BRPI0719263A2

BRPI0719263A2 - Produção de antibióticos de beta-lactama

Info

Publication number: BRPI0719263A2
Application number: BRPI0719263-0A
Authority: BR
Inventors: Marcus Hans; Roelof Ary Lans Bovenberg; Paul Klaassen; Remon Boer; Jan Metske Van Der Laan
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2006-10-05
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2014-07-15
Also published as: ES2447491T3; SI2084270T1; WO2008040731A3; EP2084270B1; KR20090086981A; EA016155B1; EP2084270A2; KR101444483B1; EA200900513A1; WO2008040731A2; US8293511B2; MX2009003594A; US20100009404A1

Description

PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS DE BETA-LACTAMA Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se a produção de antibióticos de β-lactama.

Fundamento da invenção

Antibióticos de β-Lactama são a maior família de metabólitos secundários produzidos na natureza por microorganismos. As classes mais importantes dos antibióticos de β-lactama clinicamente e economicamente são as penicilinas (penam) e cefalosporinas (cefem). Sua biossíntese ocorre por meio de uma via complexa de etapas enzimáticas. As duas primeiras etapas são as etapas chave nas vias biossintéticas das classes penam e cefem de antibióticos de β-lactama. Depois dessas duas etapas, as vias biossintéticas para penicilinas e cefalosporinas divergem. A primeira etapa na biossíntese dos antibióticos penicilina, cefalosporina e cefamicina é a condensação dos L-isômeros de três aminoácidos, ácido L-a-amino adípico (A), L-cisteína (C) e L-valina (V) , em um tripeptídeo, δ-(L-αaminoadipil) -L-cisteinil-D-valina ou ACV. Essa etapa é catalisada por δ-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetase ou ACVS. Na segunda etapa, o tripeptídeo ACV é oxidativamente ciclizado pela ação de Isopenicilina N sintase (aqui referida como IPNS) ou ciclase. 0 produto dessa reação é Isopenicilina N; esse composto contém as estruturas de anel típicas de β-lactama e tiazolidina e possui atividade antibacteriana. A partir da isopenicilina N, as penicilinas G ou V são formadas por troca da cadeia lateral hidrofílica de α-aminoadipil por uma cadeia lateral 3 0 hidrofóbica. As cadeias laterais comumente usadas em processos industriais são ácido fenilacético (PA), gerando penicilina Gi ou ácido fenoxiacético (POA), gerando penicilina V; essa reação de troca é catalisada pela enzima aciltransferase (AT) .

Devido à especificidade do substrato da enzima AT, não

é possível trocar a cadeia lateral de α-aminoadipil por qualquer cadeia lateral de interesse, embora tenha sido mostrado que ácido adípico e certos tio-derivados do ácido adípico possam ser trocados (veja WO 95/04148 e WO 10 95/04149) . Em particular, as cadeias laterais de penicilinas e cefalosporinas industrialmente importantes não podem ser diretamente trocadas via AT. Conseqüentemente, a maior parte dos antibióticos de β-lactama atualmente usados é preparada por métodos semi-sintéticos. Esses antibióticos de β-lactama 15 semi-sintéticos são obtidos por modificação de um produto Nsubstituido de β-lactama por uma ou mais reações químicas e/ou enzimáticas. Esses métodos semi-sintéticos têm a desvantagem de que eles incluem várias etapas, não são ambientalmente corretos, e são bastante caros. Seria, 20 portanto, altamente desejável aproveitar-se de uma via completamente fermentativa para antibióticos de β-lactama, por exemplo, para amoxacilina, ampicilina, cefadroxil e cefalexina.

Várias opções podem ser consideradas para uma via completamente fermentativa para antibióticos penam e cefem semi-sintéticos.

Por exemplo, uma pessoa pode se concentrar na troca da cadeia lateral de α-aminoadipil de isopenicilina N pela cadeia lateral adequada de interesse, por exemplo, a cadeia 3 0 lateral de α-amino-p-hidroxif enilacetil no caso de amoxacilina. Isso deve requerer modificação da especificidade do substrato da enzima AT, uma vez que a enzima nativa tem pouca especificidade do substrato e não é capaz de catalisar tal troca. Além disso, isso deve requerer 5 modificação da enzima CoA ligase que ativa a cadeia lateral para ser trocada.

Alternativamente, uma pessoa pode se concentrar na modificação das primeiras duas etapas na via biossintética da penicilina em uma tal forma que a amoxacilina seja diretamente sintetizada e secretada. No entanto, isso pode requerer substancial modificação das enzimas ACVS e IPNS.

Por exemplo, para amoxacilina, seria primeiramente necessária a produção de um tripeptídeo que produza a cadeia lateral da amoxacilina, ou seja, o tripeptídeo D-p15 hidroxifenilglicil-L-cisteinil-D-valina, em vez de ACV. Em segundo lugar, seria necessária uma enzima que seja capaz de ciclizar esse tripeptídeo.

ACVS é uma peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) que catalisa a formação do tripeptídeo LLD-ACV (δ-(L-α20 aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina). Nesse tripeptídeo, uma ligação de peptídeo é formada entre o grupo δ-carboxílico de ácido L-a-aminoadípico e o grupo amino de L-cisteína, e adicionalmente a conformação estereoquímica de valina é modificada de L para D.

Nos anos recentes, vários laboratórios e instituições

investigaram as opções para a construção de NRPS. Como abordagens principais, domínios e módulos foram modificados e, como uma conseqüência, novas especificidades foram introduzidas, levando a produtos de peptídeo modificados. Na 3 0 maioria dos casos, as abordagens de construção foram restritas aos fragmentos da enzima do mesmo organismo (ou ainda a mesma NRPS), limitando severamente as opções para a construção da enzima. Um problema principal da construção recente de NRPS enfocado na literatura é a mudança da 5 estereoquímica de um aminoácido do peptídeo, ou seja, uma mudança de estereoquímica L- para D-. Um domínio de condensação que forma ligação de peptídeo imediatamente abaixo de um domínio de epimerização é D-específico para o doador de peptidil ou aminoacil e L-específico para o 10 aceitador de amino acil. Tal domínio de condensação é representado como dCl. Um domínio lCl nessa posição não gera condensação das porções doadora e aceitadora (Clugston S.L. e cols. 2003, Biochemistry, 42, 12095-12104) . Um problema adicional que pode limitar opções para a construção é que os 15 domínios CeA são vistos como um par inseparável (Mootz H. D. e cols. 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 5848- 5853) .

Foi constatado de modo surpreendente agora que a construção de ACVS é viável para fornecer uma enzima

2 0 construída que é capaz de catalisar a formação de um tripeptídeo HpgCV ou PgCV, em que, na ligação do peptídeo Nterminal, é usado um grupo α-carboxílico em vez do grupo δcarboxílico que é usado no tripeptídeo natural ACV e, adicionalmente, que é capaz de modificar a configuração 25 estereoquímica L do primeiro aminoácido a uma configuração a D.

Vários grupos também investigaram a especificidade do substrato da enzima IPNS. Veja, para revisões sobre esse tópico, Baldwin and Bradley, Chem. Rev. 1990, 90, 1079-1088 and Huffman e cols. J. Med. Chem. 1992, 35, 1897-1914. Por exemplo, um substrato de m-COOH-DL-fenilglicil-L-cisteinilD-valina e p-hidroxifenilacetil-L-cisteinil-D-valina foram mencionados por não resultarem em atividade antibiótica (Huffman e cols., supra).

É também surpreendentemente constatado que a enzima

nativa IPNS é capaz de agir sobre os tripeptídeos Hidroxifenilglicil-Cisteinil-Valina (HpgCV) e FenilglicilCisteinil-Valina (PgCV), mais particularmente sobre as DLDvariantes desses tripeptídeos. O achado dessa característica 10 de IPNS abre caminhos para novos desenvolvimentos, entre eles o rastreamento de variantes de IPN S para isolar moléculas de IPNS com uma melhor atividade sobre esses peptídeos não nativos. Os achados da presente invenção pela primeira vez permitem uma produção completamente 15 fermentativa de antibióticos que anteriormente poderiam ser obtidos por meio de vias semi-sintéticas, apenas.

Descrição detalhada da invenção

Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um antibiótico de β20 lactama de Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou N-aaminofenilacetil que compreende o contato de um tripeptídeo hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) ou tripeptídeo fenilglicil-cisteinil-valina (PgCV) com uma IPNS para efetuar a formação do antibiótico de β-lactama N-a-amino25 hidroxifenilacetil ou Ν-α-aminofenilacetil.

A presente invenção mostra surpreendentemente pela primeira vez que a enzima IPNS é capaz de converter os substratos de tripeptídeo não nativo HpgCV ou PgCV, respectivamente, a compostos de β-lactama com uma cadeia 3 0 lateral de Ν-α-amino-hidroxif enilacetil ou N-aaminofenilacetil, respectivamente, como amoxacilina ou ampicilina, respectivamente.

De acordo com a invenção, uma "enzima IPNS" ou uma "enzima com atividade de IPNS" é uma enzima que cicliza um 5 tripeptídeo HpgCV ou PgCV a uma molécula de antibiótico penam. Tais enzimas IPNS têm tipicamente um grau de identidade à seqüência de aminoácidos de IPNS de Emericella (Aspergillus) nidulans de Id. de Seq. N° : 1 de pelo menos 50%.

Os aminoácidos hidroxifenilglicina (Hpg) e nd

fenilglicina (Pg) nesses tripeptídeos podem estar na forma D bem como na forma L, mas preferivelmente estão na forma D. A hidroxifenilglicina preferivelmente é p-hidroxifenilglicina.

A detecção dessa atividade de ciclização de tripeptídeo não nativo de IPNS é feita com o uso de um bioensaio e/ou uso de análise LC/MS.

Foram necessárias várias escolhas para o desenvolvimento do bioensaio. Por exemplo, foi necessário selecionar um microorganismo adequado para o teste da 20 atividade antibiótica. Além disso, foi necessário selecionar uma IPNS adequada uma vez que as enzimas IPNS de diferentes espécies parecem diferir em atividade e estabilidade específicas.

Agora que a atividade de ciclização de tripeptídeo não nativo de IPNS como acima mencionada foi detectada, é possível otimizar as condições de reação e rastrear variantes de IPNS por enzimas com melhor atividade específica e/ou especificidade alterada do substrato.

A ciclização in vitro do tripeptídeo não nativo para 3 0 gerar um antibiótico penam é tipicamente feita com o uso das condições de reação abaixo mencionadas.

O pH da mistura de reação pode estar entre 6 e 8, com o uso de qualquer tampão adequado. A mistura de reação também deve conter uma quantidade adequada de íons de 5 Fe(II). Finalmente, a presença de um agente de redução, por exemplo, DTT ou TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfino), é necessária para manter o tripeptídeo precursor em um estado reduzido. Preferivelmente, o tripeptídeo precursor é prétratado com um tal agente de redução adequado.

Opcionalmente, o antibiótico penam formado, como

amoxacilina ou ampicilina, também pode ser convertido para produzir um composto antibiótico cefem. Essa conversão requer pelo menos a enzima expandase, por exemplo, para formar cefadroxil ou cefalexina. Opcionalmente, outros 15 compostos cefem podem ser formados por versões adicionais de enzima com o uso, por exemplo, de atividade de enzima hidroxilase e acetil transferase ou atividade de enzima hidroxilase e carbamoil transferase. As enzimas necessárias para essas conversões são adequadamente obtidas a partir de 20 microorganismos produtores de cefem, como Streptomyces clavuligerus, Nocardia laetamdurans ou Aeremonium chrysogenum. Veja, para uma revisão recente, Liras and Martin, International Microbiology (2006) 9: 9-19.

Em uma modalidade preferida da invenção, uma enzima IPNS é usada como é descrito abaixo.

Em uma modalidade, tripeptídeos HpgCV e PgCV são usados como compostos de iniciação no processo. Em outra modalidade, os tripeptídeos HpgCV e PgCV são produzidos em um processo que compreende i) o contato dos aminoácidos hidroxifenilglicina (Hpg) ou fenilglicina (Pg), cisteína (C)

I e valina (V) com uma peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) para efetuar a formação do tripeptídeo hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) ou fenilglicilcisteinil-valina (PgCV).

A NRPS para uso nessa modalidade é uma NRPS não

natural com uma estrutura modular que compreende três módulos, um primeiro módulo Ml específico para Hpg ou Pg, um segundo módulo M2 específico para C, e um terceiro módulo M3 específico para V, como é aqui descrito abaixo.

O processo geral para a produção de um antibiótico de

β-lactama Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou N-a

aminofenilacetil a partir de seus aminoácidos precursores compreende, portanto, i) o contato dos aminoácidos hidroxifenilglicina (Hpg) ou fenilglicina (Pg), cisteína (C)

e valina (V) com uma peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) para efetuar a formação do tripeptídeo hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) ou fenilglicilcisteinil-valina (PgCV), e ii) contato dos referidos tripeptídeos com IPNS para efetuar a formação do antibiótico

2 0 de β-lactama N-a-amino-hidroxifenilacetil ou N-aaminofenilacetil.

Os processos podem ser realizados in vivo com o uso de uma cepa microbiana adequadamente construída, como aqui descrito abaixo.

2 5 Em um segundo aspecto da invenção, são fornecidos

polipeptídeos de IPNS variante que são modificados quando comparados a um polipeptídeo de IPNS parente e que têm uma melhor atividade de ciclização em um tripeptídeo HpgCV ou PgCV quando comparados a IPNS parente.

3 0 Uma "melhor atividade" de uma enzima IPNS variante de acordo com a invenção é uma atividade que assegura a produção de pelo menos 2 vezes a quantidade de atividade de antibiótico do tripeptídeo precursor quando comparada a IPNS parente, preferivelmente pelo menos 5 vezes a quantidade, 5 mais preferivelmente pelo menos 10 vezes a quantidade. Se a IPNS parente tem uma atividade indetectável sobre o peptídeo precursor, uma melhor atividade engloba qualquer atividade mensurável acima do limite de detecção.

Posições adequadas para modificação em uma IPNS 10 parente podem ser selecionadas com base nos critérios de a) criação de um espaço no centro ativo, e/ou b) enfraquecimento da ligação do terminal C ao sítio ativo. 0 terminal C da molécula de IPNS age como um quasi-substrato quando a enzima não é carregada com um substrato e assim 15 compete com o substrato por ligação de sítio ativo. Com a abordagem do substrato ao centro ativo, o terminal C retirase, criando espaço para o substrato. Pode ser benéfico trocar essa competição em favor da ligação do substrato.

A IPNS parente pode se originar de qualquer fonte microbiana adequada, como aqui mencionado.

Uma enzima IPNS variante particular da invenção, quando alinhada a uma IPNS de Id. de Seq. N°: 1, é modificada quando comparada a uma enzima IPNS parente em pelo menos uma das posições 75, 91, 183, 185, 287, 321, 324, 25 331, e é capaz de converter o tripeptídeo HpgCV ou PgCV, respectivamente, ao antibiótico amoxacilina ou ampicilina, respectivamente. Modificações nessas posições criam mais espaço no bolso de ligação da cadeia lateral do peptídeo para acomodar as cadeias laterais mais volumosas de Hpg e Pg 3 0 dos tripeptídeos HpgCV e PgCV quando comparadas à cadeia lateral linear e flexível α-amino-adipil de ACV. Uma variante preferida contém uma modificação em todas as posições acima. Modificações preferidas nessas posições são as modificações 75LVT, 91FH, 183ACGTVL, 185STGAC, 28 7HSDQMK, 32IFSAVTQEM, 324NDSTVA, 33IGASCVDN. Modificações

especialmente preferidas são 75VT, 183AG, 185GA, 287HQ, 32IAVTM, 324NSA, 33IASVDN.

Uma modificação pode ser uma substituição de um aminoácido particular na posição indicada por um diferente aminoácido, pode ser uma inserção de um aminoácido na posição indicada, ou pode ser uma deleção de um aminoácido da posição indicada.

Uma outra enzima IPNS variante particular da invenção, quando alinhada a uma IPNS de Id. de Seq. N°: 1, é modificada quando comparada a uma enzima IPNS parente em pelo menos posição 185, e opcionalmente em pelo menos uma das seguintes posições, com a utilização da numeração de posição de Id. de Seq. N0: 1: 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, e é capaz de converter o tripeptídeo HpgCV ou PgCV, respectivamente, ao antibiótico amoxacilina ou ampicilina, respectivamente. Modificações nessas posições trocam a competição entre os resíduos de terminal C do substrato e IPNS -Q330-T331 por ligação no sítio ativo em favor do substrato por enfraquecimento da ligação do terminal C ao sítio ativo e/ou por estabilização da conformação em que o sítio ativo é disponível para ligação de substrato. Foi constatado de modo surpreendente que a modificação em pelo menos posição 185 confere uma atividade de ciclização altamente melhorada à enzima IPNS que contém a 3 0 modificação quando comparada a uma IPNS parente que não contém a modificação.

Uma variante preferida de acordo com a invenção compreende a modificação 185RKH, mais preferivelmente a modificação 185RK, mais preferivelmente a modificação 185R.

5 0 aminoácido original na posição 18 5 depende de uma IPNS parente que é usada; por exemplo, pode ser S, T ou V.

Em uma modalidade, a modificação 185RKH é combinada com uma modificação em pelo menos uma das posições 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, como mencionado na tabela 10 abaixo. Em particular, ReK podem interagir favoravelmente com o terminal C de T331 quando a região de terminal C N-GQ-T331 adotou a conformação ativa. Surpreendentemente, a interação entre 185RK e T331 é muito benéfica para aumento da atividade para HpgCV e PgCV. Provavelmente 18 5RK se 15 favorece da formação da conformação ativa com o uso de HpgCV e PgCV como substratos.

Nativa* Modificações preferidas Modificações particularmente preferidas Y91 H F F C104 A V S T L I V T L I 183 A C V T L I A C T P190 G A V N DQESTKRY A V S T 321 A I M Q A M Q L324 N D S T V A N D 1325 A L N Q E M L M Q T3 31 G A V S C C S * naquelas posições em que um aminoácido é especificado, o aminoácido particular é conservado em todas as enzimas sIPNS nativas conhecidas até hoje. Na presente invenção, uma denotação como, por exemplo, "185RK", significa que o aminoácido na posição 185 de uma IPNS parente em questão é substituído com R ou K, ou que os na posição 185 de uma IPNS parente R ou K são 5 inseridos quando, em uma IPNS parente, nenhum aminoácido está presente nessa posição. A natureza do resíduo de aminoácido original dependerá da IPNS parente que é usada. Uma designação como, por exemplo, "VST185RK", significa que um resíduo de aminoácido específico na posição 185 presente 10 na IPNS parente, nesse exemplo, V, S ou T, é substituído por um aminoácido diferente, nesse exemplo, R ou K.

Uma IPNS parente adequada é um polipeptídeo de IPNS obtido de um organismo fúngico ou bacteriano capaz de produzir β-lactams. Uma IPNS parente preferida é uma IPNS obtida a partir de Cephalosporium acremonium, Penicillium chrysogenum, Aspergillus (Emericella) nidulans,

Streptomyces jumonjinensis, Noeardia laetamdurans, Streptomyees mieroflavis, Lysobaeter laetamgenus,

Flavobacterium speeies, Streptomyees clavuligerus, Streptomyees griseus e/ou Streptomyees eattleya. Uma IPNS parente especialmente preferida é obtida a partir de Streptomyees clavuligerus e/ou Aspergillus (Emericella) nidulans. Tipicamente, tal IPNS parente é um polipeptídeo com atividade de IPNS que tem um grau de identidade de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 7 0%, mais preferivelmente pelo menos 75%, ou ainda mais preferivelmente de pelo menos 80% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1. Além das modificações como acima apresentadas, preferivelmente a modificação 185RKH, o polipeptídeo de IPNS pode compreender modificações adicionais que concernem a posições no polipeptídeo em que a modificação não afeta 5 substancialmente a dobra ou atividade do polipeptídeo. Tipicamente, tais modificações podem ser modificações conservadoras, por exemplo, substituições em que um aminoácido não polar, polar não carregado, polar carregado ou aromático é substituído por um aminoácido diferente da 10 mesma categoria, ou pode ser devido a variação intra-cepa ou intra-espécie. Polipeptídeos que têm tais modificações adicionais tipicamente têm um grau de identidade à seqüência de Id. de Seq. N°: 1 de pelo menos 50%.

Portanto, em uma modalidade, o polipeptídeo que tem 15 atividade de IPNS e que compreende pelo menos uma das modificações como acima apresentadas tem um grau de identidade de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 55%, more, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo 20 menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, ou ainda mais preferivelmente pelo menos 80% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N° : 1.

Os termos "homologia" ou "percentual de identidade" são usados de modo intercambiável nesta especificação. Para 25 o objetivo desta invenção, é aqui definido que, para determinar o percentual de identidade de duas seqüências de aminoácidos, as seqüências são alinhadas para objetivos de comparação (por exemplo, gaps podem ser introduzidos em cada seqüência para alinhamento ótimo). Os resíduos de 3 0 aminoácido em posições correspondentes de aminoácido são então comparados. Quando a posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido que a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição. 0 percentual de identidade entre 5 as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas seqüências (ou seja, % identidade = número de posições idênticas/número total de posições (ou seja, posições que se sobrepõem incluindo intervalos) x 100). Preferivelmente, as duas seqüências têm 10 o mesmo comprimento.

A pessoa habilitada estará ciente do fato de que vários diferentes programas de computador são disponíveis para determinar a homologia entre duas seqüências. Por exemplo, uma comparação de seqüências e determinação do 15 percentual de identidade entre duas seqüências pode ser realizada com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444- 20 453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de programas Accelrys GCG (siponivel em

http: //www. accelrys. com/produtos/gcg/) , com o uso de uma matriz Blossom 62 ou matriz PAM250, e um gap weight de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um lenght weight de 0,5, 1, 2, 3, 25 4, 5 ou 6. A pessoa habilitada perceberá que esses diferentes parâmetros produzirão resultados levemente diferentes, mas que a percentagem de identidade geral das duas seqüências não é significativamente alterada quando do uso de diferentes algoritmos. Preferivelmente, a matriz é 30 uma matriz Blossom 62 com um gap weight de 10,0 e um length weight de 0,5.

As seqüências de proteína da presente invenção podem ser também usadas como uma "seqüência query" para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, 5 para identificar outros membros da família ou seqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas blastp, psi-blast, phi-blast e tblastn (versão 2.0) de Altschul, e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Quando da utilização de programas blastp, psi

blast, phi-blast e tblastn, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, programas blastp, psiblast, phi-blast e tblastn) podem ser usados. Veja a página inicial do "National Center for Biotechnology Information em www.ncbi.nlm.nih.gov.

Em um terceiro aspecto, é fornecido um polipeptídeo

que é uma Peptídeo Sintetase não ribossômica que compreende módulos, um primeiro módulo Ml específico para Hpg ou Pg, um segundo módulo M2 específico para C, e um terceiro módulo M3 específico para V. Com o termo "específico para" um

2 0 aminoácido para caracterizar um módulo, entende-se que o

módulo particular permite a incorporação do aminoácido indicado. 0 primeiro módulo Ml permite a incorporação de um primeiro aminoácido L-p-hidroxifenilglicina ou Lfenilglicina e, preferivelmente, sua conversão ao D

aminoácido correspondente. 0 segundo módulo M2 permite a incorporação do aminoácido L-cisteína enquanto é ligado ao aminoácido Hpg ou Pg. Em particular, quando o aminoácido Hpg ou Pg é em sua forma D, ο M2 módulo específico para C compreende um domínio dCl que é fundido a um domínio A que é

3 0 heterólogo. 0 terceiro módulo M3 permite a incorporação do aminoácido L-valina e sua conversão ao D-aminoácido correspondente. Desse modo, peptídeo sintetase catalisa a formação de uma DLD-tripeptídeo HidroxifenilglicilCisteinil-Valina (HpgCV) ou Fenilglicil-Cisteinil-Valina 5 (PgCV) a partir de seus precursores de L-aminoácido Hpg ou Pg, C e V.

O termo "módulo" como usado na presente invenção define uma unidade catalítica que permite a incorporação de um bloco de construção de peptídeo, usualmente um 10 aminoácido, no produto, comumente um peptídeo, e pode incluir domínios para modificações como epimerização e metilação.

Cada módulo de uma NRPS é composto dos chamados "domínios", cada domínio sendo responsável por uma etapa 15 específica da reação na incorporação de um bloco de construção de peptídeo. Cada módulo pelo menos contém um domínio de adenilação (domínio A) , responsável por reconhecimento e ativação de um aminoácido especificado, e um domínio de tiolação (domínio T ou PCP), responsável por 20 transporte de intermediários para os centros catalíticos. 0 segundo e os módulos adicionais também contêm um domínio de condensação (domínio C), responsável pela formação da ligação de peptídeo, e o último módulo também contém um domínio de terminação (domínio TE) , responsável por 25 liberação do peptídeo. Opcionalmente, um módulo pode conter domínios adicionais como um domínio de epimerização (domínio E) , responsável pela conversão da L-forma do aminoácido incorporado à D-forma. Veja Sieber S. A. e cols. 2005, Chem. Rev., 105, 715-738 para uma revisão da estrutura modular de

3 0 NRPS. Uma fonte adequada para o módulo Ml da peptídeo sintetase híbrida é uma enzima NRPS que catalisa a formação de um peptídeo que compreende o aminoácido X, em que X é Hpg ou Pg, para ser incorporado como primeiro aminoácido no 5 tripeptídeo XCV. Portanto, um módulo Ml adequado é selecionado levando em consideração a natureza do aminoácido a ser incorporado como primeiro aminoácido do tripeptídeo. Em particular, o domínio A de um módulo determina a seletividade para um aminoácido particular. Assim, um módulo 10 Ml pode ser selecionado com base na especificidade de um domínio A para o aminoácido a ser incorporado. Tal seleção pode ocorrer de acordo com o motivo de assinatura que determina especificidade dos domínios A como definido por Stachelhaus T. e cols. 1999, Chem. & Biol., 8, 493-505.

O módulo Ml não precisa conter um domínio C e um

domínio TE, como sendo o primeiro módulo da NRPS. Assim, se presente no módulo de fonte, um domínio C e/ou TE pode ser adequadamente removido, para obter um primeiro módulo Ml sem um domínio C e/ou TE. Em adição a um domínio A e T, o módulo 20 Ml da NRPS deve conter um domínio E, se um L-aminoácido precisar ser convertido a um D-aminoácido. Assim, se não presente no módulo fonte, um domínio E é fundido ao domínio t do módulo fonte, para obter um primeiro módulo Ml que contém um domínio A, TeE.

2 5 Em geral, a especificidade do módulo da NRPS para p

hidroxifenilglicina ou fenilglicina pode ser julgada por dados experimentais e/ou pode ser baseada no motivo de assinatura que determina especificidade de domínios A publicados por Stachelhaus T. e cols. 1999, Chem. & Biol., 8, 493-505. Preferivelmente, um primeiro módulo Ml com especificidade de p-hidroxifenilglicina é obtido a partir de uma CDA (antibiótico Cálcio-Dependente) Sintetase, em particular é o sexto módulo de uma CDA sintetase (a numeração de módulos de CDA Sintetase é dada como publicado por Hojati Z. e cols. 2002, Chem. & Biol., 9, 1175-1187). Preferivelmente, a CDA sintetase é obtida a partir de Streptomyces coelicolor. Alternativamente, módulos específicos para Hpg podem ser obtidos a partir de uma Cloroerenomicina Sintetase, em particular são o quarto e o quinto módulos de uma Cloroerenomicina Sintetase, preferivelmente uma Cloroerenomicina Sintetase obtida a partir de Amycolatopsis orientalis (Trauger J.W. e cols. 2000, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 97, 3112-3117); ou de uma Complestatina Sintetase, em particular é o sétimo módulo de uma Complestatina Sintetase, preferivelmente uma Complestatina Sintetase obtida a partir de Streptomyces lavendulae (Chiu H.T. e cols. 2 0 01, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 98, 8548-8553). Todos esses módulos têm especificidade para L-Hpg e o convertem no D-estereoisômero.

Preferivelmente, um primeiro módulo Ml com especificidade de fenilglicina é obtido a partir de uma Pristinamicina Sintetase, em particular é o módulo Cterminal da proteína SnbD de Pristinamicina Sintetase, como 25 publicado em Thibaut, D. e cols. 1997, J. Bact., 179, 697- 704. Preferivelmente, a Pristinamicina Sintetase é obtida a partir de Streptomyces pristinaspiralis.

O módulo de fonte C-terminal de Pristinamicina Sintetase contém um domínio TE e não contém um domínio E.

3 0 Para preparar um módulo que funciona como um primeiro módulo na peptídeo sintetase da invenção, o domínio TE é adequadamente removido do módulo de fonte C-terminal e um domínio E é fundido ao domínio T do módulo C-terminal assim modificado. Um domínio E pode ser obtido a partir de 5 qualquer NRPS adequada, por exemplo, a partir de outro módulo da mesma enzima NRPS, ou também a partir de um módulo de uma enzima NRPS diferente com especificidade de aminoácido similar (por exemplo, p-hidroxifenilglicina ou fenilglicina) ou diferente do domínio de adenilação. 10 Preferivelmente, o domínio E é obtido a partir de uma CDA Sintetase de Streptomyces coelicolor, preferivelmente a partir do sexto módulo, como acima especificado. Portanto, nessa modalidade, o módulo Ml da NRPS é um módulo híbrido.

O segundo módulo M2 da peptídeo sintetase deve 15 permitir a incorporação do aminoácido cisteína como segundo aminoácido do tripeptídeo DLD-XCV, em que X é Hpg ou Pg. A seleção desse módulo pode ser baseada no motivo de assinatura de determinação de especificidade de domínios A como publicado por Stachelhaus T. e cols. 1999.

Para permitir a ligação do aceptor de L-cisteinil ao

doador de D-X-aminoacil, o domínio C do módulo M2 é um domínio dCl (como mencionado acima e como explicado em Clugston S.L. e cols. 2003). Esse domínio dCl é fundido a um domínio A que é heterólogo. 0 termo "heterólogo" como 25 usado nesse contexto significa que os domínios CeA são de diferentes módulos. Esses módulos diferentes podem ser da mesma enzima ou podem ser de diferentes enzimas. Preferivelmente, o domínio A é obtido a partir do segundo módulo de uma ACVS. De modo surpreendente, o módulo M2

3 0 híbrido que compreende tal configuração de domínio dCl-A parece ser capaz de incorporação do aminoácido cisteína.

Em uma modalidade preferida, o domínio dCl do módulo M2 é obtido a partir do módulo imediatamente abaixo do módulo que é a fonte do primeiro módulo Ml da peptídeo 5 sintetase da invenção. Por exemplo, o domínio dCl do módulo M2 da peptídeo sintetase é o domínio dCl do sétimo módulo da CDA sintetase que é a fonte do primeiro módulo Ml.

Em outra modalidade, o domínio dCl do módulo M2 de peptídeo sintetase é o domínio dCl do segundo módulo da Proteína Iturina Sintetase ItuC de Bacillus subtilis RB14, como definido por Tsuge K. e cols. 2001, J. Bact., 183, 6265-6273.

Em uma modalidade preferida da invenção, o segundo módulo M2 da peptídeo sintetase é pelo menos parcialmente 15 obtido a partir da enzima que é a fonte do terceiro módulo M3 da peptídeo sintetase. Em particular, os domínios AeT do módulo M2 da peptídeo sintetase são obtidos a partir do módulo imediatamente acima do módulo que é a fonte do terceiro módulo da peptídeo sintetase da invenção. Por

2 0 exemplo, os domínios A e T do módulo M2 da peptídeo sintetase podem ser os domínios A e T do segundo módulo de uma ACVS.

0 terceiro módulo M3 da peptídeo sintetase deve permitir a incorporação do aminoácido valina como o terceiro

2 5 aminoácido do tripeptídeo, bem como sua conversão à forma D,

para gerar o tripeptídeo DLD-XCV.

Em uma modalidade preferida da invenção, o terceiro módulo da peptídeo sintetase é obtido a partir de uma ACVS, em particular é o terceiro módulo de uma ACVS.

3 0 A ACVS como acima mencionada preferivelmente é uma ACVS bacteriana ou fúngica, mais preferivelmente uma ACVS bacteriana obtida a partir de Nocardia lactamdurans ou uma ACVS fúngica obtida a partir de um fungo filamentoso como Penieillium ehrysogenum, Aeremonium ehrysogenum, Aspergillus 5 nidulans.

Os módulos Ml, M2 e M3 da peptídeo sintetase podem ter as seqüências de aminoácidos como mostrado abaixo. No entanto, essas seqüências são mostradas apenas como exemplos e não pretendem limitar o escopo da invenção. A pessoa 10 habilitada perceberá que domínios A de NRPS, por exemplo, partilham cerca de 30-60% de identidade de seqüência de aminoácidos, até mesmo domínios A com especificidade para o mesmo aminoácido, mas de uma fonte diferente, e compreendem vários motivos de núcleo, dentre os quais um motivo de 15 assinatura de determinação de especificidade (Stachelhaus T. e cols. 1999).

O módulo Ml da peptídeo sintetase tem, por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de acordo com Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N0 : 4 ou uma seqüência de amino com um 20 percentual de identidade de pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N0: 2 ou Id. de Seq. N0 : 4. Tais módulos de polipeptídeo com um percentual de 25 identidade de pelo menos 30% são também chamados seqüências homólogas ou homólogos.

0 módulo M2 da peptídeo sintetase tem, por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de acordo com Id. de Seq. N°: 6 ou Id. de Seq. N0 : 8 ou uma seqüência de amino com um

3 0 percentual de identidade de pelo menos 3 0%, mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, e mais preferivelmente pelo menos 60% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 6 ou Id. de Seq. N0 : 8 .

5 O módulo M3 da peptídeo sintetase tem, por exemplo,

uma seqüência de aminoácidos de acordo com Id. de Seq. N0 : 10 ou uma seqüência de amino com um percentual de identidade de pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, e mais 10 preferivelmente pelo menos 60% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N0: 10.

Os módulos da peptídeo sintetase podem ser obtidos a partir de enzimas naturais NRPS como acima especificado ou podem ser derivados de tais enzimas naturais NRPS por 15 técnicas de mutagênese, como mutagênese aleatória e/ou sítio-direcionada e/ou embaralhamento de gene. Se necessário, um módulo fonte pode ser também construído para adicionar domínios necessários, deletar domínios desnecessários ou substituir um domínio por um domínio 2 0 correspondente de um outro módulo. Tipicamente, o domínio A de um módulo determina a especificidade por um aminoácido particular, enquanto os domínios EeC podem ser obtidos a partir de qualquer módulo de escolha. Por exemplo, em uma situação em que o módulo de fonte selecionado para

2 5 incorporação do primeiro aminoácido X não é um primeiro

módulo (Módulo Ml) na enzima de fonte e assim compreende um domínio C, o domínio C do módulo de fonte pode ser deletado. Em uma situação em que o módulo de fonte não contém um domínio E embora a epimerização do aminoácido incorporado

3 0 seja desejada, um domínio E adequado pode ser adicionado. Enzimas NRPS construídas podem ser projetadas por fusão dos domínios e/ou módulos adequados na ordem apropriada. É também possível trocar um módulo ou domínio de uma enzima por um módulo ou domínio adequado de uma outra 5 enzima. Essa fusão ou troca de domínios e/ou módulos pode ser feita com o uso de técnicas de engenharia genética comumente conhecidas na técnica. A fusão de dois diferentes domínios ou módulos pode ser tipicamente feita nas regiões de ligante que estão presentes entre os módulos ou domínios.

Veja, por exemplo, EP 1 255 816 e Mootz H.D. e cols. 2000, que revelam esses tipos de construções. Parte ou todas as seqüências também podem ser obtidas por síntese sob medida da seqüência de polinucleotídeos adequada.

Por exemplo, a fusão de um fragmento de tri-domínio

ATE de um módulo de NRPS específico para Hpg para o fragmento bi-modular específico para Cys-Valde uma ACVS pode ser feita como se segue. 0 fragmento de ATE de um módulo específico para Hpg pode ser isolado por digestão de enzima de restrição do gene correspondente de NRPS nas posições de

ligante, mais especificamente, entre o domínio Ceo domínio A do módulo específico para Hpg, no caso de um módulo Cterminal, ou entre o domínio Ceo domínio A do módulo específico para Hpg, e entre o domínio Eeo domínio subseqüente (domínio C ou TE) , no caso de um módulo de

2 5 alongamento interno. 0 fragmento bi-modular Cys-Val de ACVS

pode ser obtido: 1) deixando o terminal C intacto, e 2) trocando o domínio C do módulo especifico para Cys 2 por um domínio C que tem especificidade de dCl. Em analogia à isolação do fragmento ATE, um fragmento de quatro domínios

3 0 ATEC pode ser isolado incluindo o domínio C do módulo abaixo adjacente. O último é fundido ao fragmento bi-modular CysVal de ACVS sem o domínio C acima.

As enzimas NRPS como aqui descritas podem ser adequadamente submetidas a técnicas de mutagênese, por exemplo, para melhorar as propriedades catalíticas das enzimas.

Polipeptxdeos como aqui descritos podem ser produzidos por meios sintéticos, embora comumente eles sejam feitos de modo recombinante por expressão de uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo em um organismo hospedeiro adequado.

Em um quarto aspecto, são fornecidos polinucleotídeos (por exemplo, isolados e/ou purificados) que compreendem uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma IPNS variante ou os polipeptídeos de NRPS dos aspectos anteriores da invenção. Os polinucleotídeos da presente invenção também incluem quaisquer versões degeneradas de uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, a pessoa habilitada pode, com o uso de técnicas rotineiras, fazer substituições de nucleotídeos que não afetem a seqüência de proteínas codificada nos polinucleotídeos da invenção para refletir o uso de códon de qualquer organismo hospedeiro particular em que os polipeptídeos da invenção serão expressos. Preferivelmente, as seqüências codificadoras nos polinucleotídeos são otimizadas por otimização de par de códon.

A seqüência de polinucleotídeos da invenção pode ser RNA ou DNA e inclui DNA genômico, DNA sintético ou cDNA. Preferivelmente, o polinucleotídeo é uma seqüência de DNA.

Os polinucleotídeos que codificam os módulos Ml, M2 e Μ3 da enzima NRPS do primeiro aspecto podem, por exemplo, ter uma seqüência de nucleotídeos de acordo com Id. de Seq. N°: 3, Id. de Seq. N°: 5, Id. de Seq. N°: 7, Id. de Seq. N°: 9 e Id. de Seq. N°: 11, que codifica a seqüências de 5 aminoácidos de Id. de Seq. N°: 2, Id. de Seq. N°: 4, Id. de Seq. N°: 6, Id. de Seq. N°: 8 e Id. de Seq. N°: 10, ou podem ser seqüências de nucleotídeos que codificam homólogos das seqüências de aminoácidos acima mencionadas, como acima definido.

Polinucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com

métodos bem conhecidos na técnica. Eles podem ser produzidos por combinação de oligonucleotídeos sintetizados de acordo com e junto à seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo da invenção. Alternativamente, eles podem

ser sintetizados por mutagênese de um polinucleotídeo parental em qualquer posição desejada. Polinucleotídeos também podem ser usados para obter polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo modificado adicional, por exemplo, ao submeter polinucleotídeos a técnicas adicionais

2 0 de mutagênese.

Portanto, polipeptídeos com melhor atividade são tipicamente obtidos por um método que compreende as etapas de submeter um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo à mutagênese, rastreamento da população obtida de

2 5 polipeptídeos variantes para atividade desejada, e isolação

de variantes com uma melhor atividade.

A mutagênese pode ser feita com o uso de qualquer técnica adequada conhecida por pessoa habilitada na técnica. A mutagênese pode englobar a submissão de um polinucleotídeo

3 0 a mutagênese aleatória, bem como a mutagênese sítiodirecionada. Quando mutagênese sítio-direcionada é usada, ela é preferivelmente combinada com mutagênese de saturação na posição selecionada, permitindo a substituição do aminoácido original por qualquer outro aminoácido. Tecnologia de embaralhamento de Polinucleotídeo (embaralhamento de gene) (por exemplo, como revelado em W095/22625, W098/27230, W098/01581, WOOO/46344 e/ou W003/010183) pode ser usada para obter variantes com uma combinação aleatória de qualquer posição de variante presente em qualquer membro de uma população inicial de moléculas. A população inicial pode também incluir uma ou mais variantes de acordo com a invenção.

A invenção também fornece vetores que compreendem um polinucleotídeo da invenção, incluindo vetores ou cassetes de clonagem e expressão.

Em um vetor ou cassete de expressão, o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a uma seqüência reguladora que é capaz de fornecer a expressão de um polipeptídeo a partir de sua seqüência codificadora pela célula hospedeira. 0 termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem em sua maneira pretendida. Uma seqüência reguladora como um promotor, um intensificador ou um outro sinal regulador de expressão "operacionalmente ligado" a uma seqüência codificadora é posicionada de tal modo que a expressão de um polipeptídeo a partir de sua seqüência codificadora é realizada sob condições compatíveis com as seqüências reguladoras.

Promotores/intensificadores e outros sinais reguladores de expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual o cassete ou vetor de expressão é desenhado. Se o polipeptídeo é produzido como uma proteína secretada, a seqüência de polinucleotídeos que codifica uma forma madura do polipeptídeo no cassete de expressão é operacionalmente ligada à seqüência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal.

A seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo da invenção é preferivelmente introduzida em um hospedeiro como parte de um cassete de expressão. Para transformação do hospedeiro adequado com o cassete de expressão, são disponíveis procedimento de transformação que são bem conhecidos por pessoa habilitada. O cassete de expressão pode ser usado para transformação do hospedeiro como parte de um vetor que carrega um marcador selecionável, ou o cassete de expressão pode ser co-transformado como uma molécula separada junto com o vetor que carrega um marcador selecionável. O vetor pode compreender um ou mais genes de marcador selecionável.

Para a maioria dos fungos filamentosos e leveduras, a construção de expressão é preferivelmente integrada no genoma da célula hospedeira para obter transformantes estáveis. Naquele caso, as construções são integradas em lócus aleatórios no genoma, ou em lócus alvos predeterminados com o uso de recombinação homóloga.

Portanto, um quinto aspecto da invenção fornece células hospedeiras transformadas com ou que compreendem um polinucleotídeo ou vetor da invenção.

Células hospedeiras adequadas são células hospedeiras que permitem um alto nível de expressão de um polipeptídeo de interesse. Tais células hospedeiras são usáveis no caso dos polipeptídeos que necessitam ser produzidos e também para serem usados, por exemplo, em reações in vitro. Um hospedeiro heterólogo pode ser escolhido, em que o polipeptídeo da invenção é produzido em uma forma que é substancialmente livre de outros polipeptídeos com uma atividade similar que o polipeptídeo da invenção. Isso pode ser realizado por escolha de um hospedeiro que não produza normalmente tais polipeptídeos com atividade similar.

Células hospedeiras adequadas também são células capazes de produção de compostos de {3-lactama, preferivelmente células hospedeiras que possuem a capacidade para produzir compostos de β-lactama em altos níveis. As células hospedeiras podem ser, por exemplo, células procarióticas (por exemplo, bacterianas), fúngicas ou de levedura. O hospedeiro pode ser selecionado com base na escolha para produzir um composto penam ou cefem. Quando a produção de um composto cefem é contemplada, o hospedeiro pode conter nativamente os genes necessários da via biossintética que leva a um composto cefem, em particular genes que codificam atividade de expandase, e, opcionalmente, atividade de hidroxilase e acetil transferase. Alternativamente, um ou mais genes da via biossintética que leva a um composto cefem podem ser transformados em uma célula hospedeira desprovida desses genes. É, portanto, conhecido por pessoa habilitada, que as enzimas expandase e expandase/hidroxilase são capazes de expandir ampicilina e amoxacilina (Chin e cols. 2 0 03, FEMS Microbiol. Lett., 218, 251-257; Lloyd e cols. 2004, J. Biol. Chem. 279, 15420-15426).

Em uma modalidade, uma célula hospedeira adequada é uma célula em que os genes nativos que codificam uma ACVS e/ou enzima IPNSs são inativados, por exemplo, por 5 inativação de inserção. É também possível deletar o grupo biossintético de penicilina completo que compreende os genes que codificam ACVS, IPNS e AT. Nessa via, a produção do composto de p-lactama de interesse é possível sem produção simultânea da β-lactama natural. A inativação de 10 inserção pode assim ocorrer com o uso de um gene que codifica uma NRPS e/ou um gene que codifica uma IPNS como acima descrito. Em células hospedeiras que contêm cópias múltiplas de grupos de gene de {3-lactama, as células hospedeiras em que esses grupos são espontaneamente 15 deletados podem ser selecionadas. Por exemplo, a deleção de grupos de gene de {3-lactama é descrita no pedido de patente PCT/EP2007/054 04 5.

Outra célula hospedeira adequada é uma célula que é capaz de sintetizar os aminoácidos precursores Hpg ou Pg. A

2 0 expressão heteróloga dos genes da via biossintética que levam a Hpg ou Pg é revelada em WO 02/34921. A biossíntese de Pg ou Hpg é realizada por retirada de fenilpiruvato (PP) ou p-hidroxifenilpiruvato (HPP), respectivamente, da via de aminoácido aromático, conversão de PP ou HPP a ácido

2 5 mandélico (MA) ou ácido p-hidroximandélico (HMA), respectivamente, conversão de MA ou HMA a fenilglioxilato (PGL) ou p-hidroxifenilglioxilato (HPGL), respectivamente, e finalmente conversão de PGL ou HPGL a D-Pg ou D-Hpg, respectivamente. Exemplo 15 exemplifica a expressão de Hpg 30 ou Pg via biossintética em Penicillium chrysogenum. Outra célula hospedeira adequada é uma célula que superexpressa uma 4'-fosfo-panteteína transferase (PPTase). 4'-Fosfopanteteína (PPT) é um grupo protético essencial de, entre outros, proteínas de transporte de acil de ácido 5 graxo sintases e policetida sintases, e proteínas de transporte peptidil de NRPS's. A porção de tiol livre de PPT serve para ligar covalentemente os intermediários da reação de acil como tioésteres durante a montagem de multietapas dos precursores monoméricos, tipicamente grupos 10 acetil, malonil, e aminoacil. A porção PPT é derivada de coenzima A (CoA) e transferida pós-tradução para uma cadeia lateral de serina não variante. Essa conversão dependente de Mg2+ das apoproteínas às holoproteínas é catalisada pelas 4'-fosfopanteteína transferases (PPTases). É vantajoso 15 superexpressar uma PPTase com uma especificidade de substrato ampla. Tal PPTase é, por exemplo, codificada pelo gene gsp de Bacillus brevís (Borchert e cols. 1994, J. Bacteriology, 176, 2458-2462).

Um hospedeiro pode incluir adequadamente uma ou mais das modificações como acima mencionado. Um hospedeiro preferido é uma cepa de Penicilium chrysogenum.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um processo para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção por cultivo da célula hospedeira (por exemplo 25 transformada com um vetor ou cassete de expressão como acima descrito) sob condições que levem à expressão (pelo vetor ou cassete) do polipeptídeo de acordo com a invenção, e opcionalmente recuperação do polipeptídeo expresso. 0 polipeptídeo pode ser produzido como uma proteína secretada 3 0 em cujo caso a seqüência de polinucleotídeos que codifica uma forma madura do polipeptídeo na construção de expressão é operacionalmente ligada à seqüência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal. 0 polipeptídeo também pode ser produzido como uma proteína de fusão, ou seja, 5 fundido a (parte de) um outro polipeptídeo, por exemplo, fundido a proteína de ligação de maltose.

Para reações in vitro, um polipeptídeo secretado ou um extrato livre de células que compreende o polipeptídeo pode ser usado. Opcionalmente, o polipeptídeo pode ser (parcialmente) purificado antes de seu uso.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um processo para a preparação de um composto de β-Iactama por cultivo de uma célula hospedeira do aspecto anterior sob condições para fornecer a expressão do polipeptídeo de IPNS e/ou NRPS como aqui descrito e levar à produção de um composto de β-lactama, e opcionalmente recuperação do composto de β-lactama. De acordo com a invenção, o composto de β-Iactama que é produzido é um composto de β-lactama Nacilado, em que a cadeia lateral de N-acil é uma cadeia lateral de Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou N-aaminofenilacetil. Vantajosamente, a presente invenção revela a produção totalmente fermentativa de tais antibióticos de β-lactama. Exemplos de tais antibióticos de β-lactama são amoxacilina, ampicilina, cefadroxil e cefalexina.

As células hospedeiras de acordo com a invenção podem ser cultivadas com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e uma célula hospedeira, são disponíveis condições de cultura que levam

3 0 à expressão do polipeptídeo da invenção. Depois de atingir a densidade celular desejada ou título do polipeptídeo, a cultura é interrompida e o polipeptídeo é recuperado com o uso de procedimentos conhecidos. Adicionalmente, podem ser estabelecidas condições de fermentação que levam à produção de uma β-lactam.

O meio de fermentação pode compreender um meio de cultura conhecido que contém ma fonte de carbono (por exemplo, glicose, maltose, melado), uma fonte de nitrogênio (por exemplo, sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto

de amônio, fonte de nitrogênio orgânico, por exemplo, extrato de levedura, extrato de malte, peptona), vitaminas, e outras fontes inorgânicas de nutrientes (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, elementos de traço etc.). Opcionalmente, um indutor pode ser incluído.

A seleção do meio adequado pode ser baseada na

escolha do hospedeiro de expressão e/ou baseada nos requisitos reguladores da construção de expressão. Tais meios são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. 0 meio pode, se desejado, conter componentes adicionais que

2 0 favorecem os hospedeiros de expressão transformados sobre microorganismos potencialmente contaminantes. Também pode ser necessário suplementar o meio com compostos precursores para os compostos de β-lactama a serem produzidos. Por exemplo, pode ser necessário, dependendo do hospedeiro que

2 5 é usado, incluir os aminoácidos Hpg ou Pg no meio de

cultura. Se assim for, esses aminoácidos são preferivelmente adicionados como um aditivo separado.

A fermentação pode ser realizada por um período de 0,5-30 dias. Ela pode ser um processo em lote, contínuo ou

3 0 fed-batch, adequadamente em uma temperatura na faixa entre O e 45°C e, por exemplo, em um pH entre 2 e 10. Condições de fermentação preferidas são uma temperatura na faixa entre 2 0 e 37 0C e/ou um pH entre 3 e 9. As condições adequadas são comumente selecionadas com base na escolha do 5 hospedeiro de expressão e na proteína e/ou composto de βlactama a ser expresso. Depois da fermentação, se necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou filtração. Depois de a fermentação ser interrompida e/ou depois da remoção 10 das células, o polipeptídeo da invenção ou o composto de βlactama produzido pode ser recuperado com o uso de meios convencionais. A recuperação pode incluir etapas de purificação e/ou extração e/ou cristalização.

Convenientemente, o polipeptídeo da invenção ou o composto de β-lactama é combinado com veículos adequados (sólidos ou líquidos) ou diluentes incluindo tampões para produzir uma composição de polipeptídeo ou composto de βlactama. O polipeptídeo ou o composto de β-lactama pode ser ligado ou misturado com um veículo, por exemplo, imobilizado em um veículo sólido. Portanto, a presente invenção fornece em um aspecto adicional uma composição que compreende um polipeptídeo da invenção ou um composto de βlactama. Essa pode estar em uma forma adequada para embalagem, transporte e/ou estocagem, preferivelmente em que a atividade do polipeptídeo seja mantida. As composições podem estar em forma de pasta, líquida, emulsão, pó, flocos, granulada, pélete ou outra forma. EXEMPLOS

Materiais gerais e métodos

Procedimentos padrão de DNA foram realizados como descrito em outra parte (Sambrook, J. e cols., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2* Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), a menos que determinado de outra forma. O DNA foi amplificado 5 com o uso da enzima "Phusion polimerase" proofreading (Finnzymes). As enzimas de restrição eram de Invitrogen ou New England Biolabs. O crescimento fúngico foi realizado em um meio mineral, contendo (g/L): glicose (5); lactose (80); uréia (4,5); (NH4)2SO4 (1,1); Na2SO4 (2,9); KH2PO4 (5,2); 10 K2HPO4 (4,8) e 10 mL/L de uma solução A de elemento de traço contendo ácido cítrico (150); FeSO4.7H20 (15); MgSO4- 7H20 (150); H3BO3 (0,0075); CuSO4 . 5H20 (0,24); CoSO4.7H20 (0,375); ZnSO4 - 7H20 (5); MnSO4-H2O (2,28); CaCl2. 2H20 (0,99); pH antes da esterilização 6,5. Como meio 15 rico, foi usado YEPD, contendo (g/L): extrato de levedura (10); peptona (10); glicose (20). As culturas são incubadas a 25°C em um agitador orbital a 280 rpm por 72-168 h.

Transformações de Penicillium chrysogenum foram realizadas com a cepa Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089). 2 0 Outras cepas de P. chrysogenum, incluindo mutantes da cepa Wisconsin 54-1255, que têm um melhor rendimento de |3- lactama, são também adequadas. Um exemplo de tal cepa é CBS 455.95. Além disso, cepas de P. chrysogenum com mutações ou deleções que levam à ausência ou uma diminuição da produção 25 de β-Iactama são também adequadas como hospedeiros de transformação, por exemplo, cepas em que os grupos de gene de β-lactama são deletados como descrito no pedido de patente PCT/EP2007/054045.

A transformação de P. chrysogenum foi realizada como descrito em W02004/106347. Exemplo I

Cultivo de Penicilli um chrysogenum e análise de tripeptídeos não naturais como DLD-Hpg-Cys-Val ou DLD PgCys-Val

5 Penicillium chrysogenum foi cultivado em meio mineral

(25 mL) por 96 h a 25°C. Opcionalmente, culturas cresceram com ou sem aminoácidos como L-Hpg (1 mM de concentração final) ou L-Pg (1 mM de concentração final) . Ao final da fermentação, o micélio foi removido por centrifugação ou 10 filtração, e o micélio foi lavado com solução salina fisiológica. Tanto o micélio quanto o meio foram analisados para tripeptídeos como DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val, com o uso de técnicas de MS como LC-MS/MS. Como padrões, tripeptídeos DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val sintetizados 15 foram usados. Como um resultado, nem no micélio nem no meio os tripeptídeos como DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val foram identificados. Como uma conclusão, P. chrysogenum não produz esses tripeptídeos não naturais.

Exemplo 2

2 0 Clonagem do módulo da Peptídeo Sintetase não ribossômica e cassetes de domínio

2 a. Clonagem dos fragmentos do módulo de NRPS que catalisam a incorporação e subseqüente epimerização de LHpg para D-Hpg

2 5 DNA cromossômico foi isolado de Streptomyces

coelicolor A3(2). Subseqüentemente, reações de PCR foram realizadas, com a adição de 3-8% DMSO às misturas de reação, além disso, emprego de condições padrão. Os seguintes oligonucleotídeos foram usados: HpgFwl (caccatggcgacgctgccggaactgttc; Id. de Seq. N°: 12) e HpgRevl (tcaattaattaaccactc-ggactcaaggtcggac; Id. de Seq. N°: 13). O fragmento de PCR resultante Hpgl gerou um tridomínio ATE de módulo 6 de CDA I Sintetase de S. coelicolor, foi clonado em um vetor pENTR/SD/D-Topo 5 (Invitrogen, The Netherlands), resultando no plasmídeo PHpgl.

2 b. Síntese personalizada de um fragmento de módulo de NRPS sintético que catalisa a incorporação e subseqüente epimerização de L-Pg a D-Pg.

Um fragmento de DNA sintético que consiste na

seqüência de DNA de acordo com Id. de Seq. N0 : 5 foi sintetizado de modo personalizado (DNA 2.0, Menlo Park, CA, U.S.A.) . 0 fragmento de DNA ancora um tridomínio ATE. 0 fragmento AT se originou do módulo C-terminal da proteína 15 SnbD de S. pristinaspiralis Pristinamicina Sintetase, o domínio E foi retirado do módulo 6 da CDA Sintetase de S. coelicolor.

0 fragmento de DNA foi clonado no vetor pCR-Blunt (Invitrogen), com o uso do Protocolo fornecido pelo fornecedor, gerando o vetor pPgl.

2 c. Clonagem dos fragmentos de NPRS bi-modular específicos para incorporação de cisteína e valina

Para esses experimento, os genes de ACV (δ~ . (L-αaminoadipato)-L-Cisteína, D-Valina) Tripeptídeo Sintetase de 25 Penicillium chrysogenum e Nocardia lactamdurans foram tomados como modelos. As amplificações por PCR com o uso de modelos cromossômicos de DNA de cada organismo foram realizadas. Para P. chrysogenum, os seguintes oligonucleotídeos foram empregados: o par oligo PcM2M3fwl 30 (caccttaattaatgaggagaatgcagcaacggac; Id. de Seq. N°: 14) e PcM2M3revl (tcaatagcgagcgaggtgttc; Id. de Seq. N°: 15), resultando no Fragmento PcM2M3_l (organização de domínio CATCATETe), o par oligo PcM2M3fw2

(caccactagtctggagtatctctcatctatc; Id. de Seq. N°: 16) e 5 PcM2M3revl (tcaatagcgagcgaggtgttc; Id. de Seq. N°: 15), resultando no Fragmento PcM2M3_2 (organização de domínio ATCATETe). Fragmento PcM2M3_l foi clonado em pENTR/SD/D-Topo gerando pPcM2M3_l, e clonagem do fragmento PcM2M3_2 no mesmo vetor gerou o plasmídeo pPcM2M3_2. Em uma maneira análoga, 10 amplificações por PCR com DNA cromossômico de Nocardia lactamdurans foram realizadas. Reações que usam os oligonucleotídeos NlM2M3fwl

(caccttaattaatgccgaagaggtcaccacc; Id. de Seq. N°·. 17) e NlM2M3revl (ggtcatcgctccctagg; Id. de Seq. N°: 18) geram 15 fragmento de DNA N1M2M3_1 (organização de domínio CATCATETe), enquanto reações com os oligos NlM2M3fw2 (caccactagtctcatctcaccgtcgatg; Id. de Seq. N0 : 19) e NlM2M3revl (ggtcatcgctccctagg; Id. de Seq. N° : 18) resultaram em fragmento NlM2M3_2 (organização de domínio 20 ATCATETe). Ambos os fragmentos foram finalmente clonados em vetores pENTR/SD/D-Topo, gerando plasmídeos pNlM2M3_l e pNlM2M3_2, respectivamente.

2 d. Clonagem do fragmento de domínio de condensação de NRPS específico para a formação de ligação de peptídeo entre um D- e um L-aminoácido

Dois diferentes domínios de condensação com estereoquímica dCl foram clonados. O primeiro domínio foi amplificado por PCR a partir de CDAI Sintetase com o uso de DNA cromossômico de Streptomyces coelicolor, empregando os

3 0 oligonucleotídeos sc_C_fw(caccttaattaatagccagcaaccgacccgtgcg; Id. de Seq. N°: 20) e sc_C-rev (ttactagtgtcgcgggcgtacgcctcgtc; Id. de Seq. N°: 21), gerando fragmento sc_C. O segundo fragmento que consistiu em um dCl C-domínio de NRPS do módulo C2 de 5 Iturin Sintetase ItuC de B. subtilis, de acordo com Id. de Seq. N°: 22, foi sintetizado de modo personalizado e denominado Bs_C. Ambos os fragmentos foram clonados no vetor pENTR/SD/D-Topo, resultando nos plasmldeos pSC_C e pBS_C, respectivamente.

Exemplo 3

Construção de genes de Peptídeo Sintetase não ribossômica de tripeptídeo por fusão do módulo de NRPS clonada e cassetes de domínio

O plasmídeo pHpgl foi digerido com as enzimas de restrição PacI e AscI, resultando em um fragmento de DNA de 5,9 kb que contém o Gene de módulo de NRPS específico para Hpg e a maior parte da seqüência do vetor. 0 plasmídeo pPcMlM2_l foi cortado com AscI e PacI, mostrando um fragmento de DNA de 8,5 kb. A ligação desse fragmento e do fragmento de 5,9 kb de pHpgl gerou o vetor pSCPCHybridl. Plasmídeos pPcMlM2_2, pSC_C foram restritos com SpeI e AscI, resultando em fragmentos de 7,0 kb e 1,4 kb, respectivamente. Ambos os fragmentos foram ligados e geraram o plasmídeo pPcMlM2_3. Plasmídeos pPcMlM2_3 e plasmídeo pHpgl foram cortados com PciI e PacI, gerando fragmentos de 12 kb e 4,5 kb DNA, respectivamente. A ligação de ambos os fragmentos resultou na construção final pSC_SC_C_PCM2M3Hybridl. Restrição adicional de

pSC_SC_C_PCM2M3Hybridl e pBS_C com PacI e SpeI levou aos

3 0 fragmentos de 16 kb (pSC_SC_C_PCM2M3Hybridl sem o C-domínio do módulo 2 de ACV Sintetase) e 1,4 kb (C-domínio de Bacillus subtilis), respectivamente. A ligação de ambos os fragmentos gerou o plasmídeo pSC_BS_C_PCM2M3Hybrid2.

A restrição de pHpgl e pNlMlM2_l com PacI e AflII gerou fragmentos de DNA de 3,7 kb e 8,8 kb. A ligação de ambos os fragmentos gerou plasmídeo pSCNLHybridl. Plasmídeos pSC_SC_C_PCM2M3Hybridl e pNlMlM2_2 foram restritos com SpeI e AflII, resultando em fragmentos de 4 kb (organização de tetradomínio ATEC de módulo de Hpg e domínio (D)C(L)) e 7 kb (organização ATCATETe), respectivamente. A ligação de ambos os fragmentos gerou o plasmídeo pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl. Em analogia, plasmídeos pSC_BS_C_PCM2M3Hybridl e ρΝ1Μ1Μ2_2 foram restritos com SpeI e AflII, resultando em fragmentos de 4 kb (organização de tetradomínio ATEC de módulo de Hpg e domínio (D)C(L)) e 7 kb (organização ATCATETe) , respectivamente. A ligação gerou plasmídeo pSC_BS_C_NLM2M3Hybrid2.

Para a construção de um gene de fusão de Peptxdeo Sintetase não ribossômica específico para fenilglicina, os

2 0 plasmídeos pPgl e pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl foram restritos

com as enzimas de restrição AflII e PacI. 0 fragmento de DNA de 3,4 kb (que ancora o tridomínio de NRPS ATE) de pPgl foi ligado nos fragmentos do vetor de 14 kb obtidos por restrição de pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl, resultando no 25 plasmídeo pPg_SC_C_NlM2M3Hybridl. Em analogia, se o vetor pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl foi substituído pelo vetor pSC_BS_C_NLM2M3Hybrid2, o plasmídeo resultante foi pPg_BS_C_NlM2M3Hybrid2.

Exemplo 4 3 0 Construção de iam vetor de destino de expressão de Penicillium chysogenum Gateway® para Peptídeo Sintetases não ribossômicas híbridas

Plasmídeo pPT12, que ancora o cassete NotI-flanueado Promotor-Terminador da IPN Sintase de Penicillium chrysogenum, foi digerido com NotI (para descrição do vetor, veja Theilgaard e cols. 2000, Biotechnology and Bioengineering, 72, 380-387). 0 cassete obtido PromotorTerminador de IPNS foi clonado em pBluescriptII SK (Stratagene, The Netherlands), que também foi tratado com NotI. Ligação de Ied ao pProductl. Plasmídeo pProduct 1 foi restrito com BamHl e XhoI. Adicionalmente, um fragmento de DNA que ancorou um cassete de resistência a Pleomicina sob o controle de um promotor gpdA foi sintetizado de forma personalizada. 0 cassete tem uma seqüência de acordo com Id. de Seq. N0: 23.

Depois da restrição desse fragmento de DNA sintetizado de forma personalizada com BamHI e XhoI, o DNA resultante foi ligado no vetor pProductl (que foi aberto com BamHl, XhoI). 0 plasmídeo resultante foi denominado 20 pProduct2. Em uma etapa final de clonagem, um fragmento de DNA que contém um cassete attRl-cat-ccdB-attR2 (resistência a Cloranfenicol e um gene de toxicidade para E. coli) foi

Φ

amplificado por PCR de um Vetor de destino Gateway como pET-DEST42 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Os 25 oligonucleotídeos a seguir foram usados: adiante: ttatcgatttgcataaaaaacagac (Id. de Seq. N°: 24), rev: ttatcgatgcttaccttcaagcttcg (Id. de Seq. N°: 25). 0 fragmento de DNA resultante foi restrito com ClaI e subseqüentemente clonado em pProduct2, que foi previamente 3 0 aberto por digestão com ClaI também. Aqui, os plasmídeos foram rastreados com o fragmento attRl-cat-ccdB-attR2 ancorado em tal orientação que attRl é fundido próximo ao promotor de IPNS Pipns- 0 vetor de destino Gateway* resultante foi denominado pDEST-Pcexprl.

5 Exemplo 5

Construção de construções de expressão de P. chrysogenum para peptxdeo sintetases não ribossômicas

Para a construção de construções de expressão de P. chrysogenum, a reação de LR-Clonase Gateway® foi realizada 10 com o uso de condições padronizadas como descrito por Invitrogen. Para protocolos detalhados, veja manuais para a tecnologia Gateway® em http://www.invitrogen.com. Para a reação, os vetores de entrada pSCNLHybridl,

pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl e pSC_BS_C_NLM2M3Hybrid2 foram , , ®

incubados com o vetor de destino Gateway pDEST-Pcexprl. Veja a tabela 1 para os nomes do plasmídeo de expressão resultante.

Alternativamente, para a construção de construções de expressão de P. chrysogenum, as construções que contêm os 20 genes de NRPS de tripeptídeo construído foram funcionalmente ligadas ao cassete promotor-terminador flanqueado por NotI do pcbC-gene de Penicillium chrysogenum (para descrição do vetor, veja Theilgaard e cols. 2000, Biotechnology and Bioengineering, 72, 380-387) por PCR de 25 fusão. Veja a Tabela 1 para os nomes do plasmídeo de expressão resultante.

Tabela 1

vetor de entrada usado na vetor de expressão Reação LR Resultante pSCNLHybridl pEXPR-NRPS4 pSC_SC_C_NLM2M3Hybridl pEXPR-NRPS 5 pSC_BS_C_NLM2M3Hybrid2 pEXPR-NRPS 6 pPg_SC_C_NlM2M3Hybridl pEXPR-NRPS7 pPg_BS_C_NlM2M3Hybrid2 pEXPR-NRPS8 Exemplo 6

Transformação de Penicillium chrysogenum com plasmídeo pEXPR-NRPS4 linearizado, cultivo e análise de tripeptídeo

Em experimentos independentes, Penicillium

5 chrysogenum foi transformado com pEXPR-NRPS4 que foi linearizado antes de transformação com enzimas adequadas que cortam na estrutura do vetor, como PsiI ou PciI. A seleção de transformantes foi feita em placas de Agar de meio mineral com 50 μ9/τη]1. Pleomicina e IM Sacarose. 10 Colônias resistentes à Pleomicina que aparecem nessas placas de regeneração de protoplasto foram novamente colocadas em placas de agar de pleomicina frescas sem a sacarose e cresceram até esporulação. Os transformantes resistentes à Pleomicina foram rastreados por meio de PCR 15 de colônia para a presença dos genes de NRPS. Para isso, um pequeno pedaço de colônia foi suspenso em 5 0 μ!· de tampão TE (Sambrook e cols., 1989) e incubado por 10 minutos a 95°C. Para descartar o resto das células, a mistura foi centrifugada por 5 minutos a 3.000 rpm. 0 sobrenadante (5

2 0 μΐΐι) foi usado como um modelo para a reação de PCR com Super-Taq de HT Biotechnology Ltd. As reações de PCR foram analisadas em E-gel96 de Invitrogen.

Os oligonucleotídeos a seguir foram usados no rastreamento de colônia-PCR (veja Id. de Seq. N°: 26 e Id. de Seq. N0: 27):

Plasmídeo transformado: pEXPR-NRPS4

Oligonucleotídeos para PCR de colônia:

adiante: GCCTGGTGCCTGATGC Rev: GGTGTGGTCGGAGACG 5 O tamanho esperado dessas reações de PCR foi de 3 03

bp.

Os clones positivos sofreram mais uma etapa de purificação em placas de agar de pleomicina frescas sem a sacarose. Subseqüentemente, eles cresceram em meio mineral 10 como descrito em "General Materials and Methods". Adicionalmente, o aminoácido L-Hpg (4-Hidroxifenilglicina) ou L-Pg (Fenilglicina) foi adicionado a uma concentração final de 1 mM, dependendo de qual tripeptídeo era analisado. Cultivo foi realizado em um frasco com escala de 15 agitação ou em placas de titulo micro de 24 cavidades. Ao final da fermentação, o micêlio foi removido por centrifugação ou filtração e o micélio foi lavado com solução salina fisiológica. Tanto o micélio quanto o meio foram analisados para tripeptídeos como DLD-Hpg-Cys-Val (no 20 caso, L-Hpg foi adicionado ao meio) e DLD-Pg-Cys-Val (no caso, L-Pg foi adicionado ao meio), usando técnicas de MS como LC-MS/MS. Como padrões, tripeptídeos sintetizados de modo personalizado DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val foram usados. Como um resultado, nem no micélio nem no meio 25 tripeptídeos como DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val foram identificados. Como uma conclusão, P. chrysogenum não produz esses tripeptídeos não naturais, se construções de cassetes de expressão de NRPS como pEXPR-NRPS4 estiverem integradas.

3 0 Exemplo 7 Transformação de Penicillium chrysogenum com plasmídeos pEXPR-NRPS5 e pEXPR-NRPS6 linearizados, cultivo e produção de tripeptídeo DLD-Hpg-Cys-Val

Em experimentos independentes, Penicillium

5 chrysogenum foi transformada com pEXPR-NRPS5 ou pEXPR-NRPS6 que foram linearizados antes da transformação com enzimas adequadas que cortam na estrutura do vetor, como PsiI ou PciI. A transformação de P. chrysogenum foi realizada sob condições, por exemplo, descritas em W02004/106347. A 10 seleção de transformantes foi feita em placas de agar de meio mineral com 50 μg/mL Pleomicina e IM Sacarose. Colônias resistentes à Pleomicina que aparecem nessas placas de regeneração de protoplasto foram novamente colocadas em placas de agar de pleomicina frescas sem a 15 sacarose e cresceram até esporulação. Os transformantes resistentes à Pleomicina foram rastreados por meio de PCR de colônia para a presença dos genes de NRPS. Para isso, um pequeno pedaço de colônia foi suspenso em 50 μL de tampão TE (Sambrook e cols., 1989) e incubado por 10 minutos a 20 95°C. Para descartar o resto das células, a mistura foi centrifugada por 5 minutos a 3.000 rpm. 0 sobrenadante (5 μL) foi usado como um modelo para a reação de PCR com Super-Taq de HT Biotechnology Ltd. As reações de PCR foram analisadas em E-gel96 de Invitrogen.

Os oligonucleotídeos a seguir foram usados no

rastreamento de colônia-PCR (veja Id. de Seq. N°: 26 e Id. de Seq. N0: 27):

Plasmídeo transformado: pEXPR-NRPS 5 ou pEXPR-NRPS6 3 0 Oligonucleotídeos para PCR de colônia: Adiante: GCCTGGTGCCTGATGC Rev: GGTGTGGTCGGAGACG

O tamanho esperado dessas reações de PCR foi de 3 03

bp.

Os clones positivos sofreram mais uma etapa de

purificação em placas de agar de pleomicina frescas sem a sacarose. Subseqüentemente, eles cresceram em meio mineral como descrito em "General Materials and Methods". Adicionalmente, o aminoácido L-Hpg (4-Hidroxifenilglicina)

ou L-Pg (Fenilglicina) foi adicionado a uma concentração final de 1 mM, dependendo de qual tripeptídeo era analisado. Cultivo foi realizado em um frasco com escala de agitação ou em placas de titulo micro de 24 cavidades. Ao final da fermentação, o micélio foi removido por

centrifugação ou filtração e o micélio foi lavado com solução salina fisiológica. Tanto o micélio quanto o meio foram analisados para tripeptídeos como DLD-Hpg-Cys-Val (no caso, L-Hpg foi adicionado ao meio) e DLD-Pg-Cys-Val (no caso, L-Pg foi adicionado ao meio), usando técnicas de MS

2 0 como LC-MS/MS. Como padrões, tripeptídeos sintetizados de

modo personalizado DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val foram usados. 0 micélio e o sobrenadante mostraram níveis significativos do tripeptídeo DLD-Hpg-Cys-Val. O controle negativo, para o qual uma cepa não transformada de P.

chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) foi empregada, não mostrou formação de tripeptídeo DLD-Hpg-Cys-Val. Esse resultado fornece prova de que as peptídeo sintetases não ribossômicas construídas transformadas produzem o tripeptídeo não natural DLD-Hpg-Cys-Val.

3 0 Exemplo 8 Transformação de Penicillium chrysogenum com plasmídeos pEXPR-NRPS7 e pEXPR-NRPS8 linearizados, cultivo e produção de tripeptídeo DLD-Pg-Cys-Val

Em experimentos independentes, Penicillium

5 chrysogenum foi transformado com pEXPR-NRPS7 ou pEXPR-NRPS8 ue foram linearizados antes da transformação com enzimas adequadas que cortam na estrutura do vetor, como PsiI ou PciI. A transformação de P. chrysogenum foi realizada sob condições, por exemplo, descritas em W02004/106347. A 10 seleção de transformantes foi feita em placas de agar de meio mineral com 50 μg/mL Pleomicina e IM Sacarose. Colônias resistentes à Pleomicina que aparecem nessas placas de regeneração de protoplasto foram novamente colocadas em placas de agar de pleomicina frescas sem a 15 sacarose e cresceram até esporulação. Os transformantes resistentes à Pleomicina foram rastreados por meio de PCR de colônia para a presença dos genes de NRPS. Para isso, um pequeno pedaço de colônia foi suspenso em 5 0 μL de tampão TE (Sambrook e cols. , 1989) e incubado por 10 minutos a 20 95 ° C. Para descartar o resto das células, a mistura foi centrifugada por 5 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante (5 μL) foi usado como um modelo para a reação de PCR com Super-Taq de HT Biotechnology Ltd. As reações de PCR foram analisadas em E-gel96 de Invitrogen.

Os oligonucleotídeos a seguir foram usados no

rastreamento de colônia-PCR (veja Id. de Seq. N°: 26 e Id. de Seq. N0: 27):

Plasmídeo transformado: pEXPR-NRPS 7 OU PEXPR-NRPS8 3 0 Oligonucleotídeos para PCR de colônia: Adiante: GCCTGATGC Rev: GGTGTGGTCGGAGACG

O tamanho esperado dessas reações de PCR foi de 3 03

bp.

5 Os clones positivos sofreram mais uma etapa de

purificação em placas de agar de pleomicina frescas sem a sacarose. Subseqüentemente, eles cresceram em meio mineral como descrito em "General Materials and Methods". Adicionalmente, o aminoãcido L-Hpg (4-Hidroxifenilglicina) 10 ou L-Pg (Fenilglicina) foram adicionados a uma concentração final de 1 mM, dependendo de qual tripeptídeo era analisado. Cultivo foi realizado em um frasco com escala de agitação ou em placas de microtítulo de 24 cavidades. Ao final da fermentação, o micélio foi removido por 15 centrifugação ou filtração e o micélio foi lavado com solução salina fisiológica. Tanto o micélio quanto o meio foram analisados para tripeptídeos como DLD-Pg-Cys-Val (no caso L-Pg foi adicionado ao meio), usando técnicas de MS como LC-MS/MS. Como padrões, tripeptídeos sintetizados de 20 modo personalizado DLD-Hpg-Cys-Val e DLD-Pg-Cys-Val foram usados. O micélio e o sobrenadante mostraram níveis significativos do tripeptídeo DLD-Pg-Cys-Val. 0 controle negativo, para o qual uma cepa não transformada de P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) foi empregada, 25 não mostrou formação de tripeptídeo DLD-Pg-Cys-Val. Esse resultado fornece prova de que as peptídeo sintetases não ribossômicas construídas transformadas produzem o tripeptídeo não natural DLD-Pg-Cys-Val.

Exemplo 9

3 0 Produção in vitro de amoxacilina por conversão de DLD-HpgCV Três diferentes construções, que contêm os pobC-genes de Penicillium chrysogenum (pAJL-pcbC), Nocardia lactamdurans (pAJL-pcbC-NL) e Aspergillus nidulans (pXTN313) foram inoculadas de um estoque de glicerol e 5 cresceram de um dia para o outro a 37°C, em 2xTY e 3 5 pg cloranfenicol por ml. Os respectivos pcbC-genes codificam IPNSs que são produzidas como proteínas de fusão com MBP (proteína de ligação de maltose), codificada pelo malE-gene de Escherichia eoli. Os genes de fusão malE-pebC estão sob 10 controle do tac-promotor indutível por IPTG.

DNA de plasmídeo foi isolado de culturas de um dia para o outro. 0 DNA isolado foi usado para transformar E. eoli TOPlO (Invitrogen). Uma colônia isolada foi usada para inocular 10 ml de 2xTY suplementado com 35 pg cloranfenicol 15 por ml. Depois de incubação de um dia par o outro a 37°C e 280 rpm, a OD600 foi medida. As cepas foram diluídas a 100 ml do meio fresco, a uma OD600 final de 0,015. Crescimento a 37°C e 280 rpm foi permitido até a OD600 atingir um valor entre 0,4 e 0,6. IPTG foi adicionado a uma concentração 20 final de 0,5 mM. A incubação foi continuada a 22°C e 220 rpm, de um dia para o outro.

Células foram coletadas por centrifugação e lavadas com 0,9% NaCl em água milliQ. Os péletes de células foram ressuspensos em 1,5 ml de tampão de extração (50 mM 25 Tris.HCl pH 7,5; 0,5 mg lisozima/ml, 5 mM DTT). Sonificação foi realizada para lisar as células. Depois da centrifugação por 10 minutos a 14.000 rpm em uma centrífuga Eppendorf, alíquotas de 200 μΐ foram coletadas e congeladas em nitrogênio líquido. Os extratos congelados livres de 30 células foram estocados a -80°C. Ensaios de atividade de IPNS foram realizados com ACV e HpgCV como substratos. Em adição Às condições padrão de ensaio para o ensaio de atividade de IPNS, modificações foram aplicadas à mistura do ensaio para maximizar a chance de sucesso.

As misturas de reação foram como se segue:

Mistura de Reação 1 (ensaio alternativo)

3 0 - 5 0 mM Tris.HCl pH 8.0 (preferivelmente 3 6 mM)

1-6,7 mM ascorbato (preferivelmente 3 mM)

50 μΜ a 2 mM FeSO4 (preferivelmente 86 μΜ)

0,3 - 2 mM tripeptídeo (preferivelmente 1,5 mM para ACV e 0,7 5 mM para HpgCV)

0,75 - 4 mM DTT (preferivelmente 3 mM)

0 bis-ACV foi reduzido a ACV por mistura de duas

alíquotas de 7,5 mM bis-ACV com uma alíquota de 60 mM DTT, seguido por uma incubação de 5 a 25 minutos em temperatura ambiente. Do mesmo modo, HpgCV foi reduzido antes do ensaio.

Mistura de Reação 2 (ensaio alternativo)

30 - 50 mM HEPES pH 7,0 (preferivelmente 36 mM)

0,1 - 0,2 mM ascorbato (preferivelmente 0,1 mM)

1- - 50 μΜ FeSO4 (preferivelmente 25 μΜ)

0,3 - 2 mM tripeptídeo (preferivelmente 1,5 mM para ACV e 1,5 mM para HpgCV)

0,2 - 1,2 mM TCEP (Tris(2-Carboxietil) fosfino) (preferivelmente 1 mM)

Bis-ACV e HpgCV foram pré-tratados com TCEP para quebrar ligações S-S nos dímeros. Para esse fim, duas alíquotas de 7,5 mM bis-ACV, ou HpgCV, foram misturadas com uma alíquota de 20 mM TCEP, seguido por uma incubação 10

de 5 a 25 minutos em temperatura ambiente.

5 μΐ de CFEs, contendo as proteínas de fusão MBPIPNS, foram incubadas com 5 95 μΐ das misturas de reação acima mencionadas. Depois de 10 minutos de incubação a 25°C, a reação foi interrompida por adição de 125 μΐ da reação com 5 0 μΐ metanol gelado. Após incubação a -20°C por pelo menos uma hora, as amostras foram analisadas por LC/MS.

A análise de LC/MS foi realizada em um LCQ (Thermo Scientific), usando os seguintes ajustes:

Eluentes

Gradiente

Coluna

Temp. da Coluna Fluxo

Volume de injeção Temp. da bandej a Tempo de retenção: IPN

Amoxacilina

Ampicilina

MS

Instrumento

Eluente A: 0,1% FA em água MilliQ Eluente B: 0,1% FA em água MilliQ T(min) flow (ml/min) %A %B 0,0 0,2 98 2

5.0 0,2 982 20,0 0,2 78 22

20,1 0,2 98 2

30.0 0,2 98 2 Varian Inertsil 3 ODS 3 CP22568 150*2,1 mm 3 μτη

55 0 C

0,2 ml/min μΐ

4 ° C

Aprox. 12,2 min Aprox. 4,9 min Aprox. 16,5 min

LCQ (SM05) LC/MS/MS/MS Faixa m/z micro scans tempo de injeção

10

LC/MS OFF eixo ESl/pos Probe altura nr 6,

profundidade nr 3 LC/MS/MS 360 iw =5,0 aa = 30%

366 iw = 5,0 aa = 30%

35 0 iw = 5,0 aa = 3 0%

349 iw = 5,0 aa = 30%

MS: 200 - 1000

1

50 0 ms

As amostras foram diluídas 10 vezes com água milliQ e μΐ foram injetadas no sistema LC/MS.

Substratos (ACV, HpgCV, PgCV) e produtos (IPN, amoxacilina, ampicilina) foram identificados com base am tempo de retenção (LC) , o valor de massa sobre carga (m/z) (MS) bem como o padrão de fragmentação após fragmentação no MSn-modo.

Os resultados são resumidos na tabela abaixo.

Tabela 2: Conversão dos substratos ACV e HpgCV em IPN e amoxacilina respectivamente pelas proteínas de fusão MBPIPNS de diferentes fontes.

ACV IPN HpgCV amoxacilina Origem de Mistura de Mistura de Mistura de Mistura de pcbC-gene reação 1 reação 2 reação 1 reação 2 P. 16% 50% 0% 0,0006% chrysogenum A. nidulans 36% 98% 0% 0,0007% N. 36% 99% 0% 0,0006% Iactamdurans De modo surpreendente, sob as condições experimentais de mistura de reação 2, MBP-IPNS é capaz de converter HpgCV em amoxacilina, embora nenhuma amoxacilina seja convertida sob as condições de mistura de reação 1.

Exemplo 10

Desenvolvimento de um bioensaio que permite a detecção da conversão de DLD-HpgCV a amoxacilina

As cepas bacterianas de Escherichia eoli ESS, Bacillus subtilis ATCC6633 e Micrococcus luteus ATCC9341 cresceram de um dia para o outro em meio 2xTY a 30°C e 280 rpm. Depois de

16 horas de cresicmento, a OD600 foi medida. Tipicamente, a OD600 é de 5,0, variando de 2,0 a 8,0.

Uma solução de amoxacilina foi feita em uma concentração de 7 mg/ml. Subseqüentemente, diluições em série foram feitas variando de 1 mg/l a 0,001 mg/l. Água MilliQ serviu como um controle negativo.

Em uma microplaca de 96 cavidades, 25 μΐ das diluições

em série foram pipetadas nas cavidades. Cada microplaca foi preparada em duplicata. As culturas bacterianas de um dia para o outro foram diluídas em meio 2xTY fresco a uma OD600 final de 0,01. A cada cavidade, 150 μΐ das culturas 20 bacterianas diluídas foram adicionados. As microplacas foram cobertas com uma tampa, e incubadas de um dia para o outro a 25°C e a microplaca em duplicata a 37°C.

Depois de 16 horas de incubação, a OD600 foi lida em um leitor de microplaca. A partir dos resultados, a concentração da amoxacilina que ainda permite crescimento

não inibido dos microorganismos de teste foi lida.

Tabela 3: Concentração de amoxacilina que ainda permite crescimento não inibido em meio 2xTY

[Amoxacilina](mg/l) [Amoxacilina] Cepa a 250C (mg/l) a 370C Eseheriehia eoli ESS 0,1 0,1 (DS10031) Baeillus subtilis ATCC6633 1, o 5 Mieroeoceus luteus 0, 001 0, 002 ATCC9341 Exemplo 11

Desenvolvimento de um bioensaio que permite a detecção da conversão de DLD-PgCV a ampicilina

16 horas de crescimento, a ODe00 foi medida. Tipicamente, a OD600 é 5,0, variando de 2,0 a 8,0.

Uma solução de ampicilina foi feita em uma concentração de 7 mg/ml. Subseqüentemente, diluições em série foram feitas variando de 1 mg/l a 0,001 mg/l. Água MilliQ serviu como um controle negativo.

Em uma microplaca de 96 cavidades, 25 μΐ das diluições em série foram pipetadas nas cavidades. Cada microplaca foi 15 preparada em duplicata. As culturas bacterianas de um dia para o outro foram diluídas em meio 2xTY fresco a uma OD600 final de 0,01. A cada cavidade, 150 μΐ das culturas bacterianas diluídas foram adicionados. As microplacas foram cobertas com um selo adesivo permeável a gás, e incubadas 20 de um dia para o outro a 250C e a microplaca em duplicata a

3 7 0C.

Depois de 16 horas de incubação, a OD600 foi lida em um leitor de microplaca. A partir dos resultados, a concentração da ampicilina que ainda permite crescimento não inibido dos microorganismos de teste foi lida.

Tabela 4: Concentração de ampicilina que ainda permite crescimento não inibido em meio 2xTY

Cepa [Ampicilina] [Ampicilina] (mg/l) (mg/l) a 250C a 370C Escherichia eoli ESS (DS10031) 0, 05 0, 05 Bacillus subtilis ATCC6633 0,5 2 , 5 Micrococcus luteus ATCC9341 0, 001 0, 002 Exemplo 12

Rastreamento de pcbC-genes de diferentes gêneros para a conversão in vitro de DLD-HpgCV a amoxacilina

As regiões codificadoras de pcJbC-genes de 11 espécies foram ordenadas em DNA 2.0 (1430 O1Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, USA) . Para esse fim, a seqüência de 10 DNA da região codif icadora foi tomada como uma base. As seguintes espécies foram selecionadas: Cephalosporium Acremonium, Penicillium chrysogenum, Aspergillus

(Emericella) nidulans, Streptomyces jumonjinensis, Nocardia lactamdurans, Streptomyces microflavis, Lysobacter lactamgenus, Flavobacterium species, Streptomyces

clavuligerus, Streptomyces griseus, Streptomyces cattleya.

As seqüência do códon de início foi modificada para CATATG, o sítio de reconhecimento de NdeI, para facilitar futuras etapas de clonagem. Do mesmo modo, um sítio NsiI 20 (ATGCAT) foi introduzido imediatamente atrás do códon de parada. Sítios internos NsiI e NdeI foram removidos tanto quanto possível.

Os plasmídeos que carregam o pcjbC-genes foram cortados com NsiI e NdeI e a região codif icadora do pcbCgene foi isolada e subclonada no vetor pSJ127, que foi cortada com as mesma enzimas. Desse modo, a região codificadora do pcbC-gene é clonada em estrutura com o malE-gene que codifica proteína de ligação de maltose, sob 5 o controle de um promotor indutível. Após indução da expressão, uma proteína de fusão será sintetizada que consiste na proteína de ligação de maltose no terminal N da proteína de fusão e IPNS no terminal C.

E.eoli TOPlO, transformada com os plasmídeos malE10 pcbC-, cresceram em meio 2xTY contendo 35 μg cloranfenicol/ml, de um dia para o outro a 37°C e 280 rpm. No dia seguinte, a OD600 foi medida e as células foram diluídas em meio fresco a uma OD600 final de 0,015. As células cresceram também (37°C, 280 rpm) até a OD600 atingir 15 um valor de 0,4 - 0,6. IPTG foi adicionado a uma concentração final de 0,5 mM. 0 crescimento prosseguiu a 22°C, 280 rpm de um dia para o outro. Células foram coletadas por centrifugação por 10 minutos a 5000 rpm e

4 °C. As células foram lavadas com uma solução de NaCl a 0,9%, e peletizadas novamente por centrifugação. Os péletes de células foram congelados a -200C por pelo menos 16 horas.

Os péletes de células foram ressuspensos em 1,5 ml de tampão de extração (50 mM Tris.HCl pH 7,5; 5 mM DTT) e 25 foram feitos extratos por sonificação. Os extratos foram centrifugados para remover restos celulares em uma centrífuga Eppendorf (10 minutos, 14.000 rpm, 40C). 0 sobrenadante (extrato livre de células, CFE) foi dividido em alíquotas em tubos de Eppendorf frescos e congelado em 3 0 nitrogênio líquido, e subseqüentemente estocado a -80°C. A conversão de HpgCV a amoxacilina foi analisada como se segue. Primeiramente, o substrato HpgCV foi reduzido por mistura d e500 μΐ de 200 mM HpgCV e 500 μΐ 20 mM TCEPf seguido por incubação a 25 0C por 10 minutos. Em segundo 5 lugar, a mistura de ensaio a seguir foi feita (para 10 reações) : 300 μΐ 0,5 mM FeSO4.7H20; 4 80 μΐ 1,2 5 mM ascorbato; 4270 μΐ 50 mM HEPES (pH 7,0) . 0 ensaio foi iniciado por mistura de 90 μΐ de substrato reduzido, 505 μΐ mistura de ensaio e 5 μΐ do CFE, contendo a proteína de 10 fusão MBP-IPNS.

A mistura de reação foi incubada a 25 0C por 10 minutos.

25 μΐ da mistura de reação foi misturada com 150 μΐ de uma cultura diluídas de um dia para o outro de 15 Micrococcus luteus em 2xTY (OD600 = 0 , 01), em uma microplaca. Para verificar que qualquer possível inibição de crescimento foi causada pela formação de amoxacilina, cada amostra foi também testada na presença de β-Iactamase (Penase de BBL Difco) , que cliva o anel de {3-lactama e 20 assim inativa a atividade do antibiótico.

A microplaca foi coberta com uma tampa e incubada de um dia para o outro a 30°C e 550 rpm. A OD600 foi lida em um leitor de microplaca.

Surpreendentemente, as proteínas de fusão MBP-IPNS que se originam dos pcJbC-genes de A. nidulans bem como de

S. clavuligerus mostraram inibição do crescimento de M. Iuteus7 que cresceu totalmente na presença de Penase , indicando que a inibição era devida à formação de amoxacilina de DLD-HpgCV.

Isso foi confirmado por análise de LC-MS/MS. Para esse fim, a reação foi interrompida por adição de 125 μΐ de mistura de reação com 50 μΐ metanol (-200C) . As amostras foram incubadas por pelo menos 1 hora a -20°C. foi realizada uma etapa de centrifugação (14.000 rpm por 15 5 minutos a 4°C), seguida por análise de LC-MS/MS (veja o Exemplo 9) . Os resultados confirmaram os resultados do bioensaio.

Como um controle, LLD-ACV foi incluído. De fato, como esperado, quase todas proteínas de fusão MBP-IPNS formaram IPN (isopenicilinaN) . A adição de Penase° à mistura de reação deletou o efeito observado. Novamente, os resultados foram confirmados por LC-MS/MS.

Exemplo 13

Construção de pcbC-genes

Os clones pSJ-AnIPNS (pc£>C-gene de A. nidulans) e

pSJ-ScIPNS (pcbC-gene de S. clavuligerus) foram submetidos a "error-prone PCR" (EP-PCR) com o uso do kit "Diversify PCR" de Clontech de acordo com as diretrizes do fabricante. Resumidamente, o número de erros introduzidos por PCR pode 20 ser modificado por aplicação de diferentes condições de PCR.

As inserções amplificadas pcbC foram subclonadas no vetor de expressão pBADMHmalEDEST, com o uso das enzimas de restrição NdeI e Nsil. Também nesse plasmídeo, IPNS serão produzidas como uma proteína de fusão MBP.

De cada condição aplicada, 10 clones foram seqüenciados. As bibliotecas em que uma taxa de mutação de aproximadamente 1 mutação por kb foi encontrada foram selecionadas para o rastreamento por melhores variantes 3 0 com relação à conversão de HpgCV em amoxacilina. As bibliotecas selecionadas de A. nidulans- e 5. clavuligerus pcbC cresceram, e a inserção foi subclonada no vetor de expressão pBADMHmalEDEST, com o uso das enzimas de restrição NdeI e NsiI. Também nesse plasmídeo, IPNS será produzida como uma proteína de fusão MBP.

Uma terceira biblioteca foi construída em que as mutações foram introduzidas em posições específicas no pcjbC-gene de A. nidulans (abordagem sítio-direcionada) . Essas posições foram selecionadas com base em dois 10 critérios: a) a criação de espaço no centro ativo, e b) enfraquecimento da ligação de terminal C.

A criação de espaço no centro ativo pode ser benéfica para melhorar a atividade da IPNS nativa sobre HpgCV, uma vez que a porção Hpg é maior que a porção α-aminoadipato em ACV.

O terminal C da molécula de IPNS age como um quasisubstrato quando a enzima não é carregada com um substrato. Com a abordagem do substrato para o centro ativo, o terminal C é retirado, criando espaço para o substrato. 20 Para evitar essa competição entre terminal C e substrato, foram introduzidas alterações também.

Oito posições de aminoácido foram selecionadas para modificação: 175, Y91, S183, V185, N287, L321, L324 e T331.

Iniciadores foram designados, 33-mers, em que os três nucleotídeos do meio (que codificam um aminoácido a ser modificado) foram randomizados (NNN), assim criando a possibilidade para qualquer aminoácido estar presente na molécula de IPNS resultante nas posições indicadas.

Todas as oito posições foram assim modificadas por PCR de fusão, resultando em oito sub-bibliotecas, cada uma com mutações únicas de sítio. Uma biblioteca adicional foi feita em que toda as mutações foram combinadas em um modo randômico.

Também nesse caso, as inserções da biblioteca assim obtida foram subclonadas no vetor de expressão pBADMHmalEDEST, com o uso das enzimas de restrição NdeI e NsiJ..

As três bibliotecas foram plaqueadas a partir de estoques de glicerol em meio Agar seletivo, contendo 50 pg 10 zeocina por ml. De cada biblioteca de EP-PCR, 2.500 clones independentes foram retirados e usados para inocular 15 0 μΐ de meio 2xTY contendo 50 pg zeocina por ml, em placas de 96 cavidades. Da biblioteca sítio-direcionada, 200 clones foram retirados de cada sub-biblioteca para inoculação de 15 150 μΐ de meio 2xTY contendo 50 pg zeocina por ml, em placas de 96 cavidades.

Depois de crescimento de um dia para o outro a 370C e 280 rpm, 5 μΐ das culturas confluentes foram transferidos para 1 ml de meio 2xTY fresco contendo 5 0 pg zeocina por 20 ml, em uma microplaca de cavidades profundas. O crescimento foi permitido a 37°C e 280 rpm, até a OD500 ter atingido um valor entre 0,4 e 0,6, em meda por toda a microplaca. As células foram induzidas a produzir a proteína de fusão MBPIPNS pela adição de 4 0 μΐ 5% L-arabinose a cada uma das 25 cavidades individuais. Subseqüentemente, as células cresceram por 24 horas a 22°C e 220 rpm.

As células foram coletadas por centrifugação. O sobrenadante foi descartado e os péletes de células foram congelados de um dia para o outro a -200C.

A cada cavidade, que contém um pélete de células, 100 μΐ de tampão de Iise (50 mM HEPES pH 7,0; 0,5 mg/ml lisozima; 0,1 mg/ml DNAseI; 5 mM DTT; 5 mM MgSO4) foram adicionados, seguido por uma incubação em temperatura ambiente por 3 0 minutos.

5 As microplacas foram rotacionadas, e 50 μΐ do

sobrenadante foram transferidos para uma microplaca fresca. 50 μΐ de mistura de ensaio (50 mM HEPES pH 7,0; I mM TCEP; 100 μΜ Na-ascorbato; 25 μΜ Fe-sulfato; 5 mM HpgCV) foram adicionados ao sobrenadante, seguido por uma incubação por 10 30 minutos a 25°C. 125 μΐ de uma cultura diluída de M. luteus em 2xTY (final OD600 é 0,01) foram adicionados. A placa foi incubada de um dia para o outro a 30°C. A OD600 foi lida com o uso de um leitor de microplaca.

18 clones, 16 que se originam da sub-biblioteca V185 15 e 2 da sub-biblioteca recombinada foram selecionados a partir da biblioteca de A. nidulans direcionada a a sítio. Todos esses clones mostraram uma completa inibição do crescimento de M. luteus, indicando que foi formado um composto que inibe o crescimento da cepa indicadora. Essa 20 inibição foi novamente testada de acordo com o protocolo acima, e novamente positiva. Além disso, a inibição foi ausente apos a adiçao de Penase , indicando que o composto inibidor é uma {3-lactam.

Os clones positivos cresceram em 10 ml de 2xTY com 50 25 μg zeocina por ml. Como uma fonte de controle de IPNS, pBAD-AnpcbC foi incluído no ensaio. Depois de crescimento de um dia para o outro a 37°C e 280 rpm, a OD600 foi determinada. 100 ml de meio 2xTY contendo 5 0 μg de zeocina por ml foram inoculados a uma OD600 inicial de 0,015. As 30 células cresceram a 37°C e 280 rpm até a OD600 ter atingido um valor de 0,4 a 0,6. A produção da proteína de fusão MBPIPNS foi induzida pela adição de L-arabinose em uma concentração final de 0,2%. O crescimento foi mantido a 220C e 22 0 rpm, de um dia para o outro. As células foram 5 coletadas e lavadas e congeladas a -2O0C de um dia para o outro. Os lisados de células foram preparados pela adição de 1,5 ml tampão de Iise (50 mM HEPES pH 7,0; 0,5 mg/ml lisozima; 0,1 mg/ml DNAseI; 5 mM DTT; 5 mM MgSO4), seguida por uma incubação em temperatura ambiente por 3 0 minutos. 0 10 extrato foi centrifugado e o sobrenadante (CFE) foi pipetado a um tubo fresco.

Foram feitos dois bioensaios:

1) Um bioensaio líquido: 8 μΐ de CFE foram misturados com 592 μΐ de mistura de ensaio (50 mM HEPES pH 7,0; 1 mM

TCEP; 10 0 μΜ Na-ascorbato; 2 5 μΜ Fe-sul fato; 5 mM HpgCV) . Depois da incubação por 10 minutos a 25°C, 125 μΐ de uma cultura diluída de M. luteus em 2xTY (final OD600 é 0,01) foram adicionados. Como substratos de controle, ACV foi usado (tanto LLD- quanto DLD-PgCV podem ser usados, embora

DLD-PgCV seja o substrato preferido). Além disso, para cada

. ® .

amostra um controle extra foi incluído, em que Penase foi

adicionada à mistura de ensaio. Depois de crescimento de um dia para o outro a 30°C, a OD600 foi lida.

2) Um bioensaio em placas de agar: 8 μΐ de CFE foram misturados com 592 μΐ de mistura de ensaio (50 mM HEPES pH

7,0; I mM TCEP; 100 μΜ Na-ascorbato; 25 μΜ Fe-sulfato; 5 mM HpgCV). Depois da incubação por 10 minutos a 25°C, 50 μΐ da mistura de ensaio foram colocados em uma placa de Agar em que foram feitos orifícios. De cada amostra foi incluído um 3 0 controle extra, em que Penase® foi adicionada à mistura de ensaio. 0 agar consistia em 2xTY-agar suplementado com M. luteus a uma ODs00 final de 0,01. Depois de incubação de um dia para o outro a 300C, a presença ou ausência de zonas limpas, devido â ação de β-lactamas, foi registrada.

A Tabela 5 mostra uma visão geral da atividade de

alguns dos mutantes. Cada mutante representa um grupo maior de mutantes que têm uma atividade de IPNS comparável sobre HpgCV como um substrato. A atividade da enzima IPNSs de tipo selvagem de A. nidulans sobre S. clavuligerus foi 10 abaixo do limite de detecção nesses ensaios de rastreamento.

Tabela 5: Visão geral dos bioensaios sobre a atividade de IPNS dos clones e controles selecionados.

Clone Substrato Bioensaio líquido Bioensaio de agar Como tal Com Como tal Com Penase° __ ® Penase 3 5 Al 2 HpgCV + - + 35F1 Hpgcv + - + 3 6A4 HpgCV + - + 36F3 HpgCV + - + 36C4 HpgCV + - + Wt A. nid. HpgCV - - - Wt S. cia HpgCV - - - 3 5 Al 2 ACV + - + 36F3 ACV + - + Wt A. nid. ACV + - + 35A12 PgCV + - + 36F3 PgCV + - + Wt A. nid. PgCV - - - Todos os clones positivos no rastreamento foram submetidos a análise de seqüência e clones representativos foram submetidos à análise de LC/MS. A análise de LC/MS foi realizada permitindo a identificação dos produtos formados com base no tempo de retenção, a massa do composto e o 5 padrão de fragmentação do produto. A quantidade de amoxacilina que é produzida foi determinada pelo método padrão de adição e é expressa em AU/mg de proteína, em que AU representa a quantidade de amoxacilina (em ng) formada em 10 minutos sob as condições de reação especificadas. A 10 Tabela 6 resume os clones, os resíduos de aminoácidos modificados e a atividade dos clones sobre HpgCV (em AU amoxacilina/mg proteína em CFE de E.eoli).

Tabela 6: visão geral das mutações e atividade sobre HpcCV dos mutantes ativeos de IPNS

Mutante Atividade Posição em IPNS de A. nidulans 111 135 185 190 211 293 331 3 6A4 11 V185R 20 3 5A12 90 V18 5K 35F1 13 V185K V293A 0 36F3 50 TlllA H135R V185R 35H12 30 V185K P190H 36C4 n. V185H T331C d. Wt n. d. n.d. = não detectável Exemplo 14 Conversão de DLD-PgCV a ampicilina

A atividade dos clones mutantes pcbC 36A4 (V185R), 35A12 (V185K) , 35F1 (V185K, V293A) , 36F3 (T111A, H135R, V185R), 35H12 (V185K, P190H), 36C4 (V185H, T331C) e o gene 5 de tipo selvagem pcbC de Ά. nidulans foi determinada em DLD-PgCV como um substrato. Para esse fim, os clones foram cultivados em 10 ml de 2xTY com 50 pg zeocina por ml. Depois de crescimento de um dia para o outro a 37°C e 280 rpm, a OD600 foi determinada. 100 ml de meio 2xTY contendo

50 pg zeocina por ml foram inoculados a uma OD600 inicial de

0,015. As células cresceram a 37°C e 280 rpm até a OD600 ter atingido um valor de 0,4 a 0,6. A produção da proteína de fusão MBP-IPNS foi induzida pela adição de L-arabinose em uma concentração final de 0,2%. O crescimento foi mantido a

220C e 220 rpm, de um dia para o outro. As células foram coletadas e lavadas e congeladas a -200C de um dia para o outro. Os lisados de células foram preparados pela adição de 1,5 ml tampão de Iise (50 mM HEPES pH 7,0; 0,5 mg/ml lisozima; 0,1 mg/ml DNAseI; 5 mM DTT; 5 mM MgSO4), seguida

2 0 por uma incubação em temperatura ambiente por 3 0 minutos. 0

extrato foi centrifugado e o sobrenadante (CFE) foi pipetado a um tubo fresco.

8 μΐ de CFE foram misturados com 5 92 μΐ da mistura de ensaio (50 mM HEPES pH 7,0; I mM TCEP; 100 μΜ Na-ascorbato;

25 μΜ Fe-sulfato; 5 mM PgCV) . Depois de incubação por 10 minutos a 25°C, 100 μΐ de uma cultura diluída de M. luteus em 2xTY (OD600 final é 0,01) foram adicionados a 50μ1 da mistura de reação. Como substratos de controle, ACV foi usado. Além disso, para cada amostra um controle extra foi

3 0 incluído, em que Penase® foi adicionada à mistura de ensaio. Depois de crescimento de um dia para o outro a 30°C, a OD600 foi lida. Todas as amostras, até mesmo a proteína de fusão de IPNS de A. nidulans de tipo selvagem para MBP, resultaram surpreendentemente em inibição do crescimento de M. luteus.

Análise de LC/MS foi realizada nessas amostras, permitindo a identificação do produtos formados com base no tempo de retenção, a massa do composto e o padrão de fragmentação do produto. A quantidade de ampicilina que foi 10 produzida foi determinada pelo método padrão de adição. Na Tabela 7, a atividade sobre PgCV foi resumida.

Tabela 7: Atividade das proteínas de fusão MBP-IPNSmutantes e de tipo selvagem sobre PgCV (em ng de produto por mg de proteína total, por 10 minutos) como determinados por análise de LC-MS

Mutante Atividade Posição em IPNS de A. nidulans 111 135 185 190 211 293 331 3 6A4 900 V185R 35A12 150 V18 5K 35F1 150 V185K V293A 36F3 30 TlllA H135R V185R 35H12 50 V185K P190H 3 6C4 1 V185H T331C W . t. 1 Exemplo 15

Construção de uma cepa de Penicillium que produz D-Hpg ou L-Hpg

15a Construção de plasmídeos de expressão de Penicillium

Os genes da hidroximandelato sintase de Amycolatopsis orientalis e Streptomyces coelicolor {hmaS), e os genes que codificam hidroxifenilglicina aminotransferase (hpgAT de Pseudomonas putida e hpgT de Streptomyces coelicolor respectivamente) foram clonados em plasmídeo plPCLTA por 5 amplificação de PCR desses genes a partir dos diferentes plasmídeos pBAD correspondentes descritos em WO 02/34921. 0 gene mdlB> que codifica mandelato desidrogenase de Pseudomonas putida, foi amplificado a partir de pGEM-Bldm. A inserção nos sítios NdeI e NsiI de plPCLTA foi escolhida, 10 levando a uma fusão de ATG do gene adequado com o promotor de Penicillium. Todos os genes foram amplificados por PCR, e os iniciadores de amplificação foram construídos por introdução de um sítio de restrição NdeI no iniciador acima e um sítio de restrição Nsil no iniciador abaixo. Devido ao 15 fato de que os genes hpgAT de Pseudomonas putida contêm um sítio Nsi I interno, uma abordagem alternativa foi realizada, em que a inserção foi amplificada com o uso de iniciadores que introduziram sítios NdeI- BsaI. 0 fragmento de PCR com os sítios adicionais Ndel/Bsal foi subclonado 20 como um fragmento de extremidade blunt no vetor de clonagem pCR-blunt-TOPO (Invitrogen) que leva à construção de pCRbl-hpgATpp. Depois da determinação de seqüência ter revelado que ela continha a inserção correta incluindo os sítios de flanqueamento Ndel/Bsal, esse plasmídeo foi usado

2 5 para a construção de pIPphpgATgWA por clonagem do fragmento

de Ndel/Bsal que contém o gene hpgATPp no sítio JVdel/PpulOI de plPCLTA.

Em plPCLTA, os genes introduzidos nesse vetor estão sob o controle do promotor pcbC de Penicillium chrysogenum.

3 0 Em adição, o terminador de transcrição do gene penDE, que codifica aciltransferase, foi usado nessas construções.

Os seguintes cassetes de expressão foram construídos:

Vetor de Gene Proteína codificada Promo¬ Terminaexpressão tor dor pIAohmaSgWA Ao-hmaS p-hidroximandelato pcbC penDE sintase pIScohmaSgWA Sco- p-hidroximandelato pcbC penDE hmaS sintase pIPpmdIBgWA Pp-mdlB L-mandelato pcbC penDE desidrogenase pIPphpgATgWA Pp- L-p- pcbC penDE hpgAT hidroxifenilglicina aminotransferase pIScohpgTgWA Seo- L-p- pcbC penDE hpgT hidroxifenilglicina aminotransferase Os seguintes iniciadores foram usados na amplificação

de clonagem dos genes acima mencionados:

A: genes de Amycol a topsis orientalis

Construção de pIAohwaSgWA

hmaS -Ao- Nde : 5 ' - CAGGAGGAATTACATATGCAGAATTTCGAG (Id. de

Seq. N°: 28)

hmaS-Ao-Nsi : 5 ' - CGGCCAGGGATGCATACGTCATCGCCGAGC (Id. de

Seq. N°: 29)

B: Genes de Streptomyces coelicolor

Construção de pIScohmaSgWA

hmaS-Sc-Nde : 5 ' - CAGGAGGAATTACATATGCCGCCCAGTGAC (Id. de

Seq. N°: 30)

hmaS-Sc-Nsi: 5' -GAATTCCCATATGCATCCAGGTCATCGGCC (Id. de Seq. N°: 31) Construção de pIScohpgTgWA hpgT-Sc-Nde: 5'-CAGGAGGAATTACATATGACCACCACCACC (Id . de Seq. N°: 32)

hpgT-Sc-Nsi: 5'-TCCCATATGCATCCTCAACCGTTAGACGCC (Id. de Seq. N°: 33)

C: Genes de Pseudomonas putida

Construção de pIPpmdlBgWA

hpgT-Sc-Nde: 5'-GTGAGGTAACATATGAGCCAGAATCTCTTT (Id. de Seq. N°: 34)

hpgT-Sc-Nsi: 5'-GTAATCAATGCATCACTCATGCGTGTGTTC (Id. de Seq. N°: 35)

Construção de pIPphpgATgWA

hpgAT-Nde 5' -CAGGAGGAATTACATATGTCTATTTATAGC (Id. de Seq. N° : 36)

hpgAT-Bsal 5'-GTCCTCGGTCTCATGCAT CTCGAGTTAGCCCAGGAGGT (Id.

de Seq. N0: 37)

15b Transformação de Pencillium chrysogenum

Os plasmídeos pIAohmaSgWA, pIScohmaSgWA, pIPpmdlBgWA, pIPphpgATgWA e pIScohpgTgWA foram cortados com NotI, que retira o cassete de expressão do vetor.

Penicillium chrysogenum DS12975, uma cepa industrial produtora de penicilina de DSM, foi transformada com 4 pg de DNA (ou seja "NotI-digests") e 0,25 pg de um fragmento de marcador de seleção. Nesse caso, foi usado um fragmento que confere resistência à pleomicina.

As seguintes combinações de cassetes de expressão foram transformadas:

Transformação Gene 1 Gene 2 Gene 3 1 Sc-hmaS Pp-mdlB Pp-hpgAT 2 Ao-hmaS Pp-mdlB Pp-hpgAT 3 Sc-hmaS Pp-mdlB Sc-hpgT 4 Ao-hmaS Pp-mdlB Sc-hpgT A seleção de transformantes foi feita em placas de agar de meio mineral com 1 grama por litro e I M sacarose. Colônias resistentes à pleomicina que aparecem após regeneração de protoplasto foram re-colocadas em placas de 5 agar de pleomicina frescas sem sacarose e cresceram até a esporulação.

Os transformantes foram colocados no mesmo meio e a integração dos cassetes de expressão foi verificada por PCR, com o uso de iniciadores específicos para os genes individuais.

Transformantes que contêm os três genes pretendidos foram colocados em tubos de agar inclinados e esporulados em arroz.

As seguintes ceás foram selecionadas para análise posterior:

Cepa Genes integrados no genoma AFFl08 Ao-hmaS, Pp-mdlB, Pp-hpgAT AFFl33 Ao-hmaS, Pp-mdlB, Pp-hpgAT AFF146 Sc-hmaS, Pp-mdlB, Pp-hpgAT AFF152 Sc-hmaS, Pp-mdlB, Pp-hpgAT AFF158 Ao-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT AFF162 Ao-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT AFF164 Ao-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT AFFl91 Sc-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT AFFl93 Sc-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT AFFl95 Sc-hmaS, Pp-mdlB, Sc-hpgT 15c Produção fermentativa de D-Hpg por transformantes de Penicillium Os transformantes de Penicillium chrysogenum AFF108, AFF133, AFF146 e AFF152 foram cultivados em frascos agitados por 6 dias. Produtos intracelulares e extracelulares foram determinados por NMR.

Tabela 8: Concentrações intracelulares de D-Hpg detectadas por NMR. As células cresceram por 3 a 6 dias.

Cepa D-Hpg (pg/g peso seco) Dia 3 Dia 4-6 DS12975 0 0 AFF108 40 0 AFF133 80 0 AFF14 6 40 0 AFF152 40 0 As células cresceram por 3, 4, 5, e 6 dias para

encontrar uma produção ótima para D-Hpg. A concentração depois de 3 dias foi alta o suficiente para detectar picos 10 no espectro de RMN e para quantificar o conteúdo de D-Hpg. Todos os transformantes selecionados produziram níveis detectáveis de D-Hpg mas a mais alta concentração de D-Hpg foi observada em AFF13 3 (80 pg/ g DW) . Os resultados são listados na tabela 8.

15d Produção fermentativa de L-Hpg por transformantes de Penicilli um

Cepas de Penicillium chrysogenum AFF158, AFF162, AFF164, AFF191, AFF193 e AFF195, contendo os genes de biossíntese de L-Hpg, foram cultivados em frascos agitados

2 0 por 3, 4, 5 e 6 dias. Produtos intracelulares e extracelulares foram determinados por NMR. Novamente, nenhum produto extracelular pode ser detectado mas intracelularmente, foram percebidos níveis substanciais de L-Hpg (veja, tabela 9) . Os níveis intracelulares de L-Hpg podem ser quantificados para todas as cepas e são listados na tabela

6. Diferente dos níveis de D-Hpg, os níveis de L-Hpg aumentaram com o tempo e atingiram um nível ótimo por volta dos 5 ou 6 dias de crescimento. Em micélio AFF195 a mais alta concentração foi medida e era 2,6 mg de L-Hpg por grama de peso seco. As cepas produtoras de L-Hpg conquistaram uma concentração intracelular aproximadamente

3 0 vezes maior que a AFF13 3, o maior produtor de D-Hpg.

Tabela 9: Concentrações intracelulares de L-Hpg detectadas por RMN.

Cepa L-Hpg (pg por grama de peso seco) Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 DS12975 0 0 0 0 AFF158 360 340 180 380 AFFl62 740 880 940 2 .200 AFF164 1.160 1.020 960 1.880 AFFl91 62 0 860 860 2 . 060 AFFl93 600 680 1600 740 AFF195 740 680 1. 040 2 . 640 Em um próximo experimento as células foram cultivadas por 5, 6 e 7 dias, no entanto, depois de 5 ou 6 dias a concentração de L-Hpg não aumentou mas começou a diminuir (dados não mostrados).

Exemplo 16

Produção fermentativa de amoxacilina por P. chrysogenum

Uma cepa de Pencillium chrysogenum desprovida dos grupos biossintéticos de penicilina como descrito no pedido de patente PCT/EP2007/054045 foi transformada com combinações de 1) plasmídeo pEXPR-NRPS6 (veja a tabela 1) que ancora um gene de NRPS que codifica HpgCVS (DLD-HpgCys-Val Sintetase), 2) plasmídeo que ancora o gene que codifica um mutante de IPNS V185R e 3) plasmídeo que ancora 5 o gene gsp de Bacillus brevis, que codifica uma Ppanttransferase (PPT) , sob o controle do promotor gpdA.

A seleção de transformantes foi feita em placas de agar de meio mineral com 50 pg pleomicina por ml e I M sacarose. Colônias resistentes à pleomicina que aparecem 10 após regeneração de protoplasto foram re-colocadas em placas de agar de pleomicina frescas sem sacarose e cresceram até a esporulação.

De cada transformação cerca de 100 colônias cresceram em meio mineral. Adicionalmente, o aminoácido L-Hpg foi 15 adicionado em uma concentração que varia de 1 mM a 10 mM. 0 cultivo foi realizado em escala de frasco agitado ou em placas de microtítulo de 24 cavidades. A incubação foi feita a 25°C por uma semana a 200 rpm.

Em vários pontos de tempo (4 dias a 7 dias) , as 20 amostras foram retiradas. O caldo foi centrifugado para remover o micélio. Uma amostra de caldo total foi removida e liofilizada. Tanto a amostra de caldo liofilizado quanto o sobrenadante foram analisados para a presença de amoxacilina.

No caso do sobrenadante, 10 e 50 μΐ do sobrenadante

foram adicionados a 190 e 150 μΐ respectivamente de uma cultura diluída de M. luteus, como descrito no exemplo 2. como um controle, Penase" foi adicionada à amostra, que degrada a amoxacilina. Vários transformantes mostraram uma inibição do crescimento de M. luteus, indicando a ação da amoxacilina produzida pelo transformante. A adição de Penase0 evitou a inibição de crescimento de M. luteus.

As amostra de caldo liofilizado foram tratadas com 100 - 500 μΐ de água milIiQ quente (90°C; volume dependendo da 5 quantidade de biomassa), para produzir um lisado. 10 μΐ e 50 μΐ do lisado foram misturados com 150 μΐ e 190 μΐ de uma cultura diluída de M. luteus respectivamente, como descrito acima. Um controle de Penase® foi adicionado também. Também nesse caso, várias amostras inibiram o crescimento de M.

luteus. Os extratos positivos corresponderam às amostras do sobrenadante. A identidade da β-lactama que foi formada foi confirmada como sendo amoxacilina por LC/MS/MS, como descrito no exemplo 9.

Claims

1. Processo para a preparação de ura antibiótico de βlactama Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou N-aaminofenilacetil caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um tripeptídeo hidroxifenilglicil-cisteinilvalina (HpgCV) ou um tripeptídeo fenilglicil-cisteinilvalina (PgCV) cora uma IPNS para efetuar a formação do antibiótico de {3-lactama Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou Nα-aminofenilacetil.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que IPNS tem um grau de identidade de pelo menos 5 0% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N0 : 1, e, quando alinhada à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1, contém uma arginina, lisina ou histidina na posição 185, e opcionalmente uma modificação em pelo menos uma das posições 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, com a utilização da numeração de posição de Id. de Seq. N°: 1.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tripeptídeo HpgCV ou o tripeptídeo PgCV é preparado por contato dos aminoácidos hidroxifenilglicina (Hpg) ou fenilglicina (Pg) , cisteína (C) e valina (V) com uma peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) para efetuar a formação do tripeptídeo HpgCV ou o tripeptídeo PgCV, a NRPS compreendendo um primeiro módulo Ml específico para Hpg ou Pg, um segundo módulo M2 específico para C, e um terceiro módulo M3 específico para V.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que hidroxifenilglicil-cisteinil-valina é DLD-phidroxifenilglicil-cisteinil-valina, e o antibiótico N-aamino-hidroxifenilacetil β-lactama é amoxacilina.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que fenilglicil-cisteinil-valina é DLD-fenilglicil-cisteinilvalina, e o antibiótico Ν-α-aminofenilacetil β-lactama é ampicilina.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que IPNS efetua a formação de um antibiótico de {3-lactama penam e o antibiótico de β-Iactama penam é também convertido a um antibiótico de J3-lactama cefem.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que antibiótico de β-lactama cefem é cefadroxil ou cefalexina.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado por ser realizado in vivo.

9. Enzima IPNS variante caracterizada por ter um grau de identidade de pelo menos 50% à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1, e que, quando alinhada à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1, contém uma arginina, lisina ou histidina na posição 185, e opcionalmente uma modificação em pelo menos uma das posições 91, 104, 183,190, 321, 324, 325,331, com a utilização da numeração de posição de Id. de Seq. N°: 1.

10. Peptideo sintetase não ribossômica (NRPS) que catalisa a formação do tripeptídeo HpgCV ou tripeptídeo PgCV, o NRPS caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro módulo Ml específico para Hpg ou Pg, um segundo módulo M2 específico para C, e um terceiro módulo M3 específico para V.

11. Peptídeo sintetase, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro módulo Ml específico para Hpg pode ser obtido a partir de uma CDA Sintetase, uma Cloroerenomicina Sintetase e/ou uma Complestatina Sintetase.

12. Peptídeo sintetase, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro módulo Ml específico para Pg pode ser obtido a partir de uma Pristinamicina Sintetase.

13. Peptídeo sintetase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o módulo M2 compreende um domínio dCl que é fundido a um domínio A que pode ser obtido a partir do segundo módulo de uma ACVS, em que o domínio dCl é heterólogo ao domínio A.

14. Peptídeo sintetase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o domínio dCl do módulo M2 pode ser obtido a partir da enzima que é a fonte do primeiro módulo Ml.

15. Peptídeo sintetase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o domínio dCl do módulo M2 é o domínio C do sétimo módulo de uma CDA Sintetase.

16. Peptídeo sintetase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o domínio dCl do módulo M2 é o domínio C do segundo módulo de uma Iturina Sintetase.

17. Peptídeo sintetase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que os domínios A e T do módulo M2 e o módulo completo M3 são obtidos a partir de uma ACVS, preferivelmente uma ACVS bacteriana ou fúngica.

18. Polinucleotídeo caracterizado por compreender uma seqüência de DNA que codifica a IPNS conforme definida na reivindicação 9.

19. Polinucleotídeo caracterizado por compreender uma seqüência de DNA que codifica a peptídeo sintetase conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13,14, 15, 16 ou 17.

20. Célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 ou 19.

21. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por também ser transformado com genes da via biossintética aos aminoácidos Hpg ou Pg.

22. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 ou 21, caracterizada por compreender a via biossintética para antibióticos de β-lactama, preferivelmente em que os genes que codificam ACVS e/ou IPNS são inativados.

23. Processo para a produção de um antibiótico de βlactama Ν-α-amino-hidroxifenilacetil ou N-aaminofenilacetil caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do hospedeiro de qualquer uma das reivindicações 20-22 sob condições que conduzem à produção do antibiótico de β-lactama.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antibiótico de β-lactama é amoxacilina, ampicilina, cefadroxil ou cefalexina.