BRPI0718639A2 - Usos de uma bactéria e de um sobrenadante de cultura de clostridium perfringens tipo c - Google Patents
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Description
"USOS DE UMA BACTÉRIA E DE UM SOBRENADANTE DE CULTURA DE CLOSTRIDIUMPERFRINGENS TIPO C"
A presente invenção refere-se ao uso de bactéria Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina.
Os Clostrídios são bactérias anaeróbicas formadoras de esporos Gram-positivas. Os Clostrídios são largamente reconhecidos como patógenos de animais tanto domésticos como selvagens. Um resumo dos vários Clostrídios e de doenças animais que elas causam é feito por Songer, J. G. em The Clostridium; Capítulo 10: Clostridial Diseases of Animais, Molecular Biology and Pathogenesis, ed. Rood, J.I. et al., Academic Press Ltd. (1997) ISBN 0-12-595020-9.
Das espécies Clostrídicas atualmente conhecidas, a Clostridium perfringens é às vezes considerada ser o patógeno bacteriano mais largamente ocorrente e de todas as espécies Clostrídicas ela certamente é a mais importante causa de doença entérica Clostrídica em animais domésticos. A espécie Clostridium perfringens é subdividida em cinco tipos; tipo Α-E, com base nas principais toxinas que eles produzem.
Clostridium perfringens tipos AeCe Clostridium difficile são os principais patógenos clostrídicos entéricos de suínos.
As infecções entéricas clostrídicas e porcos foram mais especificamente descritas por Songer, J. G. e Uzal, F.A. (J. Vet. Diagn. Invest 17: 528-536(2005)).
Clostridium perfringens tipo C infecta porcos, gado vacum, frangos, humanos, carneiros, cães e cavalos. Os porquinhos são os mais vulneráveis a infecção por Clostridium perfringens tipo C. Em porquinhos de 1-2 dias de idade, a infecção provoca taxas de morbidez entre 30% - 50% e taxas de fatalidade de 50% - 100%. Porquinhos mais velhos (1-2 semanas de idade) podem ter um curso de infecção mais longo. As porcas são a fonte comum de infecção. A abordagem comum para a proteção de porquinhos é vacinação das porcas com uma vacina de Clostridium perfringens tipo C, a fim de induzir anticorpos que são transferidos para sua descendência via o colostro. Isto resulta em um elevado nível de proteção em porquinhos naquele momento do tempo em que eles são mais vulneráveis a infecção Clostrídica.
Tais vacinas são baseadas em toxóides. Usualmente elas são vacinas de sobrenadante destoxificadas, em que nenhuma célula está presente. As vacinas toxóides foram descritas por Springer, S. e Selbitz, H.-J. (FEMS Immun. and Medicai Microbiol. 24: 333 - 336 (1999)).
Clostridium perfringens tipo A infecta cordeiros, cabras, bezerros, frangos, porcos, cavalos, cães e humanos. Em porcos totalmente desenvolvidos, a Clostridium perfringens tipo A é um membro da flora normal do intestino. Portanto, é atualmente presumido que os porcos totalmente desenvolvidos não são adversamente afetados pela presença da Clostridium perfringens tipo A no intestino. Ela pode, entretanto, causar enterocolite necrótica em suínos e
porcos neonatais e desmamados. As vacinas para a proteção de porcos contra Clostridium perfringens tipo A são raras. Há atualmente somente uma (licenciada condicionalmente) vacina comercialmente disponível.
Uma das razões para isto pode ser o fato de, como dito acima, a Clostridium perfringens tipo A ser um membro da flora normal. Portanto, não se esperaria que acionasse o sistema imune. Como conseqüência, não se esperaria que a produção de anticorpos fosse induzida contra Clostridium perfringens tipo A. Se os anticorpos fossem induzidos, Clostridium perfringens tipo A não sobreviveria no intestino, muito menos seria um membro da flora normal. Como uma outra conseqüência, não se esperaria, naturalmente, que as porcas transmitissem qualquer proteção para sua descendência através do colostro. Seja qual for a razão, parece que a Clostridium perfringens tipo A não induz suficiente estimulação imune.
Foi agora surpreendentemente constatado que as vacinas de Clostridium perfringens tipo C, compreendendo sobrenadante de cultura destoxificado, são muito capaz de induzir proteção cruzada contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Mais surpreendente, foi constatado que a vacinação de porcas com sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C resulta em uma significativa proteção de seus porquinhos contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Mesmo mais surpreendente, descobriu-se que mesmos as porcas têm um melhor desempenho após esta vacinação. Isto é surpreendente porque era geralmente suposto, como mencionado acima, que os porcos totalmente desenvolvidos, tais como porcas, não eram adversamente afetados por infecção por Clostridium perfringens tipo A. Este achado pela primeira vez prova que ocorre ao contrário.
Portanto, uma primeira forma de realização da presente invenção refere-se ao uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcos totalmente desenvolvidos contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Uma segunda forma de realização da presente invenção refere- se ao uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcas contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Uma terceira forma de realização da presente invenção refere- se ao uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para porcas, para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Uma quarta forma de realização da presente invenção refere-se ao uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A. Como o técnico hábil entenderá, de feto o uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C, para a manufatura de uma vacina é um processo de duas etapas: a bactéria Clostridium perfringens tipo C é usada para crescimento em um meio de cultura, a fim de obter-se o sobrenadante de cultura que é a base para a manufatura da vacina de acordo com a presente invenção.
Portanto, outra forma de realização da presente invenção refere-se ao uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcos totalmente desenvolvidos contra infecção por Clostridium perfringens tipo A. Ainda outra forma de realização da presente invenção refere-se
ao uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C, para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcas contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Repetindo, outra forma de realização da presente invenção refere-se ao uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para porcas, para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Também uma forma de realização da presente invenção refere- se ao uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C para a manufatura de uma vacina para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
Dentro do tipo de toxina de Clostridium perfringens tipo C pode ser feita uma divisão entre aquelas cepas que produzem toxina beta-2 e aquelas cepas que não produzem. Cerca de 50% de todas as cepas de Clostridium perfringens tipo C produzem esta toxina.
Verificou-se que uma bactéria Clostridium perfringens tipo C que produza toxina beta-2 é mesmo mais adequada do que uma bactéria Clostridium perfringens tipo C que não produz toxina beta-2. Tais cepas e sua identificação são i.a. descritas por Fisher, D. J. et al. (Inf. & Immun. 74: 5200 -5210 (2006)).
Assim, uma forma preferida desta forma de realização refere- se ao uso em que uma bactéria Clostridium perfringens tipo C é usada que produz toxina beta-2.
As vacinas manufaturadas como descrito acima não são de
forma alguma as únicas vacinas que são administradas a porcos no processo de criação de porcos comerciais. As vacinas clostrídicas são freqüentemente dadas cerca do mesmo tempo que vacinas contra outros organismos e vírus patogênicos de porcos. Assim, em outra forma de realização preferida, a vacina
manufaturada como descrito na presente invenção adicionalmente compreende um ou mais antígenos derivados de organismos ou vírus patogênicos de porcos, anticorpos contra aqueles antígenos ou informação genética codificando tais antígenos. Tais organismos ou vírus são preferivelmente selecionados do
grupo de vírus da pseudo-raiva, vírus PRRS, vírus de influenza de porcinos, parvo vírus de porcino, vírus da gastroenterite transmissível, Rotavírus, Escherichia eoli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptiea, Salmonella typhimurium, Salmonella eoleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Myeoplasma hyopneumoniae, Braehyspira hyodyserenteriae e Actinobacillus pleuropneumoniae.
Portanto, uma forma mais preferida desta forma de realização refere-se a uma vacina manufaturada como descrito na presente invenção, que adicionalmente compreenda um ou mais antígenos derivados de organismos ou vírus patogênicos de porco, em que estes organismos ou vírus são selecionados do grupo de vírus da pseudo-raiva, vírus PRRS, vírus de influenza de porcino, parvo vírus de porcino, vírus da gastroenterite transmissível, Rotavírus, Escheriehia eoli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptiea, Salmonella typhimurium, Salmonella eholeraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Myeoplasma hyopneumoniae, Braehyspira hyodysenteriae e Actinobacillus pleuropneumoniae.
Em seguida a infecção por Clostridium perfringens, os leitões freqüentemente sofrem de infecção por Eseheriehia eoli. Eseheriehia eoli é a causa de outra doença entérica severa em leitões. Portanto, os leitões ou porcas grávidas são freqüentemente vacinadas com vacinas de Eseheriehia eoli. As vacinas de Eseheriehia eoli são comumente usadas no campo e elas são comercialmente disponíveis. Uma vacina de combinação compreendendo tanto sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C como componentes de vacinas de Eseheriehia eoli é altamente desejável porque ela protege contra infecção por Clostridium perfringens tipo C, Clostridium perfringens tipo A e Eseheriehia eoli.
Portanto, uma forma mais preferida desta forma de realização refere-se a uma vacina manufaturada como descrito na presente invenção, que adicionalmente compreende um ou mais antígenos derivados do organismo patogênico de porco Eseheriehia eoli.
A invenção é exemplificada em uma maneira não limitante nos seguintes exemplos. Exemplos
Produção de antígeno de Clostridium perfringens tipo C
Uma cepa de Clostridium perfringens tipo C padrão, cepa 587 (também designada CWC l/S, da Weybridge U.K. Collection), foi cultivada em um fermentador até o início da fase de crescimento estacionário. A cultura foi centrifugada e a pelota contendo as células bacterianas foi descartada. Formaldeído foi adicionado ao sobrenadante a uma concentração final de 0,5% v/v para inativar as toxinas, seguido por concentração por meio de ultra filtragem e filtragem de 0,2 μιη. Preparação da vacina
Uma vacina foi formulada misturando-se o antígeno Clostridium perfringens tipo C e um adjuvante baseado em cotoferol. Cada dose da vacina (2 ml) consistiu de 20 μΐ de um concentrado de sobrenadante de cultura toxóide de antígeno Clostridium perfringens tipo C concentrado 17 vezes. A vacina satisfazia a monografia 0363 da European Pharmacopoeia (vacina de Clostridium perfringens para uso veterinário) referente a segurança e potência das vacinas tipo C.
Adicionalmente, neste experimento, antígenos de Escherichia coli (fímbrias F4ab, F4ac, F5 e F6 e toxina instável ao calor) foram adicionados para suprimir possível infecção por Eseheriehia coli. Estes componentes são conhecidos na arte e o técnico hábil saberia como produzir uma vacina com base nestes componentes.
Alternativamente, entretanto, o técnico hábil poderia usar uma vacina de Eseheriehia coli comercialmente disponível e pronta para uso, tal como Porcilis Porcoli DF (obtenível através da Intervet Int. B.V., Wim de Korverstraat 35, Boxmeer, Países Baixos).
A vacina de controle compreende os mesmos componentes, exceto quanto ao antígeno de Clostridium perfringens tipo C, que não estava presente no grupo de controle. Proteção de porcas
Uma fazenda de produção de porcos holandesa, em que havia um surto clínico de Clostridium perfringens tipo A, foi selecionada para um estudo duplo cego de eficácia de campo aleatorizado. O isolado de Clostridium perfringens tipo A da fazenda foi constatado produzir tanto toxina-α como toxina β2.
As porcas foram vacinadas IM durante a gravidez, a aproximadamente 6 e 2 semanas antes de parir, com uma vacina contendo antígenos de Escheriehia coli somente (grupo de controle) ou com uma vacina contendo antígenos de Escherichia coli e antígeno de Clostridium perfringens tipo C (grupo de teste). As vacinas foram codificadas por cor (vacina de teste 2x, vacina de controle lx) para assegurar cegueira, e a distribuição das porcas através dos grupos era de aproximadamente 2:1 (Tabela 1).
Tabela 1. Tamanhos de grupo
Grupo Número de porcas Número de leitões nascidos vivos por porca Número total de leitões Controle 41 11,6 453 Teste 77 12,1 904
Do dia da primeira vacinação até o tempo de desmamar dos leitões (3-4 semanas após parir), as porcas foram observadas a cada 3 dias quanto à saúde geral, ingestão de alimentos e diarréia. Para facilitar a análise estatística, um sistema de classificação clínica foi usado (Tabela 2). Os leitões nascidos das porcas vacinadas foram observados diariamente durante a primeira semana de vida, uma vez cada três dias a partir de uma semana até desmamar e semanalmente em seguida até o final do período de amamentação. Saúde geral, ingestão de alimentos, diarréia e mortalidade foram registrados (Tabela 2). Tabela 2. Sistema de classificação usado para porcas e leitões:
Classificação Clínica Conduta Apetite Consistência Fecal Composição Fecal 0 Normal Normal Normal Normal 1 Deprimida Ligeira inapetência Mole Muco presente 2 Letárgica Inapetência marcante Líquida Muco com sangue presente 3 Moribundo Não mamando Aquosa Sangue presente com depósitos intestinais
Resultados
Tabela 3. Observações clínicas das porcas
Classificação (N) O 1 2 3 Média Comportamento Geral Controle 687 99 51 20 0,30 Teste 1623 33 0 0 0,02 Apetite Controle 597 139 71 49 0,50 Teste 1598 47 9 0 0,04 Consistência Fecal Controle 385 250 153 68 0,89 Teste 1564 67 17 7 0,07 Composição Fecal Controle 780 71 4 0 0,09 Teste 1647 8 0 0 0,01 A Tabela 3 mostra o efeito da vacinação com uma vacina compreendendo os antígenos de Clostridium perfringens tipo C comparados com vacinação com uma vacina sem antígenos de Clostridium perfringens tipo C.
Como segue sem dúvida pela Tabela 3, a vacinação com a
vacina compreendendo os antígenos de Clostridium perfringens tipo C resultou em uma melhoria muito significativa do status de saúde das porcas. Proteção da descendência de porcas vacinadas
A taxa de mortalidade também das ninhadas das porcas que tinham sido vacinadas com a vacina compreendendo os antígenos de Clostridium perfringens tipo C foi comparada com aquela das ninhadas de porcas que tinham sido vacinadas com uma vacina sem antígenos de Clostridium perfringens tipo C.
Como conclui-se sem dúvida pela Tabela 4, a taxa de mortalidade das ninhadas das porcas que tinham sido vacinadas com a vacina compreendendo os antígenos de Clostridium perfringens tipo C foi significativamente mais baixa do que no grupo de controle.
Além disso, a Tabela 5 mostra que os leitões das porcas que tinham sido vacinadas com a vacina compreendendo os antígenos de Clostridium perfringens tipo C tinham significativamente mais baixas classificações clínicas do que os do grupo de controle.
Tabela 4. Mortalidade semanal das ninhadas de controle e de teste
Idade (dias) Controle Teste 0-6 29 22 7-13 3 3 14-21 7 2 21-27 6 1 28-34 2 1 35-41 0 0 42-48 1 1 49-55 1 1 56-62 0 0 63-70 0 0 Total (%) 50 (11,04) 31 (3,43) Tabela 5. Observações clínicas dos leitões
Classificação (N) 0 1 2 3 Média Comportamento Geral Controle 336 232 137 73 0,93 Teste 1159 271 55 11 0,28 Apetite Controle 426 166 128 58 0,77 Teste 1336 125 31 4 0,13 Consistência Fecal Controle 544 118 71 40 0,49 Teste 1419 48 17 12 0,08 Composição Fecal Controle 636 104 31 6 0,24 Teste 1414 70 10 1 0,06
Conclusão: os dados mostram que a vacinação de porcas com uma vacina contendo antígenos de Clostridium perfringens do tipo C resulta em uma melhora significante do estado de saúde de ambas as porcas vacinadas e sua prole em face de um surto de Clostridium perfringens tipo A.
Claims (12)
1. Uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcos totalmente desenvolvidos contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
2. Uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcas contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
3. Uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para porcas para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
4. Uso de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C, dito uso caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
5. Uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcos totalmente desenvolvidos contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
6. Uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de porcas contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
7. Uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para porcas para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo A.
8. Uso de um sobrenadante de cultura de Clostridium perfringens tipo C, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma vacina para a proteção de leitões contra infecção por Clostridium perfringens tipo Α.
9. Uso de acordo com a reivindicação 1 a 8, caracterizado pelo fato de uma bactéria Clostridium perfringens tipo C ser usada, que produz toxina beta-2.
10. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de para a manufatura de dita vacina serem usados adicionalmente um ou mais antígenos derivados de organismos ou vírus patogênicos de porco, anticorpos contra esses antígenos ou informação genética codificando tais antígenos.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de dito organismo ou vírus patogênico ser selecionado do grupo de vírus da Pseudo-raiva, vírus PRRS, vírus da influenza de Porcino, parvo vírus de Porcino, vírus da gastroenterite transmissível, Rotavírus, Escherichia eoli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Myeoplasma hyopneumoniae, Braehyspira hyodisenteriae e Actinobacillus pleuropneumoniae.
12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de dito organismo patogênico de porco ser Eseheriehia eoli.
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