BRPI0720271A2 - Anticorpo anti-tslp projetado - Google Patents

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Rene De Waal Malefyt
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI-TSLP PROJETADO".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se geralmente a um anticorpo espe- cífico de Iinfopoietin estromal tímico (TSLP)1 e usos deste, particularmente em distúrbios inflamatórios e alérgicos inflamatórios. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O sistema imune funciona para proteger indivíduos de agentes infecciosos, por exemplo, bactérias, organismos multicelulares, e vírus, bem como de cânceres. Este sistema inclui vários tipos de células de Iinfoide e mieloide, tais como monócitos, macrófagos, células dendríticas (DCs), eosi- nófilos, células T, células B, e neutrófilos. Estas células de Iinfoide e mieloide freqüentemente produzem proteínas de sinalização conhecidas como cito- quinas. A resposta imune inclui inflamação, isto é, o acúmulo de células i- munes sistemicamente ou em uma localização particular do corpo. Em res- posta a um agente infeccioso ou substância estranha, as células imunes se- cretam citoquinas que, por sua vez, modulam proliferação, desenvolvimento, diferenciação ou migração de célula imune. Uma resposta imune pode pro- duzir conseqüências patológicas, por exemplo, quando ela envolve inflama- ção excessiva, como em distúrbios inflamatórios alérgicos.
O TSLP é uma citoquina imune que induz respostas de célula CD4+ T mediadas por célula dendrítica com um fenótipo a proalogênico (Gil- Iiet et ai, J. Exp). Medicine 197(8): 1059-1063 (2003). O TSLP é envolvido na iniciação de inflamação alérgica (Watanabe et ai., Nature Immunology 5: 426-434 (2004); Soumelis et al., Nature Immunology 3: 673-680 (2002)).
Anticorpos estão sendo desenvolvidos contra um número de al- vos antígenos que estão envolvidos em doenças imunes. A limitação mais significante no uso de anticorpos como um agente terapêutico in vivo é a imunogenicidade dos anticorpos. Como muitos dos anticorpos monoclonais são derivados de roedores, o uso repetido em humanos resulta na geração de uma resposta imune contra o anticorpo tarapêutico. Tal resposta imune resulta em uma perda de eficiência terapêutica a um mínimo, e uma respos- ta anafilática fatal potencial a um máximo. Os esforços iniciais para reduzir a imunogenicidade de anticorpos de roedor envolveram a produção de anti- corpos quiméricos, em que regiões variáveis de camundongo foram fundidas com regiões constantes humanas. Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 84:3439-43. Contudo, camundongos injetados com híbridos de regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo desenvolvem uma forte resposta de anti-anticorpo contra a região variável humana, sugerindo que a retenção da região Fv de roedor total em tais anticorpos quiméricos pode ainda resultar em imunogenicidade indesejada em pacientes. É geralmente acreditado que circuitos fechados de região de
determinação de complementaridade (CDR) de domínios variáveis compre- endem o local de ligação de moléculas de anticorpo. Portanto, o enxerto de circuitos fechados de CDR de roedor em estruturas humanas (isto é, huma- nização) foi tentado para adicionalmente minimizar seqüências de roedor. Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534. Contudo, trocas de circuito fechado de CDR podem não resultar uniformemente em um anticorpo com as mesmas propriedades de ligação como o anticorpo de origem. Mudanças nos resíduos da estrutura (FR)1 resí- duos envolvidos no suporte de circuito fechado de CDR, em anticorpos hu- manizados, podem também serem requeridas para preservar afinidade de ligação de antígeno. Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147:1709. Enquanto o uso de enxerto de CDR e preservação de resíduo de estrutura em um núme- ro de construções humanizadas de anticorpo tem sido reportado, é difícil prever se uma seqüência particular resultará no anticorpo com a ligação de- sejada, e, às vezes, propriedades biológicas. Vide, por exemplo, Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029, Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4181, e Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421- 5.
A presente invenção proporciona um anticorpo de TSLP projeta- do e uso deste para tratar distúrbios inflamatórios, e, particularmente, distúr- bios inflamatório alérgicos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um composto de ligação que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia pesada com- preendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; ou pelo menos uma região vari- ável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP des- ta, referida região variável de cadeia leve compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
A presente invenção também proporciona um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia pe- sada compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e pelo menos uma re- gião variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, compreende pelo me- nos duas seqüências de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3. Em outras concretizações, a região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, tem as três seqüência de CDR colocadas em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3;.
Em algumas concretizações, a região variável de cadeia leve de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, compreende pelo menos duas seqüências de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. Em outras concretizações, a região variável de cadeia leve de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, tem as três se- quências de CDR colocadas em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
A presente invenção também proporciona um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia pe- sada compreendendo: a CDR-H1 de SEQ ID NO. 1, ou uma variante desta; a CDR-H2 de SEQ ID NO. 2, ou uma variante desta; e a CDR-H3 de SEQ ID NO. 3, ou uma variante desta; ou pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida regi- ão variável de cadeia leve compreendendo: a CDR-L1 de SEQ ID NO. 4, ou uma variante desta; a CDR-L2 de SEQ ID NO. 5, ou uma variante desta; e a CDR-L3 de SEQ ID NO. 6, ou uma variante desta. A presente invenção tam- bém proporciona um composto de ligação que se liga especificamente a TS- LP humano e de cino, compreendendo pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia pesada compreendendo: a CDR-H1 de SEQ ID NO. 1, ou uma variante desta; a CDR-H2 de SEQ ID NO. 2, ou uma variante desta; e a CDR-H3 de SEQ ID NO. 3, ou uma variante desta; e pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreen- dendo: a CDR-L1 de SEQ ID NO. 4, ou uma variante desta; a CDR-L2 de SEQ ID NO. 5, ou uma variante desta; e a CDR-L3 de SEQ ID NO. 6, ou uma variante desta. Em uma concretização, a variante compreende até 20 resíduos de aminoácido conservativamente modificados. Em uma concreti- zação, a variante compreende até 10 resíduos de aminoácido conservativa- mente modificados. Em uma concretização, a variante compreende até 5 resíduos de aminoácido conservativamente modificados. Em uma concreti- zação, a variante compreende até 3 resíduos de aminoácido conservativa- mente modificados.
Em algumas concretizações dos compostos de ligação acima
descritos, todo ou substancialmente todo do restante da região variável de cadeia pesada é todo ou substancialmente todo uma região Ig de humano; e todo ou substancialmente todo do restante da região variável de cadeia leve é todo ou substancialmente todo uma região Ig de humano. Em concretiza- ções preferidas, o restante da região variável de cadeia pesada é seqüência de aminoácido de cadeia pesada de humano; e o restante da região variável de cadeia leve é seqüência de aminoácido de cadeia leve de humano.
A presente invenção também proporciona um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10 ou uma variante destes; e uma região variável de cadeia leve compreendendo resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12, ou uma variante destes. Em uma concretização, a variante compreende até 20 resíduos de aminoácido conservativamente modificados. Em uma concretização, a vari- ante compreende até 10 resíduos de aminoácido conservativamente modifi- cados. Em uma concretização, a variante compreende até 5 resíduos de a- minoácido conservativamente modifj-çados. Em uma concretização, a varian- te compreende até 3 resíduos de aminoácido conservativamente modifica- dos. Em uma concretização, a região variável de cadeia leve compreende uma variante na qual o aminoácido na posição 49 de SEQ ID NO:12 foi mu- dado de Y para K.
A presente invenção também proporciona um composto de liga-
ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e uma região variável de cadeia leve compreendendo resí- duos 1-108 de SEQ ID NO: 12. A presente invenção também proporciona um composto de liga-
ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada consistindo essencialmente de resí- duos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e uma região variável de cadeia leve consis- tindo essencialmente em resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12. A presente invenção também proporciona um composto de liga-
ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 95%, 90%, 85% ou 80% de homologia a resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e/ou uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 95%, 90%, 85% ou 80% de homo- logia a resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12. Em uma concretização, a inven- ção proporciona um composto de ligação que se liga especificamente a TS- LP humano e de cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesa- da tendo pelo menos 90% de homologia a resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de ho- mologia a resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada compreenderá pelo menos 95% de homo- Iogia a resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e a região variável de cadeia leve compreenderá pelo menos 95% de homologia a resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12.
Em algumas concretizações, os compostos de ligação da inven- ção também compreendem uma região constante de cadeia pesada e/ou uma região constante de cadeia leve. Em uma concretização, a região cons- tante de cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesa- da humana γ1, γ2, γ3, ou γ4, ou uma variante desta. Em várias concretiza- ções, a região constante de cadeia leve compreende uma região constante de cadeia leve humana lâmbida ou kappa. Em algumas concretizações, o composto de ligação da invenção
é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste. Em várias concretizações, o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção é poli- clonal, monoclonal, quimérico, cino-izado, humanizado ou totalmente huma- no. Em uma concretização preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um fragmento deste.
A presente invenção também contempla que o fragmento de li- gação é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo consistin- do em Fab, Fab', Fab1-SH1 Fv, scFv, F(ab')2, e um diacorpo. A presente in- venção também contempla que o composto de ligação é um nanocorpo, um avímero, ou um aptímero.
Em uma concretização preferida, o composto de ligação é o an- ticorpo produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951. Em outra con- cretização, o composto de ligação não é o anticorpo produzido pelo hibrido- ma depositado como PTA-7951.
A invenção também envolve um anticorpo ou fragmento de liga- ção de antígeno deste que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo a seqüência de aminoácido de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18, ou uma variante desta; e/ou uma seqüência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO: 17, ou uma variante desta. A invenção também envolve um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, compreendendo aminoácidos 19 a 472 de SEQ ID NO: 18, ou uma variante destes; e/ou aminoácidos 20 a 233 de SEQ ID NO:17, ou uma variante destes. Em uma concretização, a variante compreende até 20 resíduos de aminoácido conservativamente mo- dificados. Em uma concretização, a variante compreende até 10 resíduos de aminoácido conservativamente modificados. Em uma concretização, a vari- ante compreende até 5 resíduos de aminoácido conservativamente modifi- cados. Em uma concretização, a variante compreende até 3 resíduos de a- minoácido conservativamente modificados.
A presente invenção também compreende um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, no qual referido composto de ligação tem um KD de cerca de 2,1 pM ou menos, conforme medido usando tecnologia KinExA e TSLP humano como o ligante. A pre- sente invenção também compreende um composto de ligação que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, no qual referido composto de ligação tem um KD de 2,1 pM (+/- duas vezes), conforme medido usando tecnologia KinExA e TSLP humano como o ligante. Em uma concretização, o composto de ligação é um anticorpo anti-TSLP humanizado, ou um fragmen- to de ligação de antígeno deste.
A presente invenção também compreende um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, no qual referido composto de ligação tem um KD de cerca de 111 pM ou menos, conforme medido usando-se ressonância de plasmon de superfície e TSLP humano como o ligante. A presente invenção também compreende um composto de ligação que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, no qual refe- rido composto de ligação tem um KD de 111 pM (+/-duas vezes), conforme medido usando-se ressonância de plasmon de superfície como o ligante. Em uma concretização, o composto de ligação é um anticorpo anti-TSLP huma- nizado, ou um fragmento de ligação de antígeno deste.
A presente invenção também compreende um composto de liga- ção que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, no qual referido composto de ligação tem um EC50 de cerca de 7,6 nM ou menos. A presen- te invenção também compreende um composto de ligação que se liga espe- cificamente a TSLP humano e de cino, no qual referido composto de ligação tem um EC50 de cerca de 7,6 nM (+/-duas vezes). (O EC50 se refere à con- centração de composto de ligação requerida para neutralizar TSPL humano a 50% do nível observado na ausência do composto de ligação). Em uma concretização, o composto de ligação é um anticorpo anti-TSLP humaniza- do, ou um fragmento de ligação de antígeno deste.
A presente invenção também proporciona um ácido nucleico iso- lado que codifica pelo menos uma da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve do composto de ligação da invenção. Também provido é um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico opera- velmente ligado às seqüências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor. Também providas são células hospedeiras compreendendo o vetor de ex- pressão.
Também provido é um método de produção de um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou uma região variá- vel de cadeia leve da invenção compreendendo: cultura da célula hospedeira no meio de cultura sob condições nas quais a seqüência de ácido nucleico é expressa, produzindo, desse modo, polipeptídeos compreendendo as regi- ões variáveis de cadeia leve e pesada; e recuperação dos polipeptídeos a partir da célula hospedeira ou meio de cultura.
A invenção também proporciona um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste) que se liga especificamente ao epítope em TSLP humano que é ligado pelo anticor- po produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951, no qual o anticor- po que se liga especificamente ao epítope no TSLP humano não é o anticor- po produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951.
A invenção também compreende um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste) que inibe competitivamente ligação pelo anticorpo produzido pelo hibridoma deposita- do como PTA-7951 a TSLP humano, no qual o anticorpo que inibe competi- tivamente ligação não é o anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951.
A invenção também compreende um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste) que blo- queia atividade mediada por TSLP. As atividades mediadas por TSLP inclu- em, mas não estão limitadas a, ligação a seu receptor, promoção da ativa- ção de células dendríticas que conduzem a proliferação ou sobrevivência de células Th2, secreção de quemoquinas de atração de TH2 por células dendrí- ticas, tais como TARC e MDC, produção de citoquinas pró-alérgicas, tais como IL-4, IL-5, IL-13 e TNF-alfa. Um número de ensaios pode ser empre- gado para determinar se um composto de ligação bloqueia atividade media- da por TSLP. Estes incluem os ensaios descritos nos Exemplos e outros en- saios, incluindo aqueles descritos na técnica. Vide, por exemplo, Reche et al., J. Immunol. 167:336-43 (2001); Isaksen et al„ J. Immunol. 168:3288-94 (2002).
Em uma concretização, o composto de ligação é capaz de blo- quear a ligação de TSLP a TSLPR em um ensaio de reticulação.
A presente invenção envolve um método de supressão de uma resposta imune em um indivíduo humano compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade deste um composto de ligação que se liga especi- ficamente a TSLP humano e de cino, em uma quantidade efetiva para blo- quear a atividade biológica de TSLP. A presente invenção também contem- pla administrar um agente imunosupressor ou anti-inflamatório adicional. Em uma concretização preferida, a resposta imune é asma. Em outra concreti- zação preferida, a resposta imune é inflamação alérgica. Em outra concreti- zação preferida, a inflamação alérgica é rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica. Em outra concretização preferida, a resposta imune é fibrose, doença inflamatória do intestino ou Iinfoma de Hodgkin. Em outra concretização preferida, o composto de ligação é admi- nistrado em combinação com outro agente imunomodulatório.
O anticorpo ou fragmento deste da presente invenção pode estar em uma composição compreendendo o composto de ligação da invenção, em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em uma concretização adicional, o composição compreende adicionalmente um agente imunosupressor ou anti-inflamatório.
A presente invenção também envolve uma composição compre- endendo um composto de ligação da invenção e um veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável.
A presente invenção envolve um ácido nucleico isolado que co- difica a seqüência de polipeptídeo do anticorpo ou fragmento deste da pre- sente invenção. O ácido nucleico pode estar em um vetor de expressão ope- ravelmente ligado às seqüências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira transfectada com o vetor. Também envolvida é uma célula hos- pedeira compreendendo o vetor, e um método de produção de um polipeptí- deo compreendendo cultura da célula hospedeira sob condições nas quais a seqüência de ácido nucleico é expressa, produzindo, desse modo, o polipep- tídeo, e recuperação do polipeptídeo a partir da célula hospedeira ou meio.
Em várias concretizações, a invenção se refere a medicamentos compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção. Por exemplo, a invenção envolve o uso de um composto de ligação que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, (por exemplo, qualquer um dos compostos de ligação de acordo com a invenção) para a preparação de um medicamento para tratar supressão de uma resposta imune. A presente in- venção envolve o uso de um composto de ligação que se liga especifica- mente a TSLP humano e de cino, (por exemplo, qualquer um dos compostos de ligação de acordo com a invenção) para a preparação de um medicamen- to para tratar asma. A presente invenção envolve o uso de um composto de ligação que se liga especificamente a TSLP humano e de cino, (por exem- plo, qualquer um dos compostos de ligação de acordo com a invenção) para a preparação de um medicamento para tratar um distúrbio inflamatório. Em uma concretização, o distúrbio inflamatório é um distúrbio inflamatório alérgi- co. Em uma concretização, o distúrbio inflamatório alérgico é rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica. DESCRIÇÃO DETALHADA
Conforme aqui usado, incluindo as reivindicações em anexo, as formas singulares de palavras, tais como "um," "uma," e "o," incluem suas referências plurais correspondentes, a menos que o contexto indique clara- mente de outro modo. Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência a mesma extensão como se cada publicação individual, pedi- do de patente, ou patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência. I. Definições
"Ativação," "estimulação," e "tratamento", conforme se aplicam a células ou a receptores, podem ter o mesmo significado, por exemplo, ativa- ção, estimulação, ou tratamento de uma célula ou receptor com um ligante, a menos que indicado de outro modo pelo contexto ou explicitamente. "Ligan- te" envolve Iigantes naturais e sintéticos, por exemplo, citoquinas, variantes de citoquina, análogos, muteínas, composições de ligação derivadas de an- ticorpos. "Ligante" também envolve moléculas pequenas, por exemplo, mi- méticos de peptídeo de citoquinas e miméticos de peptídeo de anticorpos. "Ativação" pode se referir a ativação de célula conforme regulada por meca- nismos internos, bem como por fatores externos ou ambientais. "Resposta," por exemplo, de uma célula, tecido, órgão, ou organismo, envolve uma mu- dança no comportamento bioquímico ou fisiológico, por exemplo, concentra- ção, densidade, adesão, ou migração dentro de um compartimento biológico, taxa de expressão de gene, ou estado de diferenciação, em que a mudança está correlacionada com ativação, estimulação, ou tratamento, ou com me- canismos internos, tais como programação genética. "Atividade" de uma molécula pode descrever ou se referir a liga- ção da molécula a um ligante, ou a um receptor, a atividade catalítica; a ca- pacidade de estimular expressão de gene ou sinalização, diferenciação, ou maturação de célula; a atividade antigênica, a modulação de atividades de outras moléculas, e similares. "Atividade" de uma molécula pode também se referir a atividade na modulação ou manutenção de interações célula a célu- la, por exemplo, adesão, ou atividade na manutenção de uma estrutura de uma célula, por exemplo, membranas de célula ou citoesqueleto. "Atividade" pode também significar atividade específica, por exemplo, [atividade catalíti- ca]/[mg de proteína], ou [atividade imunológica]/[mg de proteína], concentra- ção em um compartimento biológico, ou similares. "Atividade proliferativa" envolve uma atividade que promove, que é necessária para, ou que está especificamente associada à, por exemplo, divisão de célula normal, bem como um câncer, tumores, displasia, transformação de célula, metástase, e angiogênese.
"Administração" e "tratamento", conforme se aplica a um animal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico, se referem ao contato de um farmacêutico exógeno, terapêutico, agente di- agnóstico, ou composição ao animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, pes- quisa, e experimentais. O tratamento de uma célula envolve contato de um reagente com a célula, bem como contato de um reagente com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula. "Administração" e "tratamen- to" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação, ou por outra célula. "Tratamento", conforme se aplica a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, se refere a tratamento terapêutico, profilático ou medidas preventivas, para aplicações de pesquisa e de diagnósticos. Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" se refere a qualquer
forma de anticorpo ou fragmento deste que exibe a atividade biológica dese- jada. Desse modo, ele é usado no sentido amplo, e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anti- corpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, considerando-se que eles exibam atividade biológica desejada.
Conforme aqui usado, o termo "fragmento de ligação de TSLP",
ou "fragmento de ligação deste", envolve um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda retém substancialmente sua atividade biológica de atividade de inibição de TSLP. Portanto, o termo "fragmento de anticorpo", ou fragmento de ligação de TSLP, se refere a uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a ligação de antígeno ou região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de ca- deia simples, por exemplo, sc-Fv; anticorpos de domínio; e anticorpos multi- específicos formados de fragmentos de anticorpo. Tipicamente, um fragmen- to de ligação ou derivado retém pelo menos 10% de sua atividade inibitória de TSLP. Preferivelmente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (ou mais) de sua atividade inibitória de TSLP, embora qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado será útil. É tam- bém pretendido que um fragmento de ligação de TSLP possa incluir substitu- ições de aminoácido conservativas que não alteram substancialmente sua atividade biológica.
O termo "anticorpo monoclonal", conforme aqui usado, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para mutações possíveis que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos mono- clonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um epítope antigê- nico simples. Em contraste, preparações de anticorpo (policlonais) conven- cionais incluem tipicamente uma multiplicidade de anticorpos dirigidos contra (ou específicos para) epítopes diferentes. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não é construído como requerendo produ- ção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., (1975) Nature 256: 495, ou podem ser produzidos pelos métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também serem isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando-se técnicas descritas em Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 e Marks et al., (1991) J. Mol. BioL 222: 581 -597, por exemplo.
Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anti- corpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesa- da e/ou leve é idêntica a ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é (são) idêntica(s) a ou homóloga(s) a seqüências correspondentes em anti- corpos derivados de outras espécies pertencente a outra classe ou subclas- se de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, considerando-se que eles exibem a atividade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; e Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sei. USA 81: 6851- 6855).
Um "anticorpo de domínio" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo somente a região variável de uma ca- deia pesada, ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns exemplos, duas ou mais regiões de Vh são covalentemente unidas com um Iigador de peptídeo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões de Vh de um anticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo os mesmos, ou antígenos diferentes.
Um "anticorpo bivalente" compreende dois locais de ligação de antígeno. Em alguns exemplos, os dois locais de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. Contudo, anticorpos bivalentes podem ser bi- específicos (vide abaixo). Conforme aqui usado, o termo "Fv de cadeia simples" ou anti- corpo "scFv" se refere a fragmento de anticorpos compreendendo os domí- nios Vh e Vl de anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo simples. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigador de polipeptídeo entre os domínios de Vh e Vl que capacitam o sFv formar a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, vide Pluckthun (1994) The Pharmacology of Mono- clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.
Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos de domínio simples camelizado. Vide, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sei. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; Patente dos Estados Unidos No. 6,005,079, que, são desse modo, incorporados por referência em suas tota- lidades). Em uma concretização, a presente invenção proporciona anticorpos de domínio simples compreendendo dois domínios de Vh com modificações tais que anticorpos de domínio simples são formados.
Conforme aqui usado, o termo "diacorpos" se referem a frag- mentos de anticorpo pequenos com dois locais de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) ligado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl ou Vl-Vh). Pelo uso de um Iigador que seja muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criarem dois locais de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritos mais totalmente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Holliger et al. (1993) Proc. NatL Acad. Sei. USA 90: 6444-6448. Para uma revisão de vari- antes de anticorpo geralmente projetadas vide Holliger e Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.
Conforme aqui usado, o termo "anticorpo humanizado" se refere a formas de anticorpos que contêm seqüências de anticorpos não-humanos {por exemplo, murina), bem como anticorpos humanos. Tais anticorpos con- têm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis em que todos ou substancialmen- te todos circuitos fechados hipervariáveis corresponderem àqueles de uma imunoglobulina não-humana, e todas ou substancialmente todas das regiões de FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anti- corpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. O prefixo "hu" ou "hum" é adicionado as designações de clone de anticorpo quando necessário para distinguir anti- corpos humanizados (por exemplo, "hu23B12") de anticorpos de roedor ori- ginais (por exemplo, rato 23B12, ou "r23B12"). As formas humanizadas de anticorpos de roedor geralmente compreenderão as mesmas seqüências de CDR dos anticorpos de roedor originais, embora certas substituições de a- minoácido podem ser incluídas para aumentar afinidade ou aumentar estabi- lidade do anticorpo humanizado.
Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para proporcionar funções efe- tuadoras alteradas. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.624.821; W02003/086310; W02005/120571; W02006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tal modificação pode ser usada para aumentar ou suprimir várias reações do sistema imune, com possíveis efeitos benéficos na diagnose e terapia. Alterações da região Fc incluem mudanças de aminoácido (substituições, anulações e inserções), glicosila- ção ou deglicosilação, e adição de Fc múltiplo. Mudanças na Fc podem tam- bém alterar a meia vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos, e uma meia vida mais longa resultaria em dosagem menos freqüente, com a con- veniência aumentada concomitante e uso diminuído de material. Vide Presta (2005) J. Allergy Clin. ImmunoIA 16:731 at 734-35.
O termo "anticorpo totalmente humano" se refere a um anticorpo que compreende seqüências de proteína imunoglobulina humana somente. Um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de murina carboidrato se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo, ou em um hidridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, "anti- corpo de camundongo" se refere a um anticorpo que compreende seqüên- cias de imunoglobulina de camundongo somente.
Conforme aqui usado, o termo "região hipervariável" se refere a resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (por exem- plo, resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve, e resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95- 102 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteínas of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de um "circuito fechado hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, (1987) J. Mol. BioL 196: 901-917). Conforme aqui usado, o termo "estrutura" ou resí- duos de "FR" se refere àqueles resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável definidos aqui como resíduos de CDR. A numeração do resíduo acima se refere ao sistema de numeração de Ka- bat, e não corresponde necessariamente em detalhe à numeração de se- qüência na Listagem de Seqüência acompanhante. Vide Tabelas 2 e 3, em cuja numeração de seqüência é com referência a Listagem de Seqüência.
"Ligação" se refere a uma associação da composição de ligação com um alvo em que a associação resulta em redução no movimento Brow- niano normal da composição de ligação, em casos em que a composição de ligação pode ser dissolvida ou suspensa na solução.
"Composto de ligação" se refere a uma molécula que compreen- de uma ou mais seqüências de aminoácido que se ligam especificamente a TSLP humano. Em uma concretização preferida, o composto de ligação é um anticorpo. Em outra concretização preferida, o composto de ligação compreende um fragmento de anticorpo. 10
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Resíduo Original Substituição Conservativa Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gln (Q) Asn Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln IIe(I) Leu; Val Leu (L) lie; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; lie; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala Ser (S) Thr Thr (T) Ser
"Composição de ligação" se refere a um composto de ligação de TSLP em combinação com um estabilizador, excipiente, sal, tampão, solven- te, ou aditivo, capaz de se ligar a um alvo.
"Variantes conservativamente modificadas", ou "substituição conservativa", se refere a substituições de aminoácidos que são conhecidas àqueles técnicos neste assunto, e podem ser produzidas geralmente sem alteração da atividade biológica da molécula resultante. Aqueles técnicos neste assunto reconhecerão que, em geral, substituições de aminoácido simples em regiões não-essenciais de um polipeptídeo não alteram substan- cialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson, et ai, Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Tais substituições exemplares são preferivelmente produzidas de acordo com aquelas colocadas na Tabela 1 conforme segue: Tabela 1
Substituições de Aminoácido Conservativas Exemplares Resíduo Original Substituição Conservativa Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) lie; Leu
Os termos "consiste essencialmente em", ou variações tais co- mo "consiste essencialmente em", ou "consistindo essencialmente de", con- forme usados através de todo relatório descritivo e reivindicações, indicam a inclusão de quaisquer elementos citados ou grupo de elementos, e a inclu- são opcional de outros elementos, de natureza similar ou diferente do que os elementos citados, que não mudam materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem especificado, método, ou composição. Co- mo um exemplo não-limitativo, um anticorpo ou fragmento deste que consis- te essencialmente em uma seqüência de aminoácido citada pode também incluir um ou mais aminoácidos, incluindo substituições de um ou mais resí- duos de aminoácido que não afetam materialmente as propriedades do composto de ligação.
"Quantidade efetiva" envolve uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade efetiva também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar diagnose. Uma quantidade efetiva para um paciente particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores, tais como a condição sendo tratada, a saúde geral do paciente, a rota do método e a dose de administra- ção, e a severidade dos efeitos colaterais (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.888.530, publicada por Netti, et al.). Uma quantidade efetiva pode ser a dose máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais significantes ou efeitos tóxicos. O efeito resultará em um aperfei- çoamento de uma medida diagnostica ou parâmetro por pelo menos 5%, usualmente por pelo menos 10%, mais usualmente pelo menos 20%, mais usualmente pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, mais prefe- rivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, ideal- mente pelo menos 70%, mais idealmente pelo menos 80%, e mais idealmen- te pelo menos 90%, em que 100% é definido como o parâmetro diagnóstico mostrado por um indivíduo normal (vide, por exemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinicai Practice, Interpharm Press, Boca Ra- ton, FL; Dent (2001) Good Laboratory e Good Clinicai Practice, Urch Publ., London, UK).
"Exógena" se refere a substâncias que são produzidas fora de
um organismo, célula, ou corpo humano, dependendo do contexto.
"Endógena" se refere a substâncias que são produzidas dentro de uma célula, organismo, ou corpo humano, dependendo do contexto.
Conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico iso- lada" se refere a uma molécula de ácido nucleico que é identificada e sepa- rada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela está ordinariamente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra do que na forma ou assentamento em que ela é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distinguidas da molécula de ácido nu- cleico conforme elas existem em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em cé- lulas que expressam ordinariamente o anticorpo onde, por exemplo, a molé- cula de ácido nucleico está em uma localização cromossomal diferente da- quela das células naturais.
A expressão "seqüências de controle" se refere a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação opera- velmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são adequadas para procariótes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência de operador, e um local de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promoto- res, sinais de poliadenilação, e intensificadores.
Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando ele é colo- cado em um relacionamento funcional com outra seqüência de ácido nuclei- co. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou condutor secretório é o- peravelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um local de ligação de ribossomo é o- peravelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele está posiciona- do de modo a facilitar translação. Geralmente, "operavelmente ligado" signi- fica que as seqüências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um condutor secretório, contíguas e em fase de leitura. Contudo, intensifica- dores não têm que ser contíguos. A ligação é efetuada por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou Iigadores são usados de acordo com prática convencional.
Conforme aqui usado, as expressões "célula," "linha de célula", e "cultura de célula" são usadas permutavelmente, e todas tais designações incluem progenia. Desse modo, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula individual primária e culturas derivadas des- tas sem relação ao número de transferências. É também compreendido que toda progenia não pode ser precisamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertentes. Progenias mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica, conforme classificada na célula origi- nalmente transformada, são incluídas. Em que designações distintas são pretendidas, será claro a partir do contexto.
Conforme aqui usado, "reação de cadeia de polimerase" ou "P- CR" se refere a um procedimento ou técnica em que quantidades minutas de uma peça específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas conforme descrito em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4.683.195. Geralmente, a informação de seqüência a partir das extremidades da região de interesse, ou além, necessita estar disponível, tal que prímeres de oligo- nucleotídeo podem ser designados; estes prímeres serão idênticos ou simi- lares em seqüência a trançados opostos do gabarito a ser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5' dos dois prímeres podem coincidir com as ex- tremidades do material amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar seqüências de RNA específicas, seqüências de DNA específicas de DNA genômico total, e cDNA transcrito de RNA celular total, bacteriófago, ou se- quências de plasmídeo, etc. Vide geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi 51:263; Erlich1 ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.). Conforme aqui usado, a PCR é considerada para ser um, mas não o único, exemplo de um método de reação de polimerase de ácido nucleico para amplificação de uma amostra teste de ácido nucleico compreendendo o uso de um ácido nucleico conhecido como um prímer e uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma peça especí- fica de ácido nucleico.
Conforme aqui usado, o termo "seqüência de linha de germe" se refere a uma seqüência de seqüências de DNA de imunoglobulina não- rearranjadas. Qualquer fonte adequada de DNA de imunoglobulina não- rearranjada pode ser usada.
"Inibidores" são compostos que diminuem, bloqueiam, previ- nem, retardam ativação, inativam, desensibilizam, ou regulam inferiormente, por exemplo, um gene, proteína, ligante, receptor, ou célula. Um inibidor po- de também ser definido como uma composição que reduz, bloqueia, ou ina- tiva uma atividade constitutiva. Um "antagonista" é um composto que se o- põe as ações de um agonístico. Um antagonista previne, reduz, inibe, ou neutraliza a atividade de um agonístico. Um antagonista pode também pre- venir, inibir, ou reduzir atividade constitutiva de um alvo, por exemplo, um receptor-alvo, mesmo em que não existe agonísticos identificados.
Para examinar a extensão de inibição, por exemplo, amostras ou ensaios compreendendo uma dada, por exemplo, proteína, gene, célula, ou organismo, são tratados com um agente de ativação ou inibição potencial, e são comparados a amostras de controle sem o agente. As amostras de con- trole, isto é, não-tratadas com agente, são designadas um valor de atividade relativo de 100%. A inibição é alcançada quando o valor de atividade relativa ao controle é cerca de 90% ou menos, tipicamente 85% ou menos, mais tipi- camente 80% ou menos, mais tipicamente 75% ou menos, geralmente 70% ou menos, mais geralmente 65% ou menos, mais geralmente 60% ou me- nos, tipicamente 55% ou menos, usualmente 50% ou menos, mais usual- mente 45% ou menos, mais usualmente 40% ou menos, preferivelmente 35% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos, ainda mais preferivel- mente 25% ou menos, e mais preferivelmente menos do que 25%.
Os pontos finais na inibição podem ser monitorados conforme segue. Inibição, e resposta para tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, órgão, e indivíduo animal ou humano, podem ser monitorados por um ponto final. O ponto final pode compreender uma quan- tidade ou percentagem predeterminada de, por exemplo, um índice de infla- mação, oncogenicidade, ou degranulação ou secreção de célula, tal como a liberação de uma citoquina, oxigênio tóxico, ou uma protease. O ponto final pode compreender, por exemplo, uma quantidade predeterminada de fluxo ou transporte de íon; migração de célula; adesão de célula; proliferação de célula; potencial para metástase; diferenciação de célula; e mudança no fe- nótipo, por exemplo, mudança na expressão de gene relacionado a inflama- ção, apoptose, transformação, ciclo de célula, ou metástase (vide, por e- xemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sei. 30:145-158; Hood e Cheresh (2002) Nature Rev. Câncer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Tar- gets 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467- 1495; Grady e Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101- 128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic e Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).
Um ponto final de inibição é geralmente 75% do controle ou me- nos, preferivelmente 50% do controle ou menos, mais preferivelmente 25% do controle ou menos, e mais preferivelmente 10% do controle ou menos. Geralmente, um ponto final de ativação é pelo menos 150% do controle, pre- ferivelmente pelo menos duas vezes o controle, mais preferivelmente pelo menos quatro vezes o controle, e mais preferivelmente pelo menos 10 vezes o controle.
"Especificamente" ou "seletivamente" se liga, quando se refere a um ligante/receptor, anticorpo/antígeno, ou outro par de ligação, indica uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína, por exemplo, TSLP, em uma população heterogênea de proteínas e/ou outros biológicos. Desse modo, sob condições designadas, um ligante/antígeno especificado se liga a um receptor/anticorpo particular, e não e liga em uma quantidade significante a outras proteínas presentes na amostra.
O anticorpo, ou composição de ligação derivada a partir do local de ligação de antígeno de um anticorpo do método contemplado, se liga a seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, prefe- rivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos vezes maior, e, mais preferivelmente, pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com antígenos não-relacionados. Em uma concretização preferida, o anticorpo terá uma afinidade que é maior do que cerca de 109 litros/mol, conforme determinado, por exemplo, por análise de Scatchard (Munsen, et ai (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).
Conforme aqui usado, o termo "distúrbio inflamatório" se refere a qualquer doença ou distúrbio caracterizado por inflamação local em um local de dano ou infecção, e inclui, sem limitação, inflamação alérgica, doenças autoimunes, e outros distúrbios caracterizados por acúmulo indesejado de célula imune em um local de tecido local.
Conforme aqui usado, o termo "agente imunomodulatório" se refere a agentes naturais ou sintéticos que suprimem ou modulam uma res- posta imune. A resposta imune pode ser uma resposta humoral ou celular. Agentes imunomodulatórios envolvem agentes imunosupressores ou anti- inflamatórios.
"Agentes imunosupressores", "drogas imunosupressoras", ou "imunosupressores", conforme aqui usados, são tarapêuticos que são usa- dos na terapia imunosupressora para inibir ou prevenir atividade do sistema imune. Clinicamente eles são usados para prevenir a rejeição de órgãos transplantados e tecidos (por exemplo, tutano de osso, rim, fígado), e/ou no tratamento de doenças autoimune, ou doenças que são muito similarmente de origem autoimune (por exemplo, artrite reumatoide, miastenia gravis, eri- tematose de Iupos sistêmica, colite ulcerativa, esclerose múltipla). Fármacos imunosupressores podem ser classificadas em quatro grupos: glucocorticoides HYPERLINK
"http://en.wikipedia.org/wiki/lmmunosuppressive_drug" \l "cytosta- tics#cytostatics" \o "" citoestáticos; anticorpos (incluindo Modificadores de Resposta Biológica ou DMARDs); fármacos; fármacos, incluindo agentes quimioterápicos conhecidos usados no tratamento de distúrbios proliferati- vos. Para esclerose múltipla, em particular, os anticorpos da presente inven- ção podem ser administrados em conjunto com uma nova classe de terapêu- ticos similares a proteína de ligação de mielin, conhecidos como copaxonas.
"Agentes anti-inflamatórios", ou "fármacos anti-inflamatórias", são usados para representar ambos terapêuticos esteroidais e não- esteroidais. Esteroides, também conhecidos como corticosteroides, são fár- maços que se assemelham proximamente a cortisol, um hormônio produzido naturalmente por glândulas adrenais. Esteroides são usados como o trata- mento principal para certas condições inflamatórias, tais como: vasculite sis- têmica (inflamação de vasos sangüíneos; e Miosite (inflamação de músculo). Os esteroides podem também serem usados seletivamente para tratar con- dições inflamatórias, tais como: artrite reumatoide (artrite inflamatória crônica que ocorre nas juntas em ambos os lados do corpo); eritematose de Iupos sistêmica (uma doença generalizada causada pela função de sistema imune anormal); síndrome de Sjõgren (distúrbio crônico que seca os olhos e seca a boca).
Fármacos não-esteroidais anti-inflamatórias, usualmente abrevi-
adas por NSAIDs, são fármacos com efeitos analgésicos, antipiréticos e anti- inflamatórios - elas reduzem dor, febre e inflamação. O termo "não- esteroidal" é usado para distinguir estas fármacos de esteroides, que (entre uma faixa ampla de outros efeitos) têm uma ação anti-inflamatória de de- pressão eicosanoide similar. NSAIDs são geralmente indicadas para o alívio sintomático das seguintes condições: artrite reumatoide; osteoartrite; artro- patias inflamatórias (por exemplo, espondilite de anquilosação, artrite psoriática, síndrome de Reiter); gota aguda; dismenorréia; dor de osso metastático; dor de cabeça e enxaqueca; dor pós-operatória; dor suave a moderada devido a inflamação e dano de tecido; pirexia; e cólica renal. NSAIDs incluem salicilatos, ácidos arlialcanóicos, ácidos 2-arilpropiônico (profens), ácidos N-arilantranílicos (ácidos fenâmicos), oxicams, coxibs, e sulfonanilidas. II. Geral
A presente invenção proporciona anticorpos anti-TSLP projeta- dos e usos destes para tratar distúrbios inflamatórios, e, particularmente, distúrbios inflamatórios alérgicos. Em uma concretização preferida, o distúr- bio inflamatório é asma. Em uma concretização preferida, o distúrbio infla- matório alérgico é rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica. A presente invenção também proporciona anticorpos anti-TSLP projetados para tratar fibrose, doença inflamatória de intestino ou Iinfoma de Hodgkin.
TSLP é um membro da família de 'cadeia longa' de citoquinas hematopoiéticas. Critérios na base estrutural de reconhecimento de citoqui- na/receptor de 'cadeia longa' mostraram que, embora áreas grandes de su- perfície de proteína sejam enterradas na formação de citoquina - comple- xões de receptor, a afinidade da interação é dominada por uns poucos resí- duos de aminoácido apertadamente agrupados formando um 'ponto quente' energético no centro da interface de ligação. A identidade dos resíduos que dominam a energia de ligação de uma interface grande de proteína-proteína foi denominada o 'epítope funcional'. A afinidade da interação (e, consequen- temente, especificidade biológica) é consequentemente definida pela com- plementaridade estrutural dos epítopes funcionais de Iigante e receptor. Es- tudos detalhados de mutagênese mostraram que os resíduos mais signifi- cantes que compõem os epítopes funcionais de citoquinas e receptores são contatos hidrofóbicos envolvendo, ou cadeias laterais não-polares, tais como triptofan, os componentes alifáticos de cadeias laterais não-polares, ou o suporte principal do polipeptídeo. O 'núcleo' não-polar é circundado por um halo de resíduos polares de menor importância para energia de ligação. Es- tudos cinéticos indicam que o papel primário dos epítopes funcionais é esta- bilizar interação de proteína-proteína pela diminuição da taxa de dissociação do complexo. Tem sido sugerido que o contato inicial entre citoquina e re- ceptor é dominado pela difusão aleatória ou 'rolamento' de superfícies de proteína que produzem muitos contatos instáveis. O complexo é então esta- bilizado quando os epítopes funcionais do receptor e iigante engajam (vide,
por exemplo, Bravo e Heath, supra).
III. Geração de Anticorpos Específicos de TSLP
Qualquer método adequado para geração de anticorpos mono- clonais pode ser usado. Por exemplo, um recipiente pode ser imunizado com uma forma ligada ou não-ligada (por exemplo, ocorrendo naturalmente) do heterodímero de TSLP, ou um fragmento deste. Qualquer método adequado de imunização pode ser usado. Tais métodos podem incluir adjuvantes, ou- tros imunoestimulantes, imunizações impulsionadoras repetidas, e o uso de uma ou mais rotas de imunização.
Qualquer fonte adequada de TSLP pode ser usada como o imu- nógeno para a geração do anticorpo não-humano, das composições e méto- dos aqui descritos. Tais formas incluem, mas não estão limitadas a, proteína inteira, incluindo heterodímeros ligados e que ocorrem naturalmente, peptí- deo(s), e epítopes, gerados através de meios de degradação recombinante, sintética, química ou enzimática conhecidos na técnica.
Qualquer forma do antígeno pode ser usada para gerar o anti- corpo que é suficiente para gerar um anticorpo biologicamente ativo. Desse modo, a indução do antígeno pode ser um epítope simples, epítopes múlti- pios, ou a proteína total sozinha ou em combinação com um ou mais agen- tes de intensificação de imunogenicidade conhecidos na técnica. O antígeno de indução pode ser uma proteína de comprimento total isolada, uma proteí- na de superfície de célula (por exemplo, imunização com células transfecta- da com pelo menos uma porção do antígeno), ou uma proteína solúvel (por exemplo, imunização com somente porção de domínio extracelular da prote- ína). O antígeno pode ser produzido em uma célula geneticamente modifica- da. O DNA que codifica o antígeno pode ser genômico ou não-genômico (por exemplo, cDNA), e codifica pelo menos uma porção do domínio extrace- lular. Conforme aqui usado, o termo "porção" se refere ao número mínimo de aminoácidos ou ácidos nucleicos, conforme apropriado, para constituir um epítope imunogênico do antígeno de interesse. Quaisquer vetores genéticos adequados para transformação das células de interesse podem ser empre- gados, incluindo, mas não limitados a, vetores adenovirais, plasmídeos, e vetores não-virais, tais como lipídios catiônicos.
Qualquer método adequado pode ser usado para induzir um an- ticorpo com as propriedades biológicas desejadas para inibir TSLP. É dese- jável preparar anticorpos monoclonais (mAbs) de vários hospedeiros de mamífero, tais como, camundongos, roedores, primatas, seres humanos, etc. A descrição de técnicas para preparação de tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em, por exemplo, Stites, et al. (eds.) Basic ε Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referên- cias citadas aqui; Harlow e Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manu- al CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles ε Prac- tice (2d ed.) Academic Press, New York, NY. Desse modo, anticorpos mo- noclonais podem ser obtidos por uma variedade de técnicas familiares aos pesquisadores técnicos no assunto. Tipicamente, células de baço de um a- nimal imunizado com um antígeno desejado são imortalizadas, comumente por fusão com uma célula de mieloma. Vide Kohler e Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Métodos alternativos de imortalização incluem trans- formação com Epstein Barr Vírus, oncogenes, ou retrovírus, ou outros méto- dos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Doyle, et al. (eds. 1994, su- plementos periódicos) CELL AND TiSSUE Culture: Laboratory Procedu- res, John Wiley e Sons, New York, NY. Colônias que ocorrem de células imortalizadas simples são classificadas para produção de anticorpos da es- pecificidade e afinidade desejadas para o antígeno, e rendimentos de anti- corpos monoclonais produzidos portais células podem ser intensificados por várias técnicas, incluindo injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Alternativamente, pode-se isolar seqüências de DNA que codifi- cam um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação deste por classifi- cação de uma biblioteca de DNA de células B humanas de acordo com, por exemplo, o protocolo geral esboçado por Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.
Outras técnicas adequadas envolvem seleção de bibliotecas de anticorpos em fago ou vetores similares. Vide, por exemplo, Huse et al., Sci- ence 246:1275-1281 (1989); e Ward et al., Nature 341:544-546 (1989). Os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção podem ser usados com ou sem modificação, incluindo anticorpos quiméricos e humanizados. Freqüen- temente, os polipeptídeos e anticorpos serão rotulados por união, ou cova- Ientemente ou não-covalentemente, uma substância que proporciona um sinal detectável. Uma ampla variedade de rótulos e técnicas de conjugação são conhecidas e são reportadas extensivamente em ambas literatura cientí- fica e de patente. Rótulos adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimilumi- nescentes, partículas magnéticas, e similares. Patentes ensinando o uso de tais rótulos incluem Patentes dos Estados Unidos Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; e 4.366.241. Tam- bém, imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas, vide Cabilly Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; e Queen et al. (1989) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86:10029-10033; ou produzidas em camundongos transgê- nicos, vide Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; também vide Abgenix e Medarex technologies.
Anticorpos ou composições de ligação contra fragmentos prede- terminados de TSLP podem ser providos por imunização de animais com conjugados do polipeptídeo, fragmentos, peptídeos, ou epítopes com proteí- nas-veículo. Anticorpos monoclonais são preparados de células que secre- tam o anticorpo desejado. Estes anticorpos podem ser classificados para ligação a TSLP normal ou defectivo. Estes anticorpos monoclonais se ligarão usualmente com pelo menos um Kd de cerca de 1 μΜ, mais usualmente pelo menos cerca de 300 nM, tipicamente pelo menos cerca de 30 nM, preferi- velmente pelo menos cerca de 10 nM, mais preferivelmente pelo menos cer- ca de 3 nM ou melhor, usualmente determinado por ELISA. IV. Humanização de Anticorpos Específicos de TSLP
Qualquer anticorpo não-humanizado adequado pode ser usado como uma fonte para a região hipervariável. As fontes para anticorpos não- humanos incluem, mas não estão limitadas a, murina, Lagomorphs (incluin- do coelhos), bovino, e primatas. Para a maior parte, os anticorpos humani- zados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos de região de estrutura de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por re- síduos não-humanos correspondentes. Adicionalmente, anticorpos humani- zados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adi- cionalmente refinar desempenho do anticorpo da atividade biológica deseja- da. Para detalhes adicionais, vide Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. S- truct. Biol. 2:593-596.
Métodos para projetar recombinantemente anticorpos foram descritos, por exemplo, por Boss et al. (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.397), Cabilly et al. (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567), Law et al. (Publicação de Pedido de Patente Europeu No. 438 310) e Winter (Pu- blicação de Pedido de Patente Europeu No. 239400).
Variantes se seqüência de aminoácido de anticorpo anti-TSLP humanizado são preparadas pela introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadas no DNA de anticorpo anti-TSLP humanizado, ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, anulações de, e/ou inserções em, e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido mostradas para o anti-TSLP F(ab) humanizado. Qualquer combinação de anulação, inserção, e substituição é feita para chegar na construção final, provido que a construção final possui as características desejadas. As mu- danças de aminoácido também podem alterar os processos pós- translacionais do anticorpo anti-TSLP humanizado, tal como mudando o nú- mero ou posição de locais de glicosilação. Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões
do polipeptídeo de anticorpo anti-TSLP humanizado que são localizações preferidas para mutagênese é denominado "mutagênese de escaneamento de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos-alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp1 His, Lys, e Glu), e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoáci- dos com antígeno de TSLP. Os resíduos de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições em seguida são refinados pela intro- dução de adicionais ou outras variantes em, ou para, os locais de substitui- ção. Desse modo, enquanto o local para introdução de uma variação de se- quência de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação a um dado local, escaneamento de Ala ou mutagênese aleató- ria é conduzida no códon-alvo ou região, e as variantes de anticorpo anti- TSLP humanizado expresso são classificadas para a atividade desejada. Inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões amino-
e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipep- tídeos contendo uma centena ou mais resíduos, bem como inserções de intrassequência de resíduos de aminoácido simples ou múltiplas. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo anti-TSLP humanizado com um resíduo N-terminal metionil, ou o anticorpo fundido a uma etiqueta de epíto- pe. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo anti-TSLP huma- nizado incluem a fusão ao N- ou C-terminal de anticorpo anti-TSLP humani- zado de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida do soro do anticorpo.
Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoá-
cido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécu- la de anticorpo anti-TSLP humanizado removida, e um resíduo diferente in- serido em seu lugar. Os locais de maior interesse para mutagênese substitu- cional incluem os circuitos fechados hipervariáveis, mas alterações de FR são também contempladas. Resíduos de região hipervariável ou resíduos de FR envolvidos na ligação de antígeno são geralmente substituídos em uma maneira relativamente conservativa. Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o mode- lo de glicosilação original do anticorpo. Por alteração é significativo anulação de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adi- ção de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anti- corpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-Iigada ou O-ligada. N- Iigada se refere à fixação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção de car- boidrato à cadeia lateral de asparagina. Desse modo, a presença de qual- quer destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigada se refere a fixação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiami- no, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina possam também serem usadas.
A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é conveniente- mente acompanhada pela alteração da seqüência de aminoácido tal que ela contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeo acima descritas (para locais de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-ligados).
Ainda outro tipo de variante de aminoácido é a substituição de resíduos para proporcionar maior estabilidade química do anticorpo humani- zado final. Por exemplo, um resíduo de asparagina (N) pode ser mudado para reduzir o potencial para formação de isoaspartato em quaisquer se- qüências de NG dentro de uma CDR de roedor. Em uma concretização, a asparagina é mudada para glutamina (Q). A formação de isoaspartato pode debilitar ou anular completamente a ligação de um anticorpo a seu antígeno- alvo. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 em 734. Em adição, resíduos de metionina em CDRs de roedor podem ser mudados para reduzir a possibilidade que a metionina enxofre oxidaria, que pode reduzir a afinida- de de ligação do antígeno, e também contribuir para heterogeneidade mole- cular na preparação de anticorpo final. Id. Em uma concretização, a metioni- na é mudada para alanina (A). Os anticorpos com tais substituições são subseqüentemente classificados para assegurar que as substituições não diminuem a afinidade de ligação de TSLP a níveis inaceitáveis.
As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de se- qüências de aminoácido de anticorpo específico de TSLP humanizado são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natu- ral (no caso de variantes de seqüência de aminoácido que ocorrem natural- mente), ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada de local), mutagênese de PCR, e mutagênese de cassetes de uma variante anteriormente preparada, ou uma versão não-variante de anti- corpo anti-TSLP humanizado.
Ordinariamente, as variantes de seqüência de aminoácido do anticorpo anti-TSLP humanizado terá uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 75% da identidade de seqüência de aminoácido com as se- qüências de aminoácido de anticorpo humanizado de cadeia ou pesada ou leve, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo me- nos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente pe- lo menos 95%. A identidade ou homologia com relação a esta seqüência é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticas aos resíduos de anti-TSLP humanizados, após alinhamento das seqüências e introdução de folgas, se necessário, para al- cançar a identidade de seqüência porcento máxima, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüên- cia. Nenhuma das extensões N-terminal, C-terminal, ou internas, anulações, ou inserções na seqüência de anticorpo, devem ser construídas como afe- tando a identidade de seqüência ou homologia.
O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer clas- se de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo de IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser usado, incluindo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Variantes dos isotipos de IgG são também contempladas. O anticorpo humanizado pode compreender seqüências de mais do que uma classe ou isotipo. A otimização das seqüências de domínio constante necessárias para gerar a atividade biológica desejada é pronta- mente alcançada pela classificação dos anticorpos nos ensaios biológicos descritos abaixo.
Do mesmo modo, qualquer classe de cadeia leve pode ser usa- da nas composições e métodos aqui. Especificamente, kappa, lâmbda, ou variantes destas, são úteis nas presentes composições e métodos.
Qualquer porção adequada das seqüências de CDR a partir do anticorpo não-humano pode ser usada. As seqüências de CDR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou anulação de pelo menos um resíduo tal que a seqüência de CDR seja distinta da seqüência de anticorpo humana e não-humana empregada. É contemplado que tais mutações seri- am mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpo hu- manizado corresponderão àqueles dos resíduos de CDR não-humanos, mais freqüentemente 90%, e, mais preferivelmente maior do que 95%.
Qualquer porção adequada das seqüências de FR a partir do anticorpo humano pode ser usada. As seqüências de FR podem ser muta- genizadas por substituição, inserção ou anulação de pelo menos um resíduo tal que a seqüências de FR sejam distintas das seqüências de anticorpo humano e não-humano empregadas. É contemplado que tais mutações seri- am mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpo hu- manizado corresponderão àqueles dos resíduos de FR humanos, mais fre- qüentemente 90%, e, mais preferivelmente, maior do que 95%.
Resíduos de CDR e FR são determinados de acordo com a defi- nição de seqüência padrão de Kabat. Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987). A Tabela 2 proporciona informação identificadora de seqüência para as CDRs de cadeia pesada variável de rato (r23B12) e humano (hu23B12). A Tabela 3 proporciona informação identificadora de seqüência para as CDRs de cadeia leve variável de r23B12 e hu23B12. Tabela 2
Seqüências de Cadeia Pesada e Domínios
Clone de anticorpo SEQ ID NO: Resíduos de Vh resíduos de CDR de cadeia pesada CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 r23B12 7 1-116 26-35 50-65 95-105 Hu23B12 10 1-116 26-35 50-65 95-105
Tabela 3
Seqüências de Cadeia Leve e Domínios
Clone de anticorpo SEQ ID NO: Resíduos dE Vl Resíduos de CDR de cadeia leve CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 r23B12 8 1-108 24-34 50-56 89-97 Hu23B12 12 1-108 24-34 50-56 89-97
A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-H1 é GYIFTDYAMH (SEQ
ID NO. 1). A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-H2 é TFIPL- LDTSDYNQNFKG (SEQ ID NO. 2). A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-H3 é MGVTHSYVMDA (SEQ ID NO. 3).
A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-L1 é RASQPISISVH (SEQ ID NO. 4). A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-L2 é FASQSIS (SEQ ID NO. 5). A seqüência r23B12 e hu23B12 CDR-L3 é QQTFSLPYT (SEQ ID NO. 6).
A seqüência variável de aminoácido de cadeia pesada r23B12 é EEKLQQSGDD LVR
PGAAVKMSCKASGYIFTDYAMHWVKQRPGQGLEWIGTFIPLLDTSDYNQN FKGRATLTADKSSNTAYMELSRLTSEDSAVYYCARMGVTHSYVMDAWGQ GASVTVSS (SEQ ID NO. 7).
A seqüência variável de aminoácido de cadeia leve r23B12 é DIVLTQSPATLSV
TPGESVSLSCRASQPISISVHWFQQKSNESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGS GSGTDFTL NINRVESEDFSVYYCQQTFSLPYTFGTGTKLELKR (SEQ ID NO. 8).
A seqüência de ácido nucleico para a cadeia pesada variável de hu23B12 é CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGC GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGC GCC TCC GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ATC TTC ACC GAC TAC GCC ATG CAC TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC CAG GGG CTG GAG TGG ATG GGT ACC TTC ATC CCT CTG CTG GAC ACC AGC GAC TAC AAC CAG AAC TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT GAC GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGT GCC AGA ATG GGA GTG ACC CAC AGC TAC GTG ATG GAT GCA TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC AGC (SEQ ID NO: 9), que codifica a seqüência variável de de aminoácido de cadeia pesada de hu23B12
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYAMHWVRQAPGQGLEWM GTFIPLLDTSDYNQNFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARM GVTHSYVM DAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 10).
A seqüência de ácido nucleico para a cadeia leve variável de hu23B12 é GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGC ACC CTG TCT CTG TCT CCA GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGC CAG CCC ATC TCC ATC AGC GTG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG GCT CCA AGG CTG CTG ATC TAC TTT GCC TCC CAG AGC ATC TCC GGG ATC CCC GAT AGG TTC AGC GGA TCC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTC GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAG ACC TTC AGC CTG CCT TAC ACT TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAG CGT (SEQ ID NO: 11), que codifica a seqüência variável de aminoácido de cadeia leve de hu23B12 é EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQPISISVHWYQQKPGQA PRLLIYFASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTFSLPY TFGQG TKVEIKR (SEQ ID NO. 12).
A seqüência de ácido nucleico para a cadeia leve de hu23B12 é CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGC GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGC GCC TCC GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ATC TTC ACC GAC TAC GCC ATG CAC TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC CAG GGG CTG GAG TGG ATG GGT ACC TTC ATC CCT CTG CTG GAC ACC AGC GAC TAC AAC CAG AAC TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT GAC GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGT GCC AGA ATG GGA GTG ACC CAC AGC TAC GTG ATG GAT GCA TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC AGC GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA (SEQ ID NO: 13), que codifica a seqüência de hu23B12 de ami- noácido de cadeia pesada pesada
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYAMHWVRQAPGQGLEWM GTFIPLLDTSDYNQNFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARM GVTHSYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
A seqüência de ácido nucleico para a cadeia leve de hu23B12 é GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGC ACC CTG TCT CTG TCT CCA GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGC CAG CCC ATC TCC ATC AGC GTG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG GCT CCA AGG CTG CTG ATC TAC TTT GCC TCC CAG AGC ATC TCC GGG ATC CCC GAT AGG TTC AGC GGA TCC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTC GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAG ACC TTC AGC CTG CCT TAC ACT TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT (SEQ ID NO: 15), que codifica a seqüência de amino- ácido de cadeia leve de hu23B12
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQPISISVHWYQQKPGQAPRLLI YFASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTFSLPYTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 16).
Também contemplados são anticorpos quiméricos. Conforme notado acima, anticorpos quiméricos típicos compreendem uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica a ou homóloga às seqüências correspon- dentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica a ou homóloga às seqüências correspondentes em anti- corpos derivados de outras espécies, ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, conside- rando-se que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente dos Esta- dos Unidos 4.816.567; e Morrison et al. (1984) Proc. NatL Acad. Sei. USA 81: 6851-6855).
Anticorpos biespecíficos são também úteis nos presentes méto- dos e composições. Conforme aqui usado, o termo "anticorpo biespecífico" se refere a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, tendo espe- cificidades de ligação para pelo menos dois epítopes antigênicos diferentes. Em uma concretização, os epítopes são a partir do mesmo antígeno. Em outra concretização, os epítopes são a partir de dois antígenos diferentes. Métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na téc- nica. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos recombi- nantemente usando-se a coexpressão de dois pares de cadeia leve/cadeia pesada de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativamente, anticorpos biespecíficos podem ser prepara- dos usando-se ligação química. Vide, por exemplo, Brennan, et al. (1985) Science 229: 81. Anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecíficos. Vide, por exemplo, Hollinger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber1 et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Em ainda outras concretizações, domínios constantes diferentes podem ser anexados às regiões de Vl e Vh humanizadas aqui providas. Por exemplo, se um uso pretendido particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção fosse chamar por funções efetuadoras alteradas, um do- mínio constante de cadeia pesada outro do que IgGI pode ser usado. Embo- ra anticorpos de IgGI proporcionem meia vida longa, e para funções efetua- doras, tal como ativação de complemento e citotoxicidade celular dependen- te de anticorpo, tais atividades podem não serem desejáveis para todos os usos do anticorpo. Em tais exemplos, um domínio constante de lgG4, por
exemplo, pode ser usado.
V. Atividade biológica e Anti-TSLP Humanizado
Anticorpos tendo as características aqui identificadas como sen- do desejáveis em um anticorpo anti-TSLP humanizado podem ser classifica- dos para atividades biológicas inibitórias in vitro, ou para afinidade de ligação adequada. Para classificar os anticorpos que se ligam ao epítope no TSLP humano ligado por um anticorpo de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam ligação da citoquina a seu receptor), um ensaio de bloqueio cru- zado de rotina, tal como aquele descrito em AntiBODIES, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítope são similar- mente para bloqueio cruzado em tais ensaios, mas nem todos os anticorpos de bloqueio cruzado se ligam precisamente ao mesmo epítope, visto que o bloqueio cruzado pode resultar de impedimento estérico de ligação de anti- corpo por anticorpos ligados em epítopes mais próximos, ou mesmo se so- brepondo.
Alternativamente, mapeamento de epítope, por exemplo, con- forme descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epítope de interes- se. "Mutagênese de escaneamento de alanina", conforme descrito por Cun- ningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085, ou alguma outra forma de mutagênese de ponto de resíduos de aminoácido em TSLP humano também seja usada para determinar o epítope funcional para um anticorpo anti-TSLP da presente invenção. Estudos de mutagênese, contudo, podem também revelar resíduos de aminoácido que sejam cruciais à estrutura tridimensional total de TSLP, mas que não sejam diretamente envolvidas em contatos anti- corpo-antígeno, e, desse modo, outros métodos podem ser necessários para confirmar um epítope funcional determinado usando-se este método. O epítope ligado por um anticorpo específico pode também ser
determinado pela avaliação da ligação do anticorpo a peptídeos compreen- dendo fragmentos de TSLP humano. A seqüência de aminoácido de TSLP humano é colocada em SEQ ID NO: 4 em WO 00/17362. Uma série de pep- tídeos de sobreposição envolvendo a seqüência de TSLP pode ser sintetiza- da e classificada para ligação, por exemplo, em um ELISA direto, um ELISA competitivo (em que o peptídeo é avaliado para sua capacidade de prevenir ligação de um anticorpo a TSLP ligado a uma cavidade de uma placa de mi- crotitulação), ou em um chip. Tais métodos de classificação de peptídeo po- dem não serem capazes de detectar alguns epítopes funcionais descontí- nuos, isto é, epítopes funcionais que envolvem resíduos de aminoácido que não são contíguos ao longo da seqüência primária da cadeia de polipeptídeo de TSLP.
O epítope ligado por anticorpos da presente invenção pode tam- bém ser determinado por métodos estruturais, tais como determinação de estrutura de cristal de raios X (por exemplo, W02005/044853), modelagem molecular e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), inclu- indo determinação de RMN das taxas de troca de H-D de hidrogênios de amida instáveis em TSLP quando livres e quando ligados em um complexo com um anticorpo de interesse (Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
Com relação a cristalografia de raios X, a cristalização pode ser efetuada usando-se qualquer dos métodos conhecidos na técnica (por e- xempio, Giege et al. (1994) Acta Crystaiiogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), incluindo microbatelada (por exemplo, Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), tendo difusão de vapor de gota em balanço (por exemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300 -6303), semeadura e diálise. É desejável usar uma preparação de proteína tendo uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/mL e preferivelmente cerca de 10 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. A cristalização pode ser melhor alcan- çada em uma solução de precipitante contendo polietileno glicol 1000-20,000 (PEG; peso molecular médio variando de cerca de 1000 a cerca de 20,000 Da), preferivelmente cerca de 5000 a cerca de 7000 Da, mais preferivelmen- te cerca de 6000 Da1 com concentrações variando de cerca de 10% a cerca de 30% (w/v). Pode também ser desejável incluir um agente de estabilização de proteína, por exemplo, glicerol a uma concentração variando de cerca de 0,5% a cerca de 20%. Um sal adequado, tal como cloreto de amônia, cloreto de lítio ou citrato de sódio pode também ser desejável na solução de precipi- tante, preferivelmente em uma concentração variando de cerca de 1 mM a cerca de 1000 mM. O precipitante é preferivelmente tamponado a um pH de cerca de 3,0 a cerca de 5,0, preferivelmente cerca de 4,0. Tampões especí- ficos úteis na solução de precipitante pode variar e são bem-conhecidos na técnica (Scopes, Proteína Purification: Principies e Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York). Exemplos de tampões úteis incluem, mas não estão limitados a, HEPES, Tris, MES e acetato. Cristais podem ser desen- volvidos a uma faixa ampla de temperaturas, incluindo 2°C, 4°C, 8°C e 26°C.
Cristais de anticorpo:antígeno podem ser estudados usando-se técnicas de difração de raios X bem-conhecidas, e podem ser refinados u- sando-se software de computador, tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuído por Molecular Simulations, Inc.; vide, por exemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Aca- demic Press; Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2004/0014194), e BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bri- cogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323), as descrições dos quais são, des- se modo, aqui incorporados por referência em suas totalidades.
A ligação de anticorpos adicionais ao mesmo epítope como um anticorpo da presente invenção pode ser obtida, por exemplo, por classifica- ção de anticorpos elevada contra TSLP para ligação ao epítope, ou por imu- nização de um animal com um peptídeo compreendendo um fragmento de TSLP humano compreendendo a seqüência de epítope. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítope funcional podem ser esperados exibir atividades biológicas similares, tais como bloqueio de ligação de receptor, e tais ativi- dades podem ser confirmadas por ensaios funcionais dos anticorpos.
Afinidades de anticorpo (por exemplo, para TSLP humano) po- dem ser determinadas usando-se análise-padrão. Anticorpos humanizados preferidos são aqueles que se ligam a TSLP humano com um valor Kd of não mais do que cerca de 1x10"7; preferivelmente não mais do que cerca de 1x10"8; mais preferivelmente não mais do que cerca de 1x10"9; e mais prefe- rivelmente não mais do que cerca de 1x10"10 M.
Os anticorpos e fragmentos destes úteis nas presentes compo- sições e métodos são anticorpos e fragmentos biologicamente ativos. Con- forme aqui usado, o termo "biologicamente ativo" se refere a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de se ligar ao epítope antigênico de- sejado, ou exercer indiretamente um efeito biológico. Tipicamente, estes e- feitos resultam da falha do TSLP se ligar a seu receptor. Em uma concreti- zação, o anticorpo e fragmentos destes úteis nas presentes composições e métodos inibem: proliferação induzida por hTSLP de uma linha de célula de Baf-3 transfectada com receptor-hTSLP e IL-7Ralfa; expressão de Iuciferase induzida por hTSLP de uma linha de célula de Baf-3 transfectada com o re- ceptor-TSLP, e um sistema relator de luciferase; secreção de TARC induzida por hTSLP de monócitos primários humanos isolados de PBMCs; e indução de diferenciação de Th2.
Conforme aqui usado, o termo "específico" se refere a ligação seletiva do anticorpo ao epítope de antígeno alvo. Os anticorpos podem ser testados para especificidade de ligação por comparação da ligação a TSLP para ligação ao antígeno irrelevante ou mistura de antígeno sob um dado conjunto de condições. Se o anticorpo se liga ao TSLP pelo menos 10, e preferivelmente 50 vezes mais do que ao antígeno irrelevante ou mistura de antígeno, então ele é considerado ser específico. Um anticorpo que "especi- ficamente se liga" a TSLP não se liga às proteínas que não compreendem as seqüências derivadas de TSLP, isto é, "especificidade", conforme aqui usado, se refere a especificidade de TSLP, e não qualquer outras seqüên- cias que podem estar presentes na proteína em questão. Por exemplo, con- forme aqui usado, um anticorpo que "especificamente se liga" a TSLP tipi- camente se ligará a FLAG-h TSLP, que é uma proteína de fusão compreen- dendo TSLP e uma etiqueta de peptídeo FLAG®, mas não se liga a etiqueta de peptídeo FLAG® sozinho ou quando ele é fundido a uma proteína outra do que TSLP. VI. Composições Farmacêuticas
Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis, o anticor- po ou fragmento deste é misturado com um veículo ou excipiente farmaceu- ticamente aceitável, vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Scien- ces e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Formulações de agentes terapêuticos e de diagnósticos podem ser preparadas pela mistura com veículos fisiologicamente aceitá- veis, excipientes, ou estabilizadores na forma de, por exemplo, pós Iiofiliza- dos, pastas fluidas, soluções aquosas ou suspensões (vide, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-HiII, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science e Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Me- dications, Mareei Dekker, NY; Lieberman, etal. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Mareei Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaeeutieal Dosage Forms: Disperse Systems, Mareei Dekker, NY; Wei- ner e Kotkoskie (2000) Exeipient Toxieity e Safety, Mareei Dekker, Inc., New York, NY).
Toxicidade e eficiência terapêutica das composições de anticor- po, administradas sozinhas ou em combinação com um agente imunosu- pressor, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, para determi- nação da LD50 (a dose letal em 50% da população) e a ED50 (a dose tera- peuticamente efetiva em 50% da população). A proporção de dose entre e- feitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e ele pode ser expresso como a proporção entre LD5O e ED50. Os anticorpos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cul- tura de célula e estudos de animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compos- tos estão preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações de circula- ção que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem po- de variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada.
Rotas adequadas de administração incluem administração pa- renteral, tais como administração intra museu lar, intravenosa, ou subeutânea. A administração de anticorpo usado na composição farmacêutica, ou para praticar o método da presente invenção, pode ser efetuada em uma varieda- de de modos convencionais, tais como ingestão oral, inalação, aplicação tópica ou cutânea, subeutânea, intraperitoneal, parenteral, intraarterial ou injeção intravenosa. Em uma concretização, o composto de ligação da in- venção é administrada intravenosamente. Em outra concretização, o com- posto de ligação da invenção é administrada subeutaneamente.
Alternadamente, pode-se administrar o anticorpo em um local preferivelmente do que maneira sistêmica, por exemplo, via injeção do anti- corpo diretamente em uma junta artrítica, ou lesão induzida por patogenia caracterizada por imunopatologia, freqüentemente em um depósito ou for- mulação de liberação sustentada. Além disso, pode-se administrar o anticor- po em um sistema de distribuição de droga alvo, por exemplo, em um Iipos- soma revestido com um anticorpo específico de tecido, tendo como alvo, por exemplo, junta artrítica, ou lesão induzida por patogenia caracterizada por imunopatologia. Os Iipossomas serão alvejados e retirados seletivamente pelo tecido afligido.
A seleção de um regime de administração para um terapêutico depende de vários fatores, incluindo a taxa de rodízio de soro ou tecido da entidade, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade, e a acessibi- lidade das células alvos na matriz biológica. Preferivelmente, um regime de administração maximize a quantidade de terapêutico distribuído ao paciente consistente com um nível aceitável de efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade de biológico distribuída depende em parte da entidade particu- lar e da severidade da condição sendo tratada. Orientação na seleção de doses apropriadas de anticorpos, citoquinas, e moléculas pequenas são dis- poníveis (vide, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibo- dies, Citokines e Arthritis, Mareei Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases1 Mar- eei Dekker1 New York, NY; Baert, et ai (2003) New Engi J. Med. 348:601- 608; Milgrom1 et al. (1999) NewEngi J. Med. 341:1966-1973; Slamon1 et ai (2001) NewEngi J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz1 et al. (2000) NewEn- gl. J. Med. 342:613-619; Ghosh1 et al. (2003) New Engi J. Med. 348:24-32; Lipsky1 et ai (2000) NewEngi J. Med. 343:1594-1602).
A determinação da dose apropriada é feita pelo clínico, por e- xemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou imaginados na técnica para afetar o tratamento ou predizer afetar o tratamento. Geralmente, a dose começa com uma quantidade um tanto menor do que a dose otimizada, e é aumentada por pequenos incrementos em seguida até que o efeito otimiza- do ou desejado é alcançado relativo a quaisquer efeitos colaterais negativos. Medições de diagnóstico importantes incluem aquelas de sintomas de, por exemplo, a inflamação ou nível de citoquinas inflamatórias produzidos. Pre- ferivelmente, um biológico que será usado é derivado da mesma espécie conforme o animal alvo para tratamento, desse modo, minimizando uma resposta inflamatória, autoimune, ou proliferativa ao reagente.
Anticorpos, fragmentos de anticorpo, e citoquinas podem ser providos por infusão contínua, ou por doses em intervalos de, por exemplo, um dia, uma semana, ou 1-7 vezes por semana. As doses podem ser provi- das intravenosamente, subeutaneamente, topicamente, oralmente, nasal- mente, retalmente, intramuscularmente, intracerebralmente, intraespinhal- mente, ou por inalação. Um protocolo de dose preferido é um envolvendo a dose máxima ou freqüência de dose que evita efeitos colaterais indesejáveis significantes. Uma dose semanal total é geralmente pelo menos 0,05 Dg/kg de peso corpóreo, mais geralmente pelo menos 0,2 Dg/kg, mais geralmente pelo menos 0,5 Dg/kg, tipicamente pelo menos 1 Dg/kg, mais tipicamente pelo menos 10 Dg/kg, mais tipicamente pelo menos 100 Dg/kg, preferivel- mente pelo menos 0,2 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 1,0 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 2,0 mg/kg, otimamente pelo menos 10 mg/kg, mais otimamente pelo menos 25 mg/kg, e mais otimamente pelo me- nos 50 mg/kg (vide, por exemplo, Yang, et al. (2003) New Engi J. Med. 349:427-434; Herold, et ai (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu1 et ai (1999) J. Neuroi Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunoi Immunother. 52:133-144). A dose desejada de um tarapêu- tico de molécula pequena, por exemplo, um peptídeo mimético, produto na- 5 tural, ou químico orgânico, é cerca da mesma para um anticorpo ou polipep- tídeo, em base de mols/kg.
Conforme aqui usado, "inibir" ou "tratar" ou "tratamento", incluem uma transferência de desenvolvimento dos sintomas associados com doen- ça autoimune, ou imunopatologia induzida por patogenia e/ou uma redução 10 na severidade de tais sintomas que são ou serão esperados se desenvolve- rem. Os termos adicionalmente incluem melhora de sintomas de imunopato- logia autoimune não-controlados e indesejados, ou induzidos por patogenia existentes, prevenção de sintomas adicionais, e melhora ou prevenção das causas básicas de tais sintomas. Desse modo, os termos denotam que um 15 resultado benéfico foi conferido em um indivíduo vertebrado com uma doen- ça inflamatória.
Conforme aqui usado, o termo "quantidade terapeuticamente efetiva" ou "quantidade efetiva" se refere a uma quantidade de um anticorpo anti-TSLP ou fragmento deste, que quando administrada sozinha ou em 20 combinação com um agente terapêutico adicional a uma célula, tecido, ou indivíduo, é efetiva para prevenir ou melhorar a doença autoimune ou doen- ça associada a imunologia induzida por patogenia ou condição ou a progres- são da doença. Uma dose terapeuticamente efetiva adicionalmente se refere àquela quantidade do composto suficiente para resultar na melhora dos sin- 25 tomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhora da condição médica relevante, ou um aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção, ou melhora de tais condições. Quando aplicada a um ingrediente ativo indi- vidual administrado sozinho, uma dose terapeuticamente efetiva se refere àquele ingrediente sozinho. Quando aplicada a uma combinação, uma dose 30 terapeuticamente efetiva se refere a quantidades combinadas dos ingredien- tes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrada em combina- ção, em série ou simultaneamente. Uma quantidade efetiva de terapêutico diminuirá os sintomas tipicamente por pelo menos 10%; usualmente por pelo menos 20%; preferivelmente pelo menos cerca de 30%; mais preferivelmen- te pelo menos 40%, e mais preferivelmente por pelo menos 50%.
Métodos para co-administração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citoquina, esteroide, agente quimiote- rapêutico, antibiótico, ou radiação, são bem-conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman e GiIman1S The Pharmaco- Iogical Basis of Therapeuties, 10th ed., McGraw-HiII, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practieal Approaeh, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Caneer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Willi- ams & Wilkins, Phila., PA. A composição farmacêutica da invenção pode também conter outros agentes de imunosupressão ou de imunomodulação. Qualquer agente imunossupressor adequado pode ser empregado, incluin- do, mas não limitado a, agentes anti-inflamatórios, corticosteroides, ciclospo- rina, tacrolimus (isto é, FK-506), sirolimus, interferons, receptores de citoqui- na solúveis (por exemplo, sTNRF e slL-1R), agentes que neutralizam ativi- dade de citoquina (por exemplo, inflixmab, etanercept), micofenolato mofetil, 15-deoxispergualin, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofos- famida, metotrexato, e similares. A composição farmacêutica pode também ser empregada com outras modalidades terapêuticas, tais como fototerapia e radiação.
Indivíduos veterinários, experimentais, ou de pesquisa típicos incluem macacos, cães, gatos, ratos, camundongos, coelhos, porquinhos- da-índia, cavalos, e seres humanos.
VII. Produção de Anticorpo
Para produção recombinante dos anticorpos da presente inven- ção, os ácidos nucleicos que codificam as duas cadeias são solados e inse- ridos em um ou mais vetores replicáveis para clonagem adicional (amplifica- 30 ção do DNA), ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclo- nal é prontamente isolado e sequenciado usando-se procedimentos conven- cionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capa- zes de se ligarem especificamente às cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente inclu- em, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um ele- 5 mento intensificador, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição. Em uma concretização, ambas as cadeias leve e pesada do an- ticorpo anti-TSLP humanizado da presente invenção são expressas a partir do mesmo vetor, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor adenoviral.
Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por 10 qualquer método conhecido na técnica. Em uma concretização, os anticor- pos são expressos em células de mamífero ou de inseto na cultura, tais co- mo células de ovário de hamster chinês (CHO), células 293 de rim embriôni- co humano (HEK), células NOS de mieloma de camundongo, células de rim de hamster bebê (BHK), células de ovário de Spodoptera frugiperda (Sf9). 15 Em uma concretização, os anticorpos secretados de células CHO são recu- perados e purificados por métodos cromatográficos padrões, tais como pro- teína A, troca de cátion, troca de ânion, interação hidrofóbica, e cromatogra- fia de hidroxiapatita. Os anticorpos resultantes são concentrados e armaze- nados em 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5.
Em outra concretização, os anticorpos da presente invenção são
produzidos em levedura de acordo com os métodos descritos em W02005/040395. Brevemente, vetores que codificam as cadeias leve e pe- sada individuais de um anticorpo de interesse são introduzidos em células haploides de levedura diferentes, por exemplo, tipos de união diferentes da 25 levedura Pichia pastoris, cujas células haploides de levedura são opcional- mente auxotrofes complementares. As células de levedura haploides trans- formadas podem, em seguida, serem unidas ou fundidas para dar uma célu- la de levedura diploide capaz de produzir ambas as cadeias pesada e leve. A cepa diploide é então capaz de secretar o anticorpo totalmente montado e 30 biologicamente ativo. Os níveis de expressão relativos das duas cadeias po- dem ser otimizados, por exemplo, pelo uso de vetores com número de cópia diferente, usando-se promotores transcricionais de resistências diferentes, ou induzindo expressão de promotores indutiveis que acionam transcrição dos genes que codificam uma ou ambas as cadeias.
Em uma concretização, as respectivas cadeias pesada e leve do anticorpo anti-TSLP são introduzidas em células haploides de levedura para criar uma biblioteca de cepas de levedura haploides de um tipo de união que expressa uma pluralidade de cadeias leves, e uma biblioteca de cepas de levedura haploides de um tipo de união diferente que expressa uma plurali- dade de cadeias pesadas. Estas bibliotecas de cepas haploides podem ser unidas (ou fundidas como esferoplastos) para produzir uma série de células de levedura diploides que expressam uma biblioteca combinatorial de anti- corpos compreendida das várias permutações possíveis de cadeias leve e pesada. A biblioteca combinatorial de anticorpos pode, em seguida, ser clas- sificada para determinar se qualquer dos anticorpos têm propriedades que são superiores (por exemplo, afinidade mais alta para TSLP) àquelas dos anticorpos originais. Vide, por exemplo, W02005/040395.
Em outra concretização, os anticorpos da presente invenção são anticorpos de domínio humanos nos quais porções de um domínio variável de anticorpo são ligadas em um polipeptídeo de peso molecular de aproxi- madamente 13 kDa. Vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados 20 Unidos No. 2004/0110941. Tais agentes de peso molecular baixo, de domí- nio simples, proporcionam numerosas vantagens em termos de facilidade de síntese, estabilidade, e rota de administração.
VIII. Usos
A presente invenção proporciona métodos para uso de anti- TSLP projetado para o tratamento e diagnose de distúrbios inflamatórios.
Em uma concretização preferida, o distúrbio inflamatório é asma.
Em outra concretização preferida, o distúrbio inflamatório é um distúrbio inflamatório alérgico. Em uma concretização preferida, o distúrbio inflamatório alérgico é rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alér- gica, ou dermatite alérgica.
A presente invenção proporciona métodos para uso de anti- TSLP projetado para o tratamento e diagnose de fibrose, doença inflamatória do intestino, Iinfoma de Hodgkin, infecções virais respiratórias, ou outras in- fecções virais, artrite reumatoide, ou qualquer outro distúrbio caracterizado por inflamação no local de dano.
O escopo amplo desta invenção é melhor compreendido com referência aos seguintes exemplos, que não são pretendidos para limitar as invenções às concretizações específicas.
Todas as citações são aqui incorporadas por referência à mes- ma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por refe- rência.
Muitas modificações e variações desta invenção podem ser fei- tas sem fugir de seu espírito e escopo, conforme será aparente àqueles téc- nicos no assunto. As concretizações específicas aqui descritas são ofereci- das por meio de exemplo somente, e a invenção é para ser limitada pelos 15 termos das reivindicações em anexo, junto com o escopo total de equivalen- tes aos quais tais reivindicações são intituladas; e a invenção não é para ser limitada pelas concretizações específicas que foram apresentadas aqui por meio de exemplo.
Exemplo 1 Métodos Gerais
Métodos padrões em biologia molecular são descritos (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Mo- lecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 25 Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Métodos padrões também aparecem em Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Bioiogy, Vols.1-4, John Wiley e Sons, Inc. New York, NY, que descrevem clonagem em células bacteriais e mutagêne- se de DNA (Vol. 1), clonagem em células de mamífero e levedura (Vol. 2), 30 glicoconjugados e expressão de proteína (Vol. 3), e bioinformáticos (Vol. 4).
Métodos para purificação de proteína, incluindo imunoprecipita- ção, cromatografia, eletroforese, centrifugação, e cristalização são descritos (Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wi- Iey e Sons, Inc., New York). Análise química, modificação química, modifica- ção pós-translacional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de prote- ínas são descritos (vide, por exemplo, Coligan et al. (2000) Current Protocols 5 in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Produção, puri- 10 ficação, e fragmentação de anticorpos policlonais e monoclonais são descri- tos (Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). Técnicas padrões para caracterização de interações de Iigan- 15 te/receptor são disponíveis (vide, por exemplo, Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).
Métodos para citometria de fluxo, incluindo classificação de célu- la ativada por fluorescência (FACS), são disponíveis (vide, por exemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinicai Laboratory Practi- 20 ce, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Reagentes fluorescentes adequados para modificação de ácidos nucleicos, incluindo prímeres de ácido nucleico e sondas, polipeptídeos e anticorpos, para uso, por exemplo, como reagentes 25 de diagnóstico, são disponíveis (Molecular Probes (2003) Catalogue, Mole- cular Probes, Inc., Eugene, OU; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
Métodos padrões de histologia do sistema imune são descritos (vide, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopa- thology e Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Co- lor Atlas of Histology, Lippincott, Williams, e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology:Text e Atlas, McGraw-HiII, New York, NY). Pacotes de software e bases de dados para determinação, por exemplo, de fragmentos antigênicos, seqüências condutoras, dobramento de proteína, domínios funcionais, locais de glicosilação, e alinhamentos de se- qüência, são disponíveis (vide, por exemplo, GenBank, Vetor NTI® Suite (In- 5 formax, lnc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Ap- plications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von 10 Heijne (1986) Acid nucleics Res. 14:4683-4690).
Exemplo 2
Humanizacão de Anticorpos Anti-humano TSLP
Anticorpo de rato anti-humano TSLP 23B12 é produzido pelo hidridoma depositado em American Type Culture Collection (Manassas, VA) 15 ("ATCC") com a designação ds depósito de patente "PTA-795 r. A numani- zação de anticorpo de rato anti-humano TSLP 23B12 foi realizada conforme essencialmente como descrito nas publicações de pedido de patente PCT WO 2005/047324 e WO 2005/047326, que são incorporadas por referência.
Domínios variáveis leves e pesados do anticorpo monoclocal anti-TSLP (23B12) foram clonados e fundidos a uma cadeia leve kappa hu- mana (domínio CL) e cadeia pesada de IgGI humana (CH1-ligação-CH2- CH3), respectivamente.
A seqüência de aminoácido do domínio de VH não-humano foi comparada a um grupo de três seqüências de aminoácido de linha de germe 25 de VH humano; um representante de cada um dos subgrupos IGHV1, IGHV3 e IGHV4. Os subgrupos de VH estão listados em M.-P. Lefranc, "Nomencla- ture of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental e Cli- nicai Immunogenetics, 18:100-116, 2001. Rat 23B12 antibody scored highest against human heavy chain germline DP-14 in subgroup VH1.
Para o anticorpo de rato 23B12, a seqüência de VL foi da sub-
classe kappa de VL. A seqüência de aminoácido do domínio de VL não- humano foi comparada a um grupo de quatro seqüências de aminoácido de linha de germe kappa de VL humano. O grupo de quatro é compreendido de um representante de cada de quatro subgrupos de VL humano estabelecido listados em V. Barbie & M.-P. Lefranc, "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes e Joining (IGKJ) Segments", Experimental e Clinicai 5 Immunogenetics, 15:171-183, 1998 e M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental e Clinicai Immu- nogenetics, 18:161-174, 2001. Os quatro subgrupos também correspondem aos quatro subgrupos listados em Kabat et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U. S. Department of Health e Human Services, NIH 10 Pub. 91-3242, 5th Ed., 1991, pp. 103-130. O anticorpo de rato 23B12 se classificou mais alto contra linha de germe de cadeia leve Z-A27 no subgru- po VLkIII.
Uma vez que as seqüências de aminoácido alvos das cadeias leve e pesada variáveis foram determinadas, plasmídeos que codificam o 15 anticorpo humanizado de comprimento total foram gerados. Partindo-Se com um plasmídeo que codifica um anticorpo anti-IL-23 humanizado tendo estru- tura de linha de germe de VH1 DP-14 e um plasmídeo separado que codifica um anticorpo anti-IGFR humanizado tendo estrutura de linha de germe de VLkIII Z-A27, os plasmídeos foram alterados usando-se metagênese de 20 Kunkel (vide, por exemplo, Kunkel T A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 82:488-492) para mudar a seqüência de DNA para a seqüência 23B12 hu- manizada alvo. Simultaneamente, otimização de códon foi incorporada nas mudanças para proporcionar expressão potencialmente otimizada. As se- qüências de aminoácido de cadeia variável pesada e leve humanizadas são 25 colocadas em SEQ ID NOs: 10 e 12. As seqüências de aminoácido de ca- deia pesada e leve humanizadas de comprimento total são colocadas em SEQ ID NOs: 14 e 16. Uma variante da cadeia leve foi também criada, no qual a variante compreendia um K (preferivelmente do que um Y) na posição de aminoácido 49 de SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:16.
Exemplo 3
Determinação da Constante de Dissociação de Equilíbrio (Kn) para TSLP Anti-humano Humanizado Usando Tecnologia KinExA A constante de dissociação de equilíbrio (K0) foi determinada usando-se instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., www.sapidyne.com ). O KinExA usa o princípio do método de Ensaio de Ex- clusão Cinética baseado na medição da concentração de anticorpo não- 5 complexado em uma mistura de anticorpo, antígeno e complexo de anticor- po-antígeno. A concentração de anticorpo livre é medida por exposição da mistura a um antígeno imobilizado de fase sólida por um período muito breve de tempo. Na prática, isto é efetuado pelo escoamento da mistura de antíge- no-anticorpo em fase de solução que passa nas partículas revestidas de an- 10 tígeno presas em uma célula de fluxo. Os dados gerados pelo instrumento são analisados usando-se software de costume. As constantes de equilíbrio são calculadas usando-se uma teoria matemática baseada nas seguintes suposições:
1. A ligação segue a equação de ligação reversível para equilí-
brio:
kon [Ab] [Ag] = koff[AbAg]
2. Anticorpo e antígeno se ligam 1:1 e anticorpo total se iguala ao complexo antígeno-anticorpo, mais anticorpo livre.
3. O sinal do instrumento está linearmente relacionado a concen- tração de anticorpo livre.
Materiais
Anticorpos:
Rato anti hu TSLP mAb 23B12.H8.A4 (SPB Lote PAB330)
Rato anti hu TSLP mAb 23B12.H8.A4 (SPB Lote PAB330A)
Anti hu TSLP Humanizado mAb 23B12 (VL Y49)
Anti hu TSLP Humanizado mAb 23B12 (VL K49)
Anti hu TSLP mAb 23B12 Humanizado (VL Y49)
Antíqenos:
TSLP humano recombinante (SPB Lote P345)
TSLP humano recombinante (SPB Lote P367)
TSLP humano recombinante (R&D, Cat.N. 1398-TS/CF, Lote IDK 015031) Antígenos biotinilatados:
TSLP humano biotinilatado (SPB Lote p367AC)
TSLP humano biotinilatado (SPB Lote p367AA)
TSLP humano biotinilatado (SPB Lote 38ABMA)
Outros reagentes:
Partículas de PMMA1 98 mícrons (Sapidyne, Cat No. 440198) Neutravidin (Pierce, Cat No. 31000)
Cy5-conjugado Cabra antirrato IgG (H+L) (Jackson Immunore- search Laboratories Cat. No 112-175-167, Lote 60306)
Cy5-conjugado Cabra anti-HulgG (H+L) (Jackson Immunorese-
arch Laboratories Cat. No 109-175-088, lote 49069 e lote 58552)
Condições experimentais:
Partículas de PMMA foram revestidas com TSLP humano biotini- latado de acordo com Sapidyne "Protocolo para revestimento de partículas de PMMA com Iigantes biotinilatados tendo braços Iigadores curtos ou não- existentes". Todos os procedimentos experimentais foram feitos de acordo com o manual KinExA 3000. Todas as operações foram feitas em duplicata.
Para rato anti hu TSLP mAb 23B12.H8.A4 (SPB Lote PAB330), as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 2 mL
Taxa de fluxo de amostra: 0,25 mL/min Volume de etiqueta: 1 mL Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 mL/min Concentração de etiqueta: 0,1 nM Concentração de antígeno mais alta: 10 nM
Concentração de antígeno mais baixa: 10 pM Para rato anti hu TSLP mAb 23B12.H8.A4 (SPB Lote PAB330A), as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 4 mL Taxa de fluxo de amostra: 0,25 mL/min
Volume de etiqueta: 1 mL Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 mL/min Concentração de etiqueta: 0,05 nM Concentração de antígeno mais alta: 0,5 nM Concentração de antígeno mais baixa: 0,5 pM Para anti hu TSLP mAbs humanizado, as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 2 mL Taxa de fluxo de amostra: 0,25 mL/min Volume de etiqueta: 1 mL Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 mL/min Concentração de etiqueta: 0,02 nM
Concentração de antígeno mais alta: 0,2 nM Concentração de antígeno mais baixa: 0,2 pM As diluições em série duas vezes do antígeno foram preparadas e misturadas com o anticorpo a concentração constante. A mistura foi incu- bada por 2 horas a 25°C para equilibrar.
A Tabela 4 mostra os resultados da análise de KinExA.
Tabela 4
Valores Kn Determinados por KinExa
mAb TSLP Expressão K0(PM) rato 23B12.H8.H4 humano HEK293 0,22 Rato 23B12.H8.H4 humano E. coli 0,47 hu23B12 (VL Y49) humano HEK293 2,1 hu23B12 (VL K49) humano HEK293 1,0 hu23B12 (VL Y49) humano E. coli 1,7 Exemplo 4
Determinação do ECfin para Anti-Humano TSLP Humanizado Usando ELISA O ELISA mede o EC50 de rato 23B12 purificado de sobrenadan- te de hidridoma ou ligação de 23B12 IgGI recombinante humanizado para qualquer TSLP humano derivado de adenovírus (S-P Biopharma) ou TSLP humano derivado de E. coli (S-P Biopharma ou R&D 1398-TS).
Materiais:
Nunc Maxisorb de Imunoplaca de 96 cavidades cert. (Nunc #
439454) Salina tamponada de fosfato OX (PBS), pH 7,4 (Fisher # BP399-
20)
Salina Tris Tamponada 20X (TBS), pH 7,4 (Technova # 1680) Tween-20, grau de enzima (Fisher# BP337-500)
500 mM de EDTA (Technova # E0306)
Albumina1 grau RIA de soro bovino (Sigma # A7888)
Tampão de Revestimento: 1 pg/mL TSLP em PBS em 100 pL/cavidade Reaqente de detecção:
HRP-F(ab)’2 cabra anti-humano IgG H+L (Jackson # 109-036-
088);
HRP-F(ab)'2 cabra antirrato IgG H+L (Jackson # 112-032-072) Substrato & Soluções de Parada:
TMB Microwell Peroxidase Substrate System 2C (Kirkegaard & Perry Labs # 50-
76-00) 1:1; 1M H3PO4 0,1 mL/cavidade ABTS (Kirkegaard & Perry Labs # 50-66-06) 100 pL/cavidade Solução de parada de ABTS Peroxidase (Kirkegaard & Perry Labs # 50-085-02) diluidor de concentrado 5X 1:5 em Mllli-Q water, 100 pL/cavidade
Diluente ELlSA e Tampão de Ensaio:
50 mM de TBS ou PBS; 0,5% de BSA; 0,05% de Tween-20; 4 mM de EDTA
Tampão de Lavagem ELISA:
50 mM de TBS ou PBS; 0,05% de Tween-20;4 mM de EDTA
Equipamento:
Skatron Scanwasher300™
Dispositivos Moleculares VersaMax™ leitora de microplaca
Protocolo
Revestimento de placas foi realizado conforme segue: TSLP
(100 ou 200 ng por cavidade) em PBS foi incubado a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas com 1 ciclo (4 lavagens/ciclo) em um lavador de placa Skatron, bloqueadas por adição de 0,2 mL/cavidade de tampão de ensaio ELISA, incubadas por 60 minutos a 25°C em um oscilador orbital, e, em se- guida, lavadas por 1 ciclo. O anticorpo foi, em seguida, titulado através de uma série de oito cavidades na faixa de 1000 ng/mL a 0,4572 ng/mL usan- 5 do-se diluições 3 vezes em série, e incubado por 90 minutos a 25°C em um oscilador orbital. As placas foram lavadas por 1 ciclo, HRP-cabra F(ab')2 anti- humano ou antirrato IgG (H+L) (diluição 1:5.000) foi adicionado a 0,1 mL/cavidade e incubado por 60 minutos a 25°C em um oscilador orbital. As placas foram lavadas por 2 ciclos com rotação de placa entre ciclos. Subs- 10 trato de TMB ou ABTS foi adicionado a 0,1 mL/cavidade e incubado por 5 minutos em oscilador orbital. Solução de parada foi então adicionada a 0,1 mL/cavidade e as placas lidas a A 450-570 nm (TMB) ou A405 nm (ABTS).
A Tabela 5 mostra os resultados da análise de ELISA.
Tabela 5
Valores de ECsn Determinados Por ELISA
mAb Espécie de TS- Expressão1 de ECso(nM) LP TSLP rato 23B12.H8.H4 humana HEK293-B 0,79 rato 23B12.H8.H4 humana HEK293 0,37 rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293-F 0,26 0,47±0,28(n=3) rato 23B12.H8.H4 humana E. coli- B 0,40 rato 23B12.H8.H4 humana E. coli- B 0,39 0,44±0,20(n=5) hu23B12(VL Y49) humana HEK293-B 0,22 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,029 hu23B12(VL Y49) humana HEK293-F 0,018 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,17 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,21 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,11 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,13 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,15 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,24 mAb Espécie de TS- Expressão1 de EC50(nM) LP TSLP hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,18 hu23B12(VL Y49) humana HEK293 0,11 hu23B12(VL Y49) humana HEK2932 0,073 0,14±0,07(n=12) hu23B12(VL Y49) humana E. coli- B 0,064 hu23B12(VL Y49) humana E. coli- B 0,085 hu23B12(VL Y49) humana E. coli 0,11 hu23B12(VL Y49) humana E. coli 0,11 hu23B12(VL Y49) humana E. coli 0,060 hu23B12(VL Y49) humana E. colF 0,061 hu23B12(VL Y49) humana E. colf 0,029 0,07±0,03(n=7) 0,11±0,07(n=19) hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,45 hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,52 hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,29 hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,15 hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,19 hu23B12(VL Y49) cino HEK293 0,27 0,31±0,15(n=6) hu23B12(VL K49) humana HEK293-B 0,12 hu23B12(VL K49) humana E. coli- B 0,038 hu23B12(VL K49) humana E. coli- B 0,050 hu23B12(VL K49) humana HEK293 0,034 hu23B12(VL K49) humana HEK293-F 0,021 0,05±0,04(n=5) 1) -B = TSLP biotinilatado
-F = remoção de TSLP de local de clivagem de furina via via K101A/R102A
2) revestimento direto de 200 ng de TSLP ao invés de 100 ng Exemplo 5
Afinidade De Anticorpos de Rato 23B12 E Humanizado 23B12 para E Cino TSLP Humano
As atividades de ligação de cinética do rato parental e seu anti- corpo anti-humano TSLP 23B12 derivado humanizado contra ambos TSLP humano (hu) e macaco cynomolgus (cino) foram medidas por ressonância de plasmon de superfície usando-se um sistema BIAcore T100 (BIAcore AB, Upsalla, Sweden). Aproximadamente IOORUs de TSLP humano ou TSLP de 5 cino foram imobilizados via química de acoplamento de amina em um Sen- sor Chip CM5 (Research grade, BR-1006-68). Tampão de HBS-EP (BR- 1006-69) foi usado como o tampão de operação com uma taxa de fluxo de 30pL/min. Anticorpos de rato e 23B12 humanizado em concentrações de variação variando de 0,82 a 600 nM foram injetados sobre as superfícies de 10 TSLP hu ou cino imobilizadas a uma taxa de fluxo de 30pL/min. Seguindo cada ciclo de injeção, a superfície de chip CM5 foi regenerada usando-se uma série de soluções (10 mM de Glicina, pH 1,5 e 25 mM de NaOH, repec- tivamente) a uma taxa de fluxo de 75pL/min.
Sensogramas de ligação de subtração de práticas foram usados 15 para analisar a taxa constante de associação (ka) e dissociação (kd), e a constante de dissociação de equilíbrio Kd- Os conjuntos de dados resultan- tes foram ajustados com um modelo de analito bivalente usando-se o soft- ware BIAevaIuation (versão 1.0). A K0 determinada para o anticorpo 23B12 de rato parental contra TSLP humano foi 64 pM, enquanto o respectivo valor 20 contra o Iigante de TSLP de cino foi 86 pM (Tabela 6). A Kd determinada pa- ra o anticorpo 23B12 humanizado contra TSLP humano foi 111 pM, enquan- to o respectivo valor contra o Iigante de TSLP de cino foi 132 pM (Tabela 6), indicando uma perda de menos do que duas vezes de afinidade sob huma- nização de 23B12 mAb.
Tabela 6
Análise de BIAcore
Anticorpo Ligante Ka(1/Ms) Kd(1/s) K0(PM) rato 23B12 huTSLP 3.18E+05 2.1E-05 64 cynoTSLP 1.86E+05 1.6E-05 86 Hu 23B12 huTSLP 5.00E+05 5.6E-05 111 cynoTSLP 3.57E05 4.7E-05 132 Exemplo 6
Bioensaio de Proliferação Para A Avaliação de Neutralização de Anticorpo Anti-TSLP
A capacidade de um anticorpo monoclonal neutralizar biologica- mente TSLP foi avaliada pela aplicação de bioensaios de proliferação de curto prazo que utilizam células que expressam receptores de TSLP recom- 5 binantes. As células transfectantes de Ba/F3-TSLPR-IL7Ra proliferam em resposta a TSLP, e a resposta pode ser inibida por uma neutralização de anticorpo anti-TSLP. Cada anticorpo foi titulado contra uma concentração de TSLP escolhida dentro da região linear da curva de resposta de dose de TS- LP, perto do platô e acima da EC50 do TSLP. A proliferação, ou falta desta, é 10 medida por meios colorimétricos usando Alamar Blue, um corante indicador de crescimento baseado na detecção de atividade metabólica. A capacidade de um anticorpo neutralizar TSLP é avaliada por seu valor de EC50, ou con- centração de um anticorpo que induz inibição meio máxima de proliferação de TSLP.
Os transfectantes Ba/F3 são mantidos em meio RPMI-1640,
10% de soro bovino fetal, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L- Glutamina, 50 ug/mL de penicilina-estreptomicina, e 10 ng/mL de camun- dongo IL-3.
Os bioensaios de proliferação de Ba/F3 são trealizados em meio RPMI-1640, 10% de soro bovino fetal, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, e 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina.
O ensaio é realizado em placas de fundo plano de 96 cavidades (Falcon 3072 ou similar). Todas as preparações de reagentes e suspensões de célula utilizam o meio de bioensaio apropriado. O volume de ensaio é 150 25 pL por cavidade. Titulações de um anticorpo anti-TSLP são pré-incubadas com TSLP por 30-60 minutos à temperatura ambiente, durante cujo tempo as células são preparadas. As células são adicionadas às placas, seguindo a pré-incubação de anticorpo-citoquina. As placas de bioensaio são incubadas em uma câmara de cultura de tecido humidificada (37°C, 5% de CO2) por 30 40-48 horas. No final do tempo de cultura, Alamar Blue (Biosource Cat #DAL1100) é adicionado e permitido se desenvolver por 8-12 horas. A ab- sorvância é então lida a 570 nm e 600 nm (VERSAmax Microplate Reader, Molecular Probes), e um OD570-600 é obtido. Duplicatas ou triplicatas são re- comendadas.
As células são usadas em um estado de crescimento saudável, geralmente em densidades de 3-8 x 105/ml_. As células são contadas, peleti- zadas, lavadas duas vezes em meio de bioensaio, e suspensas à densidade apropriada para galvanização.
TSLP foi preparado para concentração de operação e adiciona- do à primeira cavidade a 75 pL. Diluições em série de 1:3 foram feitas por titulação 25:50 pL em meio de bioensaio através das cavidades, deixando 50 pL/cavidade. As células foram suspensas à densidade apropriada para gal- vanização a 100 pL por cavidade.
O anticorpo foi preparado à concentração de operação e adicio- nado à primeira cavidade a 75 pL. Diluições em série de 1:3 foram feitas por titulação 25:50 pL em meio de bioensaio através das cavidades, deixando 50 15 pL por cavidade. TSLP na concentração apropriada foi adicionado a 50 pL por cavidade às cavidades contendo o anticorpo titulado. As células foram suspensas à densidade apropriada para galvanização a 50 pL por cavidade, e adicionadas seguindo pré-incubação de anticorpo-citoquina.
Usando-se software GraphPad Prism 3.0, a absorvância foi plo- tada contra concentração de citoquina ou anticorpo, e os valores de EC50 foram determinados usando-se repressão não-linear (ajuste de curva) de resposta de dose sigmoidal.
Os resultados do ensaio são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7 Inibição de Proliferação
mAb Espécie de Expressão1 de EC50(nM) TSLP TSLP rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293 0,093 rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293 0,085 rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293 0,23 rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293 0,40 rato 23B12.H8.H4 Humana HEK293 0,10 0,11±0,07(n=5) mAb Espécie de Expressão1 de ECso(nM) TSLP TSLP rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 2,16 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 2,78 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 4,15 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 3,81 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 1,83 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 3,46 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 2,77 rato 23B12.H8.H4 Humana E. coli 3,10 3,01±0,79(n=8) rato 23B12.H8.H4 cino HEK293 0,45 rato 23B12.H8.H4 cino HEK293 0,42 rato 23B12.H8.H4 Cino HEK293 0,61 Rato 23B12.H8.H4 cino HEK293 0,77 0,56±0,16(n=4) Exemplo 7
Atividade de Neutralização De Anti-TSLP mAb r23B12 Em Produção de TARC Induzida por TSLP Por Células Dendríticas Primárias Humanas
Células mononucleares de sangue periféricas (PBMCs) foram isoladas de revestimentos nús obtidos de doadores de sangue saudáveis (Stanford Medicai School Blood Center1 Stanford, CA) por centrifugação de Ficoll e Células Dendríticas CD11c+ foram obtidas por MACS (Miltenyi Bio- tech, Auburn, CA) usando-se seleção negativa, seguido por classificação de célula usando-se um FACS. Células de linhagem negativa (Lin ) foram obti- das por depleção de MACS de células T, células B1 células NK, células de sangue vermelhas e monócitos formam PBMC usando-se gotas magnéticas revestidas de camundongo anti-humano CD3 mAb (0KT3, DNAX) e camun- dongo anti-CD16 mAb e cabra anti-camundongo IgG (Miltenyi Biotech), e usando-se gotas magnéticas diretamente revestidas com anti-CD19, CD56 eCD14 mAbs (Miltenyi Biotech). Subsequentemente, células Lin' foram manchadas com TC-anti-CD4 (Caltag, Burlingame, CA), PE-anti-CD11c e FITC-anti-CD3, -CD14, -CD19, -CD56, -CD16, e -CD20 (todos de BD Biosci- ences, San Diego, CA) e CD11c+ DC classificadas em um Vantage FACsor- ter™ (BD Biosciences) a uma pureza > 99% de células CD11c+ CD4+ Lin'.
CD11c+ CD4+ DCs foram cultivadas imediatamente após classi- ficação em RPMI (Mediatech, Herndon, VA) contendo 10% de FCS e 1% de piruvato (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) e penicilina- 5 estreptomicina (Mediatech). As células foram semeadas a 0,5 x 106/ml em placas de fundo plano de 96 cavidades na presença de meio sozinho, TSLP (15 ng/ml, DNAX), ou em uma combinação de TSLP e o anticorpo monoclo- nal de neutralização anti-TSLP mAb (clone 23B12) ou um anticorpo mono- clonal anti-TSLPR ou um rato de controle de isotipo lgG2a (R&D Systems, 10 Minneapolis, MN). Os sobrenadantes de cultura DC foram coletados após 24 horas de cultura, armazenados congelados a -20 0C e analisados para níveis de proteína de TARC por ELISA (R&D Systems).
Os resultados são providos na Tabela 8.
Tabela 8
TARC (pg/ml) DC 5 TSLP-DC 1400,5 TSLP + 5 pg/ml de anticorpo r23B12 41,5 TSLP + 0,5 pg/ml de anticorpo r23B12 146 TSLP + 0,05 pg/ml de anticorpo r23B12 570,5 TSLP + 20 pg/ml de anticorpo r23B12 199 CD11c+ DC cultivados em meio sozinho não produzem níveis
significantes de TARC. A adição de TSLP (15 ng/ml) a CD11c+ DC induziu níveis significantes de produção de TARC até ~ 1500 pg/ml. Esta indução mediada por TSLP de TARC foi bloqueada em uma maneira dependente da dose pela adição simultânea de anti-TSLP mAb 23B12.
Exemplo 8
Atividade de Neutralização De Anti-TSLP mAb r23B12 Em Diferenciação Th2 Induzida por TSLP Por Células Dendríticas Primárias Humanas
Células mononucleares de sangue periféricas (PBMCs) foram isoladas de revestimentos nús obtidos de doadores de sangue saudáveis (Stanford Medicai School Blood Center, Stanford, CA) por centrifugação de Ficoll e Células Dendríticas CD11c+ foram obtidas por MACS (Miltenyi Bio- tech, Aubum, CA) usando-se seleção negativa, seguido por classificação de célula usando-se um FACS. Células de linhagem negativa (Lin') foram obti- das por depleção de MACS de células T1 células B, células NK1 células de sangue vermelhas e monócitos formam PBMC usando-se gotas magnéticas 5 revestidas de camundongo anti-humano CD3 mAb (OKT3, DNAX) e camun- dongo anti-CD16 mAb e cabra anti-camundongo IgG (Miltenyi Biotech), e usando-se gotas magnéticas diretamente revestidas com anti-CD19, CD56 eCD14 mAbs (Miltenyi Biotech). Subsequentemente, células Lin" foram manchadas com TC-anti-CD4 (Caltag, Burlingame, CA), PE-anti-CD11c e 10 FITC-anti-CD3, -CD14, -CD19, -CD56, -CD16, e -CD20 (todos de BD Biosci- ences, San Diego1 CA) e CD11c+ DC classificadas em um Vantage FACsor- ter™ (BD Biosciences) a yma pureza > 99% de células CD11c+ CD4+ Lin'.
CD11 c+ CD4+ DCs foram cultivadas imediatamente após classi- ficação em RPMI (Mediatech, Herndon, VA) contendo 10% de FCS e 1% de 15 piruvato (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) e penicilina- estreptomicina (Mediatech). As células foram semeadas a 0,5 x 106/ml em placas de fundo plano de 96 cavidades na presença de meio sozinho, TSLP (15 ng/ml, DNAX), ou em uma combinação de TSLP e o anticorpo monoclo- nal de neutralização anti-TSLP mAb (clone 23B12) ou um anticorpo mono- 20 clonal anti-TSLPR ou um rato de controle de isotipo lgG2a (R&D Systems, Minneapolis, MN). CD11c+ DCs foram coletados após 24 horas de cultura, sob condições diferentes, lavados duas vezes e recultivados com células T de CD4+ CD45RA+ alogenéicos simples.
As células T CD4+ CD45RA+ simples foram isoladas pela classi- ficação de célula após depleção negativa de células CD8, CD16, CD20, CD19, CD56 e CD14 usando-se gotas magnéticas (Myltenyi Biotech). Após
24 horas de cultura sob condições diferentes, CD11c+ DCs foram coletados, lavados duas vezes, e co-cultivados com 5 x 104 de células T CD4+ aloge- néicas simples em placas de fundo redondo de 96 cavidades a uma propor- 30 ção de 1:5 DC:células T. Após 6 dias de cultura, os sobrenadantes foram coletados e congelados a -20 0C e números de células viáveis determinados por exclusão de "trypan blue". Para testar sua capacidade de secretar cito- quinas, células T DC-primadas CD4+ (106/ml) foram re-estimuladas com anti- CD3 biotimilatado (10 ng/ml) mAbs reticulado a placas de cultura revestidas de estreptavidin na presença de anti-CD28 mAbs solúvel (1000ng/ml). Os sobrenadantes de cultura foram coletados após 24 horas de cultura, conge- 5 lados a -20°C, ou analisados por ensaio Luminex para IFNy-, TNFa-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Linco Research Inc., St Charles, MO).
Os resultados são providos na Tabela 9.
Tabela 9
Produção DC+ TSLP-DC+ TSLP-DC+ TSLP-DC+ TSLP-DC+ de Cito- CD4 CD4 5 pg/ml de 0,5 pg/ml de 0,05 pg/ml quina r23B12 r23B12 de r23B12 +CD4 +CD4 +CD4 IL-5 (pg/ml) 115 777 24 70,6 32 IL-4 (pg/ml) 14 89 14,5 21,3 27,3 IL-13 136 1290 55,5 182 43,3 (pg/ml) A co-cultura de células de CD4+ CD45RA+ T com CD11c+ DC
que foram cultivadas em meio sozinho resultou em uma população de célula T, que sob reativação por anti-CD3 + anti-CD28 mAbs, produz níveis baixos de citoquinas Th2. A adição de TSLP (15 ng/ml) à cultura primária de CD11c+ DC induziu a produção de níveis significantes de IL-4, IL-5 e IL-13 pelas células T respondentes, sugerindo que TSLP-DC induziu a diferencia- 15 ção de células T simples em células Th2. Esta indução mediada por TSLP de diferenciação de Th2 foi bloqueada em uma maneira dependente de dose por adição simultânea de anti-TSLP mAb 23B12 para as culturas de DC pri- márias.
Exemplo 9
Cino-izacão de Anticorpos de TSLP Anti-humano.
Dois estudos mostraram que macacos cynomolgus (Macaca fas- cicularis) VL são similares a VLk-I humano e que cynomolgus VH são simila- res a VH-III humano (41%), VH-IV (39%), e VH-I (14%). (Lewis et al., Dev. Comp. Immunol. 17:549-560 (1993); e Druar et al., Immunogentics 57:730- 738 (2005.) De modo a minimizar imunogenicidade potencial de hu23B12 em macacos cymomolgus, os 23B12 CDRs de rato foram transferidos em estruturas humanas VLk-I e VH-III; estes foram então fundidos em domínios constantes de IgG de cynomolgus.
A seqüência de aminoácido da cadeia leve cino-izada é 5 MAPVQLLGLLVLFLPAMRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPISISV HWYQQKPGKAPKLLIYFASQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQTFSLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSEDQVKSGTVSWCLLN NFYPREASVKWKVDGVLKTGNSQESVTEQDSKDNTYSLSSTLTLSSTDYQ SHNVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 17). A seqüência de 10 sinal está sublinhada.
A seqüência de aminoácido da cadeia pesada cino-izada é MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGYIFTDY AMHWVRQAPGKGLEWVATFIPLLDTSDYNQNFKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARMGVTHSYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL 15 APSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYVCNVNHKPSNTKVDKRVEIKTCGGGSKPPTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPDVKFNWY VNGAEVHHAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKAL PAPIQKTISKDKGQPREPQVYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIWE 20 WESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:18). A seqüência de sinal está sub- linhada.
Os anticorpos cino-izados anti-humanos TSLP 23B12 foram en- tão recombinantemente produzidos em células de CHO.
Exemplo 10
Bioensaio de Proliferação para a Avaliação da Atividade de Neutralização de Anticorpos Cino-izados Anti-humanos TSLP
A capacidade de anticorpos cino-izados anti-humano TSLP 23B12 de neutralizar biologicamente TLSP humano ou cino foi avaliada pela aplicação de bioensaios de proliferação de curto prazo que utilizam células que expressam receptores de TSLP recombinantes. As células de Ba/F3- huTSLPR/hulL-7Ra e Ba/F3-cyTSLPR/cylL-7Ra transfectantes proliferam em resposta a TSLP humano e TSLP cino, e a resposta pode ser inibida por um anticorpo anti-TSLP de neutralização. Um anticorpo é titulado contra uma concentração de TSLP humano ou de cino escolhida dentro de uma região linear da curva de resposta de dose, perto do platô e acima de EC50. A proli- 5 feração, ou falta de, é medida por meios colorimétricos usando Alamar Blue, um corante indicador de crescimento baseado na detecção de atividade me- tabólica. A capacidade de um anticorpo neutralizar TSLP é avaliada por seu valor de EC50, ou concentração de anticorpo que induz inibição meio máxi- ma de proliferação de TSLP.
A capacidade de um anticorpo neutralizar TSLP é avaliada por
seu valor de EC50, ou concentração de um anticorpo que induz inibição meio máxima de proliferação de TSLP.
Os transfectantes Ba/F3 são mantidos em meio RPMI-1640, 10% de soro bovino fetal, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L- Glutamina, 50 pug/mL de penicilina-estreptomicina, e 10 ng/mL de camun- dongo IL-3, 1 mg/ml de G418, e 2 ug/ml de puromicin.
Os bioensaios de proliferação de Ba/F3 são realizados em meio RPMI-1640, 10% de soro bovino fetal, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, e 50 pg/mL de penicilina-estreptomicina.
Os ensaios foram realizados em placas de fundo plano de 96
cavidades (Falcon 3072 ou similar). Todas as preparações de reagentes e suspensões de célula utilizam o meio de bioensaio apropriado. O volume de ensaio é 150 pL por cavidade. Titulações de um anticorpo anti-TSLP são pré-incubadas com huTSLP por aproximadamente 30 minutos à temperatura 25 ambiente, durante cujo tempo as células foram preparadas. As células foram adicionadas às placas, seguindo a pré-incubação de anticorpo-citoquina. As placas de bioensaio foram incubadas em uma câmara de cultura de tecido humidificada (37°C, 5% de CO2) por 40-48 horas. No final do tempo de cultu- ra, Alamar Blue (Biosource Cat #DAL1100) é adicionado a 16,5 uL/cavidade 30 e permitido se desenvolver por 5-12 horas. A absorvância é então lida a 570 nm e 600 nm (VERSAmax Microplate Reader, Molecular Probes), e um OD57o-6oo foi obtido. Duplicatas foram operadas para cada amostra. As células são usadas em um estado de crescimento saudável, geralmente em densidades de 7-9 x 105/ml_. As células são lavadas duas vezes, contadas e suspensas para a densidade apropriada para galvaniza- ção a 7500 células/50 ul por cavidade.
TSLP humano ou de cino foi preparado para concentração de
operação (600 ng/mL) e adicionado à primeira cavidade a 75 pL. Diluições em série de 1:3 foram feitas por titulação 25:50 uL em meio de bioensaio através das cavidades, deixando 50 pL/cavidade. As células foram suspen- sas à densidade apropriada para galvanização a 7500 células/50 uL por ca- 10 vidade. Para substituir a adição de anticorpo, 50 ul de meio de bioensaio foi adicionado a estas cavidades para trazer o volume final para 150 ul.
O anticorpo foi preparado à concentração de operação (3X a concentração final; a concentração de partida final de cada anticorpo variou) e adicionado à primeira cavidade a 75 μί. Diluições em série de 1:3 foram 15 feitas por titulação 25:50 μ(_ em meio de bioensaio através das cavidades, deixando 50 μί por cavidade. TSLP (em concentração de operação de 9 ng/ml para HuTSLP, 3 ng/ml para CyTSLP) foi adicionado a 50 pL por cavi- dade às cavidades contendo o anticorpo titulado. As células foram então suspensas à densidade apropriada para galvanização a 7500 células/50 pL 20 por cavidade, e adicionadas seguindo pré-incubação de anticorpo-citoquina.
Os valores de EC50 são determinados por regressão não-linear (ajuste de curva) de resposta de dose de sigmoidal usando software Graph- Pad Prism 4. Para a resposta de dose de TSLP, a absorvância é plotada contra concentração de citoquina. Para atividade de neutralização, a percen- tagem de inibição é plotada contra concentração de anticorpo.
Os resultados do ensaio são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10
Ensaio baseado em Célula de Ba/F3 de Células Transfectadas de TSLPR Humano ou de Cynomolgus
TSLP TSLPR Rato23B12 Hu23B12 Hu-cy* Cy-hu* Cy23B12 Hu hu 0,6 7,6 5,3 3,9 9,4 Hu hu 1,2 9,0 TSLP TSLPR Rato23B12 Hu23B12 Hu-cy* Cy-hu* Cy23B12 Hu hu 0,1 1,2 Hu cino 0,02 0,03 Hu cino 0,08 0,05 Cino cino 0,2 0,5 0,5 2,8 4,7 Cino cino 0,4 2,2 3,2 16 26,19 Cino cino 0,7 3,0 22,17 * hu-cy = 23B12 VL/VH humanizado em domínios constantes de cynomolgus ** cy-hu = 23B12 VL/VH cino-izado em domínios constantes humanos Exemplo 11
Medições de Afinidade de BIAcore e KinExA para Anticorpos Cino-izados Anti-TSLP
A afinidade de anticorpos cino-izados anti-humano TSLP 23B12 para Iigante de TSLP humano e cino foi determinada por ressonância de plasmon de superfície usando-se o sistema BIAcore T100, conforme descrito no Exemplo 5.
A constante de disassociação de equilíbrio para os anticorpos
anti-TSLP foi determinada usando-se o instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.) conforme descrito no Exemplo 3.
Os seguintes materiais foram usados:
Anticorpos:
Rato anti hTSLP GNE01.23B12.H8.A4 (SPB Lote pab 330A)
Anti hTSLP mAb 23B12 humanizado (621HC/780LC)
Anti hTSLP mAb 23B12 cynoizado (782+MAFA19/781MAFA7) Anti hTSLP mAb 23B12 cynoizado (782+hlgG1/781hukappa)
Anti hTSLP mAb 23B12 cynoizado (huV-CynoC chimera)
Antígenos:
TSLP humano recombinante, R&D Systems (Cat.No. 1398- TS/CF, Lote. IDK 015031)
TSLP humano recombinante, R&D Systems (Cat.No. 1398-TS, Lote. IDK 026031)
TSLP humano biotinilatado (SPB Lote 38ABMA)
Outros reaqentes: Partículas de PMMA, 98 mícrons (Sapidyne, Cat No. 440198) Neutravidin (Pierce, Cat No. 31000)
Cy5 conjugado Cabra antirrato IgG (H+L) (Jackson Immunore- search Laboratories Cat. No 112-175-167, Lote 60306)
Cy5 conjugado Cabra anti-hulgG (H+L) (Jackson Immunoresear- ch Laboratories Cat. No 109-175-088, lote 58552)
Para r23B12, as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 2 ml
Taxa de fluxo de amostra: 0,25 ml/min
Volume de etiqueta: 1 ml
Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 ml/min
conc. de mAb: 0,05 nM
Concentração mais alta de Ag (TSLP): 0,5 nM Concentração mais baixa de Ag (TSLP): 0,5 pM Para hu23B12, as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 2 ml
Taxa de fluxo de amostra: 0,25 ml/min
Volume de etiqueta: 1 ml
Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 ml/min
conc. de mAb: 0,02 nM
Concentração mais alta de Ag (TSLP): 0,4 nM Concentração mais baixa de Ag (TSLP): 0,4 pM Para cy23B12, as seguintes condições foram usadas:
Volume de amostra: 2 ml
Taxa de fluxo de amostra: 0,25 ml/min
Volume de etiqueta: 1 ml
Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 ml/min
conc. de mAb: 0,1 nM
Concentração mais alta de Ag (TSLP): 1 nM Concentração mais baixa de Ag (TSLP): 1 pM Para hu-cy23B12* e cy-hu23B12**, as seguintes condições fo- ram usadas: Volume de amostra: 2 ml Taxa de fluxo de amostra: 0,25 ml/min Volume de etiqueta: 1 ml Taxa de fluxo de etiqueta: 0,25 ml/min conc. de mAb: 0,05 nM
Concentração mais alta de Ag (TSLP): 1 nM Concentração mais baixa de Ag (TSLP): 1 pM Para todos os experimentos, duas diluições em série duas vezes do antígeno foram preparadas e misturadas com o anticorpo a concentração constante. A mistura foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente para equilibrar. Os resultados dos experimentos de BIAcore e KinExA descritos acima são resumidos na Tabela 11.
Tabela 11
Medições de Afinidade de Ligação de Biacore e Kinexa KD(Piyi)
TSLP R23B12 Hu23B12 hu-cy* Cy.hu** Cy23B12 KinExA Hu 0,47 1,7 1,4 63 52 BIAacore Hu 64 111 106 556 620 Hu 126.114 1548.2066 Cy 86.112 132 114 1203 1159.2508 * hu-cy = 23B12 VL/VH humanizado em domínios constantes de cynomolgus
** cy-hu = 23B12 VL/VH cynoizado em domínios constantes humanos
Em resumo, o anticorpo anti-humano TSLP 23B12 humanizado mostrou aproximadamente ligação reduzida 5 vezes comparada ao anticorpo 20 de rato parental baseado em medições de BIAcore e KinExA (Tabela 11). A substituição de estruturas humanizadas 23B12 (VLk-III/VH-I) com aquelas menos potencialmente imunogênicos em macacos cynomolgus (VLk-I/VH-III) efetuou uma redução de 10 vezes na ligação comparada a rato parental 23B12, e uma redução 5 vezes comparada a hu23B12 (Tabelas 10, 11).
Exemplo 12
Estudos farmacocinéticos de Anticorpos Cino-izado anti-TSLP 23B12 Um ensaio ELISA foi designado para medir a quantidade de an- ticorpo cino-izado anti-TSLP que alcança o plasma, soro ou fluido de lava- gem broncoalveolar (BAL) de um animal inoculado com tal anticorpo. Reaqentes e Tampões:
Suporte Sólido: placa de 96 cavidades Nunc Maxisorp (cat#
439454)
Tampão de Revestimento: 50mM de Carbonato de sódio/ bicar- bonato pH 9,6
Tampão de Bloqueio: 0,5% de BSA em PBS Tampão de Diluente de Ensaio: 0,5% de BSA [peso/v], 0,05% de
Tween 20 [v/v], 0,25% de CHAPS [peso/v], 5 mM de EDTA, 0,35M de NaCI em PBS (AD), pH 7,4
Tampão de Lavagem: 0,05% de Tween 20 em PBS Molécula de captura: huTSLP, 38ABM, 2497 pg/mL Moléculas de detecção:
• QED R799, 3600 ug/mL (um anticorpo anti-cy23B12 de coelho monoclonal)
• anticoelho-HRP, JIR gato# 711-036-152 Substrato: TMB (Kirkegaard & Perry, gato# 50-76-03)
Solução de parada: H3P04 a 1M
Lavador de Placa: SkanWasher 300 Modelo 12010 (Molecular Devices Cat. No. 0200-3903)
Solução de parada: SpectraMax Plus 384 Microtiterplate Spec- trophotometer (Molecular Devices Part No. 0112-0056 Protocolo:
O revestimento de placas foi realizado conforme segue: huTSLP (100 ng por cavidade) no tampão de revestimento foi incubado a 40°C du- rante a noite. As placas foram lavadas com 1 ciclo (3 lavagens/ciclo) em um lavador de placa Skatron, bloqueadas pela adição de 150 pL/cavidade de 30 tampão de bloqueio, incubadas por 60 minutos à temperatura ambiente em um oscilador orbital e, em seguida, lavadas por 1 ciclo. O anticorpo cino- izado anti-TSLP 23B12 padrão foi titulado através de uma série de oito cavi- dades (réplicas) na faixa de 200 ng/mL a 1,56 ng/mL usando diluições 2 ve- zes em série. As amostras são diluídas em série em relação a seus níveis esperados. 100 pL de controles padrões e amostras foram adicionados à placa revestida e incubados por 120 minutos à temperatura ambiente em um 5 oscilador orbital. As placas foram lavadas por 2 ciclos e o anticorpo anti- cy23B12 de coelho policlonal foi adicionado a 100 pL/cavidade e incubadas por 60 minutos à temperatura ambiente em um oscilador orbital. As placas foram lavadas por 2 ciclos, HRP-burro anti-coelho IgG (H+L) (diluição 1:10.000) foi adicionado a 100 pL/cavidade, e incubadas por 60 minutos à 10 temperatura ambiente em um oscilador orbital. As placas foram lavadas por 2 ciclos com rotação de placa entre ciclos. O substrato de TMB foi adiciona- do a 100 pL/cavidade e incubado aproximadamente 5 minutos em um osci- lador orbital. A solução de parada foi em seguida adicionada a 100 pL/cavidade e as placas lidas a A450-650 nm (TMB).
Este ensaio pode detectar menos do que 156 ng/mL de anticor-
pos cino-izados anti-TSLP no plasma (5% de diluição) e soro; e menos do que 3,2 ng/mL em fluido BAL.
Este ensaio ELISA foi usado para medir os farmacocinéticos de anticorpos cino-izados anti-TSLP 23B12 após administração a camundongos e macacos.
Um estudo de PK de dose simples foi conduzido em camundon- gos CD-1 normais. Neste estudo, dez camindongos receberam 10mg/kg do anticorpo por administração intravenosa (IV); e dez camundongos recebe- ram 10 mg/kg do anticorpo por administração subcutânea (SC). Os resulta-
dos do estudo estão resumidos na Tabela 12.
Tabela 12
Rota Folga Vss AUC 0-final T1/2 ter¬ Tmáx Cmáx F(%) (m L/d ia/ (mL/kg) (pg*dia/mL) minal (dia) (pg/mL) kg) (dia) IV 24,8 220 366 6,69 - - - IV (w/o 22,8 198 404 6,36 Dia 10) SC - - 370 3,13 0,667 73,7 95,6 A Tabela 13 resume a percentagem de anticorpo cino-izado anti-
TSLP encontrada no fluido de BAL versus no soro em vários pontos de tem- po após administração de IV ou SC.
Tabela 13
Ponto de tempo (dia) IV SC BAL/Média de Soro (%) BAL/Média de Soro (%) 0,250 1,686 4,080 1,000 2,811 5,880 3,000 5,677 7,301 7,000 13,740 16,945 10,000 14,319 5,064 14,000 6,517 16,912 Dois estudos de PK de dose simples foram também conduzidos
em macacos cynomolgus. Os dois estudos usaram formulações diferentes do anticorpo cino-izado anti-TSLP 23B12: uma contendo 0,05% de Triton X- 100 e uma sem Triton X-100. Cada estudo continha três macacos. A dose usada em cada estudo é indicada na Tabela 14. O anticorpo foi administrado 10 subcutaneamente. Os resultados dos estudos são resumidos nas Tabelas Tables 14 e 15.
Tabela 14
Formu¬ Animal Dose CL/F AUC0- T1/2 ter¬ Tmáx Cmáx lação ID (mg/kg) (m L/d ia/ final minal (dia) (mg/mL) kg) (mg*dia/ (dia) mL) Nenhum Cino 5,6 15,1 326 9,18 1 26,4 Triton M2-04 (600) Cino 5,6 7,96 594 10 1 48,3 M7-05 (1090) Cino 5,7 8,82 491 12,4 2 34 M21-05 (887) 0,05% Cino 10,7 10,3 666 8,15 4 61,6 de Triton 2172 Cino 10,3 8,27 778 8,86 2 88,8 3048 Cino 9,8 8,14 753 9,08 1 89,9 5102 Tabela 15
Formulação Proporção de BAL/Soro (%) Nenhum Tri- Ponto de M2-04 M7-05 M21-05 Média ton tempo (dia) 3 0,657 0,712 0,335 0,568 10 1,83 1,15 1,81 1,60 +0,05% de Ponto de 2172 3048 5102 Média Triton X100 tempo (dia) 3 0,313 0,492 1,39 0,733 10 0,090 0,620 0,693 0,467 Exemplo 13
Administração de Anticorpos Cino-izados anti-TSLP 23B12 a Macacos Mon- kevs
Anticorpos cino-izados anti-TSLP 23B12 foram produzidos de
uma linha de célula de CHO estavelmente transfectada em cultura de sus- pensão. O sobrenadante foi colhido, tratado e purificado usando-se váras etapas cromatográficas padrão para alcançar uma preparação >95% pura de baixa endotoxina. O anticorpo purificado foi formulado para estabilidade du- 10 rante manuseio e uso, incluindo congelamento-descongelamentos múltiplos, em 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5, 7% (p/v) sacarose, e 0,05% de Tri- ton X-100. Este anticorpo é para ser administrado para alojar macacos cy- nomolgus alérgicos a poeira (HDM) para demonstrar a eficiência de anticor- pos anti-TSLP para tratar inflamação alérgica de pulmão. Este modelo de 15 animal tornará possível a coleta de tecidos aéreos, fluido de BAL, e PBMCs associados colhidos a partir do controle e animais tratados com cy23B12; e proporcionará a capacidade de avaliar a eficiência em Reações Alérgicas Anteriores (EAR) e Reações Alérgicas Posteriores (LAR). Informações adi- cionais com relação a modelos não-primatas de asma alérgica crônica são 20 conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Schelegle et al., Am. J. Pathology 158(1):333-341 (2001); Avdalovic et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174:1069-74 (2006) Care e Van Scott et al., J. Appl. Physioi 99(6):2080- 2086 (2005).
Muitas modificações e variações desta invenção podem ser fei- tas sem fugir de seu espírito e escopo, conforme será aparente àqueles ver- sados na técnica. As concretizações específicas aqui descritas são ofereci- das por meio de Exemplo somente, e a invenção é para ser limitada pelos termos das reivindicações em anexo, junto com o escopo total de equivalen- 5 tes aos quais tais reivindicações são intituladas; e a invenção não é para ser limitada pelas concretizações específicas que foram apresentadas aqui por meio de Exemplo.
A citação das publicações ou documentos acima não é pretendi- da como uma admissão que qualquer do precedente é técnica anterior perti- 10 nente, nem constitui qualquer admissão como para os conteúdos ou dados destas publicações ou documentos. As patentes dos Estados Unidos e ou- tras publicações aqui referenciadas são, desse modo, incorporadas por refe- rência.

Claims (33)

1. Composto de ligação que liga especificamente TSLP humano e cino, compreendendo: pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de ca- deia pesada compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecio- nada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; ou pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a par- tir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
2. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação compreende: peio menos uma região variávei de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de ca- deia pesada compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecio- nada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NQs: 1, 2 e 3; e pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreendendo pelo menos uma seqüência de CDR selecionada a par- tir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
3. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 2, em que: a região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, compreende pelo menos duas seqüências de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e a região variável de cadeia leve de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, compreende pelo menos duas seqüências de CDR selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
4. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 2, em que: a região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, tem as três seqüências de CDR colocadas em SEQ ID NOs: 1,2e3;e a região variável de cadeia leve de anticorpo, ou fragmento de ligação de TSLP desta, tem as três seqüências de CDR colocadas em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
5. Composto de ligação que liga especificamente TSLP humano e cino, compreendendo: pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de ca- deia pesada compreendendo: a CDR-H1 de SEQ ID NO. 1, ou uma variante desta; a CDR-H2 de SEQ ID NO. 2, ou uma variante desta; e a CDR-H3 de SEQ ID NO. 3, ou uma variante desta; ou pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreendendo: the CDR-L1 de SEQ ID NO. 4, ou uma variante desta; a CDR-L2 de SEQ ID NO. 5, ou uma variante desta; e a CDR-L3 de SEQ ID NO. 6, ou uma variante desta.
6. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 5, em que referido composto de ligação compreende: pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de ca- deia pesada compreendendo: the CDR-H1 de SEQ ID NO. 1, ou uma varian- te desta; a CDR-H2 de SEQ ID NO. 2, ou uma variante desta; e a CDR-H3 de SEQ ID NO. 3, ou uma variante desta; e pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento de ligação de TSLP desta, referida região variável de cadeia leve compreendendo: a CDR-L1 de SEQ ID NO. 4, ou uma variante desta; a CDR-L2 de SEQ ID NO. 5, ou uma variante desta; e a CDR-L3 de SEQ ID NO. 6, ou uma variante desta.
7. Composto de ligação que liga especificamente TSLP humano e cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo resíduos . 1-116 de SEQ ID NO: 10 ou uma variante destes; e uma região variável de cadeia leve compreendendo resíduos 1- 108 de SEQ ID NO: 12, ou uma variante destes, em que uma variante compreende até 20 resíduos de aminoáci- do conservativamente modificados.
8. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 7, com- preendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e uma região variável de cadeia leve compreendendo resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12.
9. Composto de ligação que liga especificamente TSLP humano e cino, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de homologia a resíduos 1-116 de SEQ ID NO: 10; e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de homologia a resíduos 1-108 de SEQ ID NO: 12.
10. Ácido nucleico isolado que codifica pelo menos uma da regi- ão variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve do composto de ligação como definido na reivindicação 1.
11. Vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 10 operavelmente ligado às seqüências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedei- ra é transfectada com o vetor.
12. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão como definido na reivindicação 11.
13. Método de produção um polipeptídeo compreendendo: cultura da célula hospedeira como definido na reivindicação 8 em meio de cultura sob condições nas quais a seqüência de ácido nucleico é expressa, produzindo, desse modo, polipeptídeos compreendendo as regi- ões variáveis de cadeias leve e pesada; e recuperação dos polipeptídeos a partir da célula hospedeira ou meio de cultura.
14. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, com- preendendo adicionalmente: uma região constante de cadeia pesada humana, ou uma varian- te desta, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservativamente modificadas; ou uma região constante de cadeia leve humana, ou uma variante desta, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservativamente modificadas.
15. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 14, em que a região constante de cadeia pesada humana compreende uma região constante de cadeia pesada humana y4 ou γ1, ou uma variante desta, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservati- vamente modificadas .
16. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 2, com- preendendo adicionalmente: uma região constante de cadeia pesada humana, ou uma varian- te desta, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservativamente modificadas; ou uma região constante de cadeia leve humana, ou uma variante desta, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservativamente modificadas.
17. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 16, em que a região constante de cadeia pesada humana compreende uma região constante de cadeia pesada humana γ4 ou γ1, ou uma variante desta, no qual a variante compreende até 20 substituições de aminoácido conservati- vamente modificadas.
18. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação de TSLP deste.
19. Composto de ligação, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação é um fragmento de anticorpo de ligação de TSLP selecionado a partir do grupo consistindo em Fab1 Fab', Fab1-SH1 Fv1 scFv, F(ab’)2, e a diacorpo.
20. Método de supressão de uma resposta imune em um indiví- duo humano, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade deste o composto de ligação como definido na reivindicação 1, ou um frag- mento de ligação de TSLP desta, em uma quantidade efetiva para bloquear a atividade biológica de TSLP.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a respos- ta imune é uma resposta inflamatória.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o indiví- duo tem um distúrbio selecionado a partir do grupo consistindo em rinosinu- site alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o indiví- duo tem asma.
24. Composição compreendendo o composto de ligação como definido na reivindicação 1 em combinação com um veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável.
25. Anticorpo que se liga especificamente ao epítope em TSLP humano que é ligado pelo anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951, no qual o anticorpo que se liga especificamente ao epítope em TSLP humano não é o anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951.
26. Anticorpo que inibe competitivamente ligação pelo anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951 a TSLP humano, no qual o anticorpo que inibe competitivamente ligação não é o anticorpo pro- duzido pelo hibridoma depositado como PTA-7951.
27. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação bloqueia atividade mediada por TSLP.
28. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que referido composto de ligação é capaz de bloquear a ligação de TSLP a TSLPR em um ensaio de bloqueio cruzado.
29. Uso do composto de ligação como definido na reivindicação .1, ou um fragmento de ligação de TSLP deste, para a preparação de um medicamento para suprimir uma resposta imune.
30.Uso do composto de ligação como definido na reivindicação 1, ou um fragmento de ligação de TSLP deste, para a preparação de um medicamento para tratar inflamação.
31. Uso do composto de ligação como definido na reivindicação 1, ou um fragmento de ligação de TSLP deste, para a preparação de um medicamento para tratar infamação alérgica.
32. Uso do composto de ligação como definido na reivindicação 1, ou um fragmento de ligação de TSLP deste, para a preparação de um medicamento para tratar rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica.
33.Uso do composto de ligação como definido na reivindicação 1, ou um fragmento de ligação de TSLP deste, para a preparação de um medicamento para tratar asma.
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