BRPI0719295B1

BRPI0719295B1 - Method for determining the ability of a plant to accumulate sugar and to alter the ability of a plant to accumulate sugar

Info

Publication number: BRPI0719295B1
Application number: BRPI0719295-9A
Authority: BR
Inventors: Mendes Souza Glaucia; Stal Papini-Terzi Flávia; Jaquiel Waclawovsky Alessandro; Zorzetto Nicollielo Vêncio Ricardo; Oliveira Marques Josélia; de Maria Félix Juliana; Menossi Teixeira Marcelo; Buckeridge Marcos; Pereira De Souza Amanda; César Ulian Eugênio; Riso Rocha Flávia
Original assignee: Universidade De Sâo Paulo - Usp
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2017-09-26
Also published as: WO2008064443A2; WO2008064443A3; US20120079621A1; US20100162442A1; US20070292874A1; US7732664B2; BRPI0719295A2; US9090702B2

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção: "Método para determinação da capacidade de uma planta de acumular açúcar e para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar" CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método para discriminação de plantas com diferentes capacidades de acumular açúcares, bem como métodos para produzir plantas com teor aumentado de sacarose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A colheita tropical de cana-de-açúcar é de grande interesse econômico, contribuindo com cerca de dois terços da produção de açúcar bruto no mundo (Pessoa Jr. e colaboradores, 2005) . Em alguns países, parte da safra é destinada ã produção de etanol, uma fonte de energia alternativa importante e um combustível menos poluente. Em virtude de sua capacidade única de armazenamento de sacarose nos caules, a cana-de-açúcar é um modelo interessante para estudos sobre a síntese, transporte e acúmulo de açúcar. A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 capaz de acumular sacarose em seus caules em níveis excedendo a 50% de seu peso seco. Internódulos no caule amadurecem progressivamente em direção à base do colmo e há um aumento correspondente na concentração de sacarose. Os componentes e reguladores do metabolismo de sacarose provavelmente exercem papéis chave na determinação do rendimento de sacarose na cana-de-açúcar (Moore, 2005; Lunn e Furbank, 1999) . A cana-de-açúcar é uma gramínea poliplóide complexa com variedades comerciais derivadas de cultura convencional. Recentes dados de rendimento indicam que essa tecnologia pode estar atingindo um limite nos aumentos da produtividade de cana-de-açúcar. Podería ser grandemente vantajoso ter genes associados a traços desejáveis objetivados ao aprimoramento dirigido de variedades. Métodos de cultura convencionais têm sido extensivamente explorados em diferentes países ao longo das últimas décadas para desenvolver variedades com rendimento aumentado de sacarose e resistentes às pestes e doenças. 0 aprimoramento convencional de variedades, contudo, está limitado pela reserva limitada de marcadores adequados. Nesse sentido, a genética molecular é encarada como uma ferramenta promissora para auxiliar no processo de identificação de marcador molecular. Conhecimento dos genes que participam na regulação do teor de sacarose pode auxiliar no desenvolvimento de novas variedades com produtividade aumentada. Esse aprimoramento não é apenas economicamente relevante, mas também tem um forte apelo ambiental, considerando que ele pode diminuir a necessidade de expandir as áreas de cultivo e que o etanol é uma fonte de energia renovável. Além disso, uma compreensão mais ampla dos mecanismos de produção de acúmulo de açúcar altamente especializados em cana-de-açúcar pode levar a novas percepções sobre o metabolismo de açúcar em outras espécies.

[003] A cana-de-açúcar é o nome comum dado à várias espécies do gênero Saccharum, nativa da Ásia, mas cultivada durante séculos em todos os cinco continentes. Ela é uma fotosintetizadora muito eficiente, tornando-se uma das culturas de gramíneas mais importantes do mundo. A cana-de-açúcar é perene e robusta, com caules fibrosos unidos de 2-6 m de comprimento, capaz de armazenar grandes quantidades de sacarose. Seu cultivo requer um clima tropical ou subtropical quente e úmido. Brasil, índia e China são os maiores produtores. Os principais cultivares comerciais são híbridos complexos selecionados de cruzamentos entre S. officinarum, S. harberi, S. robustum, S. spontaneum e S. edule, bem como gêneros relacionados que cruzam com Saccharum, tais como Erianthus, Miscanthus, Narenga e Sclerostachya.

[004] Os genótipos S. spontaneum, encontrados do Afeganistão às Ilhas do Sul do Pacífico, têm a distribuição geográfica mais ampla no gênero Saccharum. Junto com S. officinarum, ela é a espécie mais usada em programas de cultura objetivando aprimorar o vigor, teor de fibra, capacidade de rebrota, resistência a estresse ambiental e doença (Perez e colaboradores, 1997). A origem da S. spontaneum ainda não é clara. Acredita-se que ela poderia ter se originado de uma introgressão de Miscanthus, Erianthus e Sclerostachya (Roach e Daniels, 1987). Genótipos de S. officinarum se originaram na Nova Guiné a partir de S. robustum através de seleção natural e/ou humana. Eles produzem caules compactos e são capazes de acumular altos níveis de sacarose. Eles não florescem abundantemente e usualmente são usadas como a parte feminina em programas de cultura (Perez e colaboradores, 1997).

[005] O sequenciamento de 238 mil ESTs (Tags de Seqüência Expressa) de cana-de-açúcar pelo consórcio Brasileiro SUCEST (Vettore e colaboradores, 2003) foi um marco para o campo de biotecnologia de cana-de-açúcar e também para o estudo de genética básica e fisiologia de gramineas. As ESTs foram agrupadas e um total de 43 mil SAS (Sequências Montadas de Cana-de-açúcar) foi identificado e classificado (Vettore e colaboradores, 2003). Caracterização funcional dos transcritos pode ser vista no website www.sucestfun.org.

[006] Esse trabalho descreve o uso de micro arranjos de cDNA para identificar genes diferencialmente expressos em duas populações de cana-de-açúcar contrastantes quanto ao teor de açúcar. Os métodos usados para identificar expressão diferencial, a construção de microarranjos de cDNA, condições de hibridização e análise de dados foram descritos anteriormente (Papini-Terzi e colaboradores, 2005) . Um total de 5154 genes foi feito para a caracterização de perfil de expressão.

[007] As plantas analisadas na presente invenção são derivadas de múltiplos cruzamentos entre os genótipos S. officinarum e S. spontaneum e de variedades comerciais que foram selecionadas com relação ao teor de açúcar durante 12-15 anos. Uma estratégia útil para a identificação de alvo-gene foi denominada "genômica genética". Primeiro introduzido por Jansen e Nap (2001), o método objetiva aplicar análise em alta escala de expressão de gene a uma população secretória. O uso de microarranjos de cDNA para avaliar uma população de cana-de-açúcar que secreta um determinado traço pode proporcionar mais percepção sobre a sinalização e função de gene da planta do que estudos de mutagênese clássicos (Meyers e colaboradores, 2004). Embora S. officinarum e S. spontaneum apresentem uma grande variabilidade genética na natureza, muitos poucos representantes participam da geração dos híbridos comerciais modernos. Com certeza, existem genes que conferem traços favoráveis a serem identificados dentre os mesmos que podem ser explorados em programas de cultura. Da mesma forma, a comparação de proles de diferentes variedades comerciais cuidadosamente selecionadas para enriquecimento de sacarose é uma estratégia que pode apontar genes que foram selecionados durante anos através de métodos de cultura tradicionais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece métodos para a produção de plantas transgênicas e plantas que não ocorrem naturalmente com níveis aumentados de açúcar. A invenção ainda fornece métodos para determinação da capacidade de uma planta de acumular açúcar, bem como métodos para alterar a capacidade das plantas de acumular açúcar. Em modalidades preferidas, as plantas são do gênero Saccharum. Em modalidades particularmente preferidas, as plantas são cana-de-açúcar.

[009] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para determinação da capacidade de uma planta de acumular açúcar através de fornecimento de uma amostra de planta e medição do nível de expressão, na amostra, de pelo menos um polinucleotideo tendo identidade de sequência a ou compreendendo SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência. Condições de alta estringência se referem à hibridização ao DNA ligado ao filtro em 5 X SCC, dodecil sulfato de sódio a 2% (SOS) , 100 pg/ml de DNA fita simples a 55-65 °C e lavagem em 0,1 X SSC e SDS a 0,1% a 60-65 °C. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter 65% de identidade de sequência, 75% de identidade de sequência, 85% de identidade de sequência, 95% de identidade de sequência, 99% de identidade de sequência ou ser idêntico. Em outras modalidades, o polinucleotídeo é um fragmento de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento de SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência.

[010] Os níveis de expressão de polinucleotídeo são, de preferência, detectados através de medição dos níveis de RNA, os quais podem ser detectados através de qualquer método conhecido por um técnico versado no assunto, de preferência PCR ou hibridização a oligonucleotídeos. As amostras são, de preferência, tomadas da folha, internódulo, broto lateral, raiz ou inflorescência.

[011] Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para determinação da capacidade de uma planta de acumular açúcar através de fornecimento de uma amostra de planta e medição do nível de expressão, na amostra, de pelo menos um polipeptídio codificado por polinucleotídeos tendo identidade de sequência a ou compreendendo SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter 65% de identidade de sequência, 75% de identidade de sequência, 85% de identidade de sequência, 95% de identidade de sequência, 99% de identidade de sequência ou ser idêntico.

[012] Ainda em outras modalidades, a invenção fornece métodos para determinação da capacidade de uma planta de acumular açúcar através de fornecimento de uma amostra de planta e medição do nível de expressão, na amostra, de pelo menos um polipeptídio tendo similaridade ou compreendendo um polipeptídio codificado por SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ 15 ID NOs. 229 a 373. A similaridade, por exemplo, pode ser de 65%, 75%, 85%, 95%, 99% ou 100%.

[013] Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar através de fornecimento de uma amostra de planta, modulação do nível de expressão de pelo menos uma de SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 e detecção do nível de expressão de pelo menos uma de SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373. A modulação pode ser obtida através de mutagênese, de preferência através de mutagênese química ou física.

[014] Já em outra modalidade, a invenção fornece métodos para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar através de fornecimento de uma amostra de planta, expressão ou interferência com a expressão de pelo menos um polinucleotídeo tendo identidade de sequência a ou compreendendo SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373, seus fragmentos, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência e detecção do nível de expressão de pelo menos uma de SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373. Por exemplo, o polinucleotideo pode ter 65% de identidade de sequência, 75% de identidade de sequência, 85% de identidade de sequência, 95% de identidade de sequência, 99% de identidade de sequência ou ser idêntico à sequência ou um fragmento da sequência. A invenção também fornece métodos para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar através de expressão ou interferência com a expressão de polipeptídeos tendo similaridade a ou compreendendo polipeptídeos codificados por SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 e detecção do nível de expressão de pelo menos um dos polipeptídeos codificados por SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373. A similaridade, por exemplo, pode ser de 65%, 75%, 85%, 95%, 99% ou 100%. Tipicamente, os níveis de expressão de polinucleotídeos e dos polipeptídeos codificados sofrem interferência ou são diminuídos usando métodos de RNA antisenso ou interferência de RNA.

[015] Em outras modalidades, a invenção fornece plantas transgênicas produzidas através de qualquer método tendo expressão alterada de pelo menos um polinucleotideo tendo identidade de sequência a ou compreendendo SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373, seus fragmentos, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência ou tendo expressão alterada de polipeptídeos tendo identidade de sequência a ou compreendendo um polipeptídeo codificado por SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID 15 NOs. 22 9 a 373. Ainda em outras modalidades, a invenção fornece plantas transgênicas produzidas através dos métodos descritos acima, usando genes que expressam ou interferem com a expressão de pelo menos um polinucleotideo tendo identidade a ou compreendendo SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID 20 NOs. 229 a 373, seus fragmentos, seus complementos e sequências as quais se hibridizam à SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 sob condições de alta estringência ou expressão de polipeptídeos tendo similaridade a ou compreendendo polipeptídeos codificados por SEQ ID NOs. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373. Sementes, seções de caule (ou "setts") de tais plantas também são proporcionadas.

[016] Em ainda outra modalidade, a invenção proporciona plantas que não ocorrem naturalmente com níveis de expressão alterados geradas através dos métodos descritos acima, tal como mutagênese. Sementes, caroços de cana (ou seções) de tais plantas também são fornecidos. A presente invenção identifica genes diferencialmente expressos em proles e variedades de cana-de-açúcar com diferentes teores de açúcar. Medições comparativas do mRNA para os genes em isolamento ou combinados são indicativas do teor de sacarose. Métodos que medem os níveis de transcrito para os genes podem ser usados para determinar os níveis de expressão de gene e podem incluir microarranjos de cDNA, arranjos de oligonucleotídeo, PCR quantitativa, hibridização. Northern Da mesma blot ou forma, outras técnicas de métodos que medem as proteínas codificadas pelos genes também podem ser usados para caracterizar plantas e proles originárias de programas de cultura tradicionais ou plantas transgênicas com o objetivo de identificar ou selecionar candidatos que contêm um alto teor de sacarose. Adicionalmente, os genes podem ser diretamente usados para aumentar o teor de sacarose da planta se eles são introduzidos na planta através da geração de uma planta transgênica.

[017] A tecnologia de microarranjo de cDNA, PCR quantitativa e Northern blots foram usadas para identificar marcadores moleculares associados ao teor de sacarose. Os procedimentos usados foram conforme descrito em PapiniTerzi e colaboradores, 2005 e Nogueira e colaboradores, 2003. Os microarranjos de cDNA contêm 5154 ESTs relacionadas à transdução de sinal, respostas ao estresse, transcrição, sinalização hormonal, metabolismo e outras categorias funcionais de cana-de-açúcar. As plantas analisadas derivam (1) de uma prole F3 de múltiplos cruzamentos entre os genótipos S. officinarum e S. spontaneum, (2) uma prole F1 de um cruzamento entre as variedades comerciais SPS0-180 e SPSO-4966, (3) uma prole F1 de um cruzamento entre as variedades comerciais SPSO-144 e SP85-7215, (4) duas variedades precoces e ricas na produção de sacarose, SP91-1049 e SP94-3166 e (5) duas variedades tardias e pobres na produção de sacarose, SP83- 2847 e SP89-1115. Tecidos que produzem sacarose, também conhecidos como tecidos fonte (aqui folha) e tecidos que acumulam sacarose, também conhecidos como tecidos de armazenamento (aqui internódulos) foram coletados de plantas crescidas no campo. Medições do teor de açúcar solúvel (Brix) foram feitas. As amostras foram coletadas de 13 indivíduos e reservas de 7 ou 8 plantas. Em alguns casos, as amostras foram coletadas durante todo o ano. Três modelos foram usados para realizar comparações de transcriptoma para a identificação de genes diferencialmente expressos quando (I) plantas com Alto Teor de Açúcar e Baixo Teor de Açúcar foram diretamente comparadas, (II) plantas com Alto Teor de Açúcar e Baixo Teor de Açúcar foram comparadas com uma referência comum ou (III) internódulos com Alto Teor de Açúcar e Baixo Teor de Açúcar foram comparados. Os modelos Experimentais I e II proporcionaram 208 diferencialmente expressos, enquanto que o modelo III revelou 140 genes diferencialmente expressos, totalizando 348 genes diferencialmente expressos em pelo menos uma das amostras analisadas. Vários genes diferencialmente expressos foram validados através de PCR em tempo real e Northern blots usando plantas individuais como a fonte para tecidos ou grupos de plantas, o que prova que a expressão diferencial é robusta o bastante para distinguir entre plantas com alto e baixo teor de sacarose em uma reserva de plantas.

[018] Os perfis gênicos sobre uma pluralidade dos 203 genes obtidos das comparações do modelo 1 podem ser úteis como marcadores moleculares para cultura tradicional, auxiliar na seleção de proles e parentais ideais gerados em cultura tradicional ou auxiliar na seleção de eventos transgênicos gerados no processo de produção de plantas transgênicas. Os 348 genes em si, identificados nas comparações I, II e III, podem ser usados na geração de plantas transgênicas, uma vez que eles podem funcionar diretamente em síntese e/ou acúmulo de sacarose, sofrer mutação através de métodos clássicos (não transgênicos) que levam a variedades com teor aprimorado de sacarose ou ser usados como sondas na busca de polimorfismos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] FIGURA 1: Poli-cruzamentos realizados entre cultivares de S. officinarum e S. spontaneum para obter populações híbridas de cana-de-açúcar com alto e baixo teor de açúcar. Os gráficos mostram a frequência de indivíduos da prole F3, correspondendo a cada uma das classes de Brix (Brix %) . O Brix foi medido a partir do suco de 500 indivíduos. Tecidos dos 16 indivíduos extremos foram coletados e agrupados para análise de microarranjo. Para quantificação por PCR em tempo real, o RNA foi extraído independentemente para cada tecido individual.

[020] FIGURA 2: Teor de açúcar ao longo da estação de crescimento nos indivíduos extremos de uma população secretória de cana-de-açúcar. Os valores de Brix (sólidos solúveis) do internódulo mais maduro de cada planta secretória de cana-de-açúcar foram medidos ao longo da estação de crescimento. Os valores médios de Brix e desvios padrões dos sete indivíduos com os maiores ou menores teores de cana-de-açúcar são mostrados para os tempos indicados.

[021] FIGURA 3: Validação dos dados de expressão do gene através de PCR em tempo real. Os níveis de mRNA foram determinados para as SAS indicado. Reações foram feitas em triplicatas. O gene de poliubiquitina A (PUB) foi usado como referência. As barras mostram os níveis de mRNA alvo com relação ao mRNA de poliubiquitina. As barras de erro foram calculadas conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001). Amostras de RNA de uma reserva de indivíduos foram usadas para gerar os moldes para reações de PCR em tempo real. Adicionalmente, três indivíduos com alto Brix (HB) , Ind243, Ind246 e Ind253 e três indivíduos com baixo Brix (LB), Ind261, Ind265 e Ind272, foram analisados no caso do cruzamento entre duas variedades comerciais (SP80- 180 e SP80-4966). A: amostras derivadas de um cruzamento entre 20 duas variedades comerciais (SPS0-180 e SPSO-4966), B: amostras derivadas de múltiplos cruzamentos entre os genótipos S. officinarum e S. spontaneum. Lv = folha; Inl = internódulo 1; In9 = internódulo 9.

[022] FIGURA 4: Níveis de expressão de genes diferencialmente expressos em indivíduos de cana-de-açúcar. Blots de RNA foram preparadas usando 10 pg de RNA total isolado de folhas maduras de três clones indivíduos de cada população secretória (HS alto e LS baixo teor de açúcar) . O ponto de tempo avaliado nas blots corresponde ao mesmo usado nos experimentos de microarranjo de cDNA (9 meses após plantio). As blots foram hibridizadas com as sondas radioativas gene-específicas indicadas. Um fragmento de rDNA foi usado como um controle.

[023] FIGURA 5: Perfis de expressão de genes diferencialmente expressos ao longo da estação de crescimento. Blots de RNA foram preparadas a partir de RNA total de folha de um grupo de 7 indivíduos com alto (HS) e baixo (LS) teores de açúcar coletados ao longo da estação de crescimento (6, 7, 9, 11 e 13 meses após plantio) . Os gráficos mostram os níveis de expressão observados para as plantas com alto (círculos pretos) e baixo (círculos brancos) teores de açúcar. Um fragmento de rDNA foi usado como um controle.

[024] FIGURA 6: Teor de açúcar ao longo da estação de crescimento em dois cultivares de cana-de-açúcar com acúmulo pobre e tardio de sacarose (SP83-2847 e SP94-3116) e dois cultivares de cana-de-açúcar com acúmulo rico e precoce de sacarose (SP91-1049 e SP89-1115). Os valores de Brix (sólidos solúveis) do internódulo mais maduro de cada planta secretória de cana-de-açúcar foram medidos durante a estação de crescimento. Os valores médios de Brix e os desvios padrões são mostrados para os tempos indicados.

[025] FIGURA 7: Alinhamento de sequências de nucleotideo para SEQ ID No. 411: CIPK-8 (SCEQLB2019B08 .g) ; SEQ ID No. 412: CIPK-29 (SCSGHR1070F12.g); e SEQ ID No. 413: CIPK-1 (SCCCCL5001D11.g) usando CLUSTALW (Thompson e colaboradores, 1994) . A linha acima das sequências indica o fragmento de sequência de 331 bp amplificado e clonado no plasmideo de forma a silenciar o gene CIPK-8 através de interferência de RNA nas plantas transgênicas.

[026] FIGURA 8: Análise de expressão dos niveis de mRNA de CIPK-8, CIPK-29 e CIPK-1 em plantas de controle (branco) e transgênicas (cinza) de plantas de dois meses de idade usando análise por PCR quantitativa. As barras mostram os niveis de mRNA de CIPK8 (SCEQLB2019B08.g), CIPK29 (SCSGHR1070F12.g) e CIPK-1 (SCCCCL5001D11. g) com relação aos niveis de mRNA do gene de referência (SCQGAM2027G09.g). Todas as reações foram realizadas em paralelo e cada reação foi realizada em triplicata. As barras de erro foram calculadas conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001). O gráfico também mostra os niveis de sacarose e a proporção de sacarose para monossacarideos nessas plantas.

[027] FIGURA 9: Análise de expressão dos niveis de mRNA de COMT em plantas de controle (preto) e transgênicas (cinza) de plantas de dois meses de idade usando análise por PCR quantitativa. As barras mostram os niveis de mRNA de COMT (SCRFLR1012F12. g) com relação aos niveis de mRNA do gene de referência (SCQGAM2027G09.g). Todas as reações foram realizadas em paralelo e cada reação foi realizada em triplicata. As barras de erro foram calculadas conforme descri to por Li vak e Schmi ttgen (2001). O gráfico também mostra os niveis de sacarose e a proporção de sacarose para monossacarideos nessas plantas.

DEFINIÇÕES

[028] O termo "plantas" inclui qualquer planta passível de técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas) , gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Ele também inclui plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo aneuplóide, poliplóide, diplóide, haplóide e hernizigótica. O termo "planta" inclui plantas inteiras, órgãos/estruturas vegetativas de broto (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais, semente (incluindo embrião, endosperma e envoltório da semente) e frutos (o ovário maduro), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido de crescimento e semelhantes) e células (por exemplo, células protetoras, óvulos, tricomas e semelhantes) e prole das mesmas. Exemplos de plantas alvo adequadas incluiríam, mas não estão limitados a, Acádia, alfafa, maçã, abricó, Arabidopsis, alcachofra, rúcula, aspargo, abacate, banana, cevada, feijões, beterraba, amora, arando, brócolis, broto-de-Bruxelas, repolho, canola, melão, cenoura, mamona, couve-flor, aipo, cereja, chicória, cassaya, coentro, cítricas, mandarinas, cravo-da-índia, abobrinha, coco, café, milho, algodão, pepino, Pseudotsuga, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, funcho, figo, alho, abóbora, uva, toranja, orvalho doce, jicama, kiwi, alface, alhoporó, melão, limão, lima, pinheiro Loblolly, linhaça, manga, cogumelo, nectarina, noz, aveia, palma, colza, quiabo, oliva, cebola, laranja, uma planta ornamental, palma, papaia, salsa, aipo, pêra, pêssego, amendoim, ervilha, pimenta, caqui, pinho, abacaxi, banana-pão, ameixa, romã, álamo, batata, moranga, marmelo, pinheiro radiata, rabanete, pastinaca, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarínica, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, liquidambar, tangerina, chá, tabaco, tomate, mandioca, turfa, nabo, uma uva, melancia, trigo, fibras. Plantas alvo particularmente preferidas incluiríam cana-de-açúcar e beterraba sacarínica. Mais preferivelmente, a planta é uma planta de safra usada para produzir sacarose ou que pode ser transformada em uma planta que produz sacarose. Ainda de preferência, a planta é cana-de-açúcar.

[029] O termo "plantas de cana-de-açúcar" pode ser/ ou ser derivado de: - qualquer genótipo do tipo selvagem de Saccharum (por exemplo, Saccharum officinarum, Saccharum spontaneum, Saccharum robustum); - qualquer gênero que cruza com Saccharum (por exemplo, Miscanthus, Erianthus, Narenga, Sclerestachya); qualquer espontaneamente; híbrido de cana-de-açúcar gerado espontaneamente; - qualquer híbrido de cana-de-açúcar gerado através de técnicas de cultura tradicionais; quaisquer proles de cana-de-açúcar geradas a partir de cruzamentos de variedades do tipo selvagem ou comerciais; - qualquer planta de cana-de-açúcar gerada através da introdução de um transgene (plantas transgênicas).

[030] O termo "promotor" se refere a regiões ou sequências localizadas a montante e/ou a jusante do início de transcrição e as quais estão envolvidas em reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta.

[031] O termo "seção de caule" (ou série) se refere a cortes ou pedaços de caule de cana-de-açúcar usados para propagar vegetativamente culturas de cana-de-açúcar.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] Muito pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que governam a síntese e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. Embora existam variedades capazes de acumular diferentes quantidades de sacarose, estudos criados para comparar esses cultivares a nível molecular são escassos. A identificação de genes que conferem traços favoráveis a híbridos comerciais é altamente desejável para a indústria de cana-de-açúcar, uma vez que eles poderíam ser usados como marcadores para seleção assistida.

[033] A presente invenção se refere amplamente à definição de um perfil de expressão gênica para SEQ ID NOs: 1-203 que facilita a identificação, isolamento e caracterização de plantas de cana-de-açúcar com alto e baixo teor de sacarose. A presente invenção também se refere à definição de um perfil de expressão gênica para SEQ ID NOs: 1-203 e SEQ ID NOs. 229-373 que estão associadas a um teor de sacarose indicando genes que podem ser úteis na geração de plantas enriquecidas em sacarose. Dados de expressão gênica podem ser determinados para plantas que podem ser uma prole derivada de cruzamentos (A), variedades comerciais ou cultivares (B) ou plantas transgênicas (C).

[034] Com a finalidade de selecionar plantas com alto Brix (teor de açúcar solúvel), uma série de cruzamentos envolvendo os genótipos Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum foi realizada entre 21 genótipos de Saccharum officinarum e 13 genótipos de Saccharum spontaneum (Tabela I) . Subsequentemente, as proles desses cruzamentos independentes foram avaliadas com relação a seu teor de açúcar e os indivíduos mais extremos intercruzados. Uma série de eventos de recombinação e seleção foram promovidos após o que, para selecionar duas populações com capacidades contrastantes de acúmulo de açúcar (Figura 1). Oito genótipos com alto teor de Brix (HB) e oito com baixo teor de Brix (LB) foram selecionados da prole F3. No contexto da presente invenção, mas não limitado a, a diferença de Brix oscila de 3 a 16. A Tabela II mostra os valores de Brix para os dezesseis indivíduos selecionados. Folha+1 e 20 internódulos 1, 5 e 9 foram coletados. Conforme usado aqui, folha+1 é a primeira folha com um tegumento visivel e internódulos são as partes da planta acima do solo, com exceção das folhas. Os tecidos foram agrupados para HB e LB independentemente e RNA total foi extraído.

[035] Em um experimento similar, uma prole F1 crescida no campo selecionada a partir de um cruzamento entre as variedades de cana-de-açúcar SP 80-180 e SP 80-4966 foi caracterizada. De um total de 500 indivíduos, nós selecionamos sete plantas com o maior (7HB) e sete com o menor (7LB) teor de açúcar. A Figura 2 mostra os valores médios e desvios padrões para o nível de sólidos solúveis (Brix) do internódulo mais maduro desses dois grupos de plantas ao longo da estação de crescimento (6, 7, 9, 11 e 13 meses após plantio).

[036] Adicionalmente, a prole F1 de um cruzamento entre as variedades de cana-de-açúcar SPB0-144 e SP85-7215 (selecionadas conforme descrito para o cruzamento entre as variedades SP 80-180 e SP 80-4966), duas variedades precoces e ricas na produção de sacarose (SP91-1049 e SP94- 3166) e duas variedades tardias e pobres na produção de sacarose (SP83-2847 e SP89-1115) foram também analisadas. A Figura 6 mostra o teor de açúcar durante a estação de crescimento nos dois cultivares de cana-de-açúcar com acúmulo de sacarose pobre e tardio (SP83-2847 e SP94-3116) e os dois cultivares de cana-de-açúcar com acúmulo rico e precoce de sacarose (SP91-1049 e SP89-1115) . Para todos esses, medições de Brix de plantas crescidas no campo foram tomadas, os tecidos da folha foram coletados e RNA total foi extraído. A Tabela III lista todas as proles e variedades usadas na presente invenção.

[037] Em paralelo, microarranj os de cDNA foram construídos com produtos de PCR derivados de 1857 polinucleotídeos que representam genes de cana-de-açúcar das bibliotecas de cDNA produzidas pelo Consórcio Sugarcane EST (SUCEST), fornecendo uma plataforma para comparações do perfil de expressão gênica. Aproximadamente metade de todos os genes de transdução de sinal identificados pelo projeto Sugarcane Signal Transduction (SUCAST) é representada nessas séries (Papini-Terzi e colaboradores, 2005), bem como genes relacionados ao metabolismo geral, estresse, respostas a patógeno e transcrição. As amostras de HB (alto brix) e LB (baixo brix) de cada prole ou tecido de variedade foram comparadas através de hibridização aos genes arranjados. Duas réplicas de hibridizações foram feitas para cada comparação com o esfregaço corado na segunda hibridização. Para revelar os marcadores moleculares de teor de brix, hibridizações foram feitas para comparar um tecido da planta com alto brix com o mesmo tecido em uma planta de baixo brix (Modelo I) . Também, duas variedades de alto brix e duas variedades de baixo brix (Modelo II) foram comparadas realizando hibridizações contra uma referência em comum composta de uma mistura equimolar de amostras de RNA de todos os quatro cultivares. Duas réplicas de hibridizações foram feitas para cada comparação com o esfregaço corado na segunda hibridização. Adicionalmente, internódulos maduros e intermediariamente maduros foram comparados com internódulos imaturos das plantas com alto brix e baixo brix (Modelo III) . Novamente, duas hibridizações repetidas foram feitas para cada comparação com o esfregaço corado na segunda hibridização. Análise de dados foi feita essencialmente conforme descrito por Papini-Terzi e colaboradores (2005). Resumidamente, limites de corte que definem "expressão diferencial" foram calculados baseado em hibridizações "auto-auto" (Vencio e Koide, 2005) . Para melhorar a confiabilidade dos dados, apenas genes com pelo menos 70% de consistência em experimentos repetidos foram considerados diferencialmente expressos. Um total de 208 SAS (SEQ ID NOs: 1-203) foi verificado diferencialmente expresso em pelo menos urna amostra quando tecidos de plantas HB e LB foram contrastadas. Quando internódulos maduros e imaturos foram comparados, um total de 140 genes diferencialmente expressos foi identificado (SEQ ID NOs: 229 a 373). As Tabelas IV e XIII listam todas as ESTs correspondendo a cada SAS (sequência montada de cana-de-açúcar) prevista como correspondendo ao mesmo transcrito conforme montado pelo programa CAP3 (Vettore e colaboradores, 2003) e a sequência montada prevista. Os valores de proporção para os sinais de microarranjo para cada SAS em cada amostra são apresentados nas Tabelas V a X e Tabelas XIV a XX. As Tabelas também mostram as categorias e funções de gene para cada sequência.

Tabela IV - Lista de Sequências Montadas de cana-de-açúcar (SAS) e suas SEQ ID Nos.

[038] Os números de acesso ao Genbank EST estão entre parênteses. A SEQ ID No. se refere aos identificadores na listagem de sequência. As ESTs listadas estão montadas na sequência indicada e deverão ser consideradas como um transcrito. Cada SAS é diferencialmente expressa entre plantas com baixo e alto teor de sacarose. SEQ ID No. 1: SCAGFL1089G08.g (CA199089, CA224271, CA224272); SEQ ID No. 2: SCCCLR2C01G07.g (CA185584, CA166776, CA134755, CA081538, CA166739, CA15S955, CA084974, CA157742, CA270171, CA159531, CA187781, CA159517, CA089886, CA084049, CA159619, CAI40397, CA087051, CA262468, CA159606, CA089976, CA183396, CA129456, CA066628, CA166690, CA140819, CA190385, CA187438, CA208612, CA190989, CA127354, CA140895, CA106597, CA158530, CA165616, CA157955, CA158357, CA163017, CA180366, CA156493, CA156721, CA110716, CA162841, CA088522); SEQ ID No. 3: SCCCRZ1001C01.g (CA186259, CA147312, CAIO7529, CA283111, CA275744, CA245497, CA240766, CA217267, CA129544, CA232142, CA186319, CA132949, CA266299, CA279493, CA239038, CA069036, CA279491, CA081552, CA17294S, CA270762, CA214162, CA155441, CA208908, CA077560, CA094623, CA080165, CA281654, CA068431, CA080252, CA253608, CA280034, CA146798, CAI49332, CA286419, CA149406, CA208282, CA168868, CA167581, CA247594, CA245731, CA264236, CA256980, CA196120, CA166139, CA256260, CA133068, CA216602, CA096037, CA133422, CA209478, CA172392, CA196703, CA148592, CA107794, CA078322, CA069441, CA262406, CA164639, CA117241, CA291436, CA272137, CA156857, CA275745, CA233167, CA073173, CA294936, CA096560, CA204575, CAI90808, CA294814, CA134607, CA095396, CA294999, CA233246, CA279310, CA272172, CA121188, CA165918, CA087433, CA152584, CAI63918, CA134688, CA260773, CA232223, CA134035, CA087517, CA078469, CA280895, CA147004, CA270846, CA285363, CA224721, CA300843, CA085545, CA193771, CA085617, CA152497, CA147851, CA234786, CA264280, CA190048, CA264249, CA259379, CA134846, CA284676, CA066363, CA148782, CA134929, CA094480, CA100929, CA128739, CA230006, CA25787, CA272842, CA153380, CA088481, CA199337, CA067318, CA120108, CA257959, CA068501, CA227954, CAI56682, CA173310, CA064714); SEQ ID No. 4: SCEQRT1033F01.g (CA184995, CA156175, CA130817, CA186778, CA296253, CA162940, CA133313, CA185329, CA117474, CA186710, CA204874); SEQ ED No. 5: SCEZLR1031G10.g (CA175202, CA165752, CA167131, CA234178, CA121597, CA067987, CA118138, CA257467, CAO98577); SEQ ID No. 6: SCEZRZ1015G02.g (CA237872, CA095197, CA148000, CA208159); SEQ ID No. 7 : SCJFRZ2014A03.g (CA068448, CA182636, CA124874, CA151939); SEQ ID No. 8: SCUTST30 90E03.g (CA187278, CA185355, CA180421, CA184313, CA210629); SEQ ID No. 9: SCVPCL6042B11.g (CA179030, CA079210, CA171761, CA167601, CA099889); SEQ ID No. 10: SCVPFL3046C06.b (CA244704, CA169357, CA226883, CA279223, CA226955, CA169444); SEQ ID No. 11: SCACCL6008H06.g (CA297327, CA096029, CA272424); SEQ ID No. 12: SCACLR1036B06.g (CA116282, CA208326, CAI85586, CA161943, CA208173, CA164611, CA250322, CA141763, CA248417, CA173006, CA271344, GA248060, CA295677, CA141850, CAI15167, CAI5Ο326, CA263624, CA155589, CA172473, CA210572, CA212977, CA071050, CA223263, CA183780, CA182338, CA123614, CA263704, CA258818, CA227706, CA185483, CA180358, CA227787, CAI83645, CA183050, CA185991, CA164775, CA187002, CA167583, CA187440, CA294229, CA247569, CA268117, CA081801, CA175295, CA294155, CA231298, CA198645, CA181860, CA091352, CA203545, CA234600, CA163160, CA258992, CA211128, CA186109, CA173482, CAI85124, CAI94883, CA262166, CA280273, CA169398, CA224642, CA170802, CA208174, CA195079, CA169482, CA170947, CA170731, CA279502, CA170881, CA181104, CA206750, CA294040, CA171028, CA152678, CA257305, CA293976, CA213043, CA181646, CA187605, CA182139, CAI43731, CA257402, CA193572, CA180425, CA297996, CA180830, CA283968, CA183965, CA213586, CA194480, CA086671, CA208319, CA075723, CA194663, CA293330, CA184108, CA075807, CA295739, CA168382, CA167495, CA212733, CA248494, CA187062, CA182290, CA181789, CA176860, CA201177, CA081385, CA122294, CA111436, CA181610, CA081463, CA081454, CA122407, CA172507, CA217801, CA112764, CA119200, CA205047, CA177228, CA168599, CA217883); SEQ ID No. 13: SCACLR1126E09.g (CA116458, CA129697, CA118229) ; SEQ ID No. 14: SCACLR2007G02.g (CA127563, CA091213, CA254488, CA091132, CA157102); SEQ ID No. 15: SCACLR2014E12.g (CAI 92165, CA154258, CAI86575, CA158514, CA127675, CA104491, CA154264, CA097458, CA258945, CA164635, CA143359, CA186649, CA245697, CA113109, CA231117, CA271862); SEQ ID No. 16: SCACSB1037A07.g (CA167445, CA204908) ; SEQ ID No. 17: SCAGAM2125C01.g (CA082271); SEQ ID No. 18: SCAGFL1089C03.g (CA232431, CA214773, CAI99044, CA226812, CA251426); SEQ ID No. 19: SCAGLB1070E01.g (CA111450, CA086189, CA214795, CA174551, BQ804015, CA174968, CA259932, CA072721, CA214876); SEQ ID No. 20: SCAGLR1043E04.g (CA139075, CA095747, CA163740, CA287933, CA254860, CA287205, CA276681, CA163825, CA158080, CA159744, CA166834, CA089831, CA146535, CA107721, CA159823, CA163282, CA101632, CA271953, CA112877, CA165306, CA116967, CA120230, CA165312, CA186064); SEQ ID No. 21: SCAGLR1043F02.g (CA290432, CA292969, CA279534, CA183060, CA183152, CA121646, CA096370, CA099981, CA192245, CA167424, CA214962, CA125300, CA267241, CA122577, CA246321, CA214857, CA261846, CA214921, CA120097, CA122234, CA158059, CA202210, CA273838, CA263626, CA205312, CA183023, CA263706, CA185079, CA116969, CA275126, CA184998); SEQ ID No. 22: SCAGLR2026G12.g (CA282277, CA117544, CA173493, CA097993, CA123854, CA277803, CA276657, CA163057, CA089417, CA123966, CA150636, CA152810, CA105994, CA124675, CA095504, CA260199, CA124712, CA288917, CA145237, CA165000, CAI67668, CA066913, CA161175, CA128073, CA128273, CA157707, CA084376, CA143727, CA143896, CA146035, CA159999, CA128260, CA123367, CA125688, CA111277, CA081486, CA239639, CA159912, CA224751, CA135227, CA277229, CA154488, CA114788, CA187359, CAI83121, CAI37987, CA125112); SEQ ID No. 23: SCAGSD2042G08. g (CA301419, CA301408, CA282279, CA282268); SEQ ID No. 24: SCBFFL4114B06.g (CA254510); SEQ ID No. 25: SCBFFL5074C09.g (CA20400, CA293285, CA203956, CA244892, CA290019, CA132334, CA244976, CA235410, CA292110, CA239336); SEQ ID No. 26: SCBFLR1039B05.g (CA072436, CA164922, CA219265, CA294041, CA087182, CA086094, CA133140, CA082356, CA178376, CA150762, CA091920, CA261338, CA155935, CA092012, CA084247, CA074480, CA163545, CA163534, CA264111, CA188825, CA079335, CA188476, CA087023, CA271843, CA164692, CA161125, CAI615 6 9>CA186875, CA218879, CA147374, CA086305, CA218962, CA247037, CA158661, CA089106, CA089861, CA154471, CA172672, CA155677, CA157667, CA240350, CA160822, CA085679, CA142367, CA067697, CA078551, CA165453, CA193896, CA240083, CA159199, CA117385, CA083799, CA184601, CA073646, CA087006, CA067781, CA228606, CA157128, CA165295, CA164303, CA090710, CA157426, CA218214, CA144877, CA082959, CA082212, CA092766, CA218299, CA082071, CA082361, CA166357, CA092479, CA155760, CA154412, CA157932, CA080915, CA089329, CA155569, CA084631, CA084421, CA163520, CA070855, CA267791, CA070926, CA083685, CA193867, CAI64257, CA262071, CA280355, CA253389, CA151412, CA099704, CA099702, CA091852, CA103683, CA218228, CA216440, CA076652, CA218313, CA081569, CA147549, CA092093, CA092327, CA082854, CAI60806, CA234098, CA081072, CA155277, CA081503, CA156306, CA228091, CAI65593, CA084277, CA164984, CA085999); SEQ ID No. 27: SCBFLR1060F03.g (CA117505, CA090821, CA184876, CA102138); SEQ ID No. 28: SCBFRZ2046D07.g (CA150681, CA109085, CA179474, CA203314, CA174283); SEQ ID No. 29: SCBFSB1046D04.g (CA 167835); SEQ ED No. 30: SCBFSB1047C02.g (CA170539, CA208192, CAI67900, CA178739); SEQ ID No. 31: SCBFST3136A06.g (CA181757, CA181841, CA204913); SEQ ID No. 32: SCBGLR1003D06.g (CA222877, CA125433, CA148517, CA123170, CA124367, CA229025, CA191858, CA150470, CA137422, CA242621, CA067144, CA107570, CA077924, CA219677, CA117862, CA137913, CA260601, CA189186, CA191192, CA103772, CA149267, CA111228, CA149344, CA283660, CA154152, CA153751, CA165134, CA177823, CA228650, CA287491, CA136728, CA162238, CA164661, CA139437, CA189271, CA282312, CA121420, CA289514, CA134330, CA259414, CA288712, CA148333, CA134387, CA221721, CA264749, CA201139, CA113386, CA078385, CA115600, CA241752, CA106360, CA118148, CA138627, CA190187, CA115438, CA154012, CA150848, CA071918, CA22 6319, CA281964, CA270512, CA146712, CAI65133, CA078380, CA241934, CA138140, CA115533, CA117783); SEQ ID No. 33: SCBGLR1023D05.g (CA193105, CA188272, CA224873, CA241264, CA300539, CA188009, CA241339, CA241331, CA133005, CAI50388, CA079307, CA185891, CA079026, CA088897, CA116440, CA073525, CA117725, CA286594); SEQ ID No. 34: SCBGLR1096E06.g (CA131852, CA136715, CA264334, CA198772, CA181655, CA118258); SEQ ID No. 35: SCBGLR1099G02.g (CA118527, CA088599); SEQ ID No. 36: SCBGLR1115D10.g (CA236898, CA118948, CA290199, CA222803, CA247964, CA241212, CA294776, CA213997, CA223503, CA223512, CA241290, CA077364, CA223593, CA223583, CA228839, CA237054, CA200849, CA200388, CA238984, CA077442, CA079128, CA271913); SEQ ID No. 37: SCCCAD1001C08.g (CA213052, CA064626, CA208782); SEQ ID No. 38: SCCCAD1004H02.g (CA064903, CA065602, CA19668 6, CA068322); SEQ ID No. 39: SCCCAM10 01AO 3.g (CA224922, CA097767, CA289761, CA293310, CA072765, CA177152, CA082771, CA228990, CA200984, CA071379, CA186832, CA174514, CA299571, CA285188, CA200732, CA074444, CA070971, CA266681, CA292024); SEQ ID No. 40: SCCCAM2004G02.g (CA175137); SEQ ID No. 41: SCCCAM2C04G08.g (CA188572, CA081398, CA083085, CA177802, CA081466); SEQ ID No. 42: SCCCCL3001F04.g (CA090274, CA218633, CA271564, CA072795, CA176380, CA212400, CA076605, CA292379, CA176809, CA261558, CA092442, CA082952, CA171891, CA132285, CA298117, CAI36926, CA205249, CA244356, CA084659, CA174001, CA220841, CA188161, CA262641, CA084625, CA147909, CA258069, CAI30594, CA268345, CA098011, CA297370, CA147196, CA232960, CA072355, CA139295, CA103872, CA161619, CA076646, CA192047, CA069119, CA269782, CA176915, CA202483, CA147582, CA142782, CA077648, CA092390, CA082458, CA266894, CA230599, CA129577, CAI92875, CA205406, CA195633, CA258918, CA239390, CA195611, CA091961, CA211152, CA238101, CA082565, CA261071, CA139562, CA238798, CA267286, CA126957, CA112818, CA258847, CA097943, CA262159, CA170717, CA070245, CA192180, CA167707, CA147514, CA176991, CA076215, CA266294, CA071776, CA190170, CA261881, CAO82649, CA167116, CA200225, CA166545, CA174720, CA180863, CAO98735, CA078299, CA080135, CA137514, CA084364, CA146987, CA130332, CAO78373, CA215588, CA179346, CA079412, CA147435, CAI87943, CA179432, CA179450, CA167646, CA117675, CA147627, CA279536, CA123234, CA251889, CA209472, CA094022, CA093214, CA235526, CA066029, CA291616, CA270178, CA088732, CA079067, CA210802, CA173849, CA208418, CA147384, CA249228, CA205005); SEQ ID No. 43: SCCCCL3002C09.b (CA164754, CA192507, CA149213, CA260796, CA187083, CA101050, CA232366, CA230776, CA285317, CA299708, CA232454, CA168679, CA122474, CA179836, CA117294, CA122512, CA123772, CA254900, CA183002, CA127885, CA168911, CA071983, CA236670, CA266142, CA109668, CA168996, CAO94485, CA273741, CA182273, CA300109, CA259484, CA109752, CA266217, CA095537, CA105282, CA190305, CA273812, CA095612, CA174112, CA102333, CA222873, CA241526, CA234235, CA169388, CA138129, CA247699, CA259138, CA169473, CA189915, CA232514, CA174741, CA221599, CA174821, CA195129, CA205165, CA136996, CA078205, CA189405, CA235587, CA098138, CA116327, CA114878, CAI91259, CA300967, CA191089, CA235666, CA183278, CA145262, CAI37898, CA156970, CA121379, CA095453, CA134465, CA138724, CA129675, CA134544, CA174648, CA123308, CA137470, CA228406, CA125187, CA179729, CA145327, CA179613, CA116680, CA134096, CAI85020, CAO97986, CA241590, CA120065, CA098133, CA300763, CA248222, CA114920, CA140135, CA260971, CA206920, CA069768, CA135583, CA241001, CA126239, CA254670, CA104750, CA225281, CA205773, CA158716, CA177253, CA135668, CA069844, CA176685, CA104833, CAI79725, CA175015, CA093273, CA156663, CA144277, CA077356, CA139207, CA077433, CA156162, CA233672, CA289617, CA136244, CA092631, CA121367, CA166600, CA285273, CA096245, CA174136, CA131526, CA127387, CA243490, CA107152, CA130718, CA234183, CA139986, CA242827, CA295952, CA127931, CA130008, CAI34Ο95, CA138704, CA083624, CA291487, CA217158, CA140705, CA176381, CA300124, CA225694, CA269792, CA142766, CA244765, CA072024, CA208843, CA140774, CA142408, CA244840, CA240123, CA294166, CA131496, CA242966, CA183794, CA078230, CA294108, CA171510, CA070363, CA084393, CA243058, CA238566, CA130322, CA275283, CA149534, CA070447, CA086950, CA275350, CA145273, CAI03468, CA186854, CA101246, CA127499, CA113173, CA255273, CA228952, CA180533, CA188382, CA280222, CA179960, CA145293, CA205177, CA301035, CA127828); SEQ ID No. 44: SCCCCL3080A11.b (CA195011, CA186362, CA296480, CA296654, CA275397, CA290669, CA282198, CA221529, CA275467, CA135001, CA167417, CA290056, CA148875, CA076391, CA242540, CA141300, CA287167, CA076476, CA176410, CA080697, CA252988, CA184697, CA242340, CA200871, CA179397, CA253071, CAI85063, CAI59627, CA284239, CA185199, CA159286, CA291109, CAI79461, CA248226, CA08 6290, CA176240, CA191934, CA245914, CA278165, CA103412, CA152746, CA230916, CA245835, CA242649, CA230990, CA132349, CA287873, CA166292, CA273797, CA160174, CA274023, CA122335, CA273788, CA092884, CA091203, CA154817, CA276231, CA136820, CA287241, CA207749, CA276377, CA066806, CA122402, CAI59765, CA276035, CA296496, CA279832, CA271356, CA091503, CA215068, CA129109, CA116743, CA121331, CA290328, CA285668, CA287690, CA232825, CA069961, CA076390, CA101186, CA240902, CAI8Ο980, CA076475, CA226125, CA283780, CA283709, CA159661, CA182917, CA202160, CA065119, CA155633, CA218498, CA217558, CA288910, CA130058, CA169110, CA249436, CA190722, CA282286, CA169189, CA149394, CA176923, CA148689, CA123410, CA197169, CAI74886, CA202258, CA181623, CA153982, CA263764, CA274086, CA111644, CA093560, CA273768, CA112839, CA093040, CA065124, CA137999, CA264537); SEQ ID No. 45: SCCCCL3120C09.g (CA164701, CA224926, CA093647, CA083169, CA111541, CA083168, CA093732, CA122320, CA265053, CA157947, CA122415, CA122420, CA273041, CA164238, CA130292, CA121753, CA161184, CA087082, CA090483, CA072914); SEQ ID No. 46: SCCCCL3120G07.g (CA126728, CA185585, CA206387, CA125243, CA265002, CA185315, CA245734, CA180717, CA067294, CA091012, CA181272, CA244870, CA264526, CA106164, CA199596, CA180607, CA236822, CA104054, CA244956, CA125117, CA180803, CA067314, CA104139, CA224603, CA279337, CA099590, CA142258, CA168155, CA094223, CA266351, CA180794, CA231617, CA209380, CA093688, CA125829, CA187261, CA187424, CA261208, CA067342, CA226296, CA189470, CA067295, CA168751, CA090956, CAI84722, CA178676, CA211245, CA239943, CA107492); SEQ ID No. 47: SCCCCL4002E02.g (CA116501, CA215472, CAI57057, CA272126, CA132749, CA282608, CA185323, CA134724, CAI31522, CA298731, CA172476, CA093967, CA157851, CA177663, CA265966, CA164160, CA157052, CA145182, CA184790, CA069776, CA222319, CA156078, CA190828, CA140192, CA133240, CA211567, CAI66155, CAO67205, CA195541, CA091963, CA172143, CA089803, CAI63027, CAO90747, CA191514, CA139123, CA162363, CA225047, CAI09794); SEQ ID No. 48: SCCCCL4005F05.g (CA280584, CA301445, CAI01272, CAO94199, CA251241, CA287651, CA277095, CA217700); SEQ ID No. 49: SCCCCL6002B05.g (CA235513, CAI40487, CAO95693, CA183575, CA187535, CA270075, CA259493, CA2 622 65, CA181192, CA279039); SEQ ID No. 50: SCCCCL6003D08.g (CA261317, CA207685, CA249487, CA295361, CA295292, CA176975, CA249563, CA259708, CAO96709); SEQ ID No. 51: SCCCFL4094H12.g (CA235328, CA253578); SEQ ID No. 52: SCCCLB1001D03.g (CA070103, CA233451, CA280144, CA161397, CA073973, CA246052, CA266278, CA187448, CAO87616, CAIO5439, CA292489, CA289895, CA251852, CA112903, CA217956, CA110778, CA193638, CA079528, CA109891, CA157072); SEQ ED No. 53: SCCCLB1003E11.g (CA1837 8 9, CA280103, CA133961, CA139899, CA070532, CA110960, CA153393, CA133885, CA263460, CA115969, CA153912, CA115964, CA271209, CA135793, CA271124, CAI86641, CA170726, CAI86568); SEQ ID No. 54: SCCCLR1001A06.g (CA190346, CA248924, CA092763, CA083592, CA188740, CA077113, CA116115, CA158015, CA121535, CA204604, CA216472, CA105973); SEQ ID No. 55: SCCCLR1001E04.g (CA286692, CA185203, CA283556, CA297496, CA283763, CA107947, CA281797, CA273397, CA288055, CA182167, CA272567, CA275912, CA115183, CA261160, CAI69335, CA275587, CA116155, CA276409, CA275516,CA 113912, CA180802, CA281743, CAI 69255, CA275068, CA283676, CA274801, CA185414, CA288928, CA297998, CA276051, CA247335, CA278026, CA276440, CA295185, CA110175, CA182175, CA281251, CA287476, CA277138, CA277597, CA281255, CA277512, CA170522, CA282815, CA216931, CA208645, CA208714, CA117824, CA13519303, CA295245, CA210512, CA297891, CA180801, CA284125, CA275675, CA301424, CA285422, CA182158, CA286170, CA182550, CA284723, CA286095, CA282404, CA274292, CA183110); SEQ ID No. 56: SCCCLR1022B11.g (CA2 62370, CA175573, CA283139, CA282225, CA175736, CA09897 9, CA274092, CA283705, CA234778, CA090105, CA291719, CA234765, CA149808, CA156650, CA184954, CA162473, CA165344, CA283982, CA145397, CA227663, CA217233, CA193153, CA098173, CA170572, CA168929, CA133676, CA119647, CA096824, CA169015, CA181636, CA176861, CA108797, CA095801, CA102799, CA168953, CA142627, CA140623, CA150372, CA211448, CA065362, CA283916, CA262588, CA296130, CA137717, CAI44579, CA281526, CA097927, CA260822, CA178228, CA099128, CA192194, CA301126, CA135072, CAI 79839, CA150376, CA234766, CA297660, CA281655, CA176409, CA273865, CA297545, CA284140, CA297734, CA098177, CA073430, CA259653, CA136165, CA135273, CA153599, CA181778, CA282925, CA153678, CA070825, CA144282, CA296412, CA097932); SEQ ID No. 57: SCCCLR1022F10.g (CA233639, CA260053, CA185523, CA222669, CA095561, CA167708, CA222802, CA278697, CA175743, CA221789, CA121319, CA177308, CA299149, CA273209, CA244627, CA215981, CA178001, CA066057, CA244686, CA234654, CA297895, CA179682, CA207766, CA186315, CA194047, CA233580, CAI86380, CA269743, CA186727, CA179261, CA18679, CA146095, CA229185, CA239458, CA240513, CA221284, CA118249, CA276970, CA253631, CA163389, CA194377, CA184587, CA138682, CA083453, CAI86061, CAI68226, CA289825, CA261002, CA279246, CA099796, CA254874, CA222389, CA269896, CA133477, CA221786, CA298984, CA256819, CA167056, CA181465, CA164471, CA222384, CA178907, CA244604, CA118336, CA266032, CA118095, CA084230, CA280986, CA258373, CA266089, CA250738, CA193208, CA122349, CA185474, CA119690, CA175851, CA103705, CA099948, CA299982, CA276941, CA298487, CA148104, CA187876, CA107311, CA066053, CA273213, CA137497, CA222054, CA182618, CA244395, CA273241, CA244475, CA257856, CA205271, CA085415, CA192092, CA097961); SEQ ID No. 58: SCCCLR1024A02.g (CA177199, CA178859, CA148547, CA271595, CA165098, CA191796, CA284535, CA119371, CA257923, CA284457, CA139287); SEQ ID No. 59: SCCCLR1024C03.g (CA214530, CA092678, CA259139, CA119392, CA138689, CA142234, CA110468, CA166793, CA235001, CA239014, CA187582, CA153171, CA166778, CA229316, CA108240, CA142532, CA231084, CA122112, CA249179, CA267413, CA116485, CAI88769, CA130021, CA193695, CA073718, CA205841, CAI83536, CA161063, CA206262, CA235000, CA190341, CA202723, CA090059, CA090058, CA236017, CA082031, CA187867, CA155918, CA103108, CA070579, CA079479, CA110879, CA119822); SEQ ID No. 60: SCCCLR1048D07.g (CA147475, CA2 91066, CA096819, CA204869, CA181487, CA192930, CA209156, CA067272, CA147995, CA244339, CA180480, CA171800, CA284134, CA196820, CA244421, CA243578, CA182300, CA186405, CA186430, CA283235, CAI79955, CA184880, CA186482, CA145597, CA186507, CA208666, CAI97511, CAI75966, CA145686, CA256333, CA204958, CA209389, CA101793, CAI01156, CA221552, CA181039, CA166999, CA180658, CA256408, CA253875, CA192877, CA197390, CA166969, CA093997, CA240271, CA205247, CA182628, CA181383, CA099255, CA146394, CA070562, CA213081, CA185160, CA070652, CA070769, CA180031, CA291102, CA170929, CA204905, CA132911, CA218801, CA134618, CA171253, CA206709, CA167078, CA222191, CA134393, CA244769, CA298008, CA133579, CA140427, CA221930, CA171805, CA147956, CA145072, CA115358, CA168857, CA145152, CA221551, CA254585, CA222208, CA193664, CA168945, CA135732, CA106240, CA288063, CA067331, CA105045, CA182416, CA253889, CA267756, CA211247, CA197638, CA122733, CA220849, CA217920, CA217294, CA159483, CA267841, CA122809, CA064754, CA168537, CA205015, CA217367, CA212148, CA195018, CA141826, CA173132, CA185041, CA152829, CA183112, CA222487, CA066599, CA24 4066, CA165764, CA096242, CA207168, CA187102, CA121886, CA172779, CA232513, CA221622, CAI63385, CA187635, CA165823, CA108173, CA216201, CA196736, CAI45978, CA253253, CA143737, CA220822, CA066971, CA137693, CA192288, CA169323, CA149105, CA235200, CA133460, CA231421, CA256401, CAI55413, CA115687, CA231501, CA065787, CA066028, CA130814, CAI66921, CA195510, CA065872, CA119495, CA211215, CA234020, CA097049, CA110451, CA219727, CA130446, CA107579, CAI04154, CA170754, CA169355, CA138200, CA167435, CA192429, CAI90819, CA138088, CA170937, CA187379, CA222270, CA169442, CA256336, CA171875, CA289972, CA204877, CA133091, CA253873, CA146649, CA171683, CAI 74259, CA182738, CA180326, CA146716, CA132203, CAI57422, CA192841, CA257875, CA180828, CA157372, CA234853, CA112786, CA181526, CA205074, CA186020, CA194299, CA217863, CA185113, CA211872, CA121463, CA133052, CA173016, CA068878, CA195370, CA170626, CA070371, CA216657, CA068962, CA243574, CA171193, CA216340, CA297779, CA182680, CA067729, CA180065, CA207908, CA067811 , CA180150); SEQ ID No. 61: SCCCLR1048F03.g (CA127113, CA065075, CA127212, CA277499, CA129554, CA121603, CA121408, CA125178, CA127440, CA276807, CA126903, CA283043, CA236098, CA097364, CA118155, CA281809, CA070362, CA297080, CA278048, CA121485, CA301525, CA116435, CA120637, CA284860, CA277432, CA276771, CA189482, CA124010, CA276938, CA120532, CA288405, CA122385, CA276469, CA215504, CA065010, CA275948, CA126086, CA208335, CA209295, CA210653, CA126762, CA219057, CA127157, CA072321, CA12578 5, CA206577, CA190063, CA284449, CA070651, CA285051, CA065024, CA120482, CA117975, CA208190, CA129193, CA289201, CA168876, CA289063, CA096730, CA128766, CA282961, CA189708, CA285413, CA067943, CA275056, CA065005, CA274114, CA276236, CAO67075, CA126585, CA126946, CA193276, CA177371, CA286524, CA281416, CA176878, CA301261, CA120733, CA267336, CA190241, CAI19190, CA297298, CA116632, CA117265, CA276973, CA125066, CA119744, CA227317, CA279870, CA124816, CA285933, CA121585, CA212660, CA173116, CA125319, CA282719, CA212404, CA284489, CAO66031, CA285534, CA285189, CA118289, CA284558, CA119511, CA274189, CA065095, CA129555, CA283138, CA283217, CA285867, CA124018, CA281823, CA296966, CA288144, CA123645, CA126639, CA278851, CA297029, CA117985, CA296567, CA195886, CA068236, CA219344, CA065081, CA208255, CA129812, CA296642, CA126079, CA068319, CA129203, CA125738, CA276707, CA194608, CA282969, CA122439, CA122553, CA276334, CA281049, CA281213, CA208478, CA265249) ; SEQ ID No. 62: SCCCLR1065F03.g (CA119768, CA180227); SEQ ID No. 63: SCCCLR1066G08.g (CA130183, CA119863, CA190094, CA189956, CA118906, CA129694); SEQ ID No. 64: SCCCLR1068D03.g (CA13114 1, CA282509, CA101490, CA156675, CA119997, CA266674, CA131210, CA107609, CA265499) ; SEQ ID No. 65: SCCCLR1C02F07.g (CA288961, CA273685, CA256939, CA112913, CA107999, CA276603, CA241855, CA085479, CA193799, CA252891, CA097052, CA257482, CA203818, CA239070, CA266548, CA099488, CA252672, CA202292, CA279439, CA187630, CA298704, CA125723, CA251524, CA179558, CA177714, CA119975, CA276149, CA128085, CA264406, CA124059, CA247506, CA246266, CA222791, CA100437, CA252417, CA189608, CA225806) ; SEQ ID No. 66: SCCCLR1C03G01.g (CA114535, CA287070, CA203793, CA113049, CA227918, CA143767, CA239356, CA111397, CAI77088, CA130728, CA189457, CA164190, CA236768, CA141069, CA122177, CAI10741, CA276010, CA072413, CA272629, CA174772, CA256494, CA077651, CA269728, CA178457, CA115111, CA287055, CAI26217, CAI93225, CA178389, CA247689, CA228551, CA138141, CA227995, CA286643, CA189695, CA256499, CA228805, CA106329, CA202331, CA141201, CA142188, CA123003, CA256606, CA097345, CAI67647, CA290389, CA154610, CA081435, CA256686, CA126629, CA115110, CA151805, CA081363, CA167055, CA235116, CA133295, CA148899, CA173127, CA099540, CA148811, CA192344, CA235424, CA272042, CA147268); SEQ ID No. 67: SCCCLR1103H0 9.g (CA194061, CA211639, CA280503, CA116278, CA077744, CA211491, CA209038, CA100317, CA072278, CA096295, CA132466, CA250830, CA292901, CA255776, CA065950, CAI60220, CA106513, CA097514, CA098595, CA104618, CA131327, CA119740, CA264663, CA299848, CA218570, CA183289, CA097825, CA158831, CA135080, CA100314, CA132712, CA100433, CA193691, CA138566, CA103770, CA189715, CA160835, CA134464, CA167292, CA196381, CA172852, CA155853, CA084870, CA180963, CA155411, CA156712, CA154796, CA139279, CA163490, CA284118, CA156681, CA110548, CA248342, CA208017, CA169428, CA233919, CA204384, CA295171, CA179262, CA275173, CA100318, CA272098, CA196446, CA244403, CA220478, CA210201, CA218571, CA117867, CA096983, CA132497, CA122468, CA251047, CA136481, CA138022, CA211494, CA190471, CA175863, CA209234, CA143825, CA133828, CA067734, CA180756, CA137429, CA103045, CA100994, CA068413, CA234182, CA227939, CA263768, CA273411, CA205106); SEQ ID No. 68: SCCCLR1C04C02.g (CA125668, CA125865, CA189739, CA125492); SEQ ID No. 69: SCCCLR1C04G08.g (CA244725, CA238883, CA238483, CA199706, CA117832, CA204153, CA261571, CA167779, CA176803, CAI89784, CA193796, CA276132); SEQ ID No. 70: SCCCLR1C05B03.g (CA143788, CA143875, CA143787, CA143708, CA101128, CA143785, CA15 77 61, CA250652, CAI85977, CA183646, CAI20887, CA189812, CA287301); SEQ ID No. 71: SCCCLR1C05B07.g (CA165238,CA208083, CAO66000, CA126133, CA201529, CA1163063, CA122356, CA295947, CAI60571, CA120466, CA122884, CA211355, CA071582, CA264046, CAI55655, CA085182, CA225540, CA066152, CA122081, CA177997, CAI76532, CA071498, CA221498, CA171047, CA279593, CA189816, CA242630, CA092278, CA1253143 CA170969, CA281472, CA081806, CAI60840, CA272348, CA233103, CA204708, CA280170, CA198137, CA233033, CA118959, CA165234, CA086800, CA123824, CA258260, CA128698, CA140416, CA284775, CA201691, CA192826, CA189953, CA132444, CA198335, CA091105, CA091933, CA201610, CA121611, CA207356, CA259590); SEQ ID No. 72: SCCCLR1C05G07.g (CA297138, CA290571, CA262529, CA220559, CA204203, CA069404, CA115586, CA193158, CA121039, CA174217, CA115870, CA174293, CA104946, CA274619, CA220266, CA142369, CA242315, CA160721, CA158160, CA210774, CA218047, CA233747, CA278657, CA128109, CA152442, CA184091, CA100098, CAO97713, CA103537, CA217191, CA196047, CA274571, CA272485, CA069076, CA196586, CA261588, CA142478, CA202565, CA108110, CAO 84880, CA257882, CA229994, CAI 96659, CA066247, CA133689, CA297542, CA173977, CA182109, CA202628, CA230076, CA086869, CA219503, CA073403, CA098116, CA173463, CA204754, CA186033, CA233775, CA101254, CA214205, CA095524, CA069310, CA128718, CA069189, CA203720, CA243929, CA287679, CA284184, CA262863, CA261604, CA123605, CA119184, CA284257, CA202222, CA119783, CA196568, CA259819, CA172217, CA196643, CA068643, CAI04586, CA271898, CA222538, CA091523, CA264674, CA193641, CAIΟ46553, CA132878, CA125332, CA156254, CA069514, CA300556, CA176289, CA070284, CA189868, CA070369, CA195256, CA147140, CA089091, CA234689, CA066214, CA067046, CA192673, CA269296, CA243676, CA067124, CA264162, CA263530, CA160302, CA157527, CA207879, CA249440, CA104497, CA193097, CA104395, CA294629, CA117002, CA104480, CA211739, CA261852, CA126214, CA108276, CAO99770, CAI11230, CA166005, CA254045, CA132264, CA268441, CAI32728, CA290796, CA173401, CA196261, CA272490, CA233980, CA260947, CA193010, CA225272, CA290862, CA252690, CA070750, CA114221, CAO7Ο826, CA066738, CA172334, CA2297933, CA267884, CA224989, CA207706, CA229890, CA156552, CA192222, CA190669, CA160369, CA275764, CA066572, CA216926, CA165930, CA244384, CA291738, CA223497, CA286984, CA178039, CA244462, CA208957, CA240296, CA067855, CA263436, CA181579, CA223577, CA146490, CA249333, CA185057, CA201456, CA2112423, CA144460, CA157071, CA193340, CAO97777, CA194601, CA214431, CA098121, CA295608, CA127853, CA1382575, CA138018, CA218660, CA141681, CA221859, CA218738, CA185406, CA197336, CA100940, CA197241, CA2849975, CA291940, CAI59153, CA240718, CA215992, CA225524, CA210365, CA159221, CA264160, CA235294, CA159304, CA248608, CA186071, CA211758, CA069425, CA110260, CA072797, CA105702, CA120991, CAI00099, CA105781, CA244089, CA266283, CA208917, CA177938, CAI67214, CA181492, CA146602, CA065458, CA183802, CA295110, CA183809, CAI04306, CA227708, CA183876, CA267695, CA181557, CA1581285, CA104378, CA267781, CA1839215, CA227789, CA147775, CA262173, CA147225, CA164441, CA186580, CA300171, CA264964, CAI66300, CA186652, CA204896, CA285255, CA226022, CA217982, CA224315, CA105942, CA158616, CA297551, CA117447, CA220364, CAI68851, CA276987, CA190237, CA106022, CA116056, CA264622, CAI84486, CA271818, CA1684305, CA189345, CA233898, CA172815, CA155992, CA206379, CA166234, CA187152, CA212298, CA099983, CA204961, CA2 730205, CA169701, CA284310, CA180342, CA064888, CAI839755, CA284388, CA262319, CA1860215, CA248789, CA262273, CA282426, CA177536, CA248866, CA212699, CA110479, CA176162, CA144804, CA141216, CA2758815, CA176238, CA184086, CA141296, CA224239, CA204895, CA276923, CA197046, CA221422, CA068719, CA068789, CA144258, CA183632, CA130681, CA136685, CA184391, CAI12468, CA183495, CA103881, CA211815, CA204894, CA293260, CA0999295, CA094118, CA284494, CA2548738, CA135620, CA190021, CA284622, CA192812, CA135705, CA068304, CA103086, CA155097, CA173863, CA068377, CA110653, CA255712, CA209951, CA185502, CA278212, CA117995, CA255796, CA168934, CA098017, CA219302, CA257679, CA1690195, CA278196, CA105166, CA101795, CA087846, CA193447, CA270003, CA105242, CA191196, CA266313, CA288753, CA257281, CA282991, CA096227, CA068749, CA197855, CA065529, CA222362, CA243507, CA068817, CA065600, CA118181, CA068718, CA238905, CA273579, CA2133715, CA166910, CA185022, CA122534, CAI58024, CAO68788, CA070547, CA065590, CA064671, CA183774, CAI64793, CA119888, CA091778, CA202473, CA082838, CA138229, CAO 994 66, CA191901, CA124125, CA164484, CA261289, CA243775, CAI72637, CA253160, CA067154, CA172720, CA097408, CA160296, CA253234, CA273519, CA067231, CA129930, CA097192, CA126132, CA126138, CA127189, CA295338, CA206463, CA067398, CA099677, CAO97714, CA124424, CA294414, CA180655, CA294483, CA268542, CA211287, CAI68728, CA268608, CA147090, CA1170605, CA297065, CAI93107, CAI95812); SEQ ID No. 73: SCCCLR1C08G10.g (CA242767, CA121427, CAI90110, CA265913, CA256539, CA230257); SEQ ID No. 74: SCCCLR2001H09.g (CA296017, CA0732245, CA150710, CAI61861, CA275518, CA121510, CA236217, CA121324, CAIO6856, CA275589, CA105456, CA186919, CA1151995, CA072158, CAI05535, CAI98312, CA279139, CA267315, CA088244, CA228873, CA199179, CA117254, CA110928, CA120536, CA172530, CA188752, CA127047, CA079583, CA114477, CA074802, CA236212, CA208088, CA074878, CA214679, CA152717, CA292362, CA109321, CA121262, CA236850, CA257917, CA109407, CA131450, CA170188, CA117821, CA249112, CA073701, CA165055, CA280305); SEQ ID No. 75: SCCCLR2002E04.g (CA189063, CA103400, CA105310, CA257545, CA074280, CA081249, CA225565, CA111480, CA200578, CA205658, CA1725775, CA1072825, CA203202, CA110134, CA086789, CA075665, CA1193515, CA175412, CA278217, CA262185, CA289641, CA297337, CA178188, CA110401, CA071940, CA256334, CA073443, CA271459, CA114734, CA214806, CA277079, CA150950, CA112857, CA201428, CA1902205, CA290653, CA189454, CA115238, CA127110, CA112237, CA300604, CA178184, CA129133, CA178175, CA286335, CA212524, CA213221, CA223367, CA077677, CA210590, CA251136, CA223442, CA255159, CA124471, CA104032, CA206849, CA200562, CA278797, CA278234, CA121278, CA295565, CA207628, CA2495255, CA091812, CA187657, CA2162328, CA124525, CA177704, CA211004, CA238405, CA220308); SEQ ID No. 76: SCCCLR2002F08.g CA2116505, CA110492, CAI484008, CA300475, CA150508, CA150497, CA300102, CA300257, CAO95819, CAI04906, CA091149, CA153754, CA258870, CA269965, CA297954, CA065422, CA174959, CA194403, CA106313, CA139292, CA2 484715, CA282371, CA168458, CA300988, CA166296, CA067041, CA288473, CA180947, CA0671195, CA065892, CA162857, CA2728275, CA296238, CA274958, CA114610, CA273634 CA127125, CA260192, CA300615, CA285686, CA152730, CA082206, CA105905, CA285436, CA070842, CA218583, CA168512, CA070916, CA101647, CA295802, CA211573, CA262162, CA132706, CA287764, CA285726, CA272603, CA196573, CA273889, CA105900, CA296728, CA262057, CA1625415, CA064764, CA297035, CA297113, CA225722, CA125625, CA281507, CA129167, CA288837, CA106118, CA287900, CA177953, CA124483, CA128800, CA218582, CA276318, CA2873925, CA278517, CA218499, CA218007, CA299081, CA295773, CA207196, CA145252, CA150651, CA261878, CA107256, CA155204, CA155181, CA296047, CA0854475, CA127248, CA171611, CA300905, CA274697, CA184257, CA278069, CA275866, CA070109, CA141467, CA070191, CA152802, CA287858, CA190605, CA154302, CA199564, CA283532, CA209584, CA296251, CA291158, CAO64871, CA102133, CA275969, CA141502, CA275504, CA1418195, CA275580, CA106944, CA120936, CA150645, CA118413, CA274736, CA296185, CA223170, CA208853, CA283624, CA067879, CAI07873, CA264649, CA288282, CA138280, CA1485715, CA2762185, CA260193); SEQ ID No. 77: SCCCLR2002H11.g (CA127148, CA113376, CAO90822, CA175277, CA144706, CA191342, CA249121, CA112140); SEQ ID No. 78: SCCCLR2003E10.g (CA261916, CA072670, CA127180, JCA082686, CA098222, CA072679, CA227230, CA230364, CAI02583, CAI31720); SEQ ED No. 79: SCCCLR2C01F06.g (CA125903, CA130165, CA127342, CA123725); SEQ ID No. 80: SCCCLR2C02A05.g (CA116671, CA130253); SEQ ID No. 81: SCCCLR2C02D03.g (CA262689, CA083750, CAI01533, CA177058, CA236874, CA100362, CA128908, CA171906, CA102805, CA115056, CA127401, CA146627, CA158448, CA098804, CAI46619, CA258980, CA215587, CA265819, CA265880, CA212035, CA261941, CA071913, CA267912, CA154469, CA079309, CA174463, CA118147, CA146622, CA273451, CA117370, CA267710, CA188407, CA122342); SEQ ID No. 82: SCCCRT1001E01.g (CA145556, CA265124, CA140467, CA259428, CA269652, CA132841, CA253363, CA298816, CA258474, CA265609, CA240255, CA185830, CA130669, CA139431, CA1303 99, CA260672, CA138292, CA218105, CA266538, CA269994, CA218177, CA258974, CA145910, CA190685, CA221999, CA190860, CA259945, CA080912, CA278886, CA264789, CA1459145, CA107290, CA273194, CA260082, CA1371455, CA265723, CA145474, CA131856, CA2 65716); SEQ ID No. 83: SCCCRT2002G11.g (CA098113, CA259292, CAI67710, CA160985, CA167765, CA277212, CA301138, CA252372, CA264993, CA166058, CA174697, CA080916, CA298478, CA108271, CA213368, CA173993, CA211356, CA158908, CA162533, CA194961, CA184093, CA0966445, CA161001, CA300513, CA144742, CA229700, CA266477, CA092549, CA193396, CA197153, CA096270, CA267077, CA174874, CA298338, CA158349, CA214804, CA136971, CA263769, CA225513, CA214883, CA157020, CA263846, CA281339, CA164770, CA160919, CA203458, CA290101, CA161006, CA114942, CA289802, CA195261, CA298479, CA198016, CA197064, CA298238, CA171959, CA172546, CA273048, CA299633, CA137199, CA156278, CA160900, CA194153, CA265809, CA160988, CA247104, CA174172, CA265871, CA191620 CAI98789, CA175182, CA141419, CA174246, CA256737, CA123842, CA171971, CA172544, CA109630, CA163657, CA174143, CA256660, CA217966, CA109716, CA268027, CA157316, CA295099); SEQ ID No. 84: SCCCRZ1001F02.g (CA103948, CA150083, CA259661, CA300458, CA260819, CA115748, CA132394, CA139574, CA150333, CA137265, CA174881, CA276459, CA187808, CA162788, CA225541, CA236121, CA272799, CA143215, CA086510, CA126049, CA140320, CA190692, CA214128, CA29327 9, CA232739, CA288829, CA232827, CA205598, CA154561, CA2582765, CA137338, CA285532, CA128190, CA142456, CA201134, CA132162, CA228245, CA126555, CA071690, CA209954, CA143470, CA248359, CA200342, CA115266, CA136159, CA207491, CA279420, CA272494, CA229717, CA287861, CA289897, CA292215, CA288557, CA123136, CA106015, CA109649, CA124195, CA256039, CA106083, CA259023, CA109734, CA182936, CA146835, CA267500, CA260093, CA161128, CA213896, CA260715, CA247923, CA260696, CA232980, CA235230, CA161214, CA233046, CA183253, CA106339, CA205597, CA226389, CA213070, CA085049, CAI18942, CAO65078, CA265611, CA065008, CA284023); SEQ ID No. 85: SCCCRZ1001H05.g (CA145736, CA287892, CAI92135, CAI46862, CA234792, CA101303, CA204402, CA151180, CA119789, CA288119, CA151262, CA080448, CA145653, CA095725); SEQ ID No. 86: SCCCRZ1002E08.g (CAI 79035, CA191340, CA233483, CA300253, CA085975, CA269763, CA262601, CA236263, CA070203, CA086063, CA190618, CA0859695, CA300380, CA120960, CA294874, CA180727, CA292085, CA301489, CA086058, CA273085, CA131694, CA285350, CA182564, CA244750, CA238660, CA244829, CA243124, CA180028, CA144527, CA228073, CA159113, CA2603175, CAI61623, CAI85003, CA184781, CA101457, CA136411, CA287945, CA269808, CA299418, CA142515, CA174197, CA128767, CA268523, CA174275, CA282823, CA146924, CA251224, CA172558, CA131340, CA200210, CA228169, CA184495, CA201598, CA178951, CA130651, CA183353); SEQ ID No. 87: SCCCRZ1002H08.g (CA279826, CA135036, CA124184, CA0767295, CA240511, CA076725, CA146959, CA291640, CA146710, CA066324, CA122936, CA203952, CA156670, CA162985, CA245296, CA278468, CA117478, CA184525, CA207771, CA116304, CA240781); SEQ ID No. 88: SCCCRZ1004H12.g (CA216874, CA081561, CAIO6731, CA251585, CA066538, CA114810, CA148014, CA114649, CA267565, CA267650, CA088912, CA149128, CA227151, CA105454, CA125437, CA269856, CA187518, CAO66036, CA2869105, CA265042, CA234010, CA160780, CA185108, CA149229, CA110623, CA264544, CA095591, CA150496, CA111584, CA176699, CA140671, CA108165, CA123092, CA283700, CA287402, CA167981, CA064988, CA275544, CAI77425, CA141224, CA275615, CA2118035, CA125932, CA212296, CAI41306, CAI91643, CA140689, CA279161, CA0796595, CA240039, CA159148, CA174083, CA067685, CA198561, CA143599, CA267523, CA097307, CA067769, CA267610, CA101896, CA096607, CA124965, CA248186, CA124435, CA108814, CA134608, CA192137, CA108989, CAI34689, CA166683, CA094488, CA291849, CA109073, CA153798, CAI47144, CA299990, CA173707, CA267553, CA225467, CA273321, CA110109, CA267638, CA104185, CA161871, CA290349, CA270432, CA163555, CA154762, CA222553, CA270296, CA166573, CA108407, CAI82036, CAI 64299, CA202506, CA075284, CA225393, CA277703, CA202590, CA102086, CA110611, CAO65056, CA233782, CA197286, CA229575, CA277050, CA157909, CA277094, CA140749, CA137396, CA1968965, CA282885, CA239918, CA301434, CA196962, CA164275, CA084201, CA275533, CA145361, CA234812, CA275603, CA081143, CA186963, CA195293, CA131246, CA1630615, CA180624, CA120533, CA181897, 15 CA192846, CA159009, CA067687, CA2255035, CA1939285, CA170449, CAO67771, CA156228, CA157265); SEQ ID No. 89: SCCCRZ2001A10.g (CA0832 66, CA170546, CA213983, CA240546, CA214055, CA068172, CA243400, CA112026, CA159624, CA17820417, CA149593, CA195353); SEQ ID No. 90: SCCCRZ2001E12.g (CA220407, CA069786, CA266584, CA117131, CA149640, CA102 694, CA107051, CA126788, CA178629, CA116298, CA189528); SEQ ID No. 91: SCCCRZ2003E12.g (CA290451, CA171106, CA257067, CA126312, CA285909, CA191695, CA175249, CA277181, CA198875, CA264876, CA228763, CA257385, CA149818, CA268790, CA228758, CA239922, CA147478); SEQ ID No. 92: SCCCRZ2C01F09.g (CA238345, CA110244, CA292133, CA226215, CA290161, CA089133, CA225941, CA087675, CAO 81960, CA263629, CA263709, CA271851, CA098120, CA103239, CA241010, CAO81617, CA127228, CA241092, CA249515, CA289050, CAO81621, CA285377, CA149903, CA084191, CA237910, CA287616, CA170459, CA180444, CA241705, CA072646, CA198212, CA140343, CAO 74071, CA260574, CA275241, CA219063, CA230826, CA216366, CA284463, CA231731, CA275313, CA277199, CA284538, CA085114, CAI46451, CA238575, CA170457, CA241499, CA276966, CA150000, CA194018, CA282348, CA151656, CA292177, CA151735, CA081964, CA276948, CA281247, CA148593, CA127998, CA297924, CA098115, CA225142, CA104406); SEQ ID No. 93: SCCCSD1003E02.g (CA284001, CA285612, CA291203, CA278558, CA277223, CA285546, CA272455, CA284812, CA288109, CA285276, CA2740835, CA274097, CA282761, CA284853, CA282957, CA276485, CA288135, CA282680, CA287028, CA288317, CA301448, CA281013, CA278500, CA287354); SEQ ID No. 94: SCCCSD1092A08.g (CA284222, CA275878, CA276919, CA284291, CA284297, CA281361, CA273485, CA285647, CA286280, CA287406); SEQ ID No. 95: SCCCSD2001E05.g (CA282080, CA282487, CA278050, CA284383, CA274256); SEQ ID No. 96: SCCCSD2C03G12.g (CA301232, CA297876, CA297283); SEQ ID No. 97: SCCCST1001C04.g (CA096261, CA241976, CA265094, CA217159, CA169670, CA085862, CA103281, CA236141, CA230822, CA166981, CA178741, CA173538); SEQ ID No. 98: SCCCST1006B11.g (CA211361, CA070492, CA219037, CA070499, CA178358, CA173923, CA217421, CA217710); SEQ ID No. 99: SCCCST3001H12.g (CA182157, CA090806, CAI35450, CAI92177, CA157038, CA180203, CA186190, CA185139, CA088464, CA107 032, CA186187); SEQ ID No. 100: SCEPAM1020A03.g (CA298761, CA238039, CA072781, CA202979, CA265514, CA203056, CA216879, CA274267, CAI54767, CA072 753, CA232137, CA272619) ; SEQ ID No. 101: SCEPLR1030B03.g (CA284018, CA296786, CAI91311, CA135484, CA132970, CA260298, CA293358, CA232052, CAI45338, CA296858, CA300403, CA289136, CA190455, CA256928, CA276730, CA114900, CA151879, CA131612, CA282822, CA281761, CA277035, CA131569, CA256849, CA139403, CA120776, CA111640, CAI44584, CA109836, CA163350, CA103723, CA138138); SEQ ID No. 102: SCEPLR1030E06.g (CA120812, CA166500, CA121058, CA157792, CA147349); SEQ ID No. 103: SCEPRZ1008F02.g (CA084261, CA147347, CA090873, CA1520018, CA234969, CA0915605, CA150615, CA2539168, SCA204783, CA205748, CA192626, CA201996, CA202076, CA280863, CA162916, CA088703, CA085702, CA175387, CA269587, CA152933, CA092690, CA229677, CA152922, CA200559, CA156055, CA170331, CA140801, CA256055, CA152711, CA153264, CA199353, CA091994, CA151595, CA221404, CA1533375, CA198274, CA151680, CA273193, CA214750, CA249251, CA084265, CA113829); SEQ ID No. 104: SCEPRZ1010E06.g (CA153095, CA171009, CA300383, CA134779, CA147516, CA171086, CA290145, CA187047, CA190622, CA249955, CA131632, CA285405, CA195540, CA146683, CA255486, CA274214, CA143354, CA262861, CA2500355, CA196569, CA205156, CAI96644, CA296007, CA172028, CA184943, CA117936, CA257643); SEQ ID No. 105: SCEPRZ3087C08.g (CA160294, CA160210); SEQ ID No. 106: SCEQLB2019B08.g (CA279976, CA272048); SEQ ID No. 107: SCEQLR1007G03.g (CA140431, CA259456, CA211527, CA271749, CA266277, CA141614, CA215266, CA220502, CA201033, CA142803, CA094784, CA172036, CA1072121, CA194369, CA2950965, CA065513, CA157629, CA181854, CA099236, CA296097, CA0687955, CA145592, CA157045, CA169225, CA195900, CA2898005, CA083770, CAI03698, CA196336, CA066685, CA279318, CA134272, CAI69306, CA144849, CA173189, CA190898, CA206313, CA176452, CA257180, CA084874, CA101125, CA249765 CA284335, CA162053, CA180997, CAI97651, CA143812, CA188901, CA194298, CA234171, CA085641, CA267721, CA123786, CA267873, CA139542, CA208084, CA097722, CA158840, CA103745, CA232413, CA177068, CA138787, CA200611, CA183259, CA094119, CA293858, CA299758, CA232497, CA181726, CA207021, CA270176, CA077309, CA123096, CA142484, CA251020, CA205516, CA074457, CA1442335, CA130849, CA171502, CA136847, CA265729, CA120240, CA192591, CA265372, CA195921, CA209672, CA1255138, CA1923945, CA259229, CA293855, CA105693, CA081981, CA131054, CA269628, CA146587, CA088333, CA158446, CA258765, CA134005, CA143367, CA258108, CA068778, CA271982, CA101526, CA227906, CA127817, CA117772, CA107439, CA088988, CA300259, CA1353375, CA213654, CA190891, CA182017, CA120975, CAO92302, CA202807, CA094566, CA274758, CA082503, CA094014, CA237917, CA089634, CA194363, CAOS9726, CA084158, CA145586, CA1255218, CA142320, CA234258, CA229530, CA293659, CA300521, CAI09689, CAI91974, CA081639, CA294851, CA109766, CA074622, CAI98332, CA200961, CA187329, CA281641, CA066256, CA299442, CA264175, CA121806, CA266806, CA241746, CA215496, CA255625, CA234149, CA068777, CA1958425, CA178628, CA178717, CA142335, CAI09521, CAI48397, CA094810, CA096159, CA269632, CA077723, CAI34029, CAO94404, CA1989035, CA294206, CA169711, CA181781, CAI68554, CA0798075, CA198035, CA071310, CA0866915, CA180555, CA193559, CA203910, CA100811, CA085634, CA076712, CA069456, CA263383, CA280255, CA176816, CA066414, CA212509, CA167475, CA295033, CA194573, CA071797, CA076495, CA148279, CA101133, CA186819, CAI80 647, CA187603, CA198759, CA235563, CA291664, CA204052, CA2 843425, CA1029505, CA118149, CA085453, CA085470, CA097975, CA183735, CA264115, CA198176); SEQ ID No. 108: SCEQLR1091A10.g (CA114539, CA257837, CA077076, CA262215, CA274238, CA211402, CA274108, CA230959, CA121144, CA256388, CA288382, CA079882, CA230878, CA241079, CA256311, CA237783, CA240995, CA073200, CA235765, CA60113590, CA126147, CA077764, CA118720, CA123712, CA286990, CA281182, CA111839, CA1245215, CA077641, CA255256, CA111725, CA129312, CA216352, CA209624, CA111908, CA155939, CA189115, CA135189, CA235762, CA291159, CA238370); SEQ ID No. 109: SCEQRT1024B02.g (CA216940, CA225607, CA179965, CA204515, CA132482, CA185736); SEQ ID No. 110: SCEQRT1024E12.g (CA295147, CA260615, CA254686, CA132523, CA197622, CA204899, CA190453, CA212246, CAI97604, CA270758, CA2703465, CA130936, CA269290, CA256715, CAI32252, CA182867, CA107713, CA256638, CA2584025, CA217358, CAI84651, CAI09919, CA185468, CA217428, CA156179, CA220042, CAIO9994, CA284009, CA214271, CA139017, CA135234, CA260181, CA234511, CAI61112, CA102825, CA183055, CA103445, CA192331, CAI07252, CAI61202, CA288819, CA107320, CA258917, CA244198, CA220062, CA259939, CA069469, CA244275, CA220141, CA185728, CA284013); SEQ ID No. 111: SCEQRT1025D04.g (CA210404, CA217344, CA296134, CA217415, CA187015); SEQ ID No. 112: SCEQRT1025D06.g (CA132593, CA141785, CA141018, CA215251); SEQ ID No. 113: SCEQRT1026H08.g (CA145460, CA069364, CAI40129, CA250315, CA145544, CA141404, CA293054, CA282922, CAI63907, CA261070, CA163990, CA205321, CA173746, CA283810, CA134025, CA170490, CA240108, CA069401, CA280554, CA277690, CA168030, CA240167, CA222954, CA132730, CA217518, CA2774355, CA191682, CA190599, CA133625, CA264946, CA2771535, CA070912, CA217975, CA146562, CA284169, CA143199, CA087655, CA287350, CA273405, CA084518, CA301511, CA143266, CA290482); SEQ ID No. 114: SCEQRT1028C03.g (CA139365, CA286665, CA260598, CA139023, CA285888, CA274666, CA137906, CA281362, CA285687, CA136311, CA141788, CA103170, CA133136, CA269938, CA284682, CA288527, CA141870, CA285073, CA285465, CA284318, CA287 456, CA130761, CA137490, CA144380, CA297849, CA131873, CA143782, CA281126, CA143182, CA191432, CA284091, CA278152, CA164514, CA1390448, CA138535, CA283285, CA1066825, CA102643, CA136156, CA132845, CA276716, CA275759, CA284563, CA268586, CA268592, CA143781, CA268641, CA284432, CA273135, CA139564, CA297995, CA268645, CA287370, CA143142, CA138952, CA143227, CA297005, CA101363, CA142135, CA115501, CA278630, CA138496, CA101781, CA286567, CA1416235, CA136320, CA136240, CA288341, CA288312, CA104716, CA288071, CA193582, CA130778, CA297953, CA104799, CAI43442, CA274724, CA104459, CA104545, CA274625, CA290645, CA278030, CA275085, CA138291, CA145190, CA144775, CA290713, CA133241, CA141076, CA272524, CA146265, CA293757, CA135230, CA139625, CA277500, CA131620, CA269954, CA131757, CAIΟ6126, CA268581, CA273592, CA106187, CA136999, CA288204, CA277749, CA143039, CA278287, CA139806); SEQ ID No. 115: SCEQRT1031D02.g (CA074042, CA088825, CA075266, CA271676, CA295638, CA133114, CA268786, CA112006, CA291853, CA269112, CA089768, CA292656, CA273097, CA078197, CA073875, CA074037, CA189360, CA260450); SEQ ID No. 116: SCEQRT1033H06.g (CA101392, CA115952, CA155650, CA133340, CA213648, CA215953, CA108139, CA102933, CA163612); SEQ ID No. 117: SCEQRT2 0 9 8H0 6.g (CA172591, CA163271, CA229649, CA139483); SEQ ID No. 118: SCEQRT2 0 9 9H01.g (CA086208, CA264357, CA086287, CA080644, CA266323, CA161194, CA300091, CA287964, CA221671, CA131618, CA251982, CA221152, CA159591, CA221951, CA156418, CA240390, CA161187, CA159676, CA139559, CA077881, CA161261, CA110139, CA077863); SEQ ID No. 119: SCEQRT2100B02.g (CA217945, CA139573, CA204327, CA260706, CA204248, CA2692225, CA269284); SEQ ID No. 120: SCEQRZ3020C02.g (CA250725, CA161134, CAI65966, CA160060, CA156919, CA164968, CA251491, CA069428); SEQ ID No. 121: SCEZAM2058E08.g (CA188635, CA183792, CAI95687, CA084907, CA081270, CA081191, CA173384); SEQ ID No. 122: SCEZHR1047A01.g (CA103161, CA101776); SEQ ID No. 123: SCEZHR1087F0 6.g (CA253395, CA197374, CA287472, CA103877, CA278023); SEQ ID No. 124: SCEZHR1088E02.g (CA301005, CA296733, CA247972, CA103945, CA243569, CA251930); SEQ ID No. 125: SCEZLB1009A09.g (CA281626, CA244568, CAI16483, CA237705, CA298353, CA298000, CA113117, CA284416, CA277289, CA284348, CA276706, CA290833, CA2030915, CA101727, CAI76398, CA132760, CA096672, CA290760, CA282167); SEQ ID No. 126: SCEZLB1010E10.g (CA111286, CA201293, CA292534, CA113224, CA078624); SEQ ID No. 127: SCEZLB1012F10.g (CA174564, CA069051, CA216445, CA163915, CA198521, CA068371, CA296305, CA113392, CA099142, CA163996, CA166390, CA116217, CA210122, CA074493, CA114992, CA275989); SEQ ID No. 128: SCEZLR1052E07.g (CA121650, CA116831, CA120886); SEQ ID No. 129: SCEZRZ3098G10.g (CA296471, CA160526, CA273318, CA275478, CA283208, CA160609, CA285866, CA277278, CA158745, CA283693, CA285324, CA285071, CA284153, CA274955, CA285128, CA297181, CA278664, CA272542, CA273750, CA294380, CA287923, CA273821, CA294450, CA297756, CA274726, CA296701, CA277926, CA296395, CA286712, CA286723, CA286722, CA275718, CA275927, CA283291, CA275408); SEQ ID No. 130: SCEZST3147A10.g (CA194007, CA182656); SEQ ID No. 131: SCJFFL3C03C02.g (CA230214, CA230128, CA229489); SEQ ID No. 132: SCJFLR1035E04.g (CA0865275, CA195068, CA069060, CA083548, CA2958655, CA177350, CA177349, 15 CA277098, CA276954, CA155838, CA197797, CA244043, CA088503, CA121818, CA080812, CAI55548, CA078754, CA089206, CA163208, CA129874, CA211416, CA276961, CA144131, CA158866, CA1555425, CA199612, CA263981); SEQ ID No. 133: SCJFLR107 4E0 9.g (CA262344, CA266655, CA176711, CA133325, CA122163, CA131810, CA082004, CA181680, CA180565, CA078933, CA085138, CA210263, CA210980, CA184457, CA262635, CA176142, CA234269, CA176141, CA178297, CA183158, CA082635, CA082991, CA198762, CA190715, CA190706, CA274415, CA081600, CA279078, CA181928, CA081942, CA267908, CA089450, CA084567, CA186427, CA078935); SEQ ID No. 134: SCJFRT1005C11.g (CA177520, CA225223, CAIO6003, CA253319, CA171361, CA209379, CA270001, CA185425, CA155754, CA167026, CA270006, CA106095, CA213061, CA170199, CA287881, CA132140, CA204757, CA155038, CA133369, CA254157, CA280727, CA260033, CA146511, CA186031, CA1618795, CA296036, CA220424, CA220423, CA102390, CA184239); SEQ ID No. 135: SCJFRT1007E01.g (CA267659, CA267574, CA259232, CA265484, CA145383); SEQ ID No. 136: SCJFRT1007H07.g (CA2320465, CA260877, CA092783, CA231963, CA204189, CA133468, CA244788, CA244787, CA254691, CA244858, CA204513, CA230346, CA256769 , CA108120, CA089835, CA204647, CA264840, CA230425, CA268306, CA258270, CA222112, CAI65049, CA222037, CA259725, CA114043, CA233931, CA259471); SEQ ID No. 137: SCJFRT2055G07.g (CA096216, CA243260, CA285937, CA2309205, CA140859, CA083416); SEQ ID No. 138: SCJFRZ2007F10.g (CA162683, CA160048, CA279259, CA151224, CA159697, CA156537, CA162591, CA113918, CAI60134, CAI62626, CA081758, CA165192, CA159782, CA162706, CAI51304, CA266640); SEQ ID No. 139: SCJFRZ2012F04.g (CA151819, CA226484, CAI96727, CA176517, CA200020); SEQ ID No. 140 SCJFRZ2034D04.g (CA293545, CA237627, CA152997) ; SEQ ID No. 141: SCJFRZ3C03H08.g (CA159498, CA159411); SEQ ID No. 142: SCJFST1009H11.g (CA176832, CA174223, CAI74300); SEQ ID No. 143: SCJLLR1054C03.g (CA072193, CA122571, CA137632, CA070187, CA191143, CA188078, CA249372, CA249371, CA077923, CA208829, CA208828, CA070105, CA261620); SEQ ID No. 144: SCJLRT1016G06.g (CA135201, CA141549); SEQ ID No. 145: SCJLRT1021D12.g (CA169233, CA144275, CAI69232, CA076021, CA075936, CA184045, CA135772, CA095372, CA216051, CA168410); SEQ ID No. 146: SCJLRT1023A0 9.g (CA182963, CA250841, CA248659) ; SEQ ID No. 147: SCJLRZ1021D12.g (CA242041, CA249059, CA254109, CA213847, CA137917, CA148975, CA118183, CA214586, CAI97889, CA144551, CA196585, CA262465); SEQ ID No. 148: SCJLST1022A12.g (CA212757, CA175747, CAI84421); SEQ ID No. 149: SCMCLR1123E10.g (CA123814, CA077430, CA225563); SEQ ID No. 150: SCMCRT2103B04.g (CA172001(CA142458, CA218053); SEQ ID No. 151: SCMCSD2061005.g (CA281642, CA278782, CA287422); SEQ ID No. 152: SCQGHR1010D02.g (CA106316); SEQ ID No. 153: SCQGHR1012B09.g (CA287612, CA106449); SEQ ID No. 154: SCQGLR1085F11.g (CA264338, CA126544, CA192941, CAI67483, CA123056, CA124270, CA272314, CA261490, CA279307, CA265550, CA271792, CA122975, CA264343, CA270329, CA273106); SEQ ID No. 155: SCQGRT1040G03.g (CA142863, CA142796, CA136289); SEQ ID No. 156: SCQGSB1082E12.g (CA170065); SEQ ID No. 157: SCQSRT1036D03.g (CA136902, CA135021, CA287878, CA274443, CA296937, CA138673, CA191058); SEQ ID No. 158: SCQSSB1077D06.g (CA170725); SEQ ID No. 159: SCRFHR1009G06.g (CA217470, CA107403, CA198006, CA217550); SEQ ID No. 160: SCRFLR1012D12.g (CA215552, CA192043, CA124962, CA125195, CA145888, CA121817, CA278865, CA174653, CA248262, CA272947, CA260358, CA291459, CA203303, CA143179, CAI41645, CA178853, CA187649, CA206782, CA090093, CA143252, CA278919); SEQ ID No. 161: SCRFLR1012F12.g (CA145277, CA176384, CAI02865, CA218229, CA171925, CA191792, CA195660, CA218314, CA240492, CA198659, CA244914, CA182463, CA131724, CA244997, CA171817, CAI94382, CA205344, CA170805, CA205416, CA173212, CAI70885, CAI81179, CA170637, CA183044, CA195239, CA206962, CA185418, CA139670, CA195249, CA176430, CA181413, CA181342, CA091964, CA183864, CA222085, CA258352, CA1405065, CA180474, CA119811, CA222017, CA195130, CA185570, CA296593, CA194982, CAI83360, CAI73154, CA186079, CA296664, CA171270, CA195468, CAI83252, CA294806, CA132456, CA195394, CA206688, CA256506, GA131509, CAI875035, CA256594, CA1080505, CA159196, CA240650, CA177662, CA159279, CA177742, CA239913, CA171438, CA156947, CA173255, CA256346, CA235445, CA256418, CA186679, CA219554, CA187 631, CA186748, CA245097, CA185375, CA219625, CA181621, CA187266, CA123999, CA244218, CA245173, CA182407, CA253693, CA184655, CA143210, CA180512, CA256622, CA244292, CA185011, CA143274, CA168051, CA130540, CA207436, CA219682, CA066624, CA216694, CA178229, CA256208, CA213213, CA171923, CA189901, CA181034, CA102783, CA146612, CA118091, CA130413, CA185759, CA180234, CA184401, CA069670, CA186382, CA186701, CA164112, CA186458, CA186769, CA191147, CA181041, CA191952, CA298549, CA187520, CA155473, CA111918, CA181356, CA215886, CA145798, CA143022, CA249269, CA168083, CA215375, CA073688, CA161824, CA216676, CA198787, CA145199, CA254628, CA186888, CA213066, CA091970, CA215884, CA143890, CA222334, CA220813, CA171807, CA181203, CA130692, CA186145, CA260159, CA158846, CA064841, CA295391, CA192487, CA132539, CA300897, CA141052, CA155506, CA182241, CAI87303, CA258020, CA066321, CA125200, CA170189, CAI08039, CA159362, CA173331, CA298200, CA101575, CA159451, CAI16648, CAI83460, CA107663, CA240851, CA289373, CA185342, CA240929, CA216040, CA186847, CA181218, CA172612, CA180663, CA136914, CA217359, CA163192, CA172697, CA228382, CA217429, CA159166, CA185025, CA192456, CA102223, CA156933, CA101474, CAI83302, CA186227, CA159239, CA269601, CA181346, CA102790, CAI87044, CA184058, CA195530, CA255719, CA136787, CA255803, CAI40448, CA247100, CA183704, CA222949, CA183064, CA168215, CA292284, CA272087, CA174156, CA131207, CA203204, CA181678, CA195537, CA174230, CA113053, CA213323, CA18455, CA183105, CAI37679, CA221917, CA234916, CA191379, CA207396, CA249902, CA203603, CA257333, CA192868, CA108462, CA131411, CA272376, CA194489, CA249816, CA257417, CA207923, CA183017, CA194671, CA163065, CA185665, CA257591, CA182994, CA279934, CA208015, CA186256, CA177351, CA132757, CA146153, CA172253, CA181813, CAI82473, CA181263, CA182486, CA185227, CA144437, CA210632, CA179930, CA163280, CA178697, CA187150, CA102845, CA183295, CA203119, CA167619, CA183126, CA240601, CA167572, CA197131, CA187498, CA187269, CA181877, CA154563, CA166216, CA198634, CA255532, CA221973, CA205215, CA165092, CA211170, CA179824, CA185664, CA162302, CA185103, CA138255, CA173288, CA168237, CA234213, CA138061, CA256349, CA170955, CA162207, CA168159, CA134163, CA181092, CA256421, CA081501, CA134612, CA216664, CA171033, CAI80502, CA108052, CA134694, CA242240, CA185226, CAI93845, CA210899, CA159347, CA266029, CA159436, CA171415, CA135255, CA233811, CA171999, CA187597, CA1806385, CA135773, CA253334, CA131134, CA182234, CA184039, CA166175, CA180410, CA280449, CA297478, CA194983, CA215483, CA264565, CA107740); SEQ ID No. 162: SCRFLR1034G0 6.g (CA241449, CA235335, CA1171365, CA164653, CA178183, CA254415, CA125238, CA164095, CA222593, CA230775, CA129494, CA187277, CA096098, CA163037, CA2173495, CA216253, CA163492); SEQ ID No. 163: SCRFLR2037F09.g (CA209741, CA268887, CA178192, CA261014, CA242867, CA265801, CA1972285, CA129199, CA263453, CA263426, CA146361, CA212193, CA198338, CA263428, CA292726); SEQ ID No. 164: SCRUAD1063D03.g (CA068586, CA068642, CA209109, CA068658, CA068557); SEQ ID No. 165: SCRUAD1064B08.g (CA068774, CA209078, CAO68700; SEQ ID No. 166: SCRUFL1112F04.b (CA249652, CA097438, CAO97351); SEQ ID No. 167: SCRULB1060F05.g (CA173325, CA260726, CA086474, CA255253, CA258837, CA166401, CA075394, CA076741, CA220439, CA079619, CA202888, CA275737, CA272422, CA086576, CA261359, CA115018, CA176599); SEQ ID No. 168: SCRULB20 65G10.g (CA271141, CA266659, CA271226); SEQ ID No. 169: SCRUSB1062E12.g (CA169672, CA208550, CA182671, CA171140, CA184190); SEQ ID No. 170: SCSBAD1084C01.g (CA104637, CA090516, CAI96055, CA105810, CA069997, CA104732, CA225658, CA250072, CA255717, CA256367, CA256852, CA104815, CA255801, CA223408, CA217811, CA230204, CA222042, CA266094, CA202055); SEQ ID No. 171: SCSBAM1084E01.g (CA134918, CA160648, CA271201, CAI63376, CA159473, CA079123, CA287106); SEQ ID No. 172: SCSBAM1085B0 6.g (CA155118, CA160431, CA238835, CA164387, CA159328, CA079174, CA166634, CA111526) SEQ ID No. 173: SCSBAM1086F04.g (CA079296); SEQ ID No. 174: SCSBHR1050B11.g (CA210645, CA170681, CAI67697, CA107340, CA215631, CA206834, CA108412, CA182286, CAI97994, CA277167, CA163113, CA192646, CA276916, CA265467, CAI81920, CAI84384, CA273323, CA211222, CA211754, CA185581, CA219190, CA260157, CA102243, CA286611, CA185579, CA218411, CA288879, CA193027, CA229712, CA196151, CA218111, CA212330, CA256722, CA283661, CA195272, CA206786, CA197939, CA102985, CA1825065, CA284298, CA268890, CA068317, CA213471, CA2113765, CA124505, CA068559, CA110532, CA110645, CA196292, CA274987, CA291082); SEQ ID No. 175: SCSBHR1052E03.g (CA109838, CA103669, CA108022); SEQ ID No. 176: SCSBSD2029D11.g (GA273475, CA291058, CA296853, CA296781); SEQ ID NO. 177: SCSBSD2029F05.g (CA277625, CA286610, CA287004, CA286219); SEQ ID NO. 178: SCSBST3096H04.g (CA250727, CA185029, CA081571, CA209300, CA099207); SEQ ID NO. 179: SCSFAD1125C08.g (CA218816, CA217232, CA265904); SEQ ID NO. 180: SCSGAM1094D05.g (CA162116, CA086160, CA079959, CA166087, CA164634, CA259450, CA162089, CA268215, CAI62088, CA088600, CA268472, CA260072, CA265273, CA155162); SEQ ID NO. 181: SCSGFL4193B05.g (CA256924, CA227764, CA065586); SEQ ID NO. 182: SCSGHR1069F04.b (CA068965, CA109244); SEQ ID NO. 183: SCSGLR1045F05.g (CA227916, CA126326, CA235027, CA271367, CA096003, CA217599, CA092647, CA123937, CAI26293, CA212141, CA184768, CA103141, CA109865, CA103057, CAI98702, CAI03058; SEQ ID NO. 184: SCSGSB1009D11.g (CA172723, CA195396, CAI72640); SEQ ID NO. 185: SCUTAM2005B03.g (CA090809, CA245425); SEQ ID NO. 186: SCUTAM2115C12.g (CA086564, CA086570, CA092157); SEQ ID NO. 187: SCUTLR2023D06.g (CA243852, CA300860, CA067973, CA111863, CA261222, CA116646, CA107988, CA176922, CA173185, CA085544, CA264052, CA129911, CA208820, CA070339); SEQ ID NO. 188: SCUTRZ2022G04.g (CA2821925, CA102010, CA299087, CA217805, CA162851, CA237908, CA10I358, CA289898, CA293565, CA122383, CA070388, CA177777, CA069853, CA153426, CA248297, CA159447); SEQ ID NO. 189: SCUTST3084F06.g (CA186860, CA273919, CA181491, CA213324, CA181556); SEQ ID NO. 190: SCUTST3152C08.g (CA209403, CA181973, CA187843); SEQ ID NO. 191: SCVPAM1055A12.g (CA099145, CA234768, CA279908, CA080282, CA243494, CA065806, CA162304, CA0743005, CA198499, CA234769, CA099202, CA218059); SEQ ID NO. 192: SCVPCL6041F01.g (CA233726, CA099858, CA222285); SEQ ID NO. 193: SCVPFL3040D12.g (CA246849, CA247391, CA225824) ; SEQ ID NO. 194: SCVPFL3045B0 9.g (CA244206, CA242703, CA242545, CA227029, CA254139, CA255498, CA243610, CA228891, CA256240, CA241190, CA226680, CA230797, CA241549); SEQ ID NO. 195: SCVPLR1049B12.g (CA128277, CA128268, CAI13688, CA280120, CA201390, CA126944, CA263569, CA111798, CAI42645, CA11740891); SEQ ID NO. 196: SCVPLR2005G05.g (CA1154175, CA269672, CA2751505, CA196175, CA136519, CA150580, CA111903, CA181691, CA2854115, CA071020, CA199358, CA253634, CA1008865, CA199448, CA229814, CA164912, CA205467, CA104448, CA274931, CA238127, CA130082, CA265998, CA104535, CA110496, CA229735, CA266059, CA151909, CA215144, CA214637, CA175326, CA277166, CA095092, CA166114, CA197942, CA200312, CA187461, CA214780, CA273212, CA110942, CA180970, CA254976, CA243592, CA219837, CA214623); SEQ ID NO. 197: SCVPLR2012A10.g (CA128947, CA084780, CA130173, CA112670, CA081361, CA091553, CA189411, CA074286); SEQ ID NO. 198: SCVPLR2027D02.g (CA139889, CA281733, CA2 766005, CA137157, CA287148, CA196795, CA121234, CA190870, CA121263, CA285555, CA271374, CA218165, CA101129, CA275809, CA219005, CA191396, CA218180, CA218095, CA190921, CA135275, CAI03450, CA132968, CA218924, CA2181085, CA290505, CA1303175, CAI10080, CA143050, CA145955, CA131998, CA143749, CA145806, CAI08915, CAI87045, CA141195, CA140686, CA103304, CA108830, CAI02906, CA219000, CA282088); SEQ ID NO. 199: SCVPRT2074D04.g (CA216242, CA101435, CA1366115, CA237797, CA108537, CA090875, CA145883, CA175433, CA177864, CA145938, CA164642); SEQ ID NO. 200: SCVPRT2081G05.g (CA146516); SEQ ID NO. 201: SCVPRZ2038C12.g (CA116869, CA116232, CA246884, CA229323, CA101842, CA138831, CA095760, CA069655, CA170285, CA195638, CA133601, CA067592, CA291694, CA112695, CA217972, CA273837, CA067665, CA247936, CA144990, CA136455, CA278472, CA142261, CA247884, CA169426, CA136187, CA140235, CA294606, CA290785, CA138166, CA095965, CA169509, CA289245, CA290853, CA238260, CA284373, CA253974, CA274756, CA174589, CA197138, CA089467, CA176404, CA301325, CA176402, CA108223, CA263499, CA089556, CA085065, CA145765, CA209854, CA078829, CA185533, CA284004, CA223109, CA184146, CA196166, CA229320, CA133147, CA231712, CA287218, CA221504, CA153992, CA088034, CA267926, CA178000, CA237734, CA225054, CA203790, CA23298, CA300291, CA278621, CA204937, CA226326, CA100069, CA254749, CA096038, CA129441, CA096280, CA298558, CA246279, CA242469, CA199423, CA299287, CA122008, CA187480, CA240020, CA283618, CA277794, CA273434, CA207921, CA205591, CA138290, CA265687, CA246929, CA084012, CA102242); SEQ ID NO. 202: SCVPRZ2043F09.g (CA154468, CA276289); SEQ ID NO. 203: SCVPRZ3025G09.g (CA166458, CA215142, CA219273, CA067980, CA219244);

[039] Os indivíduos foram selecionados de uma prole F3 de um cruzamento entre os genótipos Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum. Amostras de RNA dos tecidos indicados foram usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A quinta coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações com alto brix e baixo brix. A última coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de baixo contra alto brix. 0 brix médio na população com alto brix foi de 22,82. 0 brix médio na população com baixo brix foi 9,84.

[040] Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SP80-144 e SP85-7215. Amostras de RNA dos tecidos indicados foram usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A quinta coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações com alto brix e baixo brix. A última coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de baixo contra alto brix. O brix médio na população com alto brix foi de 14,36. O brix médio na população com baixo brix foi 8,87. Dois indivíduos foram selecionados de SP83-2847 e dois indivíduos de SP91-1049. Amostras de RNA dos tecidos 20 indicados foram usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A quinta coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de alto brix contra baixo brix. A última coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de baixo contra alto brix. O brix médio em SP91-1049 foi de 20,2. O brix médio em SP83-2847 foi de 16,2.

[041] Dois indivíduos foram selecionados de SP89-1115 e dois indivíduos de SP94-31116. Amostras de RNA dos tecidos indicados foram usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A quinta coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de alto brix contra baixo brix. A última coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de baixo contra alto brix. 0 brix médio em SP89-1115 foi de 19,9. 0 brix médio em SP94-3116 foi de 14,2. Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SP80-180 e 15 SP80-4966. Amostras de RNA dos tecidos indicados foram coletadas de Março a Julho e usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A quinta coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações com alto brix e baixo brix. A última coluna indica as proporções médias (vezes de indução) em comparações de baixo contra alto brix. 0 brix médio na população com alto brix foi de 18,47 em Março, 21,79 em Maio e 22,63 em Julho. 0 brix médio na população com baixo brix foi de 13,66 em Março, 17,59 em Maio e 18,98 em Julho.

Confirmação de Dados de Expressão [042] Reações de PCR em tempo real foram realizadas para confirmar os dados de expressão obtidos, moldes de cDNA foram gerados a partir de um grupo de 8 indivíduos do cruzamento entre variedades comerciais (SP80-180 e SPS0- 4966), dos cruzamentos múltiplos entre os genótipos S. officinarum e S. spontaneum ou de amostras de tecido individuais. RNA de folha ou internódulo derivado de três genótipos HB (CTC98-243, CTC98-246, CTC98-253) e três genótipos LB (CTC98-261, CTC98-265, CTC98-272) (Figura 3).

Os níveis de mRNA para nove SAS mostram alguma variação nos diferentes genótipos e grupos, mas todos os niveis de transcrito estão em concordância com o esperado, baseado nos resultados de microarranj o.

[043] A expressão diferencial dos genes em plantas com alto e baixo teor de açúcar também pode ser confirmada através de hibridização de Northern blot. Quatro genes com maior 20 expressão nas plantas com alto teor de açúcar das proles SP80-180 vs. SP80-4966 (SCSBAM1085B06.g, SCACLR1126E09.g SCEQRZ3020C02. g e SCCCLR1C08G1 O. g) e três com expressão aumentada nas plantas com baixo teor de açúcar (SCSBST3096H04.g, SCEQLB2019B08.g e SCQGLR1085F11.g) foram analisados através de RNA-blots usando RNA total de três indivíduos de cana-de-açúcar para proporcionar replicação das tendências de expressão gênica. A Figura 4 mostra que os dados de microarranjo foram confirmados em pelo menos duas das três amostras independentes coletadas nove meses após plantio, indicando uma alta consistência entre os dois conjuntos de dados.

[044] Para confirmar as tendências de expressão gênica ao longo da estação de crescimento, nós determinamos os níveis de mRNA para os mesmos sete genes nas 7 reservas HS (alto teor de açúcar) e 7 LS (baixo teor de açúcar) coletadas 6, 7, 9, 11 e 13 meses após plantio (Figura 5) . O gráfico representa cada gene organizado para cada população. Os 15 quatro genes que se descobriu serem enriquecidos nas plantas com alto teor de açúcar foram consistentemente expressos diferencialmente ao longo da estação de crescimento (Figuras 5 a-d). Esses genes estão, possivelmente, envolvidos no controle da síntese de sacarose, respondendo pelo maior teor de açúcar nessas plantas secretórias. Os genes com mais transcritos nas plantas com baixo teor de açúcar mostraram um padrão menos consistente (Figuras 5 e-g).

Todos eles foram diferencialmente expressos nas plantas em nove meses após plantio, confirmando a expressão observada pelos microarranjos, mas apenas aquele que codifica dehidrina, uma proteína relacionada ao estresse (Figura 5g) tinha um padrão mais consistente ao longo da estação de crescimento.

Identidade/Função de Genes Diferencialmente Expressos [045] A SAS representadas em nosso arranjo foram escolhidas de 7381 genes catalogados pelo projeto SUCAST (Papini-Terzi e colaboradores, 2005; Souza e colaboradores, 2001) e do Catálogo de genes de metabolismo em cana-de-açúcar SUCAMET (http://sucest-fun.org). 0 Catálogo SUCAST inclui categorias Proteína e Funcional, tais como Receptores, proteínas quinases, proteína fosfatase, Pequenas GTPases, fatores de transcrição, Cálcio, Inositol, Ubiquitinação, Biossíntese de hormônio, Desenvolvimento, Estresse e Patogenicidade, dentre outros. 0 catálogo também contém 548 SAS correspondendo a proteínas hipotéticas ou novos genes para os quais nenhuma função pode ser deduzida unicamente a partir da sequência ou nenhuma similaridade foi encontrada com genes em bancos de dados públicos ("sem equivalentes"). A especificidade tecidual dos genes selecionados foi avaliada em um trabalho anterior (Papini-Terzi e colaboradores, 2005), o qual revelou 217 genes com expressão preferencial em um dos seis tecidos analisados (flores, brotos, folhas, raízes, internódulos maduros e imaturos) e 153 genes altamente abundantes.

[046] Células de mesófilo de folha são o tecido fotossintético primário e fotossintático, principalmente na forma de sacarose, é transportado para os meristemas e órgãos em desenvolvimento. Na cana-de-açúcar, folhas jovens em crescimento e o caule são os principais tecidos de importação de carboidrato. Tecidos de reserva e armazenamento devem ser coordenadamente regulados em nivel de expressão gênica e atividade enzimática para produzir crescimento rápido e acúmulo eficiente de sacarose. Luz e açúcares regulam as atividades de crescimento através de uma modulação coordenada da expressão gênica e atividades enzimáticas em tecidos de exportação de carboidrato (reserva) e importação de carboidrato (armazenamento). A regulação do gene é baseada em captação de diferentes sinais ou estímulos, os quais são, então, transmitidos através de uma via de sinalização que, no final, leva a um aumento ou diminuição de transcrição. Na sinalização do açúcar, a primeira etapa é captar a natureza e nível do açúcar específico. Embora níveis celulares elevados de açúcar regulem genes envolvidos na síntese de polissacarídeos, proteínas de armazenamento, pigmentos, bem como genes associados a respostas de defesa e respiração, a privação de açúcar intensifica a expressão de genes envolvidos na fotossíntese e re-mobilização de reservas, tal como a degradação de amido, lipídio e proteína (Koch, 1996; Yu, 1999; Ho e colaboradores, 2001). Embora o efeito regulatório de açúcares sobre a atividade fotossintética e o metabolismo da planta tenha sido reconhecido há muito, o conceito de açúcares como moléculas de sinalização central é relativamente novo (revisto em Holland e colaboradores, 2002) .

[047] Nesse trabalho, foram avaliados os níveis de expressão de genes SUCAST e SUCAMET em quatro tecidos (folha, internódulos 1, 5 e 9) de três populações de cana-de-açúcar com capacidades contrastantes de acúmulo de açúcar e quatro variedades comerciais. Foi descrito um total de 203 SAS (SEQ ID NOs: 1-203) que diferencialmente expressou entre populações com alto e baixo brix em pelo menos um dos tecidos analisados (Tabelas V a IX). Dois deles apareceram diferencialmente expressos em cinco das amostras analisadas, quatro em quatro, catorze em treze e trinta em duas, totalizando 50 genes para os quais transcritos estão alterados em mais de uma amostra (Tabela X). Os genes diferencialmente expressos pertencem a várias categorias funcionais, incluindo sinalização ao cálcio, respostas a estresse, transcrição e ubiquitinação. Esses genes e suas variantes podem ser usados para prever o teor de açúcar de plantas ou gerar plantas com maior teor de sacarose.

[048] Uma vez que um número significativo de genes que codificam quinases SNFl-relacionadas foi encontrado diferencialmente expresso (veja abaixo), buscaram-se genes diferencialmente expressos que codificam SNFls e seus reguladores em variedades comerciais que variavam quanto ao teor de sacarose. A Tabela XIV lista vários membros dessa família de proteínas, cuja expressão se verificou estar associada ao teor de sacarose.

[049] Em uma abordagem alternativa, amostras de colmo maduro (internódulo 9), intermediariamente maduro (internódulo 5) e imaturo (internódulo 1) foram comparadas. O objetivo dessas comparações foi revelar 30 genes diferencialmente expressos quando internódulos ricos em sacarose foram comparados com os primeiros internódulos ricos em sacarose. Um total de 186 genes foi identificado como regulados pelo desenvolvimento durante maturação do colmo (Tabelas XV a XX). Também se descobriu que quarenta e seis dos mesmos são diferencialmente expressos nas comparações diretas entre alto e baixo brix e dezoito deles estavam alterados em até 5 das amostras analisadas. A Tabela XXI mostra as 18 SAS encontradas diferencialmente expressas em pelo menos duas das amostras biológicas consideradas (os dados referentes a 14 das mesmas foram recuperados de Felix, 2006, conforme indicado na Tabela). SEQ ID NOs: 229-373 se referem às 140 SAS cuja expressão estava alterada em internódulos com alto teor de açúcar, as quais não estão contidas no grupo de SEQ ID NOs: 1-203. Os dados revelados por esse modelo experimental indicam que os genes diferencialmente expressos em plantas com alto vs. baixo brix podem ter um papel em maturação do colmo e podem melhorar esse processo e, consequentemente, alterar o teor de sacarose se alterados em plantas transgênicas.

[050] Existem vários genes que codificam proteína quinases envolvidas na via de sinalização de cálcio alterados em associação com o teor de sacarose. Um (SCEQRT2099H01.g) é similar aos membros da família CDPK (proteína quinase cálcio-dependente) SCBFSB1046D04.g, SCMCRT2103B04.g, SCEQRT2030G04.g, e nove outros SCCCLR1C05B07.g, SCCCLR2C01G07.g, SCSGHR1O70F12.g) às (SCACLR1036B06.g, SCEQLB2019B08.g, SCCCLBJ002D12.g, CIPKs (proteína quinases de CBL-interação) do subgrupo SnRK3 de proteína quinases SNF-semelhantes de planta (Hrabak e colaboradores, 2000) . Foi mostrado que um CIPK14 de Arabidopsis é induzido pela sacarose e elementos responsivos à sacarose em seu promotor foram identificados (Lee e colaboradores, 2005). Vários estudos reportaram que algumas CDPKs e SnRK (quinases SNF1-relacionadas) são capazes de fosforilar e regular a enzima sacarose sintase (Hardin e colaboradores, 2003; Hardin e colaboradores, 2004; Huber e colaboradores, 1996; Zhang e colaboradores, 1999). Quinases relacionadas a SNF1 de planta são reguladas pelas subunidades regulatórias AKEMbetagama (Lumbreras e colaboradores, 2001). Foi descoberto duas SAS que codificam tais subunidades regulatórias putativas de SnRK, SCEQLR1092H10.g e SCJFST1 01lB06.g, o último sendo diferencialmente expresso em sete das amostras analisadas. Foi também descoberto um gene que codifica uma SnRKl (SOJFRZ2032G01.g) sub-regulado em internódulos maduros em relação a internódulos imaturos. SnRKl (proteína quínase-1 Relacionada-SNFl) é uma proteína quinase de planta com um domínio catalítico similar àquele de SNF1 (não-fermentação-1 de sacarose) de levedo e AMPK (proteína quinase AMP-ativada) de animais (Halford e colaboradores, 2003). Carraro e colaboradores, (2001) identificaram pelo menos 22 tags de sequência expressas de cana-de-açúcar (EST) contínuas que codificam SnRKs putativas no banco de dados SUCEST. Estudos levaram à hipótese de que a SnRKl é ativada em resposta a altos níveis de sacarose intracelular e/ou baixo nível de glicose intracelular (Halford e colaboradores, 2003). A primeira proteína de planta a ser identificada como um substrato para SnRKl foi uma HMG-CoA reductase em A. thaliana (Dale e 86 colaboradores, 1995). Subsequentemente, duas outras enzimas importantes, SPS e NR foram mostradas como sendo substratos para fosforilação de SnRKl em sítios de ligação de Ser. Em ambos os casos, a fosforilação resulta em inativação da enzima, embora a inativação de MR e SPS também venha a requerer a ligação de uma proteína 14-3-3 ao sítio de fosforilação (Bachmann e colaboradores, 1996; Moorhead e colaboradores, 1999).

[051] Quatro genes que codificam CIPKs foram verificados como sendo diferencialmente expressos quando internódulos maduros e imaturos foram comparados (SCJFRZ2032C08.g, SCJLRT1023G09.g, SCCCLR1C05B07.g, SCJLRZ1023H04.g) . Os estudos publicados também identificaram dois genes adicionais que codificam CIPKs de SnRK3 SNFl-relacionadas (SCCCLR2C01G07.g e SCMCRT2103B04.g) que são diferencialmente regulados quando internódulos de cana-de-açúcar maduros e imaturos são comparados, que corroboram os presentes dados e confirmam um papel para quinases relacionadas-SNF e seus reguladores na síntese e acúmulo de sacarose (Felix, 2006). Adicionalmente, três genes que codificam quinases relacionadas-SNF1 similares às quinases relacionadas a estresse osmótico (SCCCST1004A07.g, SCEPRZ1009C10.g e SCCCST1006B1.g) também foram verificados como sendo diferencialmente expressos.

[052] CIPKs interagem com proteínas semelhantes à Calcineurina B (CBL) (Shi e colaboradores, 1999). Nós descobrimos seis genes que codificam CBLs no banco de dados SUCEST e trinta e uma CIPKs, vinte e quatro das quais foram analisadas nesse trabalho. Uma calreticulina (SCKFLR2037F09.g) e uma calmodulina (SCUTST3152C08.g) foram verificadas como estando enriquecidas em internódulos LB imaturos e folhas, respectivamente e cinco proteínas de ligação à calmodulina como estando super-reguladas (SCCCAMJOOJA03.g, SCCCLR2C02D03.g, SCEZLB10UF10.g, SCAGLR1043F02.g, SCEQLR1007G03.g, SCCCCL3120G07.g). A sinalização ao cálcio é realizada via alterações da concentração de cálcio e proteínas de captação de cálcio, tais como calmodulina, calcineurina e calreticulina (Sanders e colaboradores, 2002) . A última conta com o sinal à jusante através de cascatas de fosforilação e alterações na expressão gênica. Estudos com a sacarose sintase de milho mostraram que a fosforilação dessa enzima no resíduo Ser-15 pelas CDPKs estimula sua atividade de divagem de sacarose (Hardin e colaboradores, 2003; Huber e colaboradores, 1996). Além disso, CDPKs podem fosforilar em Ser-e objetivar essa enzima para degradação 26Sproteassoma-dependente (Hardin e colaboradores, 2003; Hardin & Huber, 1999). A sacarose sintase está relacionada a vários processos biológicos, incluindo relações de reserva/armazenamento dentro da planta (Hanggi & Fleming, 2001; Zrenner e colaboradores, 1995) e pode contribuir para o acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. Adicionalmente, foi mostrado que algumas quinases cálcio-dependentes podem fosforilar e inativar a sacarose sintase, a qual tem um papel chave na biossíntese de sacarose (McMichael e colaboradores, 1995; Pagnussat e colaboradores, 2002). Tomados juntos, esses resultados sugerem que a biossíntese de sacarose parece ser (pelo menos, parcialmente) um processo SNF1- e cálcio-regulado, genes que codificam as proteínaquinases cálcio-dependentes e quinases relacionadas-SNFl e seus moduladores diferencialmente expressos em nosso estudo podem representar pontos críticos no controle da síntese e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. Consequentemente, esses genes de cana-de-açúcar podem ser usados para aumentar o teor de sacarose em plantas transgênicas.

[053] Para confirmar que a expressão gênica diferencial associada ao teor de sacarose estava, na verdade, refletindo um papel para esses genes na síntese ou acúmulo de sacarose, nós obtivemos plantas transgênicas de cana-de-açúcar onde o gene que codifica CIPK-8 (SAS SCEQLB2019B08.g) foi silenciado através de interferência de RNAi. Calos embriônico de cana-de-açúcar dos cultivares SP80-185, SP94-3116, CTC1, SP83-2847, SP80-1842 e SP91-1049 foram bombardeados através de biolística com um constructo onde 331 bp da SAS SCEQLB2019B08 .g (SEQ ID No. 378) foram clonados na orientação senso e anti-senso. O fragmento de 331 bp foi obtido através de PCR usando os primers SNFL1 (SEQ ID No. 374): 5'-CCCTCTAGACTCGAG CATTCATTCCATTCCGTTCC- 3' e SNFL2 (SEQ ID No. 375): 5'-CCCAAGCTTGAATTC CGCCACCAGTAGCAAATTCT-3'. O fragmento foi digerido com as enzimas Xhol e EcoRI e clonados no vetor pHannibal (Wesley e colaboradores, 2001) digerido com as mesmas enzimas para a orientação senso. 0 mesmo fragmento foi, então, digerido com HindIII e Xbal e clonado no vetor já contendo o constructo senso digerido com as mesmas enzimas para a orientação anti-senso. A Figura 7 mostra um alinhamento de duas sequências de EST adicionais que codificam CIPKs (CIPK-29 SCSGHR1070F12. g e CIPK-1 SCCCCL5001D1. g) que são 95 e 85% idênticas, respectivamente, à região do fragmento CIPK-8 amplificado (linha vermelha) e mostram 65% de identidade global quando as três sequências completas são consideradas. CIPK-29 também foi identificado como diferencialmente expresso quando plantas com alto brix e baixo brix foram comparadas usando microarranjos de cDNA. CIPK-1 não foi detectado por nossos experimentos de arranjo como um gene diferencialmente expresso. Plantas transgênicas foram geradas através de co-transformação do constructo de RNAi pHannibal-CIPK e o vetor pHA9 (Wei e Albert, Patente americana US 6706948), o qual contém o promotor ubil de milho que aciona um gene neomicina fosfotransferase II e o terminador NOS. Para verificar se os níveis de mRNA de CIPK-8 estavam diminuídos nas plantas transgênicas obtidos, os níveis de mRNA de CIPK-8 foram quantificados através de PCR em tempo real. A Figura 8 mostra os níveis de mRNA para CIPK-8 em relação ao gene de referência GAPDH. Os primers de PCR em tempo real usados são listados na Tabela XII. Uma vez que CIPK-29 e CIPK-1 eram muito similares ao CIPK-8, seus níveis de mRNA também foram medidos nas plantas transgênicas. Folhas de quatro plantas do cultivar SP94-3116 transformadas com o constructo de RNAi CIPK-8 e quatro plantas transformadas com os vetores vazios apenas são mostradas. Os dados indicam silenciamento com sucesso para o gene CIPK-8 quando plantas com RNAi CIPK-8 e de controle são comparadas. Os dados também indicam que o constructo introduzido foi capaz de silenciar os genes CIPK-29 e CIPK-1 também. Para confirmar o teor aumentado de sacarose em virtude de silenciamento dos genes, os níveis de açúcar total e redutivo foram determinados através de HPLC (cromatografia de líquido de elevado desempenho). A Figura 8 indica os níveis de sacarose em plantas de controle e com silenciamento de CIPK, bem como a proporção entre sacarose para glicose + frutose. As plantas silenciadas apresentavam, em média, 64, 18 pg de sacarose/mg de peso seco da folha, enquanto que plantas de controle apresentavam 21,95 pg/mg. A proporção de sacarose/glicose+ frutose também foi alterada. Plantas com silenciamento de CIPK apresentavam uma proporção de 6, 81 de sacarose com relação aos monossacarideos, enquanto que as plantas de controle mostravam uma proporção média de 0,57. Isso pode indicar, possivelmente, uma conversão total 12 vezes mais eficiente dos monossacarideos glicose e frutose em sacarose nas folhas de plantas silenciadas.

[054] Uma vez que tanto CIPK-8 e CIPK-29 foram descobertos sendo diferencialmente expressos em folhas de cana-de-açúcar, nós postulamos que as CIPK quinases regulam a síntese de sacarose em cana-de-açúcar. Adicionalmente, CIPKs podem ter um papel na regulação do acúmulo de açúcar nos tecidos de internódulo, uma vez que várias delas foram detectadas como diferencialmente expressas nesses órgãos. Uma vez que o fragmento usado para silenciar CIPK-8 e CIPK- 29 diferencialmente expressos também foi eficiente no silenciamento de CIPK-1, a qual tem uma identidade global ao CIPK-8 e CIPK-29 de 65%, é possível que o uso de genes SNFl-relacionados com identidade aos genes abrangidos pela presente invenção, quer a genes inteiros ou fragmentos dos genes, de pelo menos 65%, mas não restrito a 65%, pode também ser capaz de silenciar os genes abrangidos. A situação inversa também é plausível. Uma vez que o CIPK-1, um gene que não foi detectado em nossos dados de microarranjo como estando associado à sacarose, foi silenciado pelo constructo CIPKB mesmo embora ele apresentasse apenas 65% de identidade de sequência à sua sequência disponível global, é possível silenciar genes associados à sacarose usando genes não relacionados à sacarose similares.

[055] Genes adicionais que podem contribuir para a síntese e acúmulo de sacarose são descritos abaixo. Nós identificamos cinco genes que codificam aquaporinas entre os genes diferencialmente expressos quando plantas com alto brix e baixo brix foram comparadas (SCCCRZ1001F02.g, SCEQRT2100B02.g). SCCCRZ1002E08.g, (SCCCLRJ024C03.g, SCCCST3001H12.g). Em um trabalho anterior, eles foram demonstrados como estando sub-regulados nos internódulos maduros (Felix, 2006). Essa família grande e diversa de proteínas da membrana, também conhecida como MIPs (Principais Proteínas Intrínsecas) está primariamente envolvida na regulação do movimento de água entre células e compartimentos celulares, embora muitas delas também facilitem a passagem de pequenos solutos (rev. Maurel e Chrispeels, 2001; Chaumont e colaboradores, 2005). De acordo com sua localização subcelular, aquaporinas podem ser classificadas como proteínas intrínsecas da membrana plasmática (PIPs) ou proteínas intrínsecas de tonoplasta (TIPs). Os genes de aquaporinas que nós identificamos como diferencialmente expressos caem em ambas essas categorias. O acúmulo de sacarose em tais concentrações altas, conforme observado em células de cana-de-açúcar, certamente representa um desafio osmótico, o qual demanda controle eficiente de compartimentalização de soluto. Como função chave no equilíbrio dos potenciais de água via regulação de permeabilidade da membrana, as aquaporinas podem ter um papel fundamental no processo de armazenamento de açúcar em vacúolos de cana-de-açúcar. Foi observado em Arabidopsis que a perda da aquaporina TIP1.1 afeta gravemente o metabolismo e transporte de carboidrato (Ma e colaboradores, 2004) e os autores postularam que essa aquaporina poderia estar envolvida em um roteamento baseado-vesícula de carboidratos em direção ao vacúolo central. Em virtude da diversidade dos papéis descritos para os membros dessa família, experimentos adicionais são necessários para elucidar os possíveis papéis dessas aquaporinas de cana-de-açúcar no processo de acúmulo de açúcar. Vias de sinalização isoladamente, mas são partes de açúcar redes não operam regulatórias celulares. Resultados recentes mostram claramente a interrelação entre diferentes sistemas de sinalização, especialmente aqueles de açúcares, fito-hormônios e luz. A maioria dos genes relacionados ao estresse são induzidos por frio e estiagem; há também uma ribonuclease que apareceu alterada quatro vezes e uma proteína induzida por ferimento expressada diferencialmente em 5 amostras. Quatro ESTs relacionadas ao estresse de cana-de-açúcar pertencem a uma classe de proteínas hidrofóbicas de baixo peso molecular (LTI) envolvidas em manutenção da integridade da membrana plasmática durante condições de estresse pelo frio, desidratação e sal. Esses genes são ativados por fatores ambientais, tais como desidratação e salinidade e por sinais químicos, tais como ácido abscísico (ABA) (Morsy e colaboradores, 2005). Dezesseis genes diferencialmente expressos codificam fatores de transcrição. Um fator de transcrição AP2/EREBP putativo (SCBGLR1099G02.g) foi mostrado como tendo expressão intensificada em folhas de plantas com alto teor de açúcar. AP2/EREBP formam uma família de fatores de transcrição planta-específicos que contêm um domínio AP2/EREBP (proteína de ligação a elemento responsivo ao etileno), uma região conservada de 60 aminoácidos envolvida em ligação a DNA (Jofuku e colaboradores, 1994; Okamuro e colaboradores, 1993; Riechmann e Meyerowitz, 1998). Fatores de transcrição AP2 estão envolvidos na especificação do órgão floral e identidade de meristema e supressão de indeterminação de meristema floral (Bowman e colaboradores, 1989; Irish e Sussex, 1990; Kunst e colaboradores, 1989; Okamuro e colaboradores, 1993). AP2 também é requerido para desenvolvimento de óvulo e envoltório da semente (Jofuku e colaboradores, 1994; Leon-Kloosterziel e colaboradores, 1994; Modrusan e colaboradores, 1994). Embora a função mais marcante do AP2 seja no desenvolvimento floral, seus transcritos são também detectados em folhas, caules e mudas (Jofuku e colaboradores, 1994), abrindo a possibilidade de funções diversas para diferentes membros da família AP2. Já foi mostrado que mutações em ap2 causam alterações na proporção de hexose para sacarose durante desenvolvimento de semente (Ohto e colaboradores, 2005). Em virtude dessa observação, acredita-se que alvos potenciais de atividade de AP2 possam ser enzimas envolvidas no metabolismo de açúcar. Foi descoberto oito genes CYP-relacionados alterados entre os genes diferencialmente expressos (SCEQRT1026H08.g, SCAGLR1043E04.g, SCACSB1037A07.g, SCUTAM2005B03.g, SCEZHR1087F0 6.g, SCSGFL4193B05.g, SCSGHR1069F04.g, SCQGHR1012B09.g). Citocroma P450 monooxigenases (P450s) são amplamente usadas em vias biossintéticas e de desintoxicação em plantas, incluindo sintese de ligninas, protetores contra UV, pigmentos, compostos de defesa, ácidos graxos, hormônios, moléculas de sinalização, ruptura de compostos tóxicos e endógenos (Schuler e Werck-Reichhart, 2003). Durante maturação de internódulo de cana-de-açúcar, células parenquimais se diferenciam em compartimentos de armazenamento de sacarose altamente especializados. Esse processo impõe à reorganização celular para se conformar ao estresse osmótico e oxidativo e envolve lignificação e suberização progressivas das paredes celulares para impedir invasão por patógeno e perda de água (Kolattukudy, 1984; Jacobsen e colaboradores, 1992), o que pode explicar a predominância de genes relacionados ao estresse (34 SAS) dentre os genes descritos nesse trabalho.

[056] Dezoito SAS diferencialmente expressas codificam a biossintese de hormônio ou genes relacionados a hormônio quando de comparação de plantas com alto brix contra baixo brix ou internódulos com alto brix contra baixo brix (SCCCAM2004G02. g, SCCCCL6002B05.g, SCCCFL4091A07.g, SCCCLR1048D07.g, SCCCLRlC03G01.g, SCCCLR2002F08.g, SCCCRT1001E01.g, SCEQRT1024E12.g, SCEQRT1028H06.g, SCEZLB1009A09.g, SCJFRT1005C11.g, SCJFRT1007H07.g, SCRFLR1012D12.g, SCSBAM1085B06.g, SCSGAM1094D05.g, SCVPLR2012Al 0.g, SCVPRZ2038F04.g, SCVPRZ3025G09.g) . Três codificam a biossintese de ácido salicilico e seis delas codificam genes da biossintese de jasmonato. Duas ESTs que estavam super-reguladas em folhas maduras com alto teor de açúcar (HS) codificam uma ácido graxo Omega-3 desaturase - FAD8. Em plantas superiores, os lipídios da membrana contêm uma alta proporção de ácidos graxos trienóicos (TAs) . Foi sugerido que esses ácidos graxos, especialmente ácido linolênico, são precursores de uma molécula de sinalização relacionada à defesa, jasmonato (JA). Em Arabidopsis, três genes que codificam ácido graxo Omega-3 desaturase, isto é, FAD3, FAD7 e FADB, são responsáveis pela produção de TAs. Estímulos ambientais, tais como ferimento, estresse por sal e invasão de patógeno, os quais levam a um rápido aumento na produção de JA, induzem significativamente à expressão dos genes FAD7 e FAD8 (Nishiuchi e Iba, 1998) . Os dados apontam para um papel da síntese de JA e ácido salicílico no metabolismo de sacarose. Esse é o primeiro relato do envolvimento desses hormônios na síntese de sacarose. Evidência recente sugere que plantas têm muitos tipos diferentes de proteína quinases semelhantes-receptor (RLKs) que podem transduzir informação celular extra na célula. Vinte e uma SAS de cana-de-açúcar que codificam urna RLK foram verificadas como sendo diferencialmente enriquecidas nas plantas com alto teor de açúcar e dezessete quando internódulos maduros e imaturos foram comparados. RLKs foram identificadas a partir de uma série de plantas e foram classificadas em classes baseado em diferentes motivos estruturais encontrados em seus domínios extra celulares. As funções fisiológicas da maioria das RLKs são desconhecidas, mas algumas delas estão envolvidas em resistência à doença e desenvolvimento da planta (Becraft, 2002). Uma SAS homóloga a um gene que codifica um fator de transcrição de Myb-repetição (SCCCLR1C08G10.g), similar ao CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED (CCA1) ou LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), estava super-regulada em folhas maduras com alto teor de açúcar. Acredita-se que CCA1/LHY e TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (T0C1) participem em um ciclo de feedback negativo, o qual é parte de um modelo para o oscilador central no relógio circadiano de Arabidopsis. Em plantas superiores, o relógio circadiano controla o alongamento de hipocótilo, movimentos diários da folha, tempo de floração e o ritmo de fixação de C02 (McClung, 2001) . Um LHY/CCA1 de cana-de-açúcar foi verificado como estando enriquecido nos indivíduos com alto teor de anticorpo e esse perfil de expressão também foi observado por toda a estação de crescimento. Em tomate, Jones e Ort (1997) demonstraram que o ritmo circadiano controla a sincronização de atividade de fosfatase da síntese de sacarose-fosfato a qual, por sua vez, determina a ativação de sacarose fosfato sintase (SPS). A SPS catalisa a conversão de UDP-glicose e frutose-6-fosfato em sacarose-6-fosfato, a segunda etapa na biossíntese de sacarose (Huber e Huber, 1996). Pathre e colaboradores, (2004) demonstraram que a variação diurna observada na atividade de SPS não era em virtude de qualquer ritmo intrínseco, mas em virtude de alterações transitórias em condições ambientais, tais como irradiação e temperatura. Quando o relógio circadiano estava corretamente sincronizado com o ambiente, plantas Arabidopsis apresentavam fotossíntese e crescimento aumentados (Dodd e colaboradores, 2005). A EST de cana-de-açúcar foi expressa principalmente em folhas maduras e imaturas, broto lateral e flor, mas também apresentava uma fraca expressão em internódulos imaturos e raízes (não mostrado). Nós supomos que o perfil de expressão de transcritos relacionado LHY/CCA1 a uma em plantas vantagem HS podería estar f otossintética e, consequentemente, uma fixação de carbono intensificada. LHY/CCA1 pode controlar a transcrição de uma proteína fosfatase que, subsequentemente, ativa a enzima SPS, aumentando a síntese de sacarose.

[057] Duas SAS que codificam proteínas 14-3-3 (SCEQRT1025D06.g e SCEQRT1031D02.g) foram verificadas como sendo mais expressas em folhas maduras da população com baixo teor de açúcar e quatro estavam sub-reguladas em internódulos maduros (SCCCRZ1001D02.g, SCCCLR1022D05.g, SCEQRT1025D06.g, SCEQRT1031D02.g). Relatos recentes destacaram a importância dessas proteínas adaptadoras em vias metabólicas de planta (Feri, 2004). Foi sugerido que os membros dessa família afetam a fixação de nitrato através de regulação da nitrato reductase (NR) e metabolismo de carboidrato através de ligação à SPS. Essa enzima tem vários sítios de fosforilação putativos que regulam sua atividade através de mecanismos dependentes e independentes de 14-3-3. Eventos não-14-3-3 incluem fosforilação de SPS sobre Ser-424 e Ser-158, a qual acredita-se que seja responsável pela modulação claro/escuro e ativação de estresse osmótico da enzima ((McMichael e colaboradores, 1993; Toroser e Huber, 1997). Contudo, há uma interação regulatória sítio-específica entre proteínas 14-3-3 e Ser-229 de SPS de espinafre, a qual inibe a atividade de SPS (Toroser e colaboradores, 1998). Esse nódulo regulatório provavelmente é o mesmo que ocorre na regulação de NR. Em seu estado não fosforilado, a SPS é ativa. A fosforilação por uma quinase (por exemplo, SNF1, Bachmann e colaboradores, 1996; Moorhead e colaboradores, 1999) não inativa a SPS, mas rotula a enzima para ligação de 14-3-3, o que completa a transição sinal induzida para inativação. A SPS que é fosforilada e ligada pelas 14-3-3s podem ser inativadas diretamente de uma maneira reversível ou podem ser desestabilizadas e submetidas à proteólise (Sehnke e colaboradores, 2002; Comparot e colaboradores, 2003) . Tem sido reportado que, durante privação de açúcar, alvos para proteínas 14-3-3 são degradados por proteases; a função disso não está clara, 15 mas foi sugerido que representa uma válvula de segurança para regulação metabólica (Cotelle e colaboradores, 2000) . Vários grupos de pesquisa reportaram o impacto de proteínas 14-3-3 sobre o metabolismo. Superexpressão de proteínas 14-3-3 em batata induziu a um aumento nos teores de catecolamina e açúcares solúveis em folhas, enquanto que um experimento anti-senso com 14-3-3 aumentou o teor de amido em tubérculo, atividade de NR e composição de aminoácido (Prescha e colaboradores, 2001; Swiedrych e colaboradores, 2002) . Além disso, Zuk e colaboradores, (2003) observaram um aumento significativo nas atividades de SPS e NR de batata quando todas as seis isoformas de 14-3-3 foram reprimidas.

[058] Existem três enzimas envolvidas na via biossintética de lignina: cinamoíla-coenzima A reductase (CCR), álcool cinamílico dehidrogenase (CAD) e ácido cafeico 3-0-metiltransferase (COMT) . Uma SAS que codifica uma COMT (SCRFLR1012F12.g) foi verificada como sendo diferencialmente expressa em quatro amostras diferentes. Ligninas são polímeros fenólicos encontrados nas paredes celulares secundárias de plantas vasculares. Elas exercem um papel importante através de redução da permeabilidade da parede celular à água e proporcionam resistência mecânica e defesa contra ferimento e infecção (Lewis e Yamamoto, 1990). A importância da biossintese de lignina como processo dominante na maturação de caules de cana-de-açúcar foi observada por Casu e colaboradores (2004). O parênquima de armazenamento dos internódulos em maturação no caule de cana-de-açúcar é extensivamente lignificado e Jacobsen e colaboradores (1992) propuseram que esse processo é equivalente ao aumento no teor de sacarose observado em internódulos maduros. Essa lignificação podería proporcionar defesa contra ferimento e infecção para essas plantas. Baixos níveis de lignina poderíam, por outro lado, levar a um alto acúmulo de sacarose ou COMT podería ter uma função adicional na síntese ou acúmulo de sacarose que não foi anteriormente identificada. Para testar essa hipótese e confirmar que expressão diferencial do gene de COMT associada ao teor de sacarose estava, na verdade, refletindo um papel para esses genes na síntese ou acúmulo de sacarose, nós obtivemos plantas transgênicas de cana-de-açúcar onde a SAS SCRFLR1012F12.g foi silenciada através de expressão anti-senso. Calos embriônico de cana-de-açúcar dos cultivares SP83-2847, SP91-1049, SP80-185, CTC1 e CTC5 foram bombardeados através de biolística com um constructo onde um fragmento de 535 bp da SAS SCRFLR1012F12.g (SEQ ID No. 380) foi clonado na orientação anti-senso no sítio BamHI do vetor pAHC17. O fragmento de 535 bp foi obtido através de PCR usando os primers COMT(AS)pAHC17 dianteiro (SEQ ID No. 376): 5'CGCGGATCCGACGTCGTCAAGTGCCAGAT3' e COMT(AS)pAHC17 reverso (SEQ ID No. 377): 5'CGGGATCCGCGTTGGCGTAGATGTAGGT3'. 0 fragmento foi digerido com a enzima BamHI, clonado no vetor pAHC17 (Christensen e Quail, 1996) digerido com a mesma enzima e os clones foram sequenciados para identificar um constructo onde o inserto estava na orientação anti-senso. Plantas transgênicas foram geradas através de co-transformação do constructo COMT(AS)/pAHC17 e o vetor pHA9 (Wei e Albert, Patente Americana US 6706948). Para verificar se os níveis de mRNA de COMT SCRFLR1012F12.g estavam diminuídos nas plantas transgênicas obtidas, os níveis de mRNA de COMT foram quantificados através de PCR em tempo real. A Figura 9 mostra os níveis de mRNA para SCRFLR1012F12.g em relação ao gene de referência GAPDH em plantas da variedade SP83-2847 transformadas com o constructo COMT (AS) pAHC17. Os primers de PCR em tempo real usados são listados na Tabela XII. Folhas de cinco plantas transformadas com o constructo anti-senso COMT e cinco plantas transformadas com os vetores apenas são mostradas. Os dados indicam silenciamento com sucesso para o gene COMT quando plantas de controle e anti-senso são comparadas. Para verificar se silenciamento dos genes levaria a um teor aumentado de sacarose, os níveis de açúcar total e redutivo foram determinados através de HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). A Figura 9 indica os níveis de sacarose em plantas com COMT silenciado e de controle, bem como a proporção entre sacarose para glicose + frutose. As plantas silenciadas apresentaram, em média, 29,34 pg de sacarose/mg de peso seco da folha, enquanto que as plantas de controle apresentavam 20,7 pg/mg. A proporção de sacarose/glicose + frutose também estava alterada. Plantas silenciadas com COMT apresentavam uma proporção de 1,74 de sacarose com relação aos monossacarideos, enquanto que as plantas de controle mostraram uma proporção média de 0,71. Isso pode indicar, possivelmente, uma conversão global 2,4 vezes mais eficiente dos monossacarideos glicose e frutose em sacarose nas folhas de plantas silenciadas.

[059] Sinais podem ser percebidos e amplificados na membrana celular por receptores acoplados a uma variedade de vias de sinalização, incluindo a via de inositol 1, 4, 5-trifosfato (IP3). Esse mensageiro secundário é produzido a partir da hidrólise de 4, 5 bisfosfato de fosfatidilinositol e eleva os níveis de Ca2+ no citosol (Berridge, 1993). A inositolpolifosfato 5-fosfatase (5Ptases) compreende um grupo grande de enzimas que podem hidrolisar 5-fosfatos a partir de uma variedade de inositol fosfato, tal como IP3 (Majerus 15 e colaboradores, 1999). Existem quatro genes que codificam enzimas do metabolismo de inositol alterado em nossos dados (SCRULB1060F05.g, SCSBST3096H04.g, SCCCLR1C02FO7.g, SCCCRZ2001A10.g) quando plantas com alto brix e baixo brix foram comparadas e uma fosfolipase C (SCSBHR1052C05.g) sub-regulada em internódulos ricos em açúcar. Derivados de inositol podem estar envolvidos na modulação dos níveis de Ca2+ e existem muitas evidências para um papel do Ca2+ em sinalização de açúcar (revisto por Rolland e colaboradores, 2002, veja acima).

[060] Na cana-de-açúcar, o uso de ancestrais selvagens como um meio de incorporar novos traços ou melhorar a variabilidade em um programa de cultura bem estabelecido algumas vezes requer um pouco de atenção e cuidado do produtor. Tais parentais podem trazer uma grande proporção de variação inferior aos híbridos comerciais atuais e provavelmente o teor de açúcar é pobre. Os cruzamentos e seleções feitos nesse estudo objetivaram produzir variabilidade no teor de açúcar, introduzindo novos genes que existem em ancestrais selvagens e que nunca tinham sido explorados no desenvolvimento de variedades comerciais híbridas. 0 objetivo final foi, uma vez que uma grande variabilidade foi criada a partir de estudos de introgressão, realizar análise de segregação volumosa em extremos da população para identificar eventualmente genes que poderíam estar relacionados ao teor de açúcar. Foi mostrado que os marcadores identificados nesse trabalho são úteis para analisar cruzamentos entre indivíduos a partir do estudo de introgressão e cultivares de elite e acompanhar genes relacionados ao teor de açúcar proveniente de ancestrais selvagens.

[061] É digno de nota que o uso de germoplasma selvagem dos genótipos S. officinarum e S. spontaneum tenha permitido a seleção de materiais mais divergentes do que os cruzamentos entre as variedades comerciais. A faixa de teor de brix de 8,6 (o indivíduo extremo para LB) a 23,9 (o indivíduo extremo para HB) nunca poderia ser atingida usando prole derivada de cruzamentos convencionais. Essa é uma população valiosa para uso em estudos de sacarose. Os resultados produzidos provavelmente são diferentes daqueles que poderiam ser obtidos com populações derivadas de cruzamentos entre variedades comerciais, com maior teor de brix, mas com fenótipos não tão contrastantes.

[062] Essa abordagem descreveu dados produzidos e marcadores moleculares a serem usados em programas de cultura, na caracterização de plantas transgênicas criadas para conter mais sacarose e/ou usadas como genes candidatos para manipulação genética em plantas transgênicas ou plantas não transgênicas de forma a melhorar o teor de açúcar de variedades comerciais. Alterações em mais de uma expressão gênica são mais significativas, enquanto que alterações em três ou um número maior de genes são altamente significativas quando se busca por marcadores moleculares, mas foi mostrado que um padrão de expressão de apenas um gene é útil na caracterização de uma planta ou população de plantas com relação ao teor de sacarose. Adicionalmente, silenciamento de dois genes diferencialmente expressos através de interferência de RNA e expressão anti-senso provou ser útil no desenvolvimento de plantas transgênicas com teor aumentado de sacarose. É muito provável que alterações nos niveis de transcrito sejam acompanhadas por alterações nos níveis de proteína codificadas pelos genes, assim, a quantificação das proteínas correspondentes também pode ser usada para identificar plantas com capacidades contrastantes de acúmulo de sacarose. Medições do teor de glicose podem acompanhar medições de expressão gênica e ser complementares na definição de plantas com expressão gênica favorável ao acúmulo de sacarose. Esses indivíduos podem ser cruzados e ciclos de seleção, com o auxílio de marcadores, podem seguir cada geração para produzir plantas que produzem mais sacarose.

Tabela XIII Lista de Sequências Montadas de cana-de- 15 açúcar (SAS) e suas SEQ ID Nos.

[063] O número de acesso ao Genbank EST está entre parênteses. A SEQ ID No. se refere aos identificadores na listagem de sequência. As ESTs listadas montadas na sequência indicada e deverão ser consideradas como um transcrito. Cada SAS é diferencialmente expressa entre plantas com baixo e alto teor de sacarose ou entre tecidos de internódulo de alto e baixo teor de sacarose. SEQ ID No. 229: SCACLR1057C07.g (CA073791, CA220104, CA175807, CA173305, CA161664, CA208707, CA275831, CA082360, CA232127, CA208522, CA082500, CA158772, CA254078, CA154812, CAI68711, CA265487, CA216423, CA082097, CA282869, CA163131, CA242148, CA116387, CA088301, CA205272, CA216758, CA083652, CA178498, CA275830, CA164981, CA173335, CA257615, CA239707, CA164577, CA085299, CA209305, CA191774, CA082901, CA206163, CA219544, CA256136, CA242861, CA087944, CA219617, CA172548, CA089365, CA242929, CA296024, CA211326, CA077845, CA065159, CA220037, CA078282, CA17630, CA087014); SEQ ID No. 230: SCACLR1130D02.g (CA100457, CA108544, CA104245, CA139305, CA183555, CA184261, CA075000, CA116753, CA124475, CA107618); SEQ ID No. 231: SCACLR1130H08.g (CA285355, CA296620, CAI90345, CA236470, CA199128, CA223158, CA296543, CA237253, CAI16793, CA223246, CA275687); SEQ ID No. 232: SCACLR2022H05.g (CA185596, CA107538, CA278239, CA142728, CA095392, CA190254, CA255382, CA118885, CAI86426, CA242032, CA083853, CA088965, CA186503, CA072676, CA246552, CA088959, CA292397, CA269566, CA163748, CA243048, CA287796, CA095283, CA194496, CA285226, CA102940, CA265718, CA242052, CA194677, CA157478, CA238095, CA282663, CA127731, CAI04186) ; SEQ ID No. 233: SCAGLR1021G10.g (CA184947, CA241174, CA116948, CA235280, CA148829, CA187937, CA290068, CA148916, CA253948, CA153438, CA200242, CA288775, CA242709, CA242784, CA147421, CA150935, CA110552, CA234507, CA277424, CA072428, CA220958, CA221034, CA26122, CA220980, CA225630, CA215861, CA229847, CA275017, CA229919, CA227414, CA289769, CA239844, CA184991); SEQ ID No. 234: SCBFAD1046D01.g (CA284358, CA285672, CA258515, CA260599, CA285724, CA284423, CA065523, CA269123); SEQ ID No. 235: SCBGFL3095D08.g (CA230968, CA243310, CA230887); SEQ ID No. 236: SCBGFL4052C11.g (CA221542, CA181746); SEQ ID No. 237: SCBGFL4053F12.g (CA2193 96, CA221898); SEQ ID No. 238: SCBGLR1096C08.g (CA190075, CA236012, CA290681, CA281821, CA111779, CA102S57, CA224586, CA290611, CA245672, CA118621, CA219281, CA212792, CA118254, CA239357, CA123219, CA245691); SEQ ID No. 239: SCBGLR1117A05.g (CA069967, CA206454, CA115471, CA222775, CA300103, CA216451, CA069882, CA240610, CA121419, CA253181, CA119047); SEQ ID No. 240: SCCCCL2001B01.b (CA075874, CA110039, CA262153, CA138938, CA222746, CA206852, CA195629, CA065975, CA111213, CA243704, CA139758, CA067579, CA228104, CA112899, CA219971, CA159289, CA067652, CA243309, CA260244, CA136110, CA260251, CA265770, CA20743, CA141173, CA260652, CA108966, CA233446, CA109052, CA266455, CA264812, CA196943, CA065789, CA204592, CA065874, CA228837, CA267875, CA067584, CA114662, CA219472, CA219452, CA067658, CA093038, CA235273); SEQ ID No. 241: SCCCCL4003D08.g (CA064615, CA239044, CA246974, CA074795, CA290714, CA074872, CA094033, CA095138, CA183882, CA249457, CA102981, CA172565, CA263531, CA183925, CA255937, CA084305, CA285149, CA085127, CA228150, CA248344, CAO64 616, CA29064 6); SEQ ID No. 242: SCCCCL4004A10.g (CA101534, CA147302, CA227522, CA219008, CA114047, CA177473, CA250309, CA131850, CA222728, CA096239, CA121915, CA209925, CA174118, CA158138, CA264731, CA219404, CA241947, CA239850, CA139416, CA088821, CA149323, CA075509, CA192414, CA168488, CA070307, CA191927, CA227992, CA191529, CA2 67 24 6, CA213285, CA250111, CA258031, CA224522, CA122970, CA072224, CA082052, CA098902, CA098895, CAO94073, CA296040, CA238636, CA098164, CA237674); SEQ ID No. 243: SCCCCL4004C06.g (CA184820, CA224856, CA126504, CA232891, CA206438, CA212819, CA232897, CA214257, CA10119, CAO82190, CA167693, CA214057, CA300033, CA094090, CA252628, CA167758, CA111995, CA074267, CA228379, CA211130, CA249343, CA209709, CA085064, CA202861, CA119928, CA225134, CAI64339, CA225122); SEQ ID No. 244: SCCCCL4007H07.g (CA259044, CA299572, CAI72510, CA266911, CA094384, CA217028, CA119215, CA269647, CA187053, CA288923, CA172798, CA216961, CA180079, CA300646, CA298791); SEQ ID No. 245: SCCCCL5002B10.g (CA221338, CA161278, CA221548, CA126743, CA176053, CA095223, CA158980, CA175702, CA137305, CA108318); SEQ ID No. 246: SCCCCL5004D02.g (CA192143, CA236211, CA277456, CA238363, CA207316, CA083476, CA300881, CA105556, CAI67444, CA195960, CA101127, CA174295, CA171982, CA179165, CA082796, CA095389, CA299706, CA235517, CA171513, CA297597, CA079747, CA159787, CA097371, CA079116); SEQ ID No. 247: SCCCFL4091A07.g (CA223439, CA251804, CA235024); SEQ ID No. 248: SCCCHR1004D03.g (CA286507, CA215612, CA183433, CA065784, CA175929, CA102729, CA205573, CA264021, CA158422); SEQ ID No. 249: SCCCHR1004H09.g (CA198695, CA218094, CA240658, CA183261, CA257018, CA185072, CA107735, CA165864, CA162193, CA280279, CA102770, CA238555, CA267028, CA131832, CA257098); SEQ ID No. 250: SCCCLB1023E12.g (CA179300, CA198187, CAO 88499, CA224987, CA116260, CA238936, CA132328, CA210346, CA300142, CA158693, CA092253, CA271421, CA241178, CA182283, CA089207, CA194934, CA092199, CA296333, CA075354, CA224675, CAO 84007, CA113237, CA296334, CA066934, CA136894, CA192584, CAI11805, CAO 67884, CA211313, CA216712, CA092778, CA066873, CAO98107, CA280346, CA144921); SEQ ID No. 251: SCCCLB2004C08.g (CA279906, CA261059); SEQ ID No. 252: SCCCLR10OÍDIO.g (CA249418, CA083581, CA252565, CA087780, CA12 632 9, CA116150, CA256293, CA189955, CA208608, CA189961, CA239503, CA122010, CA180875, CA107889, CA265080, CA154811, CA250574, CA288166, CA276490, CA203244, CA208413, CA209900, CA124777, CA289690); SEQ ID No. 253: SCCCLR1022D05.g (CA199003, CA295779, CA243427, CA242039, CA202852, CA128804, CA079318, CA079910, CA281772, CA281793, CA250251, CA140942, CA081545, CA084937, CA074621, CAIO6617, CA181947, CA091378, CA2471Q7, CA140865, CA148961, CA086118, CA235025, CA111400, CA130075, CA114483, CA193046, CA087052, CA275872, CA119131, CA224651, CA240046, CA295949, CA255246, CA231690, CA222739, CA130833, CA189913, CA216812, CA152690, CA129200, CA094241, CA087758, CA300112, CA099509, CA295694, CA152604, CA289169, CA275873, CA100849, CA151157, CA278748, CA126737, CA219267, CA143476, CA217366, CA188937, CA149217, CA129933, CA230200, CA088938, CA121701, CA110053, CA143403, CA217293, CA276362, CA230113, CA155717, CA228428, CA066322, CA148305, CA273294, CA125293, CA279142, CA133423, CA190364, CA241302, CA109003, CA171238, CA124306, CA288895, CA152905, CA137901, CA241224, CA171157, CA189103, CAO73313, CA280288, CA222537, CA244293, CA195698, CA284927, CA244221, CA240565, CA131978, CA143850, CA147045, CA116042, CA273851, CA118529, CA250276, CA114167, CA092744, CA111595, CAO82835, CA283118, CA119664, CA090489, CA243388, CA139738, CAI98502, CA074106, CA241811, CA193935, CA090417, CA144601, CA242944, CA263741, CA242878, CA181943, CA100925, CA154899, CA255036, CA298711, CA255877, CA231477, CA301130, CA079473, CA293695, CA249587, CA201652, CA270939, CA092502, CA231391, CA142524, CA293643, CA155896, CA272121, CA148488, CA249518, CA295765, CA227150, CA169631, CA100111, CA173458, CA219272, CA067413, CA086035, CA169552, CA238069, CA227079, CA101601, CA280785, CA264367, CA118824, CA220340, CA116614, CA118307, CA072726, CA255181, CA143851, CA128705, CA142362, CA230449, CAI31091, CA251477, CA151152, CA192477, CA124603, CA092380, CA126294, CA071894, CA300717, CA179264, CA233938, CA126045, CA293018, CA283292, CA168278, CA162958, CA202235, CA266711, CA131176, CA119234, CA111790, CA232293, CA175336, CA092372, CA232205, CA247106, CA117673, CA297133, CA073144, CA227288, CA150142, CA297060, CA139824, CA205064, CA116036, CA202889, CA215601, CA296581, CA119907, CA144265, CA192882, CA298102, CA198270, CA216807, CA182514, CA128480, CA105914, CA108571, CA177022, CA232110, CA128410, CA125896, CA232195, CA289717, CA295716, CA301502); SEQ ID No. 254: SCCCLR1022H07.g (CA256002, CA153512, CA119708, CA201590, CA232582, CA203039); SEQ ID No. 255: SCCCLR1024E11.g (CA236213, CA119421, CA239312, CA087963, CA236209, CA093728, CA121529, CA144287, CA110967, CA120342, CA078164); SEQ ID No. 256: SCCCLR1024F10.g (CA248370, CA191668, CAI74627, CA136231, CA240508, CA146036, CA228222, CA220265, CA237574, CA268 651, CA242965, CA146965, CA237607, CA243057, CA268723, CA266000, CA163172, CA150009, CA235949, CA119432, CA132957, CA153279, CA074733, CA155267, CA134767, CA153353, CA208681, CAO 74819, CA174997, CA294180, CA298533, CA251324, CA105997, CAO66993, CA203286, CA291734, CA274193, CA071109, CA071088, CA249083, CA208769, CA177604, CA106088, CA067069); SEQ ID No. 257: SCCCLR1068G11.g (CA132953, CA232759, CA292317, CA213697, CA232845, CA242579, CA071844, CA133612, CA213781, CA124103, CA281045, CA243542, CA268384, CA080234, CA228260, CA112544, CA220447, CA238600, CA120333, CA130280, CA222523, CA085868, CA238048, CA289325, CA085954, CA289237, CA290116, CA252889, CA230658, CA175174, CA133538, CA246442, CA230739, CA133616, CA111266, CA080878, CA127449, CA113622, CA130344, CA225351, CA239513, CA2 062 59, CA289382, CA246811, CA191694, CA129517, CA257025, CA108272, CA257105, CA089953, CAO82439, CA285102, CA090031, CA220448, CA120037, CA296110, CA233332, CA189423, CA246856, CA247427, CA116596, CA233412, CA246807, CA224412, CA299018, CA126355, CA221362, CA298715, CA128521, CA077715, CA242434, CA071472, CA128603, CA071560, CA123524, CA236982, CA139104, CA120188, CA248016); SEQ ID No. 258: SCCCLR1072E03.g (CA149803, CA140849, CA154999, CA217167, CA149970, CA197516, CA179657, CA113459, CA2054 66, CA299206, CA119586); SEQ ID No. 259: SCCCLR1072H06.g (CA293008, CA292012, CA208082, CA212163, CA095120, CA250666, CA095061, CA250751, CA266742, CA140748, CA299559, CA221625, CA199195, CA280252, CA249305, CA283511, CA119620, CA27 3507, CA284119); SEQ ID No. 260: SCCCLR1C04E03.g (CA295762, CA246851, CA247540, CA295704, CA250739, CA076585, CA129498, CA250812, CA189759, CA153500, CA182502, CA273004, CA180831, CA225947, CA295943, CA137602, CA283935, CA137601, CA225870, CA276088, CA239790, CA125960, CA283930, CA08S833, CA236700, CA129446, CA206958, CA219091, CA204694, CA114854, CA164705, CA133070, CA264948, CA076438, CA151018, CA121378, CA288667, CA166549, CA127343, CA076524, CA120880, CA267188, CA205607, CA228116, CA137280, CA117418, CA237518, CA182380, CA235506, CA203663, CA075662, CA113908, CA202142, CA156760, CA117805, CA156119); SEQ ID No. 261: SCCCLR1C07B07.g (CA281556, CA102608, CA183206, CA267464, CA216559, CA126478, CA178227, CA224781, CA220964, CA230932, CA196879, CA111576, CA159229, CA285341, CA284646, CA159313, CA267717, CA089742, CA228165, CA120559, CA267804, CA296594, CA117476, CA283020, CA291172, CA296665, CA280265, CA248548, CA090139, CA141203, CA131303, CA142862, CA269709, CA074994, CA141285, CA106243, CA141103, CA189990, CA266648, CA120035, CA134522, CA157584, CA118179, CA243432, CA210686, CA238135, CA248480, CA127949, CA290279, CA178232, CA290337, CA279227, CA148788, CA277386, CA292004, CA163922, CA248059, CA148876, CA216395, CA163999, CA249878, CA222979, CA080867, CA288178, CA267417, CA113988, CA112566, CA225163, CA249795, CA224169, CA267504, CA160144, CA199747, CA296541, CA207876, CA173201, CA127744, CA257183, CA270601, CA186974, CA244929, CA121034, CA245946, CA094024, CA249521, CA257253, CAI65727, CA270682, CA109618, CA165164, CA137020, CA283548, CA274874, CA165279, CA281754, CA280871, CA079423, CA238032, CA228443, CA157012); SEQ ID No. 262: SCCCLR2001E10.g (CA262799, CA127278, CA280201, CA287309, CA089562, CA078214, CA077866, CA287533, CA211102, CAI80904, CA089473, CA074528, CA079677, CA082818, CA118437, CA269971, CA092559, CA247542, CA285807, CA091331, CA277276, CA271301, CA072671, CA263353, CA205812, CA280164, CAI16982, CA073860, CA263266, CA116704, CA089413, CA158170, CA173734, CA180319, CA163659, CA1637 66, CA124561, CA278597, CAO 72426, CA178645, CA271786, CA264556, CA120664, CA112499, CA185831, CA084497, CA160409, CA083810, CA113314, CA160061, CAI87809, CA189668, CA238848, CA163841, CA114235, CA165641, CA121314, CA129676, CA263145, CA279135, CA177340, CA174900, CA152748, CA102472, CA112114, CA188798, CA077061, CA185135, CA077762, CA116858, CA178901, CA147468, CA188663, CA177888, CA274039, CA118008, CA273237, CA174048, CA264113, CA088386, CA281646, CA157750, CA190335, CA175668, CA270524, CA154487, CA121143, CA180710, CA181093, CA091054, CA127015, CA187162, CAO92675, CA291128, CA106777, CA088977); SEQ ID No. 263: SCCCLR2002D04.g (CA074921, CA117323, CA243313, CA211783, CA127099JCA286494, CA075012, CA073105, CA128761, CA12837 6, CA128367, CA243946, CA122696, CA128446, CA230627, CA198414, CA298411, CA122974, CA238383, CA216280, CA230711, CA209970, CA118723, CA241869, CA123055, CA088133, CA241946, CA125071, CA124739, CA240999, CA119298, CA080587, CA112133, CA270423, CA241082, CA292850, CA114123, CA226786, CA257737, CA149929, CA120520, CA202694, CA120498, CA123517, CA073839); SEQ ID No. 264: SCCCLR2002G09.g (CA116535, CA124657, CAI16605, CAI16498, CA072958, CA257354, CA247799, CA235108, CAI03542, CAI12157, CA224839, CA257438, CA123168, CA252080, CA080895, CAI02459, CA238997, CA081185, CA236648, CA078277, CA081264, CAI12560, CA112156, CA239544, CA125043, CA088777, CA248898, CA118825, CA107504, CA118646, CA248977, CA140223, CA203859, CA115827, CA103133, CA115782, CA122771, CA074515, CA229803, CA116712, CA123493, CA085075, CA122840, CA073424, CA229900, CA200897, CA073545, CA115514, CA072446, CA232187, CA072969, CA110011, CA073999, CA245664, CA298980, CA125253, CA072002, CA213810, CA190056, CA230875, CA115022, CA101040, CA230956, CA228508sCA280886, CA102455, CA245446, CA126608, CA245426, CA097164, CA243299, CA116857, CA140025, CA257680, CA101571, CA116664, CA130312, CA105336, CA129039, CA256731, CAO 952 94, CA256654, CA110599, CA073864, CA115403, CA127138, CA227390); SEQ ID No. 265: SCCCLR2C03D05.g (CA147771, CA241187, CA239901, CA282278, CA280090, CA263518, CA278293, CA187784, CA242098, CA244500, CA117444, CA243119, CA220678, CA181765, CA163903, CA182831, CA154699, CA250434, CA142468, CA127482, CA115131, CA226443, CA230328, CA129679, CA250352, CA272571, CA121245, CA246334, CA263117, CA247571, CA186969, CA152166, CA198196, CA112365, CA257624, CA204733, CA194041, CA181847, CAI55624, CA240278, CA201864, CA181440, CA277850, CA181770, CA230413, CA128431, CA142473, CA187851, CA163982, CA128359, CA129154, CAI53759, CA163714, CA129531, CA167236, CA226189, CA287855, CA203879, CA27 4284, CA260310, CA124731); SEQ ID No. 266: SCCCRT1001E12.g (CA262088, CA264485, CA209806, CAI14408, CA194065, CA206359, CA254730, CA178254, CAI66387, CA132375, CA092696, CA092563, CA126173, CA092562, CAI90880, CAI70137, CA102870, CA190269, CA119262, CA089823, CA213508, CAI44221, CA183640, CA130410, CA064605, CA298178); SEQ ID No. 267: SCCCRT2001H11.g (CA236346, CA191174, CA300423, CA105281, CA230838, CA137439, CA200619, CA195246, CA213844, CA181724, CA108176, CA092614, CA228948, CA200693, CA203186, CA209467, CA187262, CA240256, CA241667, CA299526, CA262309, CA143552, CA295095, CA254981, CA220456, CA236075, CA235832, CA300428, CA250139, CA254632, CA243208, CA293154, CA294205, CA250212, CA269402, CA261591, CA294137, CA201093, CA243170, CA291895, CA256863, CA256942, CA166864, CA241994, CA182531, CA254163, CA196827, CA137128, CA262306, CA073149, CA245330); SEQ ID No. 268: SCCCRT2002B03.g (CA220568, CA243112, CA230852, CA160770, CA180268, CA272704, CA230939, CA137141, CA244400); SEQ ID No. 269: SCCCRZ1001A09.g (CA212821, CA074667, CA146782, CA272930, CA107169, CA260410); SEQ ID No. 270: SCCCRZ1001C12.g (CA117861, CA182890, CAI38133, CAO96667, CA183036, CA276095, CA167830, CA099489, CA192252, CA137344, CA125255, CA251500, CA229153, CA082252, CAI11079, CA181249, CA071519, CA298523, CA198397, CA146190, CAI80974, CAO71438, CA170017, CA071603, CA244468, CA086723, CA146809, CAI79822, CA163106, CA139751, CA194118); SEQ ID No. 271: SCCCRZ1001D02.g (CA227562, CA113855, CA074155, CA273171, CA244452, CA244374, CA144616, CA220668, CA244135, CA208913, CA197975, CA269055, CA125771, CA281706, CA285773, CA300153, CA154032, CA245267, CA239706, CA146811, CA248711, CA179814, CA194730, CA268428, CA113399, CA242036, CA227897, CA122687, CA082472, CA299324, CA082329, CA292801, CA292314, CA247082, CA260871, CA222252, CA233879, CA130465, CA140466, CA200065, CA073081, CA114463, CA192580, CA296734, CA269090, CA243519, CA078544, CA228562, CA169691, CA177628, CAI12868, CA205245, CA269027, CA080412, CA240406, CA146360, CA229125, CA161211, CA230974, CA300322, CA295571, CA121414, CA151083, CA230896, CA232918, CA140354, CA167344, CA221235, CA161123, CA278179, CA092771, CA255868, CA214663, CA250421, CA260387, CA285663, CA089684, CA250336, CA254468, CA293447, CA244735, CA254392, CA292654, CA252918, CA126311, CA278803, CA076762, CA258105, CA136523, CA077192, CA225269, CA077910, CA230058, CA285260, CA229975, CA286249, CA158350, CA233369, CA243156, CA235192, CA092793, CA233280, CA269567, CA080589, CA121250, CA148111, CA117103, CA243125, CA242823, CA297617, CA070960, CA070900, CA182159, CA200781, CA082483, CA202989, CA133586, CA202917, CA166792, CA204111, CA133514, CA191341, CA229632, CA274798, CA112081, CA083506, CA087024, CA283073, CA075468, CA116699, CA117304, CA228310, CA123022, CA147101, CA280824, CA122938, CA269278, CA242644, CA286222, CA189979, CA231030, CA225697, CA216181, CA271428, CA287898, CA216319, CA249895, CA100564, CA255365, CA182292, CA090466, CA259629, CAI8592Ο, CAIΟ1429, CA130039, CA235211, CA235276, CA130053, CA090380, CA120551, CA242902, CA216182, CA242824, CA080452, CA260017, CA081490, CA278950, CA076773, CA182164, CA209332, CA247081, CAI94Ο98, CA262165); SEQ ID No. 272: SCCCRZ1001G10. g (CA222661, CA243406, CA269416, CA111447, CA122777, CA169118, CA240909, CA124462, CA122846, CA250422, CA244712, CA249447, CA287599, CA070902, CAI10739, CAI46855, CA256535, CA244795, CA078236, CA067840, CA070962, CA265769, CA156647, CA196108); SEQ ID No. 273: SCCCRZ1002F0 6.g (CA139097, CA266223, CAO99736, CA191325, CA138926, CA269667, CA211498, CA224822, CA216862, CA270060, CA301136, CA287834, CA146274, CA096108, CA181984, CA202409, CA084257, CA098085, CA291642, CA240057, CA110222, CA291673, CA217925, CA224622, CA218519, CA240142, CA271896, CA124695, CA232981, CA227222, CA073020, CA209126, CA233047, CA251280, CA072868, CA206681, CA107412, CA298995, CAO94500, CA195663, CA211432, CA066295, CA146933, CA220697, CAIO6447, CAO99272, CA076956, CA069454, CA275222, CA145292, CA136184, CA179267, CA148544, CA179893, CA156981, CA114064, CA191309, CA217009, CA069184, CA212599, CA264583, CA229486, CA172986, CA096567, CA067167, CA197128, CA172767, CA253169, CA291720, CA146613, CA180633, CA121860, CA133791, CA199922, CAO67244, CA262313, CA078445, CA131567, CA253243, CA074238, CA120588, CA268873, CA238585, CA219714, CA218602, CA267988, CA268534, CA070614, CA145612, CA160457, CA180428, CA268951, CA234136, CA098447, CA193324, CA136123, CA218518, CA184233, CA139019, CA145699, CA260610, CA182962, CA239591, CA099732, CA105807, CAI07503, CA138654, CA212476, CA239233, CA252352, CAI31278, CAO85013, CA220627, CA117443, CA079490, CA238164, CAI80322, CA112470, CA142140, CA075732, CA073680, CA068067, CAI57313, CAI79892, CA233146, CA240845, CA075816, CA068156, CA246078, CA233227, CA279126, CA240923, CA094282, CA069497, CAI97493, CA182107, CA166736, CA255275, CA251326, CA198871, CA281656, CA137037, CA070883, CA296203, CA078532, CA207814, CAO7Ο947, CA199983, CA282429, CA143090, CA191565, CA189249, CAI98125, CAI97513, CA203121, CA264333, CA214261, CA196418, CA251452, CA171285, CA156984, CA197506, CA211996, CA100356, CAO94466, CA133046, CA270062, CA249901, CA211434, CA225569, CAI89822, CA093801, CA100946, CA249815, CA131571, CA220355, CA136957, CA099350, CA064927, CA285088, CA217335, CA139813, CA146454, CA186309, CA217407, CA070684, CA268600, CA199112, CA126792, CA112223, CA265918, CA186374, CA070764, CA099737, CA226973, CA251532, CA142208, CA190634, CA279252, CA174635, CA237846, CA131296, CA224758, CA209005, CA132410, CA187486, CA230626, CA228588, CA080166, CA22 622 6, CA131487, CA209980, CA240058, CA211052, CA230710, CA065368, CA080253, CA165083, CA129937, CA215432, CA280033, CA244591, CA065145, CA064807, CA168165, CA198439, CA218272, CA099578, CA219277, CA218353, CAO96715, CA142481, CA142630, CA084917, CA100264, CA213047, CA134830, CA175003, CA121078, CA237503, CA135573, CA244608, CA134915, CA254178, CA135661, CA136819, CA069455, CA157330, CA164187, CAO97370, CA067491, CA145272, CA214390, CA098535, CAO97056, CA266148); SEQ ID No. 274: SCCCRZ1003A03.g (CA259202, CA100500, CAO8207 6, CAI22 924, CA157918, CA095401, CA187294, CA090612, CA080881, CAI12947, CA090695, CA130558, CA146966, CA072719, CA296093, CA262625, CA170785, CA145446, CA178555, CA206391, CA250364, CA171994, CA145530, CA147572, CA240600, CA250453, CAO95399, CA282848, CA115658, CA095183, CA237700, CA079664, CA233842, CA180299, CA262035); SEQ ED No. 275: SCCCRZ1C01H06.g (CA186428, CA147401, CA147396, CA102140, CA131386, CA067698, CA089218, CA174951, CA158992, CA071179, CA196935, CA190380, CA132381, CA232396, CA211475, CA270590, CA124159, CA132671, CA175342, CA300402, CAI65879, CA192094, CA110028, CA118616, CA147228, CA140507, CA149523, CA117528, CA130394, CA179398, CA225915, CA187763, CA266799, CA122963, CA217785, CA232794, CA262910, CA292429, CA094522, CA232704, CA127615, CA245193); SEQ ID No. 276: SCCCRZ2001F06.g (CA209945, CA125138, CAO89034, CA188983, CA140093, CA239385, CA128670, CA123109, CA283553, CA077454, CA149645, CA077376, CA239384, CA110981, CA289986, CA257955, CA274339, CA283333, CA285711, CA248034, CA094452, CA248046, CA119336, CA225096, CA248683, CA225120); SEQ ID No. 277: SCCCRZ2002C09.g (CA227904, CA086301, CA178222, CA149034, CA179328, CA164395, CA150695, CA300591, CA266120 CA214033, CA179414, CA101215, CA232117, CA266196, CA230767, CA106384, CA221659, CA077653, CA090620, CA242756, CA203337, CA104567, CA090436, CA214675, CA090702, CA182664, CA299455, CA160657, CA169652, CA115444, CA110086, CA170759, CAI04628, CAO90335, CA168143, CA252390, CA083307, CA256278, CAO 81478, CAO76382, CA257169, CA205954, CA076469, CA213516, CA257243, CA192918, CA280631, CA151528, CA122818, CA122358, CAO88685, CA210655, CA188323, CA253393, CA238275, CA191873, CAI35967, CA150598, CA230233, CA091237, CA126923, CA188824, CA280882, CA07 932 6, CA184911, CA173242, CA248830, CA251291, CA246358, CA131973, CA256847, CA075481, CA280627, CA244443, CA241676, CA234839, CA191350, CA132923, CA167430, CA214518, CA289890, CA129459, CA231295, CA234594, CA231360, CA122705, CA171017, CA174592, CA213097, CA203677, CA249784, CA241848, CAI54628, CA084636, CA147920, CA084027, CA210274, CA085409, CA073058, CA257603, CAI 71251, CA235287, CA194012, CA274516, CA189176, CA205967, CA114776, CA249998, CA170208, CA200483, CA079438, CA110598, CA213534, CA081442, CA158958, CA171823, CA201301, CA113037, CA162250, CA091597, CA199925, CA105728, CA149023, CA245774, CA257029, CA294516, CA255995, CA203027, CA251151, CA257109, CA233064, CA089686, CA165671, CA206864, CA197554, CA120723, CA294637, CA195134, CA222415, CA206697, CA089770, CA082495, CA270377, CA096681, CA204010, CA084811, CA225968, CA080123, CA268286, CA177754, CA225888, CA080209, CA280835, CA075666, CA15992 9, CA223078, CA148574, CA186803, CA139688, CA082737, CA169610, CA071215, CA251920, CA071288, CA253042, CA226647, CA067362, CA149705, CA175116, CA183854, CA253113, CA194680, CA229952, CA203951, CA145489, CA183906, CA185885, CA236571, CA183894, CA229664); SEQ ID No. 278: SCCCRZ2004E04.g (CA265204, CA171814, CA107719, CAI49900, CA193048, CA135977, CA070442); SEQ ID No. 279: SCCCRZ2C03B03.g (CA152461, CA091354, CA290267, CA150127, CA098420, CA160838, CA091259, CA210324, CA246275, CA160924, CA099832, CA246979); SEQ ID No. 280: SCCCRZ2C03B08.g (CA189326, CA128922, CA152978, CA275251, CA116757, CA206159, CA277339, CA273726, CA288950, CA288339, CA122779, CA274965, CA165128, CA149798, CA281356, CA185850, CA273473, CA083665, CA112203, CA118075, CA119323, CA258675, CA150131, CA260681, CA189332, CA183249, CA282545, CA114816, CA285606, CA284673, CA221505, CA277051, CA113469, CA274816, CA220035); SEQ ID No. 281: SCCCRZ2C03D11.g (CA212623, CA218773, CA234879, CA188440, CA150157, CA167123, CA160865, CA152558, CAI53910, CAI60953, CA292253, CA198906, CA146128, CA152637, CA253272, CA199372, CA081496, CA084800, CA210001, CA165052, CA173701, CAO98184, CAI 9898 9, CA300667, CA211850, CA160948, CA207047, CAO95115, CA136241, CA198430, CA256720, CA251375, CA166995, CA221307, CA110797, CA199377, CA154437, CA256643, CA237901, CA155637, CA237281, CA243431, CA199465, CA113301, CA201599, CA152440, CA186303, CA218694, CA091459, CA075606, CAIO2523); SEQ ID No. 282: SCCCRZ2C04A07.g (CA150208, CA254428, CA264432, CA109026, CA289248, CA212120, CA068378, CA269484, CA290794, CA150592, CA267114, CA108938, CA148663); SEQ ID No. 283: SCCCRZ3002D03.g (CA157090, CA166754, CA166468, CA081540, CA166789, CA159915, CA166748, CA158667, CAI66054, CAI60001, CA159544, CA158534, CA157577, CA163132, CA162955, CA159630, CA162379, CA156383, CA159213, CA156380, CAI59296, A157027, CA155724, CA166592, CA160596, CA157767, CAI59130, CA159692, CA160663, CA157459, CA160591, CA162831, CA157771, CAI61878, CA159777, CA157345, CA162828, CA160660, CA165592, CA157437, CA156341, CA161644, CA163699, CA166773, CA166732, CA155976, CA166749, CA166465, CA158668, CA166747, CAI66717, CA156749, CA157068, CA161600, CA157110, CA155898, CAI56928, CA155357, CA155731, CA155982, CA166777, CA165945, CA155803, CAI66847, CA158604, CA154735, CA154876, CA157483, CA154704, CAI59558, CA162867, CA156720, CA159340, CA157550, CA157322, CA156111, CA159644, CA159429); SEQ ID No. 284: SCCCST1004A07.g (CA183604, CA186275, CA243234, CA183683, CA186721, CA100350, CA187378, CA155740, CAI75579, CA231947, CA228851, CA155725, CA154689, CA254179, CAI72559, CA225984, CA264609, CA242994, CA158084, CA268024, CA173756, CA225902, CA163001, CA185577, CA159081, CA227411, CA139414, CA167973); SEQ ID No. 285: SCCCST1005H10.g (CA156092, CA252584, CA251786, CAO 958 69, CA200174, CA229003, CA150731, CA267208, CA111168, CA193424, CA298858, CA284582, CA173902, CA239780, CA210407, CA253368, CA239582); SEQ ID No. 286: SCCCST1007H11.g (CA239834, CA294188, CA174066, CA294125, CA289019, CA267191, CA205751, CA247131, CA186999, CA082859, CA248451, CA197532, CA248572, CA248681, CA229903, CA291504, CA223912, CA268732, CA229818, CA268664, CA177922, CA299828, CAOS5026, CA107150, CA270735, CA171072, CA250481, CA198295, CA224502, CA270670, CA111282, CA250414, CA170995, CA248529, CA250649, CA252343, CA115211, CA169576, CA250568, CA169653); SEQ ID No. 287: SCCCST2004D11.g (CA276737, CA286409, CA290332, CA180097, CA274366, CA290274, CA276791, CA283900); SEQ ID No. 288: SCCCST3C01D11.g (CAI 92121, CA200064); SEQ ID No. 289: SCEPCL6019E04.g (CA278974, CA178777, CA258916, CA210789, CA096932, CA228505, CA292383, CA287368, CA260767, CA258913, CA067293); SEQ ID No. 290: SCEPLB1043H04.g (CA112277, CA268601, CA084506, CA123703, CA130941, CA298376, CA100990, CA092352, CA111629, CA259193, CA175844, CA069065, CA236418, CA259195, CAI94776, CA197355, CA285641, CA279779, CA274614, CA208294) SEQ ID No. 291: SCEPRZ1009C10.g (CA216178, CA089411, CA192966, CA085572, CA147458, CA210405, CA186340, CA080065, CA195484, CA176812, CA086836, CA299623, CA186790, CA174279, CA270325); SEQ ID No. 292: SCEQLB1065H07.g (CA113324, CA112585, CA 112172); SEQ ID No. 293: SCEQRT1028H06.g (CA185370, CA217107, CA185369, CA181686, CA144447, CA259824, CA259055, CA224656, CA132900, CA139337); SEQ ID No. 294: SCEQRT2091B08.g (CA177838, CA138900, CA 131473); SEQ ID No. 295: SCEZLR1009F06.g (CA241512, CA233926, CA203368; CA147610, CA244100, CA143820, CA235700, CA224287, CA07 6822, CA136422, CA204148, CA132715, CA243514, CA121484, CA149083, CA270033, CA224204, CA235620); SEQ ID No. 296: SCEZLR1052D02.g (CA290091, CA101830, CA232662, CA121616, CA136331, CA269565, CA099181, CA274273, CA261699, CA244896, CA264816, CA291831, CA244980, CA242167, CA088365, CA207802, CA164209, CA083724, CA102047, CA144138, CA287479); SEQ ID No. 297: SCEZLR1052F07.g (CA074246, CA121654, CA248895, CA133812, CA282557, CA241182, CA114856, CA211933, CA248974, CA276743, CA101051, CA270608, CA276796); SEQ ID No. 298: SCEZRZ1012A02.g (CA297050, CA147663, CA157700, CAI05038, CA261583, CA271380, CA215641, CA159641, CAO69275, CA177800, CA270487); SEQ ID No. 299: SCJFAM10 6 6B0 5.g (CA268766, CA074908, CA268710, CA228447, CA244764, CA274990, CA065083, CA074999); SEQ ID No. 300: SCJFHR1C03E01.b (CA105064,CA292248); SEQ ID No. 301: SCJFLR1013A0 9.g (CA235310, CA282013, CA179055, CA283254, CA183161, CA290788, CA164417, CA252946, CA141957, CAO96624, CA265391, CA288713, CA274581, CA190135, CA208818, CA279074, CA197553, CA228792, CA167001, CA243611, CA173593, CA132194, CA159403, CA301384, CA172463, CA157575, CA122731, CA163302, CA159490, CA122807, CA290934, CA084459, CA209937, CA276141, CA124943, CA291009, CA101340, CA219373, CA282113, CA301068, CA151204, CA155518, CA261457, CA226015, CA281400, CA277290, CA106860, CA151298, CA131594, CA209070, CA274261, CA230293, CA281699, CA102959, CA242254, CA230377, CA110744, CA297719, CA273517, CA288217, CA283872, CA069932, CA161956, CA152851, CA167994, CA279904, CA072926, CA151486, CA294369, CA285703, CA152126, CA151570, CA123278, CA294297, CAI97602, CAI69959, CA243645, CA301385, CA264726, CA288442, CA273556, CA139713, CA195766, CA119825, CA145652, CA101345, CA295834, CA278607, CA167657, CA145735, CA164101, CA293116, CA289163, CA284698, CA072930, CA164096, CA274175, CA199249, CA282860, CA253978, CA282859, CA277633, CA274222, CA277807, CA217957, CA066317, CA154676, CA281278, CA131869, CA121746, CA143651, CA283796, CA240378, CA276222, CA180047, CA180206, CA178970, CA280226, CA109795, CA268088); SEQ ID No. 302: SCJFRT1062G05.g (CA134706, CA195808, CA245921, CA134625, CA104221); SEQ ID No. 303: SCJFRZ2009F04.g (CA151389, CA159376, CA226687, CA146560, CA166765, CA197932, CA159464, CA270358, CAI83354); SEQ ID No. 304: SCJFRZ2010A09.g (CA151517, CA183884, CAI51430); SEQ ID No. 305: SCIFRZ2028F11.g (CA186745, CA152421, CA186827, CA211953, CA191943, CA198909, CA224105, CA200632, CA255362, CA066398, CA131076, CA201119, CA299210, CA299133, CA200718, CA131498, CA157938, CA205075, CA160778, CA064989, CA277477, CA281350); SEQ ID No. 306: SCJFRZ2032C08.g (CA117340, CA295374, CA295303, CA152817); SEQ ID No. 307: SCJFRZ2032G01.g (CA133254, CA248557, CA175553, CA290388, CA170294, CA152856, CA171924, CA205645, CA233534, CA221515, CA081654, CA171952, CA065512, CA081995, CAI66558, CA065587, CA078958, CA211764, CA237388, CA258073); SEQ ID No. 308: SCJFST1009G05.g (CA296907, CA174288, CA269643, CA174211, CA193249); SEQ ED No. 309: SCJLHR1028C12.g (CA106176, CA106117, CAI08309, CA107078); SEQ ID No. 310: SCJLLR1054C09.g (CA207848, CA168087, CAI68395, CA212085, CA167523, CAD91873, CA122 611, CA155006, CA181705, CA134394, CA225549, CA210454, CA254817, CA110775, CAI78602, CA294600, CA247901, CA176250, CA191684, CA069266, CA300512, CA165622, CA155090, CA067961, CA171908, CA209040, CAI73982, CA094706, CA240234, CA103017, CA122429, CA150920, CAI12960, CA162575, CA122515, CA160567, CA113924, CAD 66919, CAI60642, CA221530, CA208709, CA071863, CA214558, CA220510, CA123419, CA244626, CA231363, CA228474, CA111123, CA134073, CA146492, CA244685, CA219982, CA073891, CA174808, CA221075, CA262113, CA114521, CA162927, CA115467, CA161791, CA168280, CA152952, CA091868, CA233706, CA164651, CA204996, CA129415, CA172853, CA166113, CA107134, CA254985, CA159872, CA159959, GA088872, CA173464); SEQ ID No. 311: SCJLLR1108H07.g (CA076625, CA161661, CA086613, CA161602, CA165554, CA245933, CA085287, CA123416, CA161598, CA175504, CA232025, CA166769, CA102997, CA076538, CA107411, CA155427, CA084502, CA106431, CA154641, CA106546, CA157227, CA154884, CA079948, CA179653, CA211436, CA121982, CA162963, CA258991, CA160716, CA243419, CA0792SO, CA072412, CA086508); SEQ ID No. 312: SCJLRZ1023H04.g (CA265135, CA190996, CA292308, CA268081, CA256348, CA207478, CA081712, CA292758, CA256420, CA167022, CA291705, CA091971, CA179799, CA140075, CA266752, CA291699, CA258363, CA113856, CA149162, CA260595, CA140368, CA246964, CA235343, CA155907, CA140145, CA279058, CA274307, CA165644, CA278889, CA205578, CA091372, CA181941, CAI66813, CA299890, CA177590, CA072486, CA156132, CA248336); SEQ ID No. 313: SCJLRZ1026F03.g (CA149469, CA205387, CA289827, CA184015, CA247348, CA282029, CA187706, CA205445); SEQ ID No. 314: SCMCCL6055H0 6.g (CA183309, CA272155, CAO71587, CAI54790, CA236184, CA111608, CA231710, CA288208, CAO9823551, CA238333, CA187031, CA071503, CA293423); SEQ ID No. 315: SCMCFL5005A02.g (CA236668, CA293232, CA251482); SEQ ID No. 316: SCQGLR1019A10.g (CA158123, CA074136, CA078695, CA202125, CA242927, CA291653, CA258225, CA223738, CA242859, CA124066, CA230103, CA120900, CA154098, CA255904, CA223648, CA129680, CA230031, CA082294, CA246357, CA262363, CA265415, CA118654, CA213833, CA125970, CA127771, CA246827, CA247296, CA087908, CA171645, CA102269, CA272756, CA137758, CAO88231, CA148006, CA122701, CA187495, CA239190, CA230034, CA228513, CA074865, CA285487, CA147299, CA125885, CA236307, CAO76601, CA116390, CA074785); SEQ ID No. 317: SCQGLR1085G10.g (CA246799, CA299090, CA247266, CA285442, CA124279, CA092800, CA073766, CA200888, CA282968); SEQ ID No. 318: SCQGLR2 0 3 2 G10.g (CA080092, CA073014, CA139013, CA225342, CA159885, CA165867, CA299929, CA118209, CAI59972, CA108533, CA108413, CA106301, CA086875, CA086531, CA129084); SEQ ID No. 319: SCQGRZ3011D06.g (CA161694, CA227205, CA245780, CA216248); SEQ ID No. 320: SCQGSB1140F12.g (CA213355, CA173336); SEQ ID No. 321: SCQGST1034G10.g (CA178801, CA186336, CA179790, CA176353, CA177570, CA236876, CA131335, CA214405, CA236124, CA186273, CA284135, CA216656, CA300978); SEQ ID No. 322: SCQSHR1023F08.g (CA282568, CA106894, CA104925, CA211813); SEQ ID No. 323: SCRFFL5034G07.g (CA292908, CA237588, CA237589); SEQ ID No. 324: SCRLAD1100E08.g (CA218592, CA211503, CA218509); SEQ ID No. 325: SCRLAM1010D08.g (CA212204, CA199909, CA248341, CA242304, CA256227, CA172929, CA220898, CA078708, CA247486, CA280865); SEQ ID No. 326: SCRLFL1008C11.g (CA228213, CA201789, CA206320); SEQ ID No. 327: SCRLFL1012B10.g (CA200156, CA199546); SEQ ID No. 328: SCRLFL3007C04.g (CA226398); SEQ ID No. 329: SCRLLR1111D02.g (CA293691, CA293635, CA125789); SEQ ID No. 330: SCRLSD1012E03.g (CA274071, CA285380); SEQ ID No. 331: SCRLST3166F11.g (CA182238, CA171790, CAI84723); SEQ ED No. 332: SCRUAD1063C06.g (CA068638, CA265707, CA068550, CA109839); SEQ ID No. 333: SCRUAD1133D10.b (CA217707, CA260899, CA295151); SEQ ID No. 334: SCRURT2 010A10.g (CA144026, CA210038, CAI97343, CA252900, CA067500); SEQ ID No. 335: SCSBAM1084F08.g (CA198503, CA079138, 20 CA07 9137); SEQ ID No. 336: SCSBHR1052C05.g (CA196243, CA215089, CAI64400, CAI95955, CA108007, CA139925, CA215090, CA224796, CA098473, CA209222, CA197036, CA209253); SEQ ID No. 337: SCSBHR1056H08.g (CA105333, CA108213); SEQ ID No. 338: SCSBLB1035F03.g (CA264024, CA104540, CAI15550, CA212924); SEQ ID No. 339: SCSBSD2058D04.g (CA287176, CA297226, CA287175); SEQ ID No. 340: SCSFAD1124E07.g (CA066760, CA217172, CA066828, CA217514); SEQ ID No. 341: SCSFHR1043G09.g (CA108353, CA218662, CA212351); SEQ ID No. 342: SCSGFL5C08F04.g (CA246146, CA236946, CA246999); SEQ ID No. 343: SCSGLR1045E07.g (CA168455, CA126284, CA177719, CA172031); SEQ ID No. 344: SCSGRT2066D05.g (CA070717, CA175523, CA145621, CA187735); SEQ ID No. 345: SCUTAM2088G02.g (CA091716, CA090231, CA091719); SEQ ID No. 346: SCUTFL3073E12.g (CA257224, CA241247, CA292613); SEQ ID No. 347: SCUTLR1037F04.g (CA170823, CA177197, CA279404, CA222805, CA121507, CA289444, CA282074, CA207370, CAI15893, CA105265, CA226291, CA170108, CA263098, CA132119, CAI07841, CA085728, CA126622, CA227826, CA227505, CA260163, CA262467, CA193720, CA219325, CA177230, CA103517, CA170340, CAI70414, CAIO5596, CA112997, CA228100, CA234662, CA258511, CA097304, CA120418); SEQ ID No. 348: SCUTLR1037F12.g (CA156611, CA293535, CA249045, CA087183, CA189165, CA086047, CA290121, CA081883, CA214139, CA229204, CA113764, CA213924, CA260485, CA126357, CA230132, CA221003, CA187849, CA273962, CA225939, CA102197, CA283956, CA183828, CA218025, CA195893, CA085608, CA263834, CA290919, CA183344, CA241008, CA104921, CA066522, CA290997, CA172858, CA095919, CA247671, CA186981, CA133280, CA245107, CA257283, CA115814, CA258330, CA212915, CA119073, CA194926, CA239944, CA104400, CA113297, CA104485, CA087184, CA069789, CA179218, CA231826, CA231159, CA086089, CA076690, CA246370, CA254495, CA091273, CA100677, CA106434, CA230786, CA253134, CA257292, CA231505, CA225180, CA241459, CAI 98266, CA115318, CA161747, CA103920, CA152307, CA133281, CA086095, CA231031, CA187270, CA242618, CA144012, CA111808, CA238509, CA253529, CAOS9266, CA157653, CA228713, CA106021, CA117820, CA126627, CA104401, CA211834, CA182929, CA104486); SEQ ID No. 349: SCUTLR1058C02.g (CA262461, CA168036, CA230840, CA293241, CA281414, CA281585, CA106941, CA142008, CAI51458, CAO92310, CA270530, CA270458, CA225598, CA151543, CA202726, CA128347, CA241827, CA282746, CA128419, CA119915, CA204605, CA215500, CA170573, CA164411, CA134253, CA142288, CAI76323, CA195642, CA255302, CA158993, CA283479, CA283473, CA126682, CA118166, CA213449, CA157587, CA207851); SEQ ID No. 350: SCUTLR2008E01.g (CA123373, CA129763, CA128815); SEQ ID No. 351: SCUTRZ2024G05.g (CA234849, CA204407, CAI05515, CA224224, CA109551, CA143843, CA279720, CA161103, CA224302, CA299491, CA122794, CA179195, CA153592, CA105749, CA164517); SEQ ID No. 352: SCUTST3086B02.g (CA213057, CA224653) ; SEQ ID No. 353: SCUTST3129E01.g (CAI 72415, CA213379, CA187638); SEQ ID No. 354: SCVPCL6041F12.g (CA082429, CA161720, CA139420, CA272127, CA238764, CA215035, CA194711, CA209687, CA171991, CA172016, CA165652, CA156463); SEQ ID No. 355: SCVPCL6042B07.g (CA169577, CA081626, CAIO6612, CAO99887, CA081969); SEQ ID No. 356: SCVPLR104 9C0 9.g (CA295256, CA300966, CA278033, CA090854, CA282609, CA121190, CA216481, CA267073, CA111152, CA126945, CA280319, CA278841, CA262278, CA287391, CA296360, CA296426, CA248739, CA287386, CA259530, CA296500, CA266143, CA216477, CA150885, CA248822, CA096454, CA099843, CA252370, CA087591, CA266218, CA071726, CA081002, CA087680, CA240033, CA219541, CA202897, CA077216, CA219614, CA066229, CA281069); SEQ ID No. 357: SCVPLR104 9E12.g (CA124363, CA107272, CA132969, CA091837, CA126955, CA122520, CA182701, CA167289); SEQ ID No. 358: SCVPLR2005H03.g (CA107547, CA139171, CA074786, CA265130, CA268083, CA243200, CA074866, CA134745, CA100667, CA131059, CA264817, CA254269, CA268118, CA264761, CA1218 69, CA2018 66, CA220819, CA156636, CA097099, CA289841, CA222964, CA116567, CA091798, CA219374, CA138613, CA221255, CA132550, CA289940, CA251888, CA205653, CAI 0095 6, CA293549, CA243537, CA136973, CA120370, CA158202, CA228366, CA260312); SEQ ID No. 359: SCVPLR2012B07.g (CA130160, CA266175, CAO 77480, CA072583, CA084569, CA194404, CA278936, CA240283, CA201232, CA288279, CA077401, CA066454, CA180797, CA244848, CA266247, CA130150, CA137685, CA233499); SEQ ID No. 360: SCVPLR2 019B0 3.g (CA087275, CA087192, CA125068, CA101699, CA222267, CA259282, CA248553, CA223061, CA172804, CA200147, CA130990, CA225681, CA231261, CA223347, CA255228, CA273849, CA254244, CA156394, CA163312, CA117607, CAO78324, CA072741, CA248475, CA212519, CA124666, CA126419, CA268138, CA105146, CA299030, CA177516, CA222789, CA105222, CA253702, CA202841, CA077031, CA077074, CA295407, CA118765, CA265852, CA289740, CA156183, CA197419, CA292775, CA207673, CA225709, CA153732, CA169731, CA102976, CA254955, CA228712, CAO67636, CA264512, CA130214, CA130204, CA106807, CA207166, CAI98764, CA216476, CA197293, CA103316, CA202300, CA077735, CA211185, CAO67184, CA159570, CA258272, CA067264, CA159656, CA200260, CA117368, CA183438); SEQ ID No. 361: SCVPLR2027A05.g (CA235611, CA214709, CA235691, CA229065, CA216821, CA251974, CA085301, CA101012, CA2712 69, CA197839, CA223162, CA118164, CA086683, CA223250, CA221375, CA188324, CA130277, CA130307, CA291410, CA227333, CA279299, CA289704, CA167019, CA207029, CA206493, CA270388, CA176609, CA255410, CA166845, CA070734, CA073573, CA070813, CA112278, CA295884); SEQ ID No. 362: SCVPRZ2038F04.g (CA278038, CA154019, CAI85583); SEQ ID No. 363: SCVPRZ3025A12.g (CA070455, CA292147, CA245381, CA166400, CA204294, CA242140); SEQ ID No. 364: SCVPRZ302 9G0 9.g (CA239171, CA273853, CAI66786, CA203209); SEQ ID No. 365: SCMCST1053A0 6.g (CA110730, CA157435, CA164231, CA176670, CA079493, CA088347); SEQ ID No. 366: SCCCLB1C06H02.g (CA189458, CA167345, CA115196, CA207187, CA252023); SEQ ID No. 367: SCJLRT1023G0 9.g (CA077219, CA072472, CA136050, CA078881, CA266374, CA224918, CA162043, CA091967, CA074650); SEQ ID No. 368: SCCCST1004C05.g (CA098064, CA072037, CA194838, CA098063, CA173775, CA074361, CA079156, CA098059, CA084783) ; SEQ ID No. 369: SCCCLB1002D12. g (CA092064, CA238036, CA222592, CA227487, CA110870, CA207790); SEQ ID No. 370: SCSGHR1070F12.g (CA076267, CA109334); SEQ ID No. 371: SCEQLR1092H10.g (CA279813, CA186407, CA212604, CA279552, CA186484, CA135161, CA069193, CA103839, CA121281, CAI53767, CA285432, CA182006, CA131451, CA285178, CA078267, CA078257, CA205885, CA136733, CA205884, CA097155, CA2d4106, CA279798, CA163611, CA091480, CA091191, CA187913, CA261976, CA277443, CA204843, CA273593, CA287502, CA287253, CA085398, CA222671); SEQ ID No. 372: SCJFST1011B06.g (CA239247, CA174473, CA262684, CA211312, CA218557); SEQ ID No. 373: SCEQRT2030G04.g (CA138771, CA145363, CA291384).

[064] Quatro indivíduos foram selecionados de SP83-2847 (VI), quatro de SP94-3116 (V3), quatro de SP91-1049 (V2) e quatro de SP89-1115 (V4). Amostras de RNA dos tecidos indicados e meses coletados foram usadas para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. As quatro últimas colunas indicam as proporções médias e a indução quando as amostras de alto e baixo brix foram comparadas contra uma mistura equimolar de RNAs das mesmas variedades coletadas em março (quando a célula tem expressão diferencial vazia, mas não detectada na amostra). As 142 medições de brix médio são mostradas na Figura 6.

[065] Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SPS0-180 e SPS0-4966. Amostras de RNA do internódulo 9 (maduro, rico 5 em açúcar) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em Março de sete indivíduos com o maior brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 9 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 9. O brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 18,47.

Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SPS0-180 e SP80-4966. Amostras de RNA do internódulo 9 (maduro, rico em açúcar) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em Julho de sete indivíduos com o maior brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 9 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 9. 0 brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 22,63.

Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SP80-180 e SPSO-4966. Amostras de RNA do internódulo 9 (maduro, rico em açúcar) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em Março de sete indivíduos com o menor brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 9 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 9. 0 brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 13,66.

Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SP80-180 e SPSO-4966. Amostras de RNA do internódulo 9 (maduro, rico em açúcar) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em julho de sete indivíduos com o menor brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 9 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 9. 0 brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 18,96.

Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SPB0-180 e SPSO-4966. Amostras de RNA do internódulo 5 (açúcar intermediário) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em julho de sete indivíduos com o maior brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 5 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 5. 0 brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 22,63.

Os indivíduos foram selecionados de uma prole F1 de um cruzamento entre duas variedades comerciais, SPS0-180 e SP80-4966. Amostras de RNA do internódulo 5 (açúcar intermediário) e internódulo 1 (baixo açúcar) foram coletados em julho de sete indivíduos com o menor brix e usados para gerar sondas para hibridizações de microarranjo de cDNA. A coluna Alto indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 5 do que no internódulo 1. A coluna Baixo indica as proporções médias (vezes de indução) de genes mais expressos no internódulo 1 do que no internódulo 5. 0 brix médio nos internódulos com maior açúcar foi de 18,96.

Genes da presente invenção A invenção fornece polinucleotídeos descritos acima e suas variantes.

Variantes "Variantes" é compreendida para incluir sequências de polinucleotideo substancialmente similares, na medida em que elas ainda tenham a mesma ou urna função substancialmente similar aos polinucleotídeos da presente invenção, por exemplo, marcador para plantas com diferentes teores de açúcar, capacidade de modular o teor de açúcar. Fontes comuns identidade de para variantes incluem sequência, fragmentos, variantes sequências de hibridização, complementos ou sequências com mutação. Um fragmento da sequência é definido como urna porção ou região da sequência que pode ser usada para alterar os níveis de expressão de um dos genes que codificam SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373 em plantas transgênicas.

Identidade de sequência "Variantes" que ocorrem naturalmente e não naturalmente de sequências diferencialmente expressas dentro da presente invenção incluem moléculas de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com as sequências de cana-de-açúcar nativas divulgadas aqui, isto é, SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373 ou complementos dessas sequências. Mais preferivelmente, as variantes têm 97%, 98%, 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência a uma sequência inteira ou um fragmento da sequência. Comparações para determinação de identidade de sequência podem ser feitas usando métodos conhecidos por um técnico versado no assunto.

Hibridi zação "Variantes" também incluem moléculas de ácido nucléico que se hibridizam sob condições de alta estringência, conforme definido aqui, às sequências de ácido nucléico de cana-de-açúcar de SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373 ou o complemento das sequências de SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373. Por exemplo, tais "variantes" podem ser moléculas de ácido nucléico que se hibridizam à sequência de SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373 ou o complemento das sequências de SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373 sob condições de baixa estringência, condições de estringência condições de alta estringência (veja moderada Sambrook ou e colaboradores (edição mais recente) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Conforme usado aqui, a frase "condições de baixa estringência" se refere às seguintes condições e equivalentes aos mesmos: hibridização a 5 x SSC, SOS a 2% e 100 pg/ml de DNA fita simples a 40°C durante 8 horas, seguido por pelo menos uma lavagem em 2 x SSC, SOS a 0,2% a 40° C durante trinta minutos. Conforme usado aqui, a frase "condições de hibridização com estringência moderada" se refere às condições a seguir e equivalentes das mesmas: hibridização a 5 x SSC, SOS a 2% e 100 pg/ml de ONA fita simples a 50°C durante 8 horas, seguido por pelo menos uma lavagem em O,1 x SSC, SOS a O, 1%, a 50°C durante trinta minutos. Conforme usado aqui, a frase "condições de hibridização de alta estringência" se refere às seguintes condições e equivalentes dos mesmos: hibridização a 5 x SSC, SOS 2% e 100 pg/ml de DNA fita simples a 65° C durante 8 horas, seguido por pelo menos uma lavagem em 0, 1 x SSC, SOS a 0,1%, a 65° C durante trinta minutos.

Complementos Alternativamente, os ácidos nucléicos da presente invenção são aqueles tendo uma sequência de nucleotideo que é o complemento do comprimento total ou porções das sequências de SEQ ID Nos. 1-203 ou 229 a 373. Polinucleotideos podem ser tão curtos quanto 14 nucleotideos, mas eles não estão limitados a esse comprimento.

Mutantes Os genes também podem sofrer mutação através de radiação ou mutagênese química usando EMS (etilmetano sulfonato) e alelos com mutação identificados através de Tilling ou geração RFPL de plantas com teor aumentado de sacarose através de metodologias não transgênicas.

Um ou mais pontos de mutações podem ser introduzidas em uma molécula de ácido nucléico para proporcionar uma molécula de ácido nucléico modificada usando, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (veja Wu (Ed.), Meth. In Enzymol. Vol. 217, San Diego: Academic Press (1993); Higuchi, "Recombinant PCR" em Innis e colaboradores (Ed.), PCR Protocols, San Diego: Academic Press, Inc. (1990), cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Tal mutagênese pode ser usada para introduzir uma inserção, deleção ou substituição de aminoácido específica desejada; alternativamente, uma sequência de ácido nucléico pode ser sintetizada tendo nucleotideos aleatórios em uma ou mais posições predeterminadas para gerar substituições de aminoácido aleatórias. Mutagênese de exploração também pode ser útil na geração de uma molécula de ácido nucléico modificada que codifica substancialmente a sequência de aminoácido como polipeptídeos da presente invenção.

Polipeptídeos da invenção Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona polipeptídeos parcial ou totalmente codificados pelos polinucleotídeos da presente invenção ou por variantes de um polinucleotídeo da presente invenção.

Em outras modalidades, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido substancialmente similar àquela codificada pelos polinucleotídeos da presente invenção. Conforme usado aqui, o termo "substancialmente a mesma sequência de aminoácido" se destina a significar um polipeptídeo ou segmento polipeptídico tendo uma sequência de aminoácido idêntica ou um polipeptídeo ou segmento polipeptídico tendo uma sequência similar não idêntica que é considerada por aqueles versados no assunto como sendo uma sequência de aminoácido funcionalmente idêntica. Em particular, polipeptídeo "substancialmente com a mesma sequência de aminoácido" pode ter uma ou mais modificações, tais como, adições, deleções ou substituições de aminoácido, incluindo substituições conservativas ou não conservativas.

Comparação de sequências para similaridade substancial pode ser realizada entre duas sequências de qualquer comprimento e usualmente é realizada com sequências entre cerca de 6 e 1200 resíduos, de preferência entre cerca de 10 e 100 resíduos e, mais preferivelmente, entre cerca de 25 e 35 resíduos. Tais comparações para similaridade substancial são realizadas usando metodologia de rotina na técnica. O percentual preferido de similaridade de sequência para polipeptídeos inclui polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 65% de similaridade, 75% de similaridade, 80% de similaridade, 85% de similaridade, 90% de similaridade, 95% de similaridade, 97% de similaridade, 98% de similaridade, 99% de similaridade ou, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 99,5% de similaridade. A similaridade de sequência é, de preferência, calculada como o número de aminoácidos similares em um alinhamento pareado como um percentual da mais curta das duas sequências no alinhamento. O alinhamento pareado é, de preferência, construído usando o programa Clustal W, usando os seguintes parâmetros de ajuste: penalidade por gap fixa = 10, penalidade por gap flutuante = 10, matriz de peso de proteína BLUSUM62. Aminoácidos similares em um alinhamento pareado são aqueles pares de aminoácidos os quais têm escores de alinhamento positivos definidos na matriz de peso de proteína preferida (BLOSUM62). A matriz de peso de proteína BLOSUM62 é considerada apropriada para as comparações descritas aqui por aqueles versados no assunto de bioinformática. (A referência ao programa Clustal W 151 (algoritmo) é Thompson, J.D., Higgins, D.G. e Gibson, TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680; e a referência para a matriz de escore BLOSUM62 é Henikoff, S. e Henikoff, J.G. (1993) Performance evaluation of amino acid substitution matrices. Proteins, 7: 49-61).

Deve ser entendido que modificações mínimas da sequência de aminoácido primária podem resultar em um polipeptídeo que tem função intensificada ou substancialmente equivalente aos polipeptídeos da presente invenção. Ainda, várias moléculas podem ser presas ao polipeptídeo das mesmas, por exemplo, outros polipeptídeos, tags antigênicas ou outras peptídicas, carboidratos, lipídios ou grupamentos químicos.

Plantas de cana-de-açúcar para identificação de genes da presente invenção A - Cruzamentos 1 - Exemplo de caracterização de uma prole derivada de ancestrais do tipo selvagem: Dois poli-cruzamentos intra-específicos iniciais poderíam ser realizados, um entre genótipos de Saccharum officinarum e o outro combinando genótipos de Saccharum spontaneum. O processo de cruzamento e seleção que podería seguir é ilustrado na Figura 1. Para cada geração, 500 indivíduos poderíam ser coletados para o teor de Brix e expressão gênica e os segregantes extremos selecionados. Os indivíduos híbridos selecionados para estudos moleculares poderíam ser plantados no campo em uma fileira de 5 metros usando práticas padrões de cultivo de cana-de-açúcar. Leituras de Brix e amostras de tecido poderíam ser coletadas muito cedo na estação, em março do ano seguinte, quando as plantas tivessem 10 meses. Para determinação do teor de Brix, as plantas poderíam ser coletadas usando um coletor de amostra de suco manual. 0 suco podería ser coletado fazendo um furo no meio do 5o internódulo visível contado a partir de cima após remoção da bainha de bolha seca mais baixa ainda presa ao colmo. Umas poucas gotas do suco poderíam ser colocadas no refractômetro manual (Nl, ATAGO, Japão) e uma leitura direta de Brix obtida. Indivíduos ou grupos de indivíduos (por exemplo, sete ou oito indivíduos) podem ter seus tecidos coletados e o RNA extraído. 2 - Exemplos de uma prole derivada de variedades comerciais: Quinhentas plantas F1 de cana-de-açúcar de um cruzamento entre duas variedades comerciais (SPSO-180 X SPSO-4966 ou SPS0-144 X SP85-7215) poderíam ser mantidas em uma estufa ou crescidas no campo. Elas poderíam secretar um teor de açúcar no caule de uma maneira normal e as sete plantas apresentando valores extremos para expressão gênica associada a um alto teor de açúcar e baixo teor de açúcar poderíam ser coletadas. Folhas maduras (Folha+1, Van Dillewijn, 1952), folha imatura, internódulo maduro, internódulo imaturo e intermediário, raiz, broto lateral e uma mistura de flores desenvolvimento poderíam em ser diferentes coletados estágios de das plantas selecionadas 6, 7, 9, 11 e 13 meses após plantio (mas, não limitado aos mesmos) . Tecidos coletados em cada ponto de tempo poderíam ser agrupados de sete indivíduos de cada grupo ou caracterizados para cada amostra individual. Para análise de blot de RNA, todos os pontos de tempo poderíam ser avaliados ou apenas um ponto de tempo poderia ser avaliado. Perfis de expressão gênica poderíam ser analisados independentemente, usando três indivíduos de cada grupo (por exemplo) ou ser determinados para um grupo de plantas. B - Variedades ou cultivares comerciais Variedades podem ser crescidas no campo durante um ano (por exemplo, desde setembro) e amostras coletadas durante todo o ano (por exemplo, em março, maio, julho ou setembro, mas não limitado aos mesmos). Amostras de tecido podem ser coletadas de 2 a 4 indivíduos de cada variedade, as quais são agrupadas ou analisadas independentemente. Exemplos de variedades que mostraram ter expressão alterada dos genes são os cultivares de acumulação precoce e com alto teor de sacarose SP91-1049 e SP89-1115 em comparação com os cultivares com acúmulo tardio e baixo teor de sacarose SP83-2847 e SP94-3116. As amostras podem ser coletadas conforme descrito acima. Métodos para determinação da capacidade de uma planta para acumular açúcar Em determinadas modalidades, a presente invenção usa genes que são diferencialmente expressos em plantas tendo diferentes níveis de açúcar, tais como SEQ ID NOs. 1 a 203 e SEQ ID NOs. 229 a 373, para determinar a capacidade da planta de acumular açúcar. Em algumas modalidades, o nível de expressão de genes é medido usando vários métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos abaixo. Em outras modalidades, o nível de expressão do polipeptídeo expresso pelos polinucleotídeos da presente invenção é detectado.

Medição de expressão de gene A expressão de gene pode ser determinada usando qualquer técnica que meça o produto de atividade do gene, 155 por exemplo, níveis de transcrito ou mRNA ou níveis de proteína, incluindo microarranjos de cDNA, arranjos de oligonucleotídeo ou pedaços de gene, PCR quantitativa, Northern blots, Western blots/ELISA/espectrometria de massa, de acordo com os métodos descritos nesse trabalho. A expressão de gene pode ser medida através de vários métodos, incluindo: • PCR quantitativa • PCR em tempo real • microarranjos de cDNA • arranjos de oligonucleotídeos ou pedaços de gene • Northern blots • qualquer técnica que meça os níveis de transcrito para genes, tal como NASBA ou TMA • qualquer técnica que use hibridização de genes ou de um produto do gene como uma medida de expressão do gene • qualquer técnica que meça um produto de expressão do gene, tal como a proteína codificada pelos genes, tal como com o auxílio de um anticorpo (conforme em Western espectrometria de massa Microarranjos de cDNA blots e ELISA) ou espectrometria de massa.

Microarranjos de cDNA

Amostragem tecidual e extração de RNA de plantas de cana-de-açúcar A primeira folha com um tegumento visível (folha+1) e os internódulos 1, 2, 5 e 9 (contados de cima para baixo, onde o número 1 era o menor internódulo visível após todas as folhas serem removidas) podem ser coletados de plantas de 6 a 18 meses de idade. 0 tecido do internódulo pode ser separado do nódulo, cortado em pequenos pedaços, congelado em nitrogênio liquido e armazenado a -80 °C. Os internódulos 1 e 2 podem ser agrupados antes de extração de RNA e são referidos como internódulo 1. Tecidos congelados podem ser triturados usando um homogeneizador. 2-2,5 g foram pesados e triturados até um pó fino, em nitrogênio liquido, usando um almofariz e pilão pré-resfriados. O tecido pulverizado será transferido para um tubo de 50 ml e homogeneizado com 5 ml de Trizol® (Invitrogen) por grama de tecido. As recomendações do fabricante para tecidos com alto teor de polissacarideo serão seguidas para as amostras de internódulo maduro. As amostras podem ser incubadas durante 5 min em temperatura ambiente (RT) com turbilhonamento ocasional. O homogenato será centrifugado a 3.000 rpm; 4 °C durante 10 min e o sobrenadante transferido para um novo tubo de 50 ml. 0,2 ml de clorofórmio (RT) serão adicionados para cada ml de solução Trizol®. A solução será misturada vigorosamente durante 15s e incubada durante 3 min em RT. Após centrifugação (3.000 rpm, 4°C, 15 min), a fase aquosa será transferida para tubos contendo 0,6 volumes de isopropanol. A solução será misturada várias vezes com ligeira inversão e incubada em RT durante 10 min. Os tubos deverão ser centrifugados a 10.000 rpm, 4°C durante 10 min e o sobrenadante foi cuidadosamente descartado. As pelotas serão lavadas com etanol a 75% gelado. As amostras deverão ser rapidamente submetidas a turbilhonamento e centrifugadas a 6.000 rpm durante 5 min. O sobrenadante pode ser novamente descartado e as pelotas lavadas com etanol a 100% gelado. Após centrifugação, o sobrenadante será descartado e as pelotas foram deixadas secar em RT durante pelo menos 10 min. Os péletes deverão ser ressuspensos em 20 μΐ de água tratada com pirocarbonato de dietila morna, submetendo a um ligeiro turbilhonamento durante cerca de 15 min. As amostras de RNA podem ser quantificadas em um espectro fotômetro e carregadas sobre géis de agarose/ formaldeido a 1,0% para inspeção de qualidade.

Amplificação por PCR e impressão de arranjo Clones de plasmideo de cDNA de cana-de-açúcar de 6438 ESTs obtidas da coleção SUCEST podem ser re-arranjados e amplificados em reações de PCR de 100 μΐ (40 ciclos, 158 anelamento a 51 °C) , diretamente a partir de clones bacterianos em cultura, usando primers T7 e SP6. Para esse trabalho, os clones tiveram sua identidade validada através de re-sequenciamento. Os produtos de PCR podem ser purificados através de filtração usando lâminas com filtro com 96 cavidades (Millipore Multiscreen® MAFBNOB50). As amostras podem ser visualizadas sobre géis de agarose a 1% para inspecionar a qualidade e quantidade de amplificação por PCR. Os produtos de PCR purificados (em solução de Tris-HCl a 10 mM, pH de 8,0) podem ser misturados com um volume igual de DMSO em lâminas com fundo em V com 384 cavidades. Microarranjos podem ser construídos arranjando fragmentos de cDNA sobre lâminas de vidro cobertas de metal otimizadas com DMSO (tipo 7, Amersham Biosciences) usando o Generation HI Microarray Spotter (Molecular Dynamics/Arnersham Pharmacia Biotech). Cada fragmento de cDNA foi colocado, para esse trabalho, sobre as lâminas pelo menos quatro vezes (isto é, réplicas técnicas). Após impressão, as lâminas foram deixadas para secar e o DNA colocado foi ligado às lâminas através de ligação cruzada por UV (50 mL).

Preparo de sonda e Hibridização Dez microgramas de RNA total podem ser transcritos inversamente, rotulados e hibridizados usando os reagentes fornecidos com o kit CyScribe Post-Labeling (Amersham Biosciences), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos das reações de rotulação podem ser purificados em lâminas de filtração Millipore Multiscreen® para remover os nucleotideos rotulados não incorporados. Microarranjos podem ser co-hibridizados com as sondas fluorescentemente rotuladas. As hibridizações foram realizadas durante a noite a 42°C em câmaras úmidas. As lâminas podem, então, ser lavadas em lx SSC e SDS a 0,2% (10 min, 55°C), duas vezes em 0,lx SSC e SDS a 0,2% (10 min, 55°C) e em 0,1 x SSC (1 min, RT) . As lâminas, então, serão enxaguadas rapidamente em água milli-Q filtrada e secas com uma corrente de nitrogênio.

Aquisição de dados, processamento e análise estatística As lâminas podem ser escaneadas usando o Generation III Scanner™ (Molecular Dynamics), ajustando o tubo fotomultiplicador (PMT) para 700 para ambos os canais. As imagens podem ser processadas e os dados coletados usando o software ArrayVision (Imaging Research Inc.). Para esse trabalho, a base mediana local foi subtraída da densidade MTM (média ponderada mediana-baseada) para cada ponto. Dados de clones que geraram fragmentos de PCR de baixa qualidade (sem amplificação ou bandas inespecíficas) ou pontos de baixa qualidade (visualmente inspecionados) foram excluídos. Os dados foram armazenados e gerenciados através do banco de dados de rede livre14 na ambiente BioArray Software.

Um conjunto de programas padronizados baseado na linguagem R foi desenvolvido para processamento de dados baseado em métodos anteriormente descritos (Papini-Terzi e colaboradores, 2005). Valores de correlação de Pearson entre as amostras foram calculados usando proporções de expressão normalizadas obtidas de amostras com alto teor de açúcar contra amostras com baixo teor de açúcar ou amostras de teste versus um grupo de amostras de hibridizações para 6438 genes. Nós usamos hibridizações homotípicas ou "selfself" da amostra do grupo de referência para definir níveis de corte intensidade-dependentes que indicariam genes diferencialmente expressos. A identificação de genes diferencialmente expressos foi realizada usando uma implementação local do método HTself (Vencio e Koide, 2005; http.7ftlasto.iq.usp.br/~rvencio/HTself), que usa hibridizações "self-self" para derivar um corte intensidade-dependente para alterações significativas que integram a função de densidade de probabilidade para 98% para diferentes níveis de intensidade de sinal. As SAS (Sequências Montadas de Cana-de-açúcar) que apresentam mais de 7 0% de suas réplicas fora das curvas de corte de alteração foram definidas como diferencialmente expressas. As proporções de fluorescência foram normalizadas para levar em conta erros sistemáticos usando a adaptação LOWESS (Yang e colaboradores, 2002) e usadas para calcular as proporções de expressão para todos os genes entre a amostra de tecido e a amostra de referência. Para cada gene, o percentual de réplicas dentro ou fora dos limites de corte foi calculado em cada amostra de tecido. Outros detalhes sobre o método estão disponíveis no web site http://www.sucest-fun.orq/pub/SUCAST.

Outros métodos que comparam um padrão de expressão com outro ou um escore de uma alteração de expresso para não expresso ou o inverso são úteis. Alterações na intensidade de expressão podem ser classificadas, quer aumentos ou diminuições. Qualquer alteração estatisticamente significativa pode ser usada. Tipicamente, alterações em uma de SEQ ID NOs: 1-203 são adequadas. Contudo, mais genes podem ser analisados de modo útil. Dados de expressão de gene de SEQ ID NOs: 1-203 podem ser usados como classificadores moleculares ou usados para treinar métodos para distinguir entre plantas ou populações de planta com baixo e alto teor de sacarose usando uma variedade de técnicas bem estabelecidas, tal como a análise discriminatória linear de Fisher (Meireles e colaboradores, 2004), o software de Análise de Previsão de Mícroarranjo PAM (Tibshirani e colaboradores, 2002) ou métodos comumente usados, tal como SVM (Support Vector Machines) ou LVQ (Learning Vector Quantization) (Mattfeldt e colaboradores, 2004}» Fazendo isso, o perfil de expressão de SEQ ID NOS. 1-203 pode ser usado para prever entre plantas com alto Brix e baixo Brix e pode ser usado para classificar os indivíduos de uma prole ou cultivares. Genes cuja expressão se descobre estar inalterada nos experimentos de microarranj o podem auxiliar na definição de classes e ser usados para treinar os algoritmos, junto com as SEQ' ID NOS. 1-203 diferenc ia Imente expressas. A

Tabela XI lista, como um exemplo, 25 SAS (SEQ ID NO. 204 a 228) as ESTs correspondentes que são consistentemente expressas em níveis similares em todas as amostras analisadas (alto e baixo Brix).

Tabela XI - Vinte e cinco genes não diferencialmente expressos entre todas as populações e variedades com alto e baixo Brix As SAS (sequências Montadas de cana-de-açúcar) e ESTs correspondentes apresentando mais de 70% de suas réplicas dentro das curvas de corte de alteração foram definidas como não diferencialmente expressas e podem ser usadas como controles em reações de PCR em tempo real ou treinar algoritmos de classificação. SEQ ID NO. 204: SCAGLR1043C02.g (CA29H99, CA126773, CA103634, CA278537, CA291283, CA105620, CA129564, CA135982, CA154949, CA137234, CA131175, CA131096, CA267022, CA136766, CA079897, CA112911, CA202743, CA212218, CA130074, CA116962, CA300529, CA233427, CA275519, CA215010, CA190793, CA264955, CA275590, CA148445, CA276733, CA197411, CA285562, CA143450, CA158699, CA148266, CA276787, CA223611, CA131410, CA129260, CA282689, CA143509, CA127374, CA223701, CA107631, CA102547, CA200880, CA126777, CA168082, CA143088, CA139235); SEQ ID NO. 205: SCAGRT3046D01.g (CA300723, CA294382, CA264769, CA294452); SEQ ID NO. 206: SCBGLR1002D06.g (CA278315, CA117650, CA127739, CA212804, CA073244, CA138816, CA152521, CA152509, CA153113, CA283276, CA259474, CA289253, CA101319, CA126194, CA187565, CA093995, CA150472, CA252354, CA226461, CA286965, CAI42703, CA298971, CA286850, CA111071, CA128235, CA130953, CA283578, CA181244, CA190282, CA241875, CA076812); SEQ ID NO. 207: SCCCCL3005D01.b (CA271043, CA272368, CA215896, CA098903, CA093456, CA150890, CA266868, CA263152, CA093454, CA284141, CA270967, CA070480, CA223204, CA261258); SEQ ID NO. 208: SCCCCL3080C09.g (CA259330, CA152240, CA289512, CA124276, CA269953, CA282554, CA150365, CA076742, CA124252, CA125409, CA189780, CA150360, CA067168, CA185260, CA268877, CA287161, CA079640, CA180418, CA284801, CA268954, CA296365, CA118827, CA184393, CA289786, CA111364, CA150081, CA229568, CA200556, CA120906, CA286941, CA225985, CA285992, CA255183, CA262927 I CA277963, CA103076, CA118794, CA118790, CA103799, CA129390, CA286405, CA100864, CA129384, CA074893, CAO 93506, CA214051, CA129364, CA111366, CA152568, CA076728, CA074983, CA124214, CAO 93579, CA122181, CA071338, CA249655, CA152647, CA128317, CA131033, CA071425, CA07 7256, CA117737, CA078093, CA199165, CA168557, CA125328, CA084326, CA150876, CA082480, CA254028, CA189858, CA276734, CA118424, CA268830, CA231681, CA276788, CA117438, CA225602, CA277928, CA114620, CA247257, CA185669, CA076943, CA075590, CA202758); SEQ ID NO. 209: SCCCCL7001A04.g (CA100620, CA223268, CA100961, CAI99955, CA223191, CA279575, CA103970, CA110326); SEQ ID NO. 210: SCCCLB1C03B04.g (CA086997, CA198468, CAI64949, CA299431,CA189172, CA279831, CA175292, CA190805, CA155239, CA074671, CA131422, CA172088, CA237966, CA113643, CAO99312, CAO97078, CA168581); SEQ ID NO. 211: SCCCLR1022H01.g (CA119702, CA189837, CA274251, CA124160, CA152830, CA202385, CA214786, CA223178, CA094030, CA092004, CA283613, CA277116, CA146444, CA297712, CA223255, CA067746, CA116394, CA067839, CA297889); SEQ ID NO. 212: SCCCLR1070B11.g (CA194863, CA069696, CA120150, CA067031, CA087323, CA292894, CA165329, CA185869, CA168662, CA209676); SEQ ID NO. 213: SCCCLR1072A03.g (CA257676, CA241502, CAI03767, CAI19541, CA212813, CA072979, CA076246, CA260516, CA173103, CA092491, CA279357, CA076330, CA298956, CA235977, CA283443, CA067187, CA172026, CA102965, CA243748, CA157421, CA254836, CA086831, CA067267, CA254991, CA165072, CA254121, CA281218, CA194801, CA107489, CA241226, CA183169, CA259059, CA110302, CA074064, CA211578, CA259058, CA241304, CA222499, CA167440, CA166656, CA103379, CA092495, CA251886, CA198331, CA197814, CA095062, CA089849, CA181078, CA238993, CA080070, CA160829, CA257963, CA077196, CA244970, CA085039, CA170461, CA159351, CA272807, CA245352, CA107493, CA159440); SEQ ID NO. 214: SCCCLR1075G05.g (CA064776, CA104174, CA262368, CA073013, CA168309, CA121412, CA226304, CA230815, CA129021, CA29930276, CA123604, CA267396, CA263329, CA120286, CA177583, CA147731, CA264721, CA123599, CA263403, CA194813 , CA241253); SEQ ID NO. 215: SCCCLR1078F05.g (CA124384, CA112238, CA228635, CA253815, CA228634, CA120519, CA228633, CA088403, CA284381, CA15335412, CA257810, CA243271, CA089170); SEQ ID NO. 216: SCCCNR1001B12.g (CA282544); SEQ ID NO. 217: SCCCRZ2002E06.g (CA079679, CA231568, CA121168, CAI49726, CA278060, CA136300); SEQ ID NO. 218: SCCCRZ2C04B04.g (CA246886, CA220871, CA154329, CA280029, CA268704, CA150217, CA219829, CA268689, CAO68008, CAO6845007, CA117830, CA087866, CA261807, CA268749, CA156666, CCA205929, CA158955, CA167141, CA239715); SEQ ID NO. 219: SCEPAM1020E03.g (CA072822, CA072801, CA188039, CA072796); SEQ ID NO. 220: SCEQRT1024H10.g (CA139099, CA281552, CA281378, CA132555, CA287054, CA251801, CA132401, CA143578, CA284175, CA143345, CA143889, CA284251, CA143429, CA143390, CA284886, CA296940, CA143494, CA139010, CA138862, CA300775, CA143467, CA134226, CA277302, CA141676, CA285542, CA142420, CA258267, CA267581, CA130719, CA274036, CA267666, CA144676, CA278111); SEQ ID NO. 221: SCEQRT1030A03.g (CA228274, CA133004, CA230581, CA230389, CA230510, CA235035, CA197298, CA088047); SEQ ID NO. 222: SCJFRT1009A08.g (CA133624, CA190354); SEQ ID NO. 223: SCJFRZ2009G01.g (CA088829, CA075098, CA139326, CA272034, CA075189, CA151398, CA276729, CA223035, CA237807, CA111462, CA106723, CA213636, CA123369, CA135723, CA244358, CA246251, CA226436, CA190274, CA123851, CA244439, CA132084, CAI78674, CA113343); SEQ ID NO. 224: SCJLFL3014C10.g (CA227690, CA227772); SEQ ID NO. 225: SCMCCL6055H0 6.g (CA183309, CA272155, CAO71587, CA154790, CA236184, CA111608, CA231710, CA288208, CAO98251, CA238333, CA187031, CA071503, CA293423); SEQ ID NO. 226: SCQGLR1019C05.g (CA239321, CA259641, CAI7Ο537, CAO94369, CA124046, CA147545, CA082777, CA187852, CAI99413, CAI5454O, CA169696, CA099319, CA204586, CA196716, CAI99496, CA171670, CA200284, CA234725, CA068506); SEQ ID NO. 227: SCQSST1037B07.g (CA261004, CA241250, CAI83198, CA296123, CA067033, CA177822, CA241340, CA217804, CA266141, CA126550, CA217886, CA183583, CA285691, CA266216); SEQ ID NO. 228: SCSBSD102 9F0 9.g (CA281292, CA275363, CA285616, CA286914, CA273656, CA286500, CA296413, CA283987, CA291253, CA274747). PCR quantitativa ou em tempo real (RT-PCR) [066] Qualquer método para medir os niveis de mRNA para os genes pode ser usado. Para esse trabalho, cinco microgramas de RNA total foram tratados com DNAse I (Grau para amplificação, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricação e uma alíquota de 7,5 μΐ do RNA tratado foi transcrita reversamente usando o Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). As reações de transcrição reversa de 20 μΐ continham o molde de RNA, 2 μΐ 10X tampão de RT, 0,5 mM cada de dATP, dGTP, dCTP e dTTP, 50 ng de hexârneros aleatórios, 0,25 pg de oligo(dT), MgC12 a 5 mM, DTT a 10 mM (ditiotreitol) , 40 U de Rnase OUT e 50 U de Transcriptase Reversa Superscript II. RNA, hexârneros aleatórios, dNTPs e oligo (dT) foram misturados primeiro, incubados a 70 °C durante 5 min e colocados sobre gelo. Subsequentemente, os componentes restantes, exceto a Transcriptase Reversa Superscript II, foram adicionados à reação e a mistura foi aquecida para 25°C durante 10 min e, então, incubada a 42 °C durante 2 min. A Transcriptase Reversa Superscript II foi adicionada a cada tubo e a reação foi incubada a 42 °C durante 1,5 h, 72°C durante 10 min e resfriada sobre gelo. Uma reação idêntica sem a transcriptase reversa foi realizada como um controle, para confirmar a ausência de DNA genômico. O produto de cDNA foi tratado com 2 U de RNAseH (Invitrogen) durante 30 min a 37°C e durante 10 min a 72°C. Reações de PCR em tempo real foram realizadas usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) em um Sistema de Detecção de Seqüência GeneArnp 5700 (Applied Biosystems). Primers foram criados usando o software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems). Buscas no BLAST contra o banco de dados SUCEST foram conduzidas para assegurar a especificidade dos primers selecionados. As sequências dos primers criados são listadas na Tabela XII. Cada reação foi realizada em duplicata e continha 2μ1 de uma diluição a 1:10 do cDNA sintetizado, primers em uma concentração final de 600 nM cada, 12,5 μΐ de SYBR Green PCR Master Mix e água com grau para PCR até um volume total de 25 μΐ. Os parâmetros para a reação de PCR foram 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de 95°C durante 15s e 60°C durante 1 min. A especificidade dos produtos amplificados foi avaliada através de análise das curvas de dissociação geradas pelo equipamento. Controles negativos também foram preparados de forma a confirmar a ausência de qualquer contaminação. A proporção entre as quantidades relativas do gene alvo e o gene de controle endógeno nas reações de RT-PCR foi determinada baseado no método18 2” DDCt com modificações. O nivel de expressão normalizado foi calculado como L — 2 e DCT = CT, aivo -CT^referênciasr pura cada amostra. Um gene de poli ubiquitina (SCCCST2001G02. g) e um gene GAPDH (SCQGAM2027G0 9.g) foram usados como uma referência endógena nas reações de RT-PCR após verificação se seus niveis de mRNA eram similares nas populações e tecidos individuais (não mostrado).

[067] Primers foram criados usando o software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems) e buscas no BLAST foram conduzidas para assegurar a especificidade dos primers selecionados. O gene de poliubiquitina (SCCCST2001G02. g) ou o gene GAPDH (SCQGAM202 7G09. g) foram usados como a referência endógena nas reações de RT-PCR.

Northern Blot [068] Eletroforese de amostras de RNA total (10 pg) pode ser realizada sobre géis de agarose contendo formaldeido a 1,5% através de procedimentos padrões (Sambrook e colaboradores, 1989) e transferido para um filtro de náilon (Hybond-N+, Amersham Biosciences). Para esse trabalho, para cada gene testado, o clone de EST mais longo de cada SAS do SUCEST foi selecionado como sonda para hibridização de blot de RNA. Os insertos foram marcados com o kit Read-To-Go (Amersham Biosciences) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Os filtros hibridizados foram expostos a placas de formação de imagem durante 24 h e as imagens digitalizadas dos sinais de hibridização de blot de RNA foram detectadas com o sistema FLA3000-G Screen (Fuji Photo Film, Japão) e quantificadas com o software Image Gauge v. 3.12 (Fuji Photo Film, Japão). Métodos para detecção dos niveis de expressão de proteina [069] Para medir ou avaliar as proteínas codificadas pelo polinucleotídeo SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373, uma série de técnicas bem estabelecidas podem ser usadas (Cell Biology - A Laboratory Handbook, Academic Press). Anticorpos podem ser estimulados contra uma proteína recombinante purificada expressa, por exemplo, em cepas bacterianas, após a sequência de codificação ser clonada em um vetor bacteriano, tal como a série de vetores pET da Invitrogen. Amostras de tecido de planta podem ser coletadas, extratos de proteína podem ser preparados e separados através de eletroforese em gel ou aplicados em lâminas com múltiplas cavidades e os níveis de proteína podem ser medidos através de Western blot ou ELISA (ensaio imunoabsorvente de ligação à enzima) usando o anticorpo e um anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou isotiocianato de fluoresceína. Alternativamente, análise de todo o proteoma pode analisar as proteínas codificadas por SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373 em larga escala com o auxílio da tecnologia de espectrometria de massa (MALDI-TOF e técnicas relacionadas) após separação de proteína. Técnicas que podem analisar (para uma revisão veja Newton e colaboradores, 2004) e avaliar níveis de proteína em larga escala também já foram descritas (Kirpatrick e colaboradores, 2005) .

Plantas transgênlcas da presente invenção [070] As plantas transgênicas podem ser geradas usando SEQ ID NO. 1 a 203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373. Alternativamente, as plantas transgênicas podem ser geradas através de uma variedade de técnicas usando genes adicionais e caracterizadas usando SEQ ID NO. 1 a 203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373. Técnicas para transformação de uma ampla variedade de espécies de planta superior são bem conhecidas e descritas (Weising e colaboradores, 1988) . Uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo desejado, por exemplo, uma sequência de cDNA que codifica uma proteína de comprimento total será, de preferência, combinada com sequências regulatórias de início de transcrição e tradução, as quais dirigirão a transcrição da sequência a partir do gene nos tecidos pretendidos da planta transformada. Por exemplo, para superexpressão, um fragmento promotor de planta pode ser empregado, o qual dirigirá a expressão do gene em todos os tecidos de uma planta regenerada. Tais promotores são referidos aqui como promotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de início de transcrição 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMVj , o promotor 1' ou 2'- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor ubil de milho derivado do gene de ubiquitina e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta conhecidos por um técnico no assunto.

[071] Genes podem ser introduzidos em plantas em cassetes de expressão que aumentarão a expressão dos genes ou silenciarão os genes através de expressão anti-senso ou interferência de RNA e levarão a uma planta com maior teor de sacarose de acordo com os métodos descritos nesse trabalho. Métodos para a geração de plantas com teor aumentado de açúcar [072] Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona métodos para a geração de plantas com teor aumentado de açúcar, através do aumento da expressão de ou interferência com a expressão de ou diminuição da expressão dos polinucleotideos da presente invenção. Em algumas modalidades, a planta é transgênica e gerada através de expressão de um gene expressando ou que interfere com a expressão de um polinucleotideo ou polipeptídeo da presente invenção. Plantas transgênicas podem ser geradas usando SEQ ID NO. 1 a 203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373. Em outras modalidades, a planta é uma gerada através de técnicas de cultura padrões ou mutagênese.

Preparo de vetores recombinantes para transformação de planta [073] SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID Nos 229 a 373 podem ser usadas para gerar plantas transgênicas com maior teor de sacarose. Para isso, vetores de DNA recombinante adequados para transformação de células de planta são preparados. Plantas transgênicas podem ser obtidas que expressam um cassete de expressão recombinante contendo um promotor ligado a um dos polinucleotideos 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 que causam um aumento no teor de sacarose na planta transgênica quando comparado com plantas de controle não transformadas ou plantas transformadas com o vetor apenas.

[074] Dependendo se o teor de açúcar aumentado está correlacionado com a expressão aumentada ou diminuída de um polinucleotideo em particular, constructos de DNA podem ser criados para aumentar ou interferir com/diminuir a expressão de genes específicos.

[075] Expressão de gene pode ser aumentada usando constructos de DNA recombinante com um polinucleotideo de interesse na orientação senso com relação ao promotor para obter superexpressão do gene.

[076] Expressão de gene pode ser diminuída usando constructos de DNA recombinantes com um polinucleotideo de interesse na orientação anti-senso com relação ao promotor para obter silenciamento de gene. Por exemplo, um fragmento de um gene de interesse pode ser clonado no vetor pAHC17 (Christensen e Quail, 1996) . Plantas transgênicas obtidas através desse método incluem plantas transgênicas de cana-de-açúcar Tia, Tlf, T2a, T2c e T3d originadas do cultivar SP83-2847. Calos embriogênicos originados desse cultivar foram transformados através de biolística, conforme descrito abaixo, com o constructo COMT-AS/pAHCl 7 contendo um fragmento de 535 bp de SEQ NO. 161 clonado no sítio BamHI para a orientação anti-senso. As plantas foram co-transformadas com o vetor pHA9 (Wei e Albert, Patente americana US 6706948).

[077] Expressão de gene pode ser diminuída ou sofrer interferência através de supressão de transcrição de um gene ou o acúmulo do mRNA correspondendo a esse gene, desse modo, impedindo a tradução do transcrito em proteína. Supressão de gene pós-transcricional é mediada através de transcrição de DNA recombinante integrado para formar RNA fita dupla (dsRNA) tendo homologia a um gene alvo para supressão. Essa formação de dsRNA resulta, mais comumente, da transcrição de uma repetição invertida integrada do gene alvo e é uma característica comum de métodos de supressão de gene conhecidos como supressão anti- senso, co-supressão e interferência de RNA (RNAi). Supressão transcricional pode ser mediada através de um dsRNA transcrito tendo homologia a uma sequência de DNA promotora para realizar aquilo que é denominado trans-supressão de promotor.

[078] Mais particularmente, a supressão de gene pós-transcricional através de inserção de um constructo de DNA recombinante com DNA na orientação anti-senso para regular a expressão de gene em células de planta é divulgada na patente U.S. No. 5.107.065 (Shewmaker e colaboradores) e patente U.S. No. 5.759.829 (Shewmaker e colaboradores). Plantas transgênicas transformadas usando tais constructos de DNA na orientação anti-senso para supressão de gene podem compreender DNA integrado disposto como repetições invertidas que resultam da inserção do constructo de DNA em plantas através de transformação Agrobacterium-mediada, conforme divulgado por Redenbaugh e colaboradores em "Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr Savr.TM. Tomato, CRC Press, Inc. (1992). Inserções de repetição invertida podem compreender uma parte ou todo o constructo de T-DNA, por exemplo, uma repetição invertida de uma unidade de transcrição completa ou urna repetição invertida de urna sequência de término de transcrição. Seleção de DNA inserido compreendendo elementos de repetição invertida pode aprimorar a eficiência de identificação de eventos de transformação eficazes para o silenciamento de gene, quer o constructo de transformação seja um constructo de DNA antisenso simples o qual deve ser inserido em múltiplas cópias ou um constructo de DNA de repetição invertida complexo (por exemplo, um constructo de RNAi) o qual pode ser inserido como uma única cópia.

[079] Supressão de gene pós-transcricional através de inserção de um constructo de DNA recombinante com DNA na orientação senso para regular a expressão de gene em plantas é divulgada na Patente U.S. No.5.283.184 (Jorgensen e colaboradores) e Patente U.S. No.5.231.020 (Jorgensen e colaboradores). T-DNA inserido que proporciona supressão de gene em plantas transformadas com tais constructos senso através de Agrobacterium é organizado predominantemente em estruturas repetidas invertidas, conforme divulgado por Jorgensen e colaboradores, Mol. Gen. Genet., 207: 471-477 (1987). Veja também Stam e colaboradores, The Plant Journal, 12(1), 63-82 (1997) que usaram estudos de segregação para suportar a descoberta de Jorgensen de que silenciamento de gene é mediado por loci multiméricos de T-DNA de transgene nos quais os T-DNAs estão dispostos em repetições invertidas. Seleção de DNA inserido compreendendo elementos de repetição invertidos pode aprimorar a eficiência de silenciamento de gene quando de transformação com constructos de DNA simples na orientação senso. A eficiência de silenciamento de gene pode ser também aprimorada através de seleção de eventos de inserção únicos quando de transformação com um constructo de RNAi contendo elementos repetidos invertidos.

[080] Conforme divulgado por Redenbaugh e colaboradores, supressão de gene pode ser obtida através de inserção, no genoma de uma planta, de DNA recombinante que transcreve dsRNA. Tal inserto de DNA pode ser transcrito em um elemento de RNA tendo a região 3' como um RNA fita dupla. Constructos de RNAi também são divulgados no EP 0426195 Al (Goldbach e colaboradores, 1991), que divulga constructos de DNA recombinante para transcrição em dsRNA de hairpina para proporcionar plantas transgênicas com resistência ao vírus do amolecimento do tabaco. RNAs fita dupla também são divulgados no documento wo 94/01550 (Agrawal e colaboradores) onde RNA anti-senso foi estabilizado com um segmento 3' auto-complementar. Agrawal e colaboradores, na Patente U.S. No. 5.107.065, divulgam o uso de tais RNAs anti-senso auto-estabilizados para regulação de expressão de gene em células de planta; veja Publicação Internacional No. 94/01550. Outros elementos de formação de hairpina fita dupla em RNA transcrito são divulgados na Publicação Internacional No. 98/05770 (Werner e colaboradores) onde o RNA anti-senso é estabilizado através de repetições de formação de hairpina de nucleotídeos (poli)CG. Veja também Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2003/0175965 Al (Lowe e colaboradores), a qual divulga supressão de gene usando um constructo de RNAi compreendendo uma sequência de codificação de gene precedida por repetições invertidas de SUTR. Veja também Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2002/0048814 Al (Oeller), onde constructos de RNAi são transcritos no RNA senso ou anti-senso, o qual é estabilizado por uma cauda poli (T)-poli (A). Veja também Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2003/0018993 Al (Gutterson e colaboradores), onde RNA senso ou anti-senso é estabilizado por uma repetição invertida da região não traduzida 3' do gene NOS. Veja também Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2003/0036197 Al (Glassman e colaboradores), onde um RNA tendo homologia a um alvo é estabilizado através de duas regiões de RNA complementares.

[081] Silenciamento de gene também pode ser realizado através de transcrição de RNA a partir de DNA senso e anti-senso, por exemplo, conforme descrito por Shewmaker e colaboradores na Patente U.S. No. 5.107.065 onde, no Exemplo 1, um vetor binário foi preparado com genes aroA senso e anti-senso. Veja também Patente U.S. No. 6.326.193, onde o gene de DNA alvo está operativamente ligado a promotores de oposição.

[082] Silenciamento de gene também pode ser realizado através de transcrição a partir de DNA senso e anti-senso continuo. A esse respeito, veja Sijen e colaboradores, The Plant Cell, Vol. 8, 2277-2294 (1996), que divulgam o uso de constructos trazendo repetições invertidas de um gene do virus mosaico de feijão-fradinho em plantas transgênicas para mediar à resistência a virus. Tais constructos para supressão de gene pós-transcricional em plantas através de RNA fita dupla também são divulgados na Publicação Internacional No. WO 99/53050 (Waterhouse e colaboradores), Publicação Internacional No. wo 99/49029 (Graham e colaboradores), Pedido de Patente Americano us No. 10/465.800 (Fillatti), Patente americana US No. 6.506.559 (Fire e colaboradores). Veja também pedido americano US No. 10/393.347 (Shewmaker e colaboradores) que divulga constructos e métodos para a expressão simultânea de um ou mais genes recombinantes, ao mesmo tempo em que suprime, simultaneamente, um ou mais genes na ti vos em uma planta transgênica. Veja também Patente americana US No. 6.448.473 (Mitsky e colaboradores) que divulga vetores de supressão multi-gene para uso em plantas. Todas as patentes, pedidos e publicações internacionais descritos acima que divulgam materiais e métodos para transcricional em plantas referência.

[083] Supressão transcricional, tal como trans-supressão de promotor, pode ser realizada através de expressão de um constructo de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a repetições invertidas do DNA promotor para um gene alvo. Constructos úteis para tal supressão de gene mediada através de trans-supressão de promotor são divulgados por Mette e colaboradores, The EMBO Journal, Vol. 18, No. 1, páginas 241-148, 1999 e por Mette e colaboradores, The EMBO Journal, Vol. 19, No. 19, páginas 5194-5201-148, 2000, ambos os quais são incorporados aqui por referência.

[084] Supressão também pode ser obtida através de inserção de mutações criadas através de elementos de transposon, que podem impedir a função do gene. Por exemplo, em muitas plantas dicotiledônias, transformação com o T-DNA de Agrobacterium pode ser prontamente obtida e grandes números de transformantes podem ser rapidamente obtidos. Também, algumas espécies têm linhagens com elementos de transposon ativos que podem ser usados eficientemente para a geração de grandes números de mutações por inserção, enquanto que algumas outras espécies carecem de tais opções. Plantas mutantes produzidas através de mutagênese com Agrobacterium ou transposon e tendo expressão alterada de um polipeptideo de interesse podem ser identificadas usando os polinucleotideos da presente invenção. Por exemplo, uma grande população de plantas com mutação pode ser selecionada com polinucleotídeos que codificam o polipeptideo de interesse para detectar plantas com mutação tendo uma inserção no gene que codifica o polipeptideo de interesse.

[085] Em algumas modalidades, constructos de DNA podem ser cDNA de comprimento total clonado no vetor de expressão pAHC17 (Christensen e Quail, 1996) em uma orientação senso para superexpressão ou em uma orientação anti-senso para silenciamento de gene. cDNAs de comprimento total podem ser amplificados através de PCR usando primers específicos e clonados no sítio BamHI do vetor pAHCl 7 que acionará a expressão constitutiva de genes sob o controle do promotor ubil de milho (Christensen e colaboradores, 1992) e foi mostrado ser eficaz na transformação e expressão de genes em cana-de-açúcar. Outros exemplos de promotores constitutivos incluem a região de início de transcrição 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor 1' - ou 2'- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, os promotores ubi4 e ubi9 isolados de genes de poliubiquitina de cana-de-açúcar (Wei e colaboradores, 1999; Wei e colaboradores, 2003), o promotor Actl de actina de arroz (McElroy e colaboradores, 1990, McElroy e colaboradores, 1991), o promotor pEmu (Last e colaboradores, 1990, Chamberlain e colaboradores, 1994) e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta conhecidos por um técnico versado do assunto.

[086] Alternativamente, vetores de expressão podem ser construídos usando promotores de cana-de-açúcar. Promotores constitutivos e elementos regulatórios podem ser isolados de genes que são constitutivamente expressos ou pelo menos expressos na maioria, se não todos, os tecidos da planta. Tais genes incluem, por exemplo, os 153 genes descritos por Papini-Terzi e colaboradores, 2005, como abundantemente expressos em tecidos de cana-de-açúcar.

[087] Alternativamente, o promotor de cana-de-açúcar pode dirigir a expressão de um ácido nucleico da invenção em um tipo especifico de tecido, órgão ou célula (isto é, promotores tecido-específicos), tais como os 217 genes descritos por Papini-Terzi e colaboradores, 2005, como sendo preferencialmente expressos em raizes, internódulos, folhas, brotos laterais ou inflorescências de cana-de-açúcar. Para constructos anti-senso, cDNA de comprimento total ou fragmentos de cDNA em torno de (mas, não restrito a) 500 bp de comprimento podem ser usados. Se uma sequência de codificação de comprimento total não está disponível, ela pode ser clonada, por exemplo, através de RACE (Frohman e colaboradores, 1988) . Para interferência de RNA (RNAi), os vetores pKannibal e pHannibal (Wesley e colaboradores, 2001) podem ser usados. Primers podem ser criados que amplificam especificamente em torno de (mas não restrito a) 200 a 400 bp do gene alvo. Dois fragmentos de PCR serão produzidos com primers de oligonucleotídeo criados para permitir a clonagem na orientação senso e anti-senso e para que uma hairpina complementar seja formada quando expressa na célula de planta. Os fragmentos de PCR conterão sitios de restrição em sua extremidade que permitirão sua introdução sobre os sitios Xhol/EcoRI/Kpnl (senso) e Clal/Hindlll/Xbal/BamHl (anti-senso) no vetor pKannibal ou pHannibal, por exemplo. Se expressão de polipeptídeo apropriada é desejada, uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação deverá ser incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta ou de T-DNA. Plantas transgênicas obtidas através desse método incluem plantas transgênicas de cana-de-açúcar 12SNF8b, 12SNF7c, 8SNF2a e 8SNF2b originadas do cultivar SP94-3116. Caules embriogênicos originados desse cultivar foram transformados através de biolística, conforme descrito abaixo, usando um fragmento de 331 bp de SEQ NO. 106 clonado nos sítios Xhol/EcoRI para a orientação senso e Hindlll/Xbal para a orientação anti-senso.

[088] O vetor de expressão compreendendo as sequências (por exemplo, promotores ou regiões de codificação) dos genes da invenção compreenderá, tipicamente, um gene marcador que confere um fenótipo selecionável às células de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar a resistência à biocida, particularmente resistência a antibiótico, tal como resistência à canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou resistência a herbicida, tal como resistência ao clorossulfuron ou Basta.

[089] Preparo de vetor de DNA para transformação de cana-de-açúcar através de bombardeamento usa uma variação do método de co-precipitação de Klein e colaboradores (1988a,b).

Transformação e propagação de planta [090] A transformação de cana-de-açúcar é uma técnica bem estabelecida (veja Falco e colaboradores, 2000 para um exemplo). Plantas transgênicas são recuperadas do calo embriogênico transformado usando um protocolo biolístico modificado. Inicio e manutenção do calo de variedades de cana-de-açúcar são feitos em meio contendo sais de Murashige & Skoog, 3 mg/L de 2,4-D, água de coco a 5%, 150 mg/L de ácido cítrico, 250 mg/L de Clavulin Beecham e 7 g/L de agar (meio CI-3). Rolos de folhas jovens de plantas de 6-12 meses de idade são cultivados durante um mês no escuro, a 27°C e calos embriogênico selecionado são subcultivados sobre o mesmo meio a cada 3 semanas. Os calos embriogênico podem ser bombardeados com vetores de expressão de plasmídeo contendo uma das sequências 1 a 203 ou SEQ ID Nos. 229 a 373. Após bombardeamento, os calos são mantidos no escuro durante 1 semana sobre meio CI-3, sem seleção, para recuperação. Calos transgênicos são selecionados sobre o mesmo meio contendo 35 mg/L de geneticina durante 6 semanas. Calos resistentes são colocados sobre o mesmo meio sem 2, 4-D para regenerar as plantas. Após aproximadamente 3 meses, as plantas são transferidas para o solo e mantidas na estufa, onde elas são testadas com relação à inserção genômica do vetor e expressão. Plantas de controle não transgênicas são obtidas através de regeneração do mesmo tipo de calo indo através das mesmas etapas de cultura tecidual sem bombardeamento e seleção. Geralmente, calos embriogênicos de cana-de-açúcar Brasileira (Saccharum officinarum L.) do genótipo SP80-180, SP80-185, SP94-3116, CTC1, SP83-2847, SP80-1842, SP91-1049 (mas não limitado a) , podem ser co-transformados com o plasmídeo pHA9 contendo genes que codificam neomicina fosfotransferase (neo) e um plasmídeo contendo o gene de interesse (um de SEQ ID NO. 1 a 203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 no plasmideo pAHC17, pKannibal ou pHannibal, por exemplo), através de bombardeamento de partícula. As plantas transformadas serão inicialmente selecionadas sobre meio de cultura contendo Geneticina e a resistência pode ser confirmada através de aplicação localizada de uma solução de canamicina as folhas de plantas endurecidas no berçário se desejado. Análise de Southern pode confirmar a integração estável dos genes alvo e neo. Alternativamente, as plantas podem ser submetidas à análise através de PCR para confirmar a inserção dos constructos de expressão no genoma de cana-de-açúcar. Primers de oligonucleotideo específicos para os constructos de expressão serão usados em reações de amplificação usando DNA genômico extraído de uma amostra das plantas transformadas. As plantas confirmadas são, então, deixadas regenerar em plantas de 4 cm de altura e, então, deixadas crescer em estufas quando os níveis de expressão do gene alvo serão verificados através de PCR em tempo real. Também, medições de Brix serão feitas para verificar o teor de sacarose. Alternativamente, genes podem ser introduzidos em cana-de-açúcar ou outras plantas usando técnicas, tais como eletroporação ou microinjeção de protoplastas de células de planta.

[091] A regeneração de planta a partir de protoplastas cultivados é descrita em Evans e colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração também pode ser obtida a partir de calos da planta, explantes, órgãos ou partes da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas, de modo geral, em Klee e colaboradores, Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987). A introdução de constructos de DNA usando precipitação com polietileno glicol é descrita em Paszkowski e colaboradores, EMBO. J. 3: 2717-2722 (1984). Técnicas de eletroporação são descritas em Frornrn e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 5824 (1985). Detalhes adicionais de técnicas de transformação balística são descritos em Klein e colaboradores, Nature 327: 70-73 (1987). Transgenes também podem ser transferidos para células de planta sem a necessidade de uma parte principal do vetor de DNA, usando constructos de transgene lineares (Fu e colaboradores, 2000, Loc e colaboradores, 2002) .

[092] Alternativamente, os constructos de DNA podem ser combinados com regiões de flanqueamento de T-DNA e introduzidos em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens dirigirão a inserção do constructo e do marcador adjacente no DNA de célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias. Técnicas de transformação Agrobacterium tumefaciens-mediadas, incluindo desarme e uso de vetores binários são 189 descritas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch e colaboradores, Science 233: 496-498 (1984) e Fraley e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803 (1983) e Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995).

[093] Alternativamente, os constructos de DNA podem ser combinados com vetores de T-DNA adequados, tais como vetores pCAMBIA pC1105.1, pC1105.1r ou versões modificadas dos mesmos e introduzidos em vetores hospedeiros bacterianos alternativos, tais como Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp. ou Mesorhizobium loti (também conhecido como cepas Transbacter), conforme descrito (Broothaerts e colaboradores, 2005).

[094] Medições de açúcar podem ser feitas em plantas de seis meses de idade. Açúcares totais e redutivos podem ser determinados em folhas de controle e plantas transgênicas coletadas, imediatamente congeladas em nitrogênio liquido e liofilizadas. Vinte mg de material liofilizado podem ser triturados usando um moinho de esferas e submetidos à extração de açúcares solúveis com 1 mL de etanol a 80% durante 20 minutos. Esse processo é repetido seis vezes (extração exaustiva). O extrato alcoólico é seco em um rotoevaporador e resuspenso em 1 mL de água milli-Q. Os níveis de açúcares totais e redutivos (Glc + Fru) são quantificados através de um método colorimétrico usando fenol-ácido sulfúrico (Dubois e colaboradores, 1956) e os procedimentos de Somogy-Nelson (Somogy, 1945) e 1 mg/mL de glicose como padrão. O teor de sacarose é estimado subtraindo a quantidade de açúcares redutivos da quantidade de açúcares totais. Plantas transgênicas podem também ser caracterizadas com relação ao teor de Brix e consideradas como tendo um teor aprimorado de sacarose se uma diferença de Brix de 3 graus é observada. Expressão diferencial de SEQ ID NOs: 1-203 pode ser usada em experimentos no campo com relação ao rendimento de sacarose para os melhores eventos (transformantes) ou em um pré-teste antes de experimentos no campo. Amostras de tecido podem ser obtidas conforme descrito acima.

Identificação de plantas com alelos com mutação [095] Variações no locus de SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 podem ser geradas através de métodos não transgênicos, podem ser encontradas em proles geradas através de cultura tradicional ou podem ser encontradas em genótipos que ocorrem naturalmente.

[096] Nos genótipos Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum, as proles de cruzamentos entre os mesmos e os cruzamentos de variedades comerciais descritas no presente trabalho podem ser selecionados com relação à mutações em SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID NOs. 22 9 a 373. Alternativamente, sementes de cana-de-açúcar podem sofrer mutagênese para aumentar a variação alélica para SEQ ID Nos. 1-203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373. Por exemplo, cana-de-açúcar pode sofrer mutagênese química com EMS (Etilmetano sulfonato - EMS).

[097] Mutações ou variações naturais em SEQ ID NOS. 1-203 ou SEQ ID NOs. 229 a 373 podem ser identificadas através de Tilling, conforme foi descrito para o trigo (Slade e colaboradores, 2005). Com Tilling, uma biblioteca de amostras de DNA de variantes com mutação ou que ocorrem naturalmente ou variantes geradas através de cultura tradicional pode ser identificada. Mutações serão detectadas através de amplificação de regiões de SEQ ID NOS. 1-203 por meio de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Os produtos de PCR serão aquecidos e re-anelados para permitir que heteroduplas se formem entre o DNA com mutação e do tipo selvagem. Heteroduplas são identificadas por meio de divagem de sítios não pareados através de endonucleases, tal como CelI e os produtos clivados identificados através de eletroforese em gel. A natureza da mutação será identificada através de sequenciamento do fragmento de PCR.

Uso como marcadores moleculares: Geração de marcadores moleculares baseada em polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição [098] SEQ ID NOs. 1-203 podem ser usadas para detectar diferenças entre indivíduos em nível de DNA. DNAs genômicos de qualquer número de indivíduos podem ser digeridos com uma enzima de restrição, de preferência uma enzima de corte de seis pares de base, submetidos à eletrof ores e podem ser hibridizados com qualquer um dos clones de DNA de SEQ ID NOs: 1-203, marcados com radioisótopos. Polimorfismos nos padrões de hibridização podem ser em virtude de diferenças nas sequências de gene entre os indivíduos. O termo "polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição" foi concebido para descrever essa variação. Por exemplo, DNA genômico pode ser extraído de indivíduos de cana-de-açúcar de qualquer uma das populações citadas na presente invenção, digerido com uma enzima de restrição, tal como (mas, não limitado a) EcoRI, HindIII, Dral, BamHI. Fragmentos de restrição podem ser separados sobre um gel de agarose a 0,8% (peso/v) usando TAE (Tris acetato a 40 mM, pH de 8,0; EDTA a 2 mM) como tampão de operação a 20 mA durante 22 h e transferido para membranas de náilon.

[099] SEQ ID NOs. 1-203 podem ser usadas para gerar sondas usando 32PdCTP com qualquer kit comercial, tal como o kit Rediprime II da Amersham (EUA) . HibridizaçÕes podem ser realizadas em uma solução de hibridização contendo, por exemplo, Na2P04 a 0,5 M, pH de 7,2, BSA a 1%, SOS a 7%, 100 ng/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado, a 65°C durante até 24h. As membranas podem ser lavadas uma vez durante 5 min a 65 °C em solução I (2 x SSC; SOS a 5%), então, 20 min a 65°C em solução II (1 x SSC; SOS a 5%) e 20 min a 65°C em solução III (0,5 x SSC; SOS a 5%). Polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição pode ser visualizado expondo a uma placa de formação de imagem durante 3-10 dias a -80°C e detectado usando um Phosphoimager, tal como FLA3000 (Fuji, Japão). Um técnico versado no assunto irá usar facilmente os procedimentos padrões para fazer notação, análise de cada segregação de marcador celular nos indivíduos da população e, finalmente, a análise de ligação para prever a utilidade de cada uma de SEQ ID Nos. 1-203 como marcadores moleculares. Um exemplo dessa etapa foi descrito por Garcia e colaboradores, (2006).

[100] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes a por meio de ilustração e exemplos para fins de clareza e compreensão, será óbvio que determinadas modificações e modalidades alternativas da invenção são consideradas, as quais não se desviam do espírito e escopo da invenção, conforme definido pelos ensinamentos precedentes e reivindicações em anexo. TABELAS: Tabela I - Genótipos de S. officinarum e S. spontaneum usados para os poli-cruzamentos. S. offlcinarum S. spontaneum Caiana Fita IN8458 IK76108 IN8488 Lahaina Krakatau MZ151 SES 147b MZ151 roxa US56158 Sabura US7440 Salangor US851008 Sinimbu UM721 NG.213 UM691 Fiji 47 SES 194 Hinahina 18 IK7686 Manjrí Red US56193 Muntok Java US57.1723 NG77142 Soff8268 SS601 Sylva NG2 8 8 0 Vae Vae Ula IJ76315 1N8425 Tabela II - Medições de Brix dos 16 indivíduos (qenótipos) selecionados para caracterização de perfil de expressão cênica.

Classificação Genótipo Brix crcgF^ziT ' CTC98-242 23, 90 CTC98-243 22,90 Alto Brix CTC98-244 23,40 CTC98-24 6 22,60 CTC98-252 22,20 CTC98-253 22,50 CTC98-258 22,10 CTC98-261 .......... 8,60” ~~ CTC98-2 62 9, 10 CTC98-265 9, 10 Baixo Brix CTC98-268 9,35 CTC98-271 10, 60 CTC98-272 10,80 CTC98-277 10,60 CTC98-279 10,60 Tabela III - Proles e variedades de cana-de-açúcar usadas para identificação de marcador molecular Tabela V - Genes diferencialmente expressos entre um grupo de alto brix de oi to plantas e um grupo de baixo brix de oito plantas.

Internódulo 9 Tabela VI - Genes diferencialmente expressos entre um grupo de oito plantas de alto brix e um grupo de oito plantas de baixo brix.

Tabela VII - Genes diferencialntenbe expressos entre uma variedade com alto brix e uma variedade com baixo brix.

Tabela VIII - Genes diferencialmente expressos entre tuna variedade com alto brix e uma variedade com baixo brix.

Tabela IX - Genes diferencialmente expressos entre um grupo de oito plantas de alto brix e um grupo de oito plantas de baixo brix.

Tabela X - Número de ocorrências de expressão diferencial para cada SAS em todas as amostras analisadas.

Tabela XIV - Genes de quinase semelhantes SHF-relacionados e subunidades regulatòrias diferencialmente expressas entre variedades com alto Srix e baixo Brix.

Tabela XV - Genes diferencialroente expressos entre o internódulo 9 (maduro, rico em agúcar) e o internódulo 1 imaturo, pobre em açúcar) de um grupo de sete plantas com alto brix.

Tabela XVII - Genes diferencialmente expressos entre o internódulo 9 {maduro, rico em açúcar) e o internádulo 1 (imaturo, pobre em açúcar) de um grupo de sete plantas com baixo bnx.

Tabela XVIII - Genes diferencialmente expressos entre o internódulo 9 (maduro , rico em açúcar) e o internòdulo 1 (imaturo, pobre em açúcar) de uma reserva de sete plantascom baixo brix.

Tabela XIX - Genes diferencialmente expressos entre o inte módulo 5 (imediatamente maduro, rico em açúcar) e o internódulo 1 (imaturo, pobre em açúcar) de uma reserva de sete plantas com alto brix.

Tabela XX - Genes diferencialmente expressos entre ointernòdulo 5 (imediatamente maduro, rico em açúcar) e ointernòdulo 1 (imaturo, pobre em açúcar) de um grupo de sete plantas com baixo brix.

Tabela XXI - Um exemplo de genes que sâo diferencialmente expressos quando plantas com alto e baixo Brix são comparada e quando internódulos maduros (irrternódulo 9) e imaturos (internódulo 1) sâo comparados. Dados indicados com um asterisco foram publicados por Felix J. M. (2006).

Tabela XXII - sequências de oligonucleotideo usadas em reações de FCR em tempo real. * As sequências do primer GAPDH foram recuperadas de Iskandar e colaboradores (2004), REFERÊNCIAS

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Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - fornecimento de uma planta; e - modulação do nivel de expressão na referida planta de um polinucleotideo selecionado do grupo consistindo de SEQ ID No. 378 (CIPK-8) e SEQ ID No. 380 (COMT).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o referido nivel de expressão é modulado através de mutagênese.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida mutagênese é quimicamente induzida.

4. Método para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - fornecimento de uma planta; e - expressão na referida planta de pelo menos um polinucleotideo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência a uma sequência de nucleotideo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID No. 378 (CIPK-8) e SEQ ID No. 380 (COMT), seus fragmentos, seus complementos e sequências as quais se hibridizam às SEQ ID No. 378 (CIPK-8) e SEQ ID No. 380 (COMT), sob condições de alta estringência.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideo sofrer interferência usando ácido nucleico anti-senso ou interferência de RNA.

6. Método para alterar a capacidade de uma planta de acumular açúcar caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - fornecimento de uma planta; e - interferência com a expresssão de pelo menos um polipeptideo tendo pelo menos 85% de similaridade a um polipeptideo codificado por uma sequência de nucleotideo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID No. 378 (CIPK-8) e SEQ ID No. 380 (COMT).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão do referido polipeptideo sofre interferência usando ácido nucleico anti-senso ou interferência de RNA para interferir com a expressão do polinucleotideo que codifica o referido polipeptideo.