códons prolongados com base na supressão de fase de leitura. Códons de quatro bases ou mais podem inserir, por exemplo, um ou múltiplos aminoácidos não naturais, na mesma proteína. Em outras modalidades, alças anticódon podem descodificar, por exemplo, pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases, ou pelo me- nos um códon de seis bases ou mais. Visto que há 256 códons de quatro bases possíveis, aminoácidos não naturais múltiplos podem ser codificados na mesma célula utilizando um códon de quatro bases ou mais. Veja da mesma forma, Anderson e outro, (2002) Exploring the Limits of Codon e Antieodon Size, Chemistrv e Bioloqy. 9:237-244; e, Magliery, (2001) Expanding the Genetie Code: Selection of Effieient Suppressors of Four-base Codons e Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approaeh in Eseheriehia coli, Ji Mol. Biol. 307: 755-769.

Por exemplo, códons de quatro bases foram utilizados para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas utilizando métodos biossintéticos in vitro. Veja, por exemplo, Ma e outro, (1993) Biochemistrv. 32:7939; e Hohsaka e outro, (1999) J. Am. Chem. Soc.. 121:34. CGGG e AGGU foram utilizados para simultaneamente incorporar 2-naftilalanina e um deri- vado de NBD de Iisina em estreptavidina in vitro com dois tRNAs supressores de fase de leitura quimicamente acilado. Veja, por exemplo, Hohsaka e outro, (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. Em um estudo in vivo, Moore e outros examinaram a habilidade dos deri- vados de tRNALeu com anticódons de NCUA para suprimir códons de UAGN (N pode ser U, A, G, ou C), e constataram que o UAGA quadripleto pode ser descodificado por um tRNALeu com um anticódon de UCUA com uma eficiência de 13 a 26% com pouca decodificação na estrutura 0 ou -1. Veja Moore e outro, (2000) J. Mol. Biol.. 298:195. Em uma modalidade, códons prolongados com base em códons raros ou códons sem sentido podem ser utiliza- dos na invenção, que pode reduzir a supressão de fase de leitura e readthrough de sentido incorreto e em outros sítios não desejados. Códons de quatro bases foram utilizados como códons seletores em uma variedade de sistemas ortogonais. Veja, por exemplo, WO 2005/019415; WO 2005/007870 e WO 2005/07624. Veja da mesma forma, Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005), o teor do qual está incorporado através de referência em sua totalidade. Enquanto os exemplos abai- xo utilizam um códon seletor ambarino, códons de quatro bases ou mais podem ser utiliza- dos igualmente, modificando-se os exemplos aqui para incluir O-tRNAs de base quatro e sintetases modificadas para incluir mutações similares para aquelas previamente descritas para vários aminoácidos não naturais O-RSs.

Para um determinado sistema, um códon seletor pode da mesma forma incluir um dos códons de três bases naturais, onde o sistema endógeno não usa (ou raramente usa) o códon de base natural. Por exemplo, isto inclui um sistema que está faltando um tRNA que reconhece o códon de três bases natural, e/ou um sistema onde o códon de três base é um códon raro.

Códons seletores opcionalmente incluem pares de base não naturais. Estes pares de base não naturais também expandem o alfabeto genético existente. Um par de base ex- tra aumenta o número de códons tripletos a partir de 64 a 125. Propriedades dos terceiros pares de base incluem pares de base estáveis e seletivos, incorporação enzimática eficiente em DNA com alta-fidelidade por uma polimerase, e a extensão de iniciador continuada efici- ente depois da síntese do par de base não natural nascente. Descrições de pares de base não naturais que podem ser adaptados para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, e outro, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnoloav. 20:177-182. Veja da mesma forma Wu, Y., e outro, (2002) JL Am. Chem. Soe. 124:14626-14630. Outras publicações relevantes são listadas abaixo.

Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é membrana permeável e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Além disso, a informação genética aumentada é estável e não destruída por enzimas celulares. Esforços anteriores por Benner e outro tira- ram vantagem de padrões de ligação de hidrogênio que são diferentes daqueles em pares Watson-Crick canônicos, o exemplo mais notável do qual é o par iso-C:iso-G. Veja, por e- xemplo, Switzer e outro, (1989) J. Am. Chem. Soc.. 111:8322; e Piccirilli e outro, (1990) Na1 ture. 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol.. 4:602. Estas bases em geral par incorreto até certo ponto com bases naturais e não pode ser enzimaticamente reproduzidos. Kool e co-trabalhos demonstrados que interações de empacotamento hidrofóbicas entre bases po- dem substituir ligação de hidrogênio para dirigir a formação de par básico. See Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; e Guckian e Kool, (1998) Anaew. Chem. Int. Ed. Enal.. 36, 2825. Em um esforço para desenvolver um par de base não natural satisfazendo todas as exigências anteriores, Schultz, Romesberg e co-trabalhos sistematicamente sintetizou e es- tudou uma série de bases hidrofóbicas não naturais. Um mesmo par de PICS:PICS é cons- tatado ser mais estável do que pares de base naturais, e pode ser eficazmente incorporado em DNA por fragmento de Klenow de DNA polimerase Escherichia coli I (KF). Veja, por e- xemplo, McMinn e outro, (1999) J. Am. Chem. Soe.. 121:11586; e Ogawa e outro, (2000) Ji Am. Chem. Soc.. 122:3274. Um mesmo par 3MN:3MN pode ser sintetizado por KF com efi- ciência e seletividade suficiente para função biológica. Veja, por exemplo, Ogawa e outro, (2000) J. Am. Chem. Soc.. 122:8803. Entretanto, ambas as bases agem como um termina- dor de cadeia para outra replicação. Um DNA polimerase mutante foi recentemente evoluída que pode ser utilizado para reproduzir o mesmo par de PICS. Além disso, um mesmo par de 7AI pode ser reproduzido. Veja, por exemplo, Tae e outro, (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. Um novo par de metalobase, Dipic:Py, foi da mesma forma desenvolvido, que forma um par estável sob ligação de Cu(II). Veja Meggers e outro, (2000) J. Am. Chem. Soc.. 122:10714. Porque códons prolongados e códons não naturais são intrinsicamente ortogonais a códons naturais, os métodos da invenção podem tirar vantagem desta proprie- dade para gerar tRNAs ortogonais para eles.

Um sistema de desvio translacional pode da mesma forma ser utilizado para incor- porar um aminoácido não natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema de desvio translacional, uma seqüência grande é inserida em um gene porém não é traduzida em pro- teína. A seqüência contém uma estrutura que serve como um estímulo para induzir o ribos- soma para pular sobre a seqüência e resumir tradução a jusante da inserção.

AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

Quando aqui utilizado, um aminoácido não natural refere-se a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, ou análogo de aminoácido diferente de selenocisteína e/ou pirrolisi- na e os seguintes vinte alfa aminoácidos geneticamente codificados: alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina. A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada através da Fórmula I:

Um aminoácido não natural é tipicamente qualquer estrutura tendo Fórmula I em que o grupo R é qualquer substituinte diferente daquele utilizado nos vinte aminoácidos na- turais. Veja por exemplo, Biochemistry by L. Stryer, 3a ed. 1988, Freeman e Company, New York, para estruturas dos vinte aminoácidos naturais. Note que, os aminoácidos não naturais da invenção podem ser compostos de ocorrência natural diferentes dos vinte alfa- aminoácidos acima.

Porque os aminoácidos não naturais da invenção tipicamente diferem dos aminoá- cidos naturais em cadeia lateral, os aminoácidos não naturais formam ligações de amida com outros aminoácidos, por exemplo, natural ou não naturais, da mesma maneira em que eles são formados em proteínas de ocorrência natural. Entretanto, os aminoácidos não natu- rais têm grupos de cadeia lateral que os distinguem dos aminoácidos naturais.

Embora os aminoácidos não naturais mostrados na FIG. 1 sejam de interesse pri- mário nos Exemplos descritos aqui, não é pretendido que a invenção seja estritamente limi- tada a estas estruturas. Realmente, uma variedade de análogos facilmente derivados, estru- turalmente relacionados podem ser facilmente produzidos que retém as características prin- cipais das estruturas das quais eles foram derivados (isto é, as estruturas mostradas na FIG. 1), e da mesma forma são especificamente reconhecidos pelas referências de aminoacil- tRNA sintetases aqui (por exemplo, as O-RSs de SEQ ID NOS: 57-101). Pretende-se que estes análogos de aminoácido relacionados estejam dentro do escopo da invenção.

Em outros aminoácidos não naturais, por exemplo, R na Fórmula I opcionalmente compreende uma alquil-, aril-, acil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenila, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, enona, imina, éster, hidroxilamina, amina, e similares, ou qualquer combinação destes. Outros aminoácidos não naturais de interesse incluem, porém não são limitados a, aminoácidos compreendendo um reticulador fotoativável, aminoácidos rotulados por centrifugação, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação de metal, aminoácidos contendo metal, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos fun- cionais, aminoácidos que covalentemente ou não covalentemente interagem com outras moléculas, aminoácidos photocaged e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos contendo biotina ou análogos de biotina, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos glicosilados, uma porção de sacarídeo ligada à cadeia lateral de aminoácido, aminoácidos compreendendo polietileno glicol ou poliéter, aminoácidos substituídos por átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis ou fotocliváveis, aminoácidos com uma cadeia lateral comprida quando comparado a aminoácidos naturais (por exemplo, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, por exemplo, maior do que cerca de 5, maior do que cerca de 10 carbonos, etc.), aminoácidos contendo açúcar ligados a carbono, aminoácidos contendo amino tioácido, e aminoácidos contendo uma ou mais porções tóxicas.

Em outro aspecto, a invenção fornece aminoácidos não naturais tendo a estrutura geral ilustrada pela Formula IV abaixo:

<formula>formula see original document page 45</formula>

Um aminoácido não natural tendo esta estrutura é tipicamente qualquer estrutura onde R1 é um substituinte utilizado em um dos vinte aminoácidos naturais (por exemplo, tirosina ou fenilalanina) e R2 é um substituinte. Desse modo, este tipo de aminoácido não natural pode ser visto como um derivado de aminoácido natural.

Além das estruturas de aminoácido não naturais mostradas na FIG. 1, aminoácidos não naturais podem da mesma forma opcionalmente compreender estruturas de cadeia principal modificadas, por exemplo, como ilustrado pelas estruturas das Fórmulas Il e III:

<formula>formula see original document page 46</formula>

em que Z tipicamente compreende OH1 NH2, SH1 NH-R', ou S-R'; X e Y, que podem ser os mesmos ou diferentes, tipicamente compreendem S ou O, e R e R', que são opcio- nalmente os mesmos ou diferentes, são tipicamente selecionados a partir da mesma lista de componentes para o grupo R descrito acima para os aminoácidos não naturais tendo Fórmu- la I bem como hidrogênio. Por exemplo, aminoácidos não naturais da invenção opcional- mente compreendem substituições no grupo amino ou carboxila como ilustrado pelas Fór- mulas Il e III. Aminoácidos não naturais deste tipo incluem, porém não são limitados a, áci- dos de α-hidróxi, a-aminotiocarboxilatos de α-tioácidos, por exemplo, com cadeias laterais correspondendo aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais. Além disso, substituições ao α-carbono opcionalmente inclui L, D, ou α-α-aminoácidos dis- substituídos tal como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, e simi- lares. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina bem como análogos de prolina de anel de 3,4,6,7,8, e 9 membros, β e γ aminoácidos tal como ácido butírico de β-alanina e γ-amino substituído.

Em alguns aspectos, a invenção utiliza aminoácidos não naturais na configuração L. Entretanto, não é pretendido que a invenção seja limitada ao uso de aminoácidos não naturais de configuração L. É considerado que D-enantiômeros destes aminoácidos não naturais da mesma forma encontram uso com a invenção.

Os aminoácidos não naturais que encontram uso com a invenção não são estritamente limitados aos aminoácidos não naturais mostrados na FIG. 1. Alguém de experiência na técnica reconhecerá que uma ampla variedade de análogos não naturais de aminoácidos de ocorrência natural é facilmente derivada. Por exemplo, porém não limitado a, aminoácidos não naturais derivados de fenilalanina ou tirosina são facilmente produzidos. Análogos de tirosina incluem, por exemplo, tirosinas para-substituídas, tirosinas orto- substituídas, e tirosinas meta substituídas, em que a tirosina substituída compreendem um grupo alquinila, grupo acetila, um grupo benzoila, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carbóxi, um grupo isopropila, um grupo metila, uma cadeia linear C6 - C2o ou hidrocarboneto ramificado, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metila, um grupo poliéter, um grupo nitro, ou similar. Além disso, anéis de arila substituídos multiplicados são da mesma forma contemplados. Análogos de glutamina da invenção incluem, porém não são limitados a, derivados de a-hidróxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos, e derivados de glutamina substituídos por amida. Análogos de fenilalanina de exemplo incluem, porém não são limitados a, fenilalaninas para-substituídas, fenialaninas orto-substituídas, e fenilalaninas meta- substituídas, em que o substituinte compreende um grupo alquinila, um grupo hidróxi, um grupo metóxi, um grupo metila, um grupo alila, um aldeído, um nitro, um grupo tiol, ou grupo ceto, ou similar. Exemplos específicos de aminoácidos não naturais incluem, porém não são limitados a, sulfotirosina, p-etiltiocarbonil-L-fenilalanina, p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina, 1,5- dansil-alanina, aminoácido de 7-amino-cumarina, aminoácido de 7-hidróxi-cumarina, nitrobenzil-serina, 0-(2-nitrobenzil)-L-tirosina, p-carboximetil-L-fenilalanina, p-ciano-L- fenilalanina, m-ciano-L-fenilalanina, bifenilalanina, 3-amino-L-tirosina, bipiridil alanina, p-(2- amino-1-hidroxietil)-L-fenilalanina, p-isopropiltiocarbonil-L-fenilalanina, 3-nitro-L-tirosina e p- nitro-L-fenilalanina. Da mesma forma, uma p-propargiloxifenilalanina, uma 3,4-diidróxi-L- fenialanina (DHP), uma 3, 4, 6-triidróxi-L-fenilalanina, uma 3,4,5-triidróxi-L-fenilalanina, 4- nitro-fenilalanina, uma p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma Ο-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, uma 3-nitro-tirosina, uma 3-tiol-tirosina, uma tri-O-acetil-GIcNAcp-serina, uma L-Dopa1 uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p- benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p- iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, e uma isopropil-L- fenilalanina, e similares. As estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais são descritas nas referências citadas aqui. Veja da mesma forma, Published International Applications WO 2004/094593, nomeado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" e International Application PCT/US2005/039210, nomeado "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS," depositado em 27 de outubro de 2005.

Síntese Química de Aminoácidos Antinaturais

Muitos dos aminoácidos antinaturais fornecidos acima estão comercialmente disponíveis, por exemplo, de Sigma (USA) ou Aldrich (Milwaukee, Wl, USA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como fornecido em várias publicações ou usando métodos padrões conhecidos por aqueles de experiência na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, veja, por exemplo, Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira Edição, Parts A and B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). As publicações adicionais que descrevem a síntese de aminoácidos antinaturais incluem, por exemplo, WO 2002/085923 intitulado "In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas e outro, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; "In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas e outro, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King e Kidd (1949) "A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates," J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman e Chatterrji, (1959) "Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substratos for Anti-Tumor Agents," J. Am. Chem. Soe. 81, 3750-3752; Craig e outros (1988) "Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1- methylbutyl]amino]quinoline (ChIoroquine)," J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay e outro, (1991) "Glutamine analogues as Potential Antimalarials," Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen e Rapoport, (1989) "Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues,". J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie e Rapoport, (1985) "Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization," J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton e outro, (1987) "Synthesis of Novel a- Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives," Tetrahedron Lett. 43:4297-4308; and, Subasinghe e outro, (1992) "Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate- sensitized site," J. Med. Chem. 35:4602-7. Também veja, Publicação Internacional WO 2004/058946, intitulada "PROTEIN FORM", depositada no dia 22 de dezembro de 2003.

Captação celular de aminoácidos antinaturais

A captação de aminoácido antinatural por uma célula é um assunto que é conside- rado tipicamente quando designando e selecionando aminoácidos antinaturais, por exemplo, para incorporação em uma proteína. Por exemplo, a densidade de carga elevada de a- aminoácidos sugere que estes compostos sejam improváveis serem permeáveis a célula. Os aminoácidos naturais são absorvidos na célula por uma coleção de sistemas de transpor- te com base em proteína que exibe freqüentemente graus variados de especificidade de aminoácido. Uma avaliação rápida pode ser feita a qual avalia quais aminoácidos antinatu- rais, se algum, é absorvido pelas células. Veja, por exemplo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, Publicação internacional WO 2004/058946, intitulada "PROTEIN FORM", de- positada no dia 22 de dezembro de 2003; e Liu e Sehultz (1999) Progress toward the evolu- tion of an organism with an expanded genetic code. PNAS 96:4780-4785. Embora a capta- ção seja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa para designar aminoáci- dos antinaturais que são assecíveis a série de reações de captação celular é para fornecer séries de reações biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.

Biossíntese de Aminoácidos Antinaturais

Muitas séries de reações biossintéticas já existem em células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Ao mesmo tempo em que um método biossintético para um aminoácido antinatural particular pode não existir por natureza, por exemplo, em uma célula, a invenção fornece tais métodos. Por exemplo, as séries de reações biossintéticas para aminoácidos antinaturais são opcionalmente geradas em célula hospedeira adicionan- do novas enzimas ou modificando séries de reações de célula hospedeira existentes. As novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas de ocorrência natural ou enzimas artificialmente evoluídas. Por exemplo, a biossíntese de p-aminofenilalanina (como apresen- tado em um exemplo em WO 2002/085923, supra) conta com a adição de uma combinação de enzimas conhecidas a partir de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula transformando a célula com um plasmídeo que compreende os genes. Os genes, quando expressados na célula, fornecem uma série de reações enzi- mática para sintetizar o composto desejado. Os exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. As seqüências de enzimas adicionais são encontradas, por exemplo, no Genbank. As enzimas artificialmente evoluídas também são opcionalmente adicionadas em uma célula da mesma maneira. Desta maneira, a maquinaria celular e recursos de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos antinaturais.

Na verdade, qualquer de uma variedade de métodos pode ser usado para produzir novas enzimas para uso em séries de reações biossintéticas, ou para evolução de séries de reações existentes, para a produção de aminoácidos antinaturais, in vitro ou in vivo. Muitos métodos disponíveis de evolução de enzimas e outros componentes de série de reações biossintéticas podem ser aplicados a presente invenção para produzir aminoácidos antinatu- rais (ou, de fato, para evoluir sintetases para ter novas especificidades de substrato ou ou- tras atividades de interesse). Por exemplo, o rearranjamento de DNA é opcionalmente usado para desenvolver novas enzimas e/ou séries de reações de tais enzimas para a produção de aminoácidos antinaturais (ou produção de novas sintetases), in vitro ou in vivo. Veja, por exemplo, Stemmer (1994), "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling," Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994), "DNA shuffling by random fragmentation and reassem- bly: In vitro recombination for molecular evolution," Proc. Nati. Acad. Sei. E.U.A.., 91:10747- 10751. Uma abordagem relacionada rearranja as famílias de genes relacionados (por e- xemplo, homólogos) para rapidamente desenvolver as enzimas com características deseja- das. Um exemplo de tais métodos de "rearranjamento de gene familiar" é encontrado em Crameri e outro (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature, 391(6664): 288-291. As novas enzimas (quer componentes de série de reações biossintéticas ou sintetases) podem ser também geradas usando um pro- cedimento de recombinação de DNA conhecido como "truncação incrementai para a criação de enzimas híbridas" ("ITCHY"), por exemplo, como descrito em Ostermeier e outro (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205. Esta abordagem também pode ser usada para gerar uma biblioteca de enzima ou outras variantes de série de reações que podem servir como substratos para um ou mais métodos de recombinação in vitro ou in vivo. Veja, também, Ostermeier e outro (1999) Os- termeier e outros (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incrementai Truncation", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 3562-67, e Ostermeier e outros (1999), "Incrementai Trunca- tion as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Bioloqical and Medicinal Chem- istry, 7: 2139-44. Outra abordagem usa mutagênese de conjunto exponencial para produzir bibliotecas de enzima ou outras variantes de série de reações que são, por exemplo, sele- cionadas quanto à capacidade de catalisar uma reação biossintética relevante à produção de um aminoácido antinatural (ou uma nova sintetase). Nesta abordagem, os grupos pe- quenos de resíduos em uma seqüência de interesse são randomizados em paralelo para identificar, a cada posição alterada, aminoácidos que levam às proteínas funcionais. Os exemplos de tais procedimentos, que podem ser adaptados a presente invenção para pro- duzir enzimas novas para a produção de aminoácidos antinaturais (ou novas sintetases) são encontrados em Delegrave e Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548-1552. Em ainda outra abordagem, mutagênese randomizada ou semi-randomizada usando oligonu- cleotídeos degenerados ou dopados para construção de componente de enzima e/ou série de reações pode ser usada, por exemplo, usando os métodos de mutagênese gerais de, por exemplo, Arkin e Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300; ou Reidhaar-Olson e outros (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes" Methods Enzymoi 208:564-86. Ainda outra abordagem, freqüentemente chamada de uma 30 mutagênese "não estocástica", que usa remontagem de polinucleotídeo e mutagênese de saturação de sítio pode ser usada para produzir enzimas e/ou componentes de série de rea- ções, que podem em seguida ser avaliados quanto a uma capacidade de realizar uma ou mais sintetases ou função de série de reações biossintética (por exemplo, para a produção de aminoácidos antinaturais in vivo). Veja, por exemplo, Short NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES" WO 00/46344.

Uma alternativa para tais métodos mutacionais envolve recombinar genomas intei- ros de organismos e selecionar progênie resultante para funções de série de reações parti- culares (freqüentemente chamado "rearranjo de genoma inteiro"). Esta abordagem pode ser aplicada a presente invenção, por exemplo, por recombinação genômica e seleção de um organismo (por exemplo, um E. coli ou outra célula) quanto a uma capacidade de produzir um aminoácido antinatural (ou intermediário deste). Por exemplo, os métodos ensinados nas seguintes publicações podem ser aplicados ao desígnio de série de reações para a evolu- ção de séries de reações existentes e/ou novas em células para produzir aminoácidos anti- naturais in vivo: Patnaik e outro (2002) "Genome shuffling of Iactobacillus for improved acid tolerance" Nature Biotechnology, 20(7): 707-712; e Zhang e outros (2002) "Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bactéria" Nature, 7 de fevereiro, 415(6872): 644- 646.

Outras técnicas para construção de organismo e série de reações metabólica, por exemplo, para a produção de compostos desejados estão também disponíveis e podem ser aplicados à produção de aminoácidos antinaturais. Os exemplos de publicações que ensi- nam abordagens de construção de série de reações útil incluem: Nakamura e White (2003) "Metabolic engineering for the microbial production of 1,3 propanediol" Curr. Opin. Biotech- nol. 14(5):454-9; Berry e outros (2002) "Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech índigo" J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133; Banta e outros (2002) "Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis" Biochemistry, 41(20), 6226-36; Selivonova e outros (2001) "Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms" Applied and Environmental Microbiology, 67:3645, e muitos outros.

Independente do método usado, tipicamente, o aminoácido antinatural produzido com uma série de reações biossintética construída da invenção é produzido em uma con- centração suficiente para biossíntese de proteína eficiente, por exemplo, uma quantidade celular natural, porém não a um tal grau como para significantemente afetar a concentração de outros aminoácidos celulares ou para exaurir recursos celulares. As concentrações típi- cas produzidas in vivo desta maneira são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mm. Uma vez que uma célula é construída para produzir enzimas desejadas para uma série de reações específica e um aminoácido antinatural é gerado, seleções in vivo são opcionalmente usa- das para também otimizar a produção do aminoácido antinatural tanto para síntese de prote- ína ribossômica quanto crescimento de célula.

Componentes Ortoqonais para Incorporar Aminoácidos Antinaturais

A invenção fornece composições e métodos para produzir componentes ortogonais para incorporar os aminoácidos antinaturais mostrados na FIG. 1 em uma cadeia de polipep- tídeo crescente em resposta a um códon seletor, por exemplo, um códon de interrupção de âmbar, um códon sem sentido, um códon com quatro ou mais bases, etc., por exemplo, in vivo. Por exemplo, a invenção fornece ortogonal-tRNAs (O-tRNAs), aminoacil-tRNA sinteta- ses ortogonais (O-RSs) e pares destes. Estes pares podem ser usados para incorporar um aminoácido antinatural em cadeias de polipeptídeo crescentes.

Uma composição da invenção inclui uma de aminoacil-tRNA sintetase (O-RS) orto- gonal, onde o O-RS preferencialmente aminoacila um O-tRNA com um aminoácido antinatu- ral da FIG. 1. Em certas modalidades, o O-RS compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO: 57-101, e variações conservadoras desta. Em certas modalidades da invenção, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA em qualquer tR- NA endógeno com o aminoácido antinatural particular, onde o O-RS tem uma inclinação para o O-tRNA, e onde a relação de O-tRNA carregado com um aminoácido antinatural para o tRNA endógeno carregado com o mesmo aminoácido antinatural é maior que 1:1, e mais preferivelmente onde o O-RS carrega o O-tRNA exclusivamente ou quase exclusivamente.

Uma composição que inclui uma O-RS pode opcionalmente também incluir um tR- NA ortogonal (O-tRNA), onde o O-tRNA reconhece um códon seletor. Tipicamente, um Ο- tRNA da invenção inclui pelo menos cerca de, por exemplo, uma eficiência de supressão de 45%, 50%, 60%, 75%, 80%, ou 90% ou mais na presença de uma sintetase cognata em resposta a um códon seletor quando comparado com a eficiência de supressão de um O- tRNA compreendendo ou codificado por uma seqüência de polinucleotídeo como apresen- tado nas listagens de seqüências (por exemplo, SEQ ID NO: 3) e exemplos neste. Em uma modalidade, a eficiência de supressão do O-RS e do O-tRNA juntos é, por exemplo, 5 ve- zes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes ou mais, maior do que a eficiência de supres- são do O-tRNA na ausência de um O-RS. Em alguns aspectos, a eficiência de supressão do O-RS e do O-tRNA juntos é pelo menos 45% da eficiência de supressão de um par de leuci- la ortogonal ou tirosil-tRNA sintetase derivado de E. coli.

Uma composição que inclui um O-tRNA pode opcionalmente incluir uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de mamífero tal como uma célula de roedor ou uma célula de primata), e/ou um sistema de translação completo.

Uma célula (por exemplo, uma célula de roedor ou uma célula de primata) que compreende um sistema de translação é também fornecida pela invenção, onde o sistema de translação inclui um ortogonal-tRNA (O-tRNA); uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS); e, um aminoácido antinatural fornecido em FIG. 1. Tipicamente, o O-RS preferenci- almente aminoacila o O-tRNA em qualquer tRNA endógeno com o aminoácido antinatural, onde o O-RS tem uma inclinação para o O-tRNA, e onde a relação de O-tRNA carregado com o aminoácido antinatural para o tRNA endógeno carregado com o aminoácido antinatu- ral é maior do que 1:1, e mais preferivelmente onde o O-RS carrega o O-tRNA exclusiva- mente ou quase exclusivamente. O O-tRNA reconhece o primeiro códon seletor, e o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com um aminoácido antinatural. Em uma modalida- de, o O-tRNA compreende ou é codificado por uma seqüência de polinucleotídeo como a- presentado em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de polinucleotídeo complementar desta. Em uma modalidade, o O-RS compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 57-101, e variações conservadoras desta.

Uma célula da invenção pode opcionalmente também compreender um par de O- tRNA/O-RS diferente adicional e um segundo aminoácido antinatural, por exemplo, onde este O-tRNA reconhece um segundo códon seletor e este O-RS preferencialmente aminoa- cila o O-tRNA correspondente com o segundo aminoácido antinatural, onde o segundo ami- noácido é diferente do primeiro aminoácido antinatural. Opcionalmente, uma célula da in- venção inclui um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um poli- peptídeo de interesse onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconhe- cido pelo O-tRNA.

Em certas modalidades, uma célula hospedeira da invenção é uma célula de mamí- fero (tal como uma célula de roedor ou uma célula de primata) que inclui um ortogonal-tRNA (O-tRNA), uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS), um aminoácido antinatural, e um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interes- se onde o polinucleotídeo compreende o códon seletor que é reconhecido pelo O-tRNA. Em certas modalidades da invenção, o O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminoácido antinatural com uma eficiência que é maior do que a eficiência com a qual o O- RS aminoacila qualquer tRNA endógeno.

Em certas modalidades da invenção, um O-tRNA da invenção compreende ou é codificado por uma seqüência de polinucleotídeo como apresentado nas listagens de se- qüência (por exemplo, SEQ ID NO: 3) ou exemplos desta, ou uma seqüência de polinucleo- tídeo complementar desta. Em certas modalidades da invenção, uma O-RS compreende uma seqüência de aminoácido como apresentado nas listagens de seqüência, ou uma vari- ação conservadora destas. Em uma modalidade, o O-RS ou uma porção deste é codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um aminoácido como apresentado nas listagens de seqüência ou exemplos nesta, ou uma seqüência de polinucleotídeo comple- mentar desta.

O O-tRNA e/ou o O-RS da invenção pode ser derivado de qualquer de uma varie- dade de organismos (por exemplo, organismos eucarióticos e/ou não eucarióticos).

Os polinucleotídeos também são um aspecto da invenção. Um polinucleotídeo da invenção (por exemplo, SEQ ID NOs: 8-56) inclui um polinucleotídeo artificial (por exemplo, artificial, e de ocorrência não natural) que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo como apresentado nas listagens de seqüência desta, e/ou é com- plementar para ou àquela seqüência de polinucleotídeo. Um polinucleotídeo da invenção também pode incluir um ácido nucléico que hibridiza para um polinucleotídeo descrito acima, sob condições altamente rigorosas, sobre substancialmente o comprimento inteiro do ácido nucléico. Um polinucleotídeo da invenção também inclui um polinucleotídeo que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico àquele de um tRNA de ocorrência natural ou ácido nucléico codífican- te correspondente (porém um polinucleotídeo da invenção é exceto um tRNA de ocorrência natural ou ácido nucléico codificante correspondente), onde o tRNA reconhece um códon seletor, por exemplo, um códon de quatro bases. Os polinucleotídeos artificiais que são, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idênticos a qualquer dos acima e/ou um polinucleotídeo compreendendo uma variação con- servadora de quaisquer dos acima, são também incluídos em polinucleotídeos da invenção.

Os vetores que compreendem um polinucleotídeo da invenção também são um as- pecto da invenção. Por exemplo, um vetor da invenção pode incluir um plasmídeo, um cos- mídeo, um fago, um vírus, um vetor de expressão, e/ou similares. Uma célula que compre- ende um vetor da invenção também é um aspecto da invenção.

Os métodos de produção de componentes de um par de O-tRNA/O-RS também são aspectos da invenção. Os componentes produzidos por estes métodos também são um aspecto da invenção. Por exemplo, os métodos para produzir pelo menos um tRNA que seja ortogonal a uma célula (O-tRNA) incluem gerar uma biblioteca de tRNAs mutantes; mutar uma alça de anticódon de cada membro da biblioteca de tRNAs mutantes para permitir o reconhecimento de um códon seletor, desse modo fornecendo uma biblioteca de O-tRNAs potenciais, e submetendo a seleção negativa uma primeira população de células de uma primeira espécie, onde as células compreendem um membro da biblioteca de O-tRNAs po- tenciais. A seleção negativa elimina células que compreendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais que é aminoacilada por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) que é en- dógena à célula. Isto fornece uma mistura de tRNAs que são ortogonais à célula das primei- ras espécies, desse modo fornecendo pelo menos um O-tRNA. Um O-tRNA produzido pelos métodos da invenção também é fornecido.

Em certas modalidades, os métodos também compreendem submeter à seleção positiva uma segunda população de células das primeiras espécies, onde as células com- preendem um membro da mistura de tRNAs que são ortogonais à célula das primeiras es- pécies, uma aminoacil-tRNA sintetase cognata, e um marcador de seleção positivo. Ao usar a seleção positiva, as células são selecionadas ou avaliadas quanto aquelas células que compreendem um membro da mistura de tRNAs que é aminoacilada pela aminoacil-tRNA sintetase cognata e que mostra uma resposta desejada na presença do marcador de sele- ção positivo, desse modo fornecendo um O-tRNA. Em certas modalidades, a segunda popu- lação de células compreende células que não foram eliminadas pela seleção negativa.

Os métodos para identificar um ortogonal-aminoacil-tRNA sintetase que carrega um O-tRNA com um aminoácido antinatural também são fornecidos. Por exemplo, os métodos incluem submeter uma população de células de uma primeira espécie a uma seleção, onde as células, cada qual compreende: 1) um membro de uma pluralidade de aminoacil-tRNA sintetases (RSs), (por exemplo, a pluralidade de RSs pode incluir RSs mutante, RSs deriva- do de uma espécie exceto uma primeira espécie ou ambos RSs mutante e RSs derivado de uma espécie exceto uma primeira espécie); 2) o ortogonal-tRNA (O-tRNA) (por exemplo, a partir de um ou mais espécies); e 3) um polinucleotídeo que codifica um marcador de sele- ção positivo e compreende pelo menos um códon de seletor.

As células (por exemplo, uma célula hospedeira) são selecionadas ou avaliadas quanto àquelas que mostram um realce na eficiência de supressão comparada com as célu- las que precisam ou têm uma quantidade reduzida do membro da pluralidade de RSs. Estas células selecionadas/avaliadas compreendem um RS ativo que aminoacila o O-tRNA. Uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal identificada pelo método também é um aspecto da in- venção.

Os métodos para produzir uma proteína em uma célula hospedeira (por exemplo, em uma célula de mamífero tal como uma célula de roedor ou uma célula de primata, ou similares) tendo o aminoácido antinatural em uma posição selecionada são também um as- pecto da invenção. Por exemplo, um método inclui crescimento, em um meio apropriado, de uma célula onde a célula compreende um ácido nucléico compreendendo pelo menos um códon seletor e codifica uma proteína, fornecendo o aminoácido antinatural, e incorporando o aminoácido antinatural na posição especificada na proteína durante a translação do ácido nucléico com o pelo menos um códon seletor, assim produzindo a proteína. A célula ainda compreende: um ortogonal-tRNA (O-tRNA) que funciona na célula e reconhece o códon se- letor; e, uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminoácido antinatural. Uma proteína produzida por este método também é um aspecto da invenção.

A invenção também fornece composições que incluem proteínas, onde as proteínas compreendem um aminoácido antinatural. Em certas modalidades, a proteína compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 75% idêntica àquela de uma proteína co- nhecida, por exemplo, uma proteína terapêutica, uma proteína diagnóstico, uma enzima in- dustrial, ou porções destes. Opcionalmente, a composição compreende um portador farma- ceuticamente aceitável.

SEQÜÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEO E ÁCIDO NUCLÉICO E VARIANTES

Como descrito aqui, a invenção fornece codificação de seqüências de polinucleotí- deo, por exemplo, O-tRNAs e O-RSs, e seqüências de aminoácido de polipeptídeo, por e- xemplo, O-RSs, e, por exemplo, composições, sistemas e métodos compreendendo as refe- ridas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo. Os exemplos das referidas seqüências, por exemplo, seqüências de nucleotídeo e aminoácido de O-RNA e O-RS são descritas aqui (veja, FIG. 16, por exemplo, SEQ ID NOs: 3 e 8-101). Porém, alguém de experiência na téc- nica apreciará que a invenção não fique limitada àquelas seqüências descritas aqui, por e- xemplo, nos Exemplos e listagem de seqüência. Alguém com experiência apreciará que a invenção também forneça muitas seqüências relacionadas com as funções descritas aqui, por exemplo, polinucleotídeos e polipeptídeos codificando variantes conservadores de uma O-RS descrito aqui. A metodologia geral para a construção e análise de espécies de sinteta- se ortogonal (O-RS) que são capazes de aminoacilar um O-tRNA com um aminoácido anti- natural em um sistema de hospedeiro de levedura é conhecido na técnica. A invenção fornece polipeptídeos (O-RSs) e polinucleotídeos, por exemplo, O- tRNA, polinucleotídeos que codificam O-RSs ou porções destes, os oligonucleotídeos usa- dos para isolar clones de aminoacil-tRNA sintetase, etc. Os polinucleotídeos da invenção incluem aqueles que codificam proteínas ou polipeptídeos de interesse da invenção com um ou mais códons seletores. Além disso, os polinucleotídeos da invenção incluem, por exem- plo, um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada de SEQ ID NOS: 8-56, e um polinucleotídeo que é complementar a ou que codifica uma seqüência de polinucleotídeo deste. Um polinucleotídeo da invenção também inclui qualquer polinucle- otídeo que codifica uma seqüência de aminoácido de O-RS selecionada de SEQ ID NOS: 57-101. Similarmente, um ácido nucléico artificial que hibridiza para um polinucleotídeo indi- cado acima sob condições altamente rigorosas sobre substancialmente o comprimento intei- ro do ácido nucléico (e é diferente de um polinucleotídeo de ocorrência natural) é um polinu- cleotídeo da invenção. Em uma modalidade, uma composição inclui um polipeptídeo da in- venção e um excipiente (por exemplo, tampão, água, excipiente farmaceuticamente aceitá- vel, etc.). A invenção também fornece um anticorpo ou antissoro especificamente imunorrea- tivo com um polipeptídeo da invenção. Um polinucleotídeo artificial é um polinucleotídeo que é artificial e não é de ocorrência natural.

Um polinucleotídeo da invenção também inclui um polinucleotídeo artificial que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico àquele de um tRNA de ocorrência natural, (porém é diferente de um tRNA de ocorrência natural). Um polinucleotídeo também inclui um polinucleotídeo artificial que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98% ou mais idêntico (porém não 100% idêntico) àquele de um tRNA ocorrência natural.

Em certas modalidades, um vetor (por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus, etc.) compreende um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Em outra modalidade, o vetor de expressão inclui um promo- tor operavelmente ligado a um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Em outra modali- dade, uma célula compreende um vetor que inclui um polinucleotídeo da invenção.

Alguém de experiência também apreciará que muitas variantes das seqüências descritas sejam incluídas na invenção. Por exemplo, variações conservadoras das seqüên- cias descritas que produzem uma seqüência funcionalmente idêntica são incluídas na in- venção. As variantes das seqüências de polinucleotídeo de ácido nucléico, em que as vari- antes hibridizam para pelo menos uma seqüência descrita, são consideradas serem incluí- das na invenção. As sub-sequências únicas das seqüências descritas aqui, como determi- nado por, por exemplo, técnicas padrões de comparação de seqüência, são também incluí- das na invenção.

Variações Conservadoras

Devido à degeneração do código genético, as "substituições silenciosas" (isto é, substituições em uma seqüência de ácido nucléico que não resulta em uma alteração em um polipeptídeo codificado) são um aspecto subentendido de toda seqüência de ácido nu- cléico que codifica uma seqüência de aminoácido. Similarmente, as "substituições de ami- noácido conservadoras", onde um ou um número limitado de aminoácidos em uma seqüên- cia de aminoácido são substituídos com aminoácidos diferentes com propriedades altamente similares, também são facilmente identificadas como sendo altamente similares a uma cons- trução descrita. Tais variações conservadoras de cada seqüência descrita são um aspecto da presente invenção.

As "variações conservadoras" de uma seqüência de ácido nucléico particular se re- ferem àqueles ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoácido idênticas ou es- sencialmente idênticas, ou, onde o ácido nucléico não codifica uma seqüência de aminoáci- do, para seqüências essencialmente idênticas. Alguém com experiência reconhecerá que as substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma porcentagem pequena de aminoácidos (tipicamente menos que 5%, mais tipicamente menos que 4%, 2% ou 1%) em uma seqüência codificada são "variações de modo conservador modificadas" onde as alterações resultam na deleção de um aminoá- cido, adição de um aminoácido, ou substituição de um aminoácido com um aminoácido qui- micamente similar. Desse modo, "variações conservadoras" de uma seqüência de polipeptí- deo listada da presente invenção incluem substituições de uma porcentagem pequena, tipi- camente menos que 5%, mais tipicamente menos que 2% ou 1%, dos aminoácidos da se- qüência de polipeptídeo, com um aminoácido do mesmo grupo de substituição conservador. Finalmente, a adição de seqüências que não alteram a atividade codificada de uma molécu- la de ácido nucléico, tal como a adição de uma seqüência não funcional, é uma variação conservadora do ácido nucléico básico.

As tabelas de substituição conservadora que forneceem aminoácidos funcionalmen- te similares são bem conhecidas na técnica, onde um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem propriedades químicas similares (por exemplo, cadeias laterais aromáticas ou cadeias laterais positivamente carregadas), e portanto, não substancialmente altera as propriedades funcionais da molécula de polipeptídeo. Os seguin- tes apresentam grupos de exemplo que contêm aminoácidos naturais de tipos de proprieda- des químicas, onde as substituições dentro de um grupo são uma "substituição conservado- ra".

Substituições de Aminoácido Conservadoras

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Hibridizacão de Ácido Nucléico

A hibridização comparativa pode ser usada para identificar ácidos nucléico da invenção, incluindo as variações conservadoras de ácidos nucléico da invenção, e este método de hibridização comparativo é um método preferido de distinguir ácidos nucléicos da invenção. Além disso, os ácidos nucléicos alvos que hibridizam para um ácido nucléico representado por SEQ ID NOS: 8-56, sob condições de severidade altas, ultra-altas e ultra- ultra altas são um aspecto da invenção. Os exemplos de tais ácidos nucléico incluem aqueles com uma ou algumas substituições de ácido nucléico silenciosas ou conservadoras quando comparado a uma determinada seqüência de ácido nucléico.

Um ácido nucléico de teste é dito especificamente hibridizar para um ácido nucléico de sonda quando ele hibridiza pelo menos 50% também para a sonda de acordo com o alvo complementar perfeitamente emparelhado, isto é, com uma relação sinal/ruído de pelo menos a metade tão elevada quanto a hibridização da sonda para o alvo sob condições nas quais a sonda perfeitamente emparelhada se liga ao alvo complementar perfeitamente emparelhado com uma relação de sinal/ruído que é pelo menos cerca de 5x-10x tão elevada quanto aquela observada para hibridização para quaisquer dos ácidos nucléico alvos não emparelhados.

Os ácidos nucléicos "hibridizam" quando eles se associam tipicamente na solução.

Os ácidos nucléicos hibridizam devido a uma variedade de forças físico-químicas bem ca- racterizadas, tal como ligação de hidrogênio, exclusão solvente, empilhamento de base e similares. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléico é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the stra- tegy of nucleic acid probe assays," (EIsevier1Nova Iorque), bem como em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (suplementado em 2004); Hames e Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press at Oxford University Press, Ox- ford, Inglaterra, fornece detalhes na síntese, rotulação, detecção e quantificação de DNA e RNA, incluindo oligonucleotídeos.

Um exemplo de condições de hibridização rigorosas para hibridização de ácidos nucléico complementares que têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma mancha do sul ou do norte é 50% de formalina com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem rigoro- sas é uma lavagem de 0,2x de SSC a 65°C durante 15 minutos (veja, Sambrook e outro, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, para uma descrição de tampão de SSC). Freqüen- temente a lavagem de severidade alta é precedida por uma lavagem de severidade baixa para remover sinal de sonda de base. Um exemplo de lavagem de baixa severidade é 2x de SSC a 40°C durante 15 minutos. Em geral, uma relação de sinal/ruído de 5x (ou mais eleva- da) do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridização específica.

As "condições de lavagem de hibridização rigorosas" no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucléico tal como hibridações do Sul e do Norte são dependentes da seqüência, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléico é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, Nova Iorque), Hames e Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press at Ox- ford University Press, Oxford, England1 e Hames e Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra. As condições de hibridização e lavagem rigo- rosas podem ser determinadas facilmente empiricamente para qualquer ácido nucléico de teste. Por exemplo, ao determinar as condições de hibridização e lavagem rigorosas, as condições de hibridização e lavagem são aumentadas gradualmente (por exemplo, aumen- tando-se a temperatura, diminuíndo-se a concentração de sal, aumentando a concentração de detergente e/ou aumentando a concentração de solventes orgânicos tais como formalina na hibridização ou lavagem), até que um conjunto selecionado de critérios seja obtido. Por exemplo, em condições de hibridização e lavagem altamente rigorosas, as condições de hibridização e lavagem são aumentadas gradualmente até que uma sonda se ligue a um alvo complementar perfeitamente emparelhado com uma relação sinal/ruído que seja pelo menos 5x tão elevada quanto aquela observada para hibridização da sonda para um alvo não emparelhado.

As condições "muito rigorosas" são selecionadas para serem iguais ao ponto de fu- são térmico (Tm) para uma sonda particular. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência de teste hibridiza para uma sonda perfeitamente em- parelhada. Com a finalidade da presente invenção, geralmente, condições de lavagem e hibridização "altamente rigorosas" são selecionadas para serem cerca de 5°C mai baixas do que a Tm para a seqüência específica em uma força iônica e pH definidos.

As condições de hibridização e lavagem "de rigorosidade ultra elevada" são aque- las nas quais a severidade das condições de hibridização e lavagem é aumentada até que a relação de sinal/ruído para ligação da sonda ao ácido nucléico de alvo complementar perfei- tamente emparelhado seja pelo menos 10x tão elevada quanto aquela observada para hibri- dização para quaisquer dos ácidos nucléicos alvos não emparelhados. Um ácido nucléico alvo que hibridiza para uma sonda sob tais condições, com uma relação sinal/ruído de pelo menos /4 daquela do ácido nucléico alvo complementar perfeitamente emparelhado é dito se ligar à sonda sob condições de severidade ultra-elevadas.

Similarmente, os níveis ainda mais elevados de severidade podem ser determina- dos gradualmente aumentando as condições de hibridização e/ou lavagem do ensaio de hibridização relevante. Por exemplo, aqueles nos quais a severidade das condições de hi- bridização e lavagem é aumentada até a relação sinal/ruído para ligação da sonda ao ácido nucléico alvo complementar perfeitamente emparelhado é pelo menos 10x, 20X, 50X, 100X, ou 500X ou mais tão alto quanto aqueles observados para hibridização para quaisquer dos ácidos nucléicos alvos não emparelhados. Um ácido nucléico alvo que hibridiza para uma sonda sob tais condições, com uma relação sinal/ruído de pelo menos Vz daquela do ácido nucléico alvo complementar perfeitamente emparelhado é dita se ligar à sonda sob condi- ções de severidade ultra-ultra-elevadas.

Os ácidos nucléicos que não hibridizam para cada outro sob condições rigorosas ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam forem substan- cialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético.

Subseqüências Únicas

Em alguns aspectos, a invenção fornece um ácido nucléico que compreende uma subsequência única em um ácido nucléico selecionado a partir das seqüências de O-tRNAs e O-RSs descritas aqui. A subsequência única é única quando comparada a um ácido nu- cléico que corresponde a qualquer seqüência de ácido nucléico de O-tRNA ou O-RS conhe- cida. O alinhamento pode ser realizado usando, por exemplo, conjunto BLAST para parâme- tros básicos. Qualquer subsequência única é útil, por exemplo, como uma sonda para identi- ficar os ácidos nucléicos da invenção ou ácidos nucléicos relacionados.

Similarmente, a invenção inclui um polipeptídeo que compreende uma subsequên- cia única em um polipeptídeo selecionado a partir das seqüências de O-RSs descritas aqui. Aqui, a subsequência única é única quando comparada a um polipeptídeo que corresponde a quaisquer das seqüências de polipeptídeo conhecidas.

A invenção também fornece ácidos nucléicos alvos que hibridizam sob condições rigorosas para um oligonucleotídeo de codificação única que codifica uma subsequência única em um polipeptídeo selecionado a partir das seqüências de O-RSs em que a subse- quência única é única quando comparada a um polipeptídeo que corresponde a quaisquer dos polipeptídeos de controle (por exemplo, seqüências de origem das quais as sintetases da invenção foram derivadas, por exemplo, através de mutação). As seqüências únicas são determinadas como notado acima.

Comparação, Identidade, e Homoloqia de Seqüência

Os termos "idêntico" ou "percentual de identidade", no contexto de duas ou mais seqüências de ácido nucléico ou polipeptídeo, se referem a duas ou mais seqüências ou subsequências que são iguais ou têm um percentual especificado de resíduos de aminoáci- do ou nucleotídeos que são iguais, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, como medido usando um dos algoritmos de comparação de seqüência descrito abaixo (ou outros algoritmos disponíveis para pessoas versadas) ou através de inspeçãovisual.

A frase "substancialmente idêntico", no contexto de dois ácidos nucléicos ou poli- peptídeos (por exemplo, DNAs que codificam um O-tRNA ou O-RS1 ou a seqüência de ami- noácido de um O-RS) se refere a duas ou mais seqüências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 60%, cerca de 80%, cerca de 90-95%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais de identidade de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido, quando comparadas e alinha- das para correspondência máxima, quando medidas usando um algoritmo de comparação de seqüência ou inspeção visual. Tais seqüências "substancialmente idênticas" são tipica- mente consideradas serem "homólogas", sem referência à ascendência atual. Preferivel- mente, a "identidade substancial" existe sobre uma região das seqüências que é pelo menos cerca de 50 resíduos em comprimento, mais preferivelmente sobre uma região de pelo me- nos cerca de 100 resíduos, e mais preferivelmente, as seqüências são substancialmente idênticas sobre pelo menos cerca de 150 resíduos, ou sobre o tamanho natural das duas seqüências a serem comparadas.

As proteínas e/ou seqüências de proteína são "homólogas" quando elas são deri- vadas, naturalmente ou artificialmente, de uma seqüência de proteína ou proteína ancestral comum. Similarmente, os ácidos nucléicos e/ou seqüências de ácido nucléico são homólo- gos quando eles são derivados, naturalmente ou artificialmente, de uma seqüência de ácido nucléico ou ácido nucléico ancestral comum. Por exemplo, qualquer ácido nucléico de ocor- rência natural pode ser modificado por qualquer método de mutagênese disponível para incluir um ou mais códons seletores. Quando expressado, este ácido nucléico mutagenizado codifica um polipeptídeo que compreende um ou mais aminoácidos antinaturais. O processo de mutação pode, certamente, adicionalmente alterar um ou mais códons padrões, desse modo mudando um ou mais aminoácidos padrões na proteína mutante resultante também. A homologia é geralmente deduzida de similaridade de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ou proteínas (ou seqüências destes). A porcentagem precisa de similaridade entre as seqüências que são úteis ao estabelecer homologia varia com o ácido nucléico e proteína em questão, porém tão pouco quanto 25% de similaridade de seqüência são habitualmente usados para estabelecer homologia. Os níveis mais elevados de similaridade de seqüência, por exemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% ou mais, podem também ser usados para estabelecer homologia. Os métodos para determinar porcentagens de simi- laridade de seqüência (por exemplo, BLASTP e BLASTN usando parâmetros básicos) são descritos aqui e estão geralmente disponíveis.

Para determinação de homologia e comparação de seqüência, Tipicamente uma seqüência age como uma seqüência de referência para que as seqüências de teste sejam comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e referência são fornecidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo seqüência são designa- dos. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula o percentual de identida- de de seqüência para a sequência(s) de teste relativo à seqüência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.

O alinhamento ideal de seqüências para comparação pode ser conduzido, por e- xemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa para método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. E.U.A. 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou através de inspeção visual (veja geral- mente Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., suplementado em 2006).

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar percentual de iden- tidade de seqüência e similaridade de seqüência é o algoritmo de BLAST, que é descrito em Altschul e outro, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para realizar as análises de BLAST está publicamente disponibilizado pelo Centro Nacional para Informação de Biotec- nologia. Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de seqüência de classificação elevada (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na seqüência de questão, que ou se iguala ou satisfaz alguns escores T de limiar de valor positivo quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. T é refe- rido como o limiar de escore de palavra vizinha (Altschul e outros (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410). Estes word hits nas redondezas iniciais agem como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos os contendo. Os word hits são em seguida pro- longados em ambas as direções ao longo de cada seqüência até onde o escore de alinha- mento cumulativo possa ser aumentado. Os escores cumulativos são calculados usando, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de emparelhamento; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos em má combinação; sempre < 0). Para seqüências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos word hits em cada direção é inter- rompida quando: o escore de alinhamento cumulativo fica abaixo da quantidade X de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou a extremidade de qualquer seqüência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sen- sibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotí- deo) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, uma interrupção de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos. Para se- qüências de aminoácido, o programam o BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (veja Henikoff e Henikoff (1989) Proc. NatL Acad. Sei. E.U.A. 89:10915).

Além de calcular o percentual de identidade de seqüência, o algoritmo de BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (veja, por exemplo, Karlin e Altschul (1993), Proc. Nat'l. Acad. Sei. E.U.A. 90:5873-5787). Uma medi- ção de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N))1 que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreria por casualidade. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a menor probabilida- de de soma em uma comparação do ácido nucléico de teste com o ácido nucléico de refe- rência for menor do que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e preferivelmente menor do que cerca de 0,001.

Mutaqênese e Outras Técnicas de Biologia Molecular O polinucleotídeo e polipeptídeos da invenção e usados na invenção podem ser manipulados usando técnicas biológicas moleculares. Os textos gerais que descrevem téc- nicas biológicas moleculares incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techni- ques, Methods in Enzymology volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook e outro, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor La- boratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publi- shing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 2006). Estes textos descrevem mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados, por exemplo, com a geração de genes que inclui códons seletores para a pro- dução de proteínas que incluem aminoácidos antinaturais, tRNAs ortogonais, sintetases or- togonais, e pares destes.

Vários tipos de mutagênese são empregados na invenção, por exemplo, para mutar moléculas de tRNA, para produzir bibliotecas de tRNAs, para produzir bibliotecas de sinteta- ses, para inserir códons seletores que codificam um aminoácido antinatural em uma proteína ou polipeptídeo de interesse. Eles incluem, porém não estão limitados a mutagênese dire- cionada ao sítio, de ponto aleatório, recombinação homóloga, embaralhamento de DNA ou outros métodos de mutagênese recursiva, construção quiméricachimeric, mutagênese usan- do modelos contendo uracila, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, mutagênese de DNA modificado por fosforotiotato, mutagênese usando DNA dúplex intervalado ou similar, ou qualquer combinação destes. Os métodos adequados adicionais incluem reparo de mau emparelhamento de ponto, mutagênese usando filamentos hospedeiros de reparo deficien- te, mutagênese de deleção, seleção por restrição, e purificação por restrição, mutagênese por síntese de gene total, reparo de rompimento de filamento duplo, e similar. A mutagêne- se, por exemplo, que envolve construções quiméricas, é também incluída na presente in- venção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informação conhecida da molécula de ocorrência natural ou molécula de ocorrência natural alterada ou mutada, por exemplo, seqüência, comparações de seqüência, propriedades físicas, estrutura de cristal e similar.

As células hospedeiras são geneticamente construídas (por exemplo, transforma- das, transduzida ou transfectada) com os polinucleotídeos da invenção ou construções que incluem um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um vetor da invenção que pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões de codificação para o tRNA ortogonal, a sintetase de tRNA ortogonal, e a proteína a ser deriva- da são operavelmente ligadas aos elementos de controle de expressão de gene que são funcionais na célula hospedeira desejada. Os vetores típicos contêm terminadores de trans- crição e translação, seqüências de iniciação de transcrição e translação, e promotores úteis para o regulamento da expressão do ácido nuoléico alvo particular. Os vetores opcionalmen- te compreendem cassetes de expressão genéricos que contêm pelo menos uma seqüência terminadora independente, seqüências que permitem réplica do cassete em eucariotas, ou procariotas, ou ambos (por exemplo, vetores de transporte de ida e volta) e marcadores de seleção para ambos os sistemas procarióticos e eucarióticos. Os vetores são adequados para réplica e/ou integração em procariotas, eucariotas, ou preferivelmente ambos. Veja Giliman e Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, e outro, Nature, 328:731 (1987); Schneider e outro, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook e outro, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3â Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 2006).

Por exemplo, o vetor pode estar na forma de um plasmídeo, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu, ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores são introduzidos em célu- las e/ou microorganismos por métodos padrões incluindo eletroporação (From e outros (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 82, 5824), infecção através de vetores virais, penetra- ção balística de alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucléico ou dentro da matriz de contas ou partículas pequenas, ou na superfície (Klein e outros (1987), Nature 327:70-73), e/ou similar.

As bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem são conhecidos amplamente por alguém versado na técnica, e estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, veja a Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC; Manassas, VA) e The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1996) Gherna e outro (eds) publicado pela ATCC.

Os procedimentos básicos adicionais para seqüenciamento, clonagem e outros aspectos de biologia molecular e considerações teóricas subjacentes também são encontrados em Sam- brook e outro, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3- Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Har- bor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Gree- ne Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 2006), e em Watson e outros (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico rotulado, seja padrão ou não padrão) pode ser sob medida ou encomendado do padrão de qualquer de uma variedade de fontes comerciais, tal como a Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.

As células hospedeiras formadas podem ser cultivadas em meios nutrientes con- vencionais modificados quando apropriado para tais atividades como, por exemplo, avaliar etapas, ativar promotores ou selecionar transformantes. Estas células podem opcionalmen- te ser cultivadas em organismos transgênicos. Outras referências úteis, por exemplo, para isolamento e cultura de célula (por exemplo, para isolamento de ácido nucléico subseqüen- te) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, Terceira Edição, Wiley-Liss, Nova Iorque e as referências citadas aqui; Payne e outros (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, NY; Gam- borg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture] Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova Iorque) e Atlas e Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

PROTEÍNAS E POLIPEPTÍDEOS DE INTERESSE

Os métodos para produzir uma proteína em uma célula com um aminoácido antina- tural em uma posição especificada também são um aspecto da invenção. Por exemplo, um método inclui crescimento, em um meio apropriado, da célula, onde a célula compreende um ácido nucléico que compreende pelo menos um códon seletor e codifica uma proteína; e, fornecer o aminoácido antinatural; onde a célula também compreende: um ortogonal-tRNA (O-tRNA) que funciona na célula e reconhece o códon seletor; e, uma aminoacil-tRNA sinte- tase ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o aminoácido anti- natural. Uma proteína produzida por este método também é um aspecto da invenção.

Em certas modalidades, o O-RS compreende uma inclinação para a aminoacilação do O-tRNA cognato sobre qualquer tRNA endógeno em um sistema de expressão. A relação relativa entre O-tRNA e tRNA endógeno que é carregada pelo O-RS, quando o O-tRNA e O- RS estão presentes em concentrações molares iguais, é maior do que 1:1, preferivelmente pelo menos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente 10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente 50:1, ainda mais preferivelmente 75:1, ainda mais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 ou mais elevado.

A invenção também fornece composições que incluem proteínas, onde as proteínas compreendem um aminoácido antinatural. Em certas modalidades, a proteína compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 75% idêntica àquela de uma proteína tera- pêutica, uma proteína diagnostica, uma enzima industrial, ou parte destas.

As composições da invenção e composições feitas pelos métodos da invenção op- cionalmente estão em uma célula. Os pares de O-tRNA/O-RS ou componentes individuais da invenção podem em seguida ser usados na maquinaria de translação de um sistema hospedeiro, que resulta em um aminoácido antinatural sendo incorporado em uma proteína. As Publicações Internacionais Nos. WO 2004/094593, depositada em 16 de abril de 2004, intitulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE", e WO 2002/085923, intitula- do "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS", descrevem este proces- so, e estão aqui incorporadas por referência. Por exemplo, quando um par de O-tRNA/O-RS é introduzido em um hospedeiro, por exemplo, uma célula de roedor ou primata, o par induz a incorporação in vivo de um aminoácido antinatural (por exemplo, os aminoácidos antinatu- rais da FIG. 1) em uma proteína em resposta a um códon seletor. O aminoácido antinatural que é adicionado ao sistema pode ser um aminoácido sintético, tal como um derivado de uma fenilalanina ou tirosina que pode ser exogenamente adicionada ao meio de crescimen- to. Opcionalmente, as composições da presente invenção podem estar em um sistema de translação in vitro, ou em um sistema(s) in vivo.

Uma célula da invenção fornece a capacidade de sintetizar proteínas que compre- endem aminoácidos antinaturais em quantidades úteis grandes. Em alguns aspectos, a composição opcionalmente inclui, por exemplo, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas ou mais da proteína que compreende um aminoácido antinatural, ou uma quantidade que possa ser obtida com métodos de produção de proteína in vivo (detalhes em produção e purificação de proteína recombinante são fornecidos aqui). Em outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição em uma concen- tração de, por exemplo, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro, ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, por exemplo, um Iisado de célula, um tampão, um tampão farmacêutico, ou outra suspensão líquida (por exemplo, em um volume de, por exemplo, aproximadamente cerca de 1 nL a cerca de 100 L). A produção de quantidades grandes (por exemplo, maiores do que aquelas tipicamente possíveis com outros métodos, por exemplo, translação in vitro) de uma proteína em uma célula que inclui pelo menos um aminoácido antinatural é um aspecto da invenção.

A incorporação de um aminoácido antinatural pode ser feita, por exemplo, adaptan- do alterações na estrutura e/ou função de proteína, por exemplo, mudar tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação de hidrogênio, hidrofobicidade, acessibilidade de sítios alvos de protease, alvejar para uma fração (por exemplo, para uma disposição de proteína), incorpo- ração de rótulos ou grupos reativos, etc. As proteínas que incluem um aminoácido antinatu- ral podem ter propriedades catalíticas ou físicas realçadas ou mesmo completamente novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas por inclusão de um aminoácido antinatural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedades estrutu- rais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meia-vida (por exemplo, meia-vida de soro), capacidade de reagir com outras mo- léculas, por exemplo, covalentemente ou não covalentemente, e similar. As composições incluindo proteínas que incluem pelo menos um aminoácido antinatural são úteis para, por exemplo, novos terapêuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteí- nas de ligação (por exemplo, anticorpos), e, por exemplo, o estudo de estrutura e função de proteína. Veja, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Bioloqy, 4:645-652.

Em alguns aspectos da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um, por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais aminoácidos antinaturais. Os aminoácidos antinaturais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais aminoácidos antinaturais diferentes. Em outro aspecto, uma composição inclui uma proteína com pelo menos um, porém menos que todo, aminoácido particular presente na proteína é um amino- ácido antinatural. Para uma determinada proteína com mais do que um aminoácido antinatu- ral, os aminoácidos antinaturais podem ser idênticos ou diferentes (por exemplo, a proteína pode incluir dois ou mais tipos diferentes de aminoácidos antinaturais, ou pode incluir dois do mesmo aminoácido antinatural). Para uma determinada proteína com mais de dois ami- noácidos antinaturais, os aminoácidos antinaturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de um aminoácido antinatural múltiplo do mesmo tipo com pelo menos um ami- noácido antinatural diferente.

Essencialmente qualquer proteína (ou parte desta) que inclua um aminoácido anti- natural (e qualquer ácido nucléico de codificação correspondente, por exemplo, que inclua um ou mais códons seletores) pode ser produzida usando as composições e métodos desta. Nenhuma tentativa é feita para identificar as centenas de milhares de proteínas conhecidas, quaisquer das quais podem ser modificadas para incluir um ou mais aminoácidos antinatu- rais, por exemplo, adaptando qualquer método de mutação disponível para incluir um ou mais códons seletores apropriados em um sistema de translação relevante. Os repositores de seqüência comuns para proteínas conhecidas incluem GenBank EMBL, DDBJ e o NCBI. Outros repositores podem ser facilmente identificados por pesquisa na internet.

Tipicamente, as proteínas são, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% ou mais idênticas a qualquer proteína disponível (por exemplo, uma proteína terapêutica, uma proteína diagnostica, uma enzima industrial, ou parte destas, e similar), e elas compre- endem um ou mais aminoácidos antinaturais. Os exemplos de proteínas terapêuticas, diag- nósticas, e outras que podem ser modificadas para compreender um ou mais aminoácidos antinaturais podem ser encontrados, porém não limitados, àqueles nas Publicações Interna- cionais WO 2004/094593, depositada em 16 de abril de 2004, intitulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; e, WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPO- RATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS". Os exemplos de proteínas terapêuticas, diag- nosticas, e outras que podem ser modificadas para compreender um ou mais aminoácidos antinaturais incluem, porém não estão limitados, por exemplo, a hirudina, antitripsina Alfa-1, Angiostatina, fator Antiemolítico, anticorpos (outros detalhes sobre anticorpos são encontra- dos abaixo), Apolipoproteína, Apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeos atriais, quimiocinas C-X-C (por exemplo, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-A, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), Calcitonina, quimiocinas CC (por exemplo, proteína-1 quimioatraente de monócito, proteína-2 quimioatraente de monócito, proteína-3 quimioatraente de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína-1 beta inflamatória de monócito, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), ligando CD40, Ligando C-kit, Caspace, Colágeno, fator de estimulação de colônia (CSF), fator de complemento 5a, inibidor de complemento, receptor 1 de complemento, cito- cinas, (por exemplo, Peptídeo-78 de Ativação de Neutrófilo Epitelial, GROa/MGSA, GRO/?, GROy, ΜΙΡ-1σ, MIP-1<í, MCP-1), Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), Eritropoietina ("EPO"), toxinas esfoliantes AeB, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, Fator de Cresci- mento de Fibroblasto (FGF), Fibrinogênio, Fibronectina, G-CSF, GM-CSF, Glicocerebrosida- se, Gonadotropina, fatores de crescimento, proteínas de Ouriço (por exemplo, Sonic, Indian, Desert), Hemoglobina, Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), Hirudina, albumina de soro humano, Insulina, Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), interferons (por exemplo, IFN-σ, IFN-0, IFN-γ), interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, etc.), Fator de Crescimento de Ceratinócito (KGF), Laetofer- rina, fator inibidor de leucemia, Luciferase, Neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), on- costatina M, proteína osteogênica, hormônio paratiróide, PD-ECSF, PDGF, hormônios de peptídeo (por exemplo, Hormônio de Crescimento Humano), Pleiotropina, Procaspace-3, Procaspace-9, Proteína A, Proteína G, exotoxinas A, B, e C pirogênicas, Relaxina, Renina, SCF, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptores de interleucina solú- veis (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15), receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinase, superantígenos, isto é, enterotoxinas estafilo- cócicas (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), superóxido dismutase (SOD), toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-1), Timosina alfa 1, ativador de plasminogênio de teci- do, fator beta de necrose de tumor (TNF beta), receptor de fator de necrose de tumor (TN- FR), fator-alfa de necrose de tumor (TNF alfa), Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGEF), Urocinase e muitos outros. Uma classe de proteínas que podem ser feitas usando as composições e métodos para incorporação in vivo de aminoácidos antinaturais descritos aqui inclui moduladores transcricionais ou uma porção destes. Os moduladores transcricionais de exemplo incluem genes e proteínas de modulador transcricional que modulam o crescimento, diferenciação, regulamento de célula, ou similar. Os moduladores transcricionais são encontrados em pro- cariotas, vírus, e eucariotas, incluindo fungos, plantas, leveduras, insetos, e animais, incluin- do mamíferos, fornecendo uma ampla faixa de alvos terapêuticos. Será apreciado que os ativadores transcricionais e expressão regulem a transcrição por muitos mecanismos, por exemplo, ligando-se aos receptores, estimulando uma cascata de transdução de sinal, regu- lando a expressão de fatores de transcrição, ligando-se a promotores e realçadores, ligan- do-se às proteínas que se ligam aos promoteres e realçadores, desembralhando DNA, li- gando pré-mRNA, poliadenilando RNA, e degradando RNA.

Uma classe de proteínas da invenção (por exemplo, proteínas com um ou mais a- minoácidos antinaturais) inclui proteínas biologicamente ativas tais como hirudina, citocinas, moléculas inflamatórias, fatores de crescimento, seus receptores, e produtos de oncogene, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-8, etc.), interferonas, FGF, IGF-I1 IGF- II, FGF, PDGF, TNF, TGF-σ, TGF-yff, EGF, KGF1 SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, e hialurina/CD44; moléculas de transdução de sinal e produtos de oncogene correspondentes, por exemplo, Mos1 Ras1 Raf, e Met; e ativadores e supressores transcri- cionais, por exemplo, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb1 Rel1 e receptores de hormônio esterói- des tais como aqueles para estrogênio, progesterona, testosterona, aldosterona, o ligando de receptor de LDL e corticosterona.

As enzimas (por exemplo, enzimas industriais) ou porções destas com pelo menos um aminoácido antinatural são também fornecidas pela invenção. Os exemplos de enzimas incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, amidases, aminoácidos racemases, acilases, dealogenases, dioxigenases, diarilpropano peroxidases, epimerases, epóxido hi- drolases, esterases, isomerases, cinases, glicose isomerases, glicosidases, glicosil transfe- rases, haloperoxidases, monooxigenases (por exemplo, p450s), Iipases1 peroxidases de lignina, hidratases de nitrila, nitrilases, protease, fosfatases, subtilisinas, transaminase, e nucleases.

Muitas destas proteínas estão comercialmente disponíveis (Veja, por exemplo, lista de preço e catálogo the Sigma BioSciences 2002), e os genes e seqüências de proteína correspondentes e, tipicamente, muitas variantes destes, são bem conhecidas (veja, por exemplo, Genbank). Qualquer delas pode ser modificada pela inserção de um ou mais ami- noácidos antinaturais de acordo com a invenção, por exemplo, para alterar a proteína com respeito a uma ou mais propriedades terapêuticas, diagnosticas ou enzimáticas de interes- se. Os exemplos de propriedades terapeuticamente relevantes incluem meia-vida de soro, meia-vida de prateleira, estabilidade, imunogenicidade, atividade terapêutica, detectabilida- de (por exemplo, pela inclusão de grupos repórteres (por exemplo, rótulos ou sítios de liga- ção de rótulo) nos aminoácidos antinaturais), redução de LD50 ou outros efeitos colaterais, capacidade de entrar no corpo através do trato gástrico (por exemplo, disponibilidade oral), ou similar. Os exemplos de propriedades diagnosticas incluem meia-vida de prateleira, esta- bilidade, atividade diagnostica, detectabilidade e similar. Os exemplos de propriedades en- zimáticas relevantes incluem meia-vida de prateleira, estabilidade, atividade enzimática, ca- pacidade de produção, ou similar.

Uma variedade de outras proteínas também pode ser modificada para incluir um ou mais aminoácidos antinaturais usando composições e métodos da invenção. Por exemplo, a invenção pode incluir substituir um ou mais aminoácidos antinaturais em uma ou mais prote- ínas de vacina com um aminoácido antinatural, por exemplo, em proteínas de fungos infec- ciosos, por exemplo, Aspergillus, espécies de Candida; bactérias, particularmente E. coli que serve como um modelo para bactérias patogênicas, bem como bactérias medicinalmente importantes tais como Estafilococos (por exemplo, aureus), ou Estreptococo (por exemplo, pneumoniae); protozoários tais como esporozoário Cpor exemplo, Plasmodia), rhizopods (por exemplo, Entamoeba) e flagela (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); vírus tais como vírus de RNA(+) (os exemplos incluem Poxviruses, por exemplo, vacínia; Picornaviruses, por exemplo, pólio; Togavírus, por exemplo, rubéola; Flavivírus, por exem- plo, HCV; e Coronavírus), vírus de RNA(-) (por exemplo, Rabdovírus, por exemplo, VSV; Paramixovimses, por exemplo, RSV; Ortomixovimses, por exemplo, gripe; Buniavírus; e A- renavírus), vírus de dsDNA (Reoviruses, por exemplo), vírus de RNA para DNA, isto é, Re- trovírus, por exemplo, HIV e HTLV, e certos vírus de DNA para RNA tais como Hepatite B.

As proteínas agricolamente relacionadas tais como proteínas de resistência a inseto (por exemplo, as proteínas Cry), enzimas de produção de amido e lipídeo, toxinas de inseto e planta, proteínas de resistência a toxina, proteínas de desintoxicação de micotoxina, enzi- mas de crescimento de planta (por exemplo, Ribulose 1,5-Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase, "RUBISCO"), Iipoxigenase (LOX), e Fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase também são alvos adequados para modificação de aminoácido antinatural.

Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou parte destes) nos métodos e/ou composições da invenção são codificados por um ácido nucléico. Tipica- mente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos, dois có- dons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.

Os genes que codificam para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser mutagenizados usando métodos bem conhecidos por alguém de experiência na técnica e descritos aqui em "Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques" para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido antinatural. Por exemplo, um ácido nucléico para uma proteína de interesse é mutagenizada para incluir um ou mais códons seletores, fornecendo a inserção do um ou mais aminoácidos antinatu- rais. A invenção inclui qualquer tal variante, por exemplo, mutante, versões de qualquer pro- teína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido antinatural. Similarmente, a inven- ção também inclui ácidos nucléicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucléico com um ou mais códons seletores que codificam um ou mais aminoácidos antinaturais.

Para fabricar uma proteína que inclui um aminoácido antinatural, alguém pode usar células hospedeiras e organismos que são adaptados para a incorporação in vivo do amino- ácido antinatural por pares de tRNA/RS ortogonal. As células hospedeiras são geneticamen- te formadas (por exemplo, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com um ou mais vetores que expressam o tRNA ortogonal, a sintetase tRNA ortogonal, e um vetor que codifi- ca a proteína a ser derivada. Cada um destes componentes pode estar no mesmo vetor, ou cada pode estar em um vetor separado, ou dois componentes podem estar em um vetor e o terceiro componente em um segundo vetor. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu, ou um polinucleotídeo conju- gado.

Definição de Polipeptídeos por Imunorreatividade

Porque os polipeptídeos da invenção fornecem uma variedade de novas seqüên- cias de polipeptídeo (por exemplo, polipeptídeos compreendendo aminoácidos antinaturais no caso de proteínas sintetizadas nos sistemas de translação nesta, ou, por exemplo, no caso das novas sintetases, novas seqüências de aminoácidos padrões), os polipeptídeos também fornecem novos aspectos estruturais que podem ser reconhecidos, por exemplo, em ensaios imunológicos. A geração de anti-soros, que especificamente ligam os polipeptí- deos da invenção, bem como os polipeptídeos que são ligados por tais anti-soros, é um as- pecto da invenção. O termo "anticorpo," como usado aqui, inclui, porém não está limitado a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou fragmentos destes que especificamente ligam e reconhecem um anali- sado (antígeno). Os exemplos incluem anticorpos de cadeia policlonal, monoclonal, quiméri- ca, e única, e similar. Os fragmentos de imunoglobulínas, incluindo os fragmentos de Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão, incluindo exibição de fago, também estão incluídos no termo "anticorpo" como usado aqui. Veja, por exemplo,Paul, Fundamen- tal Immunoloqv. 4- Ed., 1999, Raven Press, Nova Iorque, para terminologia e estrutura de anticorpo.

Para produzir anti-soros para uso em um imunoensaios, um ou mais dos polipeptí- deos imunogênicos são produzidos e purificados como descrito aqui. Por exemplo, a proteí- na recombinante pode ser produzida em uma célula recombinante. Um filamento congênito de camundongos (empregado neste ensaio porque os resultados são mais reproduzíveis devido à identidade genética virtual dos camundongos) é imunizado com a proteína(s) imu- nogênica em combinação com um adjuvante padrão, tal como o adjuvante de Freund, e um protocolo de imunização de camundongo padrão (veja, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies. A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque, para uma descrição padrão de geração de anticorpo, formatos de imunoensaio e condições que po- dem ser usadas para determinar imunorreatividade específica. Detalhes adicionais em pro- teínas, anticorpos, anti-soros, etc. podem ser encontrados Publicações Internacionais Nos. WO 2004/094593, intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"; WO 2004/035605, intitulado "GLYCOPROTEIN SYNTHESIS;" e WO 2004/058946, intitulado "PROTEIN ARRAYS".

USO DE O-tRNA E O-RS E PARES de O-tRNA/O-RS

As composições da invenção e composições feitas opcionalmente pelos métodos da invenção estão em uma célula. Os pares de O-tRNA/O-RS ou componentes individuais da invenção podem ser então usados na maquinaria de translação de um sistema de hos- pedeiro, que resulta em um aminoácido antinatural sendo incorporado em uma proteína. Publicação Internacional No. WO 2002/085923 por Schultz, e outro, intitulado "IN VIVO IN- CORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS", descreve este processo e está incorpo- rado aqui por referência. Por exemplo, quando um par de O-tRNA/O-RS é introduzido em um hospedeiro, por exemplo, Escherichia coli ou levedura, o par induz à incorporação in vivo de um aminoácido antinatural, que pode ser exogenamente adicionada ao meio de cresci- mento, em uma proteína, por exemplo, uma proteína de teste de mioglobina ou uma proteí- na terapêutica, em resposta a um códon seletor, por exemplo, um códon de não sentido âmbar. Opcionalmente, as composições da invenção podem estar dentro de um em sistema de translação iri vitro, ou em um sistema celular in vivo. As proteínas com o aminoácido an- tinatural podem ser usadas em qualquer de uma ampla faixa de aplicações. Por exemplo, a fração antinatural incorporada em uma proteína pode servir como um alvo para qualquer de uma ampla faixa de modificações, por exemplo, reticulação com outras proteínas, com mo- léculas pequenas tais como rótulos ou tinturas e/ou biomoléculas. Com estas modificações, a incorporação do aminoácido antinatural pode resultar em proteínas terapêuticas melhora- das e pode ser usada para alterar ou melhorar a função catalítica das enzimas. Em alguns aspectos, a incorporação e modificação subseqüente de um aminoácido antinatural em uma proteína pode facilitar os estudos em estrutura de proteína, interações com outras proteínas, e similares. KITS

Os kits também são um aspecto da invenção. Por exemplo, um kit para produzir uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido antinatural em uma célula de roedor ou primata é fornecido, onde o kit inclui pelo menos um recipiente que contém uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um O-tRNA, e/ou uma seqüência de polinucleotí- deo que codifica um O-RS, e/ou um polipeptídeo de O-RS. Em uma modalidade, o kit inclui também aminoácido antinatural. Em outras modalidades, o kit também compreende materi- ais instrutivos por produzir a proteína que compreende o aminoácido antinatural.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, porém não limitar a invenção reivindicada. Alguém de experiência reconhecerá uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados sem afastar-se do escopo da invenção reivindicada. É compreen- dido que os exemplos e modalidades descritos aqui sejam para propósitos ilustrativos so- mente e aquelas várias modificações ou mudanças devido a isto serão sugeridas por pes- soas versadas na técnica e serão incluídas dentro do espírito e extensão deste pedido e escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1

Limitações Técnicas de Supressão de Não Sentido em Células de Mamíferos por Componentes de Translacão de Não Mamífero

Uma estratégia para geneticamente codificar aminoácidos antinaturais em células de mamífero seria adaptar os pares de tRNA/aaRS mutantes existentes que foram gerados em sistemas hospedeiros de Escherichia eoli ou Saccharomyees eerevisiae. Porque os ele- mentos de identidade de tRNATyr em E. eoli, que inclui o braço variável e par de base G1:C72 no tronco aceptor, são distintos daqueles em células de mamíferos (Wang e Schultz (2004), "Expanding the genetic code," Angew Chem Int Ed Engl 44:34-66; e Bonnefond e outros (2005), "Evolution of the tRNA(Tyr)/TyrRS aminoacylation systems," Biochimie 87:873-883), os pares de tRNA/aaRS que foram empregados em bactérias são infelizmente não prováveis serem ortogonais em células eucarióticas. Em contraste, tRNAs em S. eerevi- siae e células de mamífero são processados similarmente e têm os mesmos elementos de identidade (Bonnefond e outro (2005), "Evolution of the tRNA(Tyr)/TyrRS aminoacylation systems," Bioehimie 87:873-883). Além disso, porque a maquinaria translacional de S. eere- visiae também é homóloga àquela de eucariotas mais elevados, é possível que alguém pos- sa transferir um par de tRNA/aaRS ortogonal modificado evoluído em S. eerevisiae em célu- las de mamífero. Realmente, Yokoyama e colaboradores usaram uma variante de EcTyrRS que foi evoluída em S. eerevisiae para aceitar p-benzoil-L-fenilalanina (pBpa) para incorporar este aminoácido fotorreativo em proteína de Grb2 humana em células CHO (Hino e outro (2005), "Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid, "Nat Methods 2, 201-206). Infelizmente, tRNAde E. coli fun- cionalmente ativo não expressa bem em células de mamífero, gravemente limitando os pro- dutos de proteína mutante (Sakamoto e outro (2002) "Site-specific incorporation of an unna- tural amino acid into proteins in mammalian cells, "Nucleic Acids Res 30:4692-4699).

EXEMPLO 2

Criação de Novos Sistemas de Supressão de Não Sentido em Células de Mamífero Para superar as limitações em expressão de tRNA ortogonal descrito acima, a pre- sente invenção fornece um sistema geral que permite a transferência de pares de tR- NA/aaRS supressores mutantes evoluídos em levedura serem usados em células de mamí- fero. Este método e os novos sistemas ortogonais são demonstrados aqui eficazmente in- troduzir vários aminoácidos antinaturais em proteína fluorescente verde (GFP) em ambas as células hospedeiras CHO de roedor e células 293T de primata (humano). Embora estes dois tipos de célula sejam usados experimentalmente, a invenção é amplamente aplicável em células hospedeiras de mamífero de diversas espécies.

CRIAÇÃO DE UM SISTEMA DE SUPRESSÃO SEM SENTIDO DE MAMÍFERO

Os tRNAs em eucariotas são transcritos através de RNA polimerase Ill que reco- nhece dois elementos de controle transcricionais intragênicos conservados, isto é, as caixas AeB (Sprague, Transcription of Eukaryotic tRNA Genes, AMS Press, Washington, DC; 1994). tRNATyr de E. coli somente tem um elemento de caixa B, e foi mostrado que a intro- dução de uma pseudo-caixa A resulta em um tRNA não funcional que não é reconhecida por EcTyrRS (Sakamoto e outro, "Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into pro- teins in mammalian cells," Nucleic Acids Res 30:4692-4699 (2002)). tRNATyr de E. coli dife- rente, o tRNATyr de Bacilo stearothermophilus (que tem elementos de identidade similares e ainda é carregado por EcTyrRS; Bedouelle, "Recognition of tRNA(Tyr) by tyrosyl-tRNA syn- thetase," Biochimie 72, 589-598 (1990)) tem caixas AeB internas de ocorrência natural. Desse modo, este tRNA junto com EcTyrRS são capazes de funcionar como um par de tR- NA/aaRS ortogonal em células de mamífero (Sakamoto e outro (2002), "Site-specific incor- poration of an unnatural amino acid irito proteins in mammalian cells," Nucleic Acids Res 30:4692-4699).

Construção e Expresson de um tRNA Ortogonal Supressor Âmbar

Para proporcionar um SstRNA t^ja supressor âmbar, o anticódon de trinucleotídeo de SstRNATyr foi alterado para C(34)UA. Uma vez que G34 de tRNATyr procariótico é somen- te um elemento de identidade fraco de TyrRS (Hou e Schimmel (1989), "Modeling with in vitro kinetic parameters for the elaboration of transfer RNA identity in vivo, "Biochemistry 35 28:4942-4947), o mutante G34C não afetaria significantemente a ligação de EcTyrRS a Bs- tRNA TyrCUA . Além disso, a supressão âmbar de não sentido deveria ser mais bem tolerada em células de mamífero do que a supressão opala ou ocre devido ocorrência inferior do códon de interrupção TAG em genomas de mamífero (TAG, 23%; TAA1 30%; TGA1 47% em Homo sapiens). Uma vez que a expressão do gene de SstRNA^ em eucariotas também depen- de da seqüência de flanqueamento 5', a seqüência de flanqueamento 5' de tRNATyr humano foi adicionado a SsfRNA^ para realçar sua transcrição em células de mamífero. Para também aumentar a transcrição de SstRNA^, um cluster de gene contendo três repeti- ções tandem do gene de SstRNA^ foi construído e seu cluster de gene foi inserido no plasmídeo pUC18 para proporcionar pUC18-3SstRNA^. A análise de mancha do norte de tRNAs totais isolados de células CHO transfectadas com pUCie-SfístRNA^ mostrou um nível duas vezes mais elevado de SstRNA^ do que as células transfectadas com um plasmídeo pUC18 contendo somente uma cópia de SstRNA

Expressão de uma Sintetase Ortoqonal

Em seguida, o gene de EcTyrRS tipo selvagem foi inserido no pcDNA4/TO/myc-His A de vetor de expressão de mamífero para proporcionar pcDNA4-EcTyrRS no qual a ex- pressão é controlada por um promotor de CMV regulado por tetraciclina (Tet). O uso de uma expressão induzível foi pretendido reduzir a toxicidade possível devido a expressão heteróloga de EcTyrRS em células de mamífero.

Demonstração de um Par de EeTyrRS/SstRNA 1^Jja Ortoqonal Funcional

A capacidade do par de SstRNA ψυΑ /EcTyrRS supressor resultante para eficiente- mente suprimir uma mutação de códon âmbar na posição Y37 de proteína fluorescente ver- de de proteína modelo, GFP (GFP37TAG) foi avaliada em células de mamífero. Porque Y37 fica localizado na superfície de GFP e distai do fluoroforo, a introdução de um aminoácido antinatural nesta posição não é esperada afetar as propriedades fluorescentes e de dobra da proteína (Ormo e outro (1996), "Crystal structure of the Aequorea victoria green fluores- cent protein," Science 273:1392-1395). Além disso, a supressão ambarina de GFP37TAG resulta na expressão de GFP tamanho natural, fornecendo um ensaio qualitativo rápido de eficiência de supressão ambarina. 0 gene GFP37TAG mutante foi inserido em pcD- NA4/TO/myc-His A para proporcionar pcDNA4-GFP37TAG no qual GFP é fundido a myc e epítopos 6xHis no terminal de C e sob o controle de um promotor Tet-regulado.

A capacidade do par de SstRNA %A /EeTyrRS suprimir o códon ambarino de não sentido de GFP37TAG foi examinada em ambas células 293 humanas e CHO de roedor de Invitrogen™ T-REx™. Ambas as linhagens de célula constitutivamente expressam o repres- sor de tetraciclina e são adequados para expressão Tet-regulada de proteínas que usam o plasmídeo de pcDNA4/TO/myc-His A. As células foram desenvolvidas para 80-90% de con- fluência (as células CHO Invitrogen™ T-REx™ foram desenvolvidas em meios F12 contendo 10% de FBS, 1% de Pen-Strep, 2 mM de L-glutamina, e 10 μθΛηΙ de blasticidina; as células 293 de Invitrogen™ T-REx™ foram desenvolvidas em DMEM contendo 10% de FBS, 1% de Pen-Strep, 2 mM de L-glutamina, e 5 μg/ml de blasticidina) e transitoriamente transfectadas com 3 μg de plasmideos por 2x10® células usando FuGENE® 6 de Roche Applied Science (0,5 μg de pUC18-3SstRNA^, 0,5 μg de pcDNA4-EcTyrRS, e 2 μ9 de pcDNA4- GFP37TAG; pUC18-3SstRNA^ ou pcDNA4-EeTyrRS foi substituído com a mesma quan- tidade de pUC18 quando eles não estão presentes). A expressão de proteína foi induzida pela adição de 1 //g/ml de tetraciclina seis horas após a transfecção, e as células foram de- senvolvidas a 37°C durante dois dias. Em ambas as linhagens celulares, a expressão de GFP de tamanho natural é dependente da presença de ambos os genes SstRNA^ e EeT- yrRS (veja, FIGS. 13A e 13B). Quando transfectadas com pcDNA4-GFP37TAG e pcDNA4- EcTyrRS ou pUC18-3fístRNA^ sozinhos, as células não exibem fluorescência verde. Es- tes experimentos demonstram que BstRNA^4 é carregado somente por EcTyrRS e que par de BstRNA/EcTyrRS pode funcionar eficientemente para suprimir um códon ambari- no de não sentido em células de primata e células de roedores. EXEMPLO 3

Demonstração de Universalidade de Sistema usando Seis Aminoácidos Antinatu- rais

A generalidade deste sistema ortogonal foi determinada. Neste sistema de teste, a capacidade de SstRNA^ e seis variantes de EeTyrRS para incorporar uma variedade de

aminácidos não naturais correspondentes em GFP37TAG em ambas as linhagens de célula CHO e 293 de Invitrogen™ T-REx™ foi determinada. As seis variantes de EcTyrRS foram previamente evoluídas em S. cerevisiae para codificar os seguintes aminoácidos antinatu- rais:

p-metóxi-L-fenilalanina (pMpa)

p-acetil-L-fenilalanina (o papai)

p-benzoil-L-fenilalanina (pBpa)

p-iodo-L-fenilalanina (pipa)

p-azido-L-fenilalanina (pAzpa)

p-propargiloxifenilalanina (pPpa)

As estruturas destes aminoácidos antinaturais são mostradas na FIG. 1; estruturas 1 até 6. A seleção e isolamento das variantes de sintetase são descritos em, por exemplo, Chin e outros (2003), "An expanded eukaryotic genetic code," Science 301:964-967; Deiters e outros (2003), "Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccha- romyces cerevisiae," J Am Chem Soc 125:11782-11783; WO 2005/003294 por Deiters e outro, "UNNATURAL REACTIVE AMINO ACID GENETIC CODE ADDITIONS", depositado em 16 de abril de 2004; e WO 2006/034410 por Deiters e outro, "ADDING PHOTO- REGULATED AMINO ACIDS TO THE GENETIC CODE," depositado em 21 de setembro de 2005.

Cada um dos seis genes de EcTyrRS foi inserido em pcDNA4/TO/myc-His A para proporcionar um derivado de pcDNA4-EcTyrRS, e expressão do aaRS em T-REx. As células CHO e 293 foram verificadas por análise de mancha do oeste (FIG. 14). Todas as seis vari- antes de EcTyrRS mostram níveis de expressão similares em ambos as linhagens de célula 293 de T-REx™ e CHO de T-REx™.

A capacidade das seis variantes de EcTyrRS junto com BstRNATyrCUA suprimir o có- don ambarino em GFP37TAG foi então testada na presença e ausência de aminoácidos antinaturais no meio de desenvolvimento. A transfecção transitória de células com plasmí- deos foi realizada como descrito para EcTyrRS tipo selvagem. Seis horas após a transfec- ção, os meios foram substituídos pelos meios frescos que contêm 1 µg/ml de tetraciclina e suplementados com o aminoácido antinatural correspondente (pMpa, 10 mM; pApa, 10 mM; pBpa, 1 mM; pipa, 8 mM; pAzpa, 5 mM; ou pPpa, 1 mM). As células foram então desenvol- vidas 24 horas para linhagem de célula CHO de T-REx™ e 48 horas para linhagem de célula 293 de T-REx™ antes da colheita. Em ambas as células CHO e 293 de T-REx™, a expres- são de GFP37TAG de tamanho natural foi dependente da presença de aminoácidos antina- turais nos meios de crescimento como indicado na FIG. 2 e FIG. 3. Na ausência de aminoá- cidos antinaturais, nenhuma expressão de GFP (<1%) foi detectada, indicando que as vari- antes de EcTyrRS especificamente carregam BstRNA^ com seus aminoácidos antinatu- rais cognatos com fidelidade elevada. Um nível de expressão baixo de GFP que contém pipa foi observado em células CHO de T-REx™ e nenhuma expressão de GFP que contêm pipa foi detectada em células 293T-REx™, possivelmente devido à toxicidade celular de pipa (na presença de 8mM de pipa, as células 293 T-Rex™ morreram em 6 horas).

EXEMPLO 4

Sistema de Expressão de Plasmídeo Melhorado para a Expressão de Componen- tes Ortogonais para Incorporar p-Metóxi-L-fenilalanina

Por que a expressão heteróloga de p-metóxi-L-fenilalanina-tRNA sintetase (pM- paRS) não mostra qualquer toxicidade celular aparente sob as condições de desenvolvimen- to usada, o plasmídeo contendo o gene de pMpaRS foi modificado para codificar (a) três repetições tandem do gene de BstRNATyrCUA, e (b) o gene de pMpaRS (pSWAN-pMpaRS na FIG. 4A).

O gene de pMpaRS foi inserido diretamente após o promotor de CMV não regulado para expressão eficiente e contínua de pMpaRS. Outro plasmídeo (pSWAN-GFP37TAG na FIG. 4B) contendo ambas três repetições tandem do gene de SstRNA^ e do gene de

GFP37TAG também foi construído. O gene que codifica GFP37TAG foi inserido após um promotor de CMV Tet-regulado para minimizar leitura potencial - através do códon ambarino de não sentido causado por supressão ambarina endógena em células de mamífero. Estes dois plasmídeos foram então analisados quanto à sua eficiência de supressão. Por que am- bos plasmídeos contêm três repetições tandem do gene de SstRNA^ , a variação da rela- ção dos dois plasmídeos para aumentar o nível de supressão não é esperado alterar a quantidade total do gene de BstRNA^ transfectado nas células. Sob condições de trans- fecção otimizadas (0,5 μg de pSWAN-pMpaRS e 2,5 μg de pSWAN-GFP37TAG por 2 χ 106 células), o nível de supressão é fortemente duas vezes mais elevado do que aquele usando os três plasmídeos pUCie-SBstRNA^, pcDNA4-pMpaRS, e pcDNA4-GFP37TAG (o nível de supressão foi determinado pelo número de células fluorescentes). As células foram de- senvolvidas durante 1-2 dias após indução e mantidas viáveis antes da colheita. O produto de GFP mutante que contém pMpa (GFP-pMpa) também foi quantificado. Na presença de 10 mM de pMpa no meio de crescimento, 1 //g de GFP mutante pode ser obtido de 2 χ 107 de células CHO de T-REx™ adesiva.

EXEMPLO 5

Espectroscopia de Massa e Análise da Fidelidade

Para também caracterizar GFP-pMpa, a proteína de mutante foi expressa em célu- las CHO de T-REx™ transitoriamente transfectadas com pSWAN-pMpaRS e pSWAN- GFP37TAG. A proteína foi purificada usando uma coluna de agarose de anticorpo anti-myc e em seguida separada por és de SDS-PAGE. A banda de GFP-pMpa do gel de SDS-PAGE foi digerido com tripsina e analisado por cromatografia líquida de fase reversa de nanoesca- la/espectrometria de massa/espectrometria de massa (nano-RP LC/MS/MS). Em paralelo, GFP tipo selvagem foi purificado de células transfectadas com pcDNA4-GFP e submetido à mesma análise.

Os espectros de massa tandem dos fragmentos contendo Y37 tríptico:

FSVSGEGEGDATY*GK (veja FIG. 5 e SEQ ID NO: 103)

onde Y* significa tirosina ou pMpa) da proteína mutante revela picos de pMpa in- tensos, indicando incorporação eficiente de pMpa (veja FIG. 6 e FIG. 7). Os íons contendo Y* (y3 a y14) todos têm um desvio de massa de 14 Da em comparação a GFP tipo selvagem, que combina exatamente a diferença de massa entre tirosina e pMpa. O desvio de massa de séries de íon y junto com a observação de um desvio de massa idêntico do íon bi3 na FIG. 7 não ambiguamente designa o sítio de incorporação de pMpa para posição 37 de GFP. As relações dos picos de MS de peptídeos contendo pMpa para aqueles de peptí- deos contendo tirosina também foram obtidas. A integração dos cromatogramas de íon úni- co dos íons precursores de:

FSVSGEGEGDATY*GK (veja FIG. 5 e SEQ ID NO: 103) sugere alta fidelidade para incorporação de pMpa (> 99,9%). Uma estimativa com base em monitoramento dos três íons de fragmento mais abundante (yg, yn, e yi2) nos da- dos de MS do tandem sugere uma pureza ainda maior (99,93%). Para adquirir as massas da proteína origem, a proteína mutante purificada por coluna de anticorpo anti-myc foi submeti- da à análise com ESI TOF-MS. A massa teórica da proteína mutante acetilada que perde a metionina de terminal de N é 29.696,00 Da, que está em boa concordância com o compo- nente principal de 29.696,0 Da observado no espectro de ESI TOF-MS desconvoluto de es- tado carregado na FIG. 8. Um aspecto menor em 29.654,0 Da é designado para a massa de acetilação de terminal de N em falta de GFP-pMpa. Nenhum sinal ou sinais de GFP tipo sel- vagem indicando incorporação de pMpas múltiplos foram detectados. Este resultado tam- bém confirma a incorporação seletiva de pMpa na posição 37 de GFP.

EXEMPLO 6

Sistemas de Expressão de Plasmídeo Melhorados para a Expressão de Compo- nentes Ortoqonais que Incorporam pApa, pBpa, pipa. pAzpa e pPpa

Os plasmídeos foram reconstruídos para proporcionar outros sistemas de dois plasmídeos variantes de pSWAN-EcTyrRS por subclonagem dos genes que codificam as várias variantes de sintetase. Estas variantes de sintetase foram como segue: p-acetil-L-fenilalanina-tRNA sintetase (pApaRS) p-benzoil-L-fenilalanina-tRNA sintetase (pBpaRS) p-iodo-L-fenilalanina-tRNA sintetase (plpaRS) p-azido-L-fenilalanina-tRNA sintetase (pAzpaRS) p-propargiloxifenilalanina-tRNA sintetase (pPpaRS)

A transfecção transitória de células CHO e 293 de T-REx™ com as variantes pS- WAN-EcTyrRS e pSWAN-GFP37TAG (0,5 μg de variante pSWAN-EcTyrRS e 2,5 μς de pSWAN-GFP37TAG por 2 χ 106 células) todas proporcionaram níveis de supressão duas vezes fortemente mais elevados do que para os três plasmídeos pUC18-3SstRNA^ , vari- ante de pcDNA4-EcTyrRS, e pcDNA4-GFP37TAG (com a exceção da variante específica de pipa). GFPs mutantes contendo pApa, pBpa, pAzpa ou pPpa também foram expressados em células CHO de T-REx™ transfectadas com as variantes de pSWAN-GFP37TAG e pS- WAN-EcTyrRS e desenvolvidos em meios contendo o aminoácido antinatural corresponden- te (pApa, 10 mM; pBpa, 1 mM; pAzpa, 5 mM; ou pPpa, 1 mM) durante 1-2 dias, e purificados usando uma coluna de anticorpo anti-myc. Os produtos das proteínas mutantes contendo pApa e pAzpa ficaram próximos daqueles para pMpa (~1 por 2 χ 107 células), e os produ- tos de proteínas de mutante que contêm pBpa e pPpa ficaram um pouco abaixo (-0,7 μg por 2 χ 107 células). Porque os níveis de expressão de variantes de EcTyrRS em células CHO de T-REx™ são similares, o produto inferior das proteínas mutantes contendo pBpa e pPpa pode ser devido às baixas concentrações de aminoácidos antinaturais nos meios.

As proteínas de GFP mutantes também foram submetidas à análise com nano-RP

LC/MS/MS para obter MS tandem dos fragmentos trípticos de:

FSVSGEGEGDATY*GK (FIG. 5 e SEQ ID NO: 103).

Os dados de MS tandem (FIGS. 9-12) claramente mostraram a incorporação dos aminoácidos antinaturais na posição 37 de GFP. O GFP mutante que contém pAzpa foi so- mente fracamente detectável. Um olhar mais íntimo aos dados revelou a presença do pep- tídeo contendo p-aminofenilalanina (pAmpa) ao contrário (FIG. 15), o que não é surpreen- dente considerando a reatividade química e a foto-instabilidade do grupo azido (pAmpa foi previamente observado a partir da análise de MS de peptídeos contendo pAzpa; Chin e ou- tros (2003), "Progress toward an expanded eukaryotic genetic code," Chem Biol 10, 511- 519). Uma quantidade de traço do peptídeo de tipo selvagem na amostra de pBpa foi identi- ficada, porém os sinais foram muito fracos para quantitação precisa da relação de pB- pa/tirosina. Nenhum sinal de tipo selvagem pôde ser detectado nas amostras de pApa, pAz- pa, e pPpa. Os dados de todas as cinco proteínas mutantes indicam a alta seletividade e fidelidade da incorporação de aminoácidos antinaturais.

EXEMPLO 7

Descrição/Conclusões

No genoma mamífero, a ocorrência de códons de interrupção ambarinos é mais alta (23% em humanos), em comparação com E. coli (7%). Portanto, a supressão ambarina po- deria ser tóxica para células se proteínas essenciais não fossem terminadas corretamente. Yokoyama e colaboradores mostraram que a expressão induzível do mutante EcTyrRS que carrega seu tRNA cognato com 3-iodo-L-tirosina minimiza possível toxicidade celular que resulta de incorporação de base de tirosina endógena pelo aaRS mutante na ausência de 3- iodo-L-tirosina. A presente invenção descrita aqui fornece uma solução para este problema. Todas as variantes de EcTyrRS foram previamente evoluídas de um esquema de seleção positiva/negativa de duas etapas em S. cerevisiae, que remove variantes de aaRS que in- corporam aminoácidos endógenos. A co-transfecção de células com uma variante de pS- WAN-EcTyrRS e pSWAN-GFP37TAG não levou a read-through observável do códon amba- rino de não sentido em GFP37TAG na ausência de aminoácidos antinaturais, sugerindo que os pares de tRNA/aaRS não suprimem eficazmente os códons de interrupção TAG naturais na ausência de aminoácidos antinaturais. As linhagens de célula estavelmente expressam tRNA e as proteínas de aaRS deveriam ser portanto viáveis na ausência de aminoácidos antinaturais. Uma vez que não há nenhuma supressão ambarina endógena observada, a expressão da proteína alvo contendo os aminoácidos antinaturais também não requer indu- ção. A criação de linhagens de célula estáveis reveste mantendo o tRNA, aaRS, e genes de proteína alvo permitirá a produção eficiente da proteína alvo que contém o aminoácido anti- natural quando as células são suplementadas com o aminoácido antinatural. Nos experi- mentos de prova de princípio presentemente descritos, as células de mamífero hospedeiras sobreviveram três dias após a adição de aminoácidos antinaturais, o que é provavelmente suficiente para expressão de proteína recombinante.

Estes estudos foram prosperamente prolongados para outros aminoácidos antinatu- rais, incluindo 1,5-danislalanina, o-nitrobenzilcisteína e ácido σ-aminocaprílico. Não é pre- tendido que a invenção seja limitada às linhagens de célula ou aminoácidos antinaturais descritos aqui.

EXEMPLO 8

Seqüências de Proteína Foto-requladas em Células de Mamífero

Em algumas modalidades dos sistemas e métodos de translação reivindicados, o aminoácido antinatural é um aminoácido foto-regulado, tal como o-nitrobenzilserina, o- nitrobenzilcisteína, ácido σ-aminocaprílico, e similar. Os aminoácidos foto-regulados (por exemplo, fotocrômico, fotoclivável, fotoisomerizável, etc.) podem ser usados para especial- mente e temporalmente controlar uma variedade de processos biológicos, por exemplo, dire- tamente regulando-se a atividade das enzimas, receptores, canais de íons ou similares, ou modulando-se as concentrações intracelulares de várias moléculas de sinalização. Veja, por exemplo, Shigeri e outro, Pharmacol. Therapeut., 2001, 91:85+; Curley, e outro, Pharmacol. Therapeut., 1999, 82:347+; Curley, e outro, Curr. Op. Chem. Bio., 1999, 3:84+; "Caged Compounds" Methods in Enzymoloqy. Marriott, G., Ed1 Academic Press, NY, 1998, V. 291; Adams, e outro, Annu. Rev. Physiol., 1993, 55:755+; and Bochet, e outro, J. Chem. Soc., Perkin 1, 2002, 125+.

Para aumentar o nível de transcrição de tRNA de supressor ambarino derivado de tRNALeu de E. coli, o tRNA supressor foi posto sob controle de seqüência de flanqueamento 5' e 3' de tRNAMet de iniciador humano. O tRNA supressor Ambarino transcrito acima junto com uma leucil-tRNA sintetase de E. coli mutante específico para o-nitrobenzilcisteína foi usado para incorporar especificamente no sítio este aminoácido antinatural em um sítio ativo de procaspase-3 humano em células Ovarianas de Hamster chinês e células 293T huma- nas. A expressão da proteína na presença de o-nitrobenzilcisteína seguido por exposição das células a luz UV durante 5 min ativou a morte de célula, indicando que a luz UV induziu a clivagem do grupo nitrobenzila de resíduo de cisteína antinatural e recuperou a atividade de procaspase-3, que ativou apoptose de célula.

Esta experiência confirma que a substituição seletiva de cisteína de sítio ativo com o-nitrobenzilcisteína em uma proteína em células de mamífero vivas pode ser usada, por exemplo, para espacialmente controlar a atividade de proteína usando, por exemplo, luz UV. Resultados similares podem ser obtidos para proteínas com grupos de sítio reativo diferen- tes (por exemplo, emprego de o-nitrobenzilserina nos resíduos de sítio ativo de serina prote- ase). Detalhes adicionais relativos aos aminoácidos foto-enjaulados ou foto-regulados po- dem ser encontrados na publicação PCT WO 2006/034410 por Dieters e outros (30 de mar- ço de 2006), intitulada "Adding Photoregulated Amino Acids to the Genetic Code", os teores da qual está aqui incorporado em sua totalidade.

EXEMPLO 9

Materiais e Métodos: Transfecção de Célula de Mamífero e Análise de Mancha do Oeste

Ambas as células CHO T-REx™ e 293 de T-REx™ (Invitrogen.) expressam consti- tutivamente o repressor de tetraciclina, que regula um expressão de genes inseridos no plasmídeo de pcDNA4/TO/myc-His A. As células CHO de T-REx™ foram desenvolvidas em F-12 (Invitrogen™), 10% de FBS (Invitrogen™), 1% de Pen-Strep (Invitrogen™), 2 mM de L- glutamina (Invitrogen™), e 10 /vg/ml de blasticidina (Invitrogen™) a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5% de CO2; as células 293 de T-REx™ foram desenvolvidas em meios de Gibco D-MEM (Invitrogen™), 10% de FBS, 1% de Pen-Strep, 2 mM de L-glutamina, e 5 μ- g/ml de blasticidina a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5% de CO2. As Foram cresci- das células a 80-90% confluency em Co-estrela (6-bem agrupamentos de cultura de célula e em seguida transfectados com plasmids que usa FuGENE® 6 (Ciência aplicada de Roche) (9 (I FuGENE® + 3 (plasmids de g). Seis horas depois de transfecção, os meios foram subs- tituídas por mídia frescas que contiveram 1 (g/ml de tetraciclina.

Para testar a supressão ambarina de variantes de EcTyrRS na presença dos seus aminoácidos antinaturais correspondentes, os aminoácidos antinaturais foram adicionados também aos meios frescos. As concentrações de aminoácidos antinaturais nos meios foram 10 mM para pMpa (Bachem, Inc), 10 mM para pApa (Synchem, Inc); 1 mM para pBpa (Ba- chem, Inc), 8 mM para pipa (Bachem, Inc), 5 mM para pAzpa (Bachem, Inc), e 1 mM para pPpa. pPpa puro quiral foi sintetizado como previamente descrito (Deiters e outros (2003), "Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae," J Am Chem Soc 125:11782-11783). As células CHO de T-REx™ foram desenvolvidas du- rante 24 horas após a adição de tetraciclina e em seguida colhidas; as células 293 de T- REx™ foram colhidas após 48 horas de incubação.

Para análise de mancha do oeste, as células colhidas foram Iisadas em tampão de RIPA (Upstate Biotechnology/Millipore) com uma diluição de 1:100 de coquetel de inibidor de protease (Sigma). O sobrenadante foi fracionado por SDS-PAGE sob condição desnatu- rada e transferido para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μτη (Invitrogen™). Para células CHO de T-REx™, as proteínas imobilizadas na membrana foram sondadas com an- ticorpo anti-myc (Invitrogen™; diluição de 1:5000) como o anticorpo primário e IgG-HRP anti- camundongo (Invitrogen™) como o anticorpo secundário. A quimioluminescência foi então detectada com substrato de manchamento do oeste de PIERCE ECL. Para células 293 de T-REx™, as membranas foram sondadas com anti-His-HRP (Invitrogen™; diluição de 1:5000) e em seguida detectadas com substrato de manchamento do oeste PIERCE ECL.

Materiais e Métodos: Transfecção de Célula Bacteriana

As células de E. coli de topo 10 (Invitrogen™) foram usadas para clonar, manter, e ampliar os plasmídeos. DNA polimerase de alta fidelidade Pfx (Invitrogen™) foi empregado para reação em cadeia de polimerase (PCR). FuGENE® 6 (Roche Applied Science) foi em- pregado como o reagente de transfecção. Todos o plasmídeos foram verificados através de seqüenciamento.

EXEMPLO 10

Materiais e Métodos: Construções de Plasmid

PUC18-36STRNA

O gene de fistRNA^ foi construído por anelamento de quatro oligodeoxinucleotí- deos (lntegrated DNA Technologies, lnc). O gene consiste na seqüência de tRNA corres- pondente que necessita da seqüência de flanqueamento 3'-CCA e 5' do gene de tRNATyr humano:

AGCGCTCCGG Illll CTGTGCTGAACCTCAGGGGACG CGACACACGTACACGTC

(SEQ ID NO: 104)

Dois sítios de restrição - EcoRI na extremidade 5' e BamHI na extremidade 3', fo- ram incorporados no dúplex de DNA sintético, que foi então inserido em pUC18 para propor- cionar pUC18-BstRNATyrCUA. O gene BstRNA^ em pUC-SstRNATyrCUA foi então amplificado

por PCR. O SstRNA^ amplificado contendo um sítio de restrição Bglll na extremidade 5' e um sítio BamHI na extremidade 3' foi inserido no sítio de restrição BamHI de pUC18- SstRNATyrCUA para proporcionar pUC18-2SstRNATyrCUA . O plasmídeo pUC18-26stRNA %A so- mente contém um sítio de restrição de BamHI que foi usado para incorporar outra cópia de BstRNATyrCUA para proporcionar pUC18-3fístRNA^. EcTyrRS e suas seis variantes foram

30 todos ampliados de pEcTyrRS/tRNACuA (Chin e outros (2003), "An expanded eukaryotic ge- netic code," Science 301:964-967) por PCR e então inseridos nos sítios de Xbal e Apal do plasmídeo de pcDNA4/TO/myc-His A (Invitrogen™) para proporcionar os vetores de pcD- NA4-EcTyrRS. Os genes de EcTyrRS foram colocados após duas seqüências operadoras de tetraciclina e o promotor de CMV, que conferem a expressão de gene regulado de tetra- ciclina em linhagens de célula de T-REx™ Invitrogen™. Eles também foram ligados a um epítopo c-myc para análise de mancha do oeste. As mutações em seis variantes de EcTyr- RS foram:

pMpaRS: Y37V/D182S/F183M ρ ApaRS: Y37I/D182G/F183M/L186A

pBpaRS: Y37G/D182G/F183Y/L186M

plpaRS: Y37I/D183S/F183M

ρAzpaRS: Y37L/D182S/F183M/L186A

pPpaRS: Y37S/D182T/F183M/L186V

pcDNA4-EcTvrRS e pcDNA4-GFP37TAG

pcDNA4-GFP foi criado inserindo gene de GFP realçado do tipo selvagem nos sí- tios de Xbal e Apal de vetor pcDNA4/TO/myc-His A. Em pcDNA4-GFP, o gene de GFP foi ligado com um epitope de myc e rótulos 6*His no terminal de C para análise de mancha do oeste e purificação por afinidade da proteína expressa. O plasmídeo pcDNA4-GFP37TAG, no qual o códon triplo de Y37 é transformado para códon ambarino TAG1 foi gerado por um kit de mutagênese direcionado ao sítio de QuikChange® (Stratagene).

Variantes de pSWAN-EcTvrRS e pSWAN-GFP37TAG

Para construir as variantes de pSWAN-EcTyrRS1 3SstRNATyrCUA foi isolado de pUC18-3fístRNATyrCUA usando enzimas de restrição BamHI e EcoRI e inserido nos sítios Bglll e Mfel de pcDNA3.1/hygro (+) (Invitrogen™) para proporcionar pcDNA-3SstRNATyrCUA. Os genes codificando as seis variantes de EcTyrRS foram então inseridos nos sítios de Xbal e Apal de pcDNA-3BstRNATyrCUA para proporcionar as variantes de pSWAN-EcTyrRS. Para cri- ar pSWAN-GFP37TAG, um vetor de pSWAN-EcTyrRS foi ampliado e digerido com enzimas de restrição Mlul e PciL Os fragmentos digeridos foram separados por electroforese de gel de agarose e o fragmento contendo 3fístRNA^ foi purificado por kit e purificação de gel

QIAquick® (QIAGEN®). O fragmento de pcDNA4-GFP37TAG do promotor de CMV para o sítio BGH poliA foi ampliado por PCR1 digerido com as enzimas de restrição Mlul e Pcil, e então ligado com o fragmento de pSWAN-EcTyrRS contendo 3SstRNA^ para proporcio- nar pSWAN-GFP37TAG (-4000 bp).

EXEMPLO 11

Materiais e Métodos: Expressão de Proteína e Purificação

As variantes de pSWAN-EcTyrRS e pSWAN-GFP37TAG foram usadas para ex- pressar GFPs mutante contendo aminoácidos antinaturais. As células CHO de T-REx™ (In- vitrogen™) foram desenvolvidas em frascos de cultura de tecido de 75 cm2 (BD Biosciences) para 80-90% de confluência e transfectadas com 2 ug de pSWAN-EcTyrRS e 10 ug de pS- 35 WAN-GFP37TAG usando 60 μu de FuGENE® 6. Após incubação durante a noite, os meios foram mudados para os meios frescos contendo o aminoácido antinatural (pMpa, 10 mM; pApa, 10 mM; pBpa, 1 mM; pAzpa, 5 mM; e pPpa, 1 mM) e 1 //g/ml de tetraciclina. As célu- las foram então desenvolvidas durante 1-2 dias a 37°C antes de colher, e em seguida Usa- das com tampão de Iise RIPA. O sobrenadante do Iisado celular foi dializado contra e equili- brado com tampão de PBS antes de carregar sobre uma coluna de agarose de anticorpo anti-myc (Sigma). A coluna foi lavada com 15 volumes de coluna de tampão de PBS e em seguida eluída com 0,1 M de hidróxido de amônio. As proteínas purificadas foram neutrali- zadas com 0,1 M de ácido acético e analisadas por SDS-PAGE. As faixas que correspon- dem a GFP Foram cortadas para análise espectrométrica de massa. Para determinar o pro- duto e adquirir espectros de massa de proteína intatos, a proteína foi concentrada a -0,1 mg/ml após a eluição.

EXEMPLO 12

Materiais e Métodos: Proteólise

A proteólise de proteínas purificadas por afinidade (realizada para amostars do tipo selvagem e pBpa) foi realizada por incubação durante a noite de proteínas a 37°C com trip- sina modificada de graus de sequenciamento (Promega) usando uma relação de substra- to/enzima de 10:1 (peso/peso) com base na concentração de proteína estimada em 100 mM de tampão de bicarbonato de trietilamônio (pH 8,5). As digestões em gel (realizadas para amostras de pMpa, pAzpa, pApa, e pPpa) foram realizadas de acordo com um procedimento de EMBL modificado (veja o site da Web para EMBL, Heidelberg, Alemanha, Bioanalytical Research Group). Brevemente, fatias de gel foram cortadas para cubos de aproximadamen- te 1 mm χ 1 mm, lavadas durante 5 minutos com água, 15 minutos com acetonitrila, e seca- das em uma centrífuga a vácuo antes de serem re-hidratadas a O0C durante 30 minutos com 12,5 ng/μl de tripsina modificada de grau de seqüenciamento em 50 mM de tampão de bi- carbonato de trietilamônio (pH 8,5). O tampão em excesso foi removido e 20 μl de 50 mM de tampão de bicarbonato de trietilamônio (pH 8,5) foram adicionado às fatias de gel antes da incubação a 37°C durante a noite. Os peptídeos foram extraídos das fatias de gel como des- crito no protocolo.

EXEMPLO 13

Materiais e Métodos: LC/MS/MS de Nano-RP

LC/MS/MS de Nano-RP foi realizado com uma bomba de HPLC, coletor de amos- tras (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), e um espectrômetro de massa híbrido LTQ Orbi- trap (ThermoElectron, San Jose, CA). As digestões trípticas foram carregadas com uma bomba de pressão sobre uma pré-coluna i.d. de 75 μm embalada com 4 cm de partículas de 35 C18 Monitor de 5-μm (Column Engineering, Ontário, CA) em uma taxa de fluxo de aproxi- madamente 2 μl/min. A pré-coluna foi então conectada á bomba de HPLC e depois de vários minutos de lavagem com solvente A a coluna analítica com ponta emissora integrada (360 /vm de O.D. χ 75/ym de i.d; 10 cm de 5 //m de C18, ponta de ~5 /vm) foi conectado em série. O perfil cromatográfico foi de 100% de solvente A (0,1% de ácido acético aquoso) para 50% de solvente B (0,1% de ácido acético em acetonitrila) em 40 min; a taxa de fluxo através da coluna analítica foi aproximadamente 100 nl/min.

Para experiências dependentes dos dados, o espectrômetro de massa foi progra- mado para primeiro registrar uma varredura Orbitrap de alta resolução em seguida um es- pectro de captura de íon de varredura completa (m/z 500.2.000). Isto foi seguido por 10 var- reduras de MS/MS dependente dos dados (energia de colisão relativa = 35%; janela de iso- lamento 3-Da) ativadas da varredura de captura de íon e finalmente duas varreduras de MS/MS alvejadas. A primeira varredura de MS/MS alvejada foi determinada isolar e frag- mentar o íon precursor duplamente carregado do peptídeo modificado por aminoácido anti- natural predito

(FSVSGEGEGDATY*GK; SEQ ID NO: 103).

A segunda varredura de MS/MS alvejada sempre foi determinada isolar e fragmen- tar o íon precursor duplamente carregado do peptídeo do tipo selvagem:

(FSVSGEGEGDATYGK; SEQ ID NO: 102)

em m/z 752,3. Os dados brutos foram procurados contra o banco de dados de MSDB que usa MASCOT (Matrixscience, Londres, REINO UNIDO) para identificação de proteína e para encontrar as varreduras que contêm os peptídeos alvos com os aminoácidos antinaturais como modificação variável. Para estimar fidelidade em Y*37 de GFP-pMpa, os cromatogramas de íon único (íons precursores duplamente carregados em m/z 752,3 pelo peso e 759,3 para pMpa) e cromatogramas de íon selecionado (y9, y11f e y12) foram integra- dos usando o pacote de software Xcalibur (ThermoElectron, San Jose, CA).

Os espectros de massa de proteína intactos foram adquiridos em um sistema de LC/MS automatizado (Waters, Milford1 MA) consistindo em um LC capilar com o coletor de amostras automático e um espectrômetro de massa QTOF2. GFP-pMpa (0,1 mg/ml) foi car- regado em uma Captrap de proteína de fase reversa (Michrom Bioresources, Auburn, CA) para dessalgamento com 0,1% de ácido acético em água e eluído com 80% de acetonitri- la/0,1% de ácido acético em 5 /vl/min na fonte de ESI do espectrômetro de massa. A adição, correção, e desconvolução dos espectros com o algoritmo de MaxEntI foram realizados usando o pacote de software MassLynx (Waters, Milford, MA).

EXEMPLO 14

Promotores para Transcrição de Mamífero

Os promotores fortes para transcrição de tRNA em células de mamífero incluem seqüência de flanqueamento 5' para o tRNALeu5(CUA) supressor de E. coli GATCC- GACCGTGTGC TTGGCAGAAC (SEQ ID NO: 105) e seqüência de flanqueamento 3' GTCCI I I I I I IG (SEQ ID NO: 106) para o tRNALeu5(CUA) supressor de E. coli. Ao mesmo tempo em que a invenção precedente foi descrita em alguns detalhes para propósitos de esclarecimento e entendimento, ficará claro para alguém versado na técnica de uma leitura desta descrição que várias mudanças na forma e detalhe podem ser feitas sem afastar-se do verdadeiro escopo da invenção. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, e/ou outros documentos citados neste pedido estão incorporados por referência em sua totalidade por todos os propósitos na mesma medida como se cada publi- cação, patente, pedido de patente, e/ou outro documento individual fosse individualmente indicado ser incorporado por referência para todos os propósitos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> The Scripps Research Institute LIU1 WENSHE SCHULTZ, PETER G.

<120> INCORPORAÇÃO GENÉTICA DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS PROTEÍNAS EM CÉLULAS MAMÍFERAS

<130> 54-002320US

<140> US 11/975,351 <141 > 2007-10-17

<160> 106

<170> Patente Na Versão 3.4

<210> 1 <211> 87 <212> RNA <213> Artificial

<220>

<223> tRNA Leu5 CUA supressor mutante <400> 1

gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcuccg gguacca 87

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> Escherichiacoli

<400> 2

ggtggggttc ccgagcggcc aaagggagca gactctaaat ctgccgtcat cgacttcgaa 60 ggttcgaatc cttcccccac cacca 85

<210> 3 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> tirosil-tRNA supressor mutante (CUA) <400> 3

ggaggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc 60 ggttcgaatc cgtccccctc ca 82

<210> 4 <211> 860 <212> PRT <213> Escherichiacoli

<400> 4

Met Gln Glu Gln Tyr Arg Pro Glu Glu Ile Glu Ser Lys Val Gln Leu 1 5 10 15

His Trp Asp Glu Lys Arg Thr Phe Glu Val Thr Glu Asp Glu Ser Lys 20 25 30

Glu Lys Tyr Tyr Cys Leu Ser Met Leu Pro Tyr Pro Ser Gly Arg Leu 35 40 45 His Met Gly His Val Arg Asn Tyr Thr Ile Gly Asp Val Ile Ala Arg 50 55 60

Tyr Gln Arg Met Leu Gly Lys Asn Val Leu Gln Pro Ile Gly Trp Asp 65 70 75 80

Ala Phe Gly Leu Pro Ala Glu Gly Ala Ala Val Lys Asn Asn Thr Ala 85 90 95

Pro Ala Pro Trp Thr Tyr Asp Asn Ile Ala Tyr Met Lys Asn Gln Leu 100 105 110

Lys Met Leu Gly Phe Gly Tyr Asp Trp Ser Arg Glu Leu Ala Thr Cys 115 120 125

Thr Pro Glu Tyr Tyr Arg Trp Glu Gln Lys Phe Phe Thr Glu Leu Tyr 130 135 140

Lys Lys Gly Leu Val Tyr Lys Lys Thr Ser Ala Val Asn Trp Cys Pro 145 150 155 160

Asn Asp Gln Thr Val Leu Ala Asn Glu Gln Val Ile Asp Gly Cys Cys 165 170 175

Trp Arg Cys Asp Thr Lys Val Glu Arg Lys Glu Ile Pro Gln Trp Phe 180 185 190

Ile Lys Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Glu Leu Leu Asn Asp Leu Asp Lys 195 200 205

Leu Asp His Trp Pro Asp Thr Val Lys Thr Met Gln Arg Asn Trp Ile 210 215 220

Gly Arg Ser Glu Gly Val Glu Ile Thr Phe Asn Val Asn Asp Tyr Asp 225 230 235 240

Asn Thr Leu Thr Val Tyr Thr Thr Arg Pro Asp Thr Phe Met Gly Cys 245 250 255 Thr Tyr Leu Ala Val Ala Ala Gly His Pro Leu Ala Gln Lys Ala Ala 260 265 270

Glu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Ala Phe Ile Asp Glu Cys Arg Asn Thr 275 280 285

Lys Val Ala Glu Ala Glu Met Ala Thr Met Glu Lys Lys Gly Val Asp 290 295 300

Thr Gly Phe Lys Ala Val His Pro Leu Thr Gly Glu Glu Ile Pro Val 305 310 315 320

Trp Ala Ala Asn Phe Val Leu Met Glu Tyr Gly Thr Gly Ala Val Met 325 330 335

Ala Val Pro Gly His Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Phe Ala Ser Lys Tyr 340 345 350 Gly Leu Asn Ile Lys Pro Val Ile Leu Ala Ala Asp Gly Ser Glu Pro 355 360 365

Asp Leu Ser Gln Gln Ala Leu Thr Glu Lys Gly Val Leu Phe Asn Ser 370 375 380

Gly Glu Phe Asn Gly Leu Asp His Glu Ala Ala Phe Asn Ala Ile Ala 385 390 395 400

Asp Lys Leu Thr Ala Met Gly Val Gly Glu Arg Lys Val Asn Tyr Arg 405 410 415

Leu Arg Asp Trp Gly Val Ser Arg Gln Arg Tyr Trp Gly Ala Pro Ile 420 425 430

Pro Met Val Thr Leu Glu Asp Gly Thr Val Met Pro Thr Pro Asp Asp 435 440 445 Gln Leu Pro Val Ile Leu Pro Glu Asp Val Val Met Asp Gly Ile Thr 450 455 460

Ser Pro Ile Lys Ala Asp Pro Glu Trp Ala Lys Thr Thr Val Asn Gly 465 470 475 480

Met Pro Ala Leu Arg Glu Thr Asp Thr Phe Asp Thr Phe Met Glu Ser 485 490 495

Ser Trp Tyr Tyr Ala Arg Tyr Thr Cys Pro Gln Tyr Lys Glu Gly Met 500 505 510

Leu Asp Ser Glu Ala Ala Asn Tyr Trp Leu Pro Val Asp Ile Tyr Ile 515 520 525

Gly Gly Ile Glu His Ala Ile Met His Leu Leu Tyr Phe Arg Phe Phe 530 535 540

His Lys Leu Met Arg Asp Ala Gly Met Val Asn Ser Asp Glu Pro Ala 545 550 555 560

Lys Gln Leu Leu Cys Gln Gly Met Val Leu Ala Asp Ala Phe Tyr Tyr 565 570 575

Val Gly Glu Asn Gly Glu Arg Asn Trp Val Ser Pro Val Asp Ala Ile 580 585 590

Val Glu Arg Asp Glu Lys Gly Arg Ile Val Lys Ala Lys Asp Ala Ala 595 600 605

Gly His Glu Leu Val Tyr Thr Gly Met Ser Lys Met Ser Lys Ser Lys 610 615 620

Asn Asn Gly Ile Asp Pro Gln Val Met Val Glu Arg Tyr Gly Ala Asp 625 630 635 640

Thr Val Arg Leu Phe Met Met Phe Ala Ser Pro Ala Asp Met Thr Leu 645 650 655 Glu Trp Gln Glu Ser Gly Val Glu Gly Ala Asn Arg Phe Leu Lys Arg 660 665 670

Val Trp Lys Leu Val Tyr Glu His Thr Ala Lys Gly Asp Val Ala Ala 675 680 685

Leu Asn Val Asp Ala Leu Thr Glu Asn Gln Lys Ala Leu Arg Arg Asp 690 695 700

Val His Lys Thr Ile Ala Lys Val Thr Asp Asp Ile Gly Arg Arg Gln 705 710 715 720

Thr Phe Asn Thr Ala Ile Ala Ala Ile Met Glu Leu Met Asn Lys Leu 725 730 735

Ala Lys Ala Pro Thr Asp Gly Glu Gln Asp Arg Ala Leu Met Gln Glu 740 745 750 Ala Leu Leu Ala Val Val Arg Met Leu Asn Pro Phe Thr Pro His Ile 755 760 765

Cys Phe Thr Leu Trp Gln Glu Leu Lys Gly Glu Gly Asp Ile Asp Asn 770 775 780

Ala Pro Trp Pro Val Ala Asp Glu Lys Ala Met Val Glu Asp Ser Thr 785 790 795 800

Leu Val Val Val Gln Val Asn Gly Lys Val Arg Ala Lys Ile Thr Val 805 810 815

Pro Val Asp Ala Thr Glu Glu Gln Val Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu 820 825 830

His Leu Val Ala Lys Tyr Leu Asp Gly Val Thr Val Arg Lys Val Ile 835 840 845 Tyr Val Pro Gly Lys Leu Leu Asn Leu Val Val Gly 850 855 860

<210> 5

<211> 2583

<212> DNA

<213> Escherichiacoli

<400> 5

atgcaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60 aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cctgtctatg 120 cttccctatc cttctggtcg actacacatg ggccacgtac gtaactacac catcggtgac 180 gtgatcgccc gctaccagca tatgctgggc aaaaacgtcc tgcagccgat cggctgggac 240 gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300 acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360 tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420 accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgcccg 480 aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540

accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcaatgc ttacgctgac 600

gagctgctca acgatctgga taaactggat cactggccag acaccgttaa aaccatgcag 660

cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720

aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780

gtacgtgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840

tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900

aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960

tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020

cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080

ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140

ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200 gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260 ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgacgct ggaagacggt 1320 accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380 gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440 atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctc ctggtactat 1500 gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560 tggctgccgg tggatatcta cattggtggt attgaacacg ccattatgca cctgctctac 1620 ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680 aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740 ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800 atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860 tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920 accgttcgtc tgtttatgat gtttgcttct ccggctgata tgactctcga atggcaggaa 1980 tccggtgtgg aaggggctaa ccgcttcctg aaacgtgtct ggaaactggt ttacgagcac 2040

acagcaaaag gtgatgttgc ggcactgaac gttgatgcgc tgactgaaaa tcagaaagcg 2100

ctgcgtcgcg atgtgcataa aacgatcgct aaagtgaccg atgatatcgg ccgtcgtcag 2160

accttcaaca ccgcaattgc ggcgattatg gagctgatga acaaactggc gaaagcacca 2220

accgatggcg agcaggaccg cgctctgatg caggaagcac tgctggccgt tgtccgtatg 2280

cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340

gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400

ctggtcgtgg tgcaggttaa cggtaaagtc cgtgccaaaa tcaccgttcc ggtggacgca 2460

acggaagaac aggttcgcga acgtgctggc caggaacatc tggtagcaaa atatcttgat 2520

ggcgttactg tacgtaaagt gatttacgta ccaggtaaac tcctcaatct ggtcgttggc 2580

taa 2583

<210> 6 <211> 424

<212> PRT

<213> Escherichiacoli

<400> 6

Met Ala Ser Ser Asn Leu Ile Lys Gln Leu Gln Glu Arg Gly Leu Val 1 5 10 15

Ala Gln Val Thr Asp Glu Glu Ala Leu Ala Glu Arg Leu Ala Gln Gly 20 25 30

Pro Ile Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Asp Pro Thr Ala Asp Ser Leu His 35 40 45

Leu Gly His Leu Val Pro Leu Leu Cys Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala 50 55 60

Gly His Lys Pro Val Ala Leu Val Gly Gly Ala Thr Gly Leu Ile Gly 65 70 75 80 Asp Pro Ser Phe Lys Ala Ala Glu Arg Lys Leu Asn Thr Glu Glu Thr 85 90 95

Val Gln Glu Trp Val Asp Lys Ile Arg Lys Gln Val Ala Pro Phe Leu 100 105 110

Asp Phe Asp Cys Gly Glu Asn Ser Ala Ile Ala Ala Asn Asn Tyr Asp 115 120 125

Trp Phe Gly Asn Met Asn Val Leu Thr Phe Leu Arg Asp Ile Gly Lys 130 135 140

His Phe Ser Val Asn Gln Met Ile Asn Lys Glu Ala Val Lys Gln Arg 145 150 155 160

Leu Asn Arg Glu Asp Gln Gly Ile Ser Phe Thr Glu Phe Ser Tyr Asn 165 170 175 Leu Leu Gln Gly Tyr Asp Phe Ala Cys Leu Asn Lys Gln Tyr Gly Val 180 185 190

Val Leu Gln Ile Gly Gly Ser Asp Gln Trp Gly Asn Ile Thr Ser Gly 195 200 205

Ile Asp Leu Thr Arg Arg Leu His Gln Asn Gln Val Phe Gly Leu Thr 210 215 220

Val Pro Leu Ile Thr Lys Ala Asp Gly Thr Lys Phe Gly Lys Thr Glu 225 230 235 240

Gly Gly Ala Val Trp Leu Asp Pro Lys Lys Thr Ser Pro Tyr Lys Phe 245 250 255

Tyr Gln Phe Trp Ile Asn Thr Ala Asp Ala Asp Val Tyr Arg Phe Leu 260 265 270

Lys Phe Phe Thr Phe Met Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Leu Glu Glu 275 280 285

Glu Asp Lys Asn Ser Gly Lys Ala Pro Arg Ala Gln Tyr Val Leu Ala 290 295 300

Glu Gln Val Thr Arg Leu Val His Gly Glu Glu Gly Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320

Lys Arg Ile Thr Glu Cys Leu Phe Ser Gly Ser Leu Ser Ala Leu Ser 325 330 335

Glu Ala Asp Phe Glu Gln Leu Ala Gln Asp Gly Val Pro Met Val Glu 340 345 350

Met Glu Lys Gly Ala Asp Leu Met Gln Ala Leu Val Asp Ser Glu Leu 355 360 365

Gln Pro Ser Arg Gly Gln Ala Arg Lys Thr Ile Ala Ser Asn Ala Ile 370 375 380 Thr Ile Asn Gly Glu Lys Gln Ser Asp Pro Glu Tyr Phe Phe Lys Glu 385 390 395 400

Glu Asp Arg Leu Phe Gly Arg Phe Thr Leu Leu Arg Arg Gly Lys Lys 405 410 415

Asn Tyr Cys Leu Ile Cys Trp Lys 420

<210> 7

<211> 1275

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 7

atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60

gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcgctcta ttgcggcttc 120

gatcctaccg etgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180 ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240

gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300

gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360

gctatcgcgg cgaacaacta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420

gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480

ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gttgcagggt 540

tatgacttcg cctgtctgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600

cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660

tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720

ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780

atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840

gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag 900 tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960 aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020 gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080 caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140 tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200 gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260 atttgctgga aataa 1275

<210> 8 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 8

atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60 gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcgt gtgtggcttc 120

gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180

ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240

gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300

gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360

gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420

gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480

ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt 540

tatagtatgg cctgtttgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600

cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660

tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720

ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780 atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840 gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag 900 tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960 aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020 gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080 caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140 tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200 gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260 atttgctgga aataa 1275

<210> 9 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> sintetase mutante <400> 9

atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60 gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcac ttgtggcttc 120 gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180 ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240 gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300 gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360 gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc agcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420 gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480 ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt 540 tatacgtatg cctgtctgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600 cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660 tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720 ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780 atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840 gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag 900 tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960 aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020 gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080 caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140 tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200 gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260 atttgctgga aataa 1275

<210> 10 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 10

atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60 gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcgt gtgtggcttc 120 gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180 ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240 gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300 gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360 gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420 gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480 ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt 540 tatagtatgg cctgtttgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600 cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660 tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720 ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780 atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840 gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960 aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020 gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 10 caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140 tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200 gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260 atttgctgga aataa 1275 <210> 11 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial

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<223> sintetase mutante <400> 11

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<210> 12 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial

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<223> sintetase mutante <400> 12

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<210> 13 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial

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<223> sintetase mutante <400> 13

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<210> 14 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial

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<223> sintetase mutante <400> 14

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<210> 15 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial

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<210> 16 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial

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<210> 17 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 17

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<223> sintetase mutante <400> 18

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<210> 19 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial

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<223> sintetase mutante <400> 19

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<223> sintetase mutante <400> 20

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<223> sintetase mutante <400> 21

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<223> sintetase mutante <400> 22

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<210> 23

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<223> sintetase mutante <400> 24

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<223> sintetase mutante <220>

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<223> sintetase mutante <400> 26

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<223> sintetase mutante <220>

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<223> sintetase mutante <220> <221 > misc_feature <222> (588)..(588) <223> η é a, c, g, ou t

<400> 28

gcgttagcag agcgactggc gcaaggcccg atcgcactcg tttgtggctt cgatcctacc 60 gctgacagct tgcatttggg gcatcttgtt ccattgttgt gcctgaaacg cttccagcag 120 gcgggccaca agccggttgc gctggtaggc ggcgcgacgg gtctgattgg cgacccgagc 180 ttcaaagctg ccgagcgtaa gctgaacacc gaagaaactg ttcaggagtg ggtggacaaa 240 atccgtaagc aggttgcccc gttcctcgat ttcgactgtg gagaaaactc tgctatcgcg 300 gccaataatt atgactggtt cggcaatatg aatgtgctga ccttcctgcg cgatattggc 360 aaacacttct ccgttaacca gatgatcaac aaagaagcgg ttaagcagcg tctcaaccgt 420 gaagatcagg ggatttcgtt cactgagttt tcctacaacc tgctgcaggg ttatagtgcg 480 gcctgtgtta acaaacagta cggtgtggtg ctgcaaattg gtggttctga ccagtggggt 540 aacatcactt ctggtatcga cctgacccgt cgtctgcatc agaatcangt g 591 <210> 29 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 29

gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcat ttgtggcttc 60 gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 120 ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 180 gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 240 gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 300 gctatcgcgg ccaatgatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 360 gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 420 ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt 480 tataattttg cctgtgtgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 540 cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 600

<210> 30 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 30

cgactggcgc aaggcccgat cgcactcacg tgtggcttcg atcctaccgc tgacagcttg 60 catttggggc atcttgttcc attgttatgc ctgaaacgct tccagcaggc gggccacaag 120 ccggttgcgc tggtaggcgg cgcgacgggt ctgattggcg acccgagctt caaagctgcc 180 gagcgtaagc tgaacaccga agaaactgtt caggagtggg tggacaaaat ccgtaagcag 240 gttgccccgt tcctcgattt cgactgtgga gaaaactctg ctatcgcggc caataattat 300 gactggttcg gcaatatgaa tgtgctgacc ttcctgcgcg atattggcaa acacttctcc 360 gttaaccaga tgatcaacaa agaagcggtt aagcagcgtc tcaaccgtga agatcagggg 420 atttcgttca ctgagttttc ctacaatctg ctgcagggtt attcggctgc ctgtcttaac 480 aaacagtacg gtgtggtgct gcaaattggt ggttctgacc agtggggtaa catcacttct 540 ggtatcgacc tgacccgtcg tctgcatcag aatcaggtg 579

<210> 31 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <220>

<221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η é a, c, g, ou t <220>

<221 > misc_feature

<222> (599)..(599)

<223> η é a, c, g, ou t

<400> 31

cgggggctgg tancccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60

ccgatcgcac tcgggtgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120

gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180

ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240

accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300

gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360

atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420

aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480

ttttcctaca acctgctgca gggttattct atggcctgtt tgaacaaaca gtacggtgtg 540

gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctganc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 32 <211> 625 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <220>

<221 > misc_feature

<222> (600)..(600)

<223> η é a, c, g, ou t

<400> 32

cgggggctgg tagcccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc ccgatcgcac tcacgtgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca atctgctgca gggttattcg gctgcctgtc ttaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgaacctgan 600 ccgtcgtctg catcaaaatc aagtg 625

<210> 33

<211> 624

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 33

cgggggctgg taccccaagt gacggacgag gaaacgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tctcttgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcaggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttatacg atggcctgtg tgaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 34 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 34

cgggggctgg tagcccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcgcgtgcgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaagg ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttattct tatgcctgtc ttaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 35

<211> 624

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 35

cgggggctgg tagcccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcgcgtgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata atíatgactg gttcggcaat 360

atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480

ttttcctaca acctgctgca gggttatacg atggcctgtt gtaacaaaca gtacggtgtg 540

gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 36 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 36

cgggggctgg taccccaagt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcacgtgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcgctgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttatacg tttgcctgta tgaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 37 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 37

gtgacggacg aggaagcgtt agcagagcga ctggcgcaag gcccgatcgc actcacgtgt 60 ggcttcgatc ctaccgctga cagcttgcat ttggggcatc ttgttccatt gttatgcctg 120 aaacgcttcc agcaggcggg ccacaagccg gttgcgctgg taggcggcgc gacgggtctg 180 attggcgacc cgagcttcaa agctgccgag cgtaagctga acaccgaaga aactgttcag 240 gagtgggtgg acaaaatccg taagcaggtt gccccgttcc tcgatttcga ctgtggagaa 300 aactctgcta tcgcggccaa taattatgac tggttcggca atatgaatgt gctgaccttc 360 ctgcgcgata ttggcaaaca cttctccgtt aaccagatga tcaacaaaga agcggttaag 420 cagcgtctca accgtgaaga tcaggggatt tcgttcactg agttttccta caatctgctg 480 cagggttatt cggctgcctg tcttaacaaa cagtacggtg tggtgctgca aattggtggt 540 tctgaccagt ggggtaacat cacttctggt atcgacctga cccgtcgtct gcatcagaat 600 caggtg 606 <210> 38 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 38

cgggggctgg tagcccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcgtttgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttattcg atggcctgta cgaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 39 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <220>

<221 > misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> η é a, c, g, ou t

<400> 39

cgggggctgg tancccaagt gacggacggg gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcagttgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatctcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttatagt tttgcctgtc tgaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 40 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 40

cgggggctgg tagcccaggt gacggacgag gaagcgttag cagagcgact ggcgcaaggc 60 ccgatcgcac tcacgtgtgg cttcgatcct accgctgaca gcttgcattt ggggcatctt 120 gttccattgt tatgcctgaa acgcttccag caggcgggcc acaagccggt tgcgctggta 180 ggcggcgcga cgggtctgat tggcgacccg agcttcaaag ctgccgagcg taagctgaac 240 accgaagaaa ctgttcagga gtgggtggac aaaatccgta agcaggttgc cccgttcctc 300 gatttcgact gtggagaaaa ctctgctatc gcggccaata attatgactg gttcggcaat 360 atgaatgtgc tgaccttcct gcgcgatatt ggcaaacact tctccgttaa ccagatgatc 420 aacaaagaag cggttaagca gcgtctcaac cgtgaagatc aggggatttc gttcactgag 480 ttttcctaca acctgctgca gggttatacg tttgcctgta ctaacaaaca gtacggtgtg 540 gtgctgcaaa ttggtggttc tgaccagtgg ggtaacatca cttctggtat cgacctgacc 600 cgtcgtctgc atcagaatca ggtg 624

<210> 41 <211> 2583 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 41

atggaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60 aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cctgtctgct 120 aatccctatc cttctggtcg actacacatg ggccacgtac gtaactacac catcggtgac 180 gtgatcgccc gctaccagcg tatgctgggc aaaaacgtcc tgcagccgat cggctgggac 240 gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300 acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360 tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420 accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgtccg 480 aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540 accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcactgc ttacgctgac 600 gagctgctca acgatctgga taaactggat cactggccag acaccgttaa aaccatgcag 660 cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720 aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780 gtagctgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840 tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900 aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960 tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020 cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080 ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140 ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200

gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260

ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgactct agaagacggt 1320

accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380

gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440

atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctg ctggatttat 1500

gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560

tggctgccgg tggatatcgg tattggtggt attgaacacg ccattatgac gctgctctac 1620

ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680

aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800

atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860 tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920 accgttcgtc tgtttatgat gtttgcttct ccggctgata tgactctcga atggcaggaa 1980 tccggtgtgg aaggggctaa ccgcttcctg aaacgtgtct ggaaactggt ttacgagcac 2040 acagcaaaag gtgatgttgc ggcactgaac gttgatgcgc tgactgaaaa tcagaaagcg 2100 ctgcgtcgcg atgtgcataa aacgatcgct aaagtgaccg atgatatcgg ccgtcgtcag 2160 accttcaaca ccgcaattgc ggcgattatg gagctgatga acaaactggc gaaagcacca 2220 accgatggcg agcaggatcg cgctctgatg caggaagcac tgctggccgt tgtccgtatg 2280 cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340 gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400 ctggtcgtgg tgcaggttaa cggtaaagtc cgtgccaaaa tcaccgttcc ggtggacgca 2460 acggaagaac aggttcgcga acgtgctggc caggaacatc tggtagcaaa atatcttgat 2520 ggcgttactg tacgtaaagt gatttacgta ccaggtaaac tcctcaatct ggtcgttggc 2580 taa 2583 <210> 42 <211> 2589 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 42

atggaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60 aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cctgtctgct 120 aatccctatc cttctggtcg actacacatg ggccacgtac gtaactacac catcggtgac 180 gtgatcgccc gctaccagcg tatgctgggc aaaaacgtcc tgcagccgat cggctgggac 240 gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300 acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360 tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420 accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgtccg 480

aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540

accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcactgc ttacgctgac 600

gagctgctca acgatctgga taaactggat cactggccag acaccgttaa aaccatgcag 660

cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720

aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacgcgttta tgggttgtac ctacctggcg 780

gtagctgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840

tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900

aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960

tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020

cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080

ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140

ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200 gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260

ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgactct agaagacggt 1320

accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380

gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440

atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctg ctggatttat 1500

gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560

tggctgccgg tggatatcgg tattggtggt attgaacacg ccattatgac gctgctctac 1620

ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680

aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800

atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860

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<210> 49 <211> 2583 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante

<400> 49

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ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680

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tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020

cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080

ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140

ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200

gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260

ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgacgct ggaagacggt 1320

accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380

gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440

atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctc ctggcggtat 1500

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tggctgccgg tggatatcct gattggtggt attgaacacg ccattatggg tctgctctac 1620 ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680

aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800

atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860

tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920

accgttcgtc tgtttatgat gtttgcttct ccggctgata tgactctcga atggcaggaa 1980

tccggtgtgg aaggggctaa ccgcttcctg aaacgtgtct ggaaactggt ttacgagcac 2040

acagcaaaag gtgatgttgc ggcactgaac gttgatgcgc tgactgaaaa tcagaaagcg 2100

ctgcgtcgcg atgtgcataa aacgatcgct aaagtgaccg atgatatcgg ccgtcgtcag 2160

accttcaaca ccgcaattgc ggcgattatg gagctgatga acaaactggc gaaagcacca 2220

accgatggcg agcaggatcg cgctctgatg caggaagcac tgctggccgt tgtccgtatg 2280

cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340 gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400

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acggaagaac aggttcgcga acgtgctggc caggaacatc tggtagcaaa atatcttgat 2520

ggcgttactg tacgtaaagt gatttacgta ccaggtaaac tcctcaatct ggtcgttggc 2580 taa 2583

<210> 54

<211> 2583

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante

<400> 54

atgcaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60

aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cctgtctggt 120

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gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300

acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360

tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420

accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgcccg 480

aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540

accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcactgc ttacgctgac 600

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aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780

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tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900 aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960 tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020 cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080 ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140 ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200 gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260 ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgacgct ggaagacggt 1320 accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380 gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440 atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctc ctgggcttat 1500 gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560 tggctgccgg tggatatcct tattggtggt attgaacacg ccattatggg tctgctctac 1620 ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680 aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

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atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860

tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920

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<210> 55 <211> 2583 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 55

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gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 56

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tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420

accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgcccg 480

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cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720

aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780

gtagctgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840

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aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960

tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020 cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080

ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140

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gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440

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ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680

aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740

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cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340

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taa 2583

<210> 57

<211> 424

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante

<400> 57

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Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Met Ala Cys Leu Asn Lys Gln Tyr Gly Val 180 185 190

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Val Pro Leu Ile Thr Lys Ala Asp Gly Thr Lys Phe Gly Lys Thr Glu 225 230 235 240 Gly Gly Ala Val Trp Leu Asp Pro Lys Lys Thr Ser Pro Tyr Lys Phe 245 250 255

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Lys Phe Phe Thr Phe Met Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Leu Glu Glu 275 280 285

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Glu Gln Val Thr Arg Leu Val His Gly Glu Glu Gly Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320

Lys Arg Ile Thr Glu Cys Leu Phe Ser Gly Ser Leu Ser Ala Leu Ser 325 330 335

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<213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 58

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Leu Gly His Leu Val Pro Leu Leu Cys Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala 50 55 60

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Asp Phe Asp Cys Gly Glu Asn Ser Ala Ile Ala Ala Asn Asn Tyr Asp 115 120 125

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Glu Gln Val Thr Arg Leu Val His Gly Glu Glu Gly Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 59 Met Ala Ser Ser Asn Leu Ile Lys Gln Leu Gln Glu Arg Gly Leu Val 1 5 10 15

Ala Gln Val Thr Asp Glu Glu Ala Leu Ala Glu Arg Leu Ala Gln Gly 20 25 30

Pro Ile Ala Leu Thr Cys Gly Phe Asp Pro Thr Ala Asp Ser Leu His 35 40 45

Leu Gly His Leu Val Pro Leu Leu Cys Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala 50 55 60

Gly His Lys Pro Val Ala Leu Val Gly Gly Ala Thr Gly Leu Ile Gly 65 70 75 80

Asp Pro Ser Phe Lys Ala Ala Glu Arg Lys Leu Asn Thr Glu Glu Thr 85 90 95 Val Gln Glu Trp Val Asp Lys Ile Arg Lys Gln Val Ala Pro Phe Leu 100 105 110

Asp Phe Asp Cys Gly Glu Asn SerAIa Ile Ala Ala Asn Asn Tyr Asp 115 120 125

Trp Phe Gly Asn Met Asn Val Leu Thr Phe Leu Arg Asp Ile Gly Lys 130 135 140

His Phe Ser Val Asn Gln Met Ile Asn Lys Glu Ala Val Lys Gln Arg 145 150 155 160

Leu Asn Arg Glu Asp Gln Gly Ile Ser Phe Thr Glu Phe Ser Tyr Asn 165 170 175

Leu Leu Gln Gly Tyr Thr Tyr Ala Cys Leu Asn Lys Gln Tyr Gly Val 180 185 190

Val Leu Gln Ile Gly Gly Ser Asp Gln Trp Gly Asn Ile Thr Ser Gly 195 200 205

Ile Asp Leu Thr Arg Arg Leu His Gln Asn Gln Val Phe Gly Leu Thr 210 215 220

Val Pro Leu Ile Thr Lys Ala Asp Gly Thr Lys Phe Gly Lys Thr Glu 225 230 235 240

Gly Gly Ala Val Trp Leu Asp Pro Lys Lys Thr Ser Pro Tyr Lys Phe 245 250 255

Tyr Gln Phe Trp Ile Asn Thr Ala Asp Ala Asp Val Tyr Arg Phe Leu 260 265 270

Lys Phe Phe Thr Phe Met Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Leu Glu Glu 275 280 285

Glu Asp Lys Asn Ser Gly Lys Ala Pro Arg Ala Gln Tyr Val Leu Ala 290 295 300 Glu Gln Val Thr Arg Leu Val His Gly Glu Glu Gly Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320

Lys Arg Ile Thr Glu Cys Leu Phe Ser Gly Ser Leu Ser Ala Leu Ser 325 330 335

Glu Ala Asp Phe Glu Gln Leu Ala Gln Asp Gly Val Pro Met Val Glu 340 345 350

Met Glu Lys Gly Ala Asp Leu Met Gln Ala Leu Val Asp Ser Glu Leu 355 360 365

Gln Pro Ser Arg Gly Gln Ala Arg Lys Thr Ile Ala Ser Asn Ala Ile 370 375 380

Thr Ile Asn Gly Glu Lys Gln Ser Asp Pro Glu Tyr Phe Phe Lys Glu 385 390 395 400 Glu Asp Arg Leu Phe Gly Arg Phe Thr Leu Leu Arg Arg Gly Lys Lys 405 410 415

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<210> 60 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial

<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 62

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 63

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 64

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<220>

<223> sintetase mutante

<400> 65

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 67

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 68

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<213> Artificial <220>

<223> sintetase mutante <400> 69

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<210> 70 <211> 424

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 70

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242

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<220>

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<220>

<223> sintetase mutante <400> 82

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Ala Lys Ala Pro Thr Asp Gly Glu Gln Asp Arg Ala Leu Met Gln Glu 740 745 750

Ala Leu Leu Ala Val Val Arg Met Leu Asn Pro Phe Thr Pro His Ile 755 760 765

Cys Phe Thr Leu Trp Gln Glu Leu Lys Gly Glu Gly Asp lie Asp Asn 770 775 780

Ala Pro Trp Pro Val Ala Asp Glu Lys Ala Met Val Glu Asp Ser Thr 735 790 795 800 Leu Val Val Val Gln Val Asn Gly Lys Val Arg Ala Lys Ile Thr Val 805 810 815

Pro Val Asp Ala Thr Glu Glu Gln Val Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu 820 825 830

His Leu Val Ala Lys Tyr Leu Asp Gly Val Thr Val Arg Lys Val Ile 835 840 845

Tyr Val Pro Gly Lys Leu Leu Asn Leu Val Val Gly 850 855 860

<210> 101 <211> 860 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> sintetase mutante <400> 101

Met Glu Glu Gln Tyr Arg Pro Glu Glu Ile Glu Ser Lys Val Gln Leu 15 10 15

His Trp Asp Glu Lys Arg Thr Phe Glu Val Thr Glu Asp Glu Gly Lys 20 25 30

Glu Lys Tyr Tyr Cys Leu Ser Trp Ser Pro Tyr Pro Ser Gly Arg Leu 35 40 45

His Met Gly His Val Arg Asn Tyr Thr Ile Gly Asp Val Ile Ala Arg 50 55 60

Tyr Gln Arg Met Leu Gly Lys Asn Val Leu Gln Pro Ile Gly Trp Asp 65 70 75 80

Lys Met Leu Gly Phe Gly Tyr Asp Trp Ser Arg Glu Leu Ala Thr Cys 115 120 125

Thr Pro Glu Tyr Tyr Arg Trp Glu Gln Lys Phe Phe Thr Glu Leu Tyr 130 135 140

Lys Lys Gly Leu Val Tyr Lys Lys Thr Ser Ala Val Asn Trp Cys Pro 145 150 155 160

Asn Asp Gln Thr Val Leu Ala Asn Glu Gln Val Ile Asp Gly Cys Cys 165 170 175

Trp Arg Cys Asp Thr Lys Val Glu Arg Lys Glu Ile Pro Gln Trp Phe 180 185 190 Ile Lys Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Glu Leu Leu Asn Asp Leu Asp Lys 195 200 205

Leu Asp His Trp Pro Asp Thr Val Lys Thr Met Gln Arg Asn Trp Ile 210 215 220

Gly Arg Ser Glu Gly Val Glu Ile Thr Phe Asn Val Asn Asp Tyr Asp 225 230 235 240

Asn Thr Leu Thr Val Tyr Ala Ser Arg Pro Asp Thr Phe Met Gly Cys 245 250 255

Thr Tyr Leu Ala Val Ala Ala Gly His Pro Leu Ala Gln Lys Ala Ala 260 265 270

Glu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Ala Phe Ile Asp Glu Cys Arg Asn Thr 275 280 285

Lys Val Ala Glu Ala Glu Met Ala Thr Met Glu Lys Lys Gly Val Asp 290 295 300

Thr Gly Phe Lys Ala Val His Pro Leu Thr Gly Glu Glu Ile Pro Val 305 310 315 320

Trp Ala Ala Asn Phe Val Leu Met Glu Tyr Gly Thr Gly Ala Val Met 325 330 335

Ala Val Pro Gly His Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Phe Ala Ser Lys Tyr 340 345 350

Gly Leu Asn Ile Lys Pro Val Ile Leu Ala Ala Asp Gly Ser Glu Pro 355 360 365

Asp Leu Ser Gln Gln Ala Leu Thr Glu Lys Gly Val Leu Phe Asn Ser 370 375 380

Leu Arg Asp Trp Gly Val Ser Arg Gln Arg Tyr Trp Gly Ala Pro Ile 420 425 430

Pro Met Val Thr Leu Glu Asp Gly Thr Val Met Pro Thr Pro Asp Asp 435 440 445

Gln Leu Pro Val Ile Leu Pro Glu Asp Val Val Met Asp Gly Ile Thr 450 455 460

Ser Pro Ile Lys Ala Asp Pro Glu Trp Ala Lys Thr Thr Val Asn Gly 465 470 475 480

Leu Asp Ser Glu Ala Ala Asn Tyr Trp Leu Pro Val Asp Ile Ala Ile 515 520 525

Gly Gly Ile Glu His Ala Ile Met Gly Leu Leu Tyr Phe Arg Phe Phe 530 535 540

His Lys Leu Met Arg Asp Ala Gly Met Val Asn Ser Asp Glu Pro Ala 545 550 555 560

Lys Gln Leu Leu Cys Gln Gly Met Val Leu Ala Asp Ala Phe Tyr Tyr 565 570 575

Val Gly Glu Asn Gly Glu Arg Asn Trp Val Ser Pro Val Asp Ala Ile 580 585 590 Val Glu Arg Asp Glu Lys Gly Arg Ile Val Lys Ala Lys Asp Ala Ala 595 600 605

Gly His Glu Leu Val Tyr Thr Gly Ile Ser Lys Met Ser Lys Ser Lys 610 615 620

Asn Asn Gly Ile Asp Pro Gln Val Met Val Glu Arg Tyr Gly Ala Asp 625 630 635 640

Thr Val Arg Leu Phe Met Met Phe Ala Ser Pro Ala Asp Met Thr Leu 645 650 655

Glu Trp Gln Glu Ser Gly Val Glu Gly Ala Asn Arg Phe Leu Lys Arg 660 665 670

Ala Trp Lys Leu Val Tyr Glu His Thr Ala Lys Gly Asp Val Ala Ala 675 680 685

Leu Asn Val Asp Ala Leu Thr Glu Asn Gln Lys Ala Leu Arg Arg Asp 690 695 700

Val His Lys Thr Ile Ala Lys Val Thr Asp Asp Ile Gly Arg Arg Gln 705 710 715 720

Thr Phe Asn Thr Ala Ile Ala Ala Ile Met Glu Leu Met Asn Lys Leu 725 730 735

Ala Lys Ala Pro Thr Asp Gly Glu Gln Asp Arg Ala Leu Met Gln Glu 740 745 750

Ala Leu Leu Ala Val Val Arg Met Leu Asn Pro Phe Thr Pro His Ile 755 760 765

Cys Phe Thr Leu Trp Gln Glu Leu Lys Gly Glu Gly Asp Ile Asp Asn 770 775 780

Pro Val Asp Ala Thr Glu Glu Gln Val Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu 820 825 830

His Leu Val Ala Lys Tyr Leu Asp Gly Val Thr Val Arg Lys Val Ile 835 840 845

Tyr Val Pro Gly Lys Leu Leu Asn Leu Val Val Gly 850 855 860

<210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico de GFP realçado <400> 102

Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys 1 5 10 15

<210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> peptídeo tríptico de GFP realçado <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (13)..(13)

<223> X é tirosina, p-methoxy-L-fenilalanina, p-acetil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p-iodo-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, ou p-propargiloxifenilalanina

<400> 103 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Xaa Gly Lys 15 10 15

<210> 104

<211> 55

<212> DNA

<213> Homosapiens

<400> 104

agcgctccgg tttttctgtg ctgaacctca ggggacgccg acacacgtac acgtc

<210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> 5-seqüência de flanqueamento

<400> 105

gatccgaccg tgtgcttggc agaac <210> 106

25 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> 3'-seqüência de flanqueamento

<400> 106 gtcctttttt tg

Claims

1. Sistema de translação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um primeiro aminoácido antinatural selecionado do grupo que consiste em: i) p-metoxifenilalanina (pMpa); ii) p-acetilfenilalanina (pApa); iii) p-benzoilfenilalanina (pBpa); iv) p-iodofenilalanina (pipa); v) p-azidofenilalanina (pAzpa); vi) p-propargiloxifenilalanina (pPpa); vii) ácido σ-aminocaprílico; viii) o-nitrobenzilcisteína (o-NBC); ix) 1,5-dansilalanina; e x) o-nitrobenzilserina (o-NBS); (b) um primeiro tRNA ortogonal (O-tRNA); (c) uma primeira aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) derivada de uma ami- noacil-tRNA sintetase eubacteriaana, em que a referida O-RS preferencialmente aminoacila a referida O-tRNA com o referido aminoácido antinatural; e (d) uma célula hospedeira que compreende (a), (b) e (c), a referida célula selecio- nada de uma célula de roedor e uma célula de primata.

2. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido primeiro O-RS preferencialmente aminoacla o referido primeiro O- tRNA com o referido primeiro aminoácido antinatural com uma eficiência que é pelo menos 50% da eficiência observada para um sistema de translação compreendendo a referida O- tRNA, o referido aminoácido antinatural, e uma aminoacil-tRNA sintetase que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOS: 57-101.

3. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido primeiro O-tRNA compreende ou é codificado pela seqüência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 3.

4. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido primeiro O-RS é derivado de uma aminoacil-tRNA sintetase de E. coli.

5. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido primeiro O-RS compreende uma seqüência de aminoácido selecio- nada do grupo de seqüências de aminoácido apresentadas em SEQ ID NOS: 57 -101, e variantes conservadoras destas.

6. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que a referida célula hospedeira adicionalmente compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína de interesse, o referido ácido nucléico compreendendo pelo me- nos um códon seletor, em que o referido códon seletor é reconhecido pelo referido primeiro O-tRNA.

7. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pe- lo fato de que a referida célula hospedeira adicionalmente compreende um segundo amino- ácido antinatural que é diferente do primeiro aminoácido antinatural, um segundo O-RS e um segundo O-tRNA, em que o segundo O-RS preferencialmente aminoacila o segundo O- tRNA com o segundo aminoácido antinatural, e em que o segundo O-tRNA reconhece um códon seletor codificado pelo ácido nucléico que é diferente do códon seletor reconhecido pelo primeiro O-tRNA.

8. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pe- lo fato de que a referida célula hospedeira compreende um polinucleotídeo que codifica o referido primeiro O-RS.

9. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pe- lo fato de que o referido polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo sele- cionada das seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID NOS: 8-56.

10. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira compreende um polinucleotídeo que codifica o referido primeiro O-tRNA.

11. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira de roedor é selecionada de uma célula hospe- deira de rato e uma célula hospedeira de camundongo.

12. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira de primata é selecionada do grupo que consis- te em célula hospedeira humana, célula hospedeira de chimpanzé, célula hospedeira de bonobo, célula hospedeira de gorila, célula hospedeira de orangotango, célula hospedeira de gibão, célula hospedeira de macaco, célula hospedeira de tamari e célula hospedeira de sagüi.

13. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira de roedor é uma célula hospedeira CHO.

14. Sistema de translação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira de primata é uma célula hospedeira 293T.

15. Método para produzir uma proteína que compreende um aminoácido antinatural em uma posição selecionada, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) fornecer: (i) um primeiro aminoácido antinatural selecionado a partir do grupo que consiste em: A) p-metoxifenilalanina (pMpa); Β) p-acetilfenilalanina (pApa); C) p-benzoilfenilalanina (pBpa); D) p-iodofenilalanina (pipa); 5 E) p-azidofenilalanina (pAzpa); F) p-propargiloxifenilalanina (pPpa); G) ácido σ-aminocaprílico; H) o-nitrobenzylcysteine (o-NBC); I) 1,5-dansilalanina; e J) o-nitrobenzilserina (o-NBS); (ii) um primeiro tRNA ortogonal (O-tRNA); (iii) uma primeira aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS), em que a referida primeira O-RS preferencialmente aminoacila o referido primeiro O-tRNA com o referido ami- noácido antinatural; (iv) um ácido nucléico codificando a referida proteína, em que o referido ácido nu- cléico compreende pelo menos um códon seletor que é reconhecido pelo referido primeiro O-tRNA, e em que a posição de códon seletor no referido ácido nucléico corresponde à po- sição selecionada na referida proteína; e (v) uma célula hospedeira que compreende (i), (ii), (iii) e (iv), a referida célula hos- pedeira selecionada de uma célula de roedor e uma célula de primata; e (b) incorporar o referido aminoácido antinatural na referida posição selecionada na referida proteína durante a translação da referida proteína em resposta ao referido códon seletor na presença do referido aminoácido antinatural, O-tRNA e O-RS, desse modo produ- zindo a referida proteína compreendendo o referido aminoácido antinatural na posição sele- cionada.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido primeiro O-RS preferencialmente aminoacila o referido primeiro O-tRNA com o referido primeiro aminoácido antinatural com uma eficiência que é pelo menos 50% da efici- ência observada para um sistema de translação compreendendo o referido O-tRNA, o refe- rido aminoácido antinatural, e uma aminoacil-tRNA sintetase que compreendem uma se- qüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 57-101.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro O-tRNA compreende ou é codificado pela seqüência de polinucleotídeo apresen- tada na SEQ ID NO: 3.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o fornecimento de um primeiro O-RS compreende fornecer um polinucleotídeo que codifica o referido primeiro O-RS.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido primeiro O-RS é derivado de uma aminoacil-tRNA sintetase de E. coli.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido primeiro O-RS compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo de seqüências de aminoácido apresentadas em SEQ ID NOS: 5 7-101, e variantes conservadoras destas.

21. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido fornecimento de um primeiro O-RS compreende fornecer um polinucleotídeo que codifica o referido O-RS.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir das seqüências de nucleotídeo apresentadas em NOS: 8-56.

23. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido fornecimento de um primeiro O-RS compreende mutar uma bolsa de ligação de aminoácido de uma aminoacil-tRNA sintetase do tipo selvagem por mutagênese direcionada ao sítio, e selecionar uma O-RS resultante que preferencialmente aminoacila o referido pri- meiro O-t RNA com o referido primeiro aminoácido antinatural.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de seleção compreende selecionar positivamente e selecionar negativa- mente para o referido primeiro O-RS de uma mistura que compreende uma pluralidade de moléculas de aminoacil-tRNA sintetase resultantes seguinte a mutagênese direcionada ao sítio.

25. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido fornecimento de um primeiro O-tRNA compreende fornecer um polinucleotídeo que codifica o referido primeiro O-tRNA.

26. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína compreende um segundo aminoácido antinatural que é diferente do refe- rido primeiro aminoácido antinatural, o método adicionalmente fornecendo o referido segun- do aminoácido antinatural, um segundo O-RS e um segundo O-tRNA, em que o segundo O- RS preferencialmente aminoacila o segundo O-tRNA com o segundo aminoácido antinatural, e em que o segundo O-tRNA reconhece um códon seletor no ácido nucléico que é diferente do códon seletor reconhecido pelo primeiro O-tRNA.

27. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de incorporação compreende cultivar a referida célula hospedeira.

28. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro aminoácido antinatural compreende um aminoácido foto-enjaulado, e em que o método adicionalmente compreende: expor a célula hospedeira à luz UV.

29. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a exposição da célula hospedeira à luz UV fornece controle de espaço de atividade de prote- ína na célula hospedeira.