BRPI0719980A2 - Método para aumentar a quantidade de vitamina k2 obtida pelo cultivo de bactérias ácido-lácticas, biomassa enriquecida, seu uso, método para produzir vitamina k2 ou para preparar ou enriquecer um produto alimentar, produto alimentar e seu uso - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA AUMENTAR A QUANTIDADE DE VITAMINA K2 OBTIDA PELO CULTIVO DE BACTÉRIAS ÁCIDO-LÁCTICAS, BIOMASSA ENRIQUECIDA, SEU USO, MÉ- TODO PARA PRODUZIR VITAMINA K2 OU PARA PREPARAR OU ENRIQUE- CER UM PRODUTO ALIMENTAR, PRODUTO ALIMENTAR E SEU USO".

A presente invenção refere-se ao domínio dos produtos alimen- tares ricos em nutrientes, vitaminas e/ou oligoelementos a fim de melhorar o teor e o equilíbrio qualitativo e quantitativo dos aportes nutricionais no homem.

A invenção se interessa mais especialmente aos meios de enri- quecer os alimentos em vitamina K.

Mais precisamente, a presente invenção se refere a um proces- so para aumentar a quantidade de vitamina K2 obtida, cultivando-se para isso pelo menos uma cepa de bactéria láctica produtora de vitamina K2, no qual a cultura da dita cepa é realizada em condições de "resting cells", de 15 modo que a quantidade de vitamina K2 produzida pela cultura em "resting cells" é superior, de um fator pelo menos igual a cerca de 1,2, àquela obtida cultivando-se a dita cepa em condições de fermentação padrão.

Por outro lado, a presente invenção visa a biomassa obtida a partir de uma cultura de bactéria láctica produtora de vitamina K2 de acordo com o processo acima.

A invenção também se refere a um processo de produção de vitamina K2, a processos de preparação de produtos alimentares, notada- mente de produtos fermentados e/ou de produtos lácteos frescos, enriqueci- dos em vitamina K2, assim como aos produtos alimentares assim obtidos.

A vitamina K é uma vitamina lipossolúvel que se apresenta sob duas

formas naturais: a vitamina K1 (ou filoquinona) e a vitamina K2 (ou menaquinona).

A vitamina K1 é sintetizada pelos vegetais. Ela é encontrada principalmente nos legumes verdes (legumes-folhas) e no óleo de soja. A vitami- na K1 intervém mais diretamente no processo de coagulação do sangue.

A vitamina K2, no que Ihe diz respeito, é produzida pelas bacté-

rias da flora intestinal. Ela aparece geralmente em pequenas quantidades em certos alimentos depois de um processo de fermentação (queijo, produtos asiáticos típicos tais Como o miso e o natto japonês, à base de soja fermen- tada, etc.). Numerosas bactérias são capazes de sintetizar a vitamina K2. Assim, além das bactérias da flora intestinal e, notadamente, as espécies Escherichia coli, Bacillus subtilis e Bacteroides spp, podem ser citadas cer- 5 tas espécies ou subespécies de bactérias lácticas tais como Lactococcus Iaetis spp. Iactisj Lactococcus Iactis spp. eremoris, Leueonostoe laetis, Leu- eonostoe mesenteroides e Propionibaeterium sp. A quantidade de vitamina K2 sintetizada por essas bactérias varia geralmente de cerca de 29 a 90 μς/Ι de leite fermentado .(Morishita^e al., 1999). É importante destacar que as 10 medidas de produção de vitamina K2 são na maior parte das vezes realiza- das a partir de Iiofilizados de resíduos celulares e os resultados dessas me- didas revelam uma grande heterogeneidade dos níveis de produção em fun- ção das cepas testadas, que pode variar do simples a mais do triplo (Mori- shita e al. 1999; Parker e al., 2003). Em termos de atividade biológica, a vi-, 15 tamina K2 é sobretudo conhecida por sua ação sobre a calcificação dos te- cidos moles.

AvitaminaKfoiiniciaímentedescritaporseupapelessenciaIno processo de coagulação do sangue. Assim, grandes carências em vitamina K provocam hemorragias, com alongamento anormal do tempo de coagula- 20 ção, e equimoses. Foi durante muito tempo considerado que as grandes ca- rências em vitamina K eram raras no adulto, as necessidades podendo em princípio ser cobertas de maneira satisfatória por uma alimentação variada e equilibrada graças â produção endógena da vitamina pelas bactérias cólicas. Com relação a isso, as pessoas de risco são tipicamente:

-os recém-nascidos, cujos intestinos não possuem no nasci-

mento as bactérias produtoras de vitamina K;

- as pessoas cujas funções hepáticas, biliàres ou intestinais são perturbadas (doenças hepáticas, mucoviscidose, colites, disenterias...); e

- aquelas que tomam antibióticos em longo curso.

Mais recentemente, foi descoberto que o impacto da vitamina K

sobre a saúde humana não se limitava a seu papel nos mecanismos de coa- gulação sanguínea. De fato, desde os anos 80, a vitamina K é também reco- nhecida por seu papel no metabolismo ósseo (Hart e al., Hart e aL, 1985).

Essa vitamina desempenha o papel de cofator em uma reação enzimática que condiciona a atividade da osteocalcina no âmbito da regula- ção da formação óssea (Hauschka PV e al., 1989; Ducy P e al., 1996). Seu 5 papel consiste mais precisamente em condicionar a carboxilação da osteo- calcina, proteína chave que regula o processo de formação óssea. Em caso de deficiência em vitamina K, essa reação não ocorre, provocando o aumen- to da razão sanguínea osteocalcina descarboxilada sobre osteocalcina car- boxilada (Váánánen e a/., 1999).

A evolução demográfica dos países ocidentais se traduziu por

um envelhecimento progressivo das populações, associado em corolário a um aumento da prevalência das patologias degenerativas, notadamente da osteoporose. A esse título, a osteoporose é doravante reconhecida com um problema maior de saúde pública.

As estimativas geográficas estabelecidas nos anos 90 puxaram

a campainha de alarme prevendo assim um aumento considerável da inci- dência dessa patologia nos próximos 50 anos, notadamente nos mais ve- lhos. Impôs-se portanto rapidamente a necessidade e a urgência de empre- ender ações a fim de prevenir essa patologia, até aí raramente despistada e assumida tardiamente.

É doravante reconhecido què a prevenção da osteoporose deve começar desde a infância, através de um crescimento ósseo ótimo, e pros- seguir toda a vida por uma manutenção da massa óssea. É sabido que os fatores nutricionais desempenham um papel importante no desenvolvimento 25 e na manutenção do patrimônio ósseo. Até agora, as estratégias nutricionais consideradas ou propostas para prevenir a osteoporose repousam essenci- almente em dois fatores chaves que são o cálcio e a vitamina D. Portanto, é sabido hoje que outros fatores nutricionais poderiam apresentar um interes- se notável.

Devido a seu papel maior na formação óssea, a vitamina K apa-

rece cada vez mais na literatura como uma pista promissora para preservar a saúde óssea do homem ao longo de toda a sua vida. OsaportesnutricionaisrecomendadosemvitaminaKnohomem (1,5 -dfe peso) foram estabelecidos levando-se em consideração so-

mente seu papel nos fenômenos de coagulação. Ora, estudos recentes su- gerem que esses aportes nutricionais recomendados são finalmente subes- 5 timados se leva-se também em consideração a atividade da vitamina K no metabolismo ósseo (Ronden e al., 1998).

Se as necessidades em vitamina K são ainda mal conhecidas, não deixa de ser um fato que pequenos aportes estão associados a uma pequena massa óssea e a um risco aumentado de fraturas no adulto (Hart e 10 al., 1985; Knapen e al., 1989; Szulc e al., 1993; Booth e al., 2000). Além dis- so, estudos de intervenção nas mulheres com menopausa mostraram que a vitamina K poderia permitir diminuir as perdas ósseas para esse alvo (Shiraki e al., 2000; Braam e al., 2003). Finalmente, estudos no animal sugerem que ela poderia desempenhar um papel favorável no decorrer do pico de massa 15 óssea e isso, ainda melhor em caso de associação sinérgica com a vitamina D. No entanto, os estudos que ligam claramente a vitamina K e o crescimen- to ósseo só foram até agora feitos no animal.

Além disso, estudos recentes permitiram trazer argumentos su- plementares em favor do impacto da vitamina K sobre o metabolismo ósseo e, em especial, sobre a constituição e a preservação da massa óssea (Booth e al., 2000; Shiraki e al., 2000; Braam e al., 2003; Hirano e Ishi, 2002).

Contrariamente ao adulto, poucos dados estão ainda disponíveis no que diz respeito aos efeitos benéficos da vitamina K sobre o metabolismo ósseo da criança. É sabido somente que é essencial otimizar a massa óssea durante o período de crescimento, a fim de constituir um reservatório ósseo máximo e proteger o adulto contra o risco de osteoporose a vir.

Em todo o caso, destaca-se do conjunto dos dados disponíveis atualmente que a melhoria do teor em vitamina K dos produtos alimentares é uma pista especialmente interessante e promissora para permitir que o indi- viduo construa e mantenha uma boa constituição óssea.

Nesse contexto, já existem produtos industriais no mercado ali- mentar que contêm uma quantidade notável de vitamina K. Podem notada- mente ser citados certos produtos lácteos que contêm bactérias lácticas, tais como os "Petits Gervais aux fruits" comercializados na França pela Reque- rente. Será no entanto notado que, por um lado, o teor desses produtos em vitamina K depende geralmente do tipo de fermentos utilizados, e, por outro 5 lado, as cepas de Lactococcus Iaetis classicamente utilizadas nos produtos lácteos não produzem uma quantidade suficiente de vitamina K para verda- deiramente satisfazer as necessidades da população, e mesmo para auxiliar a corrigir eventuais carências em vitamina K.

Existe portanto uma necessidade na técnica atual de produtos alimentares, notadamente produtos fermentados e/ou produtos lácteos fres- cos, que contêm vitamina K em quantidades suficientes para contribuir para satisfazer as necessidades e, se for necessário, para satisfazer as carên- cias, tanto na criança e no adolescente, quanto no adulto e na pessoa idosa.

Na seqüência, os termos "vitamina K2" e "vitamina K" são utili- zados indiferentemente para designara vitamina K2.

A presente invenção visa portanto responder a essa necessida- de propondo para isso pela primeira vez preparar produtos alimentares, tais como produtos fermentados e/ou produtos lácteos frescos, nos quais fer- mentos capazes de produzir a vitamina K são empregados em condições 20 que favorecem de maneira absolutamente sensível a produção de vitamina K em relação às condições de produção clássicas.

Por outro lado, no decorrer de seus trabalhos, os inventores ob- tiveram novos variantes naturais de cepas naturais de bactérias lácticas, que produzem quantidades de vitamina K significativamente superiores àquelas 25 produzidas pelas cepas naturais das quais eles derivam (ver a parte "Exem- plos" abaixo). Assim será possível vantajosamente utilizar esses variantes "su- perprodutores" de vitamina K nas condições de execução especialmente favorá- veis para a produção de vitamina K que são o objeto da presente invenção.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção sé refere a um processo para aumentar a quantidade de vitamina K2 obtida, cultivando-se pelo menos uma cepa de bactéria láctica produtora de vitami- na K2, no qual a cultura da dita cepa é realizada em condições de "resting cells", o dito processo compreendendo pelo menos:

a) a semeadura de um meio de cultura apropriado com uma quanti- dade de células bacterianas vivas que vai de cerca de 108a 1011 ufc/ml; e

b) a fermentação do meio assim semeado durante um período 5 que vai de cerca de 4 a 48 horas, de preferência de cerca de 8 a 48 horas, a

uma temperatura que vai de cerca de 4 a 50°C, de preferência que vai de cerca de 4 a 40°C, de modo que no final da etapa b), a quantidade de vita- mina K2 produzida pela cultura em "resting cells" é superior, de um fator pelo menos igual a cerca de 1,2, àquela obtida çultivando-se a dita cepa em con- dições de fermentação padrão.

A expressão "cultura em "resting cells"" ou "cultura em condi- ções de "resting cells"" faz parte da linguagem comum no domínio técnico da presente invenção. A noção de "resting cells" é portanto perfeitamente clara para o profissional. Na França, os técnicos do domínio compreendem e utili- 15 zam correntemente os termos ingleses "resting cells", que não necessitam portanto ser traduzidos. É precisado para todos os fins úteis que uma tradu- ção francesa apropriada mas pouco utilizada dos termos "resting cells" é "cé- lulas não-proliferantes".

As "condições de fermentação padrão" são, como seu nome in- dica, absolutamente clássicas e bem conhecidas pelo profissional (fala-se também de "condições de laboratório"). As "condições de fermentação pa- drão" preferidas no sentido da presente invenção são as seguintes: uma pré- cultura da cepa é realizada em meio comercial M17 (Difco® M17 Agar) ou em um meio equivalente, adicionado de 20 μΙ/ml de uma solução de hemina a 0,5 mg/ml em soda 0,1 M. Para a cultura que segue, a semeadura é reali- zada a 1 % com o auxílio da pré-cultura. A temperatura de incubação é de cerca de 30°C. A aeração é assegurada por simples agitação. Se considera- rá que as condições de fermentação podem ser modificadas em caso de necessidade pelo profissional, com base em seus conhecimentos gerais e, eventualmente, depois de experiências de regulagens de rotina. No entanto, se terá o cuidado de sistematicamente preservar os três critérios essenciais seguintes: (i) o meio de cultura é um meio apropriado para cultivar as cepas de bactérias lácticas, notadamente as cepas de Lactococcus spp.] (ii) pelo menos um composto que contém um núcleo hêmico (por exemplo, hemina, catálase ou derivados de clorofila) é acrescentado no meio de pré-cultura e/ou de cultura (de preferência, ao mesmo tempo no meio de pré-cultura e 5 no meio de cultura); e (iii) a pré-cultura e/ou a cultura (de preferência, so- mente a pré-cultura) é (são) executada(s) sob agitação.

Modos de realização especiais do processo de acordo com a invenção são tais que:

- na etapa a), a semeadura do meio de cultura é efetuada com uma quantidade de células bacterianas vivas que vai de cerca de 5.108 a

1010 ufc/ml e que vai mais especialmente ainda de cerca de 2.109 a 6.109;

- na etapa b), a fermentação do meio é efetuada nas condições padrão durante um período que vai de cerca de 12 a 36 horas, preferencial- mente de cerca de 15 a 24 horas;

- na etapa b), a fermentação do meio é conduzida nas condições

padrão a uma temperatura que vai de cerca de 15 a 35°C, de preferência de cerca de 20 a 30°C.

De preferência, no final da etapa b), a quantidade de vitamina K2 produzida pela cultura em "resting cells" é superior, de um fator pelo menos 20 igual a cerca de 1,5, àquela obtida cultivando-se a dita cepa em condições de fermentação padrão. Esse fator é de maneira ainda preferida pelo menos igual a cerca de 1,7, mais preferencialmente pelo menos igual a cerca de 1,8, mais preferencialmente ainda pelo menos igual a cerca de 1,9. Valores desse fa- tor ainda mais preferidos são de cerca de 2; 2,2; 2,4; 2,5; 2,7; 2,8; 2,9; 3.

Procura-se assim de preferência atingir, graças aos meios da

invenção, níveis de produção de vitamina K2 da ordem de 30 μg de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação padrão. Melhor, os níveis dé produção podem atingir cerca de 40 μς de vitamina / 100 g de leite fermentado, e, de maneira ainda mais preferida, eles podem 30 se situar nas proximidades de, e mesmo ultrapassar, cerca de 45 ou 50 μg de vitamina K2 / 100 g de leite fermentado. Assim, níveis de produção de cerca de 55, 60, 65, 70, 75 μg de vitamina K2 /100 g de leite fermentado, e mais ainda, são especialmente preferidos.

De acordo com um modo de realização, a cepa de bactéria lácti- ca produtora de vitamina K2, empregada no âmbito do processo da invenção é escolhida entre os gêneros Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus e Propionibacterium. Em especial, a cepa de bactéria láctica utilizada é esco- lhida entre as espécies Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostocdextrani- cum, Enterococcus faêcium, Propionibacterium sp. De maneira vantajosa, a cepa de bactéria láctica é escolhida entre os variantes naturais de Lactococ- eus lactis subsp. cremoris produtores de vitamina K2 que foram obtidos pe- los inventores no âmbito de trabalhos relatados nos exemplos abaixo: a vari- ante I-3557 depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microorganis- mos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, França) em 20/01/2006, a variante I-3558 depositado na CNCM em 20/01/2006 e a variante I-3626 depositado na CNCM em 19/06/2006.

O termo "variantes" cobre aqui:

- as variantes naturais, quer dizer obtidas espontaneamente a partir de uma cepa de bactéria láctica de referência sob o efeito de uma pressão de seleção; os variantes naturais não sofrem portanto nenhuma

manipulação genética, mas são obtidos principalmente por mutação e sele- ção a partir da cepa de referência; e

- os mutantes que compreendem uma ou várias mutações em seu genoma, que foram introduzidas por engenharia genética, quer dizer, por técnicas de mutagênese dirigida, notadamente por transformação gené-

tica com o auxílio de vetores, aplicadas á cepa de referência.

Em todos os casos, as "variantes" são, no sentido da invenção, cepas capazes de produzir vitamina K2. Vantajosamente, se o nível de pro- dução é de pelo menos cerca de 5,5 μg de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação padrão (também chamadas "con- 30 dições de laboratório"), será possível falar de variante "superprodutor" de vitamina K2.

Será notado que, em certos países (notadamente na Europa), precauções devem ser tomadas pelos industriais de alimentos quando eles desenvolvem produtos destinados à alimentação humana e/ou animal, nos quais são incorporados micro-organismos, mais especialmente micro- organismos vivos. De fato, os organismos (aqui, micro-organismos) geneti- 5 camente modificados (OGM ou mutantes) podem suscitar um sentimento de temor e de apreensão nos consumidores. Essa imagem negativa da qual sofrem os OGM em certos países é tal que o público tem tendência a "boico- tar" os alimentos que contêm OGM. Também, em um contexto no qual os consumidores exigem sempre mais transparência aos níveis do conteúdo 10 dos produtos alimentares que lhes são propostos e da origem dos ingredien- tes que esses produtos contêm, os industriais podem ser levados a propor produtos quase exclusivamente, e mesmo exclusivamente, sem OGM. No contexto da presente invenção, pode ser, portanto, vantajoso que os produ- tos alimentares provenientes da indústria e que contêm microorganismos 15 sejam preparados utilizando-se para isso exclusivamente cepas naturais ou variantes naturais de cepas naturais.

De acordo com um modo de realização, na etapa a), o meio de cultura apropriado contém gordura. Ele contém de preferência pelo menos cerca de 0,5 %, mais preferencialmente ainda pelo menos cerca de 3,5 % de 20 gordura. Um tal meio pode por exemplo ser à base de creme lácteo ou de suco de soja. Pode também se tratar de um leite ou de um leite cujo poder de tampão foi aumentado. Bem evidentemente, combinações desses dife- rentes meios podem também ser consideradas. A título de exemplo de "leite com poder tampão aumentado", será citado notadamente um leite adiciona- 25 do de β-glicerolfosfato e/ou citrato e/ou proteínas de leite e/ou qualquer in- grediente alimentar apropriado dotado de um poder de tampão.

Por exemplo, um leite semidesnatado contém tipicamente cerca de 1,5% de gordura; um leite integral contém geralmente cerca de 3,5 % de gordura.

Em um modo de realização preferido, o processo objeto da pre-

sente invenção compreende por outro lado pelo menos uma etapa preliminar à etapa a), que consiste em pré-cultivar a cepa em condições de respiração, em um meio de pré-cultura apropriada que contém pelo menos uma porfirína a uma concentração final de pelo menos cerca de 0,5 ^g/ml. Concentrações e/ou gamas de concentrações dè porfirína ainda mais preferidas são de pelo menos cerca de 1 μg/ml, melhor de pelo menos cerca de 5 μg/ml, e ainda melhor de pelo menos cerca de 10 μς/ιηΙ.

Vantajosamente, a pré-cultura é incubada a uma temperatura que cai de cerca de 4 a 40°C, de preferência a uma temperatura que vai de . cerca de 18 a 35°C, com um valor preferido de cerca de 30°C.

O tempo de incubação da pré-cultura pode variar em função das cepas e das outras condições de execução. Ele é de preferência de cerca de 8 horas, preferencialmente de pelo menos de cerca de 12 horas, mais prefe- rencialmente ainda de pelo menos de cerca de 16 horas.

A oxigenação da pré-cultura pode ser realizada por agitação ou

aeração.

Uma etapa intermediária pode por outro lado ser executada en-

tre a etapa preliminar de pré-cultura e a etapa a) do processo objeto da pre- sente invenção. Essa etapa intermediária consiste em concentrar a biomas- sa obtida no final da pré-cultura, por exemplo por centrifugação da pré- cultura seguida pela recuperação do resíduo bacteriano.

Será notado que, considerando-se as aplicações do objeto da

presente invenção no domínio alimentar, serão utilizadas de preferência condições que são ao mesmo tempo (i) aplicáveis e exploráveis na escala industrial (em termos de realização, rendimento, custo, equipamento, etc.) e (ii) apropriadas a produtos alimentares (em termos de propriedades físicas e organolépticas dos produtos acabados (gosto, odor, textura, aspecto, etc.)).

Um segundo aspecto da presente invenção está relacionado com a biomassa enriquecida suscetível de ser obtida por cultura de pelo menos uma cepa de bactéria láctica produtora de vitamina K2 em condições de "resting cells" de acordo com o processo precedentemente descrito.

Em um terceiro aspecto da presente invenção, é utilizada a bio-

massa acima mencionada para preparar um produto alimentar enriquecido em vitamina K2. Um quarto aspecto da presente invenção se refere a um proces- so para produzir vitamina K2, que compreende pelo menos:

a) a execução do processo para aumentar a quantidade de vita- mina K2 obtida cultivando-se pelo menos uma cepa de bactéria láctica pro-

dutora de vitamina K2, de acordo com a descrição precedente; e

b) a recuperação da vitamina K2 assim produzida.

De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção visa processos para preparar um produto alimentar enriquecido em vitamina K2, ou para enriquecer um produto alimentar com vitamina K2.

De acordo com um primeiro modo de realização, um tal proces-

so compreende pelo menos:

a) a produção de vitamina K2 de acordo com o processo objeto do quarto aspecto da invenção;

b) a adição de vitamina K2 assim produzida ao dito produto ali- mentar, ou a uma preparação intermediária desse último; e

c) á obtenção do dito produto alimentar enriquecido em vitamina K2.

De acordo com um segundo modo de realização, um processo

para preparar um produto alimentar enriquecido em vitamina K2 compreende pelo menos:

a) a cultura de pelo menos uma cepa de bactéria láctica produto-

ra de vitamina K2 em condições de "resting cells" de acordo com o processo para aumentar a quantidade de vitamina K2 obtida a partir de uma cultura dessa cepa (primeiro aspecto da invenção);

b) a adição da biomassa obtida a partir da cultura em a), ào dito produto alimentar ou a uma preparação intermediária desse último; e

c) a obtenção do dito produto alimentar enriquecido em vitamina K2.

Alternativamente, é possível prever realizar simultaneamente as

etapas a) e b) acima:

a) a cultura de pelo menos uma cepa de bactéria láctica produto- ra de vitamina K2 em condições de "resting cells" de acordo com o processo para aumentar a quantidade de vitamina K2 obtida a partir de uma cultura dessa cepa (primeiro aspecto da invenção), no dito produto alimentar ou em uma preparação intermediária desse último; e

b) a obtenção do produto alimentar enriquecido em vitamina K2.

Nesse caso, a ou as cepas podem notadamente ser executadas utilizando-se para isso concentrados de bactérias pré-cultivadas no local (no 5 sítio de produção dos produtos alimentares), ou utilizando-se bactérias pré- cultivadas por um fornecedor de fermentos, e depois acondicionadas e ex- pedidas para o(s) sítio(s) de produção dos produtos alimentares. Os forne- cedores podem acondicionar as bactérias no estado fresco ou congelado; alternativamente, as bactérias podem ser secadas ou liofilizadas. As bacté- 10 rias são, em todos os casos, acrescentadas à massa láctea de maneira ab- solutamente clássica (como qualquer outro fermento láctico conhecido). Para a etapa seguinte de cultura em condições favoráveis à produção de vitamina K2, são aplicadas ás condições de execução que são um dos objetos da presente invenção.

Mais um outro modo de realização do processo para enriquecer

um produto alimentar em vitamina K2 compreende pelo menos:

a) a adição da biomassa de acordo com a presente invenção, ao dito produto alimentar ou a uma preparação intermediária desse último; e

b) a obtenção do dito produto alimentar enriquecido em vitamina K2. Tipicamente, utiliza-se a biomassa como um fermento láctico

clássico.

Um sexto aspecto da presente invenção é relativo a um produto alimentar enriquecido em vitamina K2 suscetível a ser obtido pela execução de um processo tal como descrito acima.

Alternativamente, um produto alimentar enriquecido ém vitamina

K2 de acordo com a presente invenção contém a biomassa descrita acima.

A invenção se interessa aos produtos alimentares para o homem e/ou o animal, com uma preferência para os produtos alimentares destina- dos à alimentação humana. Vantajosamente, um tal produto alimentar enri- quecido em vitamina K2 reforça a solidez dos ossos da pessoa que o con- some.Essa pessoa é, de maneira preferida, uma criança.

De preferência, um produto alimentar no sentido da invenção é escolhido entre os produtos fermentados, os produtos lácteos frescos fer- mentados ou não, os produtos à base de suco de origem vegetal (frutas, le- gumes, cereais, soja, etc.) fermentados ou não, e suas combinações. De maneira mais especialmente preferida, um produto alimentar no sentido da 5 invenção é um produto fermentado e/ou um produto lácteo fresco.

No contexto da invenção, os "produtos lácteos frescos" desig- nam mais especialmente produtos lácteos frescos e fermentados, prontos para o consumo humano, quer dizer alimentos lácteos frescos e fermenta- dos. No presente pedido, são mais especialmente visados os leites fermen- 10 tados e iogurtes. Os ditos alimentos lácteos frescos e fermentados podem alternativamente ser queijos branco ou "petits-suisses".

São dadas aos termos "leites fermentados" e "iogurtes" suas signi- ficações usuais no domínio da indústria lácteo, quer dizer, produtos que são destinados ao consumo humano e que são provenientes da fermentação 15 láctica acidificante de um substrato lácteo. Esses produtos podem conter ingredientes secundários tais como frutas, vegetais, açúcar, etc. É possível, por exemplo, se referir ao Decreto francês n2 88-1203 de 30 de dezembro de 1988 relativo aos leites fermentados e ao iogurte, publicado no Journal Offi- ciel de Ia République Française de 31 de dezembro de 1988.

Também é possível se referir ao "Codex Alimentarius" (prepara-

do pela Comissão do Codex Alimentarius sob a proteção da FAO e da OMS, e publicado pela Divisão Informação da FAO, disponível on Iine em http://www.codexalimentarius.net; cf. mais especialmente o volume 12 do Codex Alimentarius "Normes Codex pour Ie Iait et Ies produits laitiers", e a norma "CODEX STAN A-1 1 (a)-1975").

A expressão "leite fermentado” é assim reservada no presente pedido ao produto lácteo preparado com um substrato lácteo que foi subme- tido a um tratamento pelo menos equivalente à pasteurização, semeado com micro-organismos que pertence à espécie ou às espécies característica(s) 30 de cada produto. Um "leite fermentado" não sofreu nenhum tratamento que permite subtrair um elemento constitutivo do substrato lácteo empregado e notadamente não sofreu um escoamento; do coalho. A coagulação dos "lei- tes fermentados" não deve ser obtida por outros meios que não sejam aque- les que resultam da atividade dos micro-organismos utilizados.

O termo "iogurte" é no que Ihe diz respeito reservado ao leite fermentado obtido, de acordo com os usos locais e constantes, pelo desen- 5 volvimento das bactérias lácticas termofílicas específicas ditas Lactobacillus bulgarieus e Streptococcus termophilus, que devem se encontrar vivas no produto acabado, à razão de pelo menos 10 milhões de bactérias por grama acrescentadas na parte láctea.

Em certos países, a regulamentação permite a adição de outras 10 bactérias lácticas na produção de iogurte, e notadamente a utilização adicio- nal de cepas de Bifidobaeterium e/ou Laetobacillus aeidophilus e/ou Lacto- baeillus casei. Essas cepas lácticas adicionais são destinadas a conferir ao produto acabado diversas propriedades, tais como aquela de favorecer o equilíbrio da flora intestinal ou de modular o sistema imunológico.

Na prática, a expressão "leite fermentado" é portanto geralmente

utilizada para designar os leites fermentados diferentes dos iogurtes. Ela pode por outro lado tomar, de acordo com os países, nomes tão diversos quanto, por exemplo, "Kefir", "Kumiss", "Lassi", "Dahi", "Leben", "Filmjôlk", "Villi", "Aeidophilus milk".

Tratando-se dos leites fermentados, a quantidade de ácido lácti-

co livre contida no substrato láeteo fermentado não deve ser inferior a 0,6 g para 100 g por ocasião da venda ao consumidor, e o teor em matéria protéica trazida para a parte láctea não deve ser inferior àquela de um leite normal.

Finalmente, a denominação "queijo branco" ou "petit-suisse" é, 25 no presente pedido, reservada a um queijo não curado, não-salgado, que foi submetido a uma fermentação por bactérias lácticas unicamente (e nenhuma outra fermentação que não seja a fermentação láctica). O teor em matéria seca dos queijo branco pode ser abaixado até 15 g ou 10 g para 100 g de queijo branco, de acordo com que seu teor em gorduras é superior a 20 g, 30 ou no máximo igual a 20 g para 100 g de queijo branco, depois de completa dessecação. O teor em matéria seca de um queijo branco está compreendi- do entre 13 e 20 %. O teor em matéria seca de um petit-suisse no que Ihe diz respeito não é inferior a 23 g para 100 g de petit-suisse. Ele está geral- mente compreendido entre 25 e 30 %. Os queijo branco e petits-suisses são geralmente agrupados sob a denominação "queijos frescos", utilizada de maneira clássica no domínio técnico da presente invenção.

As figuras seguintes ilustram a presente invenção, sem no en-

tanto limitar nem o objeto nem o alcance da mesma.

- Figura 1: Histograma que ilustra a influência da concentração em gordura dos leites sobre a produção de vitamina K2 pelas bactérias lácti- cas. Cepas 1 e 2: exemplos de cepas naturais de Lactococcus lactis ssp.

cremoris.

- Figura 2: Exemplos de cinética de produção da vitamina K2 em leite integral e de cinética de acidificação (quadro superior esquerdo) para uma cepa natural de bactéria láctica (cepa ns 1).

- Figura 3: Histograma que apresenta a produção de vitamina K2

por culturas em "resting cells" a diferentes temperaturas. Referência: cultura

em condições de crescimento padrão.

- Figura 4: Histograma que apresenta a influência das condições de pré-cultura sobre a produção de vitamina K2 de acordo com as cepas.

- Figura 5: Gráfico que ilustra a influência da população bacteri-

ana inicial do variante natural I-3558 sobre a produção de vitamina K2 duran- te a fase de "resting cells", realizada em leite clássico ou em leite tampona- do. "Sem respiração": pré-cultura clássica e depois cultura em condições de "resting cells" em leite integral. "Respiração labo": pré-cultura em condições de respiração realizada em tubo e depois cultura em condições de "resting

cells" e leite integral. "Respiração labo em leite tamponado": pré-cultura em condições de respiração e depois cultura em condições de "resting cells" em leite tamponado pelo β-glicerolfosfato. "Respiração em fermentador": pré- cultura em condições de respiração realizada em fermentador seguida por uma cultura em condições de "resting cells" em leite clássico.

- Figura 6: Histograma que apresenta a influência da viabilidade

bacteriana da variante natural I-3558 sobre a pirodução de vitamina K2 du- rante a fase de "resting cells". VitK STZ: pré-cultura em condições de respi- ração tratada com a éstreptozotocina e depois cultura em condições de "res- ting cells" em leite integral adicionado de eritromicina. VitK R+: pré-cultura em condições de respiração realizada em tubo e depois cultura em condi- ções de "resting cells" em leite integral.

É claro que a presente invenção não se limita somente à descri-

ção acima. Outros modos de realização e vantagens da invenção poderão se destacar com a leitura dos exemplos abaixo/fornecidos a título puramen- te ilustrativo.

EXEMPLOS

PARTE A: OBTENÇÃO DE VARIANTES NATURAIS DE CEPAS NATURAIS DE BACTÉRIAS LÁCTICAS CAPAZES DE PRODUZIR QUANTIDADES VANTAJOSAS DE VITAMINA K

A título de observações preliminares, deve ser notado que os protocolos de obtenção de variantes naturais descritos abaixo são aplicáveis 15 a qualquer tipo de cepa de bactéria láctica de partida. Em função das cepas de partida que o profissional utilizará, ele poderá eventualmente ser levado, por razões essencialmente práticas, a modificàr algumas das condições ex- perimentais desenvolvidas pelos inventores. Em todo o caso, as modifica- ções que o profissional será suscetível de trazer aos procedimentos abaixo 20 serão menores e necessitarão unicamente de simples manipulações de roti- na que não implicam nenhuma atividade inventiva.

A-I- Obtenção e utilização de variantes naturais resistentes à bacitracina

Ainda que uma exposição a agentes tais como a bacitracina ou o perôxido seja conhecida para permitir selecionar cepas bacterianas que a- presentam uma resistência aumentada a esses agentes, nunca foi estabele- cida uma ligação na literatura entre a resistência à bacitracina ou ao peróxi- do e os níveis de produção de vitamina K2 pelas bactérias.

No âmbito de seus trabalhos, os inventores descobriram de ma- neira absolutamente inesperada que as bactérias eram capazes de desen- volver um mecanismo original de resistência a certos agentes tais como a bacitracina ou o peróxido, que implica um aumento da produção de vitamina K2. Os inventores consideraram tirar proveito dessa descoberta com a finaíi- dade da obtenção, utilizando para isso a bacitracina ou o peróxido, por e- xemplo, como agente de seleção, de variantes naturais de cepas de bacté- rias lácticas (notadamente Lactococcus lactis) capazes de super produzir a vitamina K2.

A-l-1 protocolo de obtenção de variantes resistentes à bacitracina

Umà pré-cultura foi realizada a partir de um cristal de uma cepa natural de Lactococcus lactis na presença de 2 mL de meio de cultura co- mercial clássico M17 (meio M17 Agar, Difco ®) adicionado de Iactose a 5 g/l (abaixo, meio M17 Lac) e de hemina (20 μΙ/mL) (abaixo, meio M17 Lac +

hemina). A incubação foi efetuada sob agitação a 30°C.

A pré-cultura serviu para semear 2 mL de M17 Lac+ hemina suplementado em bacitracina (4 μg/ml). A taxa de semeadura era de 1 %. A cultura foi em seguida incubada durante 48 H sob agitação a 30°C.

E depois, 100 μί dessa suspensão foram colocados sobre uma

gelose de M17 Lac. Um disco de papel embebido com 2,5 mg de bacitracina foi colocado no centro da placa. A gelose foi incubada 48 h a 30°C. Os clo- nes próximos do disco de papel foram cultivados na presença de bacitracina (4 μg/ml) em 2 mL de M17 Lac + hemina. A incubação durou 24 H sob agita- ção a 30°C.

As células foram isoladas em gelose Ml 7 Lac na presença de

bacitracina (2 μg/ml) depois de uma incubação de 48 H a 30°C. Os clones isolados foram cultivados em M17 Lac + hemina, e depois incubados duran- te 24 H sob agitação a 30°C. Essa suspensão serviu para a elaboração do estoque congelado.

Essas experiências permitiram que os Inventores selecionassem

o variante natural Lactococcus lactis subsp. cremoris I-3557 depositado na CNCM em 20/01/2006.

A-l-2 Protocolo de realização de um exemplo de produto lácteo com o vari- ante "bacitracina"

Uma pré-cultura foi realizada a partir de um cristal da cepa em 2

mL de M17 Lac.

A pré-cultura serviu pára semear, a 1 %, 50 mL de leite integral UHT que foram incubados a 30°C durante 24 H.

A tabela I abaixo dá o resultado da dosagem de vitamina K2 ex- presso em μg Equivalente MK-4/100 g de produto, para a variante bacitraci- na-resistente e a cepa correspondente selvagem.

Tabela I

Cepa Ι-3557 Selvagem VitaminaK 8,90 3,32 (em μς/100 g) A variante bacitracina resistente superproduz portanto, à razão de um fator 3, a vitamina K quando ela é comparada com a cepa selvagem de partida.

A-Il- Obtenção e utilização de variantes naturais resistentes ao peróxido A respiração de Lactococcus lactis foi colocada em evidência

muito recentemente (Duwat e al., 2001). O sequenciamento do genoma de uma cepa de L. lactis (IL1403) confirmou a presença de genes que codificam as funções necessárias para a respiração aeróbia (Bolotin e al., 2001). L. lactis possui de fato os óperons men e cytABCD que codificam as proteínas 15 necessárias para a síntese de menaquinona e para a biogênese do citocro- mo D. Essa espécie possui também os três genes implicados nas últimas etapas da síntese de heme (hemH, hemK, e hemN, que são exigidos na oxi- dação da porfirina para a ligação do ferro à heme), mas não possui os genes implicados nas primeiras etapas desse processo. No entanto L. Iactis é ca- 20 paz de realizar uma fosforilação oxidante na presença de protoporfirinogeno.

Também foi mostrado que L. lactis podia respirar na presença de oxigênio e de heme no meio de cultura. Essa respiração permite que as cé- lulas atinjam uma biomassa maior e o pH final observado é maior do que aquele habitualmente obtido. Culturas na presença de oxigênio e/ou de he- 25 me permitem obter curvas de crescimentos comparáveis durante aproxima- damente as 6 ou 7 primeiras horas de fermentação. Em seguida, o consumo de glicose diminui no caso das culturas em presença de oxigênio e de heme, e a produção de Iactato é então menor. Isso traduz um "shift" de metabolis- mo que se produz bastante tardiamente no decorrer da cultura. A respiração de L lactis é feita portanto próximo do fim da fase exponencial de cresci- mento (Duwal e al., 2001).

O papel da respiração de L. lactisainda não é conhecido, assim como o papel que a vitamina K2 pode ter nessa espécie de métabolismo de 5 preferência fermentai. Os inventores constataram por outro lado que a vita- mina K2 era produzida por cepas de L lactis enquanto que a respiração não era induzida nas condições testadas (nenhuma heme no meio e nenhuma agitação que permite uma boa oxigenação do meio).

No citoplasma, as proteínas só apresentam poucas pontes dis- 10 sulfetos contrariamente à proteínas extracelulares. Existe um sistema enzi- mático amplamente difundido que permite limitar o número de pontes dissul- fetos. As ligações S-S são reduzidas em função SH por intermédio de uma enzima, a tioredoxina. Essa enzima é regenerada pela tioredoxina redutase. Vido e al. (2005) criaram por engenharia genética um mutante trxB1 de L 15 lactis. O gene trxB1 codifica para a tioredoxina redutase. O estudo por ele- troforese bidimensional das proteínas sintetizadas por esse mutante mostrou que ele superproduzia algumas das enzimas da via de síntese da vitamina K2, a saber as enzimas MenB e MenD.

Baseados nesses dados assim como de acordo com observa- ções pessoais, os inventores supuseram que uma das vias possíveis para melhorar a produção de vitamina K2 por L lactis poderia ser induzir a respi- ração. Uma outra pista poderia tentar mobilizar a vitamina K2 para responder a um estresse oxidativo.

Os inventores então, procuravam a obtenção de variantes natu- rais resistentes a um estresse oxidativo.

A-ll-1- protocolo de obtenção de variantes resistentes a um estresse oxidativo

O peróxido foi escolhido como exemplo de agente oxidante utili- zável. Naturalmente, outros agentes oxidantes tais como os íons hiperclóricos, os íons ferrosos, a menadiona, o paraquat, o oxigênio ou qualquer outro com- posto oxidante apropriado, poderiam ser utilizados em condições similares.

Depois de uma pré-cultura em meio M17 Lac, as cepas naturais de partida foram repicadas no mesmo meio que contém concentrações cres- centes de peróxido (por exemplo, uma gama que vai de pelo menos 20 a pelo menos 25, 27, 28,5 mg/l aproximadamente). As culturas foram incuba- das a 30°C. Depois de 24 h, os primeiros tubos da gama de concentração que não apresentam crescimento foram recolocados a incubar durante 24 h 5 suplementares. Os clones foram em seguida isolados por esgotamento em meio gelosado. Um clone foi selecionado para uma concentração de peróxi- do de 27 mg/l. Os inventores notaram que acima de uma concentração de peróxido de 28,5 mg/l, não havia crescimento.

Essas experiências permitiram assim, que os inventores selecio- nassem a variante natural Lactococcus lactis subsp. cremoris I-3558 deposi- tado na CNCM em 10/01/2006.

A-ll-2- Protocolo de realização de um exemplo de produto lácteo com o vari- ante "peróxido"

O clone selecionado foi colocado em crescimento em leite inte- gral durante 24 h. Amostras foram em seguida retiradas e congeladas a -80°C para uma dosagem ulterior de vitamina K2.

A tabela Il abaixo, indica a quantidade de vitamina K2 produzida pela variante resistente ao peróxido, comparada com a quantidade produzi- da pela cepa de partida (quantidades expressas em μ-g Equivalente MK- 4/100 g de leite fermentado).

Tabela Il

Cepa Vitamina K (nghOO g) Selvagem 2,92 ±0,45 I-3558 5,94 + 0,76 Como mostra a tabela Il acima, a variante produz cerca de duas vezes mais vitamina K2 do que a cepa selvagem correspondente.

A-Ill- Obtenção e utilização de variantes naturais resistentes a análogos es- truturais dos aminoácidos aromáticos

Os aminoácidos aromáticos exercem um "feed-back" negativo sobre sua própria via de síntese, ao nível de uma etapa comum com as vias de síntese da vitamina K e dos folatos. Quando esses aminoácidos estão presentes no meio, essas vias não são ativadas. Os Inventores procuraram portanto suprimir essa regulação negativa.

A-ll-1- Protocolo de obtenção de variantes resistentes a análogos estruturais dos aminoácidos aromáticos

Uma cepa natural de L, lactis foi espalhada em um meio gelosa- 5 do quimicamente definido (Cocaign-Bousquet, M., e ai., 1995) que não con- tém nem triptofano, nem fenilalanina, nem tirosina. Os termos "meio quimi- camente definido" são perfeitamente compreendidos pelo profissional. Trata- se de um meio que só contém compostos simples e claramente definidos (por exemplo: vitamina B9, vitamina B12, adenina, tirosina...), contrariamente 10 a um meio semissintético que contém componentes complexos (por exem- plo: extrato de levedura, caseína hidrolisada ...).

Um papel mata-borrão foi colocado no centro das placas de pétri e embebido com 80 μΙ de uma solução que contém 50 mM dos compostos seguintes: m-fluorfenilalanina, p-fluorfenilalanina, m-fluortirosina e fenilalami- 15 namida. Esses compostos são anáíogos estruturais dos aminoácidos aromá- ticos. As placas foram incubadas a 30°C. Uma zona de inibição de cresci- mento apareceu em tomo dos discos. Depois de 48 h, clones resistentes apa- receram nessa zona. Esses clones foram recolocados em crescimento no meio quimicamente definido que não contém aminoácidos aromáticos. O meio foi 20 adicionado com uma solução que contém análogos estruturais desses aminoá- cidos. A concentração final de cada um desses compostos era de 1 mM.

A-lll-2- protocolo de realização de um exemplo de produto lácteo com os clones "aminoácidos aromáticos"

As culturas obtidas de acordo com o parágrafo A-111-1 supra ser- 25 viram para semear 50 ml de meio M17 Lac (taxa de semeadura de 1 %) adi- cionado de 1 ml de uma solução de hemina (500 mg/l). As mesmas culturas serviram para semear um meio que não contém hemina, mas que é coloca- do sob agitação. Um último tipo de cultura foi realizado. Um meio M17L foi semeado e colocado a 30°C sem agitação. As culturas foram colocadas uma 30 noite a 30°C sob agitação (250 rpm). Essas culturas foram em seguida cen- trifugadas 5 min a 6000 g. O sobrenadante foi retirado e substituído por 50 ml de leite integral. Depois de 24 h, os leites fermentados foram colocados a -SO0C esperando a dosagem da vitamina K2 (ver o parágrafo B-IV abaixo).

As experiências de dosagem da vitamina K2 permitiram que os inventores selecionassem um dos clones como sendo um variante natural que superproduz a vitamina K2 (ver o parágrafo B-Vl abaixo): trata-se do variante natural Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3626 depositado na CNCM em 19/06/2006.

PARTE B: DESENVOLVIMENTO DAS CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DAS BACTÉRIAS LÁCTICAS PARA FAVORECER A PRODUÇÃO DE VITAMINA K B-I- A influência da gordura no meio Por ocasião de dosagens efetuadas em diferentes produtos, os

inventores constataram que o produto que contém mais vitamina K2 era o creme fermentado. Além disso, a vitamina K é bastante hidrofóbica. Os invento- res emitiram portanto a hipótese de que a presença de gordura, ou pelo me- nos, um ambiente hidrofóbico, podia favorecer a produção de vitamina K2.

Fermentações foram portanto, realizadas em leites que contêm

diferentes concentrações de gordura. As pré-culturas foram realizadas em meio M17 Lac. Os leites foram semeados a 1 %. A fermentação foi mantida a 30°C durante 24 h. Em seguida, amostras foram congeladas esperando uma dosagem ulterior.

Os resultados estão representados na figura 1, para duas cepas

naturais de L. lactis subsp. cremoris (cepas n2 1 e 2).

Se são considerados os resultados obtidos com uma das duas cepas naturais estudadas a título de exemplos, a utilização de um leite se- midesnatado (com cerca de 1,5 % de gordura) no lugar de um leite desnata- 25 do permitia aumentar a produção de vitamina K2 de um fator 4. A passagem de um leite semidesnatado para um leite integral (cerca de 3,5 % de gordu- ra) permitia ganhar um fator 2.

Essa tendência era a mesma qualquer que sèja a cepa natural considerada.

No entanto, o aumento da quantidade de vitamina K2 produzida

com aquele do teor do meio em gordura parece assintótico visto que a fer- mentação de um creme com cerca de 40 % de gordura não permitiu obter quantidades de vitamina K2 superiores àquelas obtidas em um leite integral (dados não-mostrados).

B-Il- A influência da taxa de crescimento das bactérias lácticas

Por ocasião do crescimento em leite de urna cepa natural de L lactis subsp. cremoris (cepa natural n2 1), os inventores realizaram um a- companhamento da cinética da produção de vitamina K2.

Gomo o mostra a figura 2, a produção de vitamina só começava quando o crescimento desacelerava. A velocidade de crescimento podia ser apreendida pelo acompanhamento da cinética de acidificação. Quando a velocidade máxima de acidificação era tingida, a bactéria entrava em fase de desaceleração.

Esse tipo de comportamento é relativamente clássico por ocasi- ão da síntese de metabólitos secundários. Diferentes parâmetros podem ser estudados a fim de diminuir a taxa de crescimento: condições físico- 15 químicas subótimas (pH, temperatura...), compostos bacteriostáticos (antibi- óticos), a cultura em "resting cells". Essa última técnica consiste em realizar uma semeadura com uma quantidade de células que corresponde pelo me- nos àquela obtida normalmente no final da fermentação clássica. Nesse ca- so, não há crescimento bacteriano, a taxa de crescimento é nula.

Os Inventores procuraram assim combinar cultura em "resting

cells" e efeito da temperatura.

Um leite integral foi semeado com um FED (Fermento de Seme- adura Direta) que contém IO11 UFC/g à razão de 10 g/l. O Ieite foi em segui- da colocado a incubar em diferentes temperaturas.

Como mostra a figura 3, o abaixamento da temperatura não ti-

nha impacto positivo sobre a produção de vitamina K2. Em contrapartida, o fato de cultivar as bactérias em "resting cells" permitiu multiplicar a produção por cerca de um fator 2: 20^g/100 g contra 10'jig/100 g para uma fermenta- ção clássica com crescimento.

B-Ill- A influência da utilização da pré-cultura em condições de respiracão

A vitamina K2 participa na cadeia respiratória. L lactis é capaz de respirar mas essa respiração só intervém no final da fermentação, quer dizer, quando fluxo metabóiico se desacelera. Essa propriedade pode ser aproximada do que foi observado por ocasião das cinéticas de produção da vitamina K2.

É importante notar que fabricar inteiramente um produto alimen- 5 tar em condições de respiração parece dificilmente realizável em escala in- dustrial. De fato, apareceriam então problemas de aeração, de agitação, de espuma, etc., difíceis de superar sem rever as aparelhagens e processos de fabricação usuais, o que necessitaria investimentos muito grandes e geraria custos suplementares de produção inaceitáveis para a indústria agroalimentar. 10 Em contrapartida, se for o caso, ao pré-cultura poderia ser reali-

zada em condições de respiração sem que isso apresente muitas dificulda- des para os industriais.

Os inventores estudaram, portanto, o impacto da pré-cultura em condições de respiração sobre a produção de vitamina K2 pelas bactérias lácticas.

Para fazer isso, pré-culturas foram realizadas em meio M17 Lac adicionado com 20 μΙ/ml de uma solução de hemina a 0,5 mg/ml em soda 0,1 M. A semeadura foi realizada a 1 % e a temperatura de incubação era de 30°C. A aeração era assegurada por simples agitação.

Em um primeiro tempo, essas pré-culturas permitiram semear

leite integral a 1 %, ou seja uma fermentação clássica. Nessas condições, nenhum impacto positivo sobre a produção de vitamina K2 foi observado (dados não mostrados).

Essas pré-culturas foram em seguida utilizadas para realizar 25 fermentações em condições de "resting cells". As pré-culturas foram realiza- das como descritas precedentemente e mantidas durante uma noite. Amos- tras de 50 ml foram centrifugadas a 6000 g durante 5 min. O sobrenadante foi retirado e substituído por leite integral. O leite foi em seguida incubado a 30°C durante 24 h. As amostras foram congeladas a -80°C para uma dosa- 30 gem ulterior.

Como mostra a figura 4, o comportamento observado era dife- rente de acordo com as cepas. A pré-cultura em condições de respiração não teve impacto sobre a produção de vitamina K2 pela cepa natural de L lactis subsp. cremoris n- 1. Em contrapartida, ela permitiu aumentar de um fator 2, a produção de vitamina K2 pelo variante natural I-3558.

A pista de pré-cultura em condições de respiração apareceu por- tanto como interessante para pelo menos certas cepas.

No entanto, na prática, é importante poder dispor, não de pré- culturas frescas mas sim de fermentos congelados. Além disso, a fim de rea- lizar fermentações em condições de "resting cells", é conveniente dispor de fermentos concentrados.

B-IV- Resultados complementares que se referem ao efeito estimulante da respiração sobre a produção de vitamina K2

Esses resultados devem ser colocados em relação com o pará- grafo A-Ill acima.

Como indicado no parágrafo A-lll-2 supra, a cultura do variante 15 natural I-3626 selecionado em presença de análogos estruturais dos amino- ácidos aromáticos serviu para semear 50 ml de meio M17 Lac (taxa de se- meadura de 1 %) adicionado de 1 ml de uma solução de hemina (500 mg/l). A mesma cultura serviu para semear um meio que não còntém hemina mas que é colocado sob agitação. Um último tipo de cultura foi realizado. Um 20 meio M17 Lac foi semeado e colocado a 30°C sem agitação. As culturas fo- ram colocadas uma noite a 30°C sob agitação (250 rpm). Essas culturas fo- ram em seguida centrifugadas 5 min a 6000 g. O sobrenadante foi retirado e substituído por 50 ml de leite integral. Depois de 24 h, os leites fermentados foram colocados a -80°C esperando a dosagem de vitamina K2.

A tabela Ill abaixo dá os resultados de produção da vitamina K2

pelo variante natural I-3626 em função das condições de execução. A quan- tidade de vitamina K2 é expressa em^g Equivalente MK-4 para 100 g de leite fermentado.

Tabela Ill

Tipo de Sem agitação Com agitação pré-cultura Sem hemina Com hemina Vitamina K2 0,77 25,77 Esses resultados mostram que a respiração (presença de hemi- na sob agitação) tem um impacto grande sobre a produção de vitamina K2. Nessas condições, a produção de vitamina é multiplicada por 5. A cepa mãe produzia 21,5 μg/100 g depois de uma pré-cultura sem respiração (dados 5 não-mostrados). Quando a pré-cultura era realizada em condições de respi- ração, a produção caia para 10,3 pg/100 g (dados não mostrados). Assim, para a cepa mãe, a pré-cultura em condições de respiração tinha um efeito negativo sobre a produção de vitamina K2.

B-V- A influência da dose de semeadura, da população final e do pH do leite Nas condições de "resting cells" descritas precedentemente para

um procedimento em respiração, a população bacteriana inicial se eleva a cerca de IO10 UFC/mL.

Essa dose de semeadura sendo dificilmente aplicável no âmbito de um processo industrial, os inventores estudaram a influência precisa da quantidade inicial de células sobre a produção de vitamina K2 durante a fase de fermentação em leite.

Por outro lado, a quantidade de células sendo maior em uma pré-cultura em condições de respiração do que em uma pré-cultura clássica, os inventores procuraram determinar se o ganho em produção observado 20 para as pré-culturas em condições de respiração era devido a um simples aumento da dose de semeadura, ou então a um aporte específico do pro- cesso de respiração.

Os inventores também procuraram determinar se a população bacteriana final, depois da fase de "resting cells", desempenhava um papel 25 determinante sobre a quantidade de vitamina K2 obtida. Sabendo que existe uma certa mortalidade bacteriana devida, entre outras coisas, à diminuição do pH durante a fermentação, os inventores estudaram o impacto da utiliza- ção de um leite tamponado sobre o nível de produção de vitamina K2.

A fim de responder a essas diferentes questões, ensaios foram realizados em condições de "resting cells", em leite clássico ou tamponado, com doses de semeadura que vão de cerca de 106 UFC/mL a 1010 UFC/mL, e isso, a partir de pré-culturas clássicas ou em respiração. As pré-culturas da cepa Ι-3558 foram realizadas em meio Μ17 Lac a 30°C. Para as experiências em condições de respiração, o meio foi adicionado com 20 μί/ιτιί de uma solução de hemina a 0,5 mg/ml (em soda 0,1 M) e a pré-cultura foi agitada durante a incubação em uma noite. Diferen- 5 tes volumes dessas pré-culturas (ver a tabela IV abaixo) foram em seguida centrifugadas a 10000 g durante 10 min.

Tabela IV

Semeadura Volume Volume Pré-cultura R+ Pré-cultura R- 100% 40 mL 160 mL 75 % 30 mL 120 mL 50% 20 mL 80 mL 30% 12 mL 48 mL % 8 mL 32 mL 10% 4 mL 16 mL % 2 mL 8 mL 0,4 mL 1,6 mL 0,01 % 0,04 mL 0,16 mL O sobrenadante foi retirado e substituído por 40 mL de leite inte- gral clássico (pré-culturas R+ e R-), ou adicionado com β-glicerofosfato a 10 0,075 M final (pré-cultura R+ unicamente). As amostras foram em seguida incubadas a 30°C durante 24 h. Uma alíquota foi retirada para efetuar um recenseamento e depois as amostras foram congeladas a -80°C para uma dosagem ulterior. Os resultados da dosagem e recenseamentos realizados antes e depois da fase de "resting cèlls" estão indicados na tabela V abaixo. 15 Essa tabela fornece os resultados da dosagem de vitamina K2 e recensea- mentos efetuados antes (TO) e depois da fase de "resting cells" (Tf) a partir de pré-culturas clássicas ou em respiração. Tabela V- dose TOR- TfR- VitKR- TO R- TfR- VitK R- TO R- Tf R- VitK R- 100% 1,08E+10 9.70E+09 44,47 3.40E+09 2,65E+09 3,40E+09 5,30E+09 35,9 75% 8,10E+09 4.30E+09 29,01 2.55E+09 2,40E+09 2,55E+09 5,80E+09 50% 5.40E+09 4,15E+09 18,58 1,70E+09 1,64E+09 19,82 1,70E+09 6.40E+09 26,7 30% 3.24E+09 4.25E+09 13,72 1,02E+09 1.20E+09 16,75 1,02E+09 7,70E+09 20% 2.16E+09 2.10E+09 9,13 6.80E+08 1.60E+09 14,09 6.80E+08 6,40E+09 18,55 10% 1.08E+09 2.10E+09 3,40E+08 1.17E+09 3.40E+08 460E+09 5% 5.40E+08 1.10E+09 6,4 1,70E+08 1.29E+09 9,41 1,70E+08 3,60E+09 13,666 1% 1.08E+08 2,15E+09 6,88 3.40E+07 1,25E+09 6,35 3,40E+07 4,20E+09 0,1% 1,08E+07 1,50E+09 6,26 3,40E+06 1,27E+09 6,19 3,40E+06 4.80E+09 R- = pré-cultura clássica R+ = pré-cultura em respiração

TP = fermentação em leite tamponado pelo β-gIicerofosfato

TO = população bacteriana inicial em Cfu/mL de cultura

Tf = população bacteriana final em Cfu/mL de cultura

VitK = dosagem da vitamina K2 em μg equivalente MK-4/100 g de produto. Os resultados obtidos estâo representados na figura 5. Também estão representados nela, a título indicativo, os resultados obtidos com uma pré-cultura em condições de respiração, realizada em fermentador seguida por uma fase de "resting cells" em leite clássico (curva "respiração em fer- 5 mentador"). Os resultados são comparáveis àqueles obtidos com pré- culturas em tubo (curva "respiração labo").

Os resultados obtidos (tabela V e figura 5) indicavam que:

- O teor em vitamina K2 dependia da dose de semeadura;

-A "inclinação" da curva era maior para uma cultura clássica. 10 Assim, para uma população bacteriana dada, a produção de vitamina K2 era maior quando a pré-cultura era realizada em condições de respiração. O ga- nho observado em condições de respiração parecia portanto devido a um aporte específico do processo de respiração mais do que a um simples au- mento da dose de semeadura, o que confirmou o interesse dessa pista;

-A produção de vitamina K2 era maior quando a fasè de "resting

cells" era realizada em leite tamponado. Isso poderia ser devido ou a uma melhor sobrevivência das bactérias nesse meio, visto que para uma mesma população inicial, a população final era de 2 a 6 vezes maior em leite tampo- nado do que em leite clássico (ver a tabela V), ou a uma melhor "extração" da vitamina K2 em leite tamponado. REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS Bolotin e al., 2001. Genome Research 11, 731-753 Duwat e al. 2001. J. Bacteriol 183(15), 4509-16 Morishita e al. 1999. J. Dairy Sei. 82, 1897-1903 5 Parker e al. 2003. Journal of Food Science 687), 2325-2330 Vido e al. 2005, J. Bact. 187, 601-10 Hart JP, e al. [letter], Lancet, 1984; 2:283 Hart JP, e al. J. Clin Endocrinol Metab. 1985; 60:1268-9 Hauschka PV, e al. Physiol Rev. 1989; 69:990-1047 10 Ducy P, e al. Nature. 1996: 382:448-52

Vããnànen HK, e al. Calcif Tissue Int. 1999; 64:S79 Ronden JE, e al. Bioehim Biophys Aeta. 1998; 1379:16-22 Knapen MH, e al. Ann Intern Med. 1989 Dec 15; 111(12):1001-5 Szulc P, eal. J Clin Invest. 1993 Apr; 91(4):1769-74 15 Booth SL, e al. Am J Clin Nutr. 2000; 71:1201-8 Shiraki M, e al. J Bone Miner Res. 2000; 15:515-21 Braam LAJLM, e al. Calcif Tissue Int. 2003 Jul; 73(1):21-6 Hirano J e Ishii Y. J Orthop Sei. 2002; 7:364-369

Cocaign-Bousquet, M e al. Journal of Applied Baeteriology 1995; 79, 108-116 PCT

0-1 Formulário PCT/R0134(SAFE) Indicações relativas a micro¬ organismos ou outro material PCT Online Filling biológico depositados (regra 13bis do PCT) Versão 3.5.000.193 MT/FOP 0-1-1 Preparadacom 20020701/0.20.5.9 0-2 Pedido Internacional n2 °-3 Referência do dossiê do depósitante ou do 351840D24409 mandatário 1 As indicações abaixo se referem ao microorganismo ou outro material biológico visado na descrição: 1-1 página p 37 1-2 linha I 20 1-3 Identificação dó depósito 1-3-1 Nome da instituição de depósito CNCM Coleção nacional de cultu¬ ras de microorganismos 1-3-2 Endereço da instituição de depósito FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris cedex 15 1-3-3 Data do depósito 19 de Junho de 2006 (19.06.2006) 1-3-4 Número de ordem CNCM I-3626 1-5 Estados designados para os quais as indica¬ de todas as designações ções são dadas 2 As indicações abaixo se referem ao microorganismo ou outro material biológico visado na descrição: 2-1 página p 37 2-2 linha 118 2-3 Identificação do depósito 2-3-1 Nome da instituição de depósito CNCM Coleção nacional de cultu¬ ras de microorganismos 2-3-2 Endereço da instituição de depósito FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris cedex 15 2-3-3 Data do depósito 20 de Janeiro de 2006 (20.01.2006) 2-3-4 Número de ordem CNCM 1-3558 2-5 Estados designados para os quais as indica¬ de todas as designações ções são dadas 3 As indicações abaixo se referem ao microorganismo ou outro material biológico visado na descrição: 3-1 página p 37 3-2 linha 115 3-3 Identificação do depósito 3-3-1 Nome da instituição de depósito CNCM Coleção nacional de cultu¬ 3-3-2 Endereço da instituição de depósito ras de microorganismos 3-3-3 Data do depósito FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr 3-3-4 Número de ordem Roux, F-75724 Paris cedex 15 20 de Junho de 2006 (20.06.2006) CNCM I-3557 3-5 Estados designados para os quais as indica¬ de todas as designações ções são dadas I RESERVADO À AGÊNCIA RECEPTORA

0-4 Essa folha foi recebida ao mesmo tempo que o pedido internacional: (sim ou não) 0-4-1 Funcionário autorizado RESERVADO AO ESCRITÓRIO INTERNACIONAL

0-5 Essa folha chegou ao Escritório 04 de Outubro de 2007 (04.10.2007) Internacional em: 0-5-1 Funcionário autorizado SylvaineDESCLOUX TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-

ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

COMPAGNIE GERVAIS DANONE BP 63 126, rue Jules Guesde 92302 levallois-perret

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo _

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO

Referência de identificação fornecida pelo depositante DN-010 106

Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

CNCM I-3626

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

( X ) descrição científica ( X ) designação taxonômica proposta

(Marcar com um X quando aplicável).

I. RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 19 junho 2006 (data do depósito original)1.

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO

O microorganismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão).

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

Nome: COLLECTION NATIONALE

DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)

Endereço: Institut Pasteur

25, rue du Docteur Roux F-75724 PAris Cedex 15 (france)

Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)

Georges Wagener

Data: Paris, 13 de setembro 2006

1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Inter- nacional de depósito foi obtido.

Formato DSMZ-BP/4(página única) 0196 TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-

ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

COMPAGNIE GERVAIS DANONE BP 63 126, rue Jules Guesde 92302 levallois-perret

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO

Referência de identificação fornecida pelo depositante DN-010 103

Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

CNCM I-3557

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

( X ) descrição científica ( X ) designação taxonômica proposta

(Marcar com um X quando aplicável).

I. RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 20 janeiro 2006 (data do depósito original)1.

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO

O microorganismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão).

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

Nome: COLLECTION NATIONALE

DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)

Endereço: Institut Pasteur

25, rue du Docteur Roux F-75724 PAris Cedex 15 (france)

Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)

Georges Wagener

Data: Paris, 23 de fevereiro 2006

1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Inter- nacional de depósito foi obtido.

Formato DSMZ-BP/4(página única) 0196 TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-

ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

COMPAGNIE GERVAIS DANONE BP 63 126, rue Jules Guesde 92302 levallois-perret

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO

Referência de identificação fornecida pelo depositante DN-010 104

Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

CNCM I-3558

I. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

( X ) descrição científica ( X ) designação taxonômica proposta

(Marcar com um X quando aplicável).

RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 20 janeiro 2006 (data do depósito original)1.

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO

O microorganismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão).

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

Nome: COLLECTION NATIONALE

DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)

Endereço: Institut Pasteur

25, rue du Docteur Roux F-75724 PAris Cedex 15 (france)

Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)

Georges Wagener

Data: Paris, 23 de fevereiro 2006

1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Inter- nacional de depósito foi obtido.

Formato DSMZ-BP/4(página única) 0196 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMATO INTERNACIONAL

Monsieur Julien MAREMBERT DANONE VITAPOLE

DIRECTION PROPRIETE INDUSTRIELLE RD 128 91767 PALAISEAU CEDEX

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Emitido por força da regra 10.2 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

I. DEPOSITANTE II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: COMPAGNIE GERVAIS DANONE Número de acesso fornecido pela Endereço: BP 63 AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO 126, rue Juíes Guesde CNCM I-3626 92302 LEVALLOIS-PERRET Data do depósito ou da transferência1: 19 de junho 2006 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE A Viabilidade do microorganismo identificado acima (II) foi testado em 20-06-2006 2. Nessa data, o referido microorganismo foi (X )3 viável ( )3 inviável IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TSTE DE VIABILIDADE É CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: COLLECTION NATIONALE Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) representação da autoridade Internacional de Endereço: Institut Pasteur Depósito ou de oficial(is) responsável(is) 25, rue du Docteur Roux Georges Wagener F-75724 PAris Cedex 15 (france) Data: Paris, 13 de setembro 2006 1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos

Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMATO INTERNACIONAL

MonsieurJulien MAREMBERT DANONE VITAPOLE

DIRECTION PROPRIETE INDUSTRIELLE RD 128 91767 PALAISEAU CEDEX

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Emitido por força da regra 10.2 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

I. DEPOSITANTE II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: COMPAGNIE GERVAIS DANONE Número de acesso fornecido pela Endereço: BP 63 AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO 126, rue Juíes Guesde CNCM I-3557 92302 LEVALLOIS-PERRET Data do depósito ou da transferência1: 20 de janeiro 2006 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE A Viabilidade do microorganismo identificado acima (II) foi testado em 23-01-2006 2. Nessa data, o referido microorganismo foi (X )3 viável ( )3 inviável IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TSTE DE VIABILIDADE É CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: COLLECTION NATIONALE Assínatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) representação da autoridade Internacional de Endereço: Institut Pasteur Depósito ou de oficial(is) responsável(is) 25, rue du Docteur Roux Georges Wagener F-75724 PAris Cedex 15 (france) Data: Paris, 23 de fevereiro 2006 1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI- CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMATO INTERNACIONAL

Monsieur Julien MAREMBERT DANONE VITAPOLE

DIRECTION PROPRIETE INDUSTRIELLE RD 128 91767 PALAISEAU CEDEX

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Emitido por força da regra 10.2 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

I. DEPOSITANTE II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: COMPAGNIE GERVAIS DANONE Número de acesso fornecido pela Endereço: BP 63 AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO 126, rue Juíes Guesde CNCM I-3558 92302 LEVALLOIS-PERRET Data do depósito ou da transferência1: 20 de janeiro 2006 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE A Viabilidade do microorganismo identificado acima (II) foi testado em 23-01-2006 2. Nessa data, o referido microorganismo foi (X )3 viável ( )3 inviável IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TSTE DE VIABILIDADE É CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de COLLECTION NATIONALE representação da autoridade Internacional de DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Endereço: Institut Pasteur Georges Wagener 25, rue du Docteur Roux Data: Paris, 23 de fevereiro 2006 F-75724 PAris Cedex 15 (france) 1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196

Claims (19)

1. Método para aumentar a quantidade de vitamina K2 obtida cultivando pelo menos uma cepa de bactérias ácido-lácticos que produz vi- tamina K2, em que a dita cepa é cultivada em condições de “resting-cells”, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) pré-cultura da dita cepa sob condições de respiração, em um meio de pré-cultura apropriado contendo pelo menos uma porfirina em uma concentração final de pelo menos cerca de 0,5 pg/ml; b) inoculação de um meio de cultura apropriado contendo gordura com uma quantidade de células bacterianas vivas variando de cerca de 108 UFC/ml a cerca de 1011 UFC/ml; e, c) fermentação do meio dessa maneira inoculado por um pe- ríodo variando de cerca de 4 horas a cerca de 48 horas, a uma temperatura variando de cerca de 4°C a cerca de 50°C, de tal maneira que, no fim da etapa c), a quantidade de vitamina K2 produzida pela cultura de “resting-cell” é mais alta, por um fator pelo menos igual a cerca de 1,2, do que aquele ob- tido pelo cultivo da dita cepa sob condições de fermentação padrão.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito meio de cultura apropriado contém pelo menos cerca de 0,5% de gordura.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito meio de cultura apropriado é leite simples ou leite cu- ja capacidade de volume foi aumentada.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 3, caracterizado pelo fato de que a dita pré-cultura é incubada a um tempe- ratura variando de cerca de 4°C a cerca de 40°C.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que a oxigenação da dita pré-cultura é realiza- da por agitação ou aeração.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que a dita pré-cultura é mantida por pelo menos cerca de 8 horas.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a dita cepa de bactérias ácido lácticos que produz vitamin K2 é selecionada dos gêneros Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus e Propionibacterium.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita cepa de bactérias ácido láctico é selecionada das espécies Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faeci- um, e Propionibacterium sp.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita cepa de bactérias ácido láctico é selecionada de variantes naturais de Lactococcus lactis subsp. cremoris que produzem vitamina K2: - I-3557 depositada com Collection Nationale de Culture des Microorganismes da França (CNCM, Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) em 20/01/2006, - I-3558 depositada com o CNCM (Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) em 20/01/2006, e - I-3626 depositada com o CNCM (Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) em 19/06/2006.

10. Biomassa enriquecida, caracterizada pelo fato de ser obtida pela cultura de pelo menos uma cepa de bactérias ácido-lácticos que produz vitamina K2, sob condições de “resting-cell”, por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Uso da biomassa, como definida na reivindicação 10, carac- terizado pelo fato de ser para preparar um produto alimentar rico em vitami- na K2.

12. Método para produzir vitamina K2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) implementação do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e b) recuperação da vitamina K2 dessa maneira produzida.

13. Método para preparar um produto alimentar rico em vitamina Κ2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) produzir a vitamina K2 por um método, como definido na reivindicação 12; b) adicionar a vitamina K2 dessa maneira produzida ao dito produto alimentar, ou a uma preparação intermediária do mesmo; e c) obter o dito produto alimentar rico em vitamina K2.

14. Método para preparar um produto alimentar rico em vitamina K2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) fazer a cultura de pelo menos uma cepa de bactérias de áci- do láctico que produz vitamina K2 sob condições de “resting-cell” por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; b) adicionar a biomassa obtida da cultura na etapa a) ao dito produto alimentar ou para uma preparação intermediária do mesmo; e c) obter o dito produto alimentar rico em vitamina K2.

15. Método para enriquecer um produto alimentar em vitamina K2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) adicionar a biomassa, como definida na reivindicação 10, ao dito produto alimentar ou para uma preparação intermediária do mesmo; e b) obter o dito produto alimentar rico em vitamina K2.

16. Produto alimentar rico em vitamina K2, caracterizado pelo fato de ser obtido pela implementação do método, como definido em qual- quer uma das reivindicações 13 a 15.

17. Produto alimentar rico em vitamina K2, co, caracterizado pe- lo fato de que contêm a biomassa, como definido na reivindicação 10.

18. Produto alimentar de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de ser um produto fermentado e/ou um produto de laticínio fresco.

19. Uso não terapêutico de um produto alimentar como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de ser para aumentar a resistência óssea do consumidor.