EA016155B1

EA016155B1 - ПОЛУЧЕНИЕ β-ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

Info

Publication number: EA016155B1
Application number: EA200900513A
Authority: EA
Inventors: Маркус Ханс; Рулоф Ари Ланс Бовенберг; Пол Классен; Ремон Бур; ВАН ДЕР Ян Метске ЛААН
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2006-10-05
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2012-02-28
Also published as: US20100009404A1; EA200900513A1; EP2084270B1; BRPI0719263A2; WO2008040731A3; WO2008040731A2; KR101444483B1; MX2009003594A; US8293511B2; KR20090086981A; EP2084270A2; ES2447491T3; SI2084270T1

Abstract

Настоящее изобретение описывает способ получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий IPNS-катализируемое превращение предшественника трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (HpgCV) или фенилглицил-цистеинил-валин (PgCV) соответственно в N-гидроксифенилглицил или N-фенилглицил β-лактамовый антибиотик соответственно. Трипептид HpgCV или трипептид PgCV затем может быть получен контактированием аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS) для того, чтобы осуществить образование трипептида HpgCV или трипептида PgCV, NRPS, содержащей первый модуль M1, специфичный к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль M3, специфичный к V. Более того, IPNS обеспечивает обладание улучшенной активностью в этом превращении так же, как и катализирование образования трипептидов. Также предоставлена клетка-хозяин, способная к ферментативному производству β-лактамовых антибиотиков с N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил боковыми цепями.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению β-лактамовых антибиотиков.

Предшествующий уровень техники β-лактамовые антибиотики являются самым большим семейством вторичных метаболитов, которые производят микроорганизмы в природе. Наиболее важными классами β-лактамовых антибиотиков и клинически, и с точки зрения экономики являются пенициллины (пенам) и цефалоспорины (цефем). Их биосинтез осуществляется посредством сложного метаболического пути. Первые две стадии являются ключевыми стадиями в путях биосинтеза β-лактамовых антибиотиков пенамового и цефенового классов. После этих двух стадий пути биосинтеза к пенициллинам и цефалоспоринам расходятся. Первой стадией в биосинтезе пенициллиновых, цефалоспориновых и цефамициновых антибиотиков является конденсирование Ь-изомеров трех аминокислот, Ь-а-аминоадипиновой кислоты (А), Ь-цистеина (С) и Ь-валина (V) в трипептид, 5-(Б-а-аминоадипил)-Ь-цистеинил-О-валин или АСУ. Эта стадия катализируется 5-(Ьа-аминоадипил)-Ь-цистеинил-Э-валин синтетазой или АСУ8. На второй стадии трипептид АСУ окислительно циклизируется под действием изопенициллин N синтазы (в дальнейшем называемой ΙΡΝ8) или циклазой. Продуктом этой реакции является изопенициллин Ν; это соединение содержит типичные βлактамовые и триазолидиновые кольцевые структуры и обладает антибактериальной активностью. Из изопенициллина N пенициллины С или V образуются заменой гидрофильной α-аминоадипил боковой цепи на гидрофобную боковую цепь. Боковыми цепями, обычно используемыми в производственных процессах, являются или фенилуксусная кислота (РА), дающая пенициллин С, или феноксиуксусная кислота (РОА), дающая пенициллин V; эта реакция замещения катализируется ферментом ацилтрансферазой (АТ).

Вследствие субстратной специфичности фермента АТ невозможно заменить α-аминоадипил боковую цепь на любую боковую цепь, представляющую интерес, хотя было показано, что адипиновая кислота и определенные тио-производные адипиновой кислоты могут быть заменены (см. νϋ 95/04148 и \νϋ 95/04149). В частности, боковые цепи промышленно важных пенициллинов и цефалоспоринов не могут быть прямо заменены с помощью АТ. Поэтому большинство используемых сейчас β-лактамовых антибиотиков получают полусинтетическими способами. Эти полусинтетические β-лактамовые антибиотики получают модификацией Ν-замещенного β-лактамового продукта посредством одной или больше химической и/или ферментативной реакции. Эти полусинтетические способы обладают тем недостатком, что они включают много стадий, не являются безвредными для окружающей среды и являются весьма дорогостоящими. Следовательно, очень желательно использовать полностью ферментативный путь к βлактамовым антибиотикам, например амоксициллину, ампициллину, цефадроксилу и цефалексину.

Могут быть рассмотрены различные варианты полностью ферментативного пути к полусинтетическим пенамовым и цефемовым антибиотикам.

Например, можно сфокусироваться на замене α-аминоадипил боковой цепи изопенициллина N на подходящую боковую цепь, представляющую интерес, например α-амино-р-гидроксифенилацетил боковую цепь в случае амоксициллина. При этом будет необходима модификация субстратной специфичности фермента АТ, так как нативный фермент имеет довольно узкую субстратную специфичность и не способен катализировать такой обмен. Кроме того, это будет требовать модификации фермента СоА лигазы, который активизирует боковую цепь, которую следует заменить.

Альтернативно, можно сфокусироваться на модификации первых двух стадий в пути биосинтеза пенициллина так, что амоксициллин прямо синтезируется и секретируется. Однако для этого будет необходима существенная модификация ферментов АСУ8 и ΙΡΝ8.

Например, для амоксициллина, во-первых, будет необходимо получение трипептида, производящего боковую цепь амоксициллина, т.е. трипептида Ό-р-гидроксифенилглицил-Ь-цистеинил-Э-валина, вместо АСУ. Во-вторых, будет необходим фермент, который способен циклизировать этот трипептид.

АСУ8 является нерибосомальной пептидной синтетазой (ΝΚΡ8), которая катализирует образование трипептида ЬЬЭ-АСУ (5-(Ь-а-аминоадипил)-Ь-цистеинил-О-валин). В этом трипептиде пептидная связь образуется между δ-карбоксильной группой Ь-а-аминоадипиновой кислоты и аминогруппой Ь-цистеина, и, кроме того, стереохимическая конформация валина изменяется от Ь до Ό.

В последние годы некоторые лаборатории и институты исследовали возможности нацеленной разработки ΝΚΡ8. В качестве главных подходов были заменены домены и модули и в результате были введены новые специфичности, приводя к измененным пептидным продуктам. В большинстве случаев инженерные подходы довольствовались ферментативными фрагментами того же самого организма (или даже той же самой ΝΚΡ8), строго ограничивая варианты для ферментной инженерии. Основной проблемой современной ΝΚΡ8 инженерии по литературе является изменение стереохимии аминокислоты пептида, т.е. изменение от Ь- к Ό-стереохимии. Образующий пептидную связь домен конденсации, находящийся непосредственно ниже домена эпимеризации, является Ό-специфическим для пептидильного или аминоацильного донора и Ь-специфическим для аминоацильного акцептора. Такой домен конденсации изображается как 'Έ.. Домен ^сСь в этом положении не приводит к конденсации донорной и акцеп

- 1 016155 торной частей (С1ид§!оп 8.Ь. е! а1. 2003, Вюсйетщру, 42, 12095-12104). Следующей проблемой, которая может ограничивать варианты инженерии, является то, что домены С и А рассматриваются как нераздельная пара (Μοο!ζ Η.Ό. е! а1. 2000, Ргос. ЫаЙ. Асаб 8с1. И8А, 97, 5848-5853).

Теперь неожиданно обнаружено, что является осуществимой такая инженерия АСУ8, которая предоставит сконструированный фермент, который способен катализировать образование трипептида НрдСУ или РдСУ, в котором в Ν-концевой пептидной связи α-карбоксильная группа используется вместо δ-карбоксильной группы, которая используется в природном трипептиде АСУ и, кроме того, который способен модифицировать Ь стереохимическую конфигурацию первой аминокислоты до Ό конфигурации.

Более того, некоторые группы исследовали субстратную специфичность фермента ΙΡΝ8. См. в продолжение этой темы Β;·ι16\νίπ и Вгаб1еу, СЕет. Неу. 1990, 90, 1079-1088 и Нийтап е! а1. 1. Меб. СЕет. 1992, 35, 1897-1914. Например, субстраты т-СООН-ОЬ-фенилглицил-Ь-цистеинил-О-валин и ргидроксифенилацетил-Ь-цистеинил-Э-валин были указаны как не приводящие к антибиотической активности (НиГГтап е! а1., выше).

Также было неожиданно обнаружено, что нативный фермент ΙΡΝ8 способен действовать на трипептиды гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (НрдСУ) и фенилглицил-цистеинил-валин (РдСУ), конкретнее на ΌΤΌ-разновидности этих трипептидов. Открытие этого свойства ΙΡΝ8 раскрывает путь к дальнейшим разработкам, среди которых скрининг разновидностей ΙΡΝ8, для того, чтобы выделить молекулы ΙΡΝ8 с улучшенной активностью на эти ненативные пептиды. Открытия настоящего изобретения впервые делают возможным полностью ферментативное получение антибиотиков, которые раньше могли быть получены только полусинтетическими способами.

Подробное описание изобретения

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения Ν-αаминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий контактирование трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (НрдСУ) или трипептида фенилглицил-цистеинил-валин (БдСУ) с ΙΡΝ8 для того, чтобы осуществить образование Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика.

Настоящее изобретение неожиданно впервые показывает, что фермент ΙΡΝ8 способен превращать ненативные трипептидные субстраты НрдСУ или БдСУ соответственно в β-лактамовые соединения с Να-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил боковой цепью соответственно, такие как амоксициллин или ампициллин соответственно.

Согласно изобретению фермент ΙΡΝ8 или фермент с ΙΡΝ8 активностью является ферментом, который циклизирует трипептид НрдСУ или БдСУ в молекулу пенамового антибиотика. Такие ΙΡΝ8 ферменты, как правило, имеют степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 ΙΡΝ8 Етепсе11а (АкрегдШш) шби1ап8.

Аминокислоты гидроксифенилглицин (Нрд) и фенилглицин (Ρ§) в этих трипептидах могут находиться в Ό- а также Ь-форме, но предпочтительно находятся в Ό-форме. Гидроксифенилглицин предпочтительно является р-гидроксифенилглицином.

Обнаружение данной ненативной трипептид-циклизирующей активности ΙΡΝ8 выполняется с использованием биоанализа и/или с использованием БС/М8 анализа.

Для разработки биоанализа требовалось создать различные альтернативы. Например, для тестирования антибиотической активности требовалось выбрать подходящий микроорганизм. Кроме того, требовалось выбрать подходящую ΙΡΝ8, так как ферменты ΙΡΝ8 от разных видов, по-видимому, различаются по специфической активности и стабильности.

Теперь, когда обнаружена ненативная трипептид-циклизирующая активность ΙΡΝ8, как указано выше, возможно оптимизировать условия реакции и провести скрининг вариантов ΙΡΝ8 на ферменты с улучшенной специфической активностью и/или измененной субстратной специфичностью.

Циклизация ненативного трипептида ш νίίτο для получения пенамового антибиотика, как правило, выполняется с использованием условий реакции как указано ниже.

Значение рН реакционной смеси может находиться между 6 и 8 при использовании любого подходящего буфера. Реакционная смесь, кроме того, должна содержать подходящее количество ионов Ее(П). Наконец, необходимо присутствие восстановителя, например ΌΤΤ или ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил) фосфина), для поддерживания предшественника трипептида в восстановленном состоянии. Предпочтительно предшественник трипептида является предварительно обработанным таким подходящим восстановителем.

Необязательно, образованный пенамовый антибиотик, такой как амоксициллин или ампициллин, затем может быть превращен с целью получения цефемового антибиотика. Это превращение требует, по меньшей мере, фермента экспандазы, например, чтобы образовать цефадроксил или цефалексин. Необязательно, другие цефемовые соединения могут быть образованы дальнейшими ферментативными превращениями с использованием, например, гидроксилазной и ацетилтрансферазной ферментативной активности или гидроксилазной и карбамоилтрансферазной ферментативной активности. Ферменты, необ

- 2 016155 ходимые для этих превращений, соответственно получают от цефем-продуцирующих микроорганизмов, таких как 81гер1отусе5 с1ауи11деш8, Ыосагй1а 1ас1атйигаи8 или Легетошит сйгукодеиит. См. недавние обзоры Ыгак и Майш, 1п1етайоиа1 МюгоЬю1оду (2006) 9: 9-19.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент ΙΡΝ8 используют, как описано здесь ниже.

В одном варианте осуществления в качестве исходных соединений в процессе используют специально сделанные трипептиды НрдСV и РдСУ. В другом варианте осуществления трипептиды НрдСУ и РдСУ получают в процессе, включающем ί) контактирование аминокислот гидроксифенилглицина (Нрд) или фенилглицина (Р§), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (ΝΚΡ8) для того, чтобы осуществить образование трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валина (НрдСУ) или фенилглицин-цистеинил-валина (РдСУ).

ΝΚΡ8 для применения в этом варианте осуществления является неприродной ΝΚΡ8 с модульным строением, содержащей три модуля, первый модуль М1, специфический к Нрд или Рд, второй модуль М2, специфический к С, и третий модуль М3, специфический к V, как описано здесь ниже.

Общий способ получения Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил βлактамового антибиотика из его предшествующих аминокислот, таким образом, включает: ί) контактирование аминокислот гидроксифенилглицина (Нрд) или фенилглицина (Рд), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (ΝΚΡ8) для того, чтобы осуществить образование трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валин (ИрдС^ или фенилглицин-цистеинил-валин (ΡдСV), и и) контактирование указанных трипептидов с ΙΡΝ8 для того, чтобы осуществить образование Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика.

Способы могут быть выполнены ш у1уо с использованием подходящего сконструированного микробного штамма, как описано здесь ниже.

Во втором аспекте изобретения предоставлены различные полипептиды ΙΡΝ8, которые модифицированы по сравнению с первоначальным (родительским) полипептидом ΙΡΝ8 и которые обладают улучшенной циклизирующей активностью на трипептид НрдСV или ΡдСV по сравнению с первоначальной ΙΡΝ8.

Улучшенной активностью разновидности фермента ΙΡΝ8 согласно изобретению является активность, которая обеспечивает получение по меньшей мере 2-кратного количества антибиотической активности, если исходить из предшественника трипептида, по сравнению с первоначальной ΙΡΝ8, предпочтительно по меньшей мере 5-кратное количество, более предпочтительно по меньшей мере 10-кратное количество. Если первоначальная ΙΡΝ8 имеет неопределяемую активность на пептид-предшественник, улучшенная активность включает любую измеримую активность выше предела обнаружения.

Подходящие положения для модификации в первоначальной ΙΡΝ8 могут быть выбраны исходя из критериев: а) создание пространства (зоны) в активном центре и/или Ь) ослабление связывания С-конца к активному участку. С-конец молекулы ΙΡΝ8 действует как квази-субстрат, когда фермент не нагружен субстратом, и, таким образом, конкурирует с субстратом за связывание активного участка. После приближения субстрата к активному центру, С-конец удаляется (отходит), создавая пространство для субстрата. Таким образом, может быть выгодным сдвинуть это соревнование в пользу связывания субстрата.

Первоначальная ΙΡΝ8 может происходить из любого подходящего микробного источника, как указано здесь ниже.

Отдельная разновидность фермента ΙΡΝ8 изобретения, после того как выровнена с последовательностью ΙΡΝ8 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 1, является модифицированной по сравнению с родительским ферментом ΙΡΝ8, по меньшей мере, в положениях 75, 91, 183, 185, 287, 321, 324, 331, и способна превратить трипептид НрдСV или Рд^ соответственно в антибиотик амоксициллин или ампициллин соответственно. Модификации в этих положениях создают больше пространства в кармане связывания боковой цепи пептида для размещения более объемистых боковых цепей Нрд и Рд трипептидов НрдСV и ΡдСV по сравнению с линейной и гибкой α-аминоадипил боковой цепью ΑСV. Предпочтительный вариант содержит модификацию по всем вышеупомянутым положениям. Предпочтительными модификациями в этих положениях являются модификации 75^^, 91ЕН, 183ΑС’СТУ^. 1858ТСАС, 287Н8ОСМК.

321Е8ΑVТ^ЕМ, 324N^8ТУΑ. 3310Α8ί.ν0Ν. Особенно предпочтительными модификациями являются 75^, 183ΑΟ, 185ΟΑ, 287НС, 321ΑVТМ, 324Ν8Α, 33^8^^

Модификация может быть замещением отдельной аминокислоты в указанном положении(ях) на другую аминокислоту, может быть включением аминокислоты в указанное положение(я) или может быть удалением аминокислоты из указанного положения(й).

Другая отдельная разновидность фермента ΙΡΝ8 изобретения, после того как выровнена с последовательностью ΙΡΝ8 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1, модифицирована по сравнению с первоначальным ферментом ΙΡΝ8, по меньшей мере, в положении 185 и необязательно по меньшей мере в одном из следующих положений, используя нумерацию положений последовательности 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1: 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, и является допускающей превращение трипептида НрдСV или ΡдСV соответственно в антибиотик амоксициллин или ампициллин соответственно. Модификации в этих положениях изменяют конкуренцию

- 3 016155 между субстратом и ГРЫ§-С-концевыми остатками -О330-Т331 для связывания в активном центре в пользу субстрата посредством ослабления связывания С-конца с активным центром и/или посредством стабилизации конформации, в которой активный участок является доступным для связывания субстрата. Было неожиданно обнаружено, что модификация, по меньшей мере, в положении 185 дает сильно улучшенную активность циклизации ферменту ΙΡΝ8, содержащему модификацию, по сравнению с первоначальной ΙΡΝ8, не содержащей модификацию.

Предпочтительная разновидность согласно изобретению содержит модификацию 185ВКН, более предпочтительно модификацию 185ВК, наиболее предпочтительно модификацию 185В. Исходная аминокислота в положении 185 зависит от первоначальной ΙΡΝ8, которая используется, например может быть 8, Т или V.

В одном варианте осуществления модификация 185ВКН является скомбинированной с модификацией по меньшей мере в одном из положений 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, как указано в табл. ниже. В частности, В и К могут взаимодействовать с С-концевым Т331, когда С-концевая область Ν-СО-Т331 принимает активную конформацию. Неожиданно взаимодействие между 185ВК и Т331 является очень выгодным для увеличения активности НрдСУ и РдСУ. Вероятно, 185ВК способствует образованию активной конформации, используя НрдСУ и Ρβί,'ν в качестве субстратов.

Нативный*	Предпочтительные модификации	Особенно предпочтительные модификации
Υ91	НР	Р
С104	АУ8ТЫ	УТЫ
183	АСУТЫ	АСТ
Р190	ΠΑνΝΟΟΕΗΤΚΚΥ	. АУ8Т
321	ΑΙΜΟ	АМО
Ь324	ΝϋδΤνΑ	ΝΌ
1325	ΑΙ ΝΤ)ΕΜ	ьмо
Т331	ОАУ8С	С8

* В тех положениях, где аминокислота установлена, отдельная аминокислота является консервативной во всех нативных ферментах, известных на данное время.

В настоящем изобретении обозначение, подобное, например, 185ВК, означает, что аминокислота в положении 185 первоначальной ΙΡΝ8, о которой идет речь, заменена или В или К, или, что в положении 185 первоначальной ΙΡΝ8 или В или К вставлены, когда в первоначальной ΙΡΝ8 нет аминокислоты, находящейся в этом положении. Природа исходного аминокислотного остатка будет зависеть от первоначальной ΙΡΝ8, которая используется. Обозначение, подобное, например, ν8Τ185ΒΚ, означает, что отдельный аминокислотный остаток в положении 185, присутствующий в первоначальной ΙΡΝ8, в этом примере V, 8 или Т, заменен другой аминокислотой, в этом примере В или К.

Подходящая первоначальная ΙΡΝ8 представляет собой полипептид ΙΡΝ8, получаемый из грибкового или бактериального организма, способного продуцировать β-лактамы. Предпочтительной первоначальной ΙΡΝ8 является ΙΡΝ8, получаемая из Серйа1о8рот1ит астетошит, Ρеη^с^1^^ит сйтукодеиит, АкрегдШик (Етег1се11а) шйи1ап8, 81гер1отусе8 щтопрпепА. ШсагШа 1ас1атйигаи8, 81гер1отусе8 т!сгоГ1ау15. Ьу8оЬас1ег 1асΐатдеии8, Е1ауоЬас1егшт креыек, 81гер1отусе8 с1ауи11деги8, 81гер1отусе8 дпкеик и/или 81герЮтусек сай1еуа. Особенно предпочтительной первоначальной ΙΡΝ8 является получаемая из 81гер1отусек с1ауи11деги8 и/или ЛкретдШик (Етепсе11а) шйи1ап8. В основном такая первоначальная ΙΡΝ8 является полипептидом с ΙΡΝ8 активностью, который имеет степень идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.

В дополнение к модификациям, как изложено выше, предпочтительно модификации 185ВКН, полипептид ΙΡΝ8 может содержать дополнительные модификации, которые касаются положений в полипептиде, в которых модификация не влияет существенно на свертывание или активность полипептида. В основном такие модификации могут являться консервативными модификациями, например замещениями, в которых неполярная, полярная незаряженная, полярная заряженная или ароматическая аминокислота замещена другой аминокислотой из той же самой категории, или могут иметь место вследствие внутриштаммной или внутривидовой разновидности. Полипептиды, имеющие такие дополнительные модификации, в основном имеют степень идентичности по меньшей мере 50% с последовательностью 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 1.

Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид, обладающий ΙΡΝ8 активностью и содержащий по меньшей мере одну из модификаций, как изложено выше, имеет степень идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.

- 4 016155

Термины гомология или процент идентичности используются здесь взаимозаменяемым образом.

Для цели настоящего изобретения здесь определено, что для того, чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в каждую последовательность для оптимального выравнивания могут быть введены пропуски). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот. Когда положение в первой последовательности является занятым тем же самым аминокислотным остатком, как соответствующее положение во второй последовательности, в таком случае молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, разделяемых последовательностями (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (т.е. перекрывающиеся положения, включая пропуски (гэпы))х100). Предпочтительно две последовательности являются одинаковой длины.

Квалифицированный специалист безусловно осведомлен о том, что существуют компьютерные программы, способные определить гомологию между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с применением математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с применением алгоритма №еб1етап и ХУшъсБ (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу САР в комплекте программного обеспечения Ассе1гук ССС (доступный на 1Шр://\у\у\у.ассе1гу5.со1п/ргойис15/дсс|/). с использованием или матрицы Βίοδδοιη 62, или матрицы РАМ250, и дар \уе1д111 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4 и а 1епд111 \уе1д111 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 или 6. Квалифицированный специалист поймет, что все эти различные параметры будут давать несущественно отличные результаты, но что общий процент идентичности двух последовательностей не изменится существенно при использовании различных алгоритмов. Предпочтительно матрица является Βίοδδοιη 62 матрицей с дар \уе1д111 10,0 и 1епд111 \уе1д1И 0,5.

Белковые последовательности настоящего изобретения могут затем быть использованы как запрошенная (циегу) последовательность для осуществления поиска в общедоступных базах данных, например для установления других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск может быть выполнен с применением программ Ыайр, ры-Ыай, рЫ-Ыай и 1Ыа§1п (версия 2.0) АЙ8сйи1, е! а1. (1990) 1. Μο1. Βίο1. 215:403-10. При использовании программ Ыакф, рм-ЫаЛ, рЫ-Ыа§1 и 1Ыа§1п могут быть использованы параметры соответствующих программ, принимающие значение по умолчанию (например, программ Ыайр, рщ-Ь1а81, рЫ-Ыай и 1Ыаз1п). См. главную страницу Национального центра биотехнологической информации на сайте \у\у\у.ηсЬ^.η11η.η^11.^ον.

В третьем аспекте предоставлен полипептид, который является нерибосомальной пептидной синтетазой, содержащей три модуля, первый модуль Μ1, специфичный к Нрд или Рд, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль М3, специфичный к V. При использовании для описания модуля термин специфичный к аминокислоте означает, что отдельный модуль делает возможным введение указанной аминокислоты. Первый модуль Μ1 делает возможным введение первой аминокислоты Б-ρгидроксифенилглицина или Ь-фенилглицина и предпочтительно ее превращение в соответствующую Όаминокислоту. Второй модуль М2 делает возможным введение аминокислоты Ь-цистеина наряду с тем, что является связанным с аминокислотой Нрд или Рд. В частности, когда аминокислота Нрд или Рд находится в ее Ό-форме, М2 модуль, специфический к С, содержит ^иС₉ домен, который соединен с А доменом, который к тому же является гетерологичным. Третий модуль М3 делает возможным введение аминокислоты Ь-валина и ее превращение в соответствующую Ό-аминокислоту. Таким образом, пептидная синтетаза катализирует образование ОБО-трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валин (НрдС'У) или фенилглицин-цистеинил-валин (РдС'У) из его Б-аминокислотных предшественников Нрд или Рд, С и V.

Термин модуль при использовании в данном изобретении определяет каталитическую единицу, которая делает возможным включение одного пептидного структурного звена, обычно аминокислоты, в продукт, обычно пептид, и может включать домены для модификаций, подобных эпимеризации и метилированию.

Каждый модуль ΝΒΡ8 составлен из так называемых доменов, каждый домен является ответственным за отдельную стадию реакции при включении пептидного структурного звена.

Каждый модуль, по меньшей мере, содержит домен аденилирования (А домен), ответственный за распознавание и активацию предназначенной аминокислоты, и домен тиолирования (Т или РСР домен), ответственный за транспорт промежуточных продуктов к каталитическим центрам. Второй и следующий модули, кроме того, содержат домен конденсации (С домен), ответственный за образование пептидной связи, и последний модуль, кроме того, содержит домен терминации (ТЕ домен), ответственный за высвобождение пептида. Необязательно, модуль может содержать дополнительные домены, такие как домен эпимеризации (Е-домен), ответственный за превращение Б-формы включенной аминокислоты в Όформу. См. 81еЬег 8.А. е! а1. 2005, С1ет. Веу., 105, 715-738 для обзора модульной структуры ΝΒΡ8.

- 5 016155

Подходящим источником для модуля М1 гибридной пептидной синтетазы является фермент ΝΚΡ8, катализирующий образование пептида, содержащего аминокислоту X, в котором X является Нрд или Рд, для включения в качестве первой аминокислоты в трипептид ХСУ. Таким образом, подходящий модуль М1 выбирают, принимая во внимание природу аминокислоты для включения в качестве первой аминокислоты в трипептид. В частности, домен А модуля обусловливает селективность для отдельной аминокислоты. Таким образом, модуль М1 может быть выбран исходя из специфичности домена А для аминокислоты, которая должна быть включена. Такой выбор может совершаться согласно специфичности определяющего характерного мотива домена А, как определено 81асйе1йаик Т. е! а1. 1999, С1ет. & ΒίοΙ, 8, 493-505.

Модулю М1 не нужно содержать С домен и ТЕ домен, так как он является первым модулем ΝΚΡ8. Таким образом, если в источнике модуля присутствует С и/или ТЕ домен, он соответственно может быть удален для того, чтобы получить первый модуль М1 без С и/или ТЕ домена. В дополнение к А и Т домену модуль М1 ΝΚΡ8 должен содержать Е домен, если Ь-аминокислоту необходимо превратить в Баминокислоту. Таким образом, если Е домен в источнике модуля не присутствует, его соединяют с Т доменом источника модуля для того, чтобы получить первый модуль М1, содержащий А, Т и Е домен.

Вообще специфичность модуля М1 ΝΚΡ8 к ρ-гидроксифенилглицину или фенилглицину можно оценить с помощью экспериментальных данных и/или может основываться на специфичности определяющего характерного мотива домена А, как опубликовано 81асйеШаик Т. е! а1. 1999, С1ет. & Βίοι, 8, 493-505.

Предпочтительно первый модуль М1 с ρ-гидроксифенилглицин специфичностью, который получают из СБА (кальцийзависимый антибиотик) синтетазы, в частности является шестым модулем СБА синтетазы (нумерация модулей СБА синтетазы дана, как опубликовано Ηο)ηΙί Ζ. е! а1. 2002, С1ет. & Βίοι, 9, 1175-1187). Предпочтительно СБА синтетазу получают из 8!герЮтусек сοе1^сο1ο^. Альтернативно, Нрдспецифические модули могут быть получены из хлоререномицин (СЫο^οе^еηοтус^η) синтетазы, и, в частности, являются четвертым и пятым модулями хлоререномицин синтетазы, предпочтительно хлоререномицин синтетазы, получаемой из Ату^а^к^ ο^^епίа^^к (Тгаидег 1\У. е! а1. 2000, Ρτοα №11. АсаФ. 8с1. И8А, 97, 3112-20 3117), или из комплестатин синтетазы, в частности является седьмым модулем комплестатин синтетазы, предпочтительно комплестатин синтетазы, получаемой из 8!герЮтусек 1ауепФи1ае (СЫи Н.Т. е! а1. 2001, Ρτοα №11. АсаФ. δα. И8А, 98, 8548-8553). Все эти модули обладают специфичностью к Ь-Нрд и превращают его в Б-стереоизомер.

Предпочтительно первый модуль М1 с фенилглициновой специфичностью, который получают из пристинамицин синтетазы, в частности является С-концевым модулем протеина 8пЬБ пристинамицин синтетазы, как опубликовано в ТЫЬаШ. Б. е! а1. 1997, 1. ВаФ, 179, 697-704. Предпочтительно пристинамицин синтетазу получают из ЗЧерФтусек ртЫтакрпайк.

С-концевой источник модуля из пристинамицин синтетазы содержит ТЕ домен и не содержит Е домен. Чтобы получить модуль, функционирующий как первый модуль в пептидной синтетазе изобретения, ТЕ домен соответственно удаляют из С-концевого источника модуля, а Е домен соединяют с Т доменом модифицированного таким образом С-концевого модуля. Домен Е можно получить из любой подходящей ΝΚΡ8, например из другого модуля того же самого фермента ΝΚΡ8, или также из модуля другого фермента ΝΚΡ8 с одинаковой (например ρ-гидроксифенилглицин или фенилглицин) или отличной аминокислотной специфичностью домена аденилирования. Предпочтительно Е домен получают из СБА синтетазы из 8!герЮтусек сοе1^сο1ο^. предпочтительно из шестого модуля, как указано выше. Таким образом, в этом варианте осуществления модуль М1 ΝΒΡ8 является гибридным модулем.

Второй модуль М2 пептидной синтетазы должен дать возможность включения аминокислоты цистеина в качестве второй аминокислоты трипептида БЬБ-ХСУ, в котором X является Нрд или Ρд. Выбор этого модуля может быть основан на специфичности определяющего характерного мотива А домена, как опубликовано 8!ас11е111аик Т. е! а1. 1999.

Чтобы дать возможность соединения Ь-цистеинил акцептора с Б-Х-аминоацил донором, С домен модуля М2 является 'Ό. доменом (как отмечено выше и как объяснено в работе С'ПидкЮп 8.Ь. е! а1. 2003). Этот Ά'ι. домен соединен с А доменом, который является к тому же гетерологичным. Термин гетерологичный при использовании в этом контексте означает, что С и А домены происходят из разных модулей. Эти различные модули могут быть из того же самого фермента или могут быть из разных ферментов. Предпочтительно А домен получают из второго модуля АСУ8. Неожиданно, гибридный модуль М2, содержащий такую конфигурацию ^сС_ъ-А домена, по-видимому, является способным включать аминокислоту цистеин.

В предпочтительном варианте осуществления Ά'ι. домен модуля М2 получают из модуля, находящегося непосредственно ниже модуля, который является источником первого модуля М1 пептидной синтетазы изобретения. Например, ^сСь домен модуля М2 пептидной синтетазы представляет собой ^сСь домен седьмого модуля СБА синтетазы, которая является источником первого модуля М1.

В другом варианте осуществления Ά'ι. домен модуля М2 пептидной синтетазы является ^сСь доменом второго модуля протеина 1!иС итурин-синтетазы ВасШик киЫШк КВ14, как определено Ткиде К. е! а1.

- 6 016155

2001, 1. Бай, 183, 6265-6273.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения второй модуль М2 пептидной синтетазы, по меньшей мере, частично получают из фермента, который является источником третьего модуля М3 пептидной синтетазы. В частности, А и Т домены М2 модуля пептидной синтетазы получают из модуля, находящегося непосредственно выше модуля, который является источником третьего модуля пептидной синтетазы изобретения. Например, А и Т домены модуля М2 пептидной синтетазы могут быть А и Т доменами второго модуля АСУ8.

Третий модуль М3 пептидной синтетазы должен давать возможность включения аминокислоты валина в качестве третьей аминокислоты трипептида, а также ее превращения в Ό-форму, чтобы давать трипептид ΌΕΌ-ХСУ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения третий модуль пептидной синтетазы, который получают из АСУ8, в частности является третьим модулем АСУ8.

АСУ8, как указано выше, предпочтительно является бактериальной или грибковой АСУ8, более предпочтительно бактериальной АСУ8, получаемой из №сагШа 1ас!атбигап8 или грибковой АСУ8, получаемой из мицелиальных грибов, таких как РешсШшт сйгукодепцт, Асгетошит сйгукодепит, Лбрсгβί11ιΐ5 шби1ап8.

Модули М1, М2 и М3 пептидной синтетазы могут иметь аминокислотные последовательности, как показано ниже. Однако эти последовательности приведены только в качестве примеров и не предназначены ограничивать рамки изобретения. Квалифицированному специалисту будет понятно, что ΝΚΡ8 А домены, например, разделяют около 30-60% идентичности аминокислотной последовательности, даже А домены со специфичностью к той же самой аминокислоте, но из разного источника, и содержат несколько центральных мотивов, в числе которых определяющий специфичность характерный мотив (81ас11е1йаи8 Т. е! а1., 1999).

М1 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 или 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 4 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2 или 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 4. Такие полипептидные модули с процентом идентичности по меньшей мере 30% также называются гомологичными последовательностями или гомологами.

М2 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 6 или с 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8.

М3 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10.

Модули пептидной синтетазы могут быть получены из природных ферментов ΝΚΡ8, как указано выше, или могут быть получены из таких природных ферментов ΝΚ.Ρ8 методами мутагенеза, таким как случайный и/или сайт-направленный мутагенез и/или перетасовкой генов. При необходимости источник модуля, кроме того, может быть сконструирован для того, чтобы добавить необходимые домены, исключить ненужные домены или заменить домен на соответствующий домен из другого модуля. В основном А домен модуля определяет специфичность к отдельной аминокислоте, тогда как Е и С домены могут быть получены из любого выбранного модуля. Например, в ситуации, когда выбранный источник модуля для включения первой аминокислоты X не является первым модулем (М1 модуль) в ферментеисточнике и таким образом содержит С домен, С домен источника модуля может быть исключен. В ситуации, когда модуль-источник не содержит Е домен, в то время как эпимеризация включенной аминокислоты является желательной, может быть добавлен подходящий Е домен.

Сконструированные ΝΚΡ8 ферменты могут быть созданы посредством интеграции соответствующих доменов и/или модулей в соответствующем порядке. Также возможно заменить модуль или домен фермента на подходящий модуль или домен другого фермента. Это объединение или обмен доменов и/или модулей может быть сделано с помощью методов генной инженерии, общеизвестных в данной области техники. Объединение двух различных доменов или модулей может быть сделано в основном в линкерных областях, которые находятся внутри между модулями и доменами. См., например, ЕР 1255816 и Μοοΐζ Η.Ό. е! а1. 2000, раскрывающие эти типы конструкций. Часть или все последовательности также могут быть получены с помощью специального синтеза соответствующей полинуклеотидной последовательности(ей).

Например, объединение АТЕ тридоменного фрагмента из Нрд-специфического ΝΚΡ8 модуля с бимодульным Су8-Уа1-специфическим фрагментом АСУ8 может быть сделано следующим образом. АТЕ фрагмент Нрд специфического модуля может быть выделен посредством обработки рестрикционным ферментом соответствующего гена ΝΚΡ8 в линкерных положениях, конкретнее, между С доменом и А

- 7 016155 доменом Нрд специфического модуля, в случае С-концевого модуля, или между С доменом и А доменом Нрд специфического модуля и между Е доменом и следующим доменом (С или ТЕ домен), в случае внутренней элонгации модуля. Бимодульный Сук-Уа1 фрагмент АСУ8 может быть получен 1) оставлением С-конца интактным, и 2) заменой С домена Сук специфического модуля 2 на С домен, который имеет ^сСь специфичность. По аналогии с выделением АТЕ фрагмента может быть выделен АТЕС четырехдоменный фрагмент, включая С домен соседнего, находящегося ниже модуля. Последний соединяется с бимодульным Сук-Уа1 фрагментом АСУ8 без находящегося выше С домена.

Ферменты ΝΚΡ8, как описано здесь, соответственно могут быть подвергнуты методам мутагенеза, например, для улучшения каталитических свойств ферментов.

Полипептиды, как описано здесь, можно получить синтетическими способами, хотя обычно они могут быть сделаны рекомбинантно посредством выделения полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в подходящем организме-хозяине.

В четвертом аспекте предоставлены полинуклеотиды (например, выделенные и/или очищенные), содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую разновидность ΙΡΝ8 или полипептиды ΝΚΡ8 предшествующих аспектов изобретения. Полинуклеотиды настоящего изобретения, кроме того, включают любые вырожденные варианты полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Например, квалифицированный специалист может, используя обычные методики, делать нуклеотидные замены, которые не затрагивают белковую последовательность, закодированную в полинуклеотидах изобретения, для того, чтобы отразить использование кодона любого отдельного организмахозяина, в котором полипептиды изобретения экспрессируются. Предпочтительно кодирующие последовательности в полинуклеотидах оптимизируются посредством оптимизации кодоновой пары.

Полинуклеотидная последовательность изобретения может представлять собой РНК или ДНК и включает геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно полинуклеотид представляет собой ДНК последовательность.

Полинуклеотиды, кодирующие модули М1, М2 и М3 фермента ΝΚΡ8 первого аспекта, например, могут иметь нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕО 10 N0: 3, 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 7, 8Е0 ГО N0: 9 и 8Е0 ГО N0: 11, кодирующими аминокислотные последовательности 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 8 и 8Е0 ГО N0: 10, или могут быть нуклеотидными последовательностями, кодирующими гомологи вышеупомянутых аминокислотных последовательностей, как определено выше.

Полинуклеотиды могут быть синтезированы согласно способам, хорошо известным в данной области техники. Они могут быть получены комбинированием олигонуклеотидов, синтезированных согласно и в соответствии с нуклеотидной последовательностью полинуклеотида изобретения. Альтернативно, они могут быть синтезированы посредством мутагенеза родительского полинуклеотида в любом желательном положении. Полинуклеотиды, кроме того, могут быть использованы для получения полинуклеотидов, кодирующих дополнительный модифицированный полипептид, например, подвергая полинуклеотиды дополнительным методам мутагенеза.

Таким образом, полипептиды с улучшенной активностью в основном получают способом, включающим стадии подвергания полинуклеотида, кодирующего полипептид, мутагенезу, скрининга полученной популяции различных полипептидов на желательную активность и выделение разновидностей с улучшенной активностью.

Мутагенез может быть выполнен с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области техники. Мутагенез может включать подвергание случайному мутагенезу, так же как и сайт-направленному мутагенезу. При использовании сайт-направленного мутагенеза его предпочтительно комбинируют с насыщающим мутагенезом в выбранном положении(ях), давая возможность замещения первоначальной аминокислоты любой другой аминокислотой. Технология перетасовки полинуклеотидов (перетасовка генов) (например, как описано в \У0 95/22625, \У0 98/27230, \У0 98/01581, \У0 00/46344 и/или XV0 03/010183) может быть использована для получения разновидностей со случайной комбинацией любых отличающихся положений, присутствующих в любом представителе исходной популяции молекул. Исходная популяция, кроме того, может включать одну или больше разновидностей согласно изобретению.

Изобретение также обеспечивает векторы, содержащие полинуклеотид изобретения, включая клонирующий и экспрессионный векторы или кассеты.

В экспрессионном векторе или кассете полинуклеотид является функционально связанным с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию полипептида из его кодирующей последовательности клеткой-хозяином. Термин функционально связанный относится к смежному положению, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или другой экспрессионный регуляторный сигнал, функционально связанный с кодирующей последовательностью, располагается так, что экспрессия полипептида из его кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с регуляторными последовательностями.

Промоторы/энхансеры и другие экспрессионные регуляторные сигналы могут быть выбраны для

- 8 016155 того, чтобы быть совместимыми с клеткой-хозяином, для которой создан полигенный экспрессирующий кластер (ехргеккюп саккейе) или вектор. Если полипептид продуцируется как секретируемый протеин, полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в полигенном экспрессирующем кластере, является функционально связанной с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид.

Последовательность ДНК, кодирующую полипептид изобретения, предпочтительно помещают в подходящего хозяина как часть полигенного экспрессирующего кластера. Для трансформации подходящего хозяина полигенным экспрессирующим кластером пригодны способы трансформации, которые хорошо известны квалифицированному специалисту. Полигенный экспрессирующий кластер может быть использован для трансформации хозяина как часть вектора, несущего селектируемый маркер, или полигенный экспрессирующий кластер может быть совместно трансформирован как отдельная молекула вместе с вектором, несущим селектируемый маркер. Вектор может содержать один или больше селектируемых маркерных генов.

Для большинства мицелиальных грибов и дрожжей экспрессирующая конструкция предпочтительно является интегрированной в геном клетки-хозяина для получения устойчивых трансформантов. В таком случае конструкции являются или интегрированными в случайные локусы в геноме, или в предопределенные локусы-мишени с использованием гомологичной рекомбинации.

Таким образом, пятый аспект изобретения обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные или содержащие полинуклеотид или вектор изобретения.

Подходящими клетками-хозяевами являются клетки-хозяева, которые делают возможным высокий уровень экспрессии представляющего интерес полипептида. Такие клетки-хозяева являются удобными в случае, если полипептиды нужно получить и затем использовать, например, в реакциях ίη νίίτο. Может быть выбран гетерологичный хозяин, в котором полипептид изобретения производится в форме, которая является, по существу, свободной от других полипептидов со сходной активностью, как полипептиды изобретения. Этого можно достигнуть выбором хозяина, который обычно не производит подобные полипептиды со сходной активностью.

Подходящими клетками-хозяевами также являются клетки, способные производить β-лактамовые соединения, предпочтительно клетками-хозяевами, обладающими способностью производить βлактамовые соединения на высоких уровнях. Клетками-хозяевами, например, могут быть прокариотические (например, бактериальные), грибковые или дрожжевые клетки. Хозяин может быть выбран на основе альтернативы - производить пенамовое или цефемовое соединение. Когда рассматривается получение цефемового соединения, хозяин может нативно содержать необходимые гены пути биосинтеза, приводящего к цефемовому соединению, в частности гены, кодирующие экспандазную активность и, необязательно, гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность. Альтернативно, один или больше генов пути биосинтеза, приводящего к цефемовому соединению, могут быть трансформированы в клеткухозяин, лишенную этих генов. В связи с этим квалифицированному специалисту известно, что ферменты экспандаза и экспандаза/гидроксилаза способны к разложению ампициллина и амоксициллина (СЫп е! а1. 2003, ЕЕМ8 МюгоЬю1. Ье«., 218, 251-257; Ь1оуй е! а1. 2004, 1. ΒίοΙ. Сйет. 279, 15420-15426).

В одном варианте осуществления подходящая клетка-хозяин представляет собой клетку, в которой нативные гены, кодирующие ферменты АСУ8 и/или ΙΡΝ8, инактивированы, например, инсерционной инактивацией. Также возможно удалить полный кластер биосинтеза пенициллина, содержащий гены, кодирующие АСУ8, ΙΡΝ8 и АТ. В этом случае получение представляющего интерес β-лактамового соединения возможно без одновременного получения природного β-лактама. Инсерционная инактивация, таким образом, может совершаться с использованием гена, кодирующего ΝΚΡ8, и/или гена, кодирующего ΙΡΝ8, как описано выше. В клетках-хозяевах, которые содержат множественные копии β-лактамовых генных кластеров, могут быть отобраны клетки-хозяева, в которых эти кластеры спонтанно ликвидированы. Например, устранение β-лактамовых генных кластеров описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045.

Другой подходящей клеткой-хозяином является клетка, которая способна синтезировать предшественник аминокислот Нрд или Ρ§. Гетерологичная экспрессия генов пути биосинтеза, ведущего к Нрд или Ρ§. раскрыта в XVО 02/34921. Биосинтез Ρβ или Нрд достигается удалением фенилпирувата (РР) или ргидроксифенилпирувата (НРР) соответственно из ароматического аминокислотного пути, превращающего РР или НРР в миндальную кислоту (МА) или р-гидроксиминдальную кислоту (НМА) соответственно, превращающего МА или НМА в фенилглиоксилат (Ρ6Ε) или р-гидроксифенилглиоксилат (ΗΡ6Ε) соответственно и окончательно превращающего Ρ6Ε или ΗΡ6Ε в Э-Ρβ или Ό-Нрд соответственно. Пример 15 приводит пример экспрессии пути биосинтеза Нрд или Ρ§ в Ρеη^с^11^ит сйгукодепит.

Другой подходящей клеткой-хозяином является клетка, которая (сверх)экспрессирует 4'-фосфопантетеин трансферазу (РРТаза). 4'-Фосфопантетеин (РРТ) представляет собой важнейшую простетическую группу в числе других ацил-несущих протеинов синтаз жирных кислот и поликетидсинтаз и пептидил-несущих протеинов ΝΚΡ8. Свободная тиоловая часть РРТ, как тиоэфиры, служит для ковалентного связывания промежуточных соединений ацильной реакции, обычно ацетил, малонил и аминоацил групп,

- 9 016155 во время многошаговой сборки мономерных предшественников. РРТ часть получают из коэнзима А (СоА) и посттрансляционно переносят на инвариантную боковую цепь серина. Это Мд²⁺-зависимое превращение апопротеинов в голопротеины катализируется 4'-фосфопантетеин трансферазами (РРТазы). Полезно (сверх)экспрессировать РРТазу с широкой субстратной специфичностью. Такая РРТаза кодируется, например, геном дкр из ВаеШик Ьтеук (Вотсйей с1 а1. 1994, 1. Вас1етю1оду, 176, 2458-2462).

Хозяин может соответственно включать одну или больше модификаций, как упомянуто выше. Предпочтительным хозяином является штамм РешсШиш сЬтукодепиш.

В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ получения полипептида согласно изобретению культивированием клетки-хозяина (например, трансформированной экспрессионным вектором или кассетой, как описано выше) при условиях, ведущих к экспрессии (посредством вектора или кассеты) полипептида согласно изобретению и, необязательно, извлечения экспрессированного полипептида. Полипептид может быть произведен как секретируемый протеин, и в этом случае полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в экспрессирующей конструкции, является функционально связанной с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Полипептид также может быть произведен как слитый (гибридный) протеин, т.е. соединенный с (частью) другим полипептидом, например слитый с мальтозу-связывающим протеином.

Для реакций ίη νίίΐΌ может быть использован секретируемый полипептид или бесклеточный экстракт, содержащий полипептид. Необязательно, полипептид может быть (частично) очищен перед его использованием.

В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ получения β-лактамового соединения культивированием клетки-хозяина предыдущего аспекта при таких условиях, чтобы обеспечить экспрессию ΕΡΝ8 и/или ΝΚΡ8 полипептида(ов), как описано здесь, и подходящих для производства βлактамового соединения, но необязательно извлечения β-лактамового соединения. Согласно изобретению β-лактамовое соединение, которое производится, является Ν-ацилированным β-лактамовым соединением, в котором Ν-ацил боковая цепь является Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-αаминофенилацетил боковой цепью. Преимущественно настоящее изобретение раскрывает полностью ферментативное получение таких β-лактамовых антибиотиков. Примерами таких β-лактамовых антибиотиков являются амоксициллин, ампициллин, цефадроксил и цефалексин.

Клетки-хозяева согласно изобретению можно культивировать с помощью методов, известных в данной области техники. Для каждой комбинации промотора и клетки-хозяина имеются условия культивирования, которые являются благоприятными для экспрессии полипептида изобретения. После достижения необходимой плотности клеток или титра полипептида культивирование останавливают и полипептид отделяют, используя известные методы. Дополнительно могут быть установлены условия ферментации, способствующие получению β-лактама.

Ферментативная среда может включать известную культуральную среду, содержащую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, мелассу), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, источники органического азота, например экстракт дрожжей, солодовый экстракт, пептон), витамины и другие неорганические питательные источники (например, фосфат, магний, калий, цинк, железо, микроэлементы и т.д.). Необязательно, может быть включен индуктор.

Выбор подходящей среды может основываться на выборе хозяина экспрессии и/или исходя из регулятивных требований экспрессирующей конструкции. Подобные среды хорошо известны специалистам в данной области техники. Среда может, при необходимости, содержать дополнительные компоненты, поддерживающие трансформированных экспрессирующих хозяев больше других потенциально загрязняющих микроорганизмов. Также может быть необходимо дополнить среду соединениямипредшественниками β-лактамовых соединений, которые должны производиться. Например, может быть необходимо, в зависимости от хозяина, который используется, включать аминокислоты Нрд или Рд в культуральную среду. Если так, эти аминокислоты предпочтительно добавляются как отдельное питание.

Ферментация может быть выполнена в течение периода 0,5-30 дней. Это может быть периодический, непрерывный или подпитываемый процесс, соответственно, при температуре в пределах между 0 и 45°С и, например, при значении рН между 2 и 10. Предпочтительными условиями ферментации являются температура в пределах между 20 и 37°С и/или значение рН между 3 и 9. Соответствующие условия обычно выбирают, исходя из выбора экспрессирующего хозяина и протеина и/или β-лактамового соединения, которое будет экспрессироваться. После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментационного бульона посредством центрифугирования или фильтрации. После остановки ферментации и/или после удаления клеток полипептид изобретения или полученное β-лактамовое соединение может быть извлечено с использованием обычных способов. Извлечение (восстановление) может включать стадии очистки, и/или экстракции, и/или кристаллизации.

Удобнее всего полипептид изобретения или β-лактамовое соединение комбинируют с подходящими (твердыми или жидкими) носителями или растворителями, включая буферы, для получения композиции полипептида или β-лактамового соединения. Полипептид или β-лактамовое соединение может быть прикреплено к или смешано с носителем, например иммобилизовано на твердом носителе. Таким обра

- 10 016155 зом, настоящее изобретение в следующем аспекте обеспечивает композицию, содержащую полипептид изобретения или β-лактамовое соединение. Она может иметь форму, подходящую для упаковки, транспортировки и/или хранения, предпочтительно, когда активность полипептида сохраняется. Композиции могут быть в форме пасты, жидкости, эмульсии, порошка, хлопьев, гранулята, шарика или другой экструдируемой форме.

Примеры

Основные материалы и методы.

Стандартные ДНК методы были выполнены, как описано в других работах (5атЬгоок, 1. с1 а1., 1989, Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1, 2'¹ Еб., Со1б 5рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1б 5рппд НагЬог, №\ν Уогк), если не указано особо. ДНК была амплифицирована с применением корректирующего фермента (ргооГгеабшд) Рйизюп полимеразы (Пппхутез). Использовали рестрикционные ферменты от компании 1пуйгодеп или №\ν Епд1апб Вю1аЬз. Грибковый рост осуществляли в минеральной среде, содержащей (г/л): глюкозу (5); лактозу (80); мочевину (4,5); (ΝΗ₄)₂8θ4 (1,1); Иа₂8О₄ (2,9); КН₂РО₄ (5,2); К₂НРО₄ (4,8) и 10 мл/л раствора микроэлементов А, содержащего лимонную кислоту (150); Ее5О₄-7Н₂О (15); М§8О4-7Н2О (150); Н3ВО3 (0,0075); Си8О4-5Н2О (0,24); Со5О4-7Н2О (0,375); 2п5О4-7Н2О (5); Мп5О₄-Н₂О (2,28); СаС1₂-2Н₂О (0,99); рН перед стерилизацией 6,5. В качестве обогащенной среды была использована УЕРИ, содержащая (г/л): дрожжевой экстракт (10); пептон (10); глюкозу (20). Культуры инкубируют при 25°С в орбитальном шейкере при 280 об/мин в течение 72-168 ч.

Трансформации РешсШшт сйгузодепцт были выполнены на штамме \У15соп5ш 54-1255 (АТСС 28089). Также являются подходящими другие штаммы Р. сйгузодепцт, включая мутанты штамма νίδсопзш 54-1255, имеющие улучшенный выход β-лактама. Примером такого штамма является СВ5 455.95. Кроме того, штаммы Р. сйгузодепцт с мутациями или делециями, приводящими к отсутствию или уменьшению производства β-лактама, также являются подходящими как организмы-хозяева трансформации, например штаммы в которых β-лактамовые генные кластеры ликвидированы, как описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045.

Трансформация Р. сйгузодепцт была выполнена, как описано в VО 2004/106347.

Пример 1. Культивирование РешсШшт сйгузодепцт и исследование неприродных трипептидов, таких как 0Е0-Нрд-Су8-Уа1 или ΌΕΌ Рд-Суз-Уа1.

РешсШшт сйгузодепцт культивировали в неорганической среде (25 мл) в течение 96 ч при 25°С. Необязательно, культуры были выращены с или без аминокислот, таких как Ь-Нрд (1 мМ окончательная концентрация) или Ь-Рд (1 мМ окончательная концентрация). В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, причем мицелий отмывали физиологическим раствором. И мицелий, и среду анализировали на трипептиды, такие как ПЬП-Нрд-Су8-Уа1 и ПЬП-Рд-Су8-Уа1, с помощью М5 методов, таких как БС-М5/М5. В качестве стандартов были использованы синтезированные по заказу трипептиды 0Е0-Нрд-Су8-Уа1 и 0Е0-Рд-Су8-Уа1. В результате ни в мицелии, ни в среде не были обнаружены трипептиды, такие как 0Е0-Нрд-Су8-Уа1 и 0Е0-Рд-Су8-Уа1. Как заключение, Р. сйгузодепцт не вырабатывает эти неприродные трипептиды.

Пример 2. Клонирование модуля нерибосомальной пептидной синтетазы и доменных кассет.

2а. Клонирование модульных фрагментов N№5, которые катализируют включение и последующую эпимеризацию Ь-Нрд в Ό-Нрд.

Хромосомная ДНК была выделена из 51гер1отусез соейсо1ог А3(2). Позже были выполнены ПЦР реакции с добавлением 3-8% ИМ5О к реакционным смесям, кроме того, и применением стандартных условий. Были использованы следующие олигонуклеотиды: НрдЕ^1 (сасса!ддсдасдс1дссддаас1дйс; 8ЕО Ш NО: 12) и НрдРеу1 (1саабаабаассас1сддас1саадд1сддас; 8ЕО Ш NО: 13). Полученный ПЦР фрагмент Нрд1, дающий АТЕ тридомен модуля СЭЛ I синтетазы из 5. соеНсоюг. клонировали в ρΕΝΤΚ/δΌ/ϋ-Торо вектор (1пуйгодеп, Нидерланды), дающий в результате плазмидный рНрд1.

2Ь. Специальный синтез синтетического модульного фрагмента ΝΚΤ5, который катализирует включение и последующую эпимеризацию Ь-Рд в Ό-Рд.

Синтетический фрагмент ДНК, состоящий из последовательности ДНК согласно 5ЕО Ш NО: 5 был синтезирован по заказу (ΌΝΛ 2.0, Меп1о Рагк, Калифорния, США). ДНК фрагмент содержал тридомен АТЕ. Фрагмент АТ происходил из С-концевого модуля протеина 5пЬИ пристинамицин синтетазы 5. рп8бпазрйаПз. Е-домен был взят из модуля 6 синтетазы СИЛ 5. соеНсоюг.

Фрагмент ДНК был клонирован в вектор рСК.-В1ип! (1пуйгодеп) с использованием протокола, предоставленного поставщиком, дающий вектор рРд1.

2с. Клонирование бимодульных фрагментов ΝΓΚ5, специфичных к включению цистеина и валина.

Для этих экспериментов гены АСУ (5(Е-а-аминоадипат)-Ь-цистеин, Ό-валин) трипептид синтетазы из РешсШшт сйгузодепит и №сагб1а 1ас1атбигапз были взяты как образцы. Были выполнены реакции ПЦР амплификации с использованием образцов ДНК каждого организма. Были использованы следующие олигонуклеотиды для Р. сйгузодепцт: олигопара РсМ2М3Г^1 (сассйаабаа!даддадаа1дсадсаасддас; 5ЕО Ш NО: 14) и РсМ2М3геу1 (1саа1адсдадсдадд1дйс; 5ЕО Ш NО: 15), дающая в результате фрагмент РсМ2М3_1 (доменная организация САТСАТЕТе), олигопара РсМ2М3Г^2 (сассас1ад!с1ддад1а1с1с1са1с1а1с;

- 11 016155

8ЕО ΙΌ N0: 16) и РсМ2М3геу1 (1саа1адсдадсдадд1дйс; 8Е0 ΙΌ N0: 15), дающая в результате фрагмент РсМ2М3_2 (доменная организация АТСАТЕТе). Фрагмент РсМ2М3_1 был клонирован в ρΕΝΤΡ/δΌ/ΩΤορο, дающий рРсМ2М3_1, и клонирование фрагмента РсМ2М3_2 в тот же самый вектор дало плазмиду рРсМ2М3_2. Аналогичным образом были выполнены ПЦР амплификации с хромосомной ДНК №сатб1а 1ас1атбигап5. Реакции с использованием олигонуклеотидов ΝΙΜ2Μ3ί^1 (сассйаабаа1дссдаададд1сассасс; 8Е0 ΙΌ N0: 17) и ΝΙΜ2Μ3κν1 (дд1са1сдс1ссс1адд; 8Е0 ΙΌ N0: 18) дали фрагмент ДНК ΝΙΜ2Μ3_1 (доменная организация САТСАТЕТе), тогда как реакции с олигами ΧΙΜ2Μ3Γ^2 (сассас)ад1с1са1с1сассд1сда1д; 8Е0 ΙΌ N0: 19) и №Μ2Μ3κν1 (дд1са1сдс1ссс1адд; 8Е0 ΙΌ N0: 18) давали в результате фрагмент №Μ2Μ3_2 (доменная организация АТСАТЕТе). Оба фрагмента были окончательно клонированы в рЕКТИ/ЗО/О-Торо векторы, давая плазмиды ρ№Μ2Μ3_1 и ρ№Μ2Μ3_2 соответственно.

26. Клонирование доменного фрагмента конденсации ИКР§, специфичного к образованию пептидной связи между Ω- и Ь-аминокислотой.

Были клонированы два различных домена конденсации с ^сСъ стереохимией. Первый домен был ПЦР-амплифицирован из ί'ΌΛΙ синтетазы с использованием хромосомной ДНК 8ΐ^еρΐοтусе8 сое11со1ог, с применением олигонуклеотидов 5с_С_Е» (сассбаайаа)адссадсаассдасссд1дсд; 8Е0 ΙΌ N0: 20) и §с_С-теу (Йас)ад1д1сдсдддсд1асдсс1сд1с; 8Е0 ΙΌ N0: 21), давая фрагмент кс_С. Второй фрагмент, который состоял из ХКР$ ^сСъ С домена из модуля ЙиС С2 итурин синтетазы В. киЫШк, согласно 8Е0 ΙΌ N0: 22, был специально синтезирован и назван Вк_С. Оба фрагмента были клонированы в вектор ρΕNΤΚ/8^/^-Τορο, давая в результате плазмиды ρ8ί.’ί.’ и |эВ8С? соответственно.

Пример 3. Создание генов трипептида нерибосомальной пептидной синтетазы объединением (слиянием) клонированного модуля ИКР§ и доменных кассет.

Плазмидный ρΗρ§1 был обработан рестрикционными ферментами Рас1 и Акс1, давая в результате фрагмент ДНК 5,9 кб, который содержит ген ^^-специфического ИКР§ модуля и большую часть векторной последовательности. Плазмиды ρРсΜ1Μ2_1 были порезаны Акс1 и Рас1, показывая фрагмент ДНК 8,5 кб. Лигирование этого фрагмента и фрагмента 5,9 кб из ρΗρ§1 дало вектор ρ8СРС Гибрид1. Плазмиды ρРсΜ1Μ2_2, ρ8С_С были ограничены 8ρе1 и Акс1, давая в результате фрагменты 7,0 кб и 1,4 кб соответственно. Оба фрагмента были лигированы и дали плазмиду ρРсΜ1 Μ2_3. Плазмиды ρРсΜ1Μ2_3 и плазмида ρΗρ§1 были порезаны Рсб и Рас1, давая фрагменты ДНК 12 и 4,5 кб соответственно. Лигирование двух фрагментов давало в результате окончательную конструкцию ρ8С_8С_С_РСΜ2М3 Гибрид1. Дальнейшая рестрикция (ограничение) ρ8С_8С_С_ρСм2Μ3 Гибрид1 и ]эВ8_С с помощью Рас1 и 8ρе1 привела к фрагментам 16 кб (ρ8С_8С_С_РСΜ2Μ3 Гибрид 1 без С домена модуля 2 АСУ синтетазы) и 1,4 кб (С домен ВасШик киЬШк) соответственно. Лигирование двух фрагментов дало плазмиду ρ8С_Β8_С_РСΜ2Μ3 Гибрид2.

Ограничение (рестрикция) ρΗρ§1 и ρNIΜ1Μ2_1 с помощью Рас1 и АГ111 дало ДНК фрагменты 3,7 и 8,8 кб. Лигирование обоих фрагментов дало плазмиду ρδΟΉΡ Гибрид1 Плазмиды ρ8С_8С_С_РСΜ2Μ3 Гибрид1 и ρ№Μ1Μ2_2 были ограничены 8ρе1 и АГ111, давая в результате 4 кб (АТЕС тетрадоменную организацию из Ηρ§ модуля и (О)С(Ь) домена) и 7 кб (АТСАТЕТе организацию) фрагменты соответственно. Лигирование обоих фрагментов дало плазмиду ρ8С_С_С_N^Μ2М3 Гибрид1. По аналогии плазмиды ρ8С_Β8_С_РСΜ2Μ3 Гибрид1 и ρ№Μ1Μ2_2 были ограничены 8ρе1 и АГ111, давая в результате 4 кб (АТЕС тетрадоменную организацию из Ηρ§ модуля и (О)С(Ъ) домена) и 7 кб (АТСАТЕТе организация) фрагменты соответственно. Лигирование давало плазмиду ρ8С_Β8_С_N^Μ2Μ3 Гибрид2.

Для конструкции гибридного гена фенилглицин специфической нерибосомальной пептидной синтетазы плазмиды ρΩ^Ι и ρ8С_8С_С_N^Μ2Μ3 Гибрид1 были ограничены каждый ферментами рестрикции АГ111 и Рас1. Фрагмент ДНК 3,4 кб (содержащий АТЕ ХИР8 тридомен) ρΗ^1 был лигирован в 14 кб векторные фрагменты, полученные рестрикцией ρ8С_8^_С_N^Μ2Μ3 Гибрид1, давая в результате плазмиду ρРд_8С_С_NIΜ2Μ3 Гибрид1. Аналогично, если вектор ρ8С_8С_С_N^Μ2Μ3 Гибрид1 был замещен вектором ρ8С_Β8_С_N^Μ2Μ3 Гибрид2, полученной плазмидой была ρРд_Β8_С_NIΜ2Μ3 Гибрид2.

Пример 4. Создание входного экспрессирующего целевого вектора (Са1е\тау® еxρ^е88^οη беШпайоп уесЮг) РешсШшт сйукодепит для гибрид-нерибосомальных пептидных синтетаз.

Плазмидная рРТ12, содержащая Nοΐ1-фланкированную промотор-терминаторную кассету из IРN синтетазы из РешсШшт сйтукодепит, была обработана №11 (описание вектора см. Тйебдаатб е1 а1. 2000, Вю1есйио1о§у апб Вюепщпееппд. 72, 380-387). Таким образом, полученная ^N8 промотортерминаторная кассета была клонирована в ρΒ1^^τίρΐ11 8К (81та1адепе, Нидерланды), который был также обработан №11. Лигирование привело к рПродукту1. Плазмидный рПродукт1 был ограничен ВатШ и Х1о1. Кроме того, был специально синтезирован фрагмент ДНК, который содержал кассету устойчивости к флеомицину под контролем промотора 8]эбА. Кассета имеет последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0: 23.

После рестрикции этого специально синтезированного фрагмента ДНК с помощью ВатШ и Х1юЕ полученная ДНК была лигирована в вектор рПродукт1 (который был открыт с помощью ВатШ, Χ1μΙ). Полученная плазмида была названа рПродукт2. В завершающей стадии клонирования фрагмент ДНК, содержащий абК1-са!-ссбВ-айК2 кассету (ген резистентности и токсичности к хлорамфениколу для Е.

- 12 016155 со11), был ПЦР-амплифицирован из входного целевого (Са1е\уау® БеЧтаРоп) вектора, такого как рЕТΌΕ8Τ42 (ΙηνίίΓΟβοη. Карлсбад, Калифорния, США). Были использованы следующие олигонуклеотиды: Γ\ν: йа!сдай1дса1аааааасадас (8Ε0 ΙΌ Νϋ: 24), гее: йа!сда1дсйассйсаадсйсд (8Ε0 ΙΌ Νϋ: 25). Полученный фрагмент ДНК был ограничен С1а1 и позже клонирован в рПродукт2, который также был предварительно открыт обработкой С1а1. Здесь были отобраны плазмиды, которые содержали фрагмент айК1-са!-ссйВайК2 в такой ориентации, что аЙК.1 соединялся затем с промотором ΙΡΝ8 Ρ_ΙΡΝ8. Полученный входной целевой (Са1е\уау® йекйпайоп) вектор был назван ρΌΕδΤ^βχρΓΕ

Пример 5. Создание экспрессирующих конструкций Ρ. сйгукодепит для нерибосомальных пептидных синтетаз.

Для создания экспрессирующих конструкций Ρ. сйгукодепит была выполнена Са1е\уау® БКС1опаке реакция с использованием стандартных условий, как описано Шуйгодеп. Подробные протоколы см. в руководствах от Са1е\уау® 1есНпо1оду на 1Шр://\у\у\у.шуЦгодеп.сот. Для реакции каждый из входных векторов рЗСЖ· Гибрид1, р8С_8С_С_ХБМ2М3 Гибрид1 и р8С_В8_С_№М2М3 Гибрид2 был проинкубирован с Са1е\уау® йекйпайоп вектором ρ^Ε8Τ-Ρсеxρ^1. Названия полученных экспрессирующих плазмид см. в табл. 1.

Альтернативно, для создания экспрессирующих конструкций Ρ. сйгукодепит, конструкции, содержащие сконструированные трипептидные ΝΡΡδ-гены, были функционально связаны с №11фланкированной промотор-терминаторной кассетой из рсЬС-гена от Ρеη^с^11^ит сйгукодепит (описание вектора см. Тйейдаагй е1 а1. 2000, Вю1есйио1оду аий Вюепдшеегшд, 72, 380-387) с помощью слияния-ПЦР (Гикюп-ПЦР). Названия полученных экспрессирующих плазмид см. в табл. 1.

Таблица 1

Входной вектор, использованный в ЬКреакции	Полученный экспрессирующий вектор
р8СЖГибрид1_____________________ р8С 8С С МАПМЗГибрид1	ΡΕΧΡΚ.-ΝΡ.Ρ84
ΡΕΧΡΚ-ΝΡΡ85
р8С В8 С ΝΕΧ42Μ3 Тибри д2	ΡΕΧΡΚ-ΝΚΡ86
рР§ 8С С М1М2МЗГибрид1	ΡΕΧΡΚ-ΝΚΡ87
рРд В8-С ММ2МЗГибрид2	ΡΕΧΡΚ-ΝΚΡ88

Пример 6. Трансформация ΡешсШ^ит сйгукодепит линеаризированной плазмидой ρΕΧΡΚ-ΝΚΡ84, культивирование и исследование трипептидов.

В независимых экспериментах Ρешс^Шит сйгукодепит был трансформирован ρΕΧΡΚ-ΝΚΡ84, который был линеаризирован перед трансформацией подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Ρδί1 или ИсН. Отбор трансформантов был сделан на чашках с неорганической агаровой средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозы.

Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта (ргоЮркМ гедепегайоп р1а1е§), были еще раз посеяны штрихом на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью метода молекулярных колоний ПЦР в геле (со1опу Ρί,Έ) на наличие генов ΝΡΡ8. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л буфера ТЕ (8атЬгоок е1 а1., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с 8ирег-Тац от компании НТ В|о1ес11по1оду Й1Й. ПЦР реакции анализировали на Б-де196 от компании Шуйгодеп.

Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. 8ΕΟ ΙΌ Νϋ: 26 и 8ΕΟ ΙΌ Νϋ: 27):

Трансформированная плазмида: ρΕΧΡΚ-ΝΚΡ84

Олигонуклеотиды для ПЦР колоний: Ριν: СССТООТОССТОАТОС

Кеу: ОаТОТООТССОАОАСО

Ожидаемый размер этих ПЦР реакций составлял 303 п.о.

Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в Основных материалах и методах. Дополнительно аминокислота Б-Нрд (4-гидроксифенилглицин) или БЩд (фенилглицин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ, в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как БЕП-Нрд-Су5-Уа1 (если Ь-Нрд был добавлен к среде) и ^^^-Ρд-Су8-Vа1 (если Б^д был добавлен к среде), с помощью М8 методов, таких как БС-М8/М8. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды БЕП-Нрд-Су5-Уа1 и ОБО^д-Сук-Уак В результате ни в мицелии, ни в среде трипептиды, такие как ПБП-Нрд-Су§-Уа1 и ОБО^д-Сук-Уа^ не были обнаружены. В качестве за

- 13 016155 ключения Ρ. сйгукодепцт не производит эти неприродные трипептиды, если были интегрированы N№8 конструкции полигенных экспрессирующих кластеров, такие как рЕХРР^РР84.

Пример 7. Трансформация РешсШшт сйгукодепцт линеаризированными плазмидами рЕХРР-20 N№85 и рЕXΡΚ-NΚΡ86, культивирование и получение трипептида ПЬП-Нрд-Сук-Уа1.

В независимых экспериментах РешсШшт сйгукодепцт был трансформирован или рЕХРР^РР85 или рЕXΡΚ-NΚΡ86, которые были линеаризированы до трансформации подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Ρκί1 или РсШ Трансформация Р. сйгукодепцт была выполнена при условиях, например, описанных в ν0 2004/106347. Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозой. Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта, были еще раз посеяны штрихом на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью ПЦР-колоний на наличие генов N№8. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л ТЕ буфера (8атЬгоок е1 а1., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с 8ирег-Тас.| от компании НТ Вю1ес11по1оду Ыб. ПЦР реакции анализировали на Е-де196 от компании 1пуйгодеп.

Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. 8ЕО 5 ГО N0: 26 и 8ЕО ГО N0: 27):

Трансформированная плазмида ρΕΧΡΚ-Ν№8 5 или ρΕΧΡΚ.-Ν№86

Олигонуклеотиды для ПЦР колоний ΙΆ СгССТОСТОССТОАТОС

Кеу: 6ОТСТСОТСОСА6АСО

Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в Основных материалах и методах. Дополнительно аминокислота Ь-Нрд (4-гидроксифенилглицин) или Ь-Рд (фенилглицин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как ОЕП-Нрд-Сук-Уа1 (если Ь-Нрд был добавлен к среде) и ПЕО-Рд-Сук-Уа1 (если Ь-Рд был добавлен к среде), с помощью М8 методов, таких как ЬС-М8/М8. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды ЭЕЭ-Нрд-Су8-Уа1 и ОЕЭ-Рд-Сук-Уак Мицелий и супернатант показали значительные уровни трипептида ПЬП-Нрд-Сук-Уак Отрицательный контроль, для которого был использован ^трансформированный штамм Р. сйгукодепцт V^κсопκ^п 54-1255 (АТСС 28089), не показал образование ЭЕЭ-Нрд-Су8-Уа1 трипептида. Этот результат дает доказательство того, что трансформированные сконструированные нерибосомальные пептидные синтетазы производят неприродный трипептид ЦЩ-Нрд-Су8-Уа1.

Пример 8. Трансформация РешсШшт сШукодепцт линеаризированной плазмидой рЕXΡΒ-NΚΡ87 и рЕХРР^РР88. культивирование и получение трипептида ЭЕЭ-Рд-Су8-Уа1.

В независимых экспериментах РешсШшт сйгукодепцт был трансформирован или рЕXΡΒ-NΚΡ87 или рЕXΡΒ-NΚΡ88, которые были линеаризированы до трансформации подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Ркб или Рсй. Трансформация Р сйгукодепцт была выполнена при условиях описанных, например, в ν0 2004/106347. Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта, были еще раз посеяны штрихом на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью ПЦР-колоний на наличие генов N№8. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л ТЕ буфера (8атЬгоок е1 а1., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с 8ирег-Тас.| от компании НТ Вю1ес11по1оду Ыб. ПЦР реакции анализировали на Е-де196 от компании Шуйгодеп.

Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. 8ЕО ГО N0: 26 и 8ЕО ГО N0: 27):

Трансформированная плазмида ρΕΧΡΚ.-Ν№8 7 или рЕХРК,Олигонуклеотиды для ПЦР колоний Ρνν: СгССТСгСтТСтССТСгАТСтС

Кеу: 66Т0Т0СТСС6А0АСС

Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в Основных материалах и методах. Дополнительно аминокислота Ь-Нрд (4-гидроксифенилглицин) или Ь-Рд (фенилгли

- 14 016155 цин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как ПЬП-Рд-Су8-Уа1 (если Ь-Рд был добавлен к среде), с помощью М8 методов, таких как БС-М8/М8. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды ПЬП-Нрд-Су8-Уа1 и ΌΕΌРд-Су8-Уа1. Мицелий и супернатант показали значительные уровни трипептида ПЬП-Рд-Су8-Уа1. Отрицательный контроль, для которого использовали ^трансформированный штамм Р. сйгуводепиш ХУьеоп81и 54-1255 (АТСС 28089), не показал образование трипептида ПЬП-Рд-Су8-Уа1. Этот результат дает доказательство того, что трансформированные сконструированные нерибосомальные пептидные синтетазы производят неприродный трипептид ПЬП-Рд-Су8-Уа1.

Пример 9. Получение амоксициллина ίη νίΐτο посредством превращения ЭГП-НрдСУ.

Три различные конструкции, содержащие рсЬС-гены РешсШшш сйгу8одеииш (рАДЪ-рсЬС), №сагб1а 1ас1ашбигаи8 (рАДЪ-рсЬС-ПЪ) и А8ретдШи8 шби1аи8 (ρΧΤΝ313), были инокулированы из глицеринового исходного раствора и росли в течение ночи при 37°С, в 2х ΤΥ и 35 мкг хлорамфеникола на мл. Соответствующие рсЬС-гены кодируют ΙΓΝ8, которые производятся как гибридные протеины с МВР (мальтозасвязывающий протеин), кодируемым та/Е-геном от Е8с11епс1иа сой. Гибридные гены та1Е-рсЬС находятся под контролем 1РТО-индуцируемого 1ас-промотора.

Плазмидная ДНК была выделена из ночных культур. Выделенную ДНК использовали для трансформации Е. сой ТОР10 Д^йтодеи). Одну выделенную колонию использовали для инокуляции 10 мл 2х ΤΥ с добавлением 35 мкг хлорамфеникола на мл. После О/Ν инкубации при 37°С и 280 об/мин измеряли ОЭ⁶⁰⁰. Штаммы разбавляли до 100 мл свежей средой до окончательного значения ОЭ⁶⁰⁰ 0,015. Был разрешен рост при 37°С и 280 грт до тех пор, пока значение ОЭ⁶⁰⁰ достигало значения между 0,4 и 0,6. 1РТО добавляли до окончательной концентрации 0,5 мМ. Инкубацию продолжали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи.

Клетки собирали центрифугированием и отмывали 0,9% №1С1 в очищенной воде ιηί11ίθ. Клеточные осадки ресуспендировали в 1,5 мл буфере для экстракции (50 мМ Трис НС1 рН 7,5; 0,5 мг лизозим/мл, 5 мМ ΌΤΤ). Для лизирования клеток осуществляли обработку ультразвуком. После центрифугирования в течение 10 мин при 14000 об/мин в цетрифуге ЕррепбогГ. отбирали аликвоты 200 мкл и замораживали в жидком азоте. Замороженные бесклеточные экстракты хранили при -80°С.

Исследования активности ΙΓΝ8 было выполнено с АСУ и НрдСУ в качестве субстратов. Кроме стандартных условий исследования для изучения ΙΓΝ8 активности были применены модификации смесей для того, чтобы предельно увеличить возможность успеха.

Реакционные смеси были следующие.

Реакционная смесь 1 (стандартное исследование).

30-50 мМ Трис НС1 рН 8.0 (предпочтительно 36 мМ)

1-6,7 мМ аскорбат (предпочтительно 3 мМ) от 50 мкМ до 2 мМ Ге8О₄ (предпочтительно 86 мкМ)

0,3-2 мМ трипептида (предпочтительно 1,5 мМ для АСУ и 0,75 мМ для НрдСУ)

0,75-4 мМ ΌΤΤ (предпочтительно 3 мМ)

Бис-АСУ был уменьшен до АСУ посредством смешивания двух аликвот 7,5 мМ бис-АСУ с одной аликвотой 60 мМ ΌΤΤ, с последующей инкубацией от 5 до 25 мин при комнатной температуре. Аналогично НрдСУ был уменьшен перед текущим исследованием.

Реакционная смесь 2 (альтернативное исследование).

30-50 мМ НЕРЕ8 рН 7,0 (предпочтительно 36 мМ)

0,1-0,2 мМ аскорбат (предпочтительно 0,1 мМ)

1-50 мкМ Ге8О₄ (предпочтительно 25 мкМ)

0,3-2 мМ трипептида (предпочтительно 1,5 мМ для АСУ и 1,5 мМ для НрдСУ)

0,2-1,2 мМ ТСЕР (Трис(2-карбоксиэтил)фосфин) (предпочтительно 1 мМ).

бис-АСУ и НрдСУ были предварительно обработаны ТСЕР для того, чтобы разорвать 8-8 связи в димерах. Для этого две аликвоты 7,5 мМ бис-АСУ или НрдСУ смешивали с одной аликвотой 20 мМ ТСЕР с последующей инкубацией от 5 до 25 мин при комнатной температуре.

мкл СГЕ, содержащих гибридные протеины МВР-1РН8, инкубировали с 595 мкл реакционных смесей, указанных выше. После 10 мин инкубации при 25°С реакцию останавливали добавлением 125 мкл реакции с 50 мкл ледяного метанола. После инкубации при -20°С в течение по меньшей мере 1 ч образцы анализировали с помощью БС/М8.

Исследование БС/М8 выполняли на приборе БСО (П1егто 8с1еи1Шс), используя следующие установочные параметры:

- 15 016155

Элюенты	Элюент А: 0,1 % РА в воде ΜϊΙΙίφ Элюент В: 0,1 % РА в воде Μίΐΐίφ
Градиент	Т (мин) поток (мл/мин) %А % В 0,0 0,2 98 2 5,0 0,2 98 2 20,0 0,2 78 22 20,1 0,2 98 2 30,0 0,2 98 2
Колонка	Уапап 1псттз11 3 ΟΌ8 3 СР 22568 150*2.1 мм 3 мкм
Температура колонки Поток	55°С 0,2 мл/мин
Вводимый объем	25 мкл
Температура поддона Время удерживания: ΙΡΝ	4°С Γΐηι.τί'ί πΜ'ϊΤί'τ* Ю О ντυτίτ Л\|лхх^илхх^ххх. дтххххх
Амоксициллин	приблизит. 4, 9 мин
Ампициллин	приблизит. 16,5 мин

М8

Прибор БС/МЗ	БСО(8М05) ОРР ах1з Е31/роз РгоЪе Ье1§Ы пг 6, <1ерЙ1 пт 3
БС/М8/М8	360 гаг =5.0 аа =30% 366 Εν =5.0 аа =30% 350 Εν =5.0 аа=ЗО%
БС/М8/М8/М8	349 Εν =5.0 аа=30%

т/ζ диапазон М3: 200-1000 микро сканирования 1 время впрыскивания 500 млсек

Образцы были разведены в 10 раз очищенной водой ιηίΙΙίΟ и 25 мкл было инжектировано в БС/М8 систему.

Субстраты (АСУ, НрдСУ, Ρβί'ν) и продукты (ΙΡΝ, амоксициллин, ампициллин) были идентифицированы, исходя из времени удерживания (БС), значения отношения (М8) массы к заряду (т/ζ), а также образца фрагментации во время фрагментации в М8^п-способе.

Результаты суммированы в таблице ниже.

Таблица 2

Превращение субстратов АСУ и НрдСУ в ΙΡΝ и амоксициллин соответственно гибридными протеинами ΜΒΡ-ΙΡΝ8 из различных источников

	АСУ-* ΙΡΝ	НркСУ-» амоксициллин
Исходный рсЬС-ген	Реакционная смесь I	Реакционная смесь 2	Реакционная смесь 1	Реакционная смесь 2
Р. скгузо^епит	16%	50%	0%	0,0006%
А ηί(1ιι1αη$	36%	98%	0%	0,0007%
Ν. 1ас1атс1игат	36%	99%	0%	0,0006%

Неожиданно при экспериментальных условиях реакционной смеси 2 ΜΒΡ-ΙΡΝ8 оказывается способным к превращению НрдСУ в амоксициллин, тогда как при условиях реакционной смеси 1 не наблюдается превращение в амоксициллин.

Пример 10. Проведение биопробы, позволяющей определить превращение ОББ-НрдСУ в амоксициллин.

Бактериальные штаммы ЕксйепсШа со11 Е88, ВасШик киЬППк АТСС6633 и М1сгососси8 1и1еи8

- 16 016155

АТСС9341 выращивали в течение ночи в 2х ΤΥ-среде при 30°С и 280 об/мин. После 16 ч роста измеряли ΘΌ⁶⁰⁰. Обычно ΘΌ⁶⁰⁰ составляет 5,0, в пределах от 2,0 до 8,0.

Раствор амоксициллина был сделан в концентрации 7 мг/мл. Потом были сделаны последовательные разведения в пределах от 1 мг/л до 0,001 мг/л. В качестве отрицательного контроля служила вода Μίΐΐίρ.

мкл серийных разведений были отмерены пипеткой в лунки 96-луночных микропланшетов. Каждый микропланшет был приготовлен дважды. Ночные бактериальные культуры разводили в свежей 2х ΤΥ-среде до окончательного значения ΘΌ⁶⁰⁰ 0,01. В каждую лунку было добавлено 150 мкл разведенных бактериальных культур. Микропланшеты закрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 25°С, а аналогичный микропланшет - при 37°С.

После 16 ч инкубации снимали показания ΘΌ⁶⁰⁰ на микропланшетном ридере. Из результатов можно было узнать концентрацию амоксициллина, все еще допускающую неингибированный рост тестируемых микроорганизмов.

Таблица 3

Концентрация амоксициллина, все еще допускающая неингибированный рост в 2х ΤΥ среде

Штамм	[Амоксициллин] (мг/л) при 25°С	[Амоксициллин] (мг/л) при 37°С
ЕаскепсЫа соИ Е88 (0810031)	0,1	0,1
ВасШиа зиЪННз АТСС6633	1,0	5
Мгсгососсиз 1и1еиз АТСС9341	0,001	0,002

Пример 11. Проведение биопробы, позволяющей определить превращение ОЕО-РдСУ в ампициллин.

Бактериальные штаммы ЕксйейсЫа со11 Е88, ВаеШик киЬННк АТСС6633 и М1сгососси8 1и1еик АТСС9341 выращивали в течение ночи в 2х ΤΥ-среде при 30°С и 280 об/мин. После 16 ч роста измеряли ΘΌ⁶⁰⁰. Обычно значение ΘΌ⁶⁰⁰ составляет 5,0, в пределах от 2,0 до 8,0.

Раствор ампициллина был сделан в концентрации 7 мг/мл. Потом были сделаны последовательные разведения в пределах от 1 до 0,001 мг/л. В качестве отрицательного контроля служила вода Μίΐΐίρ.

мкл серийных разведений были отмерены пипеткой в лунки 96-луночных микропланшетов. Каждый микропланшет был приготовлен дважды. Ночные бактериальные культуры разводили в свежей 2х ΤΥ-среде до окончательной ΘΌ⁶⁰⁰ 0,01. В каждую лунку было добавлено 150 мкл разведенных бактериальных культур. Микропланшеты закрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 25°С, а аналогичный микропланшет - при 37°С.

После 16 ч инкубации снимали показания ΘΌ на микропланшетном ридере. Из результатов можно было узнать концентрацию ампициллина, все еще допускающую неингибированный рост тестируемых микроорганизмов.

Таблица 4 Концентрация ампициллина, все еще допускающая неингибированный рост в 2х ΤΥ среде

Штамм	[Ампициллин] (мг/л) при 25 °С	[Ампициллин] (мг/л) при 37°С
ЕзскегкМа соИ Е88 (0810031)	0,05	0,05
ВасШиз зиЬЫНз АТСС6633	0,5	2,5
Мкгососсиз 1и1еиз АТСС9341	0,001	0,002

Пример 12. Скрининг рсЬС-генов из разных видов для превращения ИЕО-ИрдСУ в амоксициллин ίη νίίτο.

Кодирующие области рсЬС-генов из 11 видов были расположены на ДНК 2,0 (1430 О'Впеп Опте. 8ш1е Ε, Меп1о Рагк, СА 94025, США). Для этого последовательность ДНК кодирующей области была взята как основа. Были отобраны следующие виды: СерМокрогшт Астешошиш, РешсШшш сйгукодепит, АкрегдШик (ЕтейсеПа) шби1ап8, 81гер1отусе5 _)итоп)1пеп818, ИосагШа 1ас1атбигап8, 8йер1отусек т1сгоДат18, ЬукоЬаЛег 1ас1атдепи8, Е1атоЬас1егццп креаек, 81гер1ошусе5 с1атиНдеги8, 81гер1ошусе5 дпкеик, 81гер1отусе8 сай1еуа.

Последовательность стартового (инициирующего) кодона была изменена до ί-ΆΤΆΤΟ, сайт узнавания Ибе1 для того, чтобы облегчить дальнейшие стадии клонирования. Аналогично, №й-сайт ^ΤΟΟ-ΆΤ) был введен непосредственно после стоп-кодона (терминирующий кодон). Внутренние №11- и Ибе1-сайты были удалены настолько, насколько возможно.

Плазмиды, несущие рсЬС-гены, были вырезаны с №11 и Ибе1, и кодирующая область рсЬС-гена была выделена и субклонирована в вектор р8Н27, который был вырезан с теми же самыми ферментами. Таким образом, кодирующая область рсЬС-гена является клонированной в рамку с та1Е-геном, кодирующим мальтозосвязывающий протеин, под контролем индуцируемого промотора. При индукции экспрессии будет синтезироваться гибридный протеин, состоящий из мальтозосвязывающего протеина на Ν-конце гибридного протеина и ΙΡΝ8 на С-конце.

- 17 016155

Е.со11 ТОР10, трансформированную та1Е-рсЬС-плазмидами, выращивали в 2х ΤΥ-среде, содержащей 35 мкг хлорамфеникола/мл, в течение ночи при 37°С и 280 об/мин. На следующий день измеряли ОБ⁶⁰⁰ и клетки разводили свежей средой до окончательного значения ОБ⁶⁰⁰ 0,015. Затем клетки росли (37°С, 280 об/мин) до тех пор, пока значение ОБ⁶⁰⁰ достигало 0,4-0,6. 1РТО добавляли до окончательной концентрации 0,5 мМ. Рост продолжался в течение ночи при 22°С, 280 об/мин. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин и 4°С. Клетки отмывали 0,9% раствором №1С1 и осаждали вновь центрифугированием. Клеточные осадки замораживали при -20°С в течение по меньшей мере 16 ч.

Клеточные осадки ресуспендировали в 1,5 мл буфера для экстракции (50 мМ Трис-НС1 рН 7,5; 5 мМ БТТ), а экстрагирование проводили с помощью обработки ультразвуком. Экстракты центрифугировали для удаления обломков клеток в центрифуге для сосудов Эппендорфа (10 мин, 14000 об/мин, 4°С). Аликвоты супернатанта (бесклеточный экстракт, СЕЕ) помещали в свежие пробирки Эппендорфа и замораживали в жидком азоте и потом хранили при -80°С.

Превращение НрдСУ в амоксициллин оценивали следующим образом. Во-первых, субстрат НрдСУ восстанавливали смешиванием 500 мкл 200 мМ НрдСУ и 500 мкл 20 мМ ТСЕР с последующей инкубацией при 25°С в течение 10 мин. Во-вторых, приготавливали следующую смесь для анализа (для 10 реакций): 300 мкл 0,5 мМ Ее8О₄-7Н₂О; 480 мкл 1,25 мМ аскорбата; 4270 мкл 50 мМ НЕРЕ8 (рН 7,0). Исследование начинали смешиванием 90 мкл восстановленного субстрата, 505 мкл смеси для анализа и 5 мкл СЕЕ, содержащего гибридный протеин МВР-ШЫ8.

Реакционную смесь инкубировали при 25°С в течение 10 мин.

В микропланшете смешивали 25 мкл реакционной смеси с 150 мкл разбавленной в 2х ΤΥ (ОБ^60С1=0,01) ночной культуры Мюгососсик 1и1еик. Для того чтобы проверить, что любое возможное ингибирование роста было вызвано образованием амоксициллина, каждый образец также был проверен в присутствии β-лактамазы (Репаке® от ВВЬ Бйсо), которая расщепляет β-лактамовое кольцо и таким образом инактивирует антибиотическую активность.

Микропланшет накрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 30°С и 550 об/мин. ОБ⁶⁰⁰определяли с помощью ридера для микропланшет.

Неожиданно, гибридные протеины МВР-ШЫ8, происходящие из рсЬС-генов А. шби1апк, а также 8. с1ауибдегик, оба продемонстрировали ингибирование роста М. 1и!еик, который вполне рос в присутствии Репаке®, демонстрируя, что ингибирование происходило из-за образования амоксициллина из БЬБНрдСУ.

Это было подтверждено с помощью БС-М8/М8 исследования. Для этого реакцию останавливали добавлением 125 мкл реакционной смеси с 50 мкл метанола (-20°С). Образцы инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при -20°С. Выполняли стадию центрифугирования (14000 об/мин в течение 15 мин при 4°С) с последующим БС-М8/М8 исследованием (см. пример 9). Результаты подтвердили результаты биоанализа.

В качестве контроля был включен ЬЬБ-ЛСУ. Действительно, как ожидалось, почти все гибридные протеины МВР-ШЫ8 образовывали ШИ (изопенициллин Ν). Добавление Репаке® к реакционной смеси ликвидировало наблюдаемый эффект. Результаты вновь были подтверждены с помощью БС-М8/М8.

Пример 13. Конструирование рсЬС-генов.

Клоны рМ-Лп1РЖ (рсЬС-ген от А. шби1апк) и рЗБЗШРЖ (рсЬС-ген от 8. с1ауи11дегик) были подвергнуты ошибочно-направленной ПЦР (ЕР-ПЦР) с применением набора Б1уегкйу РСК от компании С1оШес11 в соответствии с рекомендациями поставщика. Кратко, количество ошибок, внесенных при ПЦР, может быть изменено применением различных условий ПЦР.

Амплифицированные рсЬС-вставки были субклонированы в экспрессирующий вектор рВАБМНта1ЕБЕ8Т с помощью рестрикционных ферментов Же1 и №11. Также в этой плазмиде 1РЖ будет вырабатываться как гибридный протеин МВР.

В результате каждого примененного условия были секвенированы (кедиепсеб) 10 клонов. Библиотеки, в которых была найдена частота мутаций приблизительно 1 мутация на 1 кб, были отобраны для проведения скрининга на улучшенные разновидности в отношении превращения НрдСУ в амоксициллин.

Отобранные А. №би1апк и 8. с1ауи11дегик рсЬС библиотеки были выращены, а вставка была субклонирована в экспрессирующий вектор рВАБМНта1ЕБЕ8Т с помощью рестрикционных ферментов Же1 и №11. Также в этой плазмиде ΙΓΝ8 будет вырабатываться как гибридный протеин МВР.

Была создана третья библиотека, в которой мутации были введены в специфические положения внутри рсЬС-гена от А. шби1апк (сайт-направленный подход). Эти положения были отобраны по двум критериям: а) создание пространства в активном центре и Ь) ослабление С-концевого связывания.

Создание пространства в активном центре может быть полезно для улучшения активности нативной ΙΓΝ8 на НрдСУ, так как Нрд-часть больше, чем α-аминоадипат-часть в АСУ.

С-конец молекулы ШЫ8 действует как квазисубстрат, когда фермент не нагружен субстратом. После приближения субстрата к активному центру С-конец удаляется, создавая пространство для субстрата. Для предотвращения этого соревнования между С-концом и субстратом в этом месте также были введе- 18 016155 ны изменения.

Для модификации были отобраны восемь положений аминокислот: Ι75, Υ91, 8183, У185, Ν287, Ь321, Ь324 и Т331.

Были разработаны праймеры, 33-меры, в которых три средних нуклеотида (кодирующие аминокислоту, которую следует модифицировать) были рандомизированы (ΝΝΝ), таким образом, создавая возможность для любой аминокислоты находиться в получающейся молекуле ΙΡΝ8 в указанных положениях.

Все восемь положений, таким образом, были модифицированы ПЦР слияния, давая в результате восемь подбиблиотек, каждая с мутацией в одном сайте. Была сделана одна дополнительная библиотека, в которой все мутации были скомбинированы случайным образом.

Также в этом случае вставки таким образом полученных библиотек были субклонированы в экспрессирующий вектор рВАОМНтаШОЕ^Т с использованием рестрикционных ферментов Ше1 и №11.

Три библиотеки были высеяны из исходного раствора глицерина на селективную агаровую среду, содержащую 50 мкг зеоцина на 1 мл. Из каждой ЕР-ПЦР библиотеки отбирали 2500 независимых клонов и использовали для инокуляции в 150 мкл 2х ΤΥ-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в 96 луночные планшеты. Из сайт-направленной библиотеки было отобрано 200 клонов из каждой подбиблиотеки для инокуляции в 150 мкл 2х ΤΥ-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в 96 луночные чашки.

После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин 5 мкл сливающихся культур было перенесено в 1 мл свежей 2х ΤΥ-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в микропланшеты с глубокими лунками. Культурам давали расти при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока значение ОИ⁶⁰⁰ достигало значения между 0,4 и 0,6 в среднем по микропланшету. Клетки индуцировали к производству гибридного протеина ΜΡΡ-ΙΡΝ8 добавлением 40 мкл 5% Ь-арабинозы на каждую отдельную лунку. Потом клетки росли в течение 24 ч при 22°С и 220 об/мин. Клетки собирали центрифугированием. Супернатант выливали, а клеточные осадки замораживали в течение ночи при -20°С.

В каждую лунку, содержащую клеточный осадок, было добавлено 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозима; 0,1 мг/мл ΩΝΛ^1: 5М ΌΤΤ; 5 мМ Мд§О₄) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин.

Микропланшеты откручивали (теге крип) и 50 мкл супернатанта переносили в свежий микропланшет. 50 мкл смеси для анализа (50 мМ №ΡΕ8 рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Νη-аскорбата; 25 мкМ Ресульфата; 5 мМ НрдСУ) добавляли к супернатанту с последующей инкубацией в течение 30 мин при 25°С. Добавляли 125 мкл разбавленной культуры М. Ьи!еи5 в 2х ΤΥ (окончательное значение ОЬ⁶⁰⁰ составляет 0,01). Планшет инкубировали в течение ночи при 30°С. Показания ОЬ⁶⁰⁰ снимали с помощью микропланшетного ридера.

Из сайт-направленной библиотеки А. шби1апк были отобраны 18 клонов, 16 происходили из У185 подбиблиотеки и 2 - из рекомбинированной подбиблиотеки. Все эти клоны продемонстрировали полное ингибирование роста М. 1и!еик, указывая, что было образовано соединение, ингибирующее рост индикаторного штамма. Это ингибирование было повторно проверено согласно вышеупомянутому протоколу и опять было положительным. Более того ингибирование отсутствовало после добавления Ρеηа5е®, показывая, что ингибиторное соединение является β-лактамом.

Положительные клоны выращивали в 10 мл 2х ΤΥ с 50 мкг зеоцина на 1 мл. рВАО-АпрсЬС был включен в исследование в качестве контрольного источника ΙΡΝ8. После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин определяли ОЬ⁶⁰⁰. 100 мл 2х ΤΥ среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, было инокулировано до первоначального значения ОЬ⁶⁰⁰ 0,015. Клетки росли при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока ОЭ⁶⁰⁰ не достигало значения от 0,4 до 0,6. Выработку гибридного протеина ΜΡΡ-ΙΡΝ8 индуцировали добавлением Ь-арабинозы до окончательной концентрации 0,2%. Рост поддерживали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи. Клетки собирали, отмывали и замораживали при -20°С в течение ночи. Клеточные лизаты получали добавлением 1,5 мл лизирующего буфера (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозима; 0,1 мг/мл ПИА5е1; 5 мМ ΌΤΤ; 5 мМ Мд§О₄) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали и супернатант (СРЕ) переносили пипеткой в свежую пробирку.

Было проведено два биоанализа:

1) жидкий биоанализ: 8 мкл СРЕ смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Иа-аскорбата; 25 мкМ Ре-сульфата; 5 мМ НрдСУ). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С добавляли 25 мкл разбавленной культуры М. 1и!еик в 2х ΤΥ (окончательное значение ОЬ⁶⁰⁰ составляет 0,01). В качестве контрольных субстратов использовали АСУ (можно было использовать и ЬЬО- и ΌΡΌ-Ρ^ΟΎ. хотя предпочтительным субстратом является ΌΡΌ-Ρ^ΟΎ). Кроме того, для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Ρеηа5е®. После роста в течение ночи при 30°С снимали показания ОЬ⁶⁰⁰;

2) биоанализ на агаровых чашках: 8 мкл СРЕ смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Ыа-аскорбата; 25 мкМ Ре-сульфата; 5 мМ НрдСУ). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С 50 мкл смеси для анализа наносили пятнами (кройеб) в агаровую

- 19 016155 чашку, покрывая ее целиком. Для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Гепаке®. Агар, состоящий из 2х ΤΥ-агара, дополняли М. 1и1еик до окончательного значения ΟΌ⁶⁰⁰ 0,01. После инкубирования в течение ночи при 30°С было подсчитано наличие или отсутствие чистых областей вследствие действия β-лактамов.

Табл. 5 демонстрирует активность некоторых мутантов. Каждый мутант представляет большую группу мутантов, имеющих сравнимую активность ΙΡΝ8 на НрдСУ как субстрат. Активность ферментов ΙΡΝ8 дикого типа из А. шби1апк и 8. сРппКдегик была в этом скрининге ниже предела обнаружения.

Таблица 5

Обзор биоанализов на активность ΙΡΝ8 отобранных клонов и контролей

Клон	Субстрат	Жидкая биопроба	Биопроба на агаре
Как таковой	С Пеназой®	Как таковой	С Пеназой®
35А12	НрдСУ	+	-	+	-
35Б1	НрдСУ	+		+	-

36А4	НрдСУ	+	4-
36Ρ3	НрдСУ	4-	4
36С4	НрдСУ	+	+
УЛ Α. ηίά.	НрдСУ	-	-
XVI8. с1а.	НрдСУ	-	-
35А12	АСУ	+	+
36Ρ3	АСУ	4-
XVI Α. ηίά.	АСУ	4-	+
35А12	РёСУ	+	+
36Ρ3	Г'дСУ	+	+
Χνΐ Α. ηϊά.	РдСУ	-	-

Все положительные клоны в скрининге подвергались секвенированию, а типичные клоны подвергались ЬС/М8 исследованиям. Было выполнено ЬС/М8 исследование, давая возможность идентификации образованных продуктов, исходя из времени удерживания, массы соединения и паттерна фрагментации продукта. Количество амоксициллина, который вырабатывается, определяли стандартным способом добавления и выражали в Аи/мг протеина, где Аи представляет количество амоксициллина (в нг), образованное за 10 мин при указанных условиях реакции.

Табл. 6 суммирует клоны, заряженные аминокислотные остатки и активность клонов на НрсСУ (в Аи амоксициллин/мг протеина в Е.со11 СЕЕ).

Таблица 6

Мутации и активность действующих ΙΡΝ8 мутантов на НрсСУ

Мутант	Активность (АП/мг протеина)	Положение в ΙΡΝ8 Α. ΝιάιιΙαπα
111	135	185	190	211	293	331
36А4	1120			У185К
35ΑΙ2	90			У185К
35Р1	130			У185К			У293А
36Ρ3	50	Т111А	Н135К.	У185К
35Н12	30			У185К	Р190Н
36С4	η.ά.			У185Н				Т331С
νΛ	η.ώ

п.б. = не определено

Пример 14. Превращение ΟΕΟ-Ρβί,’ν в ампициллин.

Была определена активность мутантных раЬС-клонов 36А4 (У185К), 35А12 (У185К), 35Е1 (У185К, У293А), 36Е3 (Т111А, Н135Я, У185Я), 35Н12 (У185К, Р190Н), 36С4 (У185Н, Т331С) и рсЬС-гена дикого типа от А. п1би1апк на ^^^-ΡдСУ в качестве субстрата. Для этого клоны культивировали в 10 мл 2х ΤΥ с 50 мкг зеоцина на 1 мл. После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин определяли ΟΌ⁶⁰⁰. 100 мл 2х ΤΥ среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, было инокулировано до первоначального значения ΟΌ⁶⁰⁰0,015. Клетки росли при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока ΟΌ⁶⁰⁰ достигало значения от 0,4 до 0,6. Выработку гибридного белка МΒΡ-IΡN8 индуцировали добавлением Ь-арабинозы до окончательной концентрации 0,2%. Рост поддерживали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи. Клетки собирали, отмывали и замораживали при -20°С в течение ночи. Клеточные лизаты получали добавлением 1,5 мл лизирующего буфера (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозим; 0,1 мг/мл ΩΝΛ^1; 5 мМ ΌΤΤ; 5 мМ Мд8О₄) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракты центрифугировали и супернатант (СЕЕ) разливали пипеткой в свежие пробирки.

мкл СЕЕ смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Νιаскорбата; 25 мкМ Ее-сульфата; 5 мМ НрдСУ). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С 100 мкл

- 20 016155 разбавленной культуры М. 1и1еиб в 2х ΤΥ (окончательное значение ΟΌ⁶⁰⁰ составляет 0,01) было добавлено к 50 мкл реакционной смеси. В качестве контрольного субстрата использовали АСУ. Кроме того, для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Репаке®. После роста в течение ночи при 30°С снимали показания ΟΌ⁶⁰⁰. Все образцы, даже ΙΡΝ8 гибридный протеин дикого типа А. шйи1ап5 ΜΒΡ, неожиданно приводил к ингибированию роста М, 1и1еиб.

Было выполнено ЬС/Μδ исследование этих образцов, предоставляя возможность идентификации образованных продуктов, исходя из времени удерживания, массы соединения и паттерна фрагментации продукта. Количество ампициллина, который был произведен, определяли стандартным способом добавления.

В табл. 7 суммирована активность на Ρ^ΓΎ.

Таблица 7 Активность мутантных гибридных протеинов и гибридных протеинов дикого типа ΜΒΡ-ΙΡΝ8 на Ρ^ΕΎ (в нг продукта на 1 мг общего протеина за 10 мин) как определено с помощью ЬС-М8 исследования

Мутант	Активность (Аи/мг протеина)	Положение в Л. ΝύΕιΙαης ΙΡΝ8
111	135	185	190	211	293	331
36А4	900			У185К
35А12	150			У185К
35Р1	150			У185К			Υ293Α
36Ρ3	30	ТША	Н135К	νΐ85Κ.
35Н12	50			νΐ85Κ	Ρ190Η
36С4	1			νΐ85Η				Т331С
\ν.ί..	1

Пример 15. Создание штамма Ρеη^с^11^ит, продуцирующего Ό-Нрд или Ь-Нрд.

15а. Создание экспрессирующих плазмид Ρеη^с^11^ит.

Гены гидроксиманделат синтазы от Атусо1а1орб15 ог1еп1а118 и 81гер1отусе5 сое11со1ог (Ьта8) и гены, кодирующие гидроксифенилглицин аминотрансферазу (йрдАТ от Ρ5еиάοтοпа5 риШа и НрдТ от 81герЮтусек соеБсо1ог соответственно), были клонированы в плазмиду р^СЬТА с помощью ПЦР амплификации этих генов из различных соответствующих рВАЭ плазмид, описанных в XVΟ 02/34921. Ген тй1В, кодирующий манделатдегидрогеназу от Ρ5еиάοтοηа5 риШа, был амплифицирован из рСЕМ-В1йт. Было выбрано включение в ΝώΝ и №11 сайтах р^СЬТА, приводящее к АТС слиянию соответствующего гена с промотором Ρеη^с^11^ит. Все гены были амплифицированы с помощью ПЦР, и праймеры амплификации были созданы введением сайта рестрикции ΝώΝ в выше расположенный праймер и сайта рестрикции №11 в ниже расположенный праймер. Так как гены йрдАТ из Ρ5еиάοтοηа5 риййа содержат внутренний №й-сайт, был выполнен альтернативный подход, в котором вставка была амплифицирована с использованием праймеров, которые вводили Ыйе1 и ВбаГсайты. ПЦР фрагмент с дополнительными Ыйе1/В5а1 сайтами был субклонирован как фрагмент тупых концов в клонирующий вектор ПЦР-Ыиηΐ-ТΟΡΟ (Ιηνί1годеп), приводящий к конструкции ПЦР-Ы-йрдАТ^. После установления последовательности, показавшей, что она содержала правильную вставку, включая фланкирующие ΝώΝ/Β5;·ι1 сайты, эта плазмида была использована для создания р^рйрдАТдАА клонированием фрагмента Ше1/Вба1, содержащего ген йрдАТ^ в МеГ^ри^ сайт р^СЬТА.

В рТСЬТА гены, введенные в этот вектор, находятся под контролем рсЬС-промотора Ρеη^с^11^ит сйгукодепит. Кроме того, терминатор транскрипции репЭЕ-гена, кодирующего ацилтрансферазу, использовали в этих конструкциях.

Следующие полигенные экспрессирующие кластеры были сконструированы

Вектор экспрессии	Геи	Кодируемый протеин	Промотор	Терминатор
ρΙΑοΕιηαδ^ΧνΑ	Ао-ктаЕ	р-гидроксиманделат синтетаза	рсЬС	репЕЕ
р18соЬша8“\УЛ	Зсо-ктаЕ	р-гидроксиманделат синтетаза	рсЬС	репЕЕ
ρΙΡρηκΙΙΒζΧΧΆ	Рр-пиИВ	Ъ-манделат дегидрогеназа	рсЬС	репЕЕ
ρΙΡρίρςΑΤβΧνΑ	Ρρ-ΉρχΑΤ	Ь-ргидро ксифенилглицин аминотрасфераза	рсЬС	репЕЕ
р18со!1рдТ«\УА	Зсо-ΗρξΤ	Б-ргидроксифенилглицин аминотрасфераза	рсЬС	репЕЕ

Были использованы следующие праймеры в клонирующей амплификации генов, упомянутых выше:

- 21 016155

А: г&т-л Атусо1а/ор51я ΟΓίβη/αΙΐίί

Конструкция ρ14οΚηα$%ΙΙ'Ά

ЬтаЗ-Ао-Ийе: б'-САОСтАООААТТАСАТАТОСАОААТТТС.бАСт (8ЕО ГО N0: 28)

ЬшаЗ-Ао-Ца: 5^,-СООССАСССАТССАТАССТСАТСОСССА6С (8Е0 ГО N0: 29)

В: гены Зрер/отусез соеИсо/ог

Конструкция р13соктаЗ§ТРА

Ыпа8-8с-Ц<1е: З'-САОСАС.САЛТТАСЛТАТСЮСС.СССЛОТСтАС (8Ер ΙΟΝΟ: 30) кта8-8с-№1: 5'-ОААТТСССАТАТОСАТССАСОТСАТСОСгСС (5Е0 ГО ΝΟ: 31) Конструкция р18сокр£Ту4УА

ИрдТ-Зс-Ше: 5'-САСОАСОААТТАСАТАТОАССАССАССАСС (8ЕЦ ГО N0: 32)

ЬрдТ-8с-№1: 5'-ТСССАТАТОСАТССТСААССОТТАОАСОСС (ЗЕС) ГО ΝΟ: 33)

С: ссшл РзеиАотопс^ ριιίίάα

Конструкция р1РртсИВ^^А

ЬрдТ-Зс-Мбе: 5'-ОТОАСОТААСАТАТОАОССАОААТСТСТТТ (8Еф ГО N0: 34) 11р§Т-8с-№1: 5'-ОТААТСААТ(ЗСАТСАСТСАТОСОТОТОТТС (8Еф ГО N0: 35) Конструкция р1Рркр§АТцУРА

ЬрдАТ-Ыйе 5’-САСОАООААТТАСАТАТаТСТАТТТАТАОС (8ЕЦ ΙΗΝ0: 36) йр_ёАТ-Вза1 З'-ОТССТССбТСТСАТОСАТ СТССАОТТАОСССАОСАООТ (ЗЕЦ

ГО N0:37)

15Ь. Трансформация Ρеηс^11^ит скгукодепит.

Плазмиды р1Αо11та8д\VΑ. р18со11та8д\VΑ. р1ΡртάIΒд\VΑ. рФрйрдЛТдХУЛ и р18со11рдТд\УЛ были разрезаны с помощью №11, который удаляет полигенный экспрессирующий кластер из вектора.

Ρеи^с^11^ит сйгукодеиит Ό812975, штамм, промышленно производящий пенициллин из Ό8Μ, был трансформирован 4 мкг ДНК (т.е. №11-обработанной) и 0,25 мкг выбранного маркерного фрагмента. В этом случае был использован фрагмент, который придает устойчивость к флеомицину.

Следующие комбинации полигенных экспрессирующих кластеров были трансформированы

Трансформация	Ген 1	Ген 2	ГенЗ
1	8с-1тта8	Рр-тсПВ	Рр-йрдАТ
2	Ао-йтаЗ	Рр-тсИВ	Рр-йрцАТ
3	8с-Ьта8	Рр-пиИВ	Зс-йрдТ
4	Ао-йтаЗ	Рр-тсИВ	Зс-йрдТ

Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 1 г на 1 л 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появившиеся на чашках для регенерации протоплатса, были вновь посеяны штрихом на свежие агаровые планшеты с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции.

Трансформанты были посеяны штрихом на ту же самую среду, и интеграция полигенных экспрессирующих кластеров была подтверждена с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров для отдельных генов.

Трансформанты, содержащие три намеченных гена, были посеяны на агаровые пробирки с наклоном и спорулировали на рисе.

Следующие штаммы были выбраны для дальнейшего исследования:

Штамм	Гены, интегрированные в геном
АРР108	Ао-йтаЗ, Рр-тсИВ, Рр-йрдАТ
АГЕ 133	Ао-йтаЗ, Рр-пк11В, Рр-йрдАТ
АРР146	8с-йта8, Рр-тсПВ, Рр-йрдАТ
АРР152	8с-йта8, Рр-тсИВ, Рр-йрдАТ
АРР158	Ао-йтаЗ, Рр-тсИВ, Зс-йрдАТ
АРР162	Ао-йтаЗ, Рр-тсИВ, Зс-ЬрсАТ
АРЕ164	Ао-йтаЗ, Рр-тсИВ, 8с-йр§АТ
АРЕ191	8с-йта8, Рр-тсИВ, Зс-йрдТ
АРР193	5с-йта8, Рр-т<ИВ, 8с-йрдТ
АРР195	Зс-йтаЗ, Рр-тсПВ, 8с-йр§Т

- 22 016155

15с. Ферментативное получение Ω-Нрд с помощью трансформантов РешсШшт.

Трансформанты РешсШшт с^^деит АЕЕ108, АЕЕ133, АЕЕ146 и АЕЕ152 культивировали на встряхиваемых колбах в течение 6 дней. Внутриклеточные и внеклеточные продукты определяли с помощью ΝΜΒ.

Таблица 8

Внутриклеточные концентрации Ό-Нрд, определенные с помощью ΝΜΒ Клетки выращивали в течение от 3 до 6 дней

Штамм	О-Нрд (мкг/г сухого веса)
День 3	Дни 4-6
0812975	0	0
ΑΕΡΙ 08	40	0
ΑΡΕΙ33	80	0
АРР146	40	0
АРР152	40	0

Клетки выращивали в течение 3, 4, 5 и 6 дней для того, чтобы найти оптимум для получения Ό-Нрд. Концентрация после 3 дней была достаточно высокой, чтобы определить пики в спектре ΝΜΒ и измерить содержание Ό-Нрд. Все отобранные трансформанты производили определимые количества Ό-Нрд, но самая высокая Ό-Нрд концентрация наблюдалась в АЕЕ133 (80 мкг/г Ό\ν). Результаты перечислены в табл. 8.

156. Ферментативное получение Ь-Нрд с помощью трансформантов РешсШшт.

Штаммы РешсШшт сй^у8οдеηит АЕЕ158, АЕЕ162, АЕЕ164, АЕЕ191, АЕЕ193 и АЕЕ195, содержащие биосинтетические гены Ь-Нрд, культивировали на встряхиваемых колбах в течение 3, 4, 5 и 6 дней. Внутриклеточные и внеклеточные продукты определяли с помощью ΝΜΒ. Опять внеклеточный продукт не определялся, а внутриклеточно были выявлены значительные уровни Ь-Нрд (см. табл. 9).

Внутриклеточные уровни Ь-Нрд можно было измерить во всех штаммах, и они перечислены в табл.

6. В отличие от Ό-Нрд уровня уровни Ь-Нрд увеличивались со временем и достигали оптимума через 5 или 6 дней роста. Самая высокая концентрация, которая была измерена в АЕЕ195 мицелии, составляла 2,6 мг Ь-Нрд на 1 г сухого веса. Штаммы, производящие Ь-Нрд, давали внутриклеточную концентрацию приблизительно в 30 раз больше, чем АЕЕ133, самый лучший производитель Ό-Нрд.

Таблица 9 Внутриклеточные концентрации Ь-Нрд, определенные с помощью ΝΜΒ

Штамм	Ь-Нрй (мкг на г сухого веса)
День 3	День 4	День 5	День 6
Ώ812975	0	0	0	0
АРР158	360	340	180	380
АРР162	740	880	940	2200
АРР 164	1160	1020	960	1880
АРР191	620	860	860	2060
ΑΕΡΙ 93	600	680	1600	740
ΑΕΡΙ 95	740	680	1040	2640

В следующем эксперименте клетки культивировали в течение 5, 6 и 7 дней, однако, после 5 или 6 дней концентрация Ь-Нрд не увеличивалась далее, а начинала уменьшаться (данные не показаны).

Пример 16. Ферментативное получение амоксициллина с помощью Р. сНгуюдепит.

Штамм РепсШшт сй^у8οдепит, не имеющий кластеров биосинтеза пенициллина, как описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045, был трансформирован комбинациями из 1) плазмиды рЕХРВNΒΡ86 (см. табл. 1), содержащей НВР8-ген, кодирующий НрдС'УЗ (ОЬО-Нрд-Сук^а1 синтетаза), 2) плазмиды, содержащей ген, кодирующий ΦΝ8 мутант ν185Β, и 3) плазмиды, содержащей дкр-ген из ВасШик Ьгеу18, кодирующий РраШ-трансферазу (РРТ), под контролем дрбА-промотора.

Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 мкг флеомицина на 1 мл и 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появившиеся после регенерации протопласта, были вновь посеяны штрихом на свежие агаровые чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции.

Около 100 колоний из каждой трансформации было выращено на неорганической среде Кроме того, аминокислота Ь-Нрд была добавлена в концентрации, меняющейся от 1 до 10 мМ. Культивирование выполняли на встряхиваемых колбах или в 24-луночных титрационных микропланшетах. Инкубацию проводили при 25°С в течение одной недели при 200 об/мин.

В разные моменты времени (от 4 до 7 дней) были взяты образцы. Для того чтобы удалить мицелий бульон центрифугировали. Полный образец бульона был отобран и лиофилизирован. И лиофилизированный образец, и супернатант были проанализированы на присутствие амоксициллина.

В случае супернатанта 10 и 50 мкл супернатанта было добавлено к 190 и 150 мкл, соответственно, к разбавленной культуре М. 1и1еи8, как описано в примере 2. В качестве контроля к образцу была добавле

- 23 016155 на Ρеηа8е®, которая разрушает амоксициллин. Некоторые трансформанты показали ингибирование роста М. 1и1еи8, показывая действие амоксициллина, произведенного трансформантом. Добавление Ρеηа8е® предотвращало ингибирование роста М. 1и1еи8.

Лиофилизированные образцы бульона обрабатывали 100-500 мкл горячей воды ιηί11ίρ (90°С; объем в зависимости от количества биомассы) для получения лизата. 10 и 50 мкл лизата смешивали с 150 и 190 мкл разбавленной культуры М. 1и1еи8 соответственно, как описано выше. Также был добавлен контроль с Ρеηа8е®. Также в этом случае некоторые образцы не ингибировали рост М. 1и1еик. Положительные экстракты соответствовали образцам супернатанта. С помощью БС/М8/М8 была установлена идентичность β-лактама, который был образован, с амоксициллином, как описано в примере 9.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий контактирование трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (НрдСУ) или трипептида фенилглицил-цистеинил-валин (Ρ§θν) с ΙΡΝ8 для того, чтобы осуществить образование Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, в котором в качестве исходных соединений либо используют коммерчески доступные трипептиды НрдСУ и Ρ§θν, либо трипептиды НрдСУ и Ρ§θν получают путем контактирования аминокислот гидроксифенилглицина (Нрд) или фенилглицина (Ρ§), цистеина (С) и валина (V) с ΝΒΡ8.
2. Способ по п.1, в котором ΙΡΝ8 имеет степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 и при выравнивании с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 содержит аргинин, лизин или гистидин в положении 185 и необязательно модификацию по меньшей мере в одном из положений 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, используя нумерацию положений последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
3. Способ по п.1 или 2, в котором трипептид ^βΟν или трипептид Ρβίν получают посредством контактирования аминокислот гидроксифенилглицина (Нрд) или фенилглицина (Ρ§), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (ΝΒΡ8) для того, чтобы осуществить образование трипептида НрдСУ или трипептида Ρ^ΟΫ, ΝΒΡ8, содержащей первый модуль М1, специфичный к Нрд или Ρ§, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль М3, специфичный к V.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором гидроксифенилглицил-цистеинил-валин является ΌΕΌ-ρгидроксифенилглицил-цистеинил-валином, а Ν-α-аминофенилацетил β-лактамовый антибиотик является амоксициллином.
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором фенилглицил-цистеинил-валин является ΌΕΌ-ρфенилглицил-цистеинил-валином, а Ν-α-аминофенилацетил β-лактамовый антибиотик является ампициллином.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором ΙΡΝ8 осуществляет образование пенамового βлактамового антибиотика, и пенамовый β-лактамовый антибиотик превращается затем в цефемовый βлактамовый антибиотик.
7. Способ по п.6, в котором цефемовый β-лактамовый антибиотик является цефадроксилом или цефалексином.
8. Способ по любому из пп.1-7, который осуществляется ш у1уо.
9. Фермент ΙΡΝ8, который имеет степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 и которая при выравнивании с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ: 1 содержит аргинин, лизин или гистидин в положении 185 и необязательно модификацию, по меньшей мере, в положениях 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, используя нумерацию положений последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
10. Нерибосомальная пептидная синтетаза (ΝΒΡ8), которая катализирует образование трипептида НрдСУ или трипептида ΡдСV, ΝΒΡ8, содержащая первый модуль М1, специфичный к Нрд или Ρ§, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль М3, специфичный к V, где модуль М1 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, модуль М2 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8 и модуль М3 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ: 10.
11. Пептидная синтетаза по п.10, в которой первый модуль М1, специфичный к Нрд, получен из СЭЛ синтетазы, хлороереномицин синтетазы и/или комплестатин синтетазы.
12. Пептидная синтетаза по п.10, в которой первый модуль М1, специфичный к Ρ§, получен из пристинамицин синтетазы.
13. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-12, в которой модуль М2 содержит домен ^сСь, который соединен с доменом А, получаемым из второго модуля ΑСV8, в котором домен ^сСь является гетерологичным домену А.

- 24 016155
14. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой 'А. домен модуля М2 получен из фермента, который является источником первого модуля М1.
15. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой ^сС_ъ домен модуля М2 является доменом С седьмого модуля СБА синтетазы.
16. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой 'Ό. домен модуля М2 является С доменом второго модуля итурин синтетазы.
17. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-16, в которой А и Т домены модуля М2 и полный М3 модуль получены из АСУ8, предпочтительно бактериальной или грибковой АСУ8.
18. Полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую ΙΡΝδ по п.9.
19. Полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую пептидную синтетазу по любому из пп.10-17.
20. Клетка для получения Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил βлактамового антибиотика, трансформированная полинуклеотидом по п.18 и/или 19.
21. Клетка по п.20, дополнительно трансформированная генами пути биосинтеза аминокислот Нрд или Ρд.
22. Клетка по п.20 или 21, содержащая биосинтетический путь к β-лактамовым антибиотикам, предпочтительно в котором гены, кодирующие АСУ8 и/или ΙΡΝδ, инактивированы.
23. Способ получения Ν-α-аминогидроксифенилацетил или Ν-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий культивирование клеток по любому из пп.20-22, в условиях, подходящих для получения β-лактамового антибиотика.
24. Способ по п.23, в котором β-лактамовый антибиотик является амоксициллином, ампициллином, цефадроксилом или цефалексином.